CN112851805A - 一种结合血清白蛋白的蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请属于生物医药技术领域，更具体地，本申请涉及一种结合血清白蛋白的人源化单域抗体以及包含所述单域抗体的多特异性抗体、融合蛋白和缀合物。本申请的人源化单域抗体能够高效结合人血清白蛋白，从而延长与其连接的分子的体内半衰期。本申请的人源化单域抗体及包含所述单域抗体的多特异性抗体、融合蛋白和缀合物可用于制备预防和/或治疗或辅助治疗肿瘤、感染、自身免疫疾病、代谢相关的疾病或发育相关的疾病的药物。

Description

一种结合血清白蛋白的蛋白及其用途
技术领域
本申请属于生物医药技术领域，更具体地，本申请涉及一种结合血清白蛋白的单域抗体以及包含所述单域抗体的多特异性抗体、融合蛋白和缀合物，所述单域抗体能够延长与其连接的活性剂的体内半衰期。
技术背景
大部分蛋白类药物为了达到治疗效果，往往需要多次、高剂量注射，增加了治疗负担，同时降低了患者依从性。因此目前开发了多种蛋白长效化方式，包括对蛋白进行突变修饰，提高蛋白稳定性，避免被蛋白酶识别分解，但突变后易产生免疫原性，降低药物的体内功能；另一种是进行PEG偶联，通过增加蛋白的水合半径，避免被肾脏快速清除，同时可遮蔽部分蛋白酶位点，延缓降解速率，但高分子量的PEG易导致蛋白活性损失，且存在肾脏积累导致肾小球空心化的风险。
本领域迫切需要更优的蛋白长效化技术，并应用于临床药物开发，满足用药需求，提高患者依从性。
发明内容
为解决目前长效化蛋白的难题，特异性结合人血清白蛋白的驼源抗体引起了研究者的关注，该抗体可通过结合人血清白蛋白而实现延长半衰期的作用，且因其分子量小，可避免HSA、Fc等融合蛋白对活性、工艺及药效的不利影响。然而，驼源抗体进入人体后有较强的免疫原性，易产生抗药抗体。
因此，为了降低抗药抗体的产生，提高药物的安全性，需对驼源抗体进行人源化改造。然而，由于供体抗体(例如驼源抗体)的CDR与受体抗体(例如人源抗体)的FR之间的匹配问题，人源化抗体的预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性等)通常低于非人源供体抗体(例如驼源抗体)。对此，尽管本领域的研究人员已对抗体的人源化已取得了一些进展，但是，如何对某一供体抗体进行充分的人源化，以使得所产生的人源化抗体既具有尽可能高的人源化程度，又能够尽可能地保留供体抗体的预期性质，现有技术并没有提供指导。技术人员需要针对具体供体抗体进行摸索、探究和改造，付出大量的创造性劳动才有可能获得，既具有高人源化程度、又保留具体供体抗体的预期性质的人源化抗体。
在本申请中，发明人付出了大量的创造性劳动，对驼源抗体进行了深入的研究和改造，从而开发人源化单域抗体。
本申请的人源化的单域抗体抗体是极为有利的，其不仅保留了(或甚至提高了)亲本驼源单域抗体的功能和性质，例如以很高的亲和力和特异性结合人血清白蛋白，并且具有用于延长与其连接的活性剂的体内半衰期的潜力，而且具有极高的人源化程度，可安全地施用给人受试者，而不引发或较少引发免疫原性反应。此外，本申请的人源化的单域抗体抗体具有以较低成本在微生物表达系统中生产的可能，具有作为长期大剂量需要的慢性疾病治疗药物的的巨大潜力。所以，本申请的抗体具有重大的临床价值。
单域抗体
本申请第一方面，提供了一种人源化的单域抗体或其抗原结合片段，所述单域抗体基本由4个构架区(FRs)和3个互补决定区(CDRs)组成，所述4个构架区分别为FR1-FR4。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述FRs包含：序列为SEQ ID NO:10或17，或与SEQ ID NO:10或17相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1；序列为SEQ ID NO:11或18，或与SEQ ID NO:11或18相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2；序列为SEQ ID NO:12或19，或与SEQ ID NO:12或19相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3；和序列为SEQ ID NO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4；并且，所述FR1-FR4还包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述FRs包含：序列为SEQ ID NO:10或17，或与SEQ ID NO:10或17相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1；序列为SEQ ID NO:11或18，或与SEQ ID NO:11或18相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2；序列为SEQ ID NO:12或19，或与SEQ ID NO:12或19相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3；和序列为SEQ ID NO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4；并且，所述FR1-FR4还包含：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，上述FRs进一步包含选自下列的一个或多个：在位点54上的L或S、在位点96上的A或P、在位点105上的A或T、在位点106上的E或I。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，上述FRs进一步包含：在位点54上的S、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义所述FRs包含：序列为SEQ ID NO:14或20，或与SEQ ID NO:14或20其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1；序列为SEQ ID NO:15或21，或与SEQ ID NO:15或21相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2；序列为SEQ ID NO:16或22，或与SEQ ID NO:16或22相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3；和序列为SEQ ID NO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4；并且，所述FR1-FR4还包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义所述FRs包含：序列为SEQ ID NO:14或20,或与SEQ ID NO:14或20其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1；序列为SEQ ID NO:15或21,或与SEQ ID NO:15或21相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2；序列为SEQ ID NO:16或22,或与SEQ ID NO:16或22相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3；和序列为SEQ ID NO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4；并且，所述FR1-FR4还包含：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，上述FRs进一步包含选自下列的一个或多个：在位点49上的L或S、在位点84上的A或P、在位点93上的A或T、在位点94上的E或I。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，上述FRs包含选自下列的一个或多个：在位点49上的S、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I。
在某些实施方案中，根据IMGT或Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E或Q。在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E。
本申请第二方面，提供了一种特异性结合血清白蛋白的单域抗体或其抗原结合片段，所述单域抗体基本由4个构架区(FRs)和3个互补决定区(CDRs)组成，所述4个构架区分别为FR1-FR4，所述3个互补决定区分别为CDR1-CDR3，所述抗原结合片段包含该单域抗体的至少一部分，该部分足以赋予该片段特异性结合血清白蛋白的能力。所述单域抗体或其抗原结合片段特异性结合人血清白蛋白。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
下述3个互补决定区(CDRs)：序列为SEQ ID NO：4的CDR1，序列为SEQ ID NO：5的CDR2，序列为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：37的CDR3；以及，
下述4个构架区(FRs)：序列为SEQ ID NO:10或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1，序列为SEQ ID NO:11或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2，序列为SEQ ID NO:12或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3，序列为SEQ ID NO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4；
并且，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L。
在某些实施方案中，FR1为SEQ ID NO:10或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换(例如1个，2个或3个氨基酸的置换)的序列，FR2为SEQ ID NO:11或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换(例如1个，2个或3个氨基酸的置换)的序列，FR3为SEQ ID NO:12或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换(例如1个，2个或3个氨基酸的置换)的序列，FR4为SEQID NO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换(例如1个，2个或3个氨基酸的置换)的序列；
并且，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、和在位点123上的L。
在某些实施方案中，以上任一实施方案中所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
下述3个互补决定区(CDRs)：序列为SEQ ID NO：7的CDR1，序列为SEQ ID NO：8的CDR2，序列为SEQ ID NO：9的CDR3；以及，
下述4个构架区(FRs)：序列为SEQ ID NO:14或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1，序列为SEQ ID NO:15或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2，序列为SEQ ID NO:16或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3，序列为SEQ ID NO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4；
并且，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L。
在某些实施方案中，FR1为SEQ ID NO:14或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换(例如1个，2个或3个氨基酸的置换)的序列，FR2为SEQ ID NO:15或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换(例如1个，2个或3个氨基酸的置换)的序列，FR3为SEQ ID NO:16或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换(例如1个，2个或3个氨基酸的置换)的序列，FR4为SEQID NO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换(例如1个，2个或3个氨基酸的置换)的序列；
并且，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、和在位点108上的L。
在某些实施方案中，以上任一实施方案中所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中，包含上述置换、缺失或添加的单域抗体或其抗原结合片段保留其来源的单域抗体或其抗原结合片段的降低的针对人的免疫原性和/或特异性结合人血清白蛋白的活性。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点54上的L或S、在位点96上的A或P、在位点105上的A或T、在位点106上的E或I。在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点54上的L或S、在位点96上的A或P、在位点105上的A或T、在位点106上的E或I。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点54上的S、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I。在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点54上的S、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点49上的L或S、在位点84上的A或P、在位点93上的A或T、在位点94上的E或I。在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点49上的L或S、在位点84上的A或P、在位点93上的A或T、在位点94上的E或I。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点49上的S、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I。在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点49上的S、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I。
在某些实施方案中，根据IMGT或Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E或Q。在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E、在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点54上的S、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I、在位点123上的L。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E、在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点49上的S、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I、在位点108上的L。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的Q、在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点54上的S、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I、在位点123上的L。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的Q、在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点49上的S、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I、在位点108上的L。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的Q、在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点54上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点96上的A、在位点105上的A、在位点106上的E、在位点123上的L。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的Q、在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点49上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点84上的A、在位点93上的A、在位点94上的E、在位点108上的L。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，FR1选自SEQ ID NO:10或17，FR2选自SEQ ID NO:11或18，FR3选自SEQ ID NO:12或19，FR4选自SEQ ID NO:13。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，FR1选自SEQ ID NO:14或20，FR2选自SEQ ID NO:15或21，FR3选自SEQ ID NO:16或22，FR4选自SEQ ID NO:13。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：4的CDR1，序列为SEQ ID NO：5的CDR2，序列为SEQ ID NO：6的CDR3；以及，序列为SEQ ID NO:10的FR1，序列为SEQ ID NO:11的FR2，序列为SEQ ID NO:12的FR3，序列为SEQ ID NO:13的FR4。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：7的CDR1，序列为SEQ ID NO：8的CDR2，序列为SEQ ID NO：9的CDR3；以及，序列为SEQ ID NO:14的FR1，序列为SEQ ID NO:15的FR2，序列为SEQ ID NO:16的FR3，序列为SEQ ID NO:13的FR4。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：3所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NO：3相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与SEQ ID NO：3相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)。优选地，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述变体序列为与SEQ ID NO：3相比至少一个CDR和/或至少一个FR具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)。优选地，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述变体序列保留了相比于驼源抗体降低的针对人的免疫原性和/或特异性结合人血清白蛋白的活性。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L。在某些实施方案中，所述变体包含：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L。在某些实施方案中，所述变体包含：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述变体还包含选自下列的一个或多个：在位点54上的S、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I。在某些实施方案中，所述变体还包含：在位点54上的S、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，所述变体自下列的一个或多个：在位点49上的S、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I。在某些实施方案中，所述变体包含：在位点49上的S、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I。
在某些实施方案中，根据IMGT或Kabat编号系统定义，所述变体还包含：在位点1上的E。
在某些示例性实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:3所示的序列。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：4的CDR1，序列为SEQ ID NO：5的CDR2，序列为SEQ ID NO：37的CDR3以及，序列为SEQ ID NO：17的FR1，序列为SEQ ID NO：18的FR2，序列为SEQ ID NO：19的FR3，序列为SEQ ID NO：13的FR4。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：7的CDR1，序列为SEQ ID NO：8的CDR2，序列为SEQ ID NO：9的CDR3；以及，序列为SEQ ID NO：20的FR1，序列为SEQ ID NO：21的FR2，序列为SEQ ID NO：22的FR3，序列为SEQ ID NO：13的FR4。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO：1所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NO：1相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与SEQ ID NO：1相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)。优选地，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述变体序列为与SEQ ID NO：1相比至少一个CDR和/或至少一个FR具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)。优选地，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述变体序列保留了相比于驼源抗体降低的针对人的免疫原性和/或特异性结合人血清白蛋白的活性。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L。在某些实施方案中，所述变体包含：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L。在某些实施方案中，所述变体包含：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点54上的L、在位点96上的A、在位点105上的A、在位点106上的E。在某些实施方案中，所述变体还包含：在位点54上的L、在位点96上的A、在位点105上的A、在位点106上的E。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点49上的L、在位点84上的A、在位点93上的A、在位点94上的E。在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含：在位点49上的L、在位点84上的A、在位点93上的A、在位点94上的E。
在某些实施方案中，根据IMGT或Kabat编号系统定义，所述变体还包含：在位点1上的Q。
在某些示例性实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的序列。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：4的CDR1，序列为SEQ ID NO：5的CDR2，序列为SEQ ID NO：6的CDR3；以及，序列为SEQ ID NO：17的FR1，序列为SEQ ID NO：11的FR2，序列为SEQ ID NO：12的FR3，序列为SEQ ID NO：13的FR4。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID NO：7的CDR1，序列为SEQ ID NO：8的CDR2，序列为SEQ ID NO：9的CDR3；以及，序列为SEQ ID NO：20的FR1，序列为SEQ ID NO：15的FR2，序列为SEQ ID NO：16的FR3，序列为SEQ ID NO：13的FR4。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO：2所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NO：2相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与SEQ ID NO：2相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)。优选地，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述变体序列与SEQ ID NO：2相比至少一个CDR和/或至少一个FR具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)。优选地，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述变体序列保留了相比于驼源抗体降低的针对人的免疫原性和/或特异性结合人血清白蛋白的活性。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L。在某些实施方案中，所述变体包含：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L。在某些实施方案中，所述变体包含：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L。
在某些实施方案中，根据IMGT编号系统定义，所述变体还包含选自下列的一个或多个：在位点54上的S、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I。在某些实施方案中，所述变体还包含：在位点54上的S、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I。
在某些实施方案中，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点49上的S、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I。在某些实施方案中，所述变体包含：在位点49上的S、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I。
在某些实施方案中，根据IMGT或Kabat编号系统定义，所述单变体还包含：在位点1上的Q。
在某些示例性实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:2所示的序列。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段是人源化的VHH。人源化的VHH是指，用在来自于人类抗体的VH结构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换所述天然存在的VHH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，从而获得的单域抗体。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段的V基因所编码的区段的人源化程度不低于79％，例如为80％、85％、90％、93％、95％、97％、或100％。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段的J基因所编码的区段的人源化程度不低于89％，例如为90％、93％、95％、97％、98％、或100％。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段以小于约40nM，例如小于约30nM、20nM、10nM、8nM、5nM、3nM，1nM或更小的EC50结合人血清白蛋白。在某些实施方案中，所述EC50通过ELISA技术测得。
本申请的单域抗体不限于具体的生物来源或具体的制备方法。例如，本申请的单域抗体可以这样获得：(1)通过将天然存在的VHH结构域“人源化”或者通过表达编码这样的人源化VHH结构域的核酸；(2)应用合成或半合成技术制备蛋白、多肽或其它氨基酸序列；(3)通过应用核酸合成技术制备编码单域抗体的核酸，然后表达这样获得的核酸；和/或(4)通过前述的任何组合。
多特异性抗体
本申请第三方面，提供了一种多特异性抗体，其包含本申请第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。
在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有不同于前述单域抗体或其抗原结合片段的结合特异性。在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物不结合血清白蛋白。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段能够延长与其连接的另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物的体内半衰期，体内半衰期的所述延长是相对于如果缺少所述单域抗体或其抗原结合片段时所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物的体内半衰期。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段，以及一个或多个(例如两个)所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中，所述多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物可以具有彼此不同的结合特异性。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体包含一个单域抗体或其抗原结合片段，以及一个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体包含一个单域抗体或其抗原结合片段，以及两个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体或四特异性抗体。
在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有与肿瘤特异性抗原(TSA)，肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA),T细胞衔接器(Tcell engager)分子，肿瘤免疫相关分子或自身免疫调节相关分子中至少一个的分子或抗原结合特异性。
在某些实施方案中，所述肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)包括但不限于：密蛋白，P53,KRAS,NRAS,甲胎蛋白，癌胚抗原，神经节苷脂，黏蛋白。
在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有与一个或多个与肿瘤免疫相关的分子结合的活性，所述与一个或多个与肿瘤免疫相关的分子包括：PD-1，PD-L1，CTLA4，LAG3。
在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有与包括但不限于CD19，CD20的T细胞衔接器(T cell engager)分子中的一个或多个的结合特异性。
在某些优选的实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有与包括但不限于IL6，IL6R，TNFα的自身免疫调节靶点中的一个或多个的抗原结合特异性。
在某些优选的实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有与PD-1、PD-L1、CD19，CD20，CTLA4，IL6，IL6R或TNFα中至少一个的抗原结合特异性。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体，所述双特异是结合“HSA和PD-L1”，“HSA和PD-1”，“HSA和CTLA4”，“HSA和CD19”，“HSA和CD20”，“HSA和IL6”，“HSA和IL6R”或“HSA和TNFα”的特异性。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是三特异性抗体。在某些实施方案中，所述三特异是结合“HSA，PD-1和PD-L1”，“HSA，PD-1和CTLA4”，“HSA，PD-L1和CTLA4”，“HSA，CD19和CD20”，“HSA，IL6R和TNFα”，或，“HSA，IL6和TNFα”的特异性。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是四特异性抗体。在某些实施方案中，所述多特异性抗体的四特异包括结合“HSA，PD-1和PD-L1”，“HSA，PD-1和CTLA4”，“HSA，PD-L1和CTLA4”，“HSA，CD19和CD20”，“HSA，IL6R和TNFα”，或，“HSA，IL6和TNFα”的特异性。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体从其N端至C端具有下列结构：A-L-B或B-L-A，其中：A为本申请的单域抗体或其抗原结合片段，L为接头(linker)或缺失，B为一个或多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中所述多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有结合同一抗原或不同抗原的活性。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体从其N端至C端具有选自下列的结构：B1-L1-A-L2-B2，A-L1-B1-L2-B2，B1-L1-B2-L2-A，其中：A为本申请的单域抗体或其抗原结合片段，L1和L2各自独立地为接头(linker)或缺失，B1和B2各自独立地为一个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中所述B1和B2具有结合同一抗原或不同抗原的活性。
在某些实施方案中，L、L1和L2各自独立地为(G4S)n，其中n选自0-10的整数，L、L1和L2彼此相同或不同。在某些实施方案中，n选自0-6的整数，例如0，1，2，3，4，5或6。在某些实施方案中，L、L1和L2各自独立地选自SEQ ID NO:33或34所示的序列。
在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物选自全长抗体、scFv、单域抗体或抗体类似物。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体，所述双特异性抗体包含一个本申请的单域抗体或其抗原结合片段，以及一个或多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物，所述一个或多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物不与血清白蛋白结合，且所述多个抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有同一抗原结合活性。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体，所述双特异性抗体具有下列结构：N-本申请的单域抗体或其抗原结合片段-(Linker)-一个所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是具有下列结构：N-本申请的单域抗体或其抗原结合片段-(Linker)-多个所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。所述多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物之间任选地由Linker连接。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体具有下列结构：N-多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物-(Linker)-本申请的单域抗体或其抗原结合片段。所述多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物之间任选地由Linker连接。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体，所述双特异性抗体具有下列结构：N-一个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物-(Linker)-本申请的单域抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是三特异性抗体，所述三特异性抗体具有下列结构：N-一个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物-(Linker)-本申请的单域抗体或其抗原结合片段-(Linker)-一个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。
在以上所述的实施方案中，本申请的单域抗体或其抗原结合片段与一个或多个另外的抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端或C端连接。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是三特异性抗体，所述三特异性抗体包含本申请的单域抗体或其抗原结合片段和另外的抗体或其抗原结合片段，所述另外的抗体或其抗原结合片段给与所述的三特异性抗体另外的两种抗原结合活性。所述三特异性抗体的构建可以是灵活的，另外的抗体或其抗原结合片段可以都位于本申请的单域抗体或其抗原结合片段的N端或C端，或各自位于单域抗体或其抗原结合片段的N端或C端，接头的有无，长度和数量也可以根据构建三特异性抗体的目的调整。
在以上所述的实施方案中，所述多特异性抗体具有(G4S)n的linker，其中n选自0-10的整数。在某些实施方案中，n选自0-6的整数，例如0，1，2，3，4，5或6。
在某些实施方案中，上述所述多特异性抗体具有SEQ ID NO:33或34所示的linker。
融合蛋白
本申请第四方面，提供了一种融合蛋白，其包含第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的生物活性多肽。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段能够延长与其连接的另外的生物活性多肽的体内半衰期，体内半衰期的所述延长是相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段时所述另外的生物活性多肽的体内半衰期。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽是具有治疗活性、结合活性或酶活性的多肽或蛋白。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽是另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽直接或通过接头连接至所述单域抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端。
在某些实施方案中，所述接头是(G4S)n，n为大于或等于0的整数。在某些实施方案中，n选自0-6的整数，例如0，1，2，3，4，5或6。在某些实施方案中，所述接头如SEQ ID NO:33或34所示。
在某些实施方案中，所述融合蛋白从其N端至C端具有下列结构：A-L-B或B-L-A，其中：A为本申请的单域抗体或其抗原结合片段，L为接头(linker)或缺失，B为一个或多个另外的生物活性多肽。
在某些实施方案中，所述融合蛋白从其N端至C端具有选自下列的结构：B1-L1-A-L2-B2，A-L1-B1-L2-B2，B1-L1-B2-L2-A，其中：A为本申请的单域抗体或其抗原结合片段，L1和L2各自独立地为接头(linker)或缺失，B1和B2各自独立地为一个另外的生物活性多肽。
在某些实施方案中，L、L1和L2各自独立地为(G4S)n，其中n选自0-10的整数，L、L1和L2彼此相同或不同。在某些实施方案中，n选自0-6的整数，例如0，1，2，3，4，5或6。在某些实施方案中，L、L1和L2各自独立地选自SEQ ID NO:33或34所示的序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含一个或多个(例如，两个)所述单域抗体或其抗原结合片段以及一个或多个(例如，两个)所述另外的生物活性多肽；其中，所述多个单域抗体或其抗原结合片段是相同或不同的，所述多个另外的生物活性多肽是相同或不同的。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段以及一个所述另外的生物活性多肽。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段以及两个所述另外的生物活性多肽。
在某些实施方案中，所述两个另外的生物活性多肽各自直接或通过接头分别连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端。
在某些实施方案中，所述两个另外的生物活性多肽直接或通过接头彼此连接，所述彼此连接的两个另外的生物活性多肽进一步直接或通过接头连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端或C端。
在某些实施方案中，所述两个另外的生物活性多肽各自直接或通过linker连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端和C端，或C端和N端。
在某些实施方案中，所述生物活性多肽选自集落刺激因子(CSF)、G蛋白偶联受体、IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白、人生长激素(GH)、细胞因子结合蛋白、蛋白A、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤抑制子、转移生长因子、α1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、骨刺激蛋白、降钙素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子途径抑制物、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促皮质素释放因子、自体毒素、乳铁蛋白、肌肉生长抑制素、热休克蛋白家族成员(如热休克蛋白70，GP96),或其任意组合。
在某些实施方案中，所述生物活性多肽选自G-CSF、GH、IL-15、IL15RD与IL-15融合蛋白,或其任意组合。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO:3所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NO：3相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与SEQ ID NO：3相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)，并且所述变体序列保留了其所源自的序列的降低的针对人的免疫原性和/或特异性结合人血清白蛋白的活性；并且，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E、在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点54上的S、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I、在位点123上的L；或者，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E、在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点49上的S、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I、在位点108上的L；
并且，所述生物活性多肽选自G-CSF、GH、IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白，或其任意组合。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽选自下列的序列：SEQ ID NO:23所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NO:23相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。所述变体序列保留其所源自的生物活性多肽序列的生物学功能，例如，刺激中性粒细胞生成。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽选自下列的序列：SEQ ID NO:27所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NO:27相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。所述变体序列保留其所源自的生物活性多肽序列的生物学功能，例如，促进人体生长。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽选自下列的序列：SEQ ID NOs:29-31任一项所示的序列或其变体序列，所述变体序列与前述任一项所述的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。所述变体序列保留其所源自的生物活性多肽序列的生物学功能，例如，刺激NK细胞，增强免疫力。
在某些实施方案中，所述融合蛋白具有选自下列的序列：SEQ ID NOs:24、25、26任一项所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NOs:24、25、26任一项所示的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。所述变体序列保留其所源自的序列的生物学功能，例如，相比于驼源抗体降低的针对人的免疫原性、特异性结合人血清白蛋白的活性、以及刺激中性粒细胞生成的活性。
在某些实施方案中，所述融合蛋白具有选自下列的序列：SEQ ID NO:28或38所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NO:28或38相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。所述变体序列保留其所源自的序列的生物学功能，例如，相比于驼源抗体降低的针对人的免疫原性、特异性结合人血清白蛋白的活性、以及促进人体生长的活性。
在某些实施方案中，所述融合蛋白具有选自下列的序列：SEQ ID NO:32所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NO:32相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。所述变体序列保留其所源自的序列的生物学功能，例如，相比于驼源抗体降低的针对人的免疫原性、特异性结合人血清白蛋白的活性、以及刺激NK细胞，增强免疫力的活性。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段和G-CSF(例如，SEQ ID NO:23所示的G-CSF)，所述融合蛋白以小于约40nM，例如小于约30nM、20nM、15nM、10nM、8nM、5nM、3nM，1nM或更小的EC50结合人血清白蛋白；优选地，所述EC50通过ELISA技术测得。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段和GH(例如，SEQ ID NO:27所示的GH)，所述融合蛋白以小于约40nM，例如小于约30nM、20nM、15nM、10nM、8nM、5nM、3nM，1nM或更小的EC50结合人血清白蛋白；优选地，所述EC50通过ELISA技术测得。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段和选自IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白中的一种(例如，SEQ ID NO:31所示的IL15RD与IL-15融合蛋白)，所述融合蛋白以小于约40nM，例如小于约30nM、20nM、15nM、10nM、8nM、5nM、3nM，1nM或更小的EC50结合人血清白蛋白；优选地，所述EC50通过ELISA技术测得。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段，另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物和生物活性多肽。其中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有不同于所述单域抗体或其抗原结合片段的结合特异性，例举的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物如本说明书中多特异性抗体所述，例举的生物活性多肽如前所述。
缀合物
本申请第五方面，提供了一种缀合物，其包含第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段以及连接于所述单域抗体或其抗原结合片段的化疗药物、放射性药品、显影剂。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段能够延长与其连接的化疗药物、放射性药品、显影剂的体内半衰期，体内半衰期的所述延长是相对于如果缺少所述单域抗体或其抗原结合片段时所述化疗药物、放射性药品、显影剂的体内半衰期。
在某些实施方案中，所述化疗药物选自以下的一个或多个：13-顺-视黄酸(13-cis-Retinoic Acid)，2-CdA，2-氯脱氧腺苷(2-Chlorodeoxyadenosine)，5-阿扎胞苷(5-Azacitidine)，5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)，5-FU，6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine)，6-MP，6-TG，6-硫代鸟嘌呤(6-Thioguanine)，A，Abraxane，放线菌素-D(Actinomycin-D)，ALIMTA，阿利维A酸(Alitretinoin)，爱克兰全反视黄酸(All-transretinoic Acid)，六甲蜜胺(Altretamine)，甲氨蝶呤(Amethopterin)，氨磷汀(Amifostine)，氨鲁米特(Aminoglutethimide)，阿那格雷(Anagrelide)，阿那曲唑(Anastrozole)，阿糖胞苷(Arabinosylcytosine)，Ara-C，三氧化二砷(Arsenic Trioxide)，天冬酰胺酶(Asparaginase)，ATRA，阿扎胞苷(Azacitidine)，BCG，BCNU，贝沙罗汀(Bexarotene)，比卡鲁胺(Bicalutamide)，BiCNU，博来霉素(Bleomycin)，Bortezomib，白消安(Busulfan)，C225，亚叶酸钙(Calcium Leucovorin)，喜树碱-11(Camptothecin-11)，卡培他滨(Capecitabine)，CaracTM，卡铂(Carboplatin)，卡莫司汀(Carmustine)，CarmustineWafer，康士德CC-5013，CCNU，CDDP，CeeNU，苯丁酸氮芥(Chlorambucil)，顺铂(Cisplatin)，亚叶酸因子(Citrovorum Factor)，克拉屈滨(Cladribine)，可的松(Cortisone)，CPT-11，环磷酰胺(Cyclophosphamide)，阿糖胞苷(Cytarabine)，阿糖胞苷脂质体(CytarabineLiposomal)，赛德萨达卡巴嗪(Dacarbazine)，Dacogen，更生霉素(Dactinomycin)，Darbepoetin Alfa，Dasatinib，柔红霉素(Daunomycin)，柔红霉素(Daunorubicin)，盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride)，柔红霉素脂质体(Daunorubicin Liposomal)，地卡特隆(Decadron)，地西他滨(Decitabine)，DepoCytTM，地塞米松(Dexamethasone)，醋酸地塞米松(Dexamethasone acetate)，地塞米松磷酸钠(Dexamethasone SodiumPhosphate)，地塞米松(Dexasone)，右雷佐生(Dexrazoxane)，DHAD，DIC，Diodex，多西紫杉醇(Docetaxel)，多柔比星(Doxorubicin)，多柔比星脂质体(Doxorubicin liposomal)，DroxiaTM，DTIC，EligardTM，EllenceTM，乐沙定(Eloxatin)TM，表柔比星(Epirubicin)，阿法依伯汀(Epoetin alfa)，ErbituxTM，Erlotinib，欧文氏菌属L-天冬酰胺酶(Erwinia L-asparaginase)，雌莫司汀(Estramustine)，氨磷汀(Ethyol)，依托泊苷(Etoposide)，磷酸依托泊苷(Etoposide Phosphate)，依西美坦(Exemestane)，法乐通非格司亭(Filgrastim)，氟尿苷(Floxuridine)，氟达拉滨(Fludarabine)，氟尿嘧啶(Fluorouracil)，氟尿嘧啶(Fluorouracil)(乳膏)，氟甲睾酮(Fluoxymesterone)，氟他胺(Flutamide)，亚叶酸(Folinic Acid)，氟维司群(Fulvestrant)，Gefitinib，吉西他滨(Gemcitabine)，奥佐米星(ozogamicin)，健择GleevecTM，Wafer，戈舍瑞林(Goserelin)，地塞米松(Hexadrol)，克瘤灵六甲蜜胺(Hexamethylmelamine)，HMM，和美新羟基脲醋酸氢化可的松氢化可的松(Hydrocortisone)，氢化可的松磷酸钠(Hydrocortisone SodiumPhosphate)，氢化可的松琥珀酸钠(Hydrocortisone Sodium Succinate)，氢化可的松磷酸(Hydrocortone Phosphate)，羟脲(Hydroxyurea)，伊达比星(Idarubicin)，异环磷酰胺(Ifosfamide)，甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)，咪唑羧酰胺(ImidazoleCarboxamide)，伊立替康(Irinotecan)，异维A酸(Isotretinoin)，Lapatinib，L-天冬酰胺酶，LCR，Lenalidomide，来曲唑(Letrozole)，亚叶酸钙(Leucovorin)，苯丁酸氮芥(Leukeran)，LeukineTM，亮丙瑞林(Leuprolide)，长春新碱(Leurocristine)，LeustatinTM，脂质体Ara-C，Liquid洛莫司汀(Lomustine)，L-PAM，L-沙可来新(L-Sarcolysin)，LupronM，Maxidex，氮芥(Mechlorethamine)，盐酸氮芥(MechlorethamineHydrochloride)，美卓乐梅格施甲地孕酮(Megestrol)，醋酸甲地孕酮(MegestrolAcetate)，美法仑(Melphalan)，巯嘌呤(Mercaptopurine)，美司钠(Mesna)，MesnexTM，甲氨蝶呤(Methotrexate)，甲氨蝶呤钠(Methotrexate Sodium)，甲泼尼龙(Methylprednisolone)，丝裂霉素(Mitomycin)，丝裂霉素-C(Mitomycin-C)，米托蒽醌(Mitoxantrone)，MTC，MTX，氮芥(Mustine)，马利兰MylocelTM，诺维本萘拉滨(Nelarabine)，NeulastaTM，优保津尼鲁米特(Nilutamide)，氮芥(Nitrogen Mustard)，能灭瘤奥曲肽(Octreotide)，醋酸奥曲肽(Octreotide acetate)，安可平OnxalTM，Oprevelkin，奥沙利铂(Oxaliplatin)，紫杉醇(Paclitaxel)，蛋白结合紫杉醇，帕米磷酸(Pamidronate)，Panitumumab，培门冬酶(Pegaspargase)，PEG-L-天冬酰胺酶，培美曲塞(PEMETREXED)，喷司他丁(Pentostatin)，苯丙氨酸氮芥(Phenylalanine Mustard)，泼尼松龙(Prednisolone)，泼尼松(Prednisone)，丙卡巴肼(Procarbazine)，具有卡莫司汀(Carmustine)植入物的Prolifeprospan 20，雷洛昔芬(Raloxifene)，柔红霉素盐酸盐(Rubidomycin hydrochloride)，善得定Sandostatin沙格司亭(Sargramostim)，Sorafenib，SPRYCELTM，STI-571，链佐星(Streptozocin)，SU11248，Sunitinib，他莫昔芬(Tamoxifen)，泰素泰索帝替莫唑胺(Temozolomide)，替尼泊苷(Teniposide)，TESPA，沙利度胺(Thalidomide)，硫鸟嘌呤(Thioguanine)，Thioguanine Thiophosphoamide，塞替派(Thiotepa)，托泊替康(Topotecan)，托瑞米芬(Toremifene)，维A酸(Tretinoin)，TrexallTM，TSPA，VCR，VectibixTM，凡毕士ViadurTM，长春碱(Vinblastine)，硫酸长春碱(Vinblastine Sulfate)，Vincasar长春新碱(Vincristine)，长春瑞滨(Vinorelbine)，酒石酸长春瑞滨(Vinorelbine tartrate)，VLB，VM-26，Vorinostat，VP-16，威猛希罗达ZevalinTM，诺雷德唑来膦酸(Zoledronic acid)或Zolinza。
在某些实施方案中，所述放射性药品选自以下的一个或多个：碳-11，碳-14，铬-51，钴-57，钴-58，铒-169，氟-18，镓-67，金-198，铟-111，铟-113m，碘-123，碘-125，碘-131，铁-59，氪-81m，氮-13，氧-15，磷-32，铼-186，铷-82，钐-153，硒-75，锶-89，锝-99m，铊-201，氚，氙-127，氙-133或钇-90。
在某些实施方案中，所述显像剂选自以下的一个或多个：钆，磁铁矿/磁石(magnetite)，锰，锝，I125，I131，P32，Tl201，碘帕醇(Iopamidol)或PET-FDG。
抗体及融合蛋白的制备
本申请的单域抗体、多特异性抗体或融合蛋白可以通过本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本申请单域抗体、多特异性抗体或融合蛋白的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本申请的单域抗体、多特异性抗体或融合蛋白。
本申请的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto etal.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inHudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如，Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外，Fv、Fab或F(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本申请的单域抗体或其抗原结合片段的制备也可参考Muyldermans,分子生物技术综述(Reviews in MolecularBiotechnology)74,277-302(2001),J.Sambrook&D.Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Munual(3rd Edition),Cold Spring Harbor Laboratory Press,2000,或其由中国科学出版社出版的中译本。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
本申请第六方面，提供了一种分离的核酸分子，其包含编码第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段、第三方面所述的多特异性抗体或第四方面所述的融合蛋白的核苷酸序列。根据本领域已知的密码子简并性，在某些实施方案中，所述核苷酸序列是可以根据密码子简并性进行替换的。在某些实施方案中，所述核苷酸序列是密码子最优化的。
在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含编码第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，编码第三方面所述的多特异性抗体的核苷酸序列，或编码第四方面所述的融合蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述核苷酸序列选自：(a).如SEQ ID NO:35所示的核苷酸序列或其简并序列，或(b).与(a)所述的核苷酸序列基本上相同的序列(例如，与(a)所述的核苷酸序列相比，具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高序列同一性的序列，或具有一个或更多个核苷酸取代的序列)，或(c).与(a)所述的核苷酸序列相差不超过3、6、15、30或45个核苷酸的序列。
在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含(a).如SEQ ID NO:36所示的序列或其简并序列，或(b).与(a)所述的核苷酸序列基本上相同的序列(例如，与(a)所述的核苷酸序列相比，具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高序列同一性的序列，或具有一个或更多个核苷酸取代的序列)，或(c).与(a)所述的核苷酸序列相差不超过3、6、15、30或45个核苷酸的序列。
本申请第七方面，提供了一种载体，其包含第六方面所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本申请的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，慢病毒等。在某些实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本申请的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或融合蛋白。
本申请第八方面，提供了一种宿主细胞，其包含第六方面的核酸分子和/或第七方面的载体。宿主细胞可以是真核细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞)或原核细胞(例如大肠杆菌)。合适的真核细胞包括但不限于NS0细胞、Vero细胞、Hela细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞、和MDCKII细胞。适宜的昆虫细胞包括但不限于Sf9细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌E.coli。
本申请还提供了制备第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段、第三方面所述的多特异性抗体，或第四方面所述的融合蛋白的方法，其包括，在允许蛋白(例如所述单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体，或融合蛋白)表达的条件下，培养第八方面所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体，或融合蛋白。
在某些实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌E.coli。
在某些实施方案中，所述回收包括收集菌体并纯化，其中包括将蛋白包涵体的复性产物进行层析的步骤。在某些实施方案中，通过离心收集菌体，并破碎菌体获得包涵体。在某些实施方案中，包涵体进一步通过洗涤液去除宿主蛋白或杂质。在某些实施方案中，包涵体经过变性和复性，然后上层析柱洗脱得到所述单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体，或融合蛋白。在某些实施方案中，所述洗涤液为20mM Tris+1mM EDTA+0.1％TritonX-001+1.5M尿素(pH8.0)和/或20mM Tris-HCl+1mM EDTA(pH 8.5)。
用途和药物组合物
本申请第九方面，提供了一种药物组合物，其包含第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段、第三方面所述的多特异性抗体、第四方面所述的融合蛋白、第五方面所述缀合物、第六方面所述的分离的核酸分子、第七方面所述的载体、或第八方面所述的宿主细胞；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。所述药物组合物显示比相应的缺少所述单域抗体或其抗原结合片段的药物组合物延长的体内半衰期。
在某些实施方案中，本申请的药物组合物包含本申请的单域抗体或其抗原结合片段，以及连接于所述单域抗体或其抗原结合片段的活性剂。
在某些实施方案中，所述活性剂是另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物如本申请第三方面中所定义。在某些实施方案中，所述药物组合物包含本申请的多特异性抗体。
在某些实施方案中，所述活性剂是另外的生物活性多肽。在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽如本申请第四方面中所定义。在某些实施方案中，所述药物组合物包含本申请的融合蛋白。
在某些实施方案中，所述活性剂是化疗药物、放射药品或显影剂。在某些实施方案中，所述化疗药物、放射药品、或显影剂如本申请第五方面中所定义。在某些实施方案中，所述药物组合物包含本申请的缀合物。
在某些实施方案中，本申请的药物组合物包含本申请的载体或宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。在此类实施方案中，所述宿主细胞包含如前所述的分离的核酸分子或载体。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂，例如具有抗肿瘤活性的药物；优选地，所述另外的药学活性剂包括抗PD-1/PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG-3抗体或抗TIGIT抗体。
在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本申请的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白或缀合物与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。因此，本申请的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。
本申请第十方面，提供了一种试剂盒，其包括第二方面所述的抗体或其抗原结合片段、第三方面所述的多特异性抗体、第四方面所述的融合蛋白、第五方面所述的缀合物、第六方面所述的分离的核酸分子、第七方面所述的载体、第八方面所述的宿主细胞、或第九方面所述的药物组合物；以及可选地使用说明书。
在另一方面，本申请提供了第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段用于延长与其连接的活性剂的体内半衰期的用途。
在另一方面，本申请提供了延长活性剂的体内半衰期的方法，其包括将所述活性剂与第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段连接。
在某些实施方案中，体内半衰期的所述延长是相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段时所述活性剂的体内半衰期。
在某些实施方案中，所述活性剂是另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物如本申请第三方面中所定义。
在某些实施方案中，所述活性剂是另外的生物活性多肽。在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽如本申请第四方面中所定义。
在某些实施方案中，所述活性剂是化疗药物、放射性药品或显影剂。在某些实施方案中，所述化疗药物、放射性药品或显影剂如本申请第五方面中所定义。
在某些实施方案中，所述连接是融合或化学偶联。
在另一方面，本申请提供了第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段、第三方面所述的多特异性抗体、第四方面所述的融合蛋白、第五方面所述缀合物、第六方面所述的分离的核酸分子、第七方面所述的载体、或第八方面所述的宿主细胞，在制备药物中的用途，所述药物显示相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段的相应的药物延长的体内半衰期。
在某些实施方案中，所述药物是蛋白质类药物。
在某些实施方案中，本申请提供了第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物显示相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段的相应的药物延长的体内半衰期。
在某些实施方案中，本申请提供了第三方面所述的多特异性抗体在制备药物中的用途，所述多特异性抗体包含本申请的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中，所述药物显示相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段的相应的药物延长的体内半衰期。
在某些实施方案中，本申请提供了第四方面所述的融合蛋白在制备药物中的用途，所述融合蛋白包含本申请的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的生物活性多肽；其中，所述药物显示相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段的相应的药物延长的体内半衰期。
在某些实施方案中，本申请提供了第五方面所述的缀合物在制备药物中的用途，所述缀合物包含本申请的单域抗体或其抗原结合片段，以及化疗药物，放射性药品或显影剂；其中，所述药物显示比缺少所述单域抗体或其抗原结合片段的相应的药物延长的体内半衰期。
在某些实施方案中，本申请提供了第六方面所述的分离的核酸分子在制备药物中的用途。
在某些实施方案中，本申请提供了第七方面所述的载体在制备药物中的用途。
在某些实施方案中，本申请提供了第八方面所述的宿主细胞在制备药物中的用途。
在另一方面，本申请提供了第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段、第三方面所述的多特异性抗体、第四方面所述的融合蛋白、第五方面所述缀合物、第六方面所述的分离的核酸分子、第七方面所述的载体、或第八方面所述的宿主细胞，在制备用于肿瘤、感染、自身免疫疾病、代谢相关的疾病、或发育相关的疾病的预防和/或治疗或辅助治疗的药物中的用途。
在某些实施方案中，本申请提供了第三方面所述的多特异性抗体在制备用于肿瘤、感染、自身免疫疾病、代谢相关的疾病、或发育相关的疾病的预防和/或治疗或辅助治疗的药物中的用途，所述多特异性抗体包含所述单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有针对肿瘤抗原(例如肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA))和/或免疫检查点蛋白的中的一个或多个分子或抗原结合特异性。
在某些实施方案中，本申请提供了第四方面所述的融合蛋白在制备用于肿瘤、感染、自身免疫疾病、代谢相关的疾病、或发育相关的疾病的预防和/或治疗或辅助治疗的药物中的用途，所述融合蛋白包含所述单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的生物活性多肽；其中，所述另外的生物活性多肽是具有抗肿瘤活性的多肽或蛋白。
在某些实施方案中，本申请提供了一种融合蛋白在制备用于预防或治疗中性粒细胞或白细胞减少的药物中的用途。所述融合蛋白包含本申请任何一个第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段和G-CSF(例如，SEQ ID NO.23所示的G-CSF)。优选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NOs:24-26中的任一序列。所述融合蛋白具有以下用途：(1)促进造血干细胞的增值和/或分化，(2)增加血液中中性粒或白细胞的数量，(3)激活血液中中性粒细胞的功能，(4)减轻或消除骨髓造血抑制，(5)预防或治疗感染，(6)预防和/或治疗肿瘤治疗引起的中性粒细胞和/或白细胞减少，或(7)(1)-(6)的任意组合。
在某些实施方案中，本申请提供了第三方面所述的多特异性抗体、第四方面所述的融合蛋白、第五方面所述缀合物或第九方面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于：(1)促进造血干细胞的增值和/或分化，(2)增加血液中中性粒或白细胞的数量，(3)激活血液中中性粒细胞的功能，(4)减轻或消除骨髓造血抑制，(5)预防或治疗感染，(6)预防和/或治疗肿瘤治疗引起的中性粒细胞和/或白细胞减少，或(7)(1)-(6)的任意组合。在某些实施方案中，所述多特异性抗体、融合蛋白、缀合物和/或药物组合物中包括G-CSF。
在某些实施方案中，所述中性粒细胞或白细胞减少与肿瘤治疗相关，如肿瘤的放化疗。在某些实施方案中，所述中性粒细胞或白细胞减少与感染有关，如humanimmunodeficiency viruses(HIV)感染。
在某些实施方案中，前述融合蛋白可应用于骨髓移植中。前述融合蛋白在骨髓移植中发挥上述功能的一种或多种，缩短病人获得免疫能力的时间。
在某些实施方案中，本申请提供了一种融合蛋白在制备用于促进身体发育和/或促进身高增长的药物中的用途。所述融合蛋白包含本申请任何一个第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段和生长激素多肽(例如，SEQ ID NO.27所示的人生长激素)。优选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:28或38所示的序列。所述融合蛋白具有以下用途：(1)促进蛋白质合成，影响脂肪和矿物质代谢，(2)调节代谢，促进身体发育，促进身高增长，(3)促进哺乳动物骨骼、肌肉、内脏和全身生长，或(4)(1)-(3)的任意组合。
在某些实施方案中，本申请提供了第三方面所述的多特异性抗体、第四方面所述的融合蛋白、第五方面所述缀合物或第九方面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于：(1)促进蛋白质合成，影响脂肪和矿物质代谢，(2)调节代谢，促进身体发育，促进身高增长，(3)促进哺乳动物骨骼、肌肉、内脏和全身生长，或(4)(1)-(3)的任意组合。在某些实施方案中，所述多特异性抗体、融合蛋白、缀合物和/或药物组合物中包括生长激素。
在某些实施方案中，所述哺乳动物为人；优选地，所述哺乳动物为儿童。
在某些实施方案中，所述哺乳动物为非人哺乳动物。在此类实施方案中，所述融合蛋白可作为兽药，例如施用给猪、牛、羊等产肉的家畜；例如用于生产瘦肉型猪。
在某些实施方案中，本申请提供了一种融合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于选自下列的一项或多项：(1)刺激T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞和/或NKT细胞的活化与增殖，促进T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞和/或NKT细胞的存活；(2)诱导B淋巴细胞增殖和分化，增强免疫球蛋白分泌，维持记忆细胞和B细胞分化；(3)诱导淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)的活性；(4)与IL-12协同刺激NK细胞分泌细胞因子(如IFN-γ)；(5)在受试者中刺激免疫应答(例如固有免疫应答和/或适应性免疫应答，例如体液免疫应答和/或细胞免疫应答)；例如，刺激针对肿瘤的免疫应答；和/或，(6)在受试者中预防和/或治疗肿瘤，例如非小细胞肺癌。所述融合蛋白包含本申请任何一个第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段和具有IL-15活性的多肽，例如IL-15(例如SEQ ID NO:30)、IL15RD(例如SEQ ID NO:29)、IL15RD与IL-15融合蛋白(例如SEQ ID NO:31)、或其任意组合。在某些实施方案中，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:32所示的序列。
在某些实施方案中，上述融合蛋白与另外的药学活性剂(例如具有抗肿瘤活性的药物)联合施用。在某些实施方案中，上述融合蛋白与免疫检查点抑制剂联合施用。在某些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂选自抗PD-1/PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG-3抗体、抗TIGIT抗体或其任意组合。
在某些实施方案中，上述融合蛋白与抗PD-1/PD-L1抗体联合施用。在某些实施方案中，所述抗PD-1/PD-L1抗体包含如下任一组的重链可变区和/或轻链可变区：(1)Nivolumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(2)Pembrolizumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(3)Atezolizumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(4)Durvalumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(5)Avelumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(6)αPD-1或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，所述αPD-1具有SEQID NO:39所示的重链和SEQ ID NO:40所示的轻链，(7)5C10H2L2或5C10H2L2-IgG1mt的重链可变区和/或轻链可变区，5C10H2L2及5C10H2L2-IgG1mt参见中国专利申请CN201780002182.8。其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。在某些实施方案中，所述抗PD-1/PD-L1抗体选自：Nivolumab、Pembrolizumab、Atezolizumab、Durvalumab、Avelumab、αPD-1、5C10H2L2或5C10H2L2-IgG1mt。
在某些实施方案中，本申请提供了第三方面所述的多特异性抗体、第四方面所述的融合蛋白、第五方面所述缀合物或第九方面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于选自下列的一项或多项：(1)刺激T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞和/或NKT细胞的活化与增殖，促进T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞和/或NKT细胞的存活；(2)诱导B淋巴细胞增殖和分化，增强免疫球蛋白分泌，维持记忆细胞和B细胞分化；(3)诱导淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)的活性；(4)与IL-12协同刺激NK细胞分泌细胞因子(如IFN-γ)；(5)在受试者中刺激免疫应答(例如固有免疫应答和/或适应性免疫应答，例如体液免疫应答和/或细胞免疫应答)；例如，刺激针对肿瘤的免疫应答；和/或，(6)在受试者中预防和/或治疗肿瘤，例如非小细胞肺癌。在某些实施方案中，所述多特异性抗体、融合蛋白、缀合物和/或药物组合物中包括选自IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白、及其任意组合的另外的生物活性多肽。
在某些实施方案中，本申请提供了第五方面所述的缀合物在制备用于肿瘤、感染、自身免疫疾病、代谢相关的疾病、或发育相关的疾病的预防和/或治疗或辅助治疗的药物中的用途，所述缀合物包含所述单域抗体或其抗原结合片段，以及化疗药物、放射性药品、或显影剂。
在另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤、感染、自身免疫疾病、代谢相关的疾病、或发育相关的疾病的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施用有效剂量的第二方面所述的单域抗体或其抗原结合片段、第三方面所述的多特异性抗体、第四方面所述的融合蛋白、第五方面所述缀合物、第六方面所述的分离的核酸分子、第七方面所述的载体、第八方面所述的宿主细胞、或第九方面所述的药物组合物。
在某些实施方案中，本申请提供了一种预防和/或治疗中性粒或白细胞减少的方法，所述方法包括对有需要的个体使用有效剂量的第四方面所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含G-CSF。优选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NOs:24-26中的任一序列。优选地，所述个体为人。优选地，所述中性粒或白细胞减少与肿瘤治疗相关。
在某些实施方案中，本申请提供了一种促进身体发育和/或促进身高增长的方法，所述方法包括对有需要的个体使用有效剂量的第四方面所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含生长激素多肽。优选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:28或38所示的序列。优选地，所述个体为人。优选地，所述个体为儿童。
在某些实施方案中，本申请提供了一种的方法，所述方法用于选自下列的一项或多项：(1)在受试者中刺激T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞和/或NKT细胞的活化与增殖，促进T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞和/或NKT细胞的存活；(2)在受试者中诱导B淋巴细胞增殖和分化，增强免疫球蛋白分泌，维持记忆细胞和B细胞分化；(3)在受试者中诱导淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)的活性；(4)在受试者中与IL-12协同刺激NK细胞分泌细胞因子(如IFN-γ)；(5)在受试者中刺激免疫应答(例如固有免疫应答和/或适应性免疫应答，例如体液免疫应答和/或细胞免疫应答)；例如，刺激针对肿瘤的免疫应答；和/或，(6)在受试者中预防和/或治疗肿瘤，例如非小细胞肺癌。所述方法包括对有需要的个体使用有效剂量的第四方面所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含具有IL-15活性的多肽，例如IL-15(例如SEQ ID NO:30)、IL15RD(例如SEQ ID NO:29)、IL15RD与IL-15融合蛋白(例如SEQ ID NO:31)、或其任意组合。优选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:32所示的序列。在某些实施方案中，所述在受试者中是人。优选地，所述在受试者中患有肿瘤。
在某些实施方案中，所述包含具有IL-15活性的多肽的融合蛋白与另外的药学活性剂(例如具有抗肿瘤活性的药物)联合施用，例如同时、分开或相继施用。在某些实施方案中，所述融合蛋白与免疫检查点抑制剂联合施用。在某些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂选自抗PD-1/PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG-3抗体、抗TIGIT抗体或其任意组合。
在某些实施方案中，所述包含具有IL-15活性的多肽的融合蛋白与抗PD-1/PD-L1抗体联合施用。在某些实施方案中，所述抗PD-1/PD-L1抗体包含如下任一组的重链可变区和/或轻链可变区：(1)Nivolumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(2)Pembrolizumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(3)Atezolizumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(4)Durvalumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(5)Avelumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(6)αPD-1或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，所述αPD-1具有SEQ ID NO:39所示的重链和SEQ ID NO:40所示的轻链，(7)5C10H2L2或5C10H2L2-IgG1mt的重链可变区和/或轻链可变区。其中，所述变体与其所源自的序列相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述的置换是保守置换。
本申请的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白、缀合物或药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本申请的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白、缀合物或药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本申请的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白、缀合物或药物组合物，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如无菌无热原水。
本申请的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白、缀合物或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本申请的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白、缀合物或药物组合物通过静脉输注或注射给予。
本申请的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本申请的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白或缀合物。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本申请的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白、缀合物或药物组合物的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
本申请的单域抗体可高效地结合人血清白蛋白，从而实现显著的延长半衰期的作用，且因其分子量小，可避免HSA、Fc等融合蛋白对活性、工艺及药效的不利影响。同时，本申请的单域抗体具有极高的人源化程度，可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应。此外，本申请的单域抗体或融合蛋白可以以较低成本在微生物表达系统中生产，具有作为长期大剂量需要的慢性疾病治疗药物的的巨大潜力。此外，本申请的人源化单域抗体相比于驼源抗体的表达量及质量明显提升，减少了聚体形成，有利于提高蛋白稳定性。因此，本申请的抗体或抗原结合片段具有重大的临床价值。
缩略词及术语定义
CDR 免疫球蛋白可变区中的互补决定区
FR 抗体构架区：抗体可变区中除CDR残基以外的氨基酸残基
VH 抗体重链可变区
VL 抗体轻链可变区
VHH 重链抗体的可变区结构域
IgG 免疫球蛋白G
Kabat 由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参见，例如Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
Chothia 由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统，其是基于结构环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia&Lesk (1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)。
IMGT 基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息系统(The international ImMunoGeneTics information
Figure BDA0002768756260000381
(IMGT))的编号系统，可参阅Lefrancet al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003。
KD 平衡解离常数
Ka 结合速率常数
Kd 解离速率常数
在本申请中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本申请，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“人血清白蛋白(HSA)”具有本领域技术人员公知的含义，其是人循环系统中自然产生的最常见血液蛋白，并且是人体内半衰期最长的蛋白，半衰期长达19天。HSA和重组人白蛋白(rHSA)在人体中都具有同样的长循环半衰期。研究显示，与人白蛋白遗传融合的治疗蛋白能获得白蛋白的循环半衰期特征。
如本文中所使用的，术语“粒细胞集落刺激因子(G-CSF)”具有本领域技术人员公知的含义，是一种来源于单核细胞和纤维组织母细胞的长链多肽糖蛋白，可诱导造血干细胞的增殖和分化，促进血液中的中性粒细胞数增加；另外还刺激成熟中性粒细胞从骨髓中释放并激活中性粒细胞的功能。在生物体内主要发挥三大功能：1.作用于骨髓干细胞和中性粒前体细胞，驱动中性粒细胞的分化、增殖和成熟，2.激活成熟的中性粒细胞参与免疫反应，3.协同其他细胞因子，如stem cell factor,IL-3发挥造血功能。
如本文中所使用的，术语“体内半衰期”具有本领域技术人员公知的含义，通常可以定义为分子在体内的血清浓度减少50％(例如由于通过天然机制导致配体的降解和/或配体的清除或螯合)所需要的时间。测定体内半衰期的方法是本领域技术人员所熟知的，例如可通过药物代谢动力学分析进行测定，详情可见于Kenneth,A等:Chemical Stabilityof Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists(药物的化学稳定性：药剂师手册)和Peters等，Pharmacokinete analysis:A Practical Approach(药物代谢动力学分析：实践方法)(1996)。还参考"Pharmacokinetics(药物代谢动力学)",M Gibaldi&D Perron,Marcel Dekker出版,第二修订版(1982)。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用。“抗体”包括完整的单克隆抗体，单域抗体，重链抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体，三特异性抗体)，以及有所需要的生物活性的抗体片段(例如抗原结合片段)。基本的四链抗体通常是指由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的四异聚体糖蛋白。每条重链和轻链具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链和轻链在各自的N-末端具有可变结构域(VH和VL)。各重链/轻链对的可变结构域分别形成抗原结合部位。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。抗体的种类，结构，生物学活性，制备方法参见Fundamental Immunology(William E.Paul,7thEdition,LWW,2012)；Antibody Engineering Springer Lab Manual(Roland Kontermann,Stefan Dübel,ISBN978-3-662-04605-0(eBook))；Schiel JE,Davis DL,Borisov OV,State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic MonoclonalAntibody CHaracteriazation Volume 1.Monoclonal Antibody Therapeutics:Structure,Function,and Regulatory Space(American Chemical Society,2014)。抗原结合片段是能够保留特异性抗原的能力的抗体片段，其非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体、结构域抗体或单域抗体的抗原结合片段，这些抗原结合片段包含足以赋予特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。这些氨基酸残基的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语“驼源抗体”是指，经免疫接种或抗原入侵的骆驼科(Camelidae)动物(包括骆驼(Camel)、羊驼(Alpaca)和大羊驼(L.glama))所产生的针对该抗原的抗体。本领域技术人员已知，在骆驼科动物所产生的抗体中存在缺失轻链的“重链抗体”(heavy-chain antibody,HCAb)，这种抗体只包含一个重链可变区(variable domainof heavy chain of HCAb,VHH)和两个常规的CH2与CH3区，并且单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，VHH是目前己知的可结合目标抗原的最小单位。
如本文中所使用的，术语“单域抗体(single domain antibody，sdAb)”、“结构域抗体”与“纳米抗体(nanobody)”可互换使用，其是指由抗体中单个可变结构域(例如重链可变区)所组成的抗体片段。典型地，单域抗体、结构域抗体或纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，所述4个构架区分别为FR1-FR4，所述3个互补性决定区分别为CDR1-CDR3。在某些实施方案中，本申请的单域抗体可以具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。在某些实施方案中，所述单域抗体是人源化的VHH。这些抗体不需要轻链可变区即可以高亲和力和特异性与抗原结合。与重链和轻链组成的抗体相比，纳米抗体可溶度高，对热、pH、蛋白酶和其它变形剂稳定度高，只需单链表达便于大规模生产。
如本文中所使用的，术语“多特异性抗体”是指具有多种不同抗原结合特异性的抗体，包括例如：双特异性抗体,三特异性抗体和四特异性抗体。“双特异性抗体”是指，具有两种不同抗原结合特异性的抗体，其由第一抗体(或其片段)和第二抗体(或其片段)或抗体类似物通过偶联臂所形成的偶联物，偶联的方式包括但不限于化学反应、基因融合和酶促。三特异性抗体是具有三种不同抗原结合特异性的抗体，四特异性抗体是具有四种不同抗原结合特异性的抗体。
如本文中所使用的，“抗体类似物(antibody mimetic)”，指与抗体一样特异性结合抗原，但却没有抗体结构。它们通常是人工肽或蛋白质，摩尔质量约为3至20kDa。例如，锚蛋白重复蛋白(DARPin)和fynomer。经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)可以与IgG抗体、scFv-Fc抗体片段或其组合相连，如CN104341529A。抗IL-17a的fynomer与抗IL-6R抗体结合，如WO2015141862A1。
如本文中所使用的，“基因”指的是编码蛋白的核酸物质，也可以说是调控蛋白表达的核酸物质。抗体即免疫球蛋白的重链可变区由可变段(V基因)、多样段(D基因)以及连接段(J基因)编码。V(D)J基因重排是产生抗体多样性的机制之一。
如本文中所使用的，术语“胚系抗体基因”是由非淋巴细胞编码的免疫球蛋白序列，它没有经历导致表达特异免疫球蛋白的遗传学重排及成熟的过程。本申请的各种实施方案所提供的一个优点来源于一种认识，那就是胚系抗体基因比成熟抗体基因更多地保留了动物物种个体的特征性的重要氨基酸序列结构。因此当被治疗性应用于该物种时，更少地被该物种识别为外源物质。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，FR)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)的驼源抗体。
如本文中所使用的，术语“人源化程度”是用于评价抗体与人源氨基酸残基同一性的指标。人源化抗体的人源化程度例如可通过IMGT网站DomainGapAlign来预测被测序列与人的相同结构域的同源性。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)或半最大效应浓度(EC50)表示。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(Ka或Kon)和“解离速率常数”(Kd或Koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kd/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,Annual RevBiochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、Kon和Koff值。在某些实施方案中，可以使用生物发光干涉测量法(例如ForteBio Octet法)来测量解离常数。除此以外还可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或Kinexa来测量解离常数。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本申请中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用，由两个或两个以上氨基酸组成。并且在本申请中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示，精氨酸可用R或Arg表示，天冬氨酸可用D或Asp表示，半胱氨酸可用C或Cys表示，谷氨酰胺可用Q或Gln表示，谷氨酸可用E或Glu表示，组氨酸可用H或His表示，异亮氨酸可用I或Ile表示，甘氨酸可用G或Gly表示，天冬酰胺可用N或Asn表示，亮氨酸可用L或Leu表示，赖氨酸可用K或Lys，甲硫氨酸可用M或Met表示，苯丙氨酸可用F或Phe表示，辅氨酸可用P或Pro表示，丝氨酸可用S或Ser表示，苏氨酸可用T或Thr表示，色氨酸可用W或Trp表示，酪氨酸可用Y或Tyr表示，缬氨酸可用V或Val表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本申请的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、缓解症状(无论部分或全部)、缓解或改善预后、降低或抑制疾病复发、防止或减轻并发症的发生等，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。
如本文中所使用的，术语“大约”指文中所述数值的正负10％。
如本文中所使用的，术语“多”意指≥2。
中文没有单复数的语法规则，具体是单数还是复数需要根据上下文，或领域里的常识确定。如果指的是复数，翻译时在名词的前面加上“一个或多个”是正确的。
下面将结合附图和实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本申请，而不是对本申请的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本申请的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。
附图说明
图1：G-CSF与PEG偶联反应还原SDS-PAGE检测。1：G-CSF未偶联；2：偶联0.5h；3：偶联4.5h；4：偶联20h；5：偶联24h；M：蛋白分子量标准。偶联反应得到单一偶联产物，部分为未偶联及多个PEG偶联产物。
图2：PEG偶联G-CSF纯化SDS-PAGE检测。1：偶联产物阳离子第一个洗脱峰非还原；2：偶联产物阳离子第一个洗脱峰还原；3：偶联产物阳离子第二个洗脱峰非还原；4：偶联产物阳离子第二个洗脱峰洗脱还原；M：蛋白分子量标准。
图3：驼源及人源化抗体表达与检测。M：蛋白分子量标准；1：HZ1；2：HZ2；3：HZ21；4：MSA21。
图4：融合蛋白表达SDS-PAGE检测。1：未诱导；2：HZ21NG表达破碎后沉淀；3：HZ21NG表达破碎后上清；4：HZ21NG表达破碎后全菌；5：GNHZ21表达破碎后沉淀；6：GNHZ21表达破碎后上清；7：GNHZ21表达破碎后全菌；8：GHZ21G表达破碎后上清；9：GHZ21G表达破碎后沉淀；10：GHZ21G表达破碎后全菌；11：未诱导；M：蛋白分子量标准。融合蛋白HZ21NG、GNHZ21、GHZ21G表达量分别占总蛋白70％、65％及30％，且均表达为包涵体。
图5：G-CSF及融合蛋白HZ21NG纯化收率比较。HZ21NG收率与PEG偶联相比，具有明显优势。
图6：融合蛋白刺激NFS-60细胞增殖活性检测。HZ21NG具有与瑞白一致的NFS-60细胞增殖活性，且比新瑞白活性更好。
图7：融合蛋白在大鼠中刺激中性粒细胞增殖活性检测。
图8：环磷酰胺处理模型大鼠中融合蛋白活性检测。与模型组相比，融合蛋白能显著改善嗜中性粒细胞减少症状。
图9：融合蛋白HZ21NG在大鼠体内药代动力学检测。
图10：融合蛋白HZ21NG在食蟹猴体内药代动力学检测。
图11：人源化抗体与人生长激素融合蛋白GHNHZ21与HZ21NGH表达与纯化SDS-PAGE检测。M：蛋白分子量标准；1：未诱导；2：表达破碎后上清；3：目的蛋白GHNHZ21洗脱；4：目的蛋白HZ21NGH洗脱。
图12：生长激素融合蛋白体外细胞活性检测。
图13：人源化抗体与白介素融合蛋白HZ21RD15表达SDS-PAGE检测。1：未诱导；2：表达破碎后沉淀；3：表达破碎后上清；4：表达破碎后全菌；5：包涵体洗涤上清；6：精制包涵体；M：蛋白分子量标准。
图14：融合蛋白HZ21RD15与αPD-1联用增强肿瘤杀伤。
图15：融合蛋白HZ21RD15提高肿瘤内CD8+、CD56+免疫细胞比例。
序列信息
本申请涉及的序列的信息描述于下面的表中。
Figure BDA0002768756260000471
Figure BDA0002768756260000481
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本申请，而不应视为限定本申请的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
对照品制备例1：G-CSF表达与纯化
G-CSF基因委托金斯瑞生物科技有限公司按大肠杆菌密码子进行基因优化与合成，构建至表达载体pET28a，测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。挑取单克隆至含卡那霉素的LB培养基，37℃震荡培养过夜，按1:100接种至含卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约为0.8，加入0.5mM IPTG诱导4h，收集菌体用于纯化，SDS-PAGE电泳检测表达量占总蛋白的45％。离心收集诱导后菌体，以20mM PB(pH 7.4)重悬洗涤一次，离心收集菌体。菌体使用20mM PB(pH 7.4)重悬，超声破碎裂解菌体，10000g离心15min收集包涵体。粗制包涵体依次使用洗涤液I(20mM Tris+1mM EDTA+0.1％Triton X-001+1.5M尿素(pH8.0))，及洗涤液II(20mM Tris-HCl+1mM EDTA(pH 8.5))重悬后于室温搅拌1h，溶解部分可溶的宿主蛋白，去除核酸等杂质，离心收集精制包涵体。取1g精制包涵体以变性缓冲液重悬，取变性后上清缓慢稀释至复性液中，复性完成后使用稀盐酸调节pH，离心后上清上样至阳离子层析柱，洗脱得到目的蛋白80mg，SDS-PAGE电泳检测纯度100％。
对照品制备例2：G-CSF与PEG偶联及纯化
根据现有技术已知的PEG偶联方法，取纯化好的80mg G-CSF原液调整浓度为1mg/mL，加入PEG及还原剂氰基硼氢化钠溶液，充分搅拌混匀后，2-8℃反应。取0.5h、4.5h、20h、24h偶联产物，SDS-PAGE电泳检测，结果如图1，反应0.5h即有部分蛋白偶联上PEG，至20h反应达到稳定，24h偶联效率无明显变化，通过灰度分析，约68％蛋白偶联1个PEG，4％左右蛋白偶联多个PEG，27％蛋白未偶联。产物以稀盐酸调pH，上样至阳离子层析柱，以NaCl梯度缓冲液洗脱，最终得到38mg(按蛋白定量)PEG-GCSF蛋白。SDS-PAGE电泳检测，结果如图2，第一个洗脱峰全部为未偶联的G-CSF，第二个洗脱峰为PEG-GCSF，SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度大于98％。
实施例1：纳米抗体人源化
驼源抗体进入人体，有较强的免疫原性，易产生抗药抗体，为了降低抗药抗体的产生，提高药物的安全性，需对驼源抗体进行人源化改造。采用CDR移植抗体人源化改造方法对驼源抗体MSA21(参见WO2004041865中的SEQ ID NO.1)进行人源化改造。简言之，人源化改造涉及以下步骤：
1、根据序列同源性及HLA-DR亲和性，选出同源性高且亲和力低的人胚胎系框架序列进行CDR移植，将驼源序列中人胚系基因相应位置出现频率低的氨基酸，替换为相应人源氨基酸。
2、利用计算机模拟技术，考察其空间立体结合方式，计算静电力、范德华力、亲疏水性和熵值，保留关键位点的驼源氨基酸，进行了一系列的回复突变，以使人源化抗体尽可能保留驼源抗体的抗原结合能力。
通过上述步骤设计获得人源化序列HZ1(SEQ ID NO:1)、HZ2(SEQ ID NO:2)、HZ21(SEQ ID NO:3)。其中，根据Kabat编号系统定义，HZ1、HZ2和HZ21序列的位点5为亮氨酸(Leu)、位点23为丙氨酸(Ala)、位点45为亮氨酸(Leu)、位点74为丝氨酸(Ser)、位点83为精氨酸(Arg)、位点108为亮氨酸(Leu)；HZ1序列的位点49为亮氨酸(Leu)，位点84为丙氨酸(Ala)，位点93为丙氨酸(Ala)，位点94为谷氨酸(Glu)。根据IMGT编号系统定义，HZ1、HZ2和HZ21序列的位点5上的亮氨酸(Leu)、位点24为丙氨酸(Ala)、位点50为亮氨酸(Leu)、位点83为丝氨酸(Ser)、位点95为精氨酸(Arg)、位点123为亮氨酸(Leu)；HZ1序列的位点54为亮氨酸(Leu)、位点96为丙氨酸(Ala)、位点105为丙氨酸(Ala)、位点106为谷氨酸(Glu)。
通过分析上述人源化抗体的等电点，HZ2的等电点为8.73，这会影响抗体或其融合蛋白或其缀合物的稳定性；发明人出乎意料地发现HZ21的等电点为8.08，结构更稳定，从而保证蛋白稳定性及不被快速清除。
由此，进一步分析HZ21，其V基因编码区段的人源化程度与驼源相比从84.4％提升至89.6％，J基因编码区段的人源化程度从90％提升至100％，抗体人源化程度更高，避免驼源氨基酸可能产生的免疫原性，同时获得稳定性好的人源化抗体。
利用AbYsis网站(http://www.abysis.org/abysis/)对HZ1、HZ2、HZ21的氨基酸序列进行抗体CDR区标注，结果如表1所示：
表1：人源化单域抗体及其CDR序列
Figure BDA0002768756260000501
实施例2：人源化单域抗体表达及结合活性验证
2.1驼源及人源化抗体表达检测
驼源抗体MSA21及人源化抗体HZ1、HZ2和HZ21的基因序列委托金斯瑞生物科技有限公司按大肠杆菌密码子进行基因优化与合成，基因5’-端添加信号肽，3’-端添加6×His，构建至pET28a载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞表达，挑取单克隆至LB培养基中过夜培养，按1:100接种至自诱导培养基(胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油10mL，Na2HPO4 50mM，KH2PO4 50mM，(NH)4SO4 25mM，灭菌冷却之后，加入1ml 0.22um过滤的50％葡萄糖,40ml0.22um过滤的10％乳糖,2ml 0.22um过滤的1M MgSO4)中，37℃继续培养24h，8000g离心20min收集上清液。使用Ni+层析介质纯化诱导后培养基上清，洗脱得到MSA21、HZ1、HZ2、HZ21-his蛋白，超滤换液至PBS pH7.4中，定量计算表达量，SDS-PAGE电泳检测纯度，结果见表2及图3。结果表明，经过实施例1的人源化及根据静电力、亲疏水性进行的突变改造，提高了单域抗体的表达量及质量，减少了聚体形成，有利于提高蛋白稳定性。
表2：驼源及人源化抗体表达检测
蛋白名称 表达量(mg/L) 单体纯度％ 聚体含量％
MSA21 32 92 8
HZ1 28 99 1
HZ2 35 98 2
HZ21 50 98 2
2.2HZ21-his蛋白与不同种属白蛋白的结合亲和力检测
通过ELISA检测HZ21-his蛋白与不同种属白蛋白的结合亲和力。将人白蛋白(HSA)、大鼠白蛋白(RSA)、猴白蛋白(CSA)以包被液稀释至10μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，4℃包被过夜；弃包被液，PBST洗涤1次，每孔加入250μL PBS+5％脱脂牛奶，37℃封闭2h；拍干后每孔加入100μL PBS+5％脱脂牛奶梯度稀释的HZ21-his蛋白，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，加入PBS+5％脱脂牛奶1:10000稀释的HRP标记的兔抗His标签抗体，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗板6次，加入TMB显色液显色，100μL/孔，室温反应5min，加入终止液终止反应，50μL/孔，于450nm下测光密度。数据导出至Graphpad，并计算融合蛋白HZ21-his与HSA、大鼠RSA、猴白蛋白CSA结合的EC50。HZ21-his与HSA、大鼠RSA、猴白蛋白CSA结合的EC50分别为：10.10nM，121.30nM，4.67nM，这一结果表明人源化单域抗体具有nM级与白蛋白结合能力，可进一步用于融合蛋白构建。
实施例3：人源化单域抗体与G-CSF的融合蛋白的构建、表达与纯化
人源化单域抗体与G-CSF的融合蛋白的结构参见表3。人源化抗体HZ21基因，通过重叠PCR分别拼接至G-CSF的5’端或3’端，或及在HZ21基因两端分别拼接G-CSF基因，为保证蛋白功能活性，各基因中间由GGGGSGGGGS进行连接，得到的基因构建至pET28a载体，编码蛋白分别命名为HZ21NG、GNHZ21及GHZ21G。构建好的载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单克隆至含卡那霉素的LB培养基，37℃震荡培养过夜，按1:100接种至含卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.8，加入0.5mM IPTG诱导4h，收集菌体用于纯化。菌体超声波破碎后取全菌，离心后取上清及沉淀分别SDS-PAGE电泳检测，结果如图4，融合蛋白表达量高，HZ21NG、GNHZ21、GHZ21G表达量分别占总蛋白70％、65％及30％，且均表达为包涵体(破碎后沉淀中)。
菌体按对照品制备例1的方法破菌、洗涤，取HZ21NG 1g精制包涵体按对照品制备例1的方法进行纯化。洗脱产物使用20mM醋酸钠缓冲液稀释，上样至阴离子交换柱，收集穿透液，进行SDS-PAGE电泳、尺寸排阻-高效液相色谱(SEC-HPLC)及内毒检测(鲎试剂检测法)，结果如表4所示。纯化蛋白量如图5所示，HZ21NG融合蛋白纯度及得率高(1g包涵体得到100mg HZ21NG)，且收率显著高于PEG-GCSF(1g包涵体得到38mg PEG-GCSF蛋白)。
表3：融合蛋白的构建方式
蛋白名称 蛋白结构(N端→C端) 接头L SEQ ID NO:
HZ21NG HZ21-L-GCSF (GGGGS)<sub>2</sub> 24
GNHZ21 GCSF-L-HZ21 (GGGGS)<sub>2</sub> 25
GHZ21G GCSF-L-HZ21-L-GCSF (GGGGS)<sub>2</sub> 26
表4：HZ21NG纯化后检测
蛋白 SDS-PAGE SEC-HPLC 内毒素 蛋白量
HZ21NG 98％ 99.7％ 0.55EU/mg 100mg
实施例4：融合蛋白HZ21NG的体外结合活性检测
通过ELISA检测HZ21NG与不同蛋白的结合亲和力。将人、大鼠、猴白蛋白以包被液稀释至10μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，4℃包被过夜；弃包被液，PBST洗涤1次，每孔加入250μL PBS+5％脱脂牛奶，37℃封闭2h；拍干后每孔加入100μL PBS+5％脱脂牛奶梯度稀释的HZ21NG，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，加入PBS+5％脱脂牛奶1:1000稀释的兔抗人G-CSF抗体，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗板3次。加入PBS+5％脱脂牛奶1:2000稀释的HRP羊抗兔抗体，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤6次，加入TMB显色液显色，100μL/孔，室温反应5min，加入终止液终止反应，50μL/孔，于450nm下测光密度。数据导出至Graphpad，计算融合蛋白HZ21NG与人(HSA)、大鼠(RSA)、猴白蛋白(CSA)结合EC50。HZ21NG与人(HSA)、大鼠(RSA)、猴白蛋白(CSA)结合的EC50分别为：2.10nM，174.90nM，1.58nM。结果表明，人源化抗体与生物活性蛋白融合后，保持了与人源化抗体自身相当的与白蛋白结合的能力，说明生物活性蛋白与人源化纳米抗体的融合蛋白可以结合至白蛋白。
实施例5：融合蛋白HZ21NG的体外细胞活性检测
NFS-60细胞增殖活性检测。1640+10％FBS+10ng/mL G-CSF培养NFS-60细胞，100g离心5min收集细胞，以不含G-CSF的1640+10％FBS培养基洗涤去除残留的G-CSF，计数细胞后按1×104个加入96孔板中，100μL/孔；以不含G-CSF的1640+10％FBS+0.2％HSA培养基稀释融合蛋白HZ21NG、瑞白(购自齐鲁制药，短效G-CSF)、新瑞白(购自齐鲁制药，PEG-GCSF)，100μL/孔加入至细胞中，37℃继续培养48h，加入20μL/孔CCK8，37℃培养4h，OD450nm读数，数据导入Graphpad计算蛋白刺激增殖活性。结果如图6，融合蛋白HZ21NG刺激NFS-60增殖活性(EC50＝1.65pM)与瑞白相当(EC50＝1.52pM)活性无明显差异，高于长效PEG-GCSF新瑞白活性(EC50＝3.92pM)，说明融合蛋白保留了GCSF的生物活性，并且比长效PEG-GCSF新瑞白具有更好的体外活性。
上述结果表明，融合蛋白HZ21NG保留了单域抗体与白蛋白结合的能力，同时未影响G-CSF的生物学功能，提示该融合蛋白可能具有长效刺激中性粒细胞的功能。
实施例6：融合蛋白HZ21NG对大鼠嗜中性粒细胞增殖作用
测试融合蛋白与瑞白、新瑞白刺激正常大鼠嗜中性粒细胞增殖的功能差异。SD大鼠根据体重随机分为4组，每组3只，采用后颈背部皮下给药(第0天)。瑞白及新瑞白组(按蛋白定量200μg/kg)，HZ21NG给与等摩尔剂量(按蛋白定量370μg/kg)，溶媒组(20mM醋酸，pH4.0)，均单次给药10mL/kg。给药后每天取大鼠眼眶血150μL，血细胞分析仪检测中性粒细胞含量。结果如图7，等G-CSF摩尔剂量条件下，HZ21NG给药后第一天达到最高，中性粒细胞总数较溶媒组增加6.6倍，而新瑞白增加5.6倍，第四天均恢复至溶媒组水平。而瑞白给药后第一天中性粒细胞数达到最高，数量较溶媒组增加3.8倍，然后很快即失去刺激功能，给药后第二天即恢复至溶媒组水平。结果说明融合蛋白HZ21NG具有体内长效刺激中性粒细胞增殖的功能，且略优于长效的新瑞白。
实施例7：融合蛋白HZ21NG对化疗模型大鼠嗜中性粒细胞增殖作用
使用环磷酰胺对大鼠造模，测试融合蛋白与新瑞白刺激模型大鼠嗜中性粒细胞增殖的功能差异。SD大鼠根据体重随机分为3组，每组5只，所有大鼠均静脉注射50mg/kg的环磷酰胺(第0天)。造模后24h，采用后颈背部皮下给药。模型组给予等体积HZ21NG的缓冲液(20mM醋酸，pH4.0)，新瑞白组(按蛋白定量100μg/kg)，HZ21NG组给与等摩尔剂量融合蛋白(按蛋白定量169μg/kg)，均单次给药10mL/kg。给药后每天取大鼠眼眶血150μL，血细胞分析仪检测中性粒细胞含量。结果如图8，模型组大鼠的嗜中性粒细胞迅速降低，低于1×109/L的时间达到3天，而施用HZ21NG后，仅1天低于1×109/L，说明HZ21NG能显著改善大鼠嗜中性粒细胞减少的症状；施用新瑞白后，1天低于1×109/L，但HZ21NG组最低嗜中性粒细胞总数(0.94±1.32)高于模型组(0.32±0.25)和新瑞白组(0.32±0.40)。等G-CSF摩尔剂量条件下，HZ21NG与PEG偶联长效新瑞白具有较一致的趋势，但融合蛋白可刺激嗜中性粒细胞增殖更多，最低值高于新瑞白，且能更迅速恢复至正常水平，结果说明HZ21NG具有比新瑞白更优的活性。
实施例8：融合蛋白HZ21NG在大鼠体内药代动力学检测
SD大鼠根据体重随机分为2个剂量组(1mg/kg、3mg/kg)，每组10只(雌雄各半)，采用后颈背部皮下给药(第0小时)，2mL/kg。给药前以及给药后0.5、2、6、24、48、72、96、120、168h采集血样，采集后转移至标记好的含有分离胶+促凝剂的采样管中，1500g，室温，10分钟。离心后的血清转移至新的标记好的离心管，用于PK检测。酶标板预先包被Human G-CSFAntibody(R&D，MAB214)作为捕获试剂，封闭洗板后将标准曲线样品、空白样品、质控样品和待测样品(加样前，所有样品均用稀释液按1:30倍预处理)加入酶标板中进行孵育，洗去游离的HZ21NG后，加入Human G-CSF Biotinylated Antibody(R&D，BAF214)，孵育后去除游离抗体，洗板后加入SA-HRP二抗，最后加入底物TMB显色，终止后450/630nm双波长处读取OD值，根据标准曲线计算血清中HZ21NG浓度，使用WinNonlin软件计算毒代动力学参数。结果如图9及表5，HZ21NG在大鼠体内半衰期分别为：1mg/kg剂量组为4.5h，3mg/kg剂量组为5.3h，G-CSF融合了人源化抗白蛋白单域抗体后，融合蛋白HZ21NG具有显著延长的体内半衰期(报道的G-CSF大鼠体内半衰期为1.8h，参见G.N.Cox et al.Experimental Hematology32(2004):441–449)。
表5：融合蛋白HZ21NG在大鼠体内PK参数
Figure BDA0002768756260000551
实施例9：融合蛋白HZ21NG在食蟹猴体内药代动力学检测
3岁龄食蟹猴随机分为2个剂量组(0.2mg/kg、0.6mg/kg)，每组10只(雌雄各半)，采用颈背部皮下给药(第0小时)，0.5mL/kg。给药前以及给药后0.5、2、6、24、48、72、96、120、168h采集血样，HZ21NG浓度检测及计算方法同实施例8。结果如图10及表6，HZ21NG显示出显著延长的食蟹猴体内半衰期，达到16-22h(而报道的G-CSF在食蟹猴中半衰期为3.5h，参见JAMES F.ELIASON et al.STEM CELLS.18(2000):40-45)。
表6：融合蛋白HZ21NG在食蟹猴体内PK参数
剂量 t<sub>1/2</sub> T<sub>max</sub> C<sub>max</sub> AUC<sub>last</sub>
(mg/kg) (hr) (hr) (ug/mL) (hr*ug/mL)
0.2 22.33 13.2 0.7493 24.714
0.6 16.731 26.4 2.737 135.19
大鼠及食蟹猴体内PK研究表明，G-CSF融合了人源化抗白蛋白单域抗体后，可显著延长G-CSF体内半衰期，实现功能蛋白长效化目的。
实施例10：人源化单域抗体与生长激素融合蛋白的构建与表达
人源化单域抗体与生长激素(GH)融合蛋白的结构参见表7。人源化抗体HZ21基因，通过重叠PCR拼接至人生长激素GH基因5’-端或3’-端，基因中间由(GGGGS)2进行连接，全长基因5’-端添加信号肽序列，得到的基因构建至pET28a载体，融合至5’-端编码蛋白命名为HZ21NGH，融合至3’-端编码蛋白命名为GHNHZ21。构建好的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单克隆诱导表达，超声破碎后离心收集上清，使用Protein A纯化得到目的蛋白，结果如图11。融合蛋白HZ21NGH、GHNHZ21可溶表达，纯化得到35kDa蛋白，符合目的蛋白分子量大小。
表7：融合蛋白的构建方式
蛋白名称 蛋白结构(N端→C端) 接头L SEQ ID NO:
GHNHZ21 GH-L-HZ21 (GGGGS)<sub>2</sub> 28
HZ21NGH HZ21-L-GH (GGGGS)<sub>2</sub> 38
实施例11：生长激素融合蛋白体外细胞活性检测
GH基因5’-添加信号肽序列，3’-添加6×his标签序列，构建至pET28a载体，转化至BL21(DE3)中，挑取单克隆诱导表达；诱导后离心收集表达上清，使用Ni+层析柱纯化，洗脱后超滤换液至PBS(pH 7.4)中，过滤除菌后用于活性测试，蛋白命名为GH-His。人生长激素受体(GHR，NP_000154.1)基因全长构建至慢病毒表达载体pLVX-IRES-puro载体中，包装病毒并感染BaF3细胞，嘌呤霉素筛选稳定后用于蛋白活性评价，细胞命名为BaF3-GHR。
稳定细胞BaF3-GHR以1640+10％FBS+1ng/mL mIL3+0.5μg/mL嘌呤霉素培养。使用前以1640培养基洗三次去除mIL3，1640+10％FBS培养6h后用于实验，离心细胞并以1640+10％FBS调整细胞密度至4×105/mL，取100μL细胞加入96孔板中；1640+10％FBS梯度稀释GH-his、HZ21NGH、GHNHZ21蛋白，100μL/孔加入至细胞板中，继续37℃，5％CO2静置培养48h。按20μL/孔加入CCK8，37℃继续培养4h，酶标仪检测OD450读数。结果如图12及表8，GH-his不刺激空白BaF3细胞增殖(BaF3+GH-his)，而GH-his及融合蛋白可刺激BaF3-GHR细胞增殖，人源化单域抗体融合在生长激素N-端或C-端，活性与生长激素无明显差异，HZ21NGH活性略优于GHNHZ21。
表8：生长激素及融合蛋白细胞增殖活性
样品 GH-His HZ21NGH GHNHZ21
EC50(nM) 0.051 0.036 0.091
实施例12：人源化抗体与白介素15融合蛋白构建与表达
人源化单域抗体与白介素15融合蛋白的结构参见表9。白介素15(IL15)有3个受体，IL15Rα及与白介素2共用受体IL-2Rβ和IL-2Rγ，其中IL15Rα的sushi结构域(IL15RD)与IL15结合后，刺激NK细胞活性增强。通过重叠PCR构建人源化抗体与IL15RD、IL15的全长基因，各基因由接头(GGGGS)4进行连接，得到的基因构建至pET28a载体，编码蛋白命名为HZ21RD15。构建好的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导后电泳检测，结果能得到目的蛋白，且表达为包涵体。菌体超声破碎后离心收集包涵体，使用洗涤缓冲液洗涤得到精制包涵体，结果如图13。融合蛋白诱导后表达量占总蛋白30％，经洗涤后得到80％纯度的精制包涵体可用于后续纯化。
表9：融合蛋白的构建方式
蛋白名称 蛋白结构(N端→C端) 接头L SEQ ID NO:
HZ21RD15 HZ21-L-IL15RD-L-IL15 (GGGGS)<sub>4</sub> 32
实施例13：融合蛋白HZ21RD15体内药效研究
6-8周龄B-NDG小鼠，雌性，右侧或右侧肩胛处皮下接种5×106个HCC827肿瘤细胞(人非小细胞肺癌细胞)；给药前3-4天，复苏huPBMCs，以PBS重悬，每只小鼠腹腔注射3×106(0.2ml)huPBMCs。免疫重建小鼠肿瘤平均体积达到70mm3至120mm3时，剔除瘤体积过小或过大的小鼠个体，余下小鼠随机分为3组，每组5只，分组及各组剂量为：hIgG1组2mg/kg，αPD-1抗体(其重链如SEQ ID NO:39所示，其轻链如SEQ ID NO:40所示)组1.5mg/kg，联合组αPD-1抗体剂量1.5mg/kg，HZ21RD15剂量50μg/kg，静脉给药，每周两次。
每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径，并于给药后21天采用流式细胞术检测肿瘤中人CD45+CD3+CD8+T细胞及人CD45+CD3-CD56+T细胞比例。
结果如图14、15，αPD-1组以及联合组相对于hIgG1组均显示了抑制肿瘤的效果，αPD-1联合了HZ21RD15后，增强了αPD-1抗肿瘤活性，同时瘤内人免疫细胞，以及CD45+CD3+CD8+T细胞、CD45+CD3-CD56+T细胞比例显著提高，证明融合蛋白HZ21RD15具有刺激免疫细胞增殖和/或减少肿瘤浸润的生物学活性，还具有增强免疫检查点抑制剂抗体抗肿瘤活性的功能。因此将融合蛋白HZ21RD15与免疫检查点抑制剂联用具有增强免疫反应，并且增强抗肿瘤活性的优势。
综上，本申请通过对驼源抗体进行人源化改造，得到了高人源化程度的结合白蛋白的单域抗体；基于该单域抗体构建的与另一活性蛋白的融合蛋白具有结合白蛋白活性，且与该活性蛋白一致的体外活性，及体内生物学功能。值得注意的是，该融合蛋白大大延长活性蛋白的体内半衰期，且不易引发免疫原性反应具备较高的安全性。基于单域抗体的融合蛋白具有分子量小、可原核表达的优势，与现有上市PEG偶联长效化药物相比，无需进行偶联，生产工艺简单，收率高，且活性高于PEG偶联长效化药物，明显优于目前的长效化方法。此外，本申请获得的人源化抗体相比于驼源抗体的表达量及质量明显提升，减少了聚体形成，有利于提高蛋白稳定性。
尽管本申请的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本申请的保护范围之内。本申请的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川科伦博泰生物医药股份有限公司
<120> 一种结合血清白蛋白的蛋白及其用途
<130> IDC200393
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<151> 2019-11-12
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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<223> 人源化HZ1 VHH
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Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Leu Gly Ile Ser Ser Leu Gly Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Glu Gly Gly Ser Leu Asn Pro Gly Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
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Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Gly Ile Ser Ser Leu Gly Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Asn Pro Gly Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
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<213> 人工序列
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<223> 人源化HZ21 VHH
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
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Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Leu Gly Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Gly
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Gly
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Gly
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<223> IMGT HZ1 VHH FR3
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<213> 人工序列
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<223> Kabat HZ1/HZ2 VHH FR1
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<223> Kabat HZ1 VHH FR2
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<223> Kabat HZ1 VHH FR3
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Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
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<213> Homo sapiens（智人）
<400> 23
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Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg
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Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Asn Pro Gly Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Pro
115 120 125
Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu
130 135 140
Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys
145 150 155 160
Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu
165 170 175
Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser
180 185 190
Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu
195 200 205
Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu
210 215 220
Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala
225 230 235 240
Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu
245 250 255
Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg
260 265 270
Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu
275 280 285
Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
290 295 300
<210> 25
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GNHZ21
<400> 25
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
20 25 30
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
35 40 45
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser
50 55 60
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
65 70 75 80
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile
85 90 95
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala
100 105 110
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala
115 120 125
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
130 135 140
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
145 150 155 160
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
195 200 205
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe Gly Met Thr Trp Val Arg Gln
210 215 220
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Ser Leu Gly
225 230 235 240
Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
245 250 255
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
260 265 270
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Asn
275 280 285
Pro Gly Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
290 295 300
<210> 26
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GHZ21G
<400> 26
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
20 25 30
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
35 40 45
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser
50 55 60
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
65 70 75 80
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile
85 90 95
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala
100 105 110
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala
115 120 125
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
130 135 140
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
145 150 155 160
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
195 200 205
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe Gly Met Thr Trp Val Arg Gln
210 215 220
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Ser Leu Gly
225 230 235 240
Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
245 250 255
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
260 265 270
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Asn
275 280 285
Pro Gly Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro
305 310 315 320
Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly
325 330 335
Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys
340 345 350
His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp
355 360 365
Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys
370 375 380
Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln
385 390 395 400
Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu
405 410 415
Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu
420 425 430
Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro
435 440 445
Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala
450 455 460
Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His
465 470 475 480
Leu Ala Gln Pro
<210> 27
<211> 191
<212> PRT
<213> Homo sapiens（智人）
<400> 27
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190
<210> 28
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GHNHZ21
<400> 28
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser
195 200 205
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
210 215 220
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe Gly Met Thr Trp Val Arg Gln
225 230 235 240
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Ser Leu Gly
245 250 255
Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
260 265 270
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
275 280 285
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Asn
290 295 300
Pro Gly Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
305 310 315
<210> 29
<211> 65
<212> PRT
<213> Homo sapiens（智人）
<400> 29
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg
65
<210> 30
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens（智人）
<400> 30
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 31
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15RD-IL15
<400> 31
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
100 105 110
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
115 120 125
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
130 135 140
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
145 150 155 160
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
165 170 175
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
180 185 190
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
195
<210> 32
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HZ21RD15
<400> 32
Met Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg
20 25 30
Phe Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ser Gly Ile Ser Ser Leu Gly Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Asn Pro Gly Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser
130 135 140
Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg
145 150 155 160
Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser
165 170 175
Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp
180 185 190
Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Val
210 215 220
Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met
225 230 235 240
His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys
245 250 255
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser
260 265 270
Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile
275 280 285
Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser
290 295 300
Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe
305 310 315 320
Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
325 330 335
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头1
<400> 33
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头2
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 35
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化HZ21 VHH核酸
<400> 35
gaagttcagc tgctggaaag cggtggcggt ctggttcaac cgggcggtag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cgagcggttt cacctttagc cgtttcggta tgacctgggt gcgtcaagcg 120
ccgggcaagg gtctggagtg ggttagcggc atcagcagcc tgggtgacag caccctgtac 180
gcggatagcg tgaagggccg ttttaccatt agccgtgaca acagcaaaaa caccctgtat 240
ctgcagatga acagcctgcg tccggaagat accgcggttt actattgcac catcggcggt 300
agcctgaacc cgggcggtca aggtaccctg gtgaccgttt ctagc 345
<210> 36
<211> 900
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HZ21NG核酸
<400> 36
atggaagttc agctgctgga aagcggtggc ggtctggttc aaccgggcgg tagcctgcgt 60
ctgagctgcg cggcgagcgg tttcaccttt agccgtttcg gtatgacctg ggtgcgtcaa 120
gcgccgggca agggtctgga gtgggttagc ggcatcagca gcctgggtga cagcaccctg 180
tacgcggata gcgtgaaggg ccgttttacc attagccgtg acaacagcaa aaacaccctg 240
tatctgcaga tgaacagcct gcgtccggaa gataccgcgg tttactattg caccatcggc 300
ggtagcctga acccgggcgg tcaaggtacc ctggtgaccg tttctagcgg tggtggcggt 360
tctggtggcg gtggtagcac accattaggt ccggcgagca gcctgccgca gagcttcctg 420
ctgaagtgcc tggagcaagt gcgtaaaatc caaggtgacg gcgcggcgct gcaagaaaag 480
ctgtgcgcga cctacaaact gtgccacccg gaggaactgg ttctgctggg tcacagcctg 540
ggcattccgt gggcgccgct gagcagctgc ccgagccagg cgctgcaact ggcgggttgc 600
ctgagccagc tgcacagcgg tctgttcctg tatcagggcc tgctgcaagc gctggagggt 660
atcagcccgg aactgggtcc gaccctggat accctgcaac tggacgtggc ggattttgcg 720
accaccattt ggcagcaaat ggaggaactg ggtatggcgc cggcgctgca gccgacccaa 780
ggtgcgatgc cggcgttcgc gagcgcgttt cagcgtcgtg cgggtggcgt gctggttgcg 840
agccacctgc aaagcttcct ggaagtgagc taccgtgttc tgcgtcacct ggcgcagccg 900
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HZ1 IMGT CDR3
<400> 37
Ala Glu Gly Gly Ser Leu Asn Pro
1 5
<210> 38
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HZ21NGH
<400> 38
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Leu Gly Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Asn Pro Gly Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Pro Thr
115 120 125
Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg
130 135 140
Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr
145 150 155 160
Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser
165 170 175
Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr
180 185 190
Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile
195 200 205
Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn
210 215 220
Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys
225 230 235 240
Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly
245 250 255
Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp
260 265 270
Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu
275 280 285
Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile
290 295 300
Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
305 310 315
<210> 39
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-1抗体 重链
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Lys Tyr Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ile Arg Leu Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 40
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD-1抗体 轻链
<400> 40
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Pro Ser Gly Asn Val His Asn Tyr
20 25 30
Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His His Tyr Tyr Thr Ala Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (40)

1.特异性结合血清白蛋白的单域抗体或其抗原结合片段，其中，
(1)根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
下述3个互补决定区(CDRs)：序列为SEQ ID NO：4的CDR1，序列为SEQ ID NO：5的CDR2，序列为SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：37的CDR3；以及，
下述4个构架区(FRs)：序列为SEQ ID NO:10或17，或与SEQ ID NO:10或17相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1；序列为SEQ ID NO:11或18，或与SEQ ID NO:11或18相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2；序列为SEQ ID NO:12或19，或与SEQ ID NO:12或19相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3；序列为SEQ ID NO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4；
并且，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L；
或者，
(2)根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
下述3个互补决定区(CDRs)：序列为SEQ ID NO：7的CDR1，序列为SEQ ID NO：8的CDR2，序列为SEQ ID NO：9的CDR3；以及，
下述4个构架区(FRs)：序列为SEQ ID NO:14或20，或与SEQ ID NO:14或20相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR1；序列为SEQ ID NO:15或21，或与SEQ ID NO:15或21相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR2；序列为SEQ ID NO:16或22，或与SEQ ID NO:16或22相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR3；序列为SEQ ID NO:13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失、添加或其任意组合(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的FR4；
并且，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L；
优选地，(1)-(2)任一项中所述的置换为保守置换。
2.权利要求1所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点54上的L或S、在位点96上的A或P、在位点105上的A或T、在位点106上的E或I；或者，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点49上的L或S、在位点84上的A或P、在位点93上的A或T、在位点94上的E或I；
优选地，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点54上的S、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I；或者，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下列的一个或多个：在位点49上的S、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I。
3.权利要求1或2所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，根据IMGT或Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E或Q；
优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E。
4.权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E、在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点54上的S、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I、在位点123上的L；或者，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的E、在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点49上的S、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I、在位点108上的L。
5.权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的Q、在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点54上的S、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I、在位点123上的L；或者，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的Q、在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点49上的S、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I、在位点108上的L。
6.权利要求1-3任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，根据IMGT编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的Q、在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点54上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点96上的A、在位点105上的A、在位点106上的E、在位点123上的L；或者，根据Kabat编号系统定义，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：在位点1上的Q、在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点49上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点84上的A、在位点93上的A、在位点94上的E、在位点108上的L。
7.权利要求1-6任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中：
根据IMGT编号系统定义，FR1的序列选自SEQ ID NO:10或17，FR2的序列选自SEQ IDNO:11或18，FR3的序列选自SEQ ID NO:12或19，FR4的序列选自SEQ ID NO:13；
优选地，FR1序列为SEQ ID NO:10，FR2序列为SEQ ID NO:11，FR3序列为SEQ ID NO:12，FR4为SEQ ID NO:13；
或者，
根据Kabat编号系统定义，FR1的序列选自SEQ ID NO:14或20，FR2的序列选自SEQ IDNO:15或21，FR3的序列选自SEQ ID NO:16或22，FR4的序列选自SEQ ID NO:13；
优选地，FR1序列为SEQ ID NO:14，FR2序列为SEQ ID NO:15，FR3序列为SEQ ID NO:16，FR4为SEQ ID NO:13。
8.权利要求1-7任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
(1)根据IMGT编号系统定义，序列为SEQ ID NO：4的CDR1，序列为SEQ ID NO：5的CDR2，序列为SEQ ID NO：6的CDR3；以及，序列为SEQ ID NO:10的FR1，序列为SEQ ID NO:11的FR2，序列为SEQ ID NO:12的FR3，序列为SEQ ID NO:13的FR4；或者，
(2)根据Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID NO：7的CDR1，序列为SEQ ID NO：8的CDR2，序列为SEQ ID NO：9的CDR3；以及，序列为SEQ ID NO:14的FR1，序列为SEQ ID NO:15的FR2，序列为SEQ ID NO:16的FR3，序列为SEQ ID NO:13的FR4。
9.权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO：3所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NO：3相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与SEQ ID NO：3相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述变体序列保留了特异性结合人血清白蛋白的活性；优选地，所述的置换是保守置换；
优选地，根据IMGT编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L；或者，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L；
优选地，根据IMGT编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点54上的S、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I；或者，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点49上的S、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I；
优选地，根据IMGT或Kabat编号系统定义，所述变体还包含：在位点1上的E；
优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:3所示的序列。
10.权利要求1-7任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
(1)根据IMGT编号系统定义，序列为SEQ ID NO：4的CDR1，序列为SEQ ID NO：5的CDR2，序列为SEQ ID NO：37的CDR3；以及，序列为SEQ ID NO：17的FR1，序列为SEQ ID NO：18的FR2，序列为SEQ ID NO：19的FR3，序列为SEQ ID NO：13的FR4；或者，
(2)根据Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID NO：7的CDR1，序列为SEQ ID NO：8的CDR2，序列为SEQ ID NO：9的CDR3；以及，序列为SEQ ID NO：20的FR1，序列为SEQ ID NO：21的FR2，序列为SEQ ID NO：22的FR3，序列为SEQ ID NO：13的FR4。
11.权利要求1-7和10中任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO：1所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ IDNO：1相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与SEQ IDNO：1相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述变体序列保留了特异性结合人血清白蛋白的活性；优选地，所述的置换是保守置换；
优选地，根据IMGT编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L；或者，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L；
优选地，根据IMGT编号系统定义，所述变体还包含选自下列的一个或多个：在位点54上的L、在位点96上的A、在位点105上的A、在位点106上的E；或者，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点49上的L、在位点84上的A、在位点93上的A、在位点94上的E；
优选地，根据IMGT或Kabat编号系统定义，所述变体还包含：在位点1上的Q；
优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的序列。
12.权利要求1-7任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
(1)根据IMGT编号系统定义，序列为SEQ ID NO：4的CDR1，序列为SEQ ID NO：5的CDR2，序列为SEQ ID NO：6的CDR3；以及，序列为SEQ ID NO：17的FR1，序列为SEQ ID NO：11的FR2，序列为SEQ ID NO：12的FR3，序列为SEQ ID NO：13的FR4；或者，
(2)根据Kabat编号系统定义，序列为SEQ ID NO：7的CDR1，序列为SEQ ID NO：8的CDR2，序列为SEQ ID NO：9的CDR3；以及，序列为SEQ ID NO：20的FR1，序列为SEQ ID NO：15的FR2，序列为SEQ ID NO：16的FR3，序列为SEQ ID NO：13的FR4。
13.权利要求1-7和12中任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO：2所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ IDNO：2相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，或者与SEQ IDNO：2相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)；优选地，所述变体序列保留了特异性结合人血清白蛋白的活性；优选地，所述的置换是保守置换；
优选地，根据IMGT编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点24上的A、在位点50上的L、在位点83上的S、在位点95上的R、在位点123上的L；或者，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点5上的L、在位点23上的A、在位点45上的L、在位点74上的S、在位点83上的R、在位点108上的L；
优选地，所述变体还包含选自下列的一个或多个：在位点54上的S、在位点96上的P、在位点105上的T、在位点106上的I；或者，根据Kabat编号系统定义，所述变体包含选自下列的一个或多个：在位点49上的S、在位点84上的P、在位点93上的T、在位点94上的I；
优选地，根据IMGT或Kabat编号系统定义，所述变体还包含：在位点1上的Q；
优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:2所示的序列。
14.权利要求1-13任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段是人源化的VHH；
优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段的V基因所编码的区段的人源化程度不低于79％(例如80％、85％、89％、90％、93％、95％、97％、或100％)；
优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段的J基因所编码的区段的人源化程度不低于89％(例如90％、93％、95％、97％、98％、或100％)。
15.权利要求1-14任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段以小于约40nM，例如小于约30nM、20nM、10nM、8nM、5nM、3nM，1nM或更小的EC50结合人血清白蛋白；
优选地，所述EC50通过ELISA技术测得。
16.多特异性抗体，其包含权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，以及，另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；
优选地，所述多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体或四特异性抗体；
可选地，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有与肿瘤特异性抗原(TSA)，肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)，T细胞衔接器(T cell engager)分子，肿瘤免疫相关分子或自身免疫调节相关分子中至少一个分子或抗原的结合特异性；
优选地，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有与PD-1、PD-L1、CD19、CD20、CTLA4、IL6、IL6R或TNFα中至少一个的抗原结合特异性。
17.权利要求16所述的多特异性抗体，其中，所述多特异性抗体从其N端至C端具有下列结构：A-L-B或B-L-A，其中：A为权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，L为接头(linker)或缺失，B为一个或多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中，所述多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有结合同一抗原或不同抗原的活性；
或者，所述多特异性抗体从其N端至C端具有选自下列的结构：B1-L1-A-L2-B2，A-L1-B1-L2-B2，B1-L1-B2-L2-A，其中：A为权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，L1和L2各自独立地为接头(linker)或缺失，B1和B2各自独立地为一个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中，所述B1和B2具有结合同一抗原或不同抗原的活性；
可选地，所述多特异性抗体是双特异性抗体，并且L、L1和L2各自独立地为(G4S)n，其中n选自0-10的整数，L、L1和L2彼此相同或不同；优选地，L、L1和L2各自独立地选自SEQ ID NO:33或34所示的序列。
18.融合蛋白，其包含权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的生物活性多肽；
优选地，所述另外的生物活性多肽是具有治疗活性、结合活性或酶活性的多肽或蛋白；
优选地，所述另外的生物活性多肽直接或通过接头连接至所述单域抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端；
优选地，所述融合蛋白从其N端至C端具有下列结构：A-L-B或B-L-A，其中：A为权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，L为接头(linker)或缺失，B为一个或多个另外的生物活性多肽；
或者，所述融合蛋白从其N端至C端具有选自下列的结构：B1-L1-A-L2-B2，A-L1-B1-L2-B2，B1-L1-B2-L2-A，其中：A为权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，L1和L2各自独立地为接头(linker)或缺失，B1和B2各自独立地为一个另外的生物活性多肽；
可选地，L、L1和L2各自独立地为(G4S)n，其中n选自0-10的整数，L、L1和L2彼此相同或不同；优选地，L、L1和L2各自独立地选自SEQ ID NO:33或34所示的序列。
19.权利要求18所述的融合蛋白，其包含一个或多个(例如，两个)所述单域抗体或其抗原结合片段以及一个或多个(例如，两个)所述另外的生物活性多肽；其中，所述多个单域抗体或其抗原结合片段是相同或不同的，所述多个另外的生物活性多肽是相同或不同的；
优选地，所述融合蛋白包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段以及一个所述另外的生物活性多肽；
优选地，所述融合蛋白包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段以及两个所述另外的生物活性多肽；
优选地，所述两个另外的生物活性多肽各自直接或通过linker分别连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端；
优选地，所述两个另外的生物活性多肽直接或通过linker彼此连接，所述彼此连接的两个另外的生物活性多肽进一步直接或通过linker连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端或C端；
优选地，所述两个另外的生物活性多肽各自直接或通过linker连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端和C端，或C端和N端。
20.权利要求18或19所述的融合蛋白，其中，所述生物活性多肽选自粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、集落刺激因子(CSF)、G蛋白偶联受体、IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白、人生长激素(GH)、细胞因子结合蛋白、蛋白A、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤抑制子、转移生长因子、α1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、骨刺激蛋白、降钙素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子途径抑制物、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促皮质素释放因子、自体毒素、乳铁蛋白、肌肉生长抑制素、热休克蛋白家族成员(如热休克蛋白70或GP96),或其任意组合；
优选地，所述生物活性多肽选自G-CSF、GH、IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白，或其任意组合。
21.权利要求18-20任一项所述的融合蛋白，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段如权利要求8或9中所定义，所述生物活性多肽选自G-CSF、GH、IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白，或其任意组合；
优选地，所述生物活性多肽具有选自下列的序列：SEQ ID NOs:23、27、29-31任一项所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NOs:23、27、29-31任一项所示的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述变体序列保留了其所源自的序列的生物学功能；
优选地，所述生物活性多肽选自下列的序列：SEQ ID NOs:23、27、29-31；
优选地，所述融合蛋白具有选自下列的序列：SEQ ID NOs:24、25、26、28、32、38任一项所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NOs:24、25、26、28、32、38任一项所示的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述变体序列保留了其所源自的生物活性多肽序列的生物学功能；
优选地，所述融合蛋白具有选自下列的序列：SEQ ID NOs:24、25、26、28、32、38。
22.缀合物，其包含权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段以及连接于所述单域抗体或其抗原结合片段的化疗药物、放射性药品、或显影剂；
优选地，所述化疗药物选自以下的一个或多个：13-顺-视黄酸(13-cis-RetinoicAcid)，2-CdA，2-氯脱氧腺苷(2-Chlorodeoxyadenosine)，5-阿扎胞苷(5-Azacitidine)，5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)，5-FU，6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine)，6-MP，6-TG，6-硫代鸟嘌呤(6-Thioguanine)，A，Abraxane，放线菌素-D(Actinomycin-D)，ALIMTA，阿利维A酸(Alitretinoin)，爱克兰全反视黄酸(All-transretinoic Acid)，六甲蜜胺(Altretamine)，甲氨蝶呤(Amethopterin)，氨磷汀(Amifostine)，氨鲁米特(Aminoglutethimide)，阿那格雷(Anagrelide)，阿那曲唑(Anastrozole)，阿糖胞苷(Arabinosylcytosine)，Ara-C，三氧化二砷(Arsenic Trioxide)，天冬酰胺酶(Asparaginase)，ATRA，阿扎胞苷(Azacitidine)，BCG，BCNU，贝沙罗汀(Bexarotene)，比卡鲁胺(Bicalutamide)，BiCNU，博来霉素(Bleomycin)，Bortezomib，白消安(Busulfan)，C225，亚叶酸钙(Calcium Leucovorin)，喜树碱-11(Camptothecin-11)，卡培他滨(Capecitabine)，CaracTM，卡铂(Carboplatin)，卡莫司汀(Carmustine)，CarmustineWafer，康士德CC-5013，CCNU，CDDP，CeeNU，苯丁酸氮芥(Chlorambucil)，顺铂(Cisplatin)，亚叶酸因子(Citrovorum Factor)，克拉屈滨(Cladribine)，可的松(Cortisone)，CPT-11，环磷酰胺(Cyclophosphamide)，阿糖胞苷(Cytarabine)，阿糖胞苷脂质体(CytarabineLiposomal)，赛德萨达卡巴嗪(Dacarbazine)，Dacogen，更生霉素(Dactinomycin)，Darbepoetin Alfa，Dasatinib，柔红霉素(Daunomycin)，柔红霉素(Daunorubicin)，盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride)，柔红霉素脂质体(Daunorubicin Liposomal)，地卡特隆(Decadron)，地西他滨(Decitabine)，DepoCytTM，地塞米松(Dexamethasone)，醋酸地塞米松(Dexamethasone acetate)，地塞米松磷酸钠(Dexamethasone SodiumPhosphate)，地塞米松(Dexasone)，右雷佐生(Dexrazoxane)，DHAD，DIC，Diodex，多西紫杉醇(Docetaxel)，多柔比星(Doxorubicin)，多柔比星脂质体(Doxorubicin liposomal)，DroxiaTM，DTIC，EligardTM，EllenceTM，乐沙定(Eloxatin)TM，表柔比星(Epirubicin)，阿法依伯汀(Epoetin alfa)，ErbituxTM，Erlotinib，欧文氏菌属L-天冬酰胺酶(Erwinia L-asparaginase)，雌莫司汀(Estramustine)，氨磷汀(Ethyol)，依托泊苷(Etoposide)，磷酸依托泊苷(Etoposide Phosphate)，依西美坦(Exemestane)，法乐通非格司亭(Filgrastim)，氟尿苷(Floxuridine)，氟达拉滨(Fludarabine)，氟尿嘧啶(Fluorouracil)，氟尿嘧啶(Fluorouracil)(乳膏)，氟甲睾酮(Fluoxymesterone)，氟他胺(Flutamide)，亚叶酸(Folinic Acid)，氟维司群(Fulvestrant)，Gefitinib，吉西他滨(Gemcitabine)，奥佐米星(ozogamicin)，健择GleevecTM，Wafer，戈舍瑞林(Goserelin)，地塞米松(Hexadrol)，克瘤灵六甲蜜胺(Hexamethylmelamine)，HMM，和美新羟基脲醋酸氢化可的松氢化可的松(Hydrocortisone)，氢化可的松磷酸钠(Hydrocortisone SodiumPhosphate)，氢化可的松琥珀酸钠(Hydrocortisone Sodium Succinate)，氢化可的松磷酸(Hydrocortone Phosphate)，羟脲(Hydroxyurea)，伊达比星(Idarubicin)，异环磷酰胺(Ifosfamide)，甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)，咪唑羧酰胺(ImidazoleCarboxamide)，伊立替康(Irinotecan)，异维A酸(Isotretinoin)，Lapatinib，L-天冬酰胺酶，LCR，Lenalidomide，来曲唑(Letrozole)，亚叶酸钙(Leucovorin)，苯丁酸氮芥(Leukeran)，LeukineTM，亮丙瑞林(Leuprolide)，长春新碱(Leurocristine)，LeustatinTM，脂质体Ara-C，Liquid洛莫司汀(Lomustine)，L-PAM，L-沙可来新(L-Sarcolysin)，LupronM，Maxidex，氮芥(Mechlorethamine)，盐酸氮芥(MechlorethamineHydrochloride)，美卓乐梅格施甲地孕酮(Megestrol)，醋酸甲地孕酮(MegestrolAcetate)，美法仑(Melphalan)，巯嘌呤(Mercaptopurine)，美司钠(Mesna)，MesnexTM，甲氨蝶呤(Methotrexate)，甲氨蝶呤钠(Methotrexate Sodium)，甲泼尼龙(Methylprednisolone)，丝裂霉素(Mitomycin)，丝裂霉素-C(Mitomycin-C)，米托蒽醌(Mitoxantrone)，MTC，MTX，氮芥(Mustine)，马利兰MylocelTM，诺维本萘拉滨(Nelarabine)，NeulastaTM，优保津尼鲁米特(Nilutamide)，氮芥(Nitrogen Mustard)，能灭瘤奥曲肽(Octreotide)，醋酸奥曲肽(Octreotide acetate)，安可平OnxalTM，Oprevelkin，奥沙利铂(Oxaliplatin)，紫杉醇(Paclitaxel)，蛋白结合紫杉醇，帕米磷酸(Pamidronate)，Panitumumab，培门冬酶(Pegaspargase)，PEG-L-天冬酰胺酶，培美曲塞(PEMETREXED)，喷司他丁(Pentostatin)，苯丙氨酸氮芥(Phenylalanine Mustard)，泼尼松龙(Prednisolone)，泼尼松(Prednisone)，丙卡巴肼(Procarbazine)，具有卡莫司汀(Carmustine)植入物的Prolifeprospan 20，雷洛昔芬(Raloxifene)，柔红霉素盐酸盐(Rubidomycin hydrochloride)，善得定Sandostatin沙格司亭(Sargramostim)，Sorafenib，SPRYCELTM，STI-571，链佐星(Streptozocin)，SU11248，Sunitinib，他莫昔芬(Tamoxifen)，泰素泰索帝替莫唑胺(Temozolomide)，替尼泊苷(Teniposide)，TESPA，沙利度胺(Thalidomide)，硫鸟嘌呤(Thioguanine)，Thioguanine Thiophosphoamide，塞替派(Thiotepa)，托泊替康(Topotecan)，托瑞米芬(Toremifene)，维A酸(Tretinoin)，TrexallTM，TSPA，VCR，VectibixTM，凡毕士ViadurTM，长春碱(Vinblastine)，硫酸长春碱(Vinblastine Sulfate)，Vincasar长春新碱(Vincristine)，长春瑞滨(Vinorelbine)，酒石酸长春瑞滨(Vinorelbine tartrate)，VLB，VM-26，Vorinostat，VP-16，威猛希罗达ZevalinTM，诺雷德唑来膦酸(Zoledronic acid)或Zolinza；
所述放射性药品选自以下的一个或多个：碳-11，碳-14，铬-51，钴-57，钴-58，铒-169，氟-18，镓-67，金-198，铟-111，铟-113m，碘-123，碘-125，碘-131，铁-59，氪-81m，氮-13，氧-15，磷-32，铼-186，铷-82，钐-153，硒-75，锶-89，锝-99m，铊-201，氚，氙-127，氙-133或钇-90；
所述显像剂选自以下的一个或多个：钆，磁铁矿/磁石(magnetite)，锰，锝，I125，I131，P32，Tl201，碘帕醇(Iopamidol)或PET-FDG。
23.分离的核酸分子，其编码权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求16-17任一项所述的多特异性抗体、或权利要求18-21任一项所述的融合蛋白。
24.分离的核酸分子，其包含(i)SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列或其简并序列；(ii)与(i)所述的核苷酸序列基本上相同的序列(例如，与(i)所述的核苷酸序列相比，具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高序列同一性的序列，或具有一个或更多个核苷酸取代的序列)；或(iii)与(i)所述的核苷酸序列相差不超过3、6、15、30或45个核苷酸的序列。
25.载体，其包含权利要求23或24所述的分离的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。
26.宿主细胞，其包含权利要求23或24所述的分离的核酸分子和/或权利要求25所述的载体。
27.制备权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求16-17任一项所述的多特异性抗体、或权利要求18-21任一项所述的融合蛋白的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养权利要求26所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、或融合蛋白；
优选地，所述回收包括收集菌体并纯化，其中包括将蛋白包涵体的变复性产物进行层析的步骤。
28.药物组合物，其包含权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求16-17任一项所述的多特异性抗体、权利要求18-21任一项所述的融合蛋白、权利要求22所述的缀合物、权利要求23或24所述的分离的核酸分子、权利要求25所述的载体或权利要求26所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
优选地，所述药物组合物还包含另外的药学活性剂，例如具有抗肿瘤活性的药物；优选地，所述另外的药学活性剂包括抗PD-1/PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG-3抗体或抗TIGIT抗体；
可选地，所述药物组合物包含的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白、缀合物、分离的核酸分子、载体或宿主细胞，可与所述另外的药学活性剂同时、分开或相继施用。
29.试剂盒，其包含权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求16-17任一项所述的多特异性抗体、权利要求18-21任一项所述的融合蛋白、权利要求22所述的缀合物、权利要求23或24所述的分离的核酸分子、权利要求25所述的载体、权利要求26所述的宿主细胞或权利要求28所述的药物组合物，以及任选地使用说明书。
30.权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段用于延长与其连接的活性剂的体内半衰期的用途，其中，体内半衰期的所述延长是相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段时所述活性剂的体内半衰期；
优选地，所述活性剂是另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；优选地，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物如权利要求16或17中所定义；
优选地，所述活性剂是另外的生物活性多肽；优选地，所述另外的生物活性多肽如权利要求18-21任一项中所定义；
优选地，所述活性剂是化疗药物、放射性药品或显影剂；优选地，所述化疗药物、放射性药品或显影剂如权利要求22中所定义。
31.延长活性剂的体内半衰期的方法，其包括将所述活性剂与权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段连接；其中，体内半衰期的所述延长是相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段时所述活性剂的体内半衰期；
优选地，所述活性剂是另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；优选地，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物如权利要求16或17中所定义；
优选地，所述活性剂是另外的生物活性多肽；优选地，所述另外的生物活性多肽如权利要求18-21任一项中所定义；
优选地，所述活性剂是化疗药物、放射性药品或显影剂；优选地，所述化疗药物、放射性药品或显影剂如权利要求22中所定义。
32.权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求16-17任一项所述的多特异性抗体、权利要求18-21任一项所述的融合蛋白、权利要求22所述的缀合物、权利要求23或24所述的分离的核酸分子、权利要求25所述的载体、权利要求26所述的宿主细胞或权利要求28所述的药物组合物，在制备药物中的用途，所述药物显示相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段的相应的药物延长的体内半衰期；
优选地，所述药物是蛋白质类药物。
33.权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求16-17任一项所述的多特异性抗体、权利要求18-21任一项所述的融合蛋白、权利要求22所述的缀合物、权利要求23或24所述的分离的核酸分子、权利要求25所述的载体、权利要求26所述的宿主细胞或权利要求28所述的药物组合物，在制备用于肿瘤、感染、自身免疫疾病、代谢相关的疾病、或发育相关的疾病的预防和/或治疗或辅助治疗的药物中的用途。
34.融合蛋白，其包括权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段和G-CSF；
优选地，所述G-CSF具有如SEQ ID NO:23所示的序列其变体序列，所述变体序列与SEQID NO:23相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述变体序列具有G-CSF的生物学功能；
优选地，所述融合蛋白具有选自下列的序列：SEQ ID NOs:24、25、26任一项所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NOs:24、25、26任一项所示的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；
优选地，所述融合蛋白以小于约40nM，例如小于约30nM、20nM、15nM、10nM、8nM、5nM、3nM，1nM或更小的EC50结合人血清白蛋白；优选地，所述EC50通过ELISA技术测得。
35.权利要求34所述的融合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于：
(1)促进造血干细胞的增值和/或分化，
(2)增加血液中中性粒和/或白细胞的数量，
(3)激活血液中中性粒细胞的功能，
(4)减轻或消除骨髓造血抑制，
(5)预防和/或治疗感染，
(6)预防和/或治疗肿瘤治疗引起的中性粒细胞和/或白细胞减少，或
(7)(1)-(6)的任意组合。
36.融合蛋白，其包括权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段和生长激素多肽；
优选地，所述生长激素多肽具有如SEQ ID NO:27所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NO:27相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述变体序列具有生长激素的生物学功能；
优选地，所述融合蛋白具有选自下列的序列：SEQ ID NOs:28、38任一项所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NOs:28、38任一项所示的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；
优选地，所述融合蛋白以小于约40nM，例如小于约30nM、20nM、15nM、10nM、8nM、5nM、3nM，1nM或更小的EC50结合人血清白蛋白；优选地，所述EC50通过ELISA技术测得。
37.权利要求36所述的融合蛋白，在制备药物中的用途，所述药物用于：
(1)促进蛋白质合成，影响脂肪和矿物质代谢，
(2)调节代谢，促进身体发育，促进身高增长，
(3)促进哺乳动物骨骼、肌肉、内脏和全身生长，或
(4)(1)-(3)的任意组合；
优选地，所述哺乳动物为人；优选地，所述哺乳动物为儿童。
38.融合蛋白，其包括权利要求1-15任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段和具有IL-15活性的多肽；
优选地，所述具有IL-15活性的多肽选自IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白、及其任意组合；
优选地，所述具有IL-15活性的多肽具有如SEQ ID NO:29-31任一项所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NO:29-31任一项相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；优选地，所述变体序列具有IL-15的生物学功能；
优选地，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:32所示的序列或其变体序列，所述变体序列与SEQ ID NO:32所示的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性；
优选地，所述融合蛋白以小于约40nM，例如小于约30nM、20nM、15nM、10nM、8nM、5nM、3nM，1nM或更小的EC50结合人血清白蛋白；优选地，所述EC50通过ELISA技术测得。
39.权利要求38所述的融合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于：
(1)刺激T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞和/或NKT细胞的活化与增殖，促进T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞和/或NKT细胞的存活；
(2)诱导B淋巴细胞增殖和分化，增强免疫球蛋白分泌，维持记忆细胞和B细胞分化；
(3)诱导淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)的活性；
(4)与IL-12协同刺激NK细胞分泌细胞因子(如IFN-γ)；
(5)在受试者中刺激免疫应答(例如固有免疫应答和/或适应性免疫应答，例如体液免疫应答和/或细胞免疫应答)；例如，刺激针对肿瘤的免疫应答；
(6)在受试者中预防和/或治疗肿瘤，例如非小细胞肺癌；或，
(7)(1)-(6)的任意组合；
优选地，所述融合蛋白与另外的药学活性剂(例如具有抗肿瘤活性的药物)联合施用；
优选地，所述融合蛋白与免疫检查点抑制剂联合施用；
优选地，所述免疫检查点抑制剂选自抗PD-1/PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG-3抗体、抗TIGIT抗体或其任意组合；
优选地，所述受试者是人。
40.权利要求39所述的用途，其中，所述融合蛋白与抗PD-1/PD-L1抗体联合施用；
优选地，所述抗PD-1/PD-L1抗体包含如下任一组的重链可变区和/或轻链可变区：(1)Nivolumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(2)Pembrolizumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(3)Atezolizumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(4)Durvalumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(5)Avelumab或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，(6)αPD-1或其变体的重链可变区和/或轻链可变区，所述αPD-1具有SEQID NO:39所示的重链和SEQ ID NO:40所示的轻链，(7)5C10H2L2或5C10H2L2-IgG1mt的重链可变区和/或轻链可变区；
优选地，所述抗PD-1/PD-L1抗体选自：Nivolumab、Pembrolizumab、Atezolizumab、Durvalumab、Avelumab、αPD-1、5C10H2L2或5C10H2L2-IgG1mt。
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