CN117866904A

CN117866904A - 基于单域抗体基因修饰的干细胞对于多种的疾病的制药用途

Info

Publication number: CN117866904A
Application number: CN202410276792.9A
Authority: CN
Inventors: 刘广洋; 刘拥军; 李欣; 张晨亮; 徐利强; 米一
Original assignee: Beijing Beilai Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Beijing Beilai Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2024-03-12
Filing date: 2024-03-12
Publication date: 2024-04-12

Abstract

本发明提供基于单域抗体基因修饰的干细胞对于多种的疾病的制药用途，属于干细胞技术领域。所述的干细胞包含、表达或分泌第一抗体和第二抗体，所述的第一抗体包含序列如SEQ ID NO:1‑3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述的第二抗体包含序列如SEQ ID NO:4‑6所示的HCDR4、HCDR5、HCDR6。本发明所述单域抗体基因修饰的干细胞，相对于阳性抗体和未修饰的间充质干细胞具有更好的治疗疾病效果，有很好的临床应用前景。

Description

基于单域抗体基因修饰的干细胞对于多种的疾病的制药用途

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及基于单域抗体基因修饰的干细胞对于多种的疾病的制药用途。

背景技术

干细胞是未成熟细胞，其未充分分化，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞治疗已在糖尿病、帕金森综合征、红斑狼疮、白血病等多种疾病中进行了相应治疗尝试。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）的制备技术及其应用，将干细胞治疗带入了一个全新时代。随着分子生物学技术，特别是基因编辑技术的不断发展，基因修饰在干细胞治疗中发挥着越来越重要的作用。

干细胞治疗作为一种再生医学技术，旨在用具有特定功能的细胞替代功能异常细胞，恢复相应细胞功能，改善机体健康状态。目前有多种干细胞用于临床，其中，HSC移植已改善多种免疫系统和血液系统疾病的预后，如先天性免疫缺陷、多发性骨髓瘤、地中海贫血等。研究数据表明，异体HSC的植入可将r/rAML（IDH1/IDH2突变的急性髓系白血病）患者的4年生存率提高至20%~35%。此外，MSC因具有一定的免疫调节功能，被用于治疗免疫性疾病，如移植物抗宿主病等，取得了一定疗效。现有技术中已经公开了用于治疗腺苷脱氨酶缺乏性重度联合免疫缺陷病（ADA-SCID）的自体HSC药物Strimvelis及用于治疗阿尔茨海默病的自体MSC药物AstroStem。

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一种多能干细胞，是具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞像APSC多能细胞。在胚胎发育中来源于中胚层。在机体正常的组织损伤修复过程中，MSC是一种重要的参与组织再生的细胞库。在组织损伤引起的特殊信号作用下，MSC迁移到受损部位，在局部聚集增殖，依据不同的损伤信号沿着不同途径分化。MSC易于分离扩增，体外倍增能力旺盛，即使扩增1亿倍仍能保持其多向分化能力。因此，MSC是一种实用的组织修复种子细胞。

IL-17为宿主保护粘膜感染的关键细胞因子，也是多种自身免疫和炎症性疾病的主要致病细胞因子和药物靶标。IL-17家族包括六个成员：IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F，各成员皆通过IL-17受体（IL-17RA至IL-17RE）介导其生物学功能。其中研究最多的IL-17家族成员是IL-17A，其通过与IL-17RA和IL-17RC结合来促进其生物活性。现有技术已经公开了IL-17A在人类疾病中的病理作用的研究最终导致了针对IL-17A（IL-17A和IL-17F、IL-17RA或IL-23）的单克隆抗体（mAb）的开发。

研究IL-17与干细胞的作用方式的现有技术如公开号为CN105079792A的中国专利申请，其公开了IL-17在提高间充质干细胞免疫抑制功能中的应用。具体地本发明提供了一种白介素-17、白介素-17的衍生物或其激动剂用于制备制剂或试剂盒的用途，用于提高间充质干细胞的免疫抑制功能；上调间充质干细胞中免疫抑制因子的表达；增强免疫抑制因子的mRNA的稳定性；降低RNA结合蛋白AUF1的表达水平；抑制T细胞的增殖；治疗肝炎或肝损伤。

但现有技术中未有公开IL-17相关抗体对干细胞的修饰，特别是IL-17A特异性串联抗体在干细胞修饰中的作用。本领域需要对修饰干细胞的应用进行深入研究和开发。

本发明系在上述背景下产生，本发明系基于抗IL-17A单域抗体开发项目所进行的第四代技术开发。

为便于审查，现对研发项目的技术背景进行简要介绍：

本发明人首先开发出9个单域抗体（已另案申请）；

本发明人在单域抗体的基础上，开发出由2个单域抗体构成的抗体组合（已另案申请）；

本发明人在单域抗体的基础上，开发出由抗体组合基因修饰干细胞（已另案申请）；

本发明人在基因修饰干细胞的基础上，开发出修饰干细胞的应用技术，本发明即为该应用技术之一。

以上，基于专利法单一性的相关规定，分别进行专利申请。

为便于理解本发明，可选地参阅本项目其他专利申请文件。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种基于IL-17A特异性串联抗体所修饰干细胞的应用。

本发明基于免疫羊驼进行筛选，得到了多种具有IL-17A特异性结合能力的纳米抗体，并选择了其中的两种进行串联，以实现干细胞基因修饰应用。

IL-17家族共有7个成员，分别被命名为IL-17A到IL-17F，IL-17家族氨基酸序列在C端高度相似，主要由5个在空间上保守的半胱氨酸组。表达IL-17最丰富的细胞主要是胸腺依赖的淋巴细胞，包括适应性免疫中的αβT细胞，固有免疫中的γδT细胞，恒定型自然杀伤T细胞和淋巴组织诱导样细胞（LTi-like cells）。IL-17家族在宿主抗微生物反应和炎症性疾病的发展过程中扮演着重要角色。IL-17促进了调节其各种功能的多种细胞因子的合成和分泌。这些细胞因子包括：趋化因子（如CXCL1、CXCL8和CCL2）；促炎症因子（如IL-6、TNF-α和IL-1β）；促炎症因子调节因子（如NOS和COX）；GM-CSF和G-CSF生长因子和组织重塑因子（如MMP1，MMP3和RANKL）。

不论是由固有免疫细胞还是适应性免疫细胞分泌的IL-17A和IL-17F，其最显著的功能是诱导中性粒细胞向感染部位迁移，IL-17A和IL-17F的这种功能对微生物的清除至关重要。一些研究表明，上皮和黏膜屏障受到细菌感染过程中诱导产生的IL-17A和IL-17F在宿主防御中起重要作用。第一个证明IL-17介导的宿主防御作用的研究是IL-17R缺陷型小鼠的克雷伯氏肺炎肺部感染模型（Ye P, et al. Requirement of interleukin 17receptor signaling for lung CXC chemokine and granulocyte colony-stimulatingfactor expression, neutrophil recruitment, and host defense.J Exp Med.2001;194(4):519-527.）。研究使用IL-17RA和IL-17缺陷型小鼠模型或是使用IL-17受体或配体的中和抗体来阻断IL-17信号通路，会导致小鼠对各种细胞外或者细胞内细菌感染更加敏感，这些细菌包括沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、链球菌肺炎、结核分枝杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺杆菌（Pappu R, et al. The interleukin-17cytokine family: critical players in host defence and inflammatorydiseases.Immunology. 2011; 134 (1): 8-16.;Iwakura Y, et al. Functionalspecialization of interleukin-17 family members.Immunity. 2011; 34 (2): 149-162.;McGeachy MJ, et al. The IL-17 Family of Cytokines in Health and Disease.Immunity 2019; 50 (4): 892-906.）。IL-17被鉴定为负责宿主防御真菌的分子之一，通过基因突变，这些分子被证明与人类对真菌的易感性有关。IL-17通路的先天缺陷，包括编码IL-17F或IL-17RA基因的缺陷，被发现与真菌感染的易感性增加有关，尤其是慢性黏膜皮念珠菌病，这明显表明IL-17通路在抗真菌免疫中起着重要作用（Cypowyj, et al. Immunityto infection in IL-17-deficient mice and humans.European Journal of Immunology42.9 (2012): 2246-2254.）。IL-17已被证明可以保护小鼠免受各种真菌感染，包括由肺孢子虫、夹膜组织胞浆菌和烟曲霉菌引起的感染（Gladiator A, et al. Innatelymphoid cells: new players in IL-17-mediated antifungal immunity.PLoS Pathog. 2013; 9 (12): e1003763.）。

IL-17通过两种途径促进肿瘤的发生，一种途径是通过维持炎症环境来减少了对肿瘤的局部免疫反应（He D, et al. IL-17 promotes tumor development through theinduction of tumor promoting microenvironments at tumor sites and myeloid-derived suppressor cells.J Immunol. 2010; 184 (5): 2281-2288.）；另一种途径是通过激活STAT3和NF-kB通路，促进抗凋亡基因的表达（Grivennikov SI, et al. Dangerousliaisons: STAT3 and NF-kappaB collaboration and crosstalk in cancer.Cytokine Growth Factor Rev. 2010; 21(1): 11-19.）IL-17在炎症相关的癌症中发挥其促癌症作用主要倚仗其促血管生成的特性。IL-17通过作用于基质细胞和成纤维细胞，诱导其分泌血管生成调节因子，包括VEGF，这些分泌血管生成调节因子能显著地加强炎症反应和促进肿瘤血管生成。

IL-17细胞因子家族成员，特别是IL-17A，与多种自身免疫性疾病有关，包括多发性硬化（MS）、类风湿关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）、1型糖尿病（TIDM）、炎症性肠病（IBD）和牛皮癣（Zhu S, et al. IL-17/IL-17 receptor system in autoimmunedisease: mechanisms and therapeutic potential.Clin Sci (Lond). 2012; 122(11): 487-511.）。在许多人类自身免疫性疾病中，IL-17细胞因子和IL-17受体表达上升。靶向IL-17和IL-17受体基因的转基因和敲除小鼠模型将IL-17细胞因子与自身免疫性的发展联系在一起。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的研究表明，IL-17A是T细胞介导的自身免疫性疾病病理学中的关键致病细胞因子（Langrish, C. L. et al. IL-23 drives apathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation.J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).；Sutton, C., Brereton, C., Keogh, B., Mills, K. H.&Lavelle, E. C. A crucial role for interleukin (IL)-1 in the induction of IL-17-producing T cells that mediate autoimmune encephalomyelitis.J. Exp. Med.203, 1685-1691 (2006).）。随后的研究表明，在EAE中，IL-17A由TH17细胞和分泌IL-17A的γδT（γδT17）细胞分泌（Sutton, C. E. et al. Interleukin-1 and IL-23 induceinnate IL-17 production from gammadelta T cells, amplifying Th17 responsesand autoimmunity.Immunity31, 331-341 (2009).）。

这些研究和其他详细阐述了IL-17A在人类疾病中的病理作用的研究最终导致了针对IL-17A（IL-17A和IL-17F、IL-17RA或IL-23）的单克隆抗体（mAb）的开发。目前全球范围内已上市多款阻断IL-17的抗体药物，其中包括中和IL-17A（Secukinumab和Ixekizumab）或IL-17RA（Brodalumab）的单抗药物，而国内在研的围绕IL-17靶点并用于自免疫疾病治疗的抗体药物或小分子已经超过50个。尽管与化疗药物相比抗体药通常在人体具有良好的疗效和耐受性，然而在临床使用中仍然存在很多治疗相关副作用，例如：鼻咽炎、头痛、恶心和腹泻或者更严重的如感染、心脏毒性和严重的免疫反应等；另外单抗药物结构复杂、稳定性相对较差也导致其需要反复大剂量注射从而达到最佳效果。

一方面，本发明提供了一种干细胞在疾病中的应用。

所述的应用为制药用途、制备诊断产品的用途、辅助治疗方法、治疗方法辅助诊断方法和/或诊断方法；

所述的疾病为IL-17A相关疾病；优选地，所述的疾病为炎性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病和/或肿瘤。

所述的干细胞为基于单域抗体基因修饰的干细胞，所述的干细胞包含：

（1）SEQ ID NO: 1-6所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 1-6具有至少80%序列一致性的氨基酸序列；

和/或；

（2）编码SEQ ID NO: 1-6所示的SEQ ID NO: 1-6具有至少80%序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO: 1：GEKLDYFA；

SEQ ID NO: 2：VTSSGSST；

SEQ ID NO: 3：ASTILLCSDYISAFGT；

SEQ ID NO: 4：GFSIHIYA；

SEQ ID NO: 5：ITRGGVT；

SEQ ID NO: 6：NAGGTNGGY。

在一些理解中，所述的SEQ ID NO: 1-6表示CDR区。本领域技术人员知晓，CDR区是抗体特异性识别抗原的区域，具到主要的结合活性，因此，本领域技术人员根据本发明记载的CDR区，理论上可以设计出多种抗体进行应用。如采用纳米抗体的形式。

优选地，本发明提供了一种干细胞在制备药物中的用途，所述的干细胞包含、表达或分泌第一抗体和第二抗体，所述的第一抗体包含序列如SEQ ID NO: 1-3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述的第二抗体包含序列如SEQ ID NO: 4-6所示的HCDR4、HCDR5、HCDR6。

作为优选，所述的干细胞包含：

（1）SEQ ID NO: 7-14所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 7-14具有至少80%序列一致性的氨基酸序列；

和/或；

（2）编码SEQ ID NO: 7-14所示的SEQ ID NO: 7-14具有至少80%序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO.7：QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS；

SEQ ID NO.8：IGWFRQAPGKEREVVSC；

SEQ ID NO.9：NYLSSVKDRFTISIDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYC；

SEQ ID NO.10：WGQGTQVTVAS；

SEQ ID NO.11：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS；

SEQ ID NO.12：MGWYRQAPGKQRELVAT；

SEQ ID NO.13：NNADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYC；

SEQ ID NO.14：WGQGTQVTVSS。

优选地，本发明所述的第一抗体还包括SEQ ID NO:7-10所示的氨基酸序列作为FR区；所述的第二抗体还包括SEQ ID NO:11-14所示的氨基酸序列作为FR区。

进一步优选地，所述的干细胞包含：

（1）SEQ ID NO: 16-17所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 16-17具有至少80%序列一致性的氨基酸序列；

和/或；

（2）编码SEQ ID NO: 16-17所示的SEQ ID NO: 16-17具有至少80%序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO.16：

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGEKLDYFAIGWFRQAPGKEREVVSCVTSSGSSTNYLSSVKDRFTISIDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCASTILLCSDYISAFGTWGQGTQVTVAS。

SEQ ID NO.17：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSIHIYAMGWYRQAPGKQRELVATITRGGVTNNADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCNAGGTNGGYWGQGTQVTVSS。

本文所用的术语“高变区”、“超变区”、“互补决定区”、“HVR”或“CDR”，是指在抗体可变结构域区域中序列上高变和/或形成结构上限定的环（“高变环”）的区域。通常，天然四链抗体包含六个HVR或CDR：三个存在于VH中（H1、H2、H3），三个存在于VL中（L1、L2、L3）。基于Chothia定义规则，示例性CDR（LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3）位于氨基酸残基L26-L32（L1）、L50-L52（L2）、L91-L96（L3）、H26-H32（H1）、H52-H56（H2）和H96-H101（H3）处（Chothia等人，J.Mol.Biol. 196: 901-917 (1987))。基于Kabat定义规则，示例性CDR（LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3）位于氨基酸残基L24-L34（L1）、L50-L56（L2）、L89-L97（L3）、H31-H35（H1）、H50-H65（H2）和H95-H102（H3）处（Kabat等人，Sequences ofProteins ofImmunological Interest, the fifth edtion, Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) )。基于IMGT定义规则，示例性CDR（LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3）位于氨基酸残基L27-L32（L1）、L50-L51（L2）、L89-L97（L3）、H26-H33（H1）、H51-H56（H2）和H93-H102（H3）处（Honjo, T.和Alt, F.W. (1995) Immunoglobulin genes. Academic Press pp. 3-443)。本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则、基于结构环区域位置的Chothia定义规则和基于CDR移植的抗体人源化设计的参考工具（参见J Mol Biol. 273: 927-48, 1997）。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区（例如可变区）的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。虽然本发明公开的CDR是基于IMGT定义规则所示出的序列，但是根据其他CDR定义规则所对应的氨基酸序列也应当落在本发明的保护范围中。

本发明所述的“序列一致性”在一定程度上可以理解为序列相似度、序列同一性等，在具有一定序列一致性的一个类别中，其发生的任意变异本领域技术人员可以理解不影响功能特性（如抗体的功能变体与来源抗体具有相同或相近的亲和力，或能实现相同或相近的生物学功能，具体如特异性结合IL-17A并阻断IL-17A与其受体结合）。所述的“至少80%序列一致性”所涵盖的范围包括但不限于：至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在实现序列一致性时，可采用的技术手段包括但不限于具有至少1个，优选1、2、3、4或5个的氨基酸的添加、缺失、修饰和/或取代。

在一些实施方案中，所述氨基酸的取代为保守取代，这种保守性取代优选地是以下组（a）到（e）中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代的取代：（a）小的脂肪族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；（b）极性、带负电的残基及其（不带电的）酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；（c）极性、带正电的残基：His、Arg和Lys；（d）大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、He、Val和Cys；以及（e）芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。

在一些优选的实施方案中，保守性取代如下：Ala到Gly或到Ser；Arg到Lys；Asn到Gln或到His；Asp到Glu；Cys到Ser；Gln到Asn；Glu到Asp；Gly到Ala或到Pro；His到Asn或到Gln；Ile到Leu或到Val；Leu到Ile或到Val；Lys到Arg、到Gln或到Glu；Met到Leu、到Tyr或到Ile；Phe到Met、到Leu或到Tyr；Ser到Thr；Thr到Ser；Trp到Tyr；Tyr到Trp；和/或Phe到Val、到Ile或到Leu。

优选地，所述的第一抗体和第二抗体直接连接或通过连接子连接。

可选择地，所述的干细胞中还可以包括连接子。所述的连接子可以选自(GS)_n、(GGS)_n、(GGGS)_n、(GGGGS)_n或/和AS(GGGGS)_n，优选n为1、2、3、4、5或6。

作为示例，所述的连接子可以是（GGGGS）_n，所述的n为≥1的整数，进一步优选为3。作为示例如：SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17通过SEQ ID NO: 15连接。

SEQ ID NO: 15：GGGGSGGGGSGGGGS。

可选择地，所述的干细胞中还可以包括hinge区和CH区。

在一些具体的实施例中，所述的干细胞包含：

（1）如SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:17-SEQ ID NO: 26所表示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列；

和/或；

（2）编码SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:17-SEQ ID NO: 26所表示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。

根据本领域技术人员的一般理解，本发明所述的干细胞中包括表达IL-17A特异性串联抗体的载体。但本发明干细胞的含义实际上不仅限于以上形式。本领域已公开或未公开的通过抗体对干细胞进行修饰的方式均应为本领域技术人员所理解，并通过这些方式实现本发明的应用。

如本领域技术人员所公知，由于密码子简并性问题，在明确氨基酸序列的情况下，其对应的核酸序列是有无数可能性的，本发明优选的核酸的序列仅作为一个较优的示例，而非唯一可能性。

具体地，所述的细胞中还包括协助表达和/或分泌，或延长体内半衰期的生物活性蛋白或其功能片段；所述生物活性蛋白或其功能片段选自免疫球蛋白Fc结构域、血清白蛋白、白蛋白结合多肽、前白蛋白、羧基末端肽、弹性蛋白样多肽、His标签、GST标签、MBP标签、FLAG标签和SUMO标签中的至少一种；所述免疫球蛋白Fc结构域源自人抗体、鼠抗体、灵长目动物抗体或骆驼科动物抗体、或其变体；较佳地，所述免疫球蛋白Fc结构域源自人IgG抗体，例如IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc或IgG4 Fc，优选IgG1 Fc。

优选地，所述生物活性蛋白或其功能片段与所述串联单域抗体通过连接子连接，优选肽连接子；

较佳地，所述连接肽包含G（甘氨酸）、S（丝氨酸）和A（丙氨酸）或由G和S组成的柔性多肽，优选2-30个氨基酸残基的柔性多肽；

更佳地，所述连接肽包括(GS)_n、(GGS)_n、(GGGS)_n、(GGGGS)_n和AS(GGGGS)_n，优选n为1、2、3、4、5或6。

优选地，所述的载体的类型包括但不限于：病毒性载体或非病毒性载体。

进一步优选地，所述病毒性载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、反转录病毒载体、痘病毒载体、仙台病毒载体、单纯疱疹病毒载体中的至少一种。

进一步优选地，所述的非病毒性载体包括但不限于真核载体或原核载体。

本发明的应用中，所述的干细胞的类型按分化发育潜能区分可以包括：

全能干细胞：可以分化形成完整的个体，如胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）；多能干细胞：可以分化形成多种细胞组织器官，如造血干细胞、生殖干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞等；单能干细胞：指具有向一种或两种相关的细胞类型分化的潜能，如肌肉中的成肌细胞、上皮组织基底层的干细胞。

本发明的应用中，所述的干细胞的类型按干细胞的发育阶段区分可以包括：

胚胎干细胞：高度未分化细胞，具有发育的全能型，能分化出成体的所有组织器官；成体干细胞：在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。

所述的成体干细胞包括但不限于：

造血干细胞：研究历史最长最深入的一类成体干细胞，具备分化为血液系统各种细胞的潜能，在疾病治疗、抗衰老保健等领域具有极大的应用潜能；生殖干细胞：具备分化为生殖细胞和性腺各种支持细胞的潜能，使成体得以发挥生育功能，并可以延缓性腺的衰老；间充质干细胞：具备分化为机体骨、软骨和各种器官细胞的潜能，还具备特有的免疫调节功能；神经干细胞：具备分化为神经系统各种细胞的潜能；视网膜干细胞：具备分化为视网膜各种细胞的潜能；心脏干细胞：具备分化为心脏各种细胞的潜能；肝脏干细胞：具备分化为肝脏各种细胞的潜能；胰腺干细胞：具备分化为胰腺各种细胞的潜能，在特定条件下，可以分化为胰岛细胞；肺脏干细胞：具备分化为肺脏各种细胞的潜能；肾脏干细胞：具备分化为肾脏各种细胞的潜能。

优选地，所述的干细胞为胚胎干细胞、成体干细胞、间充质干细胞、脐带血干细胞、造血干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、皮肤干细胞和/或肌肉干细胞。

作为优选，所述的干细胞为间充质干细胞；所述的干细胞分离自脐带血、脐带、胎盘、脂肪组织、皮肤、神经组织、骨髓或胚胎。

本发明的应用中，所述炎性疾病包括但不限于多发性肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎、主动脉炎综合征、恶性类风湿关节炎、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、脊椎关节炎、ANCA相关性血管炎、慢性萎缩性胃炎、急进性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、银屑病关节炎、颞动脉炎、嗜酸性筋膜炎、非酒精性脂肪性肝炎、嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎、强直性脊柱炎、包涵体肌炎、视神经脊髓炎、巨细胞动脉炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、炎症性肠病、血管炎、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性血管炎、类风湿性血管炎和/或大血管血管炎。基于干细胞的表达特性，本领域技术人员可以选择性将其应用于合适的适应症。

本发明的应用中，所述感染性疾病包括但不限于：脓毒血症和感染中毒性休克、感染性腹泻、腹腔感染、泌尿道感染、皮肤软组织感染；

优选地，所述感染性疾病包括但不限于：链球菌感染、葡萄球菌感染、链球菌感染、肠球菌感染、脑膜炎球菌感染、淋病奈瑟菌感染、霍乱和弧菌感染、沙门菌感染、志贺杆菌感染、假单胞菌及革兰阴性肠杆菌感染、军团杆菌感染、百日咳、白喉、厌氧菌感染、幽门螺杆菌感染、结核、鼠疫杆菌感染、炭疽、梅毒、钩端螺旋体病、莱姆病、立克次体病、支原体感染、衣原体感染、流行性感冒、禽流感、SARS、病毒性出血热、流行性乙型脑炎、狂犬病、病毒性肝炎、慢性乙型肝炎和/或慢性丙型肝炎。

本发明的应用中，所述自身免疫性疾病包括但不限于白塞氏病、系统性红斑狼疮、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化症、系统性硬皮病、进行性系统性硬化症、硬皮病、混合性结缔组织病、卡斯尔曼病、干燥综合征、成人斯蒂尔病、Cogan综合征、RS3PE综合征、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、IgG4相关疾病、格林巴利综合征、重症肌无力、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、Good-pasture综合征、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、巴塞杜病、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能减退症、原发性甲状腺功能减退症、艾迪生病、特发性艾迪生病、I型糖尿病、缓慢进展型I型糖尿病、局灶性硬皮病、银屑病、大疱性类天疱疮、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线性IgA大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、斑秃、白斑病、寻常型白斑病、多灶性运动神经病、结节病、肌萎缩侧索硬化、原田病、自身免疫性视神经病、特发性无精子症、习惯性流产、乳糜泻、严重哮喘、慢性荨麻疹移植免疫、家族性地中海热、扩张型心肌病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、狼疮性肾炎和/或系统性肥大细胞增多症；

优选地，所述自身免疫性疾病为斑块状银屑病、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎和/或狼疮性肾炎。

本发明的应用中，所述肿瘤包括恶性肿瘤和/或非恶性肿瘤。

根据本领域技术人员的一般理解，所述的恶性肿瘤和/或非恶性肿瘤根据人体系统至少可以包括：运动系统、循环系统、消化系统、呼吸系统、神经系统、泌尿系统、内分泌系统、生殖系统和/或免疫系统的恶性肿瘤和/或非恶性肿瘤。

在一些具体的实施方式中，所述的恶性肿瘤包括但不限于：基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、胆管癌、绒毛膜癌、结直肠癌、结缔组织癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌、胶质母细胞瘤、肝癌、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴癌、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞癌、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞癌、直肠癌、呼吸系统癌、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统癌症、B细胞淋巴癌、慢性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病和/或慢性成髓细胞性白血病。所述的非恶性肿瘤包括但不限于：脂肪瘤、神经纤维瘤、皮脂腺囊肿、乳腺囊肿、纤维瘤、平滑肌瘤、甲状腺乳头状瘤、错构瘤、肝血管瘤，肾囊肿、胃肠息肉和/或浆液性囊腺瘤。

作为优选，所述的疾病为关节炎或银屑病；所述的关节炎包括但不限于：类风湿性关节炎、银屑病关节炎或关节滑膜炎。在一些具体的实施例中，所述的药物具有降低炎症因子的效果。

所述的应用优选为制药用途、制备诊断产品的用途。

所述的应用为用于制备药物时，所述的药物中还包括药学上可接受的辅料。

本发明的有益效果：

本发明通过使用串联纳米抗体修饰干细胞，提高了干细胞治疗效果，所得修饰干细胞具有以下特点：高表达IgG4，表达量高达10.43±0.52μg/mL；高表达IL-17Nb，浓度为4106±185.84 ng/mL；且可以稳定、持续地表达分泌IL-17Nb；分泌的IL-17Nb可以阻断IL-17A/IL17RA的结合，稀释5倍后抑制率高达60%。本发明经修饰后的干细胞通过实验动物模型进行了验证，表明其在IL-17A相关疾病中的良好应用前景。

附图说明

图1为IL-17A重组蛋白（抗原）SDS-PAGE结果。

图2为阳性对照抗体Ixekizumab阻断实验结果。

图3为串联抗体G4-H10的SDS-PAGE结果。

图4为基础实验例3中阳性对照抗体Ixekizumab和串联抗体G4-H10的抗体亲和力检测结果，左图为阳性对照抗体Ixekizumab，右图为串联抗体G4-H10。

图5为基础实验例4中串联抗体G4-H10的抗体阻断实验结果。

图6为基础实验例6中制备的慢病毒滴度检测结果。

图7为基础实验例7中的间充质干细胞FITC通道信号检测结果，hUC-MSC读值为0.353%，G4-H10-MSC读值为63.329%。

图8为ELISA法检测G4-H10-MSC细胞IgG4表达量结果。

图9为ELISA法检测G4-H10-MSC细胞IL-17Nb表达量结果。

图10为ELISA法测定IL-17Nb阻断IL-17A与IL-17RA结合的结果。

图11为间充质干细胞不同培养时间下的IL17Nb表达量统计。***代表hUC-MSC添加G4-H10与IL17Nb-MSC两组之间有极显著差异（P＜0.001）。

图12为实施例1动物体重统计结果。***代表模型对照组与正常对照组相比存在显著性差异（P<0.001）；##代表G4-H10-MSC治疗组与模型对照组之间存在显著性差异（P<0.01）；&&代表G4-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异（P<0.01）；@代表C3-H10-MSC治疗组与hUC-MSC治疗组之间存在显著性差异（P<0.05）。

图13为实施例1动物足爪厚度统计结果。***代表模型对照组与正常对照组相比存在显著性差异（P<0.001）；##代表3个治疗组与模型对照组之间存在显著性差异（P<0.01）；&代表G4-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异（P<0.05）。

图14为实施例1组织病理染色结果。

图15为实施例1病理组织染色评分结果。#代表hUC-MSC治疗组与模型对照组之间存在显著性差异（P<0.05）；##代表G4-H10-MSC治疗组与模型对照组之间存在显著性差异（P<0.01）；&代表G4-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异（P<0.05）；@代表G4-H10-MSC治疗组与hUC-MSC治疗组之间存在显著性差异（P<0.05）。hUC-MSC组即hUC-MSC治疗组，阳性抗体组即阳性抗体治疗组，G4-H10-MSC组即G4-H10-MSC治疗组。

图16为实施例2动物体重统计结果。**代表模型对照组与正常对照组相比存在显著性差异（P<0.01）；##代表G4-H10-MSC治疗组与模型对照组之间存在显著性差异（P<0.01）；&&代表G4-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异（P<0.01）。

图17为实施例2动物皮肤照片。hUC-MSC组即hUC-MSC治疗组，阳性抗体组即阳性抗体治疗组，G4-H10-MSC组即G4-H10-MSC治疗组。

图18为实施例2动物皮肤临床评分结果。****代表模型对照组与正常对照组相比存在显著性差异（P<0.0001）；###代表3个治疗组分别与模型对照组之间存在显著性差异（P<0.001）；&&代表G4-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异（P<0.01）；@@代表G4-H10-MSC治疗组与hUC-MSC治疗组之间存在显著性差异（P<0.01）。

图19为实施例2动物皮肤厚度统计结果。***代表模型对照组与正常对照组相比存在显著性差异（P<0.001）； ##代表3个治疗组分别与模型对照组之间存在显著性差异（P<0.01）；&&代表G4-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异（P<0.01）。hUC-MSC组即hUC-MSC治疗组，阳性抗体组即阳性抗体治疗组，G4-H10-MSC组即G4-H10-MSC治疗组。

图20为实施例3动物体重统计结果。**代表模型对照组与正常对照组相比存在显著性差异（P<0.01）；##代表G4-H10-MSC治疗组与模型对照组之间存在显著性差异（P<0.01）；&&代表G4-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异（P<0.01）。

图21为实施例3动物足爪关节评分结果。****代表模型对照组与正常对照组相比存在显著性差异（P<0.0001）；###代表3个治疗组分别与模型对照组之间存在显著性差异（P<0.001）；&&代表G4-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异（P<0.01）；@代表G4-H10-MSC治疗组与hUC-MSC治疗组之间存在显著性差异（P<0.05）。

图22为实施例3动物皮肤临床评分结果。****代表模型对照组与正常对照组相比存在显著性差异（P<0.0001）；##代表3个治疗组分别与模型对照组之间存在显著性差异P<0.01；&代表G4-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异（P<0.05）；@代表C3-H10-MSC治疗组与hUC-MSC治疗组之间存在显著性差异（P<0.05）。

图23-图25为实施例3各组动物血清中炎症因子检测结果，hUC-MSC组即hUC-MSC治疗组，阳性抗体组即阳性抗体治疗组，G4-H10-MSC组即G4-H10-MSC治疗组：

图23为实施例3各组动物血清中TNF-α检测结果，其中：**代表模型对照组与正常对照组相比存在显著性差异（P<0.01）；#代表hUC-MSC治疗组与模型对照组之间存在显著性差异（P<0.05）；##代表G4-H10-MSC治疗组与模型对照组之间存在显著性差异（P<0.01）；&代表G4-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异（P<0.05）；@代表G4-H10-MSC治疗组与hUC-MSC治疗组之间存在显著性差异（P<0.05）。

图24为实施例3各组动物血清中IL-6检测结果，其中：**代表模型对照组与正常对照组相比存在显著性差异（P<0.01）；#代表hUC-MSC治疗组与模型对照组之间存在显著性差异（P<0.05）；##代表G4-H10-MSC治疗组与模型对照组之间存在显著性差异（P<0.01）；&代表G4-H10-MSC治疗组与阳性抗体治疗组之间存在显著性差异（P<0.05）。

图25为实施例3各组动物血清中IL-23检测结果，其中：*代表模型对照组与正常对照组相比存在显著性差异（P<0.01）；#代表阳性抗体和G4-H10-MSC治疗组与模型对照组之间存在显著性差异（P<0.05）；@代表G4-H10-MSC治疗组与hUC-MSC治疗组之间存在显著性差异（P<0.05）。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明可能涉及的部分试剂、材料和设备见表1。

表1 本发明涉及的主要试剂、材料和设备

基础实验例1IL-17纳米抗体筛选

如本发明同申请日的发明专利所体现，本发明通过抗原免疫动物进行抗体的筛选，包括步骤如下：

（1）重组抗原的制备

在IL-17抗原C端添加6×His标签，按照原核密码子优化后进行基因合成并亚克隆至pET28a载体中；经Sanger测序验证无误后，进行质粒抽提；将重组质粒转化BL21感受态，使用0.5mM IPTG诱导过夜，收集菌液裂解；使用镍柱纯化重组蛋白至纯度大于90%。（图1）

（2）阳性对照抗体Ixekizumab制备

Ixekizumab重链可变区：SEQ ID NO.20；轻链可变区SEQ ID NO.21。

SDS-PAGE检测阳性对照抗体蛋白的纯度，纯度>95%。

SEQ ID NO.20：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTDYHIHWVRQAPGQGLEWMGVINPMYGTTDYNQRFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYFTGTGVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG；

SEQ ID NO.21：

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSRSLVHSRGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFIGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHLPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

（3）IL-17A报告基因细胞株构建及验证

根据IL-17RA（UniProtKB：Q96F46）及IL-17RC（UniProtKB：Q8NAC3）的氨基酸序列信息，构建慢病毒表达载体并包装慢病毒，共同感染293细胞，筛选同时过表达这两个受体的重组293细胞，进一步稳转NFKB-Luciferase和ACT1基因，构建IL-17A报告基因细胞株293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc。加入重组抗原进行激活，同时加入阳性对照抗体Ixekizumab进行阻断实验的检测，建立靶向IL-17A的候选抗体体外药效学评价细胞株。构建的IL-17A受体过表达细胞株可以和IL-17A结合，IL17A重组蛋白可有效激活293F-IL17Ra/IL17Rc-NFκB-Luc报告基因细胞株中荧光素酶表达。

将阳性对照抗体Ixekizumab与IL-17A重组蛋白一起加入293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc细胞，阳性对照抗体Ixekizumab可抑制IL17A蛋白与其膜受体结合，并抑制胞内NFκB的信号，呈现剂量效应，见图2。

（4）羊驼免疫

使用上述制备的重组抗原蛋白对羊驼（Alpaca）进行免疫，免疫间隔时间21天，最后一次免疫10天后，采集部分外周血，分离血清采用ELISA检测免疫效果。

（5）免疫效价的检测

经6轮免疫，羊驼的免疫效价均达到要求（见下表2-3）。

表2免疫效价检测结果

表3免疫效价检测结果

（6）PBMC分离及VHH抗体片段克隆

分离PBMC，提取RNA反转录后进行两轮PCR，胶回收产物，测定浓度。

（7）单域抗体酵母展示库的构建及淘选

线性载体与PCR产物共同电转化酵母感受态菌株。单域抗体酵母展示库淘选；淘选后酵母单克隆进行流式检测。重叠PCR（Overlap PCR）产物的扩增，瞬时转染和检测，回收产物，转染。ELISA挑选阳性克隆，获得VHH抗体序列并进行基因合成，基因工程表达后蛋白A（Protein A）纯化。

富集阳性克隆；挑选富集后的单克隆，进行Phage ELISA鉴定，并对克隆进行测序分析，获取候选单域抗体的核酸及氨基酸序列信息。随机挑取20个单克隆，进行测序分析，序列差异大，库多样性较好。针对候选的单域抗体CDR区域氨基酸序列信息，采用In silico方法对可能的翻译后修饰位点进行分析。

根据酵母单克隆流式检测结果，选择与IL-17A-His结合的阳性克隆提取基因组DNA，PCR获得抗体序列。挑选差异克隆进行重叠PCR扩增，在VHH的N端加上信号肽，C端加上IgG1-Fc，PCR产物瞬时转染HEK293细胞；取表达的抗体上清进行ELISA检测：100μL转染上清加入IL-17A重组抗体预包被的96孔板中孵育，采用HRP-Protein A作为二抗进行ELISA检测，安排差异克隆进行构建真核表达载体。将构建的单域抗体表达载体瞬时转染293F细胞，采用Protein A亲和纯化重组抗体。

（8）ELISA检测重组抗体与靶蛋白的结合，FACS检测单域抗体与报告基因细胞株的结合完成单域抗体阻断功能实验，ForteBio OCTET R2 系统进行动力学表征分析。用ForteBio OCTET R2 系统进行动力学表征分析。根据全部抗体的结果进行筛选。本发明在上述基础筛选方法的基础上进一步扩展。在抗体阻断活性检测中发现，部分单域抗体虽然能够阻断Human IL-17A蛋白激活下游靶标蛋白，但阻断效果均弱于阳性抗体Ixekizumab。因此，将其中两种抗IL-17A单域抗体串联组成二价抗体，以增强其阻断效果。具体地，本发明保护的是根据2-G4（简称G4）与3-H10（简称H10）构建的串联抗体所制备干细胞的应用，后续串联抗体简称为G4-H10。

本发明中：

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。

除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。

如本文所用，术语“约”表示其后的数值的±20%的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10%的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5%的范围。

如本文所用，术语“包括”或“包含”是指“包括但不限于”。该术语旨在是开放式的，以指定任何所述特征、要素、整数、步骤或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、要素，整数、步骤、组件或其组的存在或添加。因此，术语“包含”包括更具限制性的术语“由……组成”和“基本上由……组成”。在一个实施方式中，在整个发明中特别是在权利要求书中使用的术语“包含”可以被术语“由……组成”代替。本文所用氨基酸三字母代码和单字母代码如本领域技术人员知晓，或J Biol. Chem, 243, p3558 (1968)中所述。

如本文所用，术语“任选”、“任一”、“任意”或“任一项”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。

如本文所用，术语“干细胞”是指在单细胞水平上自我更新和分化以产生子代细胞的未分化细胞，包括自我更新的祖细胞、非更新的祖细胞以及终末分化的细胞。所述干细胞一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时在身体生长、维修、更新、损伤修复中起着主要作用。

如本文所用，术语“间充质干细胞”，本领域也称为“间质干细胞（mesenchymalstem cell，MSC）”，是指一类源自中胚层的，具有一定分化潜能、可以分化成多种细胞类型的多能基质细胞群。其主要源自和存在于骨髓，此外也包括广泛源自其他“非骨髓”组织的多能细胞，例如：胎盘、脐带血、脂肪组织、成人肌肉、角膜基质、乳牙牙髓等组织。

如本文所用，术语“IL-17A”、“白介素-17A”或“IL-17”，是指一种细胞因子，属于白细胞介素17家族，由T细胞和其他类型的免疫细胞产生，并在免疫系统中发挥重要作用。IL-17A主要由Th17细胞产生，其他细胞包括CD8+T细胞、γδ T细胞、NK细胞及中性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞也表达IL-17A。它主要作用于免疫细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞，诱导炎症反应。在一些实例中，该术语包括变体、同源物、直系同源物和旁系同源物。例如，对人IL-17A特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴的IL-17A蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人IL-17A蛋白特异的抗体可以完全地对人IL-17A蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的IL-17A蛋白交叉反应。

如本文所用，术语“抗IL-17A单域（纳米）抗体”、“IL-17A单域（纳米）抗体”或“特异性结合IL-17A的串联单域（纳米）抗体，是指特异性结合IL-17A，并且部分或完全地中和、抑制或削弱IL-17A活性、和/或使IL-17A失活、阻止IL-17A应答或由IL-17A介导的下游通路或其他IL-17A介导的功能的抗体。

如本文所用，术语“抗体”，是指包含由二硫键（S S）相互连接的重链（H）和轻链（L）的糖蛋白。每条重链由重链可变区（本文中缩写为VH）和重链恒定区（本文中缩写为CH）组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区（本文中缩写为VL）和轻链恒定区（本文中缩写为VH）组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。轻链分为两类分别为kappa型轻链和lambda型轻链（例如本发明中轻链恒定区Cκ/λ表示轻链恒定区为kappa型轻链或者lambda型轻链）。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区（也称互补决定区（CDR）），其间插有较保守的构架区或框架区（FR）。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。抗体包含单特异性抗体、双特异性抗体和多特异性抗体，只要其表现所期望的生物活性或功能即可。

如本文所用，术语“单域抗体”（sdAb）或“纳米抗体”，具有其在本领域中的一般含义，且是指具有仅12 15 kDa分子量的抗体片段，其由来源于重链的单个单体可变抗体结构域组成。这种单域抗体（命名为VHH）可以在骆驼科哺乳动物中发现，且天然缺失轻链。对于（单）域抗体的一般描述，还参考上述现有技术以及EP 0368684, Ward等（Nature 1989 Oct12；341 (6242): 544-6），Holt et al, Trends Biotechnol, 2003, 21 (11): 484-490；和WO 06/030220，WO 06/003388。单域抗体的氨基酸序列和结构可以被认为由四个框架区或“FR”组成，其在本领域中被分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；为“框架区3”或“FR3”；以及“框架区4”或“FR4”；框架区被三个互补决定区或“CDR”间隔，在本领域中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”，以及“互补决定区3”或“CDR3”。因此，单域抗体可定义为具有以下一般结构的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1 FR4分别指框架区1-4，且其中CDR1-CDR3指互补决定区1-3。在本公开的上下文中，单域抗体的氨基酸残基根据International ImMunoGeneTics information system氨基酸编号（http://imgt.cmes.fr/）给出的VH结构域的通用编号方式进行编号。

如本文所用，术语“氨基酸”，是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及经修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ羧基谷氨酸和O 磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，碳结合至氢、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍类。这些类似物具有修饰的R基团（例如正亮氨酸）或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的一般化学结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。

如本文所用，术语“活性”、“功能活性”或“生物活性”，或术语“生物性质”或“生物特征”此处可互换使用，包括但不限于表位/抗原亲和力和特异性、在体内或体外中和或拮抗IL-17A活性的能力、IC50、抗体的体内稳定性和抗体的免疫原性质。本领域公知的抗体的其它可鉴定的生物学性质或特征包括，例如，交叉反应性（即通常与靶定肽的非人同源物，或与其它蛋白质或组织的交叉反应性），和保持哺乳动物细胞中蛋白质高表达水平的能力。使用本领域公知的技术观察、测定或评估前面提及的性质或特征，所述技术包括但不局限于ELISA、FACS或BIACORE等离子体共振分析、不受限制的体外或体内中和测定、受体结合、细胞因子或生长因子的产生和/或分泌、信号转导和不同来源（包括人类、灵长类或任何其它来源）的组织切片的免疫组织化学。

如本文所用，术语“Fc”或“Fc区”或“Fc片段”，是指由IgA、IgD及IgG的CH2和CH3结构域，或者由IgE及IgM的CH2、CH3和CH4结构域通过铰链区的组成的多肽。尽管Fc片段的分解是可变的，但是人IgG的重链Fc片段通常指从A231到其羧基末端这一段多肽。

如本文所用，术语“表位”，是指能够特异性结合抗体的蛋白决定簇。表位通常由表面簇集的分子，例如氨基酸或糖侧链组成，和通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的不同之处在于与前者而非后者的结合在存在变性溶剂的情况下丢失。表位可包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效封闭或覆盖的氨基酸残基（换言之，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹内）。

如本文所用，术语“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由平衡解离常数（KD）代表，平衡解离常数是解离速率常数和结合速率常数（分别是K_off和K_on）的比值。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。用于测量亲和力的一个具体方法是本文中的ForteBio动力学结合测定法。

如本文所用，术语“高亲和性”或“高亲和力”，对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0×10^-6M或更低，优选5.0×10^-8M或更低，更优选1.0×10^-8M或更低、5.0×10^-9M或更低，更优选1.0×10^-9M或更低。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指KD为10^-6M或更低，优选10^-7M或更低，更优选10^-8M或更低。

如本文所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）及其呈单链或双链形式的聚合物。除非明确地限制，否则术语包括具有与参照核酸相似的结合性质并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢的含有已知的天然核苷酸的类似物的核酸（参见，属于Kariko等人的美国专利No. 8278036，其公开了尿苷被假尿苷替代的mRNA分子，合成所述mRNA分子的方法以及用于在体内递送治疗性蛋白的方法）。除非另有所指，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体（例如，简并密码子取代）、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可通过生成其中一个或多个选择的（或全部）密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现（Batzer,Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka,J.Biol.Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini,Mol.Cell.Probes8: 91-98 (1994))。

如本文所用，术语“构建体”是指任何重组多核苷酸分子（诸如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体或线性或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子），衍生自任何来源，能够与基因组整合或自主复制，构成如下多核苷酸分子，其中已经以功能操作的方式连接（即，可操作地连接）一或多个多核苷酸分子。重组构建体通常会包含可操作地连接至转录起始调节序列的本发明的多核苷酸，这些序列会导引多核苷酸在宿主细胞中的转录。可使用异源及非异源（即，内源）启动子两者导引本发明的核酸的表达。

如本文所用，术语“载体”是指任何重组多核苷酸构建体，该构建体可用于转化的目的（即将异源DNA引入到宿主细胞中）。一种类型的载体为“质粒”，是指环状双链DNA环，可将额外DNA区段连接至该环中。另一类型的载体为病毒载体，其中可将额外DNA区段连接至病毒基因组中。某些载体能够在被引入到的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体）。在引入到宿主细胞中后，其他载体（例如，非游离型哺乳动物载体）整合至宿主细胞的基因组中，且因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够导引被操作性连接的基因的表达。本文将此类载体称为“表达载体”。

如本文所用，术语“表达载体”是指能够在转化、转染或转导至宿主细胞中时复制及表达目的基因的核酸分子。表达载体包含一或多个表型选择标记及复制起点，以确保维护载体及以在需要的情况下于宿主内提供扩增。

如本文所用，术语“药物组合物”通常是指这样的制剂，其以允许活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对将施用所述组合物的对象具有不可接受的毒性的另外的成分。所述组合物是无菌的。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。如本文中所用，术语“药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体，是本领域公知的（参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited byGennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995）。药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂、介质、包封材料、制造助剂或溶剂包封材料，其涉及维持本公开的抗体或其抗原结合片段的稳定性、溶解度或活性，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液（如缓冲盐水），醇和多元醇（如甘油）等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类（如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖），氨基酸（如谷氨酸，甘氨酸），蛋白质（如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白）或其降解产物（如乳白蛋白水解物）等。

基础实验例2IL-17A特异性串联抗体的制备和纯化

2-G4的序列为SEQ ID NO.16，CDR区依次为SEQ ID NO.1-3；

3-H10的序列为SEQ ID NO.17，CDR区依次为SEQ ID NO.4-6。

本例中的串联抗体中还包括连接子（GGGGS）₃、hinge区和CH区。

本例中构建的串联抗体的序列为SEQ ID NO.18。串联抗体的编码基因为SEQ IDNO.19。

SEQ ID NO: 18：

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGEKLDYFAIGWFRQAPGKEREVVSCVTSSGSSTNYLSSVKDRFTISIDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCASTILLCSDYISAFGTWGQGTQVTVASGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSIHIYAMGWYRQAPGKQRELVATITRGGVTNNADSVKGRFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCNAGGTNGGYWGQGTQVTVSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

SEQ ID NO:19：

CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCCGGGGGATCTCTGAGGCTCTCGTGTGCAGCCTCTGGAGAGAAATTGGATTATTTTGCCATAGGCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGTGAGGTAGTCTCATGTGTCACAAGTAGTGGTAGTAGCACAAACTATTTAAGTTCCGTGAAGGACCGATTCACCATCTCCATAGACAACGCCAAGAACACGGTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGCCATTTATTACTGTGCGTCCACTATTCTCCTCTGTTCAGATTATATCTCTGCCTTTGGCACCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCGCCTCGGGAGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGTGGCGGAGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCGGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTTAGTATCCACATCTATGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGCTGGTCGCAACTATTACTAGAGGTGGTGTAACAAATAATGCAGACTCCGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGCGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAATGCAGGTGGGACGAACGGGGGCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。

可以参照现有技术中的抗体制备方法制备上述串联抗体，具体如下：

（1）SEQ ID NO.19基因合成，与人IgG1 Fc段基因序列串联亚克隆至表达载体pcDNA3.4-hIgG1-Fc中。载体经测序验证无误后，使用Qiagen质粒大抽试剂盒（CAT#:DP117）制备去内毒素质粒备用。

（2）从冰箱中取出LVTransm转染试剂及单链抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入130μg抗体表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入400μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟得DNA/LVTransm复合物。

（3）将上述DNA/LVTransm复合物加入到30mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5% CO₂培养箱，130rpm培养6-8小时后，加入50mL新鲜的293细胞培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。

连续培养7天后，离心收集培养基上清，用0.45μm的滤膜过滤，滤液转至无菌离心管中，使用Protein A纯化抗体得纯化后的目标抗体。

SDS-PAGE检测目标抗体蛋白的纯度，串联抗体G4-H10的SDS-PAGE结果如图3所示。结果显示蛋白纯度>95%。

基础实验例3IL-17A特异性串联抗体亲和力检测

以Ixekizumab为阳性对照抗体，基因合成Ixekizumab重链及轻链可变区，将重链可变区亚克隆至pcDNA3.4-hIgG4（hIgG4氨基酸序列为SEQ ID NO.22）载体中，轻链可变区亚克隆至pcDNA3.4-hIgKc（hIgKc氨基酸序列为SEQ ID NO.23）载体中；经Sanger测序验证无误后使用质粒大抽试剂盒制备去内毒素质粒备用。其他步骤参照基础实验例2的方法，制备阳性对照抗体，纯度>95%。

SEQ ID NO.22：

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；

SEQ ID NO.23：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

ELISA检测重组抗体与靶蛋白的结合：

采用纯化后的待测抗体（2ug/mL）包被酶标板，加入Biotin-IL-17A-His，起始浓度为10ug/mL，5倍梯度稀释7个点，采用HRP-Streptavdin进行ELISA检测，各浓度测得的OD450值绘制曲线读取EC50值。

结果表明，对照抗体Ixekizumab的EC50值为10.06μg/mL；串联抗体的EC50为1.177μg/mL。见图4。

基础实验例4抗体阻断功能实验

使用293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc报告基因细胞株进行阻断活性检测。检测基础实验例2所涉及串联抗体、基础实验例3的阳性对照抗体Ixekizumab。

根据IL-17RA（UniProtKB：Q96F46）及IL-17RC（UniProtKB：Q8NAC3）的氨基酸序列信息，构建慢病毒表达载体并包装慢病毒，共同感染293细胞，筛选同时过表达这两个受体的重组293细胞，进一步稳转（SEQ ID NO.24）和ACT1基因（SEQ ID NO.25），构建IL-17A报告基因细胞株293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc。

SEQ ID NO.24：

ATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGAAGGGCCCAGCGCCATTCTACCCACTCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTGCACAAAGCCATGAAGCGCTACGCCCTGGTGCCCGGCACCATCGCCTTTACCGACGCACATATCGAGGTGGACATTACCTACGCCGAGTACTTCGAGATGAGCGTTCGGCTGGCAGAAGCTATGAAGCGCTATGGGCTGAATACAAACCATCGGATCGTGGTGTGCAGCGAGAATAGCTTGCAGTTCTTCATGCCCGTGTTGGGTGCCCTGTTCATCGGTGTGGCTGTGGCCCCAGCTAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGGGCATCAGCCAGCCCACCGTCGTATTCGTGAGCAAGAAAGGGCTGCAAAAGATCCTCAACGTGCAAAAGAAGCTACCGATCATACAAAAGATCATCATCATGGATAGCAAGACCGACTACCAGGGCTTCCAAAGCATGTACACCTTCGTGACTTCCCATTTGCCACCCGGCTTCAACGAGTACGACTTCGTGCCCGAGAGCTTCGACCGGGACAAAACCATCGCCCTGATCATGAACAGTAGTGGCAGTACCGGATTGCCCAAGGGCGTAGCCCTACCGCACCGCACCGCTTGTGTCCGATTCAGTCATGCCCGCGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTCAGCGTGGTGCCATTTCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACGCTGGGCTACTTGATCTGCGGCTTTCGGGTCGTGCTCATGTACCGCTTCGAGGAGGAGCTATTCTTGCGCAGCTTGCAAGACTATAAGATTCAATCTGCCCTGCTGGTGCCCACACTATTTAGCTTCTTCGCTAAGAGCACTCTCATCGACAAGTACGACCTAAGCAACTTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCTCAGCAAGGAGGTAGGTGAGGCCGTGGCCAAACGCTTCCACCTACCAGGCATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACAGAAACAACCAGCGCCATTCTGATCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCTGGCGCAGTAGGCAAGGTGGTGCCCTTCTTCGAGGCTAAGGTGGTGGACTTGGACACCGGTAAGACACTGGGTGTGAACCAGCGCGGCGAGCTGTGCGTCCGTGGCCCCATGATCATGAGCGGCTACGTTAACAACCCCGAGGCTACAAACGCTCTCATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGAGCCTGATCAAATACAAGGGCTACCAGGTAGCCCCAGCCGAACTGGAGAGCATCCTGCTGCAACACCCCAACATCTTCGACGCCGGGGTCGCCGGCCTGCCCGACGACGATGCCGGCGAGCTGCCCGCCGCAGTCGTCGTGCTGGAACACGGTAAAACCATGACCGAGAAGGAGATCGTGGACTATGTGGCCAGCCAGGTTACAACCGCCAAGAAGCTGCGCGGTGGTGTTGTGTTCGTGGACGAGGTGCCTAAAGGACTGACCGGCAAGTTGGACGCCCGCAAGATCCGCGAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTG；

SEQ ID NO.25：

ATGCCACCTCAGTTGCAGGAAACTCGGATGAATAGAAGCATCCCCGTGGAAGTGGACGAGAGCGAGCCGTACCCTAGTCAGCTGCTGAAGCCGATCCCTGAGTACTCCCCGGAAGAGGAATCCGAACCACCAGCCCCCAACATTCGCAATATGGCCCCCAATAGCTTGTCCGCACCAACAATGCTGCACAACTCTTCTGGCGACTTCTCTCAGGCCCACTCCACCCTGAAACTGGCGAATCACCAGCGGCCTGTATCCCGGCAGGTGACCTGTCTGAGAACTCAGGTGCTTGAAGACTCCGAGGACTCTTTCTGTAGGCGGCATCCAGGTTTGGGCAAGGCGTTTCCGTCCGGCTGTTCCGCGGTTTCAGAGCCCGCTTCCGAAAGTGTCGTGGGCGCCCTGCCAGCCGAGCACCAGTTCTCCTTCATGGAAAAGCGGAACCAGTGGCTGGTCAGTCAGCTGAGCGCCGCGTCACCTGATACAGGTCACGATTCCGACAAGTCTGACCAGTCTCTGCCCAATGCGTCAGCCGATAGTCTCGGGGGCTCCCAGGAGATGGTGCAGAGACCACAGCCGCACAGAAACCGGGCCGGGCTTGATCTGCCCACCATTGATACAGGCTACGATTCCCAGCCCCAGGACGTCCTTGGCATTCGCCAGCTGGAAAGGCCTCTGCCCTTGACCTCCGTGTGTTACCCCCAGGACCTGCCCCGCCCTTTGAGAAGCCGGGAGTTTCCCCAGTTTGAGCCCCAACGATACCCTGCCTGTGCTCAGATGCTGCCTCCGAACCTGAGCCCACACGCTCCCTGGAACTACCACTATCACTGTCCCGGCAGCCCCGATCACCAGGTGCCTTATGGACACGACTACCCGCGGGCTGCATACCAGCAGGTCATACAGCCTGCCTTGCCGGGTCAGCCGCTGCCCGGAGCTTCTGTGCGCGGCCTGCACCCCGTTCAGAAAGTGATCCTGAACTATCCAAGCCCATGGGACCATGAAGAGAGACCAGCCCAAAGAGATTGCTCTTTTCCTGGGTTGCCTAGACACCAAGACCAGCCTCACCACCAGCCTCCCAATCGGGCAGGCGCCCCAGGCGAAAGTCTCGAGTGCCCCGCCGAACTCAGACCACAGGTCCCTCAGCCCCCTTCCCCCGCGGCAGTACCCAGACCCCCCTCTAACCCACCCGCCCGGGGAACGCTCAAGACTTCAAATCTCCCAGAAGAGCTGCGCAAAGTGTTCATAACCTACAGCATGGACACCGCTATGGAGGTGGTTAAGTTCGTCAACTTCCTGCTGGTCAATGGGTTCCAGACTGCAATCGACATTTTTGAGGATAGAATTCGGGGAATCGACATCATCAAGTGGATGGAGAGATACCTGCGGGATAAGACAGTGATGATTATCGTGGCCATTAGTCCCAAGTACAAGCAAGATGTGGAGGGCGCAGAATCACAGTTGGACGAAGACGAGCACGGACTCCATACAAAATATATCCACAGGATGATGCAGATCGAGTTCATTAAACAAGGCTCCATGAATTTCCGCTTCATACCGGTCCTGTTTCCAAACGCAAAAAAAGAGCATGTACCCACTTGGCTCCAGAATACCCATGTCTACTCCTGGCCCAAGAACAAGAAGAATATCCTGCTGCGCTTGCTCAGAGAAGAAGAGTATGTCGCCCCTCCAAGGGGGCCCCTCCCCACACTCCAAGTAGTGCCACTT。

Ixekizumab和串联抗体可以阻断Human IL-17A蛋白激活293F-IL-17RA-IL-17Rc-ACT1-NFκB-Luc，IC50值分别为2.235nM、0.5888nM，串联抗体优于对照抗体。见图2和图5。

基础实验例5稳定性实验过程及结果分析：

实验过程：通过微量差示扫描荧光技术（nanoDSF）技术检测荧光变化，可在天然条件下检测蛋白热变性和化学变性，精确地确定蛋白50%处于去折叠状态时的温度（Tm）以及开始出现聚集时的温度（Tagg）；热变性Tm值和Tagg越高说明抗体蛋白越稳定。

取100μL检测对象抗体，4℃，12000×g，离心10min后，用毛细管吸取样品，每个样品准备两根毛细管，作为平行对照，按顺序放入对应的卡槽中，确保毛细管吸满样品，无气泡，进行检测分析。升温范围20℃-95℃，升温速率1℃/min，检测时间75min。

Tm定义为解链温度，Tonset定义为开始去折叠的温度，Tagg定义为聚集温度。

检测对象抗体为基础实验例2所涉及串联抗体、基础实验例3的阳性对照抗体Ixekizumab。

Ixekizumab结果：T_m1值为56.10±0.02℃；T_m2值为79.84±0.13℃；T_onset值为47.50±0.08℃；T_agg值为61.86±0.23℃；串联抗体的结果：T_m1值为58.13±0.06℃；T_m2值为82.43±0.48℃；T_onset值为51.28±0.22℃；T_agg值为58.48±0.00℃。

基础实验例6 LV-G4-H10:Fc慢病毒制备和检测方法

1.慢病毒穿梭质粒构建

构建G4-H10:Fc融合蛋白的慢病毒穿梭质粒，将G4和H10两个候选抗体(IL-17Nb)的VHH序列（G4和H10的氨基酸序列如SEQ ID NO.16和17）通过(GGGGS)₃链接后与IgG4 Fc（IgG4 Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO: 26所示，核苷酸序列如SEQ ID NO: 27所示）串联的形式构建到慢病毒穿梭质粒上，形成VHH-(GGGGS)₃-VHH-IgG4 Fc序列，处于EF-1alpha启动子下游，从而得到G4-H10:Fc慢病毒穿梭质粒。

SEQ ID NO: 26：

APEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK。

SEQ ID NO: 27：

GCCCCCGAGTTTCTGGGAGGACCTAGCGTCTTTCTGTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACACTGATGATCTCTAGGACCCCCGAGGTGACATGCGTCGTGGTGGACGTGAGCCAAGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAACCTAGAGAAGAGCAGTTCAACAGCACCTATAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGAGCAACAAGGGCCTCCCCTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGACAGCCTAGAGAGCCCCAAGTGTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAAGTGTCTCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAAAACAACTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGCAGCTTCTTTCTGTACTCCAGACTGACCGTGGACAAAAGCAGATGGCAAGAGGGCAACGTGTTTAGCTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTATACCCAGAAGTCCCTCTCTCTGAGCCTCGGCAAGTGA。

2. 慢病毒制备（病毒包装）

慢病毒包装前24 h，准备摇瓶，将HEK293T（购自ATCC，货号为CRL-3216）细胞密度调整到1.0×10⁶/mL，每瓶60 mL备用。

制备转染试剂/DNA复合物：取7.5 mL 293T培养基至15 mL离心管，加入40 µg G4-H10:Fc慢病毒穿梭质粒，80 µg辅助质粒（购自addGene，货号为：12253、12259），移液枪上下吹打充分混匀后，加入360 µL转染试剂，立即用1 mL移液器上下吹打混匀，室温下静置10min（不超过15 min）。

将转染试剂/DNA复合物逐滴加入到前一天准备好的细胞中，边加边晃动摇瓶，充分混匀后将摇瓶置于37℃、5% CO₂、120 rpm摇床上培养。

培养24h后收集上清，并用0.45 µm针头滤器过滤至病毒离心管中，45000×g、4℃、离心90 min。

离心结束后，倒掉上清，并使用移液器将残余上清去除干净，用1 mL PBS重悬沉淀，并分装至病毒分装管中，每管100 µL，即为LV-G4-H10:Fc慢病毒。

3. 慢病毒滴度检测

将293T细胞接种24孔板，过夜培养后，分别加入20µL LV-G4-H10:Fc病毒原液、稀释10倍病毒液、稀释100倍病毒液，继续培养24h，24h后更换新鲜培养基，连续培养9d后，收获细胞，提取基因组DNA（试剂盒购自Thermo，货号为K0721），用ddH₂O（双蒸水）调整质粒模板拷贝数，标曲范围为1×10⁹-1×10³，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，按照PCR预混液将2×PCR Mix（购自Applied Biosystems，ABI，美国应用生物系统公司，货号为A25742）、引物、DNA、PCR水（购自Thermo，赛默飞，货号R0582）混匀后加入相应的PCR反应孔中，进行PCR反应。并根据以下公式计算病毒的滴度。

慢病毒滴度=细胞数×拷贝数/病毒体积（mL）×稀释倍数。

慢病毒滴度检测结果见图6，无论病毒是原倍还是稀释10倍、100倍，病毒滴度在2.3E+7至2.6E+7之间，三组之间无显著差异，因此慢病毒滴度为2.45E+7 TU/mL。

基础实验例7G4-H10基因修饰干细胞（G4-H10-MSC）制备和感染效率检测

制备的LV-G4-H10:Fc慢病毒按照MOI=10加入已培养且融合度达70-80%的间充质干细胞（使用酶解法从新生儿脐带中分离，经传代扩增纯化得到P2代间充质干细胞），经37℃、CO₂培养，待细胞密度达100%后，传代，成功得到感染LV-G4-H10:Fc的间充质干细胞（G4-H10-MSC）。

将获得的G4-H10-MSC及hUC-MSC细胞按1×10⁴个/cm²培养至T25细胞培养瓶，培养液为DMEM/F12（含10%胎牛血清，均为Thermo赛默飞产品），待细胞密度达80-90%，加入转运抑制剂（购自美国BD公司，货号为555029），经过固定、洗涤、染色FITC-Protein A（染色FITC-蛋白A，购自BOSTER博士德生物，货号为BA1120）后，上机，检测间充质干细胞FITC通道信号（结果见图7），发现G4-H10-MSC细胞在FITC通道信号阳性率超过60%，而正常间充质干细胞（hUC-MSC）在FITC通道没有信号，表明LV-G4-H10:Fc慢病毒可以成功感染间充质干细胞。

基础实验例8ELISA法检测G4-H10-MSC细胞IgG4、IL-17Nb的表达

将基础实验例7获得的G4-H10-MSC与hUC-MSC分别按照1×10⁴个/cm²培养至T25细胞培养瓶，培养液为DMEM/F12（含10%胎牛血清），培养72小时后收获细胞上清，分装冻存，进行IgG4、IL-17Nb抗体含量和阻断效率检测。

1. ELISA法检测基础实验例7制备的G4-H10-MSC细胞IgG4的表达

采用invitrogen公司（美国英杰生命技术有限公司）Human IgG4 ELISA Kit（人IgG4 ELISA试剂盒，购自Thermo赛默飞，货号：BMS2095）用于检测细胞培养上清中分泌的融合蛋白IgG4含量。该试剂盒采用人IgG4固相夹心ELISA（酶联免疫吸附测定）检测匹配抗体对之间结合的靶标量。IgG4特异性抗体已预先包被在酶标板中，然后将细胞上清液样品、标准品或对照加入这些孔中并与固定（捕获）抗体结合，通过添加二抗形成夹心结构，添加底物溶液与酶-抗体-靶标复合物反应以产生可测量的信号。该信号的强度与原始样本中存在的目标浓度成正比。

将上述获得的细胞培养上清（进行不同倍稀释后发现稀释25倍最佳）通过上述人IgG4 ELISA试剂盒，检测融合蛋白中IgG4蛋白含量，结果发现，G4-H10慢病毒感染后的间充质干细胞（G4-H10-MSC）高表达IgG4，表达量高达10.43±0.52μg/mL，而正常hUC-MSC不表达IgG4（结果见图8）。

2. IL-17Nb抗体含量检测

采用IL-17A蛋白结合实验检测IL-17A纳米抗体表达情况，将终浓度为2μg/mL的IL-17A蛋白（基础实验例1中制备）包被酶标板4℃过夜，BSA封闭后，检测上述获得的G4-H10-MSC上清（进行不同倍稀释后发现稀释20倍最佳）。标准品为G4-H10融合蛋白（基础实验例2中制备），标准曲线浓度范围0-250ng/mL，标准品加入相应的孔中，样品孔加入上述获得的细胞上清（20倍稀释）孵育1h，然后用HRP标记的Protein A抗体（购自博士德，货号BA1080）作为酶标抗体孵育1h，最后加入TMB避光显色20min，终止后酶标仪检测各孔OD450nm值。实验结果如图9显示，通过IL-17A结合实验，可以确定G4-H10-MSC，说明G4-H10-MSC表达的IL-17Nb可以与IL-17A结合，而正常的间充质干细胞则不表达IL-17Nb。

基础实验例9ELISA法测定IL-17Nb阻断IL-17A与IL-17RA结合的能力

采用ACRO Biosystems（百普赛斯）公司IL-17A[Biotinylated]:IL-17RAInhibitor Screening ELISA Kit（IL-17A/IL-17RA阻断试剂盒，货号EP-139）检测G4-H10-MSC细胞阻断IL-17A/IL-17RA结合的能力。该试剂盒包被IL-17RA，以抗IL-17A的中和抗体为标准品，阻断IL-17RA与生物素化的IL-17A结合，通过检测OD450nm值判断阻断能力的强弱，阻断IL-17A/IL17RA结合能力越强，OD450nm值越低，阻断能力与OD450nm值成反比关系。将基础实验例8获得的上清进行稀释后（通过实验发现稀释5倍最佳），通过IL-17A/IL17RA阻断试剂盒检测上清中IL-17Nb阻断IL-17A/IL17RA结合的能力。

采用以下公式对IL-17A/IL17RA结合抑制率计算：

结合抑制率（%）=[OD450（阳性孔）-OD450（样品孔）]/OD450（阳性孔）×100%。

将所有样品根据说明书进行5倍稀释后，检测，结果如图10显示，正常hUC-MSC细胞无法阻断IL-17A/IL17RA的结合，而G4-H10-MSC细胞分泌的IL-17Nb可以阻断IL-17A/IL17RA的结合，稀释5倍后抑制率高达60%。

基础实验例10 干细胞稳定性研究

根据基础实验例8获得的结果（ELISA法检测IL-17Nb的表达），将基础实验例7中获得的IL-17Nb修饰的间充质干细胞G4-H10-MSC及对照的hUC-MSC以1×10⁴个/cm²接种24孔板，分别接种8孔和16孔，过夜培养后，随机选择8孔hUC-MSC更换含终浓度为2000ng/mL的G4-H10融合蛋白（基础实验例2中制备的目标抗体蛋白）的完全培养基，继续培养，分别在培养24h、48h、72h和96h收获上清，按照基础实验例8(ELISA法检测IL17Nb的表达)的方法检测上清中IL17Nb的含量。结果如图11所示，随着时间的延长，从24h到96h，hUC-MSC添加G4-H10组检测的IL17Nb含量从1986±79.90ng/mL降到了1620±37.54ng/mL，浓度逐渐降低，而IL17Nb-MSC表达的IL17Nb，随着培养时间的延长，由24h的1333±334.79增长到96h的5554±508.12ng/mL，在72h和96h，hUC-MSC添加G4-H10与IL17Nb-MSC两组之间有极显著差异（P＜0.001）。由结果可以得出，IL-17Nb-MSC可以稳定、持续地表达分泌IL-17Nb，表达浓度及稳定性均优于重组G4-H10蛋白。

实施例1代表性适应症一：类风湿关节炎动物模型构建及受试物评价结果

采用B-hIL17A转基因小鼠（百奥赛图医药科技股份有限公司）通过胶原诱导法进行类风湿关节炎（RA）模型构建。

RA模型组动物在起始日（Day1）通过尾根皮内注射接种100μg牛II型胶原蛋白(CII, Chondrex公司)和包含200μg结核分枝杆菌H37Ra的弗氏完全佐剂(CFA, Chondrex公司)的乳化剂进行初始免疫，初始免疫后第21天（Day21）接种CII和弗氏不完全佐剂(IFA)的乳化剂进行加强免疫。初次免疫后22天（Day22）将成模的RA小鼠（成模标准：RA模型临床评分≥2）随机分成4组：MSC治疗组、阳性抗体治疗组、G4-H10-MSC治疗组和模型对照组；并在分组当天分别尾静脉注射hUC-MSC（2×10⁶/只）、阳性抗体Ixekizumab（1mg/Kg）和G4-H10-MSC（2×10⁶/只）。从第20天（Day 20）到实验终点（Day 42），每隔一天评估一次体重、足爪厚度，共23天。所有动物在实验终点（Day 42）安乐死动物，取关节组织进行病理组织染色及评分。

RA模型临床评分标准：

0：正常；1：轻度的、踝关节、腕关节发红、肿胀；2：踝关节或腕关节中度发红肿胀；3：爪子严重发红、肿胀，包括指端；4、四肢最大程度发炎，包括多关节。

病理组织染色评分标准：

三组H&E染色四肢的代表性图像均由2名实验人员员采用双盲法独立评分，单项评分范围为0-5，总分为20分。（1）炎细胞浸润：0，无炎性细胞浸润；1，少量炎细胞浸润；2，轻度炎细胞浸润；3，中度炎细胞浸润；4，重度炎细胞浸润；5，极重度炎细胞浸润。（2）血管翳形成：0，无血管翳；1，少数血管翳形成；2，轻度血管翳形成（累及少于1/4的掌趾关节）；3，中度血管翳形成（累及1/4～1/2的掌趾关节）；4，重度血管翳形成（累及1/2～3/4的掌趾关节）；5，极重度血管翳形成（累及大于3/4的掌趾关节）（3）软骨侵蚀：0，无软骨侵蚀；1，轻微软骨侵蚀；2，轻度软骨侵蚀（表浅或局灶性的软骨细胞减少及胶原破坏）；3，中度软骨侵蚀（多灶性或深及软骨层1/2的软骨细胞减少及胶原破坏）；4，重度软骨侵蚀（累及软骨面1/2以上深度，一个或多个跗关节软骨面完全破坏）；5，极重度软骨侵蚀（严重的软骨细胞减少及胶原破坏，深至潮线）（4）骨质破坏：0，无骨质破坏；1，轻微骨质破坏，低倍镜下不明显；2，轻度骨质破坏（累及少于1/4的掌趾关节）；3，中度骨质破坏，明显的骨小梁及骨皮质吸收，但未及骨皮质全层（累及1/4～1/2的掌趾关节）；4，重度的骨质破坏，局部累及骨皮质全层，骨皮质变形，骨小梁吸收（累及1/2～3/4的掌趾关节）；5，极重度骨质破坏，累及骨皮质全层，骨皮质变形，骨小梁吸收（累及大于3/4的掌趾关节）。

动物体重如图12所示，加强免疫（D21）开始模型组体重与正常对照组相比显著下降，MSC治疗和G4-H10-MSC治疗组均可恢复小鼠体重，而阳性抗体组恢复小鼠体重不明显；试验终点G4-H10-MSC治疗组小鼠体重显著高于阳性抗体组。动物平均足爪厚度如图13所示，加强免疫（D21）后小鼠足爪迅速肿胀，而静脉注射hUC-MSC、阳性抗体Ixekizumab和G4-H10-MSC后，小鼠足爪厚度显著降低，其中G4-H10-MSC治疗效果显著优于阳性抗体Ixekizumab。组织病理染色结果如图14所示，模型小鼠组织炎细胞浸润、关节滑膜炎和/或血管翳形成、关节软骨破坏，关节腔消失，骨组织融合；而经治疗后发现，小鼠病理组织染色评分（图15所示）显著下降，其中G4-H10-MSC治疗（G4-H10-MSC组）效果显著优于阳性抗体Ixekizumab（阳性抗体组）和hUC-MSC治疗（hUC-MSC组）。

实施例2代表性适应症二：银屑病动物模型构建方法及构建结果

采用B-hIL17A转基因小鼠通过咪喹莫特涂抹法构建银屑病（Ps）模型构建。所有小鼠背部剃毛后，每天背部涂抹50mg咪喹莫特软膏（IMQ，明欣利迪，四川明欣药业有限公司），第一次涂抹当天记为D0，持续7天（D6）进行造模；Ps模型组随机分为四组：hUC-MSC治疗组（hUC-MSC组，2×10⁶/只）、阳性抗体Ixekizumab治疗组（1mg/Kg）、G4-H10-MSC治疗组（2×10⁶/只）和模型对照组。药物治疗组于D1和D4皮下注射给药治疗。实验过程中，每天测量动物体重，观察动物的存活情况和健康状况，对动物皮肤进行拍照，并根据皮肤的角化程度、炎性细胞浸润程度对皮肤炎症及相关指标进行皮肤临床评分。D7安乐死动物，进行相关检测：收集小鼠造模部分皮肤，利用游标卡尺测量每组动物皮肤厚度。

皮肤临床评分标准：对动物皮肤（耳部及前后爪）进行评分，根据红斑、鳞屑、厚度进行综合评分，每项指标评分均分为5个等级，为0-5分，其中0分代表无相关症状；1分代表症状轻微；2分表示症状一般；3分表示症状显著；4分表示非常显著或严重，并计算3项指标总分作为最终评分。

动物体重如图16所示，咪喹莫特造模后模型组体重与正常对照组相比显著下降，hUC-MSC治疗和G4-H10-MSC治疗组均可恢复小鼠体重，而阳性抗体组恢复小鼠体重不明显。试验终点G4-H10-MSC治疗组小鼠体重显著高于阳性抗体组。

皮肤照片和皮肤临床评分如图17-图18所示，结果表明，IMQ能够引起小鼠皮肤损伤，皮疹和脱屑程度增加，皮肤表皮增厚，组织病理学上可见以角化不全和炎症性白细胞浸润为主的真皮，表明造模成功；模型组皮肤临床评分显著升高，而皮下注射hUC-MSC、阳性抗体Ixekizumab和G4-H10-MSC后，小鼠皮肤临床评分显著降低，其中G4-H10-MSC治疗效果显著优于阳性抗体Ixekizumab。

实验终点进行皮肤厚度检测，如图19所示，发现IMQ可显著增加模型小鼠皮肤厚度，而皮下注射hUC-MSC、阳性抗体Ixekizumab和G4-H10-MSC后，小鼠皮肤厚度显著降低，其中G4-H10-MSC治疗效果显著优于阳性抗体Ixekizumab。

实施例3代表性适应症三：银屑病关节炎动物模型构建方法及构建结果

采用B-hIL17A转基因小鼠（百奥赛图医药科技股份有限公司）通过腹腔注射甘露聚糖构建银屑病关节炎（PsA）模型。取待造模小鼠，第一次腹腔注射当天记为D0，分别在D0、D4和D8进行三次腹腔注射甘露聚糖。通过三次腹腔注射甘露聚糖（SIGMA，西格玛，M7504-5G）进行造模，每次每只动物腹腔注射100mg/mL甘露聚糖，注射体积为200μL，即每次每只动物腹腔注射20mg甘露聚糖。

PsA模型组随机分为四组：hUC-MSC治疗组（hUC-MSC组，2×10⁶/只）、阳性抗体Ixekizumab治疗组（阳性抗体组，1mg/Kg）、G4-H10-MSC治疗组（G4-H10-MSC组，2×10⁶/只）和模型对照组；

药物治疗组于D3和D7静脉注射给药治疗。实验过程中，每2天测量动物体重，观察动物的存活情况和健康状况，观察并根据相关指标对动物皮肤及前后足爪进行评分。D14安乐死动物，收集小鼠外周血，分离血清后检测mIL-6、mIL-23和mTNF-α等细胞因子（试剂盒品牌均为Biolegend）。

足爪（关节）评分标准如下：0=正常；1=该爪中单指红斑、肿胀；2=该爪中两指红斑及肿胀；3=该爪中两指以上红斑及肿胀及/或踝关节肿胀。计算4只爪总评分作为最终评分。

动物体重如图20所示，甘露聚糖造模后PsA模型组体重与正常对照组相比显著下降，hUC-MSC治疗组和G4-H10-MSC治疗组均可恢复小鼠体重，而阳性抗体组恢复小鼠体重不明显，试验终点G4-H10-MSC治疗组小鼠体重显著高于阳性抗体组。

动物足爪评分和皮肤临床评分如图21-图22所示，甘露聚糖造模后PsA模型组皮肤和足爪临床评分均显著增加，阳性抗体、hUC-MSC治疗组和G4-H10-MSC治疗组均可显著降低模型动物足爪和皮肤临床评分，而G4-H10-MSC治疗组小鼠体重显著优于阳性抗体组。

炎症因子检测如图23-图25所示，甘露聚糖造模后PsA模型组动物血清中IL-6、IL-23和TNF-α等细胞因子均显著增加，而hUC-MSC治疗组和G4-H10-MSC治疗组均可显著降低模型动物血清IL-6和TNF-α水平，阳性抗体组和G4-H10-MSC治疗组均可显著降低模型动物血清IL-23水平。

以上实施例仅用于说明本发明而非限制本发明，特别是对于适应症类型，本领域技术人员在本发明公开的基础上，进行常规技术手段的替代和优化，如根据疾病与IL-17A的一定相关性推断应用于其他适应症的技术方案，同样在本发明保护的范围内。

Claims

1.一种基于单域抗体基因修饰的干细胞在制备药物中的用途，其特征在于，所述的干细胞包含、表达或分泌第一抗体和第二抗体，所述的第一抗体包含序列如SEQ ID NO: 1-3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；所述的第二抗体包含序列如SEQ ID NO: 4-6所示的HCDR4、HCDR5、HCDR6。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的第一抗体还包括SEQ ID NO:7-10所示的氨基酸序列作为FR区；所述的第二抗体还包括SEQ ID NO:11-14所示的氨基酸序列作为FR区。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的第一抗体和第二抗体直接连接或通过连接子连接。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的连接子选自(GS)_n、(GGS)_n、(GGGS)_n、(GGGGS)_n或AS(GGGGS)_n，n选自1、2、3、4、5或6。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的干细胞包含、表达或分泌：包括如SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:17-SEQ ID NO: 26所表示的的氨基酸序列的蛋白。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物用于预防或治疗炎性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病、神经系统疾病或肿瘤。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的药物用于预防或治疗炎性疾病。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的药物用于预防或治疗关节炎或银屑病。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的关节炎为类风湿性关节炎、银屑病关节炎或关节滑膜炎。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的药物用于降低炎症因子。

11.根据权利要求1-10任意一项所述的用途，其特征在于，所述的干细胞为胚胎干细胞、成体干细胞、间充质干细胞、脐带血干细胞、造血干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、皮肤干细胞或肌肉干细胞。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述干细胞分离自脐带血、脐带、胎盘、脂肪组织、皮肤、神经组织、骨髓或胚胎。

14.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物中还包括药学上可接受的辅料。