ES2710976T3 - Anticuerpos anti-CD52 - Google Patents

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Ronnie Rong Wei
Clark Qun Pan
Rebecca Sendak
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Abstract

Un anticuerpo anti-CD52 humana o un fragmento de unión a antígeno fragmento de este, en donde dicho anticuerpo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden: a) las SEQ ID NOs: 59 y 74, respectivamente; b) las SEQ ID NOs: 59 y 78, respectivamente; o c) las SEQ ID NOs: 59 y 79, respectivamente.

Description

DESCRIPCION
Anticuerpos anti-CD52
Listado de secuencias
La presente solicitud contiene un Listado de secuencias que se ha presentado electronicamente como un fichero de texto en formato ASCII y que se incorpora a la presente memoria por referencia en su totalidad. Dicho fichero de texto, creado el 11 de marzo de 2014, lleva el nombre 001662-0041-WO1_SL.txt y tiene un tamano de 142.582 bytes.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere, en general, a anticuerpos y, mas espedficamente, a anticuerpos que tienen especificidad de union para CD52 humana.
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos 61/794.576, presentada el 15 de marzo de 2013.
Antecedentes de la invencion
CD52 es una protema de superficie celular anclada a glucosilfosfatidilinositol (GPI, por sus siglas en ingles) glucosilada que se encuentra en abundancia (500000 moleculas/celula) en una variedad de celulas linfodticas normales y malignas (p. ej., linfocitos T y B). Vease, p. ej., Hale et al., J; Biol Regul Homeost Agents 15:386-391 (2001); Huh et al., Blood 92: Abstract 4199 (1998); Elsner et al., Blood 88:4684-4693 (1996); Gilleece et al., Blood 82:807-812 (1993); Rodig et al., Clin Cancer Res 12:7174-7179 (2006); Ginaldi et al., Leuk Res 22:185-191 (1998). CD52 se expresa a niveles bajos en celulas mieloides tales como monocitos, macrofagos y celulas dendnticas, con escasa expresion en linfocitos citolfticos naturales maduros (NK, por sus siglas en ingles), neutrofilos y celulas madre hematologicas. Id. En total, CD52 esta presente en al menos 95 % de todos los linfocitos y monocitos/macrofagos de sangre periferica humanos (Hale G, et al., "The CAMPATH-1 antigen (CD52)", Tissue Antigens, 35:178-327 (1990)). Las celulas epiteliales tambien producen CD52 en el epidfdimo y el conducto deferente, y el esperma la adquiere durante el pasaje a traves del aparato genital (Hale et al., 2001, supra; Domagala et al., Med Sci Monit 7:325-331 (2001)). La funcion biologica exacta de CD52 permanece incierta, pero algunas evidencias sugieren que puede participar en la migracion y coestimulacion de los linfocitos T (Rowan et al., Int Immunol 7:69-77 (1995); Masuyama et al., J Exp Med 189:979-989 (1999); Watanabe et al., Clin Immunol 120:247-259 (2006)).
Se han desarrollado diversos anticuerpos monoclonales anti-CD52. Campath-1H® (tambien conocido como alemtuzumab, Campath®, MabCampath®) es un anticuerpo monoclonal anti-CD52 humana humanizado que exhibe efectos citotoxicos potentes in vitro (citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en ingles) y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por sus siglas en ingles)). Alemtuzumab reconoce un epttopo que consiste en los cuatro aminoacidos del extremo carboxflico de la protema CD52 madura y una porcion del anclaje GPI cargado negativamente. Se han generado anticuerpos monoclonales anti-CD52 humana adicionales (vease, p. ej., WO2010/132659). Sin embargo, la afinidad de union de algunos de estos anticuerpos disminuye durante el almacenamiento y en ciertas condiciones de pH y temperatura. Por lo tanto, existe la necesidad de anticuerpos anti-CD52 que tengan una tendencia reducida a sufrir este cambio.
Compendio de la invencion
La invencion se expone en las reivindicaciones adjuntas. La invencion presenta anticuerpos anti-CD52 humana que se han genomanipulado para conservar la afinidad de union a lo largo del tiempo y en condiciones de pH y temperatura elevados. Los terminos «anticuerpo» e «inmunoglobulina» se usan de manera intercambiable en la presente memoria. Tambien se proporcionan acidos nucleicos aislados, vectores y celulas hospedantes recombinantes que comprenden una secuencia que codifica una cadena ligera o cadena pesada del anticuerpo anti-CD52, y un metodo para preparar un anticuerpo anti-CD52.
Ab26 es un anticuerpo monoclonal anti-CD52 humana humanizado que tiene una secuencia de aminoacidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 menos la secuencia senal y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera de la SEQ Id NO: 4 menos la secuencia senal. Ab26 tiene afinidad de union por CD52 y potencia reducidas a lo largo del tiempo durante el almacenamiento. De manera inesperada, hallamos que variantes de Ab26 con ciertas sustituciones simples de aminoacidos en la posicion 11 de la CDR1 de cadena ligera (p. ej., los anticuerpos monoclonales Ab21, Ab16 y Ab20) no solo conservan o superan la afinidad de union por CD52 humana de Ab26, sino que tambien demuestran una estabilidad significativamente mejorada en comparacion con Ab26. Los anticuerpos variantes tales como Ab21, Ab16 y Ab20 han demostrado una potencia biologica comparable o mejorada in vitro e in vivo en comparacion con Ab26. Estas variantes son utiles para aplicaciones terapeuticas y de diagnostico.
En la presente memoria se describe un anticuerpo anti-CD52 humana o fragmento de union a antigeno que comprende una region variable de cadena pesada y una region variable de cadena ligera, en donde dicha region variable de cadena pesada comprende: la CDR1 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 7; la CDR2 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 8; y la CDR3 de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9, y en donde dicha region variable de cadena ligera comprende la CDR1 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 86; la c DR2 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 34; y la CDR3 de cadena ligera de la SEQ ID NO: 35. El residuo 11 en la SEQ ID NO: 86 puede ser, p. ej., K, R, Q, H, S, Y, A, D, E, F, I, L, M, N, T o V.
La region variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD52 o fragmento puede comprender la SEQ ID NO: 59. La region variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CD52 o fragmento puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 74, 78 y 79. Por ejemplo, las cadenas pesada y ligera del anticuerpo o fragmento de la invencion pueden comprender: a) las SEQ ID NOs: 59 y 74, respectivamente; b) las SEQ ID NOs: 59 y 78, respectivamente; o c) las SEQ ID NOs: 59 y 79, respectivamente.
En algunas realizaciónes, el anticuerpo o fragmento comprende una secuencia de aminoacidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 sin la secuencia senal. En realizaciónes adicionales, el anticuerpo o fragmento comprende una secuencia de aminoacidos de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 49, 53 y 54. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento puede comprender (a) una secuencia de aminoacidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 sin la secuencia senal y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 49; (b) una secuencia de aminoacidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 sin la secuencia senal y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 53; o (c) una secuencia de aminoacidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 sin la secuencia senal y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 54.
En algunas realizaciónes, el anticuerpo de la invencion es una inmunoglobulina G (IgG). En realizaciónes adicionales, el anticuerpo comprende una region Fc humana (p. ej., una region Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana). La invencion tambien abarca un fragmento de union a antfgeno de cualquiera de los anticuerpos de la invencion, en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en un fragmento scFv, un fragmento Fv, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un minicuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo y un tetracuerpo.
En algunas realizaciónes, el anticuerpo de la invencion es monoclonal. En realizaciónes adicionales, el anticuerpo y el fragmento de union a antfgeno es humanizado. La lisina del extremo C de la cadena pesada de un anticuerpo o fragmento de la invencion se puede escindir opcionalmente.
La invencion tambien se refiere a una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotidica que codifica la cadena pesada o un fragmento de union a antfgeno de esta, y la cadena ligera o un fragmento de union a antfgeno de esta, de un anticuerpo. En algunas realizaciónes, la molecula de acido nucleico aislada comprende la secuencia nucleotidica de la SEQ ID NO: 101, 105, 106, 125, 129 o 130. La invencion tambien abarca un vector recombinante (p. ej., un vector de expresion) que comprende dicha molecula de acido nucleico. En algunas realizaciónes, la invencion abarca una celula hospedante aislada que comprende dicho vector.
La invencion tambien abarca una lmea celular aislada que produce un anticuerpo anti-CD52 o fragmento descrito en la presente memoria. En algunas realizaciónes, la invencion se refiere a un metodo para producir un anticuerpo antic D52 humana o un fragmento de union a antfgeno de este, que comprende (1) mantener la celula hospedante o la lmea celular descritas en la presente memoria en condiciones adecuadas para la expresion del anticuerpo o fragmento; y (2) recuperar el anticuerpo o fragmento.
La invencion abarca una composicion que comprende el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno descritos en la presente memoria y un vehmulo o portador farmaceuticamente aceptable.
La invencion se refiere a un metodo para tratar a un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz del anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno descritos en la presente memoria. En algunas realizaciónes, la invencion abarca un metodo para tratar una enfermedad autoinmunitaria (p. ej., esclerosis multiple) en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno descritos en la presente memoria. En algunas realizaciónes, la invencion abarca un metodo para tratar un cancer (p. ej., leucemia linfocftica cronica) en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno descritos en la presente memoria. La invencion tambien se refiere a un metodo para inhibir la angiogenesis en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente un anticuerpo o un fragmento de union a antfgeno descritos en la presente memoria.
En algunas realizaciónes, la invencion se refiere al uso del anticuerpo o fragmento de union a antfgeno descritos en la presente memoria para el tratamiento de, o la preparacion de un medicamento para tratar, una enfermedad autoinmunitaria (p. ej., esclerosis multiple) en un paciente que lo necesita. La invencion tambien se refiere al uso del anticuerpo o fragmento de union a antigeno descritos en la presente memoria para el tratamiento de, o la preparacion de un medicamento para tratar, un cancer (p. ej., leucemia linfocftica cronica) en un paciente que lo necesita. La invencion se refiere, ademas, al uso del anticuerpo o fragmento de union a antigeno descritos en la presente memoria para el tratamiento de la angiogenesis excesiva, o para la preparacion de un medicamento para inhibir la angiogenesis, en un paciente que lo necesita.
Breve descripcion de los dibujos
El fichero de la patente o solicitud contiene al menos un dibujo a colores. La Oficina proporcionara copias de la presente publicacion de patente o solicitud de patente con dibujo(s) a colores a pedido y tras el pago de la tarifa correspondiente.
La Figura 1 representa resultados de una deteccion sistematica rapida de anticuerpos anti-CD52. El panel superior es un flujograma de la preparacion de los anticuerpos. Las graficas del panel del medio y las tablas del panel inferior muestran los resultados de los ensayos de union BlACORE™ y las mediciones del nivel de expresion Octet.
La Figura 2 representa resultados de experimentos para la caracterizacion de anticuerpos anti-CD52 purificados. El panel superior es una fotograffa de un gel de SDS-PAGE que muestra la separacion de la cadena pesada y la cadena ligera de los anticuerpos anti-CD52. Los marcadores de peso molecular se muestran en el carril marcado con (M). La grafica y tabla en los paneles inferiores muestran los resultados de los ensayos de union BlACORE™. La Figura 3 representa fotograffas de geles de SDS-PAGE que muestran preparaciones de los anticuerpos Ab24 y Ab10 producidos en celulas CHO. Los geles tambien muestran un anticuerpo anti-CD52 testigo (TES) y el anticuerpo Ab1. El recorte de la especie de 100kD y LC se indican con flechas.
La Figura 4 representa una fotograffa de un gel de SDS-PAGE que muestra la especie de 100kD encontrada en los anticuerpos Ab24 y Ab10 con una ilustracion del dfmero «de cadena pesada solo» a la derecha. Tambien se muestran los resultados de la secuenciacion del extremo N.
La Figura 5 representa resultados de experimentos para la caracterizacion adicional de anticuerpos anti-CD52. La tabla y graficas muestran los resultados de los ensayos de union BlACORE™ y las mediciones del nivel de expresion Octet. «KGN» se refiere a un anticuerpo anti-CD52 con la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 y la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2.
La Figura 6 representa resultados de experimentos para la caracterizacion de la union a CD52 de anticuerpos anti-CD52 purificados. El panel izquierdo es una fotograffa de un gel de SDS-PAGE que muestra la cadena pesada y la cadena ligera del natural (TES) y otros anticuerpos. Los marcadores de peso molecular se muestran en el carril marcado con (M). La grafica del panel derecho muestra los resultados de los ensayos de union BlACORE™.
La Figura 7 es una grafica que representa resultados de un ensayo CDC de un anticuerpo anti-CD52 testigo y los anticuerpos Ab21, Ab16 y Ab20.
La Figura 8 representa resultados de ensayos para determinar la actividad de reduccion de celulas CD52+ de un anticuerpo anti-CD52 testigo (TES) y los anticuerpos Ab21, Ab16 y Ab20 en ratones transgenicos con CD52 humana. La grafica a la izquierda muestra resultados de muestras de sangre. La grafica a la derecha muestra resultados de muestras de bazo.
La Figura 9 muestra la secuencia de aminoacidos de una protema CD52 humana natural (N.° de acceso a GenBank AAH00644.1) (SEQ ID NO: 1).
La Figura 10 muestra la secuencia de aminoacidos de cadena pesada de longitud completa de los anticuerpos Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25 y KGN (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoacidos de cadena ligera de longitud completa del anticuerpo Ab26 (SEQ ID NO: 4). Las secuencias senal se indican en negrita y cursiva y las CDR estan subrayadas.
La Figura 11 muestra la secuencia de acido nucleico de cadena pesada de longitud completa de los anticuerpos Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25 y KGN (SEQ ID NO: 5)y las secuencias de acido nucleico de cadena ligera de longitud completa de los anticuerpos Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25 y KGN. Las secuencias senal estan subrayadas y los marcos de lectura abiertos estan en negrita.
La Figura 12 muestra las secuencias de aminoacidos de H-CDR1 (SEQ ID NO: 7), H-CDR2 (SEQ ID NO: 8), H-CDR3 (SEQ ID NO: 9), L-CDR2 (SEQ ID NO: 34) y L-CDR3 (SEQ ID NO: 35) de los anticuerpos Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24 y Ab25.
La Figura 13 muestra las secuencias de aminoacidos de L-CDR1 de los anticuerpos Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25 y Ab26. La Figura 14 muestra las secuencias de aminoacidos de cadena ligera de longitud completa de los anticuerpos Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24 y Ab25. Las CDR estan subrayadas.
La Figura 15 muestra las secuencias de aminoacidos de dominio variable de cadena pesada y ligera de los anticuerpos Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24 y Ab25. Las CDR estan subrayadas.
La Figura 16 muestra las secuencias de acido nucleico del dominio variable de cadena pesada y los dominios variables de cadena ligera de los anticuerpos Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25 y KGN.
La Figura 17 representa los resultados de experimentos para caracterizar el anticuerpo Ab1 purificado a partir de celulas HEK293. La grafica y tabla muestran resultados de ensayos BIACORE™ que miden la afinidad de Ab1 y dos preparaciones de Ab26 (TES1 y TES2) por un peptido de CD52. El panel superior derecho es una fotograffa de un gel de SDS-PAGE reductor que muestra la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) de dos preparaciones de los anticuerpos Ab26 (TES1 y t Es2) y Ab1.
La Figura 18 representa los resultados de experimentos para caracterizar el anticuerpo Ab1 purificado a partir de celulas CHO. Las graficas muestran resultados de ensayos BIACORE™ que miden la afinidad del anticuerpo Ab1 (panel inferior) y el anticuerpo Ab26 (TES) (panel superior) por un peptido de CD52.
La Figura 19 es una grafica que representa resultados de un ensayo CDC del anticuerpo Ab1 y el anticuerpo Ab26 (Testigo). Los resultados se expresan en unidades de fluorescencia relativas (UFR) como una funcion de la concentracion final en mg/ml del anticuerpo.
La Figura 20 representa resultados de una deteccion sistematica de la estabilidad de anticuerpos anti-CD52. La grafica del panel izquierdo superior muestra la Kd (nM) como una funcion del tiempo (semanas) a 45 °C y pH 7,2 para Ab26 (TES) y anticuerpos variantes. La grafica del panel derecho superior muestra la afinidad con respecto a T0 como una funcion del tiempo (semanas) a 45 °C y pH 7,2 para Ab26 (TES) y anticuerpos variantes.
La Figura 21 representa resultados de experimentos que evaluan el efecto de la incubacion en tampon de tres componentes sobre la estabilidad de anticuerpos anti-CD52. La grafica del panel izquierdo superior muestra la Kd (nM) en la Semana 0, Semana 2 y Semana 4 a 37 °C y pH 7,5 para dos preparaciones de Ab26 (TES1 y TES2) y anticuerpos variantes. La grafica del panel derecho superior muestra la Kd (nM) en la Semana 0, Semana 2 y Semana 4 a 45 °C y pH 7,4 para Ab26 (TES) y anticuerpos variantes.
La Figura 22 representa resultados de un analisis por cromatograffa de exclusion por tamanos (SEC)-HPLC de Ab26 (TES), Ab21, Ab16 y Ab20 despues de incubacion a 45 °C.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se basa en nuestro hallazgo de que ciertos anticuerpos anti-CD52 pierden estabilidad y demuestran afinidad de union reducida a lo largo del tiempo durante el almacenamiento o en ciertas condiciones de pH y temperatura. La invencion se expone en las reivindicaciones adjuntas. Hemos generados anticuerpos variantes que comprenden sustituciones de aminoacidos en una unica posicion (la posicion 11) en la CDR1 de cadena ligera (L-CDR1) de los anticuerpos originales. Hallamos que algunos de estos anticuerpos variantes demuestran no solo caractensticas de union a antfgeno y actividad biologica similares o mejoradas, incluso potencia in vivo, sino que tambien estabilidad mejorada, en comparacion con el anticuerpo original.
En la presente memoria se describen anticuerpos anti-CD52 humana, fragmentos de union a antfgeno (es decir, porciones) de los anticuerpos, las cadenas ligeras de los anticuerpos, las cadenas pesadas de los anticuerpos, y fragmentos de estas cadenas ligeras o cadenas pesadas. En la presente memoria se describen anticuerpos maduros o cadenas de estos, tales como anticuerpos glucosilados, asf como una protema de anticuerpo inmaduro o precursor. Tambien se describen en la presente memoria moleculas de acido nucleico (p. ej., vectores) que codifican estas protemas inmaduras o maduras, celulas hospedantes que comprenden dichos acidos nucleicos, metodos para producir protemas inmaduras y maduras y metodos para usar los anticuerpos.
Los anticuerpos y porciones de union a antfgeno de la presente invencion se pueden usar para tratar a un sujeto que lo necesita, p. ej., un paciente humano, para una variedad de enfermedades y afecciones mediadas o causadas por celulas que portan CD52, tales como ciertas indicaciones de enfermedades mediadas por la inmunidad (IMD, por sus siglas en ingles). Un mecanismo de accion puede ser uno en el que los anticuerpos anti-CD52 destruyen dichas celulas (p. ej., linfocitos o celulas cancerosas CD52+) al provocar la muerte celular. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden usar para tratar enfermedades autoinmunitarias (p. ej., esclerosis multiple (MS, por sus siglas en ingles), artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico, vasculitis, miositis y enfermedad de Wegener) a traves de la destruccion de linfocitos, un tipo de inmunosupresion que se logra al reducir la poblacion de linfocitos en circulacion, p. ej., linfocitos T y/o linfocitos B, que resulta en linfopenia. Los anticuerpos de la invencion tambien se pueden usar para tratar un cancer, por ejemplo, leucemias (p. ej., leucemia linfodtica cronica) y linfomas (p. ej., linfoma no hodgkiniano) o se pueden usar en el trasplante de tejidos (p. ej., trasplantes de organos solidos (p. ej., trasplante renal) y trasplantes de celulas madre). Los anticuerpos de la presente invencion tambien se pueden usar para enriquecer celulas madre hematopoyeticas, por ejemplo, en aplicaciones ex vivo (vease, p. ej., Lim et al., J. Hematology & Oncology 1:19 (2008)).
Propiedades de union a antfgeno de los presentes anticuerpos
Los anticuerpos de la presente invencion tienen especificidad de union (p. ej., especificidad epitopica) para, o son selectivos para unirse a, CD52 humana o una porcion de esta. Estos anticuerpos se unen espedficamente a una molecula de CD52, y no se unen espedficamente a moleculas distintas de CD52. La union espedfica entre un anticuerpo anti-CD52 y CD52 se puede determinar, por ejemplo, al medir la CE50 de union del anticuerpo a celulas CD52+ mediante citometna de flujo. La union espedfica se puede indicar mediante una CE50 menor que 10 pg/ml (p. ej., segun se determina mediante citometna de flujo). Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden tener especificidad de union para una CD52 humana o un fragmento de esta. Los ensayos de union se pueden llevar a cabo con una CD52 humana aislada o recombinante; peptidos derivados de CD52 humana; o celulas que expresan CD52 humana (p. ej., linfocitos T y/o B humanos, celulas hospedantes recombinantes que expresan un acido nucleico que codifica CD52 humana o fracciones de membrana celular de dichas celulas). Ademas, los anticuerpos pueden tener especificidad de union para una o mas formas de CD52 humana (p. ej., CD52 humana glucosilada; CD52 humana desglucosilada; CD52 humana no glucosilada; y variantes alelicas). En una realización, los anticuerpos tienen especificidad de union para una CD52 humana de origen natural, endogeno o natural. La secuencia de aminoacidos de una CD52 humana natural se expone en la Figura 9 (SEQ ID NO: 1).
«Afinidad de union a antfgeno» es un termino de la tecnica que describe la intensidad de una interaccion de union y tfpicamente se refiere a la intensidad de union general de un anticuerpo a su antfgeno. En algunas realizaciónes, el presente anticuerpo se une a CD52 humana con una afinidad indicada por, p. ej., (1) una Kd (Ko=Koff(kd)/Kon (ka)) de 110x10"7 M o menor, 1 preferiblemente 1x10"8 M o 1 m1enor, mas 1 p2referiblemente 1x10"9 M o menor, venta J josamente 1x10" M o menor, y lo mas preferiblemente 1x10 M o 1x10 . Por ejemplo, la Kd vana de 100 nM a 1 pM (es decir, 1x10"7 a 1x10"12 M), de 50 nM a 1 pM, de 5 nM a 1 pM o de 1 nM a 1 pM. Una afinidad de union a antfgeno deseada tambien se puede indicar mediante una constante de disociacion Koff de 5x10"1 s"1 o menor, preferiblemente 1x10"2 s" 1 o menor, ventajosamente 1x10"3 s"1 o menor, mas preferiblemente 1x104 s"1 o menor, todavfa mas preferiblemente 1x10"5 s"1 o menor, y lo mas preferiblemente 1x10"6 s"1 o menor, segun se determina mediante resonancia de plasmones superficiales. Por ejemplo la constante de disociacion Koff puede variar de 5x10"1 s"1 a 1x10"7 s"1, de 1x10"2 s"1 a 1x10"6 s"1, o de 5x10"3 s"1 a 1x10"5 s"1. Una intensidad de union a antfgeno deseada en un ensayo o entorno particular tambien se puede indicar mediante una CE50 de no mas de 10 pg/ml, p. ej., una CE50 de 0,1~10 pg/ml.
Los anticuerpos de esta invencion incluyen aquellos que se unen a un epftopo en CD52 que es el mismo que, o se superpone con, el epftopo de CD52 al que se une el anticuerpo Ab26, o cualquiera de sus variantes ejemplificadas en la presente memoria. La union al epftopo se puede determinar facilmente usando una variedad de tecnicas tales como ensayos de union competitiva. Un «epftopo», segun se usa en la presente memoria, incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse espedficamente a un anticuerpo. Los determinantes epitopicos generalmente consisten en agrupaciones superficiales qmmicamente activas de moleculas tales como aminoacidos y/o cadenas laterales de carbohidrato o azucar y generalmente tienen caractensticas estructurales tridimensionales espedficas, asf como caractensticas de carga espedficas. Un epftopo puede ser «lineal» o «conformacional». En un epftopo lineal, todos los puntos de interaccion entre la protema y la molecula de interaccion (tal como un anticuerpo) se producen linealmente a lo largo de la secuencia de aminoacidos primaria de la protema. En un epftopo conformacional, los puntos de interaccion se producen a lo largo de residuos aminoaddicos en la protema que estan separados entre sf en la secuencia polipeptfdica primaria.
En una realización, para determinar si un anticuerpo de prueba se une al mismo epftopo o a uno superpuesto de un anticuerpo anti~CD52 particular de la presente invencion, se deja que el anticuerpo anti~CD52 de la invencion se una a CD52 en condiciones de saturacion y despues se mide la capacidad del anticuerpo de prueba para unirse a CD52. Si el anticuerpo de prueba es capaz de unirse a CD52 al mismo tiempo que el anticuerpo anti~CD52 de referencia, entonces se puede inferir que el anticuerpo de prueba se une a un epftopo diferente que el anticuerpo anti~CD52 de referencia. Sin embargo, si el anticuerpo de prueba no es capaz de unirse a CD52 al mismo tiempo, entonces se puede inferir que el anticuerpo de prueba se une a un epftopo que es el mismo que, o se superpone con, el epftopo al que se une el anticuerpo anti~CD52 de referencia, o a un epftopo que esta muy proximo al epftopo al que se une el anticuerpo de referencia. Este experimento se puede llevar a cabo usando ELISA, RIA, BIACORE™ o citometna de flujo. Para evaluar si un anticuerpo anti-CD52 compite de manera cruzada con otro anticuerpo anti-CD52, se puede usar el metodo de competicion descrito anteriormente en dos sentidos, es dedr, determinar si el anticuerpo de referencia bloquea al anticuerpo de prueba y viceversa.
El agrupamiento epitopico tambien puede ser util para caracterizar los anticuerpos de la presente invencion. El termino «agrupamiento» se refiere a un metodo para agrupar anticuerpos en funcion de sus caractensticas de union a antigeno. Un proceso de alto rendimiento para «agrupar» anticuerpos en funcion de su competicion cruzada se describe en la publicacion de solicitud de patente internacional n.° WO 03/48731. El «agrupamiento epitopico» se puede investigar al permitir que una forma no etiquetada de un anticuerpo anti-CD52 «A» se una a un peptido sintetico correspondiente a la secuencia de CD52 o a celulas CD52 positivas. Posteriormente, se agrega un segundo anticuerpo anti-CD52 etiquetado «B» y se puede evaluar la cantidad de anticuerpo etiquetado que se puede unir con respecto a una muestra testigo donde las celulas o el peptido sintetico no se han expuesto anteriormente al anticuerpo anti-CD52 «A». Alternativamente, se pueden etiquetar los anticuerpos anti-CD52 «A» y «B» con diferentes fluorocromos o sustancias qmmicas que permiten la deteccion, y se pueden medir las cantidades de ambos anticuerpos etiquetados que se pueden acoplar al antfgeno de CD52 al mismo tiempo usando un dispositivo capaz de detectar las etiquetas, o medir las cantidades de ambos anticuerpos que se acoplan simultaneamente a celulas CD52 positivas mediante citometna de flujo. Las tecnologfas BIACo r E™ y Octet permiten investigar la union competitiva de formas no etiquetadas de anticuerpos. Este uso de formas no etiquetadas de anticuerpos se desea ya que la modificacion qmmica de algunos anticuerpos puede comprometer la actividad de union. Vease tambien la tecnologfa descrita en Jia et al., J. Immunol. Metodos 288:91-98 (2004), que es util para llevar a cabo el agrupamiento epitopico.
En algunas realizaciónes, los anticuerpos de la invencion se unen a CD52 humana con una afinidad similar o mejor que la del anticuerpo Ab26. En una realización particular, los anticuerpos de la invencion tienen especificidad epitopica y funcion biologica iguales o similares (p. ej., funcion de destruccion de linfocitos) que las del anticuerpo Ab26. En una realización, los presentes anticuerpos se unen a un epftopo que comprende los residuos aminoaddicos QTSS de CD52 humana.
Estructuras de los presentes anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno
Los anticuerpos de origen natural tienen una estructura central comun en la que dos cadenas ligeras identicas (aproximadamente 24 kD) y dos cadenas pesadas identicas (aproximadamente 55 o 70 kD) forman un tetramero. La porcion del extremo ammico de cada cadena se conoce como la region variable (V) y se puede distinguir de las regiones constantes (C) mas conservadas del resto de cada cadena. Dentro de la region variable de la cadena ligera (tambien denominada dominio Vl) hay una porcion de extremo carboxflico conocida como la region J. Dentro de la region variable de la cadena pesada (tambien denominada dominio Vh) hay una region D ademas de la region J. La mayor parte de la variacion secuencial de aminoacidos en anticuerpos esta restringida a tres ubicaciones separadas en las regiones V conocidas como regiones hipervariables o regiones de determinacion de la complementariedad (CDR, por sus siglas en ingles), que participan directamente en la union al antfgeno. Procediendo desde el extremo ammico, estas regiones se designan CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente. Las CDR se mantienen en su lugar mediante regiones marco conservadas (FR, por sus siglas en ingles). Procediendo desde el extremo ammico, estas regiones se designan FR1, FR2, FR3 y FR4, respectivamente. Las ubicaciones de las regiones CDR y FR y un sistema de numeracion han sido definidos por Kabat et al. Vease, Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edicion, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991); Chothia & Lesk, Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987); y el sistema de numeracion IMGT® (The International ImMunoGeneTics Iinformation System®; Lefranc, M.-P., The Immunologist 7, 132-136 (1999)). La inspeccion visual y el analisis secuencial se pueden llevar a cabo para identificar los lfmites de las CDR. Para la presente invencion, las secuencias de CDR se definen usando el sistema de Kabat y el sistema IMGT; es decir, cuando las CDR definidas por los dos sistemas no se superponen totalmente, se incluyen todos los residuos de las secuencias definidas por ambos sistemas.
La presente invencion presenta variantes del anticuerpo Ab26 original. Las secuencias de aminoacidos y acido nucleico de cadena pesada y ligera de Ab26 se muestran en las Figuras 10 y 11, respectivamente. Ab26 comprende la secuencia de aminoacidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 sin la secuencia senal y la secuencia de aminoacidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4 sin la secuencia senal.
Segun se describen en la presente memoria, las CDR de un anticuerpo pueden diferir de Ab26 en la secuencia de aminoacidos de CDR1 de cadena ligera en el residuo 34 de la protema de Ab26 madura. Algunos de estos cambios mejoran en gran medida la estabilidad del anticuerpo variante sin afectar sus caractensticas de union a antfgeno. Si la mutacion en el residuo 34 reduce la afinidad de union a antfgeno del anticuerpo variante, se pueden hacer una o mas mutaciones adicionales en la secuencia del anticuerpo (por ejemplo, en la L-CDR1, L-CDR2, L-CDR2, H-CDR1, H-CDR2 o H-CDR3) para restaurar la afinidad. El residuo 34 se puede cambiar, p. ej., de G a K, R, Q, H, S, Y, A, D, E, F, I, L, M, N, T o V. Segun se describe en la presente memoria, la secuencia de L-CDR1 del anticuerpo anti-CD52 se puede seleccionar del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 24, 29, 28, 22, 30, 33, 18, 19, 20, 21, 23, 25, 26, 27, 31 y 32.
Las secuencias de CDR de los anticuerpos ilustrados espedficamente en la presente memoria se indican en la Tabla 1 a continuacion mediante su SEQ ID NOs.
Tabla 1 SEQ ID NOs de anticuerpos anti-CD52
Anticuerpo H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
Ab1 7 8 9 11 34 35
Ab2 7 8 9 12 34 35
Ab3 7 8 9 13 34 35
Ab4 7 8 9 14 34 35
Ab5 7 8 9 15 34 35
Ab6 7 8 9 16 34 35
Ab7 7 8 9 17 34 35
Ab10 7 8 9 18 34 35
Ab11 7 8 9 19 34 35
Ab12 7 8 9 20 34 35
Ab13 7 8 9 21 34 35
Ab14 7 8 9 22 34 35
Ab15 7 8 9 23 34 35
Ab16 7 8 9 24 34 35
Ab17 7 8 9 25 34 35
Ab18 7 8 9 26 34 35
Ab19 7 8 9 27 34 35
Ab20 7 8 9 28 34 35
Ab21 7 8 9 29 34 35
Ab22 7 8 9 30 34 35
Ab23 7 8 9 31 34 35
Ab24 7 8 9 32 34 35 Anticuerpo H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3 L-CDR1 L-CDR2 L-CDR3
Ab25 7 8 9 33 34 35
En algunas realizaciónes, los anticuerpos de la invencion estan humanizados. El termino «anticuerpo anti-CD52 humanizado» segun se usa en la presente memoria se refiere a un anticuerpo que comprende una o mas CDR de cadena ligera (CDR1, CDR2 y CDR3) y/o una o mas CDR de cadena pesada (Cd Ri , CDR2 y CDR3) de un anticuerpo anti-CD52 de origen no humano, tambien denominado anticuerpo donante (p. ej., un anticuerpo anti-CD52 murino); y al menos una porcion de un anticuerpo de origen humano (p. ej., regiones marco o regiones marco y constantes, derivadas de una cadena ligera y/o una cadena pesada de origen humano). Por ejemplo, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo con una CDR injertada con o sin cambios en el marco. En algunas realizaciónes, los anticuerpos humanizados son anticuerpos desinmunizados. Vease, p. ej., Carr patente estadounidense 7.264.806, referente a anticuerpos desinmunizados que se han modificado para reducir la cantidad de posibles epftopos para linfocitos T, y reducir, de este modo, la propension del anticuerpo a desencadenar una respuesta inmunitaria tras la administracion a un humano.
Se pueden hacer cambios en la region marco, tales como aquellos que sustituyen un residuo de la region marco de origen humano con un residuo de la posicion correspondiente de un anticuerpo donante. Vease Queen patente estadounidense 5.530.101. Se pueden hacer una o mas mutaciones, incluidas eliminaciones, inserciones y sustituciones de uno o mas aminoacidos en la region marco. Si se desea, se pueden incluir mutaciones marco en un anticuerpo humanizado, y se pueden seleccionar sitios para la mutacion usando cualquier metodo adecuado, por ejemplo, segun se describe en WO 98/06248 y la patente estadounidense 6.407.213. En algunos casos, tambien se incluyen uno o mas aminoacidos que flanquean una o mas CDR (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 aminoacidos flanqueadores) en el marco original en el anticuerpo humanizado para potenciar la afinidad de union a antfgeno. Se pueden hacer, opcionalmente, retromutaciones en las regiones marco en uno o mas de los residuos para mejorar la afinidad de union a CD52 del anticuerpo humanizado.
Los anticuerpos de la presente invencion pueden diferir del anticuerpo Ab26 en la adicion, eliminacion o sustitucion (p. ej., sustitucion conservadora) de uno o mas residuos, p. ej., diferir en hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 residuos con respecto a las secuencias originales.
A modo de ejemplos, se describen en la presente memoria anticuerpos que tienen una cadena pesada que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres c Dr ) de SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 68; una cadena pesada que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 69; una cadena pesada que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SeQ ID NO: 70; una cadena pesada que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de s Eq ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas c Dr (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 71; una cadena pesada que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de s Eq ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 72; una cadena pesada que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres c Dr ) de SEQ ID NO: 73; una cadena pesada que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de s Eq ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas c Dr (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 74; una cadena pesada que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de Se Q ID NO: 75; una cadena pesada que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 76; una cadena pesada que comprende una o mas c Dr (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de s Eq ID NO: 77; una cadena pesada que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de s Eq ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 78; una cadena pesada que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 79; una cadena pesada que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 80; una cadena pesada que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres c Dr ) de SEQ ID NO: 81; una cadena pesada que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de s Eq ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas c Dr (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 82; o una cadena pesada que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera que comprende una o mas CDR (p. ej., las tres CDR) de SEQ ID NO: 83.
En la presente memoria se describe un anticuerpo que tiene especificidad de union para CD52 humana y comprende (H)-CDR1 de cadena pesada, H-CDR2, H-c Dr3, (L)-CDR1 de cadena ligera, L-CDR2 y L-CDR3 cuyas secuencias de aminoacidos son: a) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 18, 34 y 35, respectivamente; b) SEQ ID nO: 7, 8, 9, 19, 34 y 35, respectivamente; c) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 20, 34 y 35, respectivamente; d) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 21, 34 y 35, respectivamente; e) Se Q ID NO: 7, 8, 9, 22, 34 y 35, respectivamente; f) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 23, 34 y 35, respectivamente; g) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 24, 34 y 35, respectivamente; h) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 25, 34 y 35, respectivamente; i) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 26, 34 y 35, respectivamente; j) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 27, 34 y 35, respectivamente; k) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 28, 34 y 35, respectivamente; l) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 29, 34 y 35, respectivamente; m) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 30, 34 y 35, respectivamente; n) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 31, 34 y 35, respectivamente; o) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 32, 34 y 35, respectivamente; o p) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 33, 34 y 35, respectivamente.
En la presente memoria se describe un anticuerpo que comprende la L-CDR1 de SEQ ID NO: 86 (KSSQSLLYSNXKTYLN), en donde X es un aminoacido de origen natural seleccionado de D, E, K, R, H, Y, C, N, Q, S, T, A, V, L, I, M, P, F o W o un aminoacido no estandar (p. ej., no natural).
La solicitud tambien describe una cadena ligera de anticuerpo de un anticuerpo descrito en la presente memoria. La cadena ligera de anticuerpo puede comprender una L-CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 y 33. Por ejemplo, el anticuerpo tiene L-CDR1, L-CDR2 y L-CDR3 cuyas secuencias de aminoacidos son: a) SEQ ID NO: 18, 34 y 35, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 19, 34 y 35, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 20, 34 y 35, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 21, 34 y 35, respectivamente; e) SEQ ID NOs: 22, 34 y 35, respectivamente; f) SEQ ID NOs: 23, 34 y 35, respectivamente; g) SEQ iD NOs: 24, 34 y 35, respectivamente; h) SEQ ID NOs: 25, 34 y 35, respectivamente; i) SEQ ID NOs: 26, 34 y 35, respectivamente; j) SEQ iD NOs: 27, 34 y 35, respectivamente; k) SEQ ID NOs: 28, 34 y 35, respectivamente; l) SEQ ID NOs: 29, 34 y 35, respectivamente; m) SEQ ID NOs: 30, 34 y 35, respectivamente; n) SEQ Id NOs: 31, 34 y 35, respectivamente; o) SEQ ID NOs: 32, 34 y 35, respectivamente; o p) SeQ ID NOs: 33, 34 y 35, respectivamente.
La Tabla 2 indica los identificadores de secuencia (SEQ ID NO) de las secuencias de aminoacidos de las cadenas pesada y ligera de longitud completa y los dominios variables de anticuerpos que se ilustran espedficamente en la presente memoria, asf como las secuencias nucleotfdicas que codifican las cadenas pesada y ligera y los dominios variables:
Tabla 2 SEQ ID NOs de anticuerpos anti-CD52
LONGITUD COMPLETA DOMINIO VARIABLE
Anticuerpo Pesada Ligera Pesada Ligera
ADN Aminoacido ADN Aminoacido ADN Aminoacido ADN Aminoacido Ab1 5 3 112 36 84 59 88 61
Ab2 5 3 113 37 84 59 89 62
Ab3 5 3 114 38 84 59 90 63
Ab4 5 3 115 39 84 59 91 64
Ab5 5 3 116 40 84 59 92 65
Ab6 5 3 117 41 84 59 93 66
Ab7 5 3 118 42 84 59 94 67
Ab10 5 3 119 43 84 59 95 68
Ab11 5 3 120 44 84 59 96 69
Ab12 5 3 121 45 84 59 97 70
Ab13 5 3 122 46 84 59 98 71
LONGITUD COMPLETA DOMINIO VARIABLE
Anticuerpo Pesada Ligera Pesada Ligera
ADN Aminoacido ADN Aminoacido ADN Aminoacido ADN Aminoacido Ab14 5 3 123 47 84 59 99 72
Ab15 5 3 124 48 84 59 100 73
Ab16 5 3 125 49 84 59 101 74
Ab17 5 3 126 50 84 59 102 75
Ab18 5 3 127 51 84 59 103 76
Ab19 5 3 128 52 84 59 104 77
Ab20 5 3 129 53 84 59 105 78
Ab21 5 3 130 54 84 59 106 79
Ab22 5 3 131 55 84 59 107 80
Ab23 5 3 132 56 84 59 108 81
Ab24 5 3 133 57 84 59 109 82
Ab25 5 3 134 58 84 59 110 83
En la presente memoria se describe un anticuerpo que comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de dominio variable (Vl) de SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 u 83. Tambien se describe en la presente memoria un anticuerpo que comprende una cadena ligera cuya secuencia de aminoacidos comprende o consiste en SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 o 58.
En la presente memoria se describe un anticuerpo que comprende un Vh y un Vl cuyas secuencias de aminoacidos comprenden o consisten en a) SEQ ID NOs: 59 y 68, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 59 y 69, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 59 y 70, respectivamente; d) s Eq ID NOs: 59 y 71, respectivamente; e) SEQ ID NOs: 59 y 72, respectivamente; f) SEQ ID NOs: 59 y 73, respectivamente; g) SEQ ID NOs: 59 y 74, respectivamente; h) SEQ ID NOs: 59 y 75, respectivamente; i) SEQ ID NOs: 59 y 76, respectivamente; j) SEQ ID NOs: 59 y 77, respectivamente; k) SEQ ID NOs: 59 y 78, respectivamente; l) SEQ ID NOs: 59 y 79, respectivamente; m) SeQ ID NOs: 59 y 80, respectivamente; n) SEQ ID NOs: 59 y 81, respectivamente; o) s Eq ID NOs: 59 y 82, respectivamente; o p) SEQ ID NOs: 59 y 83, respectivamente.
En la presente memoria se describe un anticuerpo que comprende una cadena pesada (HC) y una cadena ligera (LC) cuyas secuencias de aminoacidos comprenden o consisten en a) SEQ ID NOs: 3 y 43, respectivamente; b) Se Q ID NOs: 3 y 44, respectivamente; c) SEQ ID NOs: 3 y 45, respectivamente; d) SEQ ID NOs: 3 y 46, respectivamente; e) SEQ ID NOs: 3 y 47, respectivamente; f) SeQ ID NOs: 3 y 48, respectivamente; g) SEQ ID NOs: 3 y 49, respectivamente; h) SEQ ID NOs: 3 y 50, respectivamente; i) SEQ ID NOs: 3 y 51, respectivamente; j) SEQ ID NOs: 3 y 52, respectivamente; k) SEQ ID NOs: 3 y 53, respectivamente; l) SEQ ID NOs: 3 y 54, respectivamente; m) SEQ iD NOs: 3 y 55, respectivamente; n) SeQ ID NOs: 3 y 56, respectivamente; o) SEQ ID NOs: 3 y 57, respectivamente; o p) SEQ ID NOs: 3 y 58, respectivamente; cada secuencia con o sin la secuencia senal, si esta presente. Un anticuerpo de la presente invencion puede comprender una cadena ligera que comprende una secuencia de dominio variable (Vl) de SEQ ID NO: 74, 78 o 79. En una realización, el anticuerpo comprende una cadena ligera cuya secuencia de aminoacidos comprende o consiste en SEQ ID NO: 49, 53 o 54. Un anticuerpo de la presente invencion puede comprender un Vh y un Vl cuyas secuencias de aminoacidos comprenden o consisten en a) SEQ ID NOs: 59 y 74, respectivamente; b) las SEQ ID NOs: 59 y 78, respectivamente; o c) las SEQ ID NOs: 59 y 79. En una realización, un anticuerpo de la presente invencion comprende una cadena pesada (HC) y una cadena ligera (LC) cuyas secuencias de aminoacidos comprenden o consisten en a) SEQ ID NOs: 3 y 49, respectivamente; b) SEQ ID NOs: 3 y 53, respectivamente; o c) SEQ ID NOs: 3 y 54; cada secuencia con o sin la secuencia senal, si esta presente.
Tambien se proporcionan en la presente memoria porciones de anticuerpos enteros, tales como cadenas ligeras o cadenas pesadas de los anticuerpos, o una porcion de las cadenas ligera y pesada. Las porciones de anticuerpos enteros incluyen porciones de union a antigeno de los anticuerpos enteros. Los terminos de «fragmento de union a antigeno» y «porcion de union a antigeno» se usan de manera intercambiable en la presente memoria. Los fragmentos de union a antfgeno de anticuerpos incluyen, por ejemplo, anticuerpos de cadena simple, fragmentos Fv, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, moleculas Fv de cadena simple (scFv), fusiones scFv-Fc, dfmeros Fv de cadena simple biespedficos, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos con dominios eliminados. Vease, p. ej., Nature Biotechnology 22(9):1161-1165 (2004)). Tambien dentro de la invencion se encuentran moleculas de union a antfgeno que comprenden un Vh y un Vl. En el caso de un Vh, la molecula tambien puede comprender una o mas de las regiones CH1, bisagra, CH2 y CH3.
La porcion o fragmentos de anticuerpo se pueden producir mediante escision enzimatica o mediante tecnicas recombinantes. Por ejemplo, se puede usar escision con papama o pepsina para generar fragmentos Fab o F(ab')2, respectivamente. Tambien se pueden producir anticuerpos en una variedad de formas truncadas usando genes de anticuerpo en los que se han introducido uno o mas codones de terminacion hacia atras del sitio de terminacion natural. Por ejemplo, una construccion recombinante que codifica la cadena pesada de un fragmento F(ab')2 se puede disenar para incluir secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y la region bisagra de la cadena pesada. Un fragmento de union a antfgeno conserva la especificidad de union de su anticuerpo original. Los fragmentos de union a antfgeno preferidos tienen especificidad de union para una CD52 humana natural. Las secuencias de acido nucleico (p. ej., ADN) que codifican las regiones variables humanizadas se pueden construir usando metodos de mutagenesis por PCR para alterar las secuencias de ADN existentes (Vease p. ej., Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res. 17:5404 (1989)). Los cebadores de PCR que codifican las nuevas CDR se pueden hibridar con una plantilla de ADN de una region variable humanizada anteriormente que se basa en la misma region variable humana, o una muy similar (Sato, K., et al., Cancer Research 53:851-856 (1993)). Si no hay una secuencia de ADN similar para su uso como plantilla, se puede construir un acido nucleico que comprende una secuencia que codifica una secuencia de region variable a partir de oligonucleotidos sinteticos (Vease, p. ej., Kolbinger, F., Protein Engineering 8:971-980 (1993)). Tambien se puede incorporar una secuencia que codifica un peptido senal en el acido nucleico (p. ej., en la smtesis, tras la insercion en un vector). Si no hay una secuencia de peptido senal disponible (p. ej., no esta tipicamente presente), se puede usar una secuencia de peptido senal de otro anticuerpo (Vease, p. ej., Kettleborough, C. A., Protein Engineering 4:773-783 (1991)). Mediante el uso de estos metodos, los metodos descritos en la presente memoria u otros metodos adecuados, se pueden producir variantes con facilidad. A menos que se indique lo contrario, las descripciones sobre la preparacion y el uso de los anticuerpos de la presente invencion se pueden aplicar a los fragmentos de union a antfgeno de estos anticuerpos.
Los anticuerpos de la presente invencion pueden ser de cualquier isotipo o subtipo, incluida IgG (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4), IgM, IgA (p. ej., IgA1 e IgA2), IgD e IgE. Los anticuerpos pueden comprender una cadena ligera deriva de cualquier cadena ligera kappa o lambda humana.
Tambien se describe en la presente memoria una variante de un anticuerpo o porcion de este segun se describe en la presente memoria, en donde dicha variante se une a CD52 humana espedficamente, pero difiere con respecto al anticuerpo de referencia o porcion de este en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoacidos (por ejemplo, en una region CDR, una region FR o un dominio constante). Por ejemplo, el anticuerpo variante es al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99% identico al anticuerpo de referencia en la cadena pesada, el dominio variable de cadena pesada, la cadena ligera o el dominio variable de cadena ligera.
La similitud o identidad de secuencia para polipeptidos tfpicamente se mide usando un programa informatico de analisis de secuencias. El programa informatico de analisis de protemas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluidas sustituciones de aminoacidos conservadoras. Por ejemplo, GCG contiene programas como «Gap» y «Bestfit» que se pueden usar con parametros predeterminados para determinar la homologfa de secuencia o identidad de secuencia entre polipeptidos relacionados estrechamente, tales como polipeptidos homologos de diferentes especies de organismos o entre una protema natural y una mutema de esta. Vease, p. ej., GCG Version 6.1. Las secuencias polipeptfdicas tambien se pueden comparar usado FASTA parametros predeterminados o recomendados, un programa en GCG Version 6.1. FASTA (p. ej., FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y el porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de la mejor superposicion entre las secuencias de consulta y busqueda (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia descrita en la presente memoria con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de organismos diferentes es el programa informatico BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando parametros predeterminados. Vease, p. ej., Altschul et al., J. Mol. Biol.
215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997).
Segun se usa en la presente memoria, los «aminoacidos» se representan mediante su nombre completo, por el codigo de tres letras correspondiente a estos o por el codigo de una letra correspondiente a estos, segun se indica en la siguiente tabla:
Nombre completo Codigo de tres letras Codigo de una letra
Acido aspartico Asp D
Acido glutamico Glu E
Lisina Lys K
Arginina Arg R
Histidina His H
Tirosina Tyr Y
Cistema Cys C
Asparagina Asn N
Glutamina Gln Q
Serina Ser S
Treonina Thr T
Glicina Gly G
Alanina Ala A
Valina Val V
Leucina Leu L
Isoleucina Ile I
Metionina Met M
Prolina Pro P
Fenilalanina Phe F
Triptofano Trp W
Uno tipo de sustitucion de aminoacidos que se puede hacer es cambiar una o mas cistemas en el anticuerpo, que pueden ser qmmicamente reactivas, por otro residuo, tal como, sin limitacion, alanina o serina. En una realización, hay una sustitucion de una cistema no canonica. La sustitucion se puede hacer en una CDR o region marco de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. En algunas realizaciónes, la cistema es canonica. Otro tipo de sustitucion de aminoacidos que se puede hacer es extraer posibles sitios proteolfticos en el anticuerpo. Dichos sitios se pueden presentar en una CDR o region marco de un dominio variable o en el dominio constante de un anticuerpo. La sustitucion de residuos cistema y la extraccion de sitios proteolfticos puede reducir el riesgo de heterogeneidad en el producto de anticuerpo y, por lo tanto, aumentar su homogeneidad. Otro tipo de sustitucion de aminoacidos es eliminar los pares asparagina-glicina que forman posibles sitios de desamidacion, al alterar uno o ambos residuos. El anticuerpo se puede desinmunizar para reducir su inmunogenicidad usando las tecnicas descritas en, p. ej., la publicacion de solicitud de patente internacional WO 98/52976 y WO 00/34317.
Otro tipo de sustitucion de aminoacidos que se puede hacer en una de las variantes es una sustitucion de aminoacidos conservadora. Una «sustitucion de aminoacidos conservadora» es una en la que un residuo aminoaddico se sustituye por otro residuo aminoaddico que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades qmmicas similares (p. ej., carga o hidrofobicidad). En general, una sustitucion de aminoacidos conservadora no cambiara sustancialmente las propiedades funcionales de una protema. En casos donde dos o mas secuencias de aminoacidos difieren entre sf por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o el grado de similitud se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitucion. Los medios para hacer este ajuste son conocidos para los expertos en la tecnica. Vease, p. ej., Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307­ 31 (1994).
Los ejemplos de grupos de aminoacidos que tienen cadenas laterales con propiedades qmmicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifaticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales alifaticas-hidroxilo: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromaticas: fenilalanina, tirosina y triptofano; 5) cadenas laterales basicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales acidas: acido aspartico y acido glutamico; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cistema y metionina. Los grupos de sustitucion de aminoacidos conservadora preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalaninatirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Alternativamente, un reemplazo conservador es cualquier cambio que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logantmica PAM250 descrita en Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992). Un reemplazo «moderadamente conservador» es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logantmica PAM250.
En la presente memoria se describen sustituciones de aminoacidos en un anticuerpo o porcion de union a antfgeno que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidacion, (3) alteran la afinidad de union para formar complejos proteicos, por ejemplo, para potenciar una actividad ADCC y CDC del anticuerpo, (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoqmmicas o funcionales de dichos analogos, pero todavfa conservan union espedfica a CD52 humana, (5) extraen la lisis del extremo C y (6) agregan o extraen sitios de glucosilacion. En algunas realizaciónes, la lisina del extremo C de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD52 de la invencion no esta presente (Lewis et al., Anal. Chem, 66(5): 585-595 (1994)).
Tambien se describe en la presente memoria un polipeptido que es la cadena ligera (o cadena) de un anticuerpo descrito en la presente memoria, o que es una porcion que contiene el dominio variable de la cadena ligera (o pesada). Dicho polipeptido es util porque se puede asociar con una cadena de anticuerpo pesada (o ligera) opuesta para formar una molecula de union a CD52. Despues de que se seleccionar un dominio Vl o Vh inicial de un anticuerpo, se pueden llevar a cabo experimentos de «mezcla y emparejamiento», en los que se barren diferentes pares que comprenden el segmento Vl o Vh seleccionado inicialmente para determinar la union a CD52 para seleccionar las combinaciones de pares Vl/Vh preferidas. Una secuencia de dominio variable definida se puede usar para genomanipular anticuerpos funcionales para CD52 al barrer bibliotecas de dominio variable para un repertorio de dominios variables colaboradores funcionales. Vease, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Portolano et al., J. Immunol., 150:880-887 (1993); Beiboer et al., J. Mol. Biol., 296:833-849 (2000); Klimka et al., British Journal of Cancer,. 83:252-260 (2000).
Para fines de diagnostico o ensayo (p. ej., generacion de imagenes para posibilitar, por ejemplo, la monitorizacion de tratamientos), el anticuerpo (p. ej., fragmento de union a antfgeno de este) puede comprender una etiqueta detectable. Las etiquetas detectables y metodos adecuados para etiquetar un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno de este se conocen en la tecnica. Las etiquetas detectables adecuadas incluyen, por ejemplo, un radioisotopo (p. ej., como Indio-111, Tecnecio-99m o Yodo-131), etiquetas de emision de positrones (p. ej., Fluor-19), iones paramagneticos (p. ej., Gadlinio (III), Manganeso (II)), una etiqueta epitopica (marcador), una etiqueta de afinidad (p. ej., biotina, avidina), una etiqueta de espm, una enzima, un grupo fluorescente o un grupo quimioluminiscente. Cuando no se emplean etiquetas, la formacion de complejos (p. ej., entre un anticuerpo humanizado y CD52 humana) se puede determinar mediante resonancia de plasmones superficiales, ELISA, FACS u otros metodos adecuados.
Los anticuerpos anti-CD52 y fragmentos de union a antfgeno usados en la invencion tambien se puede conjugar a traves, por ejemplo, de reacciones qmmicas o modificaciones geneticas, con otros restos (p. ej., restos de pegilacion) que mejoran la farmacocinetica de los anticuerpos tal como la semivida. En algunas realizaciónes, los anticuerpos anti-CD52 y fragmentos de union a antfgeno usados en la presente invencion se pueden enlazar a una citocina adecuada a traves, p. ej., de conjugacion qmmica o modificaciones geneticas (p. ej., anexar la secuencia codificante de la citocina en marco a una secuencia codificante de anticuerpo para crear asf una protema de fusion anticuerpo:citocina).
La invencion tambien se refiere a inmunoconjugados en los que el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno de la invencion se acopla a otro agente terapeutico, tal como un compuesto bioactivo (p. ej., citocinas, superantigenos, agentes citotoxicos y toxinas). Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento se puede acoplar a una molecula de origen vegetal o bacteriano (o derivado de esta), un anticuerpo de interleucina-2 o anticuerpos de toxina difterica.
Estabilidad de los presentes anticuerpos
Los anticuerpos de la invencion son estables durante el almacenamiento. Los anticuerpos de la invencion pueden tener estabilidad aumentada en comparacion con la estabilidad demostrada por Ab26. La estabilidad se puede mostrar al medir la afinidad de union de un anticuerpo por CD52 despues de un penodo en almacenamiento. Para demostrar la estabilidad, el anticuerpo se puede incubar a 37 °C o 45 °C y a pH 7,0, 7,5 y 8,0. El anticuerpo se puede incubar en tampon que contiene 10 mM de succinato, 10 mM de histidina y 10 mM de fosfato sodico, pH 7,5. La estabilidad aumentada se puede extender durante al menos 1 semana, durante al menos 2 semanas, durante al menos 3 semanas, durante al menos 4 semanas, durante al menos 5 semanas, durante al menos 6 semanas, durante al menos 7 semanas, durante al menos 8 semanas, durante al menos 9 semanas o durante al menos 10 semanas.
Acidos nucleicos y vectores recombinantes
La presente invencion tambien se refiere a moleculas de acido nucleico aisladas y/o recombinantes (incluidas, p. ej., esencialmente puras) que comprenden secuencias que codifican un anticuerpo, fragmento de union a antigeno, o cadena ligera y cadena pesada de la presente invencion.
Los acidos nucleicos que se mencionan en la presente memoria como «aislados» o «purificados» son acidos nucleicos que se han separado de los acidos nucleicos del ADN genomico o ARN celular de su fuente de origen (p. ej., tal como existen en celulas o en una mezcla de acidos nucleicos tal como una biblioteca), e incluyen acidos nucleicos obtenidos mediante metodos descritos en la presente memoria u otros metodos adecuados, incluidos acidos nucleicos esencialmente puros, acidos nucleicos producidos mediante smtesis qmmica, mediante combinaciones de metodos biologicos y qmmicos, y acidos nucleicos recombinantes que estan aislados (vease, p. ej., Daugherty, B. L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); Lewis, A. P. y J. S. Crowe, Gene, 101: 297­ 302 (1991)).
Los acidos nucleicos que se mencionan en la presente memoria como «recombinantes» son acidos nucleicos que se han producido mediante metodologfa de ADN recombinante, incluidos los acidos nucleicos que se generan mediante procedimientos que dependen de un metodo de recombinacion artificial, tal como la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles) y/o clonacion en un vector usando enzimas de restriccion. Los acidos nucleicos «recombinantes» son tambien aquellos que resultan de eventos de recombinacion que se producen a traves de mecanismos naturales de celulas, pero se seleccionan despues de la introduccion a las celulas de acidos nucleicos disenados para permitir y posibilitar un evento de recombinacion deseado.
La presente invencion tambien se refiere mas espedficamente a acidos nucleicos aislados y/o recombinantes que comprenden una secuencia nucleotidica que codifica un anticuerpo que tiene especificidad de union para CD52 humana, o cadenas pesada y ligera, o una region variable de cadena pesada y region variable de cadena ligera, de dicho anticuerpo..
En la presente memoria se describe una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 o 110, que codifica la secuencia de aminoacidos de Vl de un anticuerpo anti-CD52. En la presente memoria se describe una molecula de acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos de Vl seleccionada de SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 u 83. La molecula de acido nucleico puede codificar una secuencia de aminoacidos de Vl que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identica a la secuencia de aminoacidos de Vl de un anticuerpo anti-CD52 de referencia (por ejemplo, Ab26). La secuencia nucleotfdica que codifica la secuencia de aminoacidos de Vl de Ab26 puede ser la SEQ ID NO: 85. La molecula de acido nucleico puede codificar una secuencia de aminoacidos de Vl que comprende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 mutaciones en comparacion con la secuencia de aminoacidos de Vl de un anticuerpo anti-CD52 de referencia (por ejemplo, Ab26). Las mutaciones pueden estar en las CDR o en las FR.
En algunas realizaciónes, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 101, 105 y 106, que codifica la secuencia de aminoacidos de Vl de un anticuerpo anti-CD52. En algunas realizaciónes, la molecula de acido nucleico codifica una secuencia de aminoacidos de Vl de SEQ ID NO: 74, 78 o 79.
Tambien se describe en la presente memoria una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia nucleotfdica seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 o 134, que codifica la secuencia de aminoacidos de cadena ligera de un anticuerpo anti-CD52, ya sea con o sin una secuencia senal. Tambien se describe en la presente memoria una molecula de acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 o 58, ya sea con o sin una secuencia senal. La molecula de acido nucleico puede codificar una secuencia de aminoacidos de cadena ligera que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identica a la secuencia de aminoacidos de cadena ligera de un anticuerpo anti-CD52 de referencia (por ejemplo, Ab26). La secuencia nucleotidica que codifica la secuencia de aminoacidos de cadena ligera de Ab26 puede ser la SEQ ID NO: 6, con o sin la secuencia senal. La molecula de acido nucleico puede codificar una secuencia de aminoacidos de cadena ligera que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 mutaciones en comparacion con la secuencia de aminoacidos de cadena ligera de un anticuerpo anti-CD52 de referencia (por ejemplo, Ab26). Las mutaciones pueden estar en las CDR, en las FR o en los dominios constantes. En algunas realizaciónes, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia nucleotidica seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 125, 129 o 130, que codifica la secuencia de aminoacidos de cadena ligera de un anticuerpo anti-CD52, ya sea con o sin una secuencia senal. En algunas realizaciónes, la molecula de acido nucleico codifica una secuencia de aminoacidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 49, 53 o 54, ya sea con o sin una secuencia senal.
La molecula de acido nucleico descrita en la presente memoria puede comprender una secuencia nucleotidica que codifica la secuencia de aminoacidos de Vh de un anticuerpo anti-CD52. Por ejemplo, esta secuencia nucleotidica puede ser la SEQ ID NO: 84. En algunas realizaciónes, la molecula de acido nucleico codifica una secuencia de aminoacidos de VH que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identica a la secuencia de aminoacidos de Vh de un anticuerpo anti-CD52 de referencia (por ejemplo, Ab26). La secuencia nucleotidica que codifica la secuencia de aminoacidos de Vh de Ab26 puede ser la SEQ ID NO: 84. En algunas realizaciónes, la molecula de acido nucleico codifica una secuencia de aminoacidos de Vh que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 mutaciones en comparacion con la secuencia de aminoacidos de VH de un anticuerpo anti-CD52 de referencia (por ejemplo, Ab26). Las mutaciones pueden estar en las CDR o en las FR.
En algunas realizaciónes, la molecula de acido nucleico comprende una secuencia nucleotidica que codifica la secuencia de aminoacidos de cadena pesada de un anticuerpo anti-CD52, ya sea con o sin una secuencia senal. Por ejemplo, esta secuencia nucleotidica puede ser la SEQ ID NO: 5, con o sin la secuencia senal. En algunas realizaciónes, la molecula de acido nucleico codifica una secuencia de aminoacidos de cadena pesada que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identica a la secuencia de aminoacidos de cadena pesada de un anticuerpo anti-CD52 de referencia (por ejemplo, Ab26). La secuencia nucleotidica que codifica la secuencia de aminoacidos de cadena pesada de Ab26 puede ser la SEQ ID NO: 5, con o sin la secuencia senal. En algunas realizaciónes, la molecula de acido nucleico codifica una secuencia de aminoacidos de cadena pesada que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 mutaciones en comparacion con la secuencia de aminoacidos de cadena pesada de un anticuerpo anti-CD52 de referencia (por ejemplo, Ab26). Las mutaciones pueden estar en las CDR, en las FR o en los dominios constantes.
Los acidos nucleicos de la presente invencion se pueden usar para producir anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union para CD52 humana. Por ejemplo, un acido nucleico (p. ej., ADN (tal como ADNc), o ARN) o uno o mas acidos nucleicos que codifican un anticuerpo humanizado de la presente invencion se pueden incorporar en una construccion adecuada (p. ej., un vector recombinante) para la manipulacion adicional de las secuencias o para la produccion de los anticuerpos codificados en celulas hospedantes adecuadas.
Tambien se proporcionan construcciones o vectores (p. ej., vectores de expresion) adecuados para la expresion de un anticuerpo humanizado que tiene especificidad de union para CD52 humana. Existe una variedad de vectores disponibles, incluso vectores que se mantienen en una unica copia o multiples copias en una celula hospedante, o que se integran en el(los) cromosoma(s) de la celula hospedante. Las construcciones o vectores se pueden introducir en una celula hospedante adecuada, y se pueden producir y mantener en cultivo celulas que expresan un anticuerpo humanizado de la presente invencion. Se puede usar un vector simple o multiples vectores para la expresion de un anticuerpo humanizado que tiene especificidad de union para CD52 humana.
Los vectores de expresion adecuados, por ejemplo, vectores de expresion de celulas de mairnferos tambien pueden contener varios componentes, incluidos, pero sin limitarse a, uno o mas de los siguientes: un origen de replicacion; un gen marcador seleccionable; uno o mas elementos de control de la expresion, tales como un elemento de control de la transcripcion (p. ej., un promotor, un potenciador, un terminador) y/o una o mas senales de traduccion; una secuencia senal o secuencia lfder para dirigirse a una membrana o para secrecion. En una construccion o vector, se puede proporcionar una secuencia de peptido senal mediante la construccion o vector u otra fuente. Por ejemplo, se pueden usar las senales de transcripcion y/o traduccion de un anticuerpo para dirigir la expresion.
Se puede proporcionar un promotor para la expresion en una celula hospedante adecuada. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, un promotor se puede enlazar funcionalmente con un acido nucleico que codifica un anticuerpo o cadena de anticuerpo humanizado, de manera tal que dirija la expresion del polipeptido codificado. Existe disponible una variedad de promotores adecuados para hospedantes procariotas (p. ej., promotores lac, tac, T3, T7 para E. coli) y eucariotas (p. ej., alcohol deshidrogenasa de levadura (ADH1), SV40, CMV). Los expertos en la tecnica seran capaces de seleccionar el promotor adecuado para expresar un anticuerpo anti-CD52 o porcion de este de la invencion.
Ademas, los vectores (p. ej., vectores de expresion) tipicamente comprenden un marcador seleccionable para la seleccion de celulas hospedantes que llevan el vector, y, en el caso de un vector replicable, un origen de replicacion. Los genes que codifican productos que confieren resistencia a antibioticos o farmacos son marcadores seleccionables comunes y se puede usar en celulas procariotas (p. ej., gen de p-lactamasa (resistencia a ampicilina), gen Tet (resistencia a tetraciclina) y eucariotas (p. ej., genes de resistencia a neomicina (G418 o geneticina), gpt (acido micofenolico, ampicilina o higromicina). Los genes marcadores de dihidrofolato reductasa permiten la seleccion con metotrexato en una variedad de hospedantes. Los genes que codifican el producto genico de marcadores auxotroficos del hospedante (p. ej., LEU2, URA3, HIS3) se usan frecuentemente como marcadores seleccionables en levadura. Tambien se contempla el uso de vectores vmcos (p. ej., baculovirus) o fagicos, y vectores que son capaces de integrarse en el genoma de la celula hospedante, tales como vectores retrovrncos.
Por lo tanto, la invencion se refiere a moleculas de acido nucleico aisladas que codifican el anticuerpo humanizado, la cadena ligera humanizada, la cadena pesada humanizada de la presente invencion. La invencion tambien se refiere a moleculas de acido nucleico aisladas que codifican una porcion de union a antfgeno de los anticuerpos y sus cadenas. Las secuencias polipeptfdicas codificadas por los acidos nucleicos de la presente invencion se describieron anteriormente y se describen en los siguientes Ejemplos.
En algunas realizaciónes, un acido nucleico o vector de la presente invencion codifica una cadena pesada (o una porcion de union a antfgeno de esta) o una cadena ligera (o una porcion de union a antfgeno de esta) de la presente invencion. En otras realizaciónes, un acido nucleico o vector de la presente invencion codifica una cadena pesada y una cadena ligera (o porciones de union a antfgeno de estas) de la presente invencion. Una celula hospedante que contiene el acido nucleico que codifica la cadena pesada y el acido nucleico que codifica la cadena ligera, o un acido nucleico que codifica las cadenas pesada y ligera, se puede usar para producir un anticuerpo que comprende las cadenas pesada y ligera (o una porcion de union a antfgeno del anticuerpo). El acido nucleico que codifica la cadena pesada y el acido nucleico que codifica la cadena ligera pueden colocar en vectores de expresion separados. Tambien se pueden colocar en un vector de expresion simple con el mismo control de expresion o diferente. Vease, p. ej., Cabilly patente estadounidense 6.331.415; Fang patente estadounidense 7.662.623.
Método para producir anticuerpos que tienen especificidad para CD52 humana
Otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo para producir un anticuerpo anti-CD52 humana de la presente invencion. El anticuerpo de la presente invencion se puede producir, por ejemplo, mediante la expresion de uno o mas acidos nucleicos recombinantes que codifican el anticuerpo en una celula hospedante adecuada. La celula hospedante se puede producir usando cualquier metodo adecuado. Por ejemplo, las construcciones de expresion (p. ej., el uno o mas vectores, p. ej., un vector de expresion de celula de mairnfero) descritas en la presente memoria se pueden introducir en una celula hospedante adecuada, y la celula resultante se puede mantener (p. ej., en cultivo, en un animal, en una planta) en condiciones adecuadas para la expresion de la(s) construccion(es) o el(los) vector(es). Las celulas hospedantes adecuadas pueden ser procariotas, incluidas celulas bacterianas tales como E. coli (p. ej., cepa DH5a™ (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)), B. subtilis y/u otras bacterias adecuadas; celulas eucariotas, tales como celulas fungicas o de levadura (p. ej., Pichia pastoris, Aspergillus sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa), u otras celulas eucariotas inferiores, y celulas de eucariotas superiores tales como las de insectos (p. ej., celulas de Drosophila Schnieder S2, celulas de insecto Sf9 (WO 94/26087 (O'Connor), celulas de insecto TN5B1-4 (HIGH 5) (Invitrogen), mai^eras (p. ej., celulas COS, tales como COS-1 (n.° de acceso a ATCC CRL-1650) y COS-7 (n.° de acceso a a Tc C CRL-1651), ChO (p. ej., n.° de acceso a ATCC CRL-9096), CHO DG44 (Urlaub, G. y Chasin, LA., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7):4216-4220 (1980)), 293 (n.° de acceso a ATCC CRL-1573), HeLa (n.° de acceso a ATCC CCL-2), CV1 (n.° de acceso a ATCC CCL-70), WOP (Dailey, L., et al., J. Virol., 54:739-749 (1985)), 3T3, 293T (Pear, W. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)), celulas NSO, celulas SP2/0, celulas HuT 78 y similares)), o plantas (p. ej., tabaco, lemna (lenteja) y algas). (Vease, por ejemplo, Ausubel, F. M. et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993)). En algunas realizaciónes, la celula hospedante no es parte de un organismo multicelular (p. ej., planta o animal), p. ej., es una celula hospedante aislada o es parte de un cultivo celular.
La presente invencion tambien se refiere a celulas que comprenden un acido nucleico, p. ej., un vector, de la invencion (p. ej., un vector de expresion). Por ejemplo, un acido nucleico (es decir, uno o mas acidos nucleicos) que codifica las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo humanizado, donde dicho anticuerpo tiene especificidad de union para CD52 humana, o una construccion (es decir, una o mas construcciones, p. ej., uno o mas vectores) que comprende dicho(s) acido(s) nucleico(s), se puede introducir en una celula hospedante adecuada mediante un metodo apropiado para la celula hospedante seleccionada (p. ej., transformacion, transfeccion, electroporacion, infeccion), donde el(los) acido(s) nucleico(s) estan o se vuelven funcionalmente enlazados con uno o mas elementos de control de la expresion (p. ej., en un vector, en una construccion creada mediante procesos en la celula, integrada en el genoma de la celula hospedante). Las celulas hospedantes se pueden mantener en condiciones adecuadas para la expresion (p. ej., en presencia de un inductor, medios adecuados complementados con sales, factores de crecimiento, antibioticos, complementos nutritivos adecuados, etc.), por medio de las cuales se produce(n) el(los) polipeptido(s) codificados. Si se desea, la protema codificada (p. ej., anticuerpo humanizado, de anticuerpo de raton, anticuerpo quimerico) se puede aislar, por ejemplo, de las celulas hospedantes, el medio de cultivo o la leche. Este proceso abarca la expresion en una celula hospedante (p. ej., una celula de glandula mamaria) de un animal o planta transgenico (p. ej., tabaco) (vease, p. ej., WO 92/03918).
Se pueden producir protemas de fusion en las que una porcion de anticuerpo (p. ej., un fragmento de union a antfgeno; cadena de anticuerpo) se enlaza con un resto distinto de anticuerpo (es decir, un resto que no se produce en anticuerpos segun se encuentra en la naturaleza) en una ubicacion en el extremo N, una ubicacion en el extremo C o internamente para la protema de fusion. Por ejemplo, algunas realizaciónes se pueden producir mediante la insercion de un acido nucleico que codifica una(s) secuencia(s) de anticuerpo en un vector de expresion adecuado, tal como un vector pET (p. ej., pET-15b, Novagen), un vector fagico (p. ej., pCANTAB 5 E, Pharmacia) u otro vector (p. ej., vector de fusion de protema A pRIT2T, Pharmacia). La construccion resultante se puede introducir en una celula hospedante adecuada para la expresion. Tras la expresion, algunas protemas de fusion se pueden aislar o purificar a partir de un lisado celular por medio de una matriz de afinidad adecuada (vease, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M. et al., Eds., tomo 2, supl. 26, pags. 16.4.1-16.7.8 (1991)).
La invencion se refiere a una celula hospedante que comprende acido(s) nucleico(s) recombinante(s) que codifican un anticuerpo proporcionado en la presente memoria (p. ej., un anticuerpo, una cadena ligera o una cadena pesada, una region variable de cadena ligera o regiones variables de cadena pesada). La invencion tambien se refiere a una celula hospedante que comprende acido(s) nucleico(s) recombinante(s) que codifican una porcion de union a antfgeno del anticuerpo o sus cadenas. En algunas realizaciónes, la celula hospedante comprende un vector recombinante (p. ej., vector de expresion, vector de expresion de celula de mairnfero) de la invencion, como al que se hace referencia en la presente memoria.
La invencion tambien se refiere a un metodo para preparar un anticuerpo o una cadena polipeptfdica de anticuerpo de la presente invencion. En una realización, el metodo comprende mantener una celula hospedante de la invencion, segun se describe en la presente memoria (p. ej., una celula hospedante que contiene uno o mas acidos nucleicos aislados que codifican el anticuerpo o cadena polipeptfdica (p. ej., una cadena ligera y una cadena pesada de la invencion) en condiciones adecuadas para la expresion del anticuerpo o cadena polipeptfdica. Por ejemplo, se puede cultivar una celula hospedante sobre un sustrato o en suspension. En algunas realizaciónes, el metodo comprende, ademas, la etapa de purificar o aislar el anticuerpo o cadena polipeptfdica.
Se pueden llevar a cabo selecciones usando CD52 acoplada a DYNABEADS M-270 amina (Dynal) segun las recomendaciones del fabricante. Alternativamente, se pueden preparar selecciones usando CD52 biotinilada mediante el uso del reactivo espedfico de amina primaria succinimidil-6-(biotinamido)hexanoato siguiendo las instrucciones del fabricante (EZ link NHS LC Biotin, Pierce).
Los resultados de las selecciones se pueden someter a prueba como preparaciones periplasmaticas en barridos de alto rendimiento basados en ensayos de competicion que miden la capacidad de scFv o IgGs para competir por la union a CD52.
Las muestras que son capaces de competir en los barridos de alto rendimiento se pueden someter a secuenciacion de ADN segun se describe en Vaughan et al. (1996) y Osburn et al. (1996). A continuacion, los clones se expresanan y purificanan como scFv o IgG y se evaluanan para determinar su capacidad para unirse a CD52, neutralizar CD52 o una combinacion de estos, p. ej., mediante el uso de ensayos tales como el ensayo de citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpo (ADCC) y el ensayo de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). Las preparaciones de scFv purificadas, a continuacion, se pueden preparar segun se describe en el Ejemplo 3 de WO 01/66754. Se pueden determinar las concentraciones proteicas de las preparaciones de scFv o IgG purificadas usando el metodo BCA (Pierce). Se pueden usar estrategias similares para el barrido para determinar un colaborador optimo (la cadena opuesta) de una cadena pesada o ligera de anticuerpo fijo (o Vh o Vl). Los anticuerpos de la invencion pueden estar en forma purificada o aislada (p. ej., haber sido separados de las moleculas (p. ej., peptidos) de su fuente de origen (p. ej., el sobrenadante de celulas; en una mezcla tal como una mezcla de anticuerpos en una biblioteca), e incluyen anticuerpos obtenidos mediante metodos descritos en la presente memoria u otros metodos adecuados. Los anticuerpos aislados incluyen sustancialmente anticuerpos puros (esencialmente puros) y anticuerpos producidos mediante smtesis qmmica, tecnicas recombinantes y una combinacion de estas.
Anticuerpos que contienen un resto toxmico o una toxina
La invencion tambien se refiere a anticuerpos que comprenden un resto toxmico o una toxina. Los restos toxmicos adecuados comprenden una toxina (p. ej., toxina tensioactiva, citotoxina). El resto toxmico o toxina se puede enlazar o conjugar con el anticuerpo usando cualquier metodo adecuado. Por ejemplo, el resto toxmico o toxina se puede unir covalentemente al anticuerpo directamente o a traves de un enlazador adecuado. Los enlazadores adecuados pueden incluir enlazadores no escindibles o escindibles, por ejemplo, enlazadores escindibles por pH o enlazadores que comprenden un sitio de escision para una enzima celular. Dichos enlazadores escindibles se pueden usar para preparar un anticuerpo que puede liberar un resto toxmico o toxina despues de que se internaliza el anticuerpo. Se puede usar una variedad de metodos para enlazar o conjugar un resto toxmico o toxina con un anticuerpo. El metodo espedfico seleccionado dependera del resto toxmico o toxina y el anticuerpo al que se enlazara o conjugara. Si se desea, se pueden usar enlazadores que contienen grupos funcionales terminales para enlazar el anticuerpo y el resto toxmico o toxina. En general, la conjugacion se logra al hacer reaccionar el resto toxmico o la toxina que contiene un grupo funcional reactivo (o esta modificado para contener un grupo funcional reactivo) con un enlazador o directamente con un anticuerpo. Los enlaces covalentes se forman al hacer reaccionar un resto toxmico o toxina que contiene (o esta modificado para contener) un resto qmmico o grupo funcional que puede, en condiciones adecuadas, hacer reaccion con un segundo grupo qmmico para formar asf un enlace covalente. Si se desea, se puede agregar un grupo qmmico reactivo adecuado a un anticuerpo o a un enlazador mediante el uso de cualquier metodo adecuado. (Vease, p. ej., Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996).) En la tecnica se conocen muchas combinaciones de grupo qmmico reactivo adecuadas, por ejemplo, un grupo amina puede hacer reaccion con un grupo electrofilo tal como tosilato, mesilato, halo, ester de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) y similares. Los tioles pueden hacer reaccion con maleimida, yodoacetilo, acrilolilo, disulfuros de piridilo, tiol de acido 5-tiol-2-nitrobenzoico (TNB-tiol) y similares. Un grupo funcional aldehfdo se puede acoplar con moleculas que contienen amina o hidrazida y un grupo azida puede hacer reaccion con un grupo fosforo trivalente para formar ligaduras de fosforamidato o fosforimida. En la tecnica se conocen metodos adecuados para introducir grupos de activacion en moleculas (Vease, por ejemplo, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)).
Los restos toxmicos y toxinas adecuados incluyen, por ejemplo, maitansinoide, un taxano, una caliqueamicina, una duocarmicina o derivados de estos. El maitansinoide puede ser, por ejemplo, maitansinol o un analogo de maitansinol. Los ejemplos de analogos de maitansinol incluyen aquellos que tienen un anillo aromatico modificado y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. El maitansinol y los analogos de maitansinol se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 5.208.020 y 6.333.410. El maitansinol se puede acoplar a anticuerpos y fragmentos de anticuerpo usando, p. ej., un N-succinimidil 3-(2-piridilditio)proprionato (tambien conocido como N-succinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoato (o SPP)), 4-succinimidil-oxicarbonil-a-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato (SDPB), 2 iminotiolano o anhfdrido S-acetilsuccmico. El taxano puede ser, por ejemplo, un taxol, taxotero o taxano nuevo (vease, p. ej., WO 01/38318). La caliqueamicina puede ser, por ejemplo, una caliqueamicina de complejo de bromo, una caliqueamicina de complejo de yodo o analogos y mimeticos de estos. Las caliqueamicinas de complejo de bromo incluyen I1-BR, I2-BR, I3-BR, I4-BR, J1-BR, J2-BR y K1-BR. Las caliqueamicinas de complejo de yodo incluyen I1-I, I2-1, I3-I, J1-I, J2-I, L1-I y K1-BR. La caloqueamicina y mutantes, analogos y mimeticos de esta se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 4.970.198, 5.264.586, 5.550.246, 5.712.374 y 5.714.586. Los analogos de duocarmicina se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 5.070.092, 5.187.186, 5.641.780, 5.641.780, 4.923.990 y 5.101.038.
Los ejemplos de otras toxinas incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos, agentes alquilantes, antraciclinas, antibioticos y agentes antimitoticos. La toxina tambien puede ser una toxina tensioactiva, tal como una toxina que es un generador de radicales libres o resto que contiene radionuclido. La toxina puede ser una protema, polipeptido o peptido, p. ej., de fuentes bacterianas o una protema vegetal.
Los compuestos no codificantes de acidos nucleicos disenados para unirse, inhabilitar, promover la degradacion o prevenir la produccion del ARNm responsable de generar una protema diana espedfica tambien se pueden usar como toxina. Los compuestos no codificantes incluyen ARN o ADN, mono o bicatenario, no codificante, oligonucleotidos o sus analogos, que pueden hibridarse espedficamente con especies de ARNm individuales y evitar la transcripcion y/o el procesamiento por ARN de la especie de ARNm y/o la traduccion del polipeptido codificado y lograr asf una reduccion en la cantidad de polipeptido codificado respectivo. Ching, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 10006-10010 (1989); Broder, et al., Ann. Int. Med. 113: 604-618 (1990); Loreau, et al., FEBS Letters 274: 53-56 (1990).
Las toxinas tambien pueden ser agentes fotoactivos. Los agentes fotoactivos adecuados incluyen materiales basados en porfirina tales como sodio porfimer, las porfirinas verdes, clorina E6, el propio derivado de hematoporfirina, ftalocianinas, etiopurpurinas, texafrina y similares.
La toxina puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una diana intracelular. Dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se pueden dirigir a compartimientos o dianas subcelulares definidos.
Metodos y composiciones terapeuticos
Una composicion farmaceutica comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de uno o mas anticuerpos y opcionalmente un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Los vehmulos farmaceuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, agua, disolucion salina, disolucion salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, as^ como combinaciones de estos. Los vehftculos farmaceuticamente aceptables pueden comprender, ademas, cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones que potencian el tiempo de conservacion o la eficacia de la protema de fusion. Las composiciones se pueden formular para proporcionar una liberacion rapida, sostenida o retardad del(de los) ingrediente(s) activo(s) despues de la administracion. En la tecnica se conocen composiciones farmaceuticas y procesos adecuados para prepararlas. Vease, p. ej., Remington (2005), THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, A. Gennaro, et al., eds., 21a. ed., Mack Publishing Co. La composicion farmaceutica puede comprender, ademas, un agente inmunosupresor/ inmunomodulador y/o antiinflamatorio. Un metodo para tratar una enfermedad inmunitaria en un paciente que necesita dicho tratamiento puede comprender administrar al paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion farmaceutica. La activacion de linfocitos T mediada por CD40 antagonista podna inhibir respuestas de linfocitos T indeseadas que se producen durante la autoinmunidad, rechazo de trasplante o respuestas alergicas, por ejemplo. Inhibir la activacion de linfocitos T mediada por CD40 podna moderar la progresion y/o gravedad de estas enfermedades.
Segun se usa en la presente memoria, un «paciente» significa un animal, p. ej., mamfero, incluidos humanos. El paciente puede haber recibido un diagnostico de enfermedad inmunitaria o cancer. «Tratamiento» o «tratar» o «tratando» se refiere al proceso que implica aliviar la progresion o gravedad de un smtoma, trastorno, afeccion o enfermedad. Una «enfermedad inmunitaria» se refiere a cualquier enfermedad asociada con el desarrollo de una reaccion inmunitaria en un individuo, incluida una reaccion inmunitaria celular y/o humoral. Los ejemplos de enfermedades inmunitarias incluyen, pero no se limitan a, inflamacion, alergia, enfermedad autoinmunitaria o enfermedad relacionada con injerto. La enfermedad autoinmunitaria se puede seleccionar del grupo que consiste en lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, artritis reumatoide, diabetes, psoriasis, esclerodermia, ateroesclerosis, enfermedad intestinal inflamatoria y colitis ulcerosa.
Los anticuerpos de la presente invencion son utiles en la inmunosupresion e inmunoablacion. Los anticuerpos se dirigen a celulas que expresan CD52 (p. ej., linfocitos T y B) y reducen (o «destruyen», segun se usa en la presente memoria) su poblacion en un sujeto que lo necesita. La destruccion de los linfocitos puede ser util para tratar una variedad de enfermedades y afecciones tales como inflamacion, enfermedades autoinmunitarias y cancer (p. ej., neoplasia linfocftica (ya sea de linfocitos B o T)). Vease, p. ej., Reiff, A., Hematology, 10(2):79-93 (2005). Los ejemplos de enfermedades y afecciones que se pueden tratar con los anticuerpos o porciones de union a antfgeno de la presente invencion incluyen, sin limitacion, esclerosis multiple, lupus, artritis reumatoide, enfermedad del injerto contra el hospedante (GVHD, por sus siglas en ingles), enfermedad intestinal inflamatoria, vasculitis, enfermedad de Behcet, granulomatosis de Wegener, smdrome de Sjogren, uveitis, psoriasis, esclerodermia, polimiositis, diabetes tipo I (basada en autoinmunidad), citopenias autoinmunitarias (p. ej., neutropenia autoinmunitaria, PRCA resistente dependiente de transfusion, leucemia y linfoma yal como linfoma no hodgkiniano con neoplasia maligna y leucemia linfocftica cronica de linfocitos B (CLL, por sus siglas en ingles). El anticuerpo tambien se puede administrar profilacticamente para prevenir la aparicion de la inflamacion, o la recidiva de una enfermedad autoinmunitaria o cancer. Por ejemplo, el anticuerpo de la presente invencion se puede administrar como parte de un regimen de acondicionamiento para preparar a un paciente para un trasplante (p. ej., un trasplante de celulas madre, una infusion de linfocitos T autologos o alogenos o un trasplante de un organo solido). En algunas realizaciónes, los anticuerpos y las porciones de union a antfgeno de la invencion se usan para producir medicamentos para el tratamiento de una enfermedad inmunitaria o cancer.
Se puede usar cualquier metodo o via adecuado para administrar el polipeptido de anticuerpo o la composicion farmaceutica. Las vfas de administracion incluyen, por ejemplo, parenteral (p. ej., inyeccion intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratecal, intraperitoneal, subcutanea), oral (p. ej., alimentaria), local, topica, inhalacion (p. ej., intrabronquial, intranasal o inhalacion oral, gotas intranasales), o rectal, dependiendo de la enfermedad o afeccion que se va a tratar. Una dosis terapeuticamente eficaz de polipeptido(s) de anticuerpo administrado(s) depende de diversos factores que incluyen, por ejemplo, el tipo y gravedad de la enfermedad inmunitaria que se va a tratar, el uso de politerapia, la via de administracion del(de los) polipeptido(s) de anticuerpo o composicion farmaceutica, y el peso del paciente. Un intervalo no limitante para una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo es 0,1-20 mg/kg, y en un aspecto, 1-10 mg/kg, con respecto al peso corporal del paciente. La dosis de polipeptido(s) de anticuerpo se puede orientar adicionalmente por la cantidad de polipeptido(s) de anticuerpo necesaria para antagonizar a CD52 en modelos in vitro e/o in vivo de estados de enfermedad.
El anticuerpo de la presente invencion se puede administrar en una dosificacion unitaria simple o en multiples dosis en cualquier punto de tiempo considerado adecuado por un profesional sanitario. La dosificacion se puede determinar mediante metodos conocidos en la tecnica y puede depender, por ejemplo, de la edad, sensibilidad, tolerancia y bienestar general del individuo. El anticuerpo o porcion se puede administrar en una infusion en un penodo de varias horas, p. ej., 3, 4, 5 o 6 horas. El anticuerpo o porcion se puede administrar en diversos regfmenes, segun sea adecuado, p. ej., en dos, tres, cuatro, cinco o seis dfas consecutivos, en uno o mas ciclos, separado por 3 o mas meses, p. ej., 12 o 24 meses. La dosis total de anticuerpo anti-CD52 administrada en cualquier ciclo puede ser 10-60 mg. En una realización, los anticuerpos o porciones de la invencion se administran a un paciente usando los mismos reg^enes de dosificacion que Campath-IH®.
Los anticuerpos de la presente invencion se pueden administrar a un individuo (p. ej., un humano) solos o junto con otro agente (p. ej., un inmunosupresor) en una politerapia. El anticuerpo se puede administrar, antes, junto con o despues de la administracion de un agente adicional. En algunas realizaciónes, el agente adicional es, por ejemplo, un compuesto antiinflamatorio tal como sulfasalazina, otro compuesto antiinflamatorio no esteroide o un compuesto antiinflamatorio esteroide. En algunas realizaciónes, el agente adicional es otro anticuerpo destructor de linfocitos tal como otro anticuerpo anti-CD52, un anticuerpo anti-CD20, un anticuerpo anti-BAFF, un anticuerpo anti-BAFF-R, y similares. En algunas realizaciónes, el agente adicional es, p. ej., una citocina (p. ej., IL-7), anticuerpo anti-receptor de citocina, o un receptor soluble, que distorsiona, manipula y/o aumenta el proceso de reconstitucion que se produce tras la destruccion de los linfocitos mediada por un anticuerpo anti-CD52 (vease, p. ej., Sportes et al., "Cytokine Therapies: Ann. N.Y. Acad. Sci. 1182:28-38 (2009)). En otra realización, un mimetico peptfdico sintetico se puede administrar junto con un anticuerpo de la presente invencion.
Debido a que los anticuerpos de la presente invencion se dirigen a celulas que expresan CD52, los anticuerpos tambien se pueden usar para destruir tipos de celulas CD52+ distintos de linfocitos T y B. Por ejemplo, estudios han demostrado que los leucocitos vasculares (VLC, por sus siglas en ingles) y los monocitos Tie2+, celulas mieloides que expresan niveles elevados de CD52, promueven la angiogenesis tumoral y contribuyen a la resistencia tumoral a la terapia anti-VEGF. Pulaski et al., J. Translational Med. 7:49 (2009). Por lo tanto, los anticuerpos anti-CD52 de la presente invencion se pueden usar para inhibir la angiogenesis tumoral al dirigirse a VLC y monocitos Tie2+. Con este fin, los anticuerpos anti-CD52 se pueden administrar sistemicamente, o localmente en un sitio de neovascularizacion, tal como un sitio tumoral. La terapia con anticuerpo anti-CD52 se puede usar junto con un tratamiento para el cancer habitual tal como quimioterapia, cirugfa o radiacion, o con otra terapia dirigida, tal como terapia con anticuerpo anti-VEGF. La terapia con anticuerpo anti-CD52 se puede usar para tratar, por ejemplo, el cancer de mama, cancer de pulmon, glioma, cancer colorrectal, y cualesquiera otras indicaciones para anticuerpos anti-VEGF. La terapia con anticuerpo anti-CD52 se puede usar en otras afecciones de neovascularizacion que incluyen afecciones neovasculares no oncologicas.
Estudios han demostrado que la destruccion de linfocitos mediante alemtuzumab esta mediada por neutrofilos y linfocitos citolfticos (Hu et al., Immunology 128:260-270 (2009). Por lo tanto, en una realización de politerapia, se puede administrar un agente que estimula los neutrofilos y linfocitos citolfticos a un paciente, antes, durante o despues de la terapia con el anticuerpo anti-CD52, para potenciar la terapia con el anticuerpo. La estimulacion de los neutrofilos y/o linfocitos citolfticos incluye, sin limitacion, (1) aumentar su velocidad de division, (2) aumentar su expresion en la superficie celular de los receptores Fc correspondientes al isotipo del anticuerpo anti-CD52 (p. ej., FcyRIIIa y FcyRIIIb, FcyRII, FcyRI y FcaRI), (3) movilizar y aumentar la cantidad de celulas en circulacion, (4) reunir las celulas para que se dirijan a los sitios (p. ej., sitios de tumores, inflamacion o dano tisular), (5) y aumentar su actividad citotoxica. Los ejemplos de agentes que estimulan neutrofilos y/o linfocitos citolfticos incluyen, por ejemplo, el factor estimulante de colonias de monocitos y granulocitos (GM-CSF, por sus siglas en ingles) (p. ej., LEUKINE® o sargramostim y molgramostim); factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF, por sus siglas en ingles) (p. ej., NEUPOGEN® o filgrastim, filgrastim pegilado y lenograstim); interferon gamma (p. ej., ACTIMMUNE®); antagonistas del receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4, por sus siglas en ingles) (p. ej., MOZOBIL™ o plerixafor); y agonistas del receptor de quimiocina CXC 2 (CXCR2, por sus siglas en ingles). El recuento de neutrofilos del paciente se puede monitorizar periodicamente para garantizar la eficacia optima del tratamiento. El recuento de neutrofilos del paciente tambien se puede medir antes del inicio del tratamiento con el anticuerpo anti-CD52. La cantidad de estimulante se puede ajustar en funcion del recuento de neutrofilos del paciente. Se puede usar una dosis mas alta del estimulante si el paciente tiene un recuento de neutrofilos mas bajo que el normal. Durante los penodos de neutropenia, que pueden ser causados por el tratamiento con el anticuerpo anti-CD52, tambien se puede administrar una dosis mas alta de estimulante de neutrofilos para maximizar el efecto del anticuerpo anti-CD52.
Debido a que la estimulacion de los neutrofilos y/o linfocitos citolfticos mejora la eficacia de la terapia con anticuerpo anti-CD52, esta realización de politerapia permite usar menos anticuerpo en un paciente mientras se mantiene una eficacia del tratamiento similar. Usar menos anticuerpo anti-CD52 mientras se mantiene la eficacia del tratamiento puede ayudar a reducir los efectos secundarios del anticuerpo anti-CD52, que incluyen respuesta inmunitaria en el paciente contra el anticuerpo administrado, asf como el desarrollo de autoinmunidad secundaria (autoinmunidad que surge durante o despues del tratamiento con el anticuerpo anti-CD52). Esta realización de politerapia tambien es util en un escenario de oncologfa, p. ej., cuando el paciente tiene neutropenia.
En otra realización de politerapia, se puede usar un estimulante de linfocitos T reguladores para potenciar la terapia con el anticuerpo anti-CD52. Se ha mostrado que los anticuerpos anti-CD52 destruyen linfocitos T reguladores CD4+CD25+FoxP3+ en una medida mucho menor en comparacion con otros linfocitos T CD4+. Los linfocitos T reguladores (tambien conocidos como «Treg» o linfocitos T supresores) son celulas que son capaces de inhibir la proliferacion y/o funcion de otras celulas linfoides a traves de mecanismos dependientes del contacto o independientes del contacto (p. ej., produccion de citocina). Se han descrito diversos tipos de linfocitos T reguladores, incluidos linfocitos T y§, linfocitos citolfticos naturales T (NKT, por sus siglas en ingles), linfocitos T CD8+, linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD4-CD8- doble negativos. Vease, p. ej., Bach et al., Immunol. 3:189-98 (2003). Los linfocitos T reguladores CD4+CD25+FoxP3+ se han llamado linfocitos T reguladores «de origen natural»; expresan CD4, CD25 y el factor de transcripcion de la familia forkhead FoxP3 (secuencia p3 forkhead). Por lo tanto, en esta realización de politerapia, se puede administrar un agente que estimula linfocitos T reguladores CD4+CD25+FoxP3+ antes, durante o despues de la terapia con el anticuerpo anti-CD52, para distorsionar la composicion del sistema inmunitario tras la destruccion de los linfocitos. El agente puede, por ejemplo, activar aquellos linfocitos T, estabilizar y/o expandir la poblacion de celulas, movilizar y aumentar la circulacion de celulas, y/o reunir celulas y dirigirlas a sitios. Los ejemplos de dichos agentes son rapamicina, TGF-p activo o latente (p. ej., TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4 y TGF-p5), IL-10, IL-4, IFN-a, vitamina D (p. ej., vitamina D3), dexametasona y mofetil micofenolato (vease, p. ej., Barrat et al., J. Exp. Med. 195:603-616 (2002); Gregori et al., J Immunol. 167: 1945-1953 (2001); Battaglia et al., Blood 105: 4743-4748 (2005); Battaglia et al., J. Immunol. 177:8338-8347 (2006)).
En la presente invencion, una cantidad eficaz de anticuerpo anti-CD52 para tratar una enfermedad es una cantidad que ayuda al sujeto tratado a alcanzar uno o mas criterios de valoracion clmicos deseados. Por ejemplo, para el lupus (cuyas manifestaciones incluyen lupus eritematoso sistemico, nefritis lupica, lupus eritematoso cutaneo, lupus del SNC, manifestaciones cardiovasculares, manifestaciones pulmonares, manifestaciones hepaticas, manifestaciones hematologicas, manifestaciones gastrointestinales, manifestaciones musculoesqueleticas, lupus eritematoso neonatal, lupus eritematoso sistemico infantil, lupus eritematoso inducido por farmaco, smdrome antifosfolipfdico y smdromes de deficiencia de complemento que resultan en manifestaciones lupicas; vease, p. ej., Robert G. Lahita, Editor, Systemic Lupus Erythematosus, 4a Ed., Elsevier Academic Press, 2004), los criterios de valoracion clmicos se pueden medir al monitorizar un sistema de organos afectado (p. ej., hematuria y/o proteinuria para la nefritis lupica) y/o el uso de un mdice de actividad de la enfermedad que proporciona una puntuacion compuesta de la gravedad de la enfermedad en diversos sistemas de organos (p. ej., BILAG, SLAM, SLEDAI, ECLAM). Vease, p. ej., Mandl et al., "Monitoring patients with systemic lupus erythematosus" en Systemic Lupus Erythematosus, 4a edicion, pags. 619-631, R. G. Lahita, Editor, Elsevier Academic Press, (2004).
Los anticuerpos o porciones de estos de la invencion se pueden usar para tratar a un individuo que se ha tratado anteriormente con Campath-1H® quien ha desarrollado anticuerpos neutralizantes para Campath-1H® (p. ej., un individuo resistente a Campath-1H®). Por ejemplo, se podna tratar a un individuo que tiene una enfermedad autoinmunitaria (p. ej., esclerosis multiple, lupus, vasculitis) y/o un cancer (p. ej., una leucemia (p. ej., leucemia linfocftica cronica), un linfoma (p. ej., linfoma no hodgkiniano)) quien ha sido tratado anteriormente con Campath-1H® (p. ej., con uno o mas ciclos de tratamiento con Campath-1H®) y que ha desarrollado anticuerpos neutralizantes para Campath-1H® que reducen la eficacia de un tratamiento adicional con Campath-1H®. En otra realización, se podna tratar a un individuo que se ha vuelto resistente al tratamiento con un anticuerpo humanizado espedfico descrito en la presente memoria con uno de los otros anticuerpos humanizados descritos en la presente memoria.
A modo de ejemplo, los anticuerpos o porciones de la presente invencion son agentes terapeuticos utiles para tratar la esclerosis multiple (MS, por sus siglas en ingles). La MS incluye esclerosis multiple con recidiva-remision, secundaria progresiva, primaria progresiva y progresiva con recidiva ((Lublin et al., Neurology 46 (4), 907-11 (1996)), el diagnostico se hace por medio de, por ejemplo, la historia de smtomas y examenes neurologicos con la ayuda de pruebas como imagenes de resonancia magnetica (MRI, por sus siglas en ingles), punciones lumbares, pruebas de potenciales provocados y analisis en laboratorio de muestras de sangre. En la MS, los objetivos del tratamiento son reducir el riesgo, frecuencia y/o gravedad de las recidivas, prevenir o reducir la discapacidad que surge de la progresion de la enfermedad y promover la reparacion tisular. Por lo tanto, una cantidad de anticuerpo anti-CD52 que ayuda a alcanzar un criterio de valoracion clmico consistente con uno o mas de estos objetivos es una cantidad eficaz de anticuerpo para el tratamiento. Por ejemplo, se puede indicar un anticuerpo anti-CD52 o porcion de la presente invencion para tratar formas recidivantes de MS para enlentecer o revertir la acumulacion de discapacidad ffsica y reducir la frecuencia de exacerbaciones clmicas. El anticuerpo o porcion se puede someter a prueba en ensayos clmicos para determinar su eficacia para reducir el riesgo de recidiva y el riesgo de progresion de la discapacidad clmicamente significativa. El anticuerpo o porcion se puede administrar a pacientes que tienen una recidiva activa o estan en riesgo de desarrollar una recidiva, o a un paciente que sufre un deterioro progresivo. Vease, p. ej., la publicacion de patente estadounidense 2008/0267954.
Los metodos y composiciones de la presente invencion son utiles para tratar a pacientes con MS que han tenido una respuesta suboptima a terapia para modificacion de la MS anterior. El paciente con MS puede ser un paciente con recidiva-remision (RRMS, por sus siglas en ingles) que ha recibido anteriormente una terapia para modificar la MS, por ejemplo, interferon beta-1a (p. ej., AVOn Ex ® y REBIF®), interferon beta-1b (p. ej., BETASERON® y EXTAVIA®), acetato de glatiramer (p. ej., COPAXONE®), mitoxantrona (p. ej., NOVAnTrONE®), natalizumab (p. ej., TYSABRI®), fingolimod (p. ej., GiLENYA®) y teriflunomida (p. ej., a Ub aGiO™). En una realización, la terapia para modificar la MS anterior no es alemtuzumab (p. ej., Ca MpATH, MABCAm Pa TH o LEMTRADA™) ni otro anticuerpo anti-CD52. El paciente tratado anteriormente puede haber tenido una recidiva de MS o actividad de MS renovada mientras estaba en tratamiento o poco tiempo despues de recibir tratamiento (p. ej., despues de un ano). La actividad de MS renovada pueden incluir smtomas neurologicos nuevos o empeorados atribuibles a la MS, un aumento en la puntuacion EDSS del paciente (Kurtzke, Neurology 1983;33:1444-52), una disminucion en la puntuacion Multiple Sclerosis Functional Composite (MSFC) del paciente (Cutter et al., Brain 1999;122(Pt 5):871-82), lesiones craneales o medulares nuevas o agrandadas, perdida de volumen cerebral y/o neurodegeneracion determinada por tomograffa de coherencia optica (OCT, por sus siglas en ingles). Por ejemplo, el paciente puede haber tenido al menos una recidiva anterior mientras recibfa tratamiento con interferon beta o glatiramer. El paciente tambien puede haber tenido al menos una de las siguientes caractensticas: aparicion de smtomas 10 o menos anos antes del inicio del primer ciclo de tratamiento con el anticuerpo anti-CD52; a menos dos ataques en los dos anos antes del inicio del primer ciclo de tratamiento con el anticuerpo anti-CD52; al menos una recidiva mientras recibfa interferon beta o glatiramer despues de al menos seis meses de tratamiento; puntuacion de escala de estado de discapacidad expandida (EDSS, por sus siglas en ingles) de 5,0 o menor; y anomalfas en imagenes de resonancia magnetica (MRI) del craneo y medula espinal.
En una realización, un anticuerpo o porcion de la invencion se administra a un paciente con MS que tiene una enfermedad autoinmunitaria (p. ej., esclerosis multiple (MS)) en un regimen que comprende la administracion de un primer ciclo del anticuerpo y posteriormente al menos un ciclo adicional del anticuerpo, en el que cada ciclo de tratamiento comprende 1-5 dosis que se aplican en dfas consecutivos, y en donde cada ciclo de tratamiento esta separado el siguiente ciclo por al menos 1-24 meses (p. ej., 12 meses). Por ejemplo, en una realización, un paciente que tiene esclerosis multiple se trata con un primer ciclo de anticuerpo que comprende 5 dosis diarias del anticuerpo y posteriormente al menos un ciclo adicional de tratamiento con el anticuerpo, en el que el tratamiento se produce un ano despues del primer ciclo y comprende 3 dosis del anticuerpo aplicadas en dfas consecutivos. En una realización, un anticuerpo anti-CD52 se administra a un paciente que tiene esclerosis multiple en cinco dfas consecutivos a 12 mg/dfa en un primer ciclo de tratamiento; y despues de un ano, el anticuerpo anti-CD52 se administra al paciente en tres dfas consecutivos a 12 mg/dfa en un segundo ciclo de tratamiento. En una realización, un anticuerpo anti-CD52 se administra a un paciente que tiene esclerosis multiple en una dosis total de 60 mg en cinco dfas consecutivos en un primer ciclo de tratamiento; y despues de un ano, el anticuerpo anti-CD52 se administra al paciente en una dosis total de 36 mg en tres dfas consecutivos en un segundo ciclo de tratamiento.
En los metodos y composiciones de la presente invencion, un «ano» no tiene que ser igual a exactamente 365 dfas o 12 meses. Por ejemplo, el segundo ciclo de un anticuerpo anti-CD52 no se tiene que administrar exactamente 365 dfas o 12 meses despues del primer ciclo de administracion de un anticuerpo anti-CD52. El segundo ciclo se puede iniciar 365 dfas mas o menos hasta 6 meses, mas o menos hasta 5 meses, mas o menos hasta 4 meses, mas o menos hasta 3 meses, mas o menos hasta 2 meses, mas o menos hasta un mes, mas o menos hasta 4 semanas, mas o menos hasta 3 semanas, mas o menos hasta 2 semanas o mas o menos hasta una semana despues del inicio del primer ciclo.
En otra realización, un paciente que tiene MS solo se vuelve a tratar despues de que se ha observado evidencia de actividad de MS renovada (vease, p. ej., WO 2008/031626). En algunas realizaciónes, puede ser necesario administrar ciclos de tratamiento mas frecuentes (p. ej., cada cuatro meses, cada seis meses) si pacientes con formas mas avanzadas de MS o formas mas progresivas de otras enfermedades autoinmunitarias (tales como vasculitis; vease, p. ej., Walsh et al., Ann Rheum Dis 67:1322-1327 (2008)) sufren una recidiva poco tiempo despues de su ultimo ciclo de tratamiento o exhiben actividad de MS renovada. La evidencia de actividad de MS renovada se puede determinar en funcion de la opinion profesional del medico tratando, usando cualquier medio disponible para dicho medico. Existe una variedad de tecnicas disponibles actualmente para que los medicos diagnostiquen la actividad de MS renovada que incluyen, sin limitacion, medios clmicos (recidiva o progresion de discapacidad neurologica) o mediante imagenes de resonancia magnetica (MRI) del cerebro o medula espinal. Segun lo entienden los medicos, la actividad de la enfermedad detectada a traves de MRI se puede indicar por la aparicion de nuevas lesiones cerebrales o medulares en imagenes ponderadas en T1 (potenciadas o no potenciadas) o T2 o por el aumento del volumen de dichas lesiones.
Dado que los metodos de diagnostico para la MS evolucionan de manera continua, se anticipa que pueden hacer metodos adicionales en el futuro que detectaran la actividad de MS renovada (p. ej., relacion de transferencia de magnetizacion o MR-espectroscopfa). El metodo de diagnostico espedfico usado para detectar la actividad de MS renovada no es una limitacion de la invencion reivindicada. En ciertas realizaciónes, se llevan a cabo MRI repetidas a intervalos fijos despues de un ciclo de tratamiento para determinar si es necesario el retratamiento de cualquier paciente dado y el punto de tiempo optimo para el retratamiento de dicho paciente. En general, es deseable que el retratamiento se produzca antes de que la enfermedad se vuelva a manifestar clmicamente.
Los metodos y composiciones de la invencion pueden usarse en combinacion con otras terapias de modificacion de la MS. Los ejemplos no limitantes de terapias de modificacion de la MS incluyen interferon beta-1a (p. ej., AVONEX® y REBIF®), interferon beta-1b (p. ej., b EtASERON® y EXTAVIA®), acetato de glatiramer (p. ej., c OpAXONE®), mitoxantrona (p. ej., NOVAnTrONE®), natalizumab (p. ej., tYsABRI®), fingolimod (p. ej., GILENYA®) y teriflunomida (p. ej., AUBAGIO®).
En algunas realizaciónes, los metodos y composiciones de la invencion pueden usarse en combinacion con tratamientos o terapias generalizados o no espedficos, por ejemplo, esteroides (p. ej., corticoesteroides) o dalfampridina (p. ej., AMPYRA®).
En un aspecto, se pueden administrar farmacos conocidos para los expertos en la tecnica como eficaces para tratar efectos secundarios relacionados con la infusion antes, durante o despues de la infusion del anticuerpo anti-CD52. Dichos farmacos incluyen corticoesteroides (p. ej., metilprednisolona), acetaminofeno y antihistammicos (p. ej., difenhidramina). En algunas realizaciónes, los pacientes reciben 1 g/dfa de metilprednisolona intravenosa en uno, dos, tres, cuatro o cinco dfas consecutivos durante un ciclo de tratamiento con un anticuerpo de la invencion.
En una realización de la invencion, los pacientes pueden recibir adicionalmente un farmaco que sirve como profilaxis contra el herpes. Por ejemplo, los pacientes pueden recibir 200 mg de aciclovir (p. ej., ZOVIRAX®) dos veces al dfa durante la administracion de un anticuerpo de la invencion y durante 28 dfas posteriores.
La formulacion variara segun la via de administracion seleccionada (p. ej., disolucion, emulsion). Una composicion adecuada que comprende el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno para su administracion se puede preparar en un veldculo o portador farmaceuticamente aceptable. La composicion puede comprender multiples dosis o puede ser una composicion de una dosificacion unitaria simple. Para disoluciones o emulsiones, los portadores adecuados incluyen, por ejemplo, disoluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcoholicas/acuosas, incluidas disolucion salina y medios tamponados. Los veldculos parenterales pueden incluir disolucion de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, aceites de Ringer lactados o fijos. Los veldculos intravenosos pueden incluir diversos aditivos, conservantes o regeneradores de fluidos, nutrientes o electrolitos (vease, en general, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a edicion, Mack Publishing Co., PA, 1985). Para la inhalacion, el compuesto se puede solubilizar y cargar en un dispensador adecuado para la administracion (p. ej., un atomizador, un nebulizador o un dispensador de aerosol presurizado).
Metodos de diagnostico y composiciones
Los anticuerpos de la presente invencion son tambien utiles en una variedad de procesos con aplicaciones en investigacion y diagnostico. Por ejemplo, se pueden usar para detectar, aislar y/o purificar CD52 humana o variantes de esta (p. ej., mediante purificacion por afinidad u otros metodos adecuados tales como citometna de flujo, p. ej., para celulas, tales como linfocitos, en suspension), y para estudiar la estructura (p. ej., conformacion) y funcion de la CD52 humana. Los anticuerpos de la presente invencion seran utiles para aplicaciones in vitro.
Los anticuerpos de la presente invencion se pueden usar en aplicaciones de diagnostico (p. ej., in vitro, ex vivo). Por ejemplo, los anticuerpos humanizados de la presente invencion se pueden usar para detectar y/o medir el nivel de CD52 humana en una muestra (p. ej., en celulas que expresan CD52 humana en tejidos o fluidos corporales, tales como exudado inflamatorio, sangre, suero, fluido intestinal, tejidos que incluyen CD52 humana). Una muestra (p. ej., tejido y/o fluido corporal) se puede obtener de un individuo y un anticuerpo descrito en la presente memoria se puede usar en un metodo inmunologico adecuado para detectar y/o mediar la expresion de la CD52 humana, incluidos metodos tales como citometna de flujo (p. ej., para celulas en suspension tales como linfocitos), enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA, por sus siglas en ingles), incluidos ensayos quimioluminiscentes, radioinmunoensayos e inmunohistologfa. La invencion abarca kits (p. ej., kits de diagnostico) que comprenden los anticuerpos anti-CD52 descritos en la presente memoria.
En una realización, se proporciona un metodo para detectar la CD52 humana en una muestra que comprende poner en contacto una muestra con un anticuerpo de la presente invencion en condiciones adecuadas para la union espedfica del anticuerpo a CD52 humana y detectar los complejos anticuerpo-CD52 que se forman. En una aplicacion del metodo, los anticuerpos descritos en la presente memoria se pueden usar para analizar tejidos normales con respecto a inflamados (p. ej., de un humano) para determinar la reactividad y/o expresion de la CD52 humana (p. ej., inmunohistologicamente) para detectar asociaciones entre, p. ej., la enfermedad intestinal inflamatoria (IBD, por sus siglas en ingles), enfermedades autoinmunitarias (tales como esclerosis multiple y lupus), cancer (tales como linfoma no hodgkiniano y leucemia linfodtica cronica), u otras afecciones y la expresion aumentada de la CD52 humana (p. ej., en tejidos afectados). Por lo tanto, los anticuerpos de la presente invencion permiten metodos inmunologicos de evaluacion de la presencia de CD52 humana en tejidos normales e inflamados, a traves de los cuales se puede evaluar la presencia de la enfermedad, la progresion de la enfermedad y/o la eficacia del tratamiento anti-CD52 humana en el tratamiento de la enfermedad, p. ej., enfermedad inflamatoria. Ademas, los anticuerpos se pueden usar para examinar tejidos despues del tratamiento con un anticuerpo terapeutico anti-CD52 destructor para determinar cuan eficaz ha sido la destruccion, asf como para determinar si hay una reduccion en la expresion de CD52 (Rawstrom et al., Br. J. Heam., 107:148-153 (1999)).
A menos que se definan de cualquier otra manera, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comunmente por un experto en la tecnica al cual corresponde esta invencion. A continuacion, se describen metodos y materiales de ejemplo, aunque tambien se pueden utilizar metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente para poner en practica o evaluar la presente invencion. En caso de conflicto, prevalecera la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones. Aunque se citan varios documentos en la presente memoria, la cita no constituye una admision de que cualquiera de estos documentos forma parte del conocimiento comun general en la tecnica. A lo largo de la presente memoria descriptiva y realizaciónes, se entendera que la palabra «comprende» o variaciones tales como «comprender» o «comprendfa» implica la inclusion de un numero entero o grupos de numeros enteros indicados, pero no la exclusion de cualquier otro numero entero o grupos de numeros enteros. Los materiales, metodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren los metodos y materiales de la presente invencion. Los terminos «anticuerpo» e «inmunoglobulina» se usan de manera intercambiable en la presente memoria. Los terminos «fragmento de union a antigeno» y «porcion de union a antfgeno» tambien se usan de manera intercambiable en la presente memoria.
Ejemplos
Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren los metodos y materiales de la presente invencion.
Ejemplo 1: Expresion y caracterizacion del anticuerpo Ab1
El anticuerpo Ab1 se derivo de Ab26 al cambiar el residuo 33 (dentro de la L-CDR1) en la cadena ligera de Ab26 a Asp. Ademas, se genero un anticuerpo variante en donde los primeros 33 residuos aminoaddicos de la cadena ligera de Ab26 se eliminaron (el anticuerpo Del33). El ADN de cadena ligera variante se sintetizo en vectores pDONR221 Entry mediante DNA2.0 en la estructura de la cadena ligera y se subclono en el vector de expresion para HEK293 pCEP4(-E+I)Dest mediante clonacion Gateway. A continuacion, se llevo a cabo ADN prep a gran escala para la transfeccion celular de HEK293-EBNA. Todas las variantes y la cadena ligera testigo del Ab26 original se cotransfectaron con la cadena pesada del Ab26 original a una relacion 1:1.
Para la purificacion, se usaron 160-300 ml de medios transfectados para purificar los anticuerpos Ab26, Del33 y Ab1 usando columnas de 1 ml de protema A HiTrap (GE) y una configuracion de bomba de multiples canales. Se midio A280 en las fracciones recogidas mediante NanoDrop. Las fracciones n.° 1 y n.° 2, que conteman la mayor parte de la protema, se combinaron, se intercambio el tampon a 50 mM de fosfato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio, pH 6,0, y se concentraron usando las columnas Amicon-4 con corte 10 kD. El rendimiento de la purificacion proteica se resume en la Tabla 3.
Tabla 3 Rendimientos de purificacion proteica
Anticuerpo Volumen CM Concentracion proteica Volumen de material purificado Protema total (ml) (mg/mL) (Ml) (Mg) Ab26 300 2,86 370 1058
Del33 160 0,04 124 4
Ab1 300 1,71 900 1539
El mutante Del33 no se expreso ni purifico a niveles elevados, probablemente debido a un problema de plegado incorrecto relacionado con la eliminacion. Ab1 y Ab26 se purificaron satisfactoriamente hasta la homogeneidad para la caracterizacion adicional. La secuenciacion del extremo N de los primeros 15 aminoacidos confirmo que las tres muestras teman la secuencia esperada.
Ab26 y Ab1 tambien se expresaron en celulas CHO y se purificaron en columnas de protema A. Los anticuerpos se caracterizaron mediante BlACORE™ para determinar su afinidad por el peptido de CD52. Los resultados se muestran en la Figura 17 y la Tabla 4 para anticuerpos producidos en celulas HEK293 y en la Figura 18 y la Tabla 5 para anticuerpos producidos en celulas CHO.
Tabla 4 Resultados de afinidad de union para anticuerpos expresados en celulas HEK293
Anticuerpo ka (x106 M'1 s'1) kd (s'1) Kd (nM)
Ab26 (preparacion 1) 7,2 0,01 1,7
Ab26 (preparacion 2) 5,4 0,01 2,2
Ab1 0,4 0,58 1480
Tabla 5 Resultados de afinidad de union para anticuerpos expresados en celulas CHO
Anticuerpo ka (x106 M'1 s'1) kd (s'1) Kd (nM)
Ab26 6,2 1,6 2,6
Ab1 0,3 38,3 1250
Los ensayos de union a CD52 BIACORE™ se llevaron a cabo de la siguiente manera: Se inmovilizo un nivel bajo de un mimotopo de peptido de CD52 (CGQNDTSQTSSPSAD (SEQ ID NO: 87)) sobre un chip CM5 a traves de qmmica de tiol usando una Cys en el extremo N. Se inyectaron varias concentraciones de anticuerpo anti-CD52 preparadas en un tampon de pasada HBS-EP (1 a 20 nM) sobre la superficie para monitorizar la union. El analisis de cinetica se llevo a cabo usando el programa informatico Scrubber2.
El anticuerpo Ab1 demostro una reduccion de la afinidad de mas de 400 veces en comparacion con Ab26. No se observo una senal de union clara para el anticuerpo Ab1 a las concentraciones de 1-10 nM, mientras que Ab26 exhibe afinidad de union alta (Figura 17). Se usaron concentraciones mas altas de Ab1 (hasta 1900 nM) en un esfuerzo por obtener una medicion cuantitativa de la perdida de la afinidad de union de la variante. La Kd a 1250nM obtenida a partir del Ab1 producido en CHO fue consistente con la del Ab1 producido en HEK293 (1480nM). La disminucion en la afinidad se refleja en la constante de asociacion reducida y la constante de disociacion aumentada en la union cinetica.
Se llevo a cabo un ensayo de potencia CDC para evaluar si la perdida de afinidad afectana la funcion efectora al medir la destruccion celular a traves de la citotoxicidad dependiente de complemento. Todos los materiales de anticuerpo variantes y testigo se diluyeron en serie 1:2 en una placa solida negra de 96 pocillos de 2 mg/ml a 0,002 mg/ml en medio de ensayo (fenol-rojo sin medio IMDM BSA al 0,1 %). Los materiales con una concentracion madre <2 mg/ml se sometieron a prueba puros. Se agrego complemento serico humano normal (Quidel Corporation) a todos los pocillos a una concentracion final de 5 % (v/v). A continuacion, se agregaron linfocitos b Pfeiffer (ATCC) a una concentracion final de 0,6 x 106 celulas/ml. Se incluyeron en la misma placa un testigo de lisis celular negativo (medio de ensayo celulas), un testigo de lisis celular positivo (medio de ensayo celulas Triton X-100 al 2% (p/v)), y un testigo de respuesta a dosis positivo (4 mg/ml de material testigo). Las reacciones se incubaron durante una hora en una incubadora humidificada, 37 °C, CO2 al 5 %. A continuacion, se agregaron cincuenta microlitros de reactivo de deteccion precalentado alamarBlue® (Life Technologies) a todos los pocillos y posteriormente se incubaron en luz reducida durante cuatro horas. La reduccion relativa de alamarBlue® se midio usando un lector de placas fluorescente (ex: 530 nm, em: 590, corte: 570 nm). Se uso Softmax Pro, v. 5.3 (Molecular Devices) para generar curvas de dosis-respuesta ajustadas para un modelo de cuatro parametros. El resultado se muestra en la Figura 19. Ab26 (Testigo) demostro destruccion celular dependiente de la concentracion como se esperaba. El anticuerpo Ab1 producido en celulas CHO demostro escasa actividad CDC detectable en el intervalo de concentracion evaluado. Estos experimentos sugieren que una unica sustitucion aminoaddica puede tener un impacto significativo en la funcion biologica de Ab26.
Ejemplo 2: Analisis de la afinidad de union a CD52 de anticuerpos anti-CD52
Los anticuerpos Ab4, Ab3, Ab24, Ab10, Ab12 y Ab25 (veanse las Tablas 1 y 2) se expresaron en celulas HEK293. El ADN de cadena ligera se sintetizo, subclono y expreso transitoriamente en celulas HEK293 segun se indica a continuacion. Las moleculas de ADN se sintetizaron en vectores pDONR221 Entry mediante DNA2.0 en la estructura de la cadena ligera y se subclonaron en el vector de expresion para HEK293 pCEP4(-E+I)Dest mediante clonacion Gateway. El vector que expresaba la cadena ligera se cotransfecto con un vector que expresaba la cadena pesada de Ab26 en celulas HEK293. El ADN de Ab26 se uso como testigo para la transfeccion. Los medios acondicionados se sometieron a barrido para determinar el nivel de expresion mediante Octet usando un sensor de protema A y para determinar la afinidad de union a CD52 mediante BIACORE™ usando un chip de peptido de CD52. Los resultados se muestran en la Figura 1.
Los anticuerpos Ab24 y Ab10 demostraron afinidad de union por CD52 intensa. Ab4 y Ab3 demostraron afinidad de union por c D52 mas baja. Para confirmar este hallazgo, Ab4 y Ab3 se purificaron usando una columna de protema A para caracterizacion adicional. En la Figura 2 se muestran un gel de SDS-PAGE del anticuerpo Ab26 (TES), el anticuerpo Ab26 a partir de dos transfecciones (TES1 y TES2), Ab1, Ab4, Ab3, Ab10, Ab24, Ab12 y Ab25 y los resultados de union al peptido de CD52 mediante BIACORE™.
Los resultados con los anticuerpos purificados confirmaron los datos de barrido en medios iniciales. Ab4 y Ab3 demostraron afinidad de union por CD52 mas baja.
Ejemplo 3: Preparacion a gran escala y caracterizacion de los anticuerpos Ab24 y Ab10
Se produjeron los anticuerpos Ab24 y Ab10 a gran escala en celulas CHO K1 para determinar su union a CD52 y las propiedades inhibidoras. Se observo recorte de la cadena ligera en los dos anticuerpos; y se observo una banda por debajo de 150kD en el gel no reductor (NR) (designada en la presente «especie de l00kD») (Figura 3).
El problema de recorte de la cadena ligera se minimizo al optimizar las condiciones de cultivo de tejido y al omitir la etapa de almacenamiento de los medios a 4 °C. Parece haber una pequena cantidad de especie de 100kD (por debajo de 150KD) producida a pesar de estas mejoras (Figura 3). Los dos anticuerpos se caracterizaron adicionalmente. Se hallaron 9-12 % y 18-20 % de especie de 100kD en dos preparaciones a gran escala de Ab24 y Ab10, respectivamente, mediante SEC-HPLC. Un experimento de espectrometna de masas intacta confirmo las secuencias de los anticuerpos. La secuenciacion del extremo N de la especie de bajo peso molecular sugirio que solo estaba presente la secuencia del extremo N de la cadena pesada. Cuando se recogio la especie de 100kD y se analizo en un gel de SDS-PAGE, solo se observo la cadena pesada. Estos resultados sugieren que la especie de 100kD contema solo cadena pesada (Figura 4).
Ejemplo 4: Preparacion y barrido de anticuerpos anti-CD52 adicionales
Los vectores de expresion para los anticuerpos Ab2, Ab6, Ab7, Ab5, Ab13, Ab15, Ab17, Ab18, Ab19, Ab23, Ab22, Ab11, Ab20, Ab16, Ab21 y Ab14 (vease la Tabla 1 y 2) se transfectaron en celulas HEK293. Todos los anticuerpos se expresaron a >0,2 pg/ml cuando los medios acondicionados se analizaron con un sensor de protema A en Octet (Figura 5, panel superior). A continuacion, se uso el barrido de afinidad por CD52 mediante BIACORE™ de estas muestras de medios para identificaron los candidatos principales (Figura 5, paneles medio e inferior).
Los anticuerpos Ab2, Ab6, Ab7 y Ab5 tuvieron una afinidad de union baja por CD52. Varios otros anticuerpos demostraron afinidad de union mas alta por CD52. Estos anticuerpos incluyeron Ab22, Ab20, Ab21, Ab14, Ab14 y Ab11. Los anticuerpos Ab22, Ab20, Ab21, Ab14, Ab14 y Ab11 se estudiaron adicionalmente.
Estos seis anticuerpos (Ab22, Ab20, Ab21, Ab14, Ab14 y Ab11) se ampliaron en una expresion transitoria de anticuerpo en TripleFlask. (Este matraz tiene tres superficies de crecimiento paralelas para proporcionar un area de cultivo total de 500 cm2.) Los anticuerpos se purificaron a partir de 160 ml de medios acondicionados usando columnas de afinidad de protema A de 1 ml HiTrap (GE Healthcare). El gel reductor de SDS-PAGE exhibio la purificacion satisfactoria y pureza de anticuerpo razonable (Figura 6). Para la comparacion de union a CD52 en BIACORE™, las muestras purificadas se diluyeron hasta 60 y 7,5nM en HBS-EP y se inyectaron sobre un chip de peptido de CD52 n.° 741 (los resultados se muestran en la Figura 6 para 7,5nM). El analisis de union por BIACORE™ confirmo el resultado del barrido en medios inicial de que estos anticuerpos tienen una union estrecha con el peptido de CD52. Un experimento de union cinetica indico el siguiente rango de afinidad:
(Ab16, Ab21) > Ab26 > (Ab20, Ab11, Ab14, Ab22) > (Ab24, Ab10)
Se exhibio que Ab16 y Ab21 teman afinidades mas altas que Ab26.
Ejemplo 5: Analisis de la estabilidad de los anticuerpos anti-CD52
Para determinar si se habfa afectado la estabilidad de las variantes del anticuerpo anti-CD52, se usaron condiciones de temperatura elevada para comparar y barrer las variantes de anticuerpo anti-CD52. Se usaron Ab26 y variantes selectas purificadas a partir de celulas HEK293 para el barrido inicial. Las protemas (85 pg) se diluyeron en PBS, pH 7,2, hasta ~ 0,4 mg/ml, y se incubaron a 45 °C durante 4 semanas. Su afinidad de union por el peptido de CD52 se midio en BIACORE™. Un microgramo de cada variante tomado en la semana n.° 2 y la semana n.° 4 se diluyo en serie en HBS-EP hasta 7,5, 2,5 y 0,8nM, y se inyecto sobre el chip de peptido de CD52 n.° 741. Las constantes de union preliminares se calcularon usando el programa informatico y se muestran en la Figura 20 (Ab26 se etiqueta como «TES»).
Los resultados indican que los anticuerpos Ab21, Ab16 y Ab20 conservan afinidad de union por CD52 significativa durante las 4 semanas de incubacion, lo que sugiere que son mas estables que el anticuerpo Ab26. En cambio, los anticuerpos Ab10 y Ab22 perdieron la mayor parte de su afinidad de union por el antigeno durante el marco de tiempo de la incubacion.
Para confirmar el resultado obtenido en el experimento de incubacion, se genero una nueva preparacion de las variantes y se incubaron en tampon de «3 componentes» (10 mM de succinato, 10 mM de histidina, 10 mM de fosfato de sodio, pH 7,5) junto con el anticuerpo Ab26 a 37 °C o 45 °C durante 4 semanas. El tampon de «3 componentes» se usa tfpicamente en pruebas de capacidad de fabricacion de anticuerpos. La cantidad de material incubado se indica en la Tabla 6. Los anticuerpos Ab21, Ab16 y Ab20 tambien se incubaron a 45 °C en el mismo tampon. Se tomaron alfcuotas en la Semana 2 y la Semana 4 (T2 y T4) para evaluar su afinidad por el peptido de Cd52 mediante BIACORE™. Cada muestra se diluyo hasta 7,5, 3,75 y 1,875 nM en HBS-EP y se inyecto sobre un chip de peptido de CD52 n.° 741 durante 3 min, posteriormente se procedio a 3 min de disociacion en tampon. Las Kd aparentes se muestra en la Figura 21.
Tabla 6 Cantidad de material incubado en el experimento en tampon de tres componentes
Mutante Concentracion (mg/ml) Incubacion a 37 °C (pg) Incubacion a 45 °C (pg) Ab20 0,363 75 75
Ab22 0,350 75 -Ab16 0,366 75 75
Ab21 0,391 75 75
Ab14 0,359 75 -Ab24 0,361 75 -Ab10 0,382 75 -Ab11 0,401 75 -TES1 0,354 75 -TES2 0,375 75 75
Los resultados sugieren que la afinidad de union de los anticuerpos Ab21, Ab16 y Ab20 permanecio igual o solo disminuyo ligeramente a 37 °C y 45 °C despues de 4 semanas de incubacion, mientras que Ab26 (TES, TES1 y TES2) perdio la afinidad de union con el tiempo. La Kd de Ab26 (TES) cambio de 4,3 nM a 1230 nM despues de la incubacion a 45 °C despues de 4 semanas, lo que indica una disminucion en la union a CD52. Esto sugiere que estos mutantes son de hecho mas resistentes a la inestabilidad a lo largo del tiempo en el sitio L-CDR1.
Para verificar la integridad estructural de los anticuerpos Ab21, Ab16 y Ab20, se evaluo por SEC-HPLC la aglomeracion y fragmentacion de las variantes que se diluyeron en PBS, pH 7,2, hasta ~ 0,4 mg/ml y se incubaron a 45 °C durante 4 semanas. Se diluyeron cinco microgramos de protema en la fase movil (40mM de fosfato de sodio, 500mM de cloruro de sodio, pH 6,0) hasta un volumen total de 100 pl y se inyectaron en una columna TSK Gel G3000 SWxl a 0,5 ml/min durante 35 min. No se detecto aglomeracion significativa y solo fragmentacion limitada en Ab21, Ab16, Ab20, y Ab26 (TES) (Figura 22). Por lo tanto, la perdida de la afinidad en Ab26 probablemente no se debe a la perdida de la integridad estructural.
Ejemplo 6: Actividad biologica de los anticuerpos anti-CD52 en ensayo de potencia in vitro (potencia CDC)
Se evaluaron tres anticuerpos anti-CD52 (Ab21, Ab20 y Ab16) en un ensayo CDC. Este ensayo se uso para medir la capacidad de los anticuerpos para lisar linfocitos B Pfeiffer en presencia de complemento. Los anticuerpos se sometieron a ensayo en singlicato en la misma placa y se compararon cualitativamente con Ab26 (Testigo) (vease, Figura 7).
Los resultados sugieren que la potencia de Ab21 y Ab16 fue comparable o mejor que la de Ab26. Ab20 tuvo una potencia ligeramente mas baja en esta prueba.
Ejemplo 7: Actividad biologica de los anticuerpos anti-CD52 en ratones transgenicos HuCD52
Se evaluaron tambien tres anticuerpos anti-CD52 (Ab21, Ab20 y Ab16) en ratones transgenicos huCD52 in vivo. Los ratones transgenicos HuCD52 recibieron por inyeccion intravenosa Ab26, Ab21, Ab20 o Ab16 a 1 mg/kg (5 animales/grupo). El dfa 3 despues de la inyeccion, se analizaron la sangre y los bazos para determinar la destruccion de linfocitos mediante citometna de flujo. El alcance de la destruccion de linfocitos en la sangre y el bazo mediante el analisis de citometna de flujo se muestra en la Figura 8 (el Ab26 esta etiquetado como «TES»).
Los resultados sugieren que la destruccion de linfocitos inducida por los anticuerpos Ab21, Ab20 y Ab16 en la sangre y los bazos parecio similar o mejor que la del anticuerpo Ab26. Tomados en conjunto, estos datos confirman que estos anticuerpos anti-CD52 sin biologicamente activos in vivo.
La Tabla 7 indica las SEQ ID NO usadas en la presente memoria.
Tabla 7 SEQ ID NOs
SEQ ID TIPO DESCRIPCION NO
1 Protema de Protema CD52 natural
longitud completa
2 LC KGN
3 HC Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15,
Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25 y KGN
4 LC Ab26
5 HC (acido Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15, nucleico) Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25 y KGN
6 LC (acido Ab26
nucleico)
7 H-CDR1 Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15,
Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24 y Ab25
8 H-CDR2 Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15,
Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24 y Ab25
9 H-CDR3 Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15,
Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24 y Ab25
10 L-CDR1 Ab26
11 L-CDR1 Ab1
12 L-CDR1 Ab2
13 L-CDR1 Ab3
SEQ ID TIPO DESCRIPCION
NO
14 L-CDR1 Ab4
15 L-CDR1 Ab5
16 L-CDR1 Ab6
17 L-CDR1 Ab7
18 L-CDR1 Ab10
19 L-CDR1 Ab11
20 L-CDR1 Ab12
21 L-CDR1 Ab13
22 L-CDR1 Ab14
23 L-CDR1 Ab15
24 L-CDR1 Ab16
25 L-CDR1 Ab17
26 L-CDR1 Ab18
27 L-CDR1 Ab19
28 L-CDR1 Ab20
29 L-CDR1 Ab21
30 L-CDR1 Ab22
31 L-CDR1 Ab23
32 L-CDR1 Ab24
33 L-CDR1 Ab25
34 L-CDR2 Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15,
Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24 y Ab25
35 L-CDR3 Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15,
Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24 y Ab25
36 LC Ab1
37 LC Ab2
SEQ ID TIPO DESCRIPCION
NO
38 LC Ab3
39 LC Ab4
40 LC Ab5
41 LC Ab6
42 LC Ab7
43 LC Ab10
44 LC Ab11
45 LC Ab12
46 LC Ab13
47 LC Ab14
48 LC Ab15
49 LC Ab16
50 LC Ab17
51 LC Ab18
52 LC Ab19
53 LC Ab20
54 LC Ab21
55 LC Ab22
56 LC Ab23
57 LC Ab24
58 LC Ab25
59 Vh Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15,
Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25 y KGN
60 Vl Ab26
61 Vl Ab1
SEQ ID TIPO DESCRIPCION
NO
62 Vl Ab2
63 Vl Ab3
64 Vl Ab4
65 Vl Ab5
66 Vl Ab6
67 Vl Ab7
68 Vl Ab10
69 Vl Ab11
70 Vl Ab12
71 Vl Ab13
72 Vl Ab14
73 Vl Ab15
74 Vl Ab16
75 Vl Ab17
76 Vl Ab18
77 Vl Ab19
78 Vl Ab20
79 Vl Ab21
80 Vl Ab22
81 Vl Ab23
82 Vl Ab24
83 Vl Ab25
84 Vh (acido nucleico) Ab26, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13, Ab14, Ab15,
Ab16, Ab17, Ab18, Ab19, Ab20, Ab21, Ab22, Ab23, Ab24, Ab25 y KGN
85 Vl (acido nucleico) Ab26
SEQ ID TIPO DESCRIPCION
NO
86 L-CDR1 KSSQSLLYSNXKTYLN, en donde X no es glicina.
87 Peptido Mimotopo de peptido de CD52.
88 Vl (acido nucleico) Ab1
89 Vl (acido nucleico) Ab2
90 Vl (acido nucleico) Ab3
91 Vl (acido nucleico) Ab4
92 Vl (acido nucleico) Ab5
93 Vl (acido nucleico) Ab6
94 Vl (acido nucleico) Ab7
95 Vl (acido nucleico) Ab10
96 Vl (acido nucleico) Ab11
97 Vl (acido nucleico) Ab12
98 Vl (acido nucleico) Ab13
99 Vl (acido nucleico) Ab14
100 Vl (acido nucleico) Ab15
101 Vl (acido nucleico) Ab16
102 Vl (acido nucleico) Ab17
103 Vl (acido nucleico) Ab18
104 Vl (acido nucleico) Ab19
105 Vl (acido nucleico) Ab20
106 Vl (acido nucleico) Ab21
107 Vl (acido nucleico) Ab22
108 Vl (acido nucleico) Ab23
109 Vl (acido nucleico) Ab24
110 Vl (acido nucleico) Ab25
SEQ ID TIPO DESCRIPCION NO
111 Vl (acido nucleico) KGN
112 LC (acido Ab1
nucleico)
113 LC (acido Ab2
nucleico)
114 LC (acido Ab3
nucleico)
115 LC (acido Ab4
nucleico)
116 LC (acido Ab5
nucleico)
117 LC (acido Ab6
nucleico)
118 LC (acido Ab7
nucleico)
119 LC (acido Ab10
nucleico)
120 LC (acido Ab11
nucleico)
121 LC (acido Ab12
nucleico)
122 LC (acido Ab13
nucleico)
123 LC (acido Ab14
nucleico)
124 LC (acido Ab15
nucleico)
125 LC (acido Ab16
nucleico)
126 LC (acido Ab17
nucleico)
127 LC (acido Ab18
nucleico)
128 LC (acido Ab19
nucleico)
SEQ ID TIPO DESCRIPCION NO
129 LC (acido Ab20
nucleico)
130 LC (acido Ab21
nucleico)
131 LC (acido Ab22
nucleico)
132 LC (acido Ab23
nucleico)
133 LC (acido Ab24
nucleico)
134 LC (acido Ab25
nucleico)
135 LC (acido KGN
nucleico)

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-CD52 humana o un fragmento de union a antigeno fragmento de este, en donde dicho anticuerpo comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden:
a) las SEQ ID NOs: 59 y 74, respectivamente;
b) las SEQ ID NOs: 59 y 78, respectivamente; o
c) las SEQ ID NOs: 59 y 79, respectivamente.
2. El anticuerpo o fragmento segun la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo comprende:
a) una cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 sin la secuencia senal; o
b) una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 49, 53 y 54.
3. El anticuerpo segun la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoacidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 sin la secuencia senal y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 49.
4. El anticuerpo segun la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoacidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 sin la secuencia senal y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 53.
5. El anticuerpo segun la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de aminoacidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 sin la secuencia senal y una secuencia de aminoacidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 54.
6. El fragmento segun la reivindicación 1 o 2, en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en un fragmento scFv, un fragmento Fab, un fragmento Fv, un fragmento F(ab')2, un minicuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo y un tetracuerpo.
7. El anticuerpo o fragmento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 6, en donde dicho anticuerpo comprende una region Fc de IgG1 humana.
8. El anticuerpo o fragmento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la lisina del extremo C de la cadena pesada se escinde.
9. Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotidica que codifica la cadena pesada o un fragmento de union a antfgeno de esta, y la cadena ligera o un fragmento de union a antfgeno de esta, del anticuerpo o fragmento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
10. La molecula de acido nucleico aislada segun la reivindicación 9, que comprende la secuencia nucleotfdica de la SEQ ID NO: 101, 105, 106, 125, 129 o 130.
11. Un vector de expresion recombinante que comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 9.
12. Una celula hospedante aislada que comprende el vector segun la reivindicacion 11.
13. Una lmea celular aislada que produce el anticuerpo o fragmento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1­ 8.
14. Un metodo para producir un anticuerpo anti-CD52 humana o un fragmento de union a antfgeno de este que comprende (1) mantener una celula que comprende una secuencia nucleotfdica que codifica la cadena pesada o un fragmento de union a antfgeno de esta, y la secuencia nucleotidica que codifica la cadena ligera o un fragmento de union a antfgeno de esta, del anticuerpo o fragmento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en condiciones adecuadas para la expresion del anticuerpo o fragmento; y (2) recuperar el anticuerpo o fragmento.
15. Una composicion que comprende el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un vehfculo o portador farmaceuticamente aceptable.
16. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en el tratamiento de un trastorno autoinmunitario en un paciente que lo necesita.
17. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en el tratamiento del cancer en un paciente que lo necesita.
18. El anticuerpo o fragmento de union a antigeno para su uso segun la reivindicacion 17, en donde el cancer es leucemia linfocftica cronica.
19. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en la inhibicion de la angiogenesis en un paciente que lo necesita.
20. El anticuerpo o fragmento de union a antfgeno segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en el tratamiento de la esclerosis multiple.
21. El anticuerpo o fragmento de union a antigeno para su uso segun la reivindicacion 20, en donde la esclerosis multiple es esclerosis multiple con recidiva-remision, progresiva primaria, progresiva secundario o progresiva con recidiva.
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