CN114456259B - 一种抗新冠病毒的抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗新冠病毒的抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗新冠病毒的抗体，其包含VL和/或VH，所述VH包含：如SEQ ID NO:1‑5任一所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:6‑10任一所示的VH CDR2；和/或，如SEQ ID NO:11‑15任一所示的VH CDR3；所述VL包含：如SEQ ID NO:16‑20任一所示的VL CDR1；如EVT、WAS、EDS、FDY或GVN所示的VL CDR2；和/或，如SEQ ID NO:21‑25任一所示的VL CDR3。本发明的抗体对新型冠状病毒的刺突蛋白有强力的结合，能够力中和SARS‑CoV‑2病毒等新冠病毒的感染。

Description

一种抗新冠病毒的抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗新冠病毒(例如能够中和新冠病毒感染)的抗体及其制备方法和应用。
背景技术
冠状病毒属于套式病毒目Nidovirales，冠状病毒科Coronaviridae，冠状病毒属Coronavirus。成熟的冠状病毒表面有囊膜，囊膜表面覆有纤突，纤突末端呈球形，故整个纤突呈花瓣状或梨状，纤突之间有较宽的间隙。电镜下，囊膜纤突规则地排列成王冠状，病毒颗粒因此而得名。冠状病毒属的成员引起了多次爆发性疫情，如2002年的严重急性呼吸系统综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，缩写为SARS)和2012年的中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)、以及新型冠状病毒(SARS-CoV-2，后续简称新冠病毒)。2002年发现首个SARS病例，随后该病毒迅速扩散至越南、新加坡和加拿大等30多个地区，超过8000人感染，死亡率约为10％。2012年首次发现中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)。自2012年9月至2020年1月，WHO共报道了2506例实验室确诊病例，其中862例死亡(死亡率约为34.3％)。与2002年爆发的SARS不同，SARS疫情得到有效的控制，但是MERS-CoV至今仍在持续传播和感染，2020年1月，WHO依然报道了两位确认的MERS感染者。这两次疫情的爆发对社会都造成巨大影响，目前尚无针对这两种高度传染性的冠状病毒的有效疫苗和治疗药物。
对于冠状病毒的治疗，可通过多条途径实现，包括阻止病毒的刺突蛋白与宿主细胞受体结合、阻遏结合后的刺突蛋白构象变化诱导的病毒与宿主细胞的融合、以及抑制病毒在细胞内的复制与组装。其中，病毒的刺突蛋白与宿主细胞的受体的结合是感染的第一步途径，阻断该途径可防止病毒扩增与随后的细胞损伤和炎症反应，是治疗冠状病毒感染的最有效的方法。抗体具有亲和力高、靶点特异的优势，通过特异性地与冠状病毒的刺突蛋白结合，防止病毒入侵宿主细胞，对于治疗冠状病毒的感染具有巨大潜力。但目前仍缺乏治疗和检测新冠病毒的药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术缺乏治疗和检测新冠病毒药物的不足，提供了一种抗新冠病毒的抗体及其制备方法和应用。
为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种抗新冠病毒的抗体，其包含轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)，
所述VH包含以下的互补决定区(CDR)序列：如SEQ ID NO:1-5任一所示的VH CDR1氨基酸序列；如SEQ ID NO:6-10任一所示的VH CDR2氨基酸序列；和/或，如SEQ ID NO:11-15任一所示的VH CDR3氨基酸序列；所述VL包含以下的CDR序列：如SEQ ID NO:16-20任一所示的VL CDR1氨基酸序列；如EVT、WAS、EDS、FDY或GVN所示的VL CDR2氨基酸序列；和/或，如SEQ ID NO:21-25任一所示的VL CDR3氨基酸序列；
或者，所述VH在所述的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3的氨基酸序列的基础上分别具有3、2或1个氨基酸突变，和/或，所述VL在所述的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3氨基酸序列的基础上分别具有3、2或1个氨基酸突变。
本申请中，在类似“具有3、2或1个氨基酸的插入、缺失或替换”中“氨基酸突变”是指相较于原氨基酸序列而言，变体的序列存在氨基酸的突变，包括在原氨基酸序列的基础上发生氨基酸的插入、缺失或替换。示例性的解释是对CDR的突变可以包含3个、2个或1个氨基酸的突变，这些CDR之间可以任选地选择相同或不同数目的氨基酸残基进行突变，例如可以是对CDR1进行1个氨基酸的突变，对CDR2和CDR3不进行氨基酸突变。
本申请中，所述突变可以包括目前如本领域技术人员公知的突变，例如在抗体的生产或者应用过程中，可能会对抗体进行的一些突变，例如对可能存在的，特别是CDR区的转录后修饰(Potential post-translational modifications，PTMs)的位点进行突变，包括抗体的聚集、脱酰胺基敏感(asparagine deamidation，位点(NG，NS，NH等)、天冬氨酸异构(DG，DP)敏感位点、N糖基化(N-{P}S/T)敏感位点及氧化敏感位点等相关突变。
在一些优选的具体实施例中，所述VH包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别如SEQID NO:1、6、11所示的氨基酸序列，所述VL包括VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别如SEQ IDNO:16、EVT、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；或，所述VH包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别如SEQ ID NO:2、7、12所示的氨基酸序列，所述VL包括VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别如SEQ ID NO:17、WAS、SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；或，所述VH包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别如SEQ ID NO:3、8、13所示的氨基酸序列，所述VL包括VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3分别如SEQ ID NO:18、EDS、SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；或，所述VH包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别如SEQ ID NO:4、9、14所示的氨基酸序列，所述VL包括VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3分别如SEQ ID NO:19、FDY、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；或，所述VH包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别如SEQ ID NO:5、10、15所示的氨基酸序列，所述VL包括VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别如SEQ ID NO:20、GVN、SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
优选地，所述VH还包括重链可变区框架区(VH FWR)，和/或，所述VL还包括轻链可变区框架区(VL FWR)。
在一些优选地具体实施例中，所述VH FWR为人抗体的重链可变区框架区。
在一些优选地具体实施例中，所述VL FWR为人抗体的轻链可变区框架区。
进一步更优选地，所述VH的氨基酸序列为如SEQ ID NO:31-35或其突变任一所示的氨基酸序列，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO:26-30任一序列所示。
进一步更优选地，所述VL的氨基酸序列为如SEQ ID NO:41-45或其突变任一所示的氨基酸序列，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO:36-40任一序列所示。
上述突变为所述VH和/或VL的氨基酸序列上发生了一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或添加，且所述突变的氨基酸序列与所述VH和/或VL的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，并保持或改善了所述抗体与新冠病毒的结合；所述至少85％序列同一性优选为至少90％序列同一性，更优选为至少95％序列同一性，最优选为至少99％序列同一性。
在一些优选地具体实施例中，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示；或，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示；或，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示；或，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示；或，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示。
在本申请中，上述所列CDR的氨基酸序列均是按照IMGT定义规则所示出的。但是，本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则(参见，Kabat等人，免疫学的蛋白质序列，第五版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))和基于结构环区域位置的Chothia定义规则(参见JMol Biol273:927-48,1997)。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应了解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。虽然本发明中请求保护的范围是基于imgt定义规则所示出的序列，但是根据其他CDR的定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中。
优选地，所述抗新冠病毒的抗体为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv例如scFv、双特异性抗体、多特异性抗体、重链抗体或单域抗体(即VHH)，或由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。
本申请中，所述的“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fc”区含有抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。所述的“Fab片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。所述的“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此F(ab’)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。所述的术语“Fv”意指向抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段，但缺少恒定区。
本申请中，所述的scFv(single chain antibody fragment，单链抗体)可为本领域常规的单链抗体，其包括重链可变区、轻链可变区和15～20个氨基酸的短肽。其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子[参见，例如，Bird等人，Science 242:423-426(1988)和Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)]。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的G4S氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(G4S)4或(G4S)3接头，但也可使用其变体。
本申请中，术语“多特异性抗体”按其最广义使用，涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体，其中该VH-VL单元具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH区的抗体，每个VH-VL单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合；全长抗体、抗体片段、双特异性抗体(diabodies)、和三抗体(triabodies)、共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
本申请中，所述的单克隆抗体或mAb或Ab，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。
本申请中，所述的“重链抗体”指的是只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区的抗体，又称为HCAbs。
“单域抗体”，又称为“纳米抗体”，指的是从重链抗体中克隆出来的VHH结构，是已知的可结合目标抗原的最小单位。
在某一较佳实施例中，其是全长抗体，所述全长抗体包括重链和轻链。
优选地，所述抗体还包括抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区。
更优选地，所述重链恒定区选自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或其突变。
更优选地，所述轻链恒定区选自人源抗体的κ链或者λ链或其突变
在某一较佳实施例中，所述重链恒定区为hIgG4，且所述轻链恒定区为人源抗体的κ链或者λ链。
优选地，所述抗新冠病毒的抗体为抗新冠病毒的刺突蛋白的抗体，优选为抗新冠病毒的刺突蛋白RBD(受体结合域，receptor binding domain)的抗体，所述新冠病毒的刺突蛋白RBD的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:46所示，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO:47所示。
为了解决上述技术问题，本发明第二方面提供了一种分离的核酸，其编码如本发明第一方面所述的抗新冠病毒的抗体。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地，包括以下的步骤：通过基因克隆技术获得编码上述抗体的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述抗体的核酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述抗体的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该抗体序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
为了解决上述技术问题，本发明第三方面提供了一种重组表达载体，其包含如本发明第二方面所述的分离的核酸。
所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本申请所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载前述核酸分子即可。
优选地，所述重组表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，所述病毒载体优选逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
为了解决上述技术问题，本发明第四方面提供了一种转化体，其在宿主细胞中包含如本发明第三方面所述的重组表达载体。
所述转化体的制备方法可为本领域常规的制备方法，例如为：将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述转化体的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核酸可被有效表达即可。优选地，所述宿主细胞为原核细胞和/或真核细胞，所述原核细胞优选E.coli细胞如TG1、BL21(表达单链抗体或Fab抗体)，所述真核细胞优选HEK293细胞(例如人HEK293T或HEK293F细胞)或CHO细胞(表达全长IgG抗体，例如CHO-K1细胞)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
为了解决上述技术问题，本发明第五方面提供了一种嵌合抗原受体，其包含如本发明第一方面所述的抗新冠病毒的抗体。
为了解决上述技术问题，本发明第六方面提供了一种基因修饰的细胞，其包含如本发明第五方面所述的嵌合抗原受体。
优选地，所述基因修饰的细胞为真核细胞，优选分离的人细胞；更优选免疫细胞如T细胞，或NK细胞。
为了解决上述技术问题，本发明第七方面提供了一种抗新冠病毒的抗体的制备方法，其包含培养如本发明第四方面所述的转化体，从培养物中获得抗新冠病毒的抗体。
为了解决上述技术问题，本发明第八方面提供了一种抗体药物偶联物，其包含细胞毒性剂，以及如本发明第一方面所述的抗新冠病毒的抗体。
优选地，所述细胞毒性剂为MMAF或MMAE。
为了解决上述技术问题，本发明第九方面提供了一种药物组合物，其包含如本发明第一方面所述的抗新冠病毒的抗体和/或如本发明第八方面所述的抗体药物偶联物，和药学上可接受的载体。
优选地，所述药物组合物还包括其他抗肿瘤抗体作为活性成分。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
所述的药学上可接受的载体可为本领域常规的载体，所述的载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，优选地包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更优选地，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的上述蛋白质和/或上述的抗体药物偶联物，和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明所述的药物组合物的给药途径优选地为肠胃外施用、注射给药或口服给药。所述注射给药优选地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳地为固体、半固体、气体或液体的形式，即可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳的为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。更优选地为经由血管内、皮下、腹膜内或肌内施用。较佳地，所述药物组合物还可以作为气雾剂或粗喷雾剂施用，即经鼻施用；或者，鞘内、髓内或心室内施用。更优选地，所述的药物组合物还可以透皮、经皮、局部、肠内、阴道内、舌下或经直肠施用。本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
本发明所述的药物组合物的给药剂量水平可以根据达到所需诊断或治疗结果的组合物量而调整。施用方案也可以为单次注射或多次注射，或进行调整。所选择的剂量水平和方案依赖于包括所述药物组合物的活性和稳定性(即，半衰期)、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、待检测和/或治疗的疾病或病症、以及待治疗的受试者的健康状况和先前医疗史等各种因素而进行合理地调整。
对于本发明的所述药物组合物的治疗有效剂量可以最初在细胞培养实验或动物模型例如啮齿类动物、兔、犬、猪和/或灵长类动物中进行估计。动物模型也可以用于测定合适的施用浓度范围和途径。随后可以用于确定在人中施用的有用剂量和途径。一般地，施用有效量或剂量的确定和调整以及何时和如何进行此类调整的评估为本领域技术人员已知。
对于组合疗法，上述抗体、上述抗体药物偶联物和/或另外的制剂(例如治疗剂或诊断剂)可以各自作为单一药剂，在适合于执行预期治疗或诊断的任何时间范围内进行使用。因此，这些单一药剂可以基本上同时(即作为单一制剂或在数分钟或数小时内)或以按顺序连续施用。
关于制剂、剂量、施用方案和可测量的治疗结果的另外指导，参见Berkow等人(2000)The Merck Manual of Medical Information(Merck医学信息手册)和Merck&Co.Inc.,Whitehouse Station,New Jersey；Ebadi(1998)CRC Desk Reference ofClinical Pharmacology(临床药理学手册)等著作。
为了解决上述技术问题，本发明第十方面提供了如本发明第一方面所述的抗新冠病毒的抗体、如本发明第五方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第六方面所述的基因修饰的细胞、如本发明第八方面所述的抗体药物偶联物和/或如本发明第九方面所述的药物组合物在制备抗新冠病毒(例如抗新冠病毒的刺突蛋白优选抗新冠病毒的刺突蛋白RBD区域)的药物中的应用。
优选为在制备中和新冠病毒例如新冠病毒的刺突蛋白的感染的药物中的应用，更优选为在制备中和新冠病毒的刺突蛋白RBD的感染的药物中的应用；所述新冠病毒的刺突蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:46所示，其核苷酸序列优选如SEQ ID NO:47所示。
为了解决上述技术问题，本发明第十一方面提供了试剂盒，其包括如本发明第一方面所述的抗新冠病毒的抗体、如本发明第五方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第六方面所述的基因修饰的细胞、如本发明第八方面所述的抗体药物偶联物和/或如本发明第九方面所述的药物组合物。
优选地，所述试剂盒还包括(i)施用抗体或其抗原结合片段或抗体药物偶联物或药物组合物的装置；和/或(ii)使用说明。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测样品中新冠病毒的方法，其包括使用如本发明第一方面所述的抗新冠病毒的抗体进行检测。该检测方法包括诊断目的的检测方法和非诊断目的的检测方法。诊断目的的检测方法可以检测患者治疗前、后新冠病毒数量、活力的变化。
本发明非诊断目的的治疗或检测方法包括例如：
1.预防医学研究和公共卫生政策的制定
本领域技术人员知晓，现代医学分为两部分：预防医学和临床医学。本发明“非诊断目的的检测方法”，在预防医学中可以对环境中采集的样本(包括人体分泌物)进行检测，对环境是否被污染进行判断，从而决策是否对该环境进行封锁、暂停营业、消杀等处置方式，并决策是否对这一地区、城市甚至更高层面升级传染病防控措施。从公共卫生角度出发对传染病进行预防，避免该环境残留的病毒成为传染源。
2.科学研究领域
(1)基础医学和生态学
例如，本领域技术人员可以对水样进行检测，以判断病毒的传播时间和广泛度。再例如，巴西在2019年11月27日采集的下水道水样中检测出新冠病毒，早于世界第一例确诊病例的报道，可为病毒的溯源和传播时间提供更多的参考依据。又例如，美国加州在对2月初死亡的数名死者重新进行尸检显示，其新冠病毒检测呈阳性，比美国报道的首例新冠肺炎死亡病例提早三周，而对尸体进行检测不属于疾病的诊断和治疗方法。
(2)病毒学方面产品的研发
本领域技术人员知晓，当多种病毒在同一宿主体内同时感染，可能产生病毒突变，包括病毒自身核酸的重组，或来自不同病毒的核酸的重组。若出现病毒的突变，尤其当其发生在秋冬流感季，则情况更为严重。利用本发明的抗新冠病毒的抗体进行检测，可用于病毒学的研究，检测是否产生了病毒核酸的整合，可从预防医学的角度对病毒是否产生整合进行监测和及时预警。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了如本发明第一方面所述的抗新冠病毒的抗体、如本发明第五方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第六方面所述的基因修饰的细胞、如本发明第八方面所述的抗体药物偶联物和/或如本发明第九方面所述的药物组合物(例如诊断、预防和/或治疗新冠病毒的感染)中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明还提供一种套装药盒，其包含药盒A和药盒B，所述的药盒A包含如本发明第一方面所述的抗新冠病毒的抗体、如本发明第五方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第六方面所述的基因修饰的细胞、如本发明第八方面所述的抗体药物偶联物和/或如本发明第九方面所述的药物组合物，所述的药盒B为其他抗新冠病毒的药物组合物。所述的药盒A和药盒B可以同时使用，也可以先使用药盒A再使用药盒B，还可以先使用药盒B再使用药盒A，可以根据具体应用时的实际需求而定。
为了解决上述技术问题，如本发明第一方面所述的抗新冠病毒的抗体、如本发明第五方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第六方面所述的基因修饰的细胞、如本发明第八方面所述的抗体药物偶联物和/或如本发明第九方面所述的药物组合物还可以与其他药物进行联合用药，例如可以与化学治疗剂等进行联合用药。
术语
在本申请中，除非另有说明，否则本申请中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本申请中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在本申请中，术语“可变”通常是指这样的事实，即抗体的可变结构域的序列的某些部分变化强烈，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性并非均匀地分布在抗体的整个可变区中。它集中在轻链和重链可变区中的三个区段，被称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)。可变域中更高度保守的部分被称为框架(FWR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FWR区，大部分采用β-折叠构型，通过三个CDRs连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDRs通过FWR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点，恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
本申请所用氨基酸三字母代码和单字母代码如本领域技术人员知晓，或J.Biol.Chem,243,p3558(1968)中所述。
如本申请使用的，术语“包括”或“包含”旨在表示组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素，但根据上下文的理解，也包括“由……组成”的情况。
本申请所述的术语“抗体”可以是包括免疫球蛋白，其是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本申请中，本申请所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源的κ、λ链或其变体。在本申请中，本申请所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源的IgG1、2、3、4或其变体。
在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FWR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区4个FWR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。轻链的3个CDR区指VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3；重链的3个CDR区指VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
术语“人源抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本申请的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。然而，术语“人抗体”不包括这样的抗体，即其中已将衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗体”)。
如本申请所用，关于抗体的术语“特异性”意指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或更多个物种的该抗原。但是，这种种间交叉反应性本身不改变抗体根据特异性的分类。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合该抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体根据特异性的分类。在一些情况下，术语“特异性”或“特异性结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，意味着该相互作用取决于化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体一般识别并结合特定的蛋白质结构，而不是蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有经标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在将减少结合于抗体的标记的A的量。
本文中使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”指：包含能够结合抗原的胞外域(胞外结合结构域)、铰链结构域、跨膜结构域(跨膜区)和使胞质信号传到结构域的多肽(即胞内信号域)。铰链结构域可以被认为是用于向细胞外抗原结合区提供柔性的一部分。胞内信号域指经由确定的信号传导途径通过产生第二信使而将信息传递到细胞内以调节细胞活性的蛋白质、或通过相应于此类信使而作为效应子发挥作用的蛋白质，产生可以促进CAR的细胞(例如CAR-T细胞)的免疫效应子功能的信号。胞内信号域包含信号传导结构域，还可以包括源自共刺激分子的共刺激胞内结构域。
本发明所用的术语氨基酸序列的“同一性”(identity)可以与“相似性”互换使用，指的是氨基酸序列之间通过序列比对软件例如BLAST确定的相似程度。氨基酸序列比对的方法和软件对于本领域技术人员是公知的。可以通过对已知氨基酸序列进行一个或几个(例如1-15个，例如2、3、5、8、10或12个)氨基酸残基的取代、缺失和/或添加而获得经改造的氨基酸序列。例如，通过常规蛋白质工程手段(例如氨基酸保守取代等)，对本发明SEQ IDNO:x所示的抗体进行改造，可以获得与SEQ ID NO:x具有至少85％(例如85％～99％或90％～99％或95％～99％)序列同一性，并且具有基本相同的抗原结合结构域的变体序列。
本文所用的术语“抗原结合结构域”是包括具有功能的抗体部分，优选抗原结合和/或完整抗体的可变区。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”(如果为单链)在本申请中互换地使用。术语“核酸”、“核酸序列”，“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”和“多核苷酸”互换使用。
本文使用的术语“载体”是包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的组合物。在本领域中已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
本申请使用的表述“细胞”、“细胞系”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌等原核细胞，如酵母细胞等的真菌细胞，或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞、Vero细胞、灵长类细胞或人细胞等的动物细胞。
术语“转染”是指将外源核酸引入真核细胞。转染可以通过本领域已知的各种手段来实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道技术(biolistics)。
术语“免疫细胞”指可以引发免疫应答的细胞，“免疫细胞”及其语法上的其他形式可以指任何来源的免疫细胞。“免疫细胞”包括例如衍生自在骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞)、淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和骨髓来源的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)。术语“免疫细胞”也可以是人或非人的。例如，免疫细胞可以是来自血液的，如自体的T细胞、异体T细胞、自体NK细胞、异体NK细胞，也可以来源自细胞系，如利用EBV病毒感染来制备NK细胞系，从胚胎干细胞和iPSC诱导分化来的NK细胞以及NK92细胞系等。
如本申请使用的，术语“T细胞”是指在胸腺中成熟的一类淋巴细胞。T细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并且与与其他淋巴细胞(例如B细胞)的不同点在于细胞表面上存在T细胞受体。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、自然杀伤T细胞、T调节细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。如本文使用的，术语“NK细胞”是指起源于骨髓并且在先天免疫系统中起重要作用的一类淋巴细胞。NK细胞提供针对病毒感染的细胞、肿瘤细胞或其他应激细胞的快速免疫反应，即使是细胞表面上不存在抗体和主要组织相容性复合体。
“任选”、“任一”、“任意”或“任一项”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。本发明所用，“一个”和“一种”在本发明中用来指的一个或多于一个的语法对象。除非内容明确提示，否则术语“或”在本发明中用来意指术语“和/或”并且与之互换使用。“约”和“大约”应当通常意指鉴于测量的性质或精度，所测量的量的可接受误差程度。示例性误差程度一般在其10％范围内和更一般在其5％范围内。本发明公开的方法和组合物涵盖这样的多肽和核酸，它们具有指定的序列，变异序列或与其基本上相同或相似的序列，例如，与序列指定至少85％、90％、95％、99％或更多相同的序列。在氨基酸序列的情况下，术语“基本上相同”在本发明中用来指第一氨基酸序列。
如本文中所使用的，术语EC50是指半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，即能引起50％最大效应的浓度。
如本发明所用，术语“癌”、“癌症”、“癌症病人”意在包括全部类型的癌性生长物或致瘤过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭力阶段是什么。例子包括但不限于实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤和转移性病灶。
本领域人员应当理解的是，包含本发明所述的抗新冠病毒的抗体的产品，例如CAR-T、TCR-T、双抗、多抗、ADC等等都应当落在本发明保护的范围内。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的抗体对新型冠状病毒的刺突蛋白有强力的结合，能够力中和SARS-CoV-2病毒等新冠病毒的感染，并且其对新冠病毒的特异性高，同时也可以抑制如B.1.1.7等突变型新冠病毒。将其用于抗新冠病毒时特异性更好、安全性更高、疗效更加显著。
附图说明
图1显示了采用ELISA的方式，检测抗体与冠状病毒的刺突蛋白质的结合的结果图。
图2显示了抗体与冠状病毒的刺突蛋白质的相互作用检测的结果图，主要是利用Octet检测新型冠状病毒刺突蛋白与抗体的结合。其中A、B和C分别是SH8、SH4和SH6的结合曲线，D是拟合的结果。
图3显示了抗体中和带有新冠病毒刺突蛋白的病毒的结果图，其中A为三个抗体的荧光强度图，B为三个抗体的半中和浓度数值。
图4中A-H显示了三个抗体对不同病毒刺突蛋白是否有结合。
图5显示了三个抗体对不同新冠病毒株的抑制作用；其中A为三个抗体对野生型新冠病毒的抑制效果，B为三个抗体对突变型新冠病毒(B.1.1.7)的抑制效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例中所使用的抗体信息如下：
表1抗体重链可变区的序列(IMGT编号规则)
Figure BDA0003340802160000141
表2抗体轻链可变区的序列(IMGT编号规则)
Figure BDA0003340802160000142
Figure BDA0003340802160000151
重链可变区和轻链可变区的信息如下：
>SH2-VH-DNA
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>SH2-VH-Protein
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>SH2-VL-DNA
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>SH2-VL-Protein
LSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYASWYQQHPGKAPKLLIYEVTKRPSGVPDRFSSSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYTGTLLLFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:41)
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>SH8-VH-protein
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>SH8-VL-DNA
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>SH8-VL-protein
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>SH4-VH-protein
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>SH4-VL-DNA
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>SH4-VL-protein
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>SH6-VH-DNA
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>SH6-VH-protein
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>SH6-VL-DNA
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>SH9-VL-DNA
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>SH9-VL-Protein
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以上抗体的重链恒定区均为hIgG4，轻链恒定区除SH8是人源抗体的κ链，其余均选择人源抗体的λ链。
表3 SARS-CoV-2 S-RBD的序列
Figure BDA0003340802160000191
实施例1 ELISA检测抗体与新型冠状病毒的刺突蛋白的结合
Avidin(Pierce,#21121)用磷酸盐缓冲液PBS(Sigma,#C3041)稀释到2ng/μL。Avidin溶液加到96孔板中，每个孔25μL，4℃过夜。包被的96孔板用PBS冲洗，每个孔150μL，随后每个孔加入25μL生物素化的SARS-CoV-2 S-RBD-hFc(IgG1的Fc)溶液(SARS-CoV-2 S-RBD的信息如表3所示)，浓度是2ng/μL，室温放置1小时。空白对照是PBST(PBS含有0.05％Tween-20)和阴性对照是hFc溶液，浓度是2ng/μL。之后，96孔板用PBST润洗一次，用5％奶粉的PBST，每个孔150μL，37℃孵育1个小时进行封闭。封闭之后加入待测抗体在37℃孵育1个小时，然后待测抗体用PBST润洗8次。然后加入含有抗人IgG的带有HRP标记的抗体(Promega，W4038)，每个孔150μL。用PBST润洗8次，然后加入50μL ABTS显色溶液(Roche,#11684302001)。室温放置10分钟，在405nm下用微孔板读板机读取(Enspire,PerkinElmer)。
结论：从图1可以看出抗体对新型冠状病毒的刺突蛋白有强力的结合。
实施例2抗体与冠状病毒的刺突蛋白质的相互作用检测
使用Octet RED96仪器(Molecular Devices LLC,San Jose,CA,USA)对抗体与SARS-CoV-2 S-RBD的亲和力进行测试。纯化的S-RBD-hFc经Thrombin蛋白酶切处理，去除融合的Fc后用于实验。对于SH4的测试，首先将10μg/mL的S-RBD通过胺基偶联的方式固定在AR2G生物探针上，在含有0.02％吐温-20与0.05％BSA的PBS溶液(PBST-B)中放置60秒记录基线值。该探针与二倍系列稀释的SH4抗体(12.5nM至0.78nM，)作用300秒并记录结合反应过程，随后与PBST-B溶液反应600秒记录解离反应过程。稀释抗体与测试缓冲液均为PBST-B。对于SH8与SH6抗体的亲和力测试，选用SA生物探针，生物素化的S-RBD通过共价反应与其连接。随后的基线记录、结合与解离过程的记录同SH4。结合速率、解离速率与解离常数等动力学数据经ForteBio的分析软件得出。
结论：如图2的A～D所示，抗体可以与新型冠状病毒的刺突蛋白有强效的结合。
实施例3抗体中和带有新冠病毒刺突蛋白的病毒
将编码hACE2(人源ACE2)融合蓝色荧光蛋白(BFP)的质粒(GenBank:AF291820.1，由金斯瑞公司合成)转染293T细胞，该质粒含有Puromycin抗性。感染细胞后，通过2μg/mL的Puromycin加压筛选，用流式分选出BFP阳性的细胞，建立了293T-hACE2稳转细胞系。
采用基于慢病毒的体系构建SARS-CoV-2的慢病毒。在HEK293T细胞中，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen,L3000-015)将编码mCherry红色荧光蛋白与Luciferase荧光素酶的NL4-3质粒(addgene#44965)与pcDNA3.1-SARS-CoV-2spikeΔ19质粒(GenBank:MN908947.3，C端截短19个氨基酸，由金斯瑞公司合成)共同转染用于SARS-CoV-2假病毒包装。转染后48小时将含有释放的假病毒颗粒的细胞上清收集，0.45μm过滤后，与Lenti-X浓缩液(Takara,631231)孵育过夜，在4℃旋转混匀。随后，1500g离心45分钟收集病毒沉淀，使用DMEM培养基重悬病毒，并于-80℃保存。
在HEK293T-hACE2细胞中，使用SARS-CoV-2假病毒感染，并检测筛选抗体对假病毒的中和能力。首先将HEK293T/hACE2稳转细胞接种于96孔白色底板，培养过夜。将SARS-CoV-2的假病毒与不同浓度的抗体(稀释系数：3.16，SH8与SH4的浓度范围：200nM至200fM，SH6的浓度范围为：200nM至6.3fM)预先混合，并于37℃孵育30分钟，没有加病毒的DMEM和不加抗体的病毒分别作为对照。随后将孵育混合物加入细胞孔板中，培养16小时后，用新鲜的DMEM培养基替换假病毒&抗体复合物，细胞继续培养48小时。使用Bright-LumiTM FireflyLuciferase Reporter Gene测试试剂盒(碧云天，RG015M)检测细胞中的Luciferase蛋白表达，以此表征慢病毒感染效率。50微升的萤光素酶底物(碧云天，RG015M)首先被加入每个孔，随后在Envision酶标仪(PerkinElmer,Ensight)上读取荧光强度。
结论：如图3A所示，所有的三个抗体都能强力中和SARS-CoV-2假病毒对HEK293T-hACE2细胞的感染，且中和能力呈浓度依赖方式，在高浓度时可完全抑制假病毒的感染。SH8、SH4及SH6的半数中和浓度(NT50)分别为2.2±0.2nM、0.48±0.03nM及0.025±0.002nM(图3B)。抑制曲线的拟合方式按照1:1的方式拟合，三个抗体的HillSlope数值均接近1.0。
实施例4抗体识别的特异性
使用流式细胞术(FACS)检测抗体识别的特异性，将SARS、HcoV和MERS等不同病毒的刺突(spike)蛋白基因通过P2A肽与EGFP基因串联，瞬时转染到HEK293T细胞中。培养24小时后，收集细胞并重新悬浮在冰冷的FACS缓冲液(PBS、0.05％BSA和2mM EDTA)中。然后将表达刺突蛋白细胞(每管50000个细胞)与不同的抗S-RBD抗体，即本文中SH8、SH4和SH6，在4℃下孵育20分钟，并用1mL冰冷的FACS缓冲液洗涤，离心并重新悬浮在100μL含有识别人Fc的偶联Alexa555二抗的冰冷FACS缓冲液(1:800v/v稀释，Life technology，#A21433)。在4℃下孵育15分钟后，将细胞洗涤两次并重新悬浮在FACS缓冲液中，然后在流式细胞仪(CytoFLEX S，Beckman Culter)上进行分选和分析，以确定抗体对过表达野生型尖峰的细胞。记录和分析eGFP阳性细胞中Alexa555的荧光以评估抗体结合能力。
结论：如图4所示，所有的三个抗体都能结合新冠病毒的野生型的刺突蛋白，但是不识别SARS-CoV、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43和MERS病毒的刺突蛋白。
实施例5抗体可以高效中和野生型和突变型的新冠病毒
使用Vero细胞进行新冠病毒感染的测试。Vero细胞孵育之前，按照0.5log10的稀释梯度对SH8、SH4和SH6抗体进行系列稀释(从100nM到1pM共11步)，与固定剂量的SARS-CoV-2(Victoria 01/2020分离株)一起预孵育。使用含1.5％羧甲基纤维素的覆盖层来防止卫星焦点形成。感染后20小时，将单层膜用4％多聚甲醛固定，用2％Triton X-100透化并使用单克隆抗体对病毒的N抗原(SinoBiological,Cat.40143-R001)进行染色。用过氧化物酶偶联抗体和真蓝过氧化物酶底物显影后，ELISPOT计数。在GraphPad Prism 8.3中使用四参数回归拟合分析数据。
结论：如图5A所示，SH8、SH4和SH6均可以显著抑制野生型新冠病毒，半数中和浓度为0.88、2.04和0.15nM。如图5B所示，SH8、SH4和SH6均可以显著抑制突变型新冠病毒(B.1.1.7)，半数中和浓度分别为2.16、1.88和1.15nM。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海科技大学
大诺牛津科学有限公司
<120> 一种抗新冠病毒的抗体及其制备方法和应用
<130> P21018447C
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<151> 2020-11-07
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tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagcaa taaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagactac 300
ggtgactacc tccttgacta ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc ctca 354
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gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240
caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agaatactac 300
tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctca 348
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caggctccag gcaaggggct ggagtgggtg gcagttatat ggtctgaagg aagtactgaa 180
tactacgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcta gagacaattc caaggacacg 240
ctttatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ctgtctatta ctgtgcgaga 300
ccaggttatc caacatcaac cgaccgttca ccagcagcag ctggtgcaag gcaatactac 360
tactacggta tggacgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a 411
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accaactaca acccgtccct caagagtcga gtcaccatgt cactggacac gtccaagaac 240
cagttctccc tgaaactgag ctctgtgact gccgcggaca cggccgtcta ttactgtgcg 300
acccccggag ctattatggg tgctcttcat atctggggcc aaggcaccct ggtcaccgtc 360
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agcccggcct tccaaggcca ggtcaccatg tccgccgaca agtccttcaa taccgcctac 240
ctgcagtgga gtcgcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacttggg 300
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Leu Ser
20 25 30
His Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Thr Tyr Gly Asp Gly Asn Ser Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Arg Glu Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
Asp Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ala Val Ile Trp Ser Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Tyr Pro Thr Ser Thr Asp Arg Ser Pro Ala
100 105 110
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Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Leu Ser
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100 105 110
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Ser Leu Lys Ile Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
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Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Val Asn Pro Ala Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ala Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Arg Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Leu Gly Gln Asp His Asn Ser Gly Trp Tyr Thr Tyr Phe His
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atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaacaata ttatagtctt 300
cctctcactt tcggcggagg gaccaagctg gagatcaaac gt 342
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<212> DNA
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<223> SH4-VL-DNA
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aattttatgc tgactcagcc ccactctgtg tcggagtctc cggggaagac cgttaccatc 60
tcctgcaccc gcagcggtgg cagcggggcc gccaactatg tacagtggta ccaacagcgc 120
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ctgcagactg aagacgaggc tgactactac tgtcagtctt atgatagtag taatcacgtg 300
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<211> 360
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH6-VL-DNA
<400> 39
Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly Thr Gly Cys Thr Cys Ala Cys Thr Cys
1 5 10 15
Ala Gly Cys Cys Gly Thr Cys Cys Thr Cys Gly Gly Cys Gly Thr Cys
20 25 30
Cys Thr Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Ala Gly
35 40 45
Ala Gly Gly Gly Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Thr Cys Thr Thr
50 55 60
Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Cys
65 70 75 80
Cys Ala Ala Thr Ala Thr Cys Gly Gly Gly Ala Gly Thr Ala Ala Cys
85 90 95
Ala Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys
100 105 110
Ala Gly Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly Cys
115 120 125
Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys
130 135 140
Ala Thr Cys Thr Ala Cys Thr Thr Thr Gly Ala Thr Thr Ala Thr Cys
145 150 155 160
Gly Ala Cys Gly Thr Cys Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Gly Gly Thr
165 170 175
Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Cys Thr Thr Cys Thr Cys Thr
180 185 190
Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala
195 200 205
Cys Cys Thr Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly
210 215 220
Cys Ala Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly
225 230 235 240
Thr Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Thr Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly
245 250 255
Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys
260 265 270
Ala Thr Gly Gly Gly Ala Thr Gly Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly
275 280 285
Ala Gly Thr Gly Cys Thr Thr Gly Gly Gly Thr Gly Thr Thr Cys Gly
290 295 300
Gly Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr
305 310 315 320
Gly Ala Cys Cys Gly Thr Cys Cys Thr Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys
325 330 335
Cys Thr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Gly
340 345 350
Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Ala
355 360
<210> 40
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH9-VL-DNA
<400> 40
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagaag tgacgttggt ggttataatt atgtctcttg gtaccaacag 120
cacccaggca aagcccccaa actcttaatt tttggggtca atgatcggcc ctcaggggtt 180
tctgatcgct tctctgggtc caggactggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caacctgagg acgaggctga ttattattgc agttcgttta cacgaggcac cactctcctg 300
gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336
<210> 41
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH2-VL-Protein
<400> 41
Leu Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Glu Val Thr Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Ser Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Gly Thr
85 90 95
Leu Leu Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 42
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH8-VL-protein
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 43
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH4-VL-protein
<400> 43
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ala Ala Asn
20 25 30
Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Asp Ser Arg Arg Pro Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Val Asp Thr Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
65 70 75 80
Leu Gln Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser
85 90 95
Ser Asn His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
Gly Leu Gly Gly Leu Val Asp Tyr Lys
115 120
<210> 44
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH6-VL-protein
<400> 44
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Ala Ser Ser Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Ile Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Phe Asp Tyr Arg Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Thr Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Gly Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Ala Trp Val Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly
100 105 110
Leu Gly Gly Leu Val Asp Tyr Lys
115 120
<210> 45
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SH9-VL-Protein
<400> 45
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Arg Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Phe Gly Val Asn Asp Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Arg Gly
85 90 95
Thr Thr Leu Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 46
<211> 204
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 S-RBD的氨基酸序列
<400> 46
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe
1 5 10 15
Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala
20 25 30
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys
35 40 45
Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
65 70 75 80
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
85 90 95
Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
115 120 125
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala
130 135 140
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro
165 170 175
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr
180 185 190
Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys
195 200
<210> 47
<211> 398
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 S-RBD的核苷酸序列
<400> 47
atcaccaatc tgtgcccttt cggcgaggtg ttcaatgcca ccagattcgc cagcgtgtac 60
gcatggaacc gcaagcggat aagcaattgc gtggccgact acagcgtgct gtacaatagc 120
gccagcttca gcaccttcaa atgttatggt gtttcgccaa caaagctgaa tgacctgtgc 180
ttcaccaatg tgtacgccga cagcttcgtg atcagaggcg acgaggtgag acagatcgcg 240
ccagggcaga ccggcaagat cgccgactac aattacaagc tgcctgacga cttcaccggc 300
tgcgtgatcg cgtggaactc taacaacctg gactcgaaag ttggaggcaa ttacaattac 360
ctgtacagac tgttcagaaa gagcaatctg aagccttt 398

Claims (32)

1.一种抗新冠病毒的抗体，其特征在于，其包含VL和VH，
所述VH包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别如SEQ ID NO:1、6、11所示的氨基酸序列，所述VL包括VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别如SEQ ID NO:16、EVT、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；或，所述VH包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别如SEQ ID NO:2、7、12所示的氨基酸序列，所述VL包括VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别如SEQ ID NO:17、WAS、SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；或，所述VH包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别如SEQ ID NO:3、8、13所示的氨基酸序列，所述VL包括VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别如SEQ ID NO:18、EDS、SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；或，所述VH包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别如SEQID NO:4、9、14所示的氨基酸序列，所述VL包括VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别如SEQ IDNO:19、FDY、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；或，所述VH包括VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别如SEQ ID NO:5、10、15所示的氨基酸序列，所述VL包括VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别如SEQ ID NO:20、GVN、SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗新冠病毒的抗体，其特征在于，所述VH还包括重链可变区框架区(VH FWR)，和所述VL还包括轻链可变区框架区(VL FWR)；所述VH FWR为人抗体的重链可变区框架区，所述VL FWR为人抗体的轻链可变区框架区。
3.如权利要求2所述的抗新冠病毒的抗体，其特征在于，
所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示；或，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示；或，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示；或，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示；或，所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗新冠病毒的抗体，其特征在于，所述抗新冠病毒的抗体为全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双特异性抗体、多特异性抗体、重链抗体或单域抗体VHH，或由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。
5.如权利要求4所述的抗新冠病毒的抗体，其特征在于，所述Fv为scFv。
6.如权利要求4所述的抗新冠病毒的抗体，其特征在于，所述抗体为包括抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区的全长抗体。
7.如权利要求6所述的抗新冠病毒的抗体，其特征在于，所述重链恒定区选自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4或其突变，所述轻链恒定区选自人源抗体的κ链或者λ链或其突变。
8.如权利要求1所述的抗新冠病毒的抗体，其特征在于，所述抗新冠病毒的抗体为抗新冠病毒的刺突蛋白的抗体。
9.如权利要求8所述的抗新冠病毒的抗体，其特征在于，所述抗新冠病毒的抗体为抗新冠病毒的刺突蛋白RBD的抗体。
10.如权利要求9所述的抗新冠病毒的抗体，其特征在于，所述新冠病毒的刺突蛋白RBD的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示。
11.如权利要求10所述的抗新冠病毒的抗体，其特征在于，所述新冠病毒的刺突蛋白RBD的核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示。
12.一种分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸编码如权利要求1-11中任一项所述的抗新冠病毒的抗体。
13.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求12所述的分离的核酸。
14.如权利要求13所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。
15.如权利要求14所述的重组表达载体，其特征在于，所述病毒载体为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
16.一种转化体，其特征在于，所述转化体为在宿主细胞中包含如权利要求13-15中任一项所述的重组表达载体。
17.如权利要求16所述的转化体，其特征在于，所述宿主细胞为E.coli细胞、CHO细胞或人293细胞。
18.如权利要求17所述的转化体，其特征在于，所述E.coli细胞为TG1或BL21细胞，所述CHO细胞为CHO-K1细胞，所述人293细胞为HEK293T或HEK293F细胞。
19.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含如权利要求1-11中任一项所述的抗新冠病毒的抗体。
20.一种基因修饰的细胞，其特征在于，包含如权利要求19所述的嵌合抗原受体。
21.如权利要求20所述的基因修饰的细胞，其特征在于，所述基因修饰的细胞为真核细胞。
22.如权利要求21所述的基因修饰的细胞，其特征在于，所述真核细胞为分离的人细胞。
23.如权利要求22所述的基因修饰的细胞，其特征在于，所述分离的人细胞为免疫细胞。
24.如权利要求23所述的基因修饰的细胞，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞，或NK细胞。
25.一种抗新冠病毒的抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：培养如权利要求16-18中任一项所述的转化体，并从培养物中获得抗新冠病毒的抗体。
26.一种抗体药物偶联物，其特征在于，所述抗体药物偶联物包含细胞毒性剂，以及如权利要求1-11中任一项所述的抗新冠病毒的抗体。
27.如权利要求26所述的抗体药物偶联物，其特征在于，所述细胞毒性剂为MMAF或MMAE。
28.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1-11中任一项所述的抗新冠病毒的抗体或如权利要求26或27所述的抗体药物偶联物，和药学上可接受的载体。
29.如权利要求28所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为液体剂型、气体剂型、固体剂型和半固体剂型。
30.如权利要求1-11中任一项所述的抗新冠病毒的抗体、如权利要求19所述的嵌合抗原受体、如权利要求20-24中任一项所述的基因修饰的细胞、如权利要求26或27所述的抗体药物偶联物或如权利要求28或29所述的药物组合物在制备抗新冠病毒的药物中的应用。
31.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-11中任一项所述的抗新冠病毒的抗体、如权利要求19所述的嵌合抗原受体、如权利要求20-24中任一项所述的基因修饰的细胞、如权利要求26所述的抗体药物偶联物或如权利要求28或29所述的药物组合物。
32.如权利要求31所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括(i)施用所述抗体、所述抗体药物偶联物或所述药物组合物的装置；和/或(ii)使用说明。
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