CN112409480A - 结合血清白蛋白的蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，本发明涉及一种结合血清白蛋白的单域抗体以及包含所述单域抗体的多特异性抗体、融合蛋白和缀合物。本发明的单域抗体能够高效结合人血清白蛋白，从而延长与其连接的分子的体内半衰期。本发明的单域抗体及包含所述单域抗体的多特异性抗体、融合蛋白和缀合物可用于制备预防和/或治疗或辅助治疗肿瘤、感染、自身免疫疾病、或与代谢或发育相关的疾病的药物。

Description

结合血清白蛋白的蛋白及其用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，更具体地，本发明涉及一种结合血清白蛋白的单域抗体以及包含所述单域抗体的多特异性抗体、融合蛋白和缀合物，所述单域抗体能够延长与其连接的活性剂的体内半衰期。
技术背景
蛋白质类药物是由α-氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，包括小分子量的多肽和具有更高级结构的蛋白质。与小分子化药相比，蛋白质类药物具有药效高、特异性好、用途广泛、毒副作用低等优势。
然而大部分蛋白类药物由于分子量小，且在体内不稳定，半衰期很短，为了达到治疗效果，往往需要多次、高剂量注射，增加了治疗负担，同时降低了患者依从性。
针对蛋白药物体内半衰期短的现实，目前开发了多种蛋白长效化方式，包括对蛋白进行突变修饰，提高蛋白稳定性，避免被蛋白酶识别分解，但突变后易产生免疫原性，降低药物的体内功能；另一种是进行PEG偶联，通过增加蛋白的水合半径，避免被肾脏快速清除，同时可遮蔽部分蛋白酶位点，延缓降解速率，但高分子量的PEG易导致蛋白活性损失，且存在肾脏积累导致肾小球空心化的风险。将药物与人体内半衰期长的蛋白构建融合蛋白，是另一种有效的长效化方式，目前主要使用的是人血清白蛋白、抗体Fc区、转铁蛋白、CTP、HAP及ELP融合等。人血清白蛋白(Human Serum Albumin，简称HSA)是人血浆中最主要的蛋白质，其浓度为34-54g/L，约占血浆总蛋白的60％。HSA由585个氨基酸，分子量为66kD，在体液中人血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等，同时维持血液正常的渗透压。HSA是人体内半衰期最长的蛋白，半衰期长达19天，其可通过结合新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor，FcRn)，避免被溶酶体降解，从而实现长半衰期。HSA因分子量大，与多肽或蛋白融合后对活性、工艺、制剂以及药代动力学特性都有一定影响，进而影响药效。
本领域迫切需要更优的蛋白长效化技术，并应用于临床药物开发，满足用药需求，提高患者依从性。单域抗体仅含有一个重链可变区结构域，但保留了抗原结合能力，具有分子量小、亲和力高、稳定性好等优点，广泛用于与蛋白类药物融合实现新的功能。因此，针对血清白蛋白的纳米抗体为蛋白长效化提供了可行途径，例如WO 2012175400公开了结合白蛋白的纳米抗体从而延长了血清半衰期。然而，目前并无包含靶向白蛋白的纳米抗体的药物上市，因此，发展具有更优活性的结合血清白蛋白的纳米抗体依然是必要的。
发明内容
本发明为解决目前长效化蛋白的难题，筛选获得了与人血清白蛋白高亲和力结合的单域抗体，其可结合人血清白蛋白实现延长半衰期的作用，且因其分子量小，可避免HSA、Fc等融合蛋白对活性、工艺及药效的不利影响。同时本发明获得的抗体或其抗原结合片段，例如单域抗体或融合蛋白，具有以较低成本在微生物表达系统中生产的可能，具有作为长期大剂量需要的慢性疾病治疗药物的的巨大潜力。例如，将本发明的单域抗体与G-CSF融合，可以显著延长刺激中性粒细胞增殖的时间。
在本申请中，发明人首先开发了具有优良性质的驼源单域抗体，其能够特异性识别人血清白蛋白。在此基础上，发明人又付出了大量的创造性劳动，对该驼源抗体进行了深入的研究和改造，从而开发了该驼源单域抗体的人源化抗体。
本发明的单域抗体(特别是人源化抗体)是极为有利的，其不仅保留了(或甚至提高了)亲本驼源单域抗体的功能和性质，例如以很高的亲和力和特异性结合人血清白蛋白，从而具有用于延长与其连接的活性剂的体内半衰期的潜力，而且具有极高的人源化程度，可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应。所以本发明的抗体具有重大的临床价值。
单域抗体
本发明第一方面，提供了一种特异性结合血清白蛋白的单域抗体或其抗原结合片段，所述单域抗体由4个构架区(FRs)和3个互补决定区(CDRs)组成，所述4个构架区分别为FR1-FR4，所述3个互补决定区分别为CDR1-CDR3，所述抗原结合片段包含该单域抗体的至少一部分，该部分足以赋予该片段特异性结合血清白蛋白的能力。在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段特异性结合人血清白蛋白。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
(1a)序列为SEQ ID NO：2或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：3与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：4与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按IMGT编号系统定义；或，
(1b)序列为SEQ ID NO：5或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：6或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：7或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按Chothia或Kabat编号系统定义。
在某些实施方案中，(1a)-(1b)任一项中所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：2的CDR1，序列为SEQ ID NO：3的CDR2，序列为SEQ ID NO：4的CDR3，其中所述CDR的序列按IMGT编号系统定义。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：5的CDR1，序列为SEQ ID NO：6的CDR2，序列为SEQ ID NO：7的CDR3，其中所述CDR的序列按Chothia或Kabat编号系统定义。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包括来自人或驼的构架区(FRs)。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段的包括来自人和驼的FRs。
在某些实施方案中，本发明的单域抗体或其抗原结合片段包含：
人免疫球蛋白的重链构架区或其变体，所述变体与其所源自的胚系抗体基因序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。
在此类实施方案中，本发明的单域抗体或其抗原结合片段的的FR可以包含一个或多个非人源(例如，驼源)氨基酸残基，例如所述FR可以包含一或多个氨基酸回复突变，在这些回复突变中有相应的驼源氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下述的序列：
(1)SEQ ID NO：1所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
(2)SEQ ID NO：8所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；或，
(3)SEQ ID NO：9所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下述的序列：SEQID NOs:1、8-9任一项所示的序列。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
(2a)序列为SEQ ID NO：11或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：12或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按IMGT编号系统定义；或，
(2b)序列为SEQ ID NO：14或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：15或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：16或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按Chothia或Kabat编号系统定义。
在某些实施方案中，(2a)-(2b)任一项中所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：11的CDR1，序列为SEQ ID NO：12的CDR2，序列为SEQ ID NO：13的CDR3，其中所述CDR的序列按IMGT编号系统定义。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：14的CDR1，序列为SEQ ID NO：15的CDR2，序列为SEQ ID NO：16的CDR3，其中所述CDR的序列按Chothia或Kabat编号系统定义。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包括来自人或驼的FRs。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段的包括来自人和驼的FRs。
在某些实施方案中，本发明的单域抗体或其抗原结合片段包含：
人免疫球蛋白的重链构架区或其变体，所述变体与其所源自的胚系抗体基因序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。
在此类实施方案中，本发明的单域抗体或其抗原结合片段的的FR可以包含一个或多个非人源(例如，驼源)氨基酸残基，例如所述FR可以包含一或多个氨基酸回复突变，在这些回复突变中有相应的驼源氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下述的序列：
(1)SEQ ID NO：10所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；或，
(2)SEQ ID NO：17所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下述的序列：SEQID NOs:10、17。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
(3a)序列为SEQ ID NO：19或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：20或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：21或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按IMGT编号系统定义；或，
(3b)序列为SEQ ID NO：22或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：23或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：24或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按Chothia或Kabat编号系统定义。
在某些实施方案中，(3a)-(3b)任一项中所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：19的CDR1，序列为SEQ ID NO：20的CDR2，序列为SEQ ID NO：21的CDR3，其中所述CDR的序列按IMGT编号系统定义。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：22的CDR1，序列为SEQ ID NO：23的CDR2，序列为SEQ ID NO：24的CDR3，其中所述CDR的序列按Chothia或Kabat编号系统定义。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段的包括来自人或驼的FRs。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段的包括来自人和驼的FRs。
在某些实施方案中，本发明的单域抗体或其抗原结合片段包含：
人免疫球蛋白的重链构架区或其变体，所述变体与其所源自的胚系抗体基因序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。
在此类实施方案中，本发明的单域抗体或其抗原结合片段的的FR可以包含一个或多个非人源(例如，驼源)氨基酸残基，例如所述FR可以包含一或多个氨基酸回复突变，在这些回复突变中有相应的驼源氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下述的序列：SEQID NO：18所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
(4a)序列为SEQ ID NO：26或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：27或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：28与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按IMGT编号系统定义；或，
(4b)序列为SEQ ID NO：29或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：30或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：31或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按Chothia或Kabat编号系统定义。
在某些实施方案中，(4a)-(4b)任一项中所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：26的CDR1，序列为SEQ ID NO：27的CDR2，序列为SEQ ID NO：28的CDR3，其中所述CDR的序列按IMGT编号系统定义。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：29的CDR1，序列为SEQ ID NO：30的CDR2，序列为SEQ ID NO：31的CDR3，其中所述CDR的序列按Chothia或Kabat编号系统定义。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段的包括来自人或驼的FRs。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段的包括来自人和驼的FRs。
在某些实施方案中，本发明的单域抗体或其抗原结合片段包含：
人免疫球蛋白的重链构架区或其变体，所述变体与其所源自的胚系抗体基因序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。
在此类实施方案中，本发明的单域抗体或其抗原结合片段的的FR可以包含一个或多个非人源(例如，驼源)氨基酸残基，例如所述FR可以包含一或多个氨基酸回复突变，在这些回复突变中有相应的驼源氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下述的序列：SEQID NO：25所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
(5a)序列为SEQ ID NO：33或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：34或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：35或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按IMGT编号系统定义；或，
(5b)序列为SEQ ID NO：36或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：37或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：38或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按Chothia或Kabat编号系统定义。
在某些实施方案中，(5a)-(5b)任一项中所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：33的CDR1，序列为SEQ ID NO：34的CDR2，序列为SEQ ID NO：35的CDR3，其中所述CDR的序列按IMGT编号系统定义。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：序列为SEQ ID NO：36的CDR1，序列为SEQ ID NO：37的CDR2，序列为SEQ ID NO：38的CDR3，其中所述CDR的序列按Chothia或Kabat编号系统定义。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段的包括来自人或驼的FRs。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段的包括来自人和驼的FRs。
在某些实施方案中，本发明的单域抗体或其抗原结合片段包含：
人免疫球蛋白的重链构架区或其变体，所述变体与其所源自的胚系抗体基因序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个氨基酸的保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的保守置换)。
在此类实施方案中，本发明的单域抗体或其抗原结合片段的的FR可以包含一个或多个非人源(例如，驼源)氨基酸残基，例如所述FR可以包含一或多个氨基酸回复突变，在这些回复突变中有相应的驼源氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下述的序列：SEQID NO：32所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段是驼源的VHH、人源化的VHH或驼源化的VH。
人源化的VHH是指，用在来自于人类抗体的VH结构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换所述天然存在的VHH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，从而获得的单域抗体。
驼源化的VH是指，用在天然存在重链抗体的VHH结构域中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基替换常规4链抗体的天然存在的VH结构域(例如，来自于人类的)的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，从而获得的单域抗体。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段以小于约40nM，例如小于约30nM、20nM、10nM、8nM、5nM、3nM，1nM或更小的EC50结合人血清白蛋白。在某些实施方案中，所述EC50通过ELISA技术测得。
本发明的单域抗体不限于具体的生物来源或具体的制备方法。例如，本发明的单域抗体可以这样获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)通过将天然存在的VHH结构域“人源化”或者通过表达编码这样的人源化VHH结构域的核酸；(4)通过将来自于任何动物物种特别是哺乳动物物种诸如来自于人类的天然存在的VH结构域“骆驼源化”，或者通过表达编码这样的骆驼源化的VH结构域的核酸；(5)应用合成或半合成技术制备蛋白、多肽或其它氨基酸序列；(6)通过应用核酸合成技术制备编码单域抗体的核酸，然后表达这样获得的核酸；和/或(7)通过前述的任何组合。
多特异性抗体
本发明第二方面，提供了一种多特异性抗体，其包含本发明第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。
在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有不同于前述单域抗体或其抗原结合片段的结合特异性。在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物不结合血清白蛋白。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段能够延长与其连接的另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物的体内半衰期，体内半衰期的所述延长是相对于如果缺少所述单域抗体或其抗原结合片段时所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物的体内半衰期。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段，以及一个或多个(例如两个)所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中，所述多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物可以具有彼此不同的结合特异性。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体包含一个单域抗体或其抗原结合片段，以及一个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体包含一个单域抗体或其抗原结合片段，以及两个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体或四特异性抗体。
在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有与肿瘤特异性抗原(TSA)，肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA),T细胞衔接器(Tcell engager)分子，肿瘤免疫相关分子或自身免疫调节相关分子中至少一个的分子或抗原结合特异性。
在某些实施方案中，所述肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)包括但不限于：密蛋白，P53,KRAS,NRAS,甲胎蛋白，癌胚抗原，神经节苷脂，黏蛋白。
在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有与一个或多个与肿瘤免疫相关的分子结合的活性，所述与一个或多个与肿瘤免疫相关的分子包括：PD-1，PD-L1，CTLA4，LAG3。
在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有与包括但不限于CD19，CD20的T细胞衔接器(T cell engager)分子中的一个或多个的结合特异性。
在某些优选的实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有与包括但不限于IL6，IL6R，TNFα的自身免疫调节靶点中的一个或多个的抗原结合特异性。
在某些优选的实施方案中，所述另外的抗体或其片段、或抗体类似物具有与PD-1、PDL-1、CD19，CD20，CTLA4，IL6，IL6R或TNFα中至少一个的抗原结合特异性。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体，所述双特异是结合“HSA和PDL-1”，“HSA和PD-1”，“HSA和CTLA4”，“HSA和CD19”，“HSA和CD20”，“HSA和IL6”，“HSA和IL6R”或“HSA和TNFα”的特异性。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是三特异性抗体。在某些实施方案中，所述三特异是结合“HSA，PD-1和PD-L1”，“HSA，PD-1和CTLA4”，“HSA，PD-L1和CTLA4”，“HSA，CD19和CD20”，“HSA，IL6R和TNFα”，或，“HSA，IL6和TNFα”的特异性。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是四特异性抗体。在某些实施方案中，所述多特异性抗体的四特异包括结合“HSA，PD-1和PD-L1”，“HSA，PD-1和CTLA4”，“HSA，PD-L1和CTLA4”，“HSA，CD19和CD20”，“HSA，IL6R和TNFα”，或，“HSA，IL6和TNFα”的特异性。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体具有下列结构：A-L-B或B-L-A，其中：A为本发明的单域抗体或其抗原结合片段，L为接头(linker)或缺失，B为一个或多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中所述多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有结合同一抗原或不同抗原的活性。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体具有下列结构：B1-L1-A-L2-B2，其中：A为本发明的单域抗体或其抗原结合片段，L1和L2各自独立地为接头(linker)或缺失，B1和B2各自独立地为一个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中所述B1和B2具有结合同一抗原或不同抗原的活性。
在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物选自全长抗体、scFv、单域抗体或抗体类似物。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体，所述双特异性抗体包含一个本发明的单域抗体或其抗原结合片段，以及一个或多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物，所述一个或多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物不与血清白蛋白结合，且所述多个抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有同一抗原结合活性。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体，所述双特异性抗体具有下列结构：N-本发明的单域抗体或其抗原结合片段-(Linker)-一个所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是具有下列结构：N-本发明的单域抗体或其抗原结合片段-(Linker)-多个所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。所述多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物之间任选地由Linker连接。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体具有下列结构：N-多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物-(Linker)-本发明的单域抗体或其抗原结合片段。所述多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物之间任选地由Linker连接。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体，所述双特异性抗体具有下列结构：N-一个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物-(Linker)-本发明的单域抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述多特异性抗体是三特异性抗体，所述双特异性抗体具有下列结构：N-一个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物-(Linker)-本发明的单域抗体或其抗原结合片段-(Linker)-一个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。
在以上所述的实施方案中，本发明的单域抗体或其抗原结合片段与一个或多个另外的抗体或其抗原结合片段的重链或轻链的N端或C端连接。
在以上所述的实施方案中，所述多特异性抗体具有(G4S)n的linker，其中n选自0-10的整数。
在某些实施方案中，上述所述多特异性抗体具有SEQ ID NOs:41-43任一项所示的linker。
融合蛋白
本发明第三方面，提供了一种融合蛋白，其包含第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的生物活性多肽。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段能够延长与其连接的另外的生物活性多肽的体内半衰期，体内半衰期的所述延长是相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段时所述另外的生物活性多肽的体内半衰期。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽是具有治疗活性、结合活性或酶活性的多肽或蛋白。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽任选地通过接头连接至所述单域抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端。
在某些实施方案中，所述接头是(G4S)n，n为大于或等于0的整数。在某些实施方案中，所述接头如SEQ ID NOs:41-43任一项所示。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含一个或多个(例如，两个)所述单域抗体或其抗原结合片段以及一个或多个(例如，两个)所述另外的生物活性多肽；其中，所述多个单域抗体或其抗原结合片段是相同或不同的，所述多个另外的生物活性多肽是相同或不同的。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段以及一个所述另外的生物活性多肽。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段以及两个所述另外的生物活性多肽。
在某些实施方案中，所述两个另外的生物活性多肽任选地通过接头分别连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端。
在某些实施方案中，所述两个另外的生物活性多肽任选地通过接头彼此连接，所述彼此连接的两个另外的生物活性多肽进一步任选地通过接头连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端或C端。
在某些实施方案中，所述两个另外的生物活性多肽各自通过linker连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端和C端，或C端和N端。
在某些实施方案中，所述生物活性多肽选自集落刺激因子(CSF)、G蛋白偶联受体、IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白、细胞因子结合蛋白、蛋白A、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤抑制子、转移生长因子、α1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦蛋白骨刺激蛋白、降钙素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子途径抑制物、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促皮质素释放因子、自体毒素、乳铁蛋白、肌肉生长抑制素、热休克蛋白家族成员(如热休克蛋白70，GP96),或其任意组合。
在某些实施方案中，所述生物活性多肽选自G-CSF、IL-15、IL15RD与IL-15融合蛋白。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下述的序列：SEQID NOs：1、8、9任一项所示的序列，或与前述任一项所述的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；并且，所述生物活性多肽选自G-CSF、IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白。
在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽进一步选自下列的序列：SEQ IDNOs:44-46，或与前述任一项所述的序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白具有选自下列的序列：SEQ ID NOs:47、49、50、51、52，或与SEQ ID NOs:47、49、50、51、52中任一项所述的序列相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段和SEQ ID NO.44所示的G-CSF，所述融合蛋白以小于约40nM，例如小于约30nM、20nM、15nM、10nM、8nM、5nM、3nM，1nM或更小的EC50结合人血清白蛋白；优选地，所述EC50通过ELISA技术测得。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段，另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物和生物活性多肽。其中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有不同于所述单域抗体或其抗原结合片段的结合特异性，例举的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物如本说明书中多特异性抗体所述，例举的生物活性多肽如前所述。
缀合物
本发明第四方面，提供了一种缀合物，其包含第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段以及连接于所述单域抗体或其抗原结合片段的化疗药物、放射性药品或显影剂。
在某些实施方案中，所述单域抗体或其抗原结合片段能够延长与其连接的化疗药物或显影剂的体内半衰期，体内半衰期的所述延长是相对于如果缺少所述单域抗体或其抗原结合片段时所述化疗药物、放射性药品或显影剂的体内半衰期。
在某些实施方案中，所述化疗药物选自：13-顺-视黄酸(13-cis-Retinoic Acid)，2-CdA，2-氯脱氧腺苷(2-Chlorodeoxyadenosine)，5-阿扎胞苷(5-Azacitidine)，5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)，5-FU，6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine)，6-MP，6-TG，6-硫代鸟嘌呤(6-Thioguanine)，A，Abraxane，放线菌素-D(Actinomycin-D)，ALIMTA，阿利维A酸(Alitretinoin)，爱克兰全反视黄酸(All-transretinoic Acid)，六甲蜜胺(Altretamine)，甲氨蝶呤(Amethopterin)，氨磷汀(Amifostine)，氨鲁米特(Aminoglutethimide)，阿那格雷(Anagrelide)，阿那曲唑(Anastrozole)，阿糖胞苷(Arabinosylcytosine)，Ara-C，三氧化二砷(Arsenic Trioxide)，天冬酰胺酶(Asparaginase)，ATRA，阿扎胞苷(Azacitidine)，BCG，BCNU，贝沙罗汀(Bexarotene)，比卡鲁胺(Bicalutamide)，BiCNU，博来霉素(Bleomycin)，Bortezomib，白消安(Busulfan)，C225，亚叶酸钙(Calcium Leucovorin)，喜树碱-11(Camptothecin-11)，卡培他滨(Capecitabine)，CaracTM，卡铂(Carboplatin)，卡莫司汀(Carmustine)，CarmustineWafer，康士德CC-5013，CCNU，CDDP，CeeNU，苯丁酸氮芥(Chlorambucil)，顺铂(Cisplatin)，亚叶酸因子(Citrovorum Factor)，克拉屈滨(Cladribine)，可的松(Cortisone)，CPT-11，环磷酰胺(Cyclophosphamide)，阿糖胞苷(Cytarabine)，阿糖胞苷脂质体(CytarabineLiposomal)，赛德萨达卡巴嗪(Dacarbazine)，Dacogen，更生霉素(Dactinomycin)，Darbepoetin Alfa，Dasatinib，柔红霉素(Daunomycin)，柔红霉素(Daunorubicin)，盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride)，柔红霉素脂质体(Daunorubicin Liposomal)，地卡特隆(Decadron)，地西他滨(Decitabine)，DepoCytTM，地塞米松(Dexamethasone)，醋酸地塞米松(Dexamethasone acetate)，地塞米松磷酸钠(Dexamethasone SodiumPhosphate)，地塞米松(Dexasone)，右雷佐生(Dexrazoxane)，DHAD，DIC，Diodex，多西紫杉醇(Docetaxel)，多柔比星(Doxorubicin)，多柔比星脂质体(Doxorubicin liposomal)，DroxiaTM，DTIC，EligardTM，EllenceTM，乐沙定(Eloxatin)TM，表柔比星(Epirubicin)，阿法依伯汀(Epoetin alfa)，ErbituxTM，Erlotinib，欧文氏菌属L-天冬酰胺酶(Erwinia L-asparaginase)，雌莫司汀(Estramustine)，氨磷汀(Ethyol)，依托泊苷(Etoposide)，磷酸依托泊苷(Etoposide Phosphate)，依西美坦(Exemestane)，法乐通非格司亭(Filgrastim)，氟尿苷(Floxuridine)，氟达拉滨(Fludarabine)，氟尿嘧啶(Fluorouracil)，氟尿嘧啶(Fluorouracil)(乳膏)，氟甲睾酮(Fluoxymesterone)，氟他胺(Flutamide)，亚叶酸(Folinic Acid)，氟维司群(Fulvestrant)，Gefitinib，吉西他滨(Gemcitabine)，奥佐米星(ozogamicin)，健择GleevecTM，Wafer，戈舍瑞林(Goserelin)，地塞米松(Hexadrol)，克瘤灵六甲蜜胺(Hexamethylmelamine)，HMM，和美新羟基脲醋酸氢化可的松氢化可的松(Hydrocortisone)，氢化可的松磷酸钠(Hydrocortisone SodiumPhosphate)，氢化可的松琥珀酸钠(Hydrocortisone Sodium Succinate)，氢化可的松磷酸(Hydrocortone Phosphate)，羟脲(Hydroxyurea)，伊达比星(Idarubicin)，异环磷酰胺(Ifosfamide)，甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)，咪唑羧酰胺(ImidazoleCarboxamide)，伊立替康(Irinotecan)，异维A酸(Isotretinoin)，Lapatinib，L-天冬酰胺酶，LCR，Lenalidomide，来曲唑(Letrozole)，亚叶酸钙(Leucovorin)，苯丁酸氮芥(Leukeran)，LeukineTM，亮丙瑞林(Leuprolide)，长春新碱(Leurocristine)，LeustatinTM，脂质体Ara-C，Liquid洛莫司汀(Lomustine)，L-PAM，L-沙可来新(L-Sarcolysin)，LupronM，Maxidex，氮芥(Mechlorethamine)，盐酸氮芥(MechlorethamineHydrochloride)，美卓乐梅格施甲地孕酮(Megestrol)，醋酸甲地孕酮(MegestrolAcetate)，美法仑(Melphalan)，巯嘌呤(Mercaptopurine)，美司钠(Mesna)，MesnexTM，甲氨蝶呤(Methotrexate)，甲氨蝶呤钠(Methotrexate Sodium)，甲泼尼龙(Methylprednisolone)，丝裂霉素(Mitomycin)，丝裂霉素-C(Mitomycin-C)，米托蒽醌(Mitoxantrone)，MTC，MTX，氮芥(Mustine)，马利兰MylocelTM，诺维本萘拉滨(Nelarabine)，NeulastaTM，优保津尼鲁米特(Nilutamide)，氮芥(Nitrogen Mustard)，能灭瘤奥曲肽(Octreotide)，醋酸奥曲肽(Octreotide acetate)，安可平OnxalTM，Oprevelkin，奥沙利铂(Oxaliplatin)，紫杉醇(Paclitaxel)，蛋白结合紫杉醇，帕米磷酸(Pamidronate)，Panitumumab，培门冬酶(Pegaspargase)，PEG-L-天冬酰胺酶，培美曲塞(PEMETREXED)，喷司他丁(Pentostatin)，苯丙氨酸氮芥(Phenylalanine Mustard)，泼尼松龙(Prednisolone)，泼尼松(Prednisone)，丙卡巴肼(Procarbazine)，具有卡莫司汀(Carmustine)植入物的Prolifeprospan 20，雷洛昔芬(Raloxifene)，柔红霉素盐酸盐(Rubidomycin hydrochloride)，善得定Sandostatin沙格司亭(Sargramostim)，Sorafenib，SPRYCELTM，STI-571，链佐星(Streptozocin)，SU11248，Sunitinib，他莫昔芬(Tamoxifen)，泰素泰索帝替莫唑胺(Temozolomide)，替尼泊苷(Teniposide)，TESPA，沙利度胺(Thalidomide)，硫鸟嘌呤(Thioguanine)，Thioguanine Thiophosphoamide，塞替派(Thiotepa)，托泊替康(Topotecan)，托瑞米芬(Toremifene)，维A酸(Tretinoin)，TrexallTM，TSPA，VCR，VectibixTM，凡毕士ViadurTM，长春碱(Vinblastine)，硫酸长春碱(Vinblastine Sulfate)，Vincasar长春新碱(Vincristine)，长春瑞滨(Vinorelbine)，酒石酸长春瑞滨(Vinorelbine tartrate)，VLB，VM-26，Vorinostat，VP-16，威猛希罗达ZevalinTM，诺雷德唑来膦酸(Zoledronic acid)，Zolinza，或其任意组合。
在某些实施方案中，所述放射性药品选自：碳-11，碳-14，铬-51，钴-57，钴-58，铒-169，氟-18，镓-67，金-198，铟-111，铟-113m，碘-123，碘-125，碘-131，铁-59，氪-81m，氮-13，氧-15，磷-32，铼-186，铷-82，钐-153，硒-75，锶-89，锝-99m，铊-201，氚，氙-127，氙-133，钇-90，或其任意组合。
在某些实施方案中，所述显像剂选自：钆，磁铁矿/磁石(magnetite)，锰，锝，I125，I131，P32，Tl201，碘帕醇(Iopamidol)，PET-FDG，或其任意组合。
抗体及融合蛋白的制备
本发明的单域抗体、多特异性抗体或融合蛋白可以通过本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明单域抗体、多特异性抗体或融合蛋白的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的单域抗体、多特异性抗体或融合蛋白。
本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto etal.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inHudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如，Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外，Fv、Fab或F(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本发明的单域抗体或其抗原结合片段的制备也可参考Muyldermans,分子生物技术综述(Reviews in MolecularBiotechnology)74,277-302(2001),J.Sambrook&D.Russell,Molecular Cloning:ALaboratory Munual(3rd Edition),Cold Spring Harbor Laboratory Press,2000,或其由中国科学出版社出版的中译本。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
本发明第五方面，提供了一种分离的核酸分子，其包含编码第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段、第二方面所述的多特异性抗体或第三方面所述的融合蛋白的核苷酸序列。根据本领域已知的密码子简并性，在某些实施方案中，所述核苷酸序列是可以根据密码子简并性进行替换的。在某些实施方案中，所述核苷酸序列是密码子最优化的。
在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含编码第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：(a).如SEQ ID NO:39或40所示的核苷酸序列，或(b).与(a)所述的核苷酸序列基本上相同的序列(例如，与(a)所述的核苷酸序列相比，具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高序列同一性的序列，或具有一个或更多个核苷酸取代的序列)，或(c).与(a)所述的核苷酸序列相差不超过3、6、15、30或45个核苷酸的序列。
在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:39或40所示的序列。
本发明第六方面，提供了一种载体，其包含第五方面所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，慢病毒等。在某些实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或融合蛋白。
本发明第七方面，提供了一种宿主细胞，其包含第五方面的核酸分子和/或第六方面的载体。宿主细胞可以是真核细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞)或原核细胞(例如大肠杆菌)。合适的真核细胞包括但不限于NS0细胞、Vero细胞、Hela细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞、和MDCKII细胞。适宜的昆虫细胞包括但不限于Sf9细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌E.coli。
本发明还提供了制备第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段、第二方面所述的多特异性抗体，或第三方面所述的融合蛋白的方法，其包括，在允许蛋白(例如所述单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体，或融合蛋白)表达的条件下，培养第七方面所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体，或融合蛋白。
在某些实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌E.coli。
用途和药物组合物
本发明第八方面，提供了一种药物组合物，其包含第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段、第二方面所述的多特异性抗体、第三方面所述的融合蛋白、第四方面所述缀合物、第五方面所述的分离的核酸分子、第六方面所述的载体、或第七方面所述的宿主细胞；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。所述药物组合物显示比相应的缺少所述单域抗体或其抗原结合片段的药物组合物延长的体内半衰期。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含本发明的单域抗体或其抗原结合片段，以及连接于所述单域抗体或其抗原结合片段的活性剂。
在某些实施方案中，所述活性剂是另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物如本发明第二方面中所定义。在某些实施方案中，所述药物组合物包含本发明的多特异性抗体。
在某些实施方案中，所述活性剂是另外的生物活性多肽。在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽如本发明第三方面中所定义。在某些实施方案中，所述药物组合物包含本发明的融合蛋白。
在某些实施方案中，所述活性剂是化疗药物、放射药品或显影剂。在某些实施方案中，所述化疗药物、放射药品或显影剂如本发明第四方面中所定义。在某些实施方案中，所述药物组合物包含本发明的缀合物。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含本发明的载体或宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。在此类实施方案中，所述宿主细胞包含如前所述的分离的核酸分子或载体。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。
在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白或缀合物与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。
本发明第九方面，提供了一种试剂盒，其包括第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、第二方面所述的多特异性抗体、第三方面所述的融合蛋白、第四方面所述的缀合物、第五方面所述的分离的核酸分子、第六方面所述的载体、第七方面所述的宿主细胞、或第八方面所述的药物组合物；以及可选地使用说明书。
在另一方面，本发明提供了第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段用于延长与其连接的活性剂的体内半衰期的用途。
在另一方面，本发明提供了延长活性剂的体内半衰期的方法，其包括将所述活性剂与第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段连接。
在某些实施方案中，体内半衰期的所述延长是相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段时所述活性剂的体内半衰期。
在某些实施方案中，所述活性剂是另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物。在某些实施方案中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物如本发明第二方面中所定义。
在某些实施方案中，所述活性剂是另外的生物活性多肽。在某些实施方案中，所述另外的生物活性多肽如本发明第三方面中所定义。
在某些实施方案中，所述活性剂是化疗药物、放射性药品或显影剂。在某些实施方案中，所述化疗药物、放射性药品或显影剂如本发明第四方面中所定义。
在某些实施方案中，所述连接是融合或化学偶联。
在另一方面，本发明提供了第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段、第二方面所述的多特异性抗体、第三方面所述的融合蛋白、第四方面所述缀合物、第五方面所述的分离的核酸分子、第六方面所述的载体、或第七方面所述的宿主细胞，在制备药物中的用途，所述药物显示相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段的相应的药物延长的体内半衰期。
在某些实施方案中，所述药物是蛋白质药物。
在某些实施方案中，本发明提供了第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物显示相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段的相应的药物延长的体内半衰期。
在某些实施方案中，本发明提供了第二方面所述的多特异性抗体在制备药物中的用途，所述多特异性抗体包含本发明的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中，所述药物显示相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段的相应的药物延长的体内半衰期。
在某些实施方案中，本发明提供了第三方面所述的融合蛋白在制备药物中的用途，所述融合蛋白包含本发明的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的生物活性多肽；其中，所述药物显示相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段的相应的药物延长的体内半衰期。
在某些实施方案中，本发明提供了第四方面所述的缀合物在制备药物中的用途，所述缀合物包含本发明的单域抗体或其抗原结合片段，以及化疗药物，放射性药品或显影剂；其中，所述药物显示比缺少所述单域抗体或其抗原结合片段的相应的药物延长的体内半衰期。
在某些实施方案中，本发明提供了第五方面所述的分离的核酸分子在制备药物中的用途。
在某些实施方案中，本发明提供了第六方面所述的载体在制备药物中的用途。
在某些实施方案中，本发明提供了第七方面所述的宿主细胞在制备药物中的用途。
在另一方面，本发明提供了第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段、第二方面所述的多特异性抗体、第三方面所述的融合蛋白、第四方面所述缀合物、第五方面所述的分离的核酸分子、第六方面所述的载体、或第七方面所述的宿主细胞，在制备用于肿瘤、感染、自身免疫疾病、或与代谢或发育相关的疾病的预防和/或治疗或辅助治疗的药物中的用途。
在某些实施方案中，本发明提供了第二方面所述的多特异性抗体在制备用于肿瘤、感染、自身免疫疾病、或与代谢或发育相关的疾病的预防和/或治疗或辅助治疗的药物中的用途，所述多特异性抗体包含所述单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有针对肿瘤抗原(例如肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA))和/或免疫检查点蛋白的中的一个或多个分子或抗原结合特异性。
在某些实施方案中，本发明提供了第三方面所述的融合蛋白在制备用于肿瘤、感染、自身免疫疾病、或与代谢或发育相关的疾病的预防和/或治疗或辅助治疗的药物中的用途，所述融合蛋白包含所述单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的生物活性多肽；其中，所述另外的生物活性多肽是具有抗肿瘤活性的多肽或蛋白。
在某些实施方案中，本发明提供了一种融合蛋白在制备用于预防或治疗中性粒细胞或白细胞减少的药物中的用途。所述融合蛋白包含本发明任何一个第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段和SEQ ID NO.44所示的G-CSF。优选地，所述融合蛋白包含SEQ IDNOs:47、49、50、51中的任一序列。所述融合蛋白具有以下用途：(1)促进造血干细胞的增值、分化，(2)增加血液中中性粒或白细胞的数量，(3)激活血液中中性粒细胞的功能，(4)减轻或消除骨髓造血抑制，(5)预防或治疗感染，(6)预防和/或治疗肿瘤治疗引起的中性粒细胞或白细胞减少，或(7)(1)-(6)的任意组合。
在某些实施方案中，所述中性粒细胞或白细胞减少与肿瘤治疗相关，如肿瘤的放化疗。在某些实施方案中，所述中性粒细胞或白细胞减少与感染有关，如humanimmunodeficiency viruses(HIV)感染。
在某些实施方案中，前述融合蛋白可应用于骨髓移植中。前述融合蛋白在骨髓移植发挥上述功能的一种或多种，缩短病人获得免疫能力的时间。
在某些实施方案中，本发明提供了前述融合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于：(1)促进造血干细胞的增值、分化，(2)增加血液中中性粒或白细胞的数量，(3)激活血液中中性粒细胞的功能，(4)减轻或消除骨髓造血抑制，(5)预防或治疗感染，(6)预防和/或治疗肿瘤治疗引起的中性粒细胞或白细胞减少，或(7)(1)-(6)的任意组合。
在某些实施方案中，本发明提供了第四方面所述的缀合物在制备用于肿瘤、感染、自身免疫疾病、或与代谢或发育相关的疾病的预防和/或治疗或辅助治疗的药物中的用途，所述缀合物包含所述单域抗体或其抗原结合片段，以及化疗药物、放射性药品或显影剂。
在另一方面，本发明提供了一种预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤、感染、自身免疫疾病、或与代谢或发育相关的疾病的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施用有效剂量的第一方面所述的单域抗体或其抗原结合片段、第二方面所述的多特异性抗体、第三方面所述的融合蛋白、第四方面所述缀合物、第五方面所述的分离的核酸分子、第六方面所述的载体、第七方面所述的宿主细胞、或第八方面所述的药物组合物。
在某些实施方案中，本发明提供了一种预防和/或治疗中性粒或白细胞减少的方法，所述方法包括对有需要的个体使用有效剂量的第三方面所述的融合蛋白，优选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NOs:47、49、50、51中的任一序列。优先地，所述个体为人，优先地，所述中性粒或白细胞减少与肿瘤治疗相关。
本发明的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白、缀合物或药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白、缀合物或药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白、缀合物或药物组合物，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如无菌无热原水。
本发明的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白、缀合物或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白、缀合物或药物组合物通过静脉输注或注射给予。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白或缀合物。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、融合蛋白、缀合物或药物组合物的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
本发明的单域抗体可高效地结合人血清白蛋白，从而实现显著的延长半衰期的作用，且因其分子量小，可避免HSA、Fc等融合蛋白对活性、工艺及药效的不利影响。同时，本发明的单域抗体或融合蛋白可以以较低成本在微生物表达系统中生产，具有作为长期大剂量需要的慢性疾病治疗药物的的巨大潜力。因此，本发明的抗体或抗原结合片段具有重大的临床价值。
缩略词及术语定义
CDR 免疫球蛋白可变区中的互补决定区
FR 抗体构架区：抗体可变区中除CDR残基以外的氨基酸残基
VH 抗体重链可变区
VL 抗体轻链可变区
VHH 重链抗体的可变区结构域
IgG 免疫球蛋白G
Kabat 由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比对及编号系统(参 见，例如Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService, National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
Chothia 由Chothia等人提出的免疫球蛋白编号系统，其是基于结构 环区的位置鉴定CDR区边界的经典规则(参见，例如Chothia &Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人 (1989)Nature 342:878-883)。
IMGT 基于由Lefranc等人发起的国际免疫遗传学信息系统(The internationalImMunoGeneTics information system
Figure BDA0002172062420000341
(IMGT))的编号系统，可参阅Lefranc et al.,Dev.Comparat. Immunol.27:55-77,2003。
KD 平衡解离常数
Ka 结合速率常数
Kd 解离速率常数
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“人血清白蛋白(HSA)”具有本领域技术人员公知的含义，其是人循环系统中自然产生的最常见血液蛋白，并且是人体内半衰期最长的蛋白，半衰期长达19天。HSA和重组人白蛋白(rHSA)在人体中都具有同样的长循环半衰期。研究显示，与人白蛋白遗传融合的治疗蛋白能获得白蛋白的循环半衰期特征。
如本文中所使用的，术语“粒细胞集落刺激因子(G-CSF)”具有本领域技术人员公知的含义，是一种来源于单核细胞和纤维组织母细胞的长链多肽糖蛋白，可诱导造血干细胞的增殖和分化，促进血液中的中性粒细胞数增加；另外还刺激成熟中性粒细胞从骨髓中释放并激活中性粒细胞的功能。在生物体内主要发挥三大功能：1.作用于骨髓干细胞和中性粒前体细胞，驱动中性粒细胞的分化、增殖和成熟，2.激活成熟的中性粒细胞参与免疫反应，3.协同其他细胞因子，如stem cell factor,IL-3发挥造血功能。
如本文中所使用的，术语“体内半衰期”具有本领域技术人员公知的含义，通常可以定义为分子在体内的血清浓度减少50％(例如由于通过天然机制导致配体的降解和/或配体的清除或螯合)所需要的时间。测定体内半衰期的方法是本领域技术人员所熟知的，例如可通过药物代谢动力学分析进行测定，详情可见于Kenneth,A等:Chemical Stabilityof Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists(药物的化学稳定性：药剂师手册)和Peters等，Pharmacokinete analysis:A Practical Approach(药物代谢动力学分析：实践方法)(1996)。还参考"Pharmacokinetics(药物代谢动力学)",M Gibaldi&D Perron,Marcel Dekker出版,第二修订版(1982)。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用。“抗体”包括完整的单克隆抗体，单域抗体，重链抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体，三特异性抗体)，以及有所需要的生物活性的抗体片段(例如抗原结合片段)。基本的四链抗体通常是指由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的四异聚体糖蛋白。每条重链和轻链具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链和轻链在各自的N-末端具有可变结构域(VH和VL)。各重链/轻链对的可变结构域分别形成抗原结合部位。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。抗体的种类，结构，生物学活性，制备方法参见Fundamental Immunology(William E.Paul,7thEdition,LWW,2012)；Antibody Engineering Springer Lab Manual(Roland Kontermann,Stefan Dübel,ISBN978-3-662-04605-0(eBook))；Schiel JE,Davis DL,Borisov OV,State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic MonoclonalAntibody CHaracteriazation Volume 1.Monoclonal Antibody Therapeutics:Structure,Function,and Regulatory Space(American Chemical Society,2014)。抗原结合片段是能够保留特异性抗原的能力的抗体片段，其非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体、结构域抗体或单域抗体的抗原结合片段，这些抗原结合片段包含足以赋予特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。这些氨基酸残基的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语“驼源抗体”是指，经免疫接种或抗原入侵的骆驼科(Camelidae)动物(包括骆驼(Camel)、羊驼(Alpaca)和大羊驼(L.glama))所产生的针对该抗原的抗体。本领域技术人员已知，在骆驼科动物所产生的抗体中存在缺失轻链的“重链抗体”(heavy-chain antibody,HCAb)，这种抗体只包含一个重链可变区(variable domainof heavy chain of HCAb,VHH)和两个常规的CH2与CH3区，并且单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，VHH是目前己知的可结合目标抗原的最小单位。
如本文中所使用的，术语“单域抗体(single domain antibody，sdAb)”、“结构域抗体”与“纳米抗体(nanobody)”可互换使用，其是指由抗体中单个可变结构域(例如重链可变区)所组成的抗体片段。典型地，单域抗体、结构域抗体或纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，所述4个构架区分别为FR1-FR4，所述3个互补性决定区分别为CDR1-CDR3。在某些实施方案中，本发明的单域抗体可以具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。在某些实施方案中，所述单域抗体是驼源VHH、人源化的VHH或驼源化的VH(例如人VH的驼源化)。所述驼源VHH、人源化的VHH或驼源化的VH包含有利于用作功能性抗原结合的结构域或蛋白。这些抗体不需要轻链可变区即可以高亲和力和特异性与抗原结合。与重链和轻链组成的抗体相比，纳米抗体可溶度高，对热、pH、蛋白酶和其它变形剂稳定度高，只需单链表达便于大规模生产。
如本文中所使用的，术语“多特异性抗体”是指具有多种不同抗原结合特异性的抗体，包括例如：双特异性抗体,三特异性抗体和四特异性抗体。“双特异性抗体”是指，具有两种不同抗原结合特异性的抗体，其由第一抗体(或其片段)和第二抗体(或其片段)或抗体类似物通过偶联臂所形成的偶联物，偶联的方式包括但不限于化学反应、基因融合和酶促。三特异性抗体是具有三种不同抗原结合特异性的抗体，四特异性抗体是具有四种不同抗原结合特异性的抗体。
如本文中所使用的，“抗体类似物(antibody mimetic)”，指与抗体一样特异性结合抗原，但却没有抗体结构。它们通常是人工肽或蛋白质，摩尔质量约为3至20kDa。例如，锚蛋白重复蛋白(DARPin)和fynomer。经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)可以与IgG抗体、scFv-Fc抗体片段或其组合相连，如CN104341529A。抗IL-17a的fynomer与抗IL-6R抗体结合，如WO2015141862A1。
如本文中所使用的，术语“胚系抗体基因”是由非淋巴细胞编码的免疫球蛋白序列，它没有经历导致表达特异免疫球蛋白的遗传学重排及成熟的过程。本发明的各种实施方案所提供的一个优点来源于一种认识，那就是胚系抗体基因比成熟抗体基因更多地保留了动物物种个体的特征性的重要氨基酸序列结构。因此当被治疗性应用于该物种时，更少地被该物种识别为外源物质。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，FR)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)的驼源抗体。
为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将驼源VHH的CDR区插入人源框架序列的VH(参见Winter的美国专利No.5,225,539；Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370；以及Lo,Benny,K.C.,editor,in AntibodyEngineering:Methods and Protocols,volume 248,Humana Press,New Jersey,2004)。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)或半最大效应浓度(EC50)表示。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(Ka或Kon)和“解离速率常数”(Kd或Koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kd/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,Annual RevBiochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、Kon和Koff值。在某些实施方案中，可以使用生物发光干涉测量法(例如ForteBio Octet法)来测量解离常数。除此以外还可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或Kinexa来测量解离常数。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用，由氨基酸结构单元组成。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、缓解症状(无论部分或全部)、缓解或改善预后、降低或抑制疾病复发等，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。
如本文中所使用的，术语“大约”指文中所述数值的正负10％，例如正负5％。
如本文中所使用的，术语“多”意指≥2。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。
附图说明
图1：重组表达单域抗体SDS-PAGE检测。M：蛋白分子量标准；1：R22；2：R48；3：R55；4：R57；5：R70。
图2：融合蛋白结构示意图。生物活性分子可融合在单域抗体的N-端、C-端或两端，图中所示蛋白I和蛋白II可以为相同或不同蛋白。单域抗体可与活性剂融合，形成长效化蛋白。所述单域抗体可与活性剂融合为双特异性或多特异性抗体。
图3a:融合蛋白SDS-PAGE检测。M：蛋白分子量标准；1：R48HZ10LNG；2：R48HZ12LNG；3：R48HZ1NG；4：R48HZ2NG。
图3b：融合蛋白HZ1RD蛋白电泳检测
图4：不同接头长度融合蛋白刺激NFS-60细胞增殖能力。
图5：融合蛋白刺激大鼠中性粒细胞活性。
序列信息
本发明涉及的序列的信息描述于下面的表中。
Figure BDA0002172062420000441
Figure BDA0002172062420000451
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1.羊驼免疫与检测
选择健康的2周岁羊驼(成都阿帕克生物科技有限公司)进行免疫，第0天免疫前取10mL阴性血清作为效价检测空白，将人血白蛋白(OCTA pharma)0.5mg与等体积CFA乳化，皮下多点注射。首次免疫后21天，进行第一次加强免疫，加强7天后，取血清进行效价检测，此后根据血清效价及与小鼠、大鼠、猴的交叉结合效价，分别进行加强免疫。经检测羊驼与人血清白蛋白结合血清效价高于1:120000(EC50)，免疫周期结束。取50mL羊驼血液，按照淋巴细胞分离液使用说明分离PBMC细胞，用于后续RNA提取及建库。
实施例2.抗体文库制备与验证
使用Trizol提取PBMC细胞总RNA，电泳检测RNA纯度和完整性。按常规分子生物学操作流程，通过两轮巢式PCR扩增得到单域重链抗体条带，切胶回收后连接至pComb3XSS载体，电转化至TG1感受态细胞。根据库容检测板生长和稀释情况，计算库容量为3.4×109cfu/mL。随机从滴度平板上挑取48个克隆进行鉴定，结果表明插入率均为100％；将48个克隆测序，使用推导的氨基酸序列比对分析序列多样性，结果VHH库有良好的多样性。构建的噬菌体库具有容量大，多样性高的特点，有利于筛选获得良好的候选分子。
实施例3.噬菌体库筛选与阳性克隆鉴定
根据筛选目的，采用不同抗原交叉筛选获得高亲和力及种属交叉结合的克隆，具体流程如下：分别包被人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白，2μg/mL于4℃包被过夜；弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入300μL 3％OVA-PBS封闭液，37℃封闭1h；PBST洗涤3次，加入100μL噬菌体文库，37℃孵育1h；吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤6次，PBS洗涤2次；加入100μLGly-HCl洗脱液，37℃孵育8min，洗脱特异性结合的噬菌体；将特异性结合的噬菌体使用M13K07辅助噬菌体拯救，拯救后的文库表达噬菌体，使用PEG浓缩后测定效价和下一步亲和淘选。交叉使用人和大鼠白蛋白，同时改变抗原包被浓度、封闭液、结合时间、PBST浓度和洗涤次数，富集高亲和力抗体。
选择不同筛选方式，不同轮次的平板，挑取单克隆进行鉴定。分别包被人、小鼠、大鼠及猴白蛋白，检测各单克隆的交叉结合，选择交叉结合好的克隆送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。
实施例4.候选抗体表达与验证
根据测序结果及交叉结合强弱，初步获得R22、R48、R55、R57、R70五候选分子进一步评价，R22、R48、R55、R57、R70的VHH区序列及CDR序列如序列信息表所示。提取候选克隆质粒后转化至Rosetta(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落进行诱导表达。过夜培养的菌液按1:100接种至自诱导培养基中，37℃培养2h后，转入30℃继续培养24h。8000rpm离心收集培养上清，使用Ni+-NTA凝胶纯化分泌的纳米抗体，咪唑洗脱后超滤置换至PBS缓冲液中，定量并SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，结果如图1。
实施例5.不同种属交叉结合活性检测
通过ELISA检测本发明的纳米抗体与与人血清白蛋白(HSA)、小鼠血清白蛋白(MSA)、大鼠血清白蛋白(RSA)、猴血清白蛋白(CSA)的结合亲和力。将上述白蛋白按2μg/mL稀释，按100μL/孔加入酶标孔中，4℃包被过夜；弃包被液，PBST洗涤3次，每孔加入250μLPBS+10％脱脂牛奶，37℃封闭2h；PBST洗涤3次，每孔加入100μL PBS+10％脱脂牛奶梯度稀释的纳米抗体，37℃孵育2h；PBST洗涤6次，加入HRP Anti-His Tag抗体(用PBS+10％脱脂牛奶按1:8000稀释)，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗板6次。加入TMB显色液显色，100μL/孔，室温反应5min，加入终止液终止反应，50μL/孔，于450nm下测光密度。数据导出至Graphpad，计算各纳米抗体结合活性，其中样品没有显色的说明样品与血清白蛋白没有明显结合活性，定义为不结合。结果如表1所示。
表1：驼源抗体结合活性-ELISA(EC50,nM)
抗体 HSA MSA RSA CSA
R22 7.09 ～478.1 7.85 1.74
R48 2.11 3.00 0.92 1.73
R55 0.77 不结合 不结合 8.90
R57 21.18 32.66 2.20 ～973.8
R70 1.57 不结合 不结合 3.77
本发明筛选得到的白蛋白结合抗体，对不同种属白蛋白有不同亲和力，其中R48对人、小鼠、大鼠及猴亲和力均达到nM级，且不同种属亲和力无明显差异。R22，R70及R55分子对人、猴白蛋白也具有很高的亲和力，但R70及R55在与小鼠和大鼠的结合检测中不显色，说明无明显结合。
实施例6.抗人血清白蛋白抗体的人源化
采用CDR移植抗体人源化改造方法对驼源抗体R48、R22进行人源化改造。简言之，人源化改造涉及以下步骤：把驼源单克隆抗体的氨基酸序列与人胚系抗体氨基酸序列进行比对，找出同源性高，理化性质较优的序列，作为人胚胎系框架序列；分析考察HLA-DR亲和性，选出亲和力低的人胚胎系框架序列；再将驼源抗体的三个CDR分别移植到选定的抗体框架(FR)序列上。
具体而言，将驼源抗体R48，R22的CDR区移植到对应的人源化模板(人胚系基因序列IGHV3-23*01，参见IMGT登录号M99660)的FR框架上。
进一步，利用计算机模拟技术，应用分子对接分析可变区及其周边的框架氨基酸序列，考察其空间立体结合方式。通过计算静电力，范德华力，亲疏水性和熵值，分析该驼源抗体氨基酸序列中可与人血白蛋白作用以及维护空间构架的关键氨基酸，并在移植后的抗体中，保留这些驼源的氨基酸。也即，对上述人源化模板的FR区氨基酸残基进行了一系列的回复突变，以使人源化抗体尽可能保留驼源抗体的抗原结合能力。
根据以上方法，以驼源抗体R48的CDR为基础，共构建了2株人源化抗体，分别命名为R48HZ1、R48HZ2，其序列分别如SEQ ID NOs:8、9所示。以驼源抗体R22的CDR为基础，构建了1株人源化抗体，命名为R22HZ，其序列如SEQ ID NO:17所示。
实施例7.人源化抗体的结合活性检测
人源化抗体序列R48HZ1、R48HZ2、R22HZ及WO 2012175400公开的SEQ ID NO.1序列(以下简称Alb23)，委托金斯瑞生物科技有限公司按大肠杆菌密码子进行基因优化与合成，并在基因的N-端添加Omp A信号肽，使抗体能分泌至大肠杆菌的周质空间，C-端添加6×His标签，利于下游纯化和检测。基因按常规分子生物学方法构建至pET28a载体，转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆进行诱导表达。具体方式为，单克隆接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，吸取过夜菌按1:100接种至自诱导培养基中，37℃220rpm震荡培养2h，转移至30℃继续培养24h。诱导后菌液经8000rpm离心10min收集培养基上清，使用Ni+-NTA凝胶纯化人源化抗体，咪唑洗脱后超滤置换至PBS缓冲液中，定量并SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。
通过ELISA检测人源化抗体与人、小鼠、大鼠及猴白蛋白结合活性，具体步骤如实施例5，检测二抗使用HRP anti-His(用PBS+10％脱脂牛奶按1:8000稀释)，数据导入Graphpad计算驼源抗体及不同人源化抗体的结合活性。结果如表2所示。
表2：驼源及人源化抗体的ELISA结合活性(EC50,nM)
Figure BDA0002172062420000501
Figure BDA0002172062420000511
结果显示，R48HZ1及R48HZ2对HSA的结合活性略优于亲本抗体R48，优于对照抗体Alb23，且与不同种属的蛋白结合力相当。而Alb23与小鼠、大鼠血清白蛋白的结合活性显著低于与人和猴血清白蛋白的结合力，所以用小鼠、大鼠获得的R48HZ1及R48HZ2临床前研究数据会相对准确地推测临床结果。
实施例8.人源化抗体与生物学活性蛋白的融合蛋白的构建与表达
融合蛋白的结构参见表3和图2，其中蛋白I和蛋白II可以为同一分子，如本实施例中的G23G。具体地，G-CSF基因委托金斯瑞生物科技有限公司按大肠杆菌密码子进行基因优化与合成，利用重叠PCR将对照抗体Alb23与G-CSF拼接为融合蛋白，抗体分别融合至G-CSF蛋白的N-端和C-端，分别命名为Alb23N和Alb23C，或在抗体的两端同时融合G-CSF(命名为G23G)。为保证蛋白的正确折叠和功能，抗体和G-CSF之间通过接头(Linker)进行连接。人源化抗体R48HZ1、R48HZ2分别融合至G-CSF蛋白的N-端，其中R48HZ1与G-CSF之间分别不添加或添加(G4S)2、(G4S)4，重叠PCR拼接得到全长基因。拼接的全长基因通过酶切、连接至表达载体pET28a，测序验证后转化BL21(DE3)感受态细胞。挑取单克隆至含卡那霉素的LB培养基，37℃震荡培养过夜，按1:100接种至含卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡培养至OD600＝0.8，加入0.5mM IPTG诱导4h，收集菌体用于纯化。
同时构建真核表达系统，构建单域抗体R48HZ1与15受体α的Sushi结构域和白介素15(IL15)的融合蛋白。简单的，通过重叠PCR拼接得到R48HZ1-IL15RD-IL15的全长基因，所编码的蛋白命名为HZ1RD，具体结构参见表3和图2。构建的全长基因构建至真核表达载体pTT5，转染293E细胞表达目的蛋白，于37℃振荡培养7天，收集细胞上清用于纯化。
表3：融合蛋白的构建方式
Figure BDA0002172062420000521
实施例9.融合蛋白纯化
离心收集诱导后菌体，以PBS重悬洗涤一次。处理后菌体使用PBS融解、重悬，超声破碎仪裂解(70％功率，超声5s再间隔5s，30min)菌体，10000g离心15min收集包涵体。粗制包涵体使用洗涤液清洗两次，溶解部分可溶的宿主蛋白，去除核酸等杂质，离心收集精制包涵体用于变、复性纯化。精制包涵体以变性缓冲液重悬，室温搅拌2h充分溶解，10000g离心去除不可溶成分，取变性后上清进一步纯化。变性上清缓慢稀释至复性液中，于4℃缓慢搅拌复性40h，离心后上清使用阳离子层析柱纯化，收集目标蛋白峰进行SDS-PAGE检测，结果如图3a，变复性后融合蛋白通过一步阳离子纯化，能达到>95％纯度，R48HZ2NG有小量聚体。真核细胞表达的HZ1RD细胞上清，通过Mabselect进行纯化，低pH洗脱得到目的蛋白，目的蛋白有部分修饰，电泳检测蛋白纯度>95％，结果如图3b。
实施例10.融合蛋白体外活性验证
使用ELISA检测融合蛋白与血清白蛋白的结合活性。简要的，包被人、小鼠、大鼠、猴血清白蛋白，4℃过夜，以封闭液于37℃封闭2h，加入梯度稀释的蛋白，37℃反应2h，加入1:400稀释的HRP标记羊抗人IgG H+L二抗，37℃孵育1h，使用TMB显色，终止后读数，数据导入Graphpad计算蛋白结合活性，结果如表4所示。
表4融合蛋白结合白蛋白活性(EC50,nM)
抗体 HSA MSA RSA CSA
R48HZ10LNG 5.97 4.84 2.62 3.05
R48HZ12LNG 4.09 4.12 1.71 2.18
R48HZ1NG 2.53 1.87 0.49 1.62
R48HZ2NG 0.71 1.23 0.18 1.50
Alb23N 18.42 256.5 >297.8 12.52
Alb23C 11.38 133.2 >362.5 17.33
结果与单域抗体本身的亲和力实验相似，基于R48HZ1或R48HZ2的融合蛋白对HSA的亲和力优于对照抗体Alb23N和Alb23C，且与人、小鼠、大鼠及猴白蛋白结合活性相当。
实施例11.NFS-60细胞增殖活性检测
1640+10％FBS+10ng/mL G-CSF培养NFS-60细胞，100g离心5min收集细胞，以不含G-CSF的1640+10％FBS培养基洗涤一次去除残留的G-CSF，计数细胞后按1×104加入96孔板中，100μL/孔；以不含G-CSF的1640+10％FBS+0.2％HSA培养基稀释不同融合蛋白、新瑞白(齐鲁制药，PEG-GCSF，3mg/mL)，100μL/孔加入至细胞中，37℃继续培养48h，加入20μL/孔CCK8，37℃培养4h，OD450nm读数，数据导入Graphpad计算蛋白刺激增殖活性。
实验中检测的融合蛋白R48HZ1NG是本发明的单域抗体与G-CSF通过(G4S)4的linker融合，测得刺激NFS-60细胞增殖活性为EC50＝1.96nM，与瑞白活性相当(EC50＝1.55nM)。融合蛋白R48HZ12LNG是本发明的单域抗体与G-CSF通过(G4S)2的linker融合，测得刺激NFS-60细胞增殖活性为EC50＝2.88nM。对照新瑞白(PEG-GCSF)的活性为EC50＝3.92nM。结果如图4所示。本发明的单域抗体与G-CSF的融合蛋白刺激NFS-60细胞增殖活性均优于现在市场上的长效G-CSF新瑞白，且融合蛋白无需进行PEG偶联并再纯化，工艺更简单，收率更高，还可避免PEG质控难及可能存在肾脏积累毒性风险，具有明显的安全、质量可控的优势。
实施例12.候选抗体结合白蛋白与FcRn检测
人血白蛋白大量存在于血液中，其可被内吞后在胞内低pH条件下，与FcRn结合从而避免被溶酶体降解，因此白蛋白具有很长的半衰期。纳米抗体通过结合白蛋白后，再与FcRn结合，避免进入溶酶体降解，达到延长其体内半衰期的目的。候选抗体结合白蛋白后，不能竞争白蛋白与FcRn的结合，否则该方式不能实现，因此通过FortiBio检测纳米抗体与白蛋白\FcRn结合的活性，具体流程如下：以PBS(pH 7.4)稀释生物素标记的FcRn蛋白至5μg\mL，固化至链霉亲和素传感器SA上，在PBS(pH 6.0)条件下再平衡。以PBS(pH 6.0)稀释人血白蛋白至0.5μM，200μL加入检测孔中，再以PBS(pH 6.0)+0.5μM HSA稀释重组蛋白至0.5μM，200μL加入另一检测孔中。将SA-Bio-FcRn传感器置于检测孔中，检测结合信号，信号值达到平衡后转移至PBS(pH 6.0)解离，分析信号值判断重组与白蛋白和FcRn的结合。结果如表5，仅HSA的检测孔，FcRn与HSA结合，引起信号值增加，而融合蛋白与HSA的检测孔中，融合蛋白结合至HSA，并通过HSA结合至FcRn传感器，引起信号值增加，且信号值大于仅含HSA的样品(R48HZ1NG与HSA形成的复合体分子量增加)，说明R48HZ1NG未结合至HSA与FcRn结合的表位。上述结果说明该单域抗体-生物活性分子融合蛋白R48HZ1NG可以通过与白蛋白的结合形成蛋白复合体，增加了分子水和半径，这样可避免小分子量的生物活性蛋白被肾脏快速清除；同时，实验证明单域抗体与生物活性分子的融合蛋白不竞争白蛋白与FcRn的结合，可以预计单域抗体与生物活性分子的融合蛋白不会产生因竞争结合FcRn的副作用，白蛋白与单域抗体-生物活性分子的融合蛋白形成的复合体，可进一步与FcRn结合，从而通过白蛋白-FcRn通路获得与白蛋白一致的半衰期(参见Adam R,Griffin L,Compson JE,et.al.MABS 2016,VOL.8,NO.7,1336–1346)。因此生物活性分子，如G-CSF，可与抗白蛋白单域抗体构建成融合蛋白，通过前述机制可预期获得比未融合抗白蛋白单域抗体的生物活性分子本身延长的体内半衰期。
表5：融合蛋白与HSA及FcRn结合信号检测
Figure BDA0002172062420000561
实施例13.融合蛋白稳定性研究
验证不同融合蛋白热稳定性与加速稳定性。简要的，使用DSF检测蛋白Tm值，将融合蛋白以缓冲液20mM HAc-NaAc,pH5.0调整至浓度为0.5mg/mL。无菌水将染料SYPROorange dye稀释40倍，每蛋白样品中加入2.5μL稀释后染料，12.5μL蛋白液，5μL无菌水补至20μL体系，每个样品双复孔。样品加入至7500real-time PCR仪，设置程序为Melt curve，100％速率升温至25℃，保持2min；1％速率升温至95℃，检测不同温度荧光信号值。数据导入至Graphpad计算各蛋白Tm值，结果各融合蛋白热稳定性相似，Tm值位于46～51℃之间，具有良好的热稳定性。
实施例14.融合蛋白对大鼠的体内药效试验
使用正常大鼠，测试与血清白蛋白融合蛋白药效。SD大鼠根据体重随机分为4组，采用后颈背部皮下给药(第0天)，0.1mL/10g体重。其中新瑞白组、Alb23C组和R48HZ2NG组分别给予等G-CSF摩尔剂量，即，新瑞白组500μg/kg、R48HZ2NG组900μg/kg，Alb23C组900μg/kg。另外一组给予R48HZ2NG 2700μg/kg。以上各组全部单次给药。给药后每天取大鼠眼眶血150μL，血细胞分析仪检测中性粒细胞含量，具体分组及给药情况如表6。
表6：大鼠药效试验方案
Figure BDA0002172062420000571
结果如表7及图5所示，R48HZ2NG(900μg/kg)给药后第二天达到最高，中性粒细胞数增加约10倍，第五天恢复至正常水平，R48HZ2NG(2700μg/kg)组具有更强的刺激作用，第四天达到最高，增加约13倍，至第五天仍高于正常值。等G-CSF摩尔剂量条件下，R48HZ2NG比融合蛋白Alb23C比具有更高的和延长的中性粒细胞增殖活性。
表7融合蛋白刺激大鼠中性粒细胞增殖(中性粒细胞×109/L)
Figure BDA0002172062420000572
Figure BDA0002172062420000581
综上，本发明得到了与人、小鼠、大鼠、猴白蛋白均高亲和力结合的单域抗体和基于该单域抗体构建的融合蛋白。融合蛋白能够结合白蛋白，并保留了未与单域抗体融合的活性剂的体外和体内生物学活性而且延长了其体内半衰期，因此对于有需要用活性剂治疗的病人，使用其与本申请公开的单域抗体的融合蛋白能减少用药次数，减轻患者负担，提高患者依从性。基于单域抗体的融合蛋白具有分子量小、可原核表达、无需纯化后修饰、工艺简单成本低、质量稳定的特点。相对于新瑞白的长效方法，融合蛋白无需进行PEG偶联并再纯化，工艺更简单，收率更高，还可避免PEG质控难及可能存在肾脏积累毒性风险，具有明显的安全、质量可控的优势。所以本公开的方法明显优于目前的长效化方法。同时本申请公开的单域抗体具有极高的人源化程度，可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应，因此具有重大的临床价值。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川科伦博泰生物医药股份有限公司
<120> 结合血清白蛋白的蛋白及其用途
<130> IDC190209
<160> 55
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 125
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<213> 人工序列
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<223> 驼源抗体R48可变区
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<223> 人源化抗体R48hz1可变区
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<223> 驼源抗体R22可变区
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<223> 人源化抗体R22hz可变区
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<223> 驼源抗体R55可变区
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Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Ala Ala Thr Arg Tyr
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ile Ala Tyr
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<223> 驼源抗体R70可变区
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Arg Leu Thr Asp Ser Lys Tyr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IMGTR70 VHH CDR1
<400> 33
Gly Arg Thr Asp Thr Tyr Tyr Ser
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IMGTR70 VHH CDR2
<400> 34
Val Asn Trp Gly Ser Thr Gln Thr
1 5
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IMGTR70 VHH CDR3
<400> 35
Ala Ala Glu Arg Leu Thr Asp Ser Lys Tyr Arg Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Kabat/Chothia R70 VHH CDR1
<400> 36
Gly Arg Thr Asp Thr Tyr Tyr Ser Met Gly
1 5 10
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Kabat/Chothia R70 VHH CDR2
<400> 37
Arg Val Asn Trp Gly Ser Thr Gln Thr Asp
1 5 10
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Kabat/Chothia R70 VHH CDR3
<400> 38
Glu Arg Leu Thr Asp Ser Lys Tyr Arg Tyr
1 5 10
<210> 39
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R48HZ1核酸
<400> 39
gaagttcagc tgctggaaag cggtggcggt ctggttcaac cgggcggtag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cgagcggtcg taccttcagc cgtaactata tgggctggtt tcgtcaagcg 120
ccgggtaaag gtctggagtt cgtggcggcg atcagcggcg gtggcatgta tacctactat 180
gcggacagcg tgaagggccg ttttaccatt agccgtgata acagcaaaaa caccgtttac 240
ctgcagatga acagcctgcg tccggaggac accgcggtgt actattgcgc gggtgcggcg 300
tttggtgttg cgtggcacgc gaacagctac gaatatgatt actggggtca aggcaccctg 360
gtgaccgttt ctagc 375
<210> 40
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R48HZ2核酸
<400> 40
gaagttcagc tgctggaaag cggtggcggt ctggttcagg cgggcggtag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cgagcggtcg taccttcagc cgtaactata tgggttggtt tcgtcaaccg 120
ccgggcaagg aacgcgagtt cgtggcggcg atcagcggcg gtggcatgta tacctactat 180
gcggacagcg tgaagggtcg ttttaccatt agccgtgata acagcaaaaa caccgtttac 240
ctgcagatga acagcctgcg tccggaggac accgcggtgt actattgcgc gggtgcggcg 300
tttggtgttg cgtggcacgc gaacagctac gaatatgatt actggggtca aggcaccctg 360
gtgaccgttt ctagc 375
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头1
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头2
<400> 42
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 43
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头3
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 44
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G-CSF
<400> 44
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys
1 5 10 15
Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln
20 25 30
Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val
35 40 45
Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys
50 55 60
Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser
65 70 75 80
Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser
85 90 95
Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp
100 105 110
Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro
115 120 125
Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe
130 135 140
Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe
145 150 155 160
Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
165 170
<210> 45
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15
<400> 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 46
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL15RD-IL15
<400> 46
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Trp Val
65 70 75 80
Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met
85 90 95
His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys
100 105 110
Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser
115 120 125
Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile
130 135 140
Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser
145 150 155 160
Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe
165 170 175
Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
180 185 190
<210> 47
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R48HZ10LNG
<400> 47
Met Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg
20 25 30
Asn Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Met Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gly Ala Ala Phe Gly Val Ala Trp His Ala Asn Ser Tyr Glu
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Pro
115 120 125
Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu
130 135 140
Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys
145 150 155 160
Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu
165 170 175
Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser
180 185 190
Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu
195 200 205
Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu
210 215 220
Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala
225 230 235 240
Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu
245 250 255
Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg
260 265 270
Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu
275 280 285
Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
290 295 300
<210> 48
<211> 936
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> R48HZ12LNG核酸
<400> 48
atggaagttc agctgctgga aagcggtggc ggtctggttc aaccgggcgg tagcctgcgt 60
ctgagctgcg cggcgagcgg tcgtaccttc agccgtaact atatgggctg gtttcgtcaa 120
gcgccgggta aaggtctgga gttcgtggcg gcgatcagcg gcggtggcat gtatacctac 180
tatgcggaca gcgtgaaggg ccgttttacc attagccgtg ataacagcaa aaacaccgtt 240
tacctgcaga tgaacagcct gcgtccggag gacaccgcgg tgtactattg cgcgggtgcg 300
gcgtttggtg ttgcgtggca cgcgaacagc tacgaatatg attactgggg tcaaggcacc 360
ctggtgaccg tttctagcgg tggtggcggt tctggtggcg gtggtagcat gacaccatta 420
ggtccggcga gcagcctgcc gcagagcttc ctgctgaagt gcctggagca agtgcgtaaa 480
atccaaggtg acggcgcggc gctgcaagaa aagctgtgcg cgacctacaa actgtgccac 540
ccggaggaac tggttctgct gggtcacagc ctgggcattc cgtgggcgcc gctgagcagc 600
tgcccgagcc aggcgctgca actggcgggt tgcctgagcc agctgcacag cggtctgttc 660
ctgtatcagg gcctgctgca agcgctggag ggtatcagcc cggaactggg tccgaccctg 720
gataccctgc aactggacgt ggcggatttt gcgaccacca tttggcagca aatggaggaa 780
ctgggtatgg cgccggcgct gcagccgacc caaggtgcga tgccggcgtt cgcgagcgcg 840
tttcagcgtc gtgcgggtgg cgtgctggtt gcgagccacc tgcaaagctt cctggaagtg 900
agctaccgtg ttctgcgtca cctggcgcag ccgtaa 936
<210> 49
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R48HZ12LNG
<400> 49
Met Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg
20 25 30
Asn Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Met Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gly Ala Ala Phe Gly Val Ala Trp His Ala Asn Ser Tyr Glu
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser
130 135 140
Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile
145 150 155 160
Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys
165 170 175
Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile
180 185 190
Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala
195 200 205
Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu
210 215 220
Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp
225 230 235 240
Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln
245 250 255
Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala
260 265 270
Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu
275 280 285
Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu
290 295 300
Arg His Leu Ala Gln Pro
305 310
<210> 50
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R48HZ1NG
<400> 50
Met Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg
20 25 30
Asn Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Met Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gly Ala Ala Phe Gly Val Ala Trp His Ala Asn Ser Tyr Glu
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu
145 150 155 160
Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala
165 170 175
Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu
180 185 190
Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser
195 200 205
Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu
210 215 220
His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly
225 230 235 240
Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val
245 250 255
Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met
260 265 270
Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser
275 280 285
Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln
290 295 300
Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
305 310 315 320
<210> 51
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R48HZ2NG
<400> 51
Met Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg
20 25 30
Asn Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Met Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gly Ala Ala Phe Gly Val Ala Trp His Ala Asn Ser Tyr Glu
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu
145 150 155 160
Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala
165 170 175
Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu
180 185 190
Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser
195 200 205
Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu
210 215 220
His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly
225 230 235 240
Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val
245 250 255
Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met
260 265 270
Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser
275 280 285
Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln
290 295 300
Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
305 310 315 320
<210> 52
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HZ1RD
<400> 52
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Asn
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Met Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Ala Ala Phe Gly Val Ala Trp His Ala Asn Ser Tyr Glu Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met
130 135 140
Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser
145 150 155 160
Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr
165 170 175
Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His
180 185 190
Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys
210 215 220
Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys
245 250 255
Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser
260 265 270
Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu
275 280 285
Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu
290 295 300
Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile
305 310 315 320
Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
325
<210> 53
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Alb23N
<400> 53
Met Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser
20 25 30
Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp
35 40 45
Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser
130 135 140
Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys
145 150 155 160
Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr
165 170 175
Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly
180 185 190
Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu
195 200 205
Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly
210 215 220
Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu
225 230 235 240
Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln
245 250 255
Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly
260 265 270
Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val
275 280 285
Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val
290 295 300
Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
305 310
<210> 54
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Alb23C
<400> 54
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
20 25 30
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
35 40 45
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser
50 55 60
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
65 70 75 80
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile
85 90 95
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala
100 105 110
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala
115 120 125
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
130 135 140
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
145 150 155 160
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
195 200 205
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
210 215 220
Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro
225 230 235 240
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala
245 250 255
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
260 265 270
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
275 280 285
Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr
290 295 300
Leu Val Thr Val Ser Ser
305 310
<210> 55
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G23G
<400> 55
Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu
1 5 10 15
Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu
20 25 30
Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu
35 40 45
Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser
50 55 60
Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His
65 70 75 80
Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile
85 90 95
Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala
100 105 110
Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala
115 120 125
Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala
130 135 140
Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
145 150 155 160
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
195 200 205
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
210 215 220
Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro
225 230 235 240
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala
245 250 255
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
260 265 270
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
275 280 285
Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr
290 295 300
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
305 310 315 320
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Thr Pro Leu Gly Pro
325 330 335
Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val
340 345 350
Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala
355 360 365
Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser
370 375 380
Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu
385 390 395 400
Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr
405 410 415
Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro
420 425 430
Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile
435 440 445
Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr
450 455 460
Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly
465 470 475 480
Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr
485 490 495
Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
500 505

Claims (29)

1.特异性结合血清白蛋白的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含：
(1)下述3个互补决定区(CDRs)：
(1a)序列为SEQ ID NO：2或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：3与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：4与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按IMGT编号系统定义；或，
(1b)序列为SEQ ID NO：5或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：6或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：7或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按Chothia或Kabat编号系统定义；
或，
(2)下述3个互补决定区(CDRs)：
(2a)序列为SEQ ID NO：11或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：12或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：13或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按IMGT编号系统定义；或，
(2b)序列为SEQ ID NO：14或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：15或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：16或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按Chothia或Kabat编号系统定义；
或，
(3)下述3个互补决定区(CDRs)：
(3a)序列为SEQ ID NO：19或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：20或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：21或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按IMGT编号系统定义；或，
(3b)序列为SEQ ID NO：22或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：23或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：24或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按Chothia或Kabat编号系统定义；
或，
(4)下述3个互补决定区(CDRs)：
(4a)序列为SEQ ID NO：26或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：27或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：28与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按IMGT编号系统定义；或，
(4b)序列为SEQ ID NO：29或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：30或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：31或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按Chothia或Kabat编号系统定义；
或，
(5)下述3个互补决定区(CDRs)：
(5a)序列为SEQ ID NO：33或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：34或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：35或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按IMGT编号系统定义；或，
(5b)序列为SEQ ID NO：36或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR1，序列为SEQ ID NO：37或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR2，序列为SEQ ID NO：38或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列的CDR3，其中所述CDR的序列按Chothia或Kabat编号系统定义；
优选地，(1)-(5)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段进一步包含构架区(FRs)；优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段包含来自人或驼的FRs；
优选地，所述单域抗体由FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4组成；
优选地，所述单域抗体或其抗原结合片段特异性结合人血清白蛋白。
2.权利要求1所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段是驼源的VHH、人源化的VHH或驼源化的VH。
3.权利要求1或2所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下述的序列：
(1)SEQ ID NO：1所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
(2)SEQ ID NO：8所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；或，
(3)SEQ ID NO：9所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
4.权利要求1或2所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下述的序列：
(1)SEQ ID NO：10所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；或，
(2)SEQ ID NO：17所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
5.权利要求1或2所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下述的序列：SEQ ID NO：18所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
6.权利要求1或2所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下述的序列：SEQ ID NO：25所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
7.权利要求1或2所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段包含选自下述的序列：SEQ ID NO：32所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
8.权利要求1-7任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段以小于约40nM，例如小于约30nM、20nM、10nM、8nM、5nM、3nM，1nM或更小的EC50结合人血清白蛋白；
优选地，所述EC50通过ELISA技术测得。
9.多特异性抗体，其包含权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；
优选地，所述多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体或四特异性抗体；
可选地，所述另外的抗体或其片段、或抗体类似物具有与肿瘤特异性抗原(TSA)，肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)，T细胞衔接器(T cell engager)分子，肿瘤免疫相关分子或自身免疫调节相关分子中至少一个分子或抗原的结合特异性；
优选地，所述另外的抗体或其片段、或抗体类似物具有与PD-1、PDL-1、CD19，CD20，CTLA4，IL6，IL6R或TNFα中至少一个的抗原结合特异性。
10.权利要求9所述的多特异性抗体，其中，所述多特异性抗体具有下列结构：A-L-B或B-L-A，其中：A为权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，L为接头(linker)或缺失，B为一个或多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中，所述多个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物具有结合同一抗原或不同抗原的活性；
或者，所述多特异性抗体具有下列结构：B1-L1-A-L2-B2，其中：A为权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，L1和L2各自独立地为接头(linker)或缺失，B1和B2各自独立地为一个另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；其中，所述B1和B2具有结合同一抗原或不同抗原的活性；
可选地，所述多特异性抗体是双特异性抗体，并且L、L1和L2各自独立地为(G4S)n，其中n选自0-10的整数；优选地，L、L1和L2各自独立地选自SEQ ID NOs:41-43任一项所示的序列。
11.融合蛋白，其包含权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段，以及另外的生物活性多肽；
优选地，所述另外的生物活性多肽是具有治疗活性、结合活性或酶活性的多肽或蛋白；
优选地，所述另外的生物活性多肽任选地通过接头连接至所述单域抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端；
优选地，所述接头是(G4S)n，n为大于或等于0的整数；优选地，所述接头如SEQ ID NOs:41-43任一项所示。
12.权利要求11所述的融合蛋白，其包含一个或多个(例如，两个)所述单域抗体或其抗原结合片段以及一个或多个(例如，两个)所述另外的生物活性多肽；其中，所述多个单域抗体或其抗原结合片段是相同或不同的，所述多个另外的生物活性多肽是相同或不同的；
优选地，所述融合蛋白包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段以及一个所述另外的生物活性多肽；
优选地，所述融合蛋白包含一个所述单域抗体或其抗原结合片段以及两个所述另外的生物活性多肽；
优选地，所述两个另外的生物活性多肽任选地通过linker分别连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端；
优选地，所述两个另外的生物活性多肽任选地通过linker彼此连接，所述彼此连接的两个另外的生物活性多肽进一步任选地通过linker连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端或C端。
优选地，所述两个另外的生物活性多肽各自通过linker连接至单域抗体或其抗原结合片段的N端和C端，或C端和N端。
13.权利要求11或12所述的融合蛋白，其中，所述生物活性多肽选自粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、集落刺激因子(CSF)、G蛋白偶联受体、IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白、细胞因子结合蛋白、蛋白A、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤抑制子、转移生长因子、α1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦蛋白骨刺激蛋白、降钙素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子途径抑制物、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促皮质素释放因子、自体毒素、乳铁蛋白、肌肉生长抑制素、热休克蛋白家族成员(如热休克蛋白70或GP96),或其任意组合；
优选地，所述生物活性多肽选自G-CSF、IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白。
14.权利要求11-13任一项所述的融合蛋白，其中，所述单域抗体或其抗原结合片段如权利要求3中所定义，所述生物活性多肽选自G-CSF、IL-15、IL15RD、IL15RD与IL-15融合蛋白；
优选地，所述生物活性多肽选自下列的序列：SEQ ID NOs:44-46；
优选地，所述融合蛋白具有选自下列的序列：SEQ ID NOs:47、49、50、51、52。
15.缀合物，其包含权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段以及连接于所述单域抗体或其抗原结合片段的化疗药物、放射性药品或显影剂；
优选地，所述化疗药物选自：13-顺-视黄酸(13-cis-Retinoic Acid)，2-CdA，2-氯脱氧腺苷(2-Chlorodeoxyadenosine)，5-阿扎胞苷(5-Azacitidine)，5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil)，5-FU，6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine)，6-MP，6-TG，6-硫代鸟嘌呤(6-Thioguanine)，A，Abraxane，放线菌素-D(Actinomycin-D)，ALIMTA，阿利维A酸(Alitretinoin)，爱克兰全反视黄酸(All-transretinoic Acid)，六甲蜜胺(Altretamine)，甲氨蝶呤(Amethopterin)，氨磷汀(Amifostine)，氨鲁米特(Aminoglutethimide)，阿那格雷(Anagrelide)，阿那曲唑(Anastrozole)，阿糖胞苷(Arabinosylcytosine)，Ara-C，三氧化二砷(Arsenic Trioxide)，天冬酰胺酶(Asparaginase)，ATRA，阿扎胞苷(Azacitidine)，BCG，BCNU，贝沙罗汀(Bexarotene)，比卡鲁胺(Bicalutamide)，BiCNU，博来霉素(Bleomycin)，Bortezomib，白消安(Busulfan)，C225，亚叶酸钙(Calcium Leucovorin)，喜树碱-11(Camptothecin-11)，卡培他滨(Capecitabine)，CaracTM，卡铂(Carboplatin)，卡莫司汀(Carmustine)，CarmustineWafer，康士德CC-5013，CCNU，CDDP，CeeNU，苯丁酸氮芥(Chlorambucil)，顺铂(Cisplatin)，亚叶酸因子(Citrovorum Factor)，克拉屈滨(Cladribine)，可的松(Cortisone)，CPT-11，环磷酰胺(Cyclophosphamide)，阿糖胞苷(Cytarabine)，阿糖胞苷脂质体(CytarabineLiposomal)，赛德萨达卡巴嗪(Dacarbazine)，Dacogen，更生霉素(Dactinomycin)，Darbepoetin Alfa，Dasatinib，柔红霉素(Daunomycin)，柔红霉素(Daunorubicin)，盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride)，柔红霉素脂质体(Daunorubicin Liposomal)，地卡特隆(Decadron)，地西他滨(Decitabine)，DepoCytTM，地塞米松(Dexamethasone)，醋酸地塞米松(Dexamethasone acetate)，地塞米松磷酸钠(Dexamethasone SodiumPhosphate)，地塞米松(Dexasone)，右雷佐生(Dexrazoxane)，DHAD，DIC，Diodex，多西紫杉醇(Docetaxel)，多柔比星(Doxorubicin)，多柔比星脂质体(Doxorubicin liposomal)，DroxiaTM，DTIC，EligardTM，EllenceTM，乐沙定(Eloxatin)TM，表柔比星(Epirubicin)，阿法依伯汀(Epoetin alfa)，ErbituxTM，Erlotinib，欧文氏菌属L-天冬酰胺酶(Erwinia L-asparaginase)，雌莫司汀(Estramustine)，氨磷汀(Ethyol)，依托泊苷(Etoposide)，磷酸依托泊苷(Etoposide Phosphate)，依西美坦(Exemestane)，法乐通非格司亭(Filgrastim)，氟尿苷(Floxuridine)，氟达拉滨(Fludarabine)，氟尿嘧啶(Fluorouracil)，氟尿嘧啶(Fluorouracil)(乳膏)，氟甲睾酮(Fluoxymesterone)，氟他胺(Flutamide)，亚叶酸(Folinic Acid)，氟维司群(Fulvestrant)，Gefitinib，吉西他滨(Gemcitabine)，奥佐米星(ozogamicin)，健择GleevecTM，Wafer，戈舍瑞林(Goserelin)，地塞米松(Hexadrol)，克瘤灵六甲蜜胺(Hexamethylmelamine)，HMM，和美新羟基脲醋酸氢化可的松氢化可的松(Hydrocortisone)，氢化可的松磷酸钠(Hydrocortisone SodiumPhosphate)，氢化可的松琥珀酸钠(Hydrocortisone Sodium Succinate)，氢化可的松磷酸(Hydrocortone Phosphate)，羟脲(Hydroxyurea)，伊达比星(Idarubicin)，异环磷酰胺(Ifosfamide)，甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)，咪唑羧酰胺(ImidazoleCarboxamide)，伊立替康(Irinotecan)，异维A酸(Isotretinoin)，Lapatinib，L-天冬酰胺酶，LCR，Lenalidomide，来曲唑(Letrozole)，亚叶酸钙(Leucovorin)，苯丁酸氮芥(Leukeran)，LeukineTM，亮丙瑞林(Leuprolide)，长春新碱(Leurocristine)，LeustatinTM，脂质体Ara-C，Liquid洛莫司汀(Lomustine)，L-PAM，L-沙可来新(L-Sarcolysin)，LupronM，Maxidex，氮芥(Mechlorethamine)，盐酸氮芥(MechlorethamineHydrochloride)，美卓乐梅格施甲地孕酮(Megestrol)，醋酸甲地孕酮(MegestrolAcetate)，美法仑(Melphalan)，巯嘌呤(Mercaptopurine)，美司钠(Mesna)，MesnexTM，甲氨蝶呤(Methotrexate)，甲氨蝶呤钠(Methotrexate Sodium)，甲泼尼龙(Methylprednisolone)，丝裂霉素(Mitomycin)，丝裂霉素-C(Mitomycin-C)，米托蒽醌(Mitoxantrone)，MTC，MTX，氮芥(Mustine)，马利兰MylocelTM，诺维本萘拉滨(Nelarabine)，NeulastaTM，优保津尼鲁米特(Nilutamide)，氮芥(Nitrogen Mustard)，能灭瘤奥曲肽(Octreotide)，醋酸奥曲肽(Octreotide acetate)，安可平OnxalTM，Oprevelkin，奥沙利铂(Oxaliplatin)，紫杉醇(Paclitaxel)，蛋白结合紫杉醇，帕米磷酸(Pamidronate)，Panitumumab，培门冬酶(Pegaspargase)，PEG-L-天冬酰胺酶，培美曲塞(PEMETREXED)，喷司他丁(Pentostatin)，苯丙氨酸氮芥(Phenylalanine Mustard)，泼尼松龙(Prednisolone)，泼尼松(Prednisone)，丙卡巴肼(Procarbazine)，具有卡莫司汀(Carmustine)植入物的Prolifeprospan 20，雷洛昔芬(Raloxifene)，柔红霉素盐酸盐(Rubidomycin hydrochloride)，善得定Sandostatin沙格司亭(Sargramostim)，Sorafenib，SPRYCELTM，STI-571，链佐星(Streptozocin)，SU11248，Sunitinib，他莫昔芬(Tamoxifen)，泰素泰索帝替莫唑胺(Temozolomide)，替尼泊苷(Teniposide)，TESPA，沙利度胺(Thalidomide)，硫鸟嘌呤(Thioguanine)，Thioguanine Thiophosphoamide，塞替派(Thiotepa)，托泊替康(Topotecan)，托瑞米芬(Toremifene)，维A酸(Tretinoin)，TrexallTM，TSPA，VCR，VectibixTM，凡毕士ViadurTM，长春碱(Vinblastine)，硫酸长春碱(Vinblastine Sulfate)，Vincasar长春新碱(Vincristine)，长春瑞滨(Vinorelbine)，酒石酸长春瑞滨(Vinorelbine tartrate)，VLB，VM-26，Vorinostat，VP-16，威猛希罗达ZevalinTM，诺雷德唑来膦酸(Zoledronic acid)，Zolinza，或其任意组合；
所述放射性药品选自：碳-11，碳-14，铬-51，钴-57，钴-58，铒-169，氟-18，镓-67，金-198，铟-111，铟-113m，碘-123，碘-125，碘-131，铁-59，氪-81m，氮-13，氧-15，磷-32，铼-186，铷-82，钐-153，硒-75，锶-89，锝-99m，铊-201，氚，氙-127，氙-133，钇-90，或其任意组合；
所述显像剂选自：钆，磁铁矿/磁石(magnetite)，锰，锝，I125，I131，P32，Tl201，碘帕醇(Iopamidol)，PET-FDG，或其任意组合。
16.分离的核酸分子，其编码权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求9-10任一项所述的多特异性抗体、或权利要求11-14任一项所述的融合蛋白。
17.载体，包括编码权利要求16所述的分离的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。
18.宿主细胞，其包含权利要求16所述的分离的核酸分子和/或权利要求15所述的载体。
19.制备权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求9-10任一项所述的多特异性抗体、或权利要求11-14任一项所述的融合蛋白的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养权利要求18所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述单域抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、或融合蛋白。
20.药物组合物，其包含权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求9-10任一项所述的多特异性抗体、权利要求11-14任一项所述的融合蛋白、权利要求15所述的缀合物、权利要求16所述的分离的核酸分子、权利要求17所述的载体或权利要求18所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
21.试剂盒，其包含权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求9-10任一项所述的多特异性抗体、权利要求11-14任一项所述的融合蛋白、权利要求15所述的缀合物、权利要求16所述的分离的核酸分子、权利要求17所述的载体、权利要求18所述的宿主细胞或权利要求20所述的药物组合物，以及任选地使用说明书。
22.权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段用于延长与其连接的活性剂的体内半衰期的用途，其中，体内半衰期的所述延长是相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段时所述活性剂的体内半衰期；
优选地，所述活性剂是另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；优选地，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物如权利要求9或10中所定义；
优选地，所述活性剂是另外的生物活性多肽；优选地，所述另外的生物活性多肽如权利要求11-14任一项中所定义；
优选地，所述活性剂是化疗药物、放射性药品或显影剂；优选地，所述化疗药物、放射性药品或显影剂如权利要求15中所定义。
23.延长活性剂的体内半衰期的方法，其包括将所述活性剂与权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段连接；其中，体内半衰期的所述延长是相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段时所述活性剂的体内半衰期；
优选地，所述活性剂是另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物；优选地，所述另外的抗体或其抗原结合片段、或抗体类似物如权利要求9或10中所定义；
优选地，所述活性剂是另外的生物活性多肽；优选地，所述另外的生物活性多肽如权利要求11-14任一项中所定义；
优选地，所述活性剂是化疗药物、放射性药品或显影剂；优选地，所述化疗药物、放射性药品或显影剂如权利要求15中所定义。
24.权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求9-10任一项所述的多特异性抗体、权利要求11-14任一项所述的融合蛋白、权利要求15所述的缀合物、权利要求16所述的分离的核酸分子、权利要求17所述的载体、权利要求18所述的宿主细胞或权利要求20所述的药物组合物，在制备药物中的用途，所述药物显示相对于缺少所述单域抗体或其抗原结合片段的相应的药物延长的体内半衰期；
优选地，所述药物是蛋白质药物。
25.权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求9-10任一项所述的多特异性抗体、权利要求11-14任一项所述的融合蛋白、权利要求15所述的缀合物、权利要求16所述的分离的核酸分子、权利要求17所述的载体、权利要求18所述的宿主细胞或权利要求20所述的药物组合物，在制备用于肿瘤、感染、自身免疫疾病、或与代谢或发育相关的疾病的预防和/或治疗或辅助治疗的药物中的用途。
26.一种预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤、感染、自身免疫疾病、或与代谢或发育相关的疾病的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施用有效剂量的权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段、权利要求9-10任一项所述的多特异性抗体、权利要求11-14任一项所述的融合蛋白、权利要求15所述的缀合物、权利要求16所述的分离的核酸分子、权利要求17所述的载体、权利要求18所述的宿主细胞或权利要求20所述的药物组合物。
27.融合蛋白，其包括权利要求1-8任一项所述的单域抗体或其抗原结合片段和SEQ IDNO.44所示的G-CSF，其中所述融合蛋白以小于约40nM，例如小于约30nM、20nM、15nM、10nM、8nM、5nM、3nM，1nM或更小的EC50结合人血清白蛋白；优选地，所述EC50通过ELISA技术测得。
28.权利要求27所述的融合蛋白，在制备药物中的用途，所述药物用于：
(1)促进造血干细胞的增值、分化，
(2)增加血液中中性粒或白细胞的数量，
(3)激活血液中中性粒细胞的功能，
(4)减轻或消除骨髓造血抑制，
(5)预防和/或治疗感染，
(6)预防和/或治疗肿瘤治疗引起的中性粒细胞或白细胞减少，或
(7)(1)-(6)的任意组合。
29.一种预防和/或治疗中性粒或白细胞减少的方法，所述方法包括对有需要的个体使用有效剂量的权利要求27所述的融合蛋白，优先地，所述个体为人，优先地，所述中性粒或白细胞减少与肿瘤治疗相关。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113912730A (zh) * 2021-12-14 2022-01-11 北京科诺信诚科技有限公司 缓释的抗FcRn抗体或抗原结合片段及其应用
WO2022253302A1 (zh) * 2021-06-03 2022-12-08 北京科诺信诚科技有限公司 靶向人血清白蛋白(hsa)的纳米抗体及其应用
CN115703829A (zh) * 2021-08-16 2023-02-17 厦门大学 针对SARS-CoV-2的单域抗体及其用途
WO2023186120A1 (zh) * 2022-03-31 2023-10-05 普米斯生物技术(珠海)有限公司 抗血清白蛋白纳米抗体及其衍生物
WO2023216981A1 (zh) * 2022-05-07 2023-11-16 北京拓界生物医药科技有限公司 松弛素或类似物的融合蛋白及其医药用途
WO2023227134A1 (zh) * 2022-05-26 2023-11-30 上海洛启生物医药技术有限公司 长效il5纳米抗体及用途

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070269422A1 (en) * 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
US20090028880A1 (en) * 2005-05-18 2009-01-29 Ablynx Nv Serum albumin binding proteins
US20090111745A1 (en) * 2004-12-02 2009-04-30 Domantis Limited Plad Domain Peptides With Increased Serum Half Life Due To Conjugation To Domain Antibodies
US20090214534A1 (en) * 2004-12-02 2009-08-27 Steve Holmes Bispecific Domain Antibodies Targeting Serum Albumin And GLP-1 Or PYY
US20140186365A1 (en) * 2013-01-03 2014-07-03 Institute For Cancer Research D/B/A The Research Institute Of Fox Chase Cancer Center Antibodies that specifically bind to serum albumin without interfering with albumin's capability to interact with the fcrn
US20140302033A1 (en) * 2011-11-11 2014-10-09 Ucb Pharma S.A. Albumin binding antibodies and binding fragments thereof
CN108473564A (zh) * 2015-11-18 2018-08-31 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合剂
CN110049997A (zh) * 2016-12-07 2019-07-23 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合免疫球蛋白单可变结构域

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090111745A1 (en) * 2004-12-02 2009-04-30 Domantis Limited Plad Domain Peptides With Increased Serum Half Life Due To Conjugation To Domain Antibodies
US20090214534A1 (en) * 2004-12-02 2009-08-27 Steve Holmes Bispecific Domain Antibodies Targeting Serum Albumin And GLP-1 Or PYY
US20090028880A1 (en) * 2005-05-18 2009-01-29 Ablynx Nv Serum albumin binding proteins
US20070269422A1 (en) * 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
US20140302033A1 (en) * 2011-11-11 2014-10-09 Ucb Pharma S.A. Albumin binding antibodies and binding fragments thereof
US20140186365A1 (en) * 2013-01-03 2014-07-03 Institute For Cancer Research D/B/A The Research Institute Of Fox Chase Cancer Center Antibodies that specifically bind to serum albumin without interfering with albumin's capability to interact with the fcrn
CN108473564A (zh) * 2015-11-18 2018-08-31 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合剂
CN110049997A (zh) * 2016-12-07 2019-07-23 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合免疫球蛋白单可变结构域

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022253302A1 (zh) * 2021-06-03 2022-12-08 北京科诺信诚科技有限公司 靶向人血清白蛋白(hsa)的纳米抗体及其应用
CN115703829A (zh) * 2021-08-16 2023-02-17 厦门大学 针对SARS-CoV-2的单域抗体及其用途
CN113912730A (zh) * 2021-12-14 2022-01-11 北京科诺信诚科技有限公司 缓释的抗FcRn抗体或抗原结合片段及其应用
WO2023186120A1 (zh) * 2022-03-31 2023-10-05 普米斯生物技术(珠海)有限公司 抗血清白蛋白纳米抗体及其衍生物
WO2023216981A1 (zh) * 2022-05-07 2023-11-16 北京拓界生物医药科技有限公司 松弛素或类似物的融合蛋白及其医药用途
WO2023227134A1 (zh) * 2022-05-26 2023-11-30 上海洛启生物医药技术有限公司 长效il5纳米抗体及用途

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