TW202112812A - Csf1r抗體、il10融合蛋白及其用途 - Google Patents

Csf1r抗體、il10融合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明係提供抗體，包括抗體融合體，其特異性地結合人類CSF1受體蛋白（huCSF1R），且能減少、抑制、及/或完全阻斷huCSF1R介導之免疫調節作用，如在腫瘤微環境中調節TAMs。此外，抗體包括具有細胞介素（即IL10）的融合體，其可在腫瘤微環境中補充及/或活化CD8+ T細胞的細胞毒性。本發明亦提供使用該抗體（及其組合物）之方法，以治療對減少、抑制、及/或阻斷由CSF1結合CSF1R介導之免疫調節功能或活性有反應的疾病及病症。

Description

CSF1R抗體、IL10融合蛋白及其用途
參考相關申請案
本申請案係請求2019年5月24日提申的美國臨時專利申請序號62/852,418的權益，其內容在此併入本案以作為參考資料。
本發明係有關結合CSF1R受體之抗體及融合蛋白，以及使用此類抗體及融合蛋白之方法。
序列表
序列表之正式副本係以ASCII格式文檔經由EFS-Web與說明書同時提交，文件檔案名稱為「09793-003WO1_SeqList_ST25.txt」，建檔日期為2020年5月20日，檔案大小為 136,762位元組。由EFS-Web提交之序列表係說明書之一部分，且於此全部併入本案以作為參考資料。
集落刺激因子1受體（colony stimulating factor 1 receptor）或「CSF1R」（在本領域中亦稱作CD115、C-FMS、CSF-1R、CSFR、FIM2、FMS、HDLS、M-CSFR、M-CSF-R、或BANDDOS）為細胞表面蛋白，在人體內由CSF1R基因（亦稱作「c-FMS」）編碼。CSF1R為972個胺基酸的單程（single pass）第一型膜蛋白，其作為集落刺激因子1 （「CSF1」）的受體，集落刺激因子1為控制巨噬細胞產生、分化、及功能的細胞介素。據信，CSF1R介導大多數（即使並非全部）CSF1細胞介素的生物作用。CSF1R為酪胺酸蛋白激酶，且結合CSF1能將其活化，以進行寡聚合作用及轉磷酸化作用（trans-phosphorylation）。
CSF1R在許多癌症及腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages；TAMs）中發現皆過量表現。以CSF1結合CSF1R發現能調節TAMs的存活，其可促進免疫抑制性腫瘤微環境。據此，已有研究以CSF1R抑制劑作為癌症或發炎性疾病的可能治療。有許多CSF1R的小型分子及抗體抑制劑進入臨床試驗，包括：培昔達替尼（Pexidartinib）、PLX7486、ARRY-382、JNJ-40346527、BLZ945、印蘇單抗（Emactuzumab）、卡比拉單抗（Cabiralizumab）、AMG820、IMC-CS4。
介白素10或「IL10」（亦稱作人類細胞介素合成抑制因子、CSIF、IL-10、IL10A、GVHDS、或TGIF）為抗發炎性細胞介素。人類IL10蛋白為兩個178個胺基酸次單元的同型二聚體。IL10通過由二個IL10受體-1與二個IL10受體-2蛋白組成的受體錯合物傳訊。因此，功能性受體由四個IL10受體分子組成。IL10結合作用可分別通過由JAK1與Tyk2對IL10受體1與IL10受體2細胞質尾端磷酸化作用誘發STAT3傳訊。IL10主要由單核細胞產生，在較小程度上由淋巴細胞產生，淋巴細胞亦即第二型T輔助細胞（TH 2）、肥大細胞、CD4+ CD25+ Foxp3+ 調節性T細胞、及特定子集中之活化型T細胞與B細胞。IL10可由單核細胞在PD-1觸發時產生。
已知IL10在免疫調節及發炎反應中具有多重作用。已知IL10向下調節Th1細胞介素、MHC第II類抗原、及巨噬細胞上共刺激分子的表現。已知IL10亦可增進B細胞存活、增生、及抗體產生。IL10可阻斷NF-κB活性，並參與JAK-STAT傳訊途徑的調節。IL10能抑制由細胞（如巨噬細胞與Th1 T細胞）產生之促炎性細胞介素（如IFN-γ、IL-2、IL-3、TNFα、及GM-CSF）的合成。其亦顯示出有效阻斷抗原呈現細胞（antigen presenting cells）的抗原呈現能力；然而，其亦對特定T細胞（Th2）與肥大細胞具有刺激性，並刺激B細胞成熟及抗體產生。
IL10被視為腫瘤轉移的潛在抑制劑，以及用於免疫腫瘤治療的免疫刺激劑。在表現IL10的基因轉殖小鼠，或是以IL10在小鼠投藥，可觀察到原發性腫瘤生長受到控制並且減少腫瘤轉移。聚乙二醇化的重組型鼠源IL10蛋白，顯示在小鼠模型中可誘發IFNγ與CD8+ T細胞依賴性抗腫瘤免疫反應。聚乙二醇化重組型人類IL10蛋白，顯示可增強CD8+ T細胞分泌細胞毒性分子如顆粒酶B（Granzyme B）與穿孔蛋白（Perforin），並強化T細胞受體依賴性IFNγ的分泌。在臨床試驗中，聚乙二醇化重組型人類IL10（PEG-rHuIL-10，AM0010）顯示出實質的抗腫瘤功效，並隨劑量可誘發免疫刺激性細胞介素如IFNγ、IL-18、IL-7、GM-CSF、及IL-4。治療的病患亦發現周邊血CD8+ T細胞表現出增強的活化標記（如PD1、淋巴細胞活化基因3（LAG3）+、及增加的Fas配體（FasL）），並減少血清TGFβ。此些發現顯示，IL10治療對人類產生主要的免疫刺激作用。
本發明提供一種抗CSF1R抗體，其以高親和力特異性結合人類CSF1R。抗體能減少、抑制、及/或完全阻斷CSF1R介導之免疫調節作用，包括CSF1的結合。本發明亦提供具有一或二個IL10多胜肽的抗CSF1R抗體融合體。本發明之此些抗CSF1R/IL10融合蛋白能提供阻斷由CSF1R介導之免疫調節作用的合併治療效果，並提供由IL10介導之免疫刺激作用。
在至少一實施例中，本發明提供一種抗CSF1R抗體，包含（i）第一輕鏈互補決定區（CDR-L1）、第二輕鏈互補決定區（CDR-L2）、及第三輕鏈互補決定區（CDR-L3），及/或（ii）第一重鏈互補決定區（CDR-H1）、第二重鏈互補決定區（CDR-H2）、及第三重鏈互補決定區（CDR-H3），其中： (a)   CDR-H1包含選自於SEQ ID NO: 3、4、28、或29的胺基酸序列； (b)   CDR-H2包含選自於SEQ ID NO: 6、7、31、或32的胺基酸序列； (c)   CDR-H3包含選自於SEQ ID NO: 8、9、33、或34的胺基酸序列； (d)   CDR-L1包含選自於SEQ ID NO: 13、14、37、或38的胺基酸序列； (e)   CDR-L2包含選自於KAS、VAS、或SEQ ID NO: 15或39的胺基酸序列； (f)    CDR-L3包含選自於SEQ ID NO: 16、17、40、或41的胺基酸序列。
在至少一實施例中，本發明提供一種抗CSF1R抗體，其中： (a) CDR-H1包含SEQ ID NO: 3或4的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 6或7的胺基酸序列，且CDR-H3包含SEQ ID NO: 8或9的胺基酸序列；或 (b) CDR-H1包含SEQ ID NO: 28或29的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 31或32的胺基酸序列，且CDR-H3包含SEQ ID NO: 33或34的胺基酸序列。
在至少一實施例中，本發明提供一種抗CSF1R抗體，其中： (a)   CDR-L1包含SEQ ID NO: 13或14的胺基酸序列，CDR-L2包含KAS或SEQ ID NO: 15的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 16或17的胺基酸序列；或 (b)   CDR-L1包含SEQ ID NO: 37或38的胺基酸序列，CDR-L2包含VAS或SEQ ID NO: 39的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 40或41的胺基酸序列。
在至少一實施例中，本發明提供一種抗CSF1R抗體，其中： (a)   CDR-H1包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO: 13的胺基酸序列，CDR-L2包含KAS的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 16的胺基酸序列； (b)   CDR-H1包含SEQ ID NO: 28的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 31的胺基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO: 33的胺基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO: 37的胺基酸序列，CDR-L2包含VAS的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 40的胺基酸序列； (c)   CDR-H1包含SEQ ID NO: 4的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO: 14的胺基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO: 15的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 17的胺基酸序列； (d)   CDR-H1包含SEQ ID NO: 29的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 32的胺基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO: 34的胺基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO: 38的胺基酸序列，CDR-L2包含VAS或SEQ ID NO: 39的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列。
在至少一實施例中，本發明提供一種抗CSF1R抗體，其中該抗體包含一與選自於SEQ ID NO: 2、19、23、27、43、或47之序列具有至少90%同一性的重鏈可變結構域（VH ）胺基酸序列；及/或一與選自於SEQ ID NO: 12、21、25、36、45、或49之序列具有至少90%同一性的輕鏈可變結構域（VL ）胺基酸序列；選擇性地，其中： (a)   該抗體包含一與SEQ ID NO: 2具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 12具有至少90%同一性的輕鏈可變結構域（VL ）胺基酸序列； (b)   該抗體包含一與SEQ ID NO: 19具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 21具有至少90%同一性的VL 胺基酸序列； (c)   該抗體包含一與SEQ ID NO: 23具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 25具有至少90%同一性的VL 胺基酸序列； (d)   該抗體包含一與SEQ ID NO: 27具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 36具有至少90%同一性的VL 胺基酸序列； (e)   該抗體包含一與SEQ ID NO: 43具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 45具有至少90%同一性的VL 胺基酸序列；或 (f)    該抗體包含一與SEQ ID NO: 47具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 49具有至少90%同一性的VL 胺基酸序列。
在至少一實施例中，本發明提供一種抗CSF1R抗體，其中該抗體包含一與選自於SEQ ID NO: 58、60、62、64、66、或68之序列具有至少90%同一性的重鏈（HC）胺基酸序列，及/或一與選自於SEQ ID NO: 59、61、63、65、67、或69之序列具有至少90%同一性的輕鏈（LC）胺基酸序列；選擇性地，其中該抗體包含： (a)   SEQ ID NO: 58的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 59的LC胺基酸序列； (b)   SEQ ID NO: 60的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 61的LC胺基酸序列； (c)   SEQ ID NO: 62的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 63的LC胺基酸序列； (d)   SEQ ID NO: 64的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 65的LC胺基酸序列； (e)   SEQ ID NO: 66的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 67的LC胺基酸序列；或 (f)    SEQ ID NO: 68的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 69的LC胺基酸序列。
在至少一實施例中，本發明提供一種抗CSF1R抗體，其中該抗體包含一重鏈經由連接子（linker）融合至IL10多胜肽；視情況其中： (a)   連接子包含SEQ ID NO: 78的胺基酸序列； (b)   IL10多胜肽包含一、二、或四個IL10多胜肽；及/或 (c)   IL10多胜肽包含SEQ ID NO: 75的胺基酸序列； (d)   HC包含一與選自於SEQ ID NO: 50、51、52、53、54、55、56、或57之序列具有至少90%同一性的胺基酸序列。
在至少一實施例中，本發明提供一種抗CSF1R抗體，其中該抗體包含一與選自於SEQ ID NO: 50、51、52、53、54、55、56、或57之序列具有至少90%同一性的重鏈（HC）胺基酸序列，以及一與選自於SEQ ID NO: 59、61、63、65、67、或69之序列具有至少90%同一性的輕鏈（LC）胺基酸序列；選擇性地，其中該抗體包含： (a)   SEQ ID NO: 50的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 59的LC胺基酸序列； (b)   SEQ ID NO: 51的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 59的LC胺基酸序列； (c)   SEQ ID NO: 52的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 61的LC胺基酸序列； (d)   SEQ ID NO: 53的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 63的LC胺基酸序列； (e)   SEQ ID NO: 54的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 65的LC胺基酸序列； (f)    SEQ ID NO: 55的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 65的LC胺基酸序列； (g)   SEQ ID NO: 56的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 67的LC胺基酸序列；或 (h)   SEQ ID NO: 57的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 69的LC胺基酸序列。
在至少一實施例中，本發明提供一種抗CSF1R抗體，其中： (a)   該抗體以1 x 10-8 M或以下、1 x 10-9 M或以下、1 x 10-10 M或以下之結合親和力結合至人類CSF1R；選擇性地，其中結合親和力係藉由與SEQ ID NO: 70之huCSF1R多胜肽的平衡解離常數（KD ）來測得； (b)   該抗體以1 x 10-8 M或以下、1 x 10-9 M或以下、1 x 10-10 M或以下之結合親和力結合至食蟹猴（cynomolgus）CSF1R；選擇性地，其中結合親和力係藉由與SEQ ID NO: 71之cynoCSF1R多胜肽的平衡解離常數（KD ）來測得； (c)   該抗體減少CSF1誘發與IL34誘發的huCSF1R或AKT磷酸化作用； (d)   該抗體抑制CSF1依賴性與IL34誘發之細胞增生達至少65%、至少75%、至少85%、至少95%、或至少100%；選擇性地，其中在CSF1濃度為20 ng/mL或IL34濃度為33 ng/mL時，抗體的IC50 為5 nM或以下、1 nM或以下、0.5 nM或以下、或0.1 nM或以下； (e)   該抗體抑制人類CD14+單核細胞或單核細胞衍生之巨噬細胞之CSF1依賴性存活率達至少65%、至少75%、至少85%、至少95%、或至少100%；選擇性地，其中在CSF1濃度為100 ng/mL時，抗體的IC5 0 為5 nM或以下、1 nM或以下、0.5 nM或以下、或0.1 nM或以下； (f)    該抗體增加NK細胞針對表現CSF1R之293F細胞所介導的ADCC活性達至少10%、至少20%、或至少25%； (g)   該抗體在第21天測量的同基因型小鼠腫瘤模式（syngeneic mouse tumor model）中減少腫瘤體積達至少25%、至少50%、至少75%、或以上，其中小鼠腫瘤模式選自於：CT26 結腸癌（CRC）、EMT6 三陰性乳癌（TNBC）、MC38 結腸癌、Renca 腎癌（RCC）、LL/2肺癌、Pan02胰腺癌 （PDAC）、H22 肝癌（HCC）、Q1 頭頸癌（HNSCC）； (h)   該抗體在CT26結腸腫瘤同基因型小鼠模式中增加CSF1與IL34的血液中濃度達至少50倍、至少100倍、200倍、或至少500倍； (i)     該抗體在CT26結腸腫瘤同基因型小鼠模式中減少TAM群達至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、或以上；選擇性地，其中MDSC群減至小於10%、小於5%、或以下； (j)     該抗體增加MC/9細胞增生達至少25%、至少50%、至少100%、至少150%、至少200%或以上； (k)   該抗體在活化的CD8 T細胞中增加IFNγ與顆粒溶解酶B產生達至少25%、至少50%、至少100%、或以上；及/或 (l)     該抗體在CT26結腸腫瘤同基因型小鼠模式中增加CD8+LAG3+PD1+ T細胞血液中濃度達至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、或以上。
本發明亦提供本文揭示之抗CSFR1抗體的實施例，所包括之實施例其中：（i）該抗體為人類、人源化、或嵌合抗體；(ii) 該抗體包含融合至重組型蛋白；視情況可融合至IL10多胜肽；(iii) 該抗體為IgG類別的全長抗體，視情況其中IgG類別的抗體具有選自於IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4的同種型；（iv）該抗體包含Fc區變體，視情況可為改變效應功能（effector function）的Fc區變體及/或改變抗體半衰期的變體；（v）該抗體為抗體片段，視情況可選自於由F(ab’)2 、Fab'、Fab、Fv、單一結構域抗體（VHH）、及scFv組成之群組；（vi）該抗體包含免疫複合體，視情況其中該免疫複合體包含用於治療CSF1R介導之疾病或病症的治療劑；或（vii）該抗體為多特異性抗體，視情況可為雙特異性抗體。
在至少一實施例中，本發明提供一種分離的核酸分子或重組載體，其編碼本發明抗CSF1R抗體。在至少一實施例中，本發明提供一種分離的宿主細胞，其包含編碼本發明抗CSF1R抗體之核酸分子或重組載體。在至少一實施例中，本發明亦提供一種製造本發明抗CSFR1抗體的方法，包含培養一含有編碼抗CSF1R抗體之核酸分子或重組載體的宿主細胞，從而產生抗體。
在至少一實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明抗CSF1R抗體與醫藥上可接受的載體；視情況其中該組合物更包含IL10多胜肽、化療藥劑、及/或含有具有免疫檢查點分子特異性的抗體。
在至少一實施例中，本發明提供一種治療患有CSF1R介導疾病之受試者的方法，該方法包含投予受試者一治療上有效量之本發明抗CSF1R抗體，或投予受試者一治療上有效量之本發明醫藥組合物；視情況其中該疾病為癌症；視情況其中該癌症選自於結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、肝癌（HCC）、腎臟癌、乳癌、肺癌、胃癌、頭頸癌、及口腔癌。
在至少一實施例中，本發明提供一種治療受試者之癌症的方法，包含投予受試者CSF1R拮抗劑與IL-10促效劑；視情況其中CSF1R拮抗劑包含抗CSF1R抗體、shRNA、siRNA、miRNA、CSF1R之小分子抑制劑、或其組合；視情況其中IL-10促效劑為IL-10、IL-10受體結合蛋白、或其組合；視情況其中CSF1R拮抗劑為本發明抗CSF1R抗體；視情況其中CSF1R拮抗劑與IL10促效劑包含一具有經由連接子融合至IL10多胜肽之HC的抗CSF1R抗體；視情況其中該方法進一步包含投予受試者T細胞療法。
本發明提供抗體，包括人源化抗體，其以高親和力特異性地結合CSF1R，從而抑制、減少、及/或完全阻斷CSF1R的功能，其作為參與免疫調節的細胞表面受體，特別是CSF1R在腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）的調節存活與維持功能。TAMs為腫瘤微環境（TME）中的主要構成細胞，且對腫瘤生長與進展有重要貢獻。據信，抑制CSF1R傳訊可耗盡TAMs，從而增強抗腫瘤之T細胞反應。在臨床試驗中，當單獨使用CSF1R抑制劑時，對病患的抗腫瘤作用有限，顯示需要將此些抑制劑與其他抗腫瘤治療方法合併使用。IL10為具有抗發炎與活化CD8+ T細胞特性的細胞介素。強烈的IL-10信號可以促進腫瘤特異性CD8 + T細胞增生，使耗竭T細胞恢復活力，從而增加T細胞的細胞毒性。本發明考量抗CSF1R抗體與IL10促效劑結合的用途，包括以抗CSF1R抗體融合IL10多胜肽。如本文所揭示，組合利用CSF1R的抑制作用以減少免疫抑制性TAMs，並且利用高濃度的IL10以增進TME中的CD8+ T細胞的細胞毒性，可提供一增進療效的癌症治療方法。
因此，可預期任何組合物或配方，其包含本發明抗CSF1R抗體（包括抗CSF1R抗體融合至IL10多胜肽）者可作為治療經由CSF1R功能或其標靶抗原CSF1介導之疾病（如癌症）的治療劑。此外，可預期本發明之抗CSF1R抗體可作為結合其他治療劑（如活化CD8+ T細胞的抗體，及/或標靶免疫檢查點分子，包括但不侷限於，PD1、PD-L1、LAG3、CTLA-4、A2AR、TIM-3、BTLA、CD276、CD328、VTCN1、IDO、KIR、NOX2、VISTA、OX40、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、GITR、ICOS）的治療劑。
術語及技術
對於本文及所附之申請專利範圍之描述，單數形式「一」及「一個」包括複數指示物，除非上下文另有明確說明。因此，例如，提及「一蛋白質」包括一個以上的蛋白質，提及「一化合物」係指一個以上之化合物。亦應注意的是，申請專利範圍可撰寫成排除任何可選要件。因此，該陳述旨在作為先行基礎，使得在陳述申請專利範圍要件時使用諸如「唯一」、「僅」等排他性術語，或使用「負」限制。「包含(複數動詞)」、「包含(單數動詞)」、「包含(動名詞)」、「包括(複數動詞)」、「包括(單數動詞)」，以及「包括(動名詞)」的使用是可互換的，目的並非進行侷限。應進一步理解的是，在各種實施例的描述使用術語「包含」的情況下，本領域具有通常知識者將理解，於某些特定情況下，可以使用「基本上由～組成」或「由～組成」的語言來替代地描述實施例。
在提供一系列數值的情況下，除非上下文另有明確規定，否則應理解的是，除非上下文另有明確規定，否則該數值的每個中間整數，以及該數值的每個中間整數的每十分之一，該範圍的上限與下限之間，以及該規定範圍內的任何其他規定或中間值，都包含於本發明內。這些較小範圍的上限與下限可以獨立地包括在較小範圍內，並且也包括於本發明內，受該範圍內的任何特別排除的侷限。在該規定範圍包括這些限制中的一個或兩個的情況下，除了（i）任一或（ii）這兩個限制之外的範圍也包括於本發明中。例如，「1至50」包括「2至25」、「5至20」、「25至50」、「1至10」等。
通常，本文使用的命名法及本文描述的技術與程序包括本領域具有通常知識者充分理解與通常使用之此些，例如Sambrook等人描述的常用技術及方法， 分子克隆實驗指南（Molecular Cloning-A Laboratory Manual）（第2版），第1~3卷，冷泉港（Cold Spring Harbor）實驗室，冷泉港，紐約，1989年（以下稱「Sambrook」）；分子生物學現行規範（Current Protocols in Molecular Biology），F. M. Ausubel等人編輯，Current Protocols，Greene Publishing Associates公司與John Wiley & Sons公司的合資公司（2011年補充）（以下稱「Ausubel」）；抗體工程（Antibody Engineering），第1及2卷，R. Kontermann與S. Dubel編輯，Springer-Verlag，柏林與海德堡（2010年）；單株抗體：方法與規範（Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols），V. Ossipow與N. Fischer編輯，第2版，Humana出版社（2014年）；治療性抗體：從實驗室至臨床（Therapeutic Antibodies: From Bench to Clinic），Z. An編輯，J. Wiley & Sons, Hoboken，紐澤西州（2009年）；以及噬菌體展示技術（Phage Display），Tim Clackson與Henry B. Lowman編輯，牛津大學出版社，英國（2004年）。
本發明中引用的所有出版物、專利、專利申請，以及其他文獻出於所有目的透過引用整體併入本文，其程度如同每個單獨的出版物、專利、專利申請、或其他文獻被單獨指出透過出於所有目的在此引用。
除非另外定義，否則本文使用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域具有通常知識者通常理解的含義相同之含義。應當理解的是，本文使用的術語僅用於描述特定實施例，而非侷限性的。出於解釋本發明之目的，以下對術語的描述將適用，並且在適當的情況下，以單數形式使用的術語還將包括複數形式，反之亦然。
如本文所用，「CSF1R」係指集落刺激因子1受體蛋白，且如本文所用，包括人類、食蟹猴、小鼠之CSF1R蛋白及此些蛋白之亞型。各種示例性CSF1R蛋白之胺基酸序列係本領域中已知，並提供於下表1，及在附件序列表中。
如本文所用，「CSF1R介導之病症」或「CSF1R介導之疾病」包括與CSF1和細胞表面受體CSF1R特異性結合相關的任何醫學病症。例如，CSF1與CSF1R的特異性結合可調節TAMs在腫瘤微環境中的存活率。據此，CSF1R介導之疾病可包括但不侷限於，由對CSF1R的拮抗劑或抑制劑及/或CSF1起反應及/或介導之任何疾病或病症，包括但不限於癌症。
如本文所用，「IL10」或「IL-10」係指抗發炎性細胞介素、介白素10，亦稱作細胞介素合成抑制因子（CSIF）。各種示例性IL10多胜肽及重組型IL10融合蛋白構築體之胺基酸序列係本領域中已知，並提供於下表2，及在附件序列表中。
如本文所用，「抗體」係指包含一或多個多胜肽鏈的分子，該多胜肽鏈特異性結合特定抗原或與特定抗原發生免疫反應。本發明之示例性抗體包括單株抗體、多株抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、抗體融合體（如，融合蛋白）、多特異性抗體（如，雙特異性抗體）、單價抗體（如，單臂抗體）、多價抗體、抗原結合片段（如，Fab'、F(ab’)2 、Fab、Fv、rIgG、及scFv片段）、及合成抗體（或抗體模擬物）。
「抗CSF1R抗體」或「結合CSF1R的抗體」係指以足夠的親和力結合CSF1R的抗體，使得該抗體可作為以CSF1R為目標的診斷及/或治療劑。在一些實施例中，測量抗CSF1R特異性抗體與不相關的非CSF1R抗原的結合程度，比較其與CSF1R的結合程度小約20%、小約15%、小約10%、或小約5%，例如以放射免疫測量法（radioimmunoassay，RIA）或表面電漿共振法（surface plasma resonance，SPR）測量。在一些實施例中，本發明抗CSF1R抗體具有＜ 1 μΜ、＜ 100 nM、＜ 10 nM、＜ 1 nM、＜ 0.1 nM、＜ 0.01 nM、或＜ 1 pM（如，10-8 M或以下，如，10-8 M至10-13 M，如，10-9 M至10-13 M）的解離常數（KD ）。
「全長抗體」、「完整抗體（intact antibody）」、或「全抗體（whole antibody）」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構本質上相似的結構或具有含有如本文所定義的Fc區之重鏈的抗體。
「抗體融合體」係指一抗體以共價鍵接（或融合）至多胜肽或蛋白，通常經由一連接子接至抗體輕鏈（LC）或重鏈（HC）之末端。本發明之示例性抗體融合體包括抗CSF1R抗體融合至重組型IL10多胜肽，其係經由14個胺基酸連接子從抗體重鏈C端連接至IL10多胜肽N端。抗體融合體於此以「抗體/多胜肽」標記命名，以表示融合體組分，如「Ab/IL10」或「抗CSFR1/IL10」或「6D4/IL10」。
「抗體片段」係指全長抗體的一部分，其能夠與全長抗體一樣，結合相同的抗原。抗體片段的實例包括，但不侷限於，Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab’)2 、雙抗體、線性抗體、單價或單臂抗體、單鏈抗體分子（如，scFv）、及由抗體片段形成的多特異性抗體。
抗體的「類別」係指其重鏈具有的恆定結構域或恆定區的類型。有五種主要類型的抗體：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，其中一些進一步分為亞型（同種型），例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2。對應於不同類別免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別稱作α、δ、ε、γ、及μ。
「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈的結構域，其參與抗體與抗原的結合。天然抗體的重鏈及輕鏈（分別為VH 及VL ）的可變結構域通常具有相似的結構，每個結構域包含四個序列相對保守的骨架區（FRs）及三個高變區（hypervariable regions，HVRs）（參閱，如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁）。單個VH 或VL 結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，可使用來自結合抗原的抗體的VH 或VL 結構域分離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補VL 或VH 結構域的文庫（參閱，如Portolano等人，J. Immunol. 150:880-887（1993年）；Clarkson等人，Nature 352:624-628（1991年））。
如本文所用，「高變區」或「HVR」係指抗體可變結構域的每個區域，其在序列中是高變的及/或形成結構上限定的環（「高變環」）。通常，天然抗體包含具有六個HVRs的四條鏈；在重鏈可變結構域中有三個，VH （HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3），在輕鏈可變結構域中有三個，VL （HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3）。HVRs通常包含來自高變環及/或來自「互補決定區」（CDRs）的胺基酸殘基。許多高變區的描述正使用中，並涵蓋在本文中。Kabat互補決定區（CDRs）係基於序列變異性，且是最常使用的（Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.（1991年））。Chothia係指結構環的位置（Chothia與Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917（1987年））。除非另有說明，否則可變結構域中的HVR殘基與其他殘基（例如，骨架區殘基）在本文中根據Kabat等人編號，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版。Public Health Service，國家衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州（1991年）。AbM高變區代表Kabat CDRs與Chothia結構環之間的折衷，並由Oxford Molecular's AbM抗體建模軟體使用。「接觸」高變區係基於對可得之複雜晶體結構的分析。下表列出在此些系統下定義的高變區殘基範圍。
環 Ka b a t A b M C h o t hi a 接觸
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1       H31-H35B1      H31-H352        H26-H35B1        H26-H352         H26-H321         H26-H322       H30-H35B1         H30-H352
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
1  Kabat編號 2  Chothia編號
除了上述系統之外，可使用國際ImMunoGeneTics訊息系統識別HVRs與CDRs，稱作IMGT/V-Quest，描述於Brochet, X.等人，Nucl. Acids Res. 36，W503-508（2008年）。PMID：18503082；且可在www.imgt.org/IMGT_vquest/input線上使用。IMGT/V-Quest使用IMGT獨特編號，分析與最接近種系V基因可變區核苷酸序列之比對，以識別HVRs與CDRs。
如本文所用，高變區（HVRs）可包括如下的延伸或替代高變區：VH 結構域中的27-32、27-36、24-34、或24-38（HVR-L1）；50-52、54-56、50-56、或54-60（HVR-L2）；89-97或93-101（HVR-L3）；26-33、26-35、或31-35（HVR-H1）；51-58、50-61、或50-66（H2）；以及97-110、97-112、99-110、或99-112（H3）。針對此些定義之每一者，可變結構域殘基係依據Kabat等人（同上）編號。
如本文所用，「互補決定區」或「CDR」係指可變結構域的高變區內具有最高序列可變性及/或參與抗原識別的區域。通常，天然抗體包含具有6個互補決定區的四條鏈；在重鏈可變結構域中有三個，VH （CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3），在輕鏈可變結構域中有三個，VL （CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3）。示例性CDRs發生在可變結構域胺基酸殘基：24-34、27-32、27-36、24-38（CDR-L1）；50-56、50-52、54-56、或54-60（CDR-L2）；89-97或93-101（CDR-L3）；31-35或26-33（CDR-H1）；50-66或51-58（CDR-H2）；以及99-112、99-110、97-112、或97-110（CDR-H3）。
「骨架區」或「FR」係指除了高變區（HVR）殘基之外的可變結構域殘基。可變結構域的FRs通常由四個結構域組成：FR1、FR2、FR3、及FR4。因此，HVR與FR序列通常以下列順序出現在VH （或VL ）中：FR1-H1（L1）-FR2-H2（L2）-FR3-H3（L3）-FR4。
除非另有說明，否則在HVRs、CDRs、FRs、及可變結構域中之其他殘基的殘基位置係依據Kabat等人（同上）編號。
「天然抗體」係指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體為約150道耳頓的異四聚體醣蛋白，由兩條相同的輕鏈及兩條相同的由雙硫鍵連接的重鏈所組成。從N端至C端，每條重鏈具有一可變區（VH ），也稱作一可變重鏈結構域或重鏈可變結構域，接著是三個恆定結構域（CH1、CH2，以及CH3）。類似地，從N端至C端，每條輕鏈具有一可變區（VL ），也稱作一可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域，接著是一恆定輕（CL）結構域。基於其恆定結構域的胺基酸序列，一抗體的輕鏈可分配為兩種類型中的一種，稱作kappa（κ）以及lambda（λ）。
如本文所用，「單株抗體」係指從基本上同質的抗體群獲得的抗體，亦即，包含該群的各個抗體是相同的及/或結合相同的抗原決定位，除了可能的變體抗體（如，變體抗體含有天然存在的突變或在單株抗體的產生過程中產生的突變，並且通常以少量存在）。與通常包括針對不同決定位（抗原表位）的不同抗體的多株抗體製劑相反，單株抗體製劑的每種單株抗體針對抗原上的單一決定位。因此，術語「單株」表示抗體的特徵是從基本上同質的抗體群體獲得的，並且不應解釋為需要透過任何特定方法產生抗體。例如，待使用的單株抗體可透過多種技術製備，包括，但不侷限於，融合瘤法、重組DNA法、噬菌體展示法，以及利用含有全部或部分人類免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法，本文描述了製備單株抗體的此類方法以及其他示例性方法。
「嵌合抗體」係指其中一部分重鏈及/或輕鏈源自特定來源或物種的抗體，而該重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同的來源或物種。
「人源化抗體」係指一嵌合抗體，其包含來自非人類高變區（HVRs）的胺基酸序列、及來自人類骨架區（FRs）的胺基酸序列。在特定實施例中，人源化抗體絕大部分包含至少一個，通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有HVRs對應於非人類抗體之那些HVRs，且所有或基本上所有的FRs對應於人類抗體之那些FRs。人源化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。一抗體（如非人類抗體）的「人源化形式」，係指已經歷人源化的抗體。
「人類抗體」係指具有如下胺基酸序列之抗體，該序列對應於由人類或人類細胞所產生之抗體，或源自使用人類抗體庫或其他人類抗體編碼序列之非人類來源抗體的胺基酸序列。此一人類抗體之定義特定排除包含非人類抗原結合殘基的人源化抗體。
「人類共有骨架」代表在人類免疫球蛋白VL 或VH 骨架序列之選擇中最常見之胺基酸殘基的骨架。通常，人類免疫球蛋白VL 或VH 序列係選自可變結構域序列的子群組。通常，序列之子群組係如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD（1991），第1~3卷之子群組。在一實施例中，針對VL ，該子群組為如Kabat等人（同上）的子群組κI。在一實施例中，針對VH ，該子群組為如Kabat等人（同上）的子群組III。
如本文所用，「受體人類骨架」為包含源自人類免疫球蛋白骨架或人類共有骨架之輕鏈可變結構域（VL ）骨架或重鏈可變結構域（VH ）骨架之胺基酸序列的骨架。「源自」人類免疫球蛋白骨架或人類共有骨架之受體人類骨架可包含相同的胺基酸序列，或其可包含胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數量為10或以下、9或以下、8或以下、7或以下、6或以下、5或以下、4或以下、3或以下、或2或以下。在一些實施例中，VL 受體人類骨架序列與VL 人類免疫球蛋白骨架序列或人類共有骨架序列相同。
「Fc區」係指包含免疫球蛋白重鏈之C端多胜肽序列的二聚體複合物，其中C端多胜肽序列可使用木瓜蛋白酶將完整抗體切除而獲得。Fc區可包含天然或變體Fc序列。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc序列的邊界可變，但人類IgG重鏈Fc序列通常定義為從Cys226左右位置的胺基酸殘基或Pro230左右位置延伸至Fc序列的羧基端。然而，Fc序列之C端離胺酸（Lys447）可存在或可不存在。免疫球蛋白之Fc序列通常包含兩個恆定結構域，即CH2結構域與CH3結構域，且視情況包含CH4結構域。
「Fc受體」或「FcR」係指結合至抗體Fc區的受體。在一些實施例中，FcR為天然人類FcR。在一些實施例中，FcR（γ受體）可與IgG抗體結合，包括FcγRI、FcγRII、及FcγRIII子類別之受體，且包括此些Fc受體之等位基因變體與替代的剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA（「活化型受體」）與FcγRIIB（「抑制型受體」），其具有類似的胺基酸序列，且主要差別在於其細胞質結構域。活化型受體FcγRIIA在其細胞質結構域中含有免疫受體酪胺酸為主之活化模體（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）。抑制型受體FcγRIIB在其細胞質結構域中含有免疫受體酪胺酸為主之抑制模體（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM）（參閱，如Daeron，Annu. Rev. Immunol. 15:203-234（1997年））。如本文所用，FcR亦包括新生型受體FcRn，其負責將母體IgGs轉移至胎兒（Guyer等人，J. Immunol. 1 17:587（1976年）及Kim等人，J. Immunol. 24:249（1994年）），且調控免疫球蛋白的恆定。FcRs係於諸如，Ravetch and Kinet，Annu. Rev. Immunol 9:457-92（1991年）；Capel等人，Immunomethods 4:25-34（1994年）；以及de Haas等人，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41（1995年）之中綜述。
「多特異性抗體」為具有至少兩個不同結合位點的抗體，每個位點具有不同結合特異性。多特異性抗體可為全長抗體或抗體片段，且不同結合位點可將每一者結合至不同抗原，或不同結合位點可結合至同一抗原的兩個不同表位。
「Fv片段」係指含有完整抗原辨識與結合位點的抗體片段。此區由緊密結合之一重鏈與一輕鏈可變結構域的二聚體組成，其在性質上可為共價，如在scFv中。在此構形中，每一可變結構域的三個HVRs交互作用，並在VH-VL二聚體的表面上定義出一抗原結合位點。六個HVRs或其子集共同賦予該抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變結構域（或包含僅三個對抗原具有特異性之HVRs之Fv的一半）具有識別與結合抗原的能力，但是通常其親和力低於整個結合位點。
「Fab片段」係指一含有輕鏈之可變與恆定結構域及重鏈之可變結構域與第一恆定結構域（CH1）的抗體片段。「F(ab’)2 片段」包含一對Fab片段，其通常於其間利用鉸鏈半胱胺酸在羧基端附近共價連接。抗體片段的其他化學偶聯在本領域中亦為已知。
如本文所用，「抗原結合臂」係指抗體之一組分具有特異性結合感興趣之標靶分子的能力。通常，抗原結合臂為免疫球蛋白多胜肽序列（如，免疫球蛋白輕鏈與重鏈之HVR及/或可變結構域序列）的錯合物。
「單鏈Fv」或「scFv」係指包含抗體之VH 與VL 結構域的抗體片段，且使用單一多胜肽鏈呈現此些結構域。通常，Fv多胜肽在VH 與VL 結構域之間進一步包含多胜肽連接子，使得scFv形成所需之抗原結合結構。
「親和力」係指一分子（如，抗體）的單個結合位點與其結合配偶體（如，一抗原）之間的非共價相互作用之總和的強度。「結合親和力」係指內在結合親和力，其反映一結合對的成員（如，抗體與抗原）之間的1：1相互作用。分子X對其配偶體Y的親和力通常可以平衡解離常數（KD ）表示。親和力可透過本領域已知的常規方法測量，包括本文所述之方法。有關測量結合親和力的具體說明性及示例性實施例描述如後。
「特異性地結合」或「特異性結合」係指抗體與抗原的結合，具有親和力值不超過約1×10-7 M。在一些實施例中，抗體對除其特異性結合之抗原以外的抗原可具有二級親和力，其中「二級親和力」通常指抗體與二級抗原以本文他處所述之大於約10 nM之親和力值結合。若抗體可對二級抗原具有二級親和力，則該抗體仍會與一級抗原特異性結合。
「經分離抗體」係指一抗體從其自然環境之組分中分離出來。在一些實施例中，抗體純化至測定純度大於95%或99%，其測量係使用如電泳法（如，SDS-PAGE、等電聚焦法（IEF）、毛細管電泳法）或層析法（如，離子交換法或逆相HPLC法）。有關評估抗體純度之方法綜述，參閱，如Flatman等人，J. Chromatogr. B 848:79-87。
「效應功能」意指歸因於抗體Fc區之生物活性，其隨抗體同種型而變。抗體效應功能之實例包括：Clq結合與補體依賴性細胞毒性（CDC）；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC）；吞噬作用；細胞表面受體（如，B細胞受體）之減量下調；以及B細胞活化。
「免疫複合體」係指一抗體鍵接至一或多個異源性分子，包括但不侷限於細胞毒性劑。
「治療（名詞）」、「治療（動詞）」或「治療（動名詞）」係指試圖改變所治療的受試者的病症的自然病程的臨床干預，並可進行預防或在臨床病理學過程中進行。期望的治療結果可包括，但不侷限於，預防疾病的發生或復發、減輕症狀、減少此類疾病的任何直接或間接的病理後果、預防轉移、降低進展速度、改善或緩解疾病狀態，以及緩解或改善預後。例如，治療可包括對一受試者投予一治療上有效量之包含抗CSF1R抗體的醫藥製劑，以延緩或緩慢CSF1R及/或其結合至CSF1或其他配體介導之疾病或病症，或CSF1R可在病理及/或病程上扮演一角色之疾病或病症。
「醫藥製劑」係指允許活性成分的生物活性有效之形式的製劑，且不含對投予該製劑之受試者具有毒性的其他成分。醫藥製劑可包括一或多個活性劑。例如，醫藥製劑可包含以抗CSF1R抗體作為製劑的唯一活性劑，或可包括抗CSF1R抗體與一或多個額外之活性劑、免疫活化劑（如IL10）、或免疫檢查點分子之抑制劑。
如本文所用的，「唯一活性劑」意指醫藥製劑中之活性劑為提供或預期提供相關藥學作用以治療受試者欲治療病症的唯一活性劑。包含唯一活性劑之醫藥製劑不排除在該製劑中存在一或多個非活性劑，例如，醫藥上可接受載體。「非活性劑」為預期不提供或另明顯有助於，旨在治療受試者病症之相關藥學作用的藥劑。
「醫藥上可接受載體」係指醫藥製劑中之一成分，而非活性成分，其對所投予之受試者無毒。醫藥上可接受載體包括但不侷限於，緩衝劑、賦形劑、穩定劑、或防腐劑。
如本文所用，「免疫檢查點分子」係指用於調節免疫系統途徑，進而防止其不必要地攻擊細胞的分子。許多免疫檢查點分子（抑制性或共刺激性）係用於治療癌症及病毒感染的免疫療法（如，以阻斷抗體阻斷免疫抑制或以促效劑促進免疫刺激）的標的。用於免疫療法的示例性免疫檢查點分子包括但不侷限於，PD1、PD-L1、LAG3、CTLA-4、A2AR、TIM-3、BTLA、CD276、CD328、VTCN1、IDO、KIR、NOX2、VISTA、OX40、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、GITR、ICOS。
如本文所用，「治療上有效量」係指實現期望之治療或預防結果的活性成分或藥劑（如，醫藥製劑）的量，例如，用於治療或預防受試者體內的疾病、障礙或病症。在CSF1R介導之疾病或病症的情況中，該治療有效量的治療劑在一定程度上減輕、預防、抑制、及/或緩解與疾病、障礙或病症相關的一或多個症狀的量。對於癌症治療，體內功效可以，例如，透過評估原發性腫瘤之生長、繼發性腫瘤之發生及/或生長、發生及/或轉移數目、持續時間、嚴重程度、及/或症狀複發率、反應率（response rate，RR）、反應持續時間、及/或生活品質來測量。
如本文所用，「同時」係指投予二或多個治療劑，其中至少一部分投予的時間重疊。據此，同時投予包括，當停止投予一或多個其他藥劑之後繼續投予一或多個藥劑時的投予方案。
「個體」或「受試者」係指哺乳動物，包括但不侷限於，馴養類動物（如，牛、綿羊、貓、狗、及馬）、靈長類動物（如，人類與非人類靈長類動物，如猴子）、兔子、及囓齒類動物（如，小鼠與大鼠）。
各 實施例之詳述
I. CSF1R 與 C S F 1
人類CSF1R（在本文中亦稱作「huCSF1R」）之序列與註釋可在UniProt登入號P07333中找到，且全長972個胺基酸序列係如本文中之SEQ ID NO: 70所示。食蟹猴CSF1R（在本文中亦稱作「cynoCSF1R」）之序列與註釋可在UniProt登入號A0A2K5WG90中找到，且全長976個胺基酸序列係如本文中之SEQ ID NO: 71所示。人類CSF1之序列與註釋（其為CSF1R之同源配體）可在NM_172212.2中找到。在本文其他處所述之實施例中，使用包含人類CSF1之Glu33-Ser190與N端His9-(SGGG)2 -IEGR標籤的較短重組型CSF1片段（「M-CSF1」）。
下表1提供本發明使用之CSF1R蛋白與重組型M-CSF1多胜肽構築體的序列，及其序列標識符號之概述。序列亦包含在隨附的序列表中。
表 1 ：CSF1R與CSF1序列
名稱 序列 S EQ ID N O:
huCSF1R (P07333) MGPGVLLLLLVATAWHGQGIPVIEPSVPELVVKPGATVTLRCVGNGSVEW DGPPSPHWTLYSDGSSSILSTNNATFQNTGTYRCTEPGDPLGGSAAIHLY VKDPARPWNVLAQEVVVFEDQDALLPCLLTDPVLEAGVSLVRVRGRPLMR HTNYSFSPWHGFTIHRAKFIQSQDYQCSALMGGRKVMSISIRLKVQKVIP GPPALTLVPAELVRIRGEAAQIVCSASSVDVNFDVFLQHNNTKLAIPQQS DFHNNRYQKVLTLNLDQVDFQHAGNYSCVASNVQGKHSTSMFFRVVESAY LNLSSEQNLIQEVTVGEGLNLKVMVEAYPGLQGFNWTYLGPFSDHQPEPK LANATTKDTYRHTFTLSLPRLKPSEAGRYSFLARNPGGWRALTFELTLRY PPEVSVIWTFINGSGTLLCAASGYPQPNVTWLQCSGHTDRCDEAQVLQVW DDPYPEVLSQEPFHKVTVQSLLTVETLEHNQTYECRAHNSVGSGSWAFIP ISAGAHTHPPDEFLFTPVVVACMSIMALLLLLLLLLLYKYKQKPKYQVRW KIIESYEGNSYTFIDPTQLPYNEKWEFPRNNLQFGKTLGAGAFGKVVEAT AFGLGKEDAVLKVAVKMLKSTAHADEKEALMSELKIMSHLGQHENIVNLL GACTHGGPVLVITEYCCYGDLLNFLRRKAEAMLGPSLSPGQDPEGGVDYK NIHLEKKYVRRDSGFSSQGVDTYVEMRPVSTSSNDSFSEQDLDKEDGRPL ELRDLLHFSSQVAQGMAFLASKNCIHRDVAARNVLLTNGHVAKIGDFGLA RDIMNDSNYIVKGNARLPVKWMAPESIFDCVYTVQSDVWSYGILLWEIFS LGLNPYPGILVNSKFYKLVKDGYQMAQPAFAPKNIYSIMQACWALEPTHR PTFQQICSFLQEQAQEDRRERDYTNLPSSSRSGGSGSSSSELEEESSSEH LTCCEQGDIAQPLLQPNNYQFC 70
cynoCSF1R (XP_005558297.1) MGPGVLLLLLVVTAWHGQGIPVIEPSGPELVVKPGETVTLRCVGNGSVEW DGPISPHWTLYSDGPSSVLTTNNATFQNTRTYRCTEPGDPLGGSAAIHLY VKDPARPWNVLAKEVVVFEDQDALLPCLLTDPVLEAGVSLVRLRGRPLLR HTNYSFSPWHGFIIHRAKFIQGQDYQCSALMGGRKVMSISIRLKVQKVIP GPPALTLVPAELVRIRGEAAQIVCSASNIDVDFDVFLQHNTTKLAIPQRS DFHDNRYQKVLTLSLGQVDFQHAGNYSCVASNVQGKHSTSMFFRVVESAY LDLSSEQNLIQEVTVGEGLNLKVMVEAYPGLQGFNWTYLGPFSDHQPEPK LANATTKDTYRHTFTLSLPRLKPSEAGRYSFLARNPGGWRALTFELTLRY PPEVSVIWTSINGSGTLLCAASGYPQPNVTWLQCAGHTDRCDEAQVLQVW VDPHPEVLSQEPFQKVTVQSLLTAETLEHNQTYECRAHNSVGSGSWAFIP ISAGARTHPPDEFLFTPVVVACMSVMALLLLLLLLLLYKYKQKPKYQVRW KIIESYEGNSYTFIDPTQLPYNEKWEFPRNNLQFGKTLGAGAFGKVVEAT AFGLGKEDAVLKVAVKMLKSTAHADEKEALMSELKIMSHLGQHENIVNLL GACTHGGPVLVITEYCCYGDLLNFLRRKAEAMLGPSLSPGQDPEGGADYK NIHLEKKYVRRDSGFSSQGVDTYVEMRPVSTSSNDSFSEQDLDKEDGRPL ELWDLLHFSSQVAQGMAFLASKNCIHRDVAARNVLLTNGHVAKIGDFGLA RDIMNDSNYIVKGNARLPVKWMAPESIFDCVYTVQSDVWSYGILLWEIFS LGLNPYPGILVNSKFYKLVKDGYQMAQPAFAPKNIYSIMQACWALEPTHR PTFQQICSLLQEQAQEDRRERDYTNLPSSSRSGGSGSGSSSSSSEPEEES SSEHLACCEQGDIAQPLLQPNNYQFC 71
人類 M-CSF1 HHHHHHHHHSGGGSGGGIEGREEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDSQMETS CQITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMEDTMRFRDNTPNAIAIVQLQ ELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDW NIFSKNCNNSFAECSSQGHERQSEGS   72
II. IL10
下表2提供本發明實施例中使用之人類IL10多胜肽與兩個重組型IL10-Fc融合體構築體的序列，及其序列標識符號的概述。序列亦包含在隨附的序列表中。
表 2 ：重組型IL10多胜肽（包括IL10-Fc融合體）序列
說明 序列 SEQ ID NO:
IL10-Fc SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKE SLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKT LRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYI EAYMTMKIRN GGGGSGGGGSGGGGS pkscdkthtcppcpapellggpsvf lfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkp reeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakg qprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpenny kttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqksl slspgk   73
(IL10)2 -Fc SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKE SLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKT LRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYI EAYMTMKIRNGGGGSGGGGSGGGG SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDL RDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEV MPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKN AFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN GGGGSGGGGSGGGGS p kscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvs hedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngk eykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltc lvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrw qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk   74
IL-10 SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKE SLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKT LRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYI EAYMTMKIRN   75
可變結構域：大寫 恆定結構域：小寫 連接子：斜體大寫 IL-10：加底線大寫 人類IgG1 Fc片段：粗體小寫
III. 抗 CSF1R 抗體
在一些實施例中，本發明提供抗CSF1R抗體的結構，其為基於各種已知免疫球蛋白特徵（如，CDRs、FRs、VH 、VL 結構域，及全長重鏈與輕鏈）之胺基酸與編碼核苷酸序列。下表3提供本發明抗CSF1R抗體序列之概述，包括抗體融合體及其序列標識符號。序列包含在隨附之序列表中。
表 3 ：抗CSF1R抗體（包括抗體融合體）序列
說明 序列 SEQ ID NO:
6D4 - VH GAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTGAAGCCTAGGGCTTC AGTGAAGATATCCTGCGAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACAACA TGAACTGGGTGAAGCAGAGCCCTGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGAT ATTAATCCTTACTATGGTGCTACTACCTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAA GGCCACATTGACTGTAGACAAATCTTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCA ACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAAGAGGG GACTATGGTGACTACGAGGGCTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGAC CACGGTCACCGTCTCCTCA 1
6D4 - VH EIQLQQSGAELVKPRASVKISCEASGYSFTGYN MNWVKQSPGKSLEWIGDINPYYGAT TYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRG DYGDYEGWYFDV WGAGTTVTVSS 2
6D4 – CDR-H1 (IMGT) GYSFTGYN 3
6D4 – CDR-H1 (Kabat) GYNMN 4
6D4 – HVR-H1 (Kabat) GYSFTGYN 5
6D4 - CDR-H2 (IMGT) INPYYGAT 6
6D4 – CDR-H2 (Kabat) 6D4 – HVR-H2 (Kabat) DINPYYGATTYNQKFKG 7
6D4 – CDR-H3 (IMGT) ARRGDYGDYEGWYFDV 8
6D4 – CDR-H3 (Kabat) RGDYGDYEGWYFDV 9
6D4 – HVR-H3 (Kabat) ARRGDYGDYEGWYFDV 10
6D4 – VL GACATCCAGATGAACCAGTCTCCATCCAGTCTGTCTGCATCCCTTGGAGA CACAATTACCATCACTTGCCATGCCAGTCAGAACATTAATGTTTGGTTAA GCTGGTACCAGCAGAAACCAGGAAATATTCCTAAACTATTGATCTATAAG GCTTCCAACTTGCACACAGGCGTCCCATCAAGGTTTAGTGGCAGTGGATC TGGAACAGGTTTCACATTAACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGACATTG CCACTTACTACTGTCAACAGGGTCAAAGTTATCCGTACACGTTCGGAGGG GGGACCAAGCTGGAAATAAAA 11
6D4 – VL DIQMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNINVW LSWYQQKPGNIPKLLIYK AS NLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPYT FGG GTKLEIK 12
6D4 – CDR-L1 (IMGT) QNINVW 13
6D4 – CDR-L1 (Kabat) HASQNINVWLS 14
6D4 – HVR-L1 (Kabat)    
6D4 – CDR-L2 (IMGT) KAS n/a
6D4 – CDR-L2 (Kabat) 6D4 – HVR-L2 (Kabat) KASNLHT 15
6D4 - CDR-L3 (IMGT) QQGQSYPYT 16
6D4 - CDR-L3 (Kabat) 6D4 – HVR-L3 (Kabat) QQGQSYPYT 17
6D4.hu22 - VH CAGATTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTC TGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACCGGCTACAACA TGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAGAGCCTGGAATGGATCGGCGAC ATCAACCCCTACTACGGCGCCACCACCTACAACCAGAAATTCAAGGGCAG AGTGACCCTGACCGTGGACACCAGCACAAGCACCGCCTACATGGAACTGA GCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAAGAGGC GACTACGGCGATTACGAAGGCTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCAC AATGGTCACAGTTAGCTCT 18
6D4.hu22 - VH QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGKSLEWIGD INPYYGATTYNQKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRG DYGDYEGWYFDVWGQGTMVTVSS 19
6D4.hu22 - VL GACATCCAGATGACACAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGA CAGAGTGACCATCACCTGTCACGCCAGCCAGAACATCAACGTGTGGCTGA GCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAACGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAAG GCCAGCAATCTGCACACCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCTCTGGCAG CGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCTGCAGCCTGAGGACATTG CCACCTACTACTGTCAGCAGGGCCAGAGCTACCCCTACACATTTGGCGGA GGCACCAAGCTGGAAATCAAG 20
6D4.hu22 - VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGNAPKLLIYK ASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPYTFGG GTKLEIK 21
6D4.hu41 - VH GAGATTCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTC CGTGAAGATCAGCTGTGAAGCCAGCGGCTACAGCTTCACCGGCTACAACA TGAACTGGGTCAAGCAGGCCCCTGGCAAGAGCCTGGAATGGATCGGCGAC ATCAACCCCTACTACGGCGCCACCACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAG AGCCACACTGACCGTGGACACCAGCACAAGCACCGCCTACATGGAACTGA GCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAAGAGGC GACTACGGCGATTACGAAGGCTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCAC AATGGTCACAGTTAGCTCT 22
6D4.hu41 - VH EIQLQQSGAEVKKPGASVKISCEASGYSFTGYNMNWVKQAPGKSLEWIGD INPYYGATTYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRG DYGDYEGWYFDVWGQGTMVTVSS 23
6D4.hu41 - VL GACATCCAGATGACACAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGA CAGAGTGACCATCACCTGTCACGCCAGCCAGAACATCAACGTGTGGCTGA GCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAACGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAAG GCCAGCAATCTGCACACCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCTCTGGCAG CGGCACCGACTTCACCTTCACCATATCTAGCCTGCAGCCTGAGGACATTG CCACCTACTACTGTCAGCAGGGCCAGAGCTACCCCTACACATTTGGCGGA GGCACCAAGCTGGAAATCAAG 24
6D4.hu41 - VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGNAPKLLIYK ASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPYTFGG GTKLEIK 25
6M6 - VH GATGTTCAACTCCAGCAGTCTGGGACTGTGCTGGCACGGCCTGGGGCTTC AGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCAGCTACTGGA TACACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGCGCT ATTTATCCTGGAAATAGAGATACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAA GGCCAAACTGACTACAGTCACATCTGCCAGCACTGCCTACATGGAGCTCA GCAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACGGGGGCCTTT GCTGGTTACTACGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGT CACCGTCTCCTCA 26
6M6 - VH DVQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTSYW IHWVKQRPGQGLEWIGAIYPGNRDT NYNQKFKGKAKLTTVTSASTAYMELSSLTNEDSAVYYCTGAF AGYYDWYFDV WGAGTTVTVSS 27
6M6 - CDR-H1 (IMGT) GYTFTSYW 28
6M6 - CDR-H1 (Kabat) SYWIH 29
6M6 - HVR-H1 (Kabat) GYTFTSYWIH 30
6M6 - CDR-H2 (IMGT) IYPGNRDT 31
6M6 - CDR-H2 (Kabat) 6M6 - HVR-H2 (Kabat) AIYPGNRDTNYNQKFKG 32
6M6 - CDR-H3 (IMGT) 6M6 - HVR-H3 (Kabat) TGAFAGYYDWYFDV 33
6M6 - CDR-H3 (Kabat) AFAGYYDWYFDV 34
6M6 - VL GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCA GAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAGGTGTTGATTATGCTGGTG ATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTC CTCATCTATGTTGCATCCGATCTGGATTCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAG TGGCAGTGGGTCTGGGACAAACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGG AGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTTATGAGGATCCTCGG ACGTTCGGTGGAGGCACCACGCTGGAAATCCAA 35
6M6 - VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQGVDYAGDSY MNWYQQKPGQPPKL LIYVAS DLDSGIPARFSGSGSGTNFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSYEDPR T FGGGTTLEIQ 36
6M6 - CDR-L1 (IMGT) QGVDYAGDSY 37
6M6 - CDR-L1 (Kabat) 6M6 - HVR-L1 (Kabat) KASQGVDYAGDSYMN 38
6M6 - CDR-L2 (IMGT) VAS n/a
6M6 - CDR-L2 (Kabat) 6M6 - HVR-L2 (Kabat) VASDLDS 39
6M6 - CDR-L3 IMGT QQSYEDPRT 40
6M6 - CDR-L3 (Kabat) 6M6 - HVR-L3 (Kabat) QQSYEDPRT 41
6M6.hu12 - VH CAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAAAAACCTGGCGCCTC CGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGA TTCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGACAAGGCTTGGAATGGATGGGCGCC ATCTATCCCGGCAACCGGGACACCAACTACAACCAGAAATTCAAGGGCAG AGTGACCCTGACCACCGACACATCTGCCAGCACCGCCTACATGGAACTGA GCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTACAGGCGCCTTT GCCGGCTACTACGACTGGTACTTTGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGT GACAGTTAGTTCT 42
6M6.hu12 - VH QVQLQQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWMGA IYPGNRDTNYNQKFKGRVTLTTDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTGAF AGYYDWYFDVWGQGTTVTVSS 43
6M6.hu12 - VL GACATTGTGCTGACACAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGA AAGAGCCACCATCAACTGCAAGGCCAGCCAGGGCGTTGACTACGCCGGCG ACAGCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTG CTGATCTACGTGGCCAGCGATCTGGACAGCGGCATCCCCGATAGATTTTC CGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTTACAATCAGTTCCCTGCAGG CCGAGGACGTGGCCACCTACTATTGTCAGCAGAGCTACGAGGACCCCAGA ACCTTTGGCGGCGGAACCACACTGGAAATCAAG 44
6M6.hu12 - VL DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQGVDYAGDSYMNWYQQKPGQPPKL LIYVASDLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVATYYCQQSYEDPR TFGGGTTLEIK 45
6M6.hu41 - VH CAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCCGTGGTCAAAAAACCTGGCGCCTC CGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGA TTCACTGGGTCAAGCAGGCCCCTGGACAGGGCCTTGAATGGATCGGAGCC ATCTATCCCGGCAACCGGGACACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAG AGCCACACTGACCACCGATACCTCTGCCAGCACCGCCTACATGGAACTGA GCAGCCTGACCAGCGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTACAGGCGCCTTC GCCGGCTACTACGACTGGTACTTTGATGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGT GACAGTTAGTTCTG 46
6M6.hu41 - VH QVQLQQSGAVVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWIHWVKQAPGQGLEWIGA IYPGNRDTNYNQKFKGRATLTTDTSASTAYMELSSLTSEDTAVYYCTGAF AGYYDWYFDVWGQGTTVTVSS 47
6M6.hu41 - VL GACATTGTGCTGACACAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGA AAGAGCCACCATCAACTGCAAGGCCAGCCAGGGCGTTGACTACGCCGGCG ACAGCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTG CTGATCTACGTGGCCAGCGATCTGGATAGCGGCGTGCCCGATAGATTTTC TGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATTAGCTCCCTGCAGG CCGAGGATGTGGCCACCTACTACTGTCAGCAGAGCTACGAGGACCCCAGA ACCTTTGGCGGCGGAACCACACTGGAAATCAAG 48
6M6.hu41 - VL DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQGVDYAGDSYMNWYQQKPGQPPKL LIYVASDLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVATYYCQQSYEDPR TFGGGTTLEIK 49
6D4/IL10 - VH EIQLQQSGAELVKPRASVKISCEASGYSFTGYNMNWVKQSPGKSLEWIGD INPYYGATTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRG DYGDYEGWYFDVWGAGTTVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgc lvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslg tqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfp pkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpree qynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpr epqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennyktt ppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsls pgkLGGGGSGGGGSGGGG SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSR VKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAEN QDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQ EKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN 50
6D4/(IL10)2 - VH EIQLQQSGAELVKPRASVKISCEASGYSFTGYNMNWVKQSPGKSLEWIGD INPYYGATTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRG DYGDYEGWYFDVWGAGTTVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgc lvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslg tqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfp pkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpree qynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpr epqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennyktt ppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsls pgkLGGGGSGGGGSGGGG SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSR VKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAEN QDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQ EKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGGGSGGGGSGGGG SPGQGTQS ENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKG YLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRC HRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKI RN   51
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6D4 - HC EIQLQQSGAELVKPRASVKISCEASGYSFTGYNMNWVKQSPGKSLEWIGD INPYYGATTYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRG DYGDYEGWYFDVWGAGTTVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgc lvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslg tqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfp pkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpree qynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpr epqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennyktt ppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsls pgk 58
6D4 - LC DIQMNQSPSSLSASLGDTITITCHASQNINVWLSWYQQKPGNIPKLLIYK ASNLHTGVPSRFSGSGSGTGFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPYTFGG GTKLEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkv dnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqg lsspvtksfnrgec 59
6D4.hu22 - HC QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGKSLEWIGD INPYYGATTYNQKFKGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRG DYGDYEGWYFDVWGQGTMVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgc lvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslg tqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfp pkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpree qynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpr epqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennyktt ppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsls pgk 60
6D4.hu22 - LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGNAPKLLIYK ASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPYTFGG GTKLEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkv dnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqg lsspvtksfnrgec 61
6D4.hu41 - HC EIQLQQSGAEVKKPGASVKISCEASGYSFTGYNMNWVKQAPGKSLEWIGD INPYYGATTYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRG DYGDYEGWYFDVWGQGTMVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgc lvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslg tqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfp pkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpree qynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpr epqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennyktt ppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsls pgk 62
6D4.hu41 - LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNINVWLSWYQQKPGNAPKLLIYK ASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGQSYPYTFGG GTKLEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkv dnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqg lsspvtksfnrgec 63
6M6 - HC DVQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGA IYPGNRDTNYNQKFKGKAKLTTVTSASTAYMELSSLTNEDSAVYYCTGAF AGYYDWYFDVWGAGTTVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclv kdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtq tyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppk pkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqy nstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprep qvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttpp vldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg k 64
6M6 - LC DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQGVDYAGDSYMNWYQQKPGQPPKL LIYVASDLDSGIPARFSGSGSGTNFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSYEDPR TFGGGTTLEIQRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakv qwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacev thqglsspvtksfnrgec 65
6M6.hu12 - HC QVQLQQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWMGA IYPGNRDTNYNQKFKGRVTLTTDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTGAF AGYYDWYFDVWGQGTTVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclv kdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtq tyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppk pkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqy nstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprep qvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttpp vldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg k 66
6M6.hu12 - LC DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQGVDYAGDSYMNWYQQKPGQPPKL LIYVASDLDSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVATYYCQQSYEDPR TFGGGTTLEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakv qwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacev thqglsspvtksfnrgec 67
6M6.hu41 - HC QVQLQQSGAVVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWIHWVKQAPGQGLEWIGA IYPGNRDTNYNQKFKGRATLTTDTSASTAYMELSSLTSEDTAVYYCTGAF AGYYDWYFDVWGQGTTVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclv kdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtq tyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppk pkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqy nstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprep qvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttpp vldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg k 68
6M6.hu41 - LC DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQGVDYAGDSYMNWYQQKPGQPPKL LIYVASDLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVATYYCQQSYEDPR TFGGGTTLEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakv qwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacev thqglsspvtksfnrgec 69
可變結構域：大寫 恆定結構域：小寫 連接子：斜體大寫 IL-10：加底線大寫 人類IgG1 Fc片段：粗體小寫
1 . 抗 CSF1R 抗體 結合親和力及功能特徵
在一些實施例中，本文提供之抗CSF1R抗體以＜ 100 nM、＜ 10 nM、＜ 1 nM、＜ 0.1 nM、＜ 0.01 nM、或＜ 0.001 nM（如，10-8 M或以下，10-8 M至10-13 M，如，10-9 M至10-13 M）之平衡解離常數（KD ）結合至CSF1R。
考量到本文所揭示產生之各種抗CSF1R抗體，包括能以高親和力結合至hu-CSF1R、cy-CSF1R、及hu-CSF1R與cy-CSF1R兩者的抗體。更特別的是，在一些實施例中，本發明之抗CSF1R抗體以1 x 10-8 M或以下、1 x 10-9 M或以下、1 x 10-10 M或以下、或1 x 10-11 M或以下之結合親和力結合至hu-CSF1R。在一些實施例中，結合親和力為測量結合至SEQ ID NO: 70之huCSF1R多胜肽的平衡解離常數（KD ）。在一些實施例中，本發明之抗CSF1R抗體以1 x 10-8 M或以下、1 x 10-9 M或以下、1 x 10-10 M或以下、或1 x 10-11 M或以下之結合親和力結合至cy-CSF1R。在一些實施例中，結合親和力為測量結合至SEQ ID NO: 71之cynoCSF1R多胜肽的平衡解離常數（KD ）。在一些實施例中，本發明之抗CSF1R抗體以1 x 10-8 M或以下、1 x 10-9 M或以下、1 x 10-10 M或以下、或1 x 10-11 M或以下之結合親和力結合至huCSF1R與cynoCSF1R兩者。在一些實施例中，結合親和力為測量結合至SEQ ID NO: 70之huCSF1R多胜肽與SEQ ID NO: 75之cynoCSF1R多胜肽的平衡解離常數（KD ）。
通常，可使用多種測量方法中之任一者確定配體與其受體之結合親和力，並以多種定量值表示。本文實施例中揭示可用於確定抗體親和力之特定CSF1R結合試驗。此外，抗原結合試驗為本領域已知，且可用於本發明，包括但不侷限於，使用諸如西方墨點法、放射免疫測量法、酵素連接免疫吸附測量法（ELISA）、「三明治」免疫測量法、表面電漿共振為主之試驗（如WO2005/012359所述之BIAcore測量法）、免疫沉澱測量法、螢光免疫測量法、蛋白A免疫測量法、流式細胞儀與螢光激活細胞分選（FACS）測量法等技術的任何直接或競爭性結合試驗。
據此，在一些實施例中，結合親和力以KD 值表示，反映出固有的結合親和力（如，具有最小的活性作用）。本發明之抗CSF1R抗體對SEQ ID NO: 70之huCSF1R多胜肽呈現強的結合親和力，例如，呈現出KD 值介於10 nM與1 pM之間。據此，本發明之抗CSF1R抗體可與具有CSF1R相同或重疊表位之親和力較低之抗體競爭。
在一些實施例中，本文提供之抗CSF1R抗體可減少、抑制、及/或完全阻斷CSF1與CSF1R的結合，以及由CSF1與CSF1R之結合所介導之免疫調節及/或免疫傳訊，包括在腫瘤微環境中TAMs的維持。利用已知之細胞分析試驗法，包括本發明實施例中所描述之該些試驗，可在體外測量抗體抑制此些由CSF1與CSF1R之結合所介導之免疫調節與免疫傳訊途徑的能力。
此外，本文提供之抗CSF1R抗體包含具有IL10之抗體融合體，且據此可提供由IL10促效劑活性介導之作用，包括在腫瘤微環境中活化CD8+ T細胞。具有IL10之抗CSF1R抗體融合體所具有的IL10促效劑活性，可利用已知之細胞分析試驗法在體外進行測量，包括本發明實施例所述之試驗。
據此，在一些實施例中，本發明所述CSF1R抗體具有至少一項下列功能特徵，其特性立基於減少、抑制、及/或完全阻斷由CSF1R所介導之細胞內訊息傳遞。
在至少一實施例中，抗CSF1R抗體以1 x 10-8 M或以下、1 x 10-9 M或以下、1 x 10-10 M或以下之結合親和力結合至人類CSF1R；視情況其中結合親和力為測量對SEQ ID NO: 70之huCSF1R多胜肽的平衡解離常數（KD ）。
在至少一實施例中，抗CSF1R抗體以1 x 10-8 M或以下、1 x 10-9 M或以下、1 x 10-10 M或以下之結合親和力結合至食蟹猴CSF1R；視情況其中結合親和力為測量對SEQ ID NO: 71之cynoCSF1R多胜肽的平衡解離常數（KD ）。
在至少一實施例中，抗CSF1R抗體減少CSF1誘發及IL34誘發的huCSF1R或AKT磷酸化。
在至少一實施例中，抗CSF1R抗體抑制CSF1依賴性及IL34誘發的細胞增生達至少65%、至少75%、至少85%、至少95%、或至少100%；視情況其中在CSF1濃度為20 ng/mL或IL34濃度為33 ng/mL時，抗體的IC50 為5 nM或以下、1 nM或以下、0.5 nM或以下、或0.1 nM或以下。
在至少一實施例中，抗CSF1R抗體抑制人類CD14+單核細胞或單核細胞衍生之巨噬細胞的CSF1依賴性存活率達至少65%、至少75%、至少85%、至少95%、或至少100%；視情況其中在CSF1濃度為100 ng/mL時，抗體的IC50 為5 nM或以下、1 nM或以下、0.5 nM或以下、或0.1 nM或以下。
在至少一實施例中，抗CSF1R抗體增加NK細胞對表現CSF1R之293F細胞所介導的ADCC活性達至少10%、至少20%、或至少25%。
在至少一實施例中，抗CSF1R抗體在第21天測量的同基因型小鼠腫瘤模式中減少腫瘤體積達至少25%、至少50%、至少75%、或以上，其中小鼠腫瘤模式選自於：CT26結腸癌、EMT6三陰性乳癌、MC38 結腸癌、Renca腎癌、LL/2肺癌、Pan02胰腺癌、H22肝癌、Q1頭頸癌。
在至少一實施例中，抗CSF1R抗體在CT26結腸腫瘤同基因型小鼠模式中增加CSF1與IL34的血液濃度達至少50倍、至少100倍、至少200倍、或至少500倍。
在至少一實施例中，抗CSF1R抗體在CT26結腸腫瘤同基因型小鼠模式中減少TAM群達至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、或以上；視情況其中MDSC群係減至小於10%、小於5%、或以下。
在至少一實施例中，抗CSF1R抗體增加MC/9細胞增生達至少25%、至少50%、至少100%、至少150%、至少200%、或以上。
在至少一實施例中，抗CSF1R抗體增加活化之CD8 T細胞中IFNγ與顆粒溶解酶B產生達至少25%、至少50%、至少100%、或以上。
在至少一實施例中，抗CSF1R抗體在CT26結腸腫瘤同基因型小鼠模式中增加CD8+LAG3+PD1+ T細胞血液濃度達至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、或以上。
2 . 抗 CSF1R 抗體 片段
在一些實施例中，本發明之抗CSF1R抗體可為抗體片段。可用於本發明結合決定子（determinant）之抗體片段包括但不侷限於，Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab’)2 、Fv、scFv片段、單價、單一結構域抗體、一臂（one-armed）或單臂（single-arm）抗體、及本領域已知與本文所述之其他片段。據此，在本發明抗CSF1R抗體之一些實施例中，抗體為選自於由F(ab’)2 、Fab'、Fab、Fv、單一結構域抗體（VHH）、單臂抗體、及scFv組成之抗體片段。
欲回顧各種抗體片段，參閱，如Hudson等人，Nat. Med. 9: 129-134（2003年）。欲回顧scFv片段，參閱，如Pluckthun，in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol. 113，Rosenburg and Moore eds. （Springer-Verlag，New York），pp. 269-315（1994年）；亦參閱，WO93/16185；以及美國專利號5,571,894與5,587,458。針對含有搶救受體結合表位殘基及具有增加之體內半衰期之Fab與F(ab’)2 片段的說明，參閱美國專利號5,869,046。其他單價抗體形式說明於，如WO2007/048037、WO2008/145137、WO2008/145138、及WO2007/059782。單價、單臂抗體說明於，如WO2005/063816。雙抗體為具有兩個抗原-結合位點的抗體片段，其可為雙價或雙特異性（參閱，如EP0404097；WO93/01161；Hudson等人，Nat. Med. 9: 129- 134（2003年）；以及Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448（1993年））。
在一些實施例中，抗體片段為單一結構域抗體，其包含抗體之所有或一部份的重鏈可變結構域或所有或一部份的輕鏈可變結構域。在一些實施例中，單一結構域抗體為人類單一結構域抗體（Domantis, Inc.，Waltham，MA；參閱，如美國專利號6,248,516）。
抗體片段可利用各種技術製造，包括但不侷限於，完整抗體的蛋白水解，以及利用重組型宿主細胞（如，大腸桿菌或噬菌體）產生，如本文所述。
3. 嵌合、人源化、及人類抗 CSF1R 抗體
在一些實施例中，本發明之抗CSF1R抗體可為嵌合抗體（參閱，如美國專利號4,816,567所述之嵌合抗體；以及Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855（1984年））。在一實施例中，嵌合抗體包含非人類可變區（如，可變區源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔子、或非人類靈長類動物，如猴子）及人類恆定區。在一些實施例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類別已從母代抗體更改。考量到嵌合抗體可包括其抗原結合片段。
在一些實施例中，本發明之抗CSF1R抗體為人源化抗體。通常，非人類抗體係經人源化以降低對人類的免疫原性（immunogenicity），但保留親代非人類抗體的特異性與親和力。通常，人源化抗體包含一或多個可變結構域，其中HVRs、CDRs（或其部分）係源自非人類抗體，且FRs（或其部分）係源自人類抗體序列。人源化抗體選擇性地亦將包含至少一部份的人類恆定區。在一些實施例中，人源化抗體中的一些FR殘基係以非人類抗體（如，CDR殘基之來源抗體）之相應殘基取代，以恢復或改善抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其製造方法之回顧，如，Almagro and Fransson，Front. Biosci. 13: 1619-1633（2008年），且進一步說明於，如Riechmann等人，Nature 332:323-329（1988年）；Queen等人，Proc. Nat Ί Acad. Sci. USA 86: 10029-10033（1989年）；美國專利號5,821,337、7,527,791、6,982,321、及7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34（2005年）（描述SDR（a-HVR）接枝反應）；Padlan，Mol. Immunol. 28:489-498（1991年）（描述「再表面化」）；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60（2005年）（描述「FR調換」）；以及Osbourn等人，Methods 36:61-68（2005年）與Klimka等人，Br. J. Cancer, 83:252-260（2000年）（描述FR調換的「指導選擇」方法）。
可用於人源化之人類骨架區包括但不侷限於，「最適化」方法選取的骨架區（參閱，如Sims et al. J. Immunol. 151:2296（1993年））；源自輕鏈或重鏈可變區特定子群組之人類抗體共有序列的骨架區（參閱，如Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285（1992年）；以及Presta等人，J. Immunol, 151:2623（1993年））；人類成熟（體細胞突變型）骨架區或人類種系骨架區（參閱，如Almagro and Fransson，Front. Biosci. 13:1619- 1633（2008年））；以及源自篩選FR文庫的骨架區（參閱，如Baca等人，J. Biol. Chem. 272:10678-10684（1997年）及Rosok等人，J. Biol. Chem. 271:22611-22618（1996年））。
在一些實施例中，本發明之抗CSF1R抗體可為人類抗體。人類抗體可利用本領域中已知的各種技術產生。人類抗體通常描述於van Dijk and van de Winkel，Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74（2001年）及Lonberg，Curr. Opin. Immunol. 20:450-459（2008年）。可利用投予轉基因動物免疫原，以製備人類抗體，該轉基因動物經改良以響應抗原性攻擊，產生具有人類可變區的完整人類抗體或完整抗體。此類動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，以取代內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此類轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常失活。針對由轉基因動物中取得人類抗體之方法的綜述，參閱Lonberg，Nat. Biotech. 23:1117- 1125（2005年）。亦參閱，如美國專利號6,075,181與6,150,584之XENOMOUSE™技術；美國專利號5,770,429之HUMAB® 技術；美國專利號7,041,870之K-M MOUSE® 技術；以及美國專利申請公開號2007/0061900之VELOCIMOUSE® 技術）。利用諸如結合不同的人類恆定區，可進一步改良由此類動物產生之完整抗體的人類可變區。
人類抗體亦可利用融合瘤為主的方法製造。用於生產人類單株抗體的人類骨髓瘤與小鼠-人類異種骨髓瘤細胞株已有描述。參閱，如Kozbor J. Immunol, 133:3001（1984年）；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63（Marcel Dekker, Inc.，New York，1987年）；以及Boerner等人，J. Immunol., 147: 86（1991年）。通過人類B細胞融合瘤技術產生的人類抗體亦描述於Li等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557- 3562（2006年）。其他方法包括那些描述於，例如美國專利號7,189,826（描述由融合瘤細胞株產生的單株人類IgM抗體）。人類融合瘤技術（三源融合瘤技術（Trioma technology））亦描述於Vollmers and Brandlein，Histology and Histopathology, 20（3）:927-937（2005年）及Vollmers and Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology , 27（3）: 185-91（2005年）。
亦可利用分離Fv殖株可變結構域序列（其係選自於人類衍生之噬菌體展示文庫）產生人類抗體。此類可變結構域序列可隨後與所需之人類恆定結構域結合。從抗體文庫選取人類抗體之技術描述如下。
4. 文庫衍生之抗 CSF1R 抗體變體
在至少一實施例中，利用篩選組合文庫中具有所需改善之功能特性（如，結合親和力或交叉反應性）的抗體，可分離出抗CSF1R抗體的改良變體。例如，本領域已知有多種產生噬菌體展示文庫的方法，且篩選此類變體抗體文庫，產生改善的結合特性。其他用於產生此文庫衍生之抗體的方法可於，如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178: 1-37（O'Brien等人，ed., Humana Press，Totowa，NJ，2001年）；McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature 352: 624-628（1991年）；Marks等人，J. Mol. Biol. 222: 581-597（1992年）；Marks and Bradbury，m Methods in Molecular Biology 248: 161-175（Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ，2003年）；Sidhu等人，J. Mol. Biol. 338（2）: 299- 310（2004年）；Lee等人，J. Mol. Biol. 340（5）: 1073-1093（2004年）；Fellouse，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101（34）: 12467-12472（2004年）；以及Lee等人，J. Immunol. Methods 284（1-2）: 1 19-132（2004年）中發現。
5 .多特異性 抗體
在至少一實施例中，考量到本發明之抗CSF1R抗體可為多特異性抗體，如，雙特異性抗體。在一些實施例中，多特異性抗體具有至少二個不同的結合位點，每一者具有對不同抗原的結合特異性，其中至少一者特異性地結合CSF1R。在至少一實施例中，考量到多特異性抗體為包含CSF1R特異性與另一介導免疫調節、免疫傳訊、及/或在癌症或腫瘤細胞上表現之抗原特異性的雙特異性抗體。例如，其他特異性可針對免疫檢查點分子，如PD1、LAG3、CTLA-4、A2AR、TIM-3、BTLA、CD276、CD328、VTCN1、IDO、KIR、NOX2、VISTA、OX40、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、GITR、或ICOS。
製造多特異性抗體之技術包括但不侷限於，具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表現（參閱，如Milstein and Cuello，N a t u re 305: 537（1983年）、WO 93/08829、及Traunecker等人，EMBOJ. 10:3655（1991年））。「孔內旋鈕（Knob-in-hole）」基因工程法亦可用於產生本發明抗CSF1R抗體適用之雙特異性抗體。孔內旋鈕基因工程技術為本領域中已知，且描述於，如美國專利號5,731,168。
多特異性抗體亦可利用工程上的「靜電轉向（electrostatic steering）」效應製造，其有利於形成Fc雜二聚體抗體分子，而非同型二聚體（WO 2009 / 089004A1）；交聯二或多個抗體或片段（參閱，如美國專利號4,676,980與Brennan等人，Science, 229: 81（1985年））；利用白胺酸拉鍊（leucine zippers）製造雙特異性抗體（參閱，如Kostelny等人，J. Immunol, 148（5）: 1547-1553（1992年））；利用「雙抗體（diabody）」技術製造雙特異性抗體片段（參閱，如Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448（1993年））；利用單鏈Fv（scFv）二聚體（參閱，如Gruber等人，J. Immunol, 152:5368（1994年））；或三特異性抗體（參閱，如Tutt等人，J. Immunol. 147: 60（1991年）。
6 . 抗 CSF1R 抗體之變體
在一些實施例中，預期本發明抗CSF1R抗體之變體具有改善的特性，如抗體之結合親和力及/或其他生物性質。可將適當之修飾導入編碼抗體的核苷酸序列中，或通過胜肽合成，以製備變體。此類修飾包括，例如，在抗體之胺基酸序列中進行殘基之刪除及/或插入及/或取代。可進行刪除、插入、及取代的任意組合，以得到最終的構築體，其具有所需之CSF1R抗原結合特性。
A . 取代、插入、及刪除 變體
在一些實施例中，除了所提供之本文所述的那些，抗CSF1R抗體變體具有一或多個胺基酸取代。突變位點可包括HVRs與FRs。通常「保留性」胺基酸取代及/或基於共同的側鏈類別或性質的取代為本領域中已知，且可在本發明實施例中使用。本發明亦考量基於非保留性胺基酸取代之變體，其中胺基酸側鏈類別之一者的成員係經另一類別之胺基酸取代。胺基酸側鏈通常依據下列類別或共同特性進行分組：（1）疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile、正白胺酸；（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；（3）酸性：Asp、Glu；（4）鹼性：His、Lys、Arg；（5）鏈取向影響性：Gly、Pro；以及（6）芳香性：Trp、Tyr、Phe。抗體的胺基酸取代及隨後的篩選所需功能等技術為本領域已知，例如，保持/改善抗原結合、降低免疫原性、或改善ADCC或CDC。
胺基酸取代變體亦可包括在親代抗體之高變區具有一或多個取代的變體。通常，相對於親代抗體，選取用於進一步研究之所得變體，將具有特定生物學特性（如，親和力增加、免疫原性降低）的改良，及/或將保留親代抗體的特定生物學特性。示例性之取代變體為親和力成熟的抗體，其可利用以噬菌體展示為主的親和力成熟技術方便地產生。簡言之，一或多個HVR殘基經突變，且變異抗體在噬菌體上展示，以篩選出特定生物活性（如，結合親和力）。
用於鑑定抗體之殘基或區域可突變的適用方法為「丙胺酸掃描突變法」（參閱，如Cunningham and Wells（1989）Science，244:1081-1085）。在此方法中，殘基或標靶殘基之群組（如，帶電之殘基，如Arg、Asp、His、Lys、及Glu）係以中性或帶負電之胺基酸（如，Ala或聚丙胺酸）確認與取代，以確定抗體與抗原之交互作用是否受影響。可在各胺基酸位置導入其他取代，以證實對初始取代的功能敏感性。或者，或此外，可確定抗原-抗體錯合物的晶體結構，以確定抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基與鄰近殘基可被靶向或消除，以作為取代之候選物。可篩選變體，以確定其是否包含所需之特性。
可製備的胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基端融合體，其長度範圍為一個殘基至含有一百個或以上殘基之多胜肽，以及單一或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入之實例包括一具有N端甲硫基殘基之抗體。抗體分子之其他插入性變體可包括抗體之N端或C端與酵素或多胜肽（其增加抗體血清中半衰期）之融合體。
可在HVRs製造其他殘基取代基，以改善抗體親和力。此類改變可發生在「熱點」，即由密碼子編碼的殘基在體細胞成熟過程中經歷高頻率之突變（參閱，如Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196（2008年）），其中測試所得變體VH 或VL 的結合親和力。在一實施例中，利用構築並從二次文庫中再篩選，進行親和力成熟反應（參閱，如在Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37（O'Brien等人，ed.，Human Press，Totowa，NJ（2001年））。導入多樣性的另一方法為HVR定向法，其中將數個HVR殘基（如，一次4-6個殘基）隨機分配。利用諸如丙胺酸掃描突變法或建模，可特別鑑定出參與抗原結合的HVR殘基。特別是經常針對HVR-H3與HVR-L3。通常，可在一或多個HVRs中進行取代、插入、或刪除，只要此類改變實質上不會降低抗體結合抗原的能力。例如，可在HVRs中進行實質上不降低結合親和力的保留性改變（如，本文提供之保留性取代）。此類改變可在HVR「熱點」之外。
在一些實施例中，考量到本文所述之抗CSF1R抗體可在特定非HVR位置以半胱胺酸殘基取代，從而產生反應性巰基。此類基因工程之「thioMAbs」可用於將抗體鍵接至，如，藥物部分或連接子-藥物部分，從而產生免疫複合體，如本文他處所述。半胱胺酸基因工程抗體的產生可如美國專利號7,521,541所述。在一些實施例中，下列抗體殘基任一或多者可以半胱胺酸取代：輕鏈之V205（Kabat編號）；重鏈之A118（EU編號）；以及重鏈Fc區之S400（EU編號）。
B. 醣化變體
在一些實施例中，本發明之抗CSF1R抗體係經改變以增加或減少該抗體醣化的程度。藉由改變胺基酸序列，可進行抗體醣化位點的添加或刪除，從而產生或移除一或多個醣化位點。在抗體包含Fc區之實施例中，可改變連接至Fc區的碳水化合物。通常，由哺乳類動物細胞產生的天然抗體包含一支鏈之雙觸角寡醣，該寡醣藉由N鍵聯連接Fc區CH2結構域之約第297位（「N297」）天冬醯胺酸（參閱，如Wright等人，TIBTECH 15:26-32（1997年））。寡醣可包括各種碳水化合物，如甘露糖、N-乙醯基葡萄糖胺（GlcNAc）、半乳糖、及唾液酸，以及在雙觸角寡醣結構之「莖」中一岩藻糖連接至GlcNAc。在一些實施例中，抗體Fc區寡醣之修飾可產生具有改善之特性的變體。
在一些實施例中，本發明之抗CSF1R抗體可為包含碳水化合物結構的變體，但缺乏岩藻糖連接（直接或間接）至Fc區。例如，岩藻糖在此抗體中之量可為約1%至約80%、約1%至約65%、約5%至約65%、或約20%至約40%。岩藻糖之量可藉由計算連接至殘基N297之糖鏈中岩藻糖的平均量，相對於連接至N297的所有糖結構（如複雜、雜合、及高級甘露糖結構）的總和而確定，如MALDI-TOF質譜之測量（參閱，如WO 2008/077546）。
在一些實施例中，岩藻糖基化變體可提供變體抗體改善之ADCC功能。參閱，如美國專利公開號US 2003/0157108或US 2004/0093621。「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺失」抗體之實例及製備其之相關方法係揭示於，如US2003/0157108；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2000/61739；WO2001/29246；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J. Mol. Biol. 336:1239-1249（2004年）；Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87: 614（2004年）。用於產生去岩藻糖基化抗體之細胞株包括Led 3 CHO細胞（蛋白質岩藻糖基化作用缺失）（參閱，如Ripka等人，Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545（1986年）；US2003/0157108及WO2004/056312），及剔除細胞株，如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因（FUT8）剔除CHO細胞（參閱，如Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87:614（2004年）；Kanda, Y.等人，Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688（2006年）；以及WO2003/085107）。
C . Fc 區變體
在一些實施例中，本發明之抗CSF1R抗體在Fc區中可包含一或多個胺基酸修飾（即Fc區變體）。Fc區變體可包含人類Fc區序列（如，人類IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4 Fc區），包含在一或多個胺基酸殘基位置含有胺基酸取代。本領域已知之與本發明抗CSF1R抗體一起使用的廣範圍Fc區變體說明如下。
在一些實施例中，抗CSF1R抗體為改變效應功能的Fc區變體。在一些實施例中，效應功能改變的抗體具有一些（但並非全部的）效應功能，效應功能降低，或親代抗體無效應功能（如，無效應（effectorless））。針對效應功能（如ADCC）不需要或有害的特定應用，更需要無效應Fc區變體，及/或抗體之體內半衰期更重要。具有降低之效應或無效應功能的Fc區變體抗體可能是由下列Fc區位置之一或多者的胺基酸取代所引起：238、265、269、270、297、327、及329（參閱，如美國專利號6,737,056）。此類Fc區變體可包括在位置265、269、270、297、及327之二或多者的胺基酸取代。此類Fc區變體亦可包括殘基265與297兩者取代為丙胺酸（參閱，如美國專利號7,332,581）。
一些Fc區變體能提供對FcRs之改善或減弱的結合（參閱，如美國專利號6,737,056；WO 2004/056312；以及Shields等人，J. Biol. Chem. 9（2）: 6591- 6604（2001年））。一些能提供改善之ADCC的Fc區變體包含一或多個胺基酸取代，如Fc區之位置298、333、及/或334（依據EU編號）。Fc區變體具有改變的（即改善或減弱的）Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性（Complement Dependent Cytotoxicity ，CDC），如，美國專利號6,194,551、WO99/51642、及Idusogie等人，J. Immunol. 164: 4178- 4184（2000年）之描述。
一些Fc區變體能提供對新生型Fc受體（FcRn）之增加的半衰期 及改善的結合，如，US2005/0014934A1（Hinton等人）之揭示。此類Fc區變體包含位置238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、及434之一或多者的胺基酸取代。其他具有增加之半衰期的Fc區變體包括在位置252、254、及256的YTE突變組（即M252Y/S254T/T256E），如，US 7658921B2（Dall’Acqua等人）之揭示。Fc區變體之額外實例可在，如美國專利號5,648,260與5,624,821；以及WO94/29351中找到。
通常，可進行體外及/或體內細胞毒性試驗，以確認Fc區變體中CDC及/或ADCC活性的降低/減少。例如，可進行Fc受體（FcR）結合試驗，以確保抗體缺乏FcγR結合（因此可能缺乏ADCC活性）但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC的主要細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII、及FcγRIII。評估感興趣分子之ADCC活性之體外試驗的非侷限實例係描述於美國專利號5,500,362（參閱，如Hellstrom等人，Proc. Nat 'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063（1986年））及Hellstrom等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82: 1499-1502（1985年）；5,821,337（參閱，Bruggemann, M.等人，J. Exp. Med. 166: 1351-1361（1987年））。或者，可使用非放射性測定法（參閱，如用於流式細胞術之ACTI™非放射性細胞毒性測定法（CellTechnology, Inc.，Mountain View，CA；以及CytoTox96®非放射性細胞毒性測定法（Promega，Madison，WI）。此類試驗之適用效應細胞包括周邊血液單核細胞（PBMC）與自然殺手（NK）細胞。或者，或此外，可體內（如，在動物模式中）評估感興趣分子之ADCC活性，如Clynes等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652- 656（1998年）之揭示。亦可進行Clq結合試驗，以確認抗體無法結合Clq，從而缺乏CDC活性。參閱，如WO2006/029879與WO2005/100402中之Clq與C3c結合ELISA。欲評估補體活化作用，可進行CDC試驗（參閱，如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202: 163（1996年）；Cragg, M.S.等人，Blood 101: 1045-1052（2003年）；以及Cragg, M.S. and M.J. Glennie，SW 103:2738-2743（2004年））。FcRn結合與體內清除率/半衰期之測定，可利用本領域中已知之方法進行（參閱，如Petkova等人，Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769（2006年））。
D . 非蛋白 抗體 衍生物 – 免疫複合體
在一些實施例中，本發明之抗CSF1R抗體可進一步以非蛋白質部分修飾（即衍生化）。適於抗體衍生化之非蛋白質部分包括但不侷限於，水溶性聚合物，例如：聚乙二醇（PEG）、乙二醇與丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖（dextran）、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三氧戊環、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸均聚物或無規共聚物、及聚葡萄糖或聚（正乙烯基吡咯烷酮）聚乙二醇、丙烯乙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇（如，甘油）、聚乙烯醇、及其混合物。在一些實施例中，可利用甲氧基-聚乙二醇丙醛進行抗體修飾。聚合物可為任何分子量，且可為支鏈或非支鏈。連接抗體之聚合物數量可變，且若連接的聚合物大於一種，則其可為相同或不同分子。通常，用於衍生化之聚合物數量及/或類型可基於以下考量因素決定，包括但不侷限於，抗體之特定性質或功能，例如，抗體衍生物是否在規定的條件下用於治療。
在一些實施例中，本發明之抗CSF1R抗體亦可為一免疫複合體，其中該免疫複合體包含將一抗CSF1R抗體鍵接至一或多個細胞毒性劑。本發明考量之適用細胞毒性劑包括，化療藥劑、藥物、生長抑制劑、毒素（如，蛋白毒素、細菌、真菌、植物、或動物源之酵素上活性毒素，或其片段）、或放射性同位素。在一些實施例中，免疫複合體為抗體-藥物複合體（ADC），其中本文所述抗CSF1R抗體係鍵接至一或多個藥物。在一些實施例中，本發明之免疫複合體包含將本文所述之抗CSF1R抗體鍵接至藥物或治療劑以治療CSF1R介導之疾病或病症。
在一些實施例中，本文所述之抗CSF1R抗體可鍵接至酵素上活性毒素或其片段，包括但不侷限於，白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈（來自綠膿桿菌（P seudomonas aeruginosa ））、蓖麻毒蛋白A鏈（ricin A chain）、相思子素A鏈（abrin A chain）、蒴蓮根毒素A鏈（modeccin A chain）、α-核糖毒蛋白（alpha-sarcin）、桐油樹（A le u r i te s fordii ）蛋白、石竹素（dianthin）蛋白、美洲商陸（P h yt o l a c a americana ）蛋白、苦瓜（M o m o rdica charantia ）抑制劑、瀉果素（curcin）、巴豆毒素（crotin）、肥皂草（S ap a o na ria officinalis ）抑制劑、白樹毒素（gelonin）、絲林黴素（mitogellin）、侷限曲菌素（restrictocin）、苯黴素（phenomycin）、新黴素（enomycin）、及單端孢菌素（tricothecenes）。
在一些實施例中，本發明之免疫複合體包含將本文所述之抗CSF1R抗體鍵接至放射性同位素（即放射性複合體）。有許多放射性同位素可用於產生此類放射性複合體。實例包括211 At、131 I、125 I、90 Y、186 Re、188 Re、153 Sm、212 Bi、32 P、212 Pb、及Lu的放射性同位素。在一些實施例中，免疫複合體可包含用於同位素顯像檢測的放射性同位素，或用於NMR檢測或MRI的自旋標記。適用之放射性同位素或自旋標記可包括如，123 I、131 I、111 In、13 C、19 F、15 N、17 O、Gd、Mn、及Fe的各種同位素。
針對抗CSF1R抗體與細胞毒性劑之免疫複合體，可使用適於鍵接蛋白之各種已知雙功能試劑與化學品製造。此類試劑包括但不侷限於：N-琥珀醯亞胺基-3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯（SPDP）、琥珀醯亞胺基-4-（N-馬來醯亞胺基甲基）環己烷-1-甲酸酯（SMCC）、亞胺基硫烷（IT）、亞胺基酸酯類之雙功能衍生物（如，己二酸二甲酯HQ）、活性酯類（如，琥珀酸二琥珀醯亞胺基酯）、醛類（如，戊二醛）、雙疊氮基化合物（如，雙-（對疊氮基苯甲醯基）-己二胺）、雙重氮衍生物（如，雙-（對重氮基苯甲醯）- 乙二胺）、二異氰酸酯類（如，甲苯-2,6-二異氰酸酯）、及雙活性氟化合物（如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯）。用於製備本發明免疫複合體之試劑亦可包括市售「交聯」試劑，例如：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基- EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、及磺基-SMPB、及SVSB（琥珀醯亞胺基-（4-乙烯基碸）苯甲酸酯）（參閱，如Pierce Biotechnology, Inc.，Rockford，IL.，U.S.A）。
IV. 重組方法與組合物
本發明之抗CSF1R抗體可使用抗體生產領域中已知之重組方法及材料製造。在一些實施例中，本發明提供編碼抗CSF1R抗體之經分離核酸。該核酸可編碼包含抗體之VL 的胺基酸序列及/或包含抗體之VH 的胺基酸序列（如，抗體之輕鏈及/或重鏈）。在一些實施例中，提供一或多個包含編碼本發明抗CSF1R抗體之核酸序列的載體（如，表現載體）。在一些實施例中，提供包含編碼本發明抗CSF1R抗體之核酸序列的宿主細胞。在一實施例中，宿主細胞以包含核酸之載體轉形，該核酸編碼包含抗體之VL 的胺基酸序列及包含抗體之VH 的胺基酸序列。在另一實施例中，宿主細胞以包含核酸（其編碼包含抗體之VL 的胺基酸序列）之第一載體及包含核酸（其編碼包含抗體之VH 的胺基酸序列）之第二載體轉形。
在重組方法之一些實施例中，所使用之宿主細胞為真核細胞，如中國倉鼠卵巢（CHO）細胞或淋巴樣細胞（如，Y0、NS0、Sp20）。在一實施例中，提供製造抗CSF1R抗體之方法，其中該方法包含在適於抗體表現之條件下，培養含有編碼抗體之核酸的宿主細胞，如前面所提供，且選擇性地從宿主細胞（或宿主細胞培養基）中回收抗體。
簡言之，藉由分離編碼抗體之核酸（如，本文所述）並將此核酸插入一或多個載體中，進一步選殖及/或在宿主細胞中表現，進行抗CSF1R抗體的重組生產。此類核酸易於以本領域已知之常規程序分離與定序（如，利用寡核苷酸探針，其能特異性地結合至編碼所需抗體之重鏈與輕鏈的基因）。用於選殖或表現抗體-編碼載體之適用宿主細胞與培養方法為本領域中已知，包括原核或真核細胞。通常，在表現之後，可從細胞漿糊中分離出抗體之可溶部分，並進一步純化。除了原核生物以外，真核微生物（如絲狀真菌或酵母菌）為抗體-編碼載體的合適選殖或表現宿主，包括真菌與酵母菌株，其醣化途徑係經「人源化」，從而產生具有部分或完全人類醣化樣貌的抗體（參閱，如Gerngross，Nat. Biotech. 22: 1409-1414（2004年），及Li等人，Nat. Biotech. 24:210-215（2006年））。
適於表現本發明醣化抗CSF1R抗體之宿主細胞亦可源自多細胞生物（無脊椎動物與脊椎動物）。無脊椎動物細胞之實例包括植物與昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株，其可與昆蟲細胞結合使用，特別是用於草地夜蛾（Sp od o p te ra frugiperda ）細胞的轉染。植物細胞培養物亦可作為宿主（參閱，如美國專利號5,959,177、6,040,498、6,420,548、及7,125,978。
適用於產生本發明抗CSF1R抗體之哺乳類動物宿主細胞株的實例包括中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，包括DHFR-CHO細胞（參閱，如Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216（1980））；骨髓瘤細胞株，如Y0、NS0、及Sp2/0；經由SV40轉形之猴腎CVl細胞株（COS-7）；人類胚胎腎細胞株（293或293細胞，如，Graham等人，J. Gen Virol. 36:59（1977年）所述）；小倉鼠腎細胞（BHK）；小鼠賽特利（Sertoli）細胞（TM4細胞，如Mather，Biol. Reprod. 23:243-251（1980年）所述）；猴腎細胞（CVl）；非洲綠猴腎細胞（VERO-76）；人類子宮頸癌細胞（HELA）；犬腎細胞（MDCK；布法羅大鼠肝細胞（BRL 3A）；人類肺細胞（W138）；人類肝細胞（Hep G2）；小鼠乳腺腫瘤細胞（MMT 060562）；TR1細胞（參閱，如Mather等人，Annals N Y. Acad. Sci. 383:44-68（1982年）及US 6,235,498所述）；醫學研究委員會5（MRC 5）細胞（如，此些取自ATCC者，亦稱作CCL-171）；以及包皮4（FS-4）細胞（參閱，如Vilcek等人，Ann. N. Y. Acad. Sci. 284:703-710（1977年），Gardner & Vilcek，J. Gen. Virol. 44:161-168（1979年），及Pang等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:5341-5345（1980年）所述）。針對適用於抗體生產之有用哺乳類動物宿主細胞株的綜述，參閱，如Yazaki and Wu，Methods in Molecular Biology, Vol. 248（B.K.C. Lo, ed.，Humana Press，Totowa，NJ），pp. 255-268（2003年）。
V . 抗 CSF1R 抗體之 醫藥組合物 及製劑
本發明亦提供包含抗CSF1R抗體的醫藥組合物與醫藥製劑。在一些實施例中，本發明提供一種包含本文所述抗CSF1R抗體之醫藥製劑及醫藥上可接受載體。在一些實施例中，抗CSF1R抗體為醫藥組合物之唯一活性劑。藉由混合抗CSF1R抗體（其具有所需純度）與一或多個醫藥上可接受載體，可製備此類醫藥製劑。通常，此類抗體製劑可製成水溶液（參閱，如美國專利號6,171,586與WO2006/044908）或凍乾製劑（參閱，如美國專利號6,267,958）。
醫藥上可接受載體通常在使用之劑量與濃度下對接受者無毒。有多種此類醫藥上可接受載體為本領域中已知（參閱，如Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol, A. Ed.（1980年））。用於本發明製劑之示例性醫藥上可接受載體可包括但不侷限於：緩衝溶液，如磷酸鹽、檸檬酸鹽、及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸與甲硫胺酸；防腐劑（如，十八烷基二甲基芐基銨氯化物；六甲銨氯化物；苯扎氯銨；氯化芐索銨；苯酚、丁醇、或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；以及間甲酚）；低分子量（小於約10個殘基）多胜肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸、或離胺酸；單醣類、二糖類、及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑（如EDTA）；糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖、或山梨糖醇；成鹽反離子，如鈉；金屬錯合物（如，鋅-蛋白錯合物）；及/或非離子性界面活性劑，如聚乙二醇（PEG）。
用於本發明製劑之醫藥上可接受載體亦可包括間質藥物分散劑，如可溶性中性活性透明質酸酶醣蛋白（soluble neutral-active hyaluronidase glycoproteins，sHASEGP）（參閱，如美國專利公開號2005/0260186與2006/0104968），如人類可溶性PH- 20透明質酸酶醣蛋白（如，rHuPH20或HYLENEX®，Baxter International, Inc.）。
亦考量到本文所述製劑可含有除了抗CSF1R以外的活性成分，其對於投予該製劑之特定適應症的受試者而言是必要的。較佳地，任何額外之活性成分具有與抗CSF1R抗體活性互補的活性，且所述活性不會彼此有不利影響。
如本文他處所揭示，包括實施例，顯示本發明之抗CSF1R抗體可結合IL10多胜肽使用，以提供改善的癌症療效。據此，在一些實施例中，本發明提供一種用於治療癌症的醫藥組合物或製劑，其包含CSF1R拮抗劑（如，抗CSF1R）與IL10促效劑（如，IL10）。此外，在將本發明抗CSF1R抗體用作此類醫藥製劑或組合物中的CSF1R拮抗劑，可考慮使用其他拮抗劑，包括但不限於shRNA、siRNA、miRNA、CSF1R之小分子抑制劑或其組合等。用於此類醫藥組合物或製劑之CSF1R之小分子抑制劑可包括臨床開發上的已知化合物，包括但不侷限於，培昔達替尼、ARRY- 382、PRV-6527、BLZ-945、DCC-3014、及PLX-7486。除了本發明之抗CSF1R抗體以外，其他用於此一結合醫藥組合物或製劑與IL10的已知抗CSF1R抗體可包括任何與CSF1R結合的已知抗體，包括那些臨床上開發的抗癌藥物，如印蘇單抗、卡比拉單抗、AMG820、及LY3022855。
如本文他處所述，在一些實施例中，本發明提供用於合併治療的醫藥組合物或製劑，包含CSF1R拮抗劑與IL10促效劑。在一些實施例中，此組合可以單一醫藥組合物或製劑提供，其包含一抗CSF1R抗體融合體，其中抗CSF1R抗體經由一多胜肽連接子（如，SEQ ID NO: 78之14個胺基酸之連接子）共價融合至IL10。本文他處提供實例證實此類抗CSF1R抗體融合體（如，6D4/IL10、6D4/(IL10)2 、6D4.hu22/IL10等）及其在醫藥組合物中之用途，其減少多種同基因型小鼠癌症模式的腫瘤體積。
在一些實施例中，醫藥組合物包含抗CSF1R抗體與其他用於癌症治療之活性劑，如免疫檢查點抑制劑。用於此類實施例之免疫檢查點抑制劑包括但不侷限於，對以免疫檢查點分子作為抗原具有特異性之二次抗體。在一些實施例中，二次抗體包含對免疫檢查點分子具有特異性，該分子選自於PD1、PD-L1、LAG3、CTLA-4、A2AR、TIM-3、BTLA、CD276、CD328、VTCN1、IDO、KIR、NOX2、VISTA、OX40、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、GITR、ICOS。在至少一實施例中，醫藥組合物包含抗CSF1R抗體與額外之活性劑，其中額外之活性劑為含有對免疫檢查點分子PD1具有特異性的抗體。適於本發明實施例之醫藥組合物中含有PD1特異性之示例性抗體包括但不侷限於，多他單抗（dostarlimab）、派姆單抗（pembrolizumab）、納武單抗（nivolumab）、及匹立單抗（pidilizumab）。
在膠體藥物遞送系統（例如，微脂體、白蛋白微球、微乳劑、奈米顆粒、及奈米膠囊）或在巨乳液中，活性成分可分別包埋在所製備之微膠囊中，例如，利用凝聚（coacervation）技術或利用界面聚合，例如，羥甲基纖維素或明膠-微膠囊與聚（甲基丙烯酸甲酯）微膠囊。此類技術係揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol, A. Ed.（1980年）。
在一些實施例中，製劑可為抗體及/或其他活性成分之緩釋製劑。緩釋製劑之適用實例包括含有該抗體之固體疏水性聚合物之半透性基質，該基質為定型物件之形式，例如，薄膜或微膠囊。
通常，欲投予受試者之本發明製劑係無菌。無菌製劑可易於以已知之技術製備，例如，利用無菌濾膜過濾。
VI. 治療之用途及方法
考量到含有本發明抗CSF1R抗體之任何組合物或製劑皆可用於任何方法或用途，例如，用於以其特異性結合CSF1R之能力從而抑制、降低、及/或完全阻斷CSF1R作為參與免疫調節或傳訊受體之功能（特別是CSF1R調控腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）存活與維持之功能）的治療方法。TAMs為腫瘤微環境（TME）中主要細胞組分，且明顯有助於腫瘤生長與進展。抑制CSF1R傳訊可耗盡TAMs，從而誘發增加抗腫瘤T細胞反應。
藉由抑制、降低、及/或完全阻斷CSF1R之免疫調節及/或免疫傳訊活性，特別是CSF1R對TAMs的作用，可治療多種疾病、失調、及病症。疾病、失調、及病症包括但不侷限於，癌症，包括但不侷限於，結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、HCC、腎臟癌、乳癌、肺癌、胃癌、頭頸癌、或口腔癌。考量到含有本發明抗CSF1R抗體之任何組合物或製劑，包括抗CSF1R抗體融合體與IL10多胜肽，皆可用於治療任一上述癌症之方法或用途。在一些實施例中，癌症選自於結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、HCC、腎臟癌、乳癌、肺癌、胃癌、頭頸癌、或口腔癌。在一些實施例中，本發明提供一種治療受試者癌症的方法，該方法包含投予有需求之受試者一治療上有效量之本發明抗CSF1R抗體或投予受試者一治療上有效量之含有本發明抗CSF1R抗體與醫藥上可接受載體之醫藥組合物。
如本文所揭示，包括在以下實施例中，本發明之抗CSF1R抗體具有減少、抑制、及/或阻斷CSF1結合CSF1R的能力，從而改變CSF1與CSF1R介導之免疫傳訊途徑的交互作用。據此，在一些實施例中，本發明提供受試者一治療CSF1R介導之疾病或病症的方法，該方法包含投予受試者一治療上有效量之本發明抗CSF1R抗體或投予有需求之受試者一治療上有效量之含有本發明抗CSF1R抗體與醫藥上可接受載體之醫藥組合物。同樣地，在一些實施例中，本發明提供受試者一治療由結合至細胞上表現之CSF1R所介導疾病的方法，該方法包含投予受試者一治療上有效量之本發明抗CSF1R抗體或投予有需求之受試者一治療上有效量之含有本發明抗CSF1R抗體與醫藥上可接受載體之醫藥組合物。
依據治療方法投予抗CSF1R抗體、組合物、或醫藥製劑，可提供抗體誘發之治療效果，從而保護受試者免於及/或治療受試者CSF1R介導之疾病進展。在一些實施例中，治療方法可進一步包含投予一或多個額外之本領域具有通常知識者已知之治療劑或治療，以預防及/或治療CSF1R介導之疾病或病症。此類包含投予一或多個額外藥劑之方法可包括合併投予（其中二或多個治療劑包括在相同或分開之製劑中）及單獨投予，在該情況中，抗體組合物或製劑之投予可在投予額外治療劑之前、同時、及/或之後發生。
細胞介素IL10具有抗發炎及CD8+ T細胞活化特性。強的IL-10訊號可促進腫瘤特異性CD8 + T細胞增生，使精疲力竭之T細胞恢復活力，從而增加T細胞之細胞毒性。據此，在至少一實施例中，本發明考量一以CSF1R拮抗劑（如，抗CSF1R抗體）結合IL10促效劑之治療方法。在至少一實施例中，此合併治療可以抗CSF1R抗體融合體結合IL10多胜肽進行。如本文所揭示，結合CSF1R抑制以減少免疫抑制性TAMs，以及TME附近集中之IL10訊息以增強CD8+ T細胞之細胞毒性，可提供改善的癌症治療。據此，在以本發明抗CSFR1抗體治療CSF1R介導之疾病（如，癌症）之方法的任一實施例中，考量到抗CSF1R抗體可為如本文他處所揭示之具有IL10多胜肽之抗體融合體（或融合蛋白）。
亦考量到可用於此一具有IL10之合併治療的其他CSF1拮抗劑，包括但不侷限於，shRNA、siRNA、miRNA、或CSF1R之小分子抑制劑，或其組合。用於此一方法之CSF1R的小分子抑制劑可包括臨床上開發的已知CSF1R抑制劑化合物，如培昔達替尼、ARRY-382、PRV-6527、BLZ-945、DCC-3014、及PLX-7486。此外，可用於此一具有IL10之合併治療的其他已知CSF1R拮抗劑抗體包括已知之阻斷CSF1R的抗體，包括那些在臨床上開發用於癌症治療者，如印蘇單抗、卡比拉單抗、AMG820、及LY3022855。
在本發明治療方法之一些實施例中，含有抗CSF1R抗體之抗CSF1R抗體或醫藥製劑係以任何方式投予受試者，其全身性地遞送藥劑，或遞送至所需之標靶組織。全身性投予通常指，除了直接投予所需之靶點、組織、或器官以外，抗體在一位點以任一方式投予受試者，以使抗體或其製劑進入受試者之循環系統，因此，其進行代謝及其他類似過程。
據此，用於本發明治療方法的投予模式可包括但不侷限於，注射、輸注、滴注、及吸入。注射投予可包括靜脈注射、肌肉注射、動脈內、鞘內、腦室內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、透皮、經皮、皮下、關節內、包膜下、蛛網膜下腔、椎管內、腦內脊髓、及胸骨內注射，以及輸注。
在一些實施例中，抗CSF1R抗體之醫藥製劑係經配製，防止抗體在腸道中失活。據此，治療方法可包含口服投予製劑。
在一些實施例中，亦提供包含以本發明之抗CSF1R抗體作為藥劑之組合物或製劑的用途。此外，在一些實施例中，本發明亦提供一包含抗CSF1R抗體之組合物或製劑的用途，以製造或製備藥劑，特別是用於治療、預防、或抑制CSF1R介導之疾病的藥劑。在進一步之實施例中，藥劑係於治療、預防、或抑制CSF1R介導之疾病的方法中使用，包含投予具有CSF1R介導之疾病之個體一有效量之藥劑。在特定實施例中，藥劑進一步包含一有效量之至少一額外之治療劑，或治療。在至少一實施例中，額外之治療劑或治療為IL10促效劑，如IL10多胜肽，其係結合抗CSF1R抗體（而非作為抗體融合體）投予。
如本文他處所揭示，亦考量到，可在具有本發明抗CSF1R抗體之該藥劑中使用的額外治療劑或治療包括但不侷限於，具有免疫檢查點分子特異性之治療性抗體，該分子如PD1、PD-L1、LAG3、CTLA-4、A2AR、TIM-3、BTLA、CD276、CD328、VTCN1、IDO、KIR、NOX2、VISTA、OX40、CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、GITR、ICOS。具有免疫檢查點分子特異性之示例性抗體包括但不侷限於，抗PD1抗體，其選自於多他單抗、派姆單抗、納武單抗、及匹立單抗。
在進一步之實施例中，藥劑係用於治療、抑制、或預防受試者之CSF1R介導之疾病，如癌症，包含投予受試者一有效量之藥劑，以治療、抑制、或預防CSF1R介導之疾病。
含於本發明之組合物與製劑之抗CSF1R抗體的適用劑量（當單獨或結合一或多個額外治療劑使用時），將取決於欲治療之特定疾病或病症、疾病之嚴重程度與病程、是否出於預防或治療目的而投予抗體、先前投予病患之治療、病患之臨床病史及對抗體的反應、及主治醫師之裁量。包括於本文所述之組合物與製劑之抗CSF1R抗體，可一次性或通過一系列治療適當地投予病患。於此考量各種投劑方案，包括但不侷限於，在各種時間點上單次或多次投予、推注投予、及脈衝輸注。
取決於疾病之類型與嚴重程度，本發明製劑中約1 µg/kg至15 mg/kg之抗CSF1R抗體為用於投予人類受試者之初始候選劑量，不論是否，例如，通過一或多次單獨投予，或通過連續輸注。通常，抗體之投予劑量範圍為約0.05mg /kg至約10 mg/kg。在一些實施例中，可投予病患一或多劑之約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg、或10 mg/kg（或其任意組合）。
如本領域已知方法之認定，投予之劑量可維持數天或更久，其取決於受試者之狀況，例如，可連續投予直到CSF1R介導之疾病得到充分治療。在一些實施例中，可先投予較高的負荷劑量，接著一或多個較低劑量。然而，其他劑量方案可能適用。可利用常規技術與測定法，監測劑量投予之治療效果進展。
據此，在本發明方法之一些實施例中，抗CSF1R抗體之投予包含每日劑量約1 mg/kg至約100 mg/kg。在一些實施例中，抗CSF1R抗體之劑量包含每日劑量為至少約1 mg/kg、至少約5 mg/kg、至少約10 mg/kg、至少約20 mg/kg、或至少約30 mg/kg。
實例
本發明之各種特徵及實施例係以下列代表性實例說明，其旨在說明而非侷限。本領域具有通常知識者將易於理解到，此些特定實例僅為本發明之說明，如隨附之申請專利範圍中更充分的描述。本申請案中所述之每一實施例與特徵應理解為，可與含於其中之每一實施例互換與結合。
實例 1 ： 抗CSF1R抗體之產生
本實例說明融合瘤技術之用途，以產生本發明的兩個示例性抗CSF1R單株抗體hy6D4與hy6M6。
A . 製造 抗 CSF1R 抗體之 融合瘤細胞株的產生
材料與方法： 將13隻小鼠以重組型人類CSF1R細胞外結構域（ECD）-Fc融合蛋白（R&D Systems）進行免疫接種。將經免疫接種的小鼠進行脾細胞分離，並依據標準方法使用PEG，使其與小鼠骨髓瘤細胞株融合，產生融合瘤。將融合瘤置於96孔平底微量滴定盤中，接著在選擇性培養基中培養2至4週。隨後，在體外培養穩定之融合瘤亞殖株，以在組織培養基中產生抗體，並進行確認。如下所述，將融合瘤之培養基上清液篩選對人類CSF1R（SEQ ID NO: 70）之結合，以及抑制配體誘導之AML5增生的能力。將抗體從挑選之融合瘤上清液純化後再進一步分析其CSF1R表位結合特性、阻斷配體結合至人類CSF1R的能力、結合食蟹猴CSF1R的能力、以及抑制配體誘導之CSF1R磷酸化的能力。
B. CSF1R 特異性 E LISA
材料與方法： ，將重組型人類CSF1R-His（Biolegend）或CSF1R-Fc融合蛋白以1 µg/mL之濃度溶於塗覆溶液（SeraCare）並在4°C於96孔微量滴定盤中進行整夜固定。滴定盤孔以清洗液（含有0.05% Tween 20之咪唑緩衝鹽液）清洗後，使用1% BSA進行阻斷。將融合瘤培養基上清液或連續稀釋之抗體加入培養孔中。在37°C下培養1小時後，以清洗液清洗培養孔。將過氧化酶鍵接之山羊抗人類κ輕鏈抗體（Bethyl）加入各培養孔中，並在37°C下培養1小時。在清洗後，培養孔在室溫下以TMB受質顯影5至10分鐘，接著以1N HCl終止反應。隨後，在450 nm與650 nm下測量吸光度。EC50 值係以GraphPad Prism7計算。
結果： 如表4所示，標示「hy6D4」與「hy6M6」之融合瘤殖株抗體（以單體與融合二聚體形式）與重組型人類CSF1R呈現強的次奈米莫耳之結合。
表 4 ： 抗體與人類CSF1R之結合活性
  mAb   EC50 （M）
CSF1R-His （單體） CSF1R-Fc （二聚體）
hy6D4 5.31 ×10-10 3.81 × 10-10
hy6M6 1.12 ×10-10 6.53 ×10-11
C . 利用競爭性 ELISA 測定配體結合至 CSF1R 的抑制作用
材料與方法： 將重組型人類CSF1R-Fc融合蛋白以1 µg/mL之濃度溶於塗覆溶液（SeraCare）中並在4°C 於96孔微量滴定盤中進行整夜固定。在室溫下，滴定盤孔以清洗液清洗，並以1% BSA阻斷。將連續稀釋之抗體加入培養孔中。隨後，將2.5 ug/mL生物素化CSF1-His（Biolegend）加入，並在37°C下培養1小時。在清洗後，將鏈黴親和素-HRP（Jackson ImmunoResearch）加入各孔中，並在室溫下培養1小時。在清洗後，培養孔在室溫下以TMB受質顯影5至10分鐘，並以1N HCl終止反應。隨後，在450 nm與650 nm下測量吸光度。IC50 值係以GraphPad Prism7計算。
結果： 如表5所示，抗CSF1R抗體hy6D4與hy6M6對配體CSF1與其同源受體CSF1R之結合呈現強的（奈米莫耳濃度）阻斷活性。
表 5 ： 抗體對CSF1R與CSF1之交互作用的阻斷活性
m A b IC 5 0 （ M ）
hy6D4 1.76 ×10-9
hy6M6 1.04 ×10-9
D . 表位聚類研究
材料與方法： 表位聚類研究係以Bio-Layer Interferometry（BLI，ForteBio Octet RED96）進行。以鏈黴親和素塗佈之Octet生物感測器針尖（FortéBio）用於表位聚類一組抗CSF1R抗體（6D4與6M6）。最初，將10 µg/mL之生物素化重組型人類CSF1R-His（Biolegend）加載至鏈黴親和素感測器針尖上，取2 nm位移。在100 s與120 s基線步驟後，在600s之關聯步驟中，將純化自融合瘤上清液（hy6M6）的5 µg/mL一次飽和抗CSF1R抗體個別加載至針尖上。此外，亦以5 µg/mL之二次競爭性抗CSF1R抗體（hy6M6或hy6D4）與生物感測器針尖培養600s關聯。若訊號顯示針尖有大量積累，則視其為與不同表位結合。
結果： 如圖 1 A 與圖 1 B 之繪圖所示，感測器歷經多個試驗步驟（以數字表示，並以虛線劃分），包括：步驟1-基線；步驟2-生物素-CSF1R抗原捕獲；步驟3-以一次mAb（hy6M6）飽和化；以及步驟4-以二次mAb hy6D4（圖 1 A ）或hy6M6（圖 1 B ）競爭。圖 1A 中步驟4之位移不存在於圖 1B 之步驟4中，其清楚表明，由純化之上清液中取得的兩個抗CSF1R抗體hy6D4與hy6M6結合至CSF1R多胜肽上的不同表位。
實例 2 ： 嵌合抗CSF1R抗體6D4與6M6之製備
本實例說明以重組型基因技術製備兩抗體hy6D4與hy6M6，以及本發明之兩個示例性嵌合抗CSF1R單株抗體6D4與6M6。
A . 嵌合 抗體之構築、表現、及純化
材料與方法：
利用RNeasy Mini Kit（Qiagen）從融合瘤殖株hy6D4與hy6M6萃取總RNA。I g h 與I g l/ I g k 基因之可變區編碼序列係利用5’ RACE方法（Takara Bio）取得。用於IgG1 VH 放大之引子為：GATTACGCCAAGCTTATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC（SEQ ID NO: 76）。用於κ VL 放大之引子為：GATTACGCCAAGCTTGGATACAGTTGGTGCAGCATC（SEQ ID NO: 77）。骨架與互補決定區（CDRs）係以IMGT/V-Quest程式（www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest）確定。將抗體可變區構築體選殖至cDNA表現載體，並重新格式化成一包含人類IgG1重鏈恆定區與人類κ輕鏈恆定區的嵌合抗體。
嵌合抗體係於ExpiCHO-S細胞（Thermo Scientific）中瞬時表現。在指數生長期過程中，利用ExpiFectamine CHO Transfection Kit（Thermo Scientific），瞬時轉染20 μg編碼嵌合抗體之載體。在轉染後18至22小時，將ExpiFectamine CHO Enhancer與ExpiCHO Feed加入培養瓶中。將細胞培養8天。將各培養基的上清液離心，隨後通過0.45 μm濾膜過濾。
嵌合抗體，於此稱作「6D4」與「6M6」，係以Protein A Sepharose Fast Flow珠粒（GE Healthcare）從轉染細胞之上清液中純化。載有抗體之管柱以20倍管柱體積之PBS清洗，接著以3倍珠粒體積之0.1 M甘胺酸（pH 2.5）直接沖提至1/10體積之1M Tris緩衝液（pH 9.0）中。將含有抗體之分液合併並透析至PBS中。在存在與不存在還原劑的情況下，利用SDS-PAGE檢查經純化抗體之品質。表3提供嵌合抗體6D4與6M6之胺基酸序列及伴隨的序列。
B. 利用流式細胞術進行細胞結合與跨物種反應性研究
材料與方法： 編碼SEQ ID NO: 70之全長人類CSF1R胺基酸序列或SEQ ID NO: 71之食蟹猴CSF1R胺基酸序列的基因片段係利用Thermo基因合成服務取得，並選殖至哺乳類動物表現載體pCDNA3.4。利用聚乙烯亞胺（PEI）方法，將CSF1R表現載體轉染至Freestyle 293-F細胞（Thermo Scientific），並以遺傳黴素(Geneticin)（Thermo Scientific）進行篩選，以建立CSF1R穩定細胞株。在4°C下，AML5人類急性髓樣白血病細胞（ACC 247，DSMZ）或CSF1R過量表現之293F細胞以對照組人類IgG1（BioXcell）或抗CSF1R mAb（1 µg/106 個細胞）培養1小時。在以FACS緩衝液（含有2%FBS之PBS）清洗後，細胞以抗人類IgG–Alexa Fluor 647染色，並利用Attune NxT Flow Cytometer（Thermo Scientific）分析。
結果： 如圖 2 A 、2 B 、及2 C 所示，嵌合抗CSF1R抗體6D4與6M6呈現特異性結合至表現人類CSF1R的AML5細胞（圖 2 A ）與293F細胞（圖 2 B ）。6D4與6M6亦呈現 特異性結合至表現食蟹猴CSF1R的293F細胞（圖 2 C ）。
C . 利用嵌合 抗 CSF1R 抗體 6 D 4 與 6 M 6 抑制 配體 誘發之 C S F 1 R 磷酸化
材料與方法： AML5細胞係依據DSMZ方法培養，並維持在對數期。在室溫下，將AML5細胞（2 ×106 個）在1 mL試驗培養基（含有Glutamax之MEMα）以對照組hIgG1或抗CSF1R mAb（1 µg/mL）培養5至10分鐘。隨後，細胞在37°C下以50 ng/mL CSF1（R&D Systems）或50 ng/mL IL-34（R&D Systems）刺激5分鐘。在培養後，將細胞溶解，並萃取總蛋白質。取50 µg蛋白進行西方墨點法分析，偵測使用抗總CSF1R（Cell Signaling）、磷酸化CSF1R（Tyr723）（Cell Signaling）、總AKT（Cell Signaling）、磷酸化AKT（Tyr723）（Cell Signaling）、或β-肌動蛋白（Cell Signaling）的抗體。
結果： 如圖 3 A 與3 B 所示，嵌合抗CSF1R抗體6D4與6M6可在AML5細胞抑制配體所誘導之CSF1R磷酸化，其中所使用之配體為CSF1（圖 3 A ）或IL-34（圖 3 B ）。
D . 抗 CSF1R 抗體 6 D 4 與 6 M6 抑制 配體 依賴性 A M L 5 細胞增生
材料與方法： 在增生試驗中，將AML-5細胞（每孔1.5 ×104 個細胞）在96孔培養盤之試驗培養基（含有Glutamax之MEMα）中以連續稀釋之對照組hIgG1或抗CSF1R抗體培養。隨後，在種植之細胞中添加CSF1（20 ng/mL）或IL-34（33 ng/mL）以刺激72小時。利用CellTiter-Glo試驗（Promega）測量AML-5細胞增生。
結果： 如圖 4 A 與4 B 所示，嵌合抗CSF1R抗體6D4與6M6抑制配體CSF1（圖 4 A ）或IL-34（圖 4 B ）誘發之AML5細胞配體依賴性增生。表6顯示圖 4A 與圖 4B 中6D4與6M6所測定之IC50 值。
表 6 ：CSF1與IL-34配體依賴性抑制作用
 m A b   IC 5 0 （ M ）
C S F 1 依賴性 IL-34 依賴性
6D4 4.62 ×10-10 3.49 × 10-10
6M6 2.73 ×10-10 2.01 ×10-10
E. 抗 CSF1R 抗體 6 D 4 與 6 M6 抑制單核細胞與巨噬細胞之 C S F 1 依賴性 細胞存活率
從健康捐贈者取得人類周邊血液後，立即以密度梯度離心法，使用Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare）分離周邊血液單核細胞（PBMC）。CD14+單核細胞係以抗人類CD14鍵接之磁珠（Miltenyi Biotec）分離。在細胞存活率試驗中，將CD14+單核細胞（每孔1×104 個細胞）在96孔培養盤之培養基（含有10% FBS之RPMI1640）中以連續稀釋之對照組hIgG1或抗CSF1R抗體培養。隨後，將CSF1（100 ng/mL）加入細胞中。在刺激後6天，利用CellTiter-Glo試驗（Promega）測量細胞存活率。
為產生單核細胞衍生之巨噬細胞，將人類CD14+單核細胞以2 × 106 個細胞/mL培養於RPMI1640（含有10% FBS）與100 ng/mL CSF1中6天。在增生試驗中，分化之巨噬細胞（每孔2×104 個細胞）在96孔培養盤之培養基（含有10% FBS之RPMI1640）中培養於連續稀釋之對照組hIgG1或抗CSF1R抗體。隨後，將CSF1（10 ng/mL）加入細胞中。在刺激後72小時，利用CellTiter-Glo試驗（Promega）測量細胞存活率。
結果： 如圖 5 A 與圖 5 B 所示，嵌合抗CSF1R抗體6D4與6M6抑制由人類CD14+單核細胞與單核細胞衍生之巨噬細胞的CSF1依賴性存活率。圖 5A 與圖 5B 中6D4與6M6所測定之IC50 值顯示於表7。
表 7 ：抑制單核細胞與巨噬細胞之CSF1依賴性存活率
m A IC50
CD 1 4 + 單核細胞 巨噬細胞
6D4 5.58 ×10-10 1.38 × 10-10
6M6 1.44 ×10-10 0.72 ×10-10
F . 抗 CSF1R 抗體之 C S F 1 R 結合親和力 測定
利用Bio- Layer Interferometry（BLI）（ForteBio Octet RED96），測定6D4與6M6結合至CSF1R的動力學速率常數ka與kd。利用AHC（抗hIgG Fc Capture）生物感測器（ForteBio）進行BLI試驗，捕捉各種抗CSF1R抗體（2 μg/mL），以取得0.5 nm的位移，隨後將生物感測器浸入不同濃度（即0、0.549、1.65、4.94、14.8、44.4、133.3、及400 nM）的重組CSF1R-His蛋白中，該蛋白溶於含有PBS-Tween 20（0.1%）與BSA（0.1%）之運行緩衝液中。藉由結合反應之5分鐘結合與15分鐘分離之相互作用時間的曲線擬合分析（1:1朗繆耳模型），計算速率常數。
結果： 所測定之嵌合抗CSF1R抗體6D4與6M6結合至hu-CSF1R的結合常數KD ，以及速率常數ka與kd顯示於表8。
表 8 ： 抗體與人類CSF1R之結合動力學
m A b K a （ 1 / Ms ） K d （ 1 / s ） KD （ M ）
6D4 2.77 × 105 9.46 × 10-4 3.42 × 10-9
6M6 6.88 × 105 2.23 × 10-4 3.25 × 10-10
G . 抗體 依賴性細胞介導之 細胞毒性 （ ADCC ）試驗
利用NK Cell Isolation Kit（Miltenyi Biotec），從PBMC分離出人類NK細胞。在96孔培養盤中，先將293F/huCSF1R標靶細胞（5×103 個細胞/孔）與3 µg/mL的抗CSF1R抗體預先培養30分鐘。隨後，將NK效應細胞（1×105 個細胞/孔）以效應:標靶（E: T）20:1之比率加入培養盤中，並在37°C下培養5小時。使用CytoTox-Glo 細胞毒性試驗（Promega）測定細胞毒性。
結果： 如圖 6 所示，抗CSF1R抗體6D4與6M6兩者可促使自然殺手（NK）細胞介導之抗體依賴性細胞毒性（ADCC）增強。
實例 3 ： 人源化抗CSF1R抗體之製備與功能分析
本實例說明本發明示例性人源化抗CSF1R抗體之製備及功能確認的研究。
A . 6D4 與 6 M 6 之人源化
藉由改變重鏈與輕鏈可變區（VH 與VL ）之骨架區（FR）之特定胺基酸殘基且同時維持CDRs，將抗CSF1R抗體6D4與6M6人源化。6D4或6M6總共設計出四個人源化VH 區與三個人源化VL 區。所得的12個人源化抗體係經功能性分析，包括CSF1R之結合、熱穩定性、非特異性結合至桿狀病毒、凝集電位、及毛細管電泳。選擇兩個人源化版本的6D4，即「6D4.hu22」與「6D4.hu41」，以及兩個人源化版本的6M6，即「6M6.hu12」與「6M6.hu41」，進行進一步的功能確認。表3提供四個人源化抗體的胺基酸序列，及其序列。
B. CSF1R 特異性 E LISA
材料與方法： 將重組型人類CSF1R-His（Biolegend）或CSF1R-Fc融合蛋白以濃度1 µg/mL溶於塗覆溶液（SeraCare）並在4°C於96孔微量滴定盤進行整夜固定。滴定盤孔以清洗液（含有0.05% Tween 20之咪唑緩衝鹽液）清洗，並以1% BSA阻斷。將連續稀釋之抗體加入培養孔中。在37°C下培養1小時後，以清洗液清洗培養孔。將過氧化酶鍵接之山羊抗人類κ輕鏈抗體（Bethyl）加入各培養孔中，並在37°C下培養1小時。在清洗後，培養孔在室溫下以TMB受質顯影5至10分鐘，接著以1N HCl終止反應。隨後，在450 nm與650 nm下測量吸光度。EC50 值係以GraphPad Prism7計算。
結果： 如表9所示，人源化抗體6D4.hu22與6D4.hu41，以及6M6.hu12與6M6.hu41，以單體與融合二聚體形式與重組型人類CSF1R呈現次奈米莫耳之結合，其可比擬或優於嵌合親代抗體6D4與6M6。
表 9 ： 抗體與人類CSF1R之結合活性
m A EC50
C S F 1 R- H i s （ 單體 ） C S F 1 R-F c （ 二聚體 ）
6D4 5.31 ×10-10 3.81 × 10-10
6D4.hu22 2.11 ×10-10 1.45 ×10-10
6D4.hu41 2.03 ×10-10 1.39 ×10-10
6M6 1.12 ×10-10 6.53 ×10-11
6M6.hu12 1.03 ×10-10 6.13 ×10-11
6M6.hu41 1.07 ×10-10 6.50 ×10-11
C . 人源化 抗 CSF1R 抗體 6 D 4 .hu22 、 6 D 4 .hu41 、 6 M 6 . h u 1 2 、及 6 M 6 .hu41 抑制 C S F 1 依賴性 A M L5 細胞增生
材料與方法： 在96孔培養盤之試驗培養基（含有Glutamax之MEMα）中，以連續稀釋之對照組hIgG1或抗CSF1R抗體培養AML-5細胞（每孔1.5 ×104 個細胞）。隨後，將CSF1（20 ng/mL）加入種植之細胞中，以刺激72小時。利用CellTiter-Glo試驗（Promega）測量AML-5細胞增生。
結果： 如圖 4 C 與4 D 所示，人源化抗CSF1R抗體6D4.hu22、6D4.hu41、6M6.hu12、及6M6.hu41可抑制配體CSF1誘發之AML5細胞的配體依賴性增生。如表10所示，由圖 4 C 與圖 4 D 繪圖中所確定之6D4.hu22、6D4.hu41、6M6.hu12、及6M6.hu41之IC50 值與親代嵌合抗體的值相當。
表 10 ：CSF1配體依賴性抑制作用
 m A b IC50 （ M ）
C S F 1 依賴性
6D4 4.62 ×10-10
6D4.hu22 5.71 ×10-10
6D4.hu41 5.97 ×10-10
6M6 2.73 ×10-10
6M6.hu12 5.46 ×10-10
6M6.hu41 4.30 ×10-10
D . 人源化 抗 CSF1R 抗體 6 D 4 .hu22 、 6 D 4 .hu41 、 6 M 6 . h u 1 2 、及 6 M 6 .hu41 抑制單核細胞之 C S F 1 依賴性 細胞存活率
利用密度梯度離心法，以Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare）分離人類PBMC。CD14+單核細胞係以抗人類CD14鍵接磁珠（Miltenyi Biotec）分離。在細胞存活率試驗中，將CD14+單核細胞（每孔1×104 個細胞）在96孔培養盤之培養基（含有10% FBS之RPMI1640）中以連續稀釋之對照組hIgG1或抗CSF1R抗體培養。隨後，將CSF1（100 ng/mL）加入細胞中。經6天刺激後，利用CellTiter-Glo試驗（Promega）測量細胞存活率。
結果： 如圖 5 C 與圖 5 D 所示，人源化抗CSF1R抗體6D4.hu22、6D4.hu41、6M6.hu12、及6M6.hu41抑制人類CD14+單核細胞的CSF1依賴性存活率。由圖 5C 與圖 5D 中之6D4與6M6測定IC50 值。
實例 4 ： 具有IL10促效劑之抗CSF1R合併免疫治療
此實例說明用於結合IL10促效劑以治療腫瘤之示例性抗CSF1R抗體的研究。
A . IL10 促效劑 之製備
材料與方法： 重組型IL10-Fc（SEQ ID NO: 73）與(IL10)2 -Fc（SEQ ID NO: 74）融合蛋白之設計係藉由基因工程法將人類IL-10融合至人類IgG1-Fc的N端（其中以14個胺基酸的連接子 GGGGSGGGGSGGGG（SEQ ID NO: 78）分開）。所需之編碼融合蛋白的基因，在其之前有IL-2分泌序列，用於生產重組型蛋白。該基因係以基因合成服務（Thermo Scientific）取得。該基因片段係選殖至哺乳類動物表現載體，且重組型IL10-Fc與(IL10)2 - Fc蛋白係於經轉染之ExpiCHO細胞中表現。利用SDS-PAGE確認IL10-Fc與(IL10)2 -Fc融合蛋白是否成功製備。
B. 抗 CSF1R 與 IL-10 於 同基因型 C T26 結腸癌模式中 之抗腫瘤活性
材料與方法： 將BALB/c小鼠（6至8週大，雌性）於皮下植入5 × 105 個CT26.WT細胞（ATCC CRL-2638）。在7天後，當腫瘤體積達到50至100 mm3 時，將小鼠隨機分配至各處理組。隨後，小鼠每週二次腹腔注射30 mg/kg大鼠IgG同型對照抗體（BioXcell）、30 mg/kg抗CSF1R（殖株AFS98，BioXcell）、20 mg/kg人類Fc對照蛋白（BioXcell）、或20 mg/kg IL10-Fc融合蛋白（SEQ ID NO: 73）。利用卡尺測量法每週兩次測量腫瘤體積，直到研究結束。每週收集血樣。利用ELISA套組（Biolegend）測量小鼠血漿中CSF1、IL-34、IL-18、及CXCL9之濃度。
結果： 如圖 7 A 與圖 7 B 所示，抗CSF1R抗體阻斷劑與IL10促效劑之組合可控制腫瘤負荷。此外，如圖 8 A 與圖 8 B 所示，抗CSF1R抗體阻斷劑與IL10促效劑之組合可維持同基因型CT26結腸癌模式中與CSF1R抑制和IL10促效劑功能相關之細胞介素濃度。
C . 腫瘤浸潤免疫細胞分析
針對免疫表型分析，在腫瘤植入第14天切除腫瘤，並分離成單細胞懸液。隨後，以螢光染料鍵接之抗CD45（殖株30-F11，BD Biosciences）、抗CD3（殖株500A2，BD Biosciences）、抗CD4（殖株RM4-5，BD Biosciences）、抗CD8（殖株53-6.7，BD Biosciences）、抗F4/80（殖株T45-2342，BD Biosciences）、抗CD11b（殖株M1/70，BD Biosciences）、抗Ly6C（殖株AL-21，BD Biosciences）、抗Ly6G（殖株1A8，BD Biosciences）、及PI（Sigma）將腫瘤浸潤之細胞染色。在冰上染色30分鐘後，細胞以FACS緩衝液清洗，並以2%多聚甲醛（paraformaldehyde）固定。在室溫下，經固定之細胞係進一步以螢光染料鍵接之抗IFNγ（殖株XMG1.2，BD Biosciences）進行細胞內染色1小時。在清洗後，細胞在LSRFortessa（BD Biosciences）上分析。
結果： 如圖 9 A- 9 C 所示，在CT26同基因型腫瘤模式中，結合抗CSF1R抗體與IL10-Fc融合體促效劑可減少TAM群而非MDSC。如圖 9 D - 9 E 所示，該組合可增加活化之腫瘤浸潤T細胞群。
實例 5 ： 抗CSF1R/IL10融合蛋白之製備與功能分析
本實例說明本發明示例性抗CSF1R/IL10抗體融合體（或「融合蛋白」）之產生及功能確認的研究。
A . 雙功能 抗 CSF1R / I L10 融合蛋白之產生
材料與方法： 重組型IL10-Fc（SEQ ID NO: 73）與(IL10)2 -Fc（SEQ ID NO: 74）融合蛋白之製備係如實例4所述，其係以基因工程法將IL-10融合至人類IgG1-Fc的N端（其中以14個胺基酸的連接子 GGGGSGGGGSGGGG（SEQ ID NO: 78）分開），並於經轉染之ExpiCHO細胞中表現。重組型抗CSF1R/IL10融合體（或「融合蛋白」）6D4/IL10、6M6/IL10、6D4.hu22/IL10、6D4.hu41/IL10、6M6.hu12/IL10、及6M6.hu41/IL10之設計與製備方式類似，其係以基因工程法將人類IL10融合至嵌合或人源化抗CSF1R抗體VH 結構域之C端（如實例2與3所述之方式製備），其中以14個胺基酸的連接子 GGGGSGGGGSGGGG（SEQ ID NO: 78）分開。此外，代用抗小鼠CSF1R抗體（「AB98」）係用於產生代用抗小鼠CSF1R/IL10融合蛋白（「AB98/IL10」）。抗CSF1R/IL10融合蛋白的整體胺基酸序列設計摘錄於表3。所需之基因片段，在其之前有分泌重組型蛋白時所需之IL-2分泌序列，係以商用基因合成服務（Thermo Scientific）方式製備，並選殖至哺乳類動物表現載體中。抗CSF1R/IL10融合蛋白構築體係於經轉染之ExpiCHO細胞中表現。
B. 抗 CSF1R / IL10 融合蛋白之表現與純化
材料與方法： 抗CSF1R/IL10融合蛋白係於ExpiCHO-S細胞（Thermo Scientific）中瞬時表現。在指數生長期過程中，利用ExpiFectamine CHO Transfection Kit（Thermo Scientific），瞬時轉染20 μg編碼Ab/IL10融合蛋白之載體。在轉染後18至22小時，將ExpiFectamine CHO Enhancer與ExpiCHO Feed加入培養瓶中。將細胞培養8天。將各培養基的上清液離心，隨後通過0.45 μm濾膜過濾。
利用Protein A Sepharose Fast Flow珠粒（GE Healthcare），純化經轉染細胞上清液中的融合蛋白。載有抗體之管柱以20倍管柱體積之PBS清洗，接著以3倍珠粒體積之0.1 M甘胺酸（pH 2.5）直接沖提至1/10體積之1M Tris緩衝液（pH 9.0）中。將含有融合蛋白之分液合併並透析至PBS中。在存在與不存在還原劑的情況下，利用SDS-PAGE，並以考馬斯亮藍（Coomassie blue）染色，檢查經純化抗CSF1R/IL10融合蛋白之品質。
結果： 示例性SDS-PAGE圖像確認了IL10融合蛋白IL10-Fc與(IL10)2 -Fc及抗CSF1R/IL10融合蛋白6D4/IL10、6D4/(IL10)2 、6M6/IL10、及6M6/(IL10)2 的純度，分別如圖 10A 與圖 10B 所示。圖 10C 顯示代用抗小鼠CSF1R（「AB98」）與相對應之「AB98/IL10」融合蛋白的SDS-PAGE。
C . CSF1R 特異性 ELISA
材料與方法： 將重組型人類CSF1R-Fc或小鼠CSF1R-Fc（Sino Biological）以濃度1 µg/mL溶於塗覆溶液（SeraCare）並在4°C於在96孔微量滴定盤上進行整夜固定。滴定盤孔以清洗液（含有0.05% Tween 20之咪唑緩衝鹽液）清洗，並以1% BSA阻斷。將連續稀釋之抗CSF1R/IL-10融合蛋白加入培養孔中。在37°C下培養1小時後，以清洗液清洗培養孔。欲檢測嵌合Ab/IL10融合體，將過氧化酶鍵接之山羊抗人類κ輕鏈抗體（Bethyl）加入各培養孔中，並在37°C下培養1小時。欲檢測AB98或AB98/IL10融合體，將過氧化酶鍵接之山羊抗小鼠IgG Fab抗體（Jackson immunoresearch）加入各培養孔中，並在37°C下培養1小時。在清洗後，培養孔在室溫下以TMB受質顯影5至10分鐘，接著以1N HCl終止反應。隨後，在450 nm與650 nm下測量吸光度。
結果： EC50 值係以GraphPad Prism7計算，如表11（下方）所示。
表 1 1 ： 抗CSF1R/IL10融合蛋白與CSF1R之結合活性
融合蛋白 EC50 （ M ）
h u C S F 1 R 結合作用
6D4/IL10 4.786 ×10-10
6D4/(IL10)2 3.930 ×10-10
6D4.hu22/IL10 2.713 ×10-10
6D4.hu41/IL10 2.203 ×10-10
6M6/IL10 2.699 ×10--10
6M6/(IL10)2 2.321 ×10-10
6M6.hu12/IL10 2.515 ×10-10
6M6.hu41/IL10 2.049 ×10-10
小鼠 C S F 1 R 結合作用
AB98 6.411 ×10-10
AB98/IL10 5.461 ×10-10
D . 利用流式細胞術測定細胞結合與跨物種反應性
材料與方法： 編碼全長人類CSF1R或食蟹猴CSF1R的基因片段係利用Thermo基因合成服務取得，並選殖至哺乳類動物表現載體pCDNA3.4。利用聚乙烯亞胺（PEI）方法，將CSF1R表現載體轉染至Freestyle 293-F細胞（Thermo Scientific），並以Geneticin（Thermo Scientific）進行篩選，以建立CSF1R穩定細胞株。在4°C下，CSF1R過量表現之293F細胞以連續稀釋之抗CSF1R/IL10融合蛋白培養1小時。在以FACS緩衝液（含有2%FBS之PBS）清洗後，細胞以抗人類IgG–Alexa Fluor 647染色，並利用Attune NxT Flow Cytometer（Thermo Scientific）分析。
結果： 如圖 1 1 A 與圖 1 1 B 所示，抗CSF1R/IL10融合蛋白係交叉反應，其辨識在293F細胞上表現的huCSF1R與cynoCSF1R。
E. 利用 抗 CSF1R / I L 1 0 融合蛋白 抑制配體誘發之 C S F 1 R 磷酸化
材料與方法： 在室溫下，將AML5細胞（2 ×106 個）培養於具有1 µg/mL之對照組hIgG1、抗CSF1R、IL10-Fc、或抗CSF1R/IL10融合蛋白的1 mL試驗培養基（含有Glutamax之MEMα）中5至10分鐘。隨後，細胞在37°C下以50 ng/mL人類CSF1（R&D Systems）培養5分鐘。培養後將細胞溶解，並萃取總蛋白質，取50 µg的蛋白進行西方墨點分析，使用針對總CSF1R（Cell Signaling）、磷酸化CSF1R（Tyr723）（Cell Signaling）、或β-肌動蛋白（Cell Signaling）的抗體偵測。
結果： 如圖 12 之西方墨點圖像所示，抗CSF1R/IL10融合蛋白、6M6/IL10、及6M6/(IL10)2 減弱CSF1介導之CSF1R磷酸化。
F . 利用競爭性 ELISA 測定配體結合至 C S F 1 R 之抑制作用
材料與方法： 將重組型人類CSF1R-Fc融合蛋白以1 µg/mL之濃度溶於塗覆溶液（SeraCare）並在4°C於96孔微量滴定盤進行整夜固定。在室溫下，滴定盤孔以清洗液清洗，並以1% BSA阻斷。將連續稀釋之Ab/IL-10融合蛋白加入培養孔中。隨後，將2.5 ug/mL生物素化人類CSF1-His（Biolegend）加入，並在37°C下培養1小時。在清洗後，將鏈黴親和素-HRP（Jackson ImmunoResearch）加入各孔中，並在室溫下培養1小時。在清洗後，培養孔在室溫下以TMB受質顯影5至10分鐘，並以1N HCl終止反應。隨後，在450 nm與650 nm下測量吸光度。IC50 值係以GraphPad Prism7計算。
結果： 如表2所示，抗CSF1R/IL10融合體呈現對配體CSF1結合至其同源受體CSF1R的阻斷活性。
表 1 2 ： 抗CSF1R/IL10融合蛋白對CSF1R與CSF1交互作用之阻斷活性
  融合蛋白 IC50 （ M ）
人類CSF1對人類CSF1R 6D4/IL10 1.4 ×10-9
6M6/IL10 4.81 ×10-10
小鼠CSF1對小鼠CSF1R AB98 8.25 ×10-10
AB98/IL10 7.08 ×10-10
G . IL10RA 特異性 E LISA
材料與方法： 將重組型人類IL-10Ra融合蛋白（R&D Systems）以濃度1 µg/mL溶於塗覆溶液（SeraCare）並在4°C於96孔微量滴定盤進行整夜固定。滴定盤孔以清洗液（含有0.05% Tween 20之咪唑緩衝鹽液）清洗，並以1% BSA阻斷。將連續稀釋之Ab/IL-10融合蛋白加入培養孔中。在37°C下培養1小時後，以清洗液清洗培養孔。將過氧化酶鍵接之山羊抗人類κ輕鏈抗體（Bethyl）加入各培養孔中，並在37°C下培養1小時。在清洗後，培養孔在室溫下以TMB受質顯影5至10分鐘，接著以1N HCl終止反應。隨後，在450 nm與650 nm下測量吸光度。EC50 值係以GraphPad Prism7計算。
結果： EC50 值係以GraphPad Prism7計算，如表13（下方）所示。
表 1 3 ： 抗CSF1R/IL10融合蛋白與IL10R之結合活性
  EC50 （ M ）
IL10-Fc 3.847 ×10-9
(IL10)2 -Fc 7.236 ×10-9
6D4/IL10 2.764 ×10-9
6D4/(IL10)2 6.076 ×10-9
6M6/IL10 2.752 ×10-9
6M6/(IL10)2 9.355 ×10-9
AB98/IL10 2.472 ×10-8
H . 利用 抗 CSF1R / I L10 融合蛋白抑制 配體 依賴性 A M L5 細胞增生
材料與方法： 在96孔培養盤之試驗培養基（含有Glutamax而無FBS之MEMα）中，以連續稀釋之Ab/IL10融合蛋白培養AML-5細胞（每孔1.5 ×104 個細胞）。隨後，將人類CSF-1（20 ng/mL）加入種植之細胞中，以刺激72小時。利用CellTiter-Glo試驗（Promega）測量AML-5細胞增生。
結果： 如圖 13A 所示，抗CSF1R/IL10抗體融合體6D4/IL10、6D4.hu22/IL10、6D4.hu41/IL10、6M6/IL10、6M6.hu12/IL10、及6M6.hu41/IL10皆能抑制CSF1依賴性細胞增生。由圖中確定之IC50 值係如下表 14 所示。
表 1 4
A M L 5 細胞增生之抑制
抗體 IC50 （ M ）
6D4/IL10 4.92 x 10-9
6D4.hu22/IL10 2.98 x 10-9
6D4.hu41/IL10 3.46 x 10-9
6M6/IL10 1.87 x 10-9
6M6.hu12/IL10 1.61 x 10-9
6M6.hu41/IL10 8.93 x 10-10
I. 利用 抗 CSF1R / I L10 融合蛋白抑制 CD 1 4 + 單核細胞 與 巨噬細胞之 C S F 1 依賴性 細胞存活率
材料與方法： 利用密度梯度離心法，立即以Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare）分離人類PBMC。CD14+單核細胞係以抗人類CD14鍵接磁珠（Miltenyi Biotec）分離。在細胞存活率試驗中，CD14+單核細胞（每孔1×104 個細胞）在96孔培養盤之培養基（含有10% FBS之RPMI1640）中培養於連續稀釋之抗CSF1R或Ab/IL10融合蛋白。隨後，將CSF1（100 ng/mL）加入細胞中。在刺激後6天，利用CellTiter-Glo試驗（Promega）測量細胞存活率。
為產生單核細胞衍生之巨噬細胞，將人類CD14+單核細胞以2 × 106 個細胞/mL培養於RPMI1640（其補充10% FBS）與100 ng/mL CSF1中6天。在增生試驗中，分化之巨噬細胞（每孔2×104 個細胞）在96孔培養盤之培養基（含有10% FBS之RPMI1640）中培養於連續稀釋之抗CSF1R或Ab/IL10融合蛋白。隨後，將CSF1（10 ng/mL）加入細胞中。在刺激後72小時，利用CellTiter-Glo試驗測量細胞存活率。
結果： 如圖 1 3 B 與圖 1 3 C 所示，抗CSF1R/IL10抗體融合體6M6/IL10、6M6/(IL10)2 、6M6.hu12/IL10、及6M6.hu41/IL10皆能抑制CSF1依賴性CD14+單核細胞與巨噬細胞存活率。由圖中確定之IC50 值係如下表 15 所示。
表 1 5
CD 1 4 + 單核細胞 存活率之抑制
抗體 IC50 （ M ）
6M6 2.24 x10-10
6M6/IL10 2.82 x10-10
6M6/(IL10)2 3.05 x10-10
巨噬細胞 存活率之抑制
6M6/IL10 1.89 x10-10
6M6.hu12/IL10 1.49 x10-10
6M6.hu41/IL10 1.84 x10-10
J . 代用小鼠抗 CSF1R 抗體 A B98 抑制配體依賴性 M -NF S - 6 0 細胞增生
材料與方法： 在96孔培養盤中，將M-NFS-60鼠科骨髓性白血病細胞（ATCC CRL-1838）（每孔2×103 個細胞）培養於試驗培養基（含有10% FBS與0.05 mM β-ME之RPMI1640）中，加入連續稀釋之抗小鼠CSF1R（AB98）或抗小鼠CSF1R/IL10融合蛋白（AB98/IL10），隨後將人類CSF-1（20 ng/mL）加入種植之細胞中，以刺激72小時。利用CellTiter-Glo試驗（Promega）測量M-NFS-60細胞增生。
結果： 如圖 13D 所示，代用小鼠抗CSF1R、AB98、抗CSF1R/IL10融合蛋白AB98/IL10亦能抑制CSF1依賴性M-NFS-60細胞增生。由圖中確定之IC50 值係如下表 16 所示。
表 1 6
M-NFS-60 細胞增生之抑制
抗體 IC50 （ M ）
AB98 0.32 x 10-9
AB98/IL10 0.36 x 10-9
K . IL10 刺激 M C / 9 細胞增生
材料與方法： 利用增生試驗確定IL10的生物活性。將MC/9（ATCC，CRL-8306）鼠科肥胖細胞培養於DMEM（GIBCO），其中補充2 mM L-麩醯胺酸、0.05 mM 2-巰乙醇、10%大鼠T-STIM（Becton Dickenson）、及10% FBS。在增生試驗中，將MC/9細胞以每孔1 ×104 個細胞置於含有200 μL試驗培養基（含有10% FBS之DMEM）之96孔培養盤中，加入IL10-Fc或Ab/IL10融合蛋白。刺激72小時後，利用CellTiter-Glo試驗測量MC/9細胞增生。
結果： 如圖 1 4 A 與圖 1 4 B 所示，抗CSF1R抗體融合體6M6/IL10、6M6/(IL10)2 、6D4.hu22/IL10、6D4.hu41/IL10、6M6.hu12/IL10、及6M6.hu41/IL10能誘發MC/9細胞增生。由圖中確定之EC50 值係如下表 17 所示。
表 1 7
誘發之 M C / 9 增生
抗體 EC50 （ M ）
IL10-Fc 1.82 x10-11
6M6/IL10 9.56 x10-12
6M6/(IL10)2 5.96 x10-12
6D4.hu22/IL10 1.14 x 10-11
6D4.hu41/IL10 1.14 x 10-11
6M6.hu12/IL10 4.60 x 10-11
6M6.hu41/IL10 2.54 x 10-11
L. IL10 活化 CD 8 T 細胞
材料與方法： 利用CD8磁珠（Miltenyi Biotec），從PBMCs分離出人類CD8 T細胞。將分離的CD8 T細胞（1×107 個細胞/3 mL/孔，6孔培養盤）培養於AIM-V培養基（Thermo Scientific）中，並以T Cell TransAct（Miltenyi Biotec）活化3天。在活化後，CD8 T細胞接著清洗並置於（每孔4×105 個細胞）96孔培養盤中，且以Ab/IL-10融合蛋白處理3天。以Ab/IL-10融合蛋白處理後，細胞以1 µg/mL溶液態抗CD3（Biolegend）再次刺激4小時。依據製造商之說明，利用ELISA（Biolegend）測量細胞培養基中IFN-γ與顆粒溶解酶B之濃度。
結果： 如圖 15A 、圖 15B 、圖 15C 、及圖 15D 所示，具有IL10之抗CSF1R抗體融合體能使活化CD8 T細胞增強其IFNγ與顆粒溶解酶B之產生。由圖 15C 與圖 15D 中確定之EC50 值係如下表 18 所示。
表 1 8
抗體融合體 EC50 （ M ）
誘發之 IFNγ 產生
6D4/IL10 1.91 x10-10
6M6/IL10 3.36 x10-10
誘發之顆粒溶解酶 B 產 生
6D4/IL10 6.35 x 10-10
6D4/IL10 5.61 x 10-9
M . CT26 腫瘤模式之 腫瘤浸潤免疫細胞分析
材料與方法： 將BALB/c小鼠（6至8週大，雌性）於皮下植入5 × 105 個CT26.WT細胞（ATCC CRL-2638）。在第7天時，當腫瘤體積達到50至100 mm3 時，將小鼠隨機分配至各處理組。隨後，小鼠每週二次腹腔注射20 mg/kg人類IgG1 Fc對照組（BioXcell）、20 mg/kg IL10-Fc、30 mg/kg抗CSF1R AB98、12或36 mg/kg抗CSF1R/IL10融合蛋白（AB98/IL10）。在兩次的處理後，在第14天時收集全血與腫瘤，進行免疫表型分析。將腫瘤分離成單細胞懸液。隨後，在冰上，以螢光染料鍵接之抗CD45（殖株30-F11，BD Biosciences）、抗CD3（殖株500A2，BD Biosciences）、抗CD4（殖株RM4-5，BD Biosciences）、抗CD8（殖株53-6.7，BD Biosciences）、抗F4/80（殖株T45-2342，BD Biosciences）、抗CD11b（殖株M1/70，BD Biosciences）、抗Ly6C（殖株AL-21，BD Biosciences）、抗Ly6G（殖株1A8，BD Biosciences）、抗LAG3（殖株C9B7W，BD Biosciences）、抗PD1（殖株RMP1-30，BD Biosciences）、及PI（Sigma）將血液細胞與腫瘤浸潤之細胞染色30分鐘。在清洗後，細胞在LSRFortessa（BD Biosciences）上分析。
每週收集血樣。利用ELISA套組（Biolegend）測量小鼠CSF1的濃度。
結果： 如圖 1 7 A- 1 7 C 所示，在腫瘤模式中，以抗CSF1R抗體阻斷CSF1R會減少TAMs（CD11b+F4/80+）群。如圖 1 7 D- 1 7 E 所示，在腫瘤模式中，具IL-10功能的抗CSF1R/IL10融合體會增加CD8+LAG3+PD1+ T細胞群。
N . 抗 CSF1R / I L10 融合體 在 同基因型腫瘤模式之抗腫瘤活性
材料與方法： 將BALB/c小鼠（6至8週大，雌性）於皮下植入5 × 105 個CT26.WT細胞（ATCC CRL-2638）、5 × 105 個EMT6細胞（ATCC CRL-2755）、1 × 106 個H22細胞（RRID:CVCL_H613）、或1 × 106 個Renca細胞（ATCC CRL-2947）。將C57BL/6小鼠（6至8週大，雌性）於皮下植入3 × 105 個LL/2細胞（ATCC CRL-1642）、1 × 106 個MC38細胞（RRID:CVCL_B288）、3 × 106 個Pan02細胞（RRID:CVCL_D627）、或5 × 105 個Q1-2細胞。當腫瘤體積達到50至100 mm3 時，將小鼠隨機分配至各處理組。隨後，小鼠以每週二次進行腹腔注射對照物質或36 mg/kg抗CSF1R/IL10融合蛋白（AB98/IL10）。利用卡尺測量法每週兩次測量腫瘤體積，直到研究結束。
結果： 如圖 1 9 A- 1 9 G 所示，以代用抗小鼠CSF1R/IL10抗體融合體AB98/IL10處理，使得所有腫瘤模式在第3週時腫瘤體積明顯減少（~30-70%）。
儘管有所附申請專利範圍，但本文所揭示之內容亦可由下列條款限定，此些條款可在單獨或與一或多個其他成因或實施例結合具有益處。在不侷限前述說明之情況下，提供如以下編號之本發明特定非侷限條款，其中可使用各單獨編號之條款或與前述或以下條款中之任一者一起組合。因此，其旨在提供支持所有的此類組合，而非侷限於以下明確提供之特定組合： 1.       一種經分離之抗體或其抗原結合部分，其包含：CDR-H1，其包含選自於SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 28的胺基酸序列；CDR-H2，其包含選自於SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 31的胺基酸序列；CDR-H3，其包含選自於SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 33的胺基酸序列；CDR-L1，其包含選自於SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 37的胺基酸序列；CDR-L2，其包含選自於KAS或VAS的胺基酸序列；以及CDR-L3，其包含選自於SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 40的胺基酸序列。 2.       如條款1之經分離抗體或其抗原結合部分，其中：該CDR-H1、CDR-H2、及CDR-H3分別為SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 6、及SEQ ID NO: 8；及/或該CDR-L1、CDR-L2、及CDR-L3分別為SEQ ID NO: 13、KAS、及SEQ ID NO: 16。 3.       如條款1之經分離抗體或其抗原結合部分，其中該CDR-H1、CDR-H2、及CDR-H3分別為SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 31、及SEQ ID NO: 33；及/或該CDR-L1、CDR-L2、及CDR-L3分別為SEQ ID NO: 37、VAS、及SEQ ID NO: 40。 4.       如條款1至3中任一款之經分離抗體或其抗原結合部分，其中： (a)   VH 包含一與SEQ ID NO: 2具有至少90%同一性的序列；且VL 包含一與SEQ ID NO: 12具有至少90%同一性的序列； (b)  VH 包含一與SEQ ID NO: 19具有至少90%同一性的序列；且VL 包含一與SEQ ID NO: 21具有至少90%同一性的序列； (c)   VH 包含一與SEQ ID NO: 23具有至少90%同一性的序列；且VL 包含一與SEQ ID NO: 25具有至少90%同一性的序列； (d)  VH 包含一與SEQ ID NO: 27具有至少90%同一性的序列；且VL 包含一與SEQ ID NO: 36具有至少90%同一性的序列； (e)   VH 包含一與SEQ ID NO: 43具有至少90%同一性的序列；且VL 包含一與SEQ ID NO: 45具有至少90%同一性的序列；或 (f)    其中VH 包含一與SEQ ID NO: 47具有至少90%同一性的序列；且VL 包含一與SEQ ID NO: 49具有至少90%同一性的序列。 5.       一種重組型蛋白，其包含如條款1至4中任一款之經分離抗體或其抗原結合部分融合至IL-10多胜肽。 6.       如條款5之重組型蛋白，其中IL-10多胜肽包含SEQ ID NO: 75的胺基酸序列。 7.       如條款5至6中任一款之重組型蛋白，其中經分離抗體或其抗原結合部分經由連接子融合至IL-10多胜肽；選擇性地，其中該連接子包含SEQ ID NO: 78的胺基酸序列。 8.       如條款5至7中任一款之重組型蛋白，其包含一、二、或四個IL-10多胜肽. 9.       如條款5至8中任一款之重組型蛋白，其包含一與SEQ ID NO: 50、51、52、53、54、55、56、或57具有至少90%同一性的序列。 10.  一種醫藥組合物，其包含如條款1至4中任一款之經分離抗體或其抗原結合部分及醫藥上可接受載體。 11.  如條款10之醫藥組合物，其進一步包含IL-10。 12.  如條款11之醫藥組合物，其中該經分離抗體或其抗原結合部分融合至IL-10，從而形成重組型蛋白。 13.  如條款12之醫藥組合物，其中該重組型蛋白為如條款5至9中任一款之重組型蛋白。 14.  一種治療癌症的方法，包含投予有需求之受試者一有效量之如條款1至4中任一款之經分離抗體或其抗原結合部分或如條款5至9中任一款之重組型蛋白。 15.  如條款14之方法，其中該癌症為結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、HCC、腎臟癌、乳癌、肺癌、胃癌、頭頸癌、或口腔癌。 16.  一種治療癌症的套組，其包含：CSF1R拮抗劑與IL10促效劑。 17.  如條款16之套組，其中CSF1R拮抗劑為抗體或其抗原結合片段、shRNA、siRNA、miRNA、CSF1R之小分子抑制劑、或其組合。 18.  如條款16至17中任一款之套組，其中CSF1R拮抗劑為條款1至4中任一款之經分離抗體或其抗原結合部分。 19.  如條款16至18中任一款之套組，其中IL10促效劑為IL10、IL10受體結合蛋白、IL10受體促效劑、或其組合。 20.  一種治療癌症的方法，其包含投予有需求之受試者CSF1R拮抗劑與IL-10促效劑。 21.  如條款20之方法，其中CSF1R拮抗劑為抗體或其抗原結合片段、shRNA、siRNA、miRNA、CSF1R之小分子抑制劑、或其組合。 22.  如條款20至21中任一款之方法，其中CSF1R拮抗劑為如條款1至4中任一款之經分離抗體或其抗原結合部分。 23.  如條款20至22中任一款之方法，其中IL10促效劑為IL10、IL10受體結合蛋白、或其組合。 24.  如條款20至23中任一款之方法，其進一步包含投予受試者T細胞療法。 25.  一種T細胞活化的方法，其包含以CSF1R拮抗劑與IL10促效劑接觸T細胞群。 26.  如條款25之方法，其中CSF1R拮抗劑為抗體或其抗原結合片段、shRNA、siRNA、miRNA、CSF1R之小分子抑制劑、或其組合。 27.  如條款25至26中任一款之方法，其中CSF1R拮抗劑為如條款1至4中任一款之經分離抗體或其抗原結合部分。 28.  如條款25至27中任一款之方法，其中IL10促效劑為IL10、IL10受體結合蛋白、或其組合。 29.  如條款23之方法，其中IL-10促效劑為IL-10。 30.  如條款27至29中任一款之方法，其中經分離抗體或其抗原結合部分融合至IL10，從而形成重組型蛋白。 31.  如條款30之方法，其中該重組型蛋白為如條款5至9中任一款之重組型蛋白。 32.  如條款31之方法，其中T細胞為CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、或其組合。 33.  一種抗CSF1R抗體，其包含（i）第一輕鏈互補決定區（CDR-L1）、第二輕鏈互補決定區（CDR-L2）、及第三輕鏈互補決定區（CDR-L3），及/或（ii）第一重鏈互補決定區（CDR-H1）、第二重鏈互補決定區（CDR-H2）、及第三重鏈互補決定區（CDR-H3），其中： (a)   CDR-H1包含選自於SEQ ID NO: 3、4、28、或29的胺基酸序列； (b)   CDR-H2包含選自於SEQ ID NO: 6、7、31、或32的胺基酸序列； (c)   CDR-H3包含選自於SEQ ID NO: 8、9、33、或34的胺基酸序列； (d)   CDR-L1包含選自於SEQ ID NO: 13、14、37、或38的胺基酸序列； (e)   CDR-L2包含選自於KAS、VAS、或SEQ ID NO: 15或39的胺基酸序列； (f)    CDR-L3包含選自於SEQ ID NO: 16、17、40、或41的胺基酸序列。 34.  如條款33之抗體，其中： (a)   CDR-H1包含SEQ ID NO: 3或4的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 6或7的胺基酸序列，且CDR-H3包含SEQ ID NO: 8或9的胺基酸序列；或 (b)   CDR-H1包含SEQ ID NO: 28或29的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 31或32的胺基酸序列，且CDR-H3包含SEQ ID NO: 33或34的胺基酸序列。 35.  如條款33至34中任一款之抗體，其中： (a)   CDR-L1包含SEQ ID NO: 13或14的胺基酸序列，CDR-L2包含KAS或SEQ ID NO: 15的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 16或17的胺基酸序列；或 (b)   CDR-L1包含SEQ ID NO: 37或38的胺基酸序列，CDR-L2包含VAS或SEQ ID NO: 39的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 40或41的胺基酸序列。 36.  如條款33至35中任一款之抗體，其中： (a)   CDR-H1包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO: 13的胺基酸序列，CDR-L2包含KAS的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 16的胺基酸序列； (b)   CDR-H1包含SEQ ID NO: 28的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 31的胺基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO: 33的胺基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO: 37的胺基酸序列，CDR-L2包含VAS的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 40的胺基酸序列； (c)   CDR-H1包含SEQ ID NO: 4的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO: 14的胺基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO: 15的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 17的胺基酸序列； (d)   CDR-H1包含SEQ ID NO: 29的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 32的胺基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO: 34的胺基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO: 38的胺基酸序列，CDR-L2包含VAS或SEQ ID NO: 39的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列。 37.  如條款33至36中任一款之抗體，其中該抗體包含（i）第一輕鏈高變區（HVR-L1）、第二輕鏈高變區（HVR-L2）、及第三輕鏈高變區（HVR-L3），及/或（ii）第一重鏈高變區（HVR-H1）、第二重鏈高變區（HVR-H2）、及第三重鏈高變區（HVR-H3），其中： (a)   HVR-H1包含選自於SEQ ID NO: 5或30的胺基酸序列； (b)   HVR-H2包含選自於SEQ ID NO: 7或32的胺基酸序列； (c)   HVR-H3包含選自於SEQ ID NO: 10或33的胺基酸序列； (d)   HVR-L1包含選自於SEQ ID NO: 14或38的胺基酸序列； (e)   HVR-L2包含選自於SEQ ID NO: 15或39的胺基酸序列； (f)    HVR-L3包含選自於SEQ ID NO: 17或41的胺基酸序列。 38.  如條款37之抗體，其中： (a)   HVR-H1包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列；HVR-H2包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列；HVR-H3包含SEQ ID NO: 10的胺基酸序列；HVR-L1包含SEQ ID NO: 14的胺基酸序列；HVR-L2包含SEQ ID NO: 15的胺基酸序列；且HVR-L3包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列；或 (b)   HVR-H1包含SEQ ID NO: 30的胺基酸序列；HVR-H2包含SEQ ID NO: 32的胺基酸序列；HVR-H3包含SEQ ID NO: 33的胺基酸序列；HVR-L1包含SEQ ID NO: 38的胺基酸序列；HVR-L2包含SEQ ID NO: 39的胺基酸序列；且HVR-L3包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列。 39.  如條款33至38中任一款之抗體，其中該抗體包含一與選自於SEQ ID NO: 2、19、23、27、43、或47之序列具有至少90%同一性的重鏈可變結構域（VH）胺基酸序列；及/或一與選自於SEQ ID NO: 12、21、25、36、45、或49之序列具有至少90%同一性的輕鏈可變結構域（VL）胺基酸序列；選擇性地，其中： (a)   該抗體包含一與SEQ ID NO: 2具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 12具有至少90%同一性的輕鏈可變結構域（VL ）胺基酸序列； (b)   該抗體包含一與SEQ ID NO: 19具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 21具有至少90%同一性的VL 胺基酸序列； (c)   該抗體包含一與SEQ ID NO: 23具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 25具有至少90%同一性的VL 胺基酸序列； (d)   該抗體包含一與SEQ ID NO: 27具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 36具有至少90%同一性的VL 胺基酸序列； (e)   該抗體包含一與SEQ ID NO: 43具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 45具有至少90%同一性的VL 胺基酸序列；或 (f)    該抗體包含一與SEQ ID NO: 47具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 49具有至少90%同一性的VL 胺基酸序列。 40.  如條款33至39中任一款之抗體，其中 該抗體包含一與選自於SEQ ID NO: 58、60、62、64、66、或68之序列具有至少90%同一性的重鏈（HC）胺基酸序列，及/或一與選自於SEQ ID NO: 59、61、63、65、67、或69之序列具有至少90%同一性的輕鏈（LC）胺基酸序列；選擇性地，其中該抗體包含： (a)   SEQ ID NO: 58的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 59的LC胺基酸序列； (b)   SEQ ID NO: 60的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 61的LC胺基酸序列； (c)   SEQ ID NO: 62的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 63的LC胺基酸序列； (d)   SEQ ID NO: 64的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 65的LC胺基酸序列； (e)   SEQ ID NO: 66的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 67的LC胺基酸序列；或 (f)    SEQ ID NO: 68的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 69的LC胺基酸序列。 41.  如條款33至40中任一款之抗體，其中該抗體包含一經由連接子融合至IL10多胜肽的HC；選擇性地，其中： (a)   連接子包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列； (b)  IL10多胜肽包含一、二、或四個IL10多胜肽；及/或 (c)   IL10多胜肽包含SEQ ID NO: 75的胺基酸序列； (d)  HC包含一與選自於SEQ ID NO: 50、51、52、53、54、55、56、或57之序列具有至少90%同一性的胺基酸序列。 42.  如條款41之抗體，其中 該抗體包含一與選自於SEQ ID NO: 50、51、52、53、54、55、56、或57之序列具有至少90%同一性的重鏈（HC）胺基酸序列，以及一與選自於SEQ ID NO: 59、61、63、65、67、或69之序列具有至少90%同一性的輕鏈（LC）胺基酸序列；選擇性地，其中該抗體包含： (a)   SEQ ID NO: 50的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 59的LC胺基酸序列； (b)   SEQ ID NO: 51的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 59的LC胺基酸序列； (c)   SEQ ID NO: 52的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 61的LC胺基酸序列； (d)   SEQ ID NO: 53的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 63的LC胺基酸序列； (e)   SEQ ID NO: 54的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 65的LC胺基酸序列； (f)    SEQ ID NO: 55的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 65的LC胺基酸序列； (g)   SEQ ID NO: 56的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 67的LC胺基酸序列；或 (h)   SEQ ID NO: 57的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 69的LC胺基酸序列。 43.  如條款33至42中任一款之抗體，其中： (a)   該抗體以1 x 10-8 M或以下、1 x 10-9 M或以下、1 x 10-10 M或以下之結合親和力結合至人類CSF1R；視情況其中結合親和力係藉由與SEQ ID NO: 70之huCSF1R多胜肽的平衡解離常數（KD ）來測得； (b)   該抗體以1 x 10-8 M或以下、1 x 10-9 M或以下、1 x 10-10 M或以下之結合親和力結合至食蟹猴CSF1R；視情況其中結合親和力係藉由與SEQ ID NO: 71之cynoCSF1R多胜肽的平衡解離常數（KD ）來測得； (c)   該抗體減少CSF1誘發與IL34誘發的huCSF1R或AKT磷酸化作用； (d)   該抗體抑制CSF1依賴性與IL34誘發之細胞增生達至少65%、至少75%、至少85%、至少95%、或至少100%；視情況其中在CSF1濃度為20 ng/mL或IL34濃度為33 ng/mL時，抗體的IC50 為5 nM或以下、1 nM或以下、0.5 nM或以下、或0.1 nM或以下； (e)   該抗體抑制人類CD14+單核細胞或單核細胞衍生之巨噬細胞之CSF1依賴性存活率達至少65%、至少75%、至少85%、至少95%、或至少100%；視情況其中在CSF1濃度為100 ng/mL時，抗體的IC5 0 為5 nM或以下、1 nM或以下、0.5 nM或以下、或0.1 nM或以下； (f)    該抗體增加NK細胞介導之針對表現CSF1R之293F細胞的ADCC達至少10%、至少20%、或至少25%； (g)   該抗體在21天測量的同基因型小鼠腫瘤模式中減少腫瘤體積達至少25%、至少50%、至少75%、或以上，其中小鼠腫瘤模式選自於：CT26 CRC、EMT6 TNBC、MC38 CRC、Renca RCC、LL/2肺臟、Pan02 PDAC、H22 HCC、Q1 HNSCC； (h)   該抗體在CT26結腸腫瘤同基因型小鼠模式中增加CSF1與IL34的血液中濃度達至少50倍、至少100倍、200倍、或至少500倍； (i)     該抗體在CT26結腸腫瘤同基因型小鼠模式中減少TAM群達至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、或以上；視情況其中MDSC群減至小於10%、小於5%、或以下； (j)     該抗體增加MC/9細胞增生達至少25%、至少50%、至少100%、至少150%、至少200%或以上； (k)   該抗體在活化的CD8 T細胞中增加IFNγ與顆粒溶解酶B產生達至少25%、至少50%、至少100%、或以上；及/或 (l)     該抗體在CT26結腸腫瘤同基因型小鼠模式中增加CD8+LAG3+PD1+ T細胞血液中濃度達至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、或以上。 44.  一種經分離之多核苷酸或載體，其編碼條款33至43中任一款之抗體；或經分離之之宿主細胞，包含該寡核苷酸或載體；視情況其中該宿主細胞選自於中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、骨髓瘤細胞（如，Y0、NS0、Sp2/0）、猴腎細胞（COS-7）、人類胚胎腎細胞株（293）、小倉鼠腎細胞（BHK）、小鼠賽特利細胞（如，TM4）、非洲綠猴腎細胞（VERO-76）、人類子宮頸癌細胞（HELA）、犬腎細胞、人類肺細胞（W138）、人類肝細胞（Hep G2）、小鼠乳腺腫瘤細胞、TR1細胞、醫學研究委員會5（MRC 5）細胞、及FS4細胞。 45.  一種製造抗體的方法，包含培養如條款44之宿主細胞從而產生抗體。 46.  一種醫藥組合物，包含如條款33至43中任一款之抗體及醫藥上可接受載體；視情況其中該組合物進一步包含IL10、化療藥劑、及/或含有具有免疫檢查點分子特異性之抗體。 47.  一種治療受試者之CSF1R介導之疾病的方法，該方法包含投予受試者一治療上有效量之如條款33至43中任一款之抗體，或投予受試者受試者一治療上有效量之如條款46之醫藥組合物；視情況其中該疾病為癌症；視情況其中該癌症為結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、HCC、腎臟癌、乳癌、肺癌、胃癌、頭頸癌、或口腔癌。 48.  一種治療受試者之癌症的方法，包含投予該受試者CSF1R拮抗劑與IL-10促效劑；視情況其中該CSF1R拮抗劑包含抗CSF1R抗體、shRNA、siRNA、miRNA、CSF1R之小分子抑制劑、或其組合；視情況其中IL-10促效劑為IL-10、IL-10受體結合蛋白、或其組合；視情況其中CSF1R拮抗劑為如條款33至43中任一款之抗CSF1R抗體；視情況其中CSF1R拮抗劑與IL10促效劑包含一具有經由連接子融合至IL10多胜肽之HC的抗CSF1R抗體。 49.  如條款48之方法，其中該癌症為結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、HCC、腎臟癌、乳癌、肺癌、胃癌、頭頸癌、或口腔癌。 50.  如條款48至49中任一款之方法，其中該方法進一步包含投予該受試者T細胞療法。 51.  一種組合物或製劑之用途，其包含如條款33至43中任一款之抗CSF1R抗體，用於治療或治療之藥劑；視情況其中該治療用於CSF1R介導之疾病；視情況其中CSF1R介導之疾病為癌症。 52.  一種組合物或製劑之用途，其包含如條款33至43中任一款之抗CSF1R抗體，以製造或製備藥劑；視情況，其中該藥劑用於治療CSF1R介導之疾病；視情況其中CSF1R介導之疾病為癌症。
儘管出於清楚及理解之目的透過示例及說明的方式詳細描述了本發明的前述公開內容，但是包括本文描述的示例、描述，以及實施例的本發明是出於說明性目的，目的為示例性的，並且不應該被解釋為侷限本發明。本領域具有通常知識者將清楚，可以對本文描述的示例、描述，以及實施例進行各種修改或改變，並且將包括於本發明以及所附申請專利範圍之精神及範圍內。此外，本領域具有通常知識者將認識到許多與本文描述的那些等同之方法及程序。所有這些等同物應被理解為於本發明的範圍內並且由所附申請專利範圍覆蓋。
在以下申請專利範圍中闡述了本發明之額外的實施例。
出於所有目的，此處引用的所有出版物、專利申請案、專利、或其他文件的公開內容皆明確地通過引用全文而併入本文中，其程度與單獨引用之每一此類單獨的出版物、專利、專利申請案、或其他文件之目的相同，其係基於所有目的，通過引用將其全文併入本文中，並在此全文提出。在發生衝突的情況下，以本說明書（包括指定之術語）為準。
無
圖 1 A 與圖 1 B 描繪ForteBio表位聚類（epitope binning）試驗的結果，顯示從融合瘤上清液中純化的兩個抗CSF1R抗體「hy6D4」與「hy6M6」結合至CSF1R的不同表位。感測器通過多個試驗步驟（以數字表示，並以虛線分開），包括步驟1之基線；步驟2之生物素-CSF1R抗原捕獲；步驟3之以1st mAb飽和化；以及步驟4。圖 1A 顯示利用1st mAb hy6M6與2nd mAb hy6D4之競爭結果。圖 1B 顯示利用1st mAb hy6M6與2nd mAb hy6M6之競爭結果。
圖 2 A 、圖 2 B 、及圖 2 C 為一維直方圖（histogram），其顯示如實例2所述而進行的代表性流式細胞術實驗，嵌合抗CSF1R抗體「6D4」與「6M6」對人類與食蟹猴CSF1R蛋白的跨物種結合。圖 2A ：6D4、6M6、或對照組人類IgG（hIgG）結合至AML-5人類急性髓樣白血病細胞；圖 2B ：6D4、6M6、及hIgG結合至過量表現人類CSF1R的293F細胞；以及圖 2C ：6D4、6M6、及hIgG結合至過量表現食蟹猴CSF1R的293F細胞。
圖 3 A 與圖 3 B 描繪西方墨點凝膠圖像，其顯示在抗CSF1R抗體存在時，會減弱AML5細胞中配體所誘發之CSF1R與AKT磷酸化。如實例2所述，將AML5細胞以對照組hIgG、市售抗CSF1R抗體、「CSF1R Ab-R」與「CSF1R Ab-L」、嵌合抗CSF1R抗體6D4或6M6預處理5分鐘，隨後以CSF1（圖 3A ）或IL-34（圖 3B ）刺激5分鐘。以西方墨點法探測細胞裂解液中之總（T）與磷（P）CSF1R與AKT。
圖 4 A 、圖 4 B 、圖 4 C 、及圖 4 D 描繪在嵌合抗CSF1R抗體、6D4、及6M6存在下抑制CSF1或IL-34配體依賴性細胞增生。如實例2所述，AML5細胞與CSF1（圖 4 A ）或IL-34（圖 4 B ）及不同濃度的對照組hIgG、嵌合抗CSF1R抗體6D4及6M6培養3天；或AML5細胞以CSF1及人源化抗CSF1R抗體6D4.hu22與6D4.hu41（圖 4 C ）或6M6.hu12與6M6.hu41（圖 4 D ）培養3天。利用CellTiter-Glo試驗測量細胞增生。
圖 5 A 、圖 5 B 、圖 5 C 、及圖 5 D 描繪在抗CSF1R抗體存在下抑制CSF1依賴性細胞存活率。人類CD14+血液單核細胞（圖 5 A ）或單核細胞衍生之巨噬細胞（圖 5 B ）培養於CSF1及不同濃度的對照組hIgG、嵌合抗CSF1R抗體6D4與6M6；或人類CD14+血液單核細胞培養於不同濃度的嵌合抗CSF1R抗體6D4、及人源化抗體6D4.hu22與6D4.hu41（圖 5 C ）或嵌合抗CSF1R抗體6M6、及人源化抗體6M6.hu12與6M6.hu41（圖 5 D ）。利用CellTiter- Glo試驗測量細胞存活率。
圖 6 顯示在抗CSF1R抗體存在下可增進自然殺手（NK）細胞介導之抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。在抗CSF1R抗體存在下以E:T比率20:1混合新鮮分離的NK效應細胞與293F/CSF1R標靶細胞，並在37°C下培養5小時。利用CytoTox-Glo細胞毒性試驗（Promega）測量細胞毒性。
圖 7 A 與圖 7 B 描繪以抗CSF1R抗體阻斷劑與IL10促效劑之合併免疫治療可控制腫瘤負荷。在CT26腫瘤植入小鼠7天後，且大小達到50至100 mm3 ，將CT26腫瘤小鼠隨機分組，接著以同種型對照組（BioXcell，30 mg/kg）、抗CSF1R（BioXcell，30 mg/kg）、IL10-Fc（20 mg/kg）或組合治療每週給藥二次，共3週。圖 7A ：將CT26植入之Balb/c小鼠在第28天終點時的腫瘤體積。圖 7B ：將CT26植入之Balb/c小鼠在第0天時隨時間的個別腫瘤體積。每組n = 8隻小鼠。
圖 8 A 、圖 8 B 、圖 8 C 、及圖 8 D 描繪在同基因型CT26結腸癌模式中，與CSF1R抑制作用及IL10功能相關的細胞介素濃度。小鼠以抗CSF1R或IL10-Fc融合蛋白給藥處理1週後，血漿中的CSF1（圖 8 A ）、IL-34（圖 8 B ）、CXCL9（圖 8 C ）濃度。小鼠以抗CSF1R或IL10-Fc處理3週後的IL-18血漿濃度（圖 8 D ）。
圖 9 A 、圖 9 B 、圖 9 C 、圖 9 D 、及圖 9 E 描繪在CT26同基因型腫瘤模式中，腫瘤浸潤免疫細胞的分析結果。以同型對照抗體、抗CSF1R、或IL10-Fc治療同基因型CT26腫瘤小鼠。在治療7天後，收集腫瘤並以流式細胞術分析。圈選分析（gate）腫瘤微環境的CD45+白血球，其中TAMs（CD11b+F4/80+）（圖 9 A ）、單核型MDSCs（CD11b+Ly6C+）（圖 9 B ）、顆粒型MDSCs（CD11b+Ly6G+）（圖 9 C ）、活化型CD4 T細胞（CD4+IFNγ+）（圖 9 D ）、活化型CD8 T細胞（CD8+IFNγ+）（圖 9 E ）的百分比。每組n = 8隻小鼠。結果以平均值± SD顯示。*p ＜ 0.05、**p ＜ 0.01、***p ＜ 0.001。
圖 1 0 A 、圖 1 0 B 、及圖 10 C 描繪實例5所述之IgG/IL10融合蛋白經成功表現與純化後的凝膠圖像。圖 1 0 A 顯示IL10-Fc與(IL10)2 -Fc的SDS-PAGE圖像；圖 10B 顯示6D4/IL10、6D4/(IL10)2 、6M6/IL10、及6M6/(IL10)2 融合蛋白製備物的SDS-PAGE圖像；圖 10C 顯示代用抗小鼠CSF1R抗體AB98、及AB98/IL10融合蛋白的SDS-PAGE圖像。凝膠泳道底部標記：N：未還原處理，R：還原處理。
圖 1 1 A 與圖 1 1 B 描繪如實例5所述之跨物種結合實驗數據圖，其顯示嵌合抗CSF1R/IL10融合蛋白（「6D4/IL10」與「6M6/IL10」）與人源化抗CSF1R/IL10融合蛋白（「6D4.hu22/IL10」、「6D4.hu41/IL10」、「6M6.hu12/IL10」、及「6M6.hu41/IL10」）可跨物種結合至293F細胞所過量表現的人類CSF1R（「huCSF1R」）（圖 1 1 A ）或食蟹猴CSF1R（「cynoCSF1R」）（圖 1 1 B ）。
圖 1 2 描繪如實例5所述之所得凝膠圖像，其顯示在對照組hIgG、抗CSF1R抗體6M6、抗CSF1R抗體6M6加上IL10-Fc、抗CSF1R抗體加上(IL10)2 -Fc、或抗CSF1R/IL10融合蛋白6M6/IL10或6M6/(IL10)2 存在下，AML5細胞中CSF1誘發的CSF1R磷酸化作用減弱。
圖 1 3 A 、圖 1 3 B 、圖 1 3 C 、及圖 1 3 D 描繪如實例5所述之所得數據圖，其顯示在抗CSF1R/IL10融合蛋白存在時可抑制CSF1依賴性細胞增生。圖 1 3 A ：將AML5細胞與CSF1及人源化抗CSF1R/IL10融合蛋白培養3天。圖 1 3 B ：將人類CD14+血液單核細胞與CSF1及不同濃度的對照組hIgG、抗CSF1R、或抗CSF1R/IL10融合蛋白培養6天。圖 1 3 C ：將人類單核細胞衍生之巨噬細胞與CSF1及不同濃度的人源化抗CSF1R/IL10融合蛋白培養3天。圖 1 3 D ：將M-NFS-60細胞與CSF1及代用抗CSF1R/IL10融合蛋白培養3天。利用CellTiter-Glo試驗測量細胞存活率與增生。
圖 1 4 A 與圖 1 4 B 描繪如實例5所述之所得數據圖，其顯示利用抗CSF1R/IL10融合蛋白誘發MC/9細胞增生。將MC/9細胞與IL10-Fc及嵌合抗CSF1R/IL10融合蛋白（圖 1 4 A ）或人源化抗CSF1R/IL10融合蛋白（圖 14 B ）共同培養3天。利用CellTiter-Glo試驗測量細胞增生。
圖 1 5 A 、圖 1 5 B 、圖 1 5 C 、及圖 1 5 D 描繪如實例5所述之所得數據圖，其顯示利用抗CSF1R/IL10融合蛋白可使經抗CD3與抗CD28活化3天之CD8 T細胞增強IFNγ與顆粒溶解酶B的產生。活化的CD8 T細胞以IL10-Fc（圖 1 5 A 、圖 15 B ）或抗CSF1R/IL10融合蛋白（圖 1 5 C 、圖 1 5 D ）處理3天後，以抗CD3再刺激4小時。利用ELISA測量細胞培養基中IFNγ（圖 15 A 、圖 1 5 C ）與細胞毒性蛋白顆粒溶解酶B（圖 1 5 B 、圖 1 5 D ）的濃度。
圖 1 6 描繪在同基因型CT26結腸癌模式中與CSF1R抑制及IL-10功能相關的細胞介素濃度。顯示以抗CSF1R IL10-Fc或抗CSF1R/IL10處理1週的小鼠血漿中CSF1濃度。每組n = 6隻小鼠。結果以平均值± SD顯示。*p ＜ 0.05。
圖 1 7 A 、圖 1 7 B 、及圖 17 C 描繪在CT26同基因型腫瘤模式中，腫瘤浸潤免疫細胞分析的結果。將移植同基因型CT26腫瘤的小鼠以同型對照抗體、IL10-Fc、代用抗CSF1R、或抗CSF1R/IL10處理。在處理7天後，收集腫瘤並以流式細胞術分析。圈選分析腫瘤微環境的CD45+ 白血球，其中CD11b+（圖 1 7 A ）、TAMs（CD11b+F4/80+）（圖 1 7 B ）、顆粒型MDSCs（CD11b+Ly6G+）（圖 1 7 C ）的百分比。每組n = 6隻小鼠。結果以平均值± SD顯示。*p ＜ 0.05、**p ＜ 0.01、***p ＜ 0.001。
圖 1 8 A 與圖 1 8 B 描繪在CT26同基因型腫瘤模式中，分析血液T細胞的結果。將移植同基因型CT26腫瘤的小鼠以同型對照抗體、IL10-Fc、代用抗CSF1R、或抗CSF1R/IL10處理。在處理7天後，收集血液並以流式細胞術分析。圈選分析CD3+ 白血球中總CD8+ T細胞（圖 1 8 A ）或CD8+LAG3+PD1+（圖 1 8 B ）的百分比。每組n = 6隻小鼠。結果以平均值± SD顯示。*p ＜ 0.05、**p ＜ 0.01、***p ＜ 0.001。
圖 1 9 A 、圖 1 9 B 、圖 1 9 C 、圖 1 9 D 、圖 1 9 E 、圖 1 9 F 、圖 1 9 G 、及圖 1 9 H 描繪抗CSF1R/IL10融合蛋白可控制腫瘤生長。一旦腫瘤達到50至100 mm3 ，將移植EMT6腫瘤（圖 19A ）、CT26腫瘤（圖 19B ）、MC38腫瘤（圖 19C ）、Renca腫瘤（圖 19D ）、LL/2腫瘤（圖 19E ）、Pan02腫瘤（圖 19F ）、H22腫瘤（圖 19G ）、及Q1腫瘤（圖 19H ）的小鼠隨機分組，接著以PBS對照組或代用抗CSF1R/IL10（36 mg/kg）每週處理二次，共3週。以腫瘤細胞植入小鼠之日作為第0天，紀錄隨時間變化的腫瘤體積。每組n = 10隻小鼠。結果以平均值± SD顯示。*p ＜ 0.05、**p ＜ 0.01、***p ＜ 0.001。
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Claims (17)

  1. 一種抗CSF1R抗體，包含（i）第一輕鏈互補決定區（CDR-L1）、第二輕鏈互補決定區（CDR-L2）、及第三輕鏈互補決定區（CDR-L3），及/或（ii）第一重鏈互補決定區（CDR-H1）、第二重鏈互補決定區（CDR-H2）、及第三重鏈互補決定區（CDR-H3），其中： (a)    CDR-H1包含選自於SEQ ID NO: 3、4、28、或29的胺基酸序列； (b)   CDR-H2包含選自於SEQ ID NO: 6、7、31、或32的胺基酸序列； (c)    CDR-H3包含選自於SEQ ID NO: 8、9、33、或34的胺基酸序列； (d)   CDR-L1包含選自於SEQ ID NO: 13、14、37、或38的胺基酸序列； (e)    CDR-L2包含選自於KAS、VAS、或SEQ ID NO: 15或39的胺基酸序列； (f)     CDR-L3包含選自於SEQ ID NO: 16、17、40、或41的胺基酸序列。
  2. 如請求項1之抗體，其中： (a)   CDR-H1包含SEQ ID NO: 3或4的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 6或7的胺基酸序列，且CDR-H3包含SEQ ID NO: 8或9的胺基酸序列；或 (b)   CDR-H1包含SEQ ID NO: 28或29的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 31或32的胺基酸序列，且CDR-H3包含SEQ ID NO: 33或34的胺基酸序列。
  3. 如請求項1至2中任一項之抗體，其中： (a)    CDR-L1包含SEQ ID NO: 13或14的胺基酸序列，CDR-L2包含KAS或SEQ ID NO: 15的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 16或17的胺基酸序列；或 (b)    CDR-L1包含SEQ ID NO: 37或38的胺基酸序列，CDR-L2包含VAS或SEQ ID NO: 39的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 40或41的胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中： (a)     CDR-H1包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO: 13的胺基酸序列，CDR-L2包含KAS的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 16的胺基酸序列； (b)     CDR-H1包含SEQ ID NO: 28的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 31的胺基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO: 33的胺基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO: 37的胺基酸序列，CDR-L2包含VAS的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 40的胺基酸序列； (c)     CDR-H1包含SEQ ID NO: 4的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO: 14的胺基酸序列，CDR-L2包含SEQ ID NO: 15的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 17的胺基酸序列； (d)     CDR-H1包含SEQ ID NO: 29的胺基酸序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 32的胺基酸序列，CDR-H3包含SEQ ID NO: 34的胺基酸序列，CDR-L1包含SEQ ID NO: 38的胺基酸序列，CDR-L2包含VAS或SEQ ID NO: 39的胺基酸序列，且CDR-L3包含SEQ ID NO: 41的胺基酸序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體，其中該抗體包含：（i）第一輕鏈高變區（HVR-L1）、第二輕鏈高變區（HVR-L2）、及第三輕鏈高變區（HVR-L3），及/或（ii）第一重鏈高變區（HVR-H1）、第二重鏈高變區（HVR-H2）、及第三重鏈高變區（HVR-H3），其中： (a)   HVR-H1包含選自於SEQ ID NO: 5或30的胺基酸序列； (b)   HVR-H2包含選自於SEQ ID NO: 7或32的胺基酸序列； (c)    HVR-H3包含選自於SEQ ID NO: 10或33的胺基酸序列； (d)   HVR-L1包含選自於SEQ ID NO: 14或38的胺基酸序列； (e)    HVR-L2包含選自於SEQ ID NO: 15或39的胺基酸序列； (f)     HVR-L3包含選自於SEQ ID NO: 17或41的胺基酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體，其中該抗體包含一與選自於SEQ ID NO: 2、19、23、27、43、或47之序列具有至少90%同一性的重鏈可變結構域（VH ）胺基酸序列；及/或一與選自於SEQ ID NO: 12、21、25、36、45、或49之序列具有至少90%同一性的輕鏈可變結構域（VL ）胺基酸序列；選擇性地，其中： (a)    該抗體包含一與SEQ ID NO: 2具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 12具有至少90%同一性的輕鏈可變結構域（VL ）胺基酸序列； (b)    該抗體包含一與SEQ ID NO: 19具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 21具有至少90%同一性的VL 胺基酸序列； (c)     該抗體包含一與SEQ ID NO: 23具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 25具有至少90%同一性的VL 胺基酸序列； (d)    該抗體包含一與SEQ ID NO: 27具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 36具有至少90%同一性的VL 胺基酸序列； (e)     該抗體包含一與SEQ ID NO: 43具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 45具有至少90%同一性的VL 胺基酸序列；或 (f)      該抗體包含一與SEQ ID NO: 47具有至少90%同一性的VH 胺基酸序列；及/或一與SEQ ID NO: 49具有至少90%同一性的VL 胺基酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗體，其中該抗體包含一與選自於SEQ ID NO: 58、60、62、64、66、或68之序列具有至少90%同一性的重鏈（HC）胺基酸序列，及/或一與選自於SEQ ID NO: 59、61、63、65、67、或69之序列具有至少90%同一性的輕鏈（LC）胺基酸序列；選擇性地，其中該抗體包含： (a)   SEQ ID NO: 58的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 59的LC胺基酸序列； (b)   SEQ ID NO: 60的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 61的LC胺基酸序列； (c)    SEQ ID NO: 62的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 63的LC胺基酸序列； (d)   SEQ ID NO: 64的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 65的LC胺基酸序列； (e)    SEQ ID NO: 66的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 67的LC胺基酸序列；或 (f)     SEQ ID NO: 68的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 69的LC胺基酸序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體，其中該抗體包含一經由連接子融合至IL10多胜肽的HC；視情況其中： (a)   連接子包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列； (b)   IL10多胜肽包含一、二、或四個IL10多胜肽；及/或 (c)   IL10多胜肽包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列； (d)   HC包含一與選自於SEQ ID NO: 50、51、52、53、54、55、56、或57之序列具有至少90%同一性的胺基酸序列。
  9. 如請求項8之抗體，其中該抗體包含一與選自於SEQ ID NO: 50、51、52、53、54、55、56、或57之序列具有至少90%同一性的重鏈（HC）胺基酸序列，以及一與選自於SEQ ID NO: 59、61、63、65、67、或69之序列具有至少90%同一性的輕鏈（LC）胺基酸序列；選擇性地，其中該抗體包含： (a)   SEQ ID NO: 50的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 59的LC胺基酸序列； (b)   SEQ ID NO: 51的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 59的LC胺基酸序列； (c)    SEQ ID NO: 52的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 61的LC胺基酸序列； (d)   SEQ ID NO: 53的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 63的LC胺基酸序列； (e)    SEQ ID NO: 54的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 65的LC胺基酸序列； (f)     SEQ ID NO: 55的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 65的LC胺基酸序列； (g)   SEQ ID NO: 56的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 67的LC胺基酸序列；或 (h)   SEQ ID NO: 57的HC胺基酸序列，以及SEQ ID NO: 69的LC胺基酸序列。
  10. 如請求項1至9中任一項之抗體，其中： (a)    該抗體以1 x 10-8 M或以下、1 x 10-9 M或以下、1 x 10-10 M或以下之結合親和力結合至人類CSF1R；視情況其中該結合親和力係藉由與SEQ ID NO: 70之huCSF1R多胜肽的平衡解離常數（KD ）來測得； (b)    該抗體以1 x 10-8 M或以下、1 x 10-9 M或以下、1 x 10-10 M或以下之結合親和力結合至食蟹猴CSF1R；視情況其中該結合親和力係藉由與SEQ ID NO: 71之cynoCSF1R多胜肽的平衡解離常數（KD ）來測得； (c)    該抗體減少CSF1誘發與IL34誘發的huCSF1R或AKT磷酸化作用； (d)    該抗體抑制CSF1依賴性與IL34誘發之細胞增生達至少65%、至少75%、至少85%、至少95%、或至少100%；視情況其中在CSF1濃度為20 ng/mL或IL34濃度為33 ng/mL時，抗體的IC50 為5 nM或以下、1 nM或以下、0.5 nM或以下、或0.1 nM或以下； (e)    該抗體抑制人類CD14+單核細胞或單核細胞衍生之巨噬細胞之CSF1依賴性存活率達至少65%、至少75%、至少85%、至少95%、或至少100%；視情況其中在CSF1濃度為100 ng/mL時，抗體的IC5 0 為5 nM或以下、1 nM或以下、0.5 nM或以下、或0.1 nM或以下； (f)     該抗體增加NK細胞針對表現CSF1R之293F細胞所介導的ADCC活性達至少10%、至少20%、或至少25%； (g)    該抗體在21天測量的同基因型小鼠腫瘤模式中減少腫瘤體積達至少25%、至少50%、至少75%、或以上，其中該小鼠腫瘤模式選自於：CT26 結腸癌、EMT6 三陰性乳癌、MC38 結腸癌、Renca 腎癌、LL/2肺癌、Pan02 胰腺癌、H22肝癌、Q1 頭頸癌； (h)    該抗體在CT26結腸腫瘤同基因型小鼠模式中增加CSF1與IL34的血液中濃度達至少50倍、至少100倍、200倍、或至少500倍； (i)      該抗體在CT26結腸腫瘤同基因型小鼠模式中減少TAM群達至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、或以上；視情況其中MDSC群減至小於10%、小於5%、或以下； (j)      該抗體增加MC/9細胞增生達至少25%、至少50%、至少100%、至少150%、至少200%或以上； (k)    該抗體在活化的CD8 T細胞中增加IFNγ與顆粒溶解酶B產生達至少25%、至少50%、至少100%、或以上；及/或 (l)      該抗體在CT26結腸腫瘤同基因型小鼠模式中增加CD8+LAG3+PD1+ T細胞血液中濃度達至少2倍、至少4倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、或以上。
  11. 一種經分離之多核苷酸或載體，其編碼如請求項1至10中任一項之抗體；或經分離之宿主細胞，包含該寡核苷酸或載體；視情況其中該宿主細胞選自於中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、骨髓瘤細胞（如，Y0、NS0、Sp2/0）、猴腎細胞（COS-7）、人類胚胎腎細胞株（293）、小倉鼠腎細胞（BHK）、小鼠賽特利細胞（如，TM4）、非洲綠猴腎細胞（VERO-76）、人類子宮頸癌細胞（HELA）、犬腎細胞、人類肺細胞（W138）、人類肝細胞（Hep G2）、小鼠乳腺腫瘤細胞、TR1細胞、醫學研究委員會5（MRC 5）細胞、及FS4細胞。
  12. 一種製造抗體的方法，包含培養如請求項11之宿主細胞從而產生抗體。
  13. 一種醫藥組合物，包含如請求項1至10中任一項之抗體及醫藥上可接受載體；視情況其中該組合物更包含IL10、化療藥劑、及/或含有具有免疫檢查點分子特異性之抗體。
  14. 一種治療受試者之CSF1R介導之疾病的方法，該方法包含投予受試者一治療上有效量之如請求項1至10中任一項之抗體，或投予受試者一治療上有效量之如請求項13之醫藥組合物；視情況其中該疾病為癌症；視情況其中該癌症為結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、肝癌、腎臟癌、乳癌、肺癌、胃癌、頭頸癌、或口腔癌。
  15. 一種治療受試者之癌症的方法，包含向該受試者投予CSF1R拮抗劑與IL-10促效劑；視情況其中該CSF1R拮抗劑包含抗CSF1R抗體、shRNA、siRNA、miRNA、CSF1R之小分子抑制劑、或其組合；視情況其中IL-10促效劑為IL-10、IL-10受體結合蛋白、或其組合；視情況其中CSF1R拮抗劑為如請求項1至10中任一項之抗CSF1R抗體；視情況其中CSF1R拮抗劑與IL10促效劑包含一具有經由連接子融合至IL10多胜肽之HC的抗CSF1R抗體。
  16. 如請求項15之方法，其中該癌症為結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、HCC、腎臟癌、乳癌、肺癌、胃癌、頭頸癌、或口腔癌。
  17. 如請求項15至16中任一項之方法，其中該方法更包含投予該受試者T細胞療法。
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