CN115698063A - 血清白蛋白结合纳米抗体组合物以及其使用方法 - Google Patents

血清白蛋白结合纳米抗体组合物以及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了用于增加重组纳米抗体的稳定性的组合物和方法。本文还公开了包含结合血清白蛋白的IL‑2多肽的重组纳米抗体及其用于治疗癌症的用途。

Description

血清白蛋白结合纳米抗体组合物以及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年3月6日提交的美国临时申请第62/986,180号的权益，所述临时申请明确地以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开涉及人血清白蛋白结合纳米抗体。
背景技术
纳米抗体(Nb)是源自骆驼科有蹄类动物仅重链抗体(VHH)的最小、完整且天然的抗原结合结构域。Nb的特征在于良好溶解性、热稳定性、组织渗透性和由于与人IgG2/3的高度序列相似性而对人的潜在低毒性；然而，它们的治疗潜力受到短T1/2-通常不到几小时的显著限制。小(大约15kDa)(没有重-轻链配对和糖基化)的Nb可作为重组DNA片段合成，以用于从大肠杆菌快速大量生产。Nb的生物工程化的简易性使得能够开发多功能剂。与IgG相似，Nb的抗原结合特异性主要通过互补决定区(CDR，IgG中的3对6)-其中CDR3为最可变“指纹”的高变环来实现。CDR环由四个高度保守的框架区组成的稳健三级核心呈现。在较小的互补位的情况下，据推测Nb可能损害对抗原接合的亲和力。几项前导结构研究表明，Nb可进入抗原上的“隐蔽”表位样腔，其中IgG可能由于空间位阻而不可接近。与这些表位的结合是通过小尺寸和“凸形”形状两者实现的，它们共同促进将CDR环插入槽中。
尽管已经针对特定靶标开发了许多Nb，但本领域仍然受到用于药物递送的高质量和多功能Nb剂的可用性的限制。虽然可以想象溶解性、热稳定性、跨物种结合和生物工程的稳健性是至关重要的，但尚不清楚其它生物物理、物理化学和结构特征是否重要以及在多大程度上重要。此外，由于生物制剂通常具有不同的治疗窗口，所以可持续且经微调的个体化半衰期对于使药物功效最大化、同时减少副作用将是最理想的。对这些因素的系统和全面评估将有助于设计用于精准医疗的下一代剂。
人血清白蛋白(HSA)是最稳定的血清蛋白，半衰期为大约3周。与主要通过肾小球滤过清除的小分子不同，HSA (67kDa)不能在肾脏中直接清除。经过持续内化，它与细胞FcRn(IgG的辅助受体)形成稳定的复合物。已经表明，HSA可通过FcRn介导的内吞作用有效地再循环，从而防止大血清蛋白常见的快速溶酶体降解。虽然尚不清楚HSA-FcRn相互作用在其中复合物再循环的内体内部的局部浓度，但内体酸性环境的抗性可能是HSA的成功再循环及其稳定的先决条件。
然而，HSA与Nb的相互作用尚未得到表征，并且在许多领域仍然需要有效的纳米抗体疗法，包括细胞因子疗法。细胞因子疗法是免疫调节的重要组成部分。白介素-2(IL-2)是对T细胞活性的稳态和调控至关重要的中枢免疫细胞因子。通过刺激细胞毒性T细胞的生长，IL-2将上调免疫应答并抑制肿瘤发展。PROLEUKIN(阿地白介素，Novartis)是人白介素2(IL-2)的重组形式，并且是第一种获批的癌症免疫疗法药物。IL-2用于治疗晚期黑素瘤和转移性肾细胞癌。据报告，此类治疗使得多达10％的携带转移性肿瘤的患者完全缓解，有时长达25年不复发。大约70％接受IL-2治疗的患者具有完全肿瘤消退。然而，IL-2的主要缺点包括其较差药代动力学、低药物功效和高毒性。由于其小尺寸(大约15kDa)，IL-2通过肾小球滤过从循环中迅速清除，在人中施用后的中值半衰期不到30分钟。因此，通常需要高剂量和重复施用(每次施用常常7小时)，这可能导致严重毒性和副作用，包括血管渗漏综合征。
对于药物递送，高质量和多功能剂的可用性是有限的。虽然可以想象溶解性、热稳定性、跨物种结合和生物工程的稳健性是至关重要的，但尚不清楚其它生物物理、物理化学和结构特征是否重要以及在多大程度上重要。此外，由于生物制剂的治疗窗口通常存在显著差异，因此最需要经微调的可持续个体化半衰期，以使药物效力最大化，同时减少副作用。
因此，需要使治疗性组合物如IL-2的效力和半衰期最大化的组合物和方法。本文公开的组合物和方法解决了这些和其它需要。
发明内容
在一些方面，本文公开了一种包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽和IL-2多肽的重组纳米抗体。在一些实施方案中，所述HSA结合多肽特异性地结合至选自由表位1、表位2、表位3和表位4组成的组的HSA表位，其中表位1包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基298-307、311、332-341和371-386，其中表位2包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基5-13、62-67、93-99和228-266，其中表位3包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基226-230和298-337，并且其中表位4包含SEQID NO:1的氨基酸残基33-38和111-145。在一些实施方案中，所述HSA结合多肽包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的氨基酸序列。本文还公开了一种包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽的纳米抗体，其中所述HSA结合多肽包含互补决定区(CDR)3，其中所述CDR3包含与SEQ ID NO:10-100中的任一个具有至少50％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的重组纳米抗体的大小小于50kDa。在一些实施方案中，所述纳米抗体还包含IL-2多肽。此类纳米抗体可出人意料地提高IL-2多肽的稳定性，同时不会显著降低纳米抗体的IL-2多肽与IL-2受体之间的亲和力。
本文显示施用本文公开的重组纳米抗体可在接受所述治疗的受试者中减小肿瘤体积并提高存活率。因此，在一些方面，本文公开了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽和IL-2多肽的重组纳米抗体。
附图说明
图1(a-h)示出HSA-Nb的鉴定和表征。图1a示出HSA-Nb的示意性结构和氨基酸组成。图1b示出circos和logo图，所述图示出CDR3的多样性。图1c示出89种不同Nb的白蛋白跨物种结合的ELISA热图。图1d示出通过表面等离子体共振，3种代表性Nb的KD(包括Ka和Kd)。图1e示出通过SPR，ELISA OD与KD亲和力之间的相关性。图1f示出HSA-Nb13复合物在各种Nb浓度下的珠粒结合测定。图1g示出通过下拉测定验证Nb交叉反应性。三种代表性Nb(Nb3、Nb6和Nb13)通过与不同物种(包括人、猴、小鼠、牛和美洲驼)的白蛋白偶联的亲和树脂进行免疫沉淀。图1h示出，通过差示扫描荧光法，Nb热稳定性的热图。
图2(a-d)示出HSA-Nb复合物的结构对接和交联。图2a示出通过结构对接鉴定的主要HSA表位。图2b示出HSA和四个主要表位的草图表示。图2c示出HSA的静电表面和表位的共定位。图2d示出基于HSA-Nb复合物的交联模型，表位的相对丰度。
图3(a-k)示出四聚体HSA-Nb复合物的整合结构表征。图3a示出由Nb13、Nb29、Nb80和HSA组成的重构四聚体复合物的尺寸排阻色谱(SEC)分析。图3b示出复合物的负染色图像。图3c示出与负染色EM重叠的复合物的杂合结构模型(最佳得分)。图3d示出HSA-FcRn复合物的X射线结构。图3e至3g示出模型上界面和交联约束的特写视图。图3h是对模型的交联满意度的总结。图3i至3k示出两个带电残基(K383和D400)的定点诱变分析，所述两个带电残基与Nb80上的相应残基形成交叉的稳定盐桥。
图4(a-d)示出人源化小鼠模型中的高通量Nb药代动力学。图4a示出用于多重PK测量的基于MS的测定的示意图。图4b示出人源化小鼠模型中22种Nb的PK分析。将22种Nb(包括20种HSA-Nb和2种非结合剂对照)的等摩尔混合物的单次大丸剂施用静脉内注射到三只动物中。在不同时间点收集血清样品，进行蛋白水解，通过LC分离所得肽，并通过轨道阱QEHFX质谱仪对这些分子及其碎片离子产物进行定量。每个数据点表示来自三种不同动物的中值Nb丰度。然后将数据拟合到双相模型中以计算Nb半衰期。图4c示出PK的分布和消除的热图总结。图4d示出PK与Nb的性质之间的相关分析。
图5(a-g)示出Duraleukin(一种新类别的Nb融合细胞因子)的开发。图5a描绘Duraleukin的示意图设计。图5b示出用于Duraleukin生产的方案。图5c示出通过差示扫描荧光法，Duraleukin的热稳定性。图5d示出Duraleukin和IL-2的体外CTLL-2细胞增殖测定。图5e示出在人血清存在下Duraluekin的体外稳定性。图5f示出DL80对HSA结合的KD亲和力测量。Ka(1/Ms)＝1.66e5；Kd(1/s)＝2.75e-5；KD＝1.66pM。图5g示出DL80对HSA结合的珠粒结合测定(pH依赖性)。HSA缀合的琼脂糖树脂用于在不同pH缓冲液(pH2-pH12)中下拉DL80。SDS PAGE上亲和分离的DL80蛋白的相对强度通过Image J进行定量。
图6(a-c)示出Duraleukin在黑素瘤小鼠模型中的体内功效的评估。图6a示出肿瘤生长曲线。使用不同的剂量/间隔将携带皮下B16F10肿瘤的C57BL/6J小鼠用TA99和Duraleukin或hIL-2的组合处理(n＝8)。PBS处理用于对照。图6b示出处理后的动物存活曲线。图6c示出肿瘤浸润免疫细胞的流式细胞术分析。
图7(a-r)(计数为Nb100和113)示出代表性HSA Nb的表面等离子体共振(SPR)测量值。记录了Ka(缔合速率)、Kd(解离速率)和亲和力KD。图7a，Nb77：Ka(1/Ms)＝5.68e6；Kd(1/s)＝7.68e-5；KD＝1.35pM。图7b，Nb29：Ka(1/Ms)＝9.73e6；Kd(1/s)＝1.9e-3；KD＝1.22nM。图7c，Nb13：Ka(1/Ms)＝2.85e5；Kd(1/s)＝5.73e-5；KD＝201pM。图7d，Nb158：Ka(1/Ms)＝1.04e5；Kd(1/s)＝3.51e-5；KD＝339pM。图7e，Nb80：Ka(1/Ms)＝1.66e5；Kd(1/s)＝2.75e-5；KD＝166pM。图7f，Nb26：Ka(1/Ms)＝3.38e5；Kd(1/s)＝6.97e-5；KD＝206pM。图7g，Nb69：Ka(1/Ms)＝2.7e5；Kd(1/s)＝1.97e-4；KD＝730pM。图7h，Nb78：Ka(1/Ms)＝2.34e5；Kd(1/s)＝3.99e-5；KD＝170pM。图7i，Nb85：Ka(1/Ms)＝1.11e6；Kd(1/s)＝5.04e-4；KD＝454pM。图7j，Nb129：Ka(1/Ms)＝1.03e6；Kd(1/s)＝1.14e-4；KD＝108pM。图7k，Nb132：Ka(1/Ms)＝3.03e5；Kd(1/s)＝5.6e-5；KD＝185pM。图7l，Nb93：Ka(1/Ms)＝1.37e6；Kd(1/s)＝1.36e-4；KD＝99pM。图7m，Nb81：Ka(1/Ms)＝8.82e4；Kd(1/s)＝1.42e-5；KD＝161pM。图7n，Nb64：Ka(1/Ms)＝3.83e5；Kd(1/s)＝2.06e-4；KD＝538pM。图7o，Nb75：Ka(1/Ms)＝1.03e6；Kd(1/s)＝1.02e-4；KD＝100pM。图7p，Nb126：Ka(1/Ms)＝6.92e6；Kd(1/s)＝1.74e-3；KD＝251pM。图7q，Nb68：Ka(1/Ms)＝2.06e6；Kd(1/s)＝2.9e-2；KD＝14nM。图7r，Nb98：Ka(1/Ms)＝1.16e6；Kd(1/s)＝2.7e-2；KD＝23nM。
图8(a-t)示出代表性HSANb的热稳定性Tm。通过差示扫描荧光法(DSF)进行测量。图8a，Nb100：Tm＝63.37℃；图8b，Nb113：Tm＝64.12℃；图8c，Nb68：Tm＝44℃；图8d Nb69：Tm＝38.02℃；图8e，Nb125：Tm＝47.07℃；图8f，Nb126：Tm＝45.89℃；图8g，Nb75：Tm＝49.34℃；图8h，Nb77：Tm＝54.29℃；图8i，Nb129：Tm＝44.12℃；图8j，Nb13：Tm＝53.42℃；图8k，Nb78：Tm＝70.52℃；图8l，Nb80：Tm＝50.82℃；图8m，Nb132：Tm＝54℃；图8n，Nb158：Tm＝59.97℃；图8o，Nb81：Tm＝42.68℃；图8p，Nb85：Tm＝53.17℃；图8q，Nb29：Tm＝42.16℃；图8r，Nb64：Tm＝45.17℃；图8s，Nb93：Tm＝61.18℃；图8t，Nb98：Tm＝64.91℃。
图9示出代表性HSA-Nb复合物的交联模型。
图10(a-d)示出四聚体Nb-HSA复合物的纯化和负染色电子显微术(EM)颗粒选择。图10a示出重构的四聚体HSA-Nb复合物的尺寸排阻色谱和SDS-PAGE分析。图10b-10d示出有/无MBP(麦芽糖结合蛋白)标签和HSA的HSA-Nb复合物的EM图像。图10b示出Nb80-Nb13-Nb29-HSA复合物；图10c示出MBP-Nb80-Nb13-Nb29-MBP-HSA复合物；图10d示出HSA。
图11(a-e)示出用于Nb PK的多重定量的新型基于碎片离子的方法的示意图。图11a是消化和LC/MS分析步骤的示意图。图11b是示出掺入纳米抗体的图表，其中深色正方形表示Nb1-MS1，深色圆圈表示Nb2-MS1，浅色正方形表示Nb3-MS1，并且浅色圆圈表示Nb4-MS1。图11c是示出的图表。图11d是分离、四极、片段化、HCD细胞和定量步骤的示意图。图11e是示出掺入纳米抗体的图表，其中深色圆圈表示Nb1-PRM，深色正方形表示Nb1-MS1，深色倒三角形表示Nb2-PRM，深色圆圈表示Nb2-MS1，空心圆圈表示Nb3-PRM，空心正方形表示Nb3-MS1，空心右侧朝上三角形表示Nb4-PRM，空心倒置三角形表示Nb4-MS1。
图12(a-c)示出来自三只不同小鼠(12a(小鼠1)、12b(小鼠2)、12c(小鼠3))的NbPK测量的准确度(中值系数变化或CV)。
图13(a-c)示出B6.Cg-Tg(FCGRT)32Dcr Albem12Mvw Fcgrttm1Dcr/MvwJ小鼠模型的验证。图13a示出通过DNA电泳，Albem12Mvw纯合小鼠的验证。图13b示出通过桑格测序和SDS-PAGE分析的Fcgrttm1Dcr纯合小鼠。图13c示出HSA在小鼠模型中的药代动力学(PK)。半衰期(慢)＝8.08(天)；半衰期(快)＝0.53(天)；R2＝0.9547。半衰期(慢)＝8.08(天)；半衰期(快)＝0.53(天)；R2＝0.9547。
图14示出人源化小鼠模型中HSA和Nb施用后的血清蛋白定量。在第7天，证实了小鼠IgG的显著增加。
图15示出IL-2(空心圆圈)和DL80(实心正方形)在野生型C57BL/6J小鼠模型中的药代动力学分析。IL-2的半衰期(慢)为0.0086；IL-2的半衰期(快速)为约2.7e-0.06。Duraleukin 80的半衰期(慢)为0.40；Duraleukin 80的半衰期(快速)为0.039。
图16示出HSA上Nb结合表位所在的四个簇。簇1(Nb80)：298-307、311、332-341和371-386(aa)；簇2(Nb13)：5-13、62-67、93-99和228-266(aa)；簇3：226-230和298-337；簇4(Nb29)：33-38和111-145。
具体实施方式
最近，通过使用骆驼科动物免疫和整合蛋白质组学流水线，鉴定了用于HSA结合的大的纳米抗体(Nb)组库。在此，使用多学科方法表达且系统性地表征了一组高质量HSA-Nb。在一些实施方案中，将几种HSA-Nb与细胞因子人IL-2组合，从而开发出高度稳定的组合物(统称为“Duraleukin”)，所述组合物可用于小鼠模型中的黑素瘤治疗。
Duraleukin被描述为具有四个突出的特征：
第一，便于生产和制造。IL-2的Nb融合物(Duraleukin)在本文中已被证明容易地在细菌中(例如在大肠杆菌细胞中)作为高度纯化的、完整的和功能性蛋白质大量生产。注意施用大剂量IL-2(PROLEUKIN(阿地白介素，Novartis))是其药物功效的先决条件。相比之下，ALBULEUKIN(Human Genome Sciences)的生产主要受限于相当昂贵的哺乳动物细胞，这限制了其实用性。
第二，易于生物工程化。Duraleukin的生物工程化简单明了。在一个实例中，在C末端融合另一种多肽药物可制成“三功能药物”。这与生物工程可能非常具有挑战性的ALBULEUKIN(Human Genome Sciences)形成鲜明对比。
第三，优化的/定制的药物开发和临床应用的突出柔性和不同体内半衰期。使用人源化白蛋白小鼠模型，本文证明不同的白蛋白Nb具有不同的体内药代动力学(PK)。这表明具有不同HSA的不同Duraleukin可具有独特的PK，其可用于优化药物功效并使药物的副作用最小化，副作用是商业药物PROLEUKIN(阿地白介素，Novartis)的主要问题。
第四，优异的效力。重组多肽继承Nb的突出物理化学性质，如热稳定性和对血清蛋白酶活性的抗性(几乎免疫)。Duraleukin的大小是ALBULEUKIN(Human Genome Sciences)的三分之一(30kDa对90kDa)，结构合理并保留了载体蛋白IL-2的全部功能。由于它们的小尺寸，Duraleukin可容易地达到药物施用的最大有效摩尔浓度，因为药物摄取能力有限。与Nb(15kDa)的小完整结构域融合不会显著影响IL-2与其受体FcRN复合物之间的相互作用，而诸如ALBULEUKIN(Human Genome Sciences)的大重组蛋白可能受到结构空间位阻的影响，特别是当涉及到相当大的庞大的IL-2受体复合物时。
因此，本文公开了提高IL-2在治疗疾病(例如癌症)中的稳定性和/或有效性的组合物，其中所述组合物是包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽和IL-2多肽的重组纳米抗体。在一些实施方案中，与天然或重组IL-2多肽相比，重组纳米抗体增加IL-2的半衰期。施用包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽和IL-2多肽的重组纳米抗体出人意料地在接受所述治疗的受试者中减小肿瘤体积并提高存活率。
本申请中使用的术语应以本领域普通技术人员的普通和典型含义来解释。然而，申请人希望给予以下术语如下文所提供的特定定义。
术语
除非上下文另外明确规定，否则如在说明书和权利要求中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数个提及物。例如，术语“细胞”包括复数个细胞，包括其混合物。
如本文所用的术语“约”在涉及诸如量、百分比等的可测量值时，意在涵盖相对于所述可测量值的±20％、±10％、±5％或±1％的变化。
向受试者“施用(Administration)”或“施用(administering)”包括向受试者引入或递送剂的任何途径。施用可通过任何合适的途径，包括口服、静脉内、腹膜内、鼻内、吸入等进行。施用包括自我施用和由另外的人施用。
术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”在本文中以广义使用并且包括多克隆抗体、单克隆抗体和双特异性抗体。除了完整免疫球蛋白分子之外，术语“抗体”还包括那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，以及免疫球蛋白分子或其片段的人形式或人源化形式。抗体通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，接着是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)并且在另一端具有恒定结构域。
抗体可使用本文所述的体外测定，或通过类似方法来测试抗体的所需活性，然后根据已知的临床测试方法来测试它们的体内治疗和/或预防活性。存在五种主要类别的人免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且若干这些类别可进一步分成子类(同种型)，例如，IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。本领域技术人员了解小鼠的可比较类别。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中也可互换使用，是指抗原结合分子(如本发明的纳米抗体)所识别的抗原或靶标上的位置。可由通过蛋白质的三级折叠来并置的连续氨基酸(“线性表位”)或不连续氨基酸形成表位。后一种表位，由至少一些非连续氨基酸产生的表位，在本文中被描述为“构象表位”。表位通常包括至少3个、并且更通常至少5个或8-10个呈独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学和二维核磁共振。参见例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，Glenn E.Morris，编辑(1996)。
术语“抗原结合位点”、“结合位点”和“结合结构域”是指结合抗原决定簇或表位的多肽(如纳米抗体)的特定元件、部分或氨基酸残基。
术语“癌症”是指表现出相对自主生长的细胞，使得它们表现出异常生长表型，其特征在于对细胞增殖的控制显著丧失(即，细胞分裂失调)。癌细胞可以是恶性的或良性的。各种癌症的实例包括但不限于黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是肾癌。
术语“CDR”和“互补决定区”可互换使用，并且是指抗体的参与结合至抗原的可变链的一部分。因此，CDR是“抗原结合位点”的一部分或者是“抗原结合位点”。在一些实施方案中，纳米抗体包含共同形成抗原结合位点的三个CDR。
如本文所用的术语“包含(comprising)”及其变型与术语“包括(including)”及其变型同义地使用并且是开放的非限制性术语。尽管本文使用术语“包含”和“包括”来描述各种实施方案，但可使用术语“基本上由……组成”和“由……组成”来代替“包含”和“包括”，以提供更具体的实施方案并且也进行了公开。
“组合物”是指具有有益生物效应的任何剂。有益生物效应包括治疗效应(例如，治疗病症或其它非期望的生理疾患)和预防效应(例如，预防病症或其它非期望的生理疾患)两者。所述术语还涵盖本文具体提及的有益剂的药学上可接受的、药理学活性的衍生物，包括但不限于细菌、载体、多核苷酸、细胞、盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“组合物”时，或者当具体鉴定特定组合物时，则应理解所述术语包括组合物本身以及药学上可接受的药理学活性的载体、多核苷酸、盐、酯、酰胺、前药、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。在一些方面，本文公开的组合物包含重组多肽，所述重组多肽包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽和IL-2多肽。
“有效量”涵盖但不限于可改善、逆转、减轻、预防或诊断医学疾患或病症(例如，癌症)的症状或病征的量。除非另外明确地或通过上下文来规定，否则“有效量”不限于足以改善疾患的最小量。疾病或病症的严重性以及治疗预防、治疗或减轻疾病或病症的能力可通过生物标志物或通过临床参数来测量，而不暗示任何限制。在一些实施方案中，术语“重组纳米抗体的有效量”是指足以预防、治疗或减轻癌症的重组纳米抗体的量。
无论是否与其它序列连接，“片段”或“功能性片段”可包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其它选定修饰，条件是与未修饰的肽或蛋白质相比，片段的活性不会显著改变或受损。这些修饰可提供一些额外的性质，如除去或添加能够二硫化物结合的氨基酸，以增加其生物寿命，改变其分泌特性等。在任何情况下，功能性片段必须具有生物活性，如结合至HSA和/或改善癌症。
本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的“半衰期”通常可被定义为所述氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度在体内例如由于通过天然机制降解序列或化合物和/或清除或鳌合序列或化合物而降低至50％所用的时间。本发明的纳米抗体、氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以任何已知的方式，如通过药代动力学分析确定。这些例如，Kenneth，A等人，Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists；Peters等人，Pharmacokinete analysis:A Practical Approach(1996)；“Pharmacokinetics”，MGibaldi和D Perron，由Marcel Dekker出版，第2修订版(1982)。
术语“同一性”或“同源性”应解释为在比对序列并且必要时引入空位以实现整个序列的最大同一性百分比，并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与所比较的相应序列的碱基或残基相同的核苷酸碱基或氨基酸残基的百分比。与另一个序列具有一定百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”的多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)是指在比较这两个序列时，一定百分比的碱基(或氨基酸)在比对时是相同的。这种比对和同源性或序列同一性百分比可使用本领域中已知的软件程序来确定。这种比对可使用例如Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来提供，通过如比对程序(DNAstar公司)的计算机程序来方便地实现。
如本文所用的术语“增加的”或“增加”一般意指增加统计学上显著的量；为了避免任何疑问，“增加的”意指与参考水平相比至少10％的增加，例如与参考水平相比至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的增加，或多达并包括100％的增加，或介于10％-100％之间的任何增加，或与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加，或介于2倍与10倍或更大之间的任何增加。
如本文所用，术语“纳米抗体”、“VHH”、“VHH抗体片段”和“单结构域抗体”被无差别地使用，并且表示在没有任何轻链的骆驼科中发现的类型的抗体的单一重链的可变结构域，如PCT公布号WO 94/04678中描述的源自骆驼科的那些，所述公布以引用的方式整体并入本文。
如本文所用，“可操作地连接”是指多肽区段在单个多肽链内的排列，其中单独多肽区段可以是但不限于蛋白质、其片段、连接肽和/或信号肽。术语可操作地连接可指不同单独多肽在单一多肽或其片段内直接融合，其中不同区段之间没有插入氨基酸，以及当单独多肽通过包含一个或多个插入氨基酸的“接头”彼此连接时。
如本文所用的术语“减少的(reduced)”、“减少(reduce)”、“减少(reduction)”或“降低(decrease)”通常意指降低统计上显著的量。然而，为了避免疑问，“减少的”意指与参考水平相比减少至少10％，例如与参考水平相比减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或多达并包括100％的减少(即与参考样品相比不存在的水平)，或介于10％-100％之间的任何减少。
如本文所用的术语“核酸”意指由核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)组成的聚合物。如本文所用的术语“核糖核酸”和“RNA”意指由核糖核苷酸组成的聚合物。如本文所用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”意指由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用并且是指任何长度的聚合形式核苷酸，无论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针以及引物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则可在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可被非核苷酸组分间断。可在聚合后如通过与标记组分缀合而进一步修饰多核苷酸。所述术语也指双链和单链分子。除非另有说明或要求，作为多核苷酸的本发明的任何实施方案涵盖双链形式和已知或预测构成双链形式的两个互补单链形式两者。
术语多肽以其最广泛意义使用以指两个或更多个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚单位可通过肽键连接。在另一个实施方案中，亚单位可通过其它键，例如酯、醚等来连接。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体两者，以及氨基酸类似物和肽模拟物。如果肽链较短，则三个或更多个氨基酸的肽通常称为寡肽。如果肽链较长，则肽通常被称为多肽或蛋白质。
“药学上可接受的载体”(有时称为“载体”)是指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括可用于兽医和/或人类药物或治疗用途的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(如油/水或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。
如本文所用，术语“载体”涵盖任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域众所周知的用于药物制剂的其它材料。用于在组合物中使用的载体的选择将取决于组合物的预期施用途径。含有这些材料的药学上可接受的载体和制剂的制备在例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第21版，编辑University of theSciences in Philadelphia，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA，2005中进行了描述。生理学上可接受的载体的实例包括盐水、甘油、DMSO、缓冲液如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液以及其它有机酸的缓冲液；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子类，如钠；和/或非离子型表面活性剂类，如TWEENTM(ICI，Inc.；Bridgewater，New Jersey)、聚乙二醇(PEG)以及PLURONICSTM(BASF；Florham Park，NJ)。为了提供用于所需治疗性治疗的此类剂量的施用，本文公开的组合物可有利地包含基于包含载体或稀释剂的总组合物的重量介于约0.1重量％与99重量％之间的一种或多种主题化合物的总量。
关于多肽使用的“重组”在本文中是指两种或更多种多肽的组合，所述组合不是天然存在的。
术语“特异性”是指特定抗原结合分子(如本发明的纳米抗体)可结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。具有低特异性的纳米抗体通过单个抗原结合位点或结合结构域与多个不同的表位结合，而具有高特异性的纳米抗体通过单个抗原结合位点或结合结构域与一个或一些表位结合。在一些实施方案中，一些表位是相似或高度相似的，例如跨物种表位。如本文所用，如本文关于纳米抗体所用的术语“特异性地结合”是指与其它表位相比，纳米抗体对表位的优先结合。特异性结合可取决于结合亲和力和进行结合的条件的严格性。在一个实例中，当在严格条件下存在高亲和力结合时，纳米抗体特异性地结合表位。在一些实施方案中，本文所述的HSA结合多肽或纳米抗体特异性地结合至人血清白蛋白。
术语“受试者”在本文定义为包括动物如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(例如，人)、奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在一些实施方案中，受试者是人。
“治疗有效量”是指研究者、兽医、医生或其它临床医生所寻求的在一段时间内将引发组织、系统、动物或人的生物或医学应答的组合物如包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽和IL-2多肽的重组纳米抗体的量。在一些实施方案中，所需的应答是减小肿瘤大小、减轻癌症(例如，黑素瘤)和/或相关症状。在其它实施方案中，所需的应答是抗肿瘤免疫应答的增加，包括例如，抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤细胞和/或B细胞的激活，和/或受试者中肿瘤抗原特异性抗体的水平升高。在一些情况下，在数天、数周或数年的时间段内向受试者施用多个剂量的组合物后实现所需的生物学或医学应答。治疗有效量将根据组合物、病症或疾患及其严重性、施用途径、施用时间、排泄速率、药物组合、治疗医师的判断、剂型以及待治疗受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和/或饮食而变化。如本文所述的包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽和IL-2多肽的重组纳米抗体的治疗有效量可由本领域普通技术人员确定。
症状的治疗性显著减轻是与对照或未治疗的受试者相比，测量参数的例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％或更多。测量的或可测量的参数包括临床上可检测的疾病标志物，例如生物标志物的水平升高或降低，如肿瘤大小减小、抗肿瘤免疫应答增加，包括例如抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤细胞和/或B细胞的激活、受试者的循环和/或肿瘤中肿瘤抗原特异性抗体的水平升高和/或受试者的存活期延长。应理解，如本文公开的组合物和制剂的总每日用量将由主治医师在合理医学判断范围内决定。所需的确切量将根据诸如所治疗的疾病的类型而变化。
如本文所用的术语“治疗(treat/treating/treatment)”以及其语法变型包括部分或完全延迟、减缓、减轻癌症或疾患的一种或多种伴随性症状或降低其强度和/或减缓、减轻或阻碍癌症的一种或多种原因。根据本发明的治疗可预防性地、防治性地、姑息地或矫正地应用。在一些实施方案中，治疗是肿瘤大小减小。在一些实施方案中，治疗是癌症转移或癌症病变减少。在一些实施方案中，治疗是肿瘤数量减少。
预防性组合物在发作前(例如，在癌症的明显迹象之前)、早期发作期间(例如，在癌症的初始体征和症状时)、在癌症的确定发展后或在癌症晚期施用于受试者。预防性施用可在癌症出现之前的数分钟至数月内进行。
组合物
本文公开了包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽和IL-2多肽的重组纳米抗体，其中所述HSA结合多肽特异性地结合至HSA表位。如上文所论述，这组重组纳米抗体在本文中已显示出出人意料地有效延长IL-2多肽的半衰期。在一些实施方案中，与不是纳米抗体的一部分或未连接至纳米抗体的IL-2相比，纳米抗体的IL-2多肽与IL-2受体之间的亲和力没有显著降低或没有降低。
关于纳米抗体的人血清白蛋白部分，“血清白蛋白”是脊椎动物血液中的一种球状蛋白。血清白蛋白由肝脏产生。“人血清白蛋白”或“HSA”在本文中是指合成和水解环状腺苷5'-二磷酸-核糖并由ALB基因编码的多肽。在一些实施方案中，HSA多肽是如下在一个或多个公共可用数据库中鉴定的：HGNC：399，Entrez Gene：213，Ensembl：ENSG00000163631，OMIM：103600，UniProtKB：P02768。在一些实施方案中，HSA多肽包含SEQ ID NO:1的序列，或与SEQ ID NO:1具有等于或大于约80％、约85％、约90％、约95％或约98％同源性的多肽序列，或包含SEQ ID NO:1的一部分的多肽。SEQ ID NO:1的HSA多肽可代表成熟HSA的未成熟或预加工形式，并且因此，本文包括SEQ ID NO:1中HSA多肽的成熟或加工部分。
如上所述，“表位”是抗原结合分子(如本发明的纳米抗体)所识别的抗原或靶标上的位置。术语“表位”包括线性表位和构象表位两者。图16示出HSA上的若干表位，并且将这些表位称为“簇”。
因此，在一些方面，本文公开了包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽和IL-2多肽的重组纳米抗体，其中所述HSA结合多肽特异性地结合至选自由表位1、表位2、表位3和表位4组成的组的HSA表位，其中表位1包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基298-307、311、332-341和371-386，其中表位2包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基5-13、62-67、93-99和228-266，其中表位3包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基226-230和298-337，并且其中表位4包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基33-38和111-145。在一些实施方案中，HSA结合多肽特异性地结合至包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基298-307、311、332-341和371-386的HSA表位。在一些实施方案中，HSA结合多肽特异性地结合至包含SEQ ID NO:1的5-13、62-67、93-99和228-266的HSA表位。在一些实施方案中，HSA结合多肽特异性地结合至包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基33-38和111-145的HSA表位。在一些实施方案中，HSA结合多肽特异性地结合至包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基298-307、311、332-341和371-386的HSA表位。
应当理解，抗原结合分子(例如，本发明的HSA结合多肽、纳米抗体)的特异性可基于亲和力和/或亲合力来确定。由抗原与抗原结合分子解离的平衡常数(KD)表示的亲和力是用于抗原决定簇与抗原结合分子上的抗原结合位点之间的结合强度的量度：KD值越小，抗原决定簇与抗原结合分子之间的结合强度越强(可替代地，亲和力还可表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD)。用于测定亲和力的方法是本领域普通技术人员众所周知的。亲合力是抗原结合分子(如本发明的HSA结合多肽和纳米抗体)与相关抗原之间的结合强度的量度。亲合力涉及抗原决定簇与抗原结合分子上的其抗原结合位点之间的亲和力以及存在于抗原结合分子上的相关结合位点的数目两者。通常，抗原结合蛋白(如本发明的HSA结合多肽和纳米抗体)将以10-5至10-12摩尔/升或更小以及优选10-7至10-12摩尔/升或更小以及更优选10-8至10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105至1012升/摩尔或更大以及优选107至1012升/摩尔或更大以及更优选108至1012升/摩尔的缔合常数(KA))结合至其抗原。在一些实施方案中，Ka(缔合速率，1Ms)是约105、106、107、108、109、1010或1011。在一些实施方案中，Ka是约107。在一些实施方案中，Kd(解离速率，s)是约10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10或10-11。在一些实施方案中，KD是约10-7。在一些实施方案中，本文公开的抗原结合蛋白以小于约10-9摩尔/升的KD结合至其抗原。任何大于10μM的KD值通常被认为指示非特异性结合。如本领域普通技术人员将清楚的，解离常数可为实际解离常数或表观解离常数。
在一些实施方案中，纳米抗体的HSA结合多肽特异性地结合至人HSA。在一些实施方案中，纳米抗体的HSA结合多肽特异性地结合至人HSA和小鼠血清白蛋白。在一些实施方案中，纳米抗体结合的特异性可归因于或主要归因于纳米抗体的CDR3区。
因此，在一些实施方案中，纳米抗体的HSA结合多肽包含互补决定区(CDR)3，其中所述CDR3包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ IDNO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:99或SEQ ID NO:100具有至少50％相似性的氨基酸序列。
“50％相似性”计算如下：
残基组：氨基酸残基根据其生物物理性质分组如下：
组1：A、V、I、L、F、M、W、P→V(疏水性残基)
组2：S、G、C、N、Q、Y、T→T(极性残基)
组3：K、R、H→R(正电荷残基)
组4：D、E→E(负电荷残基)
Seq_1是选自由SEQ ID NO:10至100组成的组的序列。
Seq_2是输入序列
1.将氨基酸表示为一组残基
2.对于两个序列，生成4-聚体集合Set_1、Set_2
3.计算得分＝(Set1∩Set2)/(Set_1)
实例：
Seq_1＝DRVLYWSCGLYSTSDDV
Seq_2＝AGGGGLYKIATQYDY(输入序列)
转换为残基组：
Seq_1＝ERVVTVTTTVTTTTEEV
Seq_2＝VTTTTVTRVVTTTET
生成4-聚体集合：
Set_1＝{'ERVV','RVVT'，'TEEV'，'TTEE'，'TTTE'，'TTTT'，'TTTV'，'TTVT'，'TVTT'，'VTTT'，'VTVT'，'VVTV'}
Set_2＝{'RVVT',
'TRVV'，'TTET'，'TTTE'，'TTTT'，'TTTV'，'TTVT'，'TVTR','VTRV'，'VTTT','VVTT'}
Set_1∩Set_2＝{'RVVT'，'TTTE'，'TTTT'，'TTTV'，'TTVT'，'VTTT'}
得分＝0.5
因此，基于得分为0.5，Seq_2被认为是Seq_1的50％相似性。
在本公开中，“得分阈值≥0.5：即”是指所有氨基酸序列(纳米抗体的CDR3指纹序列)与SEQ ID NO:10至100中列出的91个CDR3序列具有等于或大于50％相似性(包括例如至少60％相似性、至少65％相似性、至少70％相似性、至少75％相似性、至少80％相似性、至少85％相似性、至少90％相似性、至少95％相似性、至少98％相似性或至少99％相似性)。
在一些实施方案中，纳米抗体的HSA结合多肽包含互补决定区(CDR)3，所述互补决定区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ IDNO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100。
因此，在一些实施方案中，纳米抗体的HSA结合多肽包含CDR3，所述CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100，其中所述CDR3特异性地结合至选自由表位1、表位2、表位3和表位4组成的组的HSA表位，其中表位1包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基298-307、311、332-341和371-386，其中表位2包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基5-13、62-67、93-99和228-266，其中表位3包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基226-230和298-337，并且其中表位4包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基33-38和111-145。在一些实施方案中，纳米抗体的HSA结合多肽包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的氨基酸序列。
关于纳米抗体的IL-2部分，IL-2是通过其与细胞表面上的IL-2受体的结合而参与B淋巴细胞、T淋巴细胞和自然杀伤细胞的激活、增殖和存活的白介素。“IL-2”在本文中是指合成和水解环状腺苷5'-二磷酸-核糖并且在人中由IL2基因编码的多肽。在一些实施方案中，IL-2多肽是如下在一个或多个公共可用数据库中鉴定的：HGNC：6001，Entrez Gene：3558，Ensembl：ENSG00000109471，OMIM：147680，UniProtKB：P60568。在一些实施方案中，IL-2多肽包含SEQ ID NO:5的序列，或与SEQ ID NO:5具有等于或大于约80％、约85％、约90％、约95％或约98％同源性的多肽序列，或包含SEQ ID NO:5的一部分的多肽。SEQ IDNO:5的IL-2多肽可代表成熟IL-2的未成熟或预加工形式，并且因此，本文包括SEQ ID NO:5中HSA多肽的成熟或加工部分。
因此，在一些实施方案中，IL-2多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能片段。本文应理解，IL-2的“功能片段”是指IL-2的具有生物活性性质(包括例如，与IL-2受体结合和/或激活NK细胞、B和/或T淋巴细胞)的片段。在一些实施方案中，HSA结合多肽通过接头连接至IL-2多肽。在一些实施方案中，接头包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一些实施方案中，IL-2多肽是重组人IL-2多肽，包括但不限于阿地白介素。阿地白介素可在氨基酸位置125处用丝氨酸取代半胱氨酸。在一些实施方案中，阿地白介素包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列。在一些实施方案中，阿地白介素是PROLEUKIN(Novartis)。
因此，在一些实施方案中，本文公开了包含HSA结合多肽和IL-2多肽的重组纳米抗体，其中所述HSA结合多肽包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的氨基酸序列，其中所述IL-2多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能片段，其中所述HSA结合多肽通过接头连接至所述IL-2多肽，并且其中所述接头包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与天然IL-2或其它IL-2如ALBULEUKIN(Human GenomeSciences)相比，纳米抗体具有增加的热稳定性和/或增加的对血清蛋白酶活性的抗性。在一些实施方案中，与天然IL-2或其它IL-2如ALBULEUKIN(Human Genome Sciences)相比，纳米抗体更快地达到体内最大有效摩尔浓度。
在一些实施方案中，任何前述方面的重组纳米抗体小于约50kDa，其可例如小于约45kDa、小于约40kDa、小于约35kDa或小于约30kDa。在一些实施方案中，任何前述方面的重组纳米抗体包含选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与天然IL-2或其它IL-2如ALBULEUKIN(Human GenomeSciences)相比，重组纳米抗体在纳米抗体的IL-2多肽部分与IL-2受体之间具有大约相同的亲和力或增加的亲和力。IL-2受体是具有三个亚基，通常称为α亚基(或IL-2Rα或CD25)、β亚基(或IL-2Rβ或CD122)和γ亚基(或IL-2γ，共同γ链，或CD132)的异源三聚体受体。β和γ亚基形成与IL-2具有中等亲和力结合的复合物(Kd大约10-9M)；而α、β和γ亚基形成与IL-2的高亲和力IL-2受体结合(Kd大约10-11M)。在一些实施方案中，重组纳米抗体在纳米抗体的IL-2多肽部分与IL-2受体之间具有大约相同的亲和力或增加的亲和力，所述IL-2受体包含例如α亚基、β亚基和γ亚基，或α、β和γ亚基。在一些实施方案中，重组纳米抗体在纳米抗体的IL-2多肽部分与IL-2受体之间具有大约相同的亲和力或增加的亲和力，其中所述IL-2受体包含α、β和γ亚基。
在本文中应理解，在酸性pH下的亲和力与消除速率密切相关(斯皮尔曼ρ＝0.78)，其次是在中性pH下的亲和力(特别是解离速率)。因此，缓慢的结合解离速率和酸性pH依赖性相互作用两者对于延长纳米抗体-HSA-FcRn三元复合物在内体中的稳定性是重要的。在一些实施方案中，重组纳米抗体的HSA结合多肽在约3.5至约7.5范围内的pH下以结构稳定的形式特异性地结合至HSA。
天然IL-2在人中具有大约小于30至60分钟的半衰期。通过使用重组纳米抗体靶向内源性人血清白蛋白可延长IL-2的半衰期。因此，在一些实施方案中，与天然或非纳米抗体重组IL-2多肽或对照纳米抗体相比，如本文所述的重组IL-2纳米抗体具有至少50倍(例如，至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍或至少1000倍)的半衰期。在一些实施方案中，与重组人IL-2如阿地白介素相比，本文所述的重组IL-2纳米抗体具有至少50倍(例如，至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍或至少1000倍)的半衰期。在一些实施方案中，与重组人IL-2如ALBULEUKIN(Human Genome Sciences)(HSA/IL-2融合蛋白)相比，本文所述的重组IL-2纳米抗体具有至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的半衰期。
在一些方面，本文公开了包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽的纳米抗体，其中所述HSA结合多肽包含互补决定区(CDR)3，其中所述CDR3包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ IDNO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ IDNO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99或SEQ ID NO:100具有至少50％相似性(包括例如，至少60％相似性、至少65％相似性、至少70％相似性、至少75％相似性、至少80％相似性、至少85％相似性、至少90％相似性、至少95％相似性、至少98％相似性或至少99％相似性)的氨基酸序列。相似性如上文中所描述进行计算。
在一些方面，本文公开了包含人血清白蛋白结合多肽(HSA)的多肽，其中所述HSA结合多肽包含互补决定区(CDR)3，其中所述CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99和SEQ ID NO:100。
在一些实施方案中，任何前述方面的重组纳米抗体或多肽被配制在药学上可接受的载体中。
治疗方法
本文提供了治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文所述的重组纳米抗体。本公开证明了出人意料的发现，即施用治疗有效量的包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽和IL-2多肽的重组纳米抗体导致癌症的治疗。
因此，本文包括治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的重组纳米抗体，其中所述纳米抗体包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽和IL-2多肽，其中所述HSA结合多肽特异性地结合至HSA表位，其中所述HSA表位选自由表位1、表位2、表位3和表位4组成的组，其中表位1包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基298-307、311、332-341和371-386，其中表位2包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基5-13、62-67、93-99和228-266，其中表位3包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基226-230和298-337，并且其中表位4包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基33-38和111-145。
在所述方法的一些实施方案中，纳米抗体的HSA结合多肽部分特异性地结合至包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基298-307、311、332-341和371-386的HSA表位。在一些实施方案中，HSA结合多肽特异性地结合至包含SEQ ID NO:1的5-13、62-67、93-99和228-266的HSA表位。在一些实施方案中，HSA结合多肽特异性地结合至包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基33-38和111-145的HSA表位。在一些实施方案中，HSA结合多肽特异性地结合至包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基298-307、311、332-341和371-386的HSA表位。
可使用本文所述的方法治疗的癌症的实例包括但不限于黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是肾癌。
在一些实施方案中，本文所述的重组纳米抗体的施用减少转移，减慢和/或阻止肿瘤生长，减小肿瘤大小，促进T细胞和NK细胞的激活、增殖和细胞毒性功能，增加抗肿瘤抗体的水平，延长受试者的存活期，和/或提高存活率。应理解并在本文中考虑，本文使用的术语“增加”、“促进”、“延长”和“减少”、“减小”是指与受试者治疗前相比或与一般或研究群体中这种症状的发生率相比的增加或减少。
在所述方法的一些实施方案中，任何前述方面的HSA结合多肽包含互补决定区(CDR)3，其中所述CDR3包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99或SEQ ID NO:100具有至少50％相似性(包括例如，至少60％相似性、至少65％相似性、至少70％相似性、至少75％相似性、至少80％相似性、至少85％相似性、至少90％相似性、至少95％相似性、至少98％相似性或至少99％相似性)的氨基酸序列。
“50％相似性”计算如下：
残基组：氨基酸残基根据其生物物理性质分组如下：
组1：A、V、I、L、F、M、W、P→V(疏水性残基)
组2：S、G、C、N、Q、Y、T→T(极性残基)
组3：K、R、H→R(正电荷残基)
组4：D、E→E(负电荷残基)
Seq_1是选自由SEQ ID NO:10至100组成的组的序列。
Seq_2是输入序列
1.将氨基酸表示为一组残基
2.对于两个序列，生成4-聚体集合Set_1、Set_2
3.计算得分＝(Set1∩Set2)/(Set_1)
实例：
Seq_1＝DRVLYWSCGLYSTSDDV
Seq_2＝AGGGGLYKIATQYDY(输入序列)
转换为残基组：
Seq_1＝ERVVTVTTTVTTTTEEV
Seq_2＝VTTTTVTRVVTTTET
生成4-聚体集合：
Set_1＝{'ERVV','RVVT'，'TEEV'，'TTEE'，'TTTE'，'TTTT'，'TTTV'，'TTVT'，'TVTT'，'VTTT'，'VTVT'，'VVTV'}
Set_2＝{'RVVT',
'TRVV'，'TTET'，'TTTE'，'TTTT'，'TTTV'，'TTVT'，'TVTR','VTRV'，'VTTT','VVTT'}
Set_1∩Set_2＝{'RVVT'，'TTTE'，'TTTT'，'TTTV'，'TTVT'，'VTTT'}
得分＝0.5
因此，基于得分为0.5，Seq_2被认为是Seq_1的50％相似性。
在本公开中，“得分阈值≥0.5：即”是指所有氨基酸序列(纳米抗体的CDR3指纹序列)与SEQ ID NO:10至100中列出的91个CDR3主序列具有等于或大于50％相似性(包括例如至少60％相似性、至少65％相似性、至少70％相似性、至少75％相似性、至少80％相似性、至少85％相似性、至少90％相似性、至少95％相似性、至少98％相似性或至少99％相似性)。
在所述方法的一些实施方案中，任何前述方面的HSA结合多肽包含互补决定区(CDR)3，所述互补决定区包含选自由SEQ ID NO:10至100组成的组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括施用治疗有效量的重组纳米抗体，所述重组纳米抗体包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽和IL-2多肽，其中所述HSA结合多肽包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，纳米抗体的IL-2多肽部分包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其功能片段。在一些实施方案中，HSA结合多肽通过接头连接至IL-2多肽。在一些实施方案中，接头包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在所述方法的一些实施方案中重组纳米抗体小于约50kDa，其可例如小于约45kDa、小于约40kDa、小于约35kDa或小于约30kDa。在一个实例中，重组多肽包含选自由SEQID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，与天然IL-2多肽、阿地白介素(例如，PROLEUKIN，Novartis)或ALBULEUKIN(Human Genome Sciences)相比，重组纳米抗体在受试者中具有约10倍、约20倍、约30倍、约40倍、50倍、约100倍、约200倍、约300倍、约400倍、约500倍、约600倍、约700倍、约800倍、约900倍或约1000倍的半衰期。
因此，在一些实施方案中，与施用天然IL-2多肽、阿地白介素或ALBULEUKIN(HumanGenome Sciences)的给药频率相比，重组纳米抗体的给药频率是约2倍低、约3倍低、约4倍低、约5倍低、约6倍低、约7倍低、约8倍低、约9倍低、约10倍低、约15倍低、约20倍低、约30倍低、约40倍低、约50倍低、约80倍或更低、约100倍或更低、约150倍或更低、约200倍或更低、约300倍或更低、约500倍或更低、约800倍或更低或约1000倍低。
任何前述方面的重组纳米抗体的给药频率包括但不限于至少每月一次、每三周一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、每天一次、或每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次或每天九次。在一些实施方案中，每次施用之间的间隔小于约2个月、小于约1个月、小于约3周、小于约2周或小于约1周，如小于约6、5、4、3、2或1天中的任一个。在一些实施方案中，重组纳米抗体的给药频率包括但不限于至少每天一次、每天两次或每天三次。在一些实施方案中，每次施用之间的间隔小于约48小时、约36小时、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时或约7小时。在一些实施方案中，每次施用之间的间隔小于约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时或约6小时。在一些实施方案中，每次施用之间的间隔是恒定的。例如，可每天、每两天、每三天、每四天、每五天或每周一次进行施用。施用也可以是连续的，并且可调整以将重组纳米抗体的水平维持在任何所需和指定的范围内。
本发明显示本文所述的重组纳米抗体可延长IL-2的半衰期。在一些实施方案中，与天然IL-2多肽或ALBULEUKIN(Human Genome Sciences)相比，重组纳米抗体可增加IL-2的治疗效应的持续时间和/或减少必须施用的IL-2的量。因此，作为重组纳米抗体的一部分的IL-2的治疗有效剂量的量可小于推荐用于一剂IL-2(例如，天然IL-2多肽或ALBULEUKIN(Human Genome Sciences))的量。例如，如果IL-2的传统推荐剂量是X量，则纳米颗粒或重组多肽组合物可包含约0.9X、约0.8X、约0.7X、约0.6X、约0.5X、约0.4X、约0.3X、约0.2X或约0.1X的量的IL-2。在一些实施方案中，这些较低治疗有效剂量的IL-2可减少IL-2的副作用(如果有的话)，和/或降低受试者在施用一段时间后对IL-2的耐药性的可能性。
所公开的方法可在癌症发作之前的任何时间进行。在一些方面，所公开的方法可在癌症发作之前60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1年；12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个月；30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3天；60、48、36、30、24、18、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2小时；或癌症发作之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、90、105、120分钟；3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、24、30、36、48、60小时；3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、45、60、90天或更多天；4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月；60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1年使用。所公开的方法可在癌症的任何阶段，包括癌症的0期、I期、II期、III期和IV期进行。
本文所述的重组纳米抗体可呈任何合适的剂型。剂型可适于通过任何适当途径的施用。适当途径包括但不限于口服(包括经颊或舌下)、直肠、硬膜外、颅内、眼内、吸入、鼻内、局部(包括经颊、舌下或经皮)、阴道、尿道内、肠胃外、颅内、皮下、肌内、静脉内、腹膜内、皮内、骨内、心内、关节内、静脉内、鞘内、玻璃体内、脑内、齿龈、龈下、脑室内和皮内。此类制剂可通过本领域已知的任何方法来制备。
本文公开的化合物和组合物在治疗、抑制、减轻、减少、改善和/或预防受试者的癌症和/或转移方面是有效的，包括向受试者施用治疗有效量的任何前述方面的化合物或任何前述方面的药物组合物。在一些实例中，癌症选自由以下组成的组：淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿、霍奇金氏病、骨髓性白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈鳞状细胞癌、肺癌如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、成神经细胞瘤/成胶质细胞瘤、卵巢癌、皮肤癌、肝癌、黑素瘤、口腔、咽、喉和肺的鳞状细胞癌、宫颈癌、乳腺癌、上皮癌、肾癌、泌尿生殖器癌、食道癌、头颈癌、大肠癌、造血癌症、睾丸癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌以及胰腺癌。
在一些实施方案中，任何前述方面的重组纳米抗体被配制在药学上可接受的载体中。
实施例
以下实施例在下文中列出，以说明根据所公开主题的组合物、方法和结果。这些实施例并不意图包括本文所公开主题的所有方面，而是示出代表性方法和结果。这些实施例并不意图排除对于本领域技术人员而言显而易见的本发明的等效方案和变体。
实施例1：HSA-Nb的系统表征。
使用His-钴树脂从大肠杆菌表达并纯化了89种具有独特CDR3序列的重组可溶性纳米抗体(Nb)。Nb的示意图及其在CDR环上的氨基酸组成在图1a中呈现。这些Nb具有高度多样化的CDR3序列，并且在物理化学性质(包括等电点、疏水性和形成分子内二硫化物的CDR3半胱氨酸(其对热稳定性是重要的))方面差异很大(图1b)。比对CDR3氨基酸并计算每个位置的发生率以生成序列网络标识(图1b)。进行酶联免疫吸附测定(ELISA)以评估Nb与包括人、猴和小鼠的不同物种的白蛋白的结合的相对亲和力。虽然所有89种Nb都结合HSA，但观察到超过三个数量级的O.D.亲和力。令人感兴趣地，少于50％的HSA-Nb结合高度保守的食蟹猴白蛋白，并且仅大约9％(8种Nb)可明显与小鼠白蛋白交叉反应。虽然HSA特异性Nb展现突出特异性，但这些跨物种结合剂也可用于相应动物模型中的实验。
随机选择20种跨越不同ELISA范围的HSA-Nb，以通过表面等离子体共振(SPR)仔细确定它们的KD亲和力(Kon和Koff两者)。75％(15/20)的所选择Nb为亲和力成熟的，获得对HSA结合的亚nM亲和力，但具有独特的、通常不同的结合和解离动力学(图1d)。例如，Nb 126的Koff为1.7x103(1/s)，比Nb 26快两个数量级；然而，由于解离速率不同，两者获得相似的KD(分别为251pM和206pM)。其它Nb，如Nb 77(13pM)、Nb 13(201pM)和Nb 80(166pM)展现快速缔合速率和缓慢解离速率。进行珠粒结合测定以确认SPR测量(图1f)。此外，在计算的ELISA亲和力与SPR KD之间发现了良好相关性(R2＝0.78，p<0.001)(图1e)。白蛋白的跨物种结合通过珠粒结合测定得到证实(图1g)。使用差示扫描量热法(DSC)评估20种HSA-Nb的热稳定性。观察到从30℃至70℃的广泛范围的解链温度(图1h，图8)。总之，这一丰富组库是由非常高质量且多样化的Nb组成的。
实施例2.通过交联和建模揭示的HSA免疫原性的景观。
体液免疫的基本特征是它能够产生大量抗体来识别任何暴露的外源性结构，尽管支持这种普遍性的结构基础仍有待充分理解。在此，为了更好地了解免疫原性的景观和性质，采用快速对接方法来鉴定表位(图2a)，随后通过化学交联和质谱(MS)进行验证(CXMS，图2b，图9)。学习了若干特征。1)尽管HSA-Nb的CDR3序列和其它物理化学性质高度不同，但仅鉴定了四种主要表位(图2a-2d和图16，从而表明存在免疫显性。2)表位对哺乳动物免疫系统具有高度选择性以避免人与骆驼科之间的共享序列。3)表面静电荷和表位形状是重要的。
实施例3.四聚体HSA-Nb复合物的杂合结构表征。
为了进一步验证线性表位并更好地了解免疫原性的结构基础，进行了评估以确定由HSA和对应于不同主要表位的3种代表性Nb(Nb 80、13和29)组成的四聚体复合物的杂合结构。首先，采用尺寸排阻色谱法(SEC)来确认3种Nb不共占，即它们不竞争HSA相互作用(图3a)；如图3a所示，在添加每种Nb后观察到明显的尺寸变化。通过负染色电子显微术(EM)分析复合物的均质级分(图3b，图10b至10d)。将大约22,000个EM粒子平均化以重建3D密度图(图3b-3c)。然后计算结构模型，并使用交联筛选最低能量模型以限制Nb的取向和定位。通过同时满足EM、交联约束和诱变来验证最终模型(图3e-3h)。
四聚体复合物的总体结构证实主要表位，并且让人想起一棵圣诞树，其中HSA的“松树”在不同位置装饰有三种构象Nb“礼物”。除了总体架构之外，还有一些观察结果。1)Nb不与HSA FcRn结合位点共占以干扰FcRn介导的内吞作用，这是对HSA稳定性至关重要的过程。2)证实了表位腔与Nb的凹形互补位之间的良好互补性。令人感兴趣地，形状互补性与其亲和力相关，最高的Nb 80(160pM)匹配良好，而最低的Nb 29(约1nM)匹配较差。重要的是，这些Nb都没有与报告的HSA-Nb(#5VNW，大约450nM KD)共定位。
在界面上观察到丰富的疏水性和带电残基，这可解释高亲和力。为了进一步研究这些相互作用，使HSA上的两个带电残基(K383和E400)发生突变。基于本文描述的模型，这些残基可形成两个交叉的稳定盐桥，在Nb CDR上具有各自相反的电荷，以更好地模拟骆驼科残基(图3i和图3j)。令人感兴趣地，虽然一个突变E400R显著削弱了Nb 80-HSA相互作用，但双突变体K383D:E400R完全消除了这种强相互作用(图3k)，从而进一步证实了本文描述的模型的准确性。图3j中所示的序列是YETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEF(SEQ ID NO:101)和YEATLEDCCAKDDPHACYATVFDKL(SEQ ID NO:102)。
实施例4.用于多重Nb药代动力学分析的准确MS测定的开发。
然后开发了一种新的MS测定，以实现对Nb的高通量、准确和特异性PK分析，同时减少在大量动物之间进行比较的偏差和挑战。无标记、基于碎片离子的MS方法对于检测血清中的Nb具有良好线性(图11a-11e)。由于这些HSA-Nb中的大多数不与小鼠白蛋白交叉反应，因此选择人源化白蛋白小鼠模型(Tg32-Alb-/-mFcRn-/-hFcRnTg/Tg)–具有mAlb及其受体mFcRn的双重敲除与hFcRn的额外敲入。据报告，当引入HSA时，它重现了天然HSA在人中的半衰期。
随后进行HSA注射，将22种Nb(包括20种HSA结合剂和2种非结合剂对照)在PBS中以等摩尔浓度混合并通过单次大丸剂静脉内(i.v.)注射施用于这种模型(n＝3)。Nb与HSA之间的1:5摩尔比用于确保存在过量的HSA以进行结合。在注射后的不同时间点对血液进行取样并作为血清储存。包括Nb在内的血清蛋白被蛋白水解；将所得肽通过高级液相色谱(LC)分离，并且通过高分辨率轨道阱MS定量Nb特征肽及其碎片离子(图4a，图11a-11e)。基于数百次LC运行的平均定量CV是15.3％(图12a-12c)。
如图4b所示，与血清半衰期为大约26-60分钟的对照Nb相比，HSA-Nb的半衰期显著提高—观察到血液清除率降低高达771倍(Nb 158)。出人意料地，观察到独特且变化较大的T1/2(从1.6天至7.6天)(图4c)，这与HSA的8.1天半衰期密切相关(有/无Nb共注射，图13c)，而不是之前在此模型中报告的21天。无标记定量血清蛋白质组学鉴定了HSA注射后5-6天血清IgG水平的数百倍增加，从而表明模型中发展抗HSA免疫应答(图14)，当以相对高的剂量施用时这对于这种良好折叠的外源性蛋白质来说并不罕见(尽管仍低于完整生理水平)。
实施例5.Nb药代动力学及其物理化学性质的相关性。
为了更好地了解HSA-Nb PK的差异，进行Nb PK与物理化学性质之间的相关性分析(图4d)，所述物理化学性质包括亲和力(在7.4和酸性pH下)、解链温度、等电点和疏水性(在CDR和全蛋白水平下)。令人感兴趣地，酸性pH下的亲和力与消除率密切相关(斯皮尔曼ρ＝0.78)，其次是在中性pH下的亲和力(特别是解离速率)和CDR3疏水性；可在三个参数之间找到合理的相关性。可以想象，缓慢结合解离速率和酸性pH依赖性相互作用对于延长Nb-HSA-FcRn三元复合物在内体中的稳定性是重要的；结合减弱导致“搭乘”日志提早终止，从而更快地消除捎带的Nb货物。本文所述的数据表明，互补位上增加的疏水性对于高亲和力结合可能是重要的。
实施例6.Duraleukin的开发：用于癌症免疫疗法的一类新型Nb融合细胞因子。
为了进行概念验证，此Nb工具包被应用于模型治疗性分子白介素-2(IL-2)。IL-2是在增强先天性和适应性(例如，CD8+T和自然杀伤细胞)免疫应答中起作用以抑制癌症发展的主细胞因子。作为第一种癌症免疫治疗药物，人IL-2(大约15kDa)已被应用于有效地治疗多种癌症，如肾癌和晚期黑素瘤，然而其临床功效仍在很大程度上受到短半衰期的限制(在人中<30-60分钟)。此外，高剂量、频繁施用hIL-2虽然对其抗癌活性是必要的，但可导致明显副作用，包括肝毒性和血管渗漏综合征。
各种N末端HSA-Nb和hIL-2的融合构建体被设计用于产生新的组合物(这些组合物通常被称为“Duraleukin”)(图5a)。使用Nb77、Nb80和Nb158快速产生三种Duraleukin(DL77、DL80和DL158)，并从大肠杆菌包涵体中大量纯化(图5b)。所有构建体均表现出大约60℃的良好热稳定性(图5c)。它们保留与hIL-2相当的生物活性，如体外CD8+T细胞增殖测定所示(图5d)，并且在体外与小鼠血清一起孵育数天时非常稳定(图5e)。此外，这些Duraleukin(如DL80)对HSA结合保留高亲和力(273pM)(图5f)。虽然DL80在酸性pH下显示出亲和力降低(2-8倍，图5g，但它仍然具有对小鼠白蛋白的最高亲和力之一，并被选择用于体内评估。
实施例7.DL80对黑素瘤治疗的治疗功效的评估。
使用野生型B6小鼠模型来证实与hIL-2相比，DL80具有延长的稳定性，血液消除改善大约46倍(图15)。然后在B16F10黑素瘤小鼠模型中评估DL80的治疗功效。荷瘤小鼠在每次注射时皮下施用等摩尔浓度的DL80或hIL-2，但频率不同(DL80每6天一次；hIL-2每天一次)，总计24天处理。TA99-一种识别肿瘤标志物TRP1的mAb并且以其与IL-2的协同活性而闻名，每6天以150μg的剂量对两组进行共同处理。处理后，让动物恢复，并连续分析肿瘤大小(图6a)和存活率(图6b)持续一个月。尽管仅使用1/6的hIL-2治疗剂量，并且在WT B6小鼠模型中观察到融合构建体DL80的PK的仅适度改善，但DL80和hIL-2处理组均表现出与PBS对照相比的肿瘤负荷和总体存活的显著降低。50％(4只小鼠)经DL80处理的黑素瘤动物存活，相比之下在hIL-2组中25％(2只小鼠)并且在PBS组中0％。在DL80应答动物中观察到几乎完全的肿瘤衰退，而在hIL-2处理的小鼠中肿瘤发生的明显反弹是明显的(图6a)，从而表明Duraleukin对于癌症治疗的优势。为了进一步探索其抗肿瘤作用的潜在机制，分离处理后不同阶段的肿瘤，并通过流式细胞术分析它们各自的免疫细胞(图6c)。虽然在处理后第1天未检测到显著变化，但在注射后第3天，在DL80处理的组织中观察到CD8+T细胞和自然杀伤(NK)细胞的显著增加，从而表明Duraleukin有效穿透肿瘤，刺激这些免疫细胞发挥其抗肿瘤活性。
实施例8.HSA结合Nb提高药物的稳定性和治疗效应。
许多小生物分子和治疗剂(包括Nb)受到其体内稳定性差的限制。在此，受骆驼科Nb的突出物理化学和生物物理性质的鼓舞，开发了一种稳健的通用方法来解决药物递送的这一基本问题。通过使用跨越生物物理学、蛋白质组学、结构生物学和计算建模的尖端多学科方法，已经系统性地表征了大量高质量HSA-Nb。开发了一种新的蛋白质组学方法用于NbPK的准确、高通量测量。然后开发了一种稳定的Nb融合细胞因子Duraleukin，并且已经优先表征了其抗肿瘤功效。
发现了HSA上的四个显性表位(装饰的圣诞树)，从而支持免疫显性假说。观察到Nb对凹度识别的偏好，这可用Nb架构的凸度来解释。尽管具有相对较小的互补位，大多数我们的Nb仍然能够实现与IgG相当的抗原结合的突出亲和力和特异性。
鉴于白蛋白的高血清浓度，可想象延长的PK不需要Nb的高亲和力。上述结果表明相反：即亲和力和pH依赖性结合呈正相关，从而强调了微环境对FcRn介导的内吞作用和受体复合物的局部浓度对有效货物递送的重要性。
实施例9.方法。
Nb DNA合成和克隆。对Nb基因进行密码子优化以在大肠杆菌中表达，并在体外合成核苷酸(Synbiotech)。在通过桑格测序验证后，将Nb基因在BamHI和XhoI或EcoRI和NotI限制位点处克隆到pET-21b(+)中。
重组Nb的纯化。将Nb DNA构建体转化到BL21(DE3)细胞中，并在37℃下涂铺在含有50μg/ml氨苄青霉素的琼脂上过夜。挑选单个细菌菌落用于LB肉汤培养基和IPTG Nb蛋白诱导。简言之，当O.D.达到大约0.4-0.6时，将0.5mM IPTG添加至大肠杆菌细胞培养物中，并在16℃下诱导Nb过夜。然后收获细胞，进行简单超声处理并在冰上用裂解缓冲液(1xPBS、150mM NaCl、0.2％ TX-100和蛋白酶抑制剂)裂解。裂解后，以15,000xg收集可溶性蛋白质提取物10分钟，并将重组Nb用His6-Cobalt树脂(Thermo)纯化并用咪唑洗脱。随后在透析缓冲液(例如，1x DPBS，pH 7.4)中对洗脱的Nbs进行透析，并在使用前储存在-80。
ELISA(酶联免疫吸附测定)。进行间接ELISA以评估免疫应答和纳米抗体亲和力。在4℃下将抗原在包被缓冲液(15mM碳酸钠，35mM碳酸氢钠，pH 9.6)中以1-10ng/孔包被到96孔ELISA板(R&D system)上过夜并在室温下用封闭缓冲液(DPBS，0.05％Tween 20，5％乳)封闭2小时。将经免疫的血清或纳米抗体在封闭缓冲液中连续稀释并与抗原一起孵育2小时。将针对美洲驼Fc(Thermo)或his标签(Genscript)的HRP缀合的第二抗体在封闭缓冲液中1:5,000-10,000稀释并在室温下孵育1小时。用1xPBST(DPBS，0.05％ Tween 20)进行3次洗涤以除去非特异性吸光度。洗涤后，将样品在黑暗下与新鲜制备的w3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物一起在室温下进一步孵育10分钟以产生信号。在终止溶液(R&D system)后，在板读数器(Multiskan GO，Thermo Fisher)上在多个波长(从450nm处的密度减去550nm波长处的光密度)读取板。然后通过Prism 7(GraphPad)处理原始数据以拟合至4PL曲线中，并且如果结果不拟合至曲线中，则计算logIC50或平均值。
体外珠粒下拉。通过表面等离子体共振(SPR)测量Nb亲和力。表面等离子体共振(SPR，Biacore 3000system，GE Healthcare)用于测量Nb亲和力。简言之，将蛋白质抗原如GST、OMP25 PDZ结构域或人血清白蛋白固定在激活的CM5传感器芯片的流动通道上。将蛋白质分析物在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释至10-30μg/ml，并以5μl/min注入SPR系统中持续420秒。然后用1M乙醇胺-HCl(pH 8.5)封闭表面。对于每种Nb分析物，以20-30μl/min的流量用含有2mM DTT的HBS-EP+运行缓冲液(GE-Healthcare)一式两份注入一系列跨越大约1,000倍的稀释液持续120-180秒，然后基于解离速率进行5-20分钟的解离时间。在每次注入之间，将传感器芯片表面用含有10mM甘氨酸-HCl(pH 1.5-2.5)的低pH缓冲液以40-50μl/min的流量再生30秒，或用20-40mM NaOH(pH 12-13)的高pH缓冲液以40-50μl/min的流量再生30秒。通过用1:1Langmuir模型或具有质量转移的1:1Langmuir模型拟合使用BIA评估处理并分析每种Nb的结合传感图。
序列表
<110> 匹兹堡大学联邦高等教育系统(UNIVERSITY OF PITTSBURGH-OF THECOMMONWEALTH SYSTEM OF
HIGHER EDUCATION)
<120> 血清白蛋白结合纳米抗体组合物以及其使用方法
<130> 10504-044WO1
<160> 103
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 609
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu
<210> 2
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Tyr Glu Pro
20 25 30
Leu Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ala Thr Ile Thr Pro Ser Gly Gly Ser Leu Ser Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Ala Pro Gly Val Gly Asn Tyr Arg Tyr Thr Arg Gln Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120
<210> 3
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Pro
20 25 30
Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ala Ser Ile Leu Trp Ser Gly Asn Asn Arg Asp Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Gly Asp Gly Leu Gly Phe Tyr Arg Ser Val Asn Gln Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120
<210> 4
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Ala Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Ile Ser Asn
20 25 30
Tyr Gly Met Gly Trp Leu Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Gly Ser Ile Asn Trp Asn Gly Ala Thr Thr His Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Ala Gln Phe Ser Val Gln Pro Thr Leu Gln Thr Tyr Asp Tyr
100 105 110
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120
<210> 5
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Arg Asp Pro Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
1 5
<210> 7
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Pro Glu Asn
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly
35 40 45
Arg Thr Tyr Glu Pro Leu Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Thr Pro Ser Gly Gly Ser Leu
65 70 75 80
Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ala Lys Lys Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Gln Pro Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Pro Gly Val Gly Asn Tyr Arg
115 120 125
Tyr Thr Arg Gln Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
130 135 140
Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Gly Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
165 170 175
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
180 185 190
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
195 200 205
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210 215 220
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
225 230 235 240
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
245 250 255
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
260 265 270
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
275 280 285
Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Leu Glu His His His His His
290 295 300
His
305
<210> 8
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Pro Glu Asn
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly
35 40 45
Arg Thr Phe Thr Pro Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ser Ile Leu Trp Ser Gly Asn Asn Arg
65 70 75 80
Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Asp Gly Leu Gly Phe Tyr Arg
115 120 125
Ser Val Asn Gln Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
130 135 140
Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Gly Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
165 170 175
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
180 185 190
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
195 200 205
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
210 215 220
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
225 230 235 240
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
245 250 255
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
260 265 270
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
275 280 285
Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Leu Glu His His His His His
290 295 300
His
305
<210> 9
<211> 303
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Pro Glu Asn
1 5 10 15
Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Gly Thr Ile Ser Asn Tyr Gly Met Gly Trp Leu Arg Gln Gly Pro Gly
50 55 60
Lys Glu Arg Glu Phe Val Gly Ser Ile Asn Trp Asn Gly Ala Thr Thr
65 70 75 80
His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
100 105 110
Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Val Ala Gln Phe Ser Val Gln Pro Thr Leu
115 120 125
Gln Thr Tyr Asp Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Glu
130 135 140
Pro Lys Thr Pro Lys Gly Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu
165 170 175
Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn
180 185 190
Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met
195 200 205
Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu
210 215 220
Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe
225 230 235 240
His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu
245 250 255
Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu
260 265 270
Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln
275 280 285
Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Leu Glu His His His His His His
290 295 300
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Gly Ser Gly Val Gly Arg Tyr Ile His Ala His Gln Tyr Glu Tyr
1 5 10 15
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Ser Leu Ile Glu Asp Tyr Ser Asp Tyr Val Asp Arg Thr Thr Glu Tyr
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Ser Ala Pro Glu Tyr Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Leu Asn Arg Pro Asp
1 5 10 15
Asp Tyr Asp Tyr
20
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Gly Ser Gly Gly Gly Gln Tyr Arg Tyr Gly Ile Gln Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Arg Lys Met Ser Thr Val Ala Thr Glu Ala Thr
1 5 10
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Arg Leu Glu Asn Gly Tyr Thr Thr Tyr Ser Arg Ile Asn Glu Tyr Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Cys Tyr Arg Thr Ser Gly Tyr Asn Tyr
1 5 10 15
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Gly Asp Gly Leu Gly Phe Tyr Arg Ser Val Asn Gln Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Gly Ala Gly Gly Gly Gln Tyr Arg Tyr Trp Ser Gln Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 19
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Ala Glu Gly Leu Ala Ser Gly Ser Tyr Asp Tyr Val Pro Pro Leu Lys
1 5 10 15
Ser Ser Trp Tyr Asp Tyr
20
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Asp Ser Gly Gly Gly Gln Tyr Arg Tyr Leu Ser Gln Phe Asp Trp
1 5 10 15
<210> 21
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Ala Phe Thr Thr Asp His Thr Leu Val Ile Val Thr Ala Arg Arg Tyr
1 5 10 15
Glu Phe
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Asp Tyr Arg Gly Leu Gly Ser Ser Arg Ala His Asp Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Tyr Asn Ile Ala Arg Gln Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Ala Pro Gly Val Gly Tyr Tyr Arg His Thr Phe Gln Tyr Asp Asp
1 5 10 15
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Asn Ser Ala Phe Phe Gly Arg Ile Tyr Phe Gly Asn Glu Asn Tyr Tyr
1 5 10 15
<210> 26
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Arg Leu Asp Pro Ile Phe Ala Ser Asn Ala Asp Tyr Ala Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Gly Ser Gly Gly Gly Gln Tyr Arg Tyr Trp Ser Gln Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 28
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Gly Pro Ser Thr Ala Gln Ala Val Gly Val Pro Phe Phe Gly Tyr Pro
1 5 10 15
Asp Asp Tyr
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Arg Glu Trp Gly Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ala Ser Tyr Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Val Phe Asp Arg Leu Ser Asp Ser Leu Leu Pro Glu Glu Arg Ser Thr
1 5 10 15
Tyr Asp Tyr
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Cys Tyr Gly Leu Gly Phe Tyr Arg Ser Val Ser Gln Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Gly Tyr Ala Gly Leu Gly Asp Ser Arg Ala His Glu Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 33
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Arg Leu Asp Pro Ile Phe Ala Ser Asn Ser Glu Tyr Ala Pro Leu Tyr
1 5 10 15
Glu Tyr
<210> 34
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Ala Gly Pro Gln Glu Ala Phe Trp Phe Pro Ser Asp Tyr Ala Gln Arg
1 5 10 15
Val Leu Tyr Asp Tyr
20
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Gly Ser Gly Gly Gly Gln Tyr Arg Tyr Ser Gly Gln Tyr Asp Asp
1 5 10 15
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Asp Val Ile Arg His Leu Tyr Gly Ser Gly Cys Pro Val Gly Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 37
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
His Thr Val Leu Glu Tyr Ser Asp Tyr Val Glu Ser Asp Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Tyr
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Asp Val Ile Arg His Leu Tyr Gly Ser Asp Cys
1 5 10
<210> 39
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Tyr Ser Asp Tyr Asp Leu Val Arg Ala Asp Gln Tyr Asn Tyr
1 5 10
<210> 40
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Gly Leu Ile Ala Arg Leu Tyr Gly Ser Asn Cys Pro Ala Gly Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 41
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Ala Asp Pro Met Gly Leu Gly Tyr Val Leu Gly Pro Arg Pro Val Asp
1 5 10 15
Arg Leu Leu Ser Ala Glu Cys Asp Tyr
20 25
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Gly Ala Ser Asp Tyr Gly Cys Tyr Asn Thr Ser Gly Ile Lys Tyr
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Asp Tyr Ala Gly Leu Gly Tyr Ser Gln Ala His Glu Tyr Glu Tyr
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Gly Ser Gly Val Gly Arg Tyr Leu Tyr Pro His Gln Tyr Asp Asn
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Ala Pro Gly Ala Gly Asn Tyr Arg Tyr Ser Arg Gln Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Gly Ser Gly Thr Gly Ile Tyr Ser Tyr Pro His Gln Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Ala Ser Gly Val Gly Met Tyr Ala Tyr Pro His Gln Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 48
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Arg Leu Asp Pro Ile Phe Ala Ser Asn Ile Asp Tyr Ala Pro Leu Tyr
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 49
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Asp Asp Arg Ala Val Pro Met Leu Gly Asp Phe Glu Asp Tyr Ile Asp
1 5 10 15
<210> 50
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Asp Ala Arg Ser Gly Ser Ala His Leu Ala Tyr His Leu Arg Asp Tyr
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Asp Gln Tyr Ala Ser Thr Val Leu Arg Val Ala Gly Glu Tyr
1 5 10
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Gly Val Val Gly Gly Trp Ala Tyr Glu Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Asp Tyr Arg Gly Leu Gly Tyr Ser Gly Ala His Glu Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 54
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Gln Phe Ser Val Gln Pro Thr Leu Gln Ala Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Lys Asn Pro Ser Ile Thr Asp Gly Glu Tyr Glu Tyr
1 5 10
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Asp Tyr Tyr Gly Leu Gly Ser Gly Leu Lys Asn Glu Tyr Glu Tyr
1 5 10 15
<210> 57
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Ala Phe Thr Thr Asp His Thr Leu Val Val Val Thr Thr Arg Gln Tyr
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 58
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Ser Tyr Leu Gly Trp Gly Thr Ala Arg Ser Ala Tyr Glu Tyr
1 5 10
<210> 59
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
Asp Asp Arg Ala Val Pro Met Leu Gly Asp Phe Met Asp Tyr Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 60
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Ser His Tyr Leu Pro Val Arg Thr Ala Ser Gly Gly Tyr His Leu Asp
1 5 10 15
Thr Asp Arg Pro Gln Tyr
20
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
Gly Val Ser Asp Tyr Trp Cys Tyr Arg Thr Ser Gly Ile Asn Tyr
1 5 10 15
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Glu Val Met Glu Cys Arg Gly Leu Gln Tyr Asn Asp
1 5 10
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<211> 11
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Val Pro Ser Asp Asn Leu Cys Gly Tyr Leu His
1 5 10
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<211> 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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Glu Thr Ser Gly Trp Gly Ser Lys Val Val Pro Asn Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 65
<211> 11
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Asp Thr Val Pro Glu Tyr Ser Asp Tyr Asp Tyr
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<211> 15
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<400> 66
Gly Tyr Asp Gly Gly Leu Tyr Lys Ile Ala Thr Gln Tyr Asp Tyr
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Ser Ala Ala Tyr Ile Gly Arg Val Tyr Phe Gly Asn Glu Asn Tyr Ser
1 5 10 15
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Asp Ser Val Asp Ala Tyr Ser Lys Gly Ser Val Tyr Ser Ala Asp Arg
1 5 10 15
Tyr Asp Tyr
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Arg Lys Thr Ser Thr Thr Thr Asn Glu Ala Thr Met Tyr Ala Tyr
1 5 10 15
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<400> 70
His Phe Thr Thr Asp His Thr Ile Val Val Val Thr Thr Arg Arg Tyr
1 5 10 15
Glu Tyr
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Ser Ala Ala Leu Ile Gly Arg Val Tyr Phe Gly
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<210> 72
<211> 14
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Asp Ala Ser Ser Thr Trp Arg Gly Val Arg Ser Arg Trp Asp Glu Tyr
1 5 10 15
Thr Tyr
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Ile Arg Pro Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Val Thr Pro Asn His Ile Asp
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Tyr
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Gly Val Ser Asp Tyr Gly Cys Tyr His Pro Ser Gly Tyr Asn Tyr
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Asn
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Val Arg Asp Asn Leu Cys Ser Asn Trp Cys Tyr Gly Leu Tyr Asp Tyr
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Leu Tyr Gly Ser Asn Cys Pro Ala Gly Leu Tyr
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Gly Pro Arg Asp Ser Gly Tyr Tyr Asp Phe
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Gly Arg Val Pro Ile Thr Ser Met Arg Arg Asn Phe Asp Val
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<220>
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Pro Val Pro Gly Ser Ser Trp Tyr Gly Ser Leu Ala Tyr Asp Tyr
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Asp Tyr Ala Gly Leu Gly Asp Ser Arg Ala His Val Tyr Glu Tyr
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Gly Arg Tyr Ser Thr Leu Phe Thr Thr Ser Glu Ala Asp Tyr Asp Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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Gly Gly Gly Ser Gln Tyr Glu Tyr
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<212> PRT
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<220>
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1 5
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<211> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成构建体
<400> 90
Leu Ser Tyr Gly Ser Met Trp Leu Asp Ala Ser Glu Arg Asn Glu Tyr
1 5 10 15
Asp Ser
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<223> 合成构建体
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Glu Ile Leu Gly Gly Gly Pro Asn Tyr
1 5
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<223> 合成构建体
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Gly Ser Thr Ser Ser Trp Lys Glu Glu Trp Tyr Asp Asn
1 5 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Leu Ser Asp Phe Ile Asp Arg Tyr Cys Ile Pro Arg Ser Pro Ile
1 5 10 15
Gly Tyr Asp Tyr
20
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<223> 合成构建体
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Thr Ile Gly Pro Arg Leu Tyr
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 95
Gly Asp Ser Ser Ser Trp Lys Asp Val Gln Tyr Asp Tyr
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
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Lys Ser Pro Ser Ser Ser Glu Phe Glu Phe
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成构建体
<400> 97
Ser Arg Tyr Met Ile Val His Gly Thr Lys Asn Leu Asp Asp
1 5 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成构建体
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Ala Pro Leu Asp Gly Leu Glu Cys Val Arg Gln
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<211> 13
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 99
Gly Asp Ser Ser Ser Trp Leu Glu Asp Arg Tyr Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成构建体
<400> 100
Arg Gly Gly Ile Ala Val Ala Met Ser Ser Arg Asp Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 101
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
1 5 10 15
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe
20 25
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<211> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成构建体
<400> 102
Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Asp Cys Cys Ala Lys Asp Asp Pro His Ala
1 5 10 15
Cys Tyr Ala Thr Val Phe Asp Lys Leu
20 25
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<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 103
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
35 40 45
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
50 55 60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
65 70 75 80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
85 90 95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
100 105 110
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser
115 120 125
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
130

Claims (28)

1.一种包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽和IL-2多肽的重组纳米抗体，其中所述HSA结合多肽特异性地结合至选自由表位1、表位2、表位3和表位4组成的组的HSA表位，
其中表位1包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基298-307、311、332-341和371-386，
其中表位2包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基5-13、62-67、93-99和228-266，
其中表位3包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基226-230和298-337，并且
其中表位4包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基33-38和111-145。
2.如权利要求1所述的重组纳米抗体，其中所述HSA结合多肽特异性地结合至人HSA和小鼠血清白蛋白。
3.如权利要求1或2所述的重组纳米抗体，其中所述HSA结合多肽包含选自由SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组纳米抗体，其中所述IL-2多肽包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:103的氨基酸序列或其功能片段。
5.如权利要求1-4中任一项所述的重组纳米抗体，其中所述HSA结合多肽通过接头连接至所述IL-2多肽。
6.如权利要求5所述的重组纳米抗体，其中所述接头包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的重组纳米抗体，其中所述重组纳米抗体小于约50kDa。
8.如权利要求1-7中任一项所述的重组纳米抗体，其中所述HSA结合多肽不降低所述IL-2多肽与其IL-2受体之间的亲和力。
9.如权利要求1-8中任一项所述的重组纳米抗体，其中所述重组纳米抗体包含选自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的氨基酸序列。
10.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽和IL-2多肽的重组纳米抗体，其中所述HSA结合多肽特异性地结合至选自由表位1、表位2、表位3和表位4组成的组的HSA表位，
其中表位1包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基298-307、311、332-341和371-386，
其中表位2包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基5-13、62-67、93-99和228-266，
其中表位3包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基226-230和298-337，并且
其中表位4包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基33-38和111-145。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述HSA结合多肽特异性地结合至人HSA和小鼠血清白蛋白。
12.如权利要求11或12所述的方法，其中所述HSA结合多肽包含选自由SEQ IDNO:2、SEQID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的氨基酸序列。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述IL-2多肽包含SEQ ID NO:5、SEQID NO:103的氨基酸序列或其功能片段。
14.如权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述HSA结合多肽通过接头连接至所述IL-2多肽。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述接头包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
16.如权利要求10-15中任一项所述的方法，其中所述重组纳米抗体小于约50kDa。
17.如权利要求10-16中任一项所述的方法，其中所述HSA结合多肽不降低所述IL-2多肽与其IL-2受体之间的亲和力。
18.如权利要求10-17中任一项所述的方法，其中所述重组纳米抗体包含选自由SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组的氨基酸序列。
19.如权利要求10-18中任一项所述的方法，其中所述重组纳米抗体具有天然IL-2多肽的约100倍的体内半衰期。
20.如权利要求10-19中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由黑素瘤和肾癌组成的组。
21.一种包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽的纳米抗体，其中所述HSA结合多肽包含互补决定区(CDR)3，其中所述CDR3包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99或SEQ ID NO:100具有至少50％相似性的氨基酸序列。
22.如权利要求21所述的纳米抗体，其中所述CDR3包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99和SEQ ID NO:100。
23.如权利要求21或22所述的纳米抗体，其中所述HSA结合多肽特异性地结合至选自由表位1、表位2、表位3和表位4组成的组的HSA表位，
其中表位1包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基298-307、311、332-341和371-386，
其中表位2包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基5-13、62-67、93-99和228-266，
其中表位3包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基226-230和298-337，并且
其中表位4包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基33-38和111-145。
24.如权利要求21-23中任一项所述的纳米抗体，所述纳米抗体还包含IL-2多肽。
25.如权利要求24所述的纳米抗体，其中所述IL-2多肽包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:103的氨基酸序列或其功能片段。
26.如权利要求24或25所述的纳米抗体，其中所述HSA结合多肽通过接头连接至所述IL-2多肽。
27.如权利要求26所述的纳米抗体，其中所述接头包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
28.如权利要求21-27中任一项所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体小于50kDa。
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