CN105209495B

CN105209495B - 抗cd52抗体

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Publication number: CN105209495B
Application number: CN201480028098.XA
Authority: CN
Inventors: H·邱; R·R·魏; C·Q·潘; R·森达克
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2020-06-26
Anticipated expiration: 2034-03-13
Also published as: WO2014151644A2; MA38485A1; EP2970467B1; JP6482524B2; TN2015000415A1; CY1121795T1; TWI644923B; AU2014233685B2; WO2014151644A3; TW201522373A; EP2970467A2; CR20150547A; GT201500267A; MX2015012991A; AU2014233685A1; PL2970467T3; ES2710976T3; JP2016518333A; PT2970467T; PE20151757A1

Abstract

本发明提供抗人CD52抗体及其抗原结合片段。还提供用于制备所述抗体和片段的分离核酸、重组载体和宿主细胞。所述抗体和片段可用于治疗应用，以治疗例如自身免疫疾病、癌症和移植排斥。

Description

抗CD52抗体

序列表

本申请包含作为ASCII形式的文本文件以电子方式已经提交的序列表，且其在此处以其全文通过提述并入。2014年3月11日生成的所述文件名称为001662-0041-WO1_SL.txt且大小为142,582字节。

发明领域

本发明一般地涉及抗体，且更具体地涉及对于人CD52具有结合特异性的抗体。

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请61/794,576的优先权。该临时申请的公开内容在本文以其全文通过提述并入。

发明背景

CD52是在多种正常和恶性类淋巴细胞(例如，T细胞和B细胞)上大量发现的(500,000分子/细胞)糖基化的、糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的细胞表面蛋白。参见，例如，Hale等,J Biol Regul Homeost Agents 15:386-391(2001)；Huh等,Blood 92:Abstract 4199(1998)；Elsner等,Blood 88:4684-4693(1996)；Gilleece等,Blood 82:807-812(1993)；Rodig等,Clin Cancer Res 12:7174-7179(2006)；Ginaldi等,Leuk Res 22:185-191(1998)。CD52在例如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞等髓样细胞上以较低水平表达，其中在成熟自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和造血干细胞上发现几乎不表达(同上)。总之，CD52存在于至少95％的所有人外周血淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞中(Hale G,等,“TheCAMPATH-1antigen(CD52),”Tissue Antigens,35:178-327(1990))。CD52还由副睾和输精管中的上皮细胞产生，且在通过生殖道期间由精子获得(Hale等,2001,见上文；Domagala等,Med Sci Monit 7：325-331(2001))。CD52的确切生物功能仍不清楚，但若干证据暗示其可能涉及T细胞迁移及共刺激(Rowan等,Int Immunol 7:69-77(1995)；Masuyama等,J ExpMed 189:979-989(1999)；Watanabe等,Clin Immunol 120:247-259(2006))。

已开发数种抗CD52单克隆抗体。

(还称为阿仑单抗(alemtuzumab)、

)是人源化抗人CD52单克隆抗体，其展现强效的体外细胞毒性效应(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC))。阿仑单抗识别由成熟CD52蛋白羧基端四个氨基酸和带负电荷的GPI锚定部分构成的表位。其他抗人CD52单克隆抗体也已产生。然而，在保存中和特定pH和温度条件下，若干这些抗体的结合亲和力降低。因此，对于具有降低的经历该变化的倾向的抗CD52抗体存在需求。

发明概述

本发明的特征为经过工程化从而随着时间经过并且在高pH和温度条件下仍保持结合亲和力的抗人CD52抗体。本文中的“抗体”和“免疫球蛋白”可互换使用。还提供包含编码抗CD52抗体轻链或重链的序列的分离核酸、重组载体和宿主细胞，和制备抗CD52抗体的方法。

Ab26是具有SEQ ID NO:3减去信号序列的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:4减去信号序列的轻链氨基酸序列的人源化抗人CD52单克隆抗体。Ab26在保存期间CD52的结合亲和力和效力会随时间降低。我们意外发现在轻链CDR1位置11具有某些单一氨基酸取代的Ab26变体(例如，单克隆抗体Ab21、Ab16和Ab20)，相比Ab26，其不仅保留或超越Ab26的人CD52结合亲和力，还展示显著改善的稳定性。所述变体抗体如Ab21、Ab16和Ab20相比Ab26已展示体外及体内可比较或改善的生物学效力。这些变体可用于治疗及诊断应用。

在一些实施方案中，本发明的抗人CD52抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含：SEQ ID NO:7的重链CDR1、SEQ ID NO:8的重链CDR2；和SEQ ID NO:9的重链CDR3，且其中所述轻链可变区包含：SEQ ID NO:86的轻链CDR1；SEQID NO:34的轻链CDR2；和SEQ ID NO:35的轻链CDR3。在进一步的实施方案中，SEQ ID NO:86的残基11可为K、R、Q、H、S、Y、A、D、E、F、I、L、M、N、T或V。在一个实施方案中，SEQ ID NO:86的残基11是K。在另一实施方案中，SEQ ID NO:86的残基11是R。在另一实施方案中，SEQ IDNO:86的残基11是Q。

在一些实施方案中，抗CD52抗体或片段的重链可变区包含SEQ ID NO:59。在另外的实施方案中，抗CD52抗体或片段的轻链可变区包含选自SEQ ID NO:68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82和83的序列。举例来说，本发明抗体或片段的重链和轻链分别可包含：a)SEQ ID NO:59和68；b)SEQ ID NO:59和69；c)SEQ ID NO:59和70；d)SEQ IDNO:59和71；e)SEQ ID NO:59和72；f)SEQ ID NO:59和73；g)SEQ ID NO:59和74；h)SEQ IDNO:59和75；i)SEQ ID NO:59和76；j)SEQ ID NO:59和77；k)SEQ ID NO:59和78；l)SEQ IDNO:59和79；m)SEQ ID NO:59和80；n)SEQ ID NO:59和81；o)SEQ ID NO:59和82；或p)SEQ IDNO:59和83。

在一些实施方案中，抗体或片段包含无信号序列的SEQ ID NO:3重链氨基酸序列。在另外的实施方案中，抗体或片段包含选自SEQ ID NO:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57和58的轻链氨基酸序列。举例来说，抗体或片段可包含(a)无信号序列的SEQ ID NO:3的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:49的轻链氨基酸序列；(b)无信号序列的SEQID NO:3的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:53的轻链氨基酸序列；或(c)无信号序列的SEQ IDNO:3的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:54的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明抗体为免疫球蛋白G(IgG)。在另外的实施方案中，抗体包含人Fc区(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。本发明还涵盖本发明任何抗体的抗原结合片段，其中所述片段选自scFv片段、Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、微型抗体、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)和四抗体(tetrabody)。

在一些实施方案中，本发明抗体是单克隆抗体。在进一步的实施方案中，抗体和抗原结合片段是人源化的。本发明抗体或片段的重链C端的赖氨酸可任选地裂解。

本发明还涉及包含编码抗体的重链或其抗原结合片段或轻链或其抗原结合片段或两者的核苷酸序列的分离核酸分子。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含SEQ IDNO:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134的核苷酸序列。本发明还涵盖包含该核酸分子的重组载体(例如，表达载体)。在一些实施方案中，本发明涵盖包含该载体的分离的宿主细胞。

本发明还涵盖产生本文描述的抗CD52抗体或片段或该抗体或片段的重链或轻链的分离细胞系。在一些实施方案中，本发明涉及制备抗人CD52抗体或其抗原结合片段的方法，其包括(1)在适于该抗体或片段表达的条件下保持本文所述的宿主细胞或细胞系；和(2)回收所述抗体或片段。

本发明涵盖包含本文所述的抗体或抗原结合片段和药物上可接受的媒剂(vehicle)或载剂(carrier)的组合物。

本发明涉及用于治疗对其有需要的患者的方法，其包括对所述患者施用有效量的本文所述的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明涵盖用于治疗对其有需要的患者中的自身免疫疾病(例如，多发性硬化症)的方法，其包括对该患者施用本文所述的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明涵盖用于治疗对其有需要患者中的癌症(例如，慢性淋巴性白血病)的方法，其包括对该患者施用本文所述的抗体或抗原结合片段。本发明还涉及抑制对其有需要患者中的血管生成的方法，其包括对该患者施用本文所述的抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，本发明涉及使用本文所述的抗体或抗原结合片段治疗对其有需要患者中的自身免疫疾病(例如，多发性硬化症)，或制备其治疗药物的用途。本发明还涉及使用本文所述的抗体或抗原结合片段治疗对其有需要患者中的癌症(例如，慢性淋巴性白血病)，或制备其治疗药物的用途。本发明进一步涉及使用本文所述的抗体或抗原结合片段治疗对有需要患者中的过度血管生成，或制备用于抑制血管生成的药物的用途。

附图简述

本专利或申请文件含有至少一个彩色绘图。在请求和支付必要费用时，有关部门将提供具彩色绘图的本专利或专利申请公开的副本。

图1描绘抗CD52抗体的快速亲和力筛选结果。上图为制备抗体的流程图。中图和下方表格显示BIACORE^TM结合分析和Octet表达水平测定的结果。

图2描述表征纯化的抗CD52抗体的实验结果。上图是显示抗CD52抗体重链和轻链分离的SDS-PAGE凝胶的照片。分子量标记示于标记的泳道(M)。下方的图和表显示BIACORE^TM结合分析的结果。

图3描述显示于CHO细胞中产生的Ab24和Ab10抗体制剂的SDS-PAGE凝胶照片。所述凝胶还显示对照的抗CD52(CTL)抗体和Ab1抗体。箭头指出100kD物种及LC剪切。

图4描述SDS-PAGE凝胶照片，其显示Ab24和Ab10抗体中存在的100kD类型(species)，其中在右侧显示了“仅重链”的二聚体。还显示N端测序结果。

图5描述表征另外的抗CD52抗体的实验结果。表和图显示BIACORE^TM结合分析及Octet表达水平测定的结果。“KGN”指具有SEQ ID NO:3重链序列和SEQ ID NO:2轻链序列的抗CD52抗体。

图6描述表征纯化抗CD52抗体的CD52结合的实验结果。左图为显示野生型(CTL)和其他抗体的重链和轻链的SDS-PAGE凝胶照片。分子量标记示于标示的泳道(M)。右侧曲线图显示BIACORE^TM结合分析的结果。

图7为描述对照抗CD52抗体和抗体Ab21、Ab16和Ab20的CDC分析结果图。

图8描述在人CD52转基因小鼠中，对照抗CD52(CTL)抗体和抗体Ab21、Ab16和Ab20的CD52+细胞消耗活性分析结果。左图显示血液样品的结果。右侧曲线图显示脾脏样品的结果。

图9显示野生型人CD52蛋白的氨基酸序列(基因库(Genbank)登录编号AAH00644.1)(SEQ ID NO:1))。

图10显示抗体Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25和KGN(SEQ ID NO:3)的全长重链氨基酸序列，和抗体Ab26(SEQ ID NO:4)的全长轻链氨基酸序列。粗斜体为信号序列，下划线为CDR。

图11显示抗体Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25和KGN(SEQ ID NO:5)的全长重链核酸序列，以及抗体Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25和KGN的全长轻链核酸序列。下划线为信号序列，粗体为开放阅读框。

图12显示抗体Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24和Ab25的H-CDR1(SEQ IDNO:7)、H-CDR2(SEQ ID NO:8)、H-CDR3(SEQ ID NO:9)、L-CDR2(SEQ ID NO:34)和L-CDR3(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列。

图13显示抗体Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25和Ab26的L-CDR1的氨基酸序列。

图14显示抗体Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24和Ab25的全长轻链氨基酸序列。下划线为CDR。

图15显示抗体Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24和Ab25的重链和轻链可变结构域的氨基酸序列。下划线为CDR。

图16显示抗体Ab26、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7、Ab10、Ab11、Ab12、Ab13、Ab14、Ab15、Ab16、Ab17、Ab18、Ab19、Ab20、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25和KGN的重链可变结构域和轻链可变结构域的核酸序列。

图17描述表征从HEK293细胞纯化的Ab1抗体的实验结果。图和表显示BIACORE^TM分析测定Ab1和两种Ab26制剂(CTL1和CTL2)对CD52肽的亲和力结果。上右图是显示两种Ab26制剂(CTL1和CTL2)和Ab1抗体的重链(HC)和轻链(LC)的还原性SDS-PAGE凝胶照片。

图18描述表征从CHO细胞纯化的Ab1抗体的实验结果。图显示BIACORE^TM分析测定Ab1抗体(下图)和Ab26抗体(CTL)(上图)对CD52肽的亲和力结果。

图19为描述Ab1抗体和Ab26抗体(对照)的CDC分析结果的图。结果以相对荧光单位(RFU)作为抗体最终浓度(单位为毫克/毫升)函数表示。

图20描述抗CD52抗体的稳定性筛选结果。上左图显示在45℃和pH 7.2就Ab26(CTL)和变体抗体而言，K_D(nM)作为时间(周)的函数。上右图显示45℃和pH 7.2就Ab26(CTL)及变体抗体而言，相对于T0的亲和力作为时间(周)的函数。

图21描述测试在三组分缓冲液中的温育对抗CD52抗体稳定性的影响的实验结果。上左图显示两种Ab26制剂(CTL1和CTL2)和变体抗体在37℃和pH 7.5于第0周、第2周和第4周的K_D(nM)。上右图显示Ab26(CTL)和变体抗体在45℃和pH 7.4于第0周、第2周和第4周的K_D(nM)。

图22描述Ab26(CTL)、Ab21、Ab16和Ab20在45℃温育后尺寸排阻层析(SEC)-HPLC分析的结果。

发明详述

本发明基于我们发现特定抗CD52抗体在特定pH和温度条件下或在保存期间随时间丧失稳定性并展示降低的结合亲和力。我们已生成在亲源抗体的轻链CDR1(L-CDR1)单一位置(位置11)包含氨基酸取代的变体抗体。我们已发现一些这样的变体抗体相比亲源抗体不仅展示相似或改善的抗原结合特性和生物活性(包括体内效价)，还展示增强的稳定性。

本发明包含抗人CD52抗体、所述抗体的抗原结合片段(即部分)、所述抗体的轻链、所述抗体的重链和这些轻链或重链的片段。本发明涉及成熟抗体及其链(例如，糖基化抗体)，以及未成熟或前体抗体蛋白。本发明还涉及编码这些未成熟或成熟蛋白两者的核酸分子(例如，载体)，包含此类核酸的宿主细胞，生产未成熟和成熟蛋白的方法，及使用该抗体的方法。

本发明的抗体和抗原结合部分可用于治疗对其有需要的受试者(例如，人患者)的各种由具有CD52的细胞介导或引起的疾病和症状，例如一些免疫介导的疾病(IMD)征兆。作用机制可能为抗CD52抗体通过引起细胞死亡而消耗这些细胞(例如，淋巴细胞或癌性CD52+细胞)。举例来说，所述抗体可经由淋巴细胞消耗(一种经由减小循环性淋巴细胞群(例如，T细胞和/或B细胞)导致淋巴细胞减少获得的免疫抑制类型)以治疗自身免疫疾病(例如，多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、血管炎、肌炎和韦格纳氏疾病(Wegener’s disease))。本发明抗体还可用于治疗癌症，例如，白血病(例如，慢性淋巴性白血病)和淋巴瘤(例如，非霍奇金氏淋巴瘤)；或用于组织移植(例如，实质器官移植(例如，肾移植)和干细胞移植)。本发明抗体还可用于富集造血干细胞，例如，在离体应用中(参见，例如，Lim等,J.Hematology&Oncology1:19(2008))。

本发明抗体的抗原结合性质

本发明抗体对于人CD52或其部分具有结合特异性(例如，表位特异性)，或选择性结合于人CD52或其部分。这些抗体特异性地与CD52分子结合，且不会特异地与非CD52分子结合。举例来说，抗CD52抗体和CD52间的特异性结合，可利用流式细胞测量法通过测量该抗体与CD52⁺细胞结合的EC₅₀确定。特异性结合可以通过小于10微克/毫升的EC₅₀表明(例如，利用流式细胞测量法测定)。本文所述的抗体可对人CD52或其片段具有结合特异性。结合分析可使用分离或重组人CD52、衍生自人CD52的肽或表达人CD52的细胞(例如，人T和/或B细胞、表达编码人CD52或这些细胞的细胞膜组分的核酸的重组宿主细胞)进行。此外，所述抗体可对一种或多种人CD52形式(例如，糖基化人CD52、去糖基化人CD52、非糖基化人CD52和等位基因变体)具有结合特异性。在一个实施方案中，所述抗体对天然存在、内源性或野生型人CD52具有结合特异性。野生型人CD52的氨基酸序列示于图9(SEQ ID NO:1)中。

“抗原结合亲和力”为本领域的术语，其描述结合相互作用的强度，一般指抗体对其抗原的整体结合强度。在一些实施方案中，本发明抗体与人CD52结合的亲和力，以例如(1)1x10^-7M或更小的K_D(K_D＝K_off(kd)/K_on(ka))表示；优选为1x10^-8M或更小；更优选为1x10^- ⁹M或更小；有利地为1x10^-10M或更小；且最优选为1x10^-11M或1x10^-12。例如，该K_D的范围为100nM至1pM(即1x10^-7至1x10^-12M)、50nM至1pM、5nM至1pM或1nM至1pM。预期的抗原结合亲和力还可如利用表面等离子共振测定，通过5x10^-1s^-1或更小的K_off速率常数表明；优选为1x10^-2s^-1或更小；有利地为1x10^-3s^-1或更小；更优选为1x10⁴s^-1或更小；又更优选为1x10^-5s^-1或更小；且最优选为1x10^-6s^-1或更小。举例来说，该K_off速率常数的范围可为5x10^-1s^-1至1x10^-7s^-1、1x10^-2s^-1至1x10^-6s^-1或5x10^-3s^-1至1x10^-5s^-1。在特定分析或设定中，期望的抗原结合强度还可以不超过10微克/毫升的EC₅₀(例如，0.1-10微克/毫升的EC₅₀)表示。

本发明抗体包括与CD52上的表位结合的抗体，所述表位与抗体Ab26或本文例示的任何其变体结合的CD52表位相同或重叠。表位结合可使用例如竞争性结合分析的各种技术很容易地确定。本文所用的“表位”包括能特异性与抗体结合的任何蛋白质决定区(epitopedeterminant)。表位决定区通常由具化学活性的表面分子群(例如，氨基酸和/或碳水化合物或糖侧链)组成，且通常具有特定的立体结构特征，以及特定的电荷特征。表位可为“线性”或“构象性”的。在线性表位中，蛋白质和相互作用分子(例如，抗体)间的所有相互作用位点沿着该蛋白的一级氨基酸序列呈线性存在。在构象表位中，相互作用的位点存在于蛋白上的、在一级多肽序列中彼此分开的氨基酸残基之间。

在一个实施方案中，为确定测试抗体是否结合于本发明特定抗CD52抗体的相同或重叠的表位，可在饱和条件下使本发明的抗CD52抗体与CD52结合，随后测定测试抗体与CD52的结合能力。如果测试抗体能与参照抗CD52抗体同时与CD52结合，则可推论该测试抗体与参照抗CD52抗体结合于不同的表位。然而，如果该测试抗体不能同时与CD52结合，则可推论该测试抗体结合的表位与参照抗CD52抗体所结合的表位相同或部分重叠，或该测试抗体结合的表位与参照抗体所结合的表位紧邻。此实验可使用ELISA、RIA、BIACORE^TM或流式细胞测量法进行。为测试抗CD52抗体是否和另一抗CD52抗体交叉竞争，可从两个方向使用上述竞争方法，即确定参照抗体是否阻断该测试抗体，反之亦然。

表位分级(binning)也可用于表征本发明的抗体。术语“分级”指根据其抗原结合特征对抗体分组的方法。根据其交叉竞争用于“分级”抗体的高通量方法描述于国际专利申请公开No.WO 03/48731。“表位分级”可通过使未标记的抗CD52抗体形式“A”和对应于CD52序列的合成肽或CD52阳性细胞结合进行研究。接下来添加已标记的第二抗CD52抗体“B”，随后评估相对于对照样品(其中细胞或合成肽未预先暴露于抗CD52抗体“A”)的可结合的标记抗体量。可替换地，抗CD52抗体“A”和“B”可使用不同荧光团或可检测的化学物质标记，随后使用能检测所述标记的装置测量可同时吸引(engage)CD52抗原的两种标记抗体量，或利用流式细胞测量术测量同时吸引CD52+细胞的两种抗体的量。BIACORE^TM和Octet技术使研究未标记的抗体形式的竞争性结合成为可能。由于一些抗体的化学修饰可能损害结合活性，因此未标识抗体形式的这种使用符合所需。还参见描述于Jia等,J.Immunol.Methods 288:91-98(2004)中用于进行表位分级的技术。

在一些实施方案中，本发明抗体以类似或优于抗体Ab26的亲和力结合人CD52。在特定的实施方案中，本发明抗体具有和抗体Ab26相同或类似的表位特异性和生物功能(例如，消耗淋巴细胞功能)。在一个实施方案中，本发明抗体结合与包含人CD52的QTSS氨基酸残基的表位结合。

本发明抗体和抗原结合片段的结构

天然存在的抗体具有共同的核心结构，其中两个相同的轻链(约24kD)和两个相同的重链(约55或70kD)形成四聚体。各链的氨基末端部分称为可变(V)区，且可与各链剩余部分的更保守的恒定(C)区区分。轻链的可变区(还称V_L结构域)中为称为J区的C端部分。重链的可变区(还称V_H结构域)中，除J区外还有D区。抗体中大部分的氨基酸序列变化局限于直接参与抗原结合的称为高变区或互补决定区(CDR)的V区中三个分开位置。从氨基末端开始，这些区域分别称为CDR1、CDR2和CDR3。所述CDR由更保守的框架区(FR)固定于适当位置。从氨基末端开始，这些区域分别称为FR1、FR2、FR3和FR4。CDR区和FR区的位置和编号系统已由Kabat等人定义；参见，Kabat,E.A.,等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,U.S.GovernmentPrinting Office(1991)；Chothia&Lesk,Canonical Structures for the HypervariableRegions of Immunoglobulins,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；和the

numbering system(The International ImMunoGeneTics Iinformation

Lefranc,M.-P.,The Immunologist 7,132-136(1999))。可进行目视检查和序列分析以确定CDR边界。就本发明而言，使用Kabat系统和IMGT系统两者界定CDR序列；即，当由所述两种系统界定的CDR序列不能完全重叠时，将来自两个系统界定的序列的所有残基都包括在内。

本发明的特征在于亲源抗体Ab26的变体。Ab26的重链和轻链氨基酸和核酸的序列分别示于图10和11。Ab26包含无信号序列的SEQ ID NO:3重链氨基酸序列和无信号序列的SEQ ID NO:4的轻链氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，本发明抗体的CDR在成熟Ab26蛋白质轻链CDR1氨基序列的残基34处和Ab26不同。一些这样的变化大幅改善该变体抗体的稳定性，而不影响其抗原结合的特性。如果残基34的突变降低变体抗体的两种抗原结合亲和力，则可在抗体序列(例如，L-CDR1、L-CDR2、L-CDR2、H-CDR1、H-CDR2或H-CDR3)中进行一个或多个额外的突变以恢复亲和力。在一些实施方案中，残基34从G变成K、R、Q、H、S、Y、A、D、E、F、I、L、M、N、T或V。在本发明的一些实施方案中，抗CD52抗体的L-CDR1序列选自SEQ ID NO:24、29、28、22、30、33、18、19、20、21、23、25、26、27、31和32。

本文具体阐述的抗体CDR序列通过其SEQ ID NO列于下列表1中。

表1抗CD52抗体的SEQ ID NO

抗体	H-CDR1	H-CDR2	H-CDR3	L-CDR1	L-CDR2	L-CDR3
							Ab1	7	8	9	11	34	35
Ab2	7	8	9	12	34	35
							Ab3	7	8	9	13	34	35
Ab4	7	8	9	14	34	35
							Ab5	7	8	9	15	34	35
Ab6	7	8	9	16	34	35
							Ab7	7	8	9	17	34	35
Ab10	7	8	9	18	34	35
							Ab11	7	8	9	19	34	35
Ab12	7	8	9	20	34	35
							Ab13	7	8	9	21	34	35
Ab14	7	8	9	22	34	35
							Ab15	7	8	9	23	34	35
Ab16	7	8	9	24	34	35
							Ab17	7	8	9	25	34	35
Ab18	7	8	9	26	34	35
							Ab19	7	8	9	27	34	35
Ab20	7	8	9	28	34	35
							Ab21	7	8	9	29	34	35
Ab22	7	8	9	30	34	35
							Ab23	7	8	9	31	34	35
Ab24	7	8	9	32	34	35
							Ab25	7	8	9	33	34	35

在一些实施方案中，本发明的抗体是人源化抗体。本文所用术语“抗CD52人源化抗体”指包含非人来源的抗CD52抗体(也称为供体抗体(例如鼠类抗CD52抗体))的一个或多个轻链CDR(CDR1、CDR2和CDR3)和/或一个或多个重链CDR(CDR1、CDR2和CDR3)；和人来源的抗体的至少一部分(例如，衍生自人来源的轻链和/或重链的框架区或框架和恒定区)的抗体。举例来说，人源化抗体是有或无框架改变的CDR移植抗体。在一些实施方案中，人源化抗体为去免疫化抗体。参见，例如，Carr U.S.Pat.7,264,806，其涉及已经修饰以减少潜在T细胞表位数量从而降低该抗体施用至人后引发免疫反应倾向的去免疫抗体。

可进行框架区的改变，例如将人来源的框架区残基用来自供体抗体对应位置的残基取代的那些改变；参见Queen U.S.Pat.5,530,101。还可进行框架区中的一个或多个突变，包括一个或多个氨基酸的缺失、插入和取代。若需要，人源化抗体中可包括框架突变，且可使用任何适当方法选择突变位点，举例来说如WO 98/06248和U.S.Pat.6,407,213中所述，其全部内容在本文通过提述并入。在一些情况中，亲源框架中在一个或多个CDR旁侧的一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个旁侧氨基酸)还可包含于人源化抗体中以增强抗原结合亲和力。任选地可在框架区中的一个或多个残基处进行回复突变以改善人源化抗体的CD52结合亲和力。

本发明抗体可因一个或多个残基的添加、缺失或取代(例如保守性取代)而和抗体Ab26不同，例如，与亲源序列的差异高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个残基。

举例来说，本发明包括抗体，其具有：包含SEQ ID NO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ ID NO:68的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链；包含SEQ ID NO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ ID NO:69的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链；包含SEQ ID NO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ ID NO:70的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链；包含SEQ IDNO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ ID NO:71的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链；包含SEQ ID NO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ ID NO:72的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链；包含SEQ ID NO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ ID NO:73的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链；包含SEQ ID NO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ ID NO:74的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链；包含SEQ ID NO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ ID NO:75的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链；包含SEQ ID NO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ IDNO:76的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链；包含SEQ ID NO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ ID NO:77的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链；包含SEQ ID NO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ ID NO:78的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链；包含SEQ ID NO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ ID NO:79的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链；包含SEQ ID NO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ ID NO:80的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链；包含SEQ ID NO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ ID NO:81的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链；包含SEQ IDNO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ ID NO:82的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链；包含SEQ ID NO:59的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的重链和包含SEQ ID NO:83的一个或多个CDR(例如全部三个CDR)的轻链的抗体。

在一个实施方案中，本发明的抗体具有对人CD52的结合特异性，且包含重链(H)-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、轻链(L)-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其氨基酸序列分别为：a)SEQ IDNO:7、8、9、18、34和35；b)SEQ ID NO:7、8、9、19、34和35；c)SEQ ID NO:7、8、9、20、34和35；d)SEQ ID NO:7、8、9、21、34和35；e)SEQ ID NO:7、8、9、22、34和35；f)SEQ ID NO:7、8、9、23、34和35；g)SEQ ID NO:7、8、9、24、34和35；h)SEQ ID NO:7、8、9、25、34和35；i)SEQ ID NO:7、8、9、26、34和35；j)SEQ ID NO:7、8、9、27、34和35；k)SEQ ID NO:7、8、9、28、34和35；l)SEQ IDNO:7、8、9、29、34和35；m)SEQ ID NO:7、8、9、30、34和35；n)SEQ ID NO:7、8、9、31、34和35；o)SEQ ID NO:7、8、9、32、34和35；或p)SEQ ID NO:7、8、9、33、34和35。

在一些实施方案中，本发明抗体包含SEQ ID NO:86(KSSQSLLYSNXKTYLN)的L-CDR1，其中X是天然存在的氨基酸(选自D、E、K、R、H、Y、C、N、Q、S、T、A、V、L、I、M、P、F或W)或非标准(例如非天然)氨基酸。

本发明还涉及本文描述的抗体的抗体轻链。在一个实施方案中，所述抗体轻链包含选自SEQ ID NO:18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32和33的L-CDR1。举例来说，该抗体具有L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其氨基酸序列分别为：a)SEQ ID NO:18、34和35；b)SEQ ID NO:19、34和35；c)SEQ ID NO:20、34和35；d)SEQ ID NO:21、34和35；e)SEQ IDNO:22、34和35；f)SEQ ID NO:23、34和35；g)SEQ ID NO:24、34和35；h)SEQ ID NO:25、34和35；i)SEQ ID NO:26、34和35；j)SEQ ID NO:27、34和35；k)SEQ ID NO:28、34和35；l)SEQ IDNO:29、34和35；m)SEQ ID NO:30、34和35；n)SEQ ID NO:31、34和35；o)SEQ ID NO:32、34和35；或p)SEQ ID NO:33、34和35。

表2列举了本文具体阐述的抗体的全长重链和轻链及可变结构域氨基酸序列，以及编码所述重链和轻链及可变结构域的核苷酸序列的序列识别符(SEQ ID NO)。

表2抗CD52抗体的SEQ ID NO

在一个实施方案中，本发明抗体包含的轻链包含SEQ ID NO:68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的可变结构域(V_L)序列。在另一实施方案中，该抗体包含其氨基酸序列含有SEQ ID NO:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58或由SEQ ID NO:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58组成的轻链。

在一些实施方案中，本发明抗体包含V_H和V_L，其氨基酸序列分别包含或其组成为：a)SEQ ID NO:59和68；b)SEQ ID NO:59和69；c)SEQ ID NO:59和70；d)SEQ ID NO:59和71；e)SEQ ID NO:59和72；f)SEQ ID NO:59和73；g)SEQ ID NO:59和74；h)SEQ ID NO:59和75；i)SEQ ID NO:59和76；j)SEQ ID NO:59和77；k)SEQ ID NO:59和78；l)SEQ ID NO:59和79；m)SEQ ID NO:59和80；n)SEQ ID NO:59和81；o)SEQ ID NO:59和82；或p)SEQ ID NO:59和83。

在一个实施方案中，本发明抗体包含重链(HC)和轻链(LC)，其氨基酸序列分别包含或其组成为：a)SEQ ID NO:3和43；b)SEQ ID NO:3和44；c)SEQ ID NO:3和45；d)SEQ IDNO:3和46；e)SEQ ID NO:3和47；f)SEQ ID NO:3和48；g)SEQ ID NO:3和49；h)SEQ ID NO:3和50；i)SEQ ID NO:3和51；j)SEQ ID NO:3和52；k)SEQ ID NO:3和53；l)SEQ ID NO:3和54；m)SEQ ID NO:3和55；n)SEQ ID NO:3和56；o)SEQ ID NO:3和57；或p)SEQ ID NO:3和58；如果存在，各序列有或无信号序列。

本文还提供完整抗体的部分，例如，所述抗体的轻链或重链，或轻链和/或重链的部分。整个抗体的部分包括整个抗体的抗原结合部分。本文中术语“抗原结合片段”和“抗原结合部分”可互换使用。举例来说，抗体的抗原结合片段包括单链抗体、Fv片段、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、Fd片段、单链Fv分子(scFv)、scFv-Fc融合体、双重特异性单链Fv二聚体、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、结构域缺失抗体和单结构域抗体(dAbs)。参见例如，Nature Biotechnology 22(9):1161-1165(2004))。本发明范围内还包括包含V_H和/或V_L的抗原结合分子。在V_H的情况中，该分子还可包含CH1区、绞链区、CH2区和CH3区中的一个或多个。

可利用酶裂解或重组技术产生抗体的部分或片段。例如，可使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解，分别产生Fab或F(ab’)₂片段。还可使用已在天然终止位点的上游引入一个或多个终止密码子的抗体基因制备呈各种截短形式的抗体。举例来说可设计编码F(ab’)₂片段重链的重组构建体以包含编码重链CH₁结构域和绞链区的DNA序列。抗原结合片段保留其亲源抗体的结合特异性。优选的抗原结合片段具有对野生型人CD52的结合特异性。可使用PCR诱变方法改变现存DNA序列以构建编码人源化可变区的核酸(例如，DNA)序列(参见，例如，Kamman,M.,等,Nucl.Acids Res.17:5404(1989))。编码新CDR的PCR引物可杂交至基于相同或非常类似的人可变区的、预先人源化的可变区的DNA模板(Sato,K.,等,CancerResearch 53:851-856(1993))。如果无可作为模板用的类似DNA序列，则可以合成的寡核苷酸构建包含编码可变区序列的序列的核酸(参见，例如，Kolbinger,F.,ProteinEngineering 8:971-980(1993))。核酸中还可并入编码信号肽的序列(例如，合成中，插入载体时)。如果无可用的信号肽序列(例如，通常不存在)，则可使用另一抗体的信号肽序列(参见，例如，Kettleborough,C.A.,Protein Engineering 4:773-783(1991))。使用这些方法、本文所述的方法或其他适当方法，可容易地制备变体。除非另外表明，否则关于制备和使用本发明抗体的讨论还适用于这些抗体的抗原结合片段。

本发明的抗体可为任何同型或亚型，包括IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM、IgA(例如，IgA1和IgA2)、IgD和IgE。所述抗体可包含衍生自人κ或λ轻链的轻链。

另一方面，本发明提供如本文所述抗体或其部分的变体，其中该变体特异性地与人CD52结合，但与参照抗体或其部分有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的不同(例如，在CDR区、FR区或恒定结构域中)。举例来说，该变体抗体与参照抗体的重链、重链可变结构域、轻链或轻链可变结构域至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

多肽的序列相似性或同一性通常使用序列分析软件测定。蛋白分析软件使用指定给各种取代、缺失和其他修饰(包括保守性氨基酸取代)的相似性量度来匹配相似序列。举例来说，GCG含有例如“Gap”和“Bestfit”等程序，其可使用缺省参数以确定密切相关多肽间(例如得自不同生物物种的同源多肽或野生型蛋白和其变体蛋白间)的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCG Version 6.1。还可使用采用缺省或建议参数的FASTA(GCGVersion 6.1中的程序)比较多肽序列；FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供查询和搜寻序列间最优佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson,Methods Enzymol.183:63-98(1990)；Pearson,Methods Mol.Biol.132:185-219(2000))。比较本发明序列和含有来自不同生物的大量序列的数据库的另一优选算法为计算机程序BLAST，尤其是使用缺省参数的blastp或tblastn。参见，例如，Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)；Altschul等,Nucleic Acids Res.25:3389-402(1997)，其通过提述并入本文。

本文所用的“氨基酸”以其全名、其对应的三字母代码或其对应的单字母代码表示，如下表所示：

根据本发明，可进行一种的氨基酸取代类型为改变抗体中可能对另一残基(例如但不限于丙氨酸或丝氨酸)具化学反应性的一个或多个半胱氨酸。在一个实施方案中，存在非典型(non-canonical)半胱氨酸的取代。该取代可在抗体的可变结构域的CDR或框架区中或在恒定结构域中进行。在一些实施方案中，该半胱氨酸是典型的。可进行的另一氨基酸取代类型为移除抗体中的潜在蛋白水解位点。这些位点可能存在于抗体的可变结构域的CDR或框架区中或恒定结构域中。半胱氨酸残基的取代和蛋白水解位点的移除可降低抗体产物中的异质性风险，因此增加其同质性。另一氨基酸取代类型通过改变一个或两个残基以消除形成潜在脱酰胺化位点的天冬酰胺-甘氨酸对。本发明的另一方面，使用描述于例如国际专利申请公开WO 98/52976和WO 00/34317中的技术，可将抗体去免疫化以降低其免疫原性。

可在根据本发明的一种变体中进行的另一氨基酸取代类型为保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基由具有化学性质相似(例如，电荷或疏水性)的侧链R基团的另一氨基酸残基取代的取代。一般而言，保守性氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能性。在两个或多个氨基酸序列的保守性取代彼此不同的情况下，可向上调整序列序列同一性百分比或相似度以校正该取代的保守性。进行此调整的方法为本领域的技术人员已知。参见，例如，Pearson,Methods Mol.Biol.243:307-31(1994)。

具有化学性质相似的侧链的氨基酸组的实例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸及天冬酰胺-谷氨酰胺。可替换地，保守性替换为Gonnet等,Science 256:1443-45(1992)中揭示的PAM250对数似然矩阵中具正值的任何变化。"适度保守性"替换乃于PAM250对数似然矩阵中具非负值的任何变化。

在特定的实施方案中，针对本发明抗体或抗原结合部分的氨基酸取代为如下的那些：(1)降低对蛋白水解的敏感性；(2)降低对氧化作用的敏感性；(3)改变结合亲和力以形成蛋白质复合物，例如，增强抗体的ADCC和CDC活性；(4)赋予或修饰这些类似物的其他物理化学或功能性质，但仍保留对人CD52的特异结合；(5)移除C端赖氨酸；和(6)加入或移除糖基化位点。在一些实施方案中，本发明抗CD52抗体重链的C端赖氨酸不存在(Lewis等,Anal.Chem,66(5):585-595(1994))。

一方面，本发明提供新型和新颖的多肽，其为本发明抗体的轻(或重)链，或为该轻(或重)链含可变结构域的部分。这些多肽由于可与相反的重(或轻)抗体链配合形成CD52结合分子而是有用的。一旦选定本发明抗体的初始V_L或V_H结构域，即可实施“混合及匹配”实验，其中从包含初始选定V_L或V_H区段的不同配对中，针对CD52结合进行筛选，选出优选V_L/V_H配对组合。可使用一种界定的可变结构域序列通过筛选可变结构域库的功能性配偶体可变结构域谱工程化针对CD52的功能性抗体。参见，例如，Clackson等,Nature,352:624-628(1991)；Portolano等,J.Immunol.,150:880-887(1993)；Beiboer等,J.Mol.Biol.,296:833-849(2000)；Klimka等,British Journal of Cancer,.83:252-260(2000)。

就诊断或分析而言(例如成像以允许例如治疗监测)，抗体(例如，其抗原结合片段)可包含可检测的标记。合适的可检测标记和用于标记抗体或其抗原结合片段的方法为本领域中已知。适当可检测标记包括举例来说放射性同位素(例如，铟-111、锝-99m或碘-131)；正电子发射标记(例如，氟-19)；顺磁性离子(例如，钆(III)、锰(II))；表位标记(卷标)；亲和力标记(例如，生物素、抗生物素蛋白)；自旋标记；酶；荧光基团或化学发光基团。不使用标记时，可利用表面等离子共振、ELISA、FACS或其他适当方法测定复合物形成(例如，人源化抗体和人CD52间)。

用于本发明的抗CD52抗体和抗原结合片段还可经由例如化学反应或基因修饰偶联于改善抗体药物动力学(例如，半衰期)的其他部分(moieties)(例如，聚乙二醇化组分)。在一些实施方案中，用于本发明的抗CD52抗体和抗原结合片段可经由例如化学偶联或基因修饰连接于适当细胞因子(例如，将细胞因子的编码序列以符合读框的方式附加至抗体编码序列从而产生抗体：细胞因子融合蛋白)。

本发明还涉及免疫偶联物，其中本发明抗体或抗原结合片段偶联于另一治疗剂，例如生物活性化合物(如，细胞因子、超级抗原、细胞毒性剂和毒素)。举例来说，抗体或片段可偶联于植物或细菌来源的分子(或其衍生物)、白介素-2抗体或白喉毒素抗体。

本发明抗体的稳定性

本发明抗体在保存中稳定。相比Ab26展示的稳定性，本发明抗体可具增强的稳定性。稳定性可在保存一段时间后通过测量抗体对CD52的结合亲和力显示。为证明稳定性，可在37℃或45℃和pH 7.0、7.5或8.0温育抗体。可使抗体在含10mM琥珀酸盐、10mM组氨酸和10mM磷酸钠、pH 7.5的缓冲液中温育。增强的稳定性可延长至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周或至少10周。

核酸和重组载体

本发明还涉及包含编码本发明抗体、抗原结合片段、轻链、重链或可变结构域等序列的分离和/或重组(包括例如基本上纯)的核酸分子。

本文中称为“分离”或“纯化”的核酸是已与其原始来源的基因组DNA或细胞RNA的核酸分离出来的核酸(例如，呈存在细胞中或例如数据库中的核酸混合物)，和包括利用本文所述的方法或其他适当方法得到的核酸，包括基本上纯的核酸、利用化学合成、组合生物和化学方法制备的核酸，和分离的重组核酸(参见例如，Daugherty,B.L.等,Nucleic AcidsRes.,19(9):2471-2476(1991)；Lewis,A.P.and J.S.Crowe,Gene,101:297-302(1991))。

本文中称为“重组的”核酸是已利用重组DNA方法(包括利用依赖人工重组方法，例如聚合酶连锁反应(PCR)和/或使用限制酶克隆入载体中等的步骤产生的核酸)制备的核酸。“重组”核酸还可以是因通过细胞天然机制发生的重组事件产生的那些核酸，但是针对在将经设计而容许并使期望重组事件成为可能的核酸引入细胞之后对这些核酸进行了选择。

更具体而言，本发明还涉及分离的和/或重组核酸，其包含编码对人CD52具有结合特异性的抗体或该抗体的重链或轻链或重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列。

在一些实施方案中，核酸分子包含选自SEQ ID NO:95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109或110的核苷酸序列，其编码抗CD52抗体的V_L氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸分子编码SEQ ID NO:68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的V_L氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸分子编码与参照抗CD52抗体(例如，Ab26)的V_L氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％完全相同的V_L氨基酸序列。编码Ab26的V_L氨基酸序列的核苷酸序列可为SEQ ID NO:85。在一些实施方案中，核酸分子编码包含相比参照抗CD52抗体(例如，Ab26)的V_L氨基酸序列含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个突变的V_L氨基酸序列。所述突变可位于CDR或FR中。

在一些实施方案中，核酸分子包含选自SEQ ID NO:119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134的核苷酸序列，其编码抗CD52抗体的、有或无信号序列的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸分子编码SEQ ID NO:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58的、有或无信号序列的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸分子编码的轻链氨基酸序列和参照抗CD52抗体(例如，Ab26)的轻链氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％完全相同。编码Ab26的轻链氨基酸序列的核苷酸序列可为有或无信号序列的SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，核酸分子编码与参照抗CD52抗体(例如，Ab26)的轻链氨基酸序列相比含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个突变的轻链氨基酸序列。所述突变可位于CDR、FR或恒定结构域中。

在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗CD52抗体的V_H氨基酸序列的核苷酸序列。举例来说，此核苷酸序列可为SEQ ID NO:84。在一些实施方案中，核酸分子编码的V_H氨基酸序列和参照抗CD52抗体(例如，Ab26)的V_H氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％完全相同。编码Ab26的V_H氨基酸序列的核苷酸序列可为SEQ ID NO:84。在一些实施方案中，核酸分子编码与参照抗CD52抗体(例如，Ab26)的V_H氨基酸序列相比含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变的V_H氨基酸序列。所述突变可位于CDR或FR中。

在一些实施方案中，核酸分子包含编码抗CD52抗体的、有或无信号序列的重链氨基酸序列的核苷酸序列。举例来说，该核苷酸序列可为有或无信号序列的SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，核酸分子编码的重链氨基酸序列和参照抗CD52抗体(例如，Ab26)的重链氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％完全相同。编码Ab26的重链氨基酸序列的核苷酸序列可为有或无信号序列的SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，该核酸分子编码与参照抗CD52抗体(例如，Ab26)的重链氨基酸序列相比含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个突变的重链氨基酸序列。所述突变可位于CDR、FR或恒定结构域中。

本发明核酸可用于生产对人CD52具结合特异性的人源化抗体。举例来说，可将编码本发明人源化抗体的核酸(如，DNA(例如cDNA)或RNA)或一种或多种核酸并入合适的构建体(如重组载体)中用于进一步序列操纵或在适当的宿主细胞中生产编码的抗体。

本发明还提供适用于表达对人CD52具结合特异性的人源化抗体的构建体或载体(例如，表达载体)。多种载体是可用的，包括在宿主细胞中以单拷贝或多拷贝维持的载体，或整合至宿主细胞染色体中的载体。可将所述构建体或载体引入适当宿主细胞中，然后可在培养物中生产和维持表达本发明人源化抗体的细胞。可使用单一载体或多重载体表达对人CD52具结合特异性的人源化抗体。

适当表达载体(例如，哺乳动物细胞表达载体)还可包含多种组分，其包括但不限下列一种或多种：复制起始点；可选择的标记基因；一个或多个表达调控元件，例如转录调控元件(如，启动子、增强子、终止子)和/或一个或多个翻译信号；用于靶向膜或分泌的信号序列或前导序列。在构建体或载体中，信号肽序列可由该构建体或载体或其他来源提供。举例来说，可使用抗体的转录和/或翻译信号以指导表达。

在合适的宿主细胞中可提供用于表达的启动子。启动子可为组成型或诱导型的。举例来说，启动子可操作地连接于编码人源化抗体或抗体链的核酸，进而其可指导编码多肽的表达。有多种适当的启动子可用于原核(例如，大肠杆菌的lac、tac、T3、T7启动子)和真核(例如，酵母醇脱氢酶(ADH1)、SV40、CMV)宿主。本领域的技术人员具有选择用于表达本发明抗CD52抗体或其部分的合适启动子的能力。

此外，载体(例如，表达载体)一般包含用于选择携带该载体的宿主细胞的可选择标记，并且在复制载体的情况中包含复制起始点。编码赋予抗生素或药物抗性的产物的基因为常见的可选择标记，并可用于原核细胞(例如，β-内酰胺酶基因(氨苄青霉素(ampicillin)抗性)、Tet基因(四环霉素抗性)和真核细胞(例如，新霉素(G418或遗传霉素(geneticin))、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素或潮霉素抗性基因)。二氢叶酸还原酶标记基因允许在各宿主中以氨甲喋呤选择。编码宿主的营养缺陷标记基因产物的基因(例如，LEU2、URA3、HIS3)常在酵母中作为可选择标记用。还涵盖使用病毒(例如，杆状病毒)或噬菌体载体和能整合入宿主细胞基因组内的载体(例如逆转录病毒载体)。

本发明因此涉及编码本发明的人源化抗体、人源化轻链、人源化重链的分离核酸分子。本发明还涉及编码抗体的抗原结合部分及其链的分离核酸分子。由本发明核酸编码的多肽序列描述于上文和下列实施例中。

在一些实施方案中，本发明的核酸或载体编码本发明的重链(或其抗原结合部分)或轻链(或其抗原结合部分)。在其他实施方案中，本发明的核酸或载体编码本发明的重链和轻链(或其抗原结合部分)两者。可使用含有重链编码核酸和轻链编码核酸或编码重链和轻链两者的单一核酸的宿主细胞制备包含重链和轻链(或抗体的抗原结合部分)的抗体。重链编码核酸和轻链编码核酸可置于分开的表达载体中。这些还可置于单一表达载体中处于相同或不同表达调控下。参见，例如，Cabilly U.S.Pat.6,331,415；Fang U.S.Pat.7,662,623。

生产具有对人CD52特异性的抗体的方法

本发明另一方面涉及制备本发明抗人CD52抗体的方法。本发明抗体举例来说可通过在适当宿主细胞中表达编码该抗体的一种或多种重组核酸产生。该宿主细胞可使用任何适当方法产生。举例来说，可将本文所述的表达构建体(如，一种或多种载体，例如，哺乳动物细胞表达载体)引入适当宿主细胞中，然后将所得细胞维持在适于构建体或载体表达的条件下(例如，在培养物中、动物中、植物中)。适当的宿主细胞可为原核细胞，包括细菌细胞(例如大肠杆菌(例如，DH5α^TM株(Invitrogen,Carlsbad,Calif.))、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和/或其他合适的细菌)；真核细胞例如真菌或酵母细胞(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、曲霉属菌种(Aspergillus sp.)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)或其他低等真核细胞)，以及高等的真核生物细胞，例如来自昆虫的细胞(例如，果蝇施耐德(Schnieder)S2细胞、Sf9昆虫细胞(WO 94/26087(O’Connor)、TN5B1-4(HIGH 5)昆虫细胞(Invitrogen)、哺乳动物的细胞(例如，COS细胞，例如，COS-1(ATCC登录编号CRL-1650)和COS-7(ATCC登录编号CRL-1651)，CHO(例如，ATCC登录编号CRL-9096)，CHO DG44(Urlaub,G.and Chasin,L A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77(7):4216-4220(1980))，293(ATCC登录编号CRL-1573)，HeLa(ATCC登录编号CCL-2)，CV1(ATCC登录编号CCL-70)，WOP(Dailey,L.,等,J.Virol.,54:739-749(1985))，3T3，293T(Pear,W.S.,等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:8392-8396(1993))，NS0细胞，SP2/0细胞，HuT 78细胞等)，或植物的细胞(例如，烟草、青萍(浮萍)和藻类)。(参见，例如，Ausubel,F.M.等,eds.Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates andJohn Wiley&Sons Inc.(1993))。在一些实施方案中，宿主细胞不是多细胞生物(例如，植物或动物)的一部分，例如其为分离的宿主细胞或细胞培养物的一部分。

本发明还涉及包含本发明核酸(如载体(例如，表达载体))的细胞。举例来说，编码人源化抗体(该抗体具有对人CD52的结合特异性)的重链和轻链的核酸(即一个或多个核酸)或包含这些核酸的构建体(即一种或多种构建体，例如，一种或多种载体)可通过适于所选定宿主细胞的方法(例如，转化、转染、电穿孔、感染)引入适当宿主细胞中(例如，于载体中、经由细胞中的进程产生的构建体中、整合至宿主细胞基因组中)，其中所述核酸与一个或多个表达调控组件可操作地连接或变成与一个或多个表达调控组件可操作地连接。在适于表达的条件下(例如，在诱导物、补充适当盐类、生长因子、抗生素、营养补充物等的适当培养基存在时)维持宿主细胞从而生产编码多肽。需要时，举例来说，可从宿主细胞、培养基或乳(milk)中分离该编码蛋白质(例如，人源化抗体、小鼠抗体、嵌合抗体)。此过程涵盖于转基因动物或植物(例如，烟草)的宿主细胞(例如，乳腺细胞)中的表达(参见例如，WO 92/03918)。

可制备其中抗体部分(例如，抗原结合片段；抗体链)连接于融合蛋白N端位置、C端位置或内部位置的非抗体组分(即不出现于天然存在抗体中的组分)的融合蛋白。举例来说，一些实施方案可通过于适当表达载体(例如，pET载体(如pET-15b，Novagen)、噬菌体载体(如，pCANTAB 5E,Pharmacia)或其他载体(如，pRIT2T蛋白质A融合载体，Pharmacia))中插入编码抗体序列的核酸予以制备。将所得构建体引入适当宿主细胞中表达。表达后，若干融合蛋白可利用适当亲和性基质从细胞溶解物中分离或纯化(参见，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel,F.M.等,Eds.,Vol.2,Suppl.26,pp.16.4.1-16.7.8(1991))。

本发明涉及包含编码本文所提供抗体(例如，抗体、轻链或重链、轻链可变区或重链可变区)的重组核酸的宿主细胞。本发明还涉及包含编码抗体或其链的抗原结合部分的重组核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包含本文提及的本发明的重组载体(例如，表达载体、哺乳动物细胞表达载体)。

本发明还涉及制备本发明抗体或抗体多肽链的方法。在一个实施方案中，该方法包括在适于表达抗体或多肽链的条件下维持本文所述的本发明宿主细胞(例如，包含编码抗体或多肽链(例如，本发明的轻链和重链、仅轻链或仅重链)的一个或多个分离核酸的宿主细胞)。举例来说，宿主细胞可培养于基质上或悬浮液中。在一些实施方案中，该方法进一步包括纯化或分离抗体或多肽链的步骤。

可使用偶联于DYNABEADS M-270胺(Dynal)的CD52根据制造商的建议进行选择。可替换地，使用生物素化的CD52的选择，可使用伯胺特异性试剂琥珀酰亚氨基-6-(生物素氨基)己酸酯依照制造商使用说明书(EZ link NHS LC Biotin,Pierce)制备。

来自选择的产物(outputs)可作为周质(periplasmic)制备物根据测量scFv或IgG竞争与CD52结合的能力的竞争分析以高通量筛选测试。

能在高通量筛选中竞争的样品可如Vaughan等(1996)和Osburn等(1996)中所述进行DNA测序。随后使克隆表达并纯化为scFv或IgG并使用例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)分析和补体依赖性细胞毒性(CDC)分析等分析法评估其结合CD52、中和CD52或其组合的能力。随后可如WO 01/66754实施例3中所述制备纯化scFv制备物。纯化scFv或IgG制备物的蛋白质浓度可使用BCA方法(Pierce)测定。类似方法可用于筛选固定抗体重链或轻链(或V_H或V_L)的最优配偶体(相对链)。

本发明抗体可以是纯化或分离形式(如，已和其原始来源(如，细胞上清液，混合物中，例如在文库中的抗体混合物中)的分子(如肽)分开)；及包括利用本文所述的方法或其他适当方法得到的抗体。分离抗体包括基本上纯(实质上纯)的抗体和通过化学合成、重组技术和其组合产生的抗体。

含毒素部分或毒素的抗体

本发明还涉及包含毒素部分或毒素的抗体。适当的毒素部分包含毒素(例如，表面活性毒素、细胞毒素)。毒素部分或毒素可使用任何适当方法连接或偶联于抗体。举例来说，毒素部分或毒素可直接或通过适当接头共价与抗体键合。适当接头可包括不可裂解或可裂解的接头，例如，pH可裂解接头或包含供细胞酶用的切割位点的接头。这些可裂解接头可用于制备抗体内化后能释放毒素部分或毒素的抗体。

可使用多种方法将毒素部分或毒素连接或偶联至抗体。所选的特定方法取决于毒素部分或毒素及想要连接或偶联的抗体。需要时，可使用含末端功能基团的接头以连接抗体和毒素部分或毒素。通常，偶联通过含反应性功能基团的毒素部分或毒素(或经修饰以含有反应性功能基团)和接头或直接和抗体反应而完成。共价键的形成通过含(或经修饰而含)化学部分或功能基团的毒素部分或毒素在适当条件下与第二个化学基团反应从而形成共价键进行。需要时，可使用任何适当方法，添加适当反应性化学基团于抗体或接头。(参见，例如，Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press:San Diego,Calif.(1996))。许多合适的反应性化学基团组合为本领域中已知，举例来说，氨基可与亲电子基团(例如，甲苯磺酸根、甲磺酸根、卤素、N-羟基琥珀酰亚氨基酯(NHS)等)反应。硫醇类可与顺丁烯二酰亚胺、碘代乙酰基、丙烯酰基、吡啶基二硫化物、5-硫醇基-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇基)等反应。醛功能基团可偶联至含胺或酰肼的分子，而叠氮基团可与三价磷基反应以形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺等连接基。引入活化基团至分子中的适当方法为本领域中已知(参见例如，Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press:SanDiego,Calif.(1996))。

适当的毒素部分和毒素包括，例如，美登木素生物碱(maytansinoid)、紫杉烷、卡奇霉素(calicheamicin)、多卡霉素(duocarmycin)或其衍生物。美登木素生物碱可为，例如，美登醇(maytansinol)或美登醇类似物。美登醇类似物的实例包括具有修饰的芳香族环的那些和在其他位置具有修饰的那些。美登醇和美登醇类似物描述于例如美国专利5,208,020和6,333,410中，其在本文通过提述并入。美登醇可使用例如3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(还为所谓4-(2-吡啶二硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(或SPP))、4-琥珀酰亚氨基-氧羰基-a-(2-吡啶二硫代)-甲苯(SMPT)、3-(2-吡啶二硫代)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SDPB)、2-亚氨基硫烷(iminothiolane)或S-乙酰基琥珀酸酐偶联至抗体和抗体片段。紫杉烷可为例如紫杉醇、泰索帝(taxotere)或新型紫杉烷(参见，例如，WO 01/38318)。卡奇霉素可为例如溴复合卡奇霉素、碘复合卡奇霉素或其类似物和模拟物。溴复合卡奇霉素包括I1-BR、I2-BR、I3-BR、I4-BR、J1-BR、J2-BR和K1-BR。碘复合卡奇霉素包括I1-I、I2-I、I3-I、J1-I、J2-I、L1-I和K1-BR。卡奇霉素及其突变体、类似物和模拟物描述于例如美国专利4,970,198、5,264,586、5,550,246、5,712,374和5,714,586中，其每一篇的内容在本文通过提述并入。多卡霉素类似物描述于例如，美国专利5,070,092、5,187,186、5,641,780、5,641,780、4,923,990和5,101,038中，其每一篇的内容在本文通过提述并入。

其他毒素的实例包括但不限于，抗代谢物、烷化剂、蒽环类、抗生素和抗有丝分裂剂。毒素还可为表面活性毒素(例如本身为自由基产生剂的毒素)或含放射性核素的部分。毒素可以是蛋白、多肽或肽，例如来自细菌来源或植物蛋白质。

设计用于负责结合、失效、促进降解或阻止生成产生特定靶蛋白的mRNA的核酸反义化合物也可作为毒素使用。反义化合物包括反义RNA或DNA、单或双链、寡核苷酸或其类似物，其可特异性地与独特的mRNA类型杂交，并组织该mRNA类型的转录和/或RNA加工和/或编码多肽的翻译，从而造成相应编码多肽的量减少。Ching,等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10006-10010(1989)；Broder,等,Ann.Int.Med.113:604-618(1990)；Loreau,等,FEBS Letters 274:53-56(1990)。

毒素还可为光活性剂。适当的光活性剂包括基于卟啉的材料如卟吩姆钠(porfimer sodium)、绿色卟啉、二氢卟吩(chlorin)E6、血卟啉衍生物本身、酞菁素、初紫红素(etiopurpurins)、替沙林(texaphrin)等。毒素可为结合细胞内标靶的抗体或抗体片段。这些抗体或抗体片段可被引导至限定的亚细胞区室或标靶。

治疗方法和组合物

药物组合物包含治疗上有效量的一种或多种抗体和任选的药物上可接受的载剂。药物上可接受的载剂包括例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐液、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。药物上可接受的载剂可进一步包含少量辅助物质例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，其增强融合蛋白质的保存期限或有效性。可配制组合物以提供给药后活性成分的快速、持续或延后释放。适当的药物组合物及其制备方法为本领域已知。参见，例如，Remington(2005),The Science and Practice of Pharmacy,A.Gennaro,等,eds.,21st ed.,MackPublishing Co.。药物组合物可进一步包含免疫抑制/免疫调节和/或抗炎剂。在需要这些治疗的患者中治疗免疫疾病的方法可包括施用治疗有效量的药物组合物至该患者。举例来说，在自身免疫、移植排斥或变应反应期间，拮抗CD40介导的T细胞活化可抑制不需要的T细胞反应发生。抑制CD40介导的T细胞活化可缓和这些疾病的进展和/或严重性。

本文所用的“患者”指动物，例如，哺乳动物，包括人。患者可能诊断患有免疫疾病或癌症。“治疗”指涉及减轻症状、病症、病况或疾病进展或严重性的过程。“免疫疾病”指任何与个体免疫反应(包括细胞性和/或体液性免疫反应)的形成相关的疾病。免疫疾病的实例包括但不限于，炎症、过敏、自身免疫疾病或与移植相关的疾病。自身免疫疾病可选自系统性红斑狼疮、多发性硬化、类风湿性关节炎、糖尿病、牛皮癣、硬皮症、动脉粥样硬化、炎性肠病和溃疡性结肠炎。

本发明抗体可用于免疫抑制和免疫切除。所述抗体靶向表达CD52的细胞(例如，T和B细胞)，且在对其有需要的受试者中减小(或如本文所用的“消耗”)其群体。淋巴细胞的消耗可用于治疗多种疾病和症状，例如发炎、自身免疫疾病和癌症(例如，淋巴细胞(B细胞或者T细胞)恶性肿瘤)。参见，例如，Reiff,A.,Hematology,10(2):79-93(2005)。可用本发明抗体或抗原结合部分治疗的疾病和症状的实例包括但不限于多发性硬化症、狼疮、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病(GVHD)、炎性肠病、血管炎、贝塞特氏(Behcet’s)病、韦格纳肉芽肿、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、葡萄膜炎、牛皮癣、硬皮症、多发性肌炎、1型(自身免疫型)糖尿病、自身免疫性血细胞减少症(例如自身免疫嗜中性粒细胞减少症、输血依赖性顽固PRCA、白血病和淋巴瘤例如有巨大肿块(bulky disease)的非霍奇金氏淋巴瘤和B细胞慢性淋巴性白血病(CLL)。抗体还可预防性施用以预防炎症的发病，或自身免疫疾病或癌症的复发。举例来说，本发明抗体可以作为调理疗法的一部分施用，为患者的移植(例如，干细胞移植、同种异体T细胞的自身输注或实体器官移植)作准备。在一些实施方案中，本发明抗体和抗原结合部分是用于制备治疗免疫疾病或癌症的药物。

可使用任何适当方法或途径施用抗体多肽或药物组合物。根据要治疗的疾病或症状，给药途径包括，例如，肠胃外(例如静脉内、动脉内、肌内、脊髓腔内、腹膜内、皮下注射)、口服(例如饮食)、局部、表皮、吸入(例如支气管内、鼻内或口腔吸入、鼻腔滴入)或经直肠。施用抗体多肽的治疗有效剂量取决于多种因素，包括例如治疗的免疫疾病的类型和严重性、联合疗法的使用、抗体多肽或药物组合物的给药途径和患者体重。抗体治疗有效量的非限制性范围相对于患者体重为0.1-20毫克/千克；一方面，为1-10毫克/千克。抗体多肽的剂量可由在疾病状态的体外和/或体内模型中的CD52拮抗作用所需抗体多肽的量进一步指导。

本发明抗体可在医疗保健提供者认为合适的任何时间点以单一单位剂量或多剂量施用。所述剂量可通过本领域中已知的方法确定，且可根据例如，个体的年龄、敏感性、耐受性及整体健康状态而定。抗体或其部分可在为期数小时(例如，3、4、5或6小时)的输注中施用。抗体或部分可以各种适当的方案进行施用，例如，在持续的2、3、4、5或6天，以一个或多个周期，其间隔为3个月或3个月以上(例如，12或24个月)。任何周期中施用的抗CD52抗体的总剂量可为10至60毫克。在一个实施方案中，本发明的抗体或部分使用与

相同的给药方案施用。

本发明抗体可单独或在联合疗法中连同另一作用剂(例如，免疫抑制剂)施用至个体(例如，人)。该抗体可在其他作用剂给药前、一起或之后施用。在一些实施方案中，其他作用剂为，例如，抗炎化合物如柳氮磺胺吡啶、另一非类固醇类抗发炎化合物或类固醇类抗炎化合物。在一些实施方案中，其他作用剂为另一消耗淋巴细胞抗体，例如另一抗CD52抗体、抗CD20抗体、抗BAFF抗体、抗BAFF-R抗体等。在一些实施方案中，其他作用剂为，例如，细胞因子(例如，IL-7)、抗细胞因子受体抗体或可溶性受体，其偏离、操纵和/或加强由抗CD52抗体介导的淋巴细胞消耗后发生的重构过程(参见，例如，Sportes等,“Cytokine Therapies:Ann.N.Y.Acad.Sci.1182:28-38(2009))。在另一实施方案中，合成的肽模拟物可与本发明抗体一起施用。

由于本发明抗体靶向CD52表达细胞，因此所述抗体还可用于消耗T细胞和B细胞以外的CD52+细胞类型。举例来说，研究已显示，血管白细胞(VLC)和Tie2+单核细胞(表达高水平CD52的髓样细胞)促进肿瘤血管生成及促成对抗VEGF疗法的肿瘤抗性。Pulaski等,J.Translational Med.7:49(2009)。本发明的抗CD52抗体因而可经由靶向VLC和Tie2+单核细胞而抑制肿瘤血管生成。对于该目的，抗CD52抗体可全身性或局部施用于新血管形成位点(例如肿瘤部位)。抗CD52抗体疗法可与标准照护癌症治疗(例如化学疗法、外科手术或放射)或与另一靶向疗法(例如抗VEGF抗体疗法)一起使用。抗CD52抗体疗法可用于治疗，例如，乳癌、肺癌、神经胶质瘤、结肠直肠癌和抗VEGF抗体的任何其他征兆。抗CD52抗体疗法还可用于其他新血管形成症状，包括非致癌的新血管形成症状。

研究已显示，阿仑单抗的淋巴细胞消耗通过嗜中性粒细胞和NK细胞介导(Hu等,Immunology 128:260-270(2009))。因此，在联合疗法的实施方案中，可在抗CD52抗体疗法的前、期间或之后施用刺激嗜中性粒细胞和NK细胞的制剂至患者以增强抗体疗法。刺激嗜中性粒细胞和/或NK细胞包括但不限于(1)增加其分裂速率；(2)增加其对应于抗CD52抗体同型的Fc受体(例如，FcγRIIIa和FcγRIIIb、FcγRII、FcγRI及FcαRI)的细胞表面表达；(3)动员和增加循环的细胞数；(4)招募细胞至靶位点(例如，肿瘤、发炎或组织损伤的位点)；(5)和增加其细胞毒性活性。刺激嗜中性粒细胞和/或NK细胞制剂的实例包括例如粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)(例如，

或沙格司亭(sargramostim)和莫拉司亭(molgramostim))；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(例如，

或非格司亭(filgrastim)、聚乙二醇化非格司亭和来格司亭(lenograstim))；干扰素-γ(例如，

)；CXC趋化素受体4(CXCR4)拮抗剂(例如，MOZOBIL TM或普乐沙福(plerixafor))；及CXC趋化因子受体2(CXCR2)激动剂。患者的嗜中性粒细胞数可定期监测以确保最优治疗效力。患者的嗜中性粒细胞数还可在开始抗CD52抗体治疗前测量。刺激剂的量可根据患者的嗜中性粒细胞数调整。如果患者具有比正常更低的嗜中性粒细胞数，则可使用较高剂量的刺激剂。在嗜中性粒细胞减少期间，其可能是由于使用抗CD52抗体治疗所引起，还可施用较高剂量的嗜中性粒细胞刺激剂以最大化抗CD52抗体的效果。

由于嗜中性粒细胞和/或NK刺激改善抗CD52抗体疗法的效力，因此联合疗法的该实施方案允许在患者中使用较少抗体而同时保持类似的治疗功效。在保持治疗功效的同时使用较少抗CD52抗体有助于降低抗CD52抗体的副作用，包括患者对所施用抗体的免疫反应和形成次级自身免疫(抗CD52抗体治疗期间或之后产生的自身免疫)。联合疗法的该实施方案还可用于肿瘤科设置，例如，在患者患有嗜中性粒细胞减少症时。

在联合疗法的另一实施方案中，可使用调节型T细胞刺激剂加强抗CD52抗体疗法。已证实相比其他CD4⁺T细胞，抗CD52抗体消耗CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺调节型T细胞的程度小得多。调节型T细胞(还称为“Treg”或抑制型T细胞)是能经由接触依赖性或无关接触(例如，产生细胞因子)的机制抑制其他类淋巴细胞增殖和/或功能的细胞。已对数种类型调节型T细胞进行了描述，包括γδT细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞和双阴性CD4^-CD8^-T细胞。参见，例如，Bach等,Immunol.3:189-98(2003)。CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺调节型T细胞已称为“天然存在”的调节型T细胞；其表达CD4、CD25和叉头家族转录因子FoxP3(叉头盒p3蛋白(forkhead box p3))。因此，在联合疗法的该实施方案中，可在抗CD52抗体疗法之前、期间或之后施用刺激CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺调节型T细胞的制剂，以在淋巴细胞消耗后破坏(skew)免疫系统的组成。该制剂可，例如，活化这些T细胞、稳定和/或扩大所述细胞的群体、动员及增加细胞的循环和/或招募细胞至靶位点。这些制剂的实例为雷帕霉素(rapamycin)；活性或潜伏的TGF-β(例如，TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4和TGF-β5)；IL-10；IL-4；IFN-α；维生素D(例如，维生素D3)；地塞米松(dexamethasone)；和霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)(参见，例如，Barrat等,J.Exp.Med.195:603-616(2002)；Gregori等,J Immunol.167:1945-1953(2001)；Battaglia等,Blood 105:4743-4748(2005)；Battaglia等,J.Immunol.177:8338-8347(2006))。

本发明中用于治疗疾病的抗CD52抗体的有效量为帮助经治疗受试者达到一个或多个预期临床终点(clinical endpoint)的量。例如，就狼疮而言(其症状包括系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、皮肤性红斑狼疮、CNS狼疮、心血管症状、肺部症状、肝脏症状、血液症状、胃肠症状、肌肉骨骼症状、新生儿狼疮、儿童系统性红斑狼疮、药物引起的红斑狼疮、抗磷脂综合征和导致狼疮症状的补体缺陷综合征；参见，例如，Robert G.Lahita,Editor,Systemic Lupus Erythematosus,4th Ed.,Elsevier Academic Press,2004)，可经由监测受影响的器官系统(例如，狼疮性肾炎的血尿和/或蛋白尿)，和/或使用提供跨越数个器官系统的疾病严重性复合分数(例如，BILAG、SLAM、SLEDAI、ECLAM)的疾病活性指数，测量临床终点。参见，例如，Mandl等,“Monitoring patients with systemic lupuserythematosus”in Systemic Lupus Erythematosus,4^th edition,pp.619-631,R.G.Lahita,Editor,Elsevier Academic Press,(2004)。

本发明抗体或其部分可用于治疗之前已用

治疗，并对

形成中和抗体的个体(例如，

顽固型个体)。举例来说，可治疗先前已以

治疗(例如，以一个或多个

治疗疗程)并对

形成降低进一步

治疗功效的中和抗体的、具自身免疫疾病(例如，多发性硬化症、狼疮、血管炎)和/或癌症(例如，白血病(如，慢性淋巴性白血病)、淋巴瘤(例如，非霍奇金氏淋巴瘤))的个体。另一实施方案中，可用本文所述的其他人源化抗体之一治疗已成为难以本文所述的特定人源化抗体治疗的个体。

举例来说，本发明的抗体或其部分对于治疗多发性硬化症(MS)是有效的治疗剂。MS包括复发缓解型、继发进行型、原发进行型和进行复发型多发性硬化症(Lublin等,Neurology 46(4),907-11(1996))，其通过例如症状史和在例如核磁共振造影(MRI)、脊椎穿刺、诱发电位测试和血液样品的实验室分析等检测帮助下的神经系统检查进行诊断。在MS中，治疗的目标是为了降低复发的风险、频率和/或严重性，预防或降低由疾病进展引起的失能和促进组织修复。因此，帮助实现与一个或多个这些目标一致的临床终点的抗CD52抗体量为抗体的治疗有效量。举例来说，本发明的抗CD52抗体或其部分显示可用于治疗MS复发型以减缓或逆转身体失能的累积和降低临床急性发作的频率。该抗体或其部分可在临床试验中测试其在降低复发风险和临床上显著失能的进展风险的效力。该抗体或其部分可施用至具有活性复发或有形成复发的风险的患者或正在经历进行性功能退化的患者。参见例如，美国专利公开2008/0267954，其全部内容在本文通过提述并入。

本发明的方法和组合物可用于治疗对之前的MS修饰疗法反应欠佳的MS患者。该MS患者可为复发缓解型(RRMS)患者，其先前已接受MS修饰疗法，例如，干扰素β-1a(如

和

)、干扰素β-1b(如

和

)、乙酸格拉默(glatiramer acetate)(如

)、米托蒽醌(mitoxantrone)(如

)、那他珠单抗(natalizumab)(如

)、芬戈莫德(fingolimod)(如

)和特立氟胺(teriflunomide)(如AUBAGIO^TM)。在一个实施方案中，先前的MS修饰疗法并非阿仑单抗(如，CAMPATH、MABCAMPATH或LEMTRADA^TM)或另外的抗CD52抗体。该之前治疗的患者可能在正在治疗或治疗后不久(例如，一年之内)具有MS复发或更新(renewd)的MS活性。更新的MS活性可包括归因于MS的新或恶化的神经症状、患者EDSS评分增加(Kurtzke,Neurology1983；33:1444-52)、患者多发性硬化症功能复合量表(MSFC)评分减少(Cutter等,Brain 1999；122(Pt 5):871-82)、新的或增大的脑或脊髓损伤、脑容积损失和/或通过光学相干断层扫描(OCT)确定的神经退化。例如，当患者以干扰素β或格拉默治疗时，可能已至少具有一次在先的复发。患者还可能具有至少一种下述特征：在开始第一个周期抗CD52抗体治疗的前10年或少于10年的症状发作；在开始第一个周期抗CD52抗体治疗的前两年内至少发作两次；在用干扰素β或格拉默治疗至少6个月后，至少有一次复发；扩展失能状态量表(EDSS)评分5.0或更低；和脑和脊髓的核磁共振造影(MRI)异常。

在一个实施方案中，本发明抗体或其部分施用至具有自身免疫疾病(例如多发性硬化症(MS))的MS患者，其给药方案包含施用第一个周期抗体，随后为至少一个另外的周期的抗体，其中各治疗周期包含以连续天数施用1至5个剂量，且其中各治疗周期与下一周期至少间隔1至24个月(例如，12个月)。举例来说，在一个实施方案中，具有多发性硬化症的患者以包含5个抗体日剂量的第一个周期抗体治疗，随后为至少一个另外的周期的抗体治疗，其中该治疗发生于第一个周期的后一年，并包含以连续天数施用3个抗体剂量。在一个实施方案中，抗CD52抗体于第一个治疗周期中以12毫克/天，5个连续天数施用至具有多发性硬化症的患者；并在一年后，在第二个治疗周期中，以12毫克/天，三个连续天数对该患者施用抗CD52抗体。在一个实施方案中，抗CD52抗体是在第一个治疗周期中于5个连续天数期间以60毫克的总剂量施用至具有多发性硬化的患者；并在一年后，第二个治疗周期中，在3个连续天数期间以36毫克的总剂量对该患者施用抗CD52抗体。

本发明的方法和组合物中，“年”无需正好等于365天或12个月。举例来说，抗CD52抗体的第二个周期无需在施用抗CD52抗体第一个周期的后正好365天或12个月施用。第二个周期可在第一个周期开始后365天加或减多达6个月、加或减多达5个月、加或减多达4个月、加或减多达3个月、加或减多达2个月、加或减多达1个月、加或减多达4周、加或减多达3周、加或减多达2周或加或减多达1周开始。

另一实施方案中，患有MS的患者仅在一旦观察到更新MS活性的证据时才进行再治疗(参见例如WO 2008/031626，其全部内容在本文通过提述并入)。在一些实施方案中，如果具有更严重形式的MS或更进展形式的其他自身免疫疾病(例如血管炎；参见，例如，Walsh等,Ann Rheum Dis 67:1322-1327(2008))的患者在其最后治疗过程后经历提早复发或显示更新的MS活性，则可能有必要施用更频繁的治疗过程(例如，每4个月、每6个月)。更新MS活性的证据可使用临床医师可用的任何方法根据进行治疗的临床医师的专业判断而确定。目前有多种技术可供临床医师用以诊断更新MS活性，其包括但不限于临床方法(神经系统失能的复发或进展)或通过脑或脊髓的核磁共振造影(MRI)。如医师已知，经由MRI检测的疾病活性可由T1(增强或未增强)或T2加权成像大脑或脊髓新损伤的出现或由此类损伤体量的增加来指示。

由于MS诊断方法正持续发展，预期未来可能有更多检测更新MS活性的方法(例如，磁化转化比率或MR光谱术)。用于检测更新MS活性的特定诊断方法不是本发明申请专利范围的限定内容。在特定实施方案中，治疗周期后以固定时间间隔进行重复的MRI以确定任何特定患者是否有必要再治疗及此类患者再治疗的最佳时间点。通常希望在临床上疾病再显现前进行再治疗。

本发明的方法和组合物可与其他MS修饰疗法组合使用。MS修饰疗法的非限制性实例包括干扰素β-1a(例如，

和

)、干扰素β-1b(例如，

和

)、醋酸格拉默(例如，

)、米托蒽醌(例如，

)、那他珠单抗(例如，

)、芬戈莫德(例如，

)和特立氟胺(例如，

)。

在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可与一般化或非特定治疗或疗法(例如，类固醇类(如，皮质类固醇类)或达伐吡啶(dalfampridine)(如，

))组合使用。

一方面，可于输注抗CD52抗体之前、期间或之后施用本领域的技术人员已知的能有效处理输注相关副作用的药物。这些药物包括皮质类固醇类(例如，甲泼尼龙)、乙酰胺酚和抗组胺类(例如苯海拉明(diphenhydramine))。在一些实施方案中，患者在以本发明抗体治疗的周期期间于1、2、3、4或5个连续天静脉内注射接受1克/天的甲泼尼龙。

于本发明的一实施方案中，患者可另外接受作为预防疱疹用的药物。举例来说，患者可于本发明抗体给药期间和之后的28天每天两次接受200毫克的无环鸟苷(acyclovir)(例如，

)。

制剂根据所选定的给药途径而不同(例如，溶液、乳液)。包含欲施用的抗体或抗原结合片段的适当组合物可制备于生理上可接受的载体或载剂中。该组合物可包含多剂量或为单一单位剂量的组合物。就溶液或乳液而言，合适的载剂包括，例如，水性或醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体可包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发油。静脉内媒剂可包括各种添加剂、防腐剂或流体、营养物或电解质补充剂(一般参见，Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th Edition,Mack Publishing Co.,PA,1985)。就吸入而言，可将化合物溶解并装填至给药用的适当分配器中(例如，雾化器(atomizer)、喷雾器(nebulizer)或加压的气溶胶分配器)。

诊断方法和组合物

本发明抗体还可用于研究和诊断上应用的各种方法。举例来说，其可用于检测、分离和/或纯化人CD52或其变体(如通过亲和纯化或其他适当方法，例如，流式细胞测量术，如用于悬浮液中的细胞(如淋巴细胞)和研究人CD52结构(如构象)和功能。本发明的抗体可用于体外应用。

本发明抗体可用于诊断应用(如体外、离体)。举例来说，本发明的人源化抗体可用于检测和/或测量样品中的人CD52水平(如在组织或体液中--例如携带人CD52的炎性渗出液、血液、血清、肠液、组织--表达人CD52的细胞)。样品(如组织和/或体液)可获自个体，且可使用本文所述的抗体以适当免疫方法检测和/或测量人CD52的表达；包括的方法例如流式细胞测量术(如用于悬浮液中的细胞，例如淋巴细胞)，酶免疫分析法(ELISA)，包括化学发光分析、放射性免疫分析和免疫组织学。本发明涵盖包含本文所述的抗CD52抗体的试剂盒(如诊断试剂盒)。

在一个实施方案中，提供检测样品中的人CD52的方法，该方法包括在适于抗体和人CD52特异性结合的条件下，使样品和本发明抗体接触，并检测所形成的抗体CD52复合物。在该方法的应用中，本文所述的抗体可用于分析正常vs.发炎组织(如，得自人)对人CD52的反应性和/或表达(如，免疫组织学上)，以检测例如炎性肠病(IBD)、自身免疫疾病(例如多发性硬化症和红斑狼疮)、癌症(如非霍奇金氏淋巴瘤和慢性淋巴性白血病)或其他症状和人CD52(如，于受影响组织中)表达增加间的关系。因此，本发明抗体允许评估人CD52在正常及发炎组织中的存在的免疫方法，从而可于疾病(如，炎性疾病)的治疗中，评估疾病的存在、疾病的进展和/或抗人CD52疗法的效力。

此外，所述抗体可用于检验用消耗性抗CD52治疗抗体治疗后的组织，以衡量消耗的功效如何以及确定CD52的表达是否有任何下调(Rawstrom等,Br.J.Heam.,107:148-153(1999))。

除非另行限定，否则本文所用的所有技术和科学术语具有和本领域的技术人员通常了解的相同意义。下文描述了例示的方法和材料，但与本文所述类似或等同的方法和材料还可用于实施或测试本发明。本文描述的所有出版物及其他参考文献全部内容均并入本文用于参照。冲突的情况中，以本说明书(包括限定)为准。本文中虽然引用一些文件，但引用并不构成承认任何这些文件形成本领域中一般普遍知识的一部分。在整个说明书及实施方案中，“包含”应理解为意指包括所述整数或整数结合但不排除任何其他整数或整数集合。材料、方法和实施方案仅供说明用途而并非意在限定。

下述实施例意在说明本发明的方法和材料。本领域中通常遇到的所述条件的适当修饰和改变对本领域的技术人员而言为显而易见且属于本发明精神和范围内。本文中，术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换使用；“抗原结合片段”和“抗原结合部分”也可互换使用。

实施例

下述实施例意在说明本发明的方法和材料。本领域中通常遇到的对所述条件的适当修饰和改变对本领域的技术人员而言为显而易见且属于本发明精神和范围至之内。

实施例1：抗体Ab1的表达和表征

抗体Ab1通过改变Ab26轻链中的残基33(于L-CDR1之内)为Asp衍生自Ab26。此外，删除Ab26轻链前33个氨基酸残基，产生变体抗体(Del33抗体)。在轻链骨架中将该变体轻链DNA通过DNA2.0合成于pDONR221Entry载体中，随后通过Gateway克隆，亚克隆入HEK293表达载体pCEP4(-E+I)Dest中。随后进行大规模DNA制备以供HEK293-EBNA细胞转染。所有变体和亲源Ab26对照轻链和亲源Ab26重链以1：1比例共转染。

对于纯化，使用1毫升HiTrap蛋白质A柱(GE)和多通道泵装置，使用160-300毫升的转染培养基纯化Ab26、Del33和Ab1抗体。通过NanoDrop测量收集级分中的A280。合并含大部分蛋白质的级分#1和#2，缓冲液交换入50mM磷酸钠、150mM氯化钠，pH 6.0，并使用10kD截留柱的Amicon-4进行浓缩。蛋白质纯化产率总结于表3。

表3蛋白纯化产率

Del33突变体未以高水平表达或纯化，很可能是由于与缺失有关的错误折叠问题。Ab1和Ab26成功地纯化至均质以用于进一步表征。前15个氨基酸的N端测序证实所有三个样品具预期的序列。

Ab26和Ab1还在CHO细胞中表达并于蛋白质A柱上纯化。通过BIACORE^TM表征所述抗体对CD52肽的亲和力。HEK293细胞中产生的抗体的结果示于图17和表4，而CHO细胞中产生的抗体的结果示于图18和表5。

表4 HEK293细胞中表达的抗体的结合亲和力

抗体	k<sub>a</sub>(x10<sup>6</sup>M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)	k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>)	K<sub>D</sub>(nM)
				Ab26(制备物1)	7.2	0.01	1.7
Ab26(制备物2)	5.4	0.01	2.2
				Ab1	0.4	0.58	1480

表5 CHO细胞中表达的抗体的结合亲和力

抗体	k<sub>a</sub>(x10<sup>6</sup>M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>)	k<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>)	K<sub>D</sub>(nM)
				Ab26	6.2	1.6	2.6
Ab1	0.3	38.3	1250

CD52 BIACORE^TM结合分析如下述进行：将低水平的CD52肽模拟表位(CGQNDTSQTSSPSAD(SEQ ID NO:87))经由硫醇化学使用N端Cys固定于CM5芯片上。将于HBS-EP电泳缓冲液中制备的数个浓度的抗CD52抗体(1至20纳摩尔)注射于表面以监测结合。使用Scrubber2软件进行动力学分析。

相比Ab26，抗体Ab1展示亲和力大于400倍的下降。Ab1抗体在1-10nM浓度未观察到明显的结合信号，然而Ab26展现高结合亲和力(图17)。为尽可能得到变体结合亲和力丧失的定量测量，使用较高浓度的Ab1的(高达1900nM)。从CHO产生的Ab1得到的1250nM K_D与HEK293产生的Ab1(1480nM)一致。亲和力的减少反映在动力学结合上，既降低结合速率(on-rate)又增加解离速率(off-rate)。

通过测量经由补体依赖型细胞毒性的细胞杀伤进行CDC效力分析以评估亲和力损失是否影响效应物功能。所有变体和对照抗体材料在黑色固体96孔板上于分析培养基(不含酚红的IMDM培养基+0.1％BSA)中，从2毫克/毫升至0.002毫克/毫升进行1：2系列稀释。测试储存浓度≤2毫克/毫升的材料纯净。向所有孔添加正常人血清补体(QuidelCorporation)至最终浓度为5％(v/v)。随后添加菲佛氏(Pfeiffer)b-淋巴细胞(ATCC)至终浓度为0.6x 10⁶细胞/毫升。相同培养板上包括阴性细胞裂解对照(分析培养基+细胞)、阳性细胞裂解对照(分析培养基+细胞+2％(w/v)Triton X-100)和阳性剂量反应对照(4毫克/毫升对照材料)。反应在湿润的37℃，5％CO₂培养箱中温育1小时。随后向所有孔中添加50微升预温热的

检测试剂(Life Technologies)，随后在减光下温育4小时。使用荧光板读取计(激发：530nm，发射：590，截留：570nm)测量

的相对减少。使用Softmax Pro,v.5.3(Molecular Devices)产生拟合成四参数模型的剂量反应曲线。结果示于图19。如所预期，Ab26(对照)展示浓度依赖性的细胞杀伤。CHO细胞中产生的抗体Ab1在所测试的浓度范围中几乎不展示可检测的CDC活性。这些实验表明单一氨基酸取代可能对Ab26的生物功能具有显著影响。

实施方案2：抗CD52抗体的CD52结合亲和力分析

抗体Ab4、Ab3、Ab24、Ab10、Ab12和Ab25(见表1和2)在HEK293细胞中表达。如下合成轻链DNA，亚克隆，并于HEK293细胞中瞬时表达。在轻链骨架中将该DNA分子通过DNA2.0合成于pDONR221Entry载体中，然后通过Geteway克隆，亚克隆入HEK293表达载体pCEP4(-E+I)Dest中。将表达轻链的载体和表达Ab26重链的载体共转染入HEK293细胞中。使用Ab26DNA作为转染对照。使用蛋白质A传感器通过Octet针对蛋白质表达水平并使用CD52肽芯片通过BIACORE^TM针对CD52结合亲和力筛选条件培养基。结果示于图1。

Ab24和Ab10抗体展示较强的CD52结合亲和力。Ab4和Ab3展示较弱的CD52结合亲和力。为证实该发现，使用蛋白质A柱纯化Ab4和Ab3用于进一步表征。Ab26抗体(CTL)、来自两个转染的Ab26抗体(CTL1和CTL2)、Ab1、Ab4、Ab3、Ab10、Ab24、Ab12和Ab25的SDS-PAGE凝胶和BIACORE^TMCD52肽结合结果示于图2。

纯化抗体的结果证实了初始培养基的筛选数据。Ab4和Ab3展示了较低的CD52结合亲和力。

实施方案3：Ab24和Ab10抗体的大规模制备和表征

在CHO K1细胞中大规模生产了Ab24和Ab10抗体以测定其CD52的结合和抑制特性。在两个抗体中观察到轻链剪切；且在非还原性(NR)凝胶上观察到150kD以下的条带(此处称为“100kD类型”)(图3)。

通过优化的组织培养条件并省略培养基在4℃的保存步骤，可使轻链剪切问题尽量降低。尽管有这些改进，似乎仍有少量100kD类型(在150KD下)产生(图3)。进一步表征这两种抗体。通过SEC-HPLC，分别于Ab24和Ab10的两个较大规模制备物中发现了9-12％和18-20％的100kD类型。完整的质谱实验确认了该抗体的序列。低分子量类型的N端测序提示仅存在重链的N端序列。当收集100kD类型并于SDS-PAGE凝胶上分析时，仅观察到重链。这些结果提示所述100kD类型仅包含重链(图4)。

实施方案4：其他抗CD52抗体的制备和筛选

将抗体Ab2、Ab6、Ab7、Ab5、Ab13、Ab15、Ab17、Ab18、Ab19、Ab23、Ab22、Ab11、Ab20、Ab16、Ab21和Ab14(参见表1和2)的表达载体转染入HEK293细胞中。在Octet上用蛋白A传感器分析条件培养基时，所有抗体表达>0.2微克/毫升(图5，上图)。随后使用这些培养基样品的BIACORE^TMCD52亲和力筛选以鉴定领先的候选者(图5，中图及下图)。

抗体Ab2、Ab6、Ab7和Ab5对CD52的结合亲和力低。几种其他抗体展示了较高的CD52结合亲和力。这些抗体包括Ab22、Ab20、Ab21、Ab14、Ab14和Ab11。对抗体Ab22、Ab20、Ab21、Ab14、Ab14和Ab11进行进一步研究。

将这六个抗体(Ab22、Ab20、Ab21、Ab14、Ab14和Ab11)扩大规模至一个TripleFlask/抗体瞬时表达。(该培养瓶具有三个平行的生长表面，以提供500cm²的总培养面积)。使用1毫升HiTrap蛋白质A亲和力柱(GE Healthcare)，从160毫升条件培养基纯化所述抗体。还原性SDS-PAGE凝胶显示了成功的纯化和合理的抗体纯度(图6)。为了以BIACORE^TM进行CD52结合比较，将纯化样品在HBS-EP中稀释至60和7.5nM，并注射于CD52肽#741芯片上(7.5nM的结果示于图6)。该BIACORE^TM结合分析证实了初始培养基筛选结果，即这些抗体与CD52肽紧密结合。动力学结合实验表明下述亲和力排名：(Ab16、Ab21)>Ab26>(Ab20、Ab11、Ab14、Ab22)>(Ab24、Ab10)

Ab16和Ab21显示具有比Ab26高的亲和力。

实施方案5：抗CD52抗体的稳定性分析

为确定抗CD52抗体变体的稳定性是否已受到影响，使用高温条件比较并筛选抗CD52抗体变体。使用Ab26和从HEK293细胞纯化的选定变体进行初始筛选。在PBS(pH 7.2)中将蛋白质(85微克)稀释至约0.4毫克/毫升，在45℃温育4周。在BIACORE^TM上测量其对CD52肽的结合亲和力。在HBS-EP中将第2周和第4周取出的1微克每种变体系列稀释至7.5、2.5和0.8nM，并注射于CD52肽#741芯片上。使用Scrubber软件计算初步结合常数并示于图20(Ab26标记为“CTL”)。

结果表示，Ab21、Ab16和Ab20抗体在4周温育期间保留显著的CD52结合亲和力，表明它们比抗体Ab26更稳定。相比之下，Ab10和Ab22抗体在温育时期期间丧失其对抗原的大部分结合亲和力。

为了确认温育实验中得到的结果，生成了变体的新制备物并与Ab26抗体一起在37℃或45℃在“三组分”缓冲液(10mM琥珀酸盐、10mM组氨酸、10mM磷酸钠，pH 7.5)中一起温育4周。该“三组分”缓冲液通常用于抗体的可生产性测试中。温育材料的量列于表6。Ab21、Ab16和Ab20抗体还在相同缓冲液中于45℃进行温育。在第2周和第4周(T2和T4)取出等分试样，通过BIACORE^TM评估其对CD52肽的亲和力。各样品于HBS-EP中稀释至7.5、3.75和1.875nM，并注射于CD52肽#741芯片上达3分钟，随后于缓冲液中解离3分钟。表观K_D示于图21。

表6三组分缓冲液实验中温育的材料的量

突变体	浓度(mg/ml)	37℃温育(μg)	45℃温育(μg)
				Ab20	0.363	75	75
Ab22	0.350	75	-
				Ab16	0.366	75	75
Ab21	0.391	75	75
				Ab14	0.359	75	-
Ab24	0.361	75	-
				Ab10	0.382	75	-
Ab11	0.401	75	-
				CTL1	0.354	75	-
CTL2	0.375	75	75

结果提示，于37℃和45℃温育4周后，Ab21、Ab16和Ab20抗体的结合亲和力保持不变或仅略为下降，而Ab26(CTL、CTL1和CTL2)则随时间丧失结合亲和力。于45℃温育4周后，Ab26(CTL)的K_D从4.3nM变化至1230nM，表示和CD52的结合下降。这提示这些突变体于L-CDR1位点确实随时间对经过的不稳定性更具抗性。

为了验证Ab21、Ab16和Ab20抗体的结构完整性，通过SEC-HPLC评估于PBS(pH 7.2)中稀释至约0.4毫克/毫升并于45℃温育4周的变体的聚集和断裂。于移动相(40mM磷酸钠、500mM氯化钠，pH 6.0)中，稀释5微克的蛋白质至总体积为100微升，然后以0.5毫升/分钟注入TSK Gel G3000 SWxl柱上，为时35分钟。于Ab21、Ab16、Ab20和Ab26(CTL)中，无明显的聚集及有限的断裂被检测出(图22)。因此，Ab26亲和力的丧失可能不是由于结构完整性的丧失所引起。

实施例6：抗CD52抗体于体外效力分析(CDC效力)中的生物活性

于CDC分析中，评估了三个抗CD52抗体(Ab21、Ab20和Ab16)。使用此分析法测量所述抗体于补体存在下分解菲佛氏B-淋巴细胞的能力。抗体于相同平板上以单次分析(singlicate)并和Ab26(对照)进行定性比较(参见，图7)。

结果显示Ab21和Ab16的效力可与Ab26相当或更为改善。Ab20于此测试中具略低的效力。

实施例7：抗CD52抗体于HuCD52转基因小鼠中的生物活性

还于huCD52转基因小鼠中体内评估了3个抗CD52抗体(Ab21、Ab20和Ab16)。对HuCD52转基因小鼠静脉内注射1毫克/千克的Ab26、Ab21、Ab20或Ab16(5只动物/组)。注射后第3天，利用流式细胞测量术分析血液和脾脏的淋巴细胞消耗。通过流式细胞测量术分析的血液和脾脏中的淋巴细胞消耗程度示于图8(Ab26标识为“CTL”)。

结果提示，由抗体Ab21、Ab20和Ab16于血液和脾脏中所诱发的淋巴细胞消耗似乎和抗体Ab26相似或更为改善。综上所述，这些数据证实这些抗CD52抗体具体内生物活性。

表7列出本文使用的SEQ ID NO。

表7SEQ ID NO