JP2021073174A - Ｉｌ−１７ａ結合ポリペプチド - Google Patents

Ｉｌ−１７ａ結合ポリペプチド Download PDF

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Abstract

【課題】本開示は、インターロイキン-１７A（IL-17A）に対する結合親和性を有する改変されたポリペプチドのクラスの提供。【解決手段】EX2DX4AX6X7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29-の配列を含むIL-17A結合ポリペプチドを提供する。診断、予後予測及び/又は治療剤としての、インターロイキン17A結合ポリペプチドの使用も開示される。【選択図】図１３Ａ−Ｂ

Description

本開示は、インターロイキン-17A（今後はIL-17Aと記載する）に対する結合親和性を有する操作したポリペプチドの1つのクラスに関する。本開示は、診断剤および／または予後予測剤および／または治療剤としてのそのようなIL-17A結合ポリペプチドの利用にも関する。
インターロイキン-17（IL-17）ファミリーは、いくつかの炎症性疾患の発病に寄与する炎症促進性サイトカインファミリーである。IL-17の主要供給源は、Tヘルパー17細胞（Th17細胞）として知られるT細胞系列であり、これらの細胞は、従来のTh1細胞サブセットおよびTh2細胞サブセットとは明確に異なっている。マウスモデルとヒトモデルでの研究の結果から、炎症および自己免疫の発生と、ある種の病原に対する宿主の防御において、IL-17とTh17細胞がカギとなる役割を果たしていることが突き止められた。これらの観察結果に基づき、IL-17とTh17細胞は、いくつかの慢性炎症性疾患、例えば乾癬、関節リウマチ（RA）、強直性脊椎炎（AS）、全身性エリテマトーデス（SLE）、多発性硬化症（MS）の治療にとって興味深い標的であると見なされている（MiossecとKolls、2012年、Nat Rev Drug Discov 第11巻：763〜767ページ）。
ジスルフィド結合ホモ二量体サイトカインIL-17Aは、IL-17ファミリーのメンバーである。このファミリーには、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17Fも含まれる。このファミリー内で、IL-17AとIL-17Fが互いに最も大きなアミノ酸配列相同性（50％）を示し、同じ受容体、すなわちIL-17受容体A（IL-17RA）とIL-17受容体C（IL-17RC）に結合する。さらに、IL-17Aは、IL-17Fとのヘテロ二量体として発現させることができる。IL-17AとIL-17Fは大きなアミノ酸配列相同性を有するとはいえ、両者は明確に異なる機能を示す。IL-17Aは、自己免疫、炎症、腫瘍の進行に関与しており、細菌や真菌の感染に対する宿主の防御でも重要な役割を果たす。それに対してIL-17Fは、主に粘膜宿主防御機構に関与する（Iwakura他、2011年、Immunity 第34巻：149〜162ページ）。
IL-17Aは、分泌されると、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞から多彩な炎症促進性サイトカイン、ケモカイン、抗菌ペプチド、メタロプロテイナーゼ（MMP類）の産生を促進する。IL-17Aの重要な1つの作用は、顆粒球形成を誘導して好中球を炎症部位へとリクルートすることである。しかしこの反応は、制御されないと慢性の炎症へと至り、組織が破壊されたり新血管形成が起こったりする可能性がある（Iwakura他 2008年、Immunol Rev第226巻：57〜79ページ；Reynolds他、2010年、Cytokine Growth Factor Rev 第21巻：413〜423ページ）。IL-17Aは、世界の人口の約2.5％が罹患するありふれた慢性炎症性皮膚疾患である乾癬の発病の中心にある（ChiricozziとKrueger、2013年、Expert Opin. Investig. Drugs第22巻(8)：993〜1005ページに概説）。RA患者での研究から、炎症を起こしている滑膜にIL-17A陽性細胞が存在していることがわかった。RAのマウスモデルでは、関節内遺伝子導入を通じたIL-17Aの投与によって臨床スコアが大きく悪化した（Lubberts他、2002年、Inflamm Res 第51巻：102〜104ページ）。逆に、IL-17Aの抑制を、対応するリガンドまたは受容体に対するモノクローナル抗体を用いて実現すると、関節炎の進行や転帰から保護された（Lubberts他、2004年、Arthritis Rheum第50巻：650〜659ページ）。MS患者では、IL-17A遺伝子が過剰発現していることが報告されており（Lock他、2002年、Nat Med 第8巻：500〜508ページ）、実験的自己免疫脳炎のマウスモデルでは、IL-17AとTh17細胞が明らかに関与していた（Cua他、2003年、Nature第421巻：744〜748ページ；UyttenhoveとVan Snick、2006年、Eur J Immunol第36巻：2868〜2874ページ）。IL-17Aのレベル上昇が、関節炎を患っている患者でさまざまな眼科炎症性疾患、例えばぶどう膜炎、強膜炎、ドライアイ疾患（DED）と臨床的に相関していることがわかっている（Kang他、2011年、J Korean Med Sci第26巻：938〜944ページ）。最近の研究により、冠動脈アテローム性動脈硬化の臨床サンプルで、IL-17とIFNγに対して陽性の細胞が血管機能障害に局所的効果を及ぼすことを示唆していることがわかった（Eid他、2009年、J Cardiothorac Surg 第4巻：58ページ）。IL-17Aは、慢性閉塞性肺疾患（COPD）でも興味深い可能性がある。COPD 患者からの肺組織ではIL-17A陽性細胞の数が増加している（Chu他、2011年、Int Immunopharmacol第11巻：1780〜1788ページ；Di Stefano他、2009年、Clin Exp Immunol第157巻：316〜324ページ）。IL-17RA欠損マウスは、COPDのマウスモデルで肺気腫の進行に抵抗するのに対し、IL-17Aの過剰発現は肺気腫の進行を加速するという事実は、IL-17Aがこの応答を媒介するのに十分であることを示唆している（Chen他、2011年、PLoS One 第6巻：e20333ページ；Shan他、2012年、Sci Transl Med第4巻：117ra9ページ）。したがって、いくつかの異なる自己免疫疾患と炎症性疾患にIL-17Aが関与していることから、IL-17Aを標的とした治療法の応用が広いことが示唆される。
IL-17Aまたはその受容体を標的とすることは、IL-17Aを媒介とした機能を阻止する最も直接的なやり方である。IL-17Aシグナル伝達を無効にするいくつかの生物学的製剤が現在臨床開発されており、その中には抗IL-17Aモノクローナル抗体であるセクキヌマブ、イキセキズマブが含まれる（Chen他、2011年、PLoS One 第6巻：e20333ページ；Shan他、 2012年、Sci Transl Med第4巻：117ra9ページ）。セクキヌマブは乾癬の治療に用いることが認可されており、現在は乾癬性関節炎（PsA）とASの治療に関して研究されている。イキセキズマブは、現在、乾癬、PsA、RAに関して臨床試験が実施されている。IL-17受容体を媒介とするシグナル伝達の阻止も臨床研究中であり、その中には、乾癬、RA、喘息を治療するためのヒトモノクローナル抗IL-17RA抗体ブロダルマブが含まれる（Hu他、2011年、Ann N Y Acad Sci第1217巻：60〜76ページ）。したがってIL-17A抑制の臨床における効果が、さまざまな疾患、特に乾癬で証明されており、安全性プロファイル（II相、III相のデータが含まれる）から、IL-17A阻害剤に関する優れた忍容性がわかる（Genovese他、2010年、Arthritis Rheum 第62巻：929〜939ページと、Hueber他、2010年、Sci Transl Med第2巻：52ra72ページ）。
乾癬やそれ以外の炎症性疾患が予測不能で慢性的な性質を持つことと、医療での必要性にうまく合致していないことから、新たな治療法の開発が正当化される。
組織侵入速度は分子のサイズと負の関係があるため、比較的大きな抗体分子は本来的に組織への分布と侵入の能力が低い。さらに、抗体は、抗原となる可能性のあるさまざまなものに対する大きな親和性と特異性のために多彩な日常的文脈（例えば分析、精製、診断、治療の目的）で広く使用されているとはいえ、相変わらずいくつかの欠点を有する。そうした欠点には、哺乳動物の複雑な発現系の必要性、凝集する傾向、限定された溶解度、ジスルフィド結合を形成して安定に維持する必要性、望まない免疫応答のリスクが含まれる。
そのためモノクローナル抗体の使用は、治療する上で必ずしも最適ではなく、IL-17Aに対する大きな親和性を有する薬剤を準備することが相変わらず必要とされている。そのような分子を疾患の治療、診断、予後予測に用いることも非常に興味深い。
新規なIL-17A結合剤で、例えば診断、予後予測、治療の用途に使用できる可能性のあるものを提供することが、本開示の1つの目的である。
新規なIL-17A結合剤で、同様の機能または他の機能を有する1つ以上の追加領域を含む融合タンパク質においてドメインとして使用できるものを提供することが、本開示の1つの目的である。
さまざまな形態の炎症性疾患と自己免疫疾患を標的とした効果的な治療を可能にする一方で、現在の治療法の上記欠点とそれ以外の欠点を緩和する分子を提供することが、本開示の1つの目的である。
予後予測と診断の用途に適した分子を提供することが、本開示の別の1つの目的である。
本開示の当業者にとって明白なこれらの目的と他の目的は、添付の請求項に記載されるとともに、本明細書の全体に開示された本発明のさまざまな特徴によって満たされる。
そこで本開示の第1の特徴では、IL-17A結合モチーフBMを含んでいて、そのモチーフが、
i）EX2DX4AX6X7EIX10X11LPNL X16X17X18QX20X21AFIX25 X26LX28X29
（ただし、互いに独立に、
X2は、A、H、M、Yから選択され；
X4は、A、D、E、F、K、L、M、N、Q、R、S、Yから選択され；
X6は、A、Q、Wから選択され；
X7は、F、I、L、M、V、W、Yから選択され；
X10は、A、Wから選択され；
X11は、A、D、E、F、G、L、M、N、Q、S、T、Yから選択され；
X16は、N、Tから選択され；
X17は、H、W、Yから選択され；
X18は、A、D、E、H、Vから選択され；
X20は、A、G、Q、S、Wから選択され；
X21は、A、D、E、F、H、K、N、R、T、V、W、Yから選択され；
X25は、A、D、E、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、Vから選択され；
X26は、K、Sから選択され；
X28は、I、L、N、Rから選択され；
X29は、D、Rから選択される）と
ii）i）に規定した配列と少なくとも89％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなるIL-17A結合ポリペプチドが提供される。
配列に関係するIL-17A結合ポリペプチドのクラスに関する上記の定義は、親足場の多数のランダムなポリペプチド変異体であって、いくつかの異なる選択実験においてIL-17Aとの相互作用に関して選択されたものの統計的分析に基づいている。同定されたIL-17A結合モチーフすなわち「BM」は、親足場の標的結合領域に対応していて、その領域は、3ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内の2つのαヘリックスを構成する。親足場では、その2つのBMヘリックスの変化したアミノ酸残基が、抗体の定常Fc部と相互作用する結合面を構成する。本開示では、結合面残基のランダムな変化と変異体のその後の選択により、Fc相互作用能力がIL-17Aと相互作用する能力に置き換わっている。
当業者であればわかるように、任意のポリペプチドの機能、例えば本開示のポリペプチドのIL-17A結合能力は、そのポリペプチドの三次構造に依存する。したがってポリペプチド内のアミノ酸配列を、そのポリペプチドの機能に影響を与えることなく、わずかに変化させることが可能である。したがって本開示は、IL-17A結合ポリペプチドの改変された変異体で、IL-17Aに結合する性質が保持されているものを包含する。
そのため、本開示には、i）に規定されたポリペプチドと89％以上一致するアミノ酸配列を含むIL-17A結合ポリペプチドも包含される。いくつかの実施態様では、そのポリペプチドは、i）に規定されたポリペプチドと少なくとも93％一致する、例えば少なくとも96％一致する配列を含むことができる。例えば、あるアミノ酸残基機能的グループ（例えば疎水性、親水性、極性など）に属するアミノ酸残基を同じ機能的グループからの別のアミノ酸残基と置き換えることができよう。
いくつかの実施態様では、そのような変更は、本明細書に開示したIL-17A結合ポリペプチドの配列の任意の位置で実現することができる。別の実施態様では、そのような変更は、非可変位置（足場アミノ酸残基とも呼ばれる）でだけ実施することができる。そのような場合、変更は、可変位置、すなわち配列i）で「X」と表記してある位置では許されない。
「％一致」という用語は、本明細書全体を通じ、例えば以下のように計算することができる。CLUDTAL Wアルゴリズム（Thompson他、Nucleic Acids Research、第22巻：4673〜4680ページ (1994年)）を用いて問い合わせ配列を標的配列とアラインメントさせる。アラインメントした最短の配列に対応するウインドウで比較を行なう。アラインメントした最短の配列が、いくつかの場合には標的配列の可能性がある。別の場合には、問い合わせ配列が、アラインメントした最短の配列を構成する可能性がある。各位置のアミノ酸残基が比較され、問い合わせ配列中で標的配列と一致した位置の割合が％一致として報告される。
第1の特徴による特別な一実施態様では、上に規定したポリペプチドであって、配列i）において、
X2が、A、H、Mから選択され；
X4が、A、D、E、F、L、M、N、Q、R、Yから選択され；
X11が、A、D、E、F、G、L、M、N、S、T、Yから選択され；
X18が、A、D、E、Vから選択され；
X20が、A、G、Q、Wから選択され；
X21が、E、F、H、N、R、T、V、W、Yから選択され；
X25が、A、D、E、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、Vから選択され；
X28が、I、N、Rから選択されるポリペプチドが提供される。
第1の特徴による別の特別な一実施態様では、直前の段落に規定したポリペプチドであって、配列i）において、
X16がTであり；
X17がWであり；
X21が、E、F、H、W、T、Yから選択され；
X25が、A、D、E、G、H、I、L、N、Q、R、S、Tから選択され；
X26がKであり；
X29がDであるポリペプチドが提供される。
「Xn」と「Xm」は、本明細書では、上に規定した配列i）中の位置nとmにあるアミノ酸を示す。ただしnとmは、配列i）においてN末端から数えたアミノ酸の位置を示す整数である。例えばX3とX7は、それぞれ、配列i）のN末端から3番目と7番目の位置にあるアミノ酸を示す。
第1の特徴による実施態様では、配列i）中のXnが、独立に、表1に掲載した可能な残基のグループから選択されるポリペプチドが提供される。当業者であれば、Xnを、掲載した可能な残基のグループの任意の1つから選択できることと、その選択は、Xm（ただしn≠m）でのアミノ酸の選択とは独立であることが理解できよう。したがって、位置Xnで可能な表1に掲載の任意の残基を、他の任意の可変位置で可能な表1に掲載の任意の残基と独立に組み合わせることができる。
当業者であれば、表1を以下のように読むべきであることが理解できよう。第1の特徴による一実施態様では、配列i）のアミノ酸残基「Xn」が「可能な残基」から選択されるポリペプチドが提供される。したがって表1には、第1の特徴によるいくつかの特別かつ個別化された実施態様が開示されている。例えば第1の特徴による一実施態様では、配列i）のX4が、A、D、E、F、L、N、Q、R、Yから選択されるポリペプチドが提供され、第1の特徴による別の一実施態様では、配列i）のX4が、D、E、N、Yから選択されるポリペプチドが提供される。疑問を避けるため述べておくと、さらに別の実施態様では、ここに示した実施態様を自由に組み合わせることができる。例えばそのような組み合わせの一実施態様は、X4が、D、E、F、N、Q、R、Yから選択され、X7が、F、V、Wから選択され、X18が、A、D、E、Hから選択され、といったポリペプチドである。
Figure 2021073174
Figure 2021073174
Figure 2021073174
IL-17A結合ポリペプチドのサブクラスを規定するより特別な一実施態様では、配列i）は、以下の11個の条件I〜XI：
I．X2がAである；
II．X4がD、E、Qから選択される；
III．X6がAである；
IV．X7がFとVから選択される；
V．X16がTである；
VI．X17がWである；
VII．X18がAとDから選択される；
VIII．X20がWである；
IX．X26がKである；
X．X28がRである；
XI．X29がDである
のうちの少なくとも6個を満たす。
第1の特徴によるIL-17A結合ポリペプチドのいくつかの例では、配列i）は、11個の条件I〜XIのうちの少なくとも7個を満たす。より具体的には、配列i）は、上記の11個の条件I〜XIのうちの少なくとも8個、例えば11個の条件I〜XIのうちの少なくとも9個、例えば11個の条件I〜XIのうちの少なくとも10個、例えば11個の条件I〜XIのすべてを満たすことができる。
第1の特徴によるIL-17A結合ポリペプチドのいくつかの実施態様では、X2X6、またはX2X10、またはX6X10はAAである。いくつかの実施態様では、X2X17、またはX2X20、またはX6X17、または X6X20、またはX10X17、またはX10X20はAWである。いくつかの実施態様では、X2X28、またはX6X28、またはX10X28はARである。いくつかの実施態様では、X17X28またはX20X28はWRである。いくつかの実施態様では、X17X20はWWである。
下記の実験の項に詳細に記述してあるように、IL-17A結合ポリペプチド変異体を選択することで、多数の個別のIL-17A結合モチーフ（BM）配列が同定された。これらの配列は、この特徴による配列i）の個別の実施態様を構成する。個別のIL-17A結合モチーフの配列は、図1に示した配列番号1〜1216のアミノ酸位置8〜36に対応する。したがってこの特徴のIL-17A結合ポリペプチドの一実施態様では、配列i）は、配列番号1〜1216からなるグループから選択された1つの配列中の位置8〜位置36の配列に対応する。一実施態様では、配列i）は、配列番号1〜66、1200、1206、1214からなるグループから選択された1つの配列中の位置8〜位置36の配列に対応する。一実施態様では、配列i）は、配列番号1〜66からなるグループから選択された1つの配列中の位置8〜位置36の配列に対応する。一実施態様では、配列i）は、配列番号1〜35からなるグループから選択された1つの配列中の位置8〜位置36の配列に対応する。一実施態様では、配列i）は、配列番号1〜27からなるグループから選択された1つの配列中の位置8〜位置36の配列に対応する。一実施態様では、配列i）は、配列番号1〜10からなるグループから選択された1つの配列中の位置8〜位置36の配列に対応する。一実施態様では、配列i）は、配列番号1〜7からなるグループから選択された1つの配列中の位置8〜位置36の配列に対応する。一実施態様では、配列i）は、配列番号1〜4からなるグループから選択された1つの配列中の位置8〜位置36の配列に対応する。一実施態様では、配列i）は、配列番号1の位置8〜位置36の配列に対応する。
本開示のいくつかの実施態様では、上に規定したBMは、3ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの「一部を形成する」。これは、BMの配列が元の3ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの配列に「挿入される」か「移植されて」、元のドメイン内で似た構造のモチーフに置き換わっていることを意味するものと理解される。例えば、理論に囚われないとすると、BMは、3ヘリックスバンドルの3つのヘリックスのうちの2つを構成すると考えられるため、任意の3ヘリックスバンドル内でそのような2ヘリックスモチーフに置き換わることができる。当業者であればわかるように、3ヘリックスバンドルドメインの2つのヘリックスから2つのBMヘリックスへの置換は、ポリペプチドの基本的構造に影響を与えないように実施せねばならない。すなわち、本発明のこの実施態様によるポリペプチドのCα骨格の全体的折り畳みは、そのポリペプチドを一部として有する3ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの全体的折り畳みと実質的に同じであり、例えば二次構造の同じ要素を同じ順番で有する。したがって本開示によるBMは、本特徴のこの実施態様によるポリペプチドが元のドメインと同じ折り畳みを有する場合には、3ヘリックスバンドルドメインの「一部を形成する」。これは、基本的構造特性が共有されていることを意味し、そうした特性の結果として、例えば似たCDスペクトルになる。当業者は、重要な他のパラメータのことも認識している。
特別な実施態様では、IL-17A結合モチーフ（BM）はしたがって3ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する。例えばBMは、本質的に、その3ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内に、相互接続ループを有する2つのαヘリックスを構成することができる。特別な実施態様では、3ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは、細菌の受容体タンパク質のドメインから選択される。そのようなドメインの非限定的な例は、黄色ブドウ球菌からのプロテインAの5つの異なる3ヘリックスドメイン（例えばドメインB）と、その誘導体である。いくつかの実施態様では、3ヘリックスバンドルタンパク質ドメインはプロテインZの変異体であり、これは、ブドウ球菌のプロテインAのドメインBに由来する。
本明細書に開示したIL-17A結合ポリペプチドが3ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成するいくつかの実施態様では、IL-17A結合ポリペプチドは、
iii）K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ
（ただし[BM]は、
X29がDであり；
XaがAとSから選択され、
XbがNとEから選択され；
XcがA、S、Cから選択され；
XdがE、N、Sから選択され；
XeがD、E、Sから選択され；
XfがAとSから選択されるという条件での、本明細書に規定したIL-17A結合モチーフである）と、
iv）iii）に規定した配列と少なくとも85％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列結合モジュール（BMod）を含むことができる。
いくつかの実施態様では、上記ポリペプチドが、製造中または保管中と生体内で大きな構造安定性（例えば化学的修飾、物理的条件の変化、タンパク質分解に対する抵抗性）を示すと有用であろう。そこで、本明細書に開示したIL-17A結合ポリペプチドが3ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する別の実施態様では、IL-17A結合ポリペプチドは、
v）K-[BM]-QPEQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ,
（ただし[BM]は、
X29がRであり；
XaがAとSから選択され、
XbがNとEから選択され；
XcがA、S、Cから選択され；
XdがE、N、Sから選択され；
XeがD、E、Sから選択され；
XfがAとSから選択されるという条件での、本明細書に規定したIL-17A結合モチーフである）と、
vi）v）に規定した配列と少なくとも85％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列結合モジュール（BMod）を含むことができる。
上述のように、上記のアミノ酸配列と比べてわずかな変化を含んでいて、その変化がポリペプチドの三次構造または機能に大きな影響は与えないポリペプチドも、本開示の範囲に含まれる。したがっていくつかの実施態様では、配列iv）とvi）は、それぞれ、iii）またはv）に規定した配列と、少なくとも87％、例えば少なくとも89％、少なくとも91％、少なくとも93％、少なくとも95％、少なくとも97％一致している。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXaはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXaはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXbはNである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXbはEである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXcはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXcはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXcはCである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXdはEである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXdはNである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXdはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXeはDである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXeはEである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXeはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXdXeは、EE、ES、SD、SE、SSから選択される。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXdXeはESである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXdXeはSEである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXdXeはSDである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）のXfはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはAであり、XbはNであり、XcはAであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはAであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはAであり、XbはNであり、XcはCであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはSであり、XfはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはSであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはAであり、XfはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはCであり、XfはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはAであり、XbはNであり、XcはAであり、XdXeはNDであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはAであり、XdXeはNDであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはAであり、XbはNであり、XcはCであり、XdXeはNDであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはSであり、XdXeはNDであり、XfはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはSであり、XdXeはNDであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはCであり、XdXeはNDであり、XfはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはAであり、XbはNであり、XcはAであり、XdXeはSEであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはAであり、XdXeはSEであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはAであり、XbはNであり、XcはCであり、XdXeはSEであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはSであり、XdXeはSEであり、XfはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはAであり、XdXeはSEであり、XfはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはCであり、XdXeはSEであり、XfはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはAであり、XbはNであり、XcはAであり、XdXeはESであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはAであり、XdXeはESであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはAであり、XbはNであり、XcはCであり、XdXeはESであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはSであり、XdXeはESであり、XfはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはCであり、XdXeはESであり、XfはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはAであり、XbはNであり、XcはAであり、XdXeはSDであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはAであり、XdXeはSDであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはAであり、XbはNであり、XcはCであり、XdXeはSDであり、XfはAである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはSであり、XdXeはSDであり、XfはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはAであり、XdXeはSDであり、XfはSである。
一実施態様では、配列iii）またはv）において、XaはSであり、XbはEであり、XcはCであり、XdXeはSDであり、XfはSである。
さらに別の一実施態様では、配列iii）は、配列番号1〜1216からなるグループから選択された配列の位置7〜位置55の配列に対応する。一実施態様では、配列iii）は、配列番号1〜66、1200、1206、1214からなるグループから選択された配列の位置7〜位置55の配列に対応する。一実施態様では、配列iii）は、配列番号1〜66からなるグループから選択された配列の位置7〜位置55の配列に対応する。一実施態様では、配列iii）は、配列番号1〜35からなるグループから選択された配列の位置7〜位置55の配列に対応する。別の一実施態様では、配列iii）は、配列番号1〜27からなるグループから選択された配列の位置7〜位置55の配列に対応する。一実施態様では、配列iii）は、配列番号1〜10からなるグループから選択された配列の位置7〜位置55の配列に対応する。さらに別の一実施態様では、配列iii）は、配列番号1〜7からなるグループから選択された配列の位置7〜位置55の配列に対応する。一実施態様では、配列iii）は、配列番号1〜4からなるグループから選択された配列の位置7〜位置55の配列に対応する。別の一実施態様では、配列iii）は、配列番号1の位置7〜位置55の配列に対応する。
また、さらに別の一実施態様では、IL-17A結合ポリペプチドであって、
vii）YA-[BMod]-AP
（ただし[BMod]は、上に規定したIL-17A結合モジュールである）と、
viii）vii）に規定した配列と少なくとも86％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含むIL-17A結合ポリペプチドが提供される。
さらに別の一実施態様では、IL-17A結合ポリペプチドであって、
ix）FA-[BMod]-AP
（ただし[BMod]は、上に規定したIL-17A結合モジュールである）と、
x）ix）に規定した配列と少なくとも86％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含むIL-17A結合ポリペプチドが提供される。
あるいは、IL-17A結合ポリペプチドであって、
xi）FN-[BMod]-AP
（ただし[BMod]は、上に規定したIL-17A結合モジュールである）と、
xii）xi）に規定した配列と少なくとも86％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含むIL-17A結合ポリペプチドが提供される。
上述のように、上記のアミノ酸配列と比べてわずかな変化を含むがその三次構造と機能に大きな影響は与えないポリペプチドも、本開示の範囲に入る。したがっていくつかの実施態様では、上に規定したIL-17A結合ポリペプチドは、例えば、vii）、ix）、xi）に規定した配列と少なくとも88％、例えば少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも94％、少なくとも96％、少なくとも98％一致する配列を持つことができる。
いくつかの実施態様では、IL-17A結合モチーフは、以下に示すアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの一部を形成することができる。
配列番号：
1250 ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;
1251 ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
1252 ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;
1253 ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
1254 AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;
1255 VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
1256 AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;
1257 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
1258 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;
1259 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
1260 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP;
1261 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDAQAPK;
1262 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDAQAP;
1263 AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
1264 AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP;
1265 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
1266 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
1267 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAP;
1268 AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
1269 AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAP;
1270 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK;
1271 AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;
1272 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;
1273 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAP;
1274 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK;
1275 AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;
1276 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
1277 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAP;
1278 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDSQAPK;
1279 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK;
1280 AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
1281 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
1282 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
1283 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK;
1284 VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;
1285 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;
1286 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK;
1287 VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;
1288 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
1289 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDSQAPK;
1290 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK;
1291 VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
1292 VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;
1293 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;
1294 ADAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
ただし[BM]は、上に規定した1つのIL-17A結合モチーフである。
一実施態様では、IL-17A結合ポリペプチドは、
xiii）VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK
（ただし[BM]は、上に規定したIL-17A結合モチーフである）と、
xiv）xiii）に規定した配列と少なくとも86％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含んでいる。
ここでも、上記のアミノ酸配列と比べてわずかな変化を含むがその三次構造と機能に大きな影響は与えないポリペプチドも、本開示の範囲に入る。したがっていくつかの実施態様では、上に規定したIL-17A結合ポリペプチドは、例えば、xiii）に規定した配列と少なくとも87％、例えば少なくとも89％、少なくとも91％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも96％、少なくとも98％一致する配列を持つことができる。
そのようなポリペプチド中の配列xiii）は、配列番号1〜1216からなるグループから選択することができる。一実施態様では、配列xiii）は、配列番号1〜66、1200、1206、1214からなるグループから選択される。一実施態様では、配列xiii）は、配列番号1〜66からなるグループから選択される。一実施態様では、配列xiii）は、配列番号1〜35からなるグループから選択される。別の一実施態様では、配列xiii）は、配列番号1〜27からなるグループから選択される。一実施態様では、配列xiii）は、配列番号1〜10からなるグループから選択される。一実施態様では、配列xiii）は、配列番号1〜7からなるグループから選択される。一実施態様では、配列xiii）は、配列番号1〜4からなるグループから選択される。一実施態様では、配列xiii）は、配列番号1である。
一実施態様では、IL-17A結合ポリペプチドは、
xv）AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK
（ただし[BM]は、上に規定したIL-17A結合モチーフである）と、
xvi）xv）に規定した配列と少なくとも86％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含んでいる。
ここでも、上記のアミノ酸配列と比べてわずかな変化を含むがその三次構造と機能に大きな影響は与えないポリペプチドも、本開示の範囲に入る。したがっていくつかの実施態様では、上に規定したIL-17A結合ポリペプチドは、例えば、xv）に規定した配列と少なくとも87％、例えば少なくとも89％、少なくとも91％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも96％、少なくとも98％一致する配列を持つことができる。
このようなポリペプチド中の配列xv）は、配列番号1217〜1222からなるグループから選択することができる。一実施態様では、配列xv）は、配列番号1218〜1222からなるグループから選択される。一実施態様では、配列xv）は、配列番号1219〜1222からなるグループから選択される。別の一実施態様では、配列xv）は、配列番号1219と配列番号1222から選択される。一実施態様では、配列xv）は、配列番号1219である。
本開示のIL-17A結合ドメインの小ささと丈夫さが、モノクローナル抗体に基づく従来の治療法を上回るいくつかの利点を与えている。そのような利点には、抗体よりも大きな用量で皮下投与（s.c.）できること、複数の代替投与経路があること、より大きな力価にしやすいこと、Fcを媒介とする副作用がないことが含まれる。サイズが小さいことに加え、大きな溶解度（100 mg/ml超）かつ安定にできることで、皮下注射用の小さな体積中に極めて大きなモル量を含む薬にすることが可能になる。全身投与に関しては、これは、外来患者が、小体積で十分に許容される用量を投与する便利な小さな事前充填式注射器または自己注射装置を用いて「家庭で使用する」治療を示唆している。それに加え、大きなモル濃度の薬調製物にできることが、さまざまな製剤中で機能の安定性を保持できる能力と組み合わさり、局所（皮膚、目、肺）投与経路の可能性が開かれる。乾癬、喘息、ぶどう膜炎、ドライアイ症候群が、IL-17Aを媒介とする疾患において代替投与経路が特に重要となる可能性のある症状の例である。
「IL-17A結合」および「IL-17Aへの結合親和性」という用語は、本明細書では、例えばELISAによって、または表面プラズモン共鳴（SPR）技術によって、または結合平衡除外アッセイ（Kinetic Exclusion Assay：KinExA（登録商標））によって調べることのできるポリペプチドの特性を意味する。例えば下記の実施例に記載したように、IL-17A結合親和性は、抗体で覆ったELISAプレートにポリペプチドのサンプルを捕獲させた後、ビオチニル化したIL-17Aを添加し、次いでストレプトアビジンが共役したHRPを添加する実験で調べることができる。TMB基質を添加し、マルチウエルプレートリーダー（例えばVictor3（Perkin Elmer社））を用いて450 nmでの吸光度を測定する。当業者であれば、その後、そのような実験で得られた結果を解釈し、ポリペプチドのIL-17Aに対する結合親和性の少なくとも定性的な指標を確立することができよう。例えば相互作用に関するEC50値（半数効果濃度）を求めるために定量的指標を望む場合には、ELISAを使用することもできる。ビオチニル化したIL-17Aの希釈系列に対するポリペプチドの応答は、上述のようにELISAを用いて測定される。当業者であれば、その後、そのような実験で得られた結果を解釈し、その結果から例えばGraphPad Prism 5と非線形回帰を利用してEC50値を計算することができよう。
IL-17A結合親和性は、IL-17Aまたはその断片を表面プラズモン共鳴（SPR）装置のセンサー・チップに固定化し、調べるポリペプチドを含むサンプルをそのチップ上を通過させる実験で調べることもできる。あるいは調べるポリペプチドを装置のセンサー・チップに固定化し、IL-17Aまたはその断片をを含むサンプルをそのチップ上を通過させる。当業者であれば、その後、そのような実験で得られた結果を解釈し、そのポリペプチドのIL-17Aに対する結合親和性の少なくとも定性的な指標を確立することができよう。例えば相互作用に関するKD値を求めるために定量的指標を望む場合には、表面プラズモン共鳴法を用いることもできる。結合値は、例えばBiacore（GE Healthcare社）またはProteOn XPR 36（Bio-Rad社）装置で明らかにすることができる。IL-17Aを装置のセンサー・チップにうまく固定化し、親和性を求めるべきポリペプチドのサンプルを段階希釈によって調製し、ランダムな順番で注入する。その後、例えばBIAevaluation 4.1ソフトウエア、または装置の製造者が提供している他の適切なソフトウエアの1：1ラングミュア結合モデルを用いてKD値を結果から計算することができる。
IL-17Aに対する結合親和性を求める別の方法は、溶液中の改変されていない分子間の平衡結合親和性と反応速度を測定するための結合平衡除外アッセイ（KinExA（登録商標）；Sapidyne Instruments社、ボイシ、アメリカ合衆国；DarlingとBrault、2004年、Assay and Drug Dev Tech 第2巻(6)：647〜657ページ）である。親和性分析に関しては、平衡解離定数KDと解離速度kaが実験で求まるのに対し、解離速度kdは、式kd = KD×kaに基づいて計算することができる。
KinExA（登録商標）KD分析では、固相に1つの相互作用パートナー（例えば滴定された結合パートナー）を固定化する必要がある。その固相はその後、平衡に到達した後に溶液中で自由状態にある他の相互作用パートナー（例えば定常結合パートナー）を捕獲するためのプローブとして利用される。それぞれの実験について、1つの結合パートナーを一定濃度にして他の結合パートナーを滴定する一連の溶液を平衡させる。次にそれらの溶液を固相に短時間曝露し、自由な定常結合パートナーの一部を捕獲して蛍光性二次分子で標識する。固相との短い接触時間は、溶液中にあらかじめ形成された複合体の解離に必要な時間よりも短い。これは、溶液と固相滴定される結合パートナーの間の競合が「化学反応論的に除外される」ことを意味する。固相は各サンプル中で自由な定常結合パートナーのためのプローブとしてだけ用いられるため、測定中に溶液の平衡は変化しない。KD値は、捕獲された自由な定常結合パートナーが発する信号から計算される。その信号は、平衡したサンプル中の自由な定常結合パートナーの濃度に正比例する。KinExA（登録商標）Proソフトウエアと最小自乗分析を利用してデータを分析し、KDと活性結合部位濃度を求めるのに最適な溶液を、化学量論的に重要なモデル、例えば1：1可逆的2分子相互作用を表わす曲線にフィットさせることができる。
結合の反応速度を明らかにすることは、平衡分析と同様の形式で実施できるが、測定値を「平衡前」に回収することと、結合信号が、時間と、滴定された結合パートナーの全濃度との関数である点が異なっている。kaを求めるのに利用できる方法が2つある。「直接法」では、滴定される濃度と定常結合パートナーを固定し、溶液の時間変化を調べる。溶液中の自由な定常結合パートナーの量は、サンプルが平衡へと向かうにつれて減少するであろう。「注入法」では、インキュベーション時間と一方のパートナーの濃度を固定し、他方のパートナーの濃度を滴定する。滴定された結合パートナーの濃度が増加していくと、より多くの複合体が形成されるために自由な定常結合パートナーの量は減少するであろう。
一実施態様では、IL-17A結合ポリペプチドはIL-17Aに結合することができ、相互作用のKD値は最大で1×10-6 M、例えば最大で1×10-7 M、例えば最大で1×10-8 M、例えば最大で1×10-9 Mである。
一実施態様では、本明細書に開示した任意の特徴によるIL-17A結合ポリペプチドは、ヒトIL-17AとマウスIL-17Aからなるグループから選択されたIL-17A分子に結合することができる。一実施態様では、上記IL-17A結合ポリペプチドは、ヒトIL-17Aに結合することができる。一実施態様では、上記IL-17A結合ポリペプチドは、マウスIL-17Aに結合することができる。一実施態様では、上記IL-17A結合ポリペプチドは、ヒトIL-17AとマウスIL-17Aに結合することができる。この点に関し、ヒトIL-17Aは、アミノ酸配列の配列番号1226、または抗原として有効なそのフラグメントを含むことができる。同様に、マウスIL-17Aは、アミノ酸配列の配列番号1227、または抗原として有効なそのフラグメントを含むことができる。
当業者であれば、本開示の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示した任意の特徴によるIL-17A結合ポリペプチドにさまざまな改変および／または追加をなして、特定の用途に合ったポリペプチドにすることが可能であることが理解できよう。
例えば一実施態様では、C末端および／またはN末端に、追加のアミノ酸が伸長している、および／または追加のアミノ酸を含む、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチドが提供される。このようなポリペプチドは、ポリペプチド鎖の先頭の位置および／または最後尾の位置に、すなわち配列i）またはii）の配列のN末端および／またはC末端に1個以上の追加のアミノ酸残基を有するポリペプチドとして理解すべきである。したがってIL-17A結合ポリペプチドは、適切な任意の数の追加のアミノ酸残基、例えば少なくとも1個の追加のアミノ酸残基を含むことができる。それぞれの追加のアミノ酸残基を個別に、またはまとめて追加し、例えばポリペプチドの作製、精製、生体内またはインビトロでの安定化、カップリング、検出を改善および／または簡単化することができる。そのような追加のアミノ酸残基は、化学的カップリングを目的として追加された1個以上の追加のアミノ酸残基を含むことができる。追加のアミノ酸残基は、ポリペプチドの精製または検出のための「タグ」（例えばHis6タグ、(HisGlu)3タグ（「HEHEHE」タグ）、「myc」（c-myc）タグ）や、タグに特異的な抗体と相互作用させたり、His6タグの場合に固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（IMAC）で用いたりするための「FLAG」タグも提供することができる。
上述の追加のアミノ酸は、（既知の有機化学の方法を利用した）化学的共役によって、または他の任意の手段（例えば融合タンパク質としてのIL-17A結合ポリペプチドの発現、または他の任意のやり方で直接に、またはリンカー（例えばアミノ酸リンカー）を通じて接合すること）によって、IL-17A結合ポリペプチドにカップルさせることができる。
上述の追加のアミノ酸は、例えば1個以上のポリペプチドドメインを含むことができる。さらに別のポリペプチドドメインは、別の機能（例えば、さらに別の結合機能、酵素機能、毒性機能、蛍光性シグナル伝達機能や、これらの組み合わせ）を持つIL-17A結合ポリペプチドを提供することができる。
さらに別のポリペプチドドメインは、同じIL-17A結合機能を有する別のIL-17A結合部分をさらに提供することができる。したがってさらに別の一実施態様では、多量体形態のIL-17A結合ポリペプチドが提供される。その多量体は、本明細書に開示した少なくとも2つのIL-17A結合ポリペプチドをモノマー単位として含んでいるものと理解される。なお、それらIL-17A結合ポリペプチドのアミノ酸配列は同じでも異なっていてもよい。多量体形態のポリペプチドは、適切な数のドメインを含むことができ、各ドメインは、IL-17A結合モチーフを持ち、それぞれがその多量体の中でモノマーを形成する。これらのドメインは、同じアミノ酸配列を持っていても、異なるアミノ酸配列を持っていてもよい。言い換えるならば、本発明のIL-17A結合ポリペプチドは、ホモ多量体またはヘテロ多量体、例えばホモ二量体またはヘテロ二量体を形成することができる。一実施態様では、モノマー単位が互いに共有結合したIL-17A結合ポリペプチドが提供される。別の一実施態様では、そのIL-17A結合ポリペプチドモノマー単位は融合タンパク質として発現する。一実施態様では、二量体形態のIL-17A結合ポリペプチドが提供される。
それに加え、「異種」の融合ポリペプチドまたは融合タンパク質、または共役体として、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチドまたはその多量体が第1のドメインまたは第1の部分を構成し、第2の部分とさらなる部分が、IL-17Aへの結合以外の機能を有するものも考慮することができ、本開示の範囲に含まれる。そのようなタンパク質中の融合ポリペプチドまたは共役体の第2の部分とさらなる部分は、望む生物活性を有することが好ましい。
そこで本開示の第2の特徴では、第1の特徴によるIL-17A結合ポリペプチドを構成する第1の部分と、望ましい生物活性を有するポリペプチドを構成する第2の部分を含む融合タンパク質または共役体が提供される。別の一実施態様では、その融合タンパク質または共役体は、望む生物活性を有する追加の部分をさらに含むことができる。なおその生物活性は、第2の部分の生物活性と同じでも異なっていてもよい。
望む生物活性の非限定的な例に、治療活性、結合活性、酵素活性が含まれる。
一実施態様では、望む生物活性を有する第2の部分は、治療活性のあるポリペプチドである。
治療活性のあるポリペプチドの非限定的な例は、生体分子、例えばヒトに内在する酵素、ホルモン、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカインからなるグループから選択された分子である。考慮するサイトカインの非限定的な例は、IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-11、IL-13、IL-21、IL-27、IL-35、IFNβ、TGFβである。考慮するケモカインの非限定的な例は、SDF-1/CXCL12、BCL/BCA-1/CXCL13、CXCL16、HCC1/CCL14、TARC/CCL17、PARC/CCL18、MIP-3β/ELC/CCL19、SLC/CCL21、CCL25/TECK、CCL27/CTACKである。
結合活性の非限定的な例は、融合タンパク質または共役体の生体内半減期を長くする結合活性である。特別な一実施態様では、その結合活性は、融合タンパク質または共役体の生体内半減期を長くするアルブミン結合活性である。一実施態様では、そのアルブミン結合活性は、連鎖球菌のプロテインGのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体によって提供される。別の特別な一実施態様では、上記結合活性は、融合タンパク質または共役体の生体内半減期を長くするFcRn結合活性である。
一実施態様では、この第2の特徴の融合タンパク質または共役体は、第1の特徴のIL-17A結合ポリペプチドの2つのモノマー（そのアミノ酸配列は同じでも異なっていてもよい）にアルブミン結合部分が連結したものを含んでいる。このコンストラクトの特別な一実施態様では、融合タンパク質または共役体は、2つのIL-17A結合モノマーと、その両者の間にあるアルブミン結合部分を含んでいる。そのアルブミン結合部分として、WO2009/016043、WO2012/004384、WO2014/048977、WO2015/091957のいずれかに記載されているように、例えば連鎖球菌のプロテインGからの「GA」アルブミン結合ドメイン（例えば「GA3」）、またはその誘導体が可能である。
一実施態様では、そのような融合タンパク質または共役体の形態は「Z-A-Z」（ただし、それぞれの「Z」は個別に、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチドである）であり、「A」はアルブミン結合ドメインである。一実施態様では、「Z-A-Z」形態のそのようなIL-17A結合ポリペプチドはIL-17Aに結合することができて、相互作用のKD値は最大で1×10-10 M、例えば最大で1×10-11 M、例えば最大で1×10-12M、例えば1×10-13 Mである。一実施態様では、そのような「Z-A-Z」ポリペプチドは、配列番号1233〜1247からなるグループから選択されたアミノ酸配列、例えば配列番号1236、1237、1242〜1247からなるグループから選択されたアミノ酸配列（例えば配列番号1236、1244、1247からなるグループ、または配列番号1237、1244、1247からなるグループから選択されたアミノ酸配列）を含んでいる。さらに特別な一実施態様では、「Z-A-Z」ポリペプチドは、配列番号1244と1245からなるグループから選択されたアミノ酸配列を含んでいる。一実施態様では、「Z-A-Z」ポリペプチドは配列番号1244を含んでいる。
一実施態様では、上記結合活性は、血管新生関連因子への結合である。血管新生関連因子の非限定的な例に含まれるのは、線維芽細胞増殖因子（FGF）、線維芽細胞増殖因子1（FGF-1）、塩基性FGF、アンギオゲニン1（Ang-1）、アンギオゲニン2（Ang-2）、アンギオポエチン1（Angpt-1）、アンギオポエチン2（Angpt-2）、アンギオポエチン3（Angpt-3）、アンギオポエチン4（Angpt-4）、免疫グロブリン様ドメイン1を有するチロシンキナーゼ（TIE-1）、免疫グロブリン様ドメイン2を有するチロシンキナーゼ（TIE-2）、血管内皮細胞増殖因子受容体1（VEGFR-1）、血管内皮細胞増殖因子受容体2（VEGFR-2）、血管内皮細胞増殖因子受容体3（VEGFR-3）、血管内皮細胞増殖因子A（VEGF-A）、血管内皮細胞増殖因子B（VEGF-B）、血管内皮細胞増殖因子C（VEGF-C）、血管内皮細胞増殖因子D（VEGF-D）、血管内皮細胞増殖因子E（VEGF-E）、胎盤増殖因子（PIGF）、トランスフォーミング増殖因子β1（TGF-β1）、トランスフォーミング増殖因子β2（TGF-β2）、トランスフォーミング増殖因子β受容体（I型、II型、III型）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）、MET受容体チロシンキナーゼ（cMET、肝細胞増殖因子受容体（HGFR）とも呼ばれる）、受容体のノッチファミリーのメンバー、βカテニンである。
一実施態様では、上記結合活性は、免疫応答関連因子への結合である。免疫応答関連因子の非限定的な例に含まれるのは、
- T細胞調節因子、例えばCD3、CD4、CD6、CD28、T細胞受容体α（TCRα）、T細胞受容体β（TCRβ）、細胞障害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）、プログラム細胞死リガンド2（PD-L2）、B7ホモログ3（B7-H3）、B7ホモログ4（B7-H4）、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（HVEM）／Bリンパ球・Tリンパ球減弱因子（BTLA）、キラー抑制受容体（KIR）、リンパ球活性化遺伝子3（LAG3）、ガレクチン-9（Gal9）／T細胞免疫グロブリンムチン-3（TIM3）、アデノシン／α2-アドレナリン作動性受容体（A2aR）；
- NK細胞リクルート因子、例えばCD16、ナチュラルキラー細胞レクチン様受容体遺伝子2D産物（NKG2D）、リンパ球機能関連抗原1（LFA1）、天然の細胞障害性受容体であるNKp30、NKp40；
- 炎症関連因子、例えば
・サイトカインとその受容体、例えば腫瘍壊死因子（TNF）；腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー（TNFSF）のメンバーであるTNFSF11/RANKL、TNFSF12/TWEAK、TNFSF13、TNFSF13B/BAFF/BLys、TNFSF14、TNFSF15；インターロイキン（IL）類のIL-1α、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-18、IL-22、IL-23、IL-26、IL-32、IL-33、IL-34；インターフェロン類のINFα、INFγ；顆粒球コロニー刺激因子（GCSF）、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）；
・炎症性ケモカインとその受容体、例えばIL-8/ CXCL8、ENA-78/CXCL5、GROα/CXCL1、CTAP-III/CXCL7、IP-10/CXCL10、Mig/CXCL9、PF4/CXCL4、GCP-2/CXCL6、MCP-1/CCL2、MIP-1α/CCL3、MIP-3α/CCL20、RANTES/CCL5、リンホタクチン/XCL1、フラクタルキン/CX3CL1である。
特別に選択された実施態様では、第2の部分の結合活性は、TNF、IL-1β、IL-6、IL-17F、IL-23からなるグループから選択された標的への結合である。
本開示の第1の特徴または第2の特徴の一実施態様では、免疫応答調節剤を含む、IL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体が提供される。そのような免疫応答調節剤の非限定的な例には、免疫抑制剤または免疫調節剤や、その他の抗炎症剤が含まれる。例えば本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体が含むことができるのは、疾患修飾抗リウマチ薬（DMARD）、例えば金塩、アザチオプリン、メトトレキサート、レフルノミド；カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンA、FK 506；リンパ球再循環の調節剤；mTOR阻害剤、例えばラパマイシン；免疫抑制特性を有するアスコマイシン；グルココルチコイド；コルチコステロイド；シクロホスファミド；免疫抑制モノクローナル抗体、例えば白血球受容体への親和性を有するモノクローナル抗体で、MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86などや、これらのリガンド；接着分子阻害剤、例えばLFA-1拮抗剤、ICAM-1拮抗剤、ICAM-3拮抗剤、VCAM-4拮抗剤、VLA-4拮抗剤；抗TNA剤、例えばエタネルセプト、TNFに対するモノクローナル抗体であるインフリキシマブ、アダリムマブ；炎症促進性サイトカインの阻害剤；IL-1ブロッカー、例えばアナキンラ、IL-1トラップ；IL-6ブロッカー；ケモカイン阻害剤；非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）、例えばアスピリン；抗感染剤や、他の免疫応答調節剤；上記のものの任意の2つ以上の組み合わせからなるグループから選択された薬剤である。
本開示の第1の特徴または第2の特徴の一実施態様では、毒性化合物を含む、IL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体が提供される。そのような毒性化合物の非限定的な例に含まれるのは、カリケアマイシン、メイタンシノイド、ネオカルジノスタチン、エスペラマイシン、ダイネマイシン、ケダルシジン、マズロペプチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、アウリスタチン、リシン-A鎖、モデクシン、短縮されたシュードモナス属外毒素A、ジフテリア毒素、組み換えゲロニンである。
最近、多重特異性剤（例えば2つ以上の抗原に結合する能力を持つ抗体）の開発で大きな進歩が見られた。それは、例えば、単一の抗体結合部位で2つの抗原を処理するために相補性決定領域（CDR）を操作すること（Bostrom他、2009年、Science 第323巻(5921)：1610〜1614ページ；Schaefer他、2011年、Cancer Cell第20巻(4)：472〜486ページ）を通じて、または操作したFcユニットを用いたヘテロ二量体抗体を構成すること（Carter、2001年、J Immunol Methods 第248巻(1〜2)：7〜15ページ；Schaefer他、2011年、Proc Natl Acad Sci USA 第108巻(27)：11187〜11192ページ）を通じて、または完全長抗体の軽鎖または重鎖のN末端またはC末端に補助認識ユニットを遺伝子操作で融合させること（Kanakaraj他、2012年、MAbs 第4巻(5)：600〜613ページ；LaFleur他、2013年、MAbs 第5巻(2)：208〜218ページ）を通じてである。
上述のように、IL-17Aに対する親和性を有する本明細書に開示のポリペプチドが別の因子、例えば免疫応答関連因子（例えば炎症関連因子）に対しても親和性を示すと有益であろう。
そこで本開示の第3の特徴では、本明細書に規定した少なくとも1つのIL-17A結合ポリペプチドと、少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントとを含む複合体が提供される。
本開示の第3の特徴を表現するのに用いるときの「複合体」という用語は、一方のポリペプチド鎖が、上に規定したIL-17A結合モチーフのおかげでIL-17Aに対する親和性を持ち、他方のポリペプチド鎖が、抗体またはそのその抗原結合フラグメントであるという構成の連結した2つ以上のポリペプチド鎖を意味するものとする。これらポリペプチド鎖は、第1と第2の特徴のIL-17A結合ポリペプチドに関して上に詳しく説明したように、それぞれが異なるタンパク質ドメインを持つことができ、得られるマルチタンパク質複合体は多数の機能を持つことができる。「複合体」は、共有結合によって接続された、本明細書に規定した2つ以上のポリペプチド（例えば組み換え融合タンパク質としての発現を通じて共有結合によって接続された2つ以上のポリペプチド鎖、または化学的共役によって連結した2つ以上のポリペプチド鎖）を意味するものとする。
第3の特徴により、上記抗体またはその抗原結合フラグメントを含む複合体が提供される。周知のように、その抗体は、可変領域に位置する少なくとも1つの抗原認識部位を通じて標的（抗原）（例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなど）に特異的に結合することのできる免疫グロブリン分子である。本明細書では、「抗体またはその抗原結合フラグメント」という表現に、完全長の、または完全なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけが包含されるのではなく、その抗原結合フラグメント、例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fab3、Fvとこれらの変異体、1つ以上の抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ミニボディ、二価抗体、三価抗体、四価抗体、線形抗体、単鎖抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）や、それ以外の改変された配置を持つ免疫グロブリン分子で、必要とされる特異性のある抗原認識部位を有するもの（例えば、抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、共有結合が変化した抗体）も包含される。改変された抗体とその抗原結合フラグメントのさらに別の例に含まれるのは、ナノボディ、AlbudAbs、DART（二重特異性再標的化）、BiTE（二重特異性T細胞エンゲージャー）、TandAbs （タンデム二重特異性抗体）、DAF（二重作用Fab）、トゥー-イン-ワン抗体、SMIP（小モジュラー免疫薬）、FynomAbs（抗体に融合したフィノマー）、DVD-Ig（二重可変ドメイン免疫グロブリン）、CovX-ボディ（ペプチド修飾抗体）、デュオボディ、triomAbsである。抗体の変異体とその抗原結合フラグメントのこのリストは限定的ではなく、当業者であれば他の適切な変異体を思いつくであろう。
完全長抗体は、2つの重鎖と2つの軽鎖を含んでいる。各重鎖は、重鎖可変領域（VH）と、第1、第2、第3の定常領域（CH1、CH2、CH3）を含んでいる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（VL）と軽鎖定常領域（CL）を含んでいる。抗体は、重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて異なるクラスに割り当てられる。抗体には、6つの主要なクラス、すなわちIgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgYがあり、そのうちのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2に分けられる。「完全長抗体」という用語は、本明細書では、任意のクラスの抗体、例えばIgD、IgE、IgG、IgA、IgM、IgY（またはその任意のサブクラス）を意味する。抗体の異なるクラスのサブユニットの構造と三次元配置は周知である。
「抗原結合フラグメント」は、対応する完全長抗体の抗原結合部の全体または重要部を保持している、抗体分子またはその誘導体の部分または領域である。抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域（VH）、または軽鎖可変領域（VL）、またはその両方を含むことができる。VHとVLのそれぞれは、典型的には、3つの相補性決定領域CDR1、CDR2、CDR3を含んでいる。VHとVLのこれら3つのCDRはフレームワーク領域（FR1、FR2、FR3、FR4）に隣接している。上に少し掲載したように、抗原結合フラグメントの例に含まれるのは、（1）VL-CL 鎖とVH-CH1鎖を有する1価フラグメントであるFabフラグメント；（2）重鎖ヒンジ領域を有するFabフラグメントであるFab'フラグメント；（3）重鎖ヒンジ領域が接合した（例えばジスルフィド架橋によってヒンジ領域の位置に連結した）Fab'フラグメントの二量体であるF(ab')2フラグメント；（4）Fcフラグメント；（5）抗体の単一のアームのVLドメインとVHドメインを有する最小抗体フラグメントであるFvフラグメント；（6）scFvのVHドメインとVLドメインがペプチドリンカーによって連結している単一ポリペプチド鎖であるFv（scFv）フラグメント；（7）2つのVHドメインと2つのVLドメインを含んでいて、それらのドメインがジスルフィド架橋により2つのVHドメインを介して連結している(scFv)2；（8）ドメイン抗体（抗原に特異的に結合する抗体単一可変ドメイン（VHまたはVL）ポリペプチドが可能）だが、これらに限定されない。
抗原結合フラグメントは、定型的な方法で調製することができる。例えばF(ab')2フラグメントは、完全長抗体分子をペプシンで消化することによって作製でき、Fabフラグメントは、F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成させることができる。あるいはフラグメントは、組み換え技術を通じて適切な宿主（大腸菌、酵母、哺乳動物、植物、昆虫の細胞）の中で軽鎖フラグメントと重鎖フラグメントを発現させた後、生体内またはインビトロでそれらを組み立てて望む抗原結合フラグメントを形成することによって調製することができる。単鎖抗体は、組み換え技術を通じ、重鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列と軽鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列を連結させることによって調製することができる。例えば、可撓性リンカーを2つの可変領域の間に組み込むことができる。当業者であれば、完全長抗体とその抗原結合フラグメントの両方を調製する方法を思いつくであろう。
そこで一実施態様では、本開示のこの特徴により、本明細書に規定した複合体として、上記少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントが、完全長抗体、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fcフラグメント、Fvフラグメント、単鎖Fvフラグメント、(scFv)2、ドメイン抗体からなるグループから選択される複合体が提供される。一実施態様では、上記少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、完全長抗体、Fabフラグメント、scFvフラグメントから選択される。特別な一実施態様では、上記少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントは完全長抗体である。
上に規定した複合体の一実施態様では、上記抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体と、これらの抗原結合フラグメントからなるグループから選択される。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書では、1価の親和性を有する抗体を指し、モノクローナル抗体のサンプル中の各抗体分子が抗原上の同じエピトープに結合することを意味するのに対し、「ポリクローナル抗体」という用語は、本明細書では、特定の抗原に反応するが、例えば抗原上の異なるエピトープを同定する異なる抗体分子が存在している可能性がある抗体の集団を意味する。ポリクローナル抗体は、典型的には、適切な哺乳動物に接種した後、その哺乳動物の血清から精製することによって作製される。モノクローナル抗体は、唯一の親細胞（例えばハイブリドーマ細胞系）のクローンである同じ免疫細胞によって作られる。「ヒト抗体」という用語は、本明細書では、ヒト被験者から得られた抗体に実質的に対応するか、その抗体に由来する可変領域と定常領域を有する抗体を意味する。「キメラ抗体」という用語は、本明細書では、組み換え抗体または遺伝子改変抗体（例えばマウスのモノクローナル抗体）であって、その抗体の免疫原性を低減させるために導入した、別の種（例えばヒト）からのポリペプチドまたはドメインを含むものを意味する。「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種からの抗体であって、免疫原性を低減させるため、そのタンパク質配列を改変して、ヒトで自然に生じる抗体変異体との類似性が大きくなるようにしたものを意味する。
本明細書に規定した複合体が、IL-17Aに結合できることに加え、少なくとも1つの追加の抗原（例えば、血管新生関連疾患に関係する抗原と免疫応答に関係する抗原からなるグループから選択された抗原）を標的としていると有用であろう。一実施態様では、その追加の抗原は血管新生に関係する。一実施態様では、その追加の抗原は免疫応答に関係する。
一実施態様では、抗原は血管新生と関係があり、抗原の選択は、線維芽細胞増殖因子（FGF）、線維芽細胞増殖因子1（FGF-1）、塩基性FGF、アンギオゲニン1（Ang-1）、アンギオゲニン2（Ang-2）、アンギオポエチン1（Angpt-1）、アンギオポエチン2（Angpt-2）、アンギオポエチン3（Angpt-3）、アンギオポエチン4（Angpt-4）、免疫グロブリン様ドメイン1を有するチロシンキナーゼ（TIE-1）、免疫グロブリン様ドメイン2を有するチロシンキナーゼ（TIE-2）、血管内皮細胞増殖因子受容体1（VEGFR-1）、血管内皮細胞増殖因子受容体2（VEGFR-2）、血管内皮細胞増殖因子受容体3（VEGFR-3）、血管内皮細胞増殖因子A（VEGF-A）、血管内皮細胞増殖因子B（VEGF-B）、血管内皮細胞増殖因子C（VEGF-C）、血管内皮細胞増殖因子D（VEGF-D）、血管内皮細胞増殖因子E（VEGF-E）、胎盤増殖因子（PIGF）、トランスフォーミング増殖因子β1（TGF-β1）、トランスフォーミング増殖因子β2（TGF-β2）、トランスフォーミング増殖因子β受容体（I型、II型、III型）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）、MET受容体チロシンキナーゼ（cMET、肝細胞増殖因子受容体（HGFR）とも呼ばれる）、受容体のノッチファミリーのメンバー、βカテニンからなるグループからなされる。一実施態様では、抗体またはそのフラグメントの選択は、AMG 780、AMG 386、MEDI-3617、ネスバクマブ、CVX-241、ベバシズマブ、ラニビズマブ、VGX100、CVX-241、ABP 215、PF-06439535、フレソリムマブ、メテリムマブ、オナルツズマブ、エミベツズマブ、タレクスツマブからなるグループからなされる。
一実施態様では、抗原は、免疫応答または免疫系の異常に関係していて、抗原の選択は、
- T細胞調節因子、例えばCD3、CD4、CD6、CD28、T細胞受容体α（TCRα）、T細胞受容体β（TCRβ）、細胞障害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）、プログラム細胞死リガンド2（PD-L2）、B7ホモログ3（B7-H3）、B7ホモログ4（B7-H4）、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（HVEM）／Bリンパ球・Tリンパ球減弱因子（BTLA）、キラー抑制受容体（KIR）、リンパ球活性化遺伝子3（LAG3）、ガレクチン-9（Gal9）／T細胞免疫グロブリンムチン-3（TIM3）、アデノシン／α2-アドレナリン作動性受容体（A2aR）；
- NK細胞リクルート因子、例えばCD16、ナチュラルキラー細胞レクチン様受容体遺伝子2D産物（NKG2D）、リンパ球機能関連抗原1（LFA1）、天然の細胞障害性受容体であるNKp30、NKp40；
- 炎症関連因子、例えば
・サイトカインとその受容体、例えば腫瘍壊死因子（TNF）；腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー（TNFSF）のメンバーであるTNFSF11/RANKL、TNFSF12/TWEAK、TNFSF13、TNFSF13B/BAFF/BLys、TNFSF14、TNFSF15；インターロイキン（IL）類のIL-1α、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-18、IL-22、IL-23、IL-26、IL-32、IL-33、IL-34；インターフェロン類のINFα、INFγ；顆粒球コロニー刺激因子（GCSF）、顆粒球マクロファージ-コロニー刺激因子（GM-CSF）；
・炎症性ケモカインとその受容体、例えばIL-8/ CXCL8、ENA-78/CXCL5、GROα/CXCL1、CTAP-III/CXCL7、IP-10/CXCL10、Mig/CXCL9、PF4/CXCL4、GCP-2/CXCL6、MCP-1/CCL2、MIP-1α/CCL3、MIP-3α/CCL20、RANTES/CCL5、リンホタクチン/XCL1、フラクタルキン/CX3CL1からなるグループからなされる。
一実施態様では、抗原は、TNF、IL-1β、IL-6、IL-17F、IL-23からなるグループから選択される。
一実施態様では、抗体またはそのフラグメントは、ビジリズマブ、オテリキシズマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、MPDL3280A、MEDI-4736、MPDL3280A、リリルマブと、これらの抗原結合フラグメントからなるグループから選択される。
特別な一実施態様では、抗原はTNFである。一実施態様では、抗体またはそのフラグメントは、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリムマブペゴルと、これらの抗原結合フラグメントからなるグループから選択される。別の一実施態様では、抗体またはそのフラグメントは、アダリムマブ、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトリムマブペゴルからなるグループから選択された完全長抗体である。特別な一実施態様では、抗体またはそのフラグメントは、アダリムマブまたはその抗原結合フラグメント、例えば完全長アダリムマブである。
本明細書に記載した複合体は、例えば融合タンパク質または共役体の形態で存在することができる。したがって上記少なくとも1つのIL-17A結合ポリペプチドと、上記少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントは、（既知の有機化学的方法を利用して）化学的共役によって、または他の任意の手段（例えば、融合タンパク質としての複合体の発現）によってカップルさせること、または直接に、またはリンカー（例えばアミノ酸リンカー）を介して他の任意のやり方で接合させることができる。
そこで一実施態様では、融合タンパク質または共役体である本明細書に規定の複合体が提供される。一実施態様では、その複合体は融合タンパク質である。別の一実施態様では、その複合体は共役体である。その複合体の一実施態様では、上記IL-17A結合ポリペプチドを上記抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖のN末端またはC末端に付着させる。別の一実施態様では、上記IL-17A結合ポリペプチドを上記抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖のN末端またはC末端に付着させる。一実施態様では、上記IL-17A結合ポリペプチドを上記抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖と軽鎖のN末端および／またはC末端に付着させる。例えば上記IL-17A結合ポリペプチドを上記抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖のN末端にだけ付着させること、軽鎖のN末端にだけ付着させること、重鎖のC末端にだけ付着させること、軽鎖のC末端にだけ付着させること、重鎖のN末端とC末端の両方に付着させること、軽鎖のC末端と重鎖のN末端にだけ付着させること、重鎖のC末端と軽鎖のN末端にだけ付着させることができる。
当業者であれば、融合タンパク質を構成するとき、融合させる機能性部分の間にしばしばリンカーを用いることを理解できよう。当業者であれば、特性の異なるさまざまな種類のリンカー（例えば可撓性のあるアミノ酸リンカー、堅固なアミノ酸リンカー、開裂可能なアミノ酸リンカー）を思いつくであろう。リンカーは、例えば安定性を大きくするため、融合タンパク質の折り畳みを改善するため、発現を増大させるため、生物活性および／または親和性および／または結合を改善するため、ターゲティングを可能にするため、融合タンパク質の薬物動態を変化させるために用いられてきた。そこで一実施態様では、本明細書に規定したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体はさらに、少なくとも1つのリンカーを含んでいる。リンカーは、例えば、可撓性のあるアミノ酸リンカー、堅固なアミノ酸リンカー、開裂可能なアミノ酸リンカーからなるグループから選択することができる。あるいはリンカーは、非ペプチドリンカーでもよい。本明細書に規定した融合タンパク質または共役体の一実施態様では、リンカーは、本明細書に規定したIL-17A結合ポリペプチドからなる第1の部分と、望む生物活性を有するポリペプチドからなる第2の部分の間に配置される。本明細書に規定した複合体の一実施態様では、リンカーは、上記IL-17A結合ポリペプチドと、上記抗体またはその抗原フラグメントの間に配置される。当業者であれば、上記文脈のいずれかで配置されたリンカーの存在が、同じ文脈または他の任意の文脈における追加のリンカーの存在を排除しないことを理解できよう。
接合されるドメインがある程度運動したり相互作用したりする必要があるときには、可撓性のあるリンカーがしばしば用いられる。可撓性のあるリンカーは、本明細書に規定したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体のいくつかの実施態様で特に有用である可能性がある。そのようなリンカーは、一般に、小さい非極性アミノ酸（例えばG）または小さい極性アミノ酸（例えばSやT）からなる。いくつかの可撓性のあるリンカーは、主に、連続したG残基とS残基からなる（例えば(GGGGS)pや(SSSSG)p）。コピー数「p」を調節することで、リンカーを最適化して、機能性部分の間の適切な分離を実現したり、必要な部分間相互作用を維持したりすることが可能になる。GとSのリンカー以外にも、他の可撓性リンカーが本分野で知られている。それは例えば、可撓性を維持するために追加のアミノ酸残基（例えばT、A、K、E）を含んでいたり、溶解性を改善するために極性アミノ酸残基を含んでいたりするGとSのリンカーである。
一実施態様では、リンカーは、グリシン（G）残基および／またはセリン（S）残基および／またはトレオニン（T）残基を含む可撓性リンカーである。一実施態様では、リンカーは、(GnSm)pと(SnGm)pから選択された一般式を持つ配列を含んでいる（ただし、独立に、n＝1〜7、m＝0〜7、n＋m≦8、p＝1〜10である）。一実施態様では、n＝1〜5である。一実施態様では、m＝0〜5である。一実施態様では、p＝1〜5である。より特別な一実施態様では、n＝4、m＝1、p＝1〜4である。
一実施態様では、リンカーは、G4S、(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4からなるグループから選択された配列を含んでいる。
一実施態様では、リンカーは、一般式GT(GnSm)pを持つ配列を含んでいる（ただし、独立に、n＝1〜7、m＝0〜7、n＋m≦8、p＝1〜10である）。一実施態様では、n＝1〜5である。一実施態様では、m＝0〜5である。一実施態様では、p＝1〜5である。より特別な一実施態様では、n＝4、m＝1、p＝1〜4である。したがってn＝4である一実施態様では、リンカーは、GT(G4Sm)pを含んでいる。特別な一実施態様では、n＝4かつp＝1であるため、リンカーはGTG4Sを含んでいる。一実施態様では、リンカーは、GT(G4S)pTS、GT(G4S)pPR、 GT(G4S)pPKからなるグループから選択された配列を含んでいる。
一実施態様では、リンカーは、一般式GAP(GnSm)pを持つ配列を含んでいる（ただし、独立に、n＝1〜7、m＝0〜7、n＋m≦8、p＝1〜10である）。一実施態様では、n＝1〜5である。一実施態様では、m＝0〜5である。一実施態様では、p＝1〜5である。より特別な一実施態様では、n＝4、m＝1、p＝1〜4である。したがってn＝4である一実施態様では、リンカーは、GAP(G4S)pを含んでいる。特別な一実施態様では、n＝4かつp＝1であるため、リンカーはGAPG4Sを含んでいる。一実施態様では、リンカーは、GAP(G4S)pTS、GAP(G4S)pPR、GAP(G4S)pPKからなるグループから選択された配列を含んでいる。
一実施態様では、リンカーは、KL(G4S)p、LQ(G4S)p、YV(G4S)pPKからなるグループから選択された配列を含んでいる。一実施態様では、リンカーは、S4G、(S4G)3、(S4G)4、(S4G)8からなるグループから選択された配列を含んでいる。一実施態様では、リンカーは、VDGS、ASGS、VEGSからなるグループから選択された配列を含んでいる。特別な一実施態様では、リンカーはASGSを含んでいる。
本開示によるIL-17A結合ポリペプチドが組み込まれた融合タンパク質、共役体、複合体に関する上記の記述について、第1の部分、第2の部分などの表記は、明確にするという理由で、本発明によるIL-17A結合ポリペプチドと他の機能を示す部分を区別するためになされていることに注意されたい。これらの表記は、融合タンパク質、共役体、複合体のポリペプチド鎖内の異なるドメインの実際の順番を意味するものではない。したがって例えば第1の部分が、融合タンパク質、共役体、複合体のN末端に、または中間に、またはC末端に現われることに制限はない。
本開示はさらに、第1の特徴によるIL-17A結合ポリペプチドや、第2の特徴による融合タンパク質または共役体に含まれるIL-17A結合ポリペプチドや、第3の特徴による複合体に含まれるIL-17A結合ポリペプチドが、さらに標識を含むポリペプチドを包含する。その標識は、例えば、蛍光性の染料と金属、発色団染料、化学発光化合物と生物発光タンパク質、酵素、放射性核種、粒子からなるグループから選択される標識である。その標識は、例えばポリペプチドの検出に用いることができる。
標識されたIL-17A結合ポリペプチドが本開示の第1の特徴によるIL-17A結合ポリペプチドと1つの標識を含んでいる実施態様では、その標識されたポリペプチドは、IL-17Aを発現する細胞、例えば炎症関連がんの細胞を間接的に標識するのに利用できる。炎症関連がんの非限定的な例に、胃がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、肝細胞がん、腺癌が含まれる（Wu他、2014年、Tumour Biol. 第35巻(6)：5347〜5356ページ；Wu他、2012年、PLoS One第7巻(12); Zhang他、2012年、Asian Pac J Cancer Prev第13巻(8)：3955〜3960ページ；Liu他、2011年、Biochem Biophys Res Commun. 第407巻(2)：348〜354ページ）。
別の実施態様では、標識されたIL-17A結合ポリペプチドは、望む生物活性を有する第2の部分と可能なさらに別の部分も含む融合タンパク質、共役体、複合体の中に部分として存在している。標識は、いくつかの場合には、IL-17A結合ポリペプチドにだけカップルさせることができ、いくつかの場合には、融合タンパク質または共役体のIL-17A結合ポリペプチドと第2の部分の両方に、および／または複合体の抗体またはその抗原結合フラグメントにカップルさせることができる。さらに、標識を第2の部分か、抗体またはその抗原結合フラグメントにだけカップルさせ、IL-17A結合部分にはカップルさせないことも可能である。したがってさらに別の一実施態様では、第2の部分を含んでいて、標識がその第2の部分にカップルしたIL-17A結合ポリペプチドが提供される。別の一実施態様では、標識が抗体またはその抗原結合フラグメントにだけカップルした、本明細書に規定した複合体が提供される。
一実施態様では、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体は、システイン残基のチオール基またはリシン残基のアミン基を介してIL-17A結合ポリペプチドに共役したポリアミノポリカルボキシレート型キレータによって提供されるキレート化環境を含んでいる。
IL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体が放射性標識をされている実施態様では、そのように放射性標識をされたポリペプチドは、放射性核種を含むことができる。大半の放射性核種は金属的性質を持っていて、金属は、一般に、タンパク質またはペプチドの中に存在する元素と安定な共有結合を形成することができない。それが理由で、タンパク質とペプチドへの放射性金属による標識は、キレータ、すなわち金属イオンとの間にキレートと呼ばれる非共有結合化合物を形成する多座配位子を用いて実施される。IL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体の一実施態様では、放射性核種の組み込みは、キレート化環境を用意することによって可能になり、その環境を通じて放射性核種がポリペプチドと配位すること、またはキレート化すること、または複合体化することができる。
キレータの一例は、ポリアミノポリカルボキシレート型のキレータである。そのようなポリアミノポリカルボキシレート型のキレータには、異なる2つのクラス、すなわち大環状キレータと非環状キレータがある。
一実施態様では、IL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体は、システイン残基のチオール基またはリシン残基のεアミン基を介してIL-17A結合ポリペプチドと共役したポリアミノポリカルボキシレート型キレータによって提供されるキレート化環境を含んでいる。
インジウム、ガリウム、イットリウム、ビスマス、放射性アクチニド、放射性ランタニドの放射性同位体に関して最もよく使用されている大環状キレータは、DOTA（1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸）のさまざまな誘導体である。一実施態様では、IL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体のキレート化環境は、DOTAまたはその誘導体によって提供される。より具体的には、一実施態様では、本開示に含まれるキレート化ポリペプチドは、DOTA誘導体である1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-トリス-酢酸-10-マレイミドエチルアセトアミド（マレイミドモノアミド- DOTA）を上記ポリペプチドと反応させることによって得られる。
それに加え、1,4,7-トリアザシクロノナン-1,4,7-三酢酸（NOTA）とその誘導体をキレータとして用いることができる。したがって一実施態様では、ポリアミノポリカルボキシレート型キレータが1,4,7-トリアザシクロノナン-1,4,7-三酢酸またはその誘導体であるIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体が提供される。
最もよく用いられている非環状ポリアミノポリカルボキシレートキレータは、DTPA（ジエチレントリアミン-五酢酸）のさまざまな誘導体である。したがってジエチレントリアミン-五酢酸またはその誘導体によって提供されるキレート化環境を持つポリペプチドも、本開示に含まれる。
一実施態様では、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体はさらに、例えばその分子の薬物動態特性を改善するため、1つ以上のポリエチレングリコール（PEG）部分を含んでいる。
本開示の第4の特徴では、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、そのポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、その発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。
本開示には、上述のポリペプチドまたは融合タンパク質を作製する方法であって、発現ベクターからのそのポリペプチドの発現を許容する条件下で宿主細胞を培養し、そのポリペプチドを単離することを含む方法も含まれる。
本開示のIL-17A結合ポリペプチドは、保護された反応性側鎖を有するアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体を用いた非生物的ペプチド合成によっても作製することができ、この非生物的ペプチド合成法は、
- アミノ酸および／またはアミノ酸誘導体を段階的にカップリングさせて、保護された反応性側鎖を有する第1の特徴によるポリペプチドを形成し、
- そのポリペプチドの保護された反応性側鎖から保護基を除去し、
- 水溶液中でそのポリペプチドを折り畳ませることを含んでいる。
本開示によるIL-17A結合ポリペプチドは、それ自体が治療剤、診断剤、予後予測剤として、または他の治療剤または診断剤を標的とする手段として有用であり、例えばIL-17Aに対する直接的または間接的な効果を有することを理解すべきである。直接的な治療効果は、例えばIL-17Aシグナル伝達を抑制することによって、例えばIL-17Aが、対応する受容体の1つ以上に結合するのを阻止することによって達成できる。
別の特徴では、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体のいずれかと、医薬として許容可能な少なくとも1種類の賦形剤または基剤とを含む組成物が提供される。一実施態様では、その組成物はさらに、少なくとも1種類の追加の活性剤、例えば少なくとも2種類の活性剤、例えば少なくとも3種類の活性剤を含んでいる。そのような組成物において有用であることが判明する可能性のある追加の活性剤の非限定的な例は、本明細書に記載した治療活性のあるポリペプチド、免疫応答調節剤、毒性化合物である。
当業者であれば、上記のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、または本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体を含む医薬組成物は、標準的な投与技術（例えば経口投与、局所投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、肺投与、経皮投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、口腔内投与、舌下投与、座薬投与）を利用して被験体に投与できることが理解できよう。したがって一実施態様では、経口投与、局所投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、肺投与、経皮投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、口腔内投与、舌下投与、座薬投与するための、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、医薬組成物が提供される。特別な一実施態様では、経口投与するための、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、医薬組成物が提供される。別の特別な一実施態様では、局所投与（例えば目への局所投与）するための、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、医薬組成物が提供される。
IL-17Aは、ある種のがん、例えば炎症関連がんである胃がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、肝細胞がん、腺癌の診断と予後予測のための貴重なマーカーとしても役立つ可能性がある。例えばIL-17は、結腸直腸がんと肝細胞がんの患者における予後予測および短い生存期間と結びついている。
そこで本開示の別の特徴では、薬、診断剤、予後予測剤として用いるための、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物が提供される。
一実施態様では、生体内でIL-17Aの機能を調節する薬として使用するための、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物が提供される。本明細書では、「調節する」という用語は、活性を変化させること、例えばIL-17Aの機能をハイポモルフ（低次形態）にして、IL-17Aの機能を部分的に、または全面的に抑制することを意味する。
IL-17A結合ポリペプチドが治療および／または予後予測および／または診断に役立つ可能性のあるIL-17A関連の症状または疾患の非限定的な例に含まれるのは、関節炎（例えば、関節リウマチ、慢性進行性関節炎、変形性関節炎、リウマチ性疾患、骨量減少を含む疾患、炎症性疼痛、脊椎関節症（強直性脊椎炎など）、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎、腸疾患性関節炎、少関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身発症性関節リウマチ、変形性関節症）；過敏症（例えば、過敏（気道過敏と皮膚過敏の両方が含まれる）、アレルギー、抗原曝露に対する応答）；胃腸疾患（例えば、自己免疫性炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸症候群が含まれる）、セリアック病（特発性スプルー）、腹腔内膿瘍、腹腔内癒着、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、ウイルス性肝炎、慢性活動性肝炎、ヘリコバクター・ピロリ関連胃炎）；眼科疾患（例えば、内分泌性眼症、グレーブス病、ぶどう膜炎（前部と後部）、乾性角結膜炎（ドライアイ疾患）、春季結膜炎、ヘルペス性間質性角膜炎、ドライアイ疾患）；腎臓疾患（例えば、糸球体腎炎（ネフローゼ症候群（その中には、特発性ネフローゼ症候群や微少変化が含まれる）あり、またはなし））；急性疾患（例えば、急性炎症反応、超急性炎症反応、敗血症性ショック（例えば、内毒素ショック、成人呼吸窮迫症候群）、髄膜炎、肺炎、重度の火傷、急性感染症、敗血症、脳卒中、虚血）；悪液質（消耗症候群）（例えば、病的なTNF放出に関連する悪液質、感染症の帰結としての悪液質、がんに関連する悪液質、臓器不全に関連する悪液質、エイズに関連する悪液質）；骨関連疾患（例えば骨代謝の疾患であり、変形性関節症、骨粗鬆症、炎症性関節炎、骨量減少（加齢性骨量減少など）、歯周病、骨インプラントの弛緩、骨侵食が含まれる））；若年性疾患（例えば、若年性関節リウマチ、少関節型若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身発症性若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸疾患性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、SEA症候群（血清反応陰性関節炎、腱付着部症、関節症症候群）、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症状、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎）；血管炎（大血管の血管炎（例えば、リウマチ性多発筋痛症、高安動脈炎、側頭動脈炎）、中血管の血管炎（例えば、バージャー病、皮膚血管炎、川崎病、結節性多発動脈炎）、小血管の血管炎（例えば、ベーチェット症候群、チャーグ-ストラウス症候群、皮膚血管炎、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、顕微鏡的多発血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、ゴルファー血管炎）、多彩な血管の血管炎、動脈炎）；皮膚疾患（例えば、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、倒置乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎）；肺疾患（例えば、閉塞性気道疾患、炎症性気道疾患、喘息、気管支炎、COPD、塵肺、肺気腫、急性と超急性の炎症反応、間質性肺線維症、気道炎、気管支喘息）；代謝疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、I型糖尿病）；他の全身性自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（SLE）、ループス腎炎、多発性軟骨炎、重症筋無力症、スティーブンス-ジョンソン症候群、腫瘍、筋炎、皮膚筋炎、成人スティル病、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、強皮症、硬化症、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多発性硬化症（MS）、ギラン-バレー病、アディソン病、レイノー病）である。
本明細書に開示したIL-17A結合ポリペプチドはさらに、心臓、肺、心臓と肺の組み合わせ、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、角膜を移植したレシピエントの治療（例えば、自家移植拒絶、異種移植拒絶）や、例えば骨髄移植後の移植片対宿主病、臓器移植関連動脈硬化症の予防に役立つ可能性がある。
本明細書に開示したIL-17A結合ポリペプチドはさらに、炎症関連がんの治療、診断、予後予測に役立つ可能性がある。「がん」という用語は、本明細書では腫瘍疾患および／またはがん（例えば転移性のがんや侵襲性のがん）を意味し、その例として、肺がん、小細胞肺がん（NSCL）、細気管支肺胞上皮細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部および首のがん、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、大腸がん、結腸直腸がん、小腸のがん、食道がん、肝臓がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸の癌腫、膣の癌腫、陰門の癌腫、ホジキン病、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞癌、胆管がん、中枢神経系（CNS）の新生物、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、腺癌、リンパ腫、リンパ性白血病、原発不明のがん、他の過形成性または新生物形成性のIL-17A関連疾患（その中には上記の任意のがんで難治性のもの、上記のがんの組み合わせ、過剰増殖性疾患が含まれる）がある。
炎症関連がんの非限定的な例に、胃がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、肝細胞がん、腺癌が含まれる。
一実施態様では、IL-17A関連疾患の治療、診断、予後予測に用いるためのIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物が提供され、IL-17A関連疾患は、炎症性疾患、自己免疫疾患、がんからなるグループ、例えば炎症性疾患と自己免疫疾患からなるグループから選択される疾患である。一実施態様では、その疾患は、炎症性疾患、アレルギー性疾患、過敏反応、自己免疫疾患、重度の感染症、移植拒絶からなるグループから選択される。
特別な一実施態様では、IL-17A関連疾患は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、乾癬、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ぶどう膜炎、ドライアイ疾患からなるグループから選択される。
より特別な一実施態様では、IL-17A関連症状は乾癬である。
別の一実施態様では、IL-17A関連症状は、炎症関連がん、例えば胃がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、肝細胞がん、腺癌から選択されるがんである。
関連する1つの特徴では、IL-17Aを検出する方法が提供される。その方法は、IL-17Aを含んでいることが疑われるサンプルを用意し、そのサンプルを、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物のいずれかと接触させ、そのIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物を検出してそのサンプル中にIL-17Aが存在することを示すことを含んでいる。一実施態様では、この方法はさらに、サンプルを接触させた後に結合しなかったポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物を除去するための中間洗浄工程を含んでいる。
一実施態様では、上記方法は、被験体内のIL-17Aの存在を明らかにする診断法または予後予測法であり、この方法は、
- 被験体を、またはその被験体から単離したサンプルを、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物のいずれかと接触させる工程と、
- その被験体内で結合した、または上記サンプルに結合したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物の量に対応する値を取得する工程を含んでいる。
一実施態様では、上記方法はさらに、被験体またはサンプルに接触させた後かつ値を取得する前に、結合しなかったポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物を除去するための中間洗浄工程を含んでいる。
一実施態様では、上記方法はさらに、上記の値を参照値と比較する工程を含んでいる。その参照値は、例えば色彩反応に基づき、数値、閾値、視覚的インディケータによって数値化することができる。当業者であれば、参照値と比較する公知のさまざまな方法が使用に適していることが理解できよう。
その方法の一実施態様では、被験体は、哺乳動物、例えばヒト被験者である。
一実施態様では、上記方法は生体内で実施される。
一実施態様では、上記方法はインビトロで実施される。
関連する1つの特徴では、IL-17A関連疾患を治療する方法が提供される。この方法は、治療を必要とする被験体に、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物のいずれかを有効量投与することを含んでいる。この方法のより特別な一実施態様では、本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物が生体内でIL-17Aの機能を調節する。
一実施態様では、IL-17A関連疾患は、炎症性疾患、自己免疫疾患、がんからなるグループ、例えば炎症性疾患と自己免疫疾患からなるグループから選択される。この特徴の特別な一実施態様では、IL-17A関連疾患は、炎症性疾患、アレルギー性疾患、過敏反応、自己免疫疾患、重度の感染症、移植拒絶からなるグループから選択される。一実施態様では、IL-17A関連疾患は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、乾癬、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ぶどう膜炎、ドライアイ疾患からなるグループから選択される。より特別な一実施態様では、IL-17A関連疾患は乾癬である。別の一実施態様では、IL-17A関連疾患は、がん（例えば、胃がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、肝細胞がん、腺癌からなるグループから選択されたがん）である。
本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物のいずれかの治療に有効な量を少なくとも1種類の第2の薬物質（例えば免疫応答調節剤、毒性化合物、抗がん剤）とともに投与することが有用であろう。
本明細書では、「同時投与」という用語は、付随投与と順次投与を包含する。したがって一実施態様では、上に規定した方法において免疫応答調節剤を同時投与することをさらに含む方法が提供される。別の一実施態様では、上に規定した方法において追加の抗炎症剤を同時投与することをさらに含む方法が提供される。別の一実施態様では、上に規定した方法において毒性化合物を同時投与することをさらに含む方法が提供される。別の一実施態様では、上に規定した方法において抗がん剤を同時投与することをさらに含む方法が提供される。
免疫応答調節剤と毒性化合物の非限定的な例は上に提示してある。抗がん剤の非限定的な例に含まれるのは、アウリスタチン、アントラサイクリン、カリケアマイシン、コンブレタスタチン、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、CC-1065抗腫瘍抗生剤、エクテイナシジン（ecteinsascidin）、ゲルダナマイシン、メイタンシノイド、メトトレキサート、マイコトキシン、タキソール、リシン、ボウガニン（bouganin）、ゲロニン、シュードモナス属外毒素38（PE38）、ジフテリア毒素（DT）と、これらの類似体、これらの誘導体、これらの組み合わせからなるグループから選択された薬剤である。当業者であれば、細胞障害剤の非限定的な例に、これら薬剤の可能なあらゆる変異体が含まれること、例えばアウリスタチンには、例えばアウリスタチンE、アウリスタチンF、アウリスタチンPEや、これらの誘導体が含まれることが理解できよう。
本発明をさまざまな特徴と実施態様を参照して説明してきたが、当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく、さまざまな変更が可能であることと、諸要素をその等価物で置換できることが理解できよう。それに加え、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況または分子を本発明の教示内容に合わせることが可能である。したがって本発明は、考慮しているどの特定の実施態様に限定されることもなく、本発明は、添付の請求項の範囲に入るあらゆる実施態様を包含しているものとする。
図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。 図1は、本開示のIL-17A結合ポリペプチドの実例（配列番号1〜1222）、対照ポリペプチド（配列番号1224）、PEP07843（配列番号1225）のアミノ酸配列と、ヒトIL-17A（配列番号1226）、マウスIL-17A（配列番号1227）、カニクイザルIL-17A（配列番号1229）、アカゲザルIL-17A（配列番号1230）、ヒトIL-17F（配列番号1228）のアミノ酸配列のリストであり、このリストは、本発明を説明するための選択および／またはスクリーニングおよび／または特徴づけに用いられる。本開示のIL-17A結合ポリペプチドでは、導出されたIL-17A結合モチーフ（BM）は、各配列中で残基8から残基36まで広がっている。Z変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（BMod）のアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。
図2は、IL-17Aが誘導するIL-6産生の抑制を、実施例3に記載したNHDFアッセイにより評価した結果を示している。（A）His6-Z06260 (◇)、His6-Z06282 (□)、His6-Z06455 (○) を、IL-17Aを含む媒体の中で滴定した。（B）Z06260-ABD（◆）、His6-Z06282（□）、Z06282-ABD（黒四角）、His6-Z06455（○）、Z06455-ABD（●）を、IL-17AとHSAを含む媒体の中で滴定した。
図3は、第1と第2の成熟ライブラリからのZ変異体の集合のIL-17A結合能力を、実施例8に記載したELISAによって調べた結果を示している。その結果は、IL-17A結合変異体Z10241（配列番号11）と比較した結合能力を％単位で表示してある。
図4は、実施例8に記載したBiacore装置で実施した結合特異性分析の結果を示している。CM5チップの表面に固定化したヒトIL-17A（黒） 、ヒトIL-17A/F（濃灰）、ヒトIL-17F（淡灰）それぞれの上に、His6タグを有するZ変異体Z10508（配列番号2）（A）、Z10532（配列番号1）（B）、Z15167（配列番号4）（C）を20 nM注入することにより、センソグラムを取得した。 図4は、実施例8に記載したBiacore装置で実施した結合特異性分析の結果を示している。CM5チップの表面に固定化したヒトIL-17A（黒） 、ヒトIL-17A/F（濃灰）、ヒトIL-17F（淡灰）それぞれの上に、His6タグを有するZ変異体Z10508（配列番号2）（A）、Z10532（配列番号1）（B）、Z15167（配列番号4）（C）を20 nM注入することにより、センソグラムを取得した。 図4は、実施例8に記載したBiacore装置で実施した結合特異性分析の結果を示している。CM5チップの表面に固定化したヒトIL-17A（黒） 、ヒトIL-17A/F（濃灰）、ヒトIL-17F（淡灰）それぞれの上に、His6タグを有するZ変異体Z10508（配列番号2）（A）、Z10532（配列番号1）（B）、Z15167（配列番号4）（C）を20 nM注入することにより、センソグラムを取得した。
図5は、実施例8に記載したようにして、IL-17Aが誘導するIL-6産生の抑制を、第1の成熟選択から選択したZ変異体（太実線）について調べ、第1の選択からの1つのZ変異体（点線）と比較した結果を示している。すべてのZ変異体が、用量に依存してIL-17Aを抑制し、成熟したZ変異体は、一次Z変異体と比べて阻止能力が増大していた。
図6は、（A）ZAZ3363（配列番号1244）、（B）ZAZ3364（配列番号1245）、（C）ZAZ3365（配列番号1246）に対するヒトIL-17A（灰）とカニクイザルIL-17A（黒）の結合を、実施例11に記載したBiacore装置で分析した結果を示している。ブランク表面からの応答を差し引いた結果を示している曲線群は、IL-17Aタンパク質をそれぞれ濃度2.5 nM、10 nM、40 nMで注入したものに対応する。
図7は、実施例14に記載したNHDFアッセイにおける、IL-17Aが誘導するIL-6産生の抑制を示している。図7Aは、二量体Z-ABD-ZポリペプチドZAZ3220（配列番号1236；黒実線）では、対応するモノマーZ変異体（配列番号11；黒点線）と比べて抑制効率が優れていることを示している。図7Bは、Z変異体Z06282（配列番号1206）を含むZ-ABD-ZポリペプチドにおけるZ部分とABD部分の間のリンカーの長さの違いの評価を示している。ABDのそれぞれの側にさまざまな数のG4Sの反復すなわち最小リンカーを有するZ-ABD-ZポリペプチドであるZAZ3174（配列番号1233）、ZAZ3176（配列番号1235）、ZAZ3234（配列番号1238）、ZAZ3235（配列番号1239）、ZAZ3236（配列番号1240）、ZAZ3237（配列番号1241）を比較した。
図8は、実施例15に記載したhIL-17A誘導KCモデルにおけるZ-ABD-Zポリペプチドによる用量に依存した抑制を示している。（A）ZAZ3174（配列番号1233）によるKC産生の完全な抑制が、2.5 mg/kgの用量で得られた。（B）ZAZ3220（配列番号1236）によるKC産生の完全な抑制が、0.4 mg/kgの用量で得られた。x軸に示した用量は、mg/kgの単位と、それに対応するピコモル用量で示してある。線よりも上の数値は、各用量群での抑制率を示している。0.1 mg/kgのZAZ3220で72％の抑制が得られた。LOQ＝定量限界。 図8は、実施例15に記載したhIL-17A誘導KCモデルにおけるZ-ABD-Zポリペプチドによる用量に依存した抑制を示している。（A）ZAZ3174（配列番号1233）によるKC産生の完全な抑制が、2.5 mg/kgの用量で得られた。（B）ZAZ3220（配列番号1236）によるKC産生の完全な抑制が、0.4 mg/kgの用量で得られた。x軸に示した用量は、mg/kgの単位と、それに対応するピコモル用量で示してある。線よりも上の数値は、各用量群での抑制率を示している。0.1 mg/kgのZAZ3220で72％の抑制が得られた。LOQ＝定量限界。
図9は、実施例16に記載したように、SDラットに対して単回の静脈内投与（黒実線）または皮下投与（灰点線）を実施した後のZ-ABD-Zポリペプチド（A）ZAZ3220（配列番号1236）と（B）ZAZ3363（配列番号1244）の薬物動態プロファイルを示している。平均血清濃度と時間の関係が示されている。
図10は、実施例17に記載したようにしてウサギの目に局所投与した結果を示している。Z変異体Z10199（配列番号1217）とZ-ABD-ZポリペプチドZAZ3174（配列番号1233）が眼房水と硝子体液の両方にの取り込まれることが証明されたが、対照IgG抗体は目に浸透しなかった。
図11は、OAF1とOAF2それぞれの中で製剤化したZAZ3363（配列番号1244）の活性を、実施例18に記載したNHDFアッセイで分析し、PBS中での製剤と比較した結果を示している。A）OAF1（●）、PBS（×）、ZAZ3363なしのOAF1（◇）。B）OAF2（△）、PBS（×）、ZAZ3363なしのOAF2（◇）。
図12は、実施例18に記載したようにして、OAF1（●）、OAF2（△）、PBS（×）の中で製剤化したZAZ3363を十二指腸内投与したときの薬物動態プロファイルを示している。
図13は、実施例19に記載したNHDFアッセイにおいて複合体HCAda-Z14253とLCAda-Z14253を評価した結果を示している。（A）複合体HCAda-Z14253（左）とLCAda-Z14253（右）の模式図。（B）IL-17Aが誘導するIL-6産生の抑制。（C）TNFが誘導するIL-8産生の抑制。（D）TNFとIL-17Aが誘導するIL-8産生の抑制。Z04726-ABDは、3つのアッセイすべてに含まれる陰性対照である。 図13は、実施例19に記載したNHDFアッセイにおいて複合体HCAda-Z14253とLCAda-Z14253を評価した結果を示している。（A）複合体HCAda-Z14253（左）とLCAda-Z14253（右）の模式図。（B）IL-17Aが誘導するIL-6産生の抑制。（C）TNFが誘導するIL-8産生の抑制。（D）TNFとIL-17Aが誘導するIL-8産生の抑制。Z04726-ABDは、3つのアッセイすべてに含まれる陰性対照である。
図14は、実施例20に記載したようにカニクイザルで1、4、7、10日目に20 mg/kg（黒）または40 mg/kg（灰）を静脈内投与した後のZ-ABD-ZポリペプチドZAZ3363（配列番号1244）の薬物動態プロファイルを示している。（A）1日目の最初の注入と（B）10日目の4回目の注入を分析した平均血漿濃度と時間の関係を示している。誤差棒は標準偏差を表わす。
図15は、個々のビーグル犬に経口投与した後のZ-ABD-ZポリペプチドZAZ3363（配列番号1244）の薬物動態プロファイルを示している。150 mgのZAZ3363を0日目に腸溶カプセルとして投与した。
まとめ
以下の実施例には、ファージ提示技術に基づいてインターロイキン17A（IL-17A）を標的とする新規なZ変異体分子を開発したことを開示する。本明細書に記載したIL-17A結合ポリペプチドの配列を決定し、そのアミノ酸配列を、図1に、配列番号1〜1222の識別子を付けてリストにしてある。実施例ではさらに、IL-17A結合ポリペプチドの特徴づけと、そのポリペプチドのインビトロおよび生体内での機能について記載する。
IL-17A結合Z変異体の選択とスクリーニング
材料と方法
標的タンパク質のビオチニル化：No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin（Thermo Scentific社、カタログ番号21327）を20倍のモル数過剰にして用い、ヒトIL-17A（hIL-17A： Peprotech社、カタログ番号200-17；配列番号1226）とマウスIL-17A（mIL-17A：Peprotech社、カタログ番号210-17；配列番号1227）を製造者が推奨するようにして室温（RT）で30分間ビオチニル化した。その後にリン酸緩衝食塩水（PBS、10 mMのリン酸塩、137 mMのNaCl、2.68 mMのKCl、pH 7.4）へと緩衝液を交換する作業は、透析カセット（Slide-a-lyzer 3.5 K、3500 MWCO、Thermo Scentific社、カタログ番号66333）を製造者の指示に従って用いて実施した。
IL-17A結合Z変異体のファージ提示選択：本質的にGroenwall他、(2007年) J Biotechnol、第128巻：162〜183ページに記載されているようにして、バクテリオファージ上に提示されたプロテインZのランダムな変異体のライブラリをファージミドpAY02592の中に構築し、そのライブラリを用いてIL-17A結合Z変異体を選択した。このライブラリでは、アルブミン結合ドメイン（連鎖球菌株G148のGA3に対応しているものであり、ABDと略記する）をZ変異体への融合パートナーとして用いる。このライブラリをZlib006Naive.IIと表記する。ライブラリのサイズは1.5×1010個（Z変異体）である。このファージミドライブラリZlib006Naive.IIを含むグリセロールストックからの大腸菌RRIΔM15細胞（Ruether他、(1982年) Nucleic Acids Res第10巻：5765〜5772ページ）を20リットルの所定の無プロリン培地［3 g/l KH2PO4、2 g/l K2HPO4、0.02 g/lウラシル、6.7 g/l YNB（Difco（登録商標）酵母窒素ベースw/oアミノ酸、Becton Dickinson社）、5.5 g/l グルコース一水和物、0.3 g/l L-アラニン、0.24 g/l L-アルギニンモノヒドロクロリド、0.11 g/l L-アスパラギン一水和物、0.1 g/l L-システイン、0.3 g/l L-グルタミン酸、0.1 g/l L-グルタミン、0.2 g/l グリシン、0.05 g/l L-ヒスチジン、0.1 g/l L-イソロイシン、0.1 g/l L-ロイシン、0.25 g/l L-リシン一塩酸塩、0.1 g/l L-メチオニン、0.2 g/l L-フェニルアラニン、0.3 g/l L-セリン、0.2 g/l L-トレオニン、0.1 g/l L-トリプトファン、0.05 g/l L-チロシン、0.1 g/l L-バリン］に接種し、100μg/mlのアンピシリンを補足した。この培養物を発酵装置（Belach Bioteknik社、BR20）の中で37℃にて増殖させた。細胞の600 nmでの光学密度（OD600）が0.75に達したとき、10倍のモル数過剰なM13K07ヘルパーファージ（New England Biolabs社、カタログ番号N0315S）を用いて約2.6リットルの培養物に感染させた。細胞を30分間インキュベートしたとき、培地［2.5 g/l (NH4)2SO4；5.0 g/l 酵母抽出物（Merck社 1.03753.0500）；25 g/lペプトン（Scharlau社 07-119）；2 g/l K2HPO4；3 g/l KH2PO4；1.25 g/l Na3C6H5O7・2 H2O；0.1 ml/l Breox FMT30消泡剤］に、発現誘導用の100μMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）と、50μg/mlのアンピリシン、12.5 μg/mlカルベニシリン、25 μg/mlカナマイシン、35 ml/lの1.217 M MgSO4、10 mlの痕跡要素溶液［129 mM FeCl3；36.7 mM ZnSO4；10.6 mM CuSO4；78.1 mM MnSO4；94.1 mM CaCl2を1.2 M HClに溶かしたもの］とを補足して発酵装置に満たし、20リットルにした。グルコースの供給を制限したバッチ培養を開始した。ここでは、600 g/lのグルコース溶液を反応装置に供給した（開始時に15 g/時、17時間後の発酵終了時に40 g/時）。25％NH4OHを自動的に添加してpHを7に制御した。空気を補足し（10リットル/分）、撹拌装置をセットして溶けた酸素のレベルを30％超に維持した。タンジェンシャルフロー濾過によって培養物の中の細胞を取り出した。
Groenwallらによる上記文献に記載されているようにして、PEG/NaCl（ポリエチレングリコール／塩化ナトリウム）の中でファージ粒子を上清から2回沈殿させ、濾過し、PBSとグリセロールに溶かした。ファージストックは、使用するまで-80℃で保管した。
ビオチニル化したhIL-17A（b-hIL-17A）またはビオチニル化したmIL-17A（b-mIL-17A）に対する選択を、6つの異なるトラックに分割した4サイクルで実施した（表2）。ファージストックの調製・選択の手続きと、選択サイクル間のファージの増幅は、本質的に、別の標的に対する選択に関してWO2009/077175に記載されているようにして実施したが、以下のような変更点がある。変更点1：選択緩衝液として、3％ウシ血清アルブミン（BSA、Sigma社、カタログ番号A3059）と0.1％トゥイーン20（Acros Organics社、カタログ番号233362500）を補足したPBSを用いた。変更点2：サイクル1〜3において、ファージストックをDynabeads（登録商標）M-280（SAビーズ、Invitrogen社、カタログ番号11206D）とともにインキュベーションすることによる事前選択を実施した。変更点3：選択に使用したすべての試験管とビーズを、5％BSAと0.1％トゥイーン20を補足したPBSであらかじめブロックした。変更点4：室温の溶液中で選択を実施し、選択の時間は、第1サイクルでは200分間、以後のサイクルでは120分間であった。変更点5：その後、6.4μgのb-hIL-17A またはb-mIL-17A につき1 mgのビーズを用い、SAビーズ上での標的-ファージ複合体の捕獲を実施した。変更点6：感染させるため、10μg/mlテトラサイクリンを補足した培地（変更点7）の中で増殖させた大腸菌株XL-1ブルー細胞（Agilent Technologies社、カタログ番号200268）を使用した。変更点8：0.1 g/lのアンピリシンと0.01 g/lのテトラサイクリンを補足したトリプトン酵母抽出物プレート（15 g/lの寒天、10 g/lのトリプトン水（Merck社）、5 g/lの酵母抽出物、3 g/lのNaCl、2％グルコース）を使用して細菌を広げた。変更点9：細菌と比べて10倍過剰なM13K07ヘルパーファージを対数相の細菌に感染させた。
選択戦略の全体像を表2に示す。この選択戦略は、標的濃度の低下と洗浄回数の増加を利用することにより、あとのサイクルで厳しさが増大していくことを示している。
Figure 2021073174
トラック1を第2サイクル〜第4サイクルでは分割し、サイクル2では合計で4つのトラック（1-1〜1-4）、サイクル3では5つのトラック（1-1-1〜1-4-2）、サイクル4では6つのトラック（1-1-1-1〜1-4-2-1）にした。選択に用いたファージ粒子の数は、直前のサイクルで溶離したファージ粒子の約2000倍であったが、選択トラック1-1、1-1-1、1-1-1-1ではより多くの量を用いた。
PBST0.1％（0.1％トゥイーン20を補足したPBS）を用いて1分間洗浄し、WO2009/077175に記載されているようにして溶離を実施した。
ELIZAのためのZ変異体の作製：ウエルが深いプレート（Nunc社、カタログ番号278752）で、100μg/mlアンピリシンと0.1 mM IPTGを補足した1 ml TSB-YE培地に選択からの単独のコロニーを接種することによってZ変異体を作製した。プレートを37℃で18〜24時間インキュベートした。細胞のペリプラズム分画を放出させるため、細胞を遠心分離によってペレット化し、400μl PBST 0.05％に再度懸濁させ、-80℃で凍結させた。凍結したサンプルを水浴中で解凍した。この凍結-解凍手続きを6回繰り返した。400μlのPBST 0.05％を解凍したサンプルに添加し、細胞を遠心分離によってペレット化した。
ペリプラズム抽出液の最後の上清は、ABDへの融合体としてのZ変異体を含んでいた。それをAQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPGと表わす（Groenwall他、上記文献）。Z#####は、長さ58個のアミノ酸残基からなる個別のZ変異体を表わす。
Z変異体のELIZAスクリーニング：ヒトIL-17AへのZ変異体の結合をELIZAアッセイで分析した。ハーフエリア96ウエルELIZAプレート（Costar社、カタログ番号3690）を、4℃にて一晩、被覆用緩衝液（50 mM炭酸ナトリウム、pH 9.6；Sigma社、カタログ番号C3041）に希釈した2μg/mlの抗ABDヤギ抗体（自家製）で被覆した。抗体溶液を流出させ、ウエルを水中で洗浄し、100μlのPBSC（0.5％カゼインを補足したPBS）で室温にて1〜3時間ブロックした。ブロッキング溶液を廃棄し、50μlのペリプラズム溶液をウエルに添加し、ゆっくりと撹拌しながら室温にて1.5時間インキュベートした。ブランク対照として、ペリプラズムサンプルの代わりにPBST 0.05％を添加した。上清を流出させ、ウエルをPBST 0.05％で4回洗浄した。次に、PBSC 中で6.5 nMの濃度にした50μlのb-hIL-17Aを各ウエルに添加した。プレートを室温で1.5時間インキュベートした後、上述のように洗浄した。PBSCの中で1：30,000に希釈したストレプトアビジン共役HRP（Thermo Scientific社、カタログ番号N100）をウエルに添加し、プレートを1時間インキュベートした。上述のようにして洗浄した後、50μlのImmunoPure TMB基質（Thermo Scientific社、カタログ番号34021）をウエルに添加し、プレートを製造者が推奨するようにして処理した。Victor3マルチウエルプレートリーダー（Perkin Elmer社）を用いて450 nmでの吸光度を測定した。
配列決定：ELIZAスクリーニングと並行して、すべてのクローンを取り出して配列を決定した。本質的にWO2009/077175に記載されているようにして、単独コロニーからPCRフラグメントを増幅し、配列を決定し、分析した。
結果
IL-17A結合Z変異体のファージ提示選択：b-hIL-17A とb-mIL-17Aに対するファージ提示選択を4サイクル実施した後に個別のクローンが得られた。
Z変異体のELIZAスクリーニング： 4サイクルの選択後に得られたクローンを96ウエルのプレートで増殖させ、ELISAでhIL-17A結合活性をスクリーニングした。42種類のZ変異体が、6.5 nMの濃度でhIL-17Aに対してブランク対照の4倍以上の応答（0.43〜3.2 AU）をすることが見いだされた。ブランク対照では応答は得られなかった。
配列決定：4サイクルの選択の後に得られたクローンの配列を決定した。各変異体に独自の識別番号#####を与え、個別の変異体をZ#####と呼ぶ。長さ58個のアミノ酸残基からなるZ変異体のアミノ酸配列を図1に配列番号1200〜1216の配列として掲載してある。導出されたIL-17A結合モチーフは、各配列の残基8から残基36まで広がっている。これらZ変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成することが予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチドのアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。
モノマーIL-17A結合Z変異体の作製
この実施例では、Hisタグを有するZ変異体およびABDと融合したZ変異体のサブクローニングと作製の一般的手続きを記述する。これらは、以下の特徴づけ実験全体で使用される。
材料と方法
Hisタグを有するZ変異体のサブクローニング：各Z変異体のDNAをライブラリベクターpAY02592から増幅した。N末端にHis6タグを有するモノマーZ変異体分子を構成するため、（本質的に、別の標的に結合するZ変異体に関してWO2009/077175に記載されているような）標準的な分子生物学の技術を用いたサブクローニング戦略を適用した。Z遺伝子フラグメントを発現ベクターpAY01448にサブクローニングすると、コードされた配列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VDが得られた。
ABDと融合したZ変異体のサブクローニング：各Z変異体のDNAをライブラリベクターpAY02592から増幅した。適切なプライマー対を用いてPCRを実施し、得られた遺伝子フラグメントを開裂酵素PstIとAccIを用いて開裂させ、同じ酵素で消化させた発現ベクターpAY03362に連結すると、ABD融合タンパク質が得られた。そのABD変異体はPP013（配列番号1224）である。発現ベクターによってコードされているコンストラクトはMGSSLQ-[Z#####]-VDSS-PP013であった。
培養：各IL-17A結合Z変異体の遺伝子フラグメントを含むプラスミドを用いて大腸菌BL21(DE3)細胞（Novagen社）を形質転換し、50μl/mlのカナマイシンを補足した800 mlまたは1000 mlのTSB-YE培地の中で37℃にて培養した。タンパク質の発現を誘導するため、IPTGを添加してOD600＝2での最終濃度を0.2 mMにし、培養物を37℃でさらに5時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収した。
His 6 タグを有するIL-17A結合Z変異体の精製：約2〜5 gの各細胞ペレットを、濃度が15 U/mlになるまでBenzonase（登録商標）（Merck社）を補足した30 mlの結合用緩衝液（20 mMリン酸ナトリウム、0.5 M NaCl、20 mMイミダゾール、pH 7.4）に再度懸濁させた。細胞を破壊した後、細胞の破片を遠心分離によって除去し、それぞれの上清を1 ml His GraviTrap IMACカラム（GE Healthcare社）に適用した。洗浄用緩衝液（20 mMリン酸ナトリウム、0.5 M NaCl、60 mMイミダゾール、pH 7.4）で洗浄することによって汚染物を除去した後、IL-17A結合Z変異体を溶離用緩衝液（20 mMリン酸ナトリウム、0.5 M NaCl、500 mMイミダゾール、pH 7.4）で溶離させた。
ABDと融合したIL-17A結合Z変異体の精製：約1〜2 gの各細胞ペレットを、Benzonase（登録商標）（Merck社）を補足した30 mlのTST緩衝液（25 mMトリス-HCl、1 mM EDTA、200 mM NaCl、0.05％トゥイーン20、pH 8.0）に再度懸濁させた。超音波処理によって細胞を破壊し、遠心分離によって破片を除去した後、それぞれの上清を、抗ABDリガンド（自家製）が固定化された1 mlアガロースとともに重力フローカラムに適用した。TST緩衝液と5 mM NH4Ac pH 5.5緩衝液で洗浄した後、ABDが融合したZ変異体を0.1 M HAcで溶離させた。抗ABDアガロースアフィニティクロマトグラフィ精製工程で溶離させた分画にアセトニトリル（ACN）を添加して最終濃度を10％にした後、サンプルを、RPC溶媒A（0.1％ TFA、10％ ACN、90％水）であらかじめ平衡させた1 ml 15RPC Resourceカラム（GE Healthcare社）に装填した。RPC溶媒Aでカラムを洗浄した後、結合したタンパク質を、20 mlの線形勾配0〜50％RPC溶媒B（0.1％TFA、80％ACN、20％水）で溶離させた。純粋なABD融合Z変異体を含む分画をSDS-PAGE分析によって同定してプールした。RPC精製の後、PD-10カラム（GE Healthcare社）を用いてプールの緩衝液をPBS（2.68 mM KCl、137 mM NaCl、1.47 mM KH2PO4、8.1 mM Na2HPO4、pH 7.4）に交換した。最後に、ABD融合Z変異体を1 ml EndoTrap（登録商標）赤カラム（Hyglos社）で精製し、内毒素の含量が少なくなるようにした。
NanoDrop（登録商標）ND-1000分光測光器を用いて280 nmでの吸光度を測定し、各タンパク質の消光係数を測定することによってタンパク質の濃度を求めた。クーマシーブルーで染色したSDS-PAGEによって純度を分析し、精製した各Z変異体が何であるかをLC/MS分析を利用して確認した。
結果
培養と精製：His6タグを有するIL-17A結合Z変異体と、C末端にABDが融合したZ変異体を、大腸菌の中で可溶性遺伝子産物として発現させた。分光測光器を用いて280 nmでの吸光度を測定することにより、約1〜5 gの細菌ペレットから精製したタンパク質の量を求めると、さまざまなIL-17A結合Z変異体が約5 mg〜20 mgの範囲に分布した。それぞれの最終タンパク質調製物をSDS-PAGEで分析すると、それらがIL-17A結合Z変異体を優勢に含んでいることがわかった。各Z変異体が正確には何であるかとその分子量をHPLC-MS分析によって確認した。
一次IL-17A結合Z変異体の阻止能力の評価
正常なヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）は、IL-17Aで刺激するとIL-6を産生し（ChangとDong、2007年、Cell Research 第17巻：435〜440ページ）、上清に放出されるIL-6の量は、添加したIL-17Aの濃度と相関する。したがってIL-17Aをブロックすると、定量できる上清中のIL-6が低下する。この実施例では、アッセイを利用してIL-17A結合Z変異体Z06260 （配列番号1200）、Z06282（配列番号1206）、Z06455（配列番号1214）の阻止能力を、単独で、またはABDとの融合体（PP013；配列番号1224）として評価した。
材料と方法
His 6 タグ付きZ変異体を用いたNHDFアッセイ：NHDF細胞（Lonza社、カタログ番号CC-2511）を、増殖促進因子（Lonza社、カタログ番号CC-5034）を補足した線維芽細胞基本培地（Lonza社、カタログ番号CC-3132）の中で培養した。実験の前日、96ウエル培養プレート（Greiner社、カタログ番号655180）のウエル1つにつき100μl の中に105個の細胞を播種した。実験当日、IL-17A特異的Z変異体であるHis6-Z06260、His6-Z06282、His6-Z06455の希釈液を別の96ウエルのプレートに調製した。これらZ変異体を、0.031 nM hIL-17Aを含む培地の中で3130 nMから0.2 nMまで3倍ステップで滴定した。hIL-17A（0.002〜31 nM）の標準曲線と、0.031 nM hIL-17A含有培地を含むか、培地だけを含む対照も準備した。一晩培養したNHDF細胞を含むプレート内の培地を廃棄した。試験サンプル、標準曲線サンプル、対照を、細胞含有プレートに移した。NHDF細胞を37℃で18〜24時間刺激した後、上清中のIL-6含量を、下記のIL-6特異的ELISAを利用して定量した。
His 6 タグ付きZ変異体とABD融合Z変異体を用いたNHDFアッセイ：NHDF細胞を上述のようにして調製した。実験当日、IL-17A特異的Z変異体コンストラクトであるHis6-Z06282、His6-Z06455、Z06260-ABD、Z06282-ABD、Z06455-ABDの希釈液を別の96ウエルのプレートに調製した。これらZ変異体コンストラクトを、0.031 nM hIL-17Aと8μM HSAを含む培地の中で780 nMから0.2 nMまで4倍ステップで滴定した。標準IL-17A曲線と対照を準備するとともに、下流分析を上述のようにして実施した。
IL-6 ELISA：96ウエルハーフエリアプレート（Costar社、カタログ番号3690）を、PBS（50μl/ウエル）中で4μg/mlの濃度にした抗IL-6モノクローナル抗体MAB206（R&D systems社）で被覆し、4℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを水道水で2回すすぎ、PBS＋2％BSA（Sigma社）で2時間ブロックした。2倍希釈系列（0.2〜50 ng/ml）の中で滴定したIL-6標準（R&D systems社、カタログ番号206-IL-50）と、細胞アッセイプレートからの上清を、被覆したELISAプレート（50μl/ウエル）に添加し、室温で1.5時間インキュベートした。プレートを自動化ELISA洗浄装置の中で4回洗浄し、0.25μg/ml（50μl/ウエル）のビオチニル化抗IL-6ポリクローナル抗体（R&D systems社、BAF206）を添加した。1時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、8000回希釈した50μlのストレプトアビジン-HRP（Thermo Fisher社、カタログ番号N100）を各ウエルに添加した。プレートをさらに1時間インキュベートして洗浄した後、ウエル1つにつき50μlのTMB（Thermo Fisher社、カタログ番号34021）を用いて現像し、50μlの2M H2SO4を用いて反応を停止させた。96ウエルプレートリーダー（Victor3）で450 nmでの吸光度を測定し、各サンプル中のIL-6の濃度を計算した。結果を最大IL-6産生の割合として提示する。その計算式は以下の通りである。
100-[(ABSIL-17Aブロッカー - ABSバックグラウンド) / (ABS最大IL-6産生 - ABSバックグラウンド)]×100
結果
最初のNHDFアッセイの結果から、3種類のZ変異体His6-Z06260、His6-Z06282、His6-Z06455のすべてが、IL-17Aが誘導するIL-6の産生を用量に依存した様式でブロックすることがわかった（図2A）。IC50値は約40〜140 nMであった。
ABDに融合した同じZ変異体でNHDFアッセイを繰り返すとともに、このアッセイにHSAを含めることで、生体内条件に似せたときの抗原への結合の保持を確認した。生体内でABDはアルブミンに結合し、より長い循環半減期をもたらすであろう。結果から、ABD と融合した3種類のZ変異体のすべてが、IL-17Aが誘導するIL-6の産生を、His6タグ付きZ変異体と同程度に、またはそれ以上にブロックすることがわかった（図2B）。第2のアッセイからのIC50値を表3にまとめてある。
Figure 2021073174
IL-17A結合Z変異体の第1の成熟ライブラリの設計と構築
この実施例では、成熟ライブラリを設計して構築した。このライブラリを用いてさらに別のIL-17A結合Z変異体を選択した。成熟ライブラリからの選択により、親和性が増大したZ変異体が得られることが通常は予想される（Orlova他、(2006年) Cancer Res 第66巻(8)：4339〜4348ページ）。この研究では、スプリット-プールDNA合成を利用してランダム化された1本鎖リンカーを生成させた。すると合成中に所定のコドンを望む位置に組み込むことが可能になる。
材料と方法
ライブラリの設計：ライブラリは、実施例1に記載したようにして同定されたIL-17A結合Z変異体の配列に基づいていた。新しいライブラリでは、Z分子足場内の13個の可変位置が、配列番号1200〜1216に規定されているZ変異体配列に従い、いくつかのアミノ酸残基へと変化した。スプリット-プール合成を利用してDNAリンカーを生成させた。このDNAリンカーはDNA 2.0社（メンロ・パーク、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）から注文されたもので、以下の147 bpの配列：5’- AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA NNN NNN NNN GCG NNN NNN GAG ATC NNN NNN TTA CCT AAC TTA ACC NNN NNN CAA NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A-3’（配列番号1248；ランダム化されたコドンをNNNと表記）を含んでおり、この配列には、対応するアミノ酸配列内の一部ランダム化ヘリックス1と2のためのコード配列が含まれるとともに、XhoIとSacIのための制限部位が隣接している。Z分子足場に13個の可変Z位置（9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35）を含む新しいライブラリにおけるアミノ酸残基の理論的分布を表4に与える。得られた理論的ライブラリのサイズは、6.1×109個の変異体である。
Figure 2021073174
ライブラリの構築： 12サイクルのPCRの間にAmpliTazゴールドポリメラーゼ（Applied Biosystems社、カタログ番号4311816）を用いてライブラリを増幅し、プールした産物を、QIAquick PCR精製キット（QIAGEN社、カタログ番号28106）を供給者が推奨するようにして用いて精製した。ランダム化されたライブラリのフラグメントを精製したプールを制限酵素XhoIとSacI-HF（New England Biolabs社、それぞれカタログ番号R0146LとR3156M）で消化させ、QIAquick PCR精製キットを用いて濃縮した。その後、分離用2.5％アガロースゲル（Nuisieve GTCアガロース、Cambrex, Invitrogen社）を用いて産物をゲル電気泳動にかけ、QIAGENゲル抽出キット（QIAGEN社、カタログ番号28706）を供給者が推奨するようにして用いてその産物をゲルから精製した。
（本質的にGroenwallらの上記文献に記載されているpAffi1と同じ）ファージミドベクターpAY02592を同じ酵素で制限し、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿を利用して精製した。制限されたフラグメントと制限されたベクターを、T4 DNAリガーゼ（Fermentas社、カタログ番号EL0011）を室温で2時間用いてモル比5：1で連結した後、4℃で一晩インキュベートした。連結されたDNAをフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿によって回収した後、10 mMトリス-HCl、pH 8.5の中に溶かした。このようにしてベクターpAY02592の中に得られたライブラリは、連鎖球菌のプロテインGに由来するアルブミン結合ドメイン（ABD）に融合したZ変異体をコードしていた。
連結反応の産物（約160 ng DNA／形質転換）を電気穿孔によってエレクトロコンピテント大腸菌ER2738細胞（Lucigen社、ミドルトン、ウィスコンシン州、アメリカ合衆国、50μl）に入れた。電気穿孔の直後、（大腸菌ER2738細胞を供給した）回収培地を約1 ml添加した。形質転換された細胞を37℃で60分間インキュベートした。サンプルを取り出して滴定し、形質転換体の数を求めた。その後細胞をプールし、2％グルコース、10μg/mlテトラサイクリン、100μg/mアンピリシンを補足したTSB-YE培地の中で37℃にて一晩培養した。細胞を4,000 gで15分間ペレット化し、PBS／グリセロール溶液（約40％のグリセロール）に再度懸濁させた。細胞のアリコートを取得し、-80℃で保管した。Z変異体のライブラリからのクローンの配列を決定して内容を検証し、構築したライブラリの出来具合をライブラリの設計と比べて評価した。配列決定は実施例1に記載したようにして実施し、アミノ酸分布を検証した。
ファージストックの調製：20リットルの発酵装置（Belach Bioteknik社）の中でファージミドライブラリを含むファージストックを調製した。ファージミドライブラリを含むグリセロールストックからの細胞を、1 g/lグルコース、100 mg/lアンピリシン、10 mg/lテトラサイクリンを補足した10リットルのTSB-YEに接種した。細胞の600 nmでの光学密度（OD600）が0.52に達したとき、5倍のモル数過剰なM13K07ヘルパーファージを用いて約1.7リットルの培養物を感染させた。細胞を30分間インキュベートしたとき、発酵装置に複合体発酵培地［2.5 g/l (NH4)2SO4；5.0 g/l 酵母抽出物；30 g/l トリプトン；2 g/l K2HPO4；3 g/l KH2PO4；1.25 g/l Na3C6H5O7・2 H2O；Breox FMT30消泡剤 0.1 ml/l］を満たして10リットルにした。以下の諸成分を添加した：10 mlカルベニシリン 25 mg/ml；5 mlカナマイシン50 mg/ml；1 ml 1M IPTG；17.5 ml/l 1.217M MgSO4；5 mlの痕跡要素溶液［129 mM FeCl3；36.7 mM ZnSO4；10.6 mM CuSO4；78.1 mM MnSO4；94.1 mM CaCl2を1.2 M HClに溶かしたもの］。グルコースの供給を制限したバッチ培養を開始した。ここでは、600 g/lのグルコース溶液を反応装置に供給した（開始時に3.5 g/時、20時間継続後に37.5 g/時にして培養終了まで）。25％NH4OHの自動添加を通じ、pHを7に制御した。空気を補足し（5リットル/分）、撹拌装置を500 rpmにセットした。バッチ培養を24時間実施した後、OD600は19.4であった。15,900 gで遠心分離することによって培養物の中の細胞をペレット化した。実施例1に記載したようにして、ファージ粒子をPEG/NaClの中で上清から2回沈殿させ、濾過し、PBSとグリセロールに溶かした。選択に使用するまでファージストックを-80℃で保管した。
結果
ライブラリの構築：結合特性が確認された一群のIL-17A結合Z変異体（実施例1と実施例3）に基づいて新しいライブラリを設計した。設計したライブラリの理論的サイズは6.1×109個のZ変異体であった。大腸菌ER2738細胞の形質転換後に滴定によりライブラリの実際のサイズを求めたところ、4.5×109個の形質転換体であった。
96個の形質転換体の配列を決定し、それらの実際の配列を理論的設計と比較することによってライブラリの品質を調べた。設計したライブラリと比較した実際のライブラリの内容は満足すべきものであることがわかった。したがってIL-17Aに対する潜在的Z変異体の成熟ライブラリがうまく構築された。
第1の成熟ライブラリからのZ変異体の選択、スクリーニング、特徴づけ
材料と方法
IL-17A結合Z変異体のファージ提示選択：標的タンパク質であるhIL-17AとmIL-17Aを実施例1に記載したようにしてビオチニル化した。実施例4に記載したようにして構築したZ変異体分子の新しいライブラリを用いたファージ提示選択を、本質的に実施例1に記載したようにしてhIL-17AとmIL-17Aに対して4サイクルで実施したが、以下のような変更点がある。変更点1：選択用緩衝液として、PBST 0.1％を用いた。選択時、ウシ胎仔血清（FCS、Gibco社、カタログ番号10108-165）とヒト血清アルブミン（HSA、Albucult、Novozymes社、カタログ番号230-005）を選択用緩衝液に添加して最終濃度をそれぞれ10％と1.5μMにした。変更点2：ファージストックをSAビーズとともにインキュベートすることにより、サイクル1で事前選択工程を実施した。変更点3：選択に用いたすべての試験管とビーズを、3％BSAと0.1％トゥイーンを補足したPBSであらかじめブロックした。変更点4：選択の時間は、サイクル1、2、3、4のそれぞれにおいて140分間、70分間、60分間、50分間であった。
選択戦略の全体像を表5に示す。この選択戦略は、標的濃度の低下と洗浄回数の増加を利用することにより、あとのサイクルで厳しさが増大していくことを示している。
Figure 2021073174
サイクル1のトラック1〜3を第2サイクル〜第4サイクルでは分割したため、サイクル2では合計で6つのトラック（1-1〜3-3）、サイクル3では6つのトラック（1-1-1〜3-3-1）、サイクル4では24のトラック（1-1-1-1a〜3-3-1-2b）になった。PBST 0.1％を用いて1分間洗浄した。しかしサイクル3のトラック1〜3に関しては洗浄のうちの1回を10分間継続した。
サイクル4における最後の洗浄の後、すべてのトラックからのSAビーズ上の標的-ファージ複合体を2つの同等な部分に分割した。第1の部分からの結合したファージ粒子はただちに溶離させたのに対し、第2の部分は、ファージ粒子を溶離させる前に一晩洗浄した。異なる2通りの手続き、すなわち1）実施例1におけるようにグリシン-HCl、pH 2.2を利用するか、2）500μlの100 mMリン酸ナトリウム、150 mM塩化ナトリウム、pH 5.5を利用して、結合したファージ粒子を溶離させた後、500μlのPBSを用いて無効化した。
ファージ粒子の増幅：選択サイクル1と2の間のファージ粒子の増幅は本質的に実施例1に記載したようにして実施したが、以下のような変更点がある。変更点1：大腸菌ER2738をファージ増幅に用いた。変更点2：M13K07ヘルパーファージを5倍過剰にして用いた。変更点3：選択サイクル2と4の間のファージ粒子の増幅は以下のようにして実施した：対数相の大腸菌ER2738にファージ粒子を感染させた後、2％グルコース、10μg/mlテトラサイクリン、100μg/mlアンピシリンを補足したTSBを添加し、次いで回転させながら37℃で30分間インキュベートした。次に、細菌にM13K07ヘルパーファージを感染させた。感染した細菌を遠心分離によってペレット化し、100μM IPTG、25μg/mlカナマイシン、100μg/mlアンピシリンを補足したTSB-YE培地に再度懸濁させ、30℃で一晩増殖させた。一晩培養した培養物を遠心分離し、上清に含まれるファージ粒子をPEG/NaCl緩衝液で2回沈殿させた。最後に、ファージを選択用緩衝液に再度懸濁させた後、次の選択サイクルに入った。
最後の選択サイクルでは、対数相の細菌に溶離液を感染させて希釈した後、0.2 g/lアンピシリンを補足したTBABプレート（30 g/lトリプトース血液寒天ベース、Oxoid社、カタログ番号CMO233B）に広げて、ELISAスクリーニングで用いる単独コロニーを形成した。
潜在的Z変異体の配列決定：異なる選択トラックから個別のクローンを取り出して配列を決定した。遺伝子フラグメントの増幅と配列分析は、本質的に実施例1に記載したようにして実施した。
Z変異体のELISAスクリーニング： （実施例1に記載したようにZ変異体ABD融合タンパク質として発現する）Z変異体を含む単独コロニーを成熟ライブラリの選択されたクローンからランダムに取り出し、本質的に実施例1に記載したようにして培地の中で増殖させた。ペリプラズム上清の調製とELISAスクリーニングも本質的に実施例1に記載したようにして実施したが、以下のような変更点がある。変更点1：ビオチニル化したhIL-17Aを濃度0.4 nMで用いた。変更点2：第1の選択からのZ変異体Z06282（配列番号1206）のペリプラズム分画を陽性対照として用いた。
Z変異体のEC50分析：選択されたIL-17A結合Z変異体について、b-hOL-17Aの希釈系列に対する応答を上述のようにELISAを利用して分析した。ビオチニル化標的タンパク質を6 nMの濃度で添加し、1：3の割合で段階的に8 pMまで希釈した。バックグラウンド対照として、標的タンパク質を添加しないZ変異体も調べた。一次IL-17A結合Z変異体Z06282（配列番号1206）を含むペリプラズムサンプルを陽性対照として含めた。GraphPad Prism 5と非線形回帰を利用してデータを分析し、EC50値（半数効果濃度）を計算した。
結果
成熟したIL-17A結合Z変異体のファージ提示選択：それぞれが4サイクルを含む合計で24の並行トラックで選択を実施した。異なる選択トラックは、標的濃度、標的種の出所（ヒトIL-17AまたはマウスIL-17A）、選択時間、洗浄条件、溶離用緩衝液のpHが異なっていた。ヒトIL-17Aだけを用い、pH 2.2で溶離した選択トラックに由来するクローンは、ELIZAスクリーニングで最高の性能を示した。
配列決定：ランダムに取り出したクローンの配列を決定した。実施例1に記載したように、個々のZ変異体に識別番号Z#####を与えた。合計で932個の新たな独自のZ変異体分子が同定された。以下のELISAスクリーニングにおける最高性能の494個の変異体について、長さ58個のアミノ酸残基からなるZ変異体のアミノ酸配列を図1に配列番号1〜3、配列番号11〜16、配列番号28〜31、配列番号36〜63、配列番号67〜519として示してある。導出されたIL-17A結合モチーフは、各配列の残基8から残基36まで広がっている。Z変異体のそれぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチドのアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。
Z変異体のELISAスクリーニング：4つの選択サイクルの後に得られたクローンを96ウエルのプレートに作製し、ELISAを利用してヒトIL-17A結合活性に関してスクリーニングした。ランダムに取り出したすべてのクローンを分析した。932種類の独自のZ変異体のうちの494個が、濃度0.4 nMでhIL-17Aに対してブランク対照の2倍以上の応答（0.15〜2.0 AU）をすることがわかった。すべての選択トラックに由来するクローンで陽性信号が見いだされた。ブランク対照は、吸光度が0.055〜0.075 AUであった。
Z変異体のEC50分析：上述のELISAスクリーニング実験の結果（吸光度が1.25 AU超）またはアミノ酸配列の変化に基づいてZ変異体の一部を選択し、ELISA形式で標的の滴定を実施した。ペリプラズムサンプルを、6 nM〜8 pMの範囲のb-hIL-17A段階希釈物とともにインキュベートした。第1の選択で同定されたZ06282（配列番号1206）を含むペリプラズムサンプルを陽性対照として含めた。得られた値を分析し、それぞれのEC50値を計算した（表6）。
Figure 2021073174
IL-17A結合Z変異体の第2の成熟ライブラリの設計と構築
この実施例では、本質的に実施例4に記載したようにして第2の成熟ライブラリを構築した。このライブラリを用いて追加のIL-17A結合Z変異体を選択した。
材料と方法
ライブラリの設計：ライブラリは、実施例5で選択されて特徴づけられたIL-17A結合Z変異体の配列に基づいていた。この新しいライブラリでは、実施例4と実施例5に記載した成熟ライブラリで変化したZ分子足場内の13個の位置が、EC50分析において最高性能を示した37種類の変異体（表6）のZ変異体配列に基づく戦略に従っていくつかのアミノ酸残基へと変更された。スプリット-プール合成を利用してDNAリンカーを生成させた。このDNAリンカーはDNA 2.0社から注文されたものであり、アミノ酸配列の一部ランダム化ヘリックス1と2をコードしている以下の147 bp：5’- AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC/GCA AAA TAC GCC AAA GAA/GAG NNN NNN NNN GCG NNN NNN GAG ATC/ATT NNN NNN TTA/CTG CCT/CCC AAC TTA/CTC ACC NNN NNN CAA/CAG NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A -3’（配列番号1249；ランダム化されたコドンをNNNと表記）を含んでいて、制限部位XhoIとSacIが隣接している。Z分子足場内に6個の可変アミノ酸位置（11、14、18、25、28、32）と7個の定常アミノ酸位置（9、10、13、17、24、27、35）を含む新しいライブラリにおけるアミノ酸残基の理論的分布を表7に与える。得られた理論的ライブラリのサイズは、3.9×106個の変異体である。
ライブラリの構築：本質的に実施例4に記載したようにしてライブラリを構築したが、以下の点を変更した。細胞を、2％グルコース、10μg/mlテトラサイクリン、100μg/mlアンピリシンを補足した0.5リットルのTSB-YE培地の中で一晩培養した。
ファージストックの調製：ファージミドライブラリを含むファージストックを振盪フラスコの中で調製した。ファージミドライブラリを含むグリセロールストックからの細胞を、2％グルコース、10μg/mlテトラサイクリン、100μg/mlアンピリシンを補足した0.5リットルのTSB-YE培地に接種した。OD600が0.6に達するまで培養物を37℃で増殖させた後、5倍のモル数過剰なM13K07ヘルパーファージを用いて約83 mlの培養物を感染させ、37℃で40分間インキュベートした。培養物の中の細胞を遠心分離によってペレット化し、100μg/mlアンピリシン、25μg/mlカナマイシン、0.1 mM IPTGを補足したTSB-YE培地に溶かし、30℃で18時間増殖させた。培養後、実施例1に記載してあるように、細胞を4,000 gで遠心分離することによってペレット化し、培地に残っているファージ粒子をPEG/NaClの中で2回沈殿させ、濾過し、PBSとグリセロールに溶かした。選択に使用するまでファージストックを-80℃で保管した。
Figure 2021073174
結果
ライブラリの構築：結合特性が検証された一群のIL-17A結合Z変異体（実施例5）に基づいて新しいライブラリを設計した。設計したライブラリの理論的サイズは3.9×106個のZ変異体であった。大腸菌ER2738細胞の形質転換後に滴定によりライブラリの実際のサイズを求めたところ、1.4×109個の形質転換体であった。
96個の形質転換体の配列を決定し、それらの実際の配列を理論的設計と比較することによってライブラリの品質を調べた。設計したライブラリと比較した実際のライブラリの内容は満足すべきものであることがわかった。したがってIL-17Aに対する潜在的Z変異体の成熟ライブラリがうまく構築された。
第2の成熟ライブラリからのZ変異体の選択、スクリーニング、特徴づけ
材料と方法
IL-17A結合Z変異体のファージ提示選択：実施例1に記載したようにして標的タンパク質hIL-17Aをビオチニル化した。実施例6に記載したようにして構築したZ変異体分子の第2の成熟ライブラリを用い、本質的に実施例5に記載したようにしてファージ提示選択をhIL-17Aに対して実施したが、以下のような変更点がある。変更点1：溶液中または固相で室温にて選択を実施した。変更点2：選択の時間は、サイクル1では60分間、または10分間、または1分間、サイクル2、3、4では30分間、または4分間、または10秒間であった。溶液中での選択の後に、実施例1に記載したようにして標的-ファージ複合体をSAビーズに捕獲した。変更点3：固相での選択中、標的をSAビーズに捕獲した後に選択を実施した。
選択戦略の全体像を表8に示す。ここには、溶液中での選択と固相上での選択の違いと、標的濃度の低下と洗浄回数の増加を利用することにより、あとのサイクルで厳しさが増大していくことがまとめられている。
サイクル1のトラック1〜6を第2サイクル〜第4サイクルでは分割し、サイクル2では合計で7つのトラック（1-1〜6-1）、サイクル3では8つのトラック（1-1-1〜6-1-1）、サイクル4では16のトラック（1-1-1-1〜6-1-1-1）にした。PBST 0.1％を用いて1分間洗浄を実施した。しかしサイクル3のトラック2-1-1、3-1-1、5-1-1では洗浄のうちの1回を15分間継続した。
サイクル4での最後の洗浄の後、5つのトラック（1-1-1-1、1-2-1-2、3-1-1-1、4-1-1-1、5-1-1-2）からのSAビーズ上の標的-ファージ複合体を2つの同等な部分に分割した。第1の部分からの結合したファージ粒子はただちに溶離させた一方で、第2の部分は、ファージ粒子の溶離の前に約65時間洗浄した。実施例1に記載したように、グリシン-HCl、pH 2.2を用い、結合したファージを溶離させた。
選択サイクル間のファージ粒子の増幅は、本質的に実施例1に記載したようにして実施した。
Figure 2021073174
潜在的Z変異体の配列決定：異なる選択トラックから個々のクローンを取り出して配列を決定した。遺伝子フラグメントの増幅と配列分析は、本質的に実施例1に記載したようにして実施した。
Z変異体のELISAスクリーニング：（実施例1に記載したようにZ変異体ABD融合タンパク質として発現する）Z変異体を含む単独コロニーを第2のIL-17A成熟ライブラリの選択されたクローンからランダムに取り出し、実施例1に記載したようにして培地の中で増殖させた。ペリプラズム上清の調製とELISAスクリーニングを本質的に実施例1に記載したようにして実施したが、以下の2点を変更した。変更点１：ビオチニル化したhIL-17Aを0.2 nMまたは0.33 nMの濃度で用いた。変更点2：第1の成熟ライブラリからの選択物で同定されたZ変異体Z10241（配列番号11）のペリプラズム分画を陽性対照として用い、ペリプラズム工程をPBST 0.05％の添加に変えることによってブランク対照を作製した。
Z変異体のEC50分析：実施例5に記載したようにELISAを利用して、選択されたIL-17A結合Z変異体についてb-hIL-17Aの希釈系列に対する応答を分析した。ビオチニル化したタンパク質を10 nMの濃度で添加し、1：2で段階的に8回希釈した後、1：5で1回希釈して8 pMに下げた。バックグラウンド対照として、標的タンパク質を添加しないZ変異体も調べた。以前の成熟Z変異体Z10241（配列番号11）を含むペリプラズムサンプルを陽性対照として含めた。GraphPad Prism 5と非線形回帰を利用してデータを分析し、EC50値を計算した。
結果
第2の成熟ライブラリからのIL-17A結合Z変異体のファージ提示選択：それぞれが4サイクルを含む合計で16の並行トラックで選択を実施した。選択トラックは、標的濃度、選択時間、洗浄条件と、選択を溶液中で実施したか固相上で実施したかが異なっていた。
配列決定：ランダムに取り出したクローンの配列を決定した。実施例1に記載したように、個々のZ変異体に識別番号Z#####を与えた。合計で759個の新たな独自のZ変異体分子が同定された。
以下のELISAスクリーニングにおける最高性能の704個の変異体について、長さ58個のアミノ酸残基からなるZ変異体のアミノ酸配列を図1に配列番号5〜10、配列番号17〜27、配列番号32〜35、配列番号64〜66、配列番号520〜1199として示してある。導出されたIL-17A結合モチーフは、各配列の残基8から残基36まで広がっている。これらZ変異体それぞれの中で完全な3ヘリックスバンドルを構成すると予測される長さ49個のアミノ酸残基からなるポリペプチドのアミノ酸配列は、残基7から残基55まで広がっている。
Z変異体のELISAスクリーニング：4つの選択サイクルの後に得られたクローンを96ウエルのプレートに作製し、ELISAを利用してhIL-17A結合活性に関してスクリーニングした。ランダムに取り出したすべてのクローンを分析した。759個の独自のZ変異体のうちの704個が、濃度0.2 nMまたは0.33 nMでhIL-17Aに対してブランク対照の2倍以上の応答（0.22〜2.2 AU）をすることがわかった。すべての選択トラックに由来するクローンで陽性信号が見いだされた。ブランク対照の平均応答は、代表的なプレート集団に基づくと0.11 AUであった。
Z変異体のEC50分析：上述のELISAスクリーニング実験の結果（吸光度が陽性対照Z10241、配列番号11の応答よりも大きいZ変異体）に基づいてZ変異体の小集団を選択し、実施例5に記載したようにしてELISA形式で標的の滴定を実施した。得られた値を分析し、それぞれのEC50値を計算した（表9）。
Figure 2021073174
成熟したIL-17A結合Z変異体の小集団のインビトロでの特徴づけ
材料と方法
N末端にHis6タグを有するZ変異体のサブクローニングと作製を実施例2に記載されているようにして実施した。His6-Z10532（配列番号1）の部位特異的突然変異誘発によって追加の変異体His6-Z15167（配列番号4）を1つ作製すると、位置25のDがAに置換された。His6-Z15167の作製は、他のZ変異体に関して上に記載したようにして実施した。
円二色性（CD）スペクトル分析：精製したHis6タグ付きZ変異体をPBSの中で希釈して0.5 mg/mlにした。希釈した各Z変異体について、250〜195 nmでのCDスペクトルを20℃で取得した。それに加え、可変温度測定（VTM）を実施して融点（Tm）を求めた。VTMでは、温度を20℃から90℃まで5℃/分の勾配で上昇させながら吸光度を221 nmで測定した。この加熱手続きの後に新たなCDスペクトルを20℃で取得し、Z変異体の再折り畳み能力を調べた。CD測定は、光路長が1 mmのセルを用いてJasco J-810分光偏光計（Jasco Scandinavia AB社）で実施した。
IL-17A結合のELISAスクリーニング：96ウエルのハーフエリアプレート（Costar社、3690）を、体積50μl/ウエルのPBS中で1μg/mlの濃度にしたhIL-17Aで4℃にて一晩被覆した。分析の当日、プレートを水道水の中で2回すすいだ後、PBS＋2％BSA（Sigma社）で2時間ブロックした。Z10241（配列番号11）を標準として用い、3倍希釈系列（300〜0.005 ng/ml）の中で滴定し、被覆されたELISAプレート（50μl/ウエル）に他のZ変異体を異なる4通りの希釈状態で添加し、室温で1.5時間インキュベートした。プレートを自動化ELISA洗浄装置で4回洗浄し、2μg/ml（50μl/ウエル）のヤギ抗Z抗体を添加した。1時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、5000回希釈した50μlの抗ヤギIgG-HRP（DAKO社）を各ウエルに添加した。プレートをさらに1時間インキュベートして洗浄した後、ウエル1つにつき50μlのTMB（Thermo Fisher社、34021）を用いて現像し、50μlの2 M H2SO4を用いて反応を停止させた。プレートをマルチ標識リーダー（Victor3、Perkin Elmer社）で読み取った。
Biacore速度論的分析：27個のHis6タグ付きZ変異体について、ヒトIL-17Aに関する速度論的定数（konとkoff）と親和性（KD）を求めた。CM5チップ表面（GE Healthcare社、カタログ番号BR100012）のカルボキシル化デキストラン層上のフローセル内にhIL-17Aを固定化した。固定化は、アミンカップリング化学を製造者のプロトコルに従って使用するとともに、HBS-EP（0.01 M HEPES pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005％ v/v 界面活性剤 P20、GE Healthcare社、カタログ番号BR100188）をランニング緩衝液として使用して実施した。ブランクとして使用するため、分析物の注入中にチップ上の1つのフローセル表面の活性化と脱活性化を行なった。この速度論的実験では、HBS-EPをランニング緩衝液として使用し、流速は50μl/mlであった。分析物、すなわちZ変異体をそれぞれHBS-EP緩衝液の中で希釈して最終濃度を100 nM、20 nM、4 nMにし、4分間かけて注入した後、8分間かけてランニング緩衝液の中で解離させた。8分間解離させた後、10 mM HClを2回注入して表面を再生させた。センソグラムから、BiaEvaluationソフトウエア4.1（GE Healthcare社）のラングミュア1：1モデルを用いて速度論的定数を計算した。
BIacore結合特異性分析：3種類のHis6タグ付きZ変異体（Z10508（配列番号2）、Z10532 （配列番号1）、Z15167（配列番号4））と、hIL-17A（配列番号1226）、hIL-17F（配列番号1228；R&D Systems社、カタログ番号1335-IL/CF）、ヒトIL-17A/Fへテロ二量体（R&D Systems社、カタログ番号5194-IL-025/CF）の間の相互作用をBiacore 2000装置で分析した。CM5チップ表面のカルボキシル化デキストラン層上のフローセル内にこれら3つの異なるIL-17変異体を固定化した。固定化は、アミンカップリング化学を製造者のプロトコルに従って使用するとともに、HBS-EPをランニング緩衝液として使用して実施した。ブランクとして使用するため、分析物の注入中にチップ上の1つのフローセル表面の活性化と脱活性化を行なった。この結合実験では、HBS-EPをランニング緩衝液として使用し、流速は50μl/mlであった。分析物、すなわちZ変異体をそれぞれHBS-EP緩衝液の中で希釈して最終濃度を4 nM、20 nM、100 nM、500 nMにし、4分間かけて注入した。15分間解離させた後、10 mM HClを4回注入して表面を再生させた。BiaEvaluationソフトウエアを用いて結果を分析した。
NHDFアッセイにおける、IL-17Aが誘導するIL-6産生の阻止：NHDFアッセイと、IL-6特異的ELISAによる定量を、本質的に実施例3に記載されているようにして実施した。簡単に述べると、実験の前日、ウエル1つにつき5000個の細胞をハーフエリア96ウエル培養プレートの100μlの中に播種した。実験当日、36種類のIL-6特異的Z変異体の希釈液を別の96ウエルのプレートに調製した。0.9 nM hIL-17Aを含む培地の中でZ変異体を4690 nMから0.08 nMまで3倍ステップで滴定した。hIL-17Aの標準曲線（6.2〜0.0001 nM）を準備するとともに、0.9 nM hIL-17A含有培地を含むか培地だけを含む対照を準備した。
結果
CD分析：His6タグを有するIL-17A結合Z変異体で求めたCDスペクトルから、それぞれが、20℃でαヘリックス構造を有することがわかった。融点（Tm）を求める可変温度測定の結果を表10に示す。90℃まで加熱する前と後に測定したスペクトルを重ねると、すべてのIL-17A結合Z変異体で可逆的折り畳みが見られた。
ELISAによるIL-17A結合能力の分析：ELISAアッセイにおいて、第1成熟ラウンドと第2成熟ラウンドからの精製したHis6タグ付きZ変異体分子について、IL-17Aに対する結合能力をスクリーニングした。結果を、変異体Z10241と比べた％結合能力として、図3に示してある。
Biacore速度論的分析： 28種類のHis6タグ付きIL-17A結合Z変異体とhIL-17Aの間の相互作用を、固定化されたIL-17Aを含む表面にさまざまな濃度のZ変異体を注入することによってBIacore装置で分析した。1：1相互作用モデルを用いたときのhIL-17Aに対するZ変異体の結合に関する速度論的定数（KD、ka（kon）、kd（koff））のまとめを表11に与える。
Figure 2021073174
Biacore結合特異性分析：3種類のHis6タグ付きZ変異体（Z10508、Z10532、Z15167）のhIL-17A、hIL-17F、hIL-17A/Fに対する結合を、それらZ変異体を、それらIL-17変異体を含む表面に注入することによってBiacore装置で分析した。表面へのリガンド固定化のレベルは、IL-17A、IL-17F、IL-17A/Fについて、それぞれ657 RU、977 RU、770 RUであった。調べたすべてのZ変異体がヒトIL-17Aへの結合と、IL-17A/Fへのより弱い結合を示したのに対し、IL-17Fへの結合は検出できなかった。得られた曲線（ブランク表面からの応答を差し引いてある）を図4に示す。Z15167が、ヒトIL-17Aへの最速会合曲線を示した
NHDFアッセイにおける、IL-17Aが誘導するIL-6の産生の阻止：NHDFアッセイにおいて、第1成熟ラウンドと第2成熟ラウンドからの精製したHis6タグ付きZ変異体について、IL-17Aが誘導するIL-6の産生を阻止する能力をスクリーニングした。NHDFアッセイの結果から、調べたすべての成熟Z変異体が、一次Z変異体His6-Z06282と比べて増大したIL-17A特異的阻止能力を有することがわかった。第1の成熟ライブラリから選択されたZ変異体の典型的な阻止プロファイルのグラフを図5に示す。分析したすべてのZ変異体について計算したIC50値を表12に示す。
Figure 2021073174
Figure 2021073174
IL-17A結合Z-ABD-Zポリペプチドの作製
IL-17Aは、受容体結合部位が2つあるホモ二量体サイトカインである。本開示のIL-17A結合Z-ABD-Zポリペプチドの2つの部分を含むポリペプチドは、そのような部分を1つ含むポリペプチドよりもIL-17Aをより効果的に阻止すると考えられていた。この実施例では、アルブミン結合ドメイン変異体PP013（配列番号1224）と融合した2つのZ変異体を含むポリペプチド（一般式はZ-[L1]-ABD-[L2]-Zであり、[L1]と[L2]は、Z部分とABD部分を隔てるリンカーである）のサブクローニングと作製の一般的手続きを記述する。
材料と方法
[L1]リンカーと[L2] リンカーの長さが異なるZ-[L1]-ABD-[L2]-Zポリペプチドのサブクローニング：Z06282（配列番号1206）、Z10241（配列番号11）、Z10532（配列番号1）のDNAを、PCRにより、Pfu Turbo DNAポリメラーゼ（Agilent Technologies社、カタログ番号600254）と適切なプライマー対を用いてライブラリベクターpAY02592から増幅した。その後の3つのクローニング工程においてT4 DNAリガーゼ（Fermentas社、カタログ番号EL0011）を用い、各部分をコードしているDNAを発現ベクターpET26b(+)（Novagen社、マディソン、ウィスコンシン州）に連結することにより、Z-[L1]-ABD-[L2]-Zコンストラクトを生成させた。ハイブリダイズしたリンカーをコードしていて、反復数の異なる(GGGGS)nを持ち、制限酵素部位が隣接したDNAにより、それら3つの部分をコードしているDNAを分離した。発現ベクターによってコードされるコンストラクトは、Z#####-[GAP-(G4S)n-TS]-PP013-[GT-(G4S)n-PR]-Z#####であった。ただしそれぞれのnは、個別に1〜4である。それ以外の具体的なことは表13に示してある。
Figure 2021073174
最小[L1]リンカーを有するZ-[L1]-ABD-[L2]-Z ポリペプチドのサブクローニング：Z06282（配列番号1206）を含むが最小リンカー[L1]を有する追加の二量体Z変異体をコードしているDNAを、標準的な分子生物学の技術を利用して生成させた。発現ベクターによってコードされるコンストラクトはZ06282-VDGS-PP013-GT-(G4S)n-PR-Z06282であった。それ以外の具体的なことは表14に示してある。
Z12876（配列番号1218）、Z14253（配列番号1219）、Z14254（配列番号1220）、Z14255（配列番号1221）（それぞれ、Z10241（配列番号11）、Z10532（配列番号1）、Z10508（配列番号2）、Z10863（配列番号3）に対応するが、アミノ酸残基VDではなくAEで始まっている）をコードしている遺伝子を、PCRにより、Pfu Turbo DNAポリメラーゼと適切なプライマー対を用いて増幅した。その後の3つのクローニング工程でT4 DNAリガーゼを用いて各フラグメントを発現ベクターpET26b(+)に連結することにより、Z-[L1]-ABD-[L2]-Zコンストラクトを生成させた。標準的な分子生物学の技術を利用し、3つの部分をコードしているDNAを、部位特異的突然変異誘発によりさらに改変したリンカーによって分離した。発現ベクターによってコードされるコンストラクトは、Z####-[VDGS]-PP013-[GT-G4S-PK]-Z####とZ#####-[ASGS]-PP013-[GT-G4S]-Z#####であった。それ以外の具体的なことは表14に示してある。
Figure 2021073174
培養：それぞれのZ-ABD-Zポリペプチドの遺伝子フラグメントを含むプラスミドを用いて大腸菌BL21（DE3）細胞（Novagen社）を形質転換し、50μg/mlカナマイシンを補足した800 mlまたは1000 mlのTSB-YE培地の中で37℃にて培養した。タンパク質の発現を誘導するため、IPTGを添加してOD600＝2での最終濃度を0.2 mMにし、培地を37℃でさらに5時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収した。
IL-17A結合Z-ABD-Zポリペプチドの精製：細胞ペレットを、Benzonase（登録商標）（Merck社）を補足したTST緩衝液（25 mMトリス-HCl、1 mM EDTA、200 mM NaCl、0.05％トゥイーン20、pH 8.0）の中に再度懸濁させた。超音波処理によって細胞を破壊し、遠心分離によって破片を除去した後、各上清を、アガロースが装填されていて抗ABDリガンド（自家製）が固定化されたカラムに適用した。TST緩衝液と5 mM NH4Ac pH 5.5緩衝液で洗浄した後、Z-ABD-Zポリペプチドを0.1 M HAcで溶離させた。溶離した分画にアセトニトリル（ACN）を添加して最終濃度を10％にし、サンプルを、RPC溶媒A（0.1％TFA、10％ACN、90％水）であらかじめ平衡させたSOURCE 15RPCカラム（GE Healthcare社）に装填した。RPC溶媒Aでカラムを洗浄した後、結合したタンパク質を、RPC溶媒AからRPC溶媒Bへの線形勾配（0.1％TFA、80％ACN、20％水）で溶離させた。純粋なZ-ABD-Zポリペプチドを含む分画をSDS-PAGE分析によって同定してプールした。RPC精製の後、Sephadex G-25カラム（GE Healthcare社）を用いてプールの緩衝液をPBS（2.68 mM KCl、137 mM NaCl、1.47 mM KH2PO4、8.1 mM Na2HPO4、pH 7.4）と交換した。最後に、Z-ABD-Z変異体をEndoTrap（登録商標）赤カラム（Hyglos社）で精製し、内毒素の含量が少なくなるようにした。
NanoDrop（登録商標）ND-1000分光測光器を用いて280 nmでの吸光度を測定し、各タンパク質の消光係数を測定することによってタンパク質濃度を求めた。クーマシーブルーで染色したSDS-PAGEによって純度を分析し、精製した各Z変異体が何であるかをHPLC-MS分析を利用して確認した。
結果
培養と精製：ABDが融合したIL-17A結合Z変異体を可溶性遺伝子産物として大腸菌の中で発現させた。最終的な各タンパク質調製物のSDS-PAGE分析から、これらが望むIL-17A結合Z変異体を優勢に含んでいることがわかった。各Z-ABD-Zポリペプチドが正確には何であるかとその分子量は、HPLC-MS分析によって確認した。
Z-ABD-Zポリペプチドの溶解度
限外濾過を利用したサンプルの連続的濃縮によって生理緩衝液中の3種類のZ-ABD-Zポリペプチドの溶解度を調べた後、280 nmで吸光度を読み取ることによる濃度測定とサンプルの目視を実施した。
材料と方法
Z-ABD-ZポリペプチドであるZAZ3363（配列番号1244）、ZAZ3364（配列番号1245）、ZAZ3422（配列番号1247）をPBS、pH 7.4の中で2.5 mg/mlに希釈した。揺動バケットロータ遠心分離装置で4000 gにて10分間遠心分離することにより、3 kDa にカットオフがある12個のAmicon Ultra遠心分離フィルタユニット（Millipore社、カタログ番号UFC800324）をPBSであらかじめすすいだ。濃縮装置を空にし、4 mlの各Z-ABD-Zポリペプチドを3つの異なる遠心分離フィルタユニットからなる第1のセットに添加した。遠心分離を20℃にて4000 gで13〜16分間実施すると、約1 mlの濃縮液が得られた。20μlのサンプルを各濃縮液（UFサンプル1）から取り出してさらに分析し、そのサンプルの残った体積を、3つの遠心分離フィルタユニットからなる第2のセットに移した。遠心分離とサンプルの取り出しを、回転時間をそれぞれ8〜10分間、7分間、13分間にして3回繰り返した（UFサンプル2、3、4のそれぞれについて）。UFサンプル1〜4をそれぞれ3、6、12、24回希釈し、NanoDrop（登録商標）ND-1000分光測光器を用いて吸光度を読み取った。理論上の消光係数1 Abs280＝0.612 mg/ml（3つのZ-ABD-Zポリペプチドすべてで同じ）を用いて濃度を計算した。希釈していない濾液の吸光度の読み取りも実施した。
結果
各遠心分離工程の後に280 nmで吸光度を読み取ることによって求めた濃度を表15に示す。濃縮液の目視で凝集体は検出されなかった。そこでZAZ3363、ZAZ3364、ZAZ3422の溶解度は、PBS、pH 7.4の中で少なくとも60 mg/mlであることが明確になった。希釈していない濾液の吸光度の読み取り値から、濃度は0 mg/mlに非常に近いことがわかった。
Figure 2021073174
Biacore結合種交差分析
材料と方法
Z-ABD-ZポリペプチドZAZ3363（配列番号1244）、ZAZ3364（配列番号1245）、ZAZ3365（配列番号1246）と、hIL-17A、カニクイザルIL-17A（cIL-17A、配列番号1229；Evitria社、特注）との間の相互作用と、ZAZ3220（配列番号1236）と、hIL-17A、アカゲザルIL-17A（rmIL-17A、配列番号1230；Cusabio社、カタログ番号 CSB-EP011597MOV）との間の相互作用をBiacore 2000で分析した。HSAをCM5チップ表面のカルボキシル化デキストラン層上のフローセル内に固定化した。固定化は、アミンカップリング化学を製造者のプロトコルに従って利用するとともに、HBS-EPをランニング緩衝液として使用して実施した。表面へのHSA固定化のレベルは、それぞれ953 RU（ZAZ3363、ZAZ3364、ZAZ3365のために使用）と493 RU（ZAZ3220のために使用）であった。ブランクとして使用するため、分析物の注入中にチップ上の1つのフローセル表面の活性化と脱活性化を行なった。この結合実験では、HBS-EPをランニング緩衝液として使用し、流速は30μl/mlであった。ZAZ3363、ZAZ3364、ZAZ3365をHBS-EPランニング緩衝液の中で希釈して最終濃度を200 nMにし、5分間かけて注入した後、IL-17A変異体を注入した。ZAZ3220をHBS-EPランニング緩衝液の中で希釈して最終濃度を500 nMにし、4分間かけて注入した後、IL-17A変異体を注入した。hIL-17AとcIL-17AのそれぞれをHBS-EPランニング緩衝液の中で希釈して最終濃度を2.5、10、40 nMにし、HSAに捕獲されたZAZ3363、ZAZ3364、ZAZ3365を有する表面に5分間かけて注入した。10分間解離させた後、10 mM HClを2回注入して表面を再生させた。hIL-17AとrmIL-17AをHBS-EPランニング緩衝液の中で希釈して最終濃度を、それぞれ、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 nMと、2.7、8.1、24.3、72、216 nMにし、HSAに捕獲されたZAZ3220を有する表面に6分間かけて注入した。5分間解離させた後、10 mM HClを2回注入して表面を再生させた。BiaEvaluationソフトウエアを用いて結果を分析した。
結果
hIL-17AとcIL-17AのZAZ3363、ZAZ3364、ZAZ3365に対する結合と、hIL-17AとrmIL-17AのZAZ3220に対する結合を、Z-ABD-ZポリペプチドをHSA含有表面に注入してからIL-17A変異体を注入することにより、Biacore装置で調べた。調べたすべてのZ変異体が、調べたIL-17A変異体に結合すること、すなわちZAZ3363、ZAZ3364、ZAZ3365がヒトとカニクイザルのIL-17Aに結合すること（図6）と、ZAZ3220がヒトとアカゲザルのIL-17Aに結合することがわかった。
Biacore結合特異性分析
この実施例では、2種類のZ-ABD-Zポリペプチドの特異性を、IL-17Aファミリーの一群のタンパク質と相互作用する可能性、他のインターロイキンと相互作用する可能性、他の豊富な血漿タンパク質と相互作用する可能性を分析することによって調べた。分析タンパク質の同じ集合について、ABD変異体PEP07843と相互作用する可能性も分析した。
材料と方法
ZAZ3363（配列番号1244）またはZAZ3422（配列番号1247）と、それぞれ24種類または12種類の異なるタンパク質の集合（表16に具体的に提示）との相互作用をBiacore 2000装置で分析した。HSAとABD変異体PEP07843（配列番号1225、N末端にGSS延長部を有するPP013（配列番号1224）に対応）をCM5チップ表面に固定化し、ブランク表面を実施例11に記載したようにして準備した。表面へのリガンド固定化のレベルは、ZAZ3363のランで使用したチップでは、HSAとPEP07843それぞれについて1315 RUと99 RUであり、ZAZ3422のランで使用したチップでは、HSAとPEP07843それぞれについて791 RUと100 RUであった。この結合実験では、HBS-EPをランニング緩衝液として使用し、流速は30μl/mlであった。ZAZ3363とZAZ3422をHBS-EPの中で、または500 mM NaClを補足したHBS-EPの中で希釈して最終濃度を200 nMにし、7分間かけて注入した後、分析物を注入した。分析物、すなわち24種類または12種類の異なるタンパク質の集合のそれぞれをHBS-EPの中で、または500 mM NaClを補足したHBS-EPの中で希釈して最終濃度を0.4〜250 nMにし、5分間かけて注入した。7分間（ZAZ3363）または10分間（ZAZ3422）解離させた後、10 mM NaOHを4回（ZAZ3363）または5回（ZAZ3422）注入し、次いで10 mM HClを2回注入して表面を再生させた。BiaEvaluationソフトウエアを用いて結果を分析した。
Figure 2021073174
結果
ZAZ3363とZAZ3422の特異性を、それぞれ24種類または12種類の分析タンパク質との相互作用をBiacore装置で調べることによって検証した。Z-ABD-ZポリペプチドをHSA含有表面に注入した後、分析タンパク質を注入した。ZAZ3363とZAZ3422で検出された相互作用だけが、hIL-17Aによる強い結合と、hIL-17A/Fによるより弱い結合であった。これは予想通りであり、実施例8に示した結果と一致している。分析タンパク質についてABD変異体PEP07843と相互作用する可能性も調べたが、相互作用は検出されなかった。したがってZ-ABD-Zポリペプチドは非常に特異的であるように見える。
KinExA（登録商標）を用いた、Z-ABD-ZとIL-17AとHSAの複合体の速度論的測定
高親和性相互作用の速度論的パラメータを正確に求める上でSPRには技術的制約があり、2つの二量体標的間の親和性をSPRによって求めるのは非常に複雑な作業であるため、HSAとの複合体になったZ-ABD-ZポリペプチドのIL-17Aに対する結合と、Z-ABD-ZポリペプチドだけのHSAに対する結合と、IL-17Aとの複合体になったZ-ABD-ZポリペプチドのHSAに対する結合をさらに分析するのに結合平衡除外アッセイ（KinExA（登録商標））技術を利用するのが適切であった。KinExA（登録商標）では、溶液相の中の改変されていない分子間の平衡結合親和性と反応速度を測定する（DarlingとBrault、2004年、Assay and Drug Dev Tech 第2巻(6)：647〜657ページ）。
材料と方法
Z-ABD-ZポリペプチドであるZAZ3220（配列番号1236）、ZAZ3363（配列番号1244）、ZAZ3422（配列番号1247）のほか、HSA（Novozymes社、カタログ番号230-005）、ヒトIL-17A（Peprotech社、カタログ番号200-17）、（実施例1に記載したようにして）ビオチニル化したヒトIL-17A、マウスモノクローナル抗HSA抗体（Abcam社、カタログ番号10241）、自家製のヤギポリクローナル抗Z抗体をSapidyne Instruments社（ボイシ、アイダホ州、アメリカ合衆国）に送り、KinExA（登録商標）測定と分析を実施してもらった。
HSAに対するZ-ABD-Z/IL-17Aの結合：親和性、すなわちKDを求めるため、HSAとの複合体になった各Z-ABD-Zポリペプチドを定常結合パートナー（CBP）として用い、IL-17Aを滴定剤として用いた。KinExA（登録商標）Proソフトウエアを用いてデータ分析を実施し、1：1可逆的二分子相互作用を表わす曲線にKDと活性結合部位濃度（ABC）関する最適解をフィットさせるために最小自乗分析を適用した。
kaを求めるため、平衡実験では、速度論的実験のための捕獲剤と同じ固定化されたIL-17Aを用い、直接結合曲線分析を適用した。サンプル中の遊離したZ-ABD-Z/HSAの量を平衡前に測定すると、サンプルが平衡に向かうにつれて遊離したZ-ABD-Z/HSAが減少することを示すデータ点が得られた。
HSAに対するZ-ABD-ZとZ-ABD-Z/IL-17Aの結合：Z-ABD-ZポリペプチドZAZ3363のHSAに対する結合をIL-17Aの存在下または不在下でさらに分析した。KDを求めるため、遊離しているZAZ3363、またはIL-17Aとの複合体になったZAZ3363を定常結合パートナー（CBP）として用い、HSAを滴定剤として用いた。上述のようにKinExA（登録商標）Proソフトウエアを用いてデータ分析を実施した。
kaを求めるため、平衡実験では、速度論的実験のための捕獲剤と同じ固定化されたIL-17Aを用い、直接結合曲線分析を適用した。サンプル中のZAZ3363/IL-17Aの量を平衡前に測定すると、サンプルが平衡に向かうにつれてZAZ3363/IL-17Aが減少することを示すデータ点が得られた。
結果
最初の一群のKinExA（登録商標）測定では、HSAとの複合体になったそれぞれのZ-ABD-ZポリペプチドZAZ3220、ZAZ3363、ZAZ3422は、例外的に大きな親和性でIL-17Aに結合し、KD値はピコモル未満からフェムトモルの範囲であることがわかった。これらのZ-ABD-Zポリペプチドと二量体IL-17Aの間に1価の結合を仮定して計算で求めた速度論的パラメータを表17に示す。
第2の一群のKinExA（登録商標）測定では、遊離しているZAZ3363またはIL-17Aとの複合体になったZAZ3363とHSAの間の相互作用を測定した。これらの分析から計算された速度論的パラメータを表18に示す。HSAに対するZAZ3363の親和性は、IL-17Aの存在によって大きな影響を受けることはなかった。
まとめると、KinExA（登録商標）技術を利用した測定結果は、Z-ABD-ZポリペプチドがIL-17Aに対して例外的に大きな親和性を持つことを示していた。0.33 pM未満というKDの測定値は、臨床的に最も進んでいる2つの比較対象であるセクキヌマブ（KD＝122 pM；WO2006/013107とWO2012/125680）とイキセキズマブ（KD＝2 pM；WO2007/070750）で報告されている親和性よりも優れている。それに加え、IL-17Aとアルブミンの両方に同時に結合することが示された。すなわち、両者の結合機能は、Z-ABD-Z融合タンパク質で損なわれていない。
Figure 2021073174
Figure 2021073174
NHDFアッセイにおけるZ-ABD-Zポリペプチドの特徴づけ
材料と方法
NHDFアッセイにおける、IL-17Aが誘導するIL-6産生の阻止：NHDF細胞（Lonza社、カタログ番号CC-2511）を、増殖促進因子（Lonza社、カタログ番号CC-5034）を供給した線維芽細胞基本培地（Lonza社、カタログ番号CC-3132）の中で培養した。実験の前日、ウエル1つにつき5000個の細胞をハーフエリア96ウエル培養プレートの100μlの中に播種した。実験当日、Z部分とABD部分の間の長さが異なるリンカーを有するIL-17A特異的Z-ABD-Zポリペプチド（ZAZ3174（配列番号1233）、ZAZ3175（配列番号1234）、ZAZ3176（配列番号1235）、ZAZ3220（配列番号1236）、ZAZ3221（配列番号1237）、ZAZ3234（配列番号1238）、ZAZ3235（配列番号1239）、ZAZ3236（配列番号1240）、ZAZ3237 （配列番号1241）、ZAZ3269（配列番号1242）、ZAZ3270（配列番号1243））の希釈液を別の96ウエルのプレートに調製した。これらZ-ABD-Zポリペプチドを、0.9 nM hIL-17Aと8μM HSAを含む培地の中で190 nMから0.003 nMまで3倍ステップで滴定した。標準IL-17A曲線（6.2〜0.0001 nM）と、0.9 nM hIL-17A含有培地か培地だけを含む対照も準備した。一晩培養したNHDF細胞を含むプレート内の培地を廃棄し、100μl/ウエルのサンプルを細胞プレートに移し、37℃のインキュベータ内に18〜24時間入れておいた。翌日、上清中のIL-6の含量を、実施例3に記載したようにしてIL-6特異的ELISAを利用して定量した。追加のZ-ABD-Zポリペプチド（ZAZ3363（配列番号1244）、ZAZ3364（配列番号1245）、ZAZ3365（配列番号1246）、ZAZ3422（配列番号1247））をその後のNHDFアッセイで本質的に上述のようにして分析したが、そのときATCCからのNHDF細胞系（カタログ番号PSC-201-012）を用いた。これらZ-ABD-Zポリペプチドを40℃で2〜4週間インキュベートした後の阻止能力も分析した。
結果
IL-17Aが誘導するIL-6産生をZ-ABD-Zポリペプチドが阻止する能力をNHDFアッセイで調べた。第1に、His6-Z10241とZAZ3220（Z10241を含む）の抑制曲線を表示した図7Aに示されているように、Z-ABD-Z形態は、モノマーHis6-Z形態と比べて阻止能力を顕著に増大させることがわかった。ZAZ3220の曲線の形が示唆しているのは、ZAZ3220の一対一抑制効果でこの細胞アッセイの検出限界に到達しているため、Z-ABD-Zポリペプチドは、この実験から評価できるよりもはるかに大きな抑制効果を有するらしいことである。ホモ二量体IL-17Aに結合することによって得られる強い親和効果が原因で、ZAZ3220の力価がアッセイの限界まで増大したと考えられる。第2に、異なる長さのリンカーを有するZ-ABD-ZポリペプチドでZ変異体Z06282（配列番号1206）とZ12876（配列番号1218）を含んでいるものの比較から、リンカーの長さは阻止能力にわずかな効果しか持たないことが明らかになった。異なる長さのリンカーを有する一群のZ06282含有Z-ABD-Zポリペプチドを図7Bに示してある。その後のNHDFアッセイで追加のZ-ABD-ZポリペプチドZAZ3363、ZAZ3364、ZAZ3365、ZAZ3422を分析し、それらZ-ABD-Zポリペプチドを40℃で2〜4週間インキュベートした後にも分析した。IL-17A抑制能力は、40℃で4週間インキュベートした後でさえ保持された。さまざまなZ-ABD-ZポリペプチドがIL-17Aを抑制する能力を反映しているIC50の計算値を表19にまとめてある。これらのIC50値は、現在臨床開発中のIL-17A抑制モノクローナル抗体であるセクキヌマブAIN457（WO2006/013107とWO2012/125680）で報告されているhIL-6産生無効化活性（IC50＝2.1±0.1 nM）の1/3未満である。
Figure 2021073174
hIL-17Aの生体内無効化
ヒトIL-17Aは、マウスIL-17A受容体に結合することと、マウスIL-17A受容体を刺激することができるため、マウスKC（CXCL1）ケモカインの上昇とその後の分泌につながる。
材料と方法
KCマウスモデルにおけるhIL-17Aの生体内無効化：用量を変化させる実験を実施し、ヒトIL-17AがマウスKCを誘導する最適用量を明らかにした。これらの実験から、150μg/kgの用量のヒトIL-17Aが、IL-17Aを投与してから2時間後に回収したマウス血清に適切なレベルのKCを誘導することが明らかになった。ZAZ3174（配列番号1233）と ZAZ3220（配列番号1236）をこのモデルで2つの異なる場合について分析した。第1の実験では、ヒトIL-17A を皮下注射する9時間前に、ZAZ3174を3通りの異なる用量0.25、2.5、25 mg/kgでマウスに皮下投与した。ヒトIL-17Aを投与してから2時間後にマウスを安楽死させ、市販のキット（KC Quantikine; R&D Systems社、カタログ番号D1700）を製造者の指示に従って使用してKCレベルをELISAによって求めた。第2の実験では、ヒトIL-17A を皮下注射する9時間前に、ZAZ3220を3通りの異なる用量0.05、0.1、0.4 mg/kgでマウスに皮下投与した。ヒトIL-17Aを投与してから2時間後にマウスを安楽死させ、KCレベルを上述のようにELISAによって求めた。
結果
KCマウスモデルにおけるhIL-17Aの生体内無効化：調べたZ-ABD-Zポリペプチドは、ヒトIL-17AがマウスIL-17受容体を刺激する能力を阻止するため、用量に依存してマウスKCの上昇を抑制することにつながる。上記の条件下での用量2.5 mg/kgのZAZ3174は、図8Aに示されているように、KCの誘導を完全に阻止した。第2の実験から、親和性成熟Z変異体を含むZ-ABD-ZポリペプチドZAZ3220が、IL-17Aによって誘導されるKC応答を用量0.4 mg/kgで完全に阻止することが明らかになった（図8B）。これは、ZAZ3174と比べて生体内阻止効果が6倍増大していることに対応する。0.1 mg/kgのZAZ3220で72％抑制が得られた。
ラットにおけるZ-ABD-Zポリペプチドの生体内薬物動態
この実施例では、2つの異なるZ-ABD-Zポリペプチドをラットに皮下注射（s.c）および／または静脈内（i.v）注射した後の薬物動態パラメータを求めた2つの別々の実験について記述する。
材料と方法
第1の実験では、PBSの中で製剤化したZAZ3220（配列番号1236）を、57ナノモル/kgに対応する1.2 mg/kgの用量でスプラーグ・ドーリー（SD）雄ラット（Charles River、ドイツ国）に静脈内投与した（n＝3）。投与後0.08時間、8時間、24時間、48時間、72時間、120時間、168時間、240時間、336時間、408時間、504時間の時点で、血液サンプルを各ラットの尾の静脈から回収した。
第2の実験では、PBSの中で製剤化したZAZ3363（配列番号1244）を、64ナノモル/kgに対応する1.2 mg/kgの用量で、SD雄ラットに静脈内投与する（n＝5）か、皮下投与した（n＝6）。静脈内投与後0時間、0.08時間、0.5時間、1時間、3時間、8時間、24時間、72時間、120時間、168時間、216時間、264時間、336時間、408時間、456時間、504時間の時点で、または皮下投与後0時間、0.08時間、0.5時間、1時間、3時間、8時間、24時間、72時間、120時間、168時間の時点で、血液サンプルを各ラットの尾の静脈から回収した。
血液サンプルから血清を調製し、分析するまで-20℃で保管した。ラットからの血清中のZAZ3220とZAZ3363の定量を、PK-ELISAを利用して実施した。
PK-ELISA：96ウエルのハーフエリアプレート（50μl/ウエル）を、4℃にて、被覆用緩衝液（Sigma社、カタログ番号C3041）中の4μg/ウエルのヤギ抗Z Ig（自家製）で一晩被覆した。翌日、プレートをPBS＋0.5％カゼインで1.5時間ブロックした。PBS-カゼイン＋10％ラット血清プール（アッセイマトリックス）の中で最小限の10倍に希釈した個別のラット血清をプレートに添加し、2倍希釈系列で滴定した。1つのプレートには、（300 ng/mlと3 pg/mlの間で滴定した）各Z-ABD-Zポリペプチドの標準が含まれ、各プレートには、アッセイの線形範囲内の濃度に希釈した各Z-ABD-Zポリペプチドの4つの対照が含まれる。標準と対照をアッセイマトリックスの中で希釈した。希釈した標準、対照、サンプルを別のプレートに調製し、被覆したELISAプレートに移した。プレートを室温で1.5時間インキュベートした後、特注の検出用抗ウサギABD Ig（4μg/ml、CUV002）とともに1.5時間インキュベートし、ロバ抗ウサギIgG-HRP（Jackson Immunoresearch社、カタログ番号711-035-152）とともに1時間インキュベートした。反応物をTMB（Thermo Fisher社）で現像し、15分後に2 M H2SO4を用いて現像反応を停止させた。450 nmでの吸光度をELISAリーダー（Victor3、Perkin Elmer社）で読み取った。サンプル中の各Z-ABD-Z変異体の濃度を標準曲線からGraphPad Prism5と4パラメータロジスティック（4-PL）曲線フィットを利用して計算した。
薬物動態分析：薬物動態分析は、個別のラット血清濃度と時間の関係に基づいていた。最終半減期（T1/2）と生物学的利用能は、Microsoft ExcelとGraphPad Prismを利用し、2コンパートメントモデルを適用して推定した。
結果
Z-ABD-ZポリペプチドZAZ3220とZAZ3363を1.2 mg/kgの用量でSDラットに1回投与した後の平均血清濃度-時間プロファイルをそれぞれ図9Aと図9Bに示す。2コンパートメント分析を利用して計算した薬物動態パラメータを表20にまとめてある。推定される半減期（t1/2）は、ZAZ3220とZAZ3363の両方とも静脈内投与の後に約49時間であった。皮下投与したZAZ3363のt1/2は45時間であり、生物学的利用能は45％と計算された。
Figure 2021073174
ウサギの目へのZ変異体の局所投与
目への局所投与は、眼科疾患、例えばぶどう膜炎、ドライアイ疾患において有利である。局所投与により、薬の極度に大きな局所濃度が可能になり、全身性副作用のリスクが最小になる。この実施例では、Z変異体分子を目に局所的に投与する可能性をウサギで調べた。Z変異体分子と対照IgGの濃度は、繰り返して局所投与した後に、前室（眼房水）と、硝子体液と、血清で測定した。
材料と方法
Z変異体の作製：Z06282（配列番号1206）由来のAEから出発したZ変異体Z10199（配列番号1217）を、タグなしだがC末端にアミン酸残基VDを付加してサブクローニングした。発現を本質的に実施例2に記載したようにして実施し、精製をアニオン交換と逆相クロマトグラフィによって行なった。サンプルの緩衝液をPBS pH 7.2に交換し、EndoTrap（登録商標）赤10カラム（(Hyglos社）を用いて内毒素を除去した。
動物研究：48ナノモル（1滴、50μl）のZ10199とZAZ3174（配列番号1233）のそれぞれを0時間、1時間、2時間、3時間の時点でウサギ（各分子についてn＝2）のそれぞれの目に局所投与した。対照であるヒトIgG抗体（Xolair；Novartis社）を同様に2羽の異なるウサギに投与した。陰性対照として、1羽のウサギにPBSだけを投与した。各投与後、まぶたを約30秒間閉じた状態にしてサンプルを角膜上に維持した。4時間後、硝子体液、眼房水、血清を回収した。サンプルを遠心分離して組織のゴミと凝集体を除去し、Z10199、ZAZ3174、抗体それぞれのレベルをELISAによって定量した。
ELISAによる定量：自家製のポリクローナルヤギ抗タンパク質Z免疫グロブリンを捕獲用に使い、自家製のポリクローナルウサギ抗タンパク質Z免疫グロブリンを一次抗体として用い、ヤギ抗ウサギIgG-HRP（Dako社、カタログ番号P0448）を二次抗体として用い、回収したサンプル中のZ10199とZAZ3174それぞれの濃度をサンドイッチELISAによって分析した。ImmunoPure TMBとともに室温で15分間インキュベートすることによって検出を行ない、2 M H2SO4を添加して反応を停止させた。マイクロプレートリーダーVictor3で450 nmにおける吸収を測定した。同じ分子について用意した標準曲線から、GraphPad prism5と非線形回帰公式を用いてZ10199の濃度を計算した。
回収したサンプル中のIgGの濃度をIgG ELISAキット（Abcam 100547）によって分析し、製造者が記載しているようにして、提供された標準曲線を用いて非線形回帰により分析を行なった。
結果
図10は、Z10199とZAZ3174の両方が局所投与後に目に浸透したことを示しており、眼房水と硝子体液に小さなnM濃度で存在していた。逆に、対照IgG抗体は、眼房水と硝子体液のどちらにも検出されなかった。血清サンプルは、Z変異体とIgGの両方に対して陰性であると見なすことができた。したがって本開示のZ変異体分子は、抗体が利用できないこの別の投与経路によって送達できるため、局所効果を実現して全身曝露を回避することができる。
ラットの十二指腸に投与したZAZ3363製剤の薬物動態分析
材料と方法
試験項目：ZAZ3363（配列番号1244）を、1）OAF1：0.12 Mケノデオキシコール酸ナトリウム（Sigma社、カタログ番号C8261）と0.12 M没食子酸プロピル（Sigma社、カタログ番号P3130）、pH 7.4；または2）OAF2：50 mg/mlカプリン酸ナトリウム（Sigma社、カタログ番号C4151）；または3）OAF3：50 mMリン酸ナトリウム（PBS）、pH 7.0の中で、50 mg/ml（OAF1とOAF2）または100 mg/ml（PBS）の濃度に製剤化した。
NHDF細胞アッセイ：OAF1、OAF2、PBSいずれかの中で製剤化されたZAZ3363（配列番号1244）の活性を、実施例14に記載したIL-17依存NHDF細胞アッセイで確認した。
十二指腸投与：雄スプラーグ・ドーリーラット（Charles River）をイソフルオランで麻酔し、小さな切れ目を作って十二指腸の位置を特定した。留置カテーテル（R-DUOD、AgnTho’s社、スウェーデン国）を外科的に十二指腸の始点から20 mmの最少血管領域に挿入した。このカテーテルをラットの皮下で背中まで到達させた。腹部筋肉を縫合して閉じた一方で、腹部皮膚の切り込みと肩甲骨下露出部位は、ステンレス鋼製の傷クリップで閉じた。ラットを回復させるため5〜6日間放置した後に研究を開始した。外科手術前に手術後鎮痛剤を皮下投与した（カルプロフェンを5 mg/kgとブプレノルフィンを0.05 mg/kg）。カルプロフェンは、手術後の2日間も毎日1回投与した。必要なときにはブプレノルフィンの追加用量を投与した。回復期間（3〜5日）中と実験中に抗生剤（エンロフロキサシン0.3 mg/ml）を飲料水に入れて投与した。エンロフロキサシンの苦みを隠すため、一片の砂糖を500 mlの飲料水に添加した。開通性を確実に維持するため、十二指腸カテーテルに殺菌水（0.2〜0.5 ml）を毎日流した。
ZAZ3363を、OAF1またはOAF2（n＝2）の中で製剤化し、体重1kgにつき5.4マイクロモルの用量で、またはPBS（n＝2）の中で製剤化して体重1kgにつき10.8マイクロモルの用量で、0.5 mlの体積にして時点ゼロに十二指腸に直接投与した。投与後1時間、3時間、8時間、24時間、72時間、120時間、168時間の時点で血液サンプルをイソフルオラン麻酔下にて採取し、血清を標準的な手続きによって調製した。血清中のZAZ3363の濃度は実施例16に記載した定量PK-ELISAによって測定したが、ZAZ3363の標準は70 ng/mlと1 ng/mlの間で滴定した。
薬物動態分析：薬物動態分析は、個別のラットの血清濃度と時間の関係に基づいていた。最終半減期（T1/2）と生物学的利用能は、Microsoft ExcelとGraphPad Prismを利用し、2コンパートメントモデルを適用して推定した。
結果
NHDF細胞アッセイにおいて、製剤化したZAZ3363の活性：それぞれOAF1とOAF2の中で製剤化したZAZ3363の活性を、PBS中の製剤と比較した。図11は、PBSで製剤化したZAZ3363と比較したOAF1の滴定曲線（図11A）と、PBSで製剤化したZAZ3363と比較したOAF2の滴定曲線（図11B）を示している。この実験から、2つの製剤中のZAZ3363の活性はPBSと同じであること、すなわちZAZ3363の活性は賦形剤の違いの影響を受けなかったことがわかった。
十二指腸内へのZAZ3363の取り込み：OAF1、OAF2、PBSで製剤化したZAZ3363の取り込みを十二指腸内投与（i.d）のラットモデルで調べた。この実験から、PBSと比べてOAF1製剤とOAF2製剤では取り込みが増加することがわかった（図12）。生物学的利用能は、表21に示したように、OAF1、OAF2、PBSのそれぞれについて、0.2、0.8、0.0007であった。OAF2で製剤化したZAZ3363が最高の取り込みを示し、PBS中の製剤と比べて平均で1160倍優れていたが、大きな個体差が見られた。OAF1中のZAZ3363製剤は、PBS中の製剤よりも平均で260倍優れていた。
Figure 2021073174
NHDFアッセイにおける抗IL-17A／抗TNF複合体の特徴づけ
材料と方法
複合体と対照抗体の作製：IL-17AとTNFを標的とする2つの異なる複合体と、TNFに対する親和性を有する抗体を構成した。「Ada」と表記する抗体は、市販のモノクローナル抗体アダリムマブと同じCDR配列と特異性を有する抗体であり、この抗体を、重鎖（HC）と軽鎖（LC）の配列HCAda（配列番号1231）とLCAda（配列番号1232）を用いて構成した。IL-17A標的Z変異体Z14253（配列番号1219）部分を、遺伝子操作により、可撓性のある15残基(GGGGS)3リンカーを通じてHCAdaまたはLCAdaのC末端に融合すると、複合体HCAda-Z14253とLCAda-Z14253がそれぞれ得られた。構成した複合体の模式図を図13Aに示す。遺伝子合成、クローニング、CHO細胞内での一過的遺伝子発現による産生、プロテインAアフィニティクロマトグラフィを利用した精製は、Evitria社（スイス国）が実施した。
NHDFアッセイにおける、IL-17Aによって誘導されるIL-6産生の阻止：NHDFアッセイを本質的に実施例14に記載してあるようにして実施し、研究サンプルHCAda-Z14253およびLCAda-Z14253とその比較対象を、0.9 nM rhIL-17A を含む培地中で63 nMから0.003 nMまで3倍ステップで滴定した。比較対象は、ZAZ3363（配列番号1244）と抗TNF抗体Adaのほか、実施例2に記載したように、VDSSリンカー（Z04726-PP013と表記）を介してABD変異体PP013（配列番号1224）に組み換えで融合した陰性対照であるZ変異体Z04726（配列番号1223；taqポリメラーゼを標的とする）であった。標準IL-17A曲線（6.2〜0.0001 nM）と、0.9 nM IL-17Aを含む培地か培地だけを含む対照も用意した。上清中のIL-6含量を実施例3に記載したIL-6特異的ELISAを利用して定量した。
NHDFアッセイにおける、IL-17Aによって誘導されるIL-8産生の阻止：NHDF（Lonza社、カタログ番号CC-2511）細胞を、増殖促進因子（Lonza社、カタログ番号CC-5034）を補足した線維芽細胞基本培地（Lonza社、カタログ番号CC-3132）の中で培養した。実験の前日、ハーフエリアの96ウエル培養プレート（Greiner社、カタログ番号675180）のウエル1つにつき5000個の細胞を100μl の中に播種した。実験当日、HCAda-Z14253とLCAda-Z14253の希釈液と上記の比較対象を別の96ウエルのプレートの中に調製した。上記の複合体と比較対象を、0.1 nM ヒトTNF（R&D Systems社、カタログ番号2210-TA/CF）を含むか0.05 nMと0.1 nM rhIL-17Aの混合物を含む培地の中で5 nMから0.0007 nMまで3倍ステップで滴定した。0.1 nM TNF含有培地を含む対照、または0.05 nMと0.1 nM rhIL-17Aの混合物含有培地を含む対照、または培地だけを含む対照も調製した。一晩培養したNHDF細胞を含むプレート内の培地を廃棄し、100μl/ウエルのサンプルを細胞プレートに移した。プレートを37℃のインキュベータの中に18〜24時間入れておいた。翌日、上清中のIL-8含量を、下記のIL-8特異的ELISAを利用して定量した。
IL-8 ELISA：IL-8をDuoSet ELISAキット（R&D systems社、カタログ番号DY208）によって定量した。ハーフエリアプレート（Costar社、カタログ番号3690）を、体積50μl/ウエルのPBS中で4μg/mlの濃度にした抗IL-8捕獲抗体で4℃にて一晩被覆した。分析の当日、プレートを水道水の中で2回すすいだ後、PBS＋2％BSAで2時間ブロックした。IL-8標準（R&D Systems社、カタログ番号890806）を2倍希釈系列（20〜0.01 ng/ml）の中で滴定したものと、細胞アッセイプレートからの上清を、被覆したELISAプレート（50μl/ウエル）に添加し、室温で1.5時間インキュベートした。プレートを自動化ELISA洗浄装置の中で4回洗浄し、20 ng/ml（50μl/ウエル）のビオチニル化抗IL-8検出抗体を添加した。さらに1時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、8000倍に希釈した50μlのストレプトアビジン-HRP（Thermo Fisher社、カタログ番号N100）を各ウエルに添加した。プレートをさらに1時間インキュベートして洗浄した後、ウエル1つにつき50μlのTMB（Thermo Fisher社、34021）を用いて現像し、50μlの2 M H2SO4を用いて反応を停止させた。プレートをマルチ標識リーダー（Victor3、Perkin Elmer社）で読み取った。
結果
NHDFアッセイにおける、IL-17Aによって誘導されるIL-6産生の阻止：2つの複合体HCAda-Z14253とLCAda-Z14253が、IL-17Aが誘導するIL-6の産生を阻止する能力をNHDFアッセイで調べた。NHDFアッセイの結果を図13Bに示す。HCAda-Z14253とLCAda-Z14253の両方とも、IL-17Aを阻止する能力はZAZ3363と似ている。予想通り、Adaまたは陰性対照Z04726-PP013では抑制は見られなかった。
NHDFアッセイにおける、IL-17Aによって誘導されるIL-8産生の阻止：2つの複合体HCAda-Z14253とLCAda-Z14253が、TNFまたはTNF/IL-17A混合物が誘導するIL-8の産生を阻止する能力をNHDFアッセイで調べた。NHDFアッセイの結果から、HCAda-Z14253とLCAda-Z14253は、特異的TNF阻止能力に関して抗TNF抗体Adaと似た抑制プロファイルを持つことがわかった（図13C）。しかしHCAda-Z14253とLCAda-Z14253は、TNFとIL-17の両方を阻止する効果を調べた組み合わせアッセイでは、AdaおよびZAZ3363と比べて優れた抑制プロファイルを持っていた（図13D）。
サルにおけるZ-ABD-Zポリペプチドの生体内薬物動態
この実施例では、Z-ABD-ZポリペプチドであるZAZ3363を投与したカニクイザルで10日間にわたって実施した反復投与研究を記述する。結果を用いてカニクイザルにおけるZAZ3363の半減期を推定した。
材料と方法
ZAZ3363（配列番号1244）を、1日目、4日目、7日目、10日目に短時間の静脈内輸液として20 mg/kg（n＝2；1匹の雄と1匹の雌）と40 mg/kg（n＝4；2匹の雄と2匹の雌）の用量で投与した。ZAZ3363の濃度を求めるための血漿サンプルを、1日目の最初の投与（時点0（投与前）、投与後5分間、0.5時間、1時間、2時間、6時間、24時間、48時間の時点）と、10日目の最後の投与（時点0（投与前）、投与後5分間、0.5時間、1時間、2時間、6時間、24時間、48時間、5日、7日、10日、12日、14日、21日の時点）について回収した。血漿サンプル中のZAZ3363の定量は、ZAZ3363をトリプシンで消化した後に得られたペプチドに基づいてLC-MS/MSによって実施した。濃度-時間プロファイルは、各サルで1日目と10日目について別々の分析をした非コンパートメント法と、1日目と10日目のデータを合わせて評価したコンパートメント法の両方を利用して評価した。
結果
1日目と10日目に投与した後のZAZ3363の平均血漿濃度-時間プロファイルをそれぞれ図14Aと図14Bに示す。ZAZ3363は単回投与として投与されて十分に薬物動態が評価されたのではないという事実にもかかわらず、多数回投与後に入手できる結果から、単回投与後の濃度-時間プロファイルを予測することが可能になる。血漿濃度は2コンパートメントの挙動に従って2つの相で低下した。このことと第2の反復投与研究（データは示さず）から推定された第2相のt1/2は約4〜7.5日であり、これはサルのアルブミンで報告されているt1/2と一致している（Deo他、1974年、J Nutr 第104巻：858〜864ページ）。有意な性差は観察されなかった。
イヌでのZ-ABD-Zポリペプチドの経口投与
材料と方法
カプセルの調製：ZAZ3363（配列番号1244）をOAF1の中で100 mg/mlの濃度にして製剤化した（実施例18参照）。この製剤を凍結乾燥させ、硬カプセルに充填した後、腸溶コーティングした（Catalent Pharma Solutions社が実施、ベインハイム、フランス国）。それぞれのカプセルは約25 mgのZAZ3363を含んでいた。
動物研究：Huntingdon Life Science社（ケンブリッジシャー、イギリス国）で動物研究を実施した。空腹にさせたビーグル犬（n＝3；雌の個体）それぞれに、ZAZ3363（約150 mg）を含む6つのカプセルを与えた。血清サンプルを、投与後0.5時間、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、24時間、96時間の時点で採取した。
定量：血清サンプル中のZAZ3363の濃度を、本質的に実施例16に記載したようにしてPKサンドイッチELISAを利用して定量したが、自家製モノクローナル抗Z IgGを第1の被覆工程で用いた。
結果
ZAZ3363について、個別のイヌでの血清濃度-時間プロファイルを図15に示す。結果から、3匹のイヌすべてでZAZ3363が腸から取り込まれたが、個体間でいくらか違いがあることがわかった。ZAZ3363の血清濃度は最大で2〜30 nMに達した。循環系に入るとZAZ3363の血清レベルは少なくとも96時間後まで安定した状態に留まる。これは、ZAZ3363内のABD部分PP013（配列番号1223）がイヌのアルブミンと相互作用することに帰せられる。PP013がイヌアルブミンに結合する能力は、以前に明らかにされている（WO2012/004384）。
実施態様の項目別リスト
1．IL-17A結合モチーフBMを含んでいて、そのモチーフが、
i）EX2DX4AX6X7EIX10X11LPNL X16X17X18QX20X21AFIX25 X26LX28X29
（ただし、互いに独立に、
X2は、A、H、M、Yから選択され；
X4は、A、D、E、F、K、L、M、N、Q、R、S、Yから選択され；
X6は、A、Q、Wから選択され；
X7は、F、I、L、M、V、W、Yから選択され；
X10は、A、Wから選択され；
X11は、A、D、E、F、G、L、M、N、Q、S、T、Yから選択され；
X16は、N、Tから選択され；
X17は、H、W、Yから選択され；
X18は、A、D、E、H、Vから選択され；
X20は、A、G、Q、S、Wから選択され；
X21は、A、D、E、F、H、K、N、R、T、V、W、Yから選択され；
X25は、A、D、E、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、Vから選択され；
X26は、K、Sから選択され；
X28は、I、L、N、Rから選択され；
X29は、D、Rから選択される）と
ii）i）に規定した配列と少なくとも89％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなるIL-17A結合ポリペプチド。
2．配列i）において、
X2が、A、H、Mから選択され；
X4が、A、D、E、F、L、M、N、Q、R、Yから選択され；
X11が、A、D、E、F、G、L、M、N、S、T、Yから選択され；
X18が、A、D、E、Vから選択され；
X20が、A、G、Q、Wから選択され；
X21が、E、F、H、N、R、T、V、W、Yから選択され；
X25が、A、D、E、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、Vから選択され；
X28が、I、N、Rから選択される、項1に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
3．配列i）において、
X16がTであり；
X17がWであり；
X21が、E、F、H、W、T、Yから選択され；
X25が、A、D、E、G、H、I、L、N、Q、R、S、Tから選択され；
X26がKであり；
X29がDである、項2に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
4．配列i）が、以下の11個の条件I〜IX：
I．X2がAである；
II．X4がD、E、Qから選択される；
III．X6がAである；
IV．X7がFとVから選択される；
V．X16がTである；
VI．X17がWである；
VII．X18がAとDから選択される；
VIII．X20がWである；
IX．X26がKである；
X．X28がRである；
XI．X29がDである
のうちの少なくとも6個を満たす、項1〜3のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
5．配列i）が、前記11個の条件I〜IXのうちの少なくとも7個を満たす、項4に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
6．配列i）が、前記11個の条件I〜IXのうちの少なくとも8個を満たす、項5に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
7．配列i）が、前記11個の条件I〜IXのうちの少なくとも9個を満たす、項6に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
8．配列i）が、前記11個の条件I〜IXのうちの少なくとも10個を満たす、項7に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
9．配列i）が、前記11個の条件I〜IXのすべてを満たす、項8に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
10．X2X6、またはX2X10、またはX6X10がAAである、項1〜9のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
11．X2X17、またはX2X20、またはX6X17、または X6X20、またはX10X17、またはX10X20がAWである、項1〜10のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
12．X2X28、またはX6X28、またはX10X28がARである、項1〜11のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
13．X17X28またはX20X28がWRである、項1〜12のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
14．X17X20がWWである、項1〜13のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
15．配列i）が、配列番号1〜1216からなるグループから選択された配列中の位置8〜位置36の配列である、項1〜14のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
16．配列i）が、配列番号1〜66、1200、1206、1214からなるグループから選択された配列中の位置8〜位置36の配列である、項15に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
17．配列i）が、配列番号1〜66からなるグループから選択された配列中の位置8〜位置36の配列である、項16に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
18．配列i）が、配列番号1〜35からなるグループから選択された配列中の位置8〜位置36の配列である、項17に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
19．配列i）が、配列番号1〜27からなるグループから選択された配列中の位置8〜位置36の配列である、項18に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
20．配列i）が、配列番号1〜10からなるグループから選択された配列中の位置8〜位置36の配列である、項19に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
21．配列i）が、配列番号1〜7からなるグループから選択された配列中の位置8〜位置36の配列である、項20に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
22．配列i）が、配列番号1〜4からなるグループから選択された配列中の位置8〜位置36の配列である、項21に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
23．配列i）が、配列番号1の位置8〜位置36の配列である、項22に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
24．前記IL-17A結合モチーフが、3ヘリックスバンドルタンパク質ドメインの一部を形成する、項1〜23のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
25．前記IL-17A結合モチーフが、本質的に、前記3ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン内で、相互接続ループを有する2つのヘリックスの一部を形成する、項24に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
26．前記3ヘリックスバンドルタンパク質ドメインが細菌受容体ドメインから選択される、項25に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
27．前記3ヘリックスバンドルタンパク質ドメインが黄色球菌からのプロテインAのドメインまたはその誘導体から選択される、項26に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
28．iii）K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ
（ただし[BM]は、
X29がDであり；
XaがAとSから選択され、
XbがNとEから選択され；
XcがA、S、Cから選択され；
XdがE、N、Sから選択され；
XeがD、E、Sから選択され；
XfがAとSから選択されるという条件での、請求項1〜23のいずれか1項に記載のIL-17A結合モチーフである）と、
iv）iii）に規定した配列と少なくとも85％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列結合モジュールBModを含む、項1〜27のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
29．v）K-[BM]-QPEQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ,
（ただし[BM]は、
X29がRであり；
XaがAとSから選択され、
XbがNとEから選択され；
XcがA、S、Cから選択され；
XdがE、N、Sから選択され；
XeがD、E、Sから選択され；
XfがAとSから選択されるという条件での、項1〜23のいずれか1項に記載のIL-17A結合モチーフである）と、
vi）v）に規定した配列と少なくとも85％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列結合モジュールBModを含む、項1〜27のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
30．配列iii）またはv）のXaがAである、項28または29に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
31．配列iii）またはv）のXaがSである、項28または29に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
32．配列iii）またはv）のXbがNである、項28〜31のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
33．配列iii）またはv）のXbがEである、項28〜31のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
34．配列iii）またはv）のXcがAである、項28〜33のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
35．配列iii）またはv）のXcがSである、項28〜33のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
36．配列iii）またはv）のXcがCである、項28〜33のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
37．配列iii）またはv）のXdがEである、項28〜36のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
38．配列iii）またはv）のXdがNである、項28〜36のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
39．配列iii）またはv）のXdがSである、項28〜36のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
40．配列iii）またはv）のXeがDである、項28〜39のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
41．配列iii）またはv）のXeがEである、項28〜39のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
42．配列iii）またはv）のXeがSである、項28〜39のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
43．配列iii）またはv）のXdXeが、EE、ES、SD、SE、SSから選択される、項37と項39〜42のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
44．配列iii）またはv）のXdXeがESである、項43に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
45．配列iii）またはv）のXdXeがSEである、項43に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
46．配列iii）またはv）のXdXeがSDである、項43に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
47．配列iii）またはv）のXfがAである、項28〜46のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
48．配列iii）またはv）のXfがSである、項28〜46のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
49．配列iii）またはv）において、XaがAであり、XbがNであり、XcがAであり、XfがAである、項28または29に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
50．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがAであり、XfがAである、項28または29に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
51．配列iii）またはv）において、XaがAであり、XbがNであり、XcがCであり、XfがAである、項28または29に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
52．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがSであり、XfがSである、項28または29に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
53．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがSであり、XfがAである、項28または29に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
54．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがAであり、XfがSである、項28または29に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
55．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがCであり、XfがSである、項28または29に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
56．配列iii）またはv）において、XaがAであり、XbがNであり、XcがAであり、XdXeがNDであり、XfがAである、項49に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
57．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがAであり、XdXeがNDであり、XfがAである、項50に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
58．配列iii）またはv）において、XaがAであり、XbがNであり、XcがCであり、XdXeがNDであり、XfがAである、項51に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
59．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがSであり、XdXeがNDであり、XfがSである、項52に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
60．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがSであり、XdXeがNDであり、XfがAである、項53に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
61．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがCであり、XdXeがNDであり、XfがSである、項55に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
62．配列iii）またはv）において、XaがAであり、XbがNであり、XcがAであり、XdXeがSEであり、XfがAである、項49に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
63．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがAであり、XdXeがSEであり、XfがAである、項50に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
64．配列iii）またはv）において、XaがAであり、XbがNであり、XcがCであり、XdXeがSEであり、XfがAである、項51に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
65．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがSであり、XdXeがSEであり、XfがSである、項52に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
66．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがAであり、XdXeがSEであり、XfがSである、項54に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
67．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがCであり、XdXeがSEであり、XfがSである、項55に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
68．配列iii）またはv）において、XaがAであり、XbがNであり、XcがAであり、XdXeがESであり、XfがAである、項49に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
69．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがAであり、XdXeがESであり、XfがAである、項50に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
70．配列iii）またはv）において、XaがAであり、XbがNであり、XcがCであり、XdXeがESであり、XfがAである、項51に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
71．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがSであり、XdXeがESであり、XfがSである、項52に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
72．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがCであり、XdXeがESであり、XfがSである、項55に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
73．配列iii）またはv）において、XaがAであり、XbがNであり、XcがAであり、XdXeがSDであり、XfがAである、項49に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
74．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがAであり、XdXeがSDであり、XfがAである、項50に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
75．配列iii）またはv）において、XaがAであり、XbがNであり、XcがCであり、XdXeがSDであり、XfがAである、項51に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
76．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがSであり、XdXeがSDであり、XfがSである、項52に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
77．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがAであり、XdXeがSDであり、XfがSである、項54に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
78．配列iii）またはv）において、XaがSであり、XbがEであり、XcがCであり、XdXeがSDであり、XfがSである、項55に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
79．配列iii）が、配列番号1〜1216からなるグループから選択された配列中の位置7〜位置55の配列である、項28に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
80．配列iii）が、配列番号1〜66、1200、1206、1214からなるグループから選択された配列中の位置7〜位置55の配列である、項79に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
81．配列iii）が、配列番号1〜66からなるグループから選択された配列中の位置7〜位置55の配列である、項80に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
82．配列iii）が、配列番号1〜35からなるグループから選択された配列中の位置7〜位置55の配列である、項81に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
83．配列iii）が、配列番号1〜27からなるグループから選択された配列中の位置7〜位置55の配列である、項82に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
84．配列iii）が、配列番号1〜10からなるグループから選択された配列中の位置7〜位置55の配列である、項83に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
85．配列iii）が、配列番号1〜7からなるグループから選択された配列中の位置7〜位置55の配列である、項84に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
86．配列iii）が、配列番号1〜4からなるグループから選択された配列中の位置7〜位置55の配列である、項85に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
87．配列iii）が、配列番号1の位置7〜位置55の配列である、項86に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
88．vii）YA-[BMod]-AP
（ただし[BMod]は、項28〜87のいずれか1項に記載のIL-17A結合モジュールである）と、
viii）vii）に規定した配列と少なくとも86％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含む、項1〜87のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
89．ix）FA-[BMod]-AP
（ただし[BMod]は、項28〜87のいずれか1項に記載のIL-17A結合モジュールである）と、
x）ix）に規定した配列と少なくとも86％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含む、項1〜87のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
90．xi）FN-[BMod]-AP
（ただし[BMod]は、項28〜87のいずれか1項に記載のIL-17A結合モジュールである）と、
xii）xi）に規定した配列と少なくとも86％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含む、項1〜87のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
91．
以下の：
ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;
ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;
ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;
VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDAQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDAQAP;
AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAP;
AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAP;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK;
AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAP;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK;
AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAP;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK;
AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK;
VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK;
VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK;
VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;
ADAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;から選択されたアミノ酸配列を含む（ただし[BM]は、項1〜23のいずれか1項に記載のIL-17A結合モチーフである）、項1〜90のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
92．xiii）VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK
（ただし[BM]は、項1〜23のいずれか1項に記載のIL-17A結合モチーフである）と、
xiv）xiii）に規定した配列と少なくとも86％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含む、項1〜91のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
93．配列xiii）が、配列番号1〜1216から選択される、項92に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
94．配列xiii）が、配列番号1〜66、1200、1206、1214から選択される、項93に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
95．配列xiii）が、配列番号1〜66から選択される、項94に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
96．配列xiii）が、配列番号1〜35から選択される、項95に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
97．配列xiii）が、配列番号1〜27から選択される、項96に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
98．配列xiii）が、配列番号1〜10から選択される、項97に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
99．配列xiii）が、配列番号1〜7から選択される、項98に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
100．配列xiii）が、配列番号1〜4から選択される、項99に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
101．配列xiii）が配列番号1である、項100に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
102．xv）AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK
（ただし[BM]は、項1〜23のいずれか1項に記載のIL-17A結合モチーフである）と、
xvi）xv）に規定した配列と少なくとも86％一致するアミノ酸配列か選択されたアミノ酸配列を含む、項1〜91のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
103．配列xv）が、配列番号1217〜1222から選択される、項102に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
104．配列xv）が、配列番号1218〜1222から選択される、項103に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
105．配列xv）が、配列番号1219〜1222から選択される、項104に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
106．配列xv）が、配列番号1219と配列番号1222から選択される、項105に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
107．配列xv）が配列番号1219である、項106に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
108．IL-17Aに結合することができて、相互作用のKD値が最大で1×10-6 M、例えば最大で1×10-7 M、例えば最大で1×10-8 M、例えば1×10-9 Mである、項1〜107のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
109．ヒトIL-17AとマウスIL-17Aからなるグループから選択されるIL-17A分子に結合することができる、項1〜108のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
110．ヒトIL-17Aに結合することができる、項109に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
111．マウスIL-17Aに結合することができる、項109に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
112．ヒトIL-17AとマウスIL-17Aに結合することができる、項109〜111のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
113．前記ヒトIL-17Aが、アミノ酸配列配列番号1226、またはその抗原として有効なフラグメントを含む、項109、110、112のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
114．前記マウスIL-17Aが、アミノ酸配列配列番号1227、またはその抗原として有効なフラグメントを含む、項109、111、112のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
115．C末端および／またはN末端に追加のアミノ酸を含む、項1〜114のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
116．前記追加のアミノ酸が、前記ポリペプチドの作製、精製、生体内またはインビトロでの安定化、カップリング、検出のいずれかを改善および／または簡単化する、項115に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
117．多量体の形態で、少なくとも2つのIL-17A結合ポリペプチドモノマー単位を含んでいて、それらのアミノ酸配列は同じでも異なっていてもよい、項1〜116のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
118．前記IL-17A結合ポリペプチドモノマー単位が互いに共有結合している、項117に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
119．前記IL-17A結合ポリペプチドモノマー単位が融合タンパク質として発現する、項118に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
120．二量体の形態である、項117〜119のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
121．- 項1〜120のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチドからなる第1の部分と；
- 望む生物活性を有するポリペプチドからなる第2の部分を含む融合タンパク質または共役体。
122．前記望む生物活性が治療活性である、項121に記載の融合タンパク質または共役体。
123．前記望む生物活性が結合活性である、項121に記載の融合タンパク質または共役体。
124．項123に記載の融合タンパク質または共役体において、前記結合活性が、その融合タンパク質または共役体の生体内半減期を長くするアルブミン活性である、融合タンパク質または共役体。
125．それぞれが項1〜116のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチドであるIL-17A結合ポリペプチドを2つ含んでいて、その両者の間にアルブミン結合部分を有する、項124に記載の融合タンパク質または共役体。
126．IL-17Aに結合できて、相互作用のKD値が、最大で1×10-10 M、例えば最大で1×10-11 M、例えば最大で1×10-12 M、例えば1×10-13 Mである、項125に記載の融合タンパク質または共役体。
127．前記第2の部分が、連鎖球菌のプロテインGのアルブミン結合ドメインまたはその誘導体を含む、項124〜126のいずれか1項に記載の融合タンパク質または共役体。
128．前記結合活性が生物活性を抑制するように作用する、項123に記載の融合タンパク質または共役体。
129．前記結合活性が生物活性を促進するように作用する、項123に記載の融合タンパク質または共役体。
130．前記望む生物活性が酵素活性である、項121に記載の融合タンパク質または共役体。
131．前記第2の部分が治療活性のあるポリペプチドである、項122に記載の融合タンパク質または共役体。
132．前記第2の部分が、免疫応答調節剤、例えば抗炎症剤である、項131に記載の融合タンパク質または共役体。
133．前記第2の部分が、ヒトに内在する酵素、ホルモン、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカインと、それらの作動剤、拮抗剤、阻害剤からなるグループから選択される、項121〜122と130〜132のいずれか1項に記載の融合タンパク質または共役体。
134．前記第2の部分が毒性化合物である、項131に記載の融合タンパク質または共役体。
135．前記結合活性が、免疫応答関連因子、例えば炎症関連因子への結合である、項123に記載の融合タンパク質または共役体。
136．項1〜117のいずれか1項に記載の少なくとも1つのIL-17A結合ポリペプチド、または項121〜135のいずれか1項に記載の少なくとも1つの融合タンパク質と、少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントとを含む複合体。
137．前記少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントが、完全長抗体、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fcフラグメント、Fvフラグメント、単鎖Fvフラグメント、(scFv)2、ドメイン抗体からなるグループから選択される、項136に記載の複合体。
138．前記少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントが、完全長抗体、Fabフラグメント、scFvフラグメントからなるグループから選択される、項137に記載の複合体。
139．前記少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントが完全長抗体である、項138に記載の複合体。
140．前記少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントが、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、項136〜139のいずれか1項に記載の複合体。
141．前記少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体と、これらの抗原結合フラグメントからなるグループから選択される、項136〜140のいずれか1項に記載の複合体。
142．前記少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒト抗体、ヒト化抗体、これらの抗原結合フラグメントのいずれかである、項141に記載の複合体。
143．前記少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントが、例えば、血管新生関連疾患に関連する抗原と、免疫応答または免疫系の異常に関係する抗原からなるグループから選択された抗原に対する親和性を有する、項136〜142のいずれか1項に記載の複合体。
144．前記抗原が血管新生関連疾患である、項143に記載の複合体。
145．前記抗原が、免疫応答または免疫系の異常、例えば炎症に関連する異常と関係している、項143に記載の複合体。
146．融合タンパク質または共役体である、項136〜145のいずれか1項に記載の複合体。
147．前記IL-17A結合ポリペプチドが、前記抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖のN末端またはC末端に付着している、項136〜146のいずれか1項に記載の複合体。
148．前記IL-17A結合ポリペプチドが、前記抗体またはその抗原結合フラグメントの軽鎖のN末端またはC末端に付着している、項136〜146のいずれか1項に記載の複合体。
149．前記IL-17A結合ポリペプチドが、前記抗体またはその抗原結合フラグメントの重鎖と軽鎖のN末端および／またはC末端に付着している、項136〜146のいずれか1項に記載の複合体。
150．融合タンパク質である、項146〜149のいずれか1項に記載の複合体。
151．例えば、非ペプチドリンカー、可撓性のあるアミノ酸リンカー、堅固なアミノ酸リンカー、開裂可能なアミノ酸リンカーからなるグループから選択された少なくとも1つのリンカーをさらに含む、項1〜150のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体。
152．前記リンカーが前記第1の部分と前記第2の部分の間に配置されている、項151に記載の融合タンパク質または共役体。
153．前記リンカーが、前記IL-17A結合ポリペプチドと、前記抗体またはその抗原結合フラグメントとの間に配置されている、項151に記載の融合タンパク質または共役体。
154．前記リンカーが、グリシン、セリン、トレオニンからなるグループから選択されたアミノ酸残基を含む可撓性のあるリンカーである、項151〜153のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体。
155．前記リンカーが、(GnSm)pと(SnGm)pから選択された一般式を持つ配列を含む（ただし、独立に、
n＝1〜7、
m＝0〜7、
n＋m≦8、
p＝1〜10である）、項154に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体。
156．n＝1〜5である、項155に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体。
157．m＝0〜5である、項155または156に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体。
158．p＝1〜5である、項155〜157のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体。
159．n＝4、m＝1、p＝1〜4である、項156〜158のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体。
160．前記リンカーが、G4S、(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4からなるグループから選択された配列を含む、項159に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体。
161．前記リンカーがG4Sを含む、項160に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体。
162．前記一般式がGT(GnSm)pである、項155〜159のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体。
163．前記リンカーが配列GTG4Sを含む、項162に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体。
164．標識をさらに含む、項1〜164のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体。
165．前記標識が、蛍光性の染料と金属、発色団染料、化学発光化合物と生物発光タンパク質、酵素、放射性核種、粒子からなるグループから選択される、項164に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体。
166．システイン残基のチオール基またはリシン残基のアミン基を介して前記IL-17A結合ポリペプチドに共役したポリアミノポリカルボキシレート型キレータによって提供されるキレート化環境を含む、項1〜165のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体。
167．1つ以上のポリエチレングリコール部分を含む、項1〜166のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体。
168．項1〜163のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
169．項168に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
170．項169に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
171．項1〜163のいずれか1項に記載のポリペプチドを作製する方法であって、
- 前記発現ベクターから前記ポリペプチドの発現を許容する条件下で項170に記載の宿主細胞を培養し、
- そのポリペプチドを単離することを含む方法。
172．項1〜167のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体と、医薬として許容可能な少なくとも1種類の賦形剤または基剤とを含む組成物。
173．治療活性のあるポリペプチド、免疫応答調節剤、抗炎症剤、毒性化合物からなるグループから選択された薬剤をさらに含む、項172に記載の組成物。
174．経口投与、局所投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、肺投与、経皮投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、口腔内投与、舌下投与、座薬投与のための、例えば経口投与または局所投与のための、項1〜167のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、または項172または173に記載の組成物。
175．薬、診断剤、予後予測剤として使用するための、項1〜167のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、または項172または173に記載の組成物。
176．生体内でIL-17Aの機能を調節する、項175に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物。
177．IL-17Aシグナル伝達を抑制する、項175または176に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物。
178．IL-17Aが対応するコグネイト受容体の少なくとも1つに結合することを阻止する、項175〜177のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物。
179．IL-17A関連疾患の治療、診断、予後予測に用いられる、項175〜178のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物。
180．前記IL-17A関連疾患が、炎症性疾患、自己免疫疾患、がんからなるグループから選択される、項179に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物。
181．前記IL-17A関連疾患が、炎症性疾患と自己免疫疾患からなるグループから選択される、項180に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物。
182．前記IL-17A関連疾患が、炎症性疾患、アレルギー性疾患、過敏反応、自己免疫疾患、重度の感染症、移植拒絶からなるグループから選択される、項181に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物。
183．前記IL-17A関連疾患が、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、乾癬、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ぶどう膜炎、ドライアイ疾患からなるグループから選択される、項182に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物。
184．前記IL-17A関連疾患が乾癬である、項183に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物。
185．前記IL-17A関連疾患が、がん、例えば胃がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、肝細胞がん、腺癌からなるグループから選択されたがんである、項179に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物。
186．IL-17Aを検出する方法であって、IL-17Aを含むことが疑われるサンプルを用意し、そのサンプルを、項1〜167のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、または項172または173に記載の組成物と接触させ、そのIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物の結合を検出して前記サンプル中にIL-17Aが存在することを示すことを含む方法。
187．被験体にIL-17Aが存在することを明らかにする方法であって、この方法が、
- その被験体を、またはその被験体から単離したサンプルを、項1〜167のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、または項172または173に記載の組成物と接触させる工程と、
- 前記被験体または前記サンプルに結合したIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、組成物の量に対応する値を取得する工程を含む方法。
188．前記値を基準と比較する工程をさらに含む、項187に記載の方法。
189．前記被験体が、哺乳動物被験体、例えばヒト被験者である、項187または188に記載の方法。
190．生体内で実施する、項187〜189のいずれか1項に記載の方法。
191．インビトロで実施する、項187〜189のいずれか1項に記載の方法。
192．IL-17A関連疾患を治療する方法であって、治療を必要とする被験体に、項1〜167のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、または項172または173に記載の組成物を有効な量投与することを含む方法。
193．前記IL-17A関連疾患が、炎症性疾患、自己免疫疾患、がんからなるグループから選択される、項192に記載の方法。
194．前記IL-17A関連疾患が、炎症性疾患と自己免疫疾患からなるグループから選択される、項193に記載の方法。
195．前記IL-17A関連疾患が、炎症性疾患、アレルギー性疾患、過敏反応、自己免疫疾患、重度の感染症、移植拒絶からなるグループから選択される、項194に記載の方法。
196．前記IL-17A関連疾患が、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、乾癬、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ぶどう膜炎、ドライアイ疾患からなるグループから選択される、項195に記載の方法。
197．前記IL-17A関連症状が乾癬である、項196に記載の方法。

Claims (17)

  1. IL-17A結合モチーフBMを含んでいて、そのモチーフが、
    i）EX2DX4AX6X7EIX10X11LPNL X16X17X18QX20X21AFIX25 X26LX28X29
    （ただし、互いに独立に、
    X2は、A、H、M、Yから選択され；
    X4は、A、D、E、F、K、L、M、N、Q、R、S、Yから選択され；
    X6は、A、Q、Wから選択され；
    X7は、F、I、L、M、V、W、Yから選択され；
    X10は、A、Wから選択され；
    X11は、A、D、E、F、G、L、M、N、Q、S、T、Yから選択され；
    X16は、N、Tから選択され；
    X17は、H、W、Yから選択され；
    X18は、A、D、E、H、Vから選択され；
    X20は、A、G、Q、S、Wから選択され；
    X21は、A、D、E、F、H、K、N、R、T、V、W、Yから選択され；
    X25は、A、D、E、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T、Vから選択され；
    X26は、K、Sから選択され；
    X28は、I、L、N、Rから選択され；
    X29は、D、Rから選択される）と
    ii）i）に規定した配列と少なくとも89％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列からなるIL-17A結合ポリペプチド。
  2. 配列i）において、
    X2が、A、H、Mから選択され；
    X4が、A、D、E、F、L、M、N、Q、R、Yから選択され；
    X11が、A、D、E、F、G、L、M、N、S、T、Yから選択され；
    X18が、A、D、E、Vから選択され；
    X20が、A、G、Q、Wから選択され；
    X21が、E、F、H、N、R、T、V、W、Yから選択され；
    X25が、A、D、E、G、H、I、L、N、Q、R、S、T、Vから選択され；
    X28が、I、N、Rから選択される、請求項1に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
  3. 配列i）において、
    X16がTであり；
    X17がWであり；
    X21が、E、F、H、W、T、Yから選択され；
    X25が、A、D、E、G、H、I、L、N、Q、R、S、Tから選択され；
    X26がKであり；
    X29がDである、請求項2に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
  4. 配列i）が、配列番号1〜1216からなるグループから選択された配列中の位置8〜位置36の配列である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
  5. iii）K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ
    （ただし[BM]は、
    X29がDであり；
    XaはAとSから選択され、
    XbはNとEから選択され；
    XcはA、S、Cから選択され；
    XdはE、N、Sから選択され；
    XeはD、E、Sから選択され；
    XfはAとSから選択されるという条件での、請求項1〜4のいずれか1項に記載のIL-17A結合モチーフである）と、
    iv）iii）に規定した配列と少なくとも85％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列結合モジュールBModを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
  6. 前記配列iii）が、配列番号1〜1216からなるグループから選択された配列中の位置7〜位置55の配列である、請求項5に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
  7. vii）YA-[BMod]-AP
    （ただし[BMod]は、請求項5または6に記載のIL-17A結合モジュールである）と、
    viii）vii）に規定した配列と少なくとも86％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
  8. xiii）VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK
    （ただし[BM]は、請求項1〜4のいずれか1項に記載のIL-17A結合モチーフである）と、
    xiv）xiii）に規定した配列と少なくとも86％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
  9. 前記配列xiii）が配列番号1〜1216から選択される、請求項8に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
  10. xv）AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK
    （ただし[BM]は、請求項1〜4のいずれか1項に記載のIL-17A結合モチーフである）と、
    xvi）xv）に規定した配列と少なくとも86％一致するアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
  11. 前記配列xv）が配列番号1〜1216から選択される、請求項10に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
  12. IL-17Aに結合することができて、相互作用のKD値が最大で1×10-6 M、例えば最大で1×10-7 M、例えば最大で1×10-8 M、例えば1×10-9 Mである、請求項1〜11のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド。
  13. - 請求項1〜12のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチドからなる第1の部分と；
    - 望む生物活性を有するポリペプチドからなる第2の部分を含む融合タンパク質または共役体。
  14. 請求項1〜12のいずれか1項に記載の少なくとも1つのIL-17A結合ポリペプチド、または請求項13に記載の少なくとも1つの融合タンパク質または共役体と、少なくとも1つの抗体またはその抗原結合フラグメントとを含む複合体。
  15. 請求項1〜14のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
  16. 請求項1〜14のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体と、医薬として許容可能な少なくとも1つの賦形剤または基剤とを含む組成物。
  17. 医薬として、または診断剤として、または予後予測剤として利用するための、請求項1〜14のいずれか1項に記載のIL-17A結合ポリペプチド、融合タンパク質、共役体、複合体、または請求項16に記載の組成物。
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