KR20150131286A - 항-cd52 항체 - Google Patents

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KR20150131286A
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후아웨이 퀴우
론니 롱 웨이
클라크 쿤 팬
레베카 센다크
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젠자임 코포레이션
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Abstract

항-인간 CD52 항체 및 그의 항원-결합 단편이 제공된다. 또한, 항체 및 단편을 제조하기 위한 단리된 핵산, 재조합 벡터 및 숙주 세포가 제공된다. 항체 및 단편은 예를 들어, 자가면역 질환, 암 및 이식 거부를 치료하기 위하여 치료적 응용에 사용될 수 있다.

Description

항-CD52 항체{ANTI-CD52 ANTIBODIES}
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 텍스트 파일로 전자적으로 제출되고, 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2014년 3월 11일에 생성된 상기 텍스트 파일은 001662-0041-WO1_SL.txt로 명명되며, 142,582 바이트 크기이다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 항체, 더욱 구체적으로는 인간 CD52에 대하여 결합 특이성을 갖는 항체에 관한 것이다.
관련 출원과의 상호-참조
본 출원은 2013년 3월 15일에 출원된 미국 가출원 제61/794,576호로부터 우선권을 주장한다. 이러한 가출원의 개시내용은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
CD52는 다양한 정상 및 악성 림프계 세포(예를 들어, T 및 B 세포) 상에서 풍부하게(500,000개 분자/세포) 관찰되는 글리코실화된 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-고정 세포 표면 단백질이다. 예를 들어, 문헌[Hale et al., J Biol Regul Homeost Agents 15:386-391 (2001)]; 문헌[Huh et al., Blood 92: Abstract 4199 (1998)]; 문헌[Elsner et al., Blood 88:4684-4693 (1996)]; 문헌[Gilleece et al., Blood 82:807-812 (1993)]; 문헌[Rodig et al., Clin Cancer Res 12:7174-7179 (2006)]; 문헌[Ginaldi et al., Leuk Res 22:185-191 (1998)]을 참조한다. CD52는 골수 세포, 예를 들어, 단핵구, 대식구 및 수지상 세포에서 더 낮은 수준으로 발현되며, 성숙 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 조혈 줄기 세포에서는 발현이 거의 관찰되지 않는다. 상기 문헌을 참조한다. 모두에서, CD52는 모든 인간 말초 혈액 림프구 및 단핵구/대식구의 적어도 95%에 존재한다(문헌[Hale G, et al., "The CAMPATH-1 antigen (CD52)," Tissue Antigens, 35:178-327 (1990)]). 또한, CD52는 부고환 및 정관 내의 상피 세포에 의해서 생성되며, 생식관의 통과 동안 정액에 의해서 획득된다(상기 문헌[Hale et al., 2001]; 문헌[Domagala et al., Med Sci Monit 7:325-331 (2001)]). CD52의 정확한 생물학적 기능은 명확하지 않지만, 일부 증거는 그것이 T 세포 이동 및 동시-자극에 수반될 수 있음을 시사한다(문헌[Rowan et al., Int Immunol 7:69-77 (1995)]; 문헌[Masuyama et al., J Exp Med 189:979-989 (1999)]; 문헌[Watanabe et al., Clin Immunol 120:247-259 (2006)]).
몇몇의 항-CD52 모노클로널 항체가 개발되었다. 캠패스(Campath)-1H®(알렘투주맙, 캠패스®, 맙캠패스(MabCampath)®로 알려져 있음)는 강력한 시험관내 세포독성 효과(항체-의존성 세포 매개의 세포독성(ADCC) 및 보체-의존성 세포독성(CDC))를 나타내는 인간화된 항-인간 CD52 모노클로널 항체이다. 알렘투주맙은 성숙 CD52 단백질의 카복시 말단 4개 아미노산 및 음으로 하전된 GPI 앵커(anchor)의 일부로 이루어지는 에피토프를 인식한다. 추가의 항-인간 CD52 모노클로널 항체가 생성되었다. 그러나, 이들 항체의 일부의 결합 친화성은 보관 중에, 그리고 특정 pH 및 온도 조건하에서 감소한다. 따라서, 이러한 변화를 겪을 경향이 감소된 항-CD52 항체가 필요하다.
본 발명은 시간이 지남에 따라, 그리고 높은 pH 및 온도 조건하에서 결합 친화성을 유지하도록 조작된 항-인간 CD52 항체를 특징으로 한다. 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에 상호교환가능하게 사용된다. 항-CD52 항체 경쇄 또는 중쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산, 재조합 벡터 및 숙주 세포, 및 항-CD52 항체의 제조 방법도 또한 제공된다.
Ab26은 신호 서열을 제한 SEQ ID NO: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 신호 서열을 제한 SEQ ID NO: 4의 경쇄 아미노산 서열을 갖는 인간화된 항-인간 CD52 모노클로널 항체이다. Ab26은 보관 동안 시간이 지남에 따라 감소된 CD52 결합 친화성 및 효능을 갖는다. 본 발명자들은 예상치 않게 경쇄 CDR1의 위치 11에서 단일의 특정 아미노산 치환을 갖는 Ab26의 변이체(예를 들어, 모노클로널 항체 Ab21, Ab16 및 Ab20)가 Ab26의 인간 CD52-결합 친화성을 유지하거나 그를 능가할 뿐 아니라, Ab26과 비교하여 상당히 개선된 안정성을 나타내는 것을 발견하였다. 변이체 항체, 예를 들어, Ab21, Ab16 및 Ab20은 시험관내 및 생체 내에서 Ab26과 비교하여 비슷한 또는 개선된 생물학적 효능을 나타낸다. 이들 변이체는 치료 및 진단 응용에 유용하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-인간 CD52 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 7의 중쇄 CDR1; SEQ ID NO: 8의 중쇄 CDR2; 및 SEQ ID NO: 9의 중쇄 CDR3을 포함하며, 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 86의 경쇄 CDR1; SEQ ID NO: 34의 경쇄 CDR2; 및 SEQ ID NO: 35의 경쇄 CDR3를 포함한다. 추가의 구현예에서, SEQ ID NO: 86에서 잔기 11은 K, R, Q, H, S, Y, A, D, E, F, I, L, M, N, T 또는 V일 수 있다. 일 구현예에서, SEQ ID NO: 86에서의 잔기 11은 K이다. 다른 구현예에서, SEQ ID NO: 86에서 잔기 11은 R이다. 또 다른 구현예에서, SEQ ID NO: 86에서 잔기 11은 Q이다.
일부 구현예에서, 항-CD52 항체 또는 단편의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 59를 포함한다. 추가의 구현예에서, 항-CD52 항체 또는 단편의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 및 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 단편의 중쇄 및 경쇄는 a) 각각 SEQ ID NO: 59 및 68; b) 각각 SEQ ID NO: 59 및 69; c) 각각 SEQ ID NO: 59 및 70; d) 각각 SEQ ID NO: 59 및 71; e) 각각 SEQ ID NO: 59 및 72; f) 각각 SEQ ID NO: 59 및 73; g) 각각 SEQ ID NO: 59 및 74; h) 각각 SEQ ID NO: 59 및 75; i) 각각 SEQ ID NO: 59 및 76; j) 각각 SEQ ID NO: 59 및 77; k) 각각 SEQ ID NO: 59 및 78; l) 각각 SEQ ID NO: 59 및 79; m) 각각 SEQ ID NO: 59 및 80; n) 각각 SEQ ID NO: 59 및 81; o) 각각 SEQ ID NO: 59 및 82; 또는 p) 각각 SEQ ID NO: 59 및 83을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 신호 서열이 없는 SEQ ID NO: 3의 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 항체 또는 단편은 SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 항체 또는 단편은 (a) 신호 서열이 없는 SEQ ID NO: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 49의 경쇄 아미노산 서열; (b) 신호 서열이 없는 SEQ ID NO: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 53의 경쇄 아미노산 서열; 또는 (c) 신호 서열이 없는 SEQ ID NO: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 54의 경쇄 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 면역글로불린 G(IgG)이다. 추가의 구현예에서, 항체는 인간 Fc 영역(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항체 중 임의의 것의 항원-결합 단편을 포함하며, 상기 단편은 scFv 단편, Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, 미니바디, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 모노클로널이다. 추가의 구현예에서, 항체 및 항원-결합 단편은 인간화된다. 본 발명의 항체 또는 단편의 중쇄 C-말단 라이신이 선택적으로 절단될 수 있다.
또한, 본 발명은 항체의 중쇄 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 경쇄 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 둘 모두를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 또는 134의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터(예를 들어, 발현 벡터)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포를 포함한다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 항-CD52 항체 또는 단편, 또는 상기 항체 또는 단편의 중쇄 또는 경쇄를 생성하는 단리된 세포주를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 (1) 본원에 기술된 숙주 세포 또는 세포주를 항체 또는 단편의 발현에 적절한 조건 하에 유지하는 단계; 및 (2) 항체 또는 단편을 회수하는 단계를 포함하는 항-인간 CD52 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 비히클 또는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 유효량의, 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 자가면역 질환(disease)(예를 들어, 다발성 경화증)의 치료를 필요로 하는 환자에서의 자가면역 질환(예를 들어, 다발성 경화증)의 치료 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암(예를 들어, 만성 림프구성 백혈병)의 치료를 필요로 하는 환자에서의 암(예를 들어, 만성 림프구성 백혈병)의 치료 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생의 억제를 필요로 하는 환자에서의 혈관신생의 억제 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 자가면역 질환(예를 들어, 다발성 경화증)의 치료를 필요로 하는 환자에서의, 자가면역 질환(예를 들어, 다발성 경화증)의 치료를 위한, 또는 자가면역 질환(예를 들어, 다발성 경화증)의 치료용 약제의 제조를 위한, 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암(예를 들어, 만성 림프구성 백혈병)의 치료를 필요로 하는 환자에서의, 암(예를 들어, 만성 림프구성 백혈병)의 치료를 위한, 또는 암(예를 들어, 만성 림프구성 백혈병)의 치료용 약제의 제조를 위한, 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 혈관신생의 치료를 필요로 하는 환자에서의, 과도한 혈관신생의 치료를 위한 또는 혈관신생의 억제용 약제의 제조를 위한 본원에 기술된 항체 또는 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 제작된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 필요한 요금의 청구 및 납부 시 해당 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 항-CD52 항체의 신속한 친화성 스크리닝으로부터의 결과를 도시한 것이다. 상부 패널은 항체의 제조의 흐름도이다. 중간의 패널 그래프 및 하부의 패널 표는 비아코어(BIACORE)™ 결합 검정 및 옥텟(Octet) 발현 수준 측정의 결과를 보여준다.
도 2는 정제된 항-CD52 항체를 특성화하는 실험으로부터의 결과를 도시한 것이다. 상부 패널은 항-CD52 항체의 중쇄 및 경쇄의 분리를 보여주는 SDS-PAGE 겔의 사진이다. 분자량 마커는 표시된(M) 레인에 나타나 있다. 하부 패널의 그래프 및 표는 비아코어™ 결합 검정의 결과를 보여준다.
도 3은 CHO 세포에서 생성되는 Ab24 및 Ab10 항체의 제제를 보여주는 SDS-PAGE 겔의 사진을 도시한 것이다. 또한, 겔은 대조군 항-CD52(CTL) 항체 및 Ab1 항체를 보여준다. 100kD 종 및 LC 클리핑(clipping)은 화살표로 나타나 있다.
도 4는 우측에 "오직 중쇄 만의" 다이머 예시와 함께 Ab24 및 Ab10 항체에서 관찰되는 100kD 종을 보여주는 SDS-PAGE 겔의 사진을 도시한 것이다. N-말단 시퀀싱 결과도 또한 나타나 있다.
도 5는 추가의 항-CD52 항체를 특성화하는 실험으로부터의 결과를 도시한 것이다. 표 및 그래프는 비아코어™ 결합 검정 및 옥텟 발현 수준 측정의 결과를 보여준다. "KGN"은 SEQ ID NO: 3의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO: 2의 경쇄 서열을 갖는 항-CD52 항체를 말한다.
도 6은 정제된 항-CD52 항체의 CD52 결합을 특성화하는 실험으로부터의 결과를 도시한 것이다. 좌측 패널은 야생형(CTL) 및 다른 항체의 중쇄 및 경쇄를 보여주는 SDS-PAGE 겔의 사진이다. 분자량 마커는 표시된(M) 레인에 나타나 있다. 우측 패널의 그래프는 비아코어™ 결합 검정의 결과를 보여준다.
도 7은 대조군 항-CD52 항체 및 항체 Ab21, Ab16 및 Ab20의 CDC 검정으로부터의 결과를 도시한 그래프이다.
도 8은 인간 CD52 트랜스제닉 마우스에서 대조군 항-CD52 항체(CTL) 및 항체 Ab21, Ab16 및 Ab20의 CD52+ 세포-고갈 활성에 대한 검정의 결과를 도시한 것이다. 좌측의 그래프는 혈액 시료로부터의 결과를 보여준다. 우측의 그래프는 비장 시료로부터의 결과를 보여준다.
도 9는 야생형 인간 CD52 단백질의 아미노산 서열을 보여준다(진뱅크(GenBank) 수탁 번호 AAH00644.1)(SEQ ID NO: 1).
도 10은 항체 Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25 및 KGN의 전장 중쇄 아미노산 서열(SEQ ID NO: 3) 및 항체 Ab26의 전장 경쇄 아미노산 서열(SEQ ID NO: 4)을 보여준다. 신호 서열은 볼드체 및 이탤릭체이며, CDR은 밑줄 표시되어 있다.
도 11은 항체 Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25 및 KGN의 전장 중쇄 핵산 서열(SEQ ID NO: 5) 및 항체 Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25 및 KGN의 전장 경쇄 핵산 서열을 보여준다. 신호 서열은 밑줄 표시되어 있으며, 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 볼드체이다.
도 12는 항체 Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24 및 Ab25의 H-CDR1(SEQ ID NO: 7), H-CDR2(SEQ ID NO: 8), H-CDR3(SEQ ID NO: 9), L-CDR2(SEQ ID NO: 34) 및 L-CDR3(SEQ ID NO: 35)의 아미노산 서열을 보여준다.
도 13은 항체 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25 및 Ab26의 L-CDR1의 아미노산 서열을 보여준다.
도 14는 항체 Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24 및 Ab25의 전장 경쇄 아미노산 서열을 보여준다. CDR은 밑줄표시되어 있다.
도 15는 항체 Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24 및 Ab25의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 보여준다. CDR은 밑줄표시되어 있다.
도 16은 항체 Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25 및 KGN의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 핵산 서열을 보여준다.
도 17은 HEK293 세포로부터 정제된 Ab1 항체를 특성화하는 실험으로부터의 결과를 도시한 것이다. 그래프 및 표는 CD52 펩티드에 대한 Ab1, 및 2개의 제제의 Ab26(CTL1 및 CTL2)의 친화성을 측정하는 비아코어™ 검정의 결과를 보여준다. 상부 우측 패널은 2개의 제제의 Ab26(CTL1 및 CTL2) 및 Ab1 항체의 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)를 보여주는 환원 SDS-PAGE 겔의 사진이다.
도 18은 CHO 세포로부터 정제된 Ab1 항체를 특성화하는 실험으로부터의 결과를 도시한 것이다. 그래프는 CD52 펩티드에 대한 Ab1 항체(하부 패널) 및 Ab26 항체(CTL)(상부 패널)의 친화성을 측정하는 비아코어™ 검정의 결과를 보여준다.
도 19는 Ab1 항체 및 Ab26 항체(대조군)의 CDC 검정으로부터의 결과를 도시한 그래프이다. 결과는 항체의 ㎎/㎖ 단위의 최종 농도의 함수로서 상대 형광 유닛(RFU)으로 표현된다.
도 20은 항-CD52 항체의 안정성 스크리닝으로부터의 결과를 도시한 것이다. 상부 좌측 패널 그래프는 Ab26(CTL) 및 변이체 항체에 대한 45℃ 및 pH 7.2에서의 시간(주)의 함수로서 KD(nM)를 보여준다. 상부 우측 패널 그래프는 Ab26(CTL) 및 변이체 항체에 대한 45℃ 및 pH 7.2에서의 시간(주)의 함수로서 T0에 비한 친화성을 보여준다.
도 21은 항-CD52 항체의 안정성에 대한 3-성분 완충제에서의 인큐베이션의 영향을 시험하는 실험으로부터의 결과를 도시한 것이다. 상부 좌측 패널 그래프는 2가지 제제의 Ab26(CTL1 및 CTL2) 및 변이체 항체에 대한 37℃ 및 pH 7.5에서의 0주, 2주 및 4주의 KD(nM)를 보여준다. 상부 우측 패널 그래프는 Ab26(CTL) 및 변이체 항체에 대한 45℃ 및 pH 7.4에서의 0주, 2주 및 4주의 KD(nM)를 보여준다.
도 22는 45℃에서의 인큐베이션 후의 Ab26(CTL), Ab21, Ab16 및 Ab20의 크기-배제 크로마토그래피(SEC)-HPLC 분석으로부터의 결과를 도시한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 특정 항-CD52 항체가 보관 중에 시간이 지남에 따라, 또는 특정 pH 및 온도 조건하에서, 안정성을 소실하며, 감소된 결합 친화성을 나타낸다는 본 발명자들의 발견을 기반으로 한다. 본 발명자들은 모 항체의 경쇄 CDR1(L-CDR1) 내의 단일의 위치(위치 11)에 아미노산 치환을 포함하는 변이체 항체를 생성하였다. 본 발명자들은 이들 변이체 항체의 일부가 모 항체와 비교하여, 단지 비슷하거나 또는 개선된 항원-결합 특징 및 생체내 효능을 비롯한 생물학적 활성뿐 아니라 증가된 안정성을 나타내는 것을 발견하였다.
항-인간 CD52 항체, 항체의 항원-결합 단편(즉, 부분), 항체의 경쇄, 항체의 중쇄 및 이들 경쇄 또는 중쇄의 단편이 본 발명에 포함된다. 본 발명은 성숙 항체 또는 그의 쇄, 예를 들어, 글리코실화된 항체, 및 미성숙 또는 전구체 항체 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 둘 모두의 이들 미성숙 단백질 또는 성숙 단백질을 인코딩하는 핵산 분자(예를 들어, 벡터), 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포, 미성숙 및 성숙 단백질의 생성 방법 및 항체의 이용 방법에 관한 것이다.
본 발명의 항체 및 항원-결합 부분은 CD52-함유 세포에 의해 매개되거나 야기되는 다양한 질환 및 증상(condition), 예를 들어, 소정의 면역-매개의 질환(IMD) 적응증(indication)에 대하여, 치료를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 인간 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 작용 메카니즘은 항-CD52 항체가 세포사를 야기함으로써 그들 세포(예를 들어, 림프구 또는 암성 CD52+ 세포)를 고갈시키는 것일 수 있다. 예를 들어, 항체는 림프구 고갈(이는 순환하는 림프구, 예를 들어, T 세포 및/또는 B 세포의 집단을 감소시켜, 림프구감소증을 야기함으로써 달성되는 면역억제의 한 유형임)을 통해 자가-면역 질환(예를 들어, 다발성 경화증(MS), 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 맥관염, 근육염 및 베게너병)을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 암, 예를 들어, 백혈병(예를 들어, 만성 림프구성 백혈병) 및 림프종(예를 들어, 비-호지킨 림프종)을 치료하기 위해 사용하거나 조직 이식(예를 들어, 고형 기관 이식(예를 들어, 신장 이식) 및 줄기 세포 이식)에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 예를 들어, 생체외 응용에서 조혈 줄기 세포를 농축시키기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lim et al., J. Hematology & Oncology 1:19 (2008)] 참조).
본 발명의 항체의 항원-결합 특성
본 발명의 항체는 인간 CD52 또는 그의 부분으로의 결합에 대한 결합 특이성(예를 들어, 에피토프 특이성)을 갖거나, 인간 CD52 또는 그의 부분으로의 결합에 선택적이다. 이들 항체는 CD52 분자에 특이적으로 결합하고, 비-CD52 분자에는 특이적으로 결합하지 않는다. 항-CD52 항체와 CD52 간의 특이적인 결합은 예를 들어, 유세포분석에 의해 CD52+ 세포로의 항체 결합의 EC50을 측정함으로써 결정될 수 있다. 특이적인 결합은 10 ㎍/㎖ 미만의 EC50(예를 들어, 유세포분석에 의해 결정시)으로 표시될 수 있다. 본원에 기술된 항체는 인간 CD52 또는 그의 단편에 대하여 결합 특이성을 가질 수 있다. 결합 검정은 단리된 또는 재조합 인간 CD52; 인간 CD52로부터 유래된 펩티드; 또는 인간 CD52를 발현하는 세포(예를 들어, 인간 T 및/또는 B 세포, 인간 CD52를 인코딩하는 핵산을 발현하는 재조합 숙주 세포 또는 이러한 세포의 세포막 분획)를 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 항체는 인간 CD52의 하나 이상의 형태(예를 들어, 글리코실화된 인간 CD52; 탈-글리코실화된 인간 CD52; 비-글리코실화된 인간 CD52; 대립형질 변이체)에 대하여 결합 특이성을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 천연 발생, 내인성 또는 야생형 인간 CD52에 대하여 결합 특이성을 갖는다. 야생형 인간 CD52의 아미노산 서열은 도 9에 나타나 있다(SEQ ID NO: 1).
"항원-결합 친화성"은 결합 상호작용의 세기를 설명하는 해당 분야의 용어이며, 전형적으로 그의 항원으로의 항체의 결합의 전체 세기를 말한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 예를 들어, (1) 1×10-7 M 이하, 바람직하게는 1×10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 1×10-9 M 이하, 유리하게는 1×10-10 M 이하, 가장 바람직하게는 1×10-11 M 또는 1×10-12의 KD(KD=Koff(kd)/Kon(ka))로 표시된 친화성으로 인간 CD52에 결합한다. 예를 들어, KD는 100 nM 내지 1 pM(즉, 1×10-7 내지 1×10-12 M), 50 nM 내지 1 pM, 5 nM 내지 1 pM 또는 1 nM 내지 1 pM 범위이다. 또한, 요망되는 항원-결합 친화성은 표면 플라스마 공명에 의해 결정시, 5×10-1 s-1 이하, 바람직하게는 1×10-2 s-1 이하, 유리하게는 1×10-3 s-1 이하, 더욱 바람직하게는 1×104 s-1 이하, 더더욱 바람직하게는 1×10-5 s-1 이하, 가장 바람직하게는 1×10-6 s-1 이하의 Koff 속도 상수로 표시될 수 있다. 예를 들어, Koff 속도 상수는 5×10-1 s-1 내지 1×10-7 s-1, 1×10-2 s-1 내지 1×10-6 s-1, 또는 5×10-3 s-1 내지 1×10-5 s-1의 범위일 수 있다. 또한, 특정 검정 또는 환경에서 요망되는 항원-결합 세기는 10 ㎍/㎖ 이하의 EC50, 예를 들어, 0.1 내지 10 ㎍/㎖의 EC50으로 표시될 수 있다.
본 발명의 항체는 항체 Ab26 또는 본원에 예시되는 그의 변이체 중 임의의 것에 의해 결합되는 CD52 에피토프와 같거나, 그와 중첩하는 CD52 상의 에피토프에 결합하는 것들을 포함한다. 에피토프 결합은 다양한 기술, 예를 들어, 경쟁적 결합 검정을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 "에피토프"는 항체로 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프 결정인자는 일반적으로 분자, 예를 들어, 아미노산 및/또는 탄수화물 또는 당 측쇄의 화학적 활성 표면 그루핑(grouping)으로 이루어지며, 일반적으로, 특이적인 3차원 구조 특징 및 특이적인 전하 특징을 갖는다. 에피토프는 "선형" 또는 "입체형태"일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질 및 상호작용 분자(예를 들어, 항체) 간의 상호작용 지점의 모두는 단백질의 일차 아미노산 서열에 따라 선형으로 나타난다. 입체형태 에피토프에서, 상호작용 지점은 일차 폴리펩티드 서열에서 서로 분리된 단백질상의 아미노산 잔기에 걸쳐 나타난다.
일 구현예에서, 시험 항체가 본 발명의 특정 항-CD52 항체의 동일한 또는 중첩 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위하여, 본 발명의 항-CD52 항체가 포화 조건하에서 CD52에 결합하게 한 다음, CD52에 결합하는 시험 항체의 능력을 측정한다. 시험 항체가 참조 항-CD52 항체와 동시에 CD52에 결합할 수 있다면, 시험 항체가 참조 항-CD52 항체와 상이한 에피토프에 결합하는 것을 추론할 수 있다. 그러나, 시험 항체가 동시에 CD52에 결합할 수 없다면, 시험 항체가 참조 항-CD52 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일하거나 그와 중첩하는 에피토프 또는 참조 항체에 의해 결합되는 에피토프와 근접한 에피토프에 결합하는 것을 추론할 수 있다. 이러한 실험은 ELISA, RIA, 비아코어™ 또는 유세포분석을 사용하여 수행될 수 있다. 항-CD52 항체가 다른 항-CD52 항체와 상호-경쟁하는지를 시험하기 위하여, 상기 기술된 경쟁 방법을 2가지 방식으로 사용할 수 있으며, 다시 말하면, 참조 항체가 시험 항체를 블로킹하는지 그리고 그 역도 그러한지를 결정하여 사용할 수 있다.
또한, 에피토프 비닝(binning)은 본 발명의 항체를 특성화하는데 유용할 수 있다. 용어 "비닝"은 항체의 항원-결합 특징에 기초하여 항체를 분류하는 방법을 말한다. 항체의 상호-경쟁에 기초한 항체의 "비닝"을 위한 고효율 과정은 국제 특허 출원 공개 WO 03/48731호에 기술되어 있다. "에피토프 비닝"은 비표지 형태의 항-CD52 항체 "A"가 CD52의 서열에 상응하는 합성 펩티드 또는 CD52-양성 세포에 결합하게 함으로써 조사될 수 있다. 이후에, 표지된 제2 항-CD52 항체 "B"를 첨가하고, 세포 또는 합성 펩티드가 이전에 항-CD52 항체 "A"에 노출된 적이 없는 대조군 시료에 상대적으로 결합할 수 있는 표지된 항체의 양을 평가할 수 있다. 대안적으로, 항-CD52 항체 "A" 및 "B"는 검출을 가능하게 하는 상이한 형광색소 또는 화학물질로 표지될 수 있으며, 표지를 검출할 수 있는 장치를 사용하여 CD52 항원과 결합할 수 있는 표지된 둘 모두의 항체의 양을 동시에 측정하거나, 유세포분석에 의해 CD52-양성 세포와 결합하는 둘 모두의 항체의 양을 동시에 측정할 수 있다. 비아코어™ 및 옥텟 기술은 비표지된 형태의 항체의 경쟁적 결합을 조사할 수 있게 한다. 일부 항체의 화학적 변형이 결합 활성을 위태롭게 할 수 있기 때문에, 비표지된 형태의 항체의 이러한 이용이 요망된다. 또한, 에피토프 비닝을 수행하는데 유용한 문헌[Jia et al., J. Immunol. Methods 288:91-98 (2004)]에 기재된 기술을 참조한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체 Ab26의 친화성과 유사하거나 그보다 더 나은 친화성으로 인간 CD52에 결합한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체 Ab26의 동일하거나 유사한 에피토프 특이성 및 생물학적 작용(예를 들어, 림프구-고갈 작용)을 갖는다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 CD52의 QTSS 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합한다.
본 발명의 항체 및 항원-결합 단편의 구조
천연 발생 항체는 공통의 코어(core) 구조를 가지며, 여기서, 2개의 동일한 경쇄(약 24 kD) 및 2개의 동일한 중쇄(약 55 또는 70 kD)가 테트라머를 형성한다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 가변(V) 영역으로 알려져 있으며, 각 쇄의 나머지의 더욱 보존된 불변(C) 영역으로부터 구별될 수 있다. 경쇄의 가변 영역(VL 도메인으로도 지칭됨) 내에 J 영역으로 알려져 있는 C-말단 부분이 존재한다. 중쇄의 가변 영역(VH 도메인으로도 지칭됨) 내에는 J 영역에 더하여 D 영역이 존재한다. 항체에서의 대부분의 아미노산 서열 변이는 항원-결합에 직접 연루되는 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)으로 알려져 있는 V 영역 내의 3가지 개별 위치에 국한된다. 이들 영역은 아미노-말단으로부터 진행하여, 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3로 표기된다. CDR은 더욱 보존된 프레임워크 영역(FR)에 의해 제자리에 유지된다. 이들 영역은 아미노-말단으로부터 진행하여, 각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 표기된다. CDR 및 FR 영역의 위치 및 넘버링 시스템은 카바트(Kabat) 등(문헌[Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)]; 문헌[Chothia & Lesk, Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)] 참조); 및 IMGT® 넘버링 시스템(The International ImMunoGeneTics Iinformation System®; 문헌[Lefranc, M.-P., The Immunologist 7, 132-136 (1999)])에 의해 정의되어 있다. 육안의 조사 및 서열 분석을 수행하여, CDR 경계를 확인할 수 있다. 본 발명을 위하여, CDR 서열은 카바트 시스템 및 IMGT 시스템 둘 모두를 사용함으로써 정의되며; 다시 말하면, 2가지 시스템에 의해 정의되는 CDR이 완전히 중첩되지 않는 경우, 둘 모두의 시스템에 의해 정의되는 서열로부터의 모든 잔기를 포함시킨다.
본 발명은 모 항체 Ab26의 변이체를 특징으로 한다. Ab26의 중쇄 및 경쇄 아미노산 및 핵산 서열은 각각 도 10 및 11에 나타나 있다. Ab26은 신호 서열이 없는 SEQ ID NO: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 신호 서열이 없는 SEQ ID NO: 4의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 항체의 CDR은 성숙 Ab26 단백질의 잔기 34에서의 경쇄 CDR1 아미노산 서열에서 Ab26과 상이하다. 이들 변화의 일부는 변이체 항체의 항원-결합 특징에 영향을 미치지 않고, 변이체 항체의 안정성을 크게 향상시킨다. 잔기 34 돌연변이가 변이체 항체의 둘 모두의 항원-결합 친화성을 감소시킨다면, 친화성을 복구시키기 위하여 항체 서열에서(예를 들어, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR2, H-CDR1, H-CDR2 또는 H-CDR3에서) 하나 이상의 추가의 돌연변이가 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 잔기 34는 G에서 K, R, Q, H, S, Y, A, D, E, F, I, L, M, N, T 또는 V로 변경된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 항-CD52 항체의 L-CDR1 서열은 SEQ ID NO: 24, 29, 28, 22, 30, 33, 18, 19, 20, 21, 23, 25, 26, 27, 31 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 특별히 예시된 항체의 CDR 서열은 그들의 SEQ ID NO에 의해 하기 표 1에 열거되어 있다.
[표 1]
Figure pct00001

일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간화된다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "항-CD52 인간화 항체"는 공여자 항체(예를 들어, 뮤린(murine) 항-CD52 항체)로도 지칭되는 비-인간 기원의 항-CD52 항체의 하나 이상의 경쇄 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3) 및/또는 하나 이상의 중쇄 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3); 및 인간 기원의 항체의 적어도 일부(예를 들어, 인간 기원의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유래된 프레임워크 영역, 또는 프레임워크 및 불변 영역)를 포함하는 항체를 말한다. 예를 들어, 인간화 항체는 프레임워크 변화가 있거나 없는 CDR-이식 항체이다. 일부 구현예에서, 인간화 항체는 탈-면역화된 항체이다. 예를 들어, 잠재적인 T-세포 에피토프의 수를 감소시켜, 이에 의해, 인간으로의 투여시에 항체가 면역 반응을 유도하는 경향을 감소시키기 위해 변형된 탈-면역화 항체에 관해서는 Carr의 미국 특허 제7,264,806호를 참조한다.
프레임워크 영역의 변화, 예를 들어, 인간 기원의 프레임워크 영역의 잔기를 공여자 항체의 상응하는 위치로부터의 잔기로 치환하는 것들이 이루어질 수 있다. Queen의 미국 특허 제5,530,101호를 참조한다. 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 및 치환을 포함하는 하나 이상의 돌연변이가 이루어질 수 있다. 필요에 따라, 프레임워크 돌연변이가 인간화 항체에 포함될 수 있으며, 돌연변이를 위한 부위는 예를 들어, 전체 개시내용이 참조로 포함되는 WO 98/06248호 및 미국 특허 제6,407,213호에 기술된 임의의 적절한 방법을 사용하여 선택될 수 있다. 일부 경우에, 모 프레임워크 내의 하나 이상의 CDR의 측부 배치된(flanking) 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 측부 배치된 아미노산)은 또한, 항원-결합 친화성을 증가시키기 위해 인간화된 항체에 포함된다. 복귀 돌연변이는 선택적으로 인간화 항체의 CD52-결합 친화성을 향상시키기 위해 프레임워크 영역 내에서 하나 이상의 잔기에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 항체는 하나 이상의 잔기의 부가, 결실 또는 치환(예를 들어, 보존적 치환)에 의해 항체 Ab26과 상이하여, 예를 들어, 모 서열과 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 잔기가 상이할 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 68의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄; SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 69의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄; SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 70의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄; SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 71의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄; SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 72의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄; SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 73의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄; SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 74의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄; SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 75의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄; SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 76의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄; SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 77의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄; SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 78의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄; SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 79의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄; SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 80의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄; SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 81의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄; SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 82의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄; 또는 SEQ ID NO: 59의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 83의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 3개 모두의 CDR)을 포함하는 경쇄를 갖는 항체를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 CD52에 대한 결합 특이성을 가지며, 중쇄(H)-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, 경쇄(L)-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 포함하고, 그의 아미노산은 a) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 18, 34 및 35; b) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 19, 34 및 35; c) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 20, 34 및 35; d) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 21, 34 및 35; e) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 22, 34 및 35; f) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 23, 34 및 35; g) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 24, 34 및 35; h) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 25, 34 및 35; i) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 26, 34 및 35; j) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 27, 34 및 35; k) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 28, 34 및 35; l) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 29, 34 및 35; m) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 30, 34 및 35; n) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 31, 34 및 35; o) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 32, 34 및 35; 또는 p) 각각 SEQ ID NO: 7, 8, 9, 33, 34 및 35이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 SEQ ID NO: 86의 L-CDR1(KSSQSLLYSNXKTYLN)을 포함하며, 여기서, X는 D, E, K, R, H, Y, C, N, Q, S, T, A, V, L, I, M, P, F 또는 W로부터 선택되는 천연 발생 아미노산, 또는 비-표준(예를 들어, 비천연) 아미노산이다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 항체의 항체 경쇄에 관한 것이다. 일 구현예에서, 항체 경쇄는 SEQ ID NO: 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 및 33으로 이루어진 군으로부터 선택되는 L-CDR1을 포함한다. 예를 들어, 항체는 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3을 가지며, 그의 아미노산 서열은 a) 각각 SEQ ID NO: 18, 34 및 35; b) 각각 SEQ ID NO: 19, 34 및 35; c) 각각 SEQ ID NO: 20, 34 및 35; d) 각각 SEQ ID NO: 21, 34 및 35; e) 각각 SEQ ID NO: 22, 34 및 35; f) 각각 SEQ ID NO: 23, 34 및 35; g) 각각 SEQ ID NO: 24, 34 및 35; h) 각각 SEQ ID NO: 25, 34 및 35; i) 각각 SEQ ID NO: 26, 34 및 35; j) 각각 SEQ ID NO: 27, 34 및 35; k) 각각 SEQ ID NO: 28, 34 및 35; l) 각각 SEQ ID NO: 29, 34 및 35; m) 각각 SEQ ID NO: 30, 34 및 35; n) 각각 SEQ ID NO: 31, 34 및 35; o) 각각 SEQ ID NO: 32, 34 및 35; 또는 p) 각각 SEQ ID NO: 33, 34 및 35이다.
표 2는 본원에 구체적으로 예시된 항체의 전장 중쇄 및 경쇄 및 가변 도메인의 아미노산 서열, 및 중쇄 및 경쇄 및 가변 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 서열 식별자(SEQ ID NO)를 열거한 것이다.
[표 2]
Figure pct00002

일 구현예에서, 본 발명의 항체는 SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 또는 83의 가변 도메인(VL) 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 또는 58을 포함하거나 그로 이루어지는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 VH 및 VL을 포함하며, 그의 아미노산 서열은 a) 각각 SEQ ID NO: 59 및 68; b) 각각 SEQ ID NO: 59 및 69; c) 각각 SEQ ID NO: 59 및 70; d) 각각 SEQ ID NO: 59 및 71; e) 각각 SEQ ID NO: 59 및 72; f) 각각 SEQ ID NO: 59 및 73; g) 각각 SEQ ID NO: 59 및 74; h) 각각 SEQ ID NO: 59 및 75; i) 각각 SEQ ID NO: 59 및 76; j) 각각 SEQ ID NO: 59 및 77; k) 각각 SEQ ID NO: 59 및 78; l) 각각 SEQ ID NO: 59 및 79; m) 각각 SEQ ID NO: 59 및 80; n) 각각 SEQ ID NO: 59 및 81; o) 각각 SEQ ID NO: 59 및 82; 또는 p) 각각 SEQ ID NO: 59 및 83을 포함하거나 그로 이루어진다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)를 포함하며, 그의 아미노산 서열은 a) 각각 SEQ ID NO: 3 및 43; b) 각각 SEQ ID NO: 3 및 44; c) 각각 SEQ ID NO: 3 및 45; d) 각각 SEQ ID NO: 3 및 46; e) 각각 SEQ ID NO: 3 및 47; f) 각각 SEQ ID NO: 3 및 48; g) 각각 SEQ ID NO: 3 및 49; h) 각각 SEQ ID NO: 3 및 50; i) 각각 SEQ ID NO: 3 및 51; j) 각각 SEQ ID NO: 3 및 52; k) 각각 SEQ ID NO: 3 및 53; l) 각각 SEQ ID NO: 3 및 54; m) 각각 SEQ ID NO: 3 및 55; n) 각각 SEQ ID NO: 3 및 56; o) 각각 SEQ ID NO: 3 및 57; 또는 p) 각각 SEQ ID NO: 3 및 58을 포함하거나 이로 이루어지며; 각 서열은 존재한다면, 신호 서열이 있거나, 신호 서열이 없다.
또한, 전체 항체의 부분, 예를 들어, 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 경쇄 및/또는 중쇄의 부분이 본원에 제공된다. 전체 항체의 부분은 전체 항체의 항원-결합 부분을 포함한다. "항원-결합 단편" 및 "항원-결합 부분"의 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 항체의 항원-결합 단편은 예를 들어, 단쇄 항체, Fv 단편, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, 단쇄 Fv 분자(scFv), scFv-Fc 융합체, 이중특이적 단쇄 Fv 다이머, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 도메인-결실 항체 및 단일 도메인 항체(dAb)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Nature Biotechnology 22(9):1161-1165 (2004))]을 참조한다. 또한, VH 및/또는 VL을 포함하는 항원-결합 분자가 본 발명 내에 있다. VH의 경우에, 분자는 또한, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
항체 부분 또는 단편은 효소에 의한 절단에 의해 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 파파인 또는 펩신 절단을 사용하여, 각각 Fab 또는 F(ab')2 단편을 생성할 수 있다. 또한, 항체는 하나 이상의 종결 코돈이 천연 종결 부위의 상류에 도입된 항체 유전자를 사용하여 다양한 절단된 형태로 생성될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편의 중쇄를 인코딩하는 재조합 작제물은 중쇄의 CH1 도메인 및 힌지 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 항원-결합 단편은 그의 모 항체의 결합 특이성을 유지한다. 바람직한 항원-결합 단편은 야생형 인간 CD52에 대한 결합 특이성을 갖는다. 인간화 가변 영역을 코딩하는 핵산(예를 들어, DNA) 서열을 기존의 DNA 서열을 변경시키기 위해 PCR 돌연변이유발 방법을 사용하여 작제할 수 있다(예를 들어, 문헌[Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res. 17:5404 (1989)] 참조). 신규한 CDR을 코딩하는 PCR 프라이머는 동일한 또는 매우 유사한 인간 가변 영역에 기초하여, 이전에 인간화된 가변 영역의 DNA 주형에 혼성화될 수 있다(문헌[Sato, K., et al., Cancer Research 53:851-856 (1993)]). 유사한 DNA 서열이 주형으로서 사용하기에 이용가능하지 않다면, 가변 영역 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 합성 올리고뉴클레오티드로부터 작제할 수 있다(예를 들어, 문헌[Kolbinger, F., Protein Engineering 8:971-980 (1993)] 참조). 또한, 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 (예를 들어, 합성시에, 벡터로의 삽입시에) 핵산으로 혼입할 수 있다. 신호 펩티드 서열이 이용가능하지 않다면(예를 들어, 전형적으로 존재하지 않음), 다른 항체로부터의 신호 펩티드 서열을 사용할 수 있다(예를 들어, 문헌[Kettleborough, C. A., Protein Engineering 4:773-783 (1991)] 참조). 이들 방법, 본원에 기술된 방법 또는 기타 적절한 방법을 사용하여, 변이체를 용이하게 생성할 수 있다. 다르게 나타내지 않는 한, 본 발명의 항체의 제조 및 이용의 논의는 이들 항체의 항원-결합 단편에 응용가능하다.
본 발명의 항체는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgM, IgA(예를 들어, IgA1 및 IgA2), IgD 및 IgE를 포함하는 임의의 아이소타입(isotype) 또는 서브타입(subtype)의 것일 수 있다. 항체는 인간 카파 또는 람다 경쇄 중 어느 하나로부터 유래된 경쇄를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 그의 부분의 변이체를 제공하며, 여기서, 상기 변이체는 인간 CD52에 특이적으로 결합하지만, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환(예를 들어, CDR 영역, FR 영역 또는 불변 도메인 내)에 의해 참조 항체 또는 그의 부분과 상이하다. 예를 들어, 변이체 항체는 중쇄, 중쇄 가변 도메인, 경쇄 또는 경쇄 가변 도메인에서 참조 항체와 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
폴리펩티드에 대한 서열 유사성 또는 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하는, 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 할당된 유사성을 척도를 사용하여 유사한 서열을 매치시킨다. 예를 들어, GCG는 유기체의 상이한 종으로부터의 밀접하게 관련된 폴리펩티드, 예를 들어 상동성 폴리펩티드 간의 또는 야생형 단백질과 그의 뮤테인(mutein) 간의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 측정하기 위해 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 프로그램, 예를 들어 "갭(Gap)" 및 "베스트핏(Bestfit)"을 포함한다. 예를 들어, GCG 버전 6.1을 참조한다. 폴리펩티드 서열을 또한 디폴트 또는 권고된 파라미터, GCG 버전 6.1의 프로그램을 사용하는 FASTA를 사용하여 비교할 수 있다. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 질의(query) 및 검색 서열 간의 최적의 중첩의 영역의 정렬 및 서열 동일성 %를 제공한다(문헌[Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)]; 문헌[Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)]). 본 발명의 서열을, 상이한 유기체로부터의 다수의 서열을 함유하는 데이터베이스와 비교하는 경우 다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 blastp 또는 tblastn이다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]; 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997)]을 참조한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "아미노산"은 하기의 표에 나타낸 바와 같이, 그의 완전한 명칭에 의해, 그에 상응하는 3-문자 코드에 의해, 또는 그에 상응하는 1-문자 코드에 의해 표현될 수 있다:
Figure pct00003

본 발명에 따르면, 이루어질 수 있는 아미노산 치환의 하나의 유형은 화학적으로 반응성일 수 있는 항체 중 하나 이상의 시스테인을, 다른 잔기, 예를 들어, 비제한적으로, 알라닌 또는 세린으로 변경시키는 것이다. 일 구현예에서, 비-정규 시스테인의 치환이 존재한다. 치환은 항체의 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역에서 또는 불변 도메인에서 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 시스테인은 정규이다. 이루어질 수 있는 아미노산 치환의 다른 유형은 항체 중 잠재적인 단백질가수분해 부위를 제거하는 것이다. 이러한 부위는 항체의 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역에 또는 불변 도메인에 존재할 수 있다. 시스테인 잔기의 치환 및 단백질가수분해 부위의 제거는 항체 생성물에서 이질성의 위험을 감소시키고, 이에 따라, 그의 동질성을 증가시킬 수 있다. 아미노산 치환의 다른 유형은 잔기 중 하나 또는 둘 모두를 변경시킴으로써 잠재적인 탈아미드화 부위를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍을 제거하는 것이다. 본 발명의 다른 양태에서, 항체는, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO98/52976호 및 WO00/34317호에 기재된 기술을 사용하여 그의 면역원성을 감소시키도록 탈면역화될 수 있다.
본 발명에 따른 변이체 중 하나에서 이루어질 수 있는 아미노산 치환의 다른 유형은 보존적 아미노산 치환이다. "보존적 아미노산 치환"은, 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 지니는 측쇄 R 기를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변경시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, 서열 동일성 % 또는 유사성의 정도는 치환의 보존적 성질을 교정하기 위해 상향 조절될 수 있다. 이 조절을 이루는 수단은 해당 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994)]을 참조한다.
유사한 화학적 특성을 지니는 측쇄를 갖는 아미노산 기의 예는 다음을 포함한다: 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르트산 및 글루탐산; 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산염-아스파르트산염 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존적 대체는 문헌[Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992)]에 개시된 PAM250 log-우도 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "중등의 보존적" 대체는 PAM250 log-우도 매트릭스에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 부분에 대한 아미노산 치환은 (1) 단백질가수분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하여, 예를 들어, 항체의 ADCC 및 CDC 활성을 향상시키기 위해 결합 친화성을 변경시키고, (4) 이러한 유사체의 다른 물리화학 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형시키나, 인간 CD52에 대한 특이적 결합을 여전히 유지하고, (5) C-말단 라이신을 제거하고, (6) 글리코실화 부위를 부가 또는 제거하는 것들이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-CD52 항체의 중쇄의 C-말단 라이신은 존재하지 않는다(문헌[Lewis et al., Anal. Chem, 66(5): 585-595 (1994)]).
일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 경쇄(또는 중쇄)이거나, 경쇄(또는 중쇄)의 가변 도메인-함유 부분인 새롭고, 신규한 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드가 유용한데, 그 이유는 그것이 대응하는 중쇄(또는 경쇄) 항체와 파트너를 이루어, CD52-결합 분자를 형성할 수 있기 때문이다. 본 발명의 항체의 초기 VL 또는 VH 도메인이 일단 선택되면, "믹스 앤드 매치(mix and match)" 실험을 수행할 수 있으며, 여기서, 초기 선택된 VL 또는 VH 세그먼트를 포함하는 상이한 쌍을 CD52 결합에 대하여 스크리닝하여, 바람직한 VL/VH 쌍 조합을 선택한다. 작용성 파트너 가변 도메인의 레퍼토리에 대하여 가변 도메인 라이브러리를 스크리닝함으로써, 하나의 정의된 가변 도메인 서열을 사용하여, CD52에 대한 작용성 항체를 조작할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]; 문헌[Portolano et al., J. Immunol., 150:880-887 (1993)]; 문헌[Beiboer et al., J. Mol. Biol., 296:833-849 (2000)]; 문헌[Klimka et al., British Journal of Cancer,. 83:252-260 (2000)]을 참조한다.
진단 또는 검정 목적(예를 들어, 영상화, 예를 들어 요법의 모니터링을 가능하게 하는 영상화)을 위하여, 항체(예를 들어, 그의 항원-결합 단편)는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 적절한 검출가능한 표지 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 표지화하기 위한 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 적절한 검출가능한 표지는 예를 들어, 방사성동위원소(예를 들어, 인듐-111, 테크네튬-99m 또는 요오드-131), 양전자 방출 표지(예를 들어, 불소-19), 상자성 이온(예를 들어, 가들리늄(III), 망간(II)), 에피토프 표지(태그), 친화성 표지(예를 들어, 비오틴, 아비딘), 스핀(spin) 표지, 효소, 형광기 또는 화학발광기를 포함한다. 표지가 이용되지 않는 경우, (예를 들어, 인간화 항체와 인간 CD52 간의) 복합체 형성은 표면 플라스몬 공명, ELISA, FACS 또는 다른 적절한 방법으로 측정될 수 있다.
본 발명에 사용된 항-CD52 항체 및 항원-결합 단편은 또한, 예를 들어, 화학 반응 또는 유전자 변형을 통해, 항체의 약동학, 예를 들어, 반감기를 개선시키는 다른 모이어티(예를 들어, PEG화 모이어티)에 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 사용된 항-CD52 항체 및 항원-결합 단편은 예를 들어, 화학적 컨쥬게이션 또는 유전자 변형을 통해 적절한 사이토카인에 연결될 수 있다(예를 들어, 사이토카인의 코딩 서열을 항체 코딩 서열에 프레임 내에서 부착시켜, 이에 의해 항체:사이토카인 융합 단백질을 생성한다).
본 발명은 또한, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편이 다른 치료제, 예를 들어, 생물활성 화합물(예를 들어, 사이토카인, 초항원, 세포독성제 및 독소)에 커플링된 면역컨쥬게이트에 관한 것이다. 예를 들어, 항체 또는 단편은 식물 또는 박테리아 기원의 분자(또는 그의 유도체), 인터류킨-2 항체 또는 디프테리아 독소 항체에 커플링될 수 있다.
본 발명의 항체의 안정성
본 발명의 항체는 보관 동안 안정적이다. 본 발명의 항체는 Ab26에 의해 나타나는 안정성에 비하여 증가된 안정성을 가질 수 있다. 안정성은 소정의 보관 기간 후에, CD52에 대한 항체의 결합 친화성을 측정함으로써 나타낼 수 있다. 안정성을 입증하기 위하여, 항체를 37℃ 또는 45℃에서, 그리고 pH 7.0, 7.5 또는 8.0에서 인큐베이션시킬 수 있다. 항체는 10 mM 석시네이트, 10 mM 히스티딘 및 10 mM 인산나트륨, pH 7.5를 함유하는 완충제 중에서 인큐베이션시킬 수 있다. 증가된 안정성은 적어도 1주 동안, 적어도 2주 동안, 적어도 3주 동안, 적어도 4주 동안, 적어도 5주 동안, 적어도 6주 동안, 적어도 7주 동안, 적어도 8주 동안, 적어도 9주 동안 또는 적어도 10주 동안 연장될 수 있다.
핵산 및 재조합 벡터
또한, 본 발명은 본 발명의 항체, 항원-결합 단편, 경쇄, 중쇄 또는 가변 도메인을 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 및/또는 재조합(예를 들어, 본질적으로 순수한 것을 포함) 핵산 분자에 관한 것이다.
"단리된" 또는 "정제된"으로 본원에서 언급된 핵산은 그들의 기원이 되는 공급원의 게놈 DNA 또는 세포 RNA의 핵산으로부터 분리된 핵산(예를 들어, 그들이 세포 내에 또는 핵산의 혼합물, 예를 들어 라이브러리 내에 존재함에 따라)이고, 본질적으로 순수한 핵산, 화학적 합성에 의해 생성된 핵산, 생물학적 및 화학적 방법의 조합에 의해 생성된 핵산, 및 단리된 재조합 핵산을 포함하는, 본원에 기재된 방법 또는 다른 적절한 방법에 의해 수득되는 핵산을 포함한다(예를 들어, 문헌[Daugherty, B. L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9):2471-2476 (1991)]; 문헌[Lewis, A. P. and J. S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)] 참조).
"재조합"으로 본원에서 언급된 핵산은 인공의 재조합 방법, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및/또는 제한 효소를 사용하는 벡터로의 클로닝에 의존하는 절차에 의해 생성된 핵산을 포함하는, 재조합 DNA 방법에 의해 생성되는 핵산이다. "재조합" 핵산은 또한, 세포의 천연 메카니즘을 통해 일어나는 재조합 사건으로부터 야기되지만, 가능한 요망되는 재조합 사건을 가능하게 하고 이루도록 설계된 핵산을 세포로 도입한 후에 선택되는 것들이다.
또한, 본 발명은 더욱 구체적으로 인간 CD52에 대하여 결합 특이성을 갖는 항체, 또는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 및/또는 재조합 핵산에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 항-CD52 항체의 VL 아미노산 서열을 인코딩하는 SEQ ID NO: 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 또는 110으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 또는 83의 VL 아미노산 서열을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 참조 항-CD52 항체(예를 들어, Ab26)의 VL 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 아미노산 서열을 인코딩한다. Ab26의 VL 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 85일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 참조 항-CD52 항체(예를 들어, Ab26)의 VL 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 돌연변이를 포함하는 VL 아미노산 서열을 인코딩한다. 돌연변이는 CDR 내에 또는 FR 내에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 신호 서열이 있거나 신호 서열이 없는, 항-CD52 항체의 경쇄 아미노산 서열을 인코딩하는 SEQ ID NO: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 또는 134로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 신호 서열이 있거나 신호 서열이 없는, SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 또는 58의 경쇄 아미노산 서열을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 참조 항-CD52 항체(예를 들어, Ab26)의 경쇄 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 아미노산 서열을 인코딩한다. Ab26의 경쇄 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 신호 서열이 있거나, 신호 서열이 없는 SEQ ID NO: 6일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 참조 항-CD52 항체(예를 들어, Ab26)의 경쇄 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 돌연변이를 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 인코딩한다. 돌연변이는 CDR 내에, FR 내에 또는 불변 도메인 내에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 항-CD52 항체의 VH 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 이러한 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 84일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 참조 항-CD52 항체(예를 들어, Ab26)의 VH 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 아미노산 서열을 인코딩한다. Ab26의 VH 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 84일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 참조 항-CD52 항체(예를 들어, Ab26)의 VH 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 돌연변이를 포함하는 VH 아미노산 서열을 인코딩한다. 돌연변이는 CDR 내에 또는 FR 내에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 신호 서열이 있거나 신호 서열이 없는, 항-CD52 항체의 중쇄 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 이러한 뉴클레오티드 서열은 신호 서열이 있거나, 신호 서열이 없는 SEQ ID NO: 5일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 참조 항-CD52 항체(예를 들어, Ab26)의 중쇄 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 아미노산 서열을 인코딩한다. Ab26의 중쇄 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 신호 서열이 있거나, 신호 서열이 없는 SEQ ID NO: 5일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 참조 항-CD52 항체(예를 들어, Ab26)의 중쇄 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 돌연변이를 포함하는 중쇄 아미노산 서열을 인코딩한다. 돌연변이는 CDR 내에, FR 내에 또는 불변 도메인 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 핵산을 사용하여, 인간 CD52에 대한 결합 특이성을 갖는 인간화 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 인간화 항체를 인코딩하는 핵산(예를 들어, DNA(예를 들어, cDNA) 또는 RNA) 또는 하나 이상의 핵산을 서열의 추가의 조작을 위해 또는 적절한 숙수 세포에서 인코딩된 항체의 생성을 위해 적절한 작제물(예를 들어, 재조합 벡터)에 혼입시킬 수 있다.
인간 CD52에 대한 결합 특이성을 갖는 인간화 항체의 발현에 적절한 작제물 또는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)도 또한 제공된다. 다양한 벡터가 이용가능하고, 숙주 세포에서 단일의 카피 또는 다중의 카피로 유지되거나 숙주 세포의 염색체(들) 내로 통합되게 되는 벡터를 포함한다. 작제물 또는 벡터는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있고, 본 발명의 인간화 항체를 발현하는 세포가 배양물 중 생성 및 유지될 수 있다. 단일 벡터 또는 다중 벡터는 인간 CD52에 대한 결합 특이성을 갖는 인간화 항체의 발현을 위해 사용될 수 있다.
적절한 발현 벡터, 예를 들어, 포유동물 세포 발현 벡터는 또한, 하기 중 하나 이상을 비제한적으로 포함하는 수많은 성분을 함유할 수 있다: 복제 원점; 선택가능한 마커 유전자; 하나 이상의 발현 조절 요소, 예를 들어, 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 종결자) 및/또는 하나 이상의 번역 신호; 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열. 작제물 또는 벡터에서, 신호 펩티드 서열은 작제물 또는 벡터 또는 다른 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 항체의 전사 및/또는 번역 신호를 사용하여, 발현을 유도할 수 있다.
프로모터는 적절한 숙주 세포에서의 발현을 위해 제공될 수 있다. 프로모터는 구성성 또는 유도성일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 인코딩된 폴리펩티드의 발현을 유도되도록 인간화 항체 또는 항체 쇄를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있다. 원핵(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)에 대한 lac, tac, T3, T7 프로모터) 및 진핵(예를 들어, 효모 알코올 데하이드로게나제(ADH1), SV40, CMV) 숙주에 대한 다양한 적절한 프로모터가 이용가능하다. 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 항-CD52 항체 또는 그의 부분을 발현시키기 위해 적절한 프로모터를 선택할 수 있을 것이다.
또한, 벡터(예를 들어, 발현 벡터)는 전형적으로 벡터를 지니는 숙주 세포의 선택을 위한 선택가능한 마커, 및 복제가능한 벡터의 경우에, 복제 원점을 포함한다. 항생제 또는 약물 내성을 부여하는 생성물을 인코딩하는 유전자는 통상의 선택가능한 마커이고 원핵(예를 들어, β-락타마제 유전자(앰피실린 내성), Tet 유전자(테트라사이클린 내성) 및 진핵 세포(예를 들어, 네오마이신(G418 또는 제네티신), gpt(마이코페놀산), 앰피실린, 또는 하이그로마이신 내성 유전자)에서 사용될 수 있다. 디하이드로폴레이트 환원효소 마커 유전자는 다양한 숙주에서 메토트렉세이트로의 선택을 가능하게 한다. 숙주의 영양요구성 마커의 유전자 생성물을 인코딩하는 유전자(예를 들어, LEU2, URA3, HIS3)는 종종 효모에서 선택가능한 마커로서 사용된다. 바이러스(예를 들어, 배큘로바이러스) 또는 파지 벡터, 및 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있는 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터의 이용도 또한 고려된다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 인간화 항체, 인간화 경쇄, 인간화 중쇄를 인코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 항체 및 그들의 쇄의 항원 결합 부분을 인코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드 서열은 상기 및 하기 실시예에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 또는 벡터는 본 발명의 중쇄(또는 그의 항원 결합 부분) 또는 경쇄(또는 그의 항원 결합 부분)를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 핵산 또는 벡터는 본 발명의 중쇄 및 경쇄(또는 그의 항원 결합 부분) 둘 모두를 인코딩한다. 중쇄 인코딩 핵산 및 경쇄 인코딩 핵산 둘 모두, 또는 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 인코딩하는 하나의 핵산을 함유하는 숙주 세포가 중쇄 및 경쇄(또는 항체의 항원-결합 부분)를 포함하는 항체를 만들기 위해 사용될 수 있다. 중쇄-인코딩 핵산 및 경쇄-인코딩 핵산은 개별 발현 벡터상에 배치될 수 있다. 또한, 그들은 동일한 또는 상이한 발현 조절하에 단일의 발현 벡터상에 배치될 수 있다. 예를 들어, Cabilly의 미국 특허 제6,331,415호; Fang의 미국 특허 제7,662,623호를 참조한다.
인간 CD52에 대한 특이성을 갖는 항체의 생성 방법
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 항-인간 CD52 항체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 적절한 숙주 세포에서 항체를 인코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산의 발현에 의해 생성될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 적절한 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 발현 작제물(예를 들어, 하나 이상의 벡터, 예를 들어, 포유동물 세포 발현 벡터)을 적절한 숙주 세포로 도입시킬 수 있고, 생성된 세포를 작제물(들) 또는 벡터(들)의 발현에 적절한 조건하에(예를 들어, 배양에서, 동물에서, 식물에서) 유지할 수 있다. 적절한 숙주 세포는 박테리아 세포, 예를 들어, 이. 콜라이(예를 들어, 균주 DH5α™(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen))), 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및/또는 다른 적절한 박테리아를 포함하는 원핵세포; 진핵 세포, 예를 들어, 진균 또는 효모 세포(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 아스페르길루스(Aspergillus) 종, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)), 또는 다른 하등 진핵 세포, 및 고등 진핵생물의 세포, 예를 들어 곤충(예를 들어, 드로소필라 스키니더(Drosophila Schnieder) S2 세포, Sf9 곤충 세포(WO 94/26087호(O'Connor)), TN5B1-4(HIGH 5) 곤충 세포(인비트로겐)), 포유동물(예를 들어, COS 세포, 예를 들어, COS-1(ATCC 수탁 번호 CRL-1650) 및 COS-7(ATCC 수탁 번호 CRL-1651), CHO(예를 들어, ATCC 수탁 번호 CRL-9096), CHO DG44(문헌[Urlaub, G. 및 Chasin, LA., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 77(7):4216-4220 (1980)]), 293(ATCC 수탁 번호 CRL-1573), HeLa(ATCC 수탁 번호 CCL-2), CV1(ATCC 수탁 번호 CCL-70), WOP(문헌[Dailey, L., et　al., J. Virol., 54:739-749 (1985)]), 3T3, 293T(문헌[Pear, W. S., et　al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)]), NS0 세포, SP2/0 세포, HuT 78 세포 등), 또는 식물(예를 들어, 담배, 좀개구리밥(lemna; 개구리밥(duckweed)), 및 조류(algae))로부터의 세포일 수 있다. (예를 들어, 문헌[Ausubel, F.M. et　al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates 및 John Wiley & Sons Inc. (1993)]을 참조한다). 일부 구현예에서, 숙주 세포는 다세포 유기체(예를 들어, 식물 또는 동물)의 일부가 아니고, 예를 들어, 그것은 단리된 숙주 세포이거나, 세포 배양물의 일부이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 핵산, 예를 들어, 벡터(예를 들어, 발현 벡터)를 포함하는 세포에 관한 것이다. 예를 들어, 인간 CD52에 대한 결합 특이성을 갖는 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산(즉, 하나 이상의 핵산) 또는 이러한 핵산(들)을 포함하는 작제물(즉, 하나 이상의 작제물, 예를 들어, 하나 이상의 벡터)은 선택된 숙주 세포에 적절한 방법(예를 들어, 형질전환, 트랜스펙션, 전기천공, 감염)에 의해 적절한 숙주 세포로 도입될 수 있으며, 핵산(들)은 하나 이상의 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결되어 있거나, 연결되게 된다(예를 들어, 벡터에서, 세포 내의 과정에 의해 생성되는 작제물에서, 숙주 세포 게놈으로 통합되어). 숙주 세포는 발현에 적절한 조건 하에(예를 들어, 유도인자(inducer), 적절한 염, 성장 인자, 항생제, 영양보조물 등이 보충된 적절한 배지의 존재하에) 유지될 수 있으며, 이에 의해, 인코딩된 폴리펩티드(들)가 생성된다. 필요에 따라, 인코딩된 단백질(예를 들어, 인간화 항체, 마우스 항체, 키메라 항체)은, 예를 들어, 숙주 세포, 배양 배지, 또는 밀크(milk)로부터 단리될 수 있다. 이 과정은 트랜스제닉 동물의 숙주 세포(예를 들어, 유선 세포) 또는 식물(예를 들어, 담배)에서 발현을 포함한다(예를 들어, WO 92/03918호 참조).
항체 부분(예를 들어, 항원-결합 단편; 항체 쇄)이 융합 단백질에 대하여 N-말단 위치, C-말단 위치 또는 내부에서 비-항체 모이어티(즉, 천연에서 관찰되는 항체에 존재하지 않는 모이어티)에 연결된 융합 단백질이 생성될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예는 항체 서열(들)을 인코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터, 예를 들어 pET 벡터(예를 들어, pET-15b, 노바젠(Novagen)), 파지 벡터(예를 들어, pCANTAB 5 E, 파마시아(Pharmacia)), 또는 다른 벡터(예를 들어, pRIT2T 단백질 A 융합 벡터, 파마시아)로 삽입함으로써 생성할 수 있다. 생성된 작제물을 발현에 적절한 숙주 세포로 도입할 수 있다. 발현 시에, 일부 융합 단백질을 적절한 친화성 매트릭스에 의해 세포 용해물로부터 단리 또는 정제할 수 있다(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., Eds., Vol. 2, Suppl. 26, pp. 16.4.1-16.7.8 (1991)] 참조).
본 발명은 본원에 제공된 항체(예를 들어, 항체, 경쇄 또는 중쇄, 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역)를 인코딩하는 재조합 핵산(들)을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항체 또는 그들의 쇄의 항원-결합 부분을 인코딩하는 재조합 핵산(들)을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 언급된 바와 같은 본 발명의 재조합 벡터(예를 들어, 발현 벡터, 포유동물 세포 발현 벡터)를 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항체 또는 항체 폴리펩티드 쇄의 제조 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 숙주 세포(예를 들어, 항체 또는 폴리펩티드 쇄(예를 들어, 본 발명의 경쇄 및 중쇄, 경쇄만, 또는 중쇄만)를 인코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산을 함유하는 숙주 세포)를 항체 또는 폴리펩티드 쇄의 발현에 적절한 조건하에 유지하는 단계를 포함한다. 예를 들어 숙주 세포는 기재상에 또는 현탁액 중에 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 항체 또는 폴리펩티드 쇄를 정제하거나 단리하는 단계를 더 포함한다.
선택은 제조처의 권고에 따라 DYNABEADS M-270 아민(다이날(Dynal))에 커플링된 CD52를 사용하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 비오틴화된 CD52를 사용하는 선택은 제조처의 지침에 따라 1차 아민 특이적 시약 석신이미딜-6-(비오틴아미도)헥사노에이트를 사용하여 이루어질 수 있다(EZ link NHS LC 비오틴, 피어스(Pierce)).
선택으로부터의 산출물은 CD52에 대한 결합을 위해 경쟁하는 scFv 또는 IgG의 능력을 측정하는 경쟁 검정을 기반으로 하는 고효율 스크린에서 주변세포질 제제로서 시험될 수 있다.
고효율 스크린에서 경쟁할 수 있는 시료를 문헌[Vaughan et　al. (1996)] 및 문헌[Osburn et　al. (1996)]에 기술된 바와 같은 DNA 시퀀싱으로 처리할 수 있다. 그 다음, 클론을 scFv 또는 IgG로서 발현 및 정제하고, 예를 들어, 검정, 예를 들어, 항체-의존성 세포 매개의 세포독성(ADCC) 검정 및 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정을 사용하여 CD52에 결합하거나, CD52를 중화시키거나, 또는 그들의 조합의 능력에 대해 평가할 것이다. 그 다음, 정제된 scFv 제제를 WO 01/66754호의 실시예 3에서 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 정제된 scFv 또는 IgG 제제의 단백질 농도는 BCA 방법(피어스)을 사용하여 결정될 수 있다. 유사한 접근법을 사용하여, 고정된 항체 중쇄 또는 경쇄(또는 VH 또는 VL)의 최적의 파트너(대응 사슬)를 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 항체는 정제된 형태 또는 단리된 형태(예를 들어, 그들의 기원이 되는 공급원(예를 들어, 세포의 상청액; 혼합물에서, 예를 들어, 라이브러리의 항체의 혼합물에서)의 분자(예를 들어, 펩티드)로부터 멀리 분리되어 있음)로 존재할 수 있으며, 본원에 기술된 방법 또는 기타 적절한 방법에 의해 수득되는 항체를 포함한다. 단리된 항체는 실질적으로 순수한(본질적으로 순수한) 항체 및 화학적 합성, 재조합 기술 및 그들의 조합에 의해 생성되는 항체를 포함한다.
독소 모이어티 또는 독소를 함유하는 항체
본 발명은 또한, 독소 모이어티 또는 독소를 포함하는 항체에 관한 것이다. 적절한 독소 모이어티는 독소(예를 들어, 표면 활성 독소, 세포독소)를 포함한다. 독소 모이어티 또는 독소는 임의의 적절한 방법을 사용하여 항체에 연결 또는 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 독소 모이어티 또는 독소는 직접적으로 또는 적절한 링커를 통해 항체에 공유 결합될 수 있다. 적절한 링커는 비절단가능한 또는 절단가능한 링커, 예를 들어, pH 절단가능한 링커 또는 세포 효소에 대한 절단 부위를 포함하는 링커를 포함할 수 있다. 이러한 절단가능한 링커는 항체가 내재화된 후, 독소 모이어티 또는 독소를 방출할 수 있는 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
독소 모이어티 또는 독소를 항체에 연결하거나 컨쥬게이트시키기 위한 다양한 방법이 사용될 수 있다. 선택된 특정 방법은 연결되거나 컨쥬게이트될 독소 모이어티 또는 독소 및 항체에 좌우될 것이다. 필요에 따라, 말단 작용기를 함유하는 링커를 사용하여 항체 및 독소 모이어티 또는 독소를 연결할 수 있다. 일반적으로, 컨쥬게이션은 반응성 작용기를 함유하는(또는 반응성 작용기를 함유하도록 변형된) 독소 모이어티 또는 독소를 링커와 또는 직접적으로 항체와 반응시켜서 달성된다. 공유 결합은 적절한 조건하에서 제2 화학 기와 반응할 수 있는 화학적 모이어티 또는 작용기를 함유하는(또는 함유하도록 변형된) 독소 모이어티 또는 독소를 반응시켜, 이에 의해 공유 결합을 형성함으로써 형성된다. 필요에 따라, 적절한 반응성 화학 기는 임의의 적절한 방법을 사용하여 항체에 또는 링커에 부가될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)] 참조). 많은 적절한 반응성 화학 기 조합은 당해 기술 분야에서 공지되어 있고, 예를 들어 아민기는 친전자성 기, 예를 들어, 토실레이트, 메실레이트, 할로, N-하이드록시석신이미딜 에스테르(NHS) 등과 반응할 수 있다. 티올은 말레이미드, 아이오도아세틸, 아크릴롤릴, 피리딜 디설피드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올(TNB-티올) 등과 반응할 수 있다. 알데히드 작용기는 아민- 또는 하이드라지드-함유 분자에 커플링될 수 있고, 아지드 기는 3가 인 기와 반응하여, 포스포르아미데이트 또는 포스포르이미드 결합을 형성할 수 있다. 활성화기를 분자로 도입하기 위한 적절한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)] 참조).
적절한 독소 모이어티 및 독소는, 예를 들어, 마이탄시노이드(maytansinoid), 탁산(taxane), 칼리케아마이신(calicheamicin), 듀오카르마이신(duocarmycin), 또는 그의 유도체를 포함한다. 마이탄시노이드는, 예를 들어, 마이탄시놀 또는 마이탄시놀 유사체일 수 있다. 마이탄시놀 유사체의 예는 변형된 방향족 고리를 갖는 것들 및 다른 위치에서 변형을 갖는 것들을 포함한다. 마이탄시놀 및 마이탄시놀 유사체는 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호 및 제6,333,410호에서 기재되어 있고, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 마이탄시놀은, 예를 들어, N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-석신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트(또는 SPP)로도 알려져 있음), 4-석신이미딜-옥시카보닐-a-(2-피리딜디티오)-톨루엔(SMPT), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트(SDPB), 2 이미노티올란, 또는 S-아세틸석신산 무수물을 사용하여 항체 및 항체 단편에 커플링될 수 있다. 탁산은, 예를 들어, 탁솔, 탁소테레, 또는 신규한 탁산일 수 있다(예를 들어, WO 01/38318호 참조). 칼리케아마이신은, 예를 들어, 브로모-복합체 칼리케아마이신, 아이오도-복합체 칼리케아마이신 또는 그의 유사체 및 모방체일 수 있다. 브로모-복합체 칼리케아마이신은 I1-BR, I2-BR, I3-BR, I4-BR, J1-BR, J2-BR 및 K1-BR을 포함한다. 아이오도-복합체 칼리케아마이신은 I1-I, I2-I, I3-I, J1-I, J2-I, L1-I 및 K1-BR을 포함한다. 칼리케아마이신 및 그의 돌연변이체, 유사체 및 모방체는, 예를 들어, 미국 특허 제4,970,198호, 제5,264,586호, 제5,550,246호, 제5,712,374호 및 제5,714,586호에 기재되어 있고, 그의 각각의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 듀오카르마이신 유사체는 예를 들어, 그의 각각의 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,070,092호, 제5,187,186호, 제5,641,780호, 제5,641,780호, 제4,923,990호 및 제5,101,038호에 기술되어 있다.
다른 독소의 예는 항대사물질, 알킬화제, 안트라사이클린, 항생제 및 항유사분열제(anti-mitotic agent)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 독소는 또한, 표면 활성 독소, 예를 들어 유리 라디칼 생성기, 또는 방사성핵종 함유 모이어티인 독소일 수 있다. 독소는 예를 들어, 박테리아 공급원으로부터의 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드, 또는 식물 단백질일 수 있다.
특정 표적 단백질의 생성을 담당하는 mRNA에 결합하거나, 그를 무능화시키거나, 그의 분해를 촉진시키거나, 그의 생성을 방지하도록 설계된 핵산의 안티센스 화합물도 또한 독소로 사용될 수 있다. 안티센스 화합물은 안티센스 RNA 또는 DNA, 단일 또는 이중 가닥, 올리고뉴클레오티드, 또는 그들의 유사체를 포함하고, 이는 개별 mRNA 종에 특이적으로 혼성화하고, mRNA 종의 전사 및/또는 RNA 프로세싱 및/또는 인코딩된 폴리펩티드의 번역을 방지하고, 이에 의해, 각각의 인코딩된 폴리펩티드의 양의 감소를 달성할 수 있다. 문헌[Ching, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10006-10010 (1989)]; 문헌[Broder, et al., Ann. Int. Med. 113: 604-618 (1990)]; 문헌[Loreau, et al., FEBS Letters 274:53-56 (1990)].
독소는 또한 광활성제일 수 있다. 적절한 광활성제는 포르피린(porphyrin)계 물질, 예를 들어 포르파이머(porfimer) 나트륨, 그린(green) 포르피린, 클로린(chlorin) E6, 헤마토포르피린 유도체 자체, 프탈로시아닌(phthalocyanine), 에티오퓨르퓨린(etiopurpurin), 텍사프린(texaphrin) 등을 포함한다.
독소는 세포내 표적에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 이러한 항체 또는 항체 단편은 정의된 하위세포 구획 또는 표적으로 지향될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
약제학적 조성물은 치료적 유효량의 하나 이상의 항체 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어, 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 그들의 조합을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 융합 단백질의 보관 기간 또는 유효성을 향상시키는 미량의 보조 물질, 예를 들어, 습윤화제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제를 더 포함할 수 있다. 조성물은 투여 후에 활성 성분(들)의 속방출, 지속 방출 또는 지연 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다. 적절한 약제학적 조성물 및 그들의 제조 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Remington (2005), The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, et al., eds., 21st ed., Mack Publishing Co]을 참조한다. 약제학적 조성물은 면역억제/면역조절 및/또는 항-염증제를 더 포함할 수 있다. 면역 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서의 면역 질환의 치료 방법은 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. CD40-매개의 T 세포 활성화의 길항에 의해, 예를 들어, 자가면역, 이식 거부 또는 알러지 반응 동안 발생하는 요망되지 않는 T 세포 반응을 억제할 수 있었다. CD40-매개의 T 세포 활성화의 억제에 의해 이들 질환의 진행 및/또는 중증도를 완화시킬 수 있었다.
본원에 사용되는 바와 같은 "환자"는 동물, 예를 들어, 인간을 포함하는 포유동물을 의미한다. 환자는 면역 질환 또는 암으로 진단될 수 있다. "치료" 또는 "치료한다" 또는 "치료하는"은 징후(symptom), 장애(disorder), 증상 또는 질환의 진행 또는 중증도를 완화시키는 것을 포함하는 과정을 말한다. "면역 질환"은 세포성 및/또는 체액성 면역 반응을 포함하는 개체에서의 면역 반응의 발생과 관련된 임의의 질환을 말한다. 면역 질환의 예는 염증, 알러지, 자가면역 질환 또는 이식-관련 질환을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 자가면역 질환은 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 당뇨병, 건선, 피부경화증, 죽상동맥경화증, 염증성 장 질환 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 항체는 면역억제 및 면역제거(immuno-ablation)에서 유용하다. 항체는 표적 CD52-발현 세포(예를 들어, T 및 B 세포)를 표적으로 하고 CD52-발현 세포의 집단의 감소(또는 본원에 사용된 바와 같이, "고갈")를 필요로 하는 대상체에서 CD52-발현 세포의 집단을 감소(또는 본원에 사용된 바와 같이, "고갈")시킨다. 림프구 고갈은 다양한 질환 및 증상, 예를 들어 염증, 자가면역 질환 및 암(예를 들어, 림프구(B 또는 T 세포) 악성종양)을 치료하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Reiff, A., Hematology, 10(2):79-93 (2005)]을 참조한다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 부분으로 치료될 수 있는 질환 및 증상의 예는 비제한적으로 다발성 경화증, 낭창, 류마티스 관절염, 이식편대 숙주병(GVHD), 염증성 장 질환, 맥관염, 베체트병, 베게너(Wegener) 육아종증, 쇼그렌 증후군, 포도막염, 건선, 경피증, 다발성근염, I형(자가면역 기반) 당뇨병, 자가면역 혈구감소증(예를 들어, 자가면역 호중구감소증, 수혈 의존 불응성 PRCA, 백혈병 및 림프종, 예를 들어 거대 질환(bulky disease)을 갖는 비호지킨 림프종 및 B-세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 포함한다. 항체는 또한, 염증의 발병 또는 자가면역 질환 또는 암의 재발을 예방하기 위해서 예방적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 이식(예를 들어, 줄기 세포 이식, 동종이계 T 세포의 자가 주입, 또는 고형 기관 이식)을 위해 환자를 준비시키기 위해 컨디셔닝 섭생법의 일부로서 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 및 항원-결합 부분은 면역 질환 또는 암의 치료용 약제를 제조하기 위해 사용된다.
임의의 적절한 방법 또는 경로를 사용하여 항체 폴리펩티드 또는 약제학적 조성물을 투여할 수 있다. 투여 경로는 치료할 질환 또는 증상에 따라, 예를 들어, 비경구(예를 들어, 정맥내, 동맥내, 근육내, 척수강내, 복강내, 피하 주사), 경구(예를 들어, 식이), 국부, 국소, 흡입(예를 들어, 기관지내, 비강내 또는 경구 흡입, 비강내 점적액), 또는 직장을 포함한다. 투여되는 항체 폴리펩티드(들)의 치료적 유효 용량은 예를 들어, 치료할 면역 질환의 유형 및 중증도, 병용 요법의 이용, 항체 폴리펩티드(들) 또는 약제학적 조성물의 투여 경로 및 환자의 체중을 포함하는 수많은 인자에 좌우된다. 항체의 치료적 유효량에 대한 비제한적인 범위는 환자의 체중에 상대적으로 0.1 내지 20 ㎎/㎏, 일 양태에서는 1 내지 10 ㎎/㎏이다. 항체 폴리펩티드(들)의 용량은 시험관내 및/또는 생체내 병태 모델에서 CD52 길항작용에 필요한 항체 폴리펩티드(들)의 양에 의해 유도될 수 있다.
본 발명의 항체는 건강 관리 제공자에 의해 적절한 것으로 여겨지는 임의의 시점에 단일의 단위 용량 또는 다중의 용량으로 투여될 수 있다. 투여향은 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 결정될 수 있으며, 예를 들어, 개체의 연령, 감수성, 용인성 및 전반적 웰-빙(well-being)에 좌우될 수 있다. 항체 또는 부분은 수시간의 기간, 예를 들어, 3, 4, 5 또는 6시간에 걸쳐 주입으로 투여될 수 있다. 항체 또는 부분은 적절한 다양한 섭생법으로, 예를 들어, 3개월 이상, 예를 들어, 12개월 또는 24개월로 분리된 1회 이상의 주기로, 연속 2, 3, 4, 5 또는 6일 투여될 수 있다. 임의의 주기에 투여되는 항-CD52 항체의 총 용량은 10 내지 60 ㎎일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 부분을 캠패스-1H®와 동일한 투여 섭생법을 사용하여 환자에게 투여한다.
본 발명의 항체를 단독으로 또는 병용 요법에서 다른 작용제(예를 들어, 면역억제제)와 함께 개체(예를 들어, 환자)에게 투여할 수 있다. 항체를 추가의 작용제의 투여 전에, 그에 함께 또는 그 이후에 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 작용제는 예를 들어, 항-염증 화합물, 예를 들어, 설파살라진, 다른 비-스테로이드성 항-염증 화합물 또는 스테로이드성 항-염증 화합물이다. 일부 구현예에서, 추가의 작용제는 다른 림프-고갈 항체, 예를 들어, 다른 항-CD52 항체, 항-CD20 항체, 항-BAFF 항체, 항-BAFF-R 항체 등이다. 일부 구현예에서, 추가의 작용제는 예를 들어, 사이토카인(예를 들어, IL-7), 항-사이토카인 수용체 항체 또는 항-CD52 항체에 의해 매개되는 림프고갈 후에 발생하는 재구성 과정을 왜곡하고/거나, 조작하고/거나 보강하는 용해성 수용체이다(예를 들어, 문헌[Sportes et al., "Cytokine Therapies: Ann. N.Y. Acad. Sci. 1182:28-38 (2009)] 참조). 다른 구현예에서, 합성 펩티드 모방체는 본 발명의 항체와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 항체가 CD52-발현 세포를 표적으로 하기 때문에, T 세포 및 B 세포 이외의 CD52+ 세포 유형을 고갈시키기 위해서도 항체를 이용할 수 있다. 예를 들어, 연구에 의해, 맥관의 백혈구(VLC) 및 Tie2+ 단핵구--높은 수준의 CD52를 발현하는 골수 세포--가 종양 혈관신생을 촉진시키고, 항-VEGF 요법에 대한 종양 내성에 기여하는 것이 나타났다. 문헌[Pulaski et al., J. Translational Med . 7:49 (2009)]. 이에 따라, 본 발명의 항-CD52 항체를 사용하여 VLC 및 Tie2+ 단핵구를 표적으로 함으로써 종양 혈관신생을 억제할 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 항-CD52 항체를 전신으로 또는 신혈관형성의 부위, 예를 들어, 종양 부위에 국부로 투여할 수 있다. 항-CD52 항체 요법은 진료 표준 암 치료, 예를 들어, 화학요법, 수술, 또는 방사선, 또는 다른 표적화된 요법, 예를 들어, 항-VEGF 항체 요법과 함께 사용될 수 있다. 항-CD52 항체 요법은, 예를 들어, 유방암, 폐암, 신경교종, 대장암, 및 항-VEGF 항체의 임의의 다른 적응증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 항-CD52 항체 요법은 또한, 비-종양 신생혈관 증상을 포함하는 다른 신생혈관 증상에서 사용될 수 있다.
연구는, 알렘투주맙에 의한 림프구 고갈이 호중구 및 NK 세포에 의해 매개된다는 것을 보여주었다(문헌[Hu et　al., Immunology 128:260-270 (2009)]). 따라서, 병용 요법의 구현예에서, 호중구 및 NK 세포를 자극하는 작용제는 항체 요법을 보강하기 위해 항-CD52 항체 요법 이전에, 그 동안에 또는 그 이후에 환자에게 투여될 수 있다. 호중구 및/또는 NK 세포를 자극하는 것은 비제한적으로 (1) 그들의 분열 속도를 증가시키는 것, (2) 항-CD52 항체의 아이소타입에 상응하는 Fc 수용체(예를 들어, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb, FcγRII, FcγRI 및 FcαRI)의 세포 표면 발현을 증가시키는 것, (3) 순환 세포를 동원하고, 그의 수를 증가시키는 것, (4) 세포를 표적 부위(예를 들어, 종양, 염증 또는 조직 손상의 부위)에 동원하는 것, 및 (5) 그들의 세포독성 활성을 증가시키는 것을 포함한다. 호중구 및/또는 NK 세포를 자극하는 작용제의 예는 예를 들어 과립구 단핵구 콜로니 자극 인자(GM-CSF)(예를 들어, LEUKINE® 또는 사그라모스팀(sargramostim) 및 몰그라모스팀(molgramostim)); 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)(예를 들어, NEUPOGEN® 또는 필그라스팀(filgrastim), PEG화된 필그라스팀, 및 레노그라스팀(lenograstim)); 인터페론 감마(예를 들어, ACTIMMUNE®); CXC 케모카인 수용체 4(CXCR4) 길항제(예를 들어, MOZOBIL™ 또는 플레릭사포르(plerixafor)); 및 CXC 케모카인 수용체 2(CXCR2) 효능제를 포함한다. 환자의 호중구 계수는 최적 치료 효능을 보장하기 위해 주기적으로 모니터링할 수 있다. 환자의 호중구 계수는 또한, 항-CD52 항체 치료의 개시 전에 측정할 수 있다. 자극제의 양을 환자의 호중구 계수를 기준으로 조정할 수 있다. 환자가 정상 호중구 계수보다 더 낮은 계수를 갖는 경우 보다 높은 용량의 자극제를 사용할 수 있다. 항-CD52 항체로의 치료에 의해 야기될 수 있는 호중구감소증의 기간 동안에, 보다 높은 용량의 호중구 자극제를 투여하여, 항-CD52 항체의 효과를 최대화시킬 수도 있다.
호중구 및/또는 NK 자극이 항-CD52 항체 요법의 효능을 개선시키기 때문에, 이러한 병용 요법의 구현예는, 환자에서 유사한 치료 효능을 유지하면서 보다 적은 항체를 사용하게 할 수 있다. 치료 효능을 유지하면서 보다 적은 항-CD52 항체를 사용하는 것은 투여된 항체에 대한 환자의 면역 반응뿐만 아니라 2차 자가면역(항-CD52 항체 치료 동안에 또는 그 이후에 일어나는 자가면역)의 발생을 포함하는 항-CD52 항체의 부작용을 감소시키는데 도움을 줄 수 있다. 이러한 병용 요법의 구현예는 또한, 예를 들어, 환자가 호중구감소증을 갖는 경우, 종양학 환경에서 유용하다.
병용 요법의 다른 구현예에서, 항-CD52 항체 요법을 보강하기 위해 조절 T 세포의 자극제를 사용할 수 있다. 항-CD52 항체가 다른 CD4+ T 세포와 비교하여 훨씬 적은 정도로 CD4+ CD25+ FoxP3+ 조절 T 세포를 고갈시키는 것으로 나타났다. 조절 T 세포("Treg" 또는 억제자 T 세포로도 알려져 있음)는 접촉-의존적 또는 접촉-독립적(예를 들어, 사이토카인 생성) 메카니즘을 통해 다른 림프 세포의 증식 및/또는 기능을 억제할 수 있는 세포이다. γδ T 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 및 이중 음성 CD4- CD8- T 세포를 포함하는 조절 T 세포의 몇몇의 유형이 설명되었다. 예를 들어, 문헌[Bach et　al., Immunol. 3:189-98 (2003)]을 참조한다. CD4+ CD25+ FoxP3+ 조절 T 세포는 "천연 발생" 조절 T 세포로 지칭되며; 그들은 CD4, CD25 및 포크헤드 패밀리(forkhead family) 전사 인자 FoxP3(포크헤드 박스 p3)을 발현한다. 따라서, 이러한 병용 요법의 구현예에서, 림프 고갈 이후의 면역계의 조성을 왜곡하기 위해 항-CD52 항체 요법 이전에, 그 동안에 또는 그 이후에 CD4+ CD25+ FoxP3+ 조절 T 세포를 자극하는 작용제를 투여할 수 있다. 상기 작용제는 예를 들어, 그들 T 세포를 활성화시키고/거나, 세포의 집단을 안정화시키고/거나 증량시키고/거나, 세포를 동원하고, 그의 순환을 증가시키고/거나, 세포를 표적 부위에 동원할 수 있다. 이러한 작용제의 예는 라파마이신, 활성 또는 잠재성 TGF-β(예를 들어, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 및 TGF-β5), IL-10, IL-4, IFN-α, 비타민 D(예를 들어, 비타민 D3), 덱사메타손, 및 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)이다(예를 들어, 문헌[Barrat et al., J. Exp. Med. 195:603-616 (2002)]; 문헌[Gregori et al., J Immunol. 167: 1945-1953 (2001)]; 문헌[Battaglia et al., Blood 105:4743-4748 (2005)]; 문헌[Battaglia et al., J. Immunol. 177:8338-8347 (2006)] 참조).
본 발명에서, 질환을 치료하기 위한 항-CD52 항체의 유효량은 하나 이상의 요망되는 임상적 종점에 치료되는 대상체가 도달하도록 도움을 주는 양이다. 예를 들어, 낭창에 있어서(그의 소견(manifestation)은 전신 홍반성 낭창, 낭창성 신장염, 피부 홍반성 낭창, CNS 낭창, 심장혈관 소견, 폐 소견, 간 소견, 혈액학 소견, 위장 소견, 근골격 소견, 신생아 홍반성 낭창, 소아 전신 홍반성 낭창, 약물 유도된 홍반성 낭창, 항-인지질 증후군, 및 낭창 소견을 야기하는 보체 결손 증후군을 포함하며; 예를 들어, 문헌[Robert G. Lahita, Editor, Systemic Lupus Erythematosus, 4th Ed., Elsevier Academic Press, 2004] 참조), 임상적 종점은 병 걸린 기관계(예를 들어, 낭창성 신장염에 대한 혈뇨 및/또는 단백뇨)를 모니터링하고/거나 몇몇의 기관계에 걸쳐 질환 중증도의 복합 점수를 제공하는 질환 활성 지수를 사용하여 측정될 수 있다(예를 들어, BILAG, SLAM, SLEDAI, ECLAM). 예를 들어, 문헌[Mandl et al., "Monitoring patients with systemic lupus erythematosus" in Systemic Lupus Erythematosus, 4th edition, pp. 619-631, R. G. Lahita, Editor, Elsevier Academic Press, (2004)]을 참조한다.
본 발명의 항체 또는 그의 부분은 캠패스-1H®로 이전에 처치된 적이 있고, 캠패스-1H®에 대한 중화 항체가 발생한 개체(예를 들어, 캠패스-1H® 불응성 개체)를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 캠패스-1H®로(예를 들어, 캠패스-1H® 치료의 하나 이상의 과정으로) 이전에 처치된 적이 있고, 추가의 캠패스-1H® 치료의 효능을 감소시키는 캠패스-1H®에 대한 중화 항체가 발생한, 자가면역 질환(예를 들어, 다발성 경화증, 낭창, 맥관염) 및/또는 암(예를 들어, 백혈병(예를 들어, 만성 림프구성 백혈병), 림프종(예를 들어, 비호지킨 림프종))을 갖는 개체를 치료할 수 있었다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 다른 인간화 항체 중의 하나를 사용하여 본원에 기재된 특정 인간화 항체로의 치료에 불응성이 된 개체를 치료할 수 있었다.
예를 들어, 본 발명의 항체 또는 부분은 다발성 경화증(MS)을 치료하기에 유용한 치료제이다. MS는 재발-완화형, 이차 진행성, 일차 진행성, 및 진행성 재발형 다발성 경화증을 포함하며(문헌(Lublin et　al., Neurology 46 (4), 907-11 (1996))), 예를 들어, 시험, 예를 들어 자기 공명 영상화(MRI), 스파이널 탭(spinal tap), 유발 전위 시험, 및 혈액 시료의 실험실 분석의 도움으로, 징후 및 신경 검사의 이력에 의해 진단된다. MS에서, 치료 목표는 재발의 위험, 빈도 및/또는 중증도를 감소시키고, 질환 진행에서 일어나는 장애를 방지하거나 감소시키고, 조직 회복을 촉진시키는 것이다. 따라서, 이들 목표 중 하나 이상과 일치하는 임상적 종점을 달성하는데 도움이 되는 항-CD52 항체의 양은 치료를 위한 항체의 유효량이다. 예를 들어, 본 발명의 항-CD52 항체 또는 부분은 재발형의 MS를 치료하여, 신체 장애의 축적을 늦추거나 역행시키고 임상적 악화의 빈도를 감소시키기 위해 권고될 수 있다. 항체 또는 부분을 임상 시험에서, 재발의 위험 및 임상적으로 유의미한 장애의 진행에 대한 위험의 감소에서의 그의 효능에 대하여 시험할 수 있다. 항체 또는 부분은 활성 재발을 갖거나, 재발이 발생할 위험이 있는 환자에게 또는 진행성 악화를 경험하는 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 개시내용이 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 제2008/0267954호를 참조한다.
본 발명의 방법 및 조성물은 이전의 MS-변형 요법에 대하여 준최적의 반응을 가졌던 MS 환자를 치료하는데 유용하다. MS 환자는 이전에 MS-변형 요법, 예를 들어, 인터페론 베타-1a(예를 들어, 아보넥스(AVONEX)® 및 레비프(REBIF)®), 인터페론 베타-1b(예를 들어, 베타세론(BETASERON)® 및 엑스타비아(EXTAVIA)®), 글라티라머 아세테이트(예를 들어, 코팍손(COPAXONE)®), 미톡산트론(예를 들어, 노반트론(NOVANTRONE)®), 나탈리주맙(예를 들어, 타이사브리(TYSABRI)®), 핀골리모드(예를 들어, 질렌야(GILENYA)®) 및 테리플루노미드(예를 들어, 오바지오(AUBAGIO)™)를 이전에 제공받았던 재발-완화형(RRMS) 환자일 수 있다. 일 구현예에서, 이전의 MS-변형 요법은 알렘투주맙(예를 들어, 캠패스, 맙캠패스 또는 렘트라다(LEMTRADA)™) 또는 다른 항-CD52 항체가 아니다. 이전에 치료된 환자는 치료되는 중에 또는 치료된 직후에(예를 들어, 1년 이내) MS 재발 또는 재개된 MS 활성을 가질 수 있다. 재개된 MS 활성은 MS에 기인하는 신규한 또는 악화되는 신경 징후, 환자의 EDSS 점수(문헌[Kurtzke, Neurology 1983; 33:1444-52])의 증가, 환자의 다발성 경화증 기능성 복합(MSFC) 점수(문헌[Cutter et al., Brain 1999; 122 (Pt5):871-82])의 감소, 신규한 또는 확대된 두개 또는 척수 병변, 뇌 체적 소실 및/또는 광 간섭 단층촬영기술(OCT)에 의해 결정되는 신경퇴화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 환자는 인터페론 베타 또는 글라티라머로 처치되는 동안 적어도 1회의 이전의 재발을 가졌을 수 있다. 또한, 환자는 하기의 특징 중 적어도 하나를 가질 수 있다: 제1 사이클의 항-CD52 항체 치료의 개시 전 10년 이하의 징후의 발병; 제1 사이클의 항-CD52 항체 치료의 개시 전 2년 내에 적어도 2회의 발병; 적어도 6개월의 치료 후에 인터페론 베타 또는 글라티라머에 있는 동안 적어도 1회의 재발; 5.0 이하의 확장 장애 상태 척도(EDSS) 점수; 및 두개 및 척수 자기 공명 영상화(MRI) 이상.
일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 부분을 제1 사이클의 항체에 이어서 적어도 하나의 추가의 사이클의 항체의 투여를 포함하는 섭생법에서 자가면역 질환(예를 들어, 다발성 경화증(MS))을 갖는 MS 환자에게 투여하며, 여기서, 각 치료 사이클은 연속하는 날에 적용되는 1 내지 5회의 용량을 포함하며, 각 치료 사이클은 다음날로부터 적어도 1 내지 24개월(예를 들어, 12개월)만큼 분리된다. 예를 들어, 일 구현예에서, 다발성 경화증을 갖는 환자는 1일 5회 용량의 항체를 포함하는 제1 사이클의 항체로 치료된 다음, 제1 사이클 1년 후에 발생하며, 연속하는 날에 적용되는 3회 용량의 항체를 포함하는 적어도 하나의 추가의 사이클의 항체로 치료된다. 일 구현예에서, 항-CD52 항체를 제1 치료 사이클에서 5일 연속, 12 ㎎/일로, 다발성 경화증을 갖는 환자에게 투여하며, 1년 후에, 제2 치료 사이클에서 항-CD52 항체를 12 ㎎/일로 3일 연속 환자에게 투여한다. 일 구현예에서, 항-CD52 항체를 제1 치료 사이클에서 연속 5일에 걸쳐 60 ㎎의 총 용량으로 다발성 경화증을 갖는 환자에게 투여하고; 1년 후에, 제2 치료 사이클에서 항-CD52 항체를 연속 3일에 걸쳐 36 ㎎의 총 용량으로 환자에게 투여한다.
본 발명의 방법 및 조성물에서, "년"은 정확하게 365일 또는 12개월과 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 제2 사이클의 항-CD52 항체를 제1 사이클의 항-CD52 항체를 투여하고 정확하게 365일 또는 12개월 후에 투여할 필요는 없다. 제2 사이클은 제1 사이클의 개시 후 365일 ± 최대 6개월, ± 최대 5개월, ± 최대 4개월, ± 최대 3개월, ± 최대 2개월, ± 최대 1개월, ± 최대 4주, ± 최대 3주, ± 최대 2주 또는 ± 최대 1주에 개시될 수 있다.
다른 구현예에서, MS를 갖는 환자는, 재개된 MS 활성의 증거가 일단 관찰되면 단지 재치료된다(예를 들어, WO 2008/031626호 참조; 그의 개시내용은 그들 전문이 참조로 본원에 포함됨). 일부 구현예에서, 더욱 진행된 형태의 MS 또는 더 진행된 형태의 다른 자가면역 질환(예컨대, 맥관염; 예를 들어, 문헌[Walsh et　al., Ann Rheum Dis 67:1322-1327 (2008)] 참조)을 갖는 환자가 치료의 마지막 과정 후에 조기에 재발을 경험하거나, 재개된 MS 활성을 보인다면, 더 빈번한 치료 과정(예를 들어, 4개월마다, 6개월마다)을 실행하는 것이 필요할 수 있다. 재개된 MS 활성의 증거는 이러한 임상의가 이용할 수 있는 임의의 수단을 사용하여 치료하는 임상의의 전문적인 판단을 기반으로 측정될 수 있다. 다양한 기술은, 비제한적으로, 임상 수단(신경 장애의 재발 또는 진행) 또는 뇌 또는 척수의 자기 공명 영상화(MRI)에 의한 것을 포함하여, 재개된 MS 활성을 진단하기 위해 임상의가 현재 이용가능하다. 개업의에 의해 이해되는 바와 같이, MRI를 통해 검출된 질환 활성은 T1(강화된 또는 비-강화된)- 또는 T2-가중 이미지상의 신규 뇌 또는 척수 병변의 발생에 의해 또는 이러한 병변의 부피의 증가에 의해 나타날 수 있다.
MS에 대한 진단 방법은 계속해서 발달하기 때문에, 재개된 MS 활성을 검출할 장래의 추가 방법(예를 들어, 자화전이율 또는 MR-분광법)이 존재할 수 있는 것으로 예상된다. 재개된 MS 활성을 검출하기 위해 사용된 특정 진단 방법은 청구된 발명의 제한은 아니다. 특정 구현예에서, 반복 MRI는 임의의 소정의 환자의 재치료가 필요한지 여부 및 이러한 환자의 재치료를 위한 최적의 시점을 결정하기 위해 치료 사이클 후의 고정 간격으로 수행된다. 일반적으로, 재치료는 임상적으로 질환이 재발현하기 전에 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법 및 조성물을 다른 MS-변형 요법과 병용하여 사용할 수 있다. MS-변형 요법의 비제한적인 예는 인터페론 베타-1a(예를 들어, 아보넥스® 및 레비프®), 인터페론 베타-1b(예를 들어, 베타세론® 및 엑스타비아®), 글라티라머 아세테이트(예를 들어, 코팍손®), 미톡산트론(예를 들어, 노반트론®), 나탈리주맙(예를 들어, 타이사브리®), 핀골리모드(예를 들어, 질렌야®) 및 테리플루노미드(예를 들어, 오바지오®)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 일반화된 또는 비특이적인 치료 또는 요법, 예를 들어, 스테로이드(예를 들어, 코르티코스테로이드) 또는 달팜프리딘(예를 들어, 암피라(AMPYRA)®)과 병용하여 사용될 수 있다.
일 양태에서, 주입-관련 부작용을 관리하기에 유효한 것으로 당업자에게 알려져 있는 약물은 항-CD52 항체의 주입 이전에, 그 동안에 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 이러한 약물은 코르티코스테로이드(예를 들어, 메틸프레드니솔론), 아세트아미노펜 및 항히스타민(예를 들어, 디펜하이드라민)을 포함한다. 일부 구현예에서, 환자에는 본 발명의 항체를 사용한 치료의 사이클 동안 연속 1, 2, 3, 4 또는 5일에 1 g/일의 정맥내 메틸프레드니솔론을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 환자는 또한, 헤르페스에 대한 예방으로 소용되는 약물을 제공받을 수 있다. 예를 들어, 환자는 본 발명의 항체의 투여 동안, 그리고 그 후 28일 동안 1일 2회 200 ㎎의 아시클로버(acyclovir)(예를 들어, 조비락스(ZOVIRAX)®)를 제공받을 수 있다.
제형은 선택된 투여 경로에 따라 변할 것이다(예를 들어, 용액, 에멀젼). 투여될 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 적절한 조성물을 생리적으로 허용되는 비히클 또는 담체 중에서 제조할 수 있다. 조성물은 다중의 용량을 포함하거나 단일의 단위 용량 조성물일 수 있다. 용액 또는 에멀젼에 대해, 적절한 담체는 예를 들어, 염수 및 완충 매질을 포함하는, 수성 또는 알코올/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링커(Ringer) 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화된 링거 또는 고정 오일을 포함할 수 있다. 정맥내 비히클은 다양한 첨가제, 보존제, 또는 유체, 영양물 또는 전해질 보충물을 포함할 수 있다(일반적으로, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th, Mack Publishing Co., PA, 1985] 참조). 흡입을 위해, 화합물을 가용화시킬 수 있고, 투여를 위해 적절한 디스펜서(예를 들어, 아토마이저, 네뷸라이저(nebulizer) 또는 가압 에어로졸 디스펜서)에 로딩할 수 있다.
진단 방법 및 조성물
본 발명의 항체는 또한, 조사 및 진단에서의 응용과 함께 다양한 과정에 유용하다. 예를 들어, 상기 항체는 (예를 들어, 현탁액 중 예를 들어, 세포, 예를 들어 림프구에 대해 친화성 정제 또는 다른 적당한 방법, 예를 들어 유세포 분석에 의해) 인간 CD52 또는 그의 변이체를 검출, 단리 및/또는 정제하고, 인간 CD52 구조(예를 들어, 입체형태) 및 기능을 연구하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 시험관내 응용에 유용할 것이다.
본 발명의 항체는 진단 응용(예를 들어, 시험관내, 생체외)에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 인간화 항체는 (예를 들어, 조직 또는 체액, 예를 들어, 인간 CD52를 갖는 염증 삼출물, 혈액, 혈청, 장액, 조직 중 인간 CD52를 발현하는 세포 상에서) 시료 중 인간 CD52의 수준을 검출 및/또는 측정하기 위해 사용될 수 있다. 시료(예를 들어, 조직 및/또는 체액)는 개체로부터 얻을 수 있고, 본원에 기재된 항체는 방법, 예를 들어 유세포 분석(예를 들어, 현탁액 중 세포, 예를 들어 림프구에 대해), 화학발광 검정, 방사성면역검정, 및 면역조직학을 포함하는 효소 연결된 면역흡착 검정(ELISA)을 포함하는, 인간 CD52 발현을 검출 및/또는 측정하기 위한 적절한 면역학적 방법에서 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 인간 CD52로의 항체의 특이적 결합에 적절한 조건하에서 시료를 본 발명의 항체과 접촉시키는 단계, 및 형성된 항체-CD52 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 시료 중 인간 CD52의 검출 방법이 제공된다. 방법의 응용에서, 본원에 기재된 항체는, 예를 들어, 염증성 장질환(IBD), 자가면역 질환(예를 들어, 다발성 경화증 및 낭창), 암(예를 들어, 비호지킨 림프종 및 만성 림프구성 백혈병), 또는 다른 증상 및 (예를 들어, 병이 난 조직 중) 인간 CD52의 증가된 발현 간의 관련성을 검출하기 위해 인간 CD52 반응성 및/또는 발현(예를 들어, 면역조직학적으로)에 대해 정상 대 염증 조직(예를 들어, 인간으로부터)을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는, 질환의 존재, 질환 진행 및/또는 질환 예를 들어, 염증 질환의 치료에서의 항-인간 CD52 요법의 효능이 평가될 수 있는 정상 및 염증 조직 중 인간 CD52의 존재의 면역학적 평가 방법을 가능하게 한다.
또한, 항체는, 고갈이 얼마나 효과적인지를 평가하기 위해서뿐만 아니라 CD52의 발현에서 임의의 하향 조절이 존재하는지를 측정하기 위해 고갈성 항-CD52 치료 항체로 치료한 후에 조직을 시험하기 위해 사용될 수 있다(문헌[Rawstrom et al., Br. J. Heam., 107:148-153 (1999)]).
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예시적인 방법 및 물질은 이하에 기술되지만, 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있다. 본 명세서에 언급된 모든 공보 및 그 밖의 다른 참고문헌은 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우에는 정의를 포함하는 본 명세서가 좌우할 것이다. 다수의 문헌이 본 명세서에 인용되어 있지만, 이 인용은 이들 문헌 중의 임의의 것이 본 기술분야에서의 일반적인 상식의 일부분을 형성한다는 것을 인정하는 것은 아니다. 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐서, 단어 "포함한다(comprise)", 또는 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변이형은 언급된 정수 또는 정수의 그룹을 포함하지만 어떤 다른 정수 또는 정수의 그룹을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다.
하기의 실시예는 본 발명의 방법 및 물질을 예시하고자 한다. 당업자에게 명백한 해당 분야에서 보통 접하는 기술된 조건 및 파라미터의 적절한 변형 및 조정은 본 발명의 목적과 범주 내에 있다. 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에 상호교환가능하게 사용된다. 또한, 용어 "항원-결합 단편" 및 "항원-결합 부분"은 본원에 상호교환가능하게 사용된다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 방법 및 물질을 예시하고자 한다. 당업자에게 명백한 해당 분야에서 보통 접하는 기술된 조건 및 파라미터의 적절한 변형 및 조정은 본 발명의 목적과 범주 내에 있다.
실시예 1: 항체 Ab1의 발현 및 특성화
Ab26의 경쇄 내의 잔기 33(L-CDR1 내)을 Asp로 변경시킴으로써, 항체 Ab1을 Ab26으로부터 유도하였다. 또한, Ab26의 경쇄의 처음 33개 아미노산 잔기가 결실된 변이체 항체를 생성하였다(Del33 항체). 변이체 경쇄 DNA를 경쇄 백본에서 DNA2.0에 의해, pDONR221 엔트리(Entry) 벡터에서 합성하고, 게이트웨이(Gateway) 클로닝에 의해 HEK293 발현 벡터 pCEP4(-E+I)Dest로 서브클로닝하였다. 그 다음, HEK293-EBNA 세포 트랜스펙션을 위해 대규모 DNA 제조를 수행하였다. 모든 변이체 및 모 Ab26 대조군 경쇄를 1:1비로 모 Ab26 중쇄와 동시-트랜스펙션시켰다.
정제를 위하여, 160 내지 300 ㎖의 트랜스펙션된 배지를 사용하여, 1 ㎖의 HiTrap 단백질 A 컬럼(GE) 및 멀티채널 펌프 셋 업을 사용하여 Ab26, Del33 및 Ab1 항체를 정제하였다. 수집된 분획에서 A280을 나노드롭(NanoDrop)으로 측정하였다. 대부분의 단백질을 함유하는 분획 #1 및 #2를 합하고, 50 mM 인산나트륨, 150 mM 염산나트륨, pH 6.0으로 완충제-교환하고, 아미콘(Amicon)-4 10 kD 컷아웃(cutout) 컬럼을 사용하여 농축시켰다. 단백질 정제 수율은 표 3에 요약되어 있다.
[표 3]
Figure pct00004

Del33 돌연변이체는 아마도 결실과 관련된 미스폴딩(misfolding) 문제에 기인하여, 높은 수준으로 발현되거나 정제되지 않았다. Ab1 및 Ab26을 추가의 특성화를 위해 성공적으로 균질할 때까지 정제하였다. 처음 15개 아미노산의 N-말단 시퀀싱에 의해, 모든 3가지 시료가 예상되는 서열을 가짐을 확인하였다.
또한, Ab26 및 Ab1을 CHO 세포에서 발현시키고, 단백질 A 컬럼에서 정제하였다. 항체를 CD52 펩티드에 대한 그들의 친화성에 대하여 비아코어(BIACORE)™에 의해 특성화하였다. 결과는 HEK293 세포에서 생성된 항체에 대하여 도 17 및 표 4에, 그리고 CHO 세포에서 생성된 항체에 대하여 도 18 및 표 5에 나타나 있다.
[표 4]
Figure pct00005

[표 5]
Figure pct00006

CD52 비아코어™ 결합 검정을 하기와 같이 수행하였다: 낮은 수준의 CD52 펩티드 미모토프(CGQNDTSQTSSPSAD(SEQ ID NO: 87))를 N-말단 Cys를 사용하여 티올 화학물질을 통해 CM5 칩에 고정화시켰다. HBS-EP 런닝(running) 완충제에서 제조된 몇몇 농도의 항-CD52 항체(1 내지 20 nM)를 표면에 주입하여, 결합을 모니터링하였다. 스크러버(Scrubber)2 소프트웨어를 사용하여 역학적 분석을 수행하였다.
항체 Ab1은 Ab26에 비하여 친화성의 400배 초과의 감소를 나타내었다. Ab26이 높은 결합 친화성을 디스플레이하는 1 내지 10 nM 농도에서 Ab1 항체에 의하여 명백한 결합 신호가 관찰되지 않았다(도 17). 변이체에 의한 결합 친화성의 소실에 대한 정량적 측정을 얻기 위한 일환으로 보다 높은 농도의 Ab1(최대 1900 nM)을 사용하였다. CHO-생성 Ab1으로부터 수득된 1250 nM KD는 HEK293-생성 Ab1의 것과 일치하였다(1480 nM). 친화성의 감소는 역학적 결합에서 감소된 온-속도(on-rate) 및 증가된 오프-속도(off-rate) 둘 모두에 반영된다.
CDC 효능 검정을 수행하여, 보체 의존적 세포독성을 통한 세포-사멸을 측정함으로써 친화성 소실이 이펙터 기능에 영향을 미칠지를 평가하였다. 모든 변이체 및 대조군 항체 물질을 하나의 솔리드 블랙(solid black) 96-웰 플레이트에 걸쳐 검정 배지(페놀-레드(phenol-red) 미함유 IMDM 배지 + 0.1% BSA) 중에, 2 ㎎/㎖에서 0.002 ㎎/㎖로 1:2 단계 희석하였다. 2 ㎎/㎖ 이하의 원액 농도를 갖는 물질은 희석하지 않고 시험하였다. 정상 인간 혈청 보체(퀴델 코포레이션(Quidel Corporation))를 5% (v/v)의 최종 농도로 모든 웰에 첨가하였다. 그 다음, 파이퍼(Pfeiffer) b-림프구(ATCC)를 0.6×106개 세포/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 세포 용해 음성 대조군(검정 배지 + 세포), 세포 용해 양성 대조군(검정 배지 + 세포 + 2% (w/v) 트리톤(Triton) X-100) 및 용량 반응 양성 대조군(4 ㎎/㎖ 대조군 물질)을 동일한 플레이트에 포함시켰다. 반응물을 가습, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 50 마이크로리터의 사전-가온된 알라마블루(alamarBlue)® 검출 시약(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies))을 모든 웰에 첨가한 다음, 감소된 광에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 알라마블루®의 상대적 감소를 형광 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다(여기: 530 nm, 방출: 590, 컷 오프: 570 nm). 소프트맥스 프로(Softmax Pro), v. 5.3(몰레큘라 디바이스즈(Molecular Devices))을 사용하여, 4-파라미터 모델에 대한 용량-반응 곡선 핏을 생성하였다. 결과는 도 19에 나타나 있다. Ab26(대조군)은 예상되는 바와 같은 농도 의존적 세포 사멸을 나타내었다. CHO 세포에서 생성된 항체 Ab1은 시험한 농도 범위에서 검출가능한 CDC 활성을 거의 나타내지 않았다. 이들 실험에 의해, 단일의 아미노산 치환이 Ab26 생물학적 기능에 상당한 영향을 가질 수 있음이 뒷받침된다.
실시예 2: 항-CD52 항체의 CD52 결합 친화성의 분석
항체 Ab4, Ab3, Ab24, Ab10, Ab12 및 Ab25(표 1 및 2 참조)를 HEK293 세포에서 발현시켰다. 하기와 같이, 경쇄 DNA를 합성하고, 서브클로닝하고, HEK293 세포에서 일시적으로 발현시켰다. DNA 분자를 경쇄 백본에서, DNA2.0에 의해 pDONR221 엔트리 벡터에서 합성하고, 게이트웨이 클로닝에 의해 HEK293 발현 벡터 pCEP4(-E+I)Dest로 서브클로닝하였다. 경쇄-발현 벡터를 Ab26 중쇄-발현 벡터와 함께 HEK293 세포 내로 동시-트랜스펙션시켰다. Ab26 DNA를 트랜스펙션을 위한 대조군으로 사용하였다. 조절된 배지를 단백질 A 센서를 사용하여 옥텟에 의해 단백질 발현 수준에 대하여, 그리고 CD52 펩티드 칩을 사용하여 비아코어™에 의해 CD52-결합 친화성에 대하여 스크리닝하였다. 결과는 도 1에 나타나 있다.
Ab24 및 Ab10 항체는 강력한 CD52 결합 친화성을 나타낸다. Ab4 및 Ab3은 더 낮은 CD52 결합 친화성을 나타낸다. 이러한 관찰을 확인하기 위하여, Ab4 및 Ab3을 추가의 특성화를 통해 단백질 A 컬럼을 사용하여 정제하였다. Ab26 항체(CTL)의 SDS-PAGE 겔, 2가지 트랜스펙션 유래의 Ab26 항체(CTL1 및 CTL2), Ab1, Ab4, Ab3, Ab10, Ab24, Ab12 및 Ab25 및 비아코어™ CD52 펩티드 결합 결과는 도 2에 나타나 있다.
정제된 항체를 사용한 결과에 의해, 초기 배지 스크리닝 데이터를 확인하였다. Ab4 및 Ab3은 더 낮은 CD52 결합 친화성을 나타내었다.
실시예 3: Ab24 및 Ab10 항체의 대규모 제조 및 특성화
Ab24 및 Ab10 항체를 CHO K1 세포에서 대규모로 생성하여, 그들의 CD52 결합 및 억제 특성을 결정하였다. 경쇄 클리핑을 2개의 항체에서 관찰하였으며; 150 kD 미만의 밴드를 비-환원(NR) 겔에서 관찰하였다(본원에서 "100 kD 종"으로 표기)(도 3).
조직 배양 조건을 최적화시키고, 4℃에서의 배지 보관 단계를 생략함으로써 경쇄 클리핑 문제를 최소화시켰다. 이들 개선에도 불구하고, 소량의 100 kD 종(150 KD 미만)이 생성되는 것으로 보인다(도 3). 2개의 항체를 추가로 특성화하였다. SEC-HPLC에 의해, 보다 큰 규모의 Ab24 및 Ab10의 2개의 제제에서 각각 9 내지 12% 및 18 내지 20%의 100 kD 종이 관찰되었다. 무손상 질량 분광계 실험에 의해, 항체의 서열을 확인하였다. 저분자량 종의 N-말단 시퀀싱에 의해, 중쇄의 N-말단 서열만이 존재하였음이 뒷받침되었다. 100 kD 종을 수집하고, SDS-PAGE 겔에서 분석하는 경우, 오직 중쇄만이 관찰되었다. 이들 결과는 100 kD 종이 오직 중쇄에만 포함되는 것을 뒷받침한다(도 4).
실시예 4: 추가의 항-CD52 항체의 제조 및 스크리닝
항체 Ab2, Ab6, Ab7, Ab5, Ab13, Ab15, Ab17, Ab18, Ab19, Ab23, Ab22, Ab11, Ab20, Ab16, Ab21 및 Ab14에 대한 발현 벡터(표 1 및 2 참조)를 HEK293 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 조절된 배지를 옥텟에서 단백질 A 센서를 사용하여 분석하는 경우, 모든 항체는 0.2 ㎍/㎖ 초과로 발현되었다(도 5, 상부 패널). 그 다음, 이들 배지 시료의 비아코어™ CD52 친화성 스크리닝을 사용하여 선도 후보물질을 확인하였다(도 5, 중간 및 하부 패널).
항체 Ab2, Ab6, Ab7 및 Ab5는 CD52에 대하여 낮은 결합 친화성을 가졌다. 몇몇의 다른 항체는 CD52에 대하여 보다 높은 결합 친화성을 나타내었다. 이들 항체에는 Ab22, Ab20, Ab21, Ab14, Ab14 및 Ab11이 포함된다. 항체 Ab22, Ab20, Ab21, Ab14, Ab14 및 Ab11을 추가로 연구하였다.
이들 6개의 항체(Ab22, Ab20, Ab21, Ab14, Ab14 및 Ab11)를 하나의 트리플플라스크(TripleFlask)/항체 일시 발현으로 대량화시켰다. (이러한 플라스크는 3개의 평행한 성장 표면을 가져, 500 ㎠의 총 배양 면적을 제공한다.) 항체를 1 ㎖ 하이트랩(HiTrap) 단백질 A 친화성 컬럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))을 사용하여 160 ㎖의 조절된 배지로부터 정제하였다. 환원 SDS-PAGE 겔은 성공적인 정제 및 적정한 항체 순도를 보였다(도 6). 비아코어™에서의 CD52 결합 비교를 위하여, 정제된 시료를 HBS-EP에서 60 및 7.5 nM로 희석하고, CD52 펩티드 #741 칩에 주입하였다(결과는 7.5 nM에 대하여 도 6에 나타나 있음). 비아코어™ 결합 분석에 의해, 이들 항체가 CD52 펩티드로의 단단한 결합을 갖는다는 초기 배지 스크리닝 결과를 확인하였다. 역학 결합 실험에 의해, 하기의 친화성 순위가 나타났다:
(Ab16, Ab21) > Ab26 > (Ab20, Ab11, Ab14, Ab22) > (Ab24, Ab10)
Ab16 및 Ab21은 Ab26보다 더 높은 친화성을 갖는 것으로 보였다.
실시예 5: 항-CD52 항체의 안정성의 분석
항-CD52 항체 변이체의 안정성이 영향을 받는지를 결정하기 위하여, 고온 조건을 사용하여, 항-CD52 항체 변이체를 비교하고 스크리닝하였다. HEK293 세포로부터 정제된 Ab26 및 선택된 변이체를 초기 스크리닝을 위해 사용하였다. 단백질(85 ㎍)을 PBS, pH 7.2에서 약 0.4 ㎎/㎖로 희석하고, 45℃에서 4주 동안 인큐베이션시켰다. CD52 펩티드에 대한 그들의 결합 친화성을 비아코어™에서 측정하였다. 2주 및 4주에 취한 일 마이크로그램의 각 변이체를 HBS-EP에서 7.5, 2.5 및 0.8 nM로 단계 희석하고, CD52 펩티드 #741 칩에 주입하였다. 스크러버 소프트웨어를 사용하여 예비 결합 상수를 계산하고 도 20에 나타내었다(Ab26은 "CTL"로 표지되어 있음).
결과는 Ab21, Ab16 및 Ab20 항체가 4주의 인큐베이션에 걸쳐 상당한 CD52 결합 친화성을 보유하는 것을 나타내며, 이는 그들이 항체 Ab26보다 더욱 안정적임을 시사한다. 대조적으로, Ab10 및 Ab22 항체는 인큐베이션 기간에 걸쳐 항원에 대한 그들의 대부분의 결합 친화성을 소실하였다.
인큐베이션 실험에서 수득된 결과를 확인하기 위하여, 새로운 변이체의 제제를 생성하고, 37℃ 또는 45℃에서 4주 동안 Ab26 항체와 함께 "3 성분" 완충제(10 mM 석시네이트, 10 mM 히스티딘, 10 mM 인산나트륨, pH 7.5)에서 인큐베이션시켰다. "3 성분" 완충제를 전형적으로 항체 제조가능성 시험에서 사용한다. 인큐베이션된 물질의 양은 표 6에 열거되어 있다. 또한, Ab21, Ab16 및 Ab20 항체를 동일한 완충제에서 45℃에서 인큐베이션시켰다. 분취액을 2주 및 4주(T2 및 T4)에 취하여, 비아코어™에 의해 CD52 펩티드에 대한 그들의 친화성을 평가하였다. 각 시료를 HBS-EP에서 7.5, 3.75 및 1.875 nM로 희석하고, 3분 동안 CD52 펩티드 #741 칩에 주입하고, 완충제에서 3분 해리시켰다. 겉보기 KD는 도 21에 나타나 있다.
[표 6]
Figure pct00007

결과는 Ab21, Ab16 및 Ab20 항체의 결합 친화성이 37℃ 및 45℃에서 4주의 인큐베이션 후에 동일하거나 오직 약간 감소되어 유지되는 한편, Ab26(CTL, CTL1 및 CTL2)이 시간이 지남에 따라 결합 친화성을 소실함을 시사한다. Ab26(CTL)의 KD는 4주 후에, 45℃에서의 인큐베이션 후에, 4.3 nM에서 1230 nM로 변경되었으며, 이는 CD52로의 결합의 감소를 나타낸다. 이는 L-CDR1 부위에서 이들 돌연변이체가 실제로 시간이 지남에 따라 불안정성에 더욱 내성이 있음을 시사한다.
Ab21, Ab16 및 Ab20 항체의 구조적 무결성을 입증하기 위하여, PBS, pH 7.2에서 약 0.4 ㎎/㎖로 희석하고, 45℃에서 4주 동안 인큐베이션시킨 변이체의 응집 및 단편화를 SEC-HPLC에 의해 평가하였다. 5 마이크로그램의 단백질을 이동상(40 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 6.0)에서 100 ㎕의 총 부피로 희석하고, 0.5 ㎖/분에서 35분 동안 TSK 겔(Gel) G3000 SWxl 컬럼으로 주입하였다. Ab21, Ab16, Ab20 및 Ab26(CTL)에서 상당한 응집이 검출되지 않고, 제한된 단편화가 검출되었다(도 22). 따라서, Ab26의 친화성의 소실은 아마도 구조적 무결성의 소실에 의해 야기되지 않을 것이다.
실시예 6: 시험관내 효능 검정( CDC 효능)에서 항-CD52 항체의 생물학적 활성
3개의 항-CD52 항체(Ab21, Ab20 및 Ab16)를 CDC 검정에서 평가하였다. 이러한 검정을 사용하여 보체의 존재하에서 파이퍼 B-림프구를 용해시키는 항체의 능력을 측정하였다. 항체를 동일한 플레이트에서 단독으로 검정하고, Ab26(대조군)과 정성적으로 비교하였다(도 7 참조).
결과는 Ab21 및 Ab16의 효능이 Ab26과 비슷하거나, 그보다 개선되었음을 뒷받침한다. Ab20은 이러한 시험에서 약간 더 낮은 효능을 가졌다.
실시예 7: HuCD52 - 트랜스제닉 마우스에서 항-CD52 항체의 생물학적 활성
또한, 3개의 항-CD52 항체(Ab21, Ab20 및 Ab16)를 huCD52 트랜스제닉 마우스에서 생체내에서 평가하였다. HuCD52 트랜스제닉 마우스에 1 ㎎/㎏으로 Ab26, Ab21, Ab20 또는 Ab16을 정맥내로 주사하였다(5마리 동물/그룹). 주사 후 3일에, 혈액 및 비장을 유세포분석에 의해 림프구 고갈에 대하여 분석하였다. 유세포분석에 의해, 혈액 및 비장에서의 림프구 고갈의 정도는 도 8에 나타나 있다(Ab26은 "CTL"로 표지되어 있음).
결과는 혈액 및 비장에서 항체 Ab21, Ab20 및 Ab16에 의해 유도되는 림프구 고갈이 항체 Ab26과 유사하거나 그보다 개선된 것으로 보임을 시사한다. 이들 데이터를 함께 취하여, 이들 항-CD52 항체는 생체내에서 생물학적으로 활성임이 확인된다.
표 7은 본원에 사용되는 SEQ ID NO를 열거한 것이다.
[표 7] SEQ ID NO
Figure pct00008

Figure pct00009

Figure pct00010

Figure pct00011
SEQUENCE LISTING <110> GENZYME CORPORATION <120> ANTI-CD52 ANTIBODIES <130> 001662-0041-WO1 <140> <141> <150> 61/794,576 <151> 2013-03-15 <160> 136 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met 1 5 10 15 Val Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr 20 25 30 Ser Ser Pro Ser Ala Ser Ser Ser Met Ser Gly Gly Ile Phe Leu Phe 35 40 45 Phe Val Ala Asn Ala Ile Ile His Leu Phe Cys Phe Ser 50 55 60 <210> 2 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Lys Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Val Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 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Synthetic polynucleotide" <400> 104 gacattgtga tgacccagac tccactcagt ttgtcagtta cccctgggca accagcctct 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaata ataaaaccta tttgaactgg 120 gttttacaga agccaggcca gtctccacag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt ctctggcagt ggatcaggaa cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggagtt tattactgcg tgcaaggttc acattttcac 300 acgttcggtc aagggaccaa gctggagatt aaa 333 <210> 105 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 105 gacattgtga tgacccagac tccactcagt ttgtcagtta cccctgggca accagcctct 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatc agaaaaccta tttgaactgg 120 gttttacaga agccaggcca gtctccacag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt ctctggcagt ggatcaggaa cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtgggagtt tattactgcg tgcaaggttc acattttcac 300 acgttcggtc aagggaccaa gctggagatt aaa 333 <210> 106 <211> 333 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aggttcacat 360 tttcacacgt tcggtcaagg gaccaagctg gagattaaac gaactgtggc agcaccaagc 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tagtga 726 <210> 124 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 124 cccaccatgg aagccccagc gcagcttctc ttcctcctgc tactctggct ccctgatacc 60 accggagaca ttgtgatgac ccagactcca ctcagtttgt cagttacccc tgggcaacca 120 gcctctatct cttgcaagtc aagtcagagc ctcttatata gtaatattaa aacctatttg 180 aactgggttt tacagaagcc aggccagtct ccacagcgcc taatctatct ggtgtctaaa 240 ctggactctg gagtccctga caggttctct ggcagtggat caggaacaga ttttacactg 300 aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtg ggagtttatt actgcgtgca aggttcacat 360 tttcacacgt tcggtcaagg gaccaagctg gagattaaac gaactgtggc agcaccaagc 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tagtga 726 <210> 125 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 125 cccaccatgg aagccccagc gcagcttctc ttcctcctgc tactctggct ccctgatacc 60 accggagaca ttgtgatgac ccagactcca ctcagtttgt cagttacccc tgggcaacca 120 gcctctatct cttgcaagtc aagtcagagc ctcttatata gtaataagaa aacctatttg 180 aactgggttt tacagaagcc aggccagtct ccacagcgcc taatctatct ggtgtctaaa 240 ctggactctg gagtccctga caggttctct ggcagtggat caggaacaga ttttacactg 300 aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtg ggagtttatt actgcgtgca aggttcacat 360 tttcacacgt tcggtcaagg gaccaagctg gagattaaac gaactgtggc agcaccaagc 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tagtga 726 <210> 126 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 126 cccaccatgg aagccccagc gcagcttctc ttcctcctgc tactctggct ccctgatacc 60 accggagaca ttgtgatgac ccagactcca ctcagtttgt cagttacccc tgggcaacca 120 gcctctatct cttgcaagtc aagtcagagc ctcttatata gtaatttgaa aacctatttg 180 aactgggttt tacagaagcc aggccagtct ccacagcgcc taatctatct ggtgtctaaa 240 ctggactctg gagtccctga caggttctct ggcagtggat caggaacaga ttttacactg 300 aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtg ggagtttatt actgcgtgca aggttcacat 360 tttcacacgt tcggtcaagg gaccaagctg gagattaaac gaactgtggc agcaccaagc 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tagtga 726 <210> 127 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 127 cccaccatgg aagccccagc gcagcttctc ttcctcctgc tactctggct ccctgatacc 60 accggagaca ttgtgatgac ccagactcca ctcagtttgt cagttacccc tgggcaacca 120 gcctctatct cttgcaagtc aagtcagagc ctcttatata gtaatgataa aacctatttg 180 aactgggttt tacagaagcc aggccagtct ccacagcgcc taatctatct ggtgtctaaa 240 ctggactctg gagtccctga caggttctct ggcagtggat caggaacaga ttttacactg 300 aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtg ggagtttatt actgcgtgca aggttcacat 360 tttcacacgt tcggtcaagg gaccaagctg gagattaaac gaactgtggc agcaccaagc 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tagtga 726 <210> 128 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 128 cccaccatgg aagccccagc gcagcttctc ttcctcctgc tactctggct ccctgatacc 60 accggagaca ttgtgatgac ccagactcca ctcagtttgt cagttacccc tgggcaacca 120 gcctctatct cttgcaagtc aagtcagagc ctcttatata gtaataataa aacctatttg 180 aactgggttt tacagaagcc aggccagtct ccacagcgcc taatctatct ggtgtctaaa 240 ctggactctg gagtccctga caggttctct ggcagtggat caggaacaga ttttacactg 300 aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtg ggagtttatt actgcgtgca aggttcacat 360 tttcacacgt tcggtcaagg gaccaagctg gagattaaac gaactgtggc agcaccaagc 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tagtga 726 <210> 129 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 129 cccaccatgg aagccccagc gcagcttctc ttcctcctgc tactctggct ccctgatacc 60 accggagaca ttgtgatgac ccagactcca ctcagtttgt cagttacccc tgggcaacca 120 gcctctatct cttgcaagtc aagtcagagc ctcttatata gtaatcagaa aacctatttg 180 aactgggttt tacagaagcc aggccagtct ccacagcgcc taatctatct ggtgtctaaa 240 ctggactctg gagtccctga caggttctct ggcagtggat caggaacaga ttttacactg 300 aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtg ggagtttatt actgcgtgca aggttcacat 360 tttcacacgt tcggtcaagg gaccaagctg gagattaaac gaactgtggc agcaccaagc 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tagtga 726 <210> 130 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 130 cccaccatgg aagccccagc gcagcttctc ttcctcctgc tactctggct ccctgatacc 60 accggagaca ttgtgatgac ccagactcca ctcagtttgt cagttacccc tgggcaacca 120 gcctctatct cttgcaagtc aagtcagagc ctcttatata gtaatcgtaa aacctatttg 180 aactgggttt tacagaagcc aggccagtct ccacagcgcc taatctatct ggtgtctaaa 240 ctggactctg gagtccctga caggttctct ggcagtggat caggaacaga ttttacactg 300 aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtg ggagtttatt actgcgtgca aggttcacat 360 tttcacacgt tcggtcaagg gaccaagctg gagattaaac gaactgtggc agcaccaagc 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tagtga 726 <210> 131 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 131 cccaccatgg aagccccagc gcagcttctc ttcctcctgc tactctggct ccctgatacc 60 accggagaca ttgtgatgac ccagactcca ctcagtttgt cagttacccc tgggcaacca 120 gcctctatct cttgcaagtc aagtcagagc ctcttatata gtaatagtaa aacctatttg 180 aactgggttt tacagaagcc aggccagtct ccacagcgcc taatctatct ggtgtctaaa 240 ctggactctg gagtccctga caggttctct ggcagtggat caggaacaga ttttacactg 300 aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtg ggagtttatt actgcgtgca aggttcacat 360 tttcacacgt tcggtcaagg gaccaagctg gagattaaac gaactgtggc agcaccaagc 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tagtga 726 <210> 132 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 132 cccaccatgg aagccccagc gcagcttctc ttcctcctgc tactctggct ccctgatacc 60 accggagaca ttgtgatgac ccagactcca ctcagtttgt cagttacccc tgggcaacca 120 gcctctatct cttgcaagtc aagtcagagc ctcttatata gtaataccaa aacctatttg 180 aactgggttt tacagaagcc aggccagtct ccacagcgcc taatctatct ggtgtctaaa 240 ctggactctg gagtccctga caggttctct ggcagtggat caggaacaga ttttacactg 300 aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtg ggagtttatt actgcgtgca aggttcacat 360 tttcacacgt tcggtcaagg gaccaagctg gagattaaac gaactgtggc agcaccaagc 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tagtga 726 <210> 133 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 133 cccaccatgg aagccccagc gcagcttctc ttcctcctgc tactctggct ccctgatacc 60 accggagaca ttgtgatgac ccagactcca ctcagtttgt cagttacccc tgggcaacca 120 gcctctatct cttgcaagtc aagtcagagc ctcttatata gtaatttgaa aacctatttg 180 aactgggttt tacagaagcc aggccagtct ccacagcgcc taatctatct ggtgtctaaa 240 ctggactctg gagtccctga caggttctct ggcagtggat caggaacaga ttttacactg 300 aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtg ggagtttatt actgcgtgca aggttcacat 360 tttcacacgt tcggtcaagg gaccaagctg gagattaaac gaactgtggc agcaccaagc 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tagtga 726 <210> 134 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 134 cccaccatgg aagccccagc gcagcttctc ttcctcctgc tactctggct ccctgatacc 60 accggagaca ttgtgatgac ccagactcca ctcagtttgt cagttacccc tgggcaacca 120 gcctctatct cttgcaagtc aagtcagagc ctcttatata gtaatgttaa aacctatttg 180 aactgggttt tacagaagcc aggccagtct ccacagcgcc taatctatct ggtgtctaaa 240 ctggactctg gagtccctga caggttctct ggcagtggat caggaacaga ttttacactg 300 aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtg ggagtttatt actgcgtgca aggttcacat 360 tttcacacgt tcggtcaagg gaccaagctg gagattaaac gaactgtggc agcaccaagc 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tagtga 726 <210> 135 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 135 cccaccatgg aagccccagc gcagcttctc ttcctcctgc tactctggct ccctgatacc 60 accggagaca ttgtgatgac ccagactcca ctcagtttgt cagttacccc tgggcaacca 120 gcctctatct cttgcaagtc aagtcagagc ctcttatata gtaaaggaaa tacctatttg 180 aactgggttt tacagaagcc aggccagtct ccacagcgcc taatctatct ggtgtctaaa 240 ctggactctg gagtccctga caggttctct ggcagtggat caggaacaga ttttacactg 300 aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtg ggagtttatt actgcgtgca aggttcacat 360 tttcacacgt tcggtcaagg gaccaagctg gagattaaac gaactgtggc agcaccaagc 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tagtga 726 <210> 136 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> /replace="Arg" or "Gln" or "His" or "Ser" or "Tyr" or "Ala" or "Asp" or "Glu" or "Phe" or "Ile" or "Leu" or "Met" or "Asn" or "Thr" or "Val" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> /note="Variant residue given in the sequence has no preference with respect to those in the annotation for the variant position" <400> 136 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Lys Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15

Claims (42)

  1. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-인간 CD52 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서,
    상기 중쇄 가변 영역이
    (a) SEQ ID NO: 7의 중쇄 CDR1;
    (b) SEQ ID NO: 8의 중쇄 CDR2; 및
    (c) SEQ ID NO: 9의 중쇄 CDR3를 포함하고,
    상기 경쇄 가변 영역이
    (a) SEQ ID NO: 86의 경쇄 CDR1;
    (b) SEQ ID NO: 34의 경쇄 CDR2; 및
    (c) SEQ ID NO: 35의 경쇄 CDR3를 포함하는 항-인간 CD52 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 신호 서열이 없는 SEQ ID NO: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 신호 서열이 없는 SEQ ID NO: 4의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체에 비하여 증가된 안정성을 나타내는 것인 항체 또는 단편.
  3. 제1항에 있어서, SEQ ID NO: 86에서 잔기 11이 K, R, Q, H, S, Y, A, D, E, F, I, L, M, N, T 또는 V(SEQ ID NO: 136)인 항체 또는 단편.
  4. 제1항에 있어서, SEQ ID NO: 86에서 잔기 11이 K(SEQ ID NO: 24)인 항체 또는 단편.
  5. 제1항에 있어서, SEQ ID NO: 86에서 잔기 11이 R(SEQ ID NO: 29)인 항체 또는 단편.
  6. 제1항에 있어서, SEQ ID NO: 86에서 잔기 11이 Q(SEQ ID NO: 28)인 항체 또는 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 59를 포함하는 것인 항체 또는 단편.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 및 83으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 항체 또는 단편.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역이
    a) 각각 SEQ ID NO: 59 및 68;
    b) 각각 SEQ ID NO: 59 및 69;
    c) 각각 SEQ ID NO: 59 및 70;
    d) 각각 SEQ ID NO: 59 및 71;
    e) 각각 SEQ ID NO: 59 및 72;
    f) 각각 SEQ ID NO: 59 및 73;
    g) 각각 SEQ ID NO: 59 및 74;
    h) 각각 SEQ ID NO: 59 및 75;
    i) 각각 SEQ ID NO: 59 및 76;
    j) 각각 SEQ ID NO: 59 및 77;
    k) 각각 SEQ ID NO: 59 및 78;
    l) 각각 SEQ ID NO: 59 및 79;
    m) 각각 SEQ ID NO: 59 및 80;
    n) 각각 SEQ ID NO: 59 및 81;
    o) 각각 SEQ ID NO: 59 및 82; 또는
    p) 각각 SEQ ID NO: 59 및 83을 포함하는 것인 항체 또는 단편.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 서열이 없는 SEQ ID NO: 3의 중쇄를 포함하는 항체 또는 단편.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄를 포함하는 항체 또는 단편.
  12. (a) 신호 서열이 없는 SEQ ID NO: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 49의 경쇄 아미노산 서열;
    (b) 신호 서열이 없는 SEQ ID NO: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 53의 경쇄 아미노산 서열; 또는
    (c) 신호 서열이 없는 SEQ ID NO: 3의 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 54의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 G(IgG)인 항체.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단편이 scFv 단편, Fab 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단편.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 Fc 영역을 포함하는 것인 항체 또는 단편.
  16. 제15항에 있어서, 상기 인간 Fc 영역이 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역인 항체 또는 단편.
  17. 제15항에 있어서, 상기 인간 Fc 영역이 인간 IgG1 Fc 영역인 항체 또는 단편.
  18. 제15항에 있어서, 상기 인간 Fc 영역이 인간 IgG2 Fc 영역인 항체 또는 단편.
  19. 제15항에 있어서, 상기 인간 Fc 영역이 인간 IgG3 Fc 영역인 항체 또는 단편.
  20. 제15항에 있어서, 상기 인간 Fc 영역이 인간 IgG4 Fc 영역인 항체 또는 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 모노클로널(monoclonal)인 항체 또는 단편.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간화된 것인 항체 또는 단편.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 C-말단 라이신이 절단된 것인 항체 또는 단편.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편의 중쇄 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 경쇄 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 둘 모두를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  25. 제24항에 있어서, SEQ ID NO: 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 또는 134의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  26. 제24항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  27. 제26항에 있어서, 상기 벡터가 발현 벡터인 벡터.
  28. 제26항 또는 제27항에 따른 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  29. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편, 또는 상기 항체 또는 단편의 중쇄 또는 경쇄를 생성하는 단리된 세포주.
  30. (1) 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편의 중쇄 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 경쇄 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 상기 항체 또는 단편의 발현에 적절한 조건하에 유지하는 단계; 및 (2) 상기 항체 또는 단편을 회수하는 단계를 포함하는 항-인간 CD52 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법.
  31. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 비히클(vehicle) 또는 담체를 포함하는 조성물.
  32. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 유효량의 항체 또는 항원-결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법.
  33. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서의 자가면역 질환의 치료 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 다발성 경화증인 방법.
  35. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료를 필요로 하는 환자에서의 암의 치료 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 암이 만성 림프구성 백혈병인 방법.
  37. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생의 억제를 필요로 하는 환자에서의 혈관신생의 억제 방법.
  38. 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서의 자가면역 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편의 용도.
  39. 제38항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 다발성 경화증인 용도.
  40. 암의 치료를 필요로 하는 환자에서의 암의 치료용 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편의 용도.
  41. 제40항에 있어서, 상기 암이 만성 림프구성 백혈병인 용도.
  42. 혈관신생의 억제를 필요로 하는 환자에서의 혈관신생의 억제용 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편의 용도.
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