CN115703829A - 针对SARS-CoV-2的单域抗体及其用途 - Google Patents
针对SARS-CoV-2的单域抗体及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本申请本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是冠状病毒(例如SARS‑CoV‑2)的诊断、预防和治疗领域。具体而言，本发明涉及抗冠状病毒的单域抗体，以及所述单域抗体的用途。本发明的抗体可用于诊断、预防和/或治疗冠状病毒感染和/或由所述感染引起的疾病。
Description
技术领域
本申请本发明涉及免疫学领域和分子病毒学领域，特别是冠状病毒(例如SARS-CoV-2)的诊断、预防和治疗领域。具体而言，本发明涉及抗冠状病毒的单域抗体，以及所述单域抗体的用途。本发明的抗体可用于诊断、预防和/或治疗冠状病毒感染和/或由所述感染引起的疾病。
背景技术
冠状病毒(coronavirus)感染可导致人类发生呼吸系统疾病，轻症冠状病毒感染可导致流感样症状，重症感染则可发展为严重病毒性肺炎,威胁人类生命健康。冠状病毒可同时感染人类与动物，一些动物源冠状病毒如果突破宿主屏障感染人类，可能在人群中快速扩散并导致严重疾病。
SARS-CoV-2是一类呈球形、表面有突起、电镜下观察形似皇冠的病毒，病毒基因为连续线性单链RNA，直径在75-160nm。SARS-CoV-2是目前发现的可以感染人类的冠状病毒科中的第七个成员。其他6个成员分别为：HCoV 229E、HCoV NL63、HCoV OC43、HCoV HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。SARS-CoV-2与SARS-CoV和MERS-CoV同属于β冠状病毒。SARS-CoV-2含有棘突糖蛋白(Spike蛋白，S蛋白)。Spike蛋白是一类很大的三聚体跨膜糖蛋白，有着大量糖基化的修饰，其在病毒表面形成特殊的花冠结构。它首先结合细胞表面的受体，然后发生“变形”，顺势将病毒包膜与细胞膜融为一体，从而将病毒内的遗传物质注入细胞，达到感染细胞的目的。Spike蛋白是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基S1和S2。其中S1主要包含有受体结合区(RBD)，负责识别细胞的受体。S2含有膜融合过程所需的基本元件。
目前，尚无批准用于预防或治疗SARS-CoV-2感染的特效药物。因此，如果研制一种能够特异性中和SARS-CoV-2的抗体，用于COVID-19的短期预防和有效治疗，这对我国乃至全球防治COVID-19具有重要意义。
发明内容
本申请的发明人经过了深入的研究和创造性的劳动，分别获得了能够特异性中和SARS-CoV-2的驼源单域抗体。本发明的抗体具有用于预防和/或治疗冠状病毒感染或由冠状病毒感染所导致的疾病的潜力，具有重大的临床价值。
在第一方面，本申请提供了一种特异性结合SARS-CoV-2的S蛋白的受体结合区(RBD)的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
(1)下述3个互补决定区(CDRs)：
序列为SEQ ID NO：1或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：2与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：3与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3；或，
(2)下述3个互补决定区(CDRs)：
序列为SEQ ID NO：10或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：11与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：12与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3；或，
(3)下述3个互补决定区(CDRs)：
序列为SEQ ID NO：19或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：20与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：21与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3。
在某些实施方案中，(1)-(3)任一项中所述的置换为保守置换。
如前所述的单域抗体或其抗原结合片段，所述单域抗体或其抗原结合片段进一步包含构架区(FRs)。在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含来自人或驼的FRs。
在某些实施方案中，所述单域抗体由FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4组成。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段是驼源的VHH或人源化的VHH。
如前所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下述的序列：
(1)SEQ ID NO：8所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
(2)SEQ ID NO：17所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；或，
(3)SEQ ID NO：26所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在另一方面，本申请提供了一种多特异性抗体，其包含如前所述的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体或四特异性抗体。
在某些实施方案中，所述另外的抗体或其片段、或抗体类似物具有与肿瘤特异性抗原(TSA)，肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)，T细胞衔接器(T cellengager)分子，肿瘤免疫相关分子或自身免疫调节相关分子中至少一个分子或抗原的结合特异性。
在某些实施方案中，所述另外的抗体或其片段、或抗体类似物具有与PD-1、PDL-1、CD19，CD20，CTLA4，IL6，IL6R或TNFα中至少一个的抗原结合特异性。
在另一方面，本申请提供了一种融合蛋白，其包含如前所述的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的生物活性多肽。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽是具有治疗活性、结合活性或酶活性的多肽或蛋白。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽任选地通过接头连接至所述单域抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含一个或多个(例如，两个)所述单域抗体或其抗原结合片段以及一个或多个(例如，两个)所述另外的生物活性多肽；其中，所述多个单域抗体或其抗原结合片段是相同或不同的，所述多个另外的生物活性多肽是相同或不同的。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段以及一个所述另外的生物活性多肽。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段以及两个所述另外的生物活性多肽。
在某些实施方案中，所述两个另外的生物活性多肽任选地通过linker分别连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端。
在另一方面，本申请提供了一种缀合物，其包含如前所述的单域抗体或其抗原结合片段以及连接于所述单域抗体或其抗原结合片段的化疗药物、放射性药品或显影剂。
在另一方面，本申请提供了一种分离的核酸分子，其编码如前所述的单域抗体或其抗原结合片段、如前所述的多特异性抗体、或如前所述的融合蛋白。根据本领域已知的密码子简并性，在某些实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列是可以根据密码子简并性进行替换的。在某些实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列是密码子最优化的。
在另一方面，本申请提供了一种载体，包括编码如前所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，所述载体为克隆载体或表达载体。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，慢病毒等。在某些实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或融合蛋白。
在另一方面，本申请提供了一种宿主细胞，其包含如前所述的分离的核酸分子和/或如前所述的载体。宿主细胞可以是真核细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞)或原核细胞(例如大肠杆菌)。合适的真核细胞包括但不限于NS0细胞、Vero细胞、Hela细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞、和MDCKII细胞。
在另一方面，本申请提供了一种制备如前所述的单域抗体或其抗原结合片段、如前所述的多特异性抗体、或如前所述的融合蛋白的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养如前所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、或融合蛋白。
本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto etal.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inHudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。
在另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含如前所述的单域抗体或其抗原结合片段、如前所述的多特异性抗体、如前所述的融合蛋白、如前所述的缀合物、如前所述的分离的核酸分子、如前所述的载体或如前所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在另一方面，本申请提供了一种试剂盒，其包含如前所述的单域抗体或其抗原结合片段、如前所述的多特异性抗体、如前所述的融合蛋白、如前所述的缀合物、如前所述的分离的核酸分子、如前所述的载体、如前所述的宿主细胞或如前所述的药物组合物，以及任选地使用说明书。
在另一方面，本申请提供了一种用于中和样品中冠状病毒的毒力的方法，其包括，将包含冠状病毒的样品与如前所述的单域抗体或其抗原结合片段、如前所述的多特异性抗体接触。
在某些实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。
在另一方面，本申请提供了一种用于检测冠状病毒在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用如前所述的抗体或其抗原结合片段或如前所述的缀合物。
在某些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
在某些实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2，所述方法包括：使用如前所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段任选地包含可检测的标记。
如前所述的双特异性抗体，或如前所述的免疫缀合物在试剂盒中的用途，所述试剂盒用于中和样品中冠状病毒的毒力的方法，或者，用于检测冠状病毒在样品中的存在或其水平的方法。
如前所述的双特异性抗体，或如前所述的免疫缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中预防和/治疗由SARS-CoV-2引起的疾病。
在某些实施方案中，药物还包含另外的药学活性剂。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)”，旧称为“新型冠状病毒”或“2019-nCov”，属于其β冠状病毒属，为含包膜的单链正义RNA病毒。SARS-CoV-2的基因组序列是本领域技术人员已知的，可参见例如GenBank：MN908947。SARS-CoV-2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(S)、整合膜蛋白(M)和膜蛋白(E)。SARS-CoV-2的受体与SARS-CoV一样，均是通过S蛋白上的受体结合结构域(Receptor binding domain,RBD)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ACE2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞，在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。
如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”和“COVID-19”是指，因SARS-CoV-2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用。“抗体”包括完整的单克隆抗体，单域抗体，重链抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体，三特异性抗体)，以及有所需要的生物活性的抗体片段(例如抗原结合片段)。基本的四链抗体通常是指由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的四异聚体糖蛋白。每条重链和轻链具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链和轻链在各自的N-末端具有可变结构域(VH和VL)。各重链/轻链对的可变结构域分别形成抗原结合部位。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。抗体的种类，结构，生物学活性，制备方法参见Fundamental Immunology(William E.Paul,7thEdition,LWW,2012)；Antibody Engineering Springer Lab Manual(Roland Kontermann,Stefan Dübel,ISBN978-3-662-04605-0(eBook))；Schiel JE,Davis DL,Borisov OV,State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic MonoclonalAntibody CHaracteriazation Volume 1.Monoclonal Antibody Therapeutics:Structure,Function,and Regulatory Space(American Chemical Society,2014)。抗原结合片段是能够保留特异性抗原的能力的抗体片段，其非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体、结构域抗体或单域抗体的抗原结合片段，这些抗原结合片段包含足以赋予特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。这些氨基酸残基的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefrancetal.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语“驼源抗体”是指，经免疫接种或抗原入侵的骆驼科(Camelidae)动物(包括骆驼(Camel)、羊驼(Alpaca)和大羊驼(L.glama))所产生的针对该抗原的抗体。本领域技术人员已知，在骆驼科动物所产生的抗体中存在缺失轻链的“重链抗体”(heavy-chain antibody,HCAb)，这种抗体只包含一个重链可变区(variable domainof heavy chain of HCAb,VHH)和两个常规的CH2与CH3区，并且单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，VHH是目前己知的可结合目标抗原的最小单位。
如本文中所使用的，术语“单域抗体(single domain antibody，sdAb)”、“结构域抗体”与“纳米抗体(nanobody)”可互换使用，其是指由抗体中单个可变结构域(例如重链可变区)所组成的抗体片段。典型地，单域抗体、结构域抗体或纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，所述4个构架区分别为FR1-FR4，所述3个互补性决定区分别为CDR1-CDR3。
在某些实施方案中，本发明的单域抗体可以具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。在某些实施方案中，所述单域抗体是驼源VHH、人源化的VHH或驼源化的VH(例如人VH的驼源化)。所述驼源VHH、人源化的VHH或驼源化的VH包含有利于用作功能性抗原结合的结构域或蛋白。这些抗体不需要轻链可变区即可以高亲和力和特异性与抗原结合。与重链和轻链组成的抗体相比，纳米抗体可溶度高，对热、pH、蛋白酶和其它变形剂稳定度高，只需单链表达便于大规模生产。
如本文中所使用的，术语“多特异性抗体”是指具有多种不同抗原结合特异性的抗体，包括例如：双特异性抗体,三特异性抗体和四特异性抗体。“双特异性抗体”是指，具有两种不同抗原结合特异性的抗体，其由第一抗体(或其片段)和第二抗体(或其片段)或抗体类似物通过偶联臂所形成的偶联物，偶联的方式包括但不限于化学反应、基因融合和酶促。三特异性抗体是具有三种不同抗原结合特异性的抗体，四特异性抗体是具有四种不同抗原结合特异性的抗体。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)或半最大效应浓度(EC50)表示。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、缓解症状(无论部分或全部)、缓解或改善预后、降低或抑制疾病复发等，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
发明的有益效果
本发明提供了中和SARS-CoV-2的单域抗体。具体而言，这些单域抗体与SARS-CoV-2的S蛋白RBD区域上的表位结合并中和SARS-CoV-2。本发明的抗体能够抑制SARS-CoV-2的RBD蛋白与受体ACE2的结合。因此，本发明的抗体可用于诊断、预防和/或治疗冠状病毒感染和/或由所述感染引起的疾病。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了重组蛋白RBD-mFc的SDS-PAGE电泳图。
图2显示了抗SARS-CoV-2纳米抗体的基因钓取电泳图。
图3显示了噬菌体展示SARS-CoV-2纳米抗体文库的库容测定结果。
图4显示了测序方法展示的SARS-CoV-2纳米抗体文库的目的基因VHH成功插入的氨基酸序列。
图5显示了噬菌体展示技术筛选SARS-CoV-2特异性纳米抗体噬菌体富集的结果。
图6显示了噬菌体水平鉴定的VHH的阳性克隆与RBD-mFc和mFC的结合能力的检测结果。
图7显示了纳米抗体的SDS-PAGE电泳图。
图8显示了纳米抗体与RBD结合活性的ELISA检测结果。
图9显示了纳米抗体与SARS-CoV-2受体结合区蛋白RBD三聚体strimer反应活性的检测结果。
图10显示了纳米抗体在SARS-CoV2 VSVpp假病毒感染模型中的中和活性测定结果。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
实施例1.抗SARS-CoV-2RBD蛋白的驼源纳米抗体的制备
1.1 SARS-CoV-2受体结合区RBD蛋白的制备及活性鉴定：
SARS-CoV-2受体结合区RBD-mFc蛋白为自行表达制备。参考SARS-CoV2-2全基因序列(MN908947.3)将SARS-CoV2-2 spike蛋白膜外区全长氨基酸序列按人类密码子偏好性进行优化获得编码核酸序列。将编码SARS-CoV2的RBD蛋白的核苷酸序列连接到真核表达质粒载体ptt5 mFc(生工，GN201916320)，该载体含有编码mFc标签的核苷酸序列。把构建好的重组质粒转染至ExpiCHO细胞(购自Thermofisher公司)进行表达纯化。SDS-PAGE电泳结果显示成功表达纯化得到了RBD-mFc蛋白(图1)，大小约60KDa。
1.2 SARS-CoV-2-纳米抗体免疫文库构建及筛选
利用RBD-mFc蛋白，采用皮下多点注射的方式对一只健康成年羊驼进行免疫。免疫结束后，抽取羊驼外周血，分离total RNA，经反转录和PCR扩增出纳米抗体(VHH)基因(图2)，将VHH基因克隆至噬菌体载体Pcgmt(实验室保留)上，转化至ER2738宿主细胞(购自Lucigen公司)中构建成噬菌体展示文库。经检测，构建的文库库容为2.67×107CFU(图3)。随机挑选30个单克隆测序，结果显示成功插入29个(图4)，文库插入率为96.7％。随后利用噬菌体展示技术进行文库筛选，经1轮“吸附-洗涤-富集”，共挑取2359个单克隆进行Elisa检测，结果显示阳性克隆128个，VHH片段的总阳性克隆率约5％。P0代的阳性率为1％，P1代的阳性率为9％(图5)。其中噬菌体阳性单克隆Nb-5-cov、Nb-4-cov、Nb-6-cov噬菌体水平与RBD-mFC具有良好的结合能力(图6)。
提取噬菌体阳性单克隆Nb-5-cov、Nb-4-cov和Nb-6-cov的质粒，并进行测序，获得三种抗体Nb-5-cov、Nb-4-cov和Nb-6-cov的CDR序列和可变区序列，具体如表1所示。
1.3抗SARS-CoV-2受体结合区RBD蛋白的驼源纳米抗体的真核表达
将以上3株序列不同的纳米抗体基因克隆至ptt5 hIgG1载体上，然后将重组质粒与转染试剂PEI 1:2混合后，转染至HEK293F细胞；37℃，5％CO2摇床培养箱中培养6天；随后收集细胞上清，采用Protein A进行纯化，并采用紫外分光测取浓度。经SDS-PAGE检测表达纯化的纳米抗体纯度大于90％(图7)，可用于后续功能活性研究，存放于-80℃备用。
实施例2.抗SARS-CoV-2RBD蛋白的纳米抗体与SARS-CoV-2RBD蛋白的反应活性
2.1反应板的制备
分别将RBD-mFc蛋白、RBD-his蛋白、mFc蛋白用50mM CB缓冲液稀释，终浓度为2μg/mL；在96孔ELISA板每孔中加入100μL的包被液，2～8℃包被16～24h后再37℃包被2h；用PBST洗涤液洗涤1次；然后每孔加入200μL的封闭液，放入37℃封闭2h；弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。
2.2 RBD纳米抗体Nb-4-cov、Nb-5-cov、Nb-6-cov的ELISA检测
取纳米抗体Nb-4-cov、Nb-5-cov、Nb-6-cov，以20mM PBS缓冲液稀释至终浓度为1μg/mL。取已包被RBD-mFc蛋白和RBD-his蛋白、mFc蛋白的ELISA板，每孔加入100μL已稀释的样品，置于37℃温箱反应60min。将ELISA板用PBST洗液洗涤5遍，每孔加入100μLHRP标记的羊抗人IgG反应液，置于37℃温箱反应30min。完成酶标记物反应步骤后，将ELISA板用PBST洗液洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂各50μL，置于37℃温箱反应15min。完成显色反应步骤后，在反应完的ELISA板中每孔加入终止液50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。结果显示纳米抗体Nb-4-cov，Nb-5-cov和Nb-6-cov具有RBD特异的结合活性(图8)。
实施例3.抗SARS-CoV-2RBD蛋白的纳米抗体与SARS-CoV-2受体结合区RBD三聚体
strimer的反应活性
3.1反应板的制备
将strimer蛋白用50mM CB缓冲液稀释，终浓度为2μg/mL；在96孔ELISA板每孔中加入100μL的包被液，2～8℃包被16～24h后再37℃包被2h；用PBST洗涤液洗涤1次；然后每孔加入200μL的封闭液，放入37℃封闭2h；弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。
3.2 ELISA检测
取纳米抗体Nb-4-cov、Nb-5-cov、Nb-6-cov，以20mM PBS缓冲液从1μg/mL为起始浓度开始10倍梯度稀释，共稀释6个梯度。取已包被strimer蛋白的ELISA板，每孔加入100μL已稀释的样品，置于37℃温箱反应60min。将ELISA板用PBST洗液洗涤5遍，每孔加入100μL HRP标记的羊抗人IgG反应液，置于37℃温箱反应30min。完成酶标记物反应步骤后，将ELISA板用PBST洗液洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂各50μL，置于37℃温箱反应15min。完成显色反应步骤后，在反应完的ELISA板中每孔加入终止液50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。结果显示(图9)，纳米抗体Nb-6-cov与strimer的EC50数值为0.02972ug/ml，具有良好的结合活性。
实施例4.抗SARS-CoV-2
RBD蛋白纳米抗体在SARS-CoV2
VSVpp假病毒感染模型中
和能力分析
SARS-CoV2-VSVpp假病毒中和方法参考文献方法进行(doi:https://doi.org/10.1101/2020.04.08.026948)。主要实验过程简述如下，为构建携带SARS-CoV-2spike蛋白的VSV假病毒，将SARS-CoV-2的spike基因(序列来源GenBank：MN908947.3)的C末端截短18个氨基酸的SARS-CoV-2的spike基因克隆到真核表达载体pCAG中，获得pCAG-nCoVSde18。将质粒pCAG-nCoVSde18转染到Vero-E6中。转染48h后，将VSVdG-EGFP-G(Addgene，31842)病毒接种到表达SARS-CoV-2Sde18截短蛋白的细胞中，孵育1h。然后去除上清液中的VSVdG-EGFP-G病毒，并加入抗VSV-G大鼠血清以阻断残留的VSVdG-EGFP-G的感染。子代病毒将携带SARS-CoV-2 Sde18截短蛋白，获得假病毒VSV-SARS-CoV2 VSVpp。VSVdG-EGFP-G感染后24h后，收集细胞上清，然后离心并过滤(孔径为0.45-μm，Millipore，SLHP033RB)以去除细胞碎片，并在-80℃下保存备用。通过梯度稀释的上清感染BHK21-hACE2后GFP阳性细胞的数目来确定病毒滴度。通过PiggyBac转座子系统在BHK21细胞中整合hACE2的基因。将含有hACE2基因的转座子载体(SBI system biosciences，PB514B-2)和转座酶质粒共转染到BHK21细胞中，通过嘌呤霉素抗性和红色荧光进行筛选，获得稳定表达hACE2的细胞BHK21-hACE2。
将抗体纳米抗体Nb-4-cov、Nb-5-cov、Nb-6-cov稀释到75μg/mL作为梯度1，4倍往下梯度稀释，共6个梯度，梯度稀释的抗体与稀释的SARS-CoV2 VSVpp病毒(MOI＝0.05)混合，并在37℃孵育1h。所有样品和病毒均用10％FBS-DMEM稀释。将80μL混合物加入预先铺板的BHK21-hACE2细胞中。孵育12h后，采用基于转盘共聚焦的高内涵成像系统(Opera phenix或Operetta CLS，购自Perkinelmer公司)对感染后细胞进行荧光成像。完成后采用Colμmbμs图像管理分析软件对所获荧光图像进行定量分析检测绿色荧光阳性细胞数量。计算出与未处理的对照孔相比，抗体处理组的GFP阳性细胞数量减少(％)，计算抑制率。
结果如图10所示，纳米抗体Nb-6-cov的IC50为0.69ng/mL，其中Nb-6-cov具有较强中和效果。
综上所述，本发明制备获得的抗SARS-CoV-2纳米抗体(Nb-4-cov纳米抗体、Nb-5-cov纳米抗体和Nb-6-cov纳米抗体)对人RBD抗原具有高亲和力结合，同时Nb-6-cov具有强的假病毒中和活性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学；养生堂有限公司
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<220>
<223> Nb-4-cov FR3
<400> 6
Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-4-cov FR4
<400> 7
Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 124
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-4-cov VHH
<400> 8
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Phe Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Ser Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ala Ser Asp Gly Ala Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Asp Ile Thr Ile Pro Val Ala Pro Thr Ser Ser His Gly Met Ala
100 105 110
Ile Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 372
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 编码Nb-4-cov VHH的核苷酸序列
<400> 9
cagttgcagc tcgtggagtc tggaggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaag cttcttcagt atcaatgcca tgggctggtc ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcagct attgctagtg atggtgccac attctatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgacgacacg gccgtctatt actgtaatgc agatattaca 300
ataccagtag cccctacgtc aagccacggc atggccatct ggggcaaagg gacccaggtc 360
actgtctcct ca 372
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-5-cov CDR1
<400> 10
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-5-cov CDR2
<400> 11
Ile Asn Ser Gly Ser Ser Ile Thr
1 5
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-5-cov CDR3
<400> 12
Ala Lys Ser Gly Ser Asn Leu Phe Leu Phe Arg Asp Gly Met Asp Phe
1 5 10 15
<210> 13
<211> 25
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-5-cov FR1
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-5-cov FR2
<400> 14
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10 15
Asn
<210> 15
<211> 38
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-5-cov FR3
<400> 15
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-5-cov FR4
<400> 16
Trp Gly Lys Gly Thr Leu Gly Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 123
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-5-cov VHH
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asn Ile Asn Ser Gly Ser Ser Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Gly Ser Asn Leu Phe Leu Phe Arg Asp Gly Met Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Lys Gly Thr Leu Gly Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 369
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 编码Nb-5-cov VHH的核苷酸序列
<400> 18
caggtgcagc tggtagagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctgaggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatgcca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ggctcgagtg ggtctcaaat attaatagtg gtagtagtat cacgtactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgtgt attactgtgc aaaatcaggt 300
tctaatctat tcctatttcg ggacggcatg gacttctggg gcaaaggcac cctgggcacc 360
gtgtcctca 369
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-6-cov CDR1
<400> 19
Gly Arg Thr Phe Ser Arg Tyr Phe
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-6-cov CDR2
<400> 20
Ile Thr Trp Ser Gly Asp Glu Thr
1 5
<210> 21
<211> 18
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-6-cov CDR3
<400> 21
Ala Ala Asp Phe Gly His Ser Tyr Tyr Tyr Thr Arg Ala Ser Glu Tyr
1 5 10 15
Glu Phe
<210> 22
<211> 25
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-6-cov FR1
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-6-cov FR2
<400> 23
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala
1 5 10 15
Cys
<210> 24
<211> 38
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-6-cov FR3
<400> 24
Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asp Thr Val Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-6-cov FR4
<400> 25
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 26
<211> 125
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Nb-6-cov VHH
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Phe Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Cys Ile Thr Trp Ser Gly Asp Glu Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Phe Gly His Ser Tyr Tyr Tyr Thr Arg Ala Ser Glu Tyr
100 105 110
Glu Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 27
<211> 375
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 编码Nb-6-cov VHH的核苷酸序列
<400> 27
caggtgcagc tggtagagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtgcgg cctctggacg caccttcagt aggtatttca tgggctggtt ccgccaggct 120
ccaggaaagg agcgtgaatt tgtagcatgt attacgtgga gtggtgatga gacatattat 180
acagactccg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagga cacggtgtat 240
ctacaaatgg acagcctgaa acctgaggac acggccattt attactgtgc agcagatttc 300
ggtcatagtt actactacac tcgcgcaagc gagtatgaat tctggggcca ggggacccag 360
gtcaccgtct cctca 375
Claims (14)
1.特异性结合SARS-CoV-2的S蛋白的受体结合区(RBD)的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
(1)下述3个互补决定区(CDRs)：
序列为SEQ ID NO：1或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：2与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：3与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3；或，
(2)下述3个互补决定区(CDRs)：
序列为SEQ ID NO：10或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：11与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：12与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3；或，
(3)下述3个互补决定区(CDRs)：
序列为SEQ ID NO：19或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：20与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：21与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3；
优选地，(1)-(3)任一项中所述的置换为保守置换。
2.权利要求1所述的单域抗体或其抗原结合片段，所述单域抗体或其抗原结合片段进一步包含构架区(FRs)；优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段包含来自人或驼的FRs；
优选地，所述单域抗体由FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4组成；
优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段是驼源的VHH或人源化的VHH。
3.权利要求1或2所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下述的序列：
(1)SEQ ID NO：8所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
(2)SEQ ID NO：17所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；或，
(3)SEQ ID NO：26所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
4.多特异性抗体，其包含权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；
优选地，所述多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体或四特异性抗体；
可选地，所述另外的抗体或其片段、或抗体类似物具有与肿瘤特异性抗原(TSA)，肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)，T细胞衔接器(T cell engager)分子，肿瘤免疫相关分子或自身免疫调节相关分子中至少一个分子或抗原的结合特异性；
优选地，所述另外的抗体或其片段、或抗体类似物具有与PD-1、PDL-1、CD19，CD20，CTLA4，IL6，IL6R或TNFα中至少一个的抗原结合特异性。
5.融合蛋白，其包含权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的生物活性多肽；
优选地，所述另外的生物活性多肽是具有治疗活性、结合活性或酶活性的多肽或蛋白；
优选地，所述另外的生物活性多肽任选地通过接头连接至所述单域抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端；
优选地，所述融合蛋白包含一个或多个(例如，两个)所述单域抗体或其抗原结合片段以及一个或多个(例如，两个)所述另外的生物活性多肽；其中，所述多个单域抗体或其抗原结合片段是相同或不同的，所述多个另外的生物活性多肽是相同或不同的；
优选地，所述融合蛋白包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段以及一个所述另外的生物活性多肽；
优选地，所述融合蛋白包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段以及两个所述另外的生物活性多肽；
优选地，所述两个另外的生物活性多肽任选地通过linker分别连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端。
6.缀合物，其包含权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段以及连接于所述单域抗体或其抗原结合片段的化疗药物、放射性药品或显影剂。
7.分离的核酸分子，其编码权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述的多特异性抗体、或权利要求5所述的融合蛋白。
8.载体，包括编码权利要求7所述的分离的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。
9.宿主细胞，其包含权利要求7所述的分离的核酸分子和/或权利要求8所述的载体。
10.制备权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述的多特异性抗体、或权利要求5所述的融合蛋白的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、或融合蛋白。
11.药物组合物，其包含权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述的多特异性抗体、权利要求5所述的融合蛋白、权利要求6所述的缀合物、权利要求7所述的分离的核酸分子、权利要求8所述的载体或权利要求9所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
12.试剂盒，其包含权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述的多特异性抗体、权利要求5所述的融合蛋白、权利要求6所述的缀合物、权利要求7所述的分离的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞或权利要求11所述的药物组合物，以及任选地使用说明书。
13.用于中和样品中冠状病毒的毒力的方法，其包括，将包含冠状病毒的样品与权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求4所述的多特异性抗体接触；
优选地，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。
14.用于检测冠状病毒在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的缀合物；
优选地，所述方法是免疫学检测，例如酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法；
优选地，所述冠状病毒是SARS-CoV-2，所述方法包括：使用权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，所述单域抗体或其抗原结合片段任选地包含可检测的标记。
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