CN117860786A

CN117860786A - 基因修饰间充质干细胞在多种疾病中的制药用途和诊断用途

Info

Publication number: CN117860786A
Application number: CN202410276787.8A
Authority: CN
Inventors: 刘拥军; 刘广洋; 李欣; 张晨亮; 徐晓丹; 周敬文
Original assignee: Beijing Beilai Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Beijing Beilai Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2024-03-12
Filing date: 2024-03-12
Publication date: 2024-04-12

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及基因修饰间充质干细胞在多种疾病中的制药用途和诊断用途。本发明提供了一种经修饰的干细胞在以下的用途：制备预防和/或治疗炎性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病和/或肿瘤的药物中的用途；和/或；制备炎性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病和/或肿瘤的诊断产品中的用途；所述干细胞包含、表达和/或分泌：第一抗体和第二抗体，所述第一抗体包含如SEQ ID NO:1‑3所示的HCDR1‑3；所述第二抗体包含如SEQ ID NO:4‑6所示的HCDR4‑6。C3‑H10‑MSC的疗效显著优于依奇珠单抗，且抗体表达含量极高，对生物医药产业具有重大意义。

Description

基因修饰间充质干细胞在多种疾病中的制药用途和诊断用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及基因修饰间充质干细胞在多种疾病中的制药用途和诊断用途。

背景技术

细胞治疗技术是指将人自体或异体细胞经过体外处理，回输人体后治疗或预防疾病的技术，其中体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、筛选以及给予药物或其他能改变细胞生物学行为的处理，经过处理的细胞发挥了主要治疗或预防疾病作用。细胞疗法主要包括：一类即以嵌合抗原受体T细胞（简称CAR-T）（Zhao Z, Chen Y, Francisco NM, ZhangY, Wu M. The application of CAR-T cell therapy in hematological malignancies:advantages and challenges. Acta Pharm Sin B. 2018;8(4):539-551.）、T细胞受体T细胞（简称TCR-T）、嵌合抗原受体自然杀伤细胞（简称CAR-NK）等为代表的在体外通过基因工程手段改造过的免疫细胞回输疗法，这种疗法也被FDA定义为基于细胞的基因疗法；一类则是直接获取后在体外扩增至一定数目便可进行回输的细胞疗法，如使用调节性T细胞（Treg）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）等治疗方案（Guidance for human somatic celltherapy and gene therapy[J]. Human Gene Therapy, 2001, 12(3):303.）；一类则是直接获取后在体外扩增至一定数目便可进行回输的细胞疗法，如使用调节性T细胞（Treg）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）等治疗方案。

目前的细胞疗法大多存在特异性不强、长效性较强，存在一定的脱靶效应等缺陷。以较为热门的CAR-T疗法为例，其在血液系统恶性肿瘤取得了一定疗效，但在实体瘤中疗效甚微。

干细胞技术与免疫治疗方法的结合产生了一种联合免疫疗法。近年来，科学家们开发了许多治疗性分子，例如双功能多靶点抗体、融合蛋白和溶瘤病毒，并且正在对不同类型的干细胞进行修饰以促进其有效递送。其中将抗体修饰的干细胞用于治疗肿瘤已经取得了一定成效（Hu, Q. et al. Conjugation of haematopoietic stem cells andplatelets decorated with anti-PD-1 antibodies augments anti-leukaemiaefficacy.Nat Biomed Eng2, 831-840 (2018).；Cordero A, Ramsey MD, Kanojia D, etal. Combination of tucatinib and neural stem cells secreting anti-HER2antibody prolongs survival of mice with metastatic brain cancer.Proc Natl Acad Sci U S A. 2022;119 (1): e2112491119.）。

国际专利申请WOUS22078320公开了一种修饰的CD117多肽，其包含抑制或减少与抗CD117抗体结合的一个或多个氨基酸修饰。还提供了编码修饰的CD117多肽的核酸，以及其中引入CD117核酸或多肽的细胞，例如造血干细胞，所述造血干细胞可用于例如造血细胞移植。

中国专利申请201980070933.9公开了一种或多种修饰的谱系特异性细胞表面抗原的遗传工程化造血细胞，例如造血干细胞（HSC）。在一些实施方案中，对一种或多种修饰的谱系特异性细胞表面蛋白进行修饰，使得谱系特异性细胞表面蛋白的一种或多种在HSC或表达其的后代细胞中至少部分保留其谱系特异性细胞表面抗原的生物学活性，但可逃避对相应野生型谱系特异性细胞表面抗原特异的细胞毒性剂的靶向作用。

目前本领域需要更多的修饰干细胞以用于免疫治疗。

发明内容

IL-17家族共有7个成员，分别被命名为IL-17A到IL-17F，IL-17家族氨基酸序列在C端高度相似，主要由5个在空间上保守的半胱氨酸组。表达IL-17最丰富的细胞主要是胸腺依赖的淋巴细胞，包括适应性免疫中的αβT细胞，固有免疫中的γδT细胞，恒定型自然杀伤T细胞和淋巴组织诱导样细胞（LTi-like cells）。IL-17家族在宿主抗微生物反应和炎症性疾病的发展过程中扮演着重要角色。IL-17促进了调节其各种功能的多种细胞因子的合成和分泌。这些细胞因子包括：趋化因子（如CXCL1、CXCL8和CCL2）；促炎症因子（如IL-6、TNF-α和IL-1β）；促炎症因子调节因子（如NOS和COX）；GM-CSF和G-CSF生长因子和组织重塑因子（如MMP1，MMP3和RANKL）。

不论是由固有免疫细胞还是适应性免疫细胞分泌的IL-17A和IL-17F，其最显著的功能是诱导中性粒细胞向感染部位迁移，IL-17A和IL-17F的这种功能对微生物的清除至关重要。一些研究表明，上皮和黏膜屏障受到细菌感染过程中诱导产生的IL-17A和IL-17F在宿主防御中起重要作用。第一个证明IL-17介导的宿主防御作用的研究是IL-17R缺陷型小鼠的克雷伯氏肺炎肺部感染模型（Ye P, et al. Requirement of interleukin 17receptor signaling for lung CXC chemokine and granulocyte colony-stimulatingfactor expression, neutrophil recruitment, and host defense.J Exp Med.2001;194(4):519-527.）。研究使用IL-17RA和IL-17缺陷型小鼠模型或是使用IL-17受体或配体的中和抗体来阻断IL-17信号通路，会导致小鼠对各种细胞外或者细胞内细菌感染更加敏感，这些细菌包括沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、链球菌肺炎、结核分枝杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺杆菌（Pappu R, et al. The interleukin-17cytokine family: critical players in host defence and inflammatorydiseases.Immunology. 2011; 134 (1): 8-16.;Iwakura Y, et al. Functionalspecialization of interleukin-17 family members.Immunity. 2011; 34 (2): 149-162.;McGeachy MJ, et al. The IL-17 Family of Cytokines in Health and Disease.Immunity 2019; 50 (4): 892-906.）。IL-17被鉴定为负责宿主防御真菌的分子之一，通过基因突变，这些分子被证明与人类对真菌的易感性有关。IL-17通路的先天缺陷，包括编码IL-17F或IL-17RA基因的缺陷，被发现与真菌感染的易感性增加有关，尤其是慢性黏膜皮念珠菌病，这明显表明IL-17通路在抗真菌免疫中起着重要作用（Cypowyj, et al. Immunityto infection in IL-17-deficient mice and humans.European Journal of Immunology42.9 (2012): 2246-2254.）。IL-17已被证明可以保护小鼠免受各种真菌感染，包括由肺孢子虫、夹膜组织胞浆菌和烟曲霉菌引起的感染（Gladiator A, et al. Innatelymphoid cells: new players in IL-17-mediated antifungal immunity.PLoS Pathog. 2013; 9 (12): e1003763.）。

IL-17通过两种途径促进肿瘤的发生，一种途径是通过维持炎症环境来减少了对肿瘤的局部免疫反应（He D, et al. IL-17 promotes tumor development through theinduction of tumor promoting microenvironments at tumor sites and myeloid-derived suppressor cells.J Immunol. 2010; 184 (5): 2281-2288.）；另一种途径是通过激活STAT3和NF-kB通路，促进抗凋亡基因的表达（Grivennikov SI, et al. Dangerousliaisons: STAT3 and NF-kappaB collaboration and crosstalk in cancer.Cytokine Growth Factor Rev. 2010; 21(1): 11-19.）IL-17在炎症相关的癌症中发挥其促癌症作用主要倚仗其促血管生成的特性。IL-17通过作用于基质细胞和成纤维细胞，诱导其分泌血管生成调节因子，包括VEGF，这些分泌血管生成调节因子能显著地加强炎症反应和促进肿瘤血管生成。

IL-17细胞因子家族成员，特别是IL-17A，与多种自身免疫性疾病有关，包括多发性硬化（MS）、类风湿关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）、1型糖尿病（TIDM）、炎症性肠病（IBD）和牛皮癣（Zhu S, et al. IL-17/IL-17 receptor system in autoimmunedisease: mechanisms and therapeutic potential.Clin Sci (Lond). 2012; 122(11): 487-511.）。在许多人类自身免疫性疾病中，IL-17细胞因子和IL-17受体表达上升。靶向IL-17和IL-17受体基因的转基因和敲除小鼠模型将IL-17细胞因子与自身免疫性的发展联系在一起。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的研究表明，IL-17A是T细胞介导的自身免疫性疾病病理学中的关键致病细胞因子（Langrish, C. L. et al. IL-23 drives apathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation.J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).；Sutton, C., Brereton, C., Keogh, B., Mills, K. H.&Lavelle, E. C. A crucial role for interleukin (IL)-1 in the induction of IL-17-producing T cells that mediate autoimmune encephalomyelitis.J. Exp. Med.203, 1685-1691 (2006).）。随后的研究表明，在EAE中，IL-17A由TH17细胞和分泌IL-17A的γδT（γδT17）细胞分泌（Sutton, C. E. et al. Interleukin-1 and IL-23 induceinnate IL-17 production from gammadelta T cells, amplifying Th17 responsesand autoimmunity.Immunity31, 331-341 (2009).）。

这些研究和其他详细阐述了IL-17A在人类疾病中的病理作用的研究最终导致了针对IL-17A（IL-17A和IL-17F、IL-17RA或IL-23）的单克隆抗体（mAb）的开发。目前全球范围内已上市多款阻断IL-17的抗体药物，其中包括中和IL-17A（Secukinumab和Ixekizumab）或IL-17RA（Brodalumab）的单抗药物，而国内在研的围绕IL-17靶点并用于自免疫疾病治疗的抗体药物或小分子已经超过50个。尽管与化疗药物相比抗体药通常在人体具有良好的疗效和耐受性，然而在临床使用中仍然存在很多治疗相关副作用，例如：鼻咽炎、头痛、恶心和腹泻或者更严重的如感染、心脏毒性和严重的免疫反应等；另外单抗药物结构复杂、稳定性相对较差也导致其需要反复大剂量注射从而达到最佳效果。

单域抗体（single domain antibody，sdAb），也称纳米抗体（nanobody，Nb)，最早是从骆驼血液中发现的新型抗体，因其只有两条重链，没有轻链，因此也被称为重链单域抗体VHH（variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody）。纳米抗体晶体直径2.5 nm，长4 nm，只包含一个重链可变区（VHH）和CH2、CH3区，相比于普通的抗体，纳米抗体轻链天然缺失，是自然存在的可以和抗原结合的最小片段。纳米抗体能像其他抗体一样与抗原等靶标紧紧结合，但不像单链抗体那样相互黏连聚集成块。以该“重链抗体”为基础的纳米抗体不仅分子量只是普通抗体的1/10，临床使用更加安全，而且化学性质也更加灵活、稳定性好、可溶性高、表达容易且容易偶联其他分子，因此研发IL17A纳米抗体可能克服传统抗体的，具有广阔的前景。

目前本领域尚未有采用IL-17（尤其是IL-17A）单域抗体修饰干细胞，以增强细胞免疫疗法的效果。

为了实现上述技术目的，本发明特此提出了以下技术方案：

在一个方面，本发明提供了一种经修饰的干细胞在以下的用途：

制备预防和/或治疗炎性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病和/或肿瘤的药物中的用途；和/或

制备炎性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病和/或肿瘤的诊断产品中的用途；

所述干细胞包含、表达和/或分泌：

（1）第一抗体，所述第一抗体包含特异性识别IL-17A的单域抗体；和

（2）第二抗体，所述第二抗体包含特异性识别IL-17A的单域抗体；

所述的第一抗体包含序列如SEQ ID NO: 1-3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和/或；与SEQ ID NO: 1-3所示的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列；

所述的第二抗体包含序列如SEQ ID NO: 4-6所示的HCDR4、HCDR5、HCDR6；和/或；与SEQ ID NO: 4-6所示的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述HCDR1具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，所述HCDR2具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，所述HCDR3具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，所述HCDR4具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，所述HCDR5具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述HCDR6具有如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO: 1为GEDLGYYA；

SEQ ID NO: 2为VTSSGSST；

SEQ ID NO: 3为ASTILLCSDYISAFGT；

SEQ ID NO: 4为GFSIHIYA；

SEQ ID NO: 5为ITRGGVT；

SEQ ID NO: 6为NAGGTNGGY。

其中SEQ ID NO: 7：DVQLVESGGGLVEPGESLRLSCAAP。

SEQ ID NO: 8：IAWFRQAPGKEREVVSC。

SEQ ID NO: 9：NYLSSVKDRFTISIDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC。

SEQ ID NO: 10：WGQGTQVTVAS。

SEQ ID NO: 11：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS。

SEQ ID NO: 12：MGWYRQAPGKQRELVAT。

SEQ ID NO: 13：NNADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYC。

SEQ ID NO: 14：WGQGTQVTVSS。

在又一个方面，本发明提供了一种经修饰的干细胞在以下的用途：

所述干细胞包含、表达和/或分泌：

1）第一蛋白，所述的第一蛋白的结构如FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4所示；

2）第二蛋白，所述的第二蛋白的结构如FR5-HCDR4-FR6-HCDR5-FR7-HCDR6-FR8所示；

所述HCDR1-HCDR6选自SEQ ID NO: 1-6所示的氨基酸序列；或；与SEQ ID NO: 1-6相比具有1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列；

所述FR1-FR8选自SEQ ID NO: 7-14所示的氨基酸序列；或；与SEQ ID NO: 7-14相比具有1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述的第一蛋白的序列包含如SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述的第二蛋白的序列包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列。

所述干细胞包含、表达和/或分泌融合蛋白：

所述的融合蛋白包含结构为FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4-linker-FR5-HCDR4-FR6-HCDR5-FR7-HCDR6-FR8的氨基酸序列；

HCDR1-HCDR6选自SEQ ID NO: 1-6所示的氨基酸序列；或；与SEQ ID NO: 1-6相比具有1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列；

FR1-FR8选自SEQ ID NO: 7-14所示的氨基酸序列；或；与SEQ ID NO: 7-14相比具有1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述linker（连接肽）包含G（Gly）、S（Ser）和A（Ala）或由G（Gly）和S（Ser）组成的柔性多肽，优选2-30个氨基酸残基的柔性多肽。

在一些实施方案中，所述linker为富含Gly和Ser的组合的肽。

在一些实施方案中，所述linker包括但不限于(GS)n、(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n和AS(GGGGS)n等，n为1、2、3、4、5或6。

在一些优选的实施方案中，所述富含Gly和Ser的组合的肽为由重复的GGGGS氨基酸序列组成的序列。

在一些优选的实施方案中，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示。

SEQ ID NO: 15：GGGGSGGGGSGGGGS。

在一些优选的实施方案中，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列。

所述的干细胞包含：

ⅰ）第一核酸分子；和

ⅱ）第二核酸分子；

所述第一核酸分子包含编码SEQ ID NO: 1-6的核苷酸序列；

所述第二核酸分子包含编码SEQ ID NO: 7-14的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述的干细胞包含：

所述第一核酸分子包含编码SEQ ID NO: 19的核苷酸序列；

所述第二核酸分子包含编码SEQ ID NO: 20的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 19：

GATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCGAGCCTGGGGAATCTCTGAGGCTCTCCTGTGCAGCCCCTGGAGAGGATTTGGGTTATTACGCCATAGCCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGTGAGGTAGTCTCATGTGTCACAAGTAGTGGTAGTAGCACAAACTATTTAAGTTCCGTGAAGGACCGATTCACCATCTCCATAGACAACGCCAAGAACACGGTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGCCGTTTATTACTGTGCGTCCACTATTCTCCTCTGTTCAGATTATATCTCTGCCTTTGGCACCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCGCCTCG。

SEQ ID NO: 20：

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCGGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTTAGTATCCACATCTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGCTGGTCGCAACTATTACTAGAGGTGGTGTAACAAATAATGCAGACTCCGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGCGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAATGCAGGTGGGACGAACGGGGGCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。

所述的干细胞包含：编码SEQ ID NO: 18的核苷酸序列。

SEQ ID NO: 18：

DVQLVESGGGLVEPGESLRLSCAAPGEDLGYYAIAWFRQAPGKEREVVSCVTSSGSSTNYLSSVKDRFTISIDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCASTILLCSDYISAFGTWGQGTQVTVASGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSIHIYAMGWYRQAPGKQRELVATITRGGVTNNADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCNAGGTNGGYWGQGTQVTVSS。

在一些实施方案中，编码SEQ ID NO: 18的核苷酸序列如SEQ ID NO: 21所示。

SEQ ID NO: 21：

GATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCGAGCCTGGGGAATCTCTGAGGCTCTCCTGTGCAGCCCCTGGAGAGGATTTGGGTTATTACGCCATAGCCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGTGAGGTAGTCTCATGTGTCACAAGTAGTGGTAGTAGCACAAACTATTTAAGTTCCGTGAAGGACCGATTCACCATCTCCATAGACAACGCCAAGAACACGGTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGCCGTTTATTACTGTGCGTCCACTATTCTCCTCTGTTCAGATTATATCTCTGCCTTTGGCACCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCGCCTCGGGAGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCGGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTTAGTATCCACATCTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGCTGGTCGCAACTATTACTAGAGGTGGTGTAACAAATAATGCAGACTCCGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGCGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAATGCAGGTGGGACGAACGGGGGCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。

在一些实施方案中，前述任一核酸分子或核苷酸序列包含于重组表达载体。所述表达载体包括原核表达载体或真核表达载体；优选地，所述真核表达载体选自酵母表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物表达载体；更优选地，所述哺乳动物表达载体选自逆转录病毒表达载体、慢病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体。

在一些实施方案中，所述干细胞还包含协助其表达和/或分泌，或延长其在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段。

在一些实施方案中，所述生物活性蛋白（也可包括多肽）或其功能片段选自免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白（例如，人血清白蛋白（HSA））、白蛋白结合多肽（例如HAS结合多肽）、前白蛋白（也称为转甲状腺素）、羧基末端肽（例如，人绒毛膜促性腺激素β亚基（CTP））、弹性蛋白样多肽（ELP）、His标签（优选6×His）、GST（谷胱甘肽巯基转移酶）标签、MBP（麦芽糖结合蛋白）标签、FLAG标签、SUMO（泛素样修饰蛋白）标签等中的至少一种。

在一些优选的实施方案中，所述生物活性蛋白或其功能片段可以为人免疫球蛋白Fc结构域，优选人IgG的Fc结构域，例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc结构域，更优选人IgG1的Fc结构域。

在一些实施方案中，所述干细胞选自胚胎干细胞、成体干细胞、间充质干细胞、脐带血干细胞、造血干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、皮肤干细胞或肌肉干细胞等。

在一些实施方案中，所述干细胞分离自脐带血、脐带、胎盘、脂肪组织、皮肤、神经组织、骨髓或胚胎等。

在一些优选的实施方案中，所述干细胞可以为间充质干细胞。

在一些优选的实施方案中，所述间充质干细胞分离自骨髓组织、脂肪组织、脐带组织或胎盘组织。

在一些实施方案中，所述药物包括有效治疗量的所述经修饰的干细胞、所述经修饰的干细胞的培养物、或经修饰的干细胞的提取物；

任选地，所述药物还包括至少一种药学上可接受的载剂。

在一些实施方案中，所述药学上接受的载剂包括，但不限于溶剂、稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂或抗氧化剂。

在一些实施方案中，所述药物可以为药学上可接受的任一形式，例如水针注射剂、冻干粉针剂、注射液、口服溶液、粉针剂、颗粒剂、散剂等，优选水针注射剂。

在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病包括，但不限于白塞氏病、系统性红斑狼疮、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化症、系统性硬皮病、进行性系统性硬化症、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎（结节性多动脉炎、显微镜下多血管炎）、主动脉炎综合征（高安动脉炎）、（恶性类）风湿性关节炎、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、脊椎关节炎、混合性结缔组织病、卡斯尔曼病、干燥综合征、成人斯蒂尔病、血管炎、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎、大血管血管炎、ANCA相关性血管炎（例如，韦格纳肉芽肿和嗜酸性韦格纳肉芽肿）、Cogan综合征、RS3PE综合征、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、IgG4相关疾病（例如，原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胰岛炎等）、格林巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、Good-pasture综合征、急进性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、巴塞杜病（格雷夫斯病（甲亢））、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、艾迪生病（慢性肾上腺皮质功能减退症）、特发性艾迪生病、I型糖尿病、缓慢进展型I型糖尿病（成人隐匿性自身免疫性糖尿病）、局灶性硬皮病、银屑病、银屑病关节炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、白斑病、寻常型白斑病、视神经脊髓炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多灶性运动神经病、结节病、巨细胞动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、自身免疫性视神经病、特发性无精子症、习惯性流产、炎症性肠病（例如溃疡性结肠炎、克罗恩病）、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、扩张型心肌病、系统性肥大细胞增多症或包涵体肌炎等。

在一些实施方案中，所述自身性免疫疾病为斑块状银屑病、类风湿关节炎、风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎或狼疮性肾炎。

在一些实施方案中，所述肿瘤包括，但不限于基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、胆管癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肝癌、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌（例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌）、淋巴瘤（包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤）、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统癌、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）、急性成淋巴细胞性白血病（ALL）、毛细胞白血病、慢性成髓细胞性白血病等。

本发明基于串联单域抗体C3-H10，构建了基因修饰间充质干细胞C3-H10-MSC。本发明提供了C3-H10-MSC在治疗自免疫疾病中的用途，通过典型自免疫疾病动物模型（风湿性关节炎模型、银屑病模型、银屑病关节炎模型等）表征了C3-H10-MSC的治疗效果。一系列实验结果显示，在体重恢复、足爪厚度降低、病理评分、皮肤临床评分以及细胞因子的含量下调等各项指标中，均显著优于阳性对照抗体依奇珠单抗（Ixekizumab）。依奇珠单抗是目前为数不多有效治疗自免疫疾病尤其是银屑病的抗体药物，本发明的C3-H10-MSC在动物模型中的治疗效果显著优于依奇珠单抗，而且抗体表达含量极高，展现出了在临床治疗自免疫疾病的巨大潜力，对生物医药产业具有重大意义。

附图说明

图1示出了IL-17A重组蛋白的SDS-PAGE结果。其中M为蛋白marker，泳道1为IL-17A重组蛋白精纯前的样品，泳道2为IL-17A重组蛋白精纯后的样品。

图2示出了串联单域抗体1-C3-3-H10的SDS-PAGE结果。

图3示出了ELISA检测串联单域抗体亲和力的实验结果。

图4示出了ELISA检测阳性对照抗体亲和力的实验结果。

图5示出了ELISA检测阴性对照亲和力的实验结果。

图6示出了BLI检测串联单域抗体亲和力的实验结果。

图7示出了BLI检测阳性对照抗体亲和力的实验结果。

图8示出了串联单域抗体阻断功能检测的实验结果。

图9示出了阳性对照抗体阻断功能检测的实验结果。

图10示出了串联单域抗体的热稳定性检测结果。

图11示出了阳性对照抗体的热稳定性检测结果。

图12示出了C3-H10慢病毒滴度的检测结果。

图13示出了流式细胞术检测成功感染C3-H10慢病毒的间充质干细胞的实验结果。

图14示出了ELISA检测IL17Nb-MSC表达IgG4浓度的实验结果。

图15示出了ELISA检测IL17Nb-MSC表达IL17Nb浓度的实验结果。

图16示出了IL17Nb-MSC对IL17A/IL17RA的结合抑制检测结果。

图17示出了C3-H10-MSC与C3-H10重组蛋白稳定性测定的实验结果。

图18示出了不同处理组小鼠的平均体重变化情况（类风湿关节炎模型）。其中***代表模型对照组与正常对照组之间代表存在显著性差异，显著性P<0.001；&&代表C3-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.01；##代表C3-H10-MSC治疗组与模型对照组之间代表存在显著性差异，显著性P<0.01；@代表C3-H10-MSC治疗组与hUC-MSC治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.05。

图19示出了不同处理组小鼠的动物平均足爪厚度的变化情况（类风湿关节炎模型）。其中***代表模型对照组与正常对照组之间代表存在显著性差异，显著性P<0.001；##代表治疗组（阳性抗体、hUC-MSC和C3-H10-MSC治疗组）与模型对照组之间代表存在显著性差异，显著性P<0.01；&代表C3-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.05。

图20示出了不同处理组小鼠的组织病理结果（类风湿关节炎模型）。

图21示出了不同处理组小鼠的病理评分（类风湿关节炎模型）。其中#代表hUC-MSC治疗组与模型对照组之间代表存在显著性差异，显著性P<0.05；##代表C3-H10-MSC治疗组与模型对照组之间存在显著性差异，显著性P<0.01；&代表C3-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.05。

图22示出了不同处理组小鼠的平均体重变化情况（银屑病模型）。其中**代表模型对照组和正常对照组存在显著性差异，显著性P<0.01；##代表C3-H10-MSC治疗组与模型对照组之间存在显著性差异，显著性P<0.01；&&代表C3-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.01。

图23示出了不同处理组小鼠的皮肤变化情况（银屑病模型）。

图24示出了不同处理组小鼠的皮肤临床评分（银屑病模型）。其中****代表模型对照组和正常对照组存在显著性差异，显著性P<0.0001；###代表治疗组（阳性抗体、hUC-MSC和C3-H10-MSC治疗组）与模型对照组之间存在显著性差异，显著性P<0.001；&代表C3-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.05；@代表C3-H10-MSC治疗组与hUC-MSC治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.05。

图25示出了不同处理组小鼠的皮肤厚度变化情况（银屑病模型）。其中***代表模型对照组与正常对照组相比存在显著性差异，显著性P<0.001；##代表治疗组（阳性抗体、hUC-MSC和C3-H10-MSC治疗组）与模型对照组之间存在显著性差异，显著性P<0.01；&&代表C3-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.01。

图26示出了不同处理组小鼠的平均体重变化情况（银屑病关节炎模型）。其中**代表模型对照组和正常对照组存在显著性差异，显著性P<0.01；&代表C3-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.05；#代表C3-H10-MSC治疗组与模型对照组之间存在显著性差异，显著性P<0.05。

图27示出了不同处理组小鼠的足爪关节平均评分（银屑病关节炎模型）。其中****代表模型对照组和正常对照组存在显著性差异，显著性P<0.0001；###代表治疗组（阳性抗体、hUC-MSC和C3-H10-MSC治疗组）与模型对照组之间存在显著性差异，显著性P<0.001；&代表C3-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.05；@代表C3-H10-MSC治疗组与hUC-MSC治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.05。

图28示出了不同处理组的皮肤临床评分（银屑病关节炎模型）。其中****代表模型对照组和正常对照组存在显著性差异，显著性P<0.0001；##代表治疗组（阳性抗体、hUC-MSC和C3-H10-MSC治疗组）与模型对照组之间存在显著性差异，显著性P<0.01；&代表C3-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.05；@代表C3-H10-MSC治疗组与hUC-MSC治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.05。

图29示出了不同处理组的TNF-α水平变化情况（银屑病关节炎模型）。其中**代表模型对照组与正常对照组之间存在显著性差异，显著性P<0.01；##代表C3-H10-MSC治疗组与模型对照组存在显著性差异，显著性P<0.01；#代表hUC-MSC治疗组与模型对照组存在显著性差异，显著性P<0.05；&代表C3-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.05；@代表C3-H10-MSC治疗组与hUC-MSC治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.05。

图30示出了不同处理组的IL-6水平变化情况（银屑病关节炎模型）。其中**代表模型对照组与正常对照组之间存在显著性差异，显著性P<0.01；#代表治疗组（hUC-MSC、C3-H10-MSC治疗组）与模型对照组之间存在显著性差异，显著性P<0.05。

图31示出了不同处理组的IL-23水平变化情况（银屑病关节炎模型）。其中*代表模型对照组与正常对照组之间存在显著性差异，显著性P<0.05；#代表治疗组（阳性抗体、C3-H10-MSC治疗组）与模型对照组之间存在显著性差异，显著性P<0.05；@代表C3-H10-MSC治疗组与hUC-MSC治疗组之间存在显著性差异，显著性P<0.05。

具体实施方式

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。

除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。

如本文所用，术语“约”表示其后的数值的±20%的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10%的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5%的范围。

如本文所用，术语“包括（comprises）”或“包含（comprising）”是指“包括但不限于”。该术语旨在是开放式的，以指定任何所述特征、要素、整数、步骤或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、要素，整数、步骤、组件或其组的存在或添加。因此，术语“包含”包括更具限制性的术语“由……组成”和“基本上由……组成”。在一个实施方式中，在整个申请中特别是在权利要求书中使用的术语“包含”可以被术语“由……组成”代替。本文所用氨基酸三字母代码和单字母代码如本领域技术人员知晓，或J Biol. Chem, 243, p3558(1968)中所述。

如本文所用，术语“任选”、“任一”、“任意”或“任一项”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。

如本文所用，术语“干细胞”是指在单细胞水平上自我更新和分化以产生子代细胞的未分化细胞，包括自我更新的祖细胞、非更新的祖细胞以及终末分化的细胞。所述干细胞一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时在身体生长、维修、更新、损伤修复中起着主要作用。

如本文所用，术语“间充质干细胞”，本领域也称为“间质干细胞（mesenchymalstem cell，MSC）”，是指一类源自中胚层的，具有一定分化潜能、可以分化成多种细胞类型的多能基质细胞群。其主要源自和存在于骨髓，此外也包括广泛源自其他“非骨髓”组织的多能细胞，例如：胎盘、脐带血、脂肪组织、成人肌肉、角膜基质、乳牙牙髓等组织。

如本文所用，术语“IL-17A”、“白介素-17A”或“IL-17”，是指一种细胞因子，属于白细胞介素17家族，由T细胞和其他类型的免疫细胞产生，并在免疫系统中发挥重要作用。IL-17A主要由Th17细胞产生，其他细胞包括CD8+T细胞、γδ T细胞、NK细胞及中性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞也表达IL-17A。它主要作用于免疫细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞，诱导炎症反应。在一些实例中，该术语包括变体、同源物、直系同源物和旁系同源物。例如，对人IL-17A特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴的IL-17A蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人IL-17A蛋白特异的抗体可以完全地对人IL-17A蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的IL-17A蛋白交叉反应。

如本文所用，术语“抗IL-17A单域（纳米）抗体”、“IL-17A单域（纳米）抗体”或“特异性结合IL-17A的串联单域（纳米）抗体，是指特异性结合IL-17A，并且部分或完全地中和、抑制或削弱IL-17A活性、和/或使IL-17A失活、阻止IL-17A应答或由IL-17A介导的下游通路或其他IL-17A介导的功能的抗体。

如本文所用，术语“抗体”，是指包含由二硫键（S-S）相互连接的重链（H）和轻链（L）的糖蛋白。每条重链由重链可变区（本文中缩写为VH）和重链恒定区（本文中缩写为CH）组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区（本文中缩写为VL）和轻链恒定区（本文中缩写为VH）组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。轻链分为两类分别为kappa型轻链和lambda型轻链（例如本发明中轻链恒定区Cκ/λ表示轻链恒定区为kappa型轻链或者lambda型轻链）。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区（也称互补决定区（CDR）），其间插有较保守的构架区或框架区（FR）。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。抗体包含单特异性抗体、双特异性抗体和多特异性抗体，只要其表现所期望的生物活性或功能即可。

如本文所用，术语“单域抗体”（sdAb）或“纳米抗体”，具有其在本领域中的一般含义，且是指具有仅12-15 kDa分子量的抗体片段，其由来源于重链的单个单体可变抗体结构域组成。这种单域抗体（命名为VHH）可以在骆驼科哺乳动物中发现，且天然缺失轻链。对于（单）域抗体的一般描述，还参考上述现有技术以及EP 0368684, Ward等（Nature 1989 Oct12；341 (6242): 544-6），Holt et al, Trends Biotechnol, 2003, 21 (11): 484-490；和WO 06/030220，WO 06/003388。单域抗体的氨基酸序列和结构可以被认为由四个框架区或“FR”组成，其在本领域中被分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；为“框架区3”或“FR3”；以及“框架区4”或“FR4”；框架区被三个互补决定区或“CDR”间隔，在本领域中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”，以及“互补决定区3”或“CDR3”。因此，单域抗体可定义为具有以下一般结构的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1-FR4分别指框架区1-4，且其中CDR1-CDR3指互补决定区1-3。在本公开的上下文中，单域抗体的氨基酸残基根据International ImMunoGeneTics information system氨基酸编号（http://imgt.cmes.fr/）给出的VH结构域的通用编号方式进行编号。

如本文所用，术语“氨基酸”，是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ羧基谷氨酸和O 磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，碳结合至氢、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍类。这些类似物具有修饰的R基团（例如正亮氨酸）或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的一般化学结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。

如本文所用，术语“活性”、“功能活性”或“生物活性”，或术语“生物性质”或“生物特征”此处可互换使用，包括但不限于表位/抗原亲和力和特异性、在体内或体外中和或拮抗IL-17A活性的能力、IC50、抗体的体内稳定性和抗体的免疫原性质。本领域公知的抗体的其它可鉴定的生物学性质或特征包括，例如，交叉反应性（即通常与靶定肽的非人同源物，或与其它蛋白质或组织的交叉反应性），和保持哺乳动物细胞中蛋白质高表达水平的能力。使用本领域公知的技术观察、测定或评估前面提及的性质或特征，所述技术包括但不局限于ELISA、FACS或BIACORE等离子体共振分析、不受限制的体外或体内中和测定、受体结合、细胞因子或生长因子的产生和/或分泌、信号转导和不同来源（包括人类、灵长类或任何其它来源）的组织切片的免疫组织化学。

如本文所用，术语“Fc”或“Fc区”或“Fc片段”，是指由IgA、IgD及IgG的CH2和CH3结构域，或者由IgE及IgM的CH2、CH3和CH4结构域通过铰链区的组成的多肽。尽管Fc片段的分解是可变的，但是人IgG的重链Fc片段通常指从A231到其羧基末端这一段多肽。

如本文所用，术语“表位”，是指能够特异性结合抗体的蛋白决定簇。表位通常由表面簇集的分子，例如氨基酸或糖侧链组成，和通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的不同之处在于与前者而非后者的结合在存在变性溶剂的情况下丢失。表位可包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效封闭或覆盖的氨基酸残基（换言之，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹内）。

如本文所用，术语“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由平衡解离常数（KD）代表，平衡解离常数是解离速率常数和结合速率常数（分别是K_off和K_on）的比值。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。用于测量亲和力的一个具体方法是本文中的ForteBio动力学结合测定法。

如本文所用，术语“高亲和性”或“高亲和力”，对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0×10^-6M或更低，优选5.0×10^-8M或更低，更优选1.0×10^-8M或更低、5.0×10^-9M或更低，更优选1.0×10^-9M或更低。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指KD为10^-6M或更低，优选10^-7M或更低，更优选10^-8M或更低。

如本文所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）及其呈单链或双链形式的聚合物。除非明确地限制，否则术语包括具有与参照核酸相似的结合性质并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢的含有已知的天然核苷酸的类似物的核酸（参见，属于Kariko等人的美国专利No. 8278036，其公开了尿苷被假尿苷替代的mRNA分子，合成所述mRNA分子的方法以及用于在体内递送治疗性蛋白的方法）。除非另有所指，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体（例如，简并密码子取代）、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可通过生成其中一个或多个选择的（或全部）密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现（Batzer,Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka,J.Biol.Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini,Mol.Cell.Probes8: 91-98 (1994))。

如本文所用，术语“构建体”是指任何重组多核苷酸分子（诸如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体或线性或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子），衍生自任何来源，能够与基因组整合或自主复制，构成如下多核苷酸分子，其中已经以功能操作的方式连接（即，可操作地连接）一或多个多核苷酸分子。重组构建体通常会包含可操作地连接至转录起始调节序列的本发明的多核苷酸，这些序列会导引多核苷酸在宿主细胞中的转录。可使用异源及非异源（即，内源）启动子两者导引本发明的核酸的表达。

如本文所用，术语“载体”是指任何重组多核苷酸构建体，该构建体可用于转化的目的（即将异源DNA引入到宿主细胞中）。一种类型的载体为“质粒”，是指环状双链DNA环，可将额外DNA区段连接至该环中。另一类型的载体为病毒载体，其中可将额外DNA区段连接至病毒基因组中。某些载体能够在被引入到的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体）。在引入到宿主细胞中后，其他载体（例如，非游离型哺乳动物载体）整合至宿主细胞的基因组中，且因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够导引被操作性连接的基因的表达。本文将此类载体称为“表达载体”。

如本文所用，术语“表达载体”是指能够在转化、转染或转导至宿主细胞中时复制及表达目的基因的核酸分子。表达载体包含一或多个表型选择标记及复制起点，以确保维护载体及以在需要的情况下于宿主内提供扩增。

如本文所用，术语“药物组合物”通常是指这样的制剂，其以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对将施用所述组合物的对象具有不可接受的毒性的另外的成分。所述组合物是无菌的。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。如本文中所用，术语“药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体，是本领域公知的（参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited byGennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995）。药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、介质、包封材料、制造助剂或溶剂包封材料，其涉及维持本公开的抗体或其抗原结合片段的稳定性、溶解度或活性，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液（如缓冲盐水），醇和多元醇（如甘油）等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类（如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖），氨基酸（如谷氨酸，甘氨酸），蛋白质（如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白）或其降解产物（如乳白蛋白水解物）等。

本发明涉及的主要试剂、材料和设备如表1所示。

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Maass DR, Sepulveda J, Pernthaner A, Shoemaker CB. Alpaca (Lamapacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies(VHHs).J Immunol Methods. 2007;324(1-2):13-25.

Lin, J, Gu, Y, Xu, Y et al. Characterization and applications ofnanobodies against Pseudomonas aeruginosa exotoxin a selected from singlealpaca B cells.Biotechnol Biotechnol Equip2020; 34: 1028-37.

Studies on design of single domain antibodies by AlpacaVHH phagelibrary and high throughput sequencing toconstruct Fab antibody purificationsystem（http: //hdl.handle.net/10232/00030916）.

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。

实施例1 IL-17纳米抗体筛选方法

1.1 制备IL-17A（Human及Mouse）重组蛋白（抗原）

从UniProt数据库中检索Human IL-17A（Q16552-1）序列信息（AA Gly 24-Ala155，如SEQ ID NO: 22所示），在C端添加6×His标签，按照原核密码子优化后进行基因合成并亚克隆至pET28a载体中；经Sanger测序验证无误后，进行质粒抽提。

将重组质粒转化BL21感受态，使用0.5mM IPTG诱导过夜，收集菌液裂解；使用镍柱纯化重组蛋白。

SDS-PAGE检测目标蛋白的纯度，结果显示纯度>90%（图1）。

SEQ ID NO: 22：

MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA。

1.2 羊驼免疫

采用制备的重组抗原对2只羊驼（Alpaca）进行免疫，免疫方式为皮下多点免疫，共免疫6次，间隔时间21天，最后一次免疫10天后，采集外周血，ELISA检测免疫效价。

经6轮免疫，羊驼的免疫效价均达到要求（见表2）。

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1.3 构建抗体酵母文库

（1）PBMC分离及VHH抗体片段克隆：

采集100 mL外周血抗凝样品，使用淋巴细胞分离液分离PBMC细胞；

提取RNA，使用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，制备cDNA；

PCR扩增VHH片段。

（2）构建单域抗体酵母展示库

1.4 酵母展示库淘选和筛选：

使用制备的IL-17A抗原，与链霉亲和素磁珠孵育，将酵母菌液加到结合了抗原的磁珠中，4℃旋转孵育60分钟对构建的酵母展示库使用链霉亲和素磁珠进行2轮磁分选。分选后酵母菌液涂SDCAA平板，挑取单克隆培养，诱导表达48 h后进行流式分析。与Biotin-IL-17A-His孵育1 h，二抗使用PE Streptavidin，孵育完成后进行流式检测。

根据流式检测结果，第二次磁分选后，酵母阳性率为37.9%，阳性克隆显著富集，将分选产物直接涂SDCAA平板，挑选单克隆进行流式检测。

1.5 FACS筛选

分选后酵母菌液涂SDCAA平板，挑取单克隆培养，诱导表达48 h后，与Biotin-抗原孵育，二抗使用PE-Streptavidin，孵育完成后进行流式检测。

结果如图6所示，FACS检测IL17A靶点单克隆与靶点结合情况；对测序获得的候选单域抗体氨基酸序列进行比对，挑选CDR区域氨基酸序列不同的候选抗体构建真核表达载体。

1.6 抗体序列鉴定

富集阳性克隆；挑选富集后的单克降，进行Phage ELISA鉴定，并对克隆进行测序分析，获取候选单域抗体的核酸及氨基酸序列信息。随机挑取20个单克隆，进行测序分析，序列差异大，库多样性较好。针对候选的单域抗体CDR区域氨基酸序列信息，采用In silico方法对可能的翻译后修饰位点进行分析。

1.7 抗体表达纯化

根据候选抗体的ELISA检测结果，挑选阳性克隆，将获得的VHH抗体序列分别进行基因合成，与human IgG1Fc串联亚克隆至表达载体pcDNA3.4-hIgG1-Fc中。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。

从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取2 mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入130μg抗体表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400 μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

将上述DNA/LVTransm复合物加入到30 mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5% CO₂培养箱，130 rpm培养6-8小时后，加入50 mL新鲜的293细胞培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。

连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45 μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体。

Protein A柱子纯化抗体的步骤如下所示：

1）将含有目标抗体的样品加入EP管中，轻轻倒置试管混合。

2）将EP管在室温下混合或在旋转器上孵育，（1-4小时或过夜），可添加 100 mMPMSF以防止蛋白质降解。

3）使用磁分离架收集磁珠并弃去上清液。如有必要，保留上清液进行分析。

4）向EP管中加入1 mL结合/洗涤缓冲液并充分混匀，使用磁力架收集磁珠并弃去上清液，重复洗涤步骤三遍。

5）向EP管中加入500 μL洗脱缓冲液，用移液器吹打或者涡旋震荡下迅速重悬，然后在室温下（约25℃）置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转EP管孵育5分钟。

6）使用磁分离架收集磁珠，将含有洗脱抗体的上清液转移到干净的EP管中。

7）重复步骤1）和2）两次。

8）向每500 μL洗脱液中加入1/10的中和缓冲液以中和pH，以利于维持抗体的生物活性，避免抗体失活。如果需要，可以通过透析或脱盐进行缓冲液交换。

9）结合/洗涤缓冲液：1×PBS，pH 7.0。

洗脱缓冲液：0.1 M 甘氨酸，pH 2-3；0.1M NaAc-HAc，pH 3.6。

中和缓冲液：1 M Tris，pH 8.5。

磁珠再生缓冲液：0.1 M NaOH。

实施例2 制备串联单域抗体

2.1 筛选抗IL-17A单域抗体

经过免疫羊驼和酵母库筛选，最终得到了14种抗IL-17A单域抗体。在抗体阻断活性检测中发现，部分单域抗体虽然能够阻断Human IL-17A蛋白激活下游靶标蛋白，但阻断效果均弱于阳性抗体Ixekizumab。因此，本发明将其中两种抗IL-17A单域抗体串联组成二价抗体，以增强其阻断效果。两种抗IL-17A单域抗体为1-C3和3-H10。

其中单域抗体1-C3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示：

DVQLVESGGGLVEPGESLRLSCAAPGEDLGYYAIAWFRQAPGKEREVVSCVTSSGSSTNYLSSVKDRFTISIDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCASTILLCSDYISAFGTWGQGTQVTVAS。

编码单域抗体1-C3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 19所示：

单域抗体3-H10的氨基酸酸序列如SEQ ID NO: 17所示：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSIHIYAMGWYRQAPGKQRELVATITRGGVTNNADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCNAGGTNGGYWGQGTQVTVSS。

编码单域抗体3-H10的核苷酸序列如SEQ ID NO: 20所示：

2.2 制备串联单域抗体1-C3-3-H10

将不同表位的候选抗体按照VHH-(GGGGS)₃-VHH-IgG1 Fc（IgG1 Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO: 22所示）的形式构建成双价的单域抗体，并采用ProteinA的磁珠进行纯化。具体步骤如下：

1）将上述两种抗IL-17A单域抗体序列进行基因合成，与human IgG1 Fc串联亚克隆至表达载体pcDNA3.4-hIgG1-Fc中。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用；

2）从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取2 mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入130 μg抗体表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400 μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

3）将上述DNA/LVTransm复合物加入到30 mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5% CO₂培养箱，130 rpm培养6-8小时后，加入50 mL新鲜的293细胞培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。

4）连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45 μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体，最终得到串联单域抗体1-C3-3-H10。

串联单域抗体1-C3-3-H10的SDS-PAGE结果如图2所示。

SEQ ID NO: 22：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

编码SEQ ID NO: 22的核苷酸序列如SEQ ID NO: 23所示：

GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。

实施例3 串联单域抗体亲和力检测

3.1 制备阳性对照抗体Ixekizumab

基因合成Ixekizumab重链及轻链可变区（轻链可变区序列如SEQ ID NO: 24所示；重链可变区序列如SEQ ID NO: 25所示），将重链可变区亚克隆至pcDNA3.4-hIgG4（IgG4氨基酸序列如SEQ ID NO: 26所示）载体中，轻链可变区亚克隆至pcDNA3.4-hIgG1 Kc载体中（IgG1 Kc氨基酸序列如SEQ ID NO: 27所示）；经Sanger测序验证无误后使用质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。

从冰箱中取出LVTransm转染试剂及重链与轻链表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取2 mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入50 μg重链和轻链表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入300 μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。

将上述DNA/LVTransm复合物加入到100 mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀，将细胞置于37℃、5% CO₂培养箱，130 RPM继续培养。

连续培养5-7天后，离心收集培养基上清，用0.45 μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A柱子纯化抗体。

SDS-PAGE检测目标抗体蛋白的纯度，结果显示蛋白纯度>95%。

SEQ ID NO: 24：

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSRSLVHSRGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFIGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHLPFTFGQGTKLEIK。

SEQ ID NO: 25：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTDYHIHWVRQAPGQGLEWMGVINPMYGTTDYNQRFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYFTGTGVYWGQGTLV。

SEQ ID NO: 26：

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK。

SEQ ID NO: 27：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

3.2 ELISA检测串联单域抗体亲和力

将纯化后的单域抗体2 μg/mL包被96孔酶标板，加入Biotin-IL-17A-His，起始浓度为10 μg/mL，5倍梯度稀释7个点，采用HRP-Streptavdin进行ELISA检测。结果显示，1-C3-3-H10的EC50为1.134 µg/mL（图3），远低于阳性对照抗体的10.06 µg/mL和阴性对照的76.15 µg/mL（图4和图5），也优于单域抗体1-C3的5.277 µg/mL和单域抗体3-H10的1.224 µg/mL。因此该串联单域抗体可与目标蛋白结合，结合能力高于阳性抗体。

3.3 BLI检测串联单域抗体亲和力

使用ForteBio OCTET R2仪器测定抗体亲和力，HIS1K传感器（Octet® ProABiosensors）固化IL7A-His，固化浓度为5 μg/mL。

缓冲液为PBST（PBS+0.02% tween20），候选抗体样品稀释至50、25、12.5、6.25、3.13、0 nM。

亲和力检测：平衡60 s，结合180 s，解离180 s，检测温度25℃。

使用ForteBio OCTET R2系统进行动力学表征分析。

结果显示，1-C3-3-H10的K_D值为1.317×10^-9M，阳性对照抗体的K_D值为0.3910×10^-9M，表明两者亲和力相当（图6和图7）。

实施例4 串联单域抗体阻断功能检测

4.1 IL-17A报告基因细胞株构建

根据IL-17RA（UniProtKB：Q96F46）及IL-17RC（UniProtKB：Q8NAC3）的氨基酸序列信息，构建慢病毒表达载体并包装慢病毒，共同感染293细胞，筛选同时过表达这两个受体的重组293细胞，进一步稳转NFKB-Luciferase（氨基酸序列如SEQ ID NO: 28所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO: 29所示）和ACT1基因（核苷酸序列如SEQ ID NO: 30所示），构建IL-17A报告基因细胞株293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc（A3）。

SEQ ID NO: 28：

MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAAVVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKIAV。

SEQ ID NO: 29：

atggaagatgccaaaaacattaagaagggcccagcgccattctacccactcgaagacgggaccgccggcgagcagctgcacaaagccatgaagcgctacgccctggtgcccggcaccatcgcctttaccgacgcacatatcgaggtggacattacctacgccgagtacttcgagatgagcgttcggctggcagaagctatgaagcgctatgggctgaatacaaaccatcggatcgtggtgtgcagcgagaatagcttgcagttcttcatgcccgtgttgggtgccctgttcatcggtgtggctgtggccccagctaacgacatctacaacgagcgcgagctgctgaacagcatgggcatcagccagcccaccgtcgtattcgtgagcaagaaagggctgcaaaagatcctcaacgtgcaaaagaagctaccgatcatacaaaagatcatcatcatggatagcaagaccgactaccagggcttccaaagcatgtacaccttcgtgacttcccatttgccacccggcttcaacgagtacgacttcgtgcccgagagcttcgaccgggacaaaaccatcgccctgatcatgaacagtagtggcagtaccggattgcccaagggcgtagccctaccgcaccgcaccgcttgtgtccgattcagtcatgcccgcgaccccatcttcggcaaccagatcatccccgacaccgctatcctcagcgtggtgccatttcaccacggcttcggcatgttcaccacgctgggctacttgatctgcggctttcgggtcgtgctcatgtaccgcttcgaggaggagctattcttgcgcagcttgcaagactataagattcaatctgccctgctggtgcccacactatttagcttcttcgctaagagcactctcatcgacaagtacgacctaagcaacttgcacgagatcgccagcggcggggcgccgctcagcaaggaggtaggtgaggccgtggccaaacgcttccacctaccaggcatccgccagggctacggcctgacagaaacaaccagcgccattctgatcacccccgaaggggacgacaagcctggcgcagtaggcaaggtggtgcccttcttcgaggctaaggtggtggacttggacaccggtaagacactgggtgtgaaccagcgcggcgagctgtgcgtccgtggccccatgatcatgagcggctacgttaacaaccccgaggctacaaacgctctcatcgacaaggacggctggctgcacagcggcgacatcgcctactgggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccggctgaagagcctgatcaaatacaagggctaccaggtagccccagccgaactggagagcatcctgctgcaacaccccaacatcttcgacgccggggtcgccggcctgcccgacgacgatgccggcgagctgcccgccgcagtcgtcgtgctggaacacggtaaaaccatgaccgagaaggagatcgtggactatgtggccagccaggttacaaccgccaagaagctgcgcggtggtgttgtgttcgtggacgaggtgcctaaaggactgaccggcaagttggacgcccgcaagatccgcgagattctcattaaggccaagaagggcggcaagatcgccgtg。

SEQ ID NO: 30：

ATGCCACCTCAGTTGCAGGAAACTCGGATGAATAGAAGCATCCCCGTGGAAGTGGACGAGAGCGAGCCGTACCCTAGTCAGCTGCTGAAGCCGATCCCTGAGTACTCCCCGGAAGAGGAATCCGAACCACCAGCCCCCAACATTCGCAATATGGCCCCCAATAGCTTGTCCGCACCAACAATGCTGCACAACTCTTCTGGCGACTTCTCTCAGGCCCACTCCACCCTGAAACTGGCGAATCACCAGCGGCCTGTATCCCGGCAGGTGACCTGTCTGAGAACTCAGGTGCTTGAAGACTCCGAGGACTCTTTCTGTAGGCGGCATCCAGGTTTGGGCAAGGCGTTTCCGTCCGGCTGTTCCGCGGTTTCAGAGCCCGCTTCCGAAAGTGTCGTGGGCGCCCTGCCAGCCGAGCACCAGTTCTCCTTCATGGAAAAGCGGAACCAGTGGCTGGTCAGTCAGCTGAGCGCCGCGTCACCTGATACAGGTCACGATTCCGACAAGTCTGACCAGTCTCTGCCCAATGCGTCAGCCGATAGTCTCGGGGGCTCCCAGGAGATGGTGCAGAGACCACAGCCGCACAGAAACCGGGCCGGGCTTGATCTGCCCACCATTGATACAGGCTACGATTCCCAGCCCCAGGACGTCCTTGGCATTCGCCAGCTGGAAAGGCCTCTGCCCTTGACCTCCGTGTGTTACCCCCAGGACCTGCCCCGCCCTTTGAGAAGCCGGGAGTTTCCCCAGTTTGAGCCCCAACGATACCCTGCCTGTGCTCAGATGCTGCCTCCGAACCTGAGCCCACACGCTCCCTGGAACTACCACTATCACTGTCCCGGCAGCCCCGATCACCAGGTGCCTTATGGACACGACTACCCGCGGGCTGCATACCAGCAGGTCATACAGCCTGCCTTGCCGGGTCAGCCGCTGCCCGGAGCTTCTGTGCGCGGCCTGCACCCCGTTCAGAAAGTGATCCTGAACTATCCAAGCCCATGGGACCATGAAGAGAGACCAGCCCAAAGAGATTGCTCTTTTCCTGGGTTGCCTAGACACCAAGACCAGCCTCACCACCAGCCTCCCAATCGGGCAGGCGCCCCAGGCGAAAGTCTCGAGTGCCCCGCCGAACTCAGACCACAGGTCCCTCAGCCCCCTTCCCCCGCGGCAGTACCCAGACCCCCCTCTAACCCACCCGCCCGGGGAACGCTCAAGACTTCAAATCTCCCAGAAGAGCTGCGCAAAGTGTTCATAACCTACAGCATGGACACCGCTATGGAGGTGGTTAAGTTCGTCAACTTCCTGCTGGTCAATGGGTTCCAGACTGCAATCGACATTTTTGAGGATAGAATTCGGGGAATCGACATCATCAAGTGGATGGAGAGATACCTGCGGGATAAGACAGTGATGATTATCGTGGCCATTAGTCCCAAGTACAAGCAAGATGTGGAGGGCGCAGAATCACAGTTGGACGAAGACGAGCACGGACTCCATACAAAATATATCCACAGGATGATGCAGATCGAGTTCATTAAACAAGGCTCCATGAATTTCCGCTTCATACCGGTCCTGTTTCCAAACGCAAAAAAAGAGCATGTACCCACTTGGCTCCAGAATACCCATGTCTACTCCTGGCCCAAGAACAAGAAGAATATCCTGCTGCGCTTGCTCAGAGAAGAAGAGTATGTCGCCCCTCCAAGGGGGCCCCTCCCCACACTCCAAGTAGTGCCACTT。

4.2 IL-17A重组蛋白与报告基因细胞株的结合

从液氮中复苏293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc（A3）细胞株，调整细胞状态至对数生长期；

将细胞分别分为若干份，每份细胞的数量为2×10⁵个细胞；

将IL-17A-His蛋白与靶细胞孵育，充分混匀后，室温孵育1小时；

800×g室温离心3分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次；

加入二抗APC-His（1：500稀释），充分混匀后，室温避光孵育30分钟；

800×g室温离心3分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；

使用500 μL PBS重悬细胞，进行流式分析。

FACS结果显示：构建的IL-17A受体过表达细胞株可以和IL-17A结合，阳性率大于90%。

采用IL-17A重组蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc（A3）。结果显示，IL-17A重组蛋白可有效激活293F-IL17Ra/IL17Rc-NFκB-Luc报告基因细胞株中荧光素酶表达。

4.3 Ixekizumab阻断IL-17A重组蛋白与报告基因细胞株结合的功能实验

本实施例采用阳性抗体Ixekizumab检测荧光报告系统的有效性。将阳性对照抗体Ixekizumab与IL-17A重组蛋白一起加入293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc（A3）细胞，结果显示：阳性对照抗体Ixekizumab可抑制IL-17A蛋白与其膜受体结合，并抑制胞内NFκB的信号，呈现剂量效应。

4.4 串联单域抗体阻断功能

使用293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc（A3）报告基因细胞株进行串联单域抗体阻断活性检测。结果显示，1-C3-3-H10的IC₅₀为0.6304 nM，阳性对照抗体的IC₅₀为2.235 nM（图8和图9）。因此，1-C3-3-H10和阳性对照抗体均可阻断Human IL-17A蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc，但1-C3-3-H10阻断效果显著优于阳性对照抗体。

实施例5 串联单域抗体稳定性检测

通过微量差示扫描荧光技术（nanoDSF）技术检测荧光变化，可在天然条件下检测蛋白热变性和化学变性，精确地确定蛋白50%处于去折叠状态时的温度（T_m）、开始去折叠的温度（T_onset）以及开始出现聚集时的温度（T_agg）；热变性T_m值、T_onset和聚集温度T_agg越高说明抗体蛋白越稳定。

取100 μL前期项目制备的候选抗体以及Ixekizumab（样本浓度大于200 μg/mL），4℃，12000×g，离心10 min后，用毛细管吸取样品，每个样品准备两根毛细管，作为平行对照，按顺序放入对应的卡槽中，确保毛细管吸满样品，无气泡，进行检测分析。

结果显示，1-C3-3-H10的T_m1为56.36℃，T_m3为81.61℃，T_onset为49.32℃，T_agg为77.67℃（图10）；阳性对照抗体的T_m1为56.10℃，T_m2为79.84℃，T_onset为47.50℃，T_agg为61.86℃（图11）。由此可知，串联抗体1-C3-3-H10的热稳定性显著优于阳性对照抗体，尤其是聚集温度T_agg相对于对照抗体提高了约16℃。

实施例6 LV-C3-H10: Fc慢病毒制备和检测方法

6.1 慢病毒穿梭质粒构建

构建1-C3-3-H10: Fc（以下简称C3-H10:Fc）融合蛋白的慢病毒穿梭质粒，将1-C3和3-H10两个候选抗体VHH序列（1-C3和3-H10的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18和20所示）通过(GGGGS)₃链接后与IgG4 Fc（IgG4 Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO: 31所示，核苷酸序列如SEQ ID NO: 32所示）串联的形式构建到慢病毒穿梭质粒上，形成VHH-(GGGGS)₃-VHH-IgG4Fc序列，处于EF-1alpha启动子下游，从而得到C3-H10:Fc慢病毒穿梭质粒。

SEQ ID NO: 31：

APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK。

SEQ ID NO: 32：

GCCCCCGAGTTTCTGGGAGGACCTAGCGTCTTTCTGTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACACTGATGATCTCTAGGACCCCCGAGGTGACATGCGTCGTGGTGGACGTGAGCCAAGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAACCTAGAGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTATAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGGCCTCCCCTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGACAGCCTAGAGAGCCCCAAGTGTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTGTCTCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAAAACAACTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGCAGCTTCTTTCTGTACTCCAGACTGACCGTGGACAAAAGCAGATGGCAAGAGGGCAACGTGTTTAGCTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTATACCCAGAAGTCCCTCTCTCTGAGCCTCGGCAAGTGA。

6.2 慢病毒感染（病毒包装）

慢病毒包装前24 h，准备摇瓶，将293F细胞密度调整到1.0×10⁶/mL备用。

制备转染试剂/DNA复合物：取7.5 mL 293F培养基至15 mL离心管，加入40 µg C3-H10:Fc慢病毒穿梭质粒，80 µg辅助质粒，移液枪上下吹打充分混匀后，加入360 µL转染试剂，立即用1 mL移液器上下吹打混匀，室温下静置10 min（不超过15 min）

将转染试剂/DNA复合物逐滴加入到前一天准备好的细胞中，边加边晃动摇瓶，充分混匀后将摇瓶置于37℃、5% CO₂、120 rpm摇床上培养。培养24 h后收集上清，并用0.45 µm针头滤器过滤至病毒离心管中，45000×g、4℃、离心90 min。

离心结束后倒掉上清，并使用移液器将残余上清去除干净，用1 mL PBS重悬沉淀，并分装至病毒分装管中，每管100 µL，即为LV-C3-H10:Fc慢病毒。

6.3 慢病毒滴度检测

将293T细胞接种24孔板，过夜培养后，分别加入20 µL LV-C3-H10:Fc病毒原液、稀释10倍病毒液、稀释100倍病毒液，继续培养24 h，24 h后更换新鲜培养基，连续培养9 d后，收获细胞，提取基因组DNA（试剂盒购自Thermo，货号为K0721），用ddH₂O调整质粒模板拷贝数，标曲范围为1×10⁹-1×10³，引物为LTR和WPRE（由苏州金唯智生物科技有限公司合成），按照PCR预混液将2×PCR Mix（购自Applied Biosystems，货号为A25742）、引物、DNA、PCR水（购自Thermo，货号R0582）混匀后加入相应的PCR反应孔中，进行PCR反应。并根据以下公式计算病毒的滴度。

慢病毒滴度=[细胞数×拷贝数/病毒体积(mL)]×稀释倍数。

病毒滴度检测结果见图12，无论病毒是原倍还是稀释10倍、100倍，病毒滴度在1.8E+7-2.2E+7之间，三组之间无显著差异，因此慢病毒滴度为2.75E+7TU/ml。

实施例7C3-H10基因修饰干细胞（C3-H10-MSC）制备和感染效率检测

制备的LV-C3-H10:Fc慢病毒，按照MOI=10加入已培养且融合度达70-80%的间充质干细胞（使用酶解法从新生儿脐带中分离，经传代扩增纯化得到P2代间充质干细胞），经37℃、CO₂培养，待细胞密度达100%后，传代，成功得到感染C3-H10:Fc的间充质干细胞（即C3-H10基因修饰的间充质干细胞，以下简称C3-H10-MSC）。

将获得的C3-H10-MSC细胞按1×10⁴/cm²培养至T25细胞培养瓶，待细胞密度达80-90%，加入转运抑制剂（购自BD，货号为555029），经过固定、洗涤、染色FITC-Protein A（购自BOSTER，货号为BA1120）后，上机，检测间充质干细胞FITC通道信号（图13），发现C3-H10-MSC在FITC通道信号阳性率超过60%，而正常间充质干细胞（即普通的、未经慢病毒感染的间充质干细胞，以下简称hUC-MSC）在FITC通道没有信号，表明C3-H10慢病毒可成功感染间充质干细胞，感染率达到58%以上。

实施例8 ELISA法检测C3-H10-MSC细胞IgG4、IL-17Nb的表达

将实施例6获得的C3-H10-MSC以及hUC-MSC分别按1×10⁴/cm²培养至T25细胞培养瓶，培养液为DMEM/F12（含10%胎牛血清），培养72小时后收获细胞培养上清，分装冻存，用于后续检测。

8.1 ELISA法检测C3-H10-MSC细胞IgG4的表达

采用Human IgG4 ELISA Kit（厂家：Thermo，货号：BMS2095）用于检测细胞培养上清中分泌的融合蛋白IgG4含量。该试剂盒采用人IgG4固相夹心ELISA（酶联免疫吸附测定）检测匹配抗体对之间结合的靶标量。IgG4特异性抗体已预先包被在酶标板中，然后将细胞上清液样品、标准品或对照加入这些孔中并与固定（捕获）抗体结合，通过添加二抗形成夹心结构，添加底物溶液与酶-抗体-靶标复合物反应以产生可测量的信号。该信号的强度与原始样本中存在的目标浓度成正比。

将上述细胞培养上清加入IgG4 ELISA试剂盒，检测融合蛋白中IgG4蛋白含量，结果发现，C3-H10-MSC高表达IgG4，表达量高达7976.67±1414.21 ng/mL，而hUC-MSC不表达IgG4（图14）。

8.2IL-17Nb抗体含量检测

采用IL-17A蛋白结合实验检测IL-17A纳米抗体表达情况，将终浓度为2 µg/mL的IL-17A蛋白（由实施例1获得）包被酶标板4℃过夜，BSA封闭后，检测上述获得的细胞培养上清（即C3-H10-MSC和hUC-MSC的培养上清）。标准品为C3-H10融合蛋白（由实施例2获得），标准曲线浓度范围0-250 ng/mL，标准品加入相应的孔中，样品孔加入所述细胞培养上清（10倍稀释）孵育1 h，然后用HRP标记的Protein A抗体（购自博士德，货号BA1080）作为酶标抗体孵育1 h，最后加入TMB避光显色20 min，终止后酶标仪检测各孔OD450nm值。实验结果如图15显示，通过IL-17A结合实验，可以确定C3-H10-MSC高表达IL-17Nb，浓度为2612.33±157.09 ng/mL，表明C3-H10-MSC表达的IL-17Nb可以与IL-17A结合，而hUC-MSC则不表达IL-17Nb。

实施例9 ELISA法检测C3-H10-MSC细胞IgG4、IL-17Nb的表达

采用公司IL-17A[Biotinylated]: IL-17RA Inhibitor Screening ELISA Kit（厂家ACRO Biosystems，货号EP-139）试剂盒检测C3-H10-MSC细胞阻断IL-17A/IL-17RA结合的能力。该试剂盒包被IL-17RA，以抗IL-17A的中和抗体为标准品，阻断IL-17RA与生物素化的IL-17A结合，通过检测OD450nm值判断阻断能力的强弱，阻断IL-17A/IL17RA结合能力越强，OD450nm值越低，阻断能力与OD450nm值成反比关系。取实施例8获得的细胞上清，通过ACRO Biosystems的试剂盒检测上清中IL-17Nb阻断IL-17A/IL17RA结合的能力。

采用以下公式对IL-17A/IL17RA结合抑制率计算：

结合抑制率（%）=[OD450（Positive孔）-OD450（样品孔）]/OD450（Positive孔）×100%。

将所有样品进行5倍稀释后，检测，结果如图16显示，hUC-MSC细胞无法阻断IL-17A/IL17RA的结合，而C3-H10-MSC细胞分泌的IL-17Nb可以阻断IL-17A/IL17RA的结合，稀释5倍后抑制率高达58%。

实施例10 干细胞稳定性研究

根据实施例9获得的结果，将实施例7中获得的C3-H10-MSC及hUC-MSC以1×10⁴/cm²接种24孔板，分别接种8孔和16孔，过夜培养后，随机选择8孔hUC-MSC更换含终浓度为1500ng/mL的C3-H10重组蛋白（即1-C3-3-H10串联抗体，以下简称C3-H10，由实施例2制备）的完全培养基，继续培养，分别在培养24 h、48 h、72 h和96 h收获上清，按照实施例9的方法检测上清中IL-17Nb的含量。结果如图17所示，随着时间的延长，从24 h到96 h，hUC-MSC+(C3-H10)组检测的IL-17Nb含量从1393±108 ng/mL降到了1042±48 ng/mL，随着时间的延长，浓度逐渐降低，而C3-H10-MSC可以稳定的表达IL-17Nb，随着培养时间的延长，IL-17Nb的浓度逐渐增多，由24 h的918±36 ng/mL增长到96 h的4993±128 ng/mL。在24 h，hUC-MSC+(C3-H10)与C3-H10-MSC两组之间有显著差异（P＜0.01），72 h和96 h时，hUC-MSC+C3-H10与C3-H10-MSC两组之间有极显著差异（P＜0.001）。C3-H10-MSC可以稳定、持续的表达分泌IL-17Nb，因此，C3-H10-MSC表达IL-17Nb的稳定性显著优于C3-H10重组蛋白。

实施例11 C3-H10-MSC在治疗类风湿关节炎中的应用

采用B-hIL17A转基因小鼠（百奥赛图医药科技股份有限公司，Cat No.110053）通过胶原诱导法进行类风湿关节炎（RA）模型构建。RA模型组动物在起始日（Day1）通过尾根皮内注射接种100 μg牛II型胶原蛋白（CII，Chondrex公司）和包含200 μg结核分枝杆菌H37Ra的弗氏完全佐剂（CFA，Chondrex公司）的乳化剂进行初始免疫，初始免疫后第21天（Day21）接种CII和弗氏不完全佐剂(IFA)的乳化剂进行加强免疫。初次免疫后22天（Day22）将成模的RA小鼠（成模标准：临床评分≥2）随机分成4组：MSC治疗组、阳性抗体治疗组、C3-H10-MSC治疗组和模型对照组；并在分组当天分别尾静脉注射hUC-MSC（2×10⁶/只）、阳性抗体Ixekizumab（1 mg/kg）和C3-H10-MSC（2×10⁶/只）。从第20天（Day20）到实验终点（Day42），每隔一天评估一次体重足爪厚度和临床评分，共23天。所有动物在实验终点（Day42）安乐死动物，取关节组织进行病理组织染色及评分。

临床评分标准如表3所示。

三组H&E染色四肢的代表性图像均由2名实验人员员采用双盲法独立评分，单项评分范围为0-5分，总分为20分，H&E染色评分标准如下所示：

（1）炎细胞浸润：0分，无炎性细胞浸润；1分，少量炎细胞浸润；2分，轻度炎细胞浸润；3分，中度炎细胞浸润；4分，重度炎细胞浸润；5分，极重度炎细胞浸润。

（2）血管翳形成：0分，无血管翳；1分，少数血管翳形成；2分，轻度血管翳形成（累及少于1/4的掌趾关节）；3分，中度血管翳形成（累及1/4-1/2的掌趾关节）；4分，重度血管翳形成（累及1/2-3/4的掌趾关节）；5分，极重度血管翳形成（累及大于3/4的掌趾关节）。

（3）软骨侵蚀：0分，无软骨侵蚀；1分，轻微软骨侵蚀；2分，轻度软骨侵蚀（表浅或局灶性的软骨细胞减少及胶原破坏）；3分，中度软骨侵蚀（多灶性或深及软骨层1/2的软骨细胞减少及胶原破坏）；4分，重度软骨侵蚀（累及软骨面1/2以上深度，一个或多个跗关节软骨面完全破坏）；5分，极重度软骨侵蚀（严重的软骨细胞减少及胶原破坏，深至潮线）。

（4）骨质破坏：0分，无骨质破坏；1分，轻微骨质破坏，低倍镜下不明显；2分，轻度骨质破坏（累及少于1/4的掌趾关节）；3分，中度骨质破坏，明显的骨小梁及骨皮质吸收，但未及骨皮质全层（累及1/4-1/2的掌趾关节）；4分，重度的骨质破坏，局部累及骨皮质全层，骨皮质变形，骨小梁吸收（累及1/2-3/4的掌趾关节）；5分，极重度骨质破坏，累及骨皮质全层，骨皮质变形，骨小梁吸收（累及大于3/4的掌趾关节）。

动物体重结果显示，加强免疫（D21）开始模型组体重与正常对照组相比显著下降，MSC治疗和C3-H10-MSC治疗组均可恢复小鼠体重，而阳性抗体组恢复小鼠体重不明显；试验终点C3-H10-MSC治疗组小鼠体重显著高于阳性抗体组（图18）。动物足爪厚度结果显示，加强免疫（D21）后小鼠足爪迅速肿胀，而静脉注射hUC-MSC、阳性抗体Ixekizumab和C3-H10-MSC后，小鼠足爪厚度显著降低，其中C3-H10-MSC治疗效果显著优于阳性抗体Ixekizumab（图19）。组织病理结果显示，模型小鼠组织炎细胞浸润、关节滑膜炎和/或血管翳形成、关节软骨破坏，关节腔消失，骨组织融合（图20）；而经治疗后发现，小鼠病理组织评分显著下降，其中C3-H10-MSC治疗效果显著优于阳性抗体Ixekizumab（图20-图21）。

实施例12 C3-H10-MSC在治疗银屑病中的应用

采用B-hIL17A转基因小鼠（百奥赛图医药科技股份有限公司，Cat No.110053）通过咪喹莫特涂抹法构建银屑病（Ps）模型构建。所有小鼠背部剃毛后，每天背部涂抹50 mg咪喹莫特软膏（IMQ，明欣利迪，四川明欣药业有限公司），第一次涂抹当天记为D0，持续7天（D6）进行造模；Ps模型组随机分为四组：hUC-MSC治疗组（2×10⁶/只）、阳性抗体Ixekizumab治疗组（1 mg/kg）、C3-H10-MSC治疗组（2×10⁶/只）和模型对照组。药物治疗组于D1和D4皮下注射给药治疗。实验过程中，每天测量动物体重，观察动物的存活情况和健康状况，对动物皮肤进行拍照，并根据皮肤的角化程度、炎性细胞浸润程度对皮肤炎症及相关指标进行临床评分。D7安乐死动物，进行相关检测：收集小鼠造模部分皮肤，利用游标卡尺测量每组动物皮肤厚度。

皮肤评分标准：对动物皮肤（耳部及前后爪）进行评分，根据红斑、鳞屑、厚度进行综合评分，每项指标评分均分为5个等级，为0-5分，其中0分代表无相关症状；1分代表症状轻微；2分表示症状一般；3分表示症状显著；4分表示非常显著或严重，并计算3项指标总分作为最终评分。

动物体重结果显示，咪喹莫特造模后模型组体重与正常对照组相比显著下降，hUC-MSC治疗和C3-H10-MSC治疗组均可恢复小鼠体重，而阳性抗体组恢复小鼠体重不明显。试验终点C3-H10-MSC治疗组小鼠体重显著高于阳性抗体组（图22）。

皮肤照片和皮肤临床评分如图22-图23所示，IMQ能够引起小鼠皮肤损伤，皮疹和脱屑程度增加，皮肤表皮增厚，组织病理学上可见以角化不全和炎症性白细胞浸润为主的真皮，模型组皮肤临床评分显著升高，表明动物模型构建成功。而皮下注射hUC-MSC、阳性抗体Ixekizumab和C3-H10-MSC后，小鼠皮肤临床评分显著降低，其中C3-H10-MSC治疗效果显著优于阳性抗体Ixekizumab（图23-图24）。

实验终点进行皮肤厚度检测，如图25所示，发现IMQ可显著增加模型小鼠皮肤厚度，而皮下注射hUC-MSC、阳性抗体Ixekizumab和C3-H10-MSC后，小鼠皮肤厚度显著降低，其中C3-H10-MSC治疗效果显著优于阳性抗体Ixekizumab。

实施例13 C3-H10-MSC在治疗银屑病关节炎中的应用

采用B-hIL17A转基因小鼠（百奥赛图医药科技股份有限公司，Cat No.110053）通过腹腔注射甘露聚糖构建银屑病关节炎（PsA）模型。小鼠通过三次腹腔注射甘露聚糖（SIGMA，M7504-5G）进行造模，第一次腹腔注射当天记为D0，即分别在D0、D4和D8进行三次腹腔注射甘露聚糖，每次每只动物腹腔注射100 mg/mL甘露聚糖，注射体积为200 μL，即每次每只动物腹腔注射20 mg甘露聚糖。

PsA模型组随机分为四组：hUC-MSC治疗组（2×10⁶/只）、阳性抗体Ixekizumab治疗组（1 mg/kg）、C3-H10-MSC治疗组（2×10⁶/只）和模型对照组；药物治疗组于D3和D7静脉注射给药治疗。实验过程中，每2天测量动物体重，观察动物的存活情况和健康状况，观察并根据相关指标对动物皮肤及前后足爪进行评分，足爪关节评分标准如下所示，皮肤临床评分标准同实施例12。D14安乐死动物，收集小鼠外周血，分离血清后检测mIL-6、mIL-23和mTNF-α等细胞因子（试剂盒均购自Biolegend）。

足爪关节评分：对动物所有前后爪关节炎情况进行评分，评价标准如下：0分=正常；1分=该爪中单指红斑、肿胀；2分=该爪中两指红斑及肿胀；3分=该爪中两指以上红斑及肿胀及/或踝关节肿胀。计算4只爪总评分作为最终评分。

动物体重结果显示，甘露聚糖造模后PsA模型组体重与正常对照组相比显著下降，hUC-MSC治疗和C3-H10-MSC治疗组均可恢复小鼠体重，而阳性抗体组恢复小鼠体重不明显，试验终点C3-H10-MSC治疗组小鼠体重显著高于阳性抗体组（图26）。

动物足爪和皮肤临床评分结果显示，甘露聚糖造模后PsA模型组皮肤和足爪临床评分均显著增加，阳性抗体、hUC-MSC治疗和C3-H10-MSC治疗组均可显著降低模型动物足爪和皮肤临床评分，而C3-H10-MSC治疗组小鼠体重显著优于阳性抗体组（图27-图28）。

炎症因子检测结果显示，甘露聚糖造模后PsA模型组动物血清中mIL-6、mIL-23和mTNF-α等细胞因子均显著增加，而hUC-MSC治疗和C3-H10-MSC治疗组均可显著降低模型动物血清mIL-6和mTNF-α水平，阳性抗体组和C3-H10-MSC治疗组均可显著降低模型动物血清mIL-23水平（图29-图31）。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种经修饰的干细胞在以下的用途：

制备预防和/或治疗炎性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病和/或肿瘤的药物中的用途；和/或制备炎性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病和/或肿瘤的诊断产品中的用途；

所述干细胞包含、表达和/或分泌：

所述的第一抗体包含序列如SEQ ID NO: 1-3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；和/或；与SEQID NO: 1-3所示的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列；

所述的第二抗体包含序列如SEQ ID NO: 4-6所示的HCDR4、HCDR5、HCDR6；和/或；与SEQID NO: 4-6所示的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述干细胞包含、表达和/或分泌：

3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的第一蛋白的序列包含如SEQ IDNO: 16所示的氨基酸序列；和/或

所述的第二蛋白的序列包含如SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述干细胞包含、表达和/或分泌融合蛋白：

FR1-FR8选自SEQ ID NO: 7-14所示的氨基酸序列；或；与SEQ ID NO: 7-14相比具有1、2、3、4或5个氨基酸差异的氨基酸序列；

所述linker为富含Gly和Ser的组合的肽。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述富含Gly和Ser的组合的肽为由重复的GGGGS氨基酸序列组成的序列。

6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列。

7. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的干细胞包含：

ⅰ）第一核酸分子；和

ⅱ）第二核酸分子；

所述第一核酸分子包含编码SEQ ID NO: 1-6的核苷酸序列；

所述第二核酸分子包含编码SEQ ID NO: 7-14的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的干细胞包含：

所述第一核酸分子包含编码SEQ ID NO: 19的核苷酸序列；

所述第二核酸分子包含编码SEQ ID NO: 20的核苷酸序列。

9. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的干细胞包含：编码SEQ ID NO: 18的核苷酸序列。

10. 根据权利要求1-9中任一所述的用途，其特征在于，所述HCDR1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2具有如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，所述HCDR3具有如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，所述HCDR4具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，所述HCDR5具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列，所述HCDR6具有如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。

11.根据权利要求1-9中任一所述的用途，其特征在于，所述的干细胞包含、表达和/或分泌能够延长抗体在体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述生物活性蛋白或其功能片段选自免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、白蛋白结合多肽、前白蛋白、羧基末端肽、弹性蛋白样多肽、His标签、GST标签、MBP标签、FLAG标签和SUMO标签中的至少一种。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc结构域为人免疫球蛋白Fc结构域。

14.根据权利要求13所述用途，其特征在于，所述人免疫球蛋白Fc结构域为人IgG1的Fc结构域。

15.根据权利要求12-14中任一所述的用途，其特征在于，所述干细胞选自胚胎干细胞、成体干细胞、间充质干细胞、脐带血干细胞、造血干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、皮肤干细胞或肌肉干细胞。

16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞。

17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于，所述干细胞分离自脐带血、脐带、胎盘、脂肪组织、皮肤、神经组织、骨髓或胚胎。

18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述药物包括有效治疗量的所述干细胞、所述干细胞的培养物、或所述干细胞的提取物，以及至少一种药学上可接受的载剂。

19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述药学上接受的载剂选自溶剂、稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂和抗氧化剂中的至少一种。

20.根据权利要求16-19中任一所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型包括水针注射剂、冻干粉针剂、注射液、口服溶液、粉针剂、颗粒剂或散剂。

21.根据权利要求20所述的用途，其特征在于，所述自身免疫性疾病包括白塞氏病、系统性红斑狼疮、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化症、系统性硬皮病、进行性系统性硬化症、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎、主动脉炎综合征、风湿性关节炎、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、脊椎关节炎、混合性结缔组织病、卡斯尔曼病、干燥综合征、成人斯蒂尔病、血管炎、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎、大血管血管炎、ANCA相关性血管炎、Cogan综合征、RS3PE综合征、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、IgG4相关疾病、格林巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、Good-pasture综合征、急进性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、巴塞杜病、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、艾迪生病、特发性艾迪生病、I型糖尿病、缓慢进展型I型糖尿病、局灶性硬皮病、银屑病、银屑病关节炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、白斑病、寻常型白斑病、视神经脊髓炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、多灶性运动神经病、结节病、巨细胞动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、自身免疫性视神经病、特发性无精子症、习惯性流产、炎症性肠病、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、扩张型心肌病、系统性肥大细胞增多症或包涵体肌炎。

22.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、胆管癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、消化系统癌症、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肝癌、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统癌、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病或慢性成髓细胞性白血病。