EA031025B1 - Антитела против ntb-a и связанные с ними композиции и способы - Google Patents

Abstract

Изобретение предлагает антитела, в том числе конъюгаты антител с лекарственными средствами, способные специфически связываться с NTB-A. Изобретение также предлагает способы применения антител против NTB-A для детекции или модуляции активности (например, ингибирования пролиферации) NTB-A-экспрессирующих клеток, а также для диагностики или лечения заболеваний или расстройств (таких как рак), ассоциированных с NTB-A-экспрессирующими клетками. Кроме того, изобретение предлагает способ лечения множественной миеломы с использованием конъюгата антитела против NTB-A с лекарственным средством, который необязательно включает в себя антитело против NTB-A, раскрытое в данном документе.

Description

Настоящее изобретение также относится к вектору экспрессии, содержащему описанный выше полинуклеотид, а также клетке-хозяина, содержащей такой вектор экспрессии, которые можно использовать в способах получения антитела по настоящему изобретению. Такой способ получения антитела по изобретению, как правило, включает культивирование клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию антитела, и выделение антитела из клетки-хозяина.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей описанное выше антитело, и фармацевтически совместимый ингредиент.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего раком, характеризующегося экспрессией NTB-A. Способ лечения обычно включает введение пациенту описанного выше антитела в эффективном режиме. В некоторых аспектах антитело конъюгируют с цитотоксическим или цитостатическим средством. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей множественную миелому, острый миелоидный лейкоз (AML) и В-клеточную лимфому (такую как неходжкинская лимфома (NHL)).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения пациента, страдающего от множественной миеломы. Способ лечения обычно включает введение пациенту в эффективном режиме антитела, способного специфически связываться с NTB-A человека, где антитело конъюгировано с цитотоксическим или цитостатическим средством. В некоторых вариантах антитело против NTB-A представляет собой описанное выше антитело.

Указанные и другие аспекты настоящего изобретения станут очевидными из нижеследующего подробного описания изобретения и прилагаемых чертежей.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показаны результаты анализа интернализации с использованием антитела 11А1 против NTB-A на клеточной линии множественной миеломы U-266.

На фиг. 2 показаны результаты конкурентного анализа антитела с использованием антител против NTB-A 11A1 и 26В7.

Определения.

Если не указано иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют традиционные значения, хорошо известные рядовым специалистам, к которым относятся описанные здесь способы и композиции.

Если не указано иначе, в настоящем описании нижеследующие термины и фразы имеют определенные для них значения.

Термин конъюгат антитело-лекарственное средство относится к антителу, конъюгированному с цитотоксическим средством или цитостатическим средством. Обычно конъюгаты антителолекарственное средство связываются с антигеном-мишенью (например, NTB-A) на поверхности клетки с последующей интернализацией конъюгата антитело-лекарственное средство в клетку и высвобождением лекарственного средства.

Термин полипептид или полипептидная цепь относится к полимеру из аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, полученному естественным или синтетическим путем. Полипептиды, содержащие менее чем примерно 10 аминокислотных остатков, обычно называют пептидами.

Белок представляет собой макромолекулу, содержащую одну или несколько полипептидных цепей. Белок может также содержать непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заместители могут присоединяться к белку в клетке, в которой продуцируется белок, и варьируют в зависимости от типа клетки. Белки определяются здесь с учетом структур их аминокислотных скелетов; заместители, такие как углеводные группы, обычно не указываются, но тем не менее могут присутствовать.

Термины аминоконцевой и карбоксиконцевой используются здесь для обозначения положений в полипептидах. Если это позволяет контекст, указанные термины используются со ссылкой на конкретную последовательность или часть полипептида для обозначения близости или относительного положения. Например, конкретная последовательность, являющаяся карбоксиконцевой по отношению к основной последовательности, в полипептиде расположена вблизи карбоксильного конца основной последовательности, но не обязательно на карбокси-конце целого полипептида.

Термин антитело в настоящем описании относится к белкам-иммуноглобулинам, продуцируемым в организме в ответ на присутствие антигена и способным связываться с антигеном, а также к их антиген-связывающим фрагментам и рекомбинантным вариантам. Следовательно, термин антитело включает, например, интактные моноклональные антитела (например, антитела, полученные с использованием гибридомной технологии) и антиген-связывающие фрагменты антител, такие как фрагменты F(ab')2 и Fab. Данный термин также охватывает рекомбинантные интактные антитела и их фрагменты, включающие химерные антитела, гуманизированные антитела, одноцепочечные фрагменты Fv, одноцепочечные антитела, диатела, минитела, линейные антитела, поливалентные или полиспецифические (например, биспецифические) гибридные антитела и т.п. Таким образом, термин антитело используется в широком

- 3 031025 смысле и включает любой белок, содержащий антиген-связывающий участок и способный специфически связываться с антигеном. Термин антитело также включает антитело само по себе (голое антитело) или антитело, конъюгированное с цитостатическим или цитотоксическим лекарственным средством.

Термин рекомбинантные антитела относится к антителам, аминокислотная последовательность которых отличается от последовательности нативного антитела. Применение методов рекомбинантных ДНК для получения антител позволяет не ограничиваться последовательностями аминокислот, обнаруженными в природных антителах; структуру антител можно изменять с получением желательных характеристик. Возможные варианты многочисленны и варьируют от изменения только одной аминокислоты, или небольшого числа аминокислот, до полного реконструирования, например вариабельного или константного участка. Изменения в константном участке, как правило, осуществляют, чтобы улучшить или изменить такие характеристики, как, например, фиксация комплемента, взаимодействие с клетками и другие эффекторные функции. Изменения в вариабельном участке обычно проводят, чтобы улучшить антиген-связывающие характеристики, повысить стабильность вариабельного участка или уменьшить риск иммуногенности.

Антиген-связывающий участок антитела представляет собой фрагмент антитела, достаточный для связывания с антигеном. Минимальный антиген-связывающий участок, как правило, представляет собой вариабельный домен или его рекомбинантный вариант. Однодоменные связывающие участки можно получить из верблюжьих антител (см. Muyldermans and Lauwereys, J. Mol. Recog. 12: 131-140, 1999; Nguyen et al., EMBO J. 19: 921-930, 2000) или из доменов VH других видов, и использовать их для получения однодоменных антител (dAbs, см. Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989; патент США №6248516, Winter et al.). В некоторых вариантах антиген-связывающий участок представляет собой полипептидный фрагмент, содержащий только 2 участка, определяющих комплементарность (CDR), полученных из природного или неприродного (например, мутантного) вариабельного домена тяжелой цепи или вариабельного домена легкой цепи, или их сочетания (см., например, Pessi et al., Nature 362: 367-369, 1993; Qiu et al., Nature Biotechnol. 25: 921-929, 2007). Чаще антиген-связывающий участок антитела содержит и вариабельный домен тяжелой цепи (VH), и вариабельный домен легкой цепи (VL), которые связываются с одним эпитопом.

В контексте настоящего изобретения антитело может содержать помимо антиген-связывающего участка один или несколько компонентов, включающих, например, второй антиген-связывающий участок антитела (который может связываться с таким же или другим эпитопом, или таким же или другим антигеном), пептидный линкер, константный участок иммуноглобулина, шарнирный участок иммуноглобулина, амфипатическую спираль (см. Pack and Pluckthun, Biochem. 31: 1579-1584, 1992), непептидный линкер, олигонуклеотид (см. Chaudri et al., FEBS Letters 450: 23-26, 1999), цитостатическое или цитотоксическое лекарственное средство и т. п. и может представлять собой мономерный или мультимерный белок. Примеры молекул, содержащих антиген-связывающий участок антитела, известны в данной области и включают, например, Fv, одноцепочечный Fv (scFv), Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c , диатела, dAbs, минитела, нанотела, гибриды Fab-scFv, биспецифические (scFv)₄-IgG и биспецифические (scFv)₂-Fab. (См., например, Hu et al., Cancer Res. 56: 3055-3061, 1996; Atwell et al., Molecular Immunology 33: 1301-1312, 1996; Carter and Merchant, Curr. Opin. Biotechnol. 8: 449-454, 1997; Zuo et al., Protein Engineering 13: 361-367, 2000; и Lu et al., J. Immunol. Methods 267: 213-226, 2002).

В настоящем описании термин иммуноглобулин относится к белку, состоящему из одного или нескольких полипептидов, в основном, кодируемому геном (генами) иммуноглобулина. Одна из форм иммуноглобулина является основной структурной единицей нативных (т.е. природных) антител позвоночных. Данная форма представляет собой тетрамер и состоит из двух идентичных пар цепей иммуноглобулина, где каждая пара содержит одну легкую цепь и одну тяжелую цепь. В каждой паре вариабельные участки легкой и тяжелой цепей (VL и VH) вместе отвечают, главным образом, за связывание с антигеном, а константные участки, в первую очередь, отвечают за эффекторные функции антитела. У высших позвоночных идентифицировано пять классов иммуноглобулиновых белков (IgG, IgA, IgM, IgD и IgE). IgG относится к основному классу; как правило, он является вторым по распространенности среди белков, обнаруженных в плазме. Человеческие IgG включают четыре подкласса, обозначаемые IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Константные участки тяжелой цепи класса IgG обозначают греческим символом γ. Например, иммуноглобулины подкласса IgG1 содержат константный участок тяжелой цепи γ1. Тяжелая цепь любого иммуноглобулина содержит константный участок, который состоит из белковых доменов константного участка (СН1, шарнирный участок, СН2 и СН3; IgG3 также содержит домен СН4), которые в данном подклассе являются практически неизменными у разных видов.

Последовательности ДНК, кодирующие цепи человеческих и нечеловеческих иммуноглобулинов, известны в данной области техники. (См., например, Ellison et al., DNA 1: 11-18, 1981; Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10: 4071-4079, 1982; Kenten et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 79: 6661-6665, 1982; Seno et al., Nuc. Acids Res. 11: 719-726, 1983; Riechmann et al., Nature 332: 323-327, 1988; Amster et al., Nuc.Acids Res. 8: 2055-2065, 1980; Rusconi and Kohler, Nature 314: 330-334, 1985; Boss et al., Nuc.Acids Res. 12: 37913806, 1984; Bothwell et al., Nature 298: 380-382, 1982; van der Loo et al., Immunogenetics 42: 333-341, 1995;

- 4 031025

Karlin et al., J. Mol.Evol. 22: 195-208, 1985; Kindsvogel et al., DNA 1: 335-343, 1982; Breiner et al., Gene 18: 165-174, 1982; Kondo et al., Eur.J. Immunol. 23: 245-249, 1993; и GenBank, №J00228). Обзор по структурам и функциям иммуноглобулинов можно найти в Putnam, The Plasma Proteins, Vol V, Academic Press, Inc., 49-140, 1987; и Padlan, Mol. Immunol. 31: 169-217, 1994. Термин иммуноглобулин используется в данном документе в обычном значении и относится к интактному антителу, составляющим его цепям, или фрагментам цепей, в зависимости от контекста.

Полноразмерные легкие цепи иммуноглобулина (примерно 25 кДа или 214 аминокислот) кодируются геном вариабельного участка (кодирующим примерно 110 аминокислот) на амино-конце и геном константного участка каппа или лямбда на карбокси-конце. Полноразмерные тяжелые цепи иммуноглобулина (примерно 50 кДа или 446 аминокислот) кодируются геном вариабельного участка (кодирующим примерно 116 аминокислот) и геном константного участка гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон (кодирующим примерно 330 аминокислот), причем последний определяет изотип IgG, IgM, IgA, IgD или IgE соответственно. В легких и тяжелых цепях вариабельный и константный участки соединяются J''участком размером примерно 12 или более аминокислот, а тяжелая цепь также содержит D''-участок размером примерно 10 или более аминокислот. (Общий обзор можно найти в Fundamental Immunology (Paul, ed., Raven Press, N.Y., 2nd ed.1989), гл. 7).

Вариабельный участок легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина (также называемый вариабельный домен легкой цепи (домен VL) или вариабельный домен тяжелой цепи (домен VH), соответственно) состоит из каркасного участка, прерываемого тремя гипервариабельными участками, называемыми также участки, определяющие комплементарность, или CDR. Каркасные участки служат для выравнивания CDR, обеспечивающих специфическое связывание с эпитопом антигена. Таким образом, термин гипервариабельный участок, или CDR, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые в первую очередь отвечают за связывание антигена. В направлении от амино-конца к карбоксиконцу, как VL, так и VH-домены включают следующие каркасные участки (FR) и участки CDR: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Отнесение аминокислот к конкретному домену осуществляют в соответствии с определениями Rabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), или Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342: 878-883, 1989. Rabat также предлагает широко используемую систему нумерации (нумерация Rabat), согласно которой соответствующим остаткам в разных тяжелых цепях или в разных легких цепях присваивается одинаковый номер. CDR 1, 2 и 3 домена VL также обозначаются здесь, соответственно, как CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3; CDR 1, 2 и 3 домена VH также обозначаются здесь, соответственно, как CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3.

Если контекст не указывает иначе, используемый здесь термин моноклональное антитело не ограничивается антителами, полученными с помощью гибридомной технологии. Термин моноклональное антитело относится к антителу, полученному из одного клона, включающего любой эукариотической, прокариотической или фаговый клон, и не ограничивается методом, с помощью которого его получают.

Домен VH или VL иммуноглобулина, полученный из исходного вариабельного домена, включает рекомбинантный домен VH или VL, содержащий некоторые или все CDR, полностью или практически полностью взятые из исходного вариабельного домена. В некоторых вариантах полученный вариабельный домен представляет собой гуманизированный домен VH или VL. Антитело, содержащее домен VH или VL, полученный из исходного вариабельного домена, как правило, сохраняет характеристики связывания антитела, содержащего исходный вариабельный участок.

Термин гуманизированный домен VH или гуманизированный домен VL относится к домену VH или VL иммуноглобулина, содержащему некоторые или все CDR, полностью или практически полностью взятые из нечеловеческого (например, мышиного или крысиного) донорного иммуноглобулина, и последовательности каркасных участков вариабельного домена, которые полностью или практически полностью получены из человеческого иммуноглобулина. Нечеловеческий иммуноглобулин, из которого получают CDR, называют донорным, а человеческий иммуноглобулин, из которого получают каркасные участки, называют акцепторным. Иногда в человеческих каркасных участках вариабельного домена гуманизированного антитела сохраняют некоторые нечеловеческие остатки, если это приводит к улучшению соответствующих характеристик связывания (например, мутации в каркасных участках могут потребоваться для сохранения сродства связывания при получении гуманизированного антитела).

Гуманизированное антитело представляет собой антитело, содержащее один или оба из гуманизированного домена VH и гуманизированного домена VL. Константный участок (участки) иммуноглобулина может отсутствовать, однако, если он присутствует, он полностью или практически полностью получен из константного участка человеческого иммуноглобулина.

CDR гуманизированного антитела в основном получен из соответствующего CDR нечеловеческого антитела, если по меньшей мере 60%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95 или 100% соответствующих остатков (определенных по системе Rabat) в указанных CDR идентичны между собой. В конкретных вариантах гуманизированного домена VH или VL, содержащего CDR, в основном полученные из нечеловеческого иммуноглобулина, CDR гуманизированного домена VH или VL содержат не более шести (например, не более пяти, не более четырех, не более трех, не более двух или не

- 5 031025 более одного) замен аминокислот (предпочтительно консервативные замены) во всех трех CDR по сравнению с соответствующими CDR нечеловеческих VH или VL. Каркасные последовательности вариабельного участка домена VH или VL антитела или, в случае присутствия, последовательность константного участка иммуноглобулина, в основном получены из человеческой каркасной последовательности VH или VL, или человеческого константного участка, соответственно, если по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95 или 100% соответствующих остатков, определенных по системе Rabat, являются идентичными. Следовательно, все фрагменты гуманизированного антитела, за исключением CDR, полностью или практически полностью получены из соответствующих фрагментов природных последовательностей человеческих иммуноглобулинов.

Антитела обычно получают в выделенной форме. Это означает, что чистота антитела, как правило, составляет по меньшей мере 50% мас./мас. по отношению к мешающим белкам и другим примесям, которые могут появиться в процессе получения или очистки, но не исключает возможность того, что антитело может находиться в сочетании с избытком фармацевтически приемлемого носителя (носителей) или другой среды, используемой для облегчения применения антитела. Иногда чистота антитела составляет по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95 или 99% мас./мас. по отношению к мешающим белкам и примесям, которые могут появиться в процессе получения или очистки.

Специфическое связывание антитела с антигеном-мишенью означает, что сродство антитела к антигену составляет по меньшей мере 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ или 10¹⁰ М^-1. Специфическое связывание превышает неспецифическое связывание по меньшей мере с одной неродственной мишенью и отличается от него на детектируемую величину. Специфическое связывание может обуславливаться образованием связей между отдельными функциональными группами или конкретным пространственным соответствием (например, типа ключ в замке), тогда как неспецифическое связывание обычно является результатом ван-дерваальсовых взаимодействий.

Термин эпитоп относится к участку на антигене, с которым связывается антитело. Эпитоп может быть образован из смежных аминокислот или несмежных аминокислот, приближенных друг к другу в результате третичной укладки одного или нескольких белков. Эпитопы, образованные из смежных аминокислот, как правило, сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные в результате третичной укладки, обычно утрачиваются после обработки денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно содержит по меньшей мере 3, чаще по меньшей мере 5 или 810 аминокислот, образующих уникальную пространственную конформацию. Методы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и 2мерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol.66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).

Антитела, которые распознают одинаковые или перекрывающиеся эпитопы можно идентифицировать с помощью простого иммуноанализа, демонстрирующего способность одного антитела конкурировать с другим антителом за связывание с антигеном-мишенью. Эпитоп, с которым связывается антитело, также можно определить путем анализа антитела, связанного с антигеном, методом рентгеновской кристаллографии, позволяющим идентифицировать контактирующие остатки. Альтернативно два антитела связываются с одним и тем же эпитопом, если все аминокислотные мутации в антигене, которые приводят к уменьшению или устранению связывания с одним антителом, уменьшают или устраняют связывание с другим (при условии, что такие мутации не вызывают глобального изменения структуры антигена). Два антитела связываются с перекрывающимися эпитопами, если некоторые из аминокислотных мутаций, которые уменьшают или устраняют связывание с одним антителом, уменьшают или устраняют связывание с другим.

Конкуренцию между антителами определяют с помощью анализа, в котором тестируемое антитело ингибирует специфическое связывание стандартного антитела с общим антигеном (см. например, Junghans et al., Cancer Res. 50: 1495, 1990). Тестируемое антитело конкурирует со стандартным антителом, если избыток тестируемого антитела (составляющий, например, по меньшей мере, 2х, 5х, 10х, 20х или 100х) ингибирует связывание стандартного антитела по меньшей мере на 55%, предпочтительно на 75, 90 или 99% по данным анализа конкурентного связывания. Антитела, индентифицируемые с помощью конкурентного анализа (конкурирующие антитела), включают антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и стандартное антитело, а также антитела, связывающиеся с соседним эпитопом, достаточно приближенным к эпитопу, с которым связывается стандартное антитело, чтобы вызвать стерическое затруднение. Антитела, индентифицируемые с помощью конкурентного анализа, также включают антитела, которые косвенно конкурируют со стандартным антителом, вызывая конформационное изменение в белке-мишени, и таким образом предотвращая связывание стандартного антитела с эпитопом, отличающимся от эпитопа, с которым связывается тестируемое антитело.

Термины элемент экспрессии и кассета экспрессии используются здесь как взаимозаменяемые и относятся к сегменту нуклеиновой кислоты, содержащему последовательность, кодирующую представляющий интерес полипептид, и способному обеспечить экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине. Элемент экспрессии, как правило, содержит промотор транскрипции, открытую рамку

- 6 031025 считывания, кодирующую представляющий интерес полипептид, и терминатор транскрипции, присутствующие в функциональной конфигурации. Помимо промотора и терминатора транскрипции элемент экспрессии может также содержать другие сегменты нуклеиновой кислоты, такие как, например, энхансер или сигнал полиаденилирования.

Термин вектор экспрессии в соответствии с данным описанием относится к молекуле нуклеиновой кислоты, линейной или циклической, содержащей один или несколько элементов экспрессии. Помимо одного или нескольких элементов экспрессии вектор экспрессии может также содержать дополнительные сегменты нуклеиновой кислоты, такие как, например, одна или несколько точек начала репликации или один или несколько селектируемых маркеров. Векторы экспрессии обычно получают из плазмидной или вирусной ДНК, или вектор экспрессии может содержать элементы обеих указанных ДНК.

В применении к описанным здесь белкам ссылка на аминокислотные остатки, соответствующие приведенным в SEQ ID NO, включает посттрансляционные модификации таких остатков.

Термин пациент включает человека и других млекопитающих, которые получают либо профилактическое, либо терапевтическое лечение.

Термин эффективное количество в контексте лечения расстройств, сопровождающихся экспрессией NTB-A, путем введения описанного в данном документе антитела против NTB-A, относится к количеству такого антитела, которое является достаточным для подавления возникновения или ослабления одного или нескольких симптомов расстройства, сопровождающегося экспрессией NTB-A. Эффективное количество антитела вводят в соответствии со способами настоящего изобретения в эффективном режиме. Термин эффективный режим относится к сочетанию количества вводимого антитела и частоты введения, достаточному для достижения профилактического или терапевтического лечения расстройства.

С учетом подразделения аминокислотных замен на консервативные или неконсервативные, следующие аминокислотные замены относят к консервативным заменам: замена серина на треонин, аланин или аспарагин; замена треонина на пролин или серин; замена аспарагина на аспарагиновую кислоту, гистидин или серин; замена аспарагиновой кислоты на глутаминовую кислоту или аспарагин; замена глутаминовой кислоты на глутамин, лизин или аспарагиновую кислоту; замена глутамина на аргинин, лизин или глутаминовую кислоту; замена гистидина на тирозин или аспарагин; замена аргинина на лизин или глутамин; замена метионина на изолейцин, лейцин или валин; замена изолейцина на лейцин, валин или метионин; замена лейцина на валин, изолейцин или метионин; замена фенилаланина на тирозин или триптофан; замена тирозина на триптофан, гистидин или фенилаланин; замена пролина на треонин; замена аланина на серин; замена лизина на глутаминовую кислоту, глутамин или аргинин; замена валина на метионин, изолейцин или лейцин; и замена триптофана на фенилаланин или тирозин. Консервативные замены также могут включать замены аминокислот на аминокислоты того же класса. Аминокислоты подразделяют на классы следующим образом: группа I (гидрофобные боковые цепи): met, ala, val, leu, ile; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): cys, ser, thr; группа III (кислые боковые цепи): asp, glu; группа IV (основные боковые цепи): asn, gin, his, lys, arg; группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): gly, pro; и группа VI (ароматические боковые цепи): trp, tyr, phe.

Две аминокислотные последовательности обладают 100% идентичностью, если аминокислотные остатки двух аминокислотных последовательностей являются одинаковыми при выравнивании с максимальным соответствием. Сравнение последовательностей можно проводить с помощью стандартных компьютерных программ, таких как программы, входящие в состав компьютерного набора для биоинформатики Lasergene, который производится DNASTAR (Madison, Wisconsin). Другие способы сравнения двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей путем определения оптимального выравнивания хорошо известны специалистам в данной области, (см., например, Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc.1997); Wu et al. (eds.), Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins, in Methods in Gene Biotechnology 123-151 (CRC Press, Inc.1997); Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing (2nd ed., Academic Press, Inc. 1998). Две аминокислотные последовательности считаются практически идентичными, если эти две последовательности по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичны друг другу.

Процент идентичности последовательностей определяют путем максимального выравнивания последовательностей антител с использованием системы нумерации Rabat. После выравнивания, если исследуемый участок антитела (например, целый вариабельный домен тяжелой или легкой цепи) сравнивают с таким же участком стандартного антитела, определяют процент идентичности последовательностей исследуемого и стандартного антитела путем деления числа положений, занимаемых одинаковыми аминокислотами в исследуемом и стандартном антителах, на общее число выравненных положений двух участков, без учета гэпов, с последующим умножением на 100, чтобы получить значение процентов.

Композиции или способы, содержащие один или несколько из перечисленных элементов, могут включать и другие элементы, специально не указанные. Например, композиция, содержащая антитело, может содержать только антитело, или антитело в сочетании с другими ингредиентами.

Обозначение диапазона значений включает все целые числа в пределах диапазона или определяю

- 7 031025 щие диапазон.

Эффекторная функция антитела представляет собой функцию, за выполнение которой отвечает Fcучасток Ig. Такие функции могут включать, например, антитело-зависимую клеточную цитотоксичность, антитело-зависимый клеточный фагоцитоз или комплемент-зависимую цитотоксичность. Такая функция может осуществляться, например, в результате связывания Fc-участка с рецептором Fc на иммунной клетке, обладающей фагоцитарной или литической активностью, или в результате связывания Fc-участка с компонентами системы комплемента. Как правило, эффект (эффекты), опосредованный Fcсвязывающими клетками или компонентами комплемента, приводит к ингибированию и/или истощению NTB-A-направленных клеток. Fc участки антител могут привлекать клетки, экспрессирующие рецептор Fc (FcR), размещая их рядом с покрытыми антителами клетками-мишенями. Клетки, экспрессирующие поверхностный FcR, специфичный к IgG, такой как FcyRIII (CD16), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD64), могут действовать как эффекторные клетки, уничтожая IgG-покрытые клетки. Такие эффекторные клетки включают моноциты, макрофаги, природные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и эозинофилы. Взаимодействие FcyR с IgG активирует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) или антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP). ADCC опосредуется эффекторными клетками CD16⁺ через секрецию мембранных порообразующих белков и протеаз, а фагоцитоз опосредуется эффекторными клетками CD32⁺ и CD64⁺ (см. Fundamental Immunology, 4^th ed. , Paul ed., Lippincott-Raven, N.Y., 1997, Chapters 3, 17 and 30; Uchida et al., J. Exp.Med. 199: 1659-69, 2004; Akewanlop et al., Cancer Res. 61: 406165, 2001; Watanabe et al., Breast Cancer Res. Treat. 53: 199-207, 1999) . Помимо ADCC и ADCP Fc-участки антител, связанных с клетками, также могут активировать классический путь комплемента, индуцирующий комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC). Компонент системы комплемента C1q связывается с Fc-участками антител, образующих комплексы с антигенами. Связывание C1q с антителами, связанными с клетками, может инициировать каскад событий, включающих протеолитическую активацию С4 и С2 с образованием конвертазы С3. Расщепление С3 до С3Ь под действием конвертазы С3 приводит к активации терминальных компонентов комплемента, включающих С5Ь, С6, С7, С8 и С9. В совокупности указанные белки образуют разрушающие мембрану комплексные поры на клетках, покрытых антителами. Указанные поры нарушают целостность клеточных мембран, приводя к гибели клеток-мишеней (см. Immunobiology, 6^th ed., Janeway et al., Garland Science, N.Y., 2005, Chapter 2).

Термин антитело-зависимая клеточная цитотоксичность, или ADCC относится к механизму индуцирования гибели клеток, который определяется взаимодействием покрытых антителами клетокмишеней с иммунными клетками, обладающими литической активностью (также называемыми эффекторные клетки). Такие эффекторные клетки включают естественные киллеры, моноциты/макрофаги и нейтрофилы. Эффекторные клетки присоединяются к Fc-участку Ig, связанного с клетками-мишенями, по антиген-связывающим участкам. Гибель покрытых антителами клеток-мишеней опосредуется активностью эффекторных клеток.

Термин антитело-зависимый клеточной фагоцитоз, или ADCP, относится к процессу, включающему полную или частичную интернализацию покрытых антителами клеток фагоцитирующими иммунными клетками (такими как макрофаги, нейтрофилы и дендритные клетки), способными связываться с Fc-участком иммуноглобулина.

Термин комплемент-зависимая цитотоксичность или CDC относится к механизму индуцирования гибели клеток, в котором Fc-участок связанного с мишенью антитела активирует серию ферментативных реакций, приводящих к образованию отверстий в мембране клетки-мишени. Как правило, комплексы антиген-антитело, например, присутствующие на покрытых антителами клетках-мишенях, связывают компонент комплемент C1q и активируют его, а он, в свою очередь, активирует каскад комплемента, приводящий к гибели клеток-мишеней. Активация комплемента также может привести к осаждению компонентов комплемента на поверхности клетки-мишени, индуцирующему ADCC путем связывания рецепторов комплемента (например, CR3) на лейкоцитах.

Термин цитотоксический эффект относится к истощению, устранению и/или уничтожению клеток-мишеней. Цитотоксическое средство представляет собой средство, оказывающее цитотоксическое действие на клетки. Цитотоксические средства можно конъюгировать с антителом или вводить в сочетании с антителом.

Термин цитостатический эффект относится к ингибированию пролиферации клеток. Цитостатическое средство представляет собой средство, оказывающее цитостатическое действие на клетки, ингибируя рост и/или размножение конкретной подгруппы клеток. Цитостатические средства можно конъюгировать с антителом или вводить в сочетании с антителом.

Термин фармацевтически приемлемый означает одобренный или заслуживающий одобрения регулятивным органом федерального правительства или правительства штата, или перечисленный в Фармакопее США, или другой общепризнанной фармакопее, для применения на животных и, более предпочтительно, на людях. Термин фармацевтически совместимый ингредиент относится к фармацевтически приемлемому разбавителю, адъюванту, наполнителю или носителю, который может входить в состав композиции наряду с антителом против NTB-A.

Фраза фармацевтически приемлемая соль относится к фармацевтически приемлемым органиче

- 8 031025 ским или неорганическим солям антитела против NTB-A, или его конъюгата, или средства, вводимого с антителом против NTB-A. Примеры солей включают сульфат, цитрат, ацетат, оксалат, хлорид, бромид, иодид, нитрат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, лактат, салицилат, кислый цитрат, тартрат, олеат, таннат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкуронат, сахарат, формиат, бензоат, глутамат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, птолуолсульфонат, и памоат (т.е. 1,1'-метилен-бис-(2-гидрокси-3-нафтоат)). Фармацевтически приемлемая соль может быть образована путем включения другой молекулы, такой как ацетат-ион, сукцинат-ион или другой противоион. Противоион может представлять собой любой органический или неорганический радикал, который стабилизирует заряд на исходном соединении. Кроме того, структура фармацевтически приемлемой соли может содержать более одного заряженного атома. Фармацевтически приемлемая соль, содержащая несколько заряженных атомов, может иметь несколько противоионов. Следовательно, фармацевтически приемлемая соль может иметь один или несколько заряженных атомов и/или один или несколько противоионов.

Если из контекста не следует иное, выражение примерно X, или приблизительно X, следует понимать, как значение X, приведенное с точностью ±10%.

Гликозилирование зависит от типа клетки-хозяина, используемой для экспрессии антитела. Поскольку клетки, используемые для экспрессии рекомбинантных антител как потенциальных терапевтических средств, редко представляют собой нативные клетки, характер гликозилирования рекомбинантных антител, экспрессированных в ненативных клетках, и антител, содержащих такие же первичные последовательности тяжелой и легкой цепей, экспрессированных в нативных клетках, может сильно различаться. Линии клеток млекопитающих, полученные из грызунов (такие как SP2/0, СНО или BHK), могут обеспечивать гликозилирование, имеющее некоторое сходство с человеческим гликозилированием. Однако некоторые человеческие компоненты могут отсутствовать (например, 2,6-связанное сиалилирование), а ряд других компонентов, как правило, отсутствующих в организме человека, могут присутствовать, например, такие как концевые сиаловые кислоты, которые обычно отсутствуют в клетках человека (например, NeuGc), или концевой остаток галактозы, связанный с другим остатком галактозы связью, как правило, отсутствующей в клетках человека (структуры Gal-Gal). Рекомбинантные IgG, экспрессированные в клетках СНО, как правило, имеют меньшую степень галактозилирования, чем рекомбинантные иммуноглобулины, экспрессированные в клетках мышиной миеломы. Соответственно, рекомбинантные IgG, продуцируемые в клетках СНО, могут содержать более высокие уровни GO гликанов, чем rlgG, продуцируемые в линиях клеток мышиной миеломы.

Структуру гликозилирования антител можно анализировать с помощью традиционных методов, включающих углеводный анализ, в том числе лектиновую хроматографию, ЯМР, масс-спектрометрию, ВЭЖХ, гель-проникающую хроматографию, анализ моносахаридного состава, последовательное ферментативное расщепление и высокоэффективную анионообменную хроматографию с импульсной амперометрической детекцией, где анионообменную хроматографию проводят при высоких значениях рН, чтобы разделить олигосахариды на основе заряда. Методы высвобождения олигосахаридов для аналитических целей включают ферментативную обработку (ее обычно проводят с использованием пептид-Nглюкозидазы F/эндо-бета-галактозидазы), отщепление с помощью сильнощелочной среды, с высвобождением, в основном, О-связанных структур, и химические методы с использованием безводного гидразина с высвобождением как N-, так и О-связанных олигосахаридов.

Таким образом, характер гликозилирования рекомбинантного экспрессированного антитела может определяться типом клеток, в которых осуществляется экспрессия (например, СНО), и отличаться на детектируемом уровне по результатам любого из вышеуказанных методов от характера гликозилирования в клетках других типов, в частности клетках других видов, таких как мышь и человек.

Подробное описание изобретения

I. Общие сведения.

Изобретение предлагает антитела, способные специфически связываться с NTB-A. Указанные антитела можно использовать, например, для лечения и диагностики разных видов рака, сопровождающихся экспрессией NTB-A, а также для детекции NTB-A (например, детекции экспрессии NTB-A на клетках). Изобретение также предлагает способы такого лечения, диагностики и детекции NTB-A с использованием антител настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также предлагает способ лечения множественной миеломы с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC), который специфически связывается с NTB-A. Считается, что авторы настоящего изобретения первыми продемонстрировали уничтожение клеток множественной миеломы с использованием ADC против NTB-A. В состав ADC против NTB-A, предназначенного для лечения множественной миеломы, может входить, например, ADC, содержащий описанное здесь антитело против NTB-A. В одном аспекте, способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, антитела, способного специфически связываться с NTB-A человека, где антитело конъюгировано с цитотоксическим средством.

II. Молекулы-мишени.

Если не указано иначе, NTB-A представляет собой NTB-A человека. Типичную человеческую по

- 9 031025 следовательность обозначают UniProtKB/Swiss-Prot с номером доступа Q96DU3. Известны четыре изоформы сплайсинг-вариантов. Зрелый внеклеточный участок ограничен остатками 22-226 Q96DU3.

Если из контекста не следует иное, ссылка на NTB-A относится, по меньшей мере, к внеклеточному домену белка, как правило, к полноразмерному белку, не считая отщепляемый сигнальный пептид (аминокислоты 1-21 Q96DU3).

III. Антитела настоящего изобретения.

В одном аспекте настоящее изобретение предлагает выделенные антитела против NTBA, способные специфически связываться с эпитопом зрелого внеклеточного участка NTB-A (например, эпитоп, включающий аминокислотные остатки 22-226 последовательности UniProtKB/Swiss-Prot с номером доступа Q96DU3). В некоторых вариантах осуществления антитело против NTB-A в соответствии с настоящим изобретением может конкурировать за связывание с антигеном NTB-A человека с моноклональным антителом, имеющим такие же домены VH/VL, как и mAb против NTB-A, идентифицированное и выделенное авторами настоящего изобретения. В некоторых аспектах антитело против NTB-A настоящего изобретения представляет собой антитело мыши, определенное в настоящем описании, или его химерную или гуманизированную форму.

Один из способов измерения сродства антитела к антигену-мишени включает определение кажущейся константы диссоциации комплекса антитела с антигеном. В некоторых аспектах кажущаяся константа диссоциации (Kd) комплекса описанного здесь антитела с NTB-A находится в диапазоне от 0,1 до 10 нМ, предпочтительно от 0,1 до 5 нМ, более предпочтительно от 0,1 до 2 нМ или от 0,1 до 1 нМ.

Идентифицировано и охарактеризовано моноклональное антитело мыши против NTB-A, обозначенное mAb 11A1. Антитело мыши 11А1 представляет собой антитело IgG1. Обнаружено, что mAb 11А1 связывается с полноразмерным внеклеточным участком NTB-A (остатки 22-226 UniProtKB/Swiss-Prot, номер доступа Q96DU3) с Kd 0,13 нМ, но не с изоформой 4 NTB-A (в которой пропущены остатки 18128 последовательности с номером доступа Q96DU3). Также идентифицировано и охарактеризовано второе антитело, обозначенное mAb 26В7. Обнаружено, что mAb 26B7 конкурирует с mAb 11A1 за связывание с NTB-A человека в анализе конкурентного связывания (см. пример 5) и связывается с NTB-A с Kd 0,16 нМ. Аминокислотные последовательности CDR VH, VL и VH/VL по системе Kabat для каждого из моноклональных антител мыши 11А1 и 26В7 определены и приведены ниже в табл. 1 и 2. Антитела 11А1 и 26В7 не связываются с NTB-A человекообразных обезьян.

Таблица 1. Аминокислотные последовательности вариабельных участков mAb против NTB-A

mAb (VH/VL)	Аминокислотная последовательность +4	SEQ ID NO:
11А1	mkcswiifflmavvtgvnsevhlqqsgaelvkpgasvklsctasgfηί	1
(VH)	kdyyvhwvkqrteqglewigkidpedgeikyapkf qgeat itadt ssn t a у 1 ql· s s 11 se dt a vy у car ystyfdywgqgt 111vs s
11А1	TiecnT-llwvlllwvpqstqdivlcqspaclavslgqkatisckaskk	2
(VL)	vtifgsisalhwyqqkpgqppkliyngaklesgvsarfsdsgsqnrsq fgnqlsltltidpveaddaatyyclqnkevpytfgggtkleikr
26В7 (VH)	mgwsyiilflvatatgvhsqvqllqpqaewkpgtsvklsckasgynf tiywinwvk1rpgqg1ew i gdihpgrgntnlnekfktkat 11vdt s s s taymqlnslafedsalyycarededwyfdvwgagttvtvss	3
26В7 (VL)	mkllaellglllfcfsgvrcdl·qmnqspsslsaslqdtititcrasqg isiwfnwyqqksgnipklliyktsnlhtgvpprfsgsgsgtdftltis slqpediatyyclqsqsypytfgggtkleikr	4

t Показанные аминокислотные последовательности содержат N-концевой сигнальный пептид (выделен подчеркиванием) Если из контекста явно не следует иное, в данном описании ссылки на домены VH и VL указанных моноклональных антител относятся к зрелому полипептиду (и, следовательно, не включают сигнальный пептцд) t Участки CDR, определенные в соответствии с системой Kabat выделены жирным шрифтом

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает выделенное антитело мыши, содержащее (i) домен VH, аминокислотная последовательность которого включает остатки 20-135 последовательности SEQ ID NO:1 и (ii) домена VL, аминокислотная последовательность которого включает остатки 21-140 последовательности SEQ ID NO:2 или его химерные или гуманизированные формы. Как и антитело мыши, его химерные и гуманизированные формы связывают NTBA человека, но не NTB-A человекообразных обезьян.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает выделенное антитело, которое конкурирует за специфическое связывание с NTB-A человека с моноклональным антителом (mAb), содержащим (i) домен VH, аминокислотная последовательность которого включает остатки 20135 последовательности SEQ ID NO:1, и (ii) домен VL, аминокислотная последовательность которого включает остатки 21-140 последовательности SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение также предлагает выделенное антитело, способное специфически связываться с тем же эпитопом NTB-A человека, что и моноклональное антитело, содержащее (а) домен VH, аминокислотная последовательность которого включает остатки 20-135 последовательности SEQ ID

- 10 031025

NO:1, и домен VL, аминокислотная последовательность которого включает остатки 21-140 последовательности SEQ ID NO:2, или (b) домен VH, аминокислотная последовательность которого включает остатки 20-137 последовательности SEQ ID NO:3, и домен VL, аминокислотная последовательность которого включает остатки 21-128 последовательности SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах антитело связывается с тем же эпитопом NTB-A, что и вышеупомянутое mAb, что определяют методом картирования эпитопов, выбранного из (i) рентгеновской сокристаллографии, (ii) матричного сканирования олигопептидов (также иногда называемого сканирование пептидов с перекрыванием, или анализ pepscan), (iii) сайт-направленного мутагенеза (такого как аланин-сканирующий мутагенез), и (iv) масс-спектрометрии с обменом H/D. Указанные методы картирования эпитопов хорошо известны в данной области и могут успешно использоваться в целях настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также предлагает выделенное антитело, которое специфически связывается с NTB-A человека и содержит (i) домен VH, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80% идентична последовательности, включающей остатки 20-135 последовательности SEQ ID NO:1, или остатки 20-137 последовательности SEQ ID NO:3; и/или (ii) домен VL, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80% идентична последовательности, включающей остатки 21-140 последовательности SEQ ID NO:2, или остатки 21-128 последовательности SEQ ID NO:4. Как правило, если антитело содержит и вариабельный домен тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи, домены VH и VL соответствуют одному и тому же стандартному антителу из табл. 1 (т. е. последовательности доменов VH и VL обычно имеют указанную степень идентичности по отношению к остаткам 20-135 последовательности SEQ ID NO:1 и остаткам 21-140 последовательности SEQ ID NO:2, соответственно, или остаткам 20-137 последовательности SEQ ID NO:3 и остаткам 21-128 последовательности SEQ ID NO:4 соответственно).

Настоящее изобретение также предлагает выделенное антитело, которое специфически связывается с NTB-A человека и содержит (i) домен VH, полученный из домена VH, аминокислотная последовательность которого включает остатки 20-135 последовательности SEQ ID NO:1, или остатки 20-137 последовательности SEQ ID NO:3, и/или (ii) домен VL, полученный из домена VL, аминокислотная последовательность которого включает остатки 21-140 последовательности SEQ ID NO:2 или остатки 21-128 последовательности SEQ ID NO:4. Например, домены VH и/или VL могут быть соответственно получены из (а) домена VH, аминокислотная последовательность которого включает остатки 20-135 последовательности SEQ ID NO:1, и/или домена VL, аминокислотная последовательность которого включает остатки 21-140 последовательности SEQ ID NO:2, или (b) домена VH, аминокислотная последовательность которого включает остатки 20-137 последовательности SEQ ID NO:3, и/или домена VL, аминокислотная последовательность которого включает остатки 21-128 последовательности SEQ ID NO:4. Каркасные последовательности вариабельного домена VH или VL могут быть получены полностью или практически полностью из последовательности иммуноглобулина, отличной от эталонной последовательности, такой как, например, последовательность иммуноглобулина другого вида (например, человека). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает гуманизированное антитело, содержащее один или оба из гуманизированного домена VH и гуманизированного домена VL, полученных из одного или обоих доменов VH и VL, указанных в приведенных выше пунктах (а) или (b) , описанное далее в данном документе. Как правило, но не всегда, гуманизированные антитела сохраняют некоторые нечеловеческие остатки из донорных видов в человеческих каркасных участках вариабельного домена.

Настоящее изобретение также предлагает моноклональное антитело, которое специфически связывается с NTB-A и содержит участки, определяющие комплементарность (CDR), последовательности которых описаны в SEQ ID NO:5 (CDR1), SEQ ID NO:6 (CDR2) и SEQ ID NO:7 (CDR3), и CDR легкой цепи, последовательности которых описаны в SEQ ID NO:8 (CDR4), SEQ ID NO:9 (CDR5) и SEQ ID NO:10 (CDR6), причем каждый CDR может содержать 0, 1, 2 или 3 консервативные аминокислотные замены. В некоторых аспектах антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело. В некоторых аспектах каждый CDR может содержать 0 или 1 консервативную аминокислотную замену. Такое антитело может представлять собой, например, мышиное, химерное, гуманизированное или венированное антитело.

Настоящее изобретение также предлагает моноклональное антитело, которое специфически связывается с NTB-A и содержит участки, определяющие комплементарность (CDR), последовательности которых описаны в SEQ ID NO:11 (CDR1), SEQ ID NO:12 (CDR2) и SEQ ID NO:13 (CDR3), и CDR легкой цепи, последовательности которых описаны в SEQ ID NO:14 (CDR4), SEQ ID NO:15 (CDR5) и SEQ ID NO:16 (CDR6), причем каждый CDR может содержать 0, 1, 2 или 3 консервативные аминокислотные замены. В некоторых аспектах антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело. Такое антитело может представлять собой, например, мышиное, химерное, гуманизированное или венированное антитело.

Способность антител изобретения к специфическому связыванию можно исследовать с помощью любого способа, известного в данной области. Подходящие иммуноанализы включают, без ограничения, аналитические системы, использующие такие методы, как вестерн-блоттинг, ELISA, радиоиммуноанали

- 11 031025 зы, сэндвич-иммуноанализы, иммунопреципитация, анализы с использованием преципитина, анализы диффузии преципитина в геле, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы, иммуноанализы с использованием белка А и анализы фиксации комплемента. Такие анализы являются рутинными и хорошо известны в данной области (см., например, Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, John Wiley & Sons, Inc., New York). Также можно использовать обычные анализы, такие как анализы, описанные в Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988). Кроме того, Biacore® (GE Healthcare, Piscataway, NJ) является лишь одним из множества форматов анализа методом поверхностного плазмонного резонанса, которые обычно используются для анализа связывания моноклональных антител. В других ссылках, включающих The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn Morris ed. Humana Press, 1996), описаны альтернативные методы, которые можно использовать для связывания антител и которые могут предоставлять сравнимые данные, касающиеся специфичности антител к NTB-A.

Чтобы определить, конкурирует ли антитело за специфическое связывание с NTB-A человека с mAb, содержащим домены VH и VL mAb 11A1 (т.е. домен VH, аминокислотная последовательность которого включает остатки 20-135 последовательности SEQ ID NO:1, и домен VL, аминокислотная последовательность которого включает остатки 21-140 последовательности SEQ ID NO:2), используют описанный ниже анализ конкурентного связывания.

В данном анализе используют стандартное антитело, которое представляет собой антитело мыши 11А1, относящееся к IgG1 (т.е. которое содержит домены VH и VL 11A1 в двухвалентной структуре нативного антитела). NTB-A-положительные клетки Ramos высевают в количестве 2х10⁵ клеток на лунку в 96-луночный планшет с V-образным дном (Thermo Scientific, Rochester, NY). Пятикратные серийные разведения 2Х концентрированных антител (20 мкг/мл представляет собой 2Х исходную концентрацию немеченных выбранных антител) получают в буфере FACS (PBS + 2% фетальной бычьей сыворотки + 0,02% азида натрия), содержащем 2Х постоянную концентрацию AT'647-меченого антитела мыши 11А1 при 2Х значении Kd 0,0188 мкг/мл (0,0376 мкг/мл). Растворы антитела инкубируют с клетками в течение 1 ч на льду, в защищенном от света месте. Клетки дважды промывают буфером FACS и анализируют на проточном цитометре LSRII (BD Biosciences, San Jose, CA). Результаты приводят в виде процента от максимального связывания. Выбранное антитело конкурирует с меченым стандартным антителом за специфическое связывание с NTB-A, если выбранное антитело уменьшает связывание стандартного антитела с NTB-A до уровня менее 45% от максимального связывания (т.е. от 0 до 45%) при концентрации немеченого выбранного антитела 10 мкг/мл. В некоторых аспектах антитело конкурирует за связывание, если выбранное антитело уменьшает связывание стандартного антитела NTB-A до уровня менее 30% от максимального связывания при концентрации немеченого выбранного антитела 10 мкг/мл. В некоторых аспектах антитело конкурирует за связывание, если выбранное антитело уменьшает связывание стандартного антитела с NTB-A до уровня менее 20% от максимального связывания при концентрации немеченого выбранного антитела 10 мкг/мл. В некоторых аспектах антитело конкурирует за связывание, если выбранное антитело уменьшает связывание стандартного антитела с NTB-A до уровня менее 10% от максимального связывания при концентрации немеченого выбранного антитела 10 мкг/мл. В некоторых аспектах антитело конкурирует за связывание, если выбранное антитело уменьшает связывание стандартного антитела с NTB-A до уровня менее 5% от максимального связывания при концентрации немеченого выбранного антитела 10 мкг/мл. В некоторых аспектах антитело конкурирует за связывание, если выбранное антитело уменьшает связывание стандартного антитела с NTB-A до уровня менее 2%, или менее 1% от максимального связывания при концентрации немеченого выбранного антитела 10 мкг/мл. Как можно видеть на фиг. 2, антитело мыши 11А1 конкурирует за связывание с самим собой и с антителом 26В7. Указанное антитело не конкурирует за связывание с антителом НТ-7.

В некоторых вариантах осуществления антитело против NTBA содержит вариабельный домен тяжелой цепи и/или вариабельный домен легкой цепи, которые, по существу, идентичны перечисленным в табл. 1 вариабельным доменам тяжелой и/или легкой цепи антитела.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления антитело против NTB-A содержит (а) вариабельный домен тяжелой цепи, последовательность которого, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 99,5% идентична аминокислотной последовательности домена VH, приведенной в табл. 1, и/или (b) вариабельный домен легкой цепи, последовательность которого по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 99,5% идентична аминокислотной последовательности домена VL, приведенного в табл. 1. В конкретных вариантах антитело против NTB-A содержит (а) вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность домена VH, приведенную в табл. 1, и/или (b) вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность домена VL, приведенную в табл. 1. В некоторых вариантах осуществления, где антитело содержит как вариабельный домен тяжелой цепи, так и вариабельный домен легкой цепи, ва

- 12 031025 риабельные домены тяжелой и легкой цепей соответствуют одному и тому же стандартному антителу, приведенному в табл. 1. Например, в более конкретных вариантах антитело против NTB-A содержит вариабельные домены легкой и тяжелой цепей, имеющие соответствующие аминокислотные последовательности VH и VL, выбранные из следующих пар последовательностей VH/VL: (I) остатки 20-135 SEQ ID NO:1 и остатки 21-140 SEQ ID NO:2; и (II) остатки 20-137 SEQ ID NO:3 и остатки 21-128 SEQ ID NO:4.

В некоторых вариантах осуществления антитело против NTB-A настоящего изобретения содержит один или несколько CDR, антитела против NTB-A, приведенного в табл. 1. CDR доменов VH и VL из табл. 1, определенные по системе Rabat, также приведены ниже в табл. 2.

Таблица 2. Последовательности CDR доменов VH и VL антитела против NTB-A

тАЬ	CDR	Аминокислотная Последовательность	SEO ID NO:
11А1	CDR-H1	dyyvh	5
CDR-H2	kidpedge ikyapkf qg	6
CDR-H3	ystyfdy	7
CDR-L1	kaskkvtifgsisalh	8
CDR-L2	ngakles	9
CDR-L3	lqnkevpyt	10
26В7	CDR-H1	iywin	11
CDR-H2	dihpgrgntnlnekfkt	12
CDR-H3	ededwyfdv	13
CDR-L1	rasqgisiwfn	14
CDR-L2	ktsnlht	15
CDR-L3	lqsqsypyt	16

Например, в некоторых вариантах антитело содержит CDR тяжелой цепи (по меньшей мере один из участков CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) и/или соответствующий CDR легкой цепи (по меньшей мере один из участков CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3) антитела, приведенного в табл. 1. В типичных вариантах осуществления антитело против NTB-A содержит два или три CDR тяжелой цепи и/или два или три CDR легкой цепи антитела, приведенного в табл. 1. В некоторых вариантах, где антитело против NTB-A содержит по меньшей мере один CDR тяжелой цепи антитела, приведенного в табл. 1, антитело также содержит по меньшей мере один соответствующий CDR легкой цепи.

В конкретных вариантах антитело против NTB-A содержит вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, где вариабельный домен тяжелой или легкой цепи, включает (а) набор из трех CDR, соответствующих CDR тяжелой или легкой цепи, присутствующих в антителе, приведенном в табл. 1, и (b) набор из четырех каркасных участков. Например, антитело против NTB-A может содержать вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, где вариабельный домен тяжелой или легкой цепи содержит (а) набор из трех CDR, где набор CDR получен из антитела, приведенного в табл. 1, и (b) набор из четырех каркасных участков, где набор каркасных участков является идентичным набору каркасных областей антитела, приведенного в табл. 1, или отличается от него (например, получен из человеческих каркасных участков).

В некоторых вариантах антитело против NTB-A содержит как (I) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий (а) набор из трех CDR, соответствующих CDR тяжелой цепи антитела, приведенного в табл. 1, и (b) набор из четырех каркасных участков; так и (II) вариабельный домен легкой цепи, содержащий (а) набор из трех CDR, соответствующих CDR легкой цепи антитела, приведенного в табл. 1, и (b) набор из четырех каркасных участков. В типичных вариантах осуществления CDR тяжелой цепи и легкой цепи получены из одного и того же антитела, приведенного в табл. 1.

В некоторых вариантах осуществления антитело против NTB-A настоящего изобретения содержит вариабельный участок тяжелой и/или легкой цепи, содержащий по меньшей мере один CDR, имеющий ноль, одну, две, три или четыре аминокислотные замены (предпочтительно консервативные замены) по сравнению с CDR доменов VL или VH, приведенных в табл. 1. В некоторых вариантах, например, антитело против NTB-A настоящего изобретения содержит CDR тяжелой цепи, CDR1-H1, CDR-H2 и CDRН3, где по меньшей мере один из CDR-H1, CDR2-H2 и CDR-H3 содержит ноль, одну, две, три или четыре аминокислотные замены (предпочтительно консервативные замены) по сравнению с доменом VH, приведенным в табл. 1. В других вариантах антитело против NTB-A настоящего изобретения содержит CDR легкой цепи, CDR1-L1, CDR2-L2 и CDR3-L3, где по меньшей мере один из CDR1-L1, CDR2-L2 и CDR3-L3 содержит ноль, одну, две, три или четыре аминокислотные замены (предпочтительно консервативные замены) по сравнению с доменом VL, приведенным в табл. 1. В некоторых вариантах осуществления антитело против NTB-A содержит оба описанных выше набора CDR тяжелой цепи и легкой цепи.

- 13 031025

Особенно подходящие антитела против NTB-A содержат вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1-L1, CDR2-L2 и CDR3-L3, и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1-H1, CDR2-H2 и CDR3-H3, где указанный набор CDR тяжелых и легких цепей, содержит шесть или менее, как правило, пять или менее, более предпочтительно четыре или менее, и наиболее предпочтительно 3 или менее аминокислотные замены (желательно консервативные замены) по сравнению с CDR домена VH и домена VL, приведенных в табл. 1; в некоторых таких вариантах, шесть или менее аминокислотных замен вводят в последовательности CDR домена VH и домена VL антитела, приведенного в табл. 1.

В некоторых вариантах осуществления антитело против NTB-A настоящего изобретения содержит гуманизированный домен VH и/или гуманизированный домен VL, полученные соответственно из доменов VH и/или VL, приведенных в табл. 1. В конкретных вариантах антитело против NTB-A содержит как гуманизированный домен VH, так и гуманизированный домен VL, полученные соответственно из домена VH и домена VL, приведенных в таблице 1. Как правило, гуманизированные домены VH и VL получают из одного и того же антитела, приведенного в табл. 1.

Гуманизированное антитело представляет собой рекомбинантное антитело, полученное путем прививки CDR из нечеловеческих донорных антител на акцепторные последовательности человеческих антител (см., например, Queen, патенты США 5530101 и 5585089; Winter, патент США 5225539; Carter, патент США 6407213; Adair, патент США 5859205, и Foote, патент США 6881557). Последовательности акцепторного антитела могут включать, например, зрелую последовательность человеческого антитела, смесь таких последовательностей, консенсусные последовательности человеческих антител или последовательность участка из зародышевой линии. Таким образом, гуманизированное антитело представляет собой антитело, в котором некоторые или все CDR полностью или практически полностью получены из донорного антитела, а каркасные последовательности вариабельного домена и константные домены, если они присутствуют, полностью или практически полностью получены из последовательностей человеческих антител. Подобным образом, гуманизированный домен VH содержит по меньшей мере один, два, как правило, все три CDR, полностью или практически полностью полученные из домена VH донорного антитела, а каркасные последовательности вариабельного домена полностью или практически полностью получены из домена VH человеческого антитела; такой гуманизированный домен VH антитела может быть связан, как правило, по амино-концу, с константным участком тяжелой цепи иммуноглобулина, полностью или практически полностью полученным из человеческой последовательности константного участка тяжелой цепи. Подобным образом, гуманизированный домен VL содержит по меньшей мере один, два, как правило, все три CDR, полностью или практически полностью полученные из домена VL донорного антитела, а каркасные последовательности вариабельного участка полностью или практически полностью получены из домена VL человеческого антитела; такой гуманизированный домен VL может быть связан, как правило, по аминоконцу, с константным участком легкой цепи иммуноглобулина, полностью или практически полностью полученным из человеческой последовательности константного участка легкой цепи. Как правило, гуманизированное антитело содержит как гуманизированный домен VH, так и гуманизированный домен VL. Часто, но не всегда, гуманизированные антитела сохраняют некоторые нечеловеческие остатки в каркасных участках человеческого вариабельного домена, позволяющие улучшить присущие им характеристики связывания (например, мутации в рамках считывания могут потребоваться для сохранения сродства связывания при гуманизации антитела).

Хотя зачастую все шесть CDR (предпочтительно определенные по системе Kabat) гуманизированного антитела получают из нечеловеческого антитела, также можно получить гуманизированные антитела, в которых не все CDR, (например, по меньшей мере 3, 4 или 5 CDR) получены из нечеловеческого антитела (например, Pascalis et al., J. Immunol. 169: 3076, 2002; Vajdos et al., J. Mol.Biol, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol.Immunol. 36: 1079-1091, 1999; Tamura et al., J. Immunol, 164: 1432-1441, 2000). В некоторых аспектах гуманизированные антитела содержат все шесть CDR, но в один или несколько CDR вводят ноль, одну, две или три консервативные замены.

Некоторые аминокислотные остатки каркасного участка человеческого вариабельного домена могут быть выбраны для замещения на основе их возможного влияния на конформацию CDR и/или связывание с антигеном. Анализ такого возможного влияния включает моделирование, определение характеристик аминокислот в конкретных положениях, или эмпирическое наблюдение влияния замещения или мутагенеза конкретных аминокислот.

Например, если аминокислотный остаток из каркасного участка мышиного вариабельного домена отличается от выбранного остатка из каркасного участка человеческого вариабельного домена, аминокислота человеческого каркасного участка может быть заменена эквивалентной аминокислотой каркасного участка антитела мыши, если можно ожидать, что аминокислота:

(1) нековалентно и непосредственно связывается с антигеном, (2) примыкает к участку CDR, (3) иным образом взаимодействует с участком CDR (например, находится на расстоянии примерно 6А от участка CDR); или (4) опосредует взаимодействие между тяжелой и легкой цепями.

- 14 031025

Другой возможный вариант включает замену определенных остатков CDR антитела мыши на соответствующие остатки последовательностей CDR человека, как правило, CDR акцепторных последовательностей человека, используемых при конструировании примеров гуманизированных антител. В некоторых антителах только часть CDR, а именно подгруппа остатков CDR, необходимых для связывания, называемых SDR, требуется для сохранения способности гуманизированного антитела к связыванию. Остатки CDR, не контактирующие с антигеном и не входящие в подгруппу SDR, можно определить на основе предыдущих исследований (например, остатки Н60-Н65 из CDRH2 зачастую не требуются) участков CDR Kabat, лежащих за пределами гипервариабельных петель Chothia (Chothia, J. Mol. Biol. 196: 901, 1987), с помощью молекулярного моделирования, и/или эмпирически, или как описано в Gonzales et al., Mol.Immunol. 41: 863, 2004. В таких гуманизированных антителах существуют положения, в которых отсутствует один или несколько донорных остатков CDR или в которых пропущен весь донорный CDR, и аминокислота, занимающая такое положение, может представлять собой аминокислоту, занимающую соответствующее положение (в соответствии с нумерацией Kabat) в последовательности акцепторного антитела. Число таких замен акцепторных аминокислот на донорные, введенных в CDR, отражает баланс конкурирующих факторов. Такие замены могут иметь преимущество, заключающееся в уменьшении числа аминокислот мыши в гуманизированном антителе и, следовательно, в уменьшении потенциальной иммуногенности. Однако замены могут также вызывать изменения сродства, а значительного снижения сродства предпочтительно нужно избегать. В другом варианте один или несколько остатков CDR гуманизированного антитела против NTB-A (которые иначе были бы таким же, как остатки CDR антитела, приведенного в табл. 1) можно заменить на соответствующие остатки CDR антитела, отличного от приведенного в табл. 1. Положения CDR и аминокислоты для замены также можно выбрать эмпирически.

Можно осуществить и другие аминокислотные замены, хотя и не предпочтительные, например, среди каркасных остатков, которые не контактируют с CDR, или даже среди некоторых остатков, которые могут контактировать с CDR, или среди аминокислот, входящих в состав CDR. Часто замены, сделанные в варианте гуманизированных последовательностей, являются консервативными по отношению к замененным аминокислотам. Предпочтительно, такие замены, консервативные или не консервативные, не оказывают существенного влияния на сродство связывания или активность гуманизированного антитела, т.е. его способность связывать NTB-A человека или подавлять рост раковых клеток.

Предпочтительные антитела против NTB-A или их конъюгированные формы (например, конъюгаты антитело-лекарственное средство) подавляют развитие рака (например, ингибируют рост клеток, метастазирование и/или летальность для организмов), как показано на раковых клетках, размножающихся в культуре, на животных моделях или в клинических испытаниях. Животные модели можно получить путем имплантации NTB-A-экспрессирующих опухолевых клеточных линий человека в подходящие штаммы иммунодефицитных грызунов, например, бестимусных голых мышей или мышей SCID. Указанные линии опухолевых клеток можно получить в иммунодефицитных хозяевах-грызунах либо в виде солидной опухоли путем подкожной инъекции или в виде распространенной опухоли путем внутривенной инъекции. После того как указанные модели опухоли приживутся в организме хозяина, их можно использовать для оценки терапевтической эффективности антител против NTB-A, или их конъюгированных форм.

В некоторых вариантах антитело против NTB-A настоящего изобретения содержит домен VH и/или VL, связанный по меньшей мере с частью константного участка иммуноглобулина (например, константного участка человеческого иммуноглобулина). Например, в некоторых вариантах осуществления антитело против NTB-A содержит первую и вторую полипептидные цепи, где первая полипептидная цепь содержит описанный здесь домен VH, связанный по меньшей мере с частью константного участка тяжелой цепи иммуноглобулина, а вторая полипептидная цепь содержит описанный здесь домен VL, связанный по меньшей мере с частью константного участка легкой цепи иммуноглобулина. Как правило, домен VH или VL связан по амино-концу с константным участком иммуноглобулина или его частью. В конкретных вариантах антитела, содержащего первую и вторую полипептидные цепи, первая и вторая полипептидные цепи имеют доменную структуру, соответствующую тяжелой и легкой цепям интактного нативного антитела, например первая полипептидная (тяжелая) цепь имеет доменную структуру, которая включает в направлении от амино-конца к карбокси-концу VH-СН1-шарнир-СН2-СН3, а вторая полипептидная (легкая) цепь имеет доменную структуру, которая включает в направлении от амино-конца к карбокси-концу VL-CL.

В других вариантах осуществления антитело против NTB-A представляет собой одноцепочечное антитело, содержащее домен VH, домен VL и по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (например, константный участок тяжелой цепи, в котором отсутствует домен СН1), соединенные в одну полипептидную цепь. Например, домены VH и VL можно объединить с получением одноцепочечного Fv (scFv) в VH/VL или VL/VH (аминоконцевой/карбоксиконцевой) ориентации, a scFv можно присоединить (как правило, по амино-концу) к константному участку тяжелой цепи, такому как, например, константный участок, содержащий домены СН2 и СН3, но не содержащий домен CH1. ScFv обычно присоединяют к константному участку посредством линкера, такого как, например, линкер, полученный из шарнирного участка иммуноглобулина.

- 15 031025

Выбор константного участка может зависеть, отчасти, от типа желательной активности, включающей антитело-зависимую клеточную цитотоксичность, антитело-зависимый клеточный фагоцитоз и/или комплемент-зависимую цитотоксичность. Например, человеческие изотипы IgG1 и IgG3 обладают высокой комплемент-зависимой цитотоксичностью, человеческий изотип IgG2 обладает низкой комплементзависимой цитотоксичностью, а человеческий IgG4 не обладает комплемент-зависимой цитотоксичностью. Человеческие IgG1 и IgG3 также индуцируют более интенсивные клеточные эффекторные функции, чем человеческие IgG2 и IgG4. Константные участки легкой цепи могут относиться к подклассам лямбда или каппа. Антитела можно экспрессировать, например, в виде тетрамеров, содержащих две легкие и две тяжелые цепи, в виде отдельных тяжелых цепей, легких цепей, в виде Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv, или в виде одноцепочечных антител, в которых вариабельные домены тяжелой и легкой цепей связаны через спейсер. Кроме того, если это необходимо, в константные участки можно ввести мутацию. В некоторых аспектах мутантная форма природного человеческого константного участка обладает пониженным связыванием с рецептором Fcy по сравнению с природным человеческим константным участком.

Человеческие константные участки характеризуются аллотипическими вариациями и изоаллотипическими вариациями среди разных индивидуумов, т. е. константные участки у разных людей могут различаться по одному или нескольким полиморфным положениям. Отличие изоаллотипов от аллотипов заключается в том, что сыворотка, распознающая изоаллотип, связывается с неполиморфным участком одного или нескольких других изотипов.

Одна или несколько аминокислот на амино- или карбокси-конце легкой и/или тяжелой цепи, например, С-концевой лизин тяжелой цепи, могут отсутствовать или могут быть дериватизированы у части молекул, или у всех молекул. В константные участки можно ввести замены с целью уменьшения или увеличения эффекторной функции, такой как комплемент-опосредованная цитотоксичность или ADCC (см., например, Winter et al., патент США №5624821; Tso et al., патент США №5834597 и Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 4005, 2006), или увеличения периода полужизни в организме человека (см., например, Hinton et al., J. Biol Chem.279: 6213, 2004).

Типичная замена включает замену нативной аминокислоты на остаток цистеина, введенную в аминокислотное положение 234, 235, 237, 239, 267, 298, 299, 326, 330 или 332, предпочтительно она представляет собой мутацию S239C в человеческом имуноглобулине изотипа IgG1 (США 20100158909). В некоторых аспектах наличие дополнительного остатка цистеина обеспечивает образование дисульфидных связей между цепями. Такое образование дисульфидных связей между цепями может вызвать пространственное затруднение, тем самым уменьшая сродство связывания Fc участок-FcYR. Остаток (остатки) цистеина, введенный в Fc-участок константного домена IgG, или в непосредственной близости к нему, также может служить в качестве участка конъюгации с терапевтическими средствами (т.е. для присоединения цитотоксических средств с помощью тиол-специфичных реагентов, таких как малеимидные производные лекарственных средств. Наличие терапевтического средства вызывает стерическое затруднение, тем самым дополнительно уменьшая сродство связывания Fc-участок-FcγR. Другие замены в любом из положений 234, 235, 236 и/или 237 уменьшают сродство к рецепторам Fcy, особенно, к рецептору FcyRI (см., например, патент США 6624821, патент США 5624821).

Период полужизни антитела in vivo также может влиять на его эффекторные функции. Период полужизни антитела можно увеличить или уменьшить, чтобы изменить его терапевтическую активность. FcRn представляет собой рецептор, структурно подобный антигену МНС класса I, который нековалентно связывается с 32-микроглобулином. FcRn регулирует катаболизм IgG и их трансцитоз через ткани (Ghetie and Ward, Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766, 2000; Ghetie and Ward, Immunol. Res. 25: 97-113, 2002). Взаимодействие IgG-FcRn происходит при рН 6,0 (pH внутриклеточных везикул) , но не при рН 7,4 (рН крови); данное взаимодействие обеспечивает возвращение IgG в кровоток (Ghetie and Ward, 2000, выше; Ghetie and Ward, 2002, выше). Картируют участок человеческого IgG1, участвующего в связывании FcRn (Shields et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-604, 2001). Аланиновые замены в положениях Pro238, Thr256, Thr307, Gln311, Asp312, Glu380, Glu382 или Asn434 человеческого IgG1 повышают связывание FcRn (Shields et al., выше). Молекулы IgG1, несущие указанные замены, имеют более длительные периоды полужизни в сыворотке. Следовательно, такие модифицированные молекулы IgG1 могут выполнять свои эффекторные функции и оказывать терапевтическое действие в течение более длительного периода времени, чем немодифицированные IgG1. Другие примеры замен с целью увеличения связывания с FcRn включают введение Gln в положение 250 и/или Leu в положение 428. Все положения константного участка нумеруют по системе EU.

Олигосахариды, ковалентно присоединенные к консервативному Asn297, участвуют в обеспечении связывания Fc-участка IgG с FcyR (Lund et al., J. Immunol. 157: 4963-69, 1996; Wright and Morrison, Trends Biotechnol. 15: 26-31, 1997). Рекомбинантное конструирование указанной гликозилированной формы IgG может привести к значительному повышению IgG-опосредованной ADCC. Введение модификации по биссекторному N-ацетилглюкозамину (Umana et al., Nat. Biotechnol. 17: 176-180, 1999; Davies et al., Biotech. Bioeng. 74: 288-94, 2001) в указанную гликоформу, или удаление фукозы (Shields et al., J. Biol. Chem. 277: 26733-40, 2002; Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 6591-604, 2003; Niwa et al. , Cancer Res. 64:

- 16 031025

2127-33, 2004) из указанной гликоформы, являются двумя примерами рекомбинантного конструирования Fc IgG, которые приводят к повышению связывания между Fc IgG и FcyR, тем самым увеличивая Igопосредованную ADCC-активность.

Системная замена контактирующих с растворителем аминокислот Fc участка человеческого IgG1 приводит к получению вариантов IgG с измененным сродством к FcyR (Shields et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-604, 2001). По сравнению с исходным IgG1 подмножество таких вариантов, содержащих замены Thr256/Ser298, Ser298/Glu333, Ser298/Lys334 или Ser298/Glu333/Lys334 на Ala, характеризуется увеличением как сродства к FcyR, так и ADCC-активности (Shields et al., 2001, выше; Okazaki et al., J. Mol.Biol. 336: 1239-49, 2004).

Активность антител, связанную с фиксацией комплемента (как связывание C1q, так и CDCактивность) можно повысить путем замены Lys326 и Glu333 (Idusogie et al., J. Immunol. 166: 2571-2575, 2001) . Такие же замены в скелете человеческого IgG2 могут превратить изотип антитела, который плохо связывается с C1q и обладает низкой способностью активировать комплемент, в изотип, который может связывать C1q и опосредовать CDC (Idusogie et al., выше). Для повышения способности антител фиксировать комплемент также используют некоторые другие методы. Например, прививка карбоксиконцевого фрагмента IgM размером 18-аминокислот на карбокси-конец IgG значительно повышает CDCактивность антител. Данный эффект наблюдается даже в случае IgG4, который обычно не обладает заметной CDC-активностью (Smith et al., J. Immunol. 154: 2226-36, 1995). Кроме того, замена Ser444, находящегося вблизи карбокси-конца тяжелой цепи IgG1, на Cys индуцирует димеризацию IgG1 хвост к хвосту, приводящую к 200-кратному увеличению CDC-активности по сравнению с мономерным IgG1 (Shopes et al., J. Immunol. 148: 2918-22, 1992). Кроме того, биспецифическое диатело, специфичное к C1q, также обладает CDC-активностью (Kontermann et al., Nat. Biotech. 15: 629-31, 1997).

Активность в отношении комплемента можно уменьшить путем замены по меньшей мере одного из аминокислотных остатков 318, 320 и 322 тяжелой цепи на остаток, содержащий другую боковую цепь, например, Ala. Введение других алкилзамещенных неионных остатков, таких как Gly, Iie, Leu или Val, или ароматических неполярных остатков, таких как Phe, Tyr, Trp и Pro, вместо любого из трех остатков также приводит к уменьшению или аннулированию связывания Clq. Ser, Thr, Cys и Met можно ввести в положения 320 и 322, но не 318, чтобы уменьшить или аннулировать dq-связывающую активность. Замена остатка в положении 318 (Glu) на полярный остаток может изменить, но не аннулировать Clqсвязывающую активность. Замена остатка в положении 297 (Asn) на Ala приводит к исчезновению литической активности, но лишь незначительно уменьшает (примерно в три раза) сродство к Clq. Данное изменение разрушает участок гликозилирования и приводит к отсутствию углевода, который необходим для активации комплемента. Любая другая замена в данном положении также разрушает участок гликозилирования. Нижеследующие мутации и любое их сочетание также могут привести к уменьшению связывания Clq: D270A, К322А, Р329А и P311S (см. WO 06/036291).

Ссылка на человеческой константной участок относится к константному участку любого природного аллотипа, или к константному участку, полученному путем любой пермутации остатков, занимающих полиморфные положения в природных аллотипах. Кроме того, природный человеческий константный участок может содержать до 1, 2, 5 или 10 мутаций, таких, как указанные выше, приводящих к уменьшению связывания с рецептором Fcгамма или увеличению связывания с FcRn.

IV. Нуклеиновые кислоты и способы их получения.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает нуклеиновые кислоты, кодирующие любые из описанных выше доменов VH и/или VL, в том числе полипептиды, содержащие домены VH и/или VL, связанные с другими полипептидными сегментами, такими как, например, сегменты полипептидов, соответствующие константному участку иммуноглобулина. Как правило, нуклеиновые кислоты также кодируют сигнальный пептид, гибридизованный по амино-концу со зрелым полипептидом, содержащим домены VH и/или VL. Кодирующие последовательности нуклеиновых кислот могут находиться в функциональной связи с регуляторными последовательностями, обеспечивающими экспрессию кодирующих последовательностей, такими как промотор, энхансер, участок связывания с рибосомой, сигнал терминации транскрипции и т.п. Нуклеиновые кислоты могут находиться в виде выделенной формы, или их можно клонировать в одном или нескольких векторах. Нуклеиновые кислоты можно синтезировать, например, путем твердофазного синтеза или метом ПЦР из перекрывающихся олигонуклеотидов. Нуклеиновые кислоты, кодирующие как домен VH, так и домен VL (например, в контексте антитела, содержащего отдельные тяжелые и легкие цепи), можно соединить в одну непрерывную нуклеиновую кислоту, например, в векторе экспрессии, или их можно использовать по отдельности, например, каждую можно клонировать в собственном векторе экспрессии.

Антитела против NTB-A обычно получают путем рекомбинантной экспрессии одной или нескольких нуклеиновых кислот, кодирующих одну или несколько цепей антитела. Рекомбинантные полинуклеотидные конструкции, как правило, содержат последовательности, контролирующие экспрессию, функционально связанные с последовательностями, кодирующими одну или несколько полипептидных цепей, содержащих домены VH и/или VL, такие как природно-ассоциированные или гетерологичные

- 17 031025 промоторные участки. Предпочтительно, контролирующие экспрессию последовательности представляют собой эукариотические промоторные системы в векторах, способных к трансформации или трансфекции эукариотических клеток-хозяев. После внедрения вектора в соответствующего хозяина, последнего держат в условиях, обеспечивающих высокий уровень экспрессии нуклеотидных последовательностей, а также сбор и очистку перекрестно реагирующих антител.

В некоторых вариантах осуществления для экспрессии антитела, содержащего первую и вторую полипептидные цепи (например, тяжелую и легкую цепь), две полипептидные цепи совместно экспрессируют из отдельных векторов в клетке-хозяине с получением молекулы полноразмерного антитела. В других вариантах осуществления для экспрессии двухцепочечных антител две полипептидные цепи совместно экспрессируют из отдельных единиц экспрессии в одном векторе, введенном в клетку-хозяина, с получением молекулы полноразмерного антитела.

Клетки млекопитающих являются предпочтительными хозяевами для экспрессии нуклеотидных сегментов, кодирующих иммуноглобулины или их фрагменты. См. Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Ряд подходящих линий клеток-хозяев, способных секретировать интактные гетерологичные белки, разработаны в данной области и включают клеточные линии СНО (например, DG44), разные клеточные линии COS, клетки HeLa, клетки HEK293, L-клетки, и не продуцирующие антитела клетки миеломы, такие как Sp2/0 и NS0. Предпочтительно клетки не являются человеческими. Векторы экспрессии, подходящие для данных клеток, могут содержать последовательности, контролирующие экспрессию, такие как участок инициации репликации, промотор, энхансер (Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49, 1986), и необходимые участки информации о процессинге, такие как участки связывания рибосом, участки сплайсинга РНК, участки полиаденилирования и последовательности терминации транскрипции. Предпочтительные последовательности, контролирующие экспрессию, включают промоторы, полученные из эндогенных генов, цитомегаловируса, SV40, аденовируса, бычьего вируса папилломы и т.п. См. Со et al., J. Immunol. 148: 1149, 1992.

После экспрессии антитела могут быть очищены с помощью стандартных методов, известных в данной области, включающих очистку методом ВЭЖХ, колоночную хроматографию, гель-электрофорез и т.п. (общий обзор можно найти в Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).

V. Конъюгаты антител с лекарственными средствами.

Антитела против NTB-A можно конъюгировать с цитотоксическими или цитостатическими фрагментами (включающими их фармацевтически приемлемые соли) с получением конъюгата антителолекарственное средство (ADC). Особенно подходящими фрагментами для конъюгации с антителами являются цитотоксические средства (например, химиотерапевтические средства), пролекарствоконвертирующие ферменты, радиоактивные изотопы или соединения, или токсины (указанные фрагменты совместно называют терапевтическим средством). Например, антитело против NTB-A можно конъюгировать с цитотоксическим средством, таким как химиотерапевтическое средство или токсин (например, цитостатическое или разрушающее клетки средство, такое как, например, абрин, рицин А, синегнойный экзотоксин или дифтерийный токсин). Примеры подходящих классов цитотоксических средств включают, например, средства, связывающиеся с малой бороздкой ДНК, ДНК-алкилирующие средства и ингибиторы тубулина. Примеры цитотоксических средств включают, например, камптотецин, ауристатины, калихеамицины, дуокармицины, этопозиды, майтансиноиды (например, DM1, DM2, DM3, DM4), таксаны, бензодиазепины (например, пирроло [1,4] бензодиазепины, индолинобензодиазепины и оксазолидинобензодиазепины) и алкалоиды барвинка.

Антитело против NTB-A можно конъюгировать с пролекарство-конвертирующим ферментом. Пролекарство-конвертирующий фермент можно гибридизовать с рекомбинантным антителом или химически конъюгировать с ним с помощью известных методов. Примеры пролекарство-конвертирующих ферментов включают карбоксипептидазу G2, бета-глюкуронидазу, пенициллина^-амидазу, пенициллин-Самидазу, β-лактамазу, β-глюкозидазу, нитроредуктазу и карбоксипептидазу А.

Методы конъюгации терапевтических средств с белками, в частности с антителами, хорошо известны. (См., например, Alley et al., Current Opinion in Chemical Biology 2010 14: 1-9; Senter, Cancer J., 2008, 14(3): 154-169.) Терапевтическое средство можно конъюгировать таким образом, что его активность будет снижена, если оно не отщепляется от антитела (например, в результате гидролиза, протеолитической деградации или под действием расщепляющего средства). В некоторых аспектах терапевтическое средство присоединяют к антителу посредством расщепляемого линкера, который может расщепляться во внутриклеточной среде NTB-A-экспрессирующих раковых клеток, но практически не чувствителен к внеклеточной среде, следовательно, конъюгат отщепляется от антитела после интернализации NTB-Aэкспрессирующими раковыми клетками (например, в эндосомах, или, например, в результате чувствительности к рН или чувствительности к протеазам, в среде лизосом или в среде кавеол). В некоторых аспектах терапевтическое средство может быть присоединено к антителу посредством нерасщепляемого линкера.

Как правило, ADC содержит линкерный участок между терапевтическим средством и антителом против NTB-A. Как указано выше, линкер обычно расщепляется во внутриклеточных условиях, так что в результате расщепления линкера лекарственное средство высвобождается из конъюгата с антителом во

- 18 031025 внутриклеточной среде (например, в лизосомах, эндосомах или кавеолах). Линкер может представлять собой, например, пептидильный линкер, который расщепляется под действием внутриклеточного фермента пептидазы или протеазы, включающего лизосомальную или эндосомальную протеазу. Расщепляющие средства могут включать катепсины В и D, а также плазмин (см., например, Dubowchik and Walker, Pharm. Therapeutics 83: 67-123, 1999). Наиболее типичными являются пептидильные линкеры, которые расщепляются ферментами, присутствующими в NTB-A-экспрессирующих клетках. Например, можно использовать пептидильный линкер, который расщепляется под действием тиол-зависимой протеазы катепсин-В, который экспрессируется на высоком уровне в раковой ткани (например, линкер, содержащий пептид Phe-Leu или Val-Cit).

Расщепляемый линкер может быть рН-чувствительным, т. е. чувствительным к гидролизу при определенных значениях рН. Как правило, рН-чувствительный линкер гидролизуется в кислых условиях. Например, можно использовать кислоточувствительный линкер, который гидролизуется в лизосомах (такой как гидразона, семикарбазона, тиосемикарбазон, цис-аконитовый амид, ортоэфир, ацеталь, кеталь и т.п.). (См., например, патенты США №5122368; 5824805; 5622929; Dubowchik and Walker, Pharm. Therapeutics 83:67-123, 1999; Neville et al., Biol. Chem. 264: 14653-14661, 1989). Такие линкеры являются относительно стабильными в нейтральных условиях рН, присутствующих, например, в крови, но нестабильными при рН ниже 5,5 или 5,0, что примерно равно рН в лизосомах.

Другие линкеры (такие как дисульфидный линкер) расщепляются в восстанавливающих условиях. Дисульфидные линкеры включают линкеры, которые могут быть получены с использованием SATA (Nсукцинимидил-3-ацетилтиоацетат), SPDP Щ-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат), SPDB (Nсукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)бутират) и SMPT (N-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа(2-пиридилдитио)толуол), SPDB и SMPT. (См., например, Thorpe et al., Cancer Res. 47: 5924-5931, 1987; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987). (См. также патент США №4880935).

Линкер также может представлять собой малонатный линкер (Johnson et al., Anticancer Res. 15: 1387-93, 1995), малеимидобензоильный линкер (Lau et al., Bioorg-Med-Chem. 3: 1299-1304, 1995), или 3'N-амидный аналог (Lau et al., Bioorg-Мед-Chem. 3: 1305-12, 1995).

Линкер также может представлять собой нерасщепляемый линкер, такой как малеимидоалкиленовый или малеимидарильный линкер, который непосредственно присоединяется к терапевтическому средству и высвобождается в результате протеолитической деградации антитела.

Как правило, линкер является практически не чувствительным к внеклеточной среде, т.е. не более чем примерно 20%, предпочтительно не более чем примерно 15%, более предпочтительно не более чем примерно 10%, и еще более предпочтительно не более чем примерно 5%, не более чем примерно 3%, или не более чем примерно 1% линкеров в образце ADC расщепляется, если ADC присутствует во внеклеточной среде (например, в плазме). Является ли линкер практически не чувствительным к внеклеточной среде, можно определить, например, путем независимой инкубации с плазмой (a) ADC (образец ADC) и (b) равного количества молей неконъюгированного антитела или терапевтического средства (контрольный образец) в течение заданного периода времени (например, в течение 2, 4, 8, 16 или 24 ч), с последующим сравнением количества неконъюгированного антитела или терапевтического средства, присутствующего в образце ADC, с количеством, присутствующим в контрольном образце, где количество измеряют, например, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Линкер может также способствовать интернационализации в клетку. Линкер может способствовать клеточной интернализации, если он конъюгирован с терапевтическим средством (например, если конъюгат линкер-терапевтическое средство представляет собой фрагмент ADC, или производное ADC, описанное в данном документе). Альтернативно линкер может способствовать клеточной интернализации, если он конъюгирован как с терапевтическим средством, так и антителом против NTB-A (т. е. находится в составе ADC, описанного в данном документе).

Примеры конъюгатов антитело-лекарственное средство включают конъюгаты антителолекарственное средство на основе ауристатина, то есть конъюгаты, в которых лекарственное средство представляет собой ауристатиновое средство. Показано, что ауристатины связывают тубулин, препятствуя динамике микротрубочек, а также ядерному и клеточному делению, и обладают противораковой активностью. Как правило, конъюгат антитело-лекарственное средство на основе ауристатина содержит линкер между ауристатиновым средством и антителом против NTB-A. Линкер может представлять собой, например, расщепляемый линкер (например, пептидильный линкер) или нерасщепляемый линкер (например, линкер, высвобождаемый при деградации антитела). Ауристатин может представлять собой ауристатин Е или его производное. Ауристатин может представлять собой, например, сложный эфир, образованный ауристатином Е и кетокислотой. Например, ауристатин Е можно подвергнуть взаимодействию с параацетилбензойной кислотой или бензоилвалериановой кислотой с получением АЕВ и AEVB соответственно. Другие типичные ауристатины включают MMAF и ММАЕ. Синтез и структура примеров ауристатинов описаны в публикациях патентов США №7659241, 7498298, 2009-0111756, 20090018086 и 7968687, каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки во всей своей полноте и для всех целей.

- 19 031025

Примеры конъюгатов антитело-лекарственное средство на основе ауристатина включают конъюгаты vcMMAE, vcMMAF и mcMMAF, показанные ниже, где Ab обозначает описанное здесь антитело, a val-cit обозначает дипептид валин-цитруллин

или его фармацевтически приемлемую соль. р обозначает нагрузку лекарственного средства, т. е. число молекул лекарственное средство-линкер на молекулу антитела. В зависимости от контекста р может обозначать среднее число молекул лекарственное средство-линкер на молекулу антитела, также называемое средней нагрузкой лекарственного средства, р варьирует от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления р, обозначающий среднюю нагрузку лекарственного средства, составляет примерно от 2 до 5. В некоторых вариантах осуществления р равен примерно 2, примерно 3, примерно 4 или примерно 5. Среднее число молекул лекарственного средства на молекулу антитела можно определить с помощью традиционных методов, таких как масс-спектроскопия, HIC, ELISA и ВЭЖХ. В некоторых аспектах антитело против NTBA присоединяют к молекуле лекарственное средство-линкер через цистеиновый остаток антитела. В некоторых аспектах остаток цистеина представляет собой остаток, введенный в антитело рекомбинантным способом. В других аспектах остаток цистеина представляет собой остаток цистеина, участвующий в образовании дисульфидной связи между цепями.

VI. Применение.

В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способы применения антитела против NTBA, описанного в данном документе, включающие модуляцию биологической активности NTB-Aэкспрессирующих клеток, таких как, например, естественные киллерные (NK) клетки, NK-подобные Тклетки, Т-клетки, моноциты, дендритные клетки, В-клетки и эозинофилы. Такие способы включают, например, ингибирование активности NTB-A-экспрессирующих клеток (например, ингибирование пролиферации). Такие способы также включают, например, способы лечения заболевания или расстройства, ассоциированного с NTB-A-экспрессирующими клетками.

Например, антитела против NTBA настоящего изобретения, как голые, так и в виде конъюгатов с лекарственными средствами, можно использовать для лечения рака, характеризующегося экспрессией NTB-A. При некоторых из таких видов рака детектируемые уровни NTB-A обнаруживают либо на уровне белка (например, с помощью иммуноанализа с использованием одного из описанных антител), либо на уровне мРНК. Некоторые из таких видов рака характеризуются повышенным уровнем NTB-A по сравнению с доброкачественной тканью того же типа, предпочтительно полученной от того же пациента. Примерный уровень NTB-A на раковых клетках, подлежащих лечению, составляет 5000-150000 молекул NTB-A на клетку, хотя лечение можно проводить и при более высоких, и при более низких уровнях.

- 20 031025

Уровень NTB-A в раковой ткани необязательно измеряют перед проведением лечения.

Примеры раковых заболеваний, ассоциированных с экспрессией NTB-A и подлежащих лечению, включают гематологические злокачественные заболевания, в том числе В-клеточные, Т-клеточные и НКклеточные злокачественные заболевания. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой множественную миелому, острый миелоидный лейкоз (AML), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) или Т-клеточную или В-клеточную лимфому, такую как, например, неходжкинская лимфома (NHL). Лечение можно применять к пациентам, страдающим от первичных или метастатических заболеваний указанных видов. Лечение также можно применять к пациентам, не восприимчивым к стандартным способам лечения, или к пациентам, у которых наблюдается рецидив после ответа на такое лечение.

В родственном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения множественной миеломы с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC), содержащего антитело, способное специфически связываться с NTB-А. В некоторых вариантах данного аспекта ADC против NTBA, предназначенный для лечения множественной миеломы, содержит описанное здесь антитело против NTB-A (например, гуманизированное антитело, содержащее домены VH и VL, полученные соответственно из домена VH, аминокислотная последовательность которого включает остатки 20-135 последовательности SEQ ID NO:1, и домена VL, аминокислотная последовательность которого включает остатки 21-140 последовательности SEQ ID NO:2). В других аспектах ADC против NTB-A, предназначенный для лечения множественной миеломы, содержит антитело, отличное от антитела, описанного в данном документе, способное специфически связываться с внеклеточным доменом NTB-A. В данной области известен ряд антител против NTB-A. Другие антитела против NTB-A можно получить de novo, например, путем иммунизации NTB-A или одним или несколькими его внеклеточными доменами. Такой иммуноген можно получить из природного источника, путем пептидного синтеза или путем рекомбинантной экспрессии. Антитела против NTB-A человека можно получить разными способами, известными в данной области.

Антитела против NTBA настоящего изобретения, как голые, так и в виде конъюгатов с лекарственными средствами, можно использовать для лечения заболеваний и расстройств, связанных с В-клетками, таких как заболевания, характеризующиеся избыточным количеством В-клеток, гиперактивностью Вклеток или дисфункцией В клеток. Указанные заболевания включают воспалительные заболевания и аутоиммунные заболевания. Примеры заболеваний, которые можно лечить с помощью способов настоящего изобретения, включают ревматоидный артрит, системную красную волчанку, рассеянный склероз, воспалительное заболевание кишечника, астму, аллергию, целиакию, реакцию трансплантат против хозяина и отторжение трансплантата.

Настоящее изобретение относится к способам лечения заболеваний и расстройств, описанных в данном документе, используемым в виде монотерапии или в виде сочетания, например, со стандартным способом лечения таких заболеваний и/или расстройств. Соответственно, способы лечения рака включают введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела или конъюгата антитела с лекарственным средством настоящего изобретения в сочетании с другим противораковым средством, или другим средством, облегчающим симптомы рака. Способы лечения аутоиммунного заболевания включают введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела, или конъюгата антитела с лекарственным средством настоящего изобретения в сочетании с другим терапевтическим средством для лечения аутоиммунного заболевания. Способы лечения воспалительного заболевания включают введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела, или конъюгата антитела с лекарственным средством настоящего изобретения в сочетании с другим терапевтическим средством для лечения воспалительных заболеваний.

Антитела против NTB-A, по отдельности или в виде конъюгатов, вводят в эффективном режиме, включающем дозировку, способ введения и частоту введения, которые обеспечивают задержку появления, уменьшение тяжести, подавление дальнейшего ухудшения и/или улучшение по меньшей мере одного признака или симптома рака. В некоторых случаях терапевтическую эффективность у отдельного пациента определяют по сравнению с историческим контролем или прошлым опытом у того же пациента. В других случаях терапевтическую эффективность можно продемонстрировать с помощью доклинических или клинических испытаний в группе пациентов, получающих лечение, по сравнению с контрольной группой пациентов, не получающих лечение.

Примеры дозировочных режимов для антитела против NTB-A включают дозы в диапазоне от 0,1 до 50 мг/кг массы тела пациента, более предпочтительно от 1 до 30 мг/кг, от 1 до 20 мг/кг, от 1 до 15 мг/кг, от 1 до 12 мг/кг или от 1 до 10 мг/кг, или от 2 до 30 мг/кг, от 2 до 20 мг/кг, от 2 до 15 мг/кг, от 2 до 12 мг/кг или от 2 до 10 мг/кг, или от 3 до 30 мг/кг, от 3 до 20 мг/кг, от 3 до 15 мг/кг, от 3 до 12 мг/кг или от 3 до 10 мг/кг. Примеры дозировочных режимов для моноклонального антитела или конъюгата антитела с лекарственным средством включают дозы в диапазоне от 0,1 до 7,5 мг/кг, от 0,2 до 7,5 мг/кг, от 0,5 до 7,5 мг/кг, от 1 до 7,5 мг/кг, или от 2 до 7,5 мг/кг, или от 3 до 7,5 мг/кг массы тела индивидуума, или 0,1-20, или 0,5-5 мг/кг массы тела (например, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг), или 10-1500, или 200-1500 мг в виде фиксированной дозы. В некоторых способах дозу, составляющую по меньшей мере 0,3, 0,5, 1,

- 21 031025

1,5 мг/кг, по меньшей мере 2 мг/кг, или по меньшей мере 3 мг/кг, вводят пациенту один раз в три недели или реже. В числе прочих факторов доза зависит от частоты введения, состояния пациента и реакции на предшествующее лечение, если таковое имеет место, независимо от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим, или является ли расстройство острым или хроническим.

Введение обычно осуществляют парентерально. Кроме того, можно проводить локальное введение непосредственно в опухоль. Предпочтительным является введение в системный кровоток внутривенным или подкожным способом. Внутривенное введение можно проводить, например, путем инфузии в течение периода времени, составляющего, например, 30-90 мин, или путем однократной болюсной инъекции.

Частота введения зависит, в числе других факторов, от периода полужизни антитела или конъюгата в кровотоке, состояния пациента и способа введения. Введение можно осуществлять ежедневно, еженедельно, ежемесячно, ежеквартально или с нерегулярными интервалами в ответ на изменения в состоянии пациента или на прогрессирование рака, подлежащего лечению. Примерная частота внутривенного введения составляет от двух раз в неделю до ежеквартального введения в течение продолжительного курса лечения, хотя можно использовать более высокую или более низкую частоту введения. Другие примеры частоты внутривенного введения включают еженедельное введение или введение три раза каждые четыре недели в течение продолжительного курса лечения, хотя можно использовать более высокую или более низкую частоту введения. В случае подкожного введения пример частоты введения находится в диапазоне от ежедневного до ежемесячного введения, хотя можно использовать более высокую или более низкую частоту введения.

Число вводимых доз зависит от природы рака (например, от того, наблюдаются ли симптомы острого или хронического заболевания) и ответ расстройства на лечение. При острых расстройствах или обострениях хронического расстройства зачастую достаточно ввести от 1 до 10 доз. Иногда при остром расстройстве или обострении хронического расстройства достаточно ввести одну болюсную дозу, возможно, в разделенном виде. Лечение можно повторить при рецидиве острого расстройства или обострения. В случае хронических заболеваний антитело можно вводить через равные промежутки времени, например, еженедельно, раз в две недели, ежемесячно, ежеквартально, раз в полгода, в течение, по меньшей мере, 1 года, 5 лет или 10 лет, или в течение всей жизни пациента.

Фармацевтические композиции для парентерального введения, предпочтительно являющиеся стерильными и практически изотоническими, производятся в условиях GMP. Фармацевтические композиции могут быть получены в виде стандартной лекарственной формы (например, содержащей дозу для однократного введения). Фармацевтические композиции могут содержать один или несколько физиологически приемлемых носителей, разбавителей, наполнителей или вспомогательных веществ. Состав композиции зависит от выбранного способа введения. Для введения путем инъекции, антитела получают в виде водных растворов, предпочтительно, в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера, физиологический раствор или ацетатный буфер (чтобы уменьшить дискомфорт в месте инъекции). Раствор может содержать, например, суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Альтернативно антитела могут находиться в лиофилизированной форме, которую перед применением смешивают с подходящим носителем, таким как стерильная апирогенная вода. Концентрация антител в жидком препарате может составлять, например, 1-100 мг/мл, например, 10 мг/мл.

Лечение антителами настоящего изобретения можно сочетать с химиотерапией, облучением, лечением стволовыми клетками, хирургическим вмешательством и другими процедурами, эффективными в отношении расстройства, подлежащего лечению. Подходящие классы других средств, которые можно вводить в сочетании с антителом против NTB-A, включают, например, антитела к другим рецепторам, экспрессируемым на раковых клетках, антитубулиновые средства (например, ауристатины), средства, связывающиеся с малой бороздкой ДНК, ингибиторы репликации ДНК, алкилирующие средства (например, комплексы платины, такие как цис-платина, моноядерные комплексы платины, двухъядерные комплексы платины и трехъядерные комплексы платины, а также карбоплатин), антрациклины, антибиотики, антифолаты, антиметаболиты, средства, повышающие чувствительность к химиотерапии, дуокармицины, этопозиды, фторированные пиримидины, ионофоры, лекситропсины, нитрозомочевины, платинолы, предварительно образованные соединения, пуриновые антиметаболиты, пуромицины, средства, повышающие чувствительность к облучению, стероиды, таксаны, ингибиторы топоизомеразы, алкалоиды барвинка и т. п.

Лечение антителом против NTB-A, необязательно в сочетании с любым из других средств или режимов, описанных выше, используемым отдельно или в виде конъюгата с лекарственным средством, может увеличить среднюю выживаемость при отсутствии прогрессирования, или общую выживаемость пациентов, страдающих от рака, характеризующегося экспрессией NTB-A (такого как множественная миелома, AML, NHL), особенно в случае рецидивирующего или рефрактерного заболевания, по меньшей мере, на 30 или 40%, предпочтительно на 50, 60, 70 или даже 100% или более, по сравнению с аналогичным лечением (например, химиотерапией) в отсутствии антитела против NTB-A, используемого отдельно или в виде конъюгата. В дополнение к или в качестве альтернативы стандартному способу лечения (такому как химиотерапия), введение антитела против NTB-A, используемого отдельно или в виде конъ- 22 031025 югата, может увеличить степень полного ответа, степень частичного ответа или степень объективного ответа (полный + частичный) у пациентов с раком, характеризующимся экспрессией NTB-A по меньшей мере на 30 или 40%, предпочтительно на 50, 60, 70 или даже 100% по сравнению с таким же лечением (например, химиотерапией), но в отсутствии антитела против NTB-A.

Как правило, в клинических испытаниях (например, в фазе II, фазе II/III или фазе III испытания) вышеупомянутое увеличение средней выживаемости при отсутствии прогрессирования и/или степени ответа пациентов, получающих стандартную терапию в сочетании с антителом против NTB-A, по сравнению с контрольной группой пациентов, получающих только стандартную терапию (или в сочетании с плацебо), является статистически значимым, например, р=0,05, или 0,01, или даже 0,001. Степени полного и частичного ответа определяют на основе объективных критериев, обычно используемых в клинических испытаниях способов лечения рака, например, перечисленных или принятых Национальным институтом рака и/или Управлением по контролю за продуктами и лекарствами.

В других способах применения антитела против NTB-A настоящего изобретения можно использовать для детекции NTB-A в целях клинической диагностики или лечения или в исследовательских целях. Экспрессия NTB-A при раковом заболевании свидетельствует о том, что рак можно лечить антителами настоящего изобретения. Антитела могут поставляться в виде реагентов для лабораторных исследований, включающих детекцию клеток, несущих NTB-A, и их ответ на разные стимулы. В таких способах можно использовать антитела против NTB-A, меченные флуоресцентной молекулой, спин-меченой молекулой, ферментом или радиоизотопом, которые могут поставляться в виде набора, содержащего все необходимые реагенты для проведения анализа NTB-A. Антитела также можно использовать для очистки NTB-A, например методом аффинной хроматографии.

Все патентные заявки, другие публикации, номера доступа и т.п., упомянутые выше или ниже, включены в данный документ в качестве ссылки во всей полноте для всех целей в той же степени, как если бы каждый отдельный элемент был конкретно и индивидуально указан как включенный в качестве ссылки. Если разным версиям последовательности присваивается номер доступа в разное время, имеется в виду версия, получившая номер доступа на момент действительной даты подачи настоящей заявки. Действительная дата подачи относится к более ранней из даты фактической подачи заявки и даты подачи приоритетной заявки со ссылкой на номер доступа, если это имеет место. Подобным образом, если разные версии публикации публикуются в разное время, подразумевается версия, опубликованная последней перед действительной датой подачи заявки, если не указано иное. Если специально не указано иначе, все признаки, стадии, элементы, воплощения или аспекты настоящего изобретения можно использовать в сочетании с любыми другими. Хотя настоящее изобретение описано с приведением некоторых деталей в качестве иллюстрации и примера в целях ясности и понимания, очевидно, что определенные изменения и модификации могут быть осуществлены в пределах объема, определяемого прилагаемой формулой изобретения.

Примеры

Пример 1. Экспрессия NTB-A на клеточных линиях множественной миеломы.

Клеточные линии Amo-1, JJN-3, Karpas-620, KMS-12-BM, MOLP-8, OPM-2 (DSMZ; RPMI 1640 + 20% FBS), L-363 (DSMZ; RPMI 1640 + 15% FBS), LP-1, SK-MM-2 (DSMZ; RPMI 1640 + 10% FBS), EJM (DSMZ; EMEM + 20% FBS), MM.1R, MM.IS, NCI-H929, RPMI-8226 (ATCC; RPMI 1640 + 10% FBS) и U266 (ATCC; RPMI 1640 + 15% FBS) культивируют при 37хС и 5% СО₂. 500000 клеток окрашивают в буфере FACs (PBS + 3% FBS + 0,02% азида натрия) в течение 45 мин на льду антителами против NTB-A NT-7 и 11А1. Для детекции используют РЕ-конъюгированное вторичное антитело. Окрашенные клетки анализируют с помощью проточного цитометра FACSCalibur (Becton Dickinson).

Показано, что NTB-A экспрессируется на пяти из пятнадцати клеточных линий множественной миеломы, Karpas-620, EJM, MM.1R, MM.1S и U-266.

Пример 2. Экспрессия NTB-A в образцах пациентов, страдающих от множественной миеломы.

Замороженные образцы аспирата костного мозга пациента-человека с множественной миеломой (510 миллионов клеток) получают от BioServe (Beltsville, MD), AllCells (Emeryville, CA), Conversant Healthcare Systems (Huntsville, AL) и ProteoGenex (Culver City, CA). Клетки костного мозга пациента с ММ оттаивают при 37°С, переносят в предварительно нагретую среду RPMI 1640 и обрабатывают ДНКазой 1 (0,05 мг/мл) в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы минимизировать агрегацию клеток. Затем клетки центрифугируют (1400 об/мин; 5 мин), ресуспендируют в RPMI 1640 + 10% FBS и измеряют количество/жизнеспособность клеток с использованием трипанового синего. Затем клетки пациента центрифугируют, ресуспендируют в буфере FACS (PBS + 3% FBS + 0,02% азида натрия) на льду, фильтруют через клеточный фильтр 100 мкм, чтобы удалить дебрис, и аликвоты клеточной суспензии объемом 100 мкл вносят в лунки 96-луночного планшета с V-образным дном для последующего окрашивания (1,2х10⁵-1,0х10⁶ жизнеспособных клеток/лунку). Клетки аспирата костного мозга пациента подвергают тройному окрашиванию антителом против hCD38-FITC, антителом против hCD45-APC и РЕконъюгированным антителом против NTB-A (клон: NT-7), или контрольным IgG того же изотипа (30 мин на льду). Окрашенные клетки промывают дважды буфером FACS и анализируют методом проточ

- 23 031025 ной цитометрии с помощью проточного цитометра FACSCalibur. Количественно определяют экспрессию NTB-A на поверхности клеток множественной миеломы субпопуляции CD38+/CD45-. В качестве положительного контроля также измеряют экспрессию CD138 (клон: 1D4) как антигена множественной миеломы.

Показано, что NTB-A экспрессируется на поверхности клеток образцов 13 из 15 пациентов. См. приведенную ниже табл. 3.

Таблица 3. Суммарные результаты измерения экспрессии NTB-A на клетках плазмы пациентов-людей с множественной миеломой

Пациент с множественной миеломой	История лечения	Экспрессия NTB-A (клон NT-7)	Экспрессия CD138 (клон ID4)
1	Стадия III/ р ецид и в ир ующа я	2,37	1, 51
2	Недавно диагностированный	15, 4	7, 99
3	Недавно диагностированный	79, 8	143
4	Химиотерапия VAD; Аутотрансплантация	25, 0	745
5	Химиотерапия VAD	14,0	12, 8
6	Пересадка костного мозга; Бортезомиб	1,16	1, 65
7	Недавно диагностированный	18,2	1, 45
8	Недавно диагностированный	87, 3	46, 6
9	Недавно диагностированный	85, 7	17,3
10	Химиотерапия; Аутотрансплантация	1,22	106
11	Мелфалан, Леналидомид	5, 09	2,20
12	Леналидомид, Цитоксан, Талидомид	7,56	3,25
13	Бортезомиб	17,3	4,55
14	Химиотерапия VAD; Леналидомид, Бортезомиб	17, 8	74, 33
15	Недавно диагностированный	12,7	11, 45

Кратность увеличения экспрессии антигена (средняя интенсивность флуоресценции) по сравнению с изотипическим контрольным антителом.

Пример 3. Выбор антител.

Лимфоциты, полученные из селезенки и лимфатических узлов мышей, продуцирующих антитело против NTB-A, гибридизуют с клетками миеломы. Гибридные клетки можно обнаружить после инкубации в течение ночи в среде для выращивания гибридом. После извлечения клетки центрифугируют и затем помещают в полутвердую среду. После инкубации выбирают гибридомные клоны, продуцирующие IgG. Проводят скрининг супернатантов гибридомных культур путем измерения флуоресцентного сигнала на поверхности NTB-A-положительных клеток и обнаруживают, что 313 из 478 гибридомных клонов специфически связываются с внеклеточным доменом NTB-A. Специфическое связывание флуоресцентно меченых ADC с внеклеточным доменом NTB-A подтверждают методом проточной цитомет

- 24 031025 рии (BD Biosciences FACSCalibur) с использованием ряда NTB-A-экспрессирующих клеток множественной миеломы в концентрации 2,0 мкг/мл. 313 гибридом, связывающихся с NTB-A, используют для непосредственной конъюгации с vc-MMAE с помощью способов, описанных в международной заявке WO 2011/109308. Ряд антител, полученных в результате непосредственной конъюгации, тестируют путем анализа связывания и цитотоксичности. 313 ADC, связывающихся с NTB-A, подвергают скринингу на цитотоксичность, используя клеточные линии множественной миеломы. Исследования цитотоксичности проводят путем помещения 15000 клеток множественной миеломы в лунку с соответствующей питательной средой. Чтобы провести клеточный анализ связывания, конъюгаты антитела против NTB-A, нагруженного vcMMAE 4, с лекарственным средством, тестируют на клетках в конечной концентрации 12,5, 50,0 и 200 нг/мл и инкубируют в течение всего 96 ч при 37°С. Измеряют жизнеспособность клеток, используя люминесцентный анализ Cell Titer Glo (Promega), и определяют активность ADC на основании процента жизнеспособности по сравнению с необработанными контрольными клетками. Значения IC₅₀ определяют из кривых доза-ответ, полученных с использованием программного обеспечения Prism (GraphPad). Считают, что цитотоксичность присутствует, если IC₅₀ меньше или равно 50 нг/мл. 69 наиболее активных моноклональных антител против NTBA в виде ADC используют для дальнейших анализов. Только у 6 из 69 самых активных ADC значение IC₅₀ составляет менее 12,5 нг/мл. Для получения кривых насыщения связывания и определения значений Kd используют метод проточной цитометрии и небольшую группу высокоцитотоксичных ADC против NTB-A. ADC против NTB-A, содержащие антитела 11А1 и 26В7, обладают наиболее высокой цитотоксичностью.

Пример 4. Анализ интернализации антитела против NTB-A.

Определяют способность конъюгата антитела мыши 11А1 с mcMMAF интернализоваться в клетки NTB-A⁺ линии U-266 (фиг. 1).

Антиген-положительные клетки U-266 инкубируют с 5 мкг/мл конъюгата антитела против NTB-A человека с лекарственным средством, 11A1-mcMMAF (антимитотическое средство MMAF присоединяют к антителу через малеимидокапроильный линкер (mc) в стехиометрическом соотношении 4 молекулы лекарственного средства на молекулу антитела посредством цистеиновых связей), в течение 30 мин на шейкере при 4°С. Клетки промывают три раза средой RPMI 1640 + 10% фетальной бычьей сыворотки и затем помещают в количестве 5x105 клеток/100 мкл на лунку в два одинаковых 96-луночных планшета с U-образным дном (Biosciences, San Jose, CA). Один планшет инкубируют при 37°С, а другой при 4°С. Один образец сразу промывают и окрашивают в нулевой момент времени. Клетки собирают из обоих планшетов в моменты времени 0,5, 1, 2, 8 и 24 ч, промывают два раза холодным буфером для промывания (PBS + 2,5 % фетальной бычьей сыворотки) и окрашивают 10 мкг/мл конъюгата козьего антитела против IgG мыши с РЕ (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) в течение 30 мин на льду, в защищенном от света месте. Клетки снова промывают два раза буфером для промывания и фиксируют, используя 500 мкл PBS + 1% параформальдегида. После сбора и окрашивания всех образцов их анализируют на проточном цитометре FACs Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA) и полученные данные выражают в процентах от MFI в нулевой момент времени.

Пример 5. Анализ цитотоксичности ADC.

Получают конъюгаты моноклональных антител мыши против NTB-A 11A1 и 26В7 с лекарственным средством (ADC). Антимитотическое средство монометилауристатин Е (ММАЕ) конъюгируют с mAb против NTB-A через катепсина-расщепляемый валин-цитруллиновый (vc) линкер, а монометилауристатин F (MMAF) конъюгируют через малеимидокапроильный (mc) линкер в стехиометрическом соотношении 4 молекулы лекарственного средства на молекулу антитела посредством цистеиновых связей, как описано в патентах США №7659241 и 7498298. Проводят серийные 3-кратные разведения ADC антитело против NTB-A-vc-ММАЕ(4) и -mc-MMAF(4) средой с получением 10 точек кривой, соответствующих разным дозам (1000 - 0,05081 нг/мл), и добавляют разведения к клеткам множественной миеломы, культивируемых в аналитических 96-луночных планшетах. Клеточные линии множественной миеломы Karpas-620, EJM, MM.1R, MM.1S U-266 (NTB-A+) и L363 (NTB-A-) обрабатывают ADC против NTB-A с четырьмя повторами и инкубируют в течение 96 ч при 37°С и 5% СО₂. Жизнеспособность клеток определяют с использованием люминесцентного анализа цитотоксичности Cell Titer Glo (Promega), результаты которого регистрируют с помощью планшет-ридера EnVision (Perkin Elmer). Для построения кривых доза-эффект и определения значений IC50 используют программное обеспечение GraphPad Prism.

- 25 031025

Результаты анализа цитотоксичности ADC в отношении клеточных линий множественной миеломы

АЬ	Лекарственное средство	Karpas-620	EJM	MM. IS	U-266	MM.1R.	Изотип
11А1	vcMMAE	3.77	12.5	48.9	2.37	13.6	mlgGl
11А1	mcMMAF	0.648	2.48	3.10	0.877	2.52	mlgGl
26В7	vcMMAE	431	52.5	>1000	6.04	78.9	mlgGl
26В7	mcMMAF	2.61	6.07	3.99	1.72	5.86	mlgGl

Результаты анализа цитотоксичности ADC в отношении клеточных линий AML и NHL

Ab	Лекарственное средство	CA46 (NHL)	Ramos (NHL)	HNT-34 (AML)	HEL92.1.7 (AML)	KG-1 (AML)	Изотип
11A1	vcMMAE	8.91	5.77	1.58	>1000	14.0	mlgGl
11A1	mcMMAF	2.61	1.76	0.861	>1000	2.09	mlgGl
26B7	vcMMAE	13.8	6.83	3.26	>1000	178.2	mlgGl
26B7	mcMMAF	4.91	3.19	1.13	>1000	2.45	mlgGl

Пример 6. Анализ конкурентного связывания.

В данном примере подробно описан анализ, используемый для оценки способности исследуемого антитела конкурировать за связывание с антителом мыши 11А1. В конкретном исследовании определяют способность антитела 26В7 и антитела NT-7 (клон: NT-7 (BioLegend #317208)) конкурировать с антителом 11А1. Также определяют способность антитела 11А1 конкурировать с самим собой. В анализе используют стандартное антитело, представляющее собой антитело мыши 11А1, которое относится к изотипу IgG1 (т.е. содержит домены VH и VL, образующие двухвалентную структуру нативного (природного) антитела, т. е. тетрамер, состоящий из двух идентичных пар цепей иммуноглобулина, где каждая пара состоит из одной легкой цепи и одной тяжелой цепи).

NTB-A-положительные клетки в экспоненциальной фазе роста, экспрессирующие примерно 24500 поверхностных молекул NTB-A на клетку (например, клетки Ramos) собирают, промывают изотоническим забуференным фосфатом солевым раствором (PBS) и хранят на льду. Аликвоты NTB-Aположительных клеток помещают в лунки 96-луночного планшета с v-образным дном на льду, в количестве 2х10⁵ клеток на лунку в объеме 100 мкл.

Получают 2Х концентрацию стандартного антитела, конъюгированного с флуоресцентной меткой (например, AF647), в PBS/FBS (PBS, содержащий 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS)/0,02% азида натрия), где концентрация 1X равна 0,0188 мкг/мл (концентрация, соответствующая значению Kd mAb 11A1). Затем аликвоты полученного раствора PBS/FBS/меченное Ab вносят в лунки 96-луночного планшета для разведения (200 мкл/лунку). Ряд лунок А оставляют для исходной 2Х смеси немеченого исследуемого антитела в растворе PBS/FBS/меченное Ab (см. п.(4) ниже); достаточное число лунок также оставляют для контролей.

Получают 2Х концентрацию немеченого исследуемого антитела (анализируемого на конкурентное связывание) в растворе PBS/FBS AF-меченное Ab (20 мкг/мл исследуемого антитела, следовательно, концентрация 1X равна 10 мкг/мл). Аликвоты немеченого исследуемого антитела в концентрации 2Х помещают в лунки первого столбца 96-луночного планшета для разведения. Затем образцы подвергают серийному пятикратному разведению (50 мл исходного разведения исследуемого антитела добавляют к 200 мкл раствора PBS/FBS/меченное Ab в следующем ряду, повторяя от ряда к ряду планшета).

Достаточное число лунок (например, лунки А1-А6) оставляют для настройки проточного цитометра, также оставляют неокрашенные лунки, в которые добавляют только PBS/FBS (меченное стандартное антитело отсутствует). Указанные лунки используют в качестве неокрашенных контролей (0% окрашивания). Достаточное число лунок (например, лунки А7-А12) используют для получения 100% окрашивания, эти лунки содержат PBS/FBS/меченное Ab и не содержат немеченое исследуемое антитело.

100 мкл разведенных образцов из планшета для разведения переносят с двойными повторами в соответствующие лунки с клетками (100 мкл) планшета с v-образным дном, с получением концентраций 1X. Затем полученные образцы инкубируют в течение одного часа на льду в защищенном от света месте.

После инкубации клетки дважды промывают PBS/FBS. Например, планшет центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, супернатант отбрасывают, планшеты встряхивают, чтобы распределить клетки, и добавляют буфер для промывания (PBS/FBS) (примерно 200 мкл/лунку/промыв); после последнего откручивания планшеты переворачивают и аккуратно промакивают.

После промывания клеточные осадки ресуспендируют в 250 мкл PBS/FBS и клетки держат при 2

- 26 031025

8°С в защищенном от света месте, до анализа на проточном цитометре (например, проточный цитометр LSRII, BD Biosciences, San Jose, CA).

На проточном цитометре выделяют представляющую интерес клеточную популяцию путем отсекания популяций по прямому рассеянию и боковому рассеянию (FSC/SSC) с получением диаграммы популяций, и детектируют флуоресцентный сигнал от флуоресцентной метки.

Затем результаты проточной цитометрии анализируют путем анализа сигмоидальной кривой дозаответ (переменный наклон). IC₅₀ немеченого антитела (т.е. концентрацию немеченого исследуемого антитела, при которой связывание меченного стандартного антитела составляет 50% от максимального связывания) определяют по подогнанной кривой.

Антитело 11А1 конкурирует с самим собой и с антителом 26В7, но не с антителом NT-7. Считают, что немеченое исследуемое антитело конкурирует с 11А1 за связывание с NTB-A, если оно снижает связывание 11А1 до менее чем 45% от максимального связывания при концентрации антитела 10 мкг/мл (предпочтительно до менее чем 20%, или даже менее чем 10%).

Антитела 11А1 и 26В7 также тестируют на конкуренцию с антителом 480.12, используя конкурентный анализ на основе FACS, как описано в патенте США №7874067. Результаты анализа (данные не показаны) демонстрируют, что антитела 11А1 и 26В7 не конкурируют за связывание с антителом 480.12.

Пример 7. Измерение сродства и специфичности связывания mAb.

Титрование дозы антител мыши против NTB-A человека, конъюгированных с Alexa Fluor 647 (11А1 и 26В7), используют для получения кривой насыщения связывания. Антиген-положительные клетки Ramos высевают в количестве 1х10⁵ клеток на лунку в 96-луночный планшет с V-образным дном (Thermo Scientific, Rochester, NY). Трехкратные серийные разведения антител с концентрацией 2Х в буфере FACs (PBS + 2% фетальной бычьей сыворотки + 0,02% азида) добавляют к клеткам с двойными повторами. Растворы антител инкубируют с клетками в течение 1 ч на льду, в защищенном от света месте. Клетки дважды промывают буфером FACs и анализируют на проточном цитометре LSRII (BD Biosciences, San Jose, CA). Значения KD определяют с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (La Jolla, CA).

Антитела мыши 11А1 и 26В7 против NTB-A человека тестируют на связывание с клетками множественной миеломы U-266 и стабильными трансфектантами 293-F17/hNTB-A, изоформа 4, и 293F17/cynomolgus-NTB-A. Клетки высевают в количестве 2,5х10⁵ клеток/лунку в буфере FACS (PBS + 2% фетальной бычьей сыворотки + 0,02% азида) и инкубируют с 2 мкг/мл антитела в течение 45 мин на льду. Клетки промывают два раза и окрашивают козьим антителом против IgG мыши, конъюгированным с РЕ (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), в течение 30 мин на льду, в защищенном от света месте. Клетки снова дважды промывают буфером FACS и фиксируют в 500 мкл IX PBS + 1% параформальдегида. Окрашенные клетки анализируют на проточном цитометре FACs Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA).

Измерение сродства.

Антитело	Клеточная линия	Kd (нМ) комплекса с ΝΤΒ-Ά человека
Антитело мыши 11А1	Ramos	0, 13

изотипа IgGl
Антитело мыши 26В7 изотипа IgGl	Ramos	0, 16

Пример 8. Исследования ксенотрансплантатов MM in vivo.

Мышей NOD scid с нокаутом гамма-цепи рецептора IL2 (NSG) используют для получения моделей распространенных клеточных линий множественной миеломы, в которых опухолевые клетки локализуются в отделе костного мозга. Мышам имплантируют 1 млн клеток множественной миеломы MM.1R или 5 млн клеток множественной миеломы U-266 и через 5 дней после имплантации опухолевых клеток вводят конъюгаты антител против NTB-A с лекарственным средством. Конъюгаты антитела против NTB-A с лекарственным средством vcMMAE, с нагрузкой 4 молекулы vcMMAE, доставляют мышам путем внутрибрюшинного введения однократной дозы 1,0 и 3,0 мг/кг. Через каждые 2-3 недели после введения конъюгата антитело-лекарственное средство в сыворотке мышей методом ELISA определяют уровни легкой цепи лямбда Ig, секретируемой клетками множественной миеломы. У мышей каждой опытной группы определяют наличие симптомов развития болезни и заболеваемость, при наличии симптомов запущенного заболевания мышей умерщвляют. Для контрольных и опытных групп получают кривые выживания Каплана-Мейера и проводят статистический анализ, чтобы определить значимость наблюдаемой противоопухолевой активности на каждом уровне дозы ADC по сравнению с контролем-средой или не связывающим контрольным ADC.

- 27 031025

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> SEATTLE GENETICS, INC.

<120> Антитела против NTB-A и связанные с ними композиции и способы <130> NTBA-00111PC <150> US 61/745,239 <151> 2012-12-21 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 135 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Вариабельный участок (VH) mAb против NTB-A 11A1 <400> 1

Met 1

Lys

Cys

Ser

Trp 5

Ile

Ile

Phe

Phe

Leu 10

Met

Ala

Val

Val

Thr 15

Gly

Val

Asn

Ser

Glu

Val

His

Leu

Gln

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Leu

Val

Lys

20

25

30

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly

Phe

Asn

Ile

35

40

45

Lys

Asp

Tyr

Tyr

Val

His

Trp

Val

Lys

Gln

Arg

Thr

Glu

Gln

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Ile

Gly

Lys

Ile

Asp

Pro

Glu

Asp

Gly

Glu

Ile

Lys

Tyr

Ala

65

70

75

80

Pro

Lys

Phe

Gln

Gly

Glu

Ala

Thr

Ile

Thr

Ala

Asp

Thr

Ser

Ser

Asn

85

90

95

Thr

Ala

Tyr

Leu

Gln

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Tyr

Ser

Thr

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

115

120

125

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

Ser

130 135 <210> 2 <211> 140

- 28 031025 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223>

Вариабельный

участок

(VL)

mAb против

NTB-

A 11A1

<400>

2

Met Glu

Ser

Asn

Thr

Leu

Leu

Leu

Trp

Val

Leu

Leu

Leu

Trp

Val

Pro

1

5

10

15

Gly Ser

Thr

Gly

Asp

Ile

Val

Leu

Thr

Gln

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

20

25

30

Val Ser

Leu

Gly

Gln

Lys

Ala

Thr

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Lys

Lys

35

40

45

Val Thr

Ile

Phe

Gly

Ser

Ile

Ser

Ala

Leu

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

50

55

60

Pro Gly

Gln

Pro

Pro

Lys

Leu

Ile

Tyr

Asn

Gly

Ala

Lys

Leu

Glu

Ser

65

70

75

80

Gly Val

Ser

Ala

Arg

Phe

Ser

Asp

Ser

Gly

Ser

Gln

Asn

Arg

Ser

Gln

85

90

95

Phe Gly

Asn

Gln

Leu

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Ile

Asp

Pro

Val

Glu

Ala

100

105

110

Asp Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Leu

Gln

Asn

Lys

Glu

Val

Pro

Tyr

115

120

125

Thr Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

130

135

140

<210>

3

<211>

137

<212>

Белок

<213>

Искусственная

<220>

<223>

Вариабельный

участок

(VH)

mAb против

NTB-

-A 26B7

<400>

3

Met Gly

Trp

Ser

Tyr

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

1

5

10

15

Val His

Ser

Gln

Val

Gln

Leu

Leu

Gln

Pro

Gly

Ala

Glu

Val

Val

Lys

20

25

30

Pro Gly

Thr

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Asn

Phe

- 29 031025

Thr

Ile 50

Tyr Trp

Ile Asn Trp Val 55

Lys

Leu Arg

Pro 60

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

Gly

Asp

Ile

His

Pro

Gly

Arg

Gly

Asn

Thr

Asn

Leu

Asn

65

70

75

80

Glu

Lys

Phe

Lys

Thr

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Thr

Ser

Ser

Ser

85

90

95

Thr

Ala

Tyr

Met

Gln

Leu

Asn

Ser

Leu

Ala

Phe

Glu

Asp

Ser

Ala

Leu

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Glu

Asp

Glu

Asp

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

115

120

125

Ala

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130 135 <210> 4 <211> 128 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223>

Вариабельный

участок

(VL)

mAb против

NTB-A 26B7

<400>

4

Met

Lys

Leu

Leu

Ala

Glu

Leu

Leu

Gly

Leu

Leu

Leu

Phe

Cys

Phe

Ser

1

5

10

15

Gly

Val

Arg

Cys

Asp

Ile

Gln

Met

Asn

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

20

25

30

Ala

Ser

Leu

Gly

Asp

Thr

Ile

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gln

Gly

35

40

45

Ile

Ser

Ile

Trp

Phe

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Ser

Gly

Asn

Ile

Pro

50

55

60

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Lys

Thr

Ser

Asn

Leu

His

Thr

Gly

Val

Pro

Pro

65

70

75

80

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

85

90

95

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Leu

Gln

Ser

Gln

100

105

110

- 30 031025

Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr

115 120

Lys Leu Glu Ile Lys Arg

125

<210>	5
<211>	5
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Последовательность CDR домена VH и VL антитела против NTB-A 11A1
<400>	5
Asp Tyr Tyr Val His
1	5

<210> 6 <211> 17 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность CDR домена VH и VL антитела против NTB-A 26B7 <400>6

Lys Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Ile Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln

5 1015

Gly <210>7 <211>7 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность CDR домена VH и VL антитела против NTB-A 11A1 <400> 7

Tyr Ser Thr Tyr Phe Asp Tyr

5

<210> <211> <212> <213>	8 16 Белок Искусственная
<220>
<223>	Последовательность CDR домена VH и VL антитела против NTB-A 11A1
<400>	8
Lys Ala Ser Lys Lys Val Thr Ile Phe Gly Ser Ile Ser Ala Leu His

- 31 031025 <210>

<211>

<212>

<213>

Белок

Искусственная <220>

<223>

Последовательность CDR домена

VH

VL антитела против

NTB-A

11A1 <400>

Asn Gly Ala Lys Leu Glu Ser <210>

<211>

<212>

<213>

Белок

Искусственная1 <220>

<223>

Последовательность CDR домена

VH

VL антитела против

NTB-A

11A1 <400>

Leu Gln Asn Lys Glu Val Pro Tyr Thr 1 <210>

<211>

<212>

<213>

Белок

Искусственная <220>

<223>

<400>

Последовательность CDR домена

VH

VL антитела против

NTB-A

6B7

Ile Tyr Trp Ile Asn <210>

<211>

<212>

<213>

Белок

Искусственная <220>

<223>

Последовательность CDR домена

VH

VL антитела против

NTB-A

11A1 <400>

Asp Ile His Pro Gly Arg Gly Asn Thr Asn Leu Asn Glu Lys Phe Lys

5 10 15

Thr <210> 13

- 32 031025 <211>9 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223>	Последовательность CDR домена	VH и VL антитела против	NTB-A	11A1
<400>	13
Glu Asp	Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1	5
<210>	14
<211>	11
<212>	Белок
<213>	Искусственная
<220>
<223>	Последовательность CDR домена	VH и VL антитела против	NTB-A	11A1
<400>	14
Arg Ala	. Ser Gln Gly Ile Ser Ile Trp	Phe Asn
1	5	10

<210>15 <211>7 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность CDR домена VH и VL антитела против NTB-A 11A1 <400>15

Lys Thr Ser Asn Leu His Thr <210> 16 <211>9 <212> Белок <213> Искусственная <220>

<223> Последовательность CDR домена VH и VL антитела против NTB-A 11A1 <400>16

Leu Gln Ser Gln Ser Tyr Pro Tyr Thr

Claims (11)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенное антитело, которое специфически связывает NTB-А человека (SLAMF6), где антитело содержит аминокислотную последовательность CDR-H1, показанную в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO:11;

   аминокислотную последовательность CDR-H2, показанную в SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO:12;

   аминокислотную последовательность CDR-H3, показанную в SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO:13;

   аминокислотную последовательность CDR-L1, показанную в SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO:14;

   - 33 031025 аминокислотную последовательность CDR-L2, показанную в SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 15; и аминокислотную последовательность CDR-L3, показанную в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 16.
2. 2. Антитело по п.1, где антитело содержит домены VH и VL, имеющие аминокислотные последовательности в положениях 20-135 из SEQ ID NO: 1 и положениях 21-140 из SEQ ID NO: 2 соответственно.
3. 3. Антитело по п.2, где антитело содержит первую полипептидную цепь, содержащую домен VH, и вторую полипептидную цепь, содержащую домен VL, причем первая полипептидная цепь содержит по меньшей мере часть константного участка тяжелой цепи иммуноглобулина, гибридизованного с доменом VH, а вторая полипептидная цепь содержит по меньшей мере часть константного участка легкой цепи иммуноглобулина, гибридизованного с доменом VL.
4. 4. Антитело по п.3, где константный участок тяжелой цепи представляет собой мутантную форму природного человеческого константного участка, обладающую пониженной способностью к связыванию рецептора Fcy по сравнению с природным человеческим константным участком.
5. 5. Антитело по любому из пп.3 или 4, где константный участок тяжелой цепи относится к изотипу, выбранному из группы, включающей изотипы иммуноглобулинов человека IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
6. 6. Антитело по любому из пп.1-5, где антитело конъюгировано с цитотоксическим или цитостати ческим средством.
7. 7. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая домен VH и VL домен, определенные в п.2.
8. 8. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественного новообразования, содержащая антитело по п.1 и фармацевтически совместимый ингредиент.
9. 9. Способ лечения пациента со злокачественным новообразованием, характеризующимся экспрессией NTB-A, где способ включает введение пациенту антитела по п.1.
10. 10. Способ по п.9, где злокачественное новообразование выбрано из группы, включающей множественную миелому, острый миелоидный лейкоз (AML) и Т- или В-клеточную лимфому.
11. 11. Способ по п.10, где В-клеточная лимфома представляет собой неходжкинскую лимфому (NHL).

    Фиг. 1