CN108064235A - Il-17a结合多肽 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及一类具有对白细胞介素‑17A(IL‑17A)的结合亲和力的工程化多肽，并提供了包含序列EX2DX4AX6X7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29‑的IL‑17A结合多肽。还公开了此类白细胞介素‑17A结合多肽作为诊断剂、预后剂和/或治疗剂的用途。

Description

IL-17A结合多肽
发明领域
本公开内容涉及一类对白细胞介素-17A(以下称为IL-17A)具有结合亲和力的工程化多肽。本公开内容还涉及此类白细胞介素-17A结合多肽作为诊断剂、预后剂和/或治疗剂的用途。
背景
白细胞介素-17(IL-17)家族为促成几种炎性疾病的发病机制的促炎性细胞因子家族。IL-17的主要来源为称为辅助性T细胞17(Th17细胞)的T细胞谱系，其与经典Th1和Th2细胞亚群(subsets)不同。在小鼠模型和人类中的研究结果已经确定了IL-17和Th17细胞在炎症和自身免疫的发病机制以及在宿主防御某些病原体中的关键作用。基于这些观察结果，IL-17和Th17细胞被认为是用于治疗几种慢性炎性疾病诸如银屑病、类风湿性关节炎(RA)、强直性脊柱炎(AS)、系统性红斑狼疮(SLE)和多发性硬化(MS)的感兴趣的靶(Miossec和Kolls,2012,Nat Rev Drug Discov 11:763-7)。
二硫键连接的同二聚体细胞因子IL-17A为IL-17家族的成员，该家族还包括IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F。在该家族内，IL-17A和IL-17F显示出与彼此最高的氨基酸序列同源性(50％)，并且它们与相同的受体结合：IL-17受体A(IL-17RA)和IL-17受体C(IL-17RC)。此外，可以将IL-17A与IL-17F一起作为异二聚体表达。尽管IL-17A和IL-17F共有高的氨基酸序列同源性，但它们执行不同的功能。IL-17A参与自身免疫、炎症和肿瘤的发展，并且在宿主防御细菌和真菌感染中也起重要作用。在另一方面，IL-17F主要参与粘膜宿主防御机制(Iwakura等，2011,Immunity34:149-62)。
当分泌IL-17A时，IL-17A促进从成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞产生多种促炎性细胞因子、趋化因子、抗微生物肽和金属蛋白酶(MMP)。IL-17A的一个重要作用为诱导粒细胞生成和对炎症部位的中性粒细胞募集。然而，如果不受控制，这种反应可能导致慢性炎症，伴随组织破坏和新血管形成(Iwakura等2008,Immunol Rev 226:57-79；Reynolds等2010,Cytokine Growth Factor Rev 21:413-23)。IL-17A为银屑病发病机制的中心，银屑病为一种常见的慢性炎性皮肤病，影响约2.5％的世界人口(在Chiricozzi和Krueger,2013,Expert Opin.Investig.Drugs 22(8):993-1005中综述)。具有RA的患者中的研究已经表明，IL-17A阳性细胞存在于发炎的滑膜中。在RA的小鼠模型中，通过经由关节内基因转移施用IL-17A，临床评分严重恶化(Lubberts等2002,Inflamm Res 51:102-4)。相反，IL-17A用针对该配体或受体的单克隆抗体的抑制保护免受关节炎的发展和结果(Lubberts等2004,Arthritis Rheum 50:650-9)。在MS患者中，IL-17A基因被报告为过表达(Lock等2002,Nat Med 8:500-8)，并且IL-17A和Th17细胞已经明确地牵涉在实验性自身免疫性脑炎的小鼠模型中(Cua等2003,Nature 421:744-8；Uyttenhove和Van Snick 2006,Eur JImmunol 36:2868-74)。已经显示增加的IL-17A水平与罹患关节炎的患者中的多种眼部炎性疾病，诸如葡萄膜炎、巩膜炎和干眼病(DED)临床相关(Kang等2011,J Korean Med Sci26:938-44)。最近的研究已经显示冠状动脉粥样硬化临床样本中的IL-17和IFNγ阳性细胞，表明对血管功能异常具有局部作用(Eid等，2009,J Cardiothorac Surg 4:58)。IL-17A也可对慢性阻塞性肺疾病(COPD)有意义。在来自COPD患者的肺组织中IL-17A阳性细胞数目增加(Chu等2011,Int Immunopharmacol 11:1780-8；Di Stefano等2009,Clin ExpImmunol157:316-24)。在COPD小鼠模型中，IL-17RA缺陷小鼠对肺气肿的发展耐受，而IL-17A的过表达加速了肺气肿的发展，表明IL-17A足以介导该应答(Chen等2011,PLoS One 6:e20333；Shan等2012,Sci Transl Med 4:117ra9)。因此，IL-17A在几种不同的自身免疫性疾病和炎性疾病中的参与表明靶向IL-17A的治疗的广泛的适用性。
IL-17A或其受体的靶向为阻断IL-17A介导的功能的最直接方式。中和IL-17A信号传导的几种生物剂(biologics)，包括抗-IL-17A单克隆抗体苏金单抗(secukinumab)和ixekizumab，现在正在临床开发中(Patel等，2013,Ann Rheum Dis 72增刊2:ii116-23)。苏金单抗已被批准用于治疗银屑病，并且目前正在研究用于治疗银屑病关节炎(PsA)和AS。Ixekizumab目前正在进行银屑病、PsA和RA的临床试验。IL-17受体介导的信号传导的阻断也在进行临床研究，包括人类单克隆抗-IL-17RA抗体brodalumab用于治疗银屑病、RA和哮喘(Hu等2011,Ann N Y Acad Sci 1217:60-76)。因此，已经证实了IL-17A抑制在不同的疾病，特别是银屑病中的临床功效，并且包括II期和III期数据在内的安全性谱显示对IL-17A抑制剂的良好的耐受性(Genovese等2010,Arthritis Rheum 62:929-39和Hueber等2010,Sci Transl Med 2:52ra72)。
银屑病以及其他炎性疾病的不可预期且慢性的性质以及高度未被满足的医学需求使得有必要发展新的治疗模式(modes of treatment)。
由于组织渗透率与分子的尺寸负相关，相对大的抗体分子固有地具有差的组织分布和渗透能力。此外，尽管由于抗体对许多可能的抗原的高亲和力和特异性，抗体广泛用于多种常规情况(诸如用于分析、纯化、诊断和治疗目的)，但它们仍然遭受几种缺点。此类缺点包括需要复杂的哺乳动物表达系统、聚集倾向、有限的溶解度、需要形成和稳定地维持二硫键、以及不想要的免疫应答的风险。
因此，单克隆抗体的使用对于疗法并不总是最佳的，并且对于提供对IL-17A具有高亲和力的剂存在持续的需求。还很感兴趣的为提供此类分子在疾病的治疗、诊断和预后中的用途。
发明概述
本公开内容的目的为提供新的IL-17A结合剂，所述新的IL-17A结合剂可以例如用于诊断应用、预后应用和治疗应用。
本公开内容的目的为提供新的IL-17A结合剂，所述新的IL-17A结合剂可以用作包含具有相似或其他功能的一个或更多个另外的结构域的融合蛋白中的结构域。
本公开内容的目的为提供一种允许靶向多种形式的炎性疾病和自身免疫性疾病的有效疗法同时减轻目前疗法的以上提到的和其他缺点的分子。
本公开内容的另外的目的为提供一种适于预后应用和诊断应用的分子。
对于本领域技术人员由本公开内容是明显的这些目的和其他目的由如在所附权利要求书中要求保护的和如本文一般性公开的本发明的不同方面来满足。
因此，在本公开内容的第一方面，提供了IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含IL-17A结合基序BM，所述基序由选自以下的氨基酸序列组成：
i)EX2DX4AX6X7EIX10X11LPNL X16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29
其中，彼此独立地，
X2选自A、H、M和Y；
X4选自A、D、E、F、K、L、M、N、Q、R、S和Y；
X6选自A、Q和W；
X7选自F、I、L、M、V、W和Y；
X10选自A和W；
X11选自A、D、E、F、G、L、M、N、Q、S、T和Y；
X16选自N和T；
X17选自H、W和Y；
X18选自A、D、E、H和V；
X20选自A、G、Q、S和W；
X21选自A、D、E、F、H、K、N、R、T、V、W和Y；
X25选自A、D、E、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T和V；
X26选自K和S；
X28选自I、L、N和R；且
X29选自D和R；
和
ii)与在i)中定义的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。
一类序列相关的IL-17A结合多肽的以上定义是基于亲本支架的许多随机多肽变体的统计学分析，所述多肽变体在几种不同的选择实验中针对其与IL-17A的相互作用来选择。所鉴定的IL-17A结合基序，或“BM”相应于亲本支架的靶结合区域，所述区域构成在三螺旋束蛋白结构域内的2个α螺旋。在亲本支架中，两个BM螺旋的改变的氨基酸残基构成用于与抗体的恒定Fc部分相互作用的结合表面。在本公开内容中，结合表面的残基的随机变化和随后的变体选择已将Fc相互作用能力替换为与IL-17A相互作用的能力。
如技术人员将认识到的，任何多肽的功能诸如本公开内容的多肽的IL-17A结合能力取决于多肽的三级结构。因此，对多肽中的氨基酸序列做出微小改变而不影响其功能是可能的。因此，本公开内容包括IL-17A结合多肽的修饰的变体，所述变体为IL-17A结合特征被保留的变体。
以这种方式，本公开内容还包括IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含与如i)中定义的多肽具有89％或更大的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽可以包含与如i)中定义的多肽至少93％、诸如至少96％相同的序列。例如，属于氨基酸残基的特定功能分组(例如疏水性、亲水性、极性等)的氨基酸残基可被交换为来自相同功能组的另一个氨基酸残基是可能的。
在一些实施方案中，此类改变可以在如本文公开的IL-17A结合多肽的序列的任何位置中做出。在其他实施方案中，此类改变可仅在也称为支架氨基酸残基的非可变位置中做出。在此类情况中，在可变位置，即序列i)中用“X”表示的位置中的改变不被允许。
如在整个说明书中使用的术语“％同一性”，例如可以如下计算。使用CLUSTAL W算法(Thompson等，Nucleic Acids Research,22:4673-4680(1994))将查询序列与靶序列对齐。在相应于最短的对齐序列的窗口上进行比较。在某些例子中，最短的对齐序列可以是靶序列。在其他情况下，查询序列可以构成最短的对齐序列。将每一个位置处的氨基酸残基进行比较，并且在靶序列中具有相同的相应物的查询序列中的位置的百分比被报告为同一性％。
在根据第一方面的一个特定的实施方案中，提供了如以上定义的多肽，其中，在序列i)中，
X2选自A、H和M；
X4选自A、D、E、F、L、M、N、Q、R和Y；
X11选自A、D、E、F、G、L、M、N、S、T和Y；
X18选自A、D、E和V；
X20选自A、G、Q和W；
X21选自E、F、H、N、R、T、V、W和Y；
X25选自A、D、E、G、H、I、L、N、Q、R、S、T和V；且
X28选自I、N和R。
在根据第一方面的另一个特定的实施方案中，提供了如上一段定义的多肽，其中，另外，在序列i)中，
X16为T；
X17为W；
X21选自E、F、H、W、T和Y；
X25选自A、D、E、G、H、I、L、N、Q、R、S和T；
X26为K；且
X29为D。
“Xn”和“Xm”在本文用于指示如以上定义的序列i)中位置n和m中的氨基酸，其中n和m为指示当从N末端计数时序列i)内的氨基酸的位置的整数。例如，X3和X7分别指示从序列i)的N末端起位置3和7中的氨基酸。
在根据第一方面的实施方案中，提供了多肽，其中序列i)中的Xn独立地选自如表1中列出的一组可能的残基。技术人员将领会到，Xn可以选自所列出的可能的残基组中的任一个并且该选择独立于Xm中的氨基酸的选择，其中n≠m。因此，表1中所列出的位置Xn中的可能残基中的任一个可以独立地与表1中所列出的任何其他可变位置中的可能残基组合。
技术人员将领会到，表1应被如下解读：在根据第一方面的一个实施方案中，提供了多肽，其中序列i)中的氨基酸残基“Xn”选自“可能的残基”。因此，表1公开了本公开内容的第一方面的几个特定且个体化的实施方案。例如，在根据第一方面的一个实施方案中，提供了其中序列i)中的X4选自A、D、E、F、L、N、Q、R和Y的多肽，并且在根据第一方面的另一个实施方案中，提供了其中序列i)中的X4选自D、E、N和Y的多肽。为了避免疑问，所列出的实施方案在又其他实施方案中可以被自由地组合。例如，一个此类组合的实施方案为其中X4选自D、E、F、N、Q、R和Y，而X7选自F、V和W，且X18选自A、D、E和H等等的多肽。
表1：
在定义IL-17A结合多肽的亚类的更特定的实施方案中，序列i)满足以下11个条件I-XI中的至少6个：
I.X2为A；
II.X4选自D、E和Q；
III.X6为A；
IV.X7选自F和V；
V.X16为T；
VI.X17为W；
VII.X18选自A和D；
VIII.X20为W；
IX.X26为K；
X.X28为R；且
XI.X29为D。
在根据第一方面的IL-17A结合多肽的一些实例中，序列i)满足11个条件I-XI中的至少7个。更特别地，序列i)可以满足11个条件I-XI中的至少8个，诸如11个条件I-XI中的至少9个，诸如11个条件I-XI中的至少10个，诸如11个条件I-XI的全部。
在根据第一方面的IL-17A结合多肽的一些实施方案中，X2X6、X2X10或X6X10为AA。在一些实施方案中，X2X17、X2X20、X6X17、X6X20、X10X17或X10X20为AW。在一些实施方案中，X2X28、X6X28或X10X28为AR。在一些实施方案中，X17X28或X20X28为WR。在一些实施方案中，X17X20为WW。
如在以下实验部分中详细描述的，IL-17A结合多肽变体的选择已导致鉴定出大量单独IL-17A结合基序(BM)序列。这些序列构成根据该方面的序列i)的单独实施方案。单独IL-17A结合基序的序列相应于图1中展示的SEQ ID NO:1-1216中的氨基酸位置8-36。因此，在根据该方面的IL-17A结合多肽的一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-1216组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-66、1200、1206和1214组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-66组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-35组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-27组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-10组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ IDNO:1-7组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。在一个实施方案中，序列i)相应于SEQ ID NO:1中从位置8至位置36的序列。
在本公开内容的一些实施方案中，如以上定义的BM“形成”三螺旋束蛋白结构域“的一部分”。这被理解为意指将BM的序列“插入”进原始三螺旋束结构域的序列中或“移植”在原始三螺旋束结构域的序列上，使得BM替代原始结构域中的相似结构基序。例如，不希望受理论的束缚，BM被认为构成三螺旋束的三个螺旋中的两个，并因此可以替代任何三螺旋束内的此类双螺旋基序。如本领域技术人员将认识到的，三螺旋束结构域的两个螺旋被两个BM螺旋的替代必须被进行为不影响多肽的基本结构。即，根据本发明的该实施方案的多肽的Cα骨架的整体折叠与其形成一部分的三螺旋束蛋白结构域的整体折叠基本上一致，例如以相同顺序具有相同的二级结构元件等。因此，如果根据该方面的该实施方案的多肽具有与原始结构域相同的折叠，那么根据本公开内容的BM“形成”三螺旋束结构域“的一部分”，意味着共有基本结构特性，例如，导致相似CD光谱的那些特性。本领域技术人员知晓相关的其他参数。
在特定实施方案中，IL-17A结合基序(BM)因此形成三螺旋束蛋白结构域的一部分。例如，BM可以基本上构成所述三螺旋束蛋白结构域内具有互相连接的环的两个α螺旋。在特定的实施方案中，所述三螺旋束蛋白结构域选自细菌受体蛋白的结构域。此类结构域的非限制性实例为来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的五个不同的三螺旋结构域，诸如结构域B，及其衍生物。在一些实施方案中，三螺旋束蛋白结构域为蛋白Z的变体，所述蛋白Z源自葡萄球菌(staphylococcal)蛋白A的结构域B。
在其中如本文公开的IL-17A结合多肽形成三螺旋束蛋白结构域的一部分的实施方案中，IL-17A结合多肽可以包含选自以下的氨基酸序列结合模块(BMod)：
iii)K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ；
其中
[BM]为如本文定义的IL-17A结合基序，条件是X29为D；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；
Xf选自A和S；和
iv)与由iii)定义的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中可以是有益的为，所述多肽在生产或储存期间以及在体内表现出高的结构稳定性，诸如对化学修饰、对物理条件的改变以及对蛋白水解的耐受。因此，在其中如本文公开的IL-17A结合多肽形成三螺旋束蛋白结构域的一部分的实施方案中，IL-17A结合多肽可以包含选自以下的氨基酸序列结合模块(BMod)：
v)K-[BM]-QPEQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ，
其中
[BM]为如本文定义的IL-17A结合基序，条件是X29为R；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；
Xf选自A和S；和
vi)与由v)定义的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
如以上讨论的，与以上的氨基酸序列相比包含微小改变的多肽也在本公开内容的范围内，所述改变不大程度地影响多肽的三级结构或功能。因此，在一些实施方案中，序列iv)和vi)分别与由iii)或v)定义的序列具有至少87％同一性、诸如至少89％同一性、诸如至少91％同一性、诸如至少93％同一性、诸如至少95％同一性、诸如至少97％同一性。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xa为A。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xa为S。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xb为N。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xb为E。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xc为A。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xc为S。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xc为C。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xd为E。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xd为N。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xd为S。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xe为D。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xe为E。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xe为S。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的XdXe选自EE、ES、SD、SE和SS。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的XdXe为ES。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的XdXe为SE。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的XdXe为SD。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xf为A。
在一个实施方案中，序列iii)或v)中的Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为ND且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A；XdXe为ND且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为ND且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为ND且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为ND且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为ND且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为SE且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A；XdXe为SE且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为SE且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为SE且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A；XdXe为SE且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为SE且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为ES且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A；XdXe为ES且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为ES且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为ES且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为ES且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为SD且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A；XdXe为SD且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为SD且Xf为A。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为SD且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A；XdXe为SD且Xf为S。
在一个实施方案中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为SD且Xf为S。
在又另外的实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-1216组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-66、1200、1206和1214组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-66组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-35组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在另一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-27组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-10组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在又另一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQID NO:1-7组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。在一个实施方案中，序列iii)相应于选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的序列中从位置7至位置55的序列，且在另一个实施方案中，序列iii)相应于SEQ ID NO:1中从位置7至位置55的序列。
并且，在另外的实施方案中，提供了IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
vii)YA-[BMod]-AP；
其中[BMod]为如以上定义的IL-17A结合模块；和
viii)与由vii)定义的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。
在可选的另外的实施方案中，提供了IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
ix)FA-[BMod]-AP；
其中[BMod]为如以上定义的IL-17A结合模块；和
x)与由ix)定义的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。
可选地，提供了IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xi)FN-[BMod]-AP；
其中[BMod]为如以上定义的IL-17A结合模块；和
xii)与由xi)定义的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。
如以上讨论的，包含与以上氨基酸序列相比的微小改变而不大程度地影响其三级结构和功能的多肽也落入本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，如以上定义的IL-17A结合多肽可以例如具有与由vii)、ix)或xi)定义的序列至少88％、诸如至少90％、诸如至少92％、诸如至少94％、诸如至少96％、诸如至少98％相同的序列。
在一些实施方案中，IL-17A结合基序可以形成包含选自以下的氨基酸序列的多肽的一部分：
SEQ ID NO:
其中[BM]为如以上定义的IL-17A结合基序。
在一个实施方案中，IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xiii)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]为如以上定义的IL-17A结合基序；和
xiv)与xiii)中定义的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。
再一次，与以上氨基酸序列相比包含较小的改变且不大程度地影响其三级结构和功能的多肽也在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，如以上定义的IL-17A结合多肽可以例如具有与由xiii)定义的序列至少87％、诸如至少89％、诸如至少91％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少96％、诸如至少98％相同的序列。
此类多肽中的序列xiii)可以选自由SEQ ID NO:1-1216组成的组。在一个实施方案中，序列xiii)选自由SEQ ID NO:1-66、1200、1206和1214组成的组。在一个实施方案中，序列xiii)选自由SEQ ID NO:1-66组成的组。在一个实施方案中，序列xiii)选自由SEQ IDNO:1-35组成的组。在另一个实施方案中，序列xiii)选自由SEQ ID NO:1-27组成的组。在一个实施方案中，序列xiii)选自由SEQ ID NO:1-10组成的组。在一个实施方案中，序列xiii)选自SEQ ID NO:1-7。在一个实施方案中，序列xiii)选自由SEQ ID NO:1-4组成的组。在一个实施方案中，序列xiii)为SEQ ID NO:1。
在一个实施方案中，IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xv)AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]为如以上定义的IL-17A结合基序；和
xvi)与xv)中定义的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。
再一次，与以上氨基酸序列相比包含较小的改变且不大程度地影响其三级结构和功能的多肽也在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，如以上定义的IL-17A结合多肽可以例如具有与由xv)定义的序列至少87％、诸如至少89％、诸如至少91％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少96％、诸如至少98％相同的序列。
此类多肽中的序列xv)可以选自由SEQ ID NO:1217-1222组成的组。在一个实施方案中，序列xv)选自由SEQ ID NO:1218-1222组成的组。在一个实施方案中，序列xv)选自由SEQ ID NO:1219-1222组成的组。在另一个实施方案中，序列xv)选自由SEQ ID NO:1219和SEQ ID NO:1222组成的组。在一个实施方案中，序列xv)为SEQ ID NO:1219。
本公开内容的IL-17A结合结构域的小尺寸和稳健性赋予了超过基于常规单克隆抗体的疗法的几种优势。此类优势包括以比抗体更高剂量皮下(s.c.)施用的可能性、替代的施用途径、为了优异效力的格式的灵活性和不存在Fc介导的副作用。小尺寸与非常高的溶解度(>100mg/ml)潜力和稳定性组合允许用于s.c.注射的在小体积内极大摩尔量的药物。对于全身性施用，这暗示了门诊患者使用方便的、小的预填充注射器或自动注射器以小体积和良好地耐受的剂量施用来“家庭使用”治疗。另外，在药物制品中高摩尔浓度的能力结合在多样的制剂中保持功能稳定性的能力开启了局部(皮肤、眼睛、肺)施用途径。银屑病、哮喘、葡萄膜炎和干眼综合征(dry eye syndrome)为在IL-17A介导的疾病中替代的施用途径可特别有意义的适应症的实例。
如在本说明书中使用的术语“IL-17A结合”和“对IL-17A的结合亲和力”指可以例如通过ELISA、通过使用表面等离子体共振(SPR)技术或通过使用动力学排除测定测试的多肽的特性。例如，如在以下实施例中描述的，IL-17A结合亲和力可以在以下实验中被测试，在所述实验中多肽的样品被捕获在包被抗体的ELISA板上，并添加生物素化的IL-17A，随后是链霉抗生物素蛋白缀合的HRP。添加TMB底物，并使用多孔板读取器，诸如Victor3(Perkin Elmer)来测量在450nm处的吸光度。然后，技术人员可以解释通过此类实验获得的结果，以至少建立多肽对IL-17A的结合亲和力的定性测量。如果定量测量是期望的，例如，以确定相互作用的EC50值(半最大有效浓度)，也可以使用ELISA。多肽针对生物素化的IL-17A的稀释系列的应答使用如以上描述的ELISA来测量。然后，技术人员可解释通过此类实验获得的结果，且EC50值可以使用例如GraphPad Prism 5和非线性回归从结果计算。
IL-17A结合亲和力还可以在以下实验中测试，在所述实验中，IL-17A或其片段被固定在表面等离子体共振(SPR)仪器的传感器芯片上，且包含待测试的多肽的样品在芯片上通过。可选地，待被测试的多肽被固定在仪器的传感芯片上，并且使包含IL-17A或其片段的样品在芯片上通过。然后，技术人员可以解释通过此类实验获得的结果，以至少建立多肽对IL-17A的结合亲和力的定性测量。如果定量测量是期望的，例如以确定相互作用的KD值，也可以使用表面等离子体共振方法。例如，结合值可以在Biacore(GE Healthcare)或ProteOn XPR 36(Bio-Rad)仪器中来定义。IL-17A被适当地固定在仪器的传感器芯片上，并且将要被确定亲和力的多肽的样品通过连续稀释被制备并以随机顺序被注射。然后，KD值可以使用例如由仪器制造商提供的BIAevaluation 4.1软件的1:1Langmui结合模型，或其他合适的软件从结果计算。
用于确定对IL-17A的结合亲和力的另一种方法为动力学排除测定(Sapidyne Instruments Inc,Boise,USA；Darling and Brault,2004.Assay and Drug DevTech 2(6):647-657)，其用于测量溶液中未修饰分子之间的平衡结合亲和力和动力学。对于亲和力分析，平衡解离常数KD和缔合速率ka实验地确定，而解离速率kd可以基于等式kd＝KD*ka计算。
KD分析要求将一个相互作用配偶体(partner)(例如滴定的结合配偶体)固定在固相上，然后将其用作探针以在达到平衡后捕获溶液中游离的其他相互作用配偶体(例如恒定结合配偶体)。对于每一个实验，使一种结合配偶体的恒定浓度的一系列溶液与另一种结合配偶体的滴定平衡。然后将溶液短暂暴露于固相，并且捕获一部分游离的恒定结合配偶体并将其用荧光次级分子标记。与固相的短接触时间小于溶液中预形成的复合物解离所需的时间，意味着，溶液和固相滴定的结合配偶体之间的竞争被“动力学排除”。由于固相仅用作每一个样品中游离的恒定结合配偶体的探针，所以溶液平衡在测量期间不变化。KD值从由捕获的游离的恒定结合配偶体生成的信号计算，所述信号与所平衡的样品中游离的恒定结合配偶体的浓度成正比。可以使用Pro软件和最小二乘分析来分析数据，以将KD和活性结合位点浓度(ABC)的最佳解决方案拟合为表示化学计量相关模型例如1:1可逆双分子相互作用的曲线。
除了测量结果被“预平衡”收集以外，结合动力学的确定可以以与平衡分析相似的格式进行，并且结合信号为时间和滴定的结合配偶体的总浓度的函数。存在两种可以用来确定ka的方法。“直接方法”保持滴定和恒定结合配偶体的浓度固定，并随时间探测溶液。当样品朝向平衡移动时，溶液中游离的恒定结合配偶体的量将降低。“注射方法”保持孵育时间和一种配偶体的浓度固定，同时滴定另一种配偶体的浓度。随着滴定的结合配偶体的浓度增加，游离的恒定结合配偶体的量将随着形成更多的配合物而降低。
在一个实施方案中，IL-17A结合多肽能够结合IL-17A，以使得相互作用的KD值为至多1x10-6M，诸如至多1x10-7M，诸如至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M。
在一个实施方案中，根据本文公开的任何方面的IL-17A结合多肽能够结合选自由人类IL-17A和鼠IL-17A组成的组的IL-17A分子。在一个实施方案中，IL-17A结合多肽能够结合人类IL-17A。在一个实施方案中，IL-17A结合多肽能够结合鼠IL-17A。在一个实施方案中，IL-17A结合多肽能够结合人类IL-17A和鼠IL-17A。在这方面，人类IL-17A可以包含氨基酸序列SEQ ID NO:1226或其抗原性有效片段。同样地，鼠IL-17A可以包含氨基酸序列SEQID NO:1227或其抗原性有效片段。
技术人员将理解，可以对根据本文公开的任何方面的IL-17A结合多肽进行多种修饰和/或添加，以对特定应用定制多肽而不偏离本公开内容的范围。
例如，在一个实施方案中，提供了如本文描述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽已在C末端和/或N末端延长和/或包含另外的氨基酸。此类多肽应该被理解为在多肽链中的第一和/或最末位置处(即在序列i)或ii)的N-和/或C-末端)具有一个或更多个另外的氨基酸残基的多肽。因此，IL-17A结合多肽可以包含任何合适数目的另外的氨基酸残基，例如至少一个另外的氨基酸残基。每一个另外的氨基酸残基可以单独或共同地被添加，以例如改进和/或简化多肽的产生、纯化、体内或体外的稳定、偶联或检测。此类另外的氨基酸残基可以包含出于化学偶联的目的添加的一个或更多个氨基酸残基。这样的一个实例为添加半胱氨酸残基。另外的氨基酸残基还可以提供用于多肽的纯化或检测的“标签”，诸如His6标签、(HisGlu)3标签(“HEHEHE”标签)或“myc”(c-myc)标签或“FLAG”标签，用于与对标签特异性的抗体相互作用或在His6-标签的情况下用于固定金属亲和层析(IMAC)。
如以上讨论的另外的氨基酸可以通过化学缀合(使用已知的有机化学方法)或通过任何其他的方法被偶联至IL-17A结合多肽，任何其他的方法诸如将IL-17A结合多肽表达为融合蛋白或以任何其他方式直接或经由接头例如氨基酸接头连接。
如以上讨论的另外的氨基酸可以例如构成一个或更多个多肽结构域。另外的多肽结构域可以向IL-17A结合多肽提供另一种功能，诸如例如又另一种结合功能、酶促功能、毒性功能、荧光信号传导功能、或其组合。
此外，另外的多肽结构域可以提供具有相同IL-17A结合功能的另一种IL-17A结合部分。因此，在另外的实施方案中，提供了多聚体形式的IL-17A结合多肽。所述多聚体被理解为包含至少两个如本文公开的IL-17A结合多肽作为单体单元，所述单体单元的氨基酸序列可以相同或不同。多聚体形式的多肽可以包含合适数目的结构域，每一个结构域具有IL-17A结合基序，并且每一个结构域形成多聚体内的单体。这些结构域可具有相同的氨基酸序列，但可选地，它们可具有不同的氨基酸序列。换言之，本发明的IL-17A结合多肽可以形成同多聚体或异多聚体，例如同二聚体或异二聚体。在一个实施方案中，提供了IL-17A结合多肽，其中所述单体单元被共价偶联在一起。在另一个实施方案中，所述IL-17A结合多肽单体单元被表达为融合蛋白。在一个实施方案中，提供了呈二聚体形式的IL-17A结合多肽。
另外，其中本文描述的IL-17A结合多肽或其多聚体构成第一结构域或第一部分，且第二和另外的部分具有除结合IL-17A以外的其他功能的“异种”融合多肽或蛋白或缀合物也被预期，并落入本公开内容的范围内。在这样的蛋白中的融合多肽或缀合物的第二和另外的一个或更多个部分适当地具有期望的生物学活性。
因此，在本公开内容的第二方面，提供了融合蛋白或缀合物，所述融合蛋白或缀合物包含由根据第一方面的IL-17A结合多肽组成的第一部分，和由具有期望的生物学活性的多肽组成的第二部分。在另一个实施方案中，所述融合蛋白或缀合物可另外包含另外的部分，所述另外的部分包含期望的生物学活性，所述期望的生物学活性可与所述第二部分的生物学活性相同或不同。
期望的生物学活性的非限制性实例包括治疗活性、结合活性、以及酶促活性。
在一个实施方案中，具有期望的生物学活性的第二部分是治疗活性多肽。
治疗活性多肽的非限制性实例是生物分子，例如选自由人内源酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子和淋巴因子组成的组的分子。预期的细胞因子的非限制性实例为IL-2、IL--4、IL-7、IL-10、IL-11、IL-13、IL-21、IL-27、IL-35、IFNβ和TGFβ。预期的趋化因子的非限制性实例为SDF-1/CXCL12、BCL/BCA-1/CXCL13、CXCL16、HCC1/CCL14、TARC/CCL17、PARC/CCL18、MIP-3β/ELC/CCL19、SLC/CCL21、CCL25/TECK和CCL27/CTACK。
结合活性的非限制性实例为增加融合蛋白或缀合物的体内半衰期的结合活性。在一个特定的实施方案中，所述结合活性为增加融合蛋白或缀合物的体内半衰期的白蛋白结合活性。在一个实施方案中，所述白蛋白结合活性由链球菌(streptococcal)G蛋白的白蛋白结合结构域或其衍生物提供。在另一个特定的实施方案中，所述结合活性为增加融合蛋白或缀合物的体内半衰期的FcRn结合活性。
在一个实施方案中，该第二方面的融合蛋白或缀合物包含通过白蛋白结合部分连接的第一方面的IL-17A结合多肽的两个单体，该两个单体的氨基酸序列可以相同或不同。在该构建体的特定实施方案中，融合蛋白或缀合物包含两个IL-17A结合单体，在它们之间具有白蛋白结合部分。所述白蛋白结合部分可以例如为来自链球菌G蛋白的“GA”白蛋白结合结构域，诸如在WO2009/016043、WO2012/004384、WO2014/048977和WO2015/091957的任何一个中描述的“GA3”或其衍生物。
在一个实施方案中，此类融合蛋白或缀合物的格式为“Z-A-Z”，其中每一个“Z”单独地为如本文描述的IL-17A结合多肽，且“A”为白蛋白结合结构域。在一个实施方案中，此类具有“Z-A-Z”格式的IL-17A结合多肽能够结合IL-17A，以使得相互作用的KD值为至多1x10-10M，诸如至多1x10-11M，诸如至多1x10-12M，诸如至多1x10-13M。在一个实施方案中，此类“Z-A-Z”多肽包含选自由SEQ ID NO:1233-1247组成的组，例如选自由SEQ ID NO:1236、1237和1242-1247组成的组，诸如选自由SEQ ID NO:1236、1244和1247组成的组或由SEQ IDNO:1237、1244和1247组成的组的氨基酸序列。在甚至更特定的实施方案中，“Z-A-Z”多肽包含选自由SEQ ID NO:1244和1245组成的组的氨基酸序列。在一个实施方案中，“Z-A-Z”多肽包含SEQ ID NO:1244。
在一个实施方案中，所述结合活性为对血管发生相关因子的结合。血管发生相关因子的非限制性实例包括成纤维细胞生长因子(FGF)、成纤维细胞生长因子1(FGF-1)、碱性FGF(basic FGF)、血管生成蛋白1(Ang-1)、血管生成蛋白2(Ang-2)、血管生成素1(Angpt-1)、血管生成素2(Angpt-2)、血管生成素3(Angpt-3)、血管生成素4(Angpt-4)、具有免疫球蛋白样结构域1的酪氨酸激酶(TIE-1)、具有免疫球蛋白样结构域2的酪氨酸激酶(TIE-2)、血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR-1)、血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2)、血管内皮细胞生长因子受体3(VEGFR-3)、血管内皮细胞生长因子A(VEGF-A)、血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)、血管内皮细胞生长因子C(VEGF-C)、血管内皮细胞生长因子D(VEGF-D)、血管内皮细胞生长因子E(VEGF-E)、胎盘生长因子(placental growth factor)(PlGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β2(TGF-β2)、转化生长因子β受体(I型、II型和III型)、基质金属蛋白酶(MMP)、MET受体酪氨酸激酶(也称为cMET和肝细胞生长因子受体(HGFR))、Notch受体家族的成员和β-连环蛋白(beta-catenin)。
在一个实施方案中，所述结合活性为对免疫应答相关因子的结合。免疫应答相关因子的非限制性实例包括
-T细胞调节因子诸如CD3、CD4、CD6、CD28、T-细胞受体α(TCRα)、T-细胞受体β(TCRβ)、细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2)、B7同源物3(B7-H3)、B7同源物4(B7-H4)、疱疹病毒入侵介导因子(herpes virus entry mediator)(HVEM)/B-和T-淋巴细胞弱化子(attenuator)(BTLA)、杀伤细胞抑制性受体(killer inhibitory receptor)(KIR)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、半乳凝素-9(Gal9)/T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM3)和腺苷/α-2肾上腺素能受体(A2aR)；
-NK细胞募集因子(NK-cell recruitment factor)诸如CD16、自然杀伤细胞凝集素样受体基因2D产物(NKG2D)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA1)和自然细胞毒性受体NKp30和NKp40；
-炎症相关因子诸如
·细胞因子及其受体，包括肿瘤坏死因子(TNF)；肿瘤坏死因子配体超家族(TNFSF)成员TNFSF11/RANKL、TNFSF12/TWEAK、TNFSF13、TNFSF13B/BAFF/BLys、TNFSF14、TNFSF15；白细胞介素(IL)IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-18、IL-22、IL-23、IL-26、IL-32、IL33和IL-34；干扰素INFα和INFγ；粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(granulocytecolony-stimulating factor)(GM-CSF)；以及
·炎性趋化因子及其受体，包括IL-8/CXCL8、ENA-78/CXCL5、GROα/CXCL1、CTAP-III/CXCL7、IP-10/CXCL10、Mig/CXCL9、PF4/CXCL4、GCP-2/CXCL6、MCP-1/CCL2、MIP-1α/CCL3、MIP-3α/CCL20、RANTES/CCL5、淋巴细胞趋化因子/XCL1和分形趋化因子(fractalkine)/CX3CL1。
在特别选择的实施方案中，所述第二部分的结合活性为对选自由TNF、IL-1β、IL-6、IL-17F和IL-23组成的组的靶的结合。
在本公开内容的第一或第二方面的一个实施方案中，提供了IL-17A结合多肽、融合蛋白或缀合物，所述IL-17A结合多肽、融合蛋白或缀合物包括免疫应答改变剂(modifying agent)。此类免疫应答改变剂的非限制性实例包括免疫抑制剂或免疫调控剂或其他抗炎剂。例如，如本文描述的IL-17A结合多肽、融合蛋白或缀合物可以包括选自由以下组成的组的剂：改变病情抗风湿药物(disease-modifying antirheumatic drug，DMARD)，诸如金盐、咪唑硫嘌呤、甲氨蝶呤和来氟米特；钙调磷酸酶抑制剂，诸如环孢菌素A或FK 506；淋巴细胞再循环调控剂；mTOR抑制剂，诸如雷帕霉素；具有免疫抑制特性的子囊霉素；糖皮质激素；皮质类固醇；环磷酰胺；免疫抑制单克隆抗体，例如对白细胞受体诸如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86或其配体具有亲和力的单克隆抗体；粘附分子抑制剂，诸如LFA-1拮抗剂、ICAM-1或ICAM-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；抗-TNF剂，诸如依那西普，和针对TNF的单克隆抗体，诸如英夫利昔单抗和阿达木单抗；促炎性细胞因子的抑制剂；IL-1阻断剂诸如阿那白滞素或IL-1陷阱(trap)；IL-6阻断剂；趋化因子抑制剂；非甾体抗炎药物(NSAID)诸如阿司匹林；以及抗感染剂和其他免疫应答调控剂；以及以上任何两种或更多种的组合。
在本公开内容的第一或第二方面的一个实施方案中，提供了IL-17A结合多肽、融合蛋白或缀合物，所述IL-17A结合多肽、融合蛋白或缀合物包括毒性化合物。此类毒性化合物的非限制性实例包括卡利奇霉素(calicheamicin)、美登醇(maytansinoid)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、为炔霉素(dynemicin)、kedarcidin、maduropeptin、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、奥瑞他汀(auristatin)、蓖麻毒素-A链(ricin-A chain)、蒴莲根毒素(modeccin)、截短的假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A、白喉毒素和重组多花白树毒蛋白(gelonin)。
最近，在开发多特异性剂，诸如，具有结合多于一种抗原的能力的抗体方面已取得显著的进展，例如通过工程化互补决定区域(CDR)以在单个抗体组合位点中满足两种抗原(Bostrom等,2009,Science323(5921):1610-1614；Schaefer等,2011,Cancer Cell 20(4):472-486)，经由使用工程化的Fc单元构建异质二聚体抗体(Carter,2001,J ImmunolMethods 248(1-2):7-15；Schaefer等,2011,Proc Natl Acad Sci USA108(27):11187-11192)以及经由将辅助识别单元基因融合至全长抗体的轻链或重链的N-末端或C-末端(Kanakaraj等,2012,MAbs 4(5):600-613；LaFleur等,2013,MAbs 5(2):208-218)。
如以上讨论的，以下可以是有益的，如本文公开的对IL-17A具有亲和力的多肽也对另一种因子，诸如免疫应答相关因子，例如炎症相关因子表现出亲和力。
因此，在本公开内容的第三方面，提供了一种复合物，所述复合物包含至少一种如本文定义的IL-17A结合多肽和至少一种抗体或其抗原结合片段。
当在本文中用于表示本公开内容的第三方面时，术语“复合物”被意图指两个或更多个缔合的多肽链，一个通过如以上定义的其IL-17A结合基序的作用具有对IL-17A的亲和力，并且另一个为抗体或其抗原结合片段。这些多肽链可以各自包含如以上对于第一和第二方面的IL-17A结合多肽详细描述的不同的蛋白结构域，并且所得到的多蛋白复合物可以具有多种功能。“复合物”意图指由共价键连接的如以上定义的两个或更多个多肽，例如通过将其表达为重组的融合蛋白而由共价键连接或通过化学缀合而缔合的两个或更多个多肽链。
第三方面提供了一种复合物，所述复合物包含抗体或其抗原结合片段。如被熟知的，抗体为能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区域的至少一个抗原识别位点特异性结合靶(抗原)的免疫球蛋白分子，所述靶诸如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽或其他。如本文使用的，术语“抗体或其抗原结合片段”不仅包括全长或完整的多克隆抗体或单克隆抗体，还包括：其抗原结合片段，诸如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fab3、Fv及其变体；包含一个或更多个抗体部分的融合蛋白；人源化抗体；嵌合抗体；微型抗体(minibodies)；双链抗体(diabodies)；三链抗体(triabodies)；四链抗体(tetrabodies)；线性抗体；单链抗体；多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及免疫球蛋白分子的包含所需特异性的抗原识别位点的任何其他修饰的构造，包括抗体的糖基化变体，抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。修饰的抗体及其抗原结合片段的另外的实例包括纳米抗体、AlbudAb、DART(双亲和力重靶向)、BiTE(双特异性T-细胞衔接器(bispecific T-cell engager))、TandAb(串联双链抗体)、DAF(双重作用Fab)、二合一抗体(two-in-one antibodies)、SMIP(小模块免疫药物(small modular immunopharmaceuticals))、FynomAb(与抗体融合的fynomer)、DVD-Ig(双重可变结构域免疫球蛋白)、CovX-body(肽修饰的抗体)、duobody和triomAb。抗体及其抗原结合片段的变体的该列举不被认为是限制性的，并且技术人员知道其他合适的变体。
全长抗体包含两个重链和两个轻链。每一个重链包含重链可变区(VH)和第一恒定区、第二恒定区和第三恒定区(CH1、CH2和CH3)。每一个轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。取决于抗体的重链的恒定结构域的氨基酸序列，抗体被指定为不同的类别。存在6大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY，并且这些抗体中的几种可以被进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。如本文使用的术语“全长抗体”指任何类别的抗体，诸如IgD、IgE、IgG、IgA、IgM或IgY(或其任何亚类)。不同类别的抗体的亚基结构和三维构造是熟知的。
“抗原结合片段”为抗体分子的保留了相应全长抗体的所有或重要的抗原结合部分的部分或区域，或其衍生物。抗体结合片段可以包含重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)，或两者。VH和VL的每一个通常包含3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。VH或VL中的3个CDR侧翼为框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)。如以上简要地列出的，抗原结合片段的实例包括但不限于：(1)Fab片段，所述Fab片段为具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)Fab’片段，所述Fab’片段为具有重链铰链区的Fab片段，(3)F(ab′)2片段，所述F(ab′)2片段为通过重链铰链区连接，例如通过在铰链区的二硫桥连接的Fab’片段的二聚体；(4)Fc片段；(5)Fv片段，所述Fv片段为具有抗体的单臂的VL和VH结构域的最小抗体片段；(6)单链Fv(scFv)片段，所述单链Fv(scFv)片段为其中scFv的VH和VL结构域通过肽接头连接的多肽单链；(7)(scFv)2，所述(scFv)2包含两个VH结构域和两个VL结构域并经由二硫桥通过两个VH结构域缔合，以及(8)结构域抗体，所述结构域抗体可以是特异性地结合抗原的抗体单可变结构域(VH或VL)多肽。
抗原结合片段可以经由常规方法制备。例如，F(ab′)2片段可以通过全长抗体分子的胃蛋白酶消化产生，并且Fab片段可以通过还原F(ab′)2片段的二硫桥产生。可选地，片段可以经由重组技术通过在合适的宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞或昆虫细胞)中表达重链片段和轻链片段并使它们组装以在体内或体外形成期望的抗原结合片段来制备。单链抗体可经由重组技术通过连接编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列来制备。例如，可在两个可变区之间掺入柔性接头。技术人员知晓用于制备全长抗体及其抗原结合片段两者的方法。
因此，在一个实施方案中，本公开内容的该方面提供了一种如本文定义的复合物，其中所述至少一种抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：全长抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab′)2片段、Fc片段、Fv片段、单链Fv片段、(scFv)2和结构域抗体。在一个实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段选自全长抗体、Fab片段和scFv片段。在一个特定的实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段为全长抗体。
在如本文定义的所述复合物的一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体及其抗原结合片段。
如本文使用的术语“单克隆抗体”指具有单价亲和力的抗体，意指单克隆抗体的样品中的每一种抗体分子结合抗原上的同一表位，而如本文使用的术语“多克隆抗体”指对特定的抗原起反应的抗体集合，但在该集合中可以存在例如鉴定抗原上的不同表位的不同抗体分子。多克隆抗体通常通过接种合适的哺乳动物产生并从哺乳动物的血清纯化。单克隆抗体由为唯一的亲本细胞的克隆(例如杂交瘤细胞系)的相同的免疫细胞产生。如本文使用的术语“人类抗体”指具有基本上相应于或源自从人类受试者获得的抗体的可变区和恒定区的抗体。如本文使用的术语“嵌合抗体”指重组抗体或遗传工程化的抗体，诸如例如包含来自不同的物种例如人类的多肽或结构域的鼠单克隆抗体，所述来自不同的物种的多肽或结构域被引入以减少抗体的免疫原性。术语“人源化抗体”指来自非人类物种，其蛋白序列已被修饰以增加它们与在人类中自然产生的抗体变体的相似性以降低免疫原性的抗体。
对于如本文定义的复合物，除了能够结合IL-17A以外，靶向至少一种另外的抗原，诸如选自由与血管发生相关紊乱相关的抗原和与免疫应答相关的抗原组成的组的抗原可以是有益的。在一个实施方案中，所述另外的抗原与血管发生相关。在一个实施方案中，所述另外的抗原与免疫应答相关。
在一个实施方案中，抗原与血管发生相关，并且选自由以下组成的组：成纤维细胞生长因子(FGF)、成纤维细胞生长因子1(FGF-1)、碱性FGF、血管生成蛋白1(Ang-1)、血管生成蛋白2(Ang-2)、血管生成素1(Angpt-1)、血管生成素2(Angpt-2)、血管生成素3(Angpt-3)、血管生成素4(Angpt-4)、具有免疫球蛋白样结构域1的酪氨酸激酶(TIE-1)、具有免疫球蛋白样结构域2的酪氨酸激酶(TIE-2)、血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR-1)、血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2)、血管内皮细胞生长因子受体3(VEGFR-3)、血管内皮细胞生长因子A(VEGF-A)、血管内皮细胞生长因子B(VEGF-B)、血管内皮细胞生长因子C(VEGF-C)、血管内皮细胞生长因子D(VEGF-D)、血管内皮细胞生长因子E(VEGF-E)、胎盘生长因子(PlGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β2(TGF-β2)、转化生长因子β受体(I型、II型和III型)、基质金属蛋白酶(MMP)、MET受体酪氨酸激酶(也称为cMET和肝细胞生长因子受体(HGFR))、Notch受体家族的成员和β-连环蛋白。在一个实施方案中，所述抗体或其片段选自由AMG 780、AMG 386、MEDI-3617、nesvacumab、CVX-241、贝伐单抗(bevacizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、VGX100、CVX-241、ABP 215、PF-06439535、fresolimumab、metelimumab、onartuzumab、emibetuzumab和tarextumab组成的组。
在一个实施方案中，抗原与免疫应答或免疫系统紊乱相关，并且选自由以下组成的组：
-T细胞调节因子诸如CD3、CD4、CD6、CD28、T-细胞受体α(TCRα)、T-细胞受体β(TCRβ)、细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，程序性死亡配体1(PD-L1)、程序性死亡配体2(PD-L2)、B7同源物3(B7-H3)、B7同源物4(B7-H4)、疱疹病毒入侵介导因子(HVEM)/B-和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、杀伤细胞抑制性受体(KIR)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、半乳凝素-9(Gal9)/T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM3)和腺苷/α-2肾上腺素能受体(A2aR)；
-NK-细胞募集因子诸如CD16、自然杀伤细胞凝集素样受体基因2D产物(NKG2D)、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA1)和自然细胞毒性受体NKp30和NKp40；
-炎症相关因子诸如
·细胞因子及其受体，包括肿瘤坏死因子(TNF)；肿瘤坏死因子配体超家族(TNFSF)成员TNFSF11/RANKL、TNFSF12/TWEAK、TNFSF13、TNFSF13B/BAFF/BLys、TNFSF14、TNFSF15；白细胞介素(IL)IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-18、IL-22、IL-23、IL-26、IL-32、IL33和IL-34；干扰素INFα和INFγ；粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(granulocytecolony-stimulating factor)(GM-CSF)；以及
·炎性趋化因子及其受体，包括IL-8/CXCL8、ENA-78/CXCL5、GROα/CXCL1、CTAP-III/CXCL7、IP-10/CXCL10、Mig/CXCL9、PF4/CXCL4、GCP-2/CXCL6、MCP-1/CCL2、MIP-1α/CCL3、MIP-3α/CCL20、RANTES/CCL5、淋巴细胞趋化因子/XCL1和分形趋化因子/CX3CL1。
在一个实施方案中，抗原选自由TNF、IL-1β、IL-6、IL-17F和IL-23组成的组。
在一个实施方案中，所述抗体或其片段选自由visilizumab、otelixizumab、伊匹单抗(ipilimumab)、tremelimumab、pembrolizumab、纳武单抗(nivolumab)、pidilizumab、MPDL3280A、MEDI-4736、MPDL3280A和lirilumab、及其抗原结合片段组成的组。
在一个特定的实施方案中，所述抗原为TNF。在一个实施方案中，所述抗体或其片段选自由阿达木单抗、英夫利昔、戈利木单抗(golimumab)、赛妥珠单抗(certolimumabpegol)及其抗原结合片段组成的组。在另一个实施方案中，所述抗体或其片段为选自由阿达木单抗、英夫利昔、戈利木单抗和赛妥珠单抗组成的组的全长抗体。在一个特定的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为阿达木单抗或其抗原结合片段，例如全长阿达木单抗。
如本文描述的复合物可以例如以融合蛋白或缀合物的形式存在。因此，所述至少一种IL-17A结合多肽和所述至少一种抗体或其抗原结合片段可以通过化学缀合的方法(使用已知的有机化学方法)或通过任何其他方法诸如将复合物表达为融合蛋白而被偶联，或以其他方式直接地或经由接头例如氨基酸接头而被连接。
因此，在一个实施方案中，提供了一种如本文定义的复合物，其中所述复合物为融合蛋白或缀合物。在一个实施方案中，所述复合物为融合蛋白。在另一个实施方案中，所述复合物为缀合物。在所述复合物的一个实施方案中，所述IL-17A结合多肽被附接至所述抗体或其抗原结合片段的重链的N-末端或C-末端。在另一个实施方案中，所述IL-17A结合多肽被附接至所述抗体或其抗原结合片段的轻链的N-末端或C-末端。在一个实施方案中，所述IL-17A结合多肽被附接至所述抗体或其抗原结合片段的轻链和重链的N-末端和/或C-末端。例如，IL-17A结合多肽可以被附接至所述抗体或其抗原结合片段的仅重链的N-末端、仅轻链的N-末端、仅重链的C-末端、仅轻链的C-末端、重链的N-末端和C-末端两者、轻链的N-末端和C-末端两者、仅轻链的C-末端和重链的N-末端、仅重链的C-末端和轻链的N-末端。
如本领域技术人员理解的，融合蛋白的构建通常涉及在待融合的功能部分之间使用接头。技术人员知晓具有不同特性的不同种类的接头，诸如柔性的氨基酸接头、刚性的氨基酸接头和可裂解的氨基酸接头。接头已用于例如增加融合蛋白的稳定性或改进融合蛋白的折叠，以增加融合蛋白的表达，改进融合蛋白的生物学活性、亲和力和/或结合，使融合蛋白能够靶向并改变融合蛋白的药代动力学。因此，在一个实施方案中，如本文定义的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物还包含至少一种接头。接头可以例如选自由柔性的氨基酸接头、刚性的氨基酸接头和可裂解的氨基酸接头组成的组。可选地，接头可以是非肽接头。在如本文公开的融合蛋白或缀合物的一个实施方案中，所述接头被布置在由如本文定义的IL-17A结合多肽组成的第一部分和由具有期望的生物学活性的多肽组成的第二部分之间。在如本文公开的复合物的一个实施方案中，所述接头被布置在所述IL-17A结合多肽和所述抗体或其抗原结合片段之间。本领域技术人员将领会到，在任何以上提到的上下文中布置的接头的存在不排除在相同或任何其他情况下另外的接头的存在。
当连接的结构域要求一定程度的移动或相互作用时通常使用柔性的接头，并且在如本文定义的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物的一些实施方案中柔性的接头可以是特别有用的。此类接头通常包括小的、非极性氨基酸(例如G)或极性氨基酸(例如S或T)。一些柔性的接头主要由G和S残基的延伸组成，例如(GGGGS)p和(SSSSG)p。调整拷贝数“p”允许优化接头，以实现功能部分之间的适当分离或以维持必要的部分间相互作用。除了G和S接头以外，其他柔性的接头为本领域已知的，诸如包含另外的氨基酸残基的G和S接头，所述另外的氨基酸残基诸如T、A、K和E以维持柔性，以及极性氨基酸残基以改进溶解度。
在一个实施方案中，所述接头为包含甘氨酸(G)、丝氨酸(S)和/或苏氨酸(T)残基的柔性的接头。在一个实施方案中，所述接头包含具有选自(GnSm)p和(SnGm)p的通式的序列，其中，独立地，n＝1-7、m＝0-7、n+m≤8且p＝1-10。在一个实施方案中，n＝1-5。在一个实施方案中，m＝0-5。在一个实施方案中，p＝1-5。在一个更特定的实施方案中，n＝4、m＝1且p＝1-4。
在一个实施方案中，所述接头包含选自由G4S、(G4S)2、(G4S)3和(G4S)4组成的组的序列。
在一个实施方案中，所述接头包含具有通式GT(GnSm)p的序列，其中，独立地，n＝1-7、m＝0-7、n+m≤8且p＝1-10。在一个实施方案中，n＝1-5。在一个实施方案中，m＝0-5。在一个实施方案中，p＝1-5。在一个更特别的实施方案中，n＝4、m＝1且p＝1-4。因此，在n＝4的一个实施方案中，所述接头包含GT(G4S)p。在一个特定的实施方案中，n＝4且p＝1，使得所述接头包含GTG4S。在一个实施方案中，所述接头包含选自由GT(G4S)pTS、GT(G4S)pPR和GT(G4S)pPK组成的组的序列。
在一个实施方案中，所述接头包含具有通式GAP(GnSm)p的序列，其中，独立地，n＝1-7、m＝0-7、n+m≤8且p＝1-10。在一个实施方案中，n＝1-5。在一个实施方案中，m＝0-5。在一个实施方案中，p＝1-5。在一个更特定的实施方案中，n＝4、m＝1且p＝1-4。因此，在n＝4的一个实施方案中，所述接头包含GAP(G4S)p。在一个特定的实施方案中，n＝4且p＝1，使得所述接头包含GAPG4S。在一个实施方案中，所述接头包含选自由GAP(G4S)pTS、GAP(G4S)pPR和GAP(G4S)pPK组成的组的序列。
在一个实施方案中，所述接头包含选自由KL(G4S)p、LQ(G4S)p和YV(G4S)pPK组成的组的序列。在一个实施方案中，所述接头包含选自由S4G、(S4G)3、(S4G)4和(S4G)8组成的组的序列。在一个实施方案中，所述接头包含选自由VDGS、ASGS和VEGS组成的组的序列。在一个特定的实施方案中，所述接头包含ASGS。
关于掺入根据本公开内容的IL-17A结合多肽的融合蛋白、缀合物或复合物的以上描述，应注意，第一、第二和另外的部分的指定是为清楚的原因而做出，以将一方面根据本发明的一种或更多种IL-17A结合多肽和另一方面表现其他功能的部分进行区分。这些指定不意图指不同结构域在融合蛋白、缀合物或复合物的多肽链中的实际顺序。因此，例如，所述第一部分可以无限制地出现在融合蛋白、缀合物或复合物的N-末端、中间、或C-末端。
本公开内容还包括其中根据第一方面的IL-17A结合多肽、如在根据第二方面的融合蛋白或缀合物中或在根据第三方面的复合物中包含的IL-17A结合多肽还包含标记物的多肽，所述标记物诸如选自由荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性核素和颗粒组成的组的标记物。例如，此类标记物可用于检测多肽。
在其中标记的IL-17A结合多肽包含根据本公开内容的第一方面的IL-17A结合多肽和标记物的实施方案中，该标记的多肽可以被用于间接标记IL-17A表达细胞，诸如炎症相关的癌症的细胞。炎症相关的癌症的非限制性实例包括胃癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌和腺癌(Wu等，2014Tumour Biol.35(6):5347-56；Wu等，2012PLoS One 7(12)；Zhang等2012 Asian Pac J Cancer Prev 13(8):3955-60；Liu等，2011Biochem BiophysRes Commun.407(2):348-54)。
在其他实施方案中，标记的IL-17A结合多肽作为还包含具有期望的生物学活性的第二部分和可能的另外部分的融合蛋白、缀合物或复合物中的部分存在。标记物可以在一些情况下被偶联至仅IL-17A结合多肽，且在一些情况下被偶联至IL-17A结合多肽和融合蛋白或缀合物的第二部分和/或复合物的抗体或抗原结合片段两者。此外，标记物可以被偶联至仅第二部分或抗体或其抗原结合片段而不偶联至IL-17A结合部分也是可能的。因此，在又另一个实施方案中，提供了IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含第二部分，其中所述标记物被偶联至仅所述第二部分。在另一个实施方案中，提供了一种如本文定义的复合物，其中所述标记物被偶联至仅抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，如本文描述的所述IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物包括由经由半胱氨酸残基的巯基基团或赖氨酸残基的胺基基团缀合至IL-17A结合多肽的聚氨基聚羧酸螯合剂提供的螯合环境。
在其中IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物被放射性标记的实施方案中，此类放射性标记的多肽可以包含放射性核素。大部分的放射性核素具有金属的性质并且金属通常不能与存在于蛋白和肽中的元素形成稳定的共价键。出于这个原因，用放射性金属对蛋白和肽的标记借助于与金属离子形成称为螯合物的非共价化合物的螯合剂，即多齿配体来进行。在IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物的实施方案中，放射性核素的掺入通过螯合环境的提供来实现，通过螯合环境的提供放射性核素可以被配位、螯合或络合至多肽。
螯合剂的一个实例为聚氨基聚羧酸类型的螯合剂。这样的聚氨基聚羧酸螯合剂可被区分为两类：大环螯合剂和无环螯合剂。
在一个实施方案中，IL-17A结合多肽、融合蛋白或缀合物包括由经由半胱氨酸残基的硫基基团或赖氨酸残基的ε胺基基团缀合至IL-17A结合多肽的聚氨基聚羧酸螯合剂提供的螯合环境。
用于铟、镓、钇、铋、放射性锕系元素(radioactinides)和放射性镧系元素(radiolanthanides)的放射性同位素的最常用的大环螯合剂为DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)的不同衍生物。在一个实施方案中，IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物的螯合环境由DOTA或其衍生物提供。更具体地，在一个实施方案中，由本公开内容所包括的螯合多肽通过使DOTA衍生物1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三-乙酸-10-马来酰亚胺乙基乙酰胺(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-tris-aceticacid-10-maleimidoethylacetamide)(马来酰亚胺单酰胺-DOTA(maleimidomonoamide-DOTA))与所述多肽反应来获得。
另外，1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)及其衍生物可以用作螯合剂。因此，在一个实施方案中。提供了IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，其中聚氨基聚羧酸螯合剂为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸或其衍生物。
最常用的无环聚氨基聚羧酸螯合剂为DTPA(二亚乙基三胺-五乙酸)的不同衍生物。因此，具有由二亚乙基三胺五乙酸或其衍生物提供的螯合环境的多肽也被本公开内容所包括。
在一个实施方案中，如本文描述的所述IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物还包含一个或更多个聚乙二醇(PEG)部分，例如以改进分子的药代动力学特性。
在本公开内容的第四方面，提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码如本文描述的IL-17A结合多肽或融合蛋白；表达载体，所述表达载体包含所述多核苷酸；和宿主细胞，所述宿主细胞包含所述表达载体。
本公开内容还包括一种产生如以上描述的多肽或融合蛋白的方法，所述方法包括在容许所述多肽由其表达载体表达的条件下培养所述宿主细胞，和分离所述多肽。
本公开内容的IL-17A结合多肽可以可选地使用具有保护的反应性侧链的氨基酸和/或氨基酸衍生物通过非生物肽合成来制备，所述非生物肽合成包括
-将氨基酸和/或氨基酸衍生物逐步偶联以形成具有保护的反应性侧链的根据第一方面的多肽，
-从多肽的反应性侧链去除保护基团，和
-在水性溶液中折叠多肽。
应理解，根据本公开内容的IL-17A结合多肽可以独立地被用作治疗剂、诊断剂或预后剂；或被用作用于靶向例如对IL-17A具有直接或间接的作用的其他治疗剂或诊断剂的工具(means)。直接治疗作用可以例如通过抑制IL-17A信号传导，诸如通过阻断IL-17A对其一种或更多种受体的结合来实现。
在另一方面，提供了组合物，所述组合物包含如本文描述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。在一个实施方案中，所述组合物还包含至少一种另外的活性剂，诸如至少两种另外的活性剂，诸如至少三种另外的活性剂。可以证明在此类组合物中有用的另外的活性剂的非限制性实例为本文描述的治疗活性多肽、免疫应答改变剂和毒性化合物。
技术人员将领会到，所述IL-17结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物或包含如本文描述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物的药物组合物可以使用标准施用技术施用至受试者，所述标准施用技术诸如包括口服、局部、静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌内、鼻内、含服(buccal)、舌下或栓剂施用。因此，在一个实施方案中，提供了如本文描述的用于口服、局部、静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌内、鼻内、含服、舌下或栓剂施用的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物或药物组合物。在一个特定的实施方案中，提供了如本文描述的用于口服施用的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物或药物组合物。在另一个特定的实施方案中，提供了如本文描述的用于局部施用，例如局部施用至眼睛的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物或药物组合物。
IL-17A也可以用作某些癌症诸如炎症相关癌症，例如胃癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌和腺癌的诊断和预后的有价值的标志物。例如，IL-17已被与罹患结肠直肠癌和肝细胞癌的患者中的预后和差的存活相关联。
因此，在本公开内容的另一个方面，提供如在本文中所描述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物用于作为药剂、诊断剂或预后剂使用。
在一个实施方案中，提供了如在本文描述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物，用于作为药剂以体内调控IL-17A功能。如本文使用的，术语“调控”指改变活性，诸如使IL-17A功能亚效等位基因部分地抑制或完全地抑制IL-17A功能。
其中IL-17A结合多肽可以用于治疗、预后和/或诊断的IL-17A相关状况或疾病的非限制性实例包括，关节炎，诸如类风湿性关节炎、关节炎慢性病(arthritis chronicaprogrediente)、变形性关节炎(arthritis deformans)和风湿性疾病，涉及骨损失的疾病、炎性疼痛、脊柱关节病(spondyloarhropathies)，包括强直性脊柱炎、莱特尔综合征(Reiter syndrome)、反应性关节炎、银屑病关节炎、肠炎性关节炎、少关节类风湿性关节炎(pauciarticular rheumatoid arthritis)、多关节类风湿性关节炎(polyarticularrheumatoid arthritis)、全身性发作类风湿性关节炎、骨关节炎；超敏反应状况诸如超敏反应(包括气道超敏反应(airways hypersensitivity)和皮肤超敏反应两者)、对变应原暴露的过敏和应答；胃肠道状况或疾病，诸如自身免疫性炎性肠病(包括例如溃疡性结肠炎、克罗恩病和肠易激综合征)、乳糜泄(celiac disease)(特发性口炎性腹泻(idiopathicsprue))、腹膜内脓肿和粘连(intraperitoneal abscesses and adhesions)、原发性胆汁性硬化(primary biliary sclerosis)、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、慢性活动性肝炎和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)相关性胃炎；眼部状况和疾病，诸如内分泌性眼病(endocrine ophthalmopathy)、格雷夫斯病、葡萄膜炎(前部和后部)、干燥性角膜结膜炎(keratoconjunctivitis sicca)(干眼病)、春季角膜结膜炎(vernalkeratoconjunctivitis)、疱疹性间质性角膜炎(herpetic stromal keratitis)和干眼病；肾部状况(nephrological conditions)和疾病，诸如肾小球性肾炎(有和没有肾病综合征(nephrotic syndrome)，例如包括特发性肾病综合征或微小病变型肾病(minimal changedisease))；急性状况和疾病，诸如急性和超急性炎性反应、脓毒性休克(例如，内毒素性休克和成人型呼吸窘迫综合征)、脑膜炎、肺炎、严重烧伤、急性感染、败血症、中风和局部缺血(ischemia)；恶病质(消瘦综合征)，诸如与病态TNF释放相关的恶病质、由于感染引起的恶病质、与癌症相关的恶病质、与器官功能异常相关的恶病质和AIDS相关性恶病质；骨相关状况和疾病，诸如骨代谢疾病，包括骨关节炎、骨质疏松、炎性关节炎、骨损失诸如年龄相关性骨损失、牙周病(periodontal disease)、骨植入物松动和骨侵蚀；幼年型状况和疾病，诸如幼年型类风湿性关节炎、少关节幼年型类风湿性关节炎、多关节幼年型类风湿性关节炎、全身性发作幼年型类风湿性关节炎、幼年型强直性脊柱炎、幼年型肠病性关节炎、幼年型反应性关节炎、幼年型莱特尔综合征、SEA综合征(血清阴性、肌腱端病(Enthesopathy)、关节病综合征)、幼年型皮肌炎、幼年型银屑病关节炎、幼年型硬皮病、幼年型系统性红斑狼疮和幼年型血管炎；血管炎，包括大血管的血管炎，诸如风湿性多肌痛、大动脉炎(Takayasu’sarteritis)和颞动脉炎，中血管的血管炎(vasculitis of medium vessels)，诸如Buerger氏病(Buerger’s disease)、皮肤血管炎、川崎病(Kawasaki disease)和结节性多动脉炎，小血管的血管炎诸如，综合征(s syndrome)、丘-斯综合征(Churg-Strausssyndrome)、皮肤血管炎、过敏性紫癜(Henoch-purpura)、微血管性血管炎(microscopic polyangiitis)、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)和Golfer血管炎(Golfer’s vasculitis)、可变血管的血管炎和动脉炎(vasculitis of variablevessels and arteritis)；皮肤状况或疾病，诸如银屑病、斑块型银屑病(plaquepsoriasis)、滴状银屑病(guttate psoriasis)、皮褶银屑病(inverse psoriasis)、脓疱性银屑病、红皮病性银屑病、皮炎和特应性皮炎；肺部状况和疾病，诸如阻塞性或炎性气道疾病、哮喘、支气管炎、COPD、肺尘埃沉着病、肺气肿、急性和超急性炎性反应、间质性肺纤维化(interstitial lung fibrosis)、气道炎症和支气管哮喘；代谢状况和疾病，诸如动脉粥样硬化、血脂异常和I型糖尿病；以及其他系统性自身免疫性状况和疾病，诸如系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎、多软骨炎、重症肌无力、史蒂芬斯-强森综合征(Stevens-Johnsonsyndrome)、肿瘤、肌炎、皮肌炎、成人型发作斯蒂尔病(adult-onset Still’s disease)、风湿性多肌痛(polymyalgia rheumatica)、结节病、硬皮病、硬化、系统性硬化症、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、多发性硬化(MS)、吉兰巴利病(Guillain-Barre disease)、艾迪生病(Addison’s disease)和雷诺现象(Raynaud’s phenomenon)。
如本文公开的IL-17A结合多肽还可以用于治疗心脏、肺、组合心肺、肝、肾、胰腺、皮肤或角膜移植物的接受者，包括同种异体移植物排斥或异种移植排斥，以及用于预防移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)，诸如在骨髓移植后，和器官移植物相关的动脉硬化。
如本文公开的IL-17A结合多肽还可以用于炎症相关癌症的治疗、诊断或预后。如本文使用的术语“癌症”指肿瘤疾病和/或癌症，诸如转移性或侵袭性癌症，例如肺癌、非小细胞肺癌(NSCL)、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤或眼内黑素瘤、直肠癌、肛门癌(cancer of the anal region)、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastriccancer)、结肠癌、结肠直肠癌、小肠癌、食道癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌(carcinoma of the renal pelvis)、间皮瘤、肝细胞癌、胆道癌、中枢神经系统(CNS)的赘生物、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤、腺癌、淋巴瘤、淋巴细胞白血病或未知起源的癌症、或其他增生性或赘生性(neoplastic)IL-17A相关状况，包括任何以上癌症的耐药形式或一种或更多种以上癌症或过度增殖性疾病的组合。
炎症相关的癌症的非限制性实例包括胃癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌和腺癌。
在一个实施方案中，提供了IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物，用于在治疗、诊断或预后IL-17A相关状况，诸如选自由炎性疾病、自身免疫性疾病、和癌症，诸如炎性疾病和自身免疫性疾病组成的组的状况中使用。在一个实施方案中，所述状况选自由炎性状况、过敏性状况、超敏反应、自身免疫性疾病、严重感染和移植物排斥组成的组。
在一个特定的实施方案中，所述IL-17A相关状况选自由类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、银屑病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、葡萄膜炎和干眼病组成的组。
在甚至更特定的实施方案中，所述IL-17A相关状况为银屑病。
在另一个实施方案中，所述IL-17A相关状况为炎症相关癌症，诸如选自由胃癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌和腺癌组成的组的癌症。
在相关的方面，提供了一种检测IL-17A的方法，所述方法包括提供疑似包含IL-17A的样品；使所述样品与如本文描述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物接触；和检测IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物的结合以指示样品中IL-17A的存在。在一个实施方案中，所述方法还包括中间洗涤步骤用于在接触样品之后去除未结合的多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物。
在一个实施方案中，所述方法为用于确定受试者中IL-17A的存在的诊断或预后方法，所述方法包括以下步骤：
-使受试者或从受试者分离的样品与如本文描述的IL-17A结合多肽、
融合蛋白、缀合物、复合物或组合物接触，和
-获得相应于已在所述受试者中或与所述样品结合的IL-17A结合多
肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物的量的值。
在一个实施方案中，所述方法还包括中间洗涤步骤用于在接触受试者或样品之后且在获得值之前去除未结合的多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物。
在一个实施方案中，所述方法还包括将所述值与参考比较的步骤。可以通过数值、阈值或视觉指示剂对所述参考评分，例如基于显色反应。技术人员将领会到，本领域已知的与参考比较的不同方式可以是适合使用的。
在此方法的一个实施方案中，所述受试者为哺乳动物受试者，诸如人类受试者。
在一个实施方案中，所述方法在体内进行。
在一个实施方案中，所述方法在体外进行。
在相关的方面，提供了一种治疗IL-17A相关状况的方法，所述方法包括将有效量的如本文描述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物施用至需要其的受试者。在所述方法的更特定的实施方案中，如本文描述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物在体内调控IL-17A功能。
在一个实施方案中，所述IL-17A相关状况选自由炎性疾病、自身免疫性疾病和癌症组成的组，诸如由炎性疾病和自身免疫性疾病组成的组。在所述方面的一个特定的实施方案中，所述IL-17A相关状况选自由炎性状况、过敏性状况、超敏反应、自身免疫性疾病、严重感染和移植物排斥组成的组。在一个实施方案中，所述IL-17A相关状况选自由类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、银屑病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、葡萄膜炎和干眼病组成的组。在更特定的实施方案中，所述IL-17A相关状况为银屑病。在另一个实施方案中，所述IL-17A相关状况为癌症，诸如选自由胃癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌和腺癌组成的组的癌症。
施用治疗有效量的如本文描述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物连同至少一种第二药物物质可以是有益的，所述至少一种第二药物物质诸如免疫应答改变剂、毒性化合物或抗癌剂。
如本文使用的，术语“共施用”包括相伴施用(concomitant adminstration)和顺序施用。因此，在一个实施方案中，提供了一种如以上定义的方法，所述方法还包括共施用免疫应答调控剂。在另一个实施方案中，提供了一种如以上定义的方法，所述方法还包括共施用另外的抗炎剂。在另一个实施方案中，提供了一种如以上定义的方法，所述方法还包括共施用毒性化合物。在另一个实施方案中，提供了一种如以上定义的方法，所述方法还包括共施用抗癌剂。
上文给出了免疫应答调控剂和毒性化合物的非限制性实例。抗癌剂的非限制性实例包括选自由以下组成的组的剂：奥瑞他汀、蒽环霉素、刺孢霉素、考布他汀、阿霉素、倍癌霉素(duocarmycin)、CC-1065抗肿瘤抗生素、海鞘素(ecteinascidin)、格尔德霉素、美登醇(maytansinoid)、甲氨蝶呤、真菌毒素、紫杉醇、蓖麻毒素、bouganin、白树毒素、假单胞菌外毒素38(PE38)、白喉毒素(DT)、及它们的类似物，及其衍生物及其组合。技术人员将领会到，细胞毒素剂的非限制性实例包括所述剂的所有可能的变型,例如剂奥瑞他汀包括例如奥瑞他汀E、奥瑞他汀F、奥瑞他汀PE及其衍生物。
尽管本发明已参考多种示例性方面和实施方案被描述，但本领域技术人员将理解，可以做出多种改变，且等同物可代替其要素而不偏离本发明的范围。另外，可以进行很多修改以使特定的情况或分子适应本发明的教导而不偏离其实质范围。因此，意图本发明不限于预期的任何特定的实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求书的范围内的所有实施方案。
附图简述
图1为本公开内容的IL-17A结合多肽的实例(SEQ ID NO:1-1222)、对照多肽(SEQID NO:1223)、白蛋白结合多肽PP013(SEQ ID NO:1224)和PEP07843(SEQ ID NO:1225)的氨基酸序列以及用于选择、筛选和/或表征本发明的示例的人类IL-17A(SEQ ID NO:1226)、鼠IL-17A(SEQ ID NO:1227)、食蟹猴(cynomolgus monkey)IL-17A(SEQ ID NO:1229)、猕猴(rhesus monkey)IL-17A(SEQ ID NO:1230)和人类IL-17F(SEQ ID NO:1228)的氨基酸序列的列表。在本公开内容的IL-17A结合多肽中，推断的IL-17A结合基序(BM)在每一个序列中从残基8延伸至残基36。预测构成这些Z变体的每一个内的完整三螺旋束的49个氨基酸残基长多肽(BMod)的氨基酸序列从残基7延伸至残基55。
图2示出了通过实施例3中描述的NHDF测定评价的对IL-17A诱导的IL-6产生的抑制。(A)在包含IL-17A的培养基中滴定His6-Z06260(空心菱形)、His6-Z06282(空心正方形)和His6-Z06455(空心圆形)。(B)在包含IL-17A和HSA的培养基中滴定Z06260-ABD(实心菱形)、His6-Z06282(空心正方形)、Z06282-ABD(实心正方形)、His6-Z06455(空心圆形)和Z06455-ABD(实心圆形)。
图3示出了如实施例8中描述的，通过ELISA测定的来自第一和第二成熟文库的一组Z变体的IL-17A结合能力。结果被展示为与IL-17A结合变体Z10241(SEQ ID NO:11)相比的结合能力百分比。
图4示出了如实施例8描述的在Biacore仪器中进行的结合特异性分析的结果。通过对固定在CM5芯片的表面上的人类IL-17A(黑色)、人类IL-17A/F(深灰)和人类IL-17F(浅灰)分别注射20nM His6-加标签的Z变体Z10508(SEQ ID NO:2)(A)、Z10532(SEQ ID NO:1)(B)和Z15167(SEQ ID NO:4)(C)来获得传感图。
图5示出了如实施例8中描述测定的，与来自初级选择(虚线曲线)的一种结合物相比，起源于第一成熟选择的一系列Z变体(实线曲线)对IL-17A诱导的IL-6产生的抑制。所有结合物以剂量依赖性方式抑制IL-17A，并且与初级结合物相比，成熟的结合物具有增加的阻断能力。
图6示出了在如实施例11中描述的Biacore仪器中分析的，人类IL-17A(灰色)和食蟹猴(cynomolgus)IL-17A(黑色)对(A)ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)、(B)ZAZ3364(SEQ IDNO:1245)和(C)ZAZ3365(SEQ ID NO:1246)的结合。从其减去来自空白表面的应答的所得曲线相应于各自以浓度2.5nM、10nM和40nM注射的IL-17A蛋白。
图7示出了在实施例14中描述的NHDF测定中对IL-17A诱导的IL-6产生的抑制。图7A示出了与相应的单体Z变体Z10241(SEQ ID NO:11；虚线黑线)相比，二聚体Z-ABD-Z多肽ZAZ3220(SEQ ID NO:1236；实线黑线)的优异抑制功效。图7B示出了包含Z变体Z06282(SEQID NO:1206)的Z-ABD-Z多肽中Z部分和ABD部分之间的不同接头长度的评价。比较了在ABD的每一侧上具有不同数目的G4S重复或最小接头的Z-ABD-Z多肽ZAZ3174(SEQ ID NO:1233)、ZAZ3176(SEQ ID NO:1235)、ZAZ3234(SEQ ID NO:1238)、ZAZ3235(SEQ ID NO:1239)、ZAZ3236(SEQ ID NO:1240)和ZAZ3237(SEQ ID NO:1241)。
图8示出了实施例15中描述的hIL-17A诱导的KC-模型中Z-ABD-Z多肽的剂量依赖性抑制。(A)在2.5mg/kg剂量获得了ZAZ3174(SEQ ID NO:1233)对KC产生的完全抑制。(B)在0.4mg/kg剂量获得了ZAZ3220(SEQ ID NO:1236)对KC产生的完全抑制。x-轴上指示的剂量以mg/kg和相应的pmol剂量给出。在柱上方的数字指示每一个剂量组中的抑制百分比；在0.1mg/kg ZAZ3220观察到72％抑制。LOQ＝定量限值。
图9示出了如在实施例16中描述的，在单次i.v.(黑线)或s.c.(灰色虚线)施用至SD大鼠后，Z-ABD-Z多肽(A)ZAZ3220(SEQ ID NO:1236)和(B)ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)的药代动力学谱。展示了平均血清浓度与时间的关系。
图10示出了如实施例17中描述进行的对兔眼睛局部施用的结果。证明了在房水(aqueous humor)和玻璃体液(vitreous humor)两者中Z变体Z10199(SEQ ID NO:1217)和Z-ABD-Z多肽ZAZ3174(SEQ ID NO:1233)的摄取，而对照IgG抗体没有渗透眼睛。
图11示出了在实施例18中描述的NHDF测定中与在PBS配制相比，分别在OAF1和OAF2中配制并分析的ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)的活性。A)OAF1(实心圆形)、PBS(十字形)和无ZAZ3363的OAF1(空心菱形)。B)OAF2(空心三角形)、PBS(十字形)和无ZAZ3363的OAF2(空心菱形)。
图12示出了如实施例18中描述进行的在OAF1(实心圆形)、OAF2(空心三角形)和PBS(十字形)中配制的ZAZ3363的十二指肠内施用的药代动力学谱。
图13示出了在实施例19中描述的NHDF测定中复合物HCAda-Z14253和LCAda-Z14253的评价。(A)复合物HCAda-Z14253(左)和LCAda-Z14253(右)的示意图。(B)对IL-17A诱导的IL-6产生的抑制。(C)TNF诱导的IL-8产生的抑制。(D)对TNF和IL-17A诱导的IL-8产生的抑制。Z04726-ABD为阴性对照，被包括在所有三种测定中。
图14示出了如在实施例20中描述的在第1天、第4天、第7天和第10天在i.v.施用20mg/kg(黑色)或40mg/kg(灰色)后在食蟹猴中的Z-ABD-Z多肽ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)的药代动力学谱。示出了在分析(A)在第1天第一次注射和(B)在第10天第四次注射后的平均血浆浓度与时间的关系。误差棒表示标准偏差。
图15示出了在口服施用后在个体比格犬(beagle dog)中的Z-ABD-Z多肽ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)的药代动力学谱。在第0天将150mgZAZ3363作为肠溶包衣胶囊施用。
实施例
概述
以下实施例公开了基于噬菌体展示技术开发的靶向细胞白介素17A(IL-17A)的新型Z变体分子。对本文描述的IL-17A结合多肽测序，并且它们的氨基酸序列以序列标识符SEQ ID NO:1-1222在图1中列出。实施例还描述了IL-17A结合多肽的表征以及所述多肽的体外和体内功能。
实施例1
IL-17A结合Z变体的选择和筛选
材料和方法
靶蛋白的生物素化：使用No-Weigh EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素(ThermoScentific,目录号21327)根据制造商的建议在室温(RT)以20x摩尔过量将人类IL-17A(hIL-17A Peprotech目录号200-17；SEQ ID NO:1226)和鼠IL-17A(mIL-17A Peprotech目录号210-17；SEQ ID NO:1227)生物素化30min。根据制造商的说明使用透析盒(Slide-a-lyzer 3.5K,3500MWCO,Thermo Scentific,目录号66333)进行至磷酸盐缓冲的盐水(PBS，10mM磷酸盐、137mM NaCl、2.68mM KCl，pH 7.4)的随后的缓冲液交换。
IL-17A结合Z变体的噬菌体展示选择：基本上如等(2007)JBiotechnol,128:162-183中描述的在噬菌粒pAY02592中构建的被展示在噬菌体上的蛋白Z的随机变体的文库被用于选择IL-17A结合Z变体。在该文库中，将白蛋白结合域(缩写为ABD，并且相应于来自链球菌(Streptococcus)菌株G148的G蛋白的GA3)用作对于Z变体的融合配偶体。该文库被表示为Zlib006Naive.II并具有1.5x1010个文库成员(Z变体)的尺寸。将来自包含噬菌粒文库Zlib006Naive.II的甘油储备液的大肠杆菌RRIΔM15细胞(Rüther等，(1982)Nucleic Acids Res 10:5765-5772)接种在补充有100μg/ml氨苄青霉素的20l限定的不含脯氨酸的培养基[3g/l KH2PO4、2g/l K2HPO4、0.02g/l尿嘧啶、6.7g/l YNB(DifcoTM不含氨基酸的酵母氮源基础，Becton Dickinson)、5.5g/l一水合葡萄糖、0.3g/l L-丙氨酸、0.24g/l L-精氨酸单盐酸盐、0.11g/l L-天冬酰胺一水合物、0.1g/l L-半胱氨酸、0.3g/lL-谷氨酸、0.1g/l L-谷氨酰胺、0.2g/l甘氨酸、0.05g/l L-组氨酸、0.1g/l L-异亮氨酸、0.1g/l L-亮氨酸、0.25g/l L-赖氨酸单盐酸盐、0.1g/l L-甲硫氨酸、0.2g/l L-苯丙氨酸、0.3g/l L-丝氨酸、0.2g/l L-苏氨酸、0.1g/l L-色氨酸、0.05g/l L-酪氨酸、0.1g/l L-缬氨酸]中。该培养物在发酵罐(BelachBioteknik,BR20)中在37℃生长。当细胞达到0.75的600nm处光密度(OD600)时，使用10x摩尔过量的M13K07辅助噬菌体(New England Biolabs，目录号N0315S)感染约2.6l的培养物。将细胞孵育30min，届时用补充有100μM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)(用于诱导表达)和50μg/ml氨苄青霉素、12.5μg/ml羧苄青霉素、25μg/ml卡那霉素、35ml/l 1.217M MgSO4和10ml微量元素溶液[溶解于1.2M HCl中的129mMFeCl3；36.7mM ZnSO4；10.6mM CuSO4；78.1mM MnSO4；94.1mM CaCl2]的培养基[2.5g/l(NH4)2SO4；5.0g/l酵母提取物(Merck 1.03753.0500)；25g/l蛋白胨(Scharlau07-119)；2g/lK2HPO4；3g/l KH2PO4；1.25g/l Na3C6H5O7·2H2O；0.1ml/l Breox FMT30消泡剂]填充发酵罐至20升。开始葡萄糖限制的补料分批培养，其中将600g/l葡萄糖溶液补料至反应器(开始时15g/h，17h之后在发酵结束时40g/h)。通过自动添加25％NH4OH，将pH控制在7。补充空气(10l/min)，并设置搅拌器使溶解氧水平保持高于30％。通过切向流过滤去除培养物中的细胞。
该噬菌体颗粒从上清以PEG/NaCl(聚乙二醇/氯化钠)沉淀两次，过滤并溶解于PBS和甘油中，如等，同上中所述。将噬菌体储备液在使用之前储存于-80℃。
在被划分在六个不同的轨道中的四个循环中进行针对生物素化的hIL-17A(b-hIL-17A)和生物素化的mIL-17A(b-mIL-17A)的选择(表2)。噬菌体储备液制备、选择程序和在选择循环之间的噬菌体的扩增基本上如在WO2009/077175针对另外一个靶的选择所描述的来进行，但具有以下例外。例外1：补充有3％牛血清白蛋白(BSA,Sigma，目录号A3059)和0.1％Tween20(Acros Organics，目录号233362500)的PBS用作选择缓冲液。例外2：通过用M-280链霉抗生物素蛋白(SA珠，Invitrogen，目录号11206D)孵育噬菌体储备液，在循环1-3中进行预选择。例外3：用补充有5％BSA和0.1％Tween20的PBS来预封闭在选择中使用的所有管和珠。例外4：在RT在溶液中进行选择，且选择的时间为在第一个循环中的第200min，和在随后的循环中的第120min。例外5：这之后，使用1mg珠/6.4μg b-hIL-17A或b-mIL-17A捕获SA珠上的靶-噬菌体复合物。例外6：使用生长在补充有10μg/ml四环素(例外7)的培养基中的大肠杆菌菌株XL1-Blue细胞(Agilent Technologies，目录号200268)以用于感染。例外8：使用补充有0.1g/l氨苄青霉素和0.01g/l四环素的胰蛋白胨酵母提取物板(15g/l琼脂、10g/l胰蛋白胨水(Merck)、5g/l酵母提取物、3g/l NaCl、2％葡萄糖)以用于细菌扩散。例外9：与细菌相比10x过量的M13K07辅助噬菌体被允许感染对数生长期细菌。
在表2中示出了选择策略的概览，描述了在随后的循环中使用降低的靶浓度和增加的洗涤次数获得的增加的严格性。
表2：从初级文库选择的概览
轨道1被划分在第二至第四个循环，导致在循环2中总计4个轨道(1-1至1-4)，在循环3中5个轨道(1-1-1至1-4-2)，和在循环4中6个轨道(1-1-1-1至1-4-2-1)。用于选择的噬菌体颗粒的数目为前一循环中洗脱的噬菌体颗粒数目的约2000倍，但在选择轨道1-1、1-1-1和1-1-1-1中使用更高的量。
使用PBST 0.1％(补充有0.1％Tween-20的PBS)进行洗涤1min，并如WO2009/077175中描述进行洗脱。
用于ELISA的Z变体的产生：通过在深孔板(Nunc，目录号278752)中将来自选择的单克隆接种到补充有100μg/ml氨苄青霉素和0.1mM IPTG的1ml TSB-YE培养基来产生Z变体。在37℃下将板孵育18-24h。通过离心使细胞沉淀，重悬于400μl的0.05％PBST中且冷冻于-80℃以释放细胞的周质级分。将冷冻的样品在水浴中解冻，并且重复冷冻-解冻程序6次。将400μl PBST 0.05％添加至解冻的样品中且通过离心使细胞沉淀。
最终的周质提取物上清液包含作为与ABD的融合的Z-变体，表示为AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG(等，同上)。Z#####指各个58个氨基酸残基的Z变体。
Z变体的ELISA筛选：Z变体与人类IL-17A的结合以ELISA测定来分析。在4℃用2μg/ml在包被缓冲液(50mM碳酸钠，pH 9.6；Sigma,目录号C3041)中稀释的抗ABD山羊抗体(内部产生的)包被半区96孔ELISA板(Costar,目录号3690)过夜。将抗体溶液倾出，并且将孔在水中洗涤并且用100μl的PBSC(补充有0.5％酪蛋白的PBS)在RT封闭1至3h。将封闭溶液弃去并将50μl周质溶液添加至孔中并在RT在缓慢震荡下孵育1.5h。作为空白对照，添加PBST0.05％，而非周质样品。将上清液倾出并用0.05％PBST洗涤孔4次。然后，将PBSC中的6.5nM浓度的50μl b-hIL-17A添加至每一个孔中。将板在RT孵育1.5h，随后是如以上描述的洗涤。将在PBSC中以1:30,000稀释的链霉抗生物素蛋白缀合的HRP(Thermo Scientific，目录号N100)添加至孔中并且将板孵育1h。在如以上描述的洗涤之后，将50μl ImmunoPure TMB底物(Thermo Scientific，目录号34021)添加至孔，并将板根据制造商的建议进行处理。使用Victor3多孔板读取器(Perkin Elmer)来测量在450nm处的吸光度。
测序：与ELISA筛选平行地挑取所有克隆进行测序。基本上如WO2009/077175中描述的，从单个菌落扩增PCR片段、进行测序和分析。
结果
IL-17A结合Z变体的噬菌体展示选择：在4个循环的针对b-hIL-17A和b-mIL-17A的噬菌体展示选择之后，获得各个克隆。
Z变体的ELISA筛选：在四个循环的选择之后获得的克隆在96孔板中扩大并在ELISA中针对hIL-17A结合活性筛选。发现42种Z变体针对6.5nM浓度的hIL-17A给出4x空白对照或更高(0.43-3.2AU)的应答。对空白对照未获得应答。
测序：在四个循环的选择之后对获得的克隆进行测序。对每一个变体给出独特的标识号#####，并且将各个变体称为Z#####。58个氨基酸残基长Z变体的氨基酸序列在图1中和序列表中作为SEQ ID NO:1200-1216列出。在每一个序列中，推断的IL-17A结合基序从残基8延伸至残基36。预测构成这些Z变体的每一个内的完整三螺旋束的49个氨基酸残基长多肽的氨基酸序列从残基7延伸至残基55。
实施例2
单体IL-17A结合Z变体的产生
该实施例描述了His-加标签的Z变体和与ABD融合的Z变体的亚克隆和产生的一般程序，其在下文的表征实验中被使用。
材料和方法
具有His-标签的Z变体的亚克隆：从文库载体pAY02592扩增各自Z变体的DNA。使用标准分子生物学技术(基本上如WO2009/077175中针对结合另一种靶的Z变体描述的)来应用用于构建具有N-末端His6标签的单体Z变体分子的亚克隆策略。将Z基因片段亚克隆到表达载体pAY01448，导致编码序列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD。
与ABD融合的Z变体的亚克隆：从文库载体pAY02592扩增各自Z变体的DNA。使用合适的引物对进行PCR，并且将所得的基因片段用限制性内切酶PstI和AccI裂解，并连接到用相同酶消化的表达载体pAY03362中，产生ABD融合蛋白，其中ABD变体为PP013(SEQ ID NO:1224)。由该表达载体编码的构建体为MGSSLQ-[Z#####]-VDSS-PP013。
培养：用包含每一个各自的IL-17A结合Z变体的基因片段的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)，并在37℃在800ml或1000ml的补充有50μg/ml卡那霉素的TSB-YE培养基中培养。为了诱导蛋白表达，在OD600＝2时，添加IPTG至终浓度为0.2mM并使培养物在37℃再孵育5h。通过离心收获细胞。
纯化带有His 6 -标签的IL-17A结合Z变体：将约2-5g每一种细胞沉淀物重悬于30ml的补充有(Merck)至浓度为15U/ml的结合缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、20mM咪唑，pH 7.4)中。在细胞破碎之后，细胞碎片通过离心去除，并且将每一种上清液应用于1ml His GraviTrap IMAC柱(GE Healthcare)。污染物通过用洗涤缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、60mM咪唑，pH 7.4)洗涤来除去，且IL-17A结合Z变体随后用洗脱缓冲液1(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、500mM咪唑，pH 7.4)来洗脱。
与ABD融合的IL-17A结合Z变体的纯化：将约1-2g的每一种细胞沉淀物重悬于30ml补充有(Merck)的TST-缓冲液(25mM Tris-HCl、1mM EDTA、200mM NaCl、0.05％Tween20,pH 8.0)中。在通过超声处理破碎细胞和通过离心澄清之后，每一种上清液被应用于带有固定有抗-ABD配体(内部产生的)的1ml琼脂糖的重力流柱上。在用TST-缓冲液和5mM NH4Ac pH 5.5缓冲液洗涤之后，用0.1M HAc洗脱ABD融合的Z变体。将乙腈(ACN)以10％的终浓度添加至在抗-ABD琼脂糖亲和层析纯化步骤中洗脱的级分，并且将样品装载在1ml预先用RPC溶剂A(0.1％TFA、10％ACN、90％水)平衡的Resource 15RPC柱(GEHealthcare)上。在柱用RPC溶剂A洗涤之后，结合的蛋白用线性梯度0％-50％RPC溶剂B(0.1％TFA、80％ACN、20％水)在20ml中来洗脱。包含纯的ABD-融合的Z变体的级分通过SDS-PAGE分析来鉴定并汇集。在RPC纯化之后，池的缓冲液使用PD-10柱(GE Healthcare)交换为PBS(2.68mM KCl、137mM NaCl、1.47mM KH2PO4、8.1mM Na2HPO4，pH 7.4)。最后，ABD融合的Z变体在1ml 红柱(Hyglos)上纯化以确保低内毒素含量。
蛋白浓度通过使用ND-1000分光光度计测量在280nm处的吸光度和各自蛋白的消光系数来确定。通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析纯度，并使用LC/MS分析来证实每一种纯化的Z变体的身份。
结果
培养和纯化：将带有His6-标签的IL-17A结合Z变体以及在其C-末端融合至ABD的Z变体在大肠杆菌中表达为可溶性基因产物。来自约1-5g细菌沉淀物的纯化的蛋白的量，通过以分光光度计测量在280nm处的吸光度来确定，并且对于不同的IL-17A结合Z变体范围从约5mg至20mg。每一种最终蛋白制品的SDS-PAGE分析显示，这些制品主要包含IL-17A结合Z变体。通过HPLC-MS分析来证实每一种Z变体的正确身份和分子量。
实施例3
初级IL-17A结合Z变体的阻断能力的评价
正常人类皮肤成纤维细胞(NHDF)在用IL-17A刺激后产生IL-6(Chang和Dong2007,Cell Research 17:435-440)，并且向上清液释放的IL-6的量与添加的IL-17A的浓度相关。因此，IL-17A的阻断导致上清液中可以被定量的IL-6的减少。在该实施例中，该测定用于评价单独的或与ABD(PP013；SEQ ID NO:1224)融合的IL-17A结合Z变体Z06260(SEQ IDNO:1200)、Z06282(SEQ ID NO:1206)和Z06455(SEQ ID NO:1214)的阻断能力。
材料和方法
His 6 -加标签的Z-变体的NHDF测定：将NHDF细胞(Lonza，目录号CC-2511)培养于供给促生长因子(growth promoting factors)(Lonza，目录号CC-5034)的成纤维细胞基础培养基(Lonza，目录号CC-3132)中。在实验的前一天，以100μl将105个细胞/孔接种到96孔培养板(Greiner，目录号655180)中。在实验当天，IL-17A特异性Z变体His6-Z06260、His6-Z06282和His6-Z06455的稀释物在单独的96孔板中制备。将Z变体在包含0.031nM hIL-17A的培养基中以三倍步骤从3130nM滴定至0.2nM。还制备了hIL-17A的标准曲线(0.002-31nM)以及包含具有0.031nM hIL-17A的培养基或单独的培养基的对照。将具有过夜培养的NHDF细胞的板中的培养基弃去。将测试样品、标准曲线样品和对照转移至包含细胞的板中。将NHDF细胞在37℃下刺激18-24h，并且随后使用下文描述的IL-6特异性ELISA定量上清液中的IL-6含量。
His 6 -加标签的和ABD融合的Z变体的NHDF测定：如以上描述制备NHDF细胞。在实验当天，IL-17A特异性Z变体构建体His6-Z06282、His6-Z06455、Z06260-ABD、Z06282-ABD和Z06455-ABD的稀释物在单独的96孔板中制备。将Z变体构建体在包含0.031nM IL-17A和8μMHSA的培养基中以四倍步骤从780nM滴定至0.2nM。如以上描述进行标准IL-17A曲线和对照的制备以及下游分析。
IL-6 ELISA：用在PBS(50μl/孔)中的4μg/ml浓度的抗-IL-6单克隆抗体MAB206(R&D systems)包被96孔半区板(Costar,目录号3690)并且在4℃孵育过夜。在第二天，将板在自来水中润洗两次并且用PBS+2％BSA(Sigma)封闭2h。以2-倍稀释系列(0.2-50ng/ml)滴定的IL-6标准物(R&D systems，目录号206-IL-50)和来自细胞测定板的上清液被添加至包被的ELISA板(50μl/孔)并且在RT孵育1.5h。将板在自动ELISA洗涤器中洗涤4次，并且添加0.25μg/ml(50μl/孔)生物素化的抗-IL-6多克隆抗体(R&D systems,BAF206)。在孵育1h之后，洗涤板，并且将50μl的经稀释8000倍的链霉抗生物素蛋白-HRP(Thermo Fisher，目录号N100)添加至每一个孔。在另外一个小时的孵育和随后的洗涤之后，将板用50μl TMB(Thermo Fisher，目录号34021)/孔进行显影并且反应用50μl 2M H2SO4来终止。在96孔板读取器(Victor3)中测量在450nm处的吸光度，并计算每一个样品中IL-6的浓度。将结果展示为最大的IL-6产生的百分比，计算为：
100-[(ABSIL-17A阻断剂-ABS背景)/(ABS最大IL-6产生-ABS背景)]x100
结果
来自第一NHDF测定的结果显示，所有三种Z变体His6-Z06260、His6-Z06282和His6-Z06455以剂量依赖性方式阻断IL-17A诱导的IL-6产生(图2A)。IC50值为约40-140nM。
用与ABD融合的相同Z变体重复NHDF测定以及在测定中包含HSA以确定当模拟体内条件时保留与抗原的结合。在体内，ABD将结合白蛋白并输送更长的循环半衰期。结果显示，与ABD融合的所有三种结合物均比His6-加标签的Z变体同样好或更好地阻断IL-17A诱导的IL-6产生(图2B)。来自第二测定的IC50值归纳于表3中。
表3：在HSA存在下，初级Z-变体阻断IL-17A诱导的IL-6产生的IC50值
分析物 Z变体的SEQ ID NO IC50(nM)
Z06260-ABD 1200 8
His6-Z06282 1206 16
Z06282-ABD 1206 15
His6-Z06455 1214 67
Z06455-ABD 1214 15
实施例4
IL-17A结合Z变体的第一成熟文库的设计和构建
在该实施例中，设计并构建了成熟文库。使用该文库选择另外的IL-17A结合Z变体。来自成熟文库的选择通常被预期产生具有增加的亲和力的结合物(Orlova等，(2006)Cancer Res 66(8):4339-48)。在该研究中，使用裂池DNA合成(split-pool DNAsynthesis)来产生随机化的单链接头，使得能够将定义的密码子掺入合成中期望的位置。
材料和方法
文库设计：文库是基于实施例1中描述鉴定的IL-17A结合Z变体的序列。在新的文库中，根据基于SEQ ID NO:1200-1216中定义的Z变体序列的策略，使Z分子支架中的13个可变位置向某些氨基酸残基偏倚。包含从DNA 2.0(Menlo Park,CA,USA)订购的以下147bp序列的DNA接头使用裂池合成产生：5’-AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAAGAA NNN NNN NNN GCG NNN NNN GAG ATC NNN NNN TTA CCT AAC TTA ACC NNN NNN CAANNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A-3’(SEQ ID NO:1248；随机化密码子表示为NNN)，其包含相应氨基酸序列中部分地随机化的螺旋1和2的编码序列，侧翼为XhoI和SacI的限制性位点。氨基酸残基在包括Z分子支架中的13个可变Z位置(9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32和35)的新的文库中的理论分布在表4中给出。所得的理论文库尺寸为6.1x109种变体。
表4：文库设计，第一成熟
文库构建：使用AmpliTaq Gold聚合酶(Applied Biosystems，目录号4311816)根据供应商的建议在12个循环的PCR期间扩增文库，并且用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，目录号28106)根据供应商的建议纯化汇集的产物。随机化文库片段的纯化的池用限制性内切酶XhoI和SacI-HF(New England Biolabs，分别地，目录号R0146L和目录号R3156M)来消化，并且使用QIAquick PCR纯化试剂盒来浓缩。随后，根据供应商的建议使产物使用制备性2.5％琼脂糖凝胶(Nuisieve GTC琼脂糖，Cambrex，Invitrogen)经历凝胶电泳并使用QIAGEN凝胶提取试剂盒(QIAGEN，目录号28706)从所述凝胶进行纯化。
噬菌粒载体pAY02592(基本上如等，同上中描述的pAffi1)用相同酶限制性内切，使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀来纯化。将限制性内切片段和限制性内切载体以5:1的摩尔比率用T4DNA连接酶(Fermentas,目录号EL0011)在RT连接2h，随后在4℃孵育过夜。通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀回收连接的DNA，随后溶解于10mM Tris-HCl，pH 8.5中。因此，所得的在载体pAY02592中的文库编码Z变体，每一个Z变体与源自链球菌G蛋白的白蛋白结合域(ABD)融合。
连接反应(约160ng DNA/转化)被电穿孔到电感受态大肠杆菌ER2738细胞(Lucigen,Middleton,WI,USA,50μl)中。紧接在电穿孔之后，添加约1ml的恢复培养基(供给大肠杆菌ER2738细胞)。将转化的细胞在37℃孵育60min。取出样品用于滴定并用于确定转化株的数目。细胞此后汇集并在37℃在1l的补充有2％葡萄糖、10μg/ml四环素和100μg/ml氨苄青霉素的TSB-YE培养基中培养过夜。将细胞以4,000g沉淀15min，并重悬于PBS/甘油溶液(约40％甘油)中。将细胞等分并储存于-80℃。对来自Z变体的文库克隆进行测序，以验证内含物，并评价所构建文库与该文库设计相比的结果。如实施例1中描述的进行测序，并证实氨基酸分布。
噬菌体储备液的制备：在20l发酵罐(Belach Bioteknik)中制备包含噬菌粒文库的噬菌体储备液。将来自包含该噬菌粒文库的甘油储备液的细胞接种于10l的补充有1g/l葡萄糖、100mg/l氨苄青霉素和10mg/l四环素的TSB-YE中。当细胞达到0.52的600nm处光密度(OD600)时，使用5x摩尔过量的M13K07辅助噬菌体感染约1.7l的培养物。将细胞孵育30min，届时用复合发酵培养基[2.5g/l(NH4)2SO4；5.0g/l酵母提取物；30g/l胰蛋白胨，2g/lK2HPO4；3g/l KH2PO4，1.25g/l；Na3C6H5O7·2H2O；Breox FMT30消泡剂0.1ml/l]填充发酵罐至10l。添加以下组分：10ml羧苄青霉素25mg/ml；5ml卡那霉素50mg/ml；1ml 1M IPTG；17.5ml/l 1.217M MgSO4和5ml的微量元素溶液[溶解于1.2M HCl中的129mM FeCl3；36.7mM ZnSO4；10.6mM CuSO4；78.1mM MnSO4；94.1mM CaCl2]。开始葡萄糖限制的补料分批培养，其中将600g/l葡萄糖溶液补料至反应器(开始时3.5g/h，20h之后37.5g/h持续直到培养结束)。通过自动添加25％NH4OH，将pH控制在pH 7。补充空气(5l/min)并将搅拌器设置为500rpm。补料分批培养24h之后，OD600为19.4。通过以15,900g离心使培养物中的细胞沉淀。噬菌体颗粒如实施例1中描述的从上清液以PEG/NaCl沉淀两次，过滤并溶解于PBS和甘油中。将噬菌体储备液储存于-80℃，直到在选择中使用。
结果
文库构建：基于具有被证实的结合特性的一组IL-17A结合Z变体(实施例1和3)来设计新的文库。设计的文库的理论尺寸为6.1x109种Z变体。转化至大肠杆菌ER2738细胞之后通过滴定确定的文库的实际大小为4.5x109种转化株。
文库质量通过测序96种转化株和通过将它们的实际序列与理论设计比较来测试。与设计的文库比较，实际文库的内容物显示是令人满意的。因此成功构建了IL-17A的潜在结合物的成熟文库。
实施例5
来自第一成熟文库的Z变体的选择、筛选和表征
材料和方法
IL-17A结合Z变体的噬菌体展示选择：如实施例1中描述的，将靶蛋白hIL-17A和mIL-17A生物素化。使用如实施例4中描述构建的Z变体分子的新的文库，在基本上如实施例1中描述的针对hIL-17A和mIL-17A的四个循环中进行噬菌体展示选择，但有以下例外。例外1：PBST 0.1％用作选择缓冲液。在选择时，分别将胎牛血清(FCS,Gibco,目录号10108-165)和人类血清白蛋白(HSA,Albucult,Novozymes,目录号230-005)添加至选择缓冲液至10％和1.5μM的最终浓度。例外2：通过将噬菌体储备液与SA珠一起孵育进行预选择步骤。例外3：用补充有3％BSA和0.1％Tween20的PBS来预封闭在选择中使用的所有管和珠。例外4：选择的时间分别为在循环1、2、3和4中的第140min、70min、60min、50min。
在表5中显示了选择策略的概览，描述了在随后的循环中通过使用降低的靶浓度和增加的洗涤次数获得的增加的严格性。
表5：从第一成熟文库选择的概览
循环1中的轨道1-3被划分在第二至第四个循环，导致在循环2中总计6个轨道(1-1至3-3)，在循环3中6个轨道(1-1-1至3-3-1)，和在循环4中24个轨道(1-1-1-1a至3-3-1-2b)。使用PBST 0.1％进行洗涤1min。然而，对于循环3中的轨道1-3，其中一个洗涤持续10min。
在循环4中最后一次洗涤之后，将来自所有轨道的SA珠上的靶噬菌体复合物分为两等份。立即洗脱来自第一部分的结合的噬菌体颗粒，而第二部分在洗脱噬菌体颗粒之前经历过夜洗涤。使用以下两种不同的程序洗脱结合的噬菌体颗粒：1)如在实施例1中的用甘氨酸-HCl，pH 2.2，或2)500μl的100mM磷酸钠、150mM氯化钠，pH 5.5并用500μl PBS中和。
噬菌体颗粒的扩增：选择循环1和2之间的噬菌体颗粒的扩增基本上如实施例1中描述来进行，但具有以下例外。例外1：大肠杆菌ER2738用于噬菌体扩增。例外2：以5x过量使用M13K07辅助噬菌体。例外3：选择循环2和4之间的噬菌体颗粒的扩增如下进行：在用噬菌体颗粒感染对数生长期大肠杆菌ER2738之后，添加补充有2％葡萄糖、10μg/ml四环素和100μg/ml氨苄青霉素的TSB，并且随后在37℃伴随旋转孵育30min。然后，用M13K07辅助噬菌体感染细菌。将感染的细菌通过离心沉淀，重悬于补充有100μM IPTG、25μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄霉素的TSB-YE培养基中并在30℃生长过夜。将过夜培养物离心并将上清液中的噬菌体颗粒用PEG/NaCl缓冲液沉淀两次。最后，将噬菌体重悬于选择缓冲液，然后进入下一个选择循环。
在最后的选择循环中，将对数生长期细菌用洗脱物感染，并稀释，然后涂布在补充有0.2g/l氨苄青霉素的TBAB平板(30g/l胰蛋白胨血琼脂基，Oxoid目录号CMO233B)上以形成待在ELISA筛选中使用的单菌落。
潜在结合物的测序：挑取来自不同的选择轨道的单独克隆用于测序。基本上如实施例1中描述进行基因片段的扩增和基因片段的序列分析。
Z变体的ELISA筛选：包含Z变体(如实施例1中描述的表达为Z变体ABD融合蛋白)的单菌落随机从成熟文库的选择的克隆来挑取，并基本上如实施例1中描述生长在培养基中。还基本上如实施例1中描述进行周质上清液的制备和ELISA筛选，但具有以下两个例外。例外1：以0.4nM的浓度使用生物素化的hIL-17A。例外2：来自初级选择的Z变体Z06282(SEQ IDNO:1206)的周质级分用作阳性对照。
Z变体的EC50分析：使一系列IL-17A结合Z变体经历如以上描述的使用ELISA对针对b-hIL-17A的系列稀释物的应答的分析。以6nM的浓度加入生物素化的靶蛋白，并且以1:3逐步稀释直到8pM。作为背景对照，还测定Z变体而不添加靶蛋白。包含初始IL-17A结合物Z06282(SEQ ID NO:1206)的周质样品作为阳性对照被包括。使用GraphPad Prism 5和非线性回归分析数据并且计算EC50值(半最大有效浓度)。
结果
成熟IL-17A结合Z变体的噬菌体展示选择：在各自包含4个循环的总计24个平行轨道中进行选择。不同的选择轨道在靶浓度、靶物种来源(人类IL-17A或鼠IL-17A)、选择时间、洗涤条件和洗脱缓冲液的pH方面不同。起源于选择轨道的仅使用人类IL-17并在pH 2.2下洗脱的克隆显示在ELISA筛选中具有最佳性能。
测序：对随机挑取的克隆测序。每个单独的Z变体如实施例1中所述提供识别号码Z#####。总计932种新的独特的Z变体分子被鉴定。对于在下文ELISA筛选中的494种最佳表现变体，58个氨基酸残基长Z变体的氨基酸序列在图1中被列为SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:11-16、SEQ ID NO:28-31、SEQ ID NO:36-63和SEQ ID NO:67-519。在每一个序列中，推断的IL-17A结合基序从残基8延伸至残基36。预测构成这些Z变体的每一个内的完整三螺旋束的49个氨基酸残基长多肽的氨基酸序列从残基7延伸至残基55。
Z变体的ELISA筛选：在四个选择循环之后获得的克隆在96孔板中产生并使用ELISA针对人类IL-17A结合活性筛选。对所有随机挑取的克隆进行分析。发现932种独特的Z变体中的494种针对0.4nM浓度的hIL-17A给出2x空白对照或更高(0.15-2.0AU)的应答。起源于所有选择轨道的克隆都显示出阳性信号。空白对照具有0.055-0.075AU的吸光度。
Z变体的EC50分析：Z变体的亚组基于以上描述的ELISA实验的结果(高于1.25AU的吸光度)或基于氨基酸序列中的变化来选择，并以ELISA格式经历靶滴定。使周质样品与b-hIL-17A范围从6nM至8pM的系列稀释物一起孵育。包含在初级选择中鉴定的Z06282(SEQ IDNO:1206)的周质样品作为阳性对照被包括。分析获得的值并计算各自的EC50值(表6)。
表6：由ELISA滴定分析计算的EC50值
实施例6
IL-17A结合Z变体的第二成熟文库的设计和构建
在该实施例中，基本上如实施例4中描述的构建第二成熟文库。使用该文库选择另外的IL-17A结合Z变体。
材料和方法
文库设计：文库是基于实施例5中选择并表征的IL-17A结合Z变体的序列。在新的文库中，根据基于EC50分析中37种最佳表现变体的Z变体序列的策略(表6)，使实施例4和5中描述的成熟文库中变化的Z分子支架中的13个位置向某些氨基酸残基偏倚。DNA接头使用裂池合成产生，并从DNA 2.0订购。它包含编码氨基酸序列的部分随机化的螺旋1和2的以下147bp：5’-AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC/GCA AAA TAC GCC AAA GAA/GAG NNN NNNNNN GCG NNN NNN GAG ATC/ATT NNN NNN TTA/CTG CCT/CCC AAC TTA/CTC ACC NNN NNNCAA/CAG NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTATTT A-3’(SEQ ID NO:1249；随机化密码子表示为NNN)，侧翼为限制性位点XhoI和SacI。在表7中给出了新的文库中氨基酸残基的理论分布，包括Z分子支架中的6个可变氨基酸位置(11、14、18、25、28和32)和7个恒定氨基酸位置(9、10、13、17、24、27和35)。所得的理论文库尺寸为3.9x106种变体。
文库构建：基本上如实施例4中描述构建文库，但具有以下例外：将细胞在0.5l的补充有2％葡萄糖、10μg/ml四环素和100μg/ml氨苄青霉素的TSB-YE培养基中培养过夜。
噬菌体储备液的制备：在摇瓶中制备包含噬菌粒文库的噬菌体储备液。将来自包含该噬菌粒文库的甘油储备液的细胞接种于0.5l的补充有2％葡萄糖、10μg/ml四环素和100μg/ml氨苄青霉素的TSB-YE培养基中。培养物在37℃生长，直到OD600达到0.6，并且然后使用5x摩尔过量的M13K07辅助噬菌体感染约83ml的培养物，并在37℃孵育40min。通过离心使培养物中的细胞沉淀，溶解于补充有100μg/ml氨苄青霉素、25μg/ml卡那霉素和0.1mMIPTG的TSB-YE培养基中，并在30℃°生长18h。在培养之后，通过以4,000g离心使细胞沉淀，并且此后保留在培养基中的噬菌体颗粒如实施例1中描述的以PEG/NaCl沉淀两次、过滤并溶解于PBS和甘油中。将噬菌体储备液储存于-80℃，直到在选择中使用。
表7：文库设计，第二成熟
结果
文库构建：基于具有被证实的结合特性的一组IL-17A结合Z变体(实施例5)来设计新的文库。设计的文库的理论尺寸为3.9x106种Z变体。在转化至大肠杆菌ER2738细胞之后通过滴定确定的文库的实际尺寸为1.4x109种转化株。
文库质量通过测序96种转化株和通过将它们的实际序列与理论设计比较来测试。与设计的文库比较，实际文库的内容物显示是令人满意的。因此成功构建了IL-17A的潜在结合物的成熟文库。
实施例7
来自第二成熟文库的Z变体的选择、筛选和表征
材料和方法
IL-17A结合Z变体的噬菌体展示选择：靶蛋白hIL-17A如实施例1中描述进行生物素化。使用如实施例6中描述构建的Z变体分子的第二成熟文库，基本上如实施例5中描述的针对hIL-17A进行噬菌体展示选择，但有以下例外。例外1：在RT在溶液中或在固相进行选择。例外2：选择的时间为在循环1中的第60min、第10min或第1min和在循环2、3和4中的第30min、第4min或第10秒。如实施例1中描述，在溶液中的选择之后在SA珠上捕获靶噬菌体复合物。例外3：在固相选择期间，靶在选择之前被捕获在SA珠上。
在表8中显示了选择策略的概览，概述了在溶液中的选择和在固相上的选择之间的差异、以及在随后的循环中通过使用降低的靶浓度和增加的洗涤次数获得的增加的严格性。
循环1中的轨道1-6被分在第二至第四个循环，导致在循环2中总计7个轨道(1-1至6-1)，在循环3中8个轨道(1-1-1至6-1-1)，和在循环4中16个轨道(1-1-1-1至6-1-1-1)。在1min期间使用PBST 0.1％进行洗涤。然而，其中一个洗涤在循环3中的轨道2-1-1、3-1-1和5-1-1中持续15min。
在循环4中最后一次洗涤之后，将来自5个轨道(1-1-1-1、1-2-1-2、3-1-1-1、4-1-1-1和5-1-1-2)的SA珠上的靶噬菌体复合物分为两等份。立即洗脱来自第一部分的结合的噬菌体颗粒，而第二部分在洗脱噬菌体颗粒之前经历约65h期间的洗涤。如实施例1中描述的，使用甘氨酸-HCl、pH2.2洗脱结合的噬菌体。
基本上如实施例1中描述的，进行在选择循环之间的噬菌体颗粒的扩增。
表8：从第二成熟文库选择的概览
潜在结合物的测序：挑取来自不同的选择轨道的单独克隆用于测序。基本上如实施例1中描述进行基因片段的扩增和序列分析。
Z变体的ELISA筛选：从IL-17A第二成熟文库的选择的克隆随机挑取包含Z变体(如在实施例1中描述的被表达为Z变体ABD融合蛋白)的单菌落，并如实施例1中描述的在培养中生长。基本上如实施例1中描述的进行周质上清液的制备和ELISA筛选，但具有以下两个例外。例外1：以0.2nM或0.33nM的浓度使用生物素化的hIL-17A。例外2：来自第一成熟文库的选择中鉴定的Z变体Z10241(SEQ ID NO:11)的周质级分用作阳性对照，并且通过添加PBST 0.05％的交换周质步骤而产生空白对照。
Z变体的EC50分析：使一系列IL-17A结合Z变体经历如实施例5中描述的使用ELISA对针对b-hIL-17A的系列稀释物的应答的分析。以10nM的浓度添加生物素化的蛋白，并且以1:2逐步稀释八次，随后是以1:5稀释一次直到8pM。作为背景对照，还测定Z变体而不添加靶蛋白。包含先前成熟的Z变体Z10241(SEQ ID NO:11)的周质样品作为阳性对照被包括。使用GraphPad Prism 5和非线性回归分析数据并且计算EC50值。
结果
来自第二成熟文库的IL-17A结合Z变体的噬菌体展示选择：在各自包含4个循环的总计16个平行轨道中进行选择。选择轨道在靶浓度、选择时间、洗涤条件、和选择在溶液中或在固相上进行的方面不同。
测序：对随机挑取的克隆测序。每一个单独的Z变体如实施例1中描述提供识别号码Z#####。总计759种新的独特的Z变体分子被鉴定。
对于在下文ELISA筛选中的704种最佳表现变体，58个氨基酸残基长Z变体的氨基酸序列在图1和序列表中被列为SEQ ID NO:5-10、SEQ ID NO:17-27、SEQ ID NO:32-35、SEQID NO:64-66和SEQ ID NO:520-1199。在每一个序列中，推断的IL-17A结合基序从残基8延伸至残基36。预测构成这些Z变体的每一个内的完整三螺旋束的49个氨基酸残基长多肽的氨基酸序列从残基7延伸至残基55。
Z变体的ELISA筛选：在四个选择循环之后获得的克隆在96孔板中产生并使用ELISA针对hIL-17A结合活性筛选。对所有随机挑取的克隆进行分析。发现759种独特的Z变体中的704种针对0.2nM或0.33nM浓度的hIL-17A给出2x空白对照或更高(0.22-2.2AU)的应答。起源于所有选择轨道的克隆都收集到阳性信号。基于板的代表性组，空白对照的平均应答为0.11AU。
Z变体的EC50分析：IL-17A结合Z变体的亚组基于以上描述的ELISA实验中的结果(Z变体具有高于阳性对照Z10241，SEQ ID NO:11的应答的吸光度)来选择，并如实施例5中描述的以ELISA格式经历靶滴定。分析获得的值并计算它们的各自EC50值(表9)。
表9：由ELISA滴定分析计算的EC50值
实施例8
成熟IL-17A结合Z变体的子集的体外表征
材料和方法
如实施例2中描述进行具有N-末端His6-标签的Z变体的亚克隆和产生。通过定点诱变His6-Z10532(SEQ ID NO:1)导致位置25中的D被A置换产生一种另外的变体His6-Z15167(SEQ ID NO:4)。His6-Z15167的产生如以上对于其他Z变体描述的来进行。
圆二色性(CD)光谱分析：纯化的His6-加标签的Z变体在PBS中被稀释至0.5mg/ml。对于每一种稀释的Z变体，在20℃获得在250-195nm处的CD光谱。另外，进行可变温度测量(VTM)以确定解链温度(Tm)。在VTM中，在221nm处测量吸光度，同时将温度以5℃/min的温度斜率从20℃提高至90℃。在加热程序之后在20℃获得新的CD光谱，以研究Z变体的重折叠能力。在Jasco J-810分光偏振计(Jasco Scandinavia AB)上使用具有1mm的光路长度的比色皿进行CD测量。
IL-17结合ELISA筛选：将96孔半区板(Costar,3690)在4℃用在PBS中以1μg/ml的hIL-17A以50μl/孔的体积包被过夜。在分析当天，将板在自来水中润洗两次并且然后用PBS+2％BSA(Sigma)封闭2h。Z10241(SEQ ID NO:11)用作标准物并且以3倍稀释系列(300-0.005ng/ml)进行滴定，并且将其他Z变体以4种不同的稀释添加至包被的ELISA板(50μl/孔)，并在RT孵育1.5h。将板在自动ELISA洗涤器中洗涤4次，并且添加2μg/ml(50μl/孔)山羊抗-Z抗体。在孵育1h之后，洗涤板，并且将50μl的经稀释5000倍的抗-山羊IgG-HRP(DAKO)添加至每孔。在另外一个小时的孵育、洗涤之后，将板用50μl TMB(Thermo Fisher，34021)/孔进行显影并且反应用50μl 2M H2SO4来终止。在多标记物读取器(Victor3,Perkin Elmer)中读取板。
Biacore动力学分析：确定人类IL-17A对27种His6-加标签的Z变体的动力学常数(kon和koff)和亲和力(KD)。hIL-17A被固定在流通池中CM5芯片表面(GE Healthcare，目录号BR100012)上的羧化的葡聚糖(dextran)层上。根据制造商的方案使用胺偶联化学反应以及使用HBS-EP(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA,0.005％v/v表面活性剂P20,GEHealthcare，目录号BR100188)作为运行缓冲液进行固定。在芯片上的一个流通池表面被活化和灭活用作在分析物注入期间的空白。在动力学实验中，HBS-EP用作运行缓冲液，且流动速率为50μl/min。将分析物，即Z变体各自在HBS-EP缓冲液中稀释至终浓度为100nM、20nM和4nM，并注射4min，随后在运行缓冲液中解离8min。在8min解离之后，用2次注射10mM HCl再生表面。动力学常数使用BiaEvaluation软件4.1(GE Healthcare)的Langmuir 1:1模型由传感图来计算。
Biacore结合特异性分析：在Biacore 2000仪器中分析3种His6-加标签的IL-17A结合Z变体(Z10508(SEQ ID NO:2)、Z10532(SEQ ID NO:1)和Z15167(SEQ ID NO:4))与hIL-17A(SEQ ID NO:1226)、hIL-17F(SEQ ID NO:1228；R&D Systems，目录号1335-IL/CF)和人类IL-17A/F异二聚体(R&D Systems，目录号5194-IL-025/CF)的相互作用。将3种不同的IL-17变体固定在CM5芯片表面的羧化葡聚糖层上的流通池中。根据制造商的方案使用胺偶联化学反应以及使用HBS-EP作为运行缓冲液进行固定。在芯片上的一个流通池表面被活化和灭活用作在分析物注入期间的空白。在结合实验中，HBS-EP用作运行缓冲液，且流动速率为50μl/min。将分析物，即Z变体各自在HBS-EP运行缓冲液中稀释至终浓度为4nM、20nM、100nM和500nM，并注射4min。在解离15min之后，用4次注射10mM HCl再生表面。使用BiaEvaluation软件分析结果。
NHDF测定中对IL-17A诱导的IL-6产生的阻断：基本上如实施例3中描述通过IL-6特异性ELISA进行NHDF测定和定量。简言之，在实验的前一天，以100μl将5000个细胞/孔接种到半区96孔培养板。在实验当天，36种IL-17A特异性Z变体的稀释物在单独的96孔板中制备。将Z变体在包含0.9nM hIL-17A的培养基中以三倍步骤从4690nM滴定至0.08nM。制备了hIL-17A的标准曲线(6.2-0.0001nM)以及包含具有0.9nM hIL-17A的培养基或单独的培养基的对照。
结果
CD分析：对具有His6标签的IL-17A结合Z变体确定的CD光谱显示，每一种变体在20℃具有α-螺旋结构。其中确定解链温度(Tm)的可变温度测量的结果示于表10中。对所有IL-17A结合Z变体，当将在加热至90℃之前和之后测量的光谱重叠时，观察到可逆折叠。
通过ELISA分析IL-17A结合能力：在ELISA测定中筛选来自第一和第二成熟轮的纯化的His6-加标签的Z变体分子结合IL-17A的能力。结果在图3中被显示为与变体Z10241相比的结合能力百分比。
Biacore动力学分析：通过在包含固定的IL-17A的表面上注射不同浓度的Z变体，在Biacore仪器中分析28种His6-加标签的IL-17A结合Z变体与hIL-17A的相互作用。使用1:1相互作用模型，Z变体与hIL-17A的结合的动力学参数(KD、ka(kon)和kd(koff))的归纳在表11中给出。
表10：解链温度(Tm)
Biacore结合特异性分析：通过在包含IL-17变体的表面上注射Z变体，在Biacore仪器中测试3种His6-加标签的IL-17A结合Z变体(Z10508、Z10532和Z15167)与hIL-17A、hIL-17F和hIL-17A/F的结合。表面上的配体固定水平分别为IL-17A、IL-17F和IL-17A/F的657RU、977RU和770RU。所有测试的Z变体显示与人类IL-17A的结合，且与IL-17A/F的结合较弱，而未能检测到与IL-17F的结合。图4中展示了从其减去来自空白表面的应答所得的曲线。Z15167显示对人类IL-17A的最快缔合曲线。
NHDF测定中IL-17A诱导的IL-6产生的阻断：在NHDF测定中筛选来自第一和第二成熟轮的纯化的His6-加标签的Z变体阻断IL-17A诱导的IL-6产生的能力。来自NHDF测定的结果显示，所有测试的成熟结合物与初级结合物His6-Z06282相比具有增加的IL-17A特异性阻断能力。展示来自第一成熟文库的一系列结合物的典型抑制谱的图示于图5中，并且所有分析的结合物的计算的IC50值示于表12中。
表11：Z变体与hIL-17A结合的动力学参数
表12：成熟Z-变体的IC50值
实施例9
IL-17结合Z-ABD-Z多肽的产生
IL-17A为具有两个受体结合位点的同二聚体细胞因子。据推测，包含本公开内容的IL-17A结合Z变体的两个部分的多肽将比包含一个此类部分的多肽更有效地阻断IL-17A。该实施例描述了用于亚克隆和产生包含以通用格式Z-[L1]-ABD-[L2]-Z与白蛋白结合结构域变体PP013(SEQ ID NO:1224)融合的两个Z变体的多肽的一般程序，其中[L1]和[L2]为将Z和ABD部分分离的接头。
材料和方法
具有不同[L1]和[L2]接头长度的Z-[L1]-ABD-[L2]-Z多肽的亚克隆：使用PfuTurbo DNA聚合酶(Agilent Technologies，目录号600254)连同合适的引物对通过PCR从文库载体pAY02592扩增Z06282(SEQ ID NO:1206)、Z10241(SEQ ID NO:11)和Z10532(SEQ IDNO:1)的DNA。通过使用T4DNA连接酶(Fermentas，目录号EL0011)在三个随后的克隆步骤中将编码每一个部分的DNA连接到表达载体pET26b(+)(Novagen,Madison,WI)中，产生Z-[L1]-ABD-[L2]-Z构建体。编码3个部分的DNA通过编码具有不同数目的(GGGGS)n重复的杂交接头的DNA分离，侧翼为限制性内切酶位点。由表达载体编码的构建体为Z#####-[GAP-(G4S)n-TS]-PP013-[GT-(G4S)n-PR]-Z#####，其中每一个n单独地为1-4，和如在表13中进一步指定的。
表13：经由不同的[L1]和[L2]长度与ABD融合的二聚体Z变体
名称 SEQ ID NO Z-[L1]-ABD-[L2]-Z多肽
ZAZ3174 1233 Z06282-[GAP-(G4S)4-TS]-PP013-[GT-(G4S)4-PR]-Z06282
ZAZ3175 1234 Z06282-[GAP-(G4S)3-TS]-PP013-[GT-(G4S)3-PR]-Z06282
ZAZ3176 1235 Z06282-[GAP-(G4S)2-TS]-PP013-[GT-(G4S)2-PR]-Z06282
ZAZ3236 1240 Z06282-[GAP-G4S-TS]-PP013-[GT-G4S-PR]-Z06282
ZAZ3237 1241 Z06282-[GAP-G4S-TS]-PP013-[GT-(G4S)2-PR]-Z06282
ZAZ3220 1236 Z10241-[GAP-(G4S)4-TS]-PP013-[GT-(G4S)4-PR]-Z10241
ZAZ3221 1237 Z10532-[GAP-(G4S)4-TS]-PP013-[GT-(G4S)4-PR]-Z10532
编码Z#####-[(I)-(G4S)n-(II)]-PP013-[(III)-(G4S)n-(IV)]-Z#####的DNA中的限制性位点可分别用限制性内切酶AscI(I)、SpeI(II)、KpnI(III)和SacII(IV)裂解。
具有最小的[L1]接头的Z-[L1]-ABD-[L2]-Z多肽的亚克隆：使用标准分子生物学技术产生编码包含Z06282(SEQ ID NO:1206)但具有最小接头[L1]的另外的二聚Z变体的DNA。由表达载体编码的构建体为Z06282-VDGS-PP013-GT-(G4S)n-PR-Z06282，和如在表14中进一步指定的。
使用Pfu Turbo DNA聚合酶连同合适的引物对通过PCR扩增编码Z12876(SEQ IDNO:1218)、Z14253(SEQ ID NO:1219)、Z14254(SEQ ID NO:1220)和Z14255(SEQ ID NO:1221)(分别相应于Z10241(SEQ ID NO:11)、Z10532(SEQ ID NO:1)、Z10508(SEQ ID NO:2)和Z10863(SEQ ID NO:3)，但以氨基酸残基AE而不是VD开始)的基因。通过使用T4 DNA连接酶在三个随后的克隆步骤中将每一种片段连接到表达载体pET26b(+)中，产生Z-[L1]-ABD-[L2]-Z构建体。使用标准分子生物学技术通过定点诱变进一步修饰的接头分离编码三个部分的DNA。由表达载体编码的构建体为Z####-[VDGS]-PP013-[GT-G4S-PK]-Z####和Z#####-[ASGS]-PP013-[GT-G4S]–Z#####，和如在表14中进一步指定的。
表14：经由最小的[L1]接头与ABD融合的二聚体Z变体
△：缺失指定的氨基酸残基
培养：将大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)用包含每一种各自Z-ABD-Z多肽的基因片段的质粒转化，并在37℃在800ml或1000ml的补充有50μg/ml卡那霉素的TSB-YE培养基中培养。为了诱导蛋白表达，在OD600＝2时，添加IPTG至终浓度为0.2mM并使培养物在37℃再孵育5h。通过离心收获细胞。
IL-17A结合Z-ABD-Z多肽的纯化：将细胞沉淀物重悬于补充有(Merck)的TST缓冲液(25mM Tris-HCl、1mM EDTA、200mM NaCl、0.05％Tween 20,pH 8.0)中。在通过超声处理破碎细胞和通过离心澄清之后，每一种上清液被应用于装有琼脂糖和固定有抗-ABD配体(内部产生的)的柱上。在用TST缓冲液和5mM NH4Ac pH 5.5缓冲液洗涤之后，用0.1M HAc洗脱Z-ABD-Z多肽。将乙腈(ACN)以10％的终浓度添加至洗脱的级分，并且将样品装载在预先用RPC溶剂A(0.1％TFA、10％ACN、90％水)平衡的Source 15RPC柱(GEHealthcare)上。在柱用RPC溶剂A洗涤之后，结合的蛋白用从RPC溶剂A到RPC溶剂B(0.1％TFA、80％ACN、20％水)的线性梯度洗脱。包含纯的Z-ABD-Z多肽的级分通过SDS-PAGE分析来鉴定并汇集。在RPC纯化之后，池的缓冲液使用Sephadex G-25柱(GE Healthcare)交换为PBS(2.68mM KCl、137mM NaCl、1.47mM KH2PO4、8.1mM Na2HPO4，pH 7.4)。最后，Z-ABD-Z变体在红柱(Hyglos)上纯化以确保低内毒素含量。
蛋白浓度通过使用ND-1000分光光度计测量在280nm处的吸光度和各自蛋白的消光系数来确定。通过用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析纯度，并通过LC/MS分析来证实每种纯化的Z-ABD-Z变体的身份。
结果
培养和纯化：与ABD融合的IL-17A结合Z变体在大肠杆菌中表达为可溶性基因产物。每一种最终蛋白制品的SDS-PAGE分析显示，这些蛋白制品主要包含期望的IL-17A结合Z-ABD-Z多肽。通过HPLC-MS分析来证实每一种Z-ABD-Z多肽的正确身份和分子量。
实施例10
Z-ABD-Z多肽的溶解度
通过使用超滤连续浓缩样品，随后通过在280nm处的吸光度读数进行浓度测量，并目视检查样品来研究三种Z-ABD-Z多肽在生理缓冲液中的溶解度。
材料和方法
将Z-ABD-Z多肽ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)、ZAZ3364(SEQ ID NO:1245)和ZAZ3422(SEQ ID NO:1247)在PBS，pH 7.4中稀释至2.5mg/ml。将12个具有3kDa截留量(cut-off)的Amicon Ultra离心过滤器单元(Millipore，目录号UFC800324)在浮桶式转子离心机中通过以4000g离心10min用PBS进行预清洗。将浓缩器倒空，并将4ml的每一种Z-ABD-Z多肽添加至第一组三个不同的离心过滤器单元中。在20℃以4000g进行离心13-16min，产生约1ml浓缩物。从每一种浓缩物中取出20μl样品(UF样品1)用于进一步分析，并将剩余的样品体积转移至第二组三个离心过滤器单元。分别以8-10min、7min和13min的旋转时间将离心和样品取出重复三次(分别为UF样品2、3和4)。使用ND-1000分光光度计并且通过分别将UF样品1-4在PBS中稀释3倍、6倍、12倍和24倍进行吸光度读数。使用理论消光系数1Abs280＝0.612mg/ml计算浓度(对于所有三种Z-ABD-Z多肽相同)。还进行未稀释滤液的吸光度读数。
结果
在每一个离心步骤之后通过在280nm处的吸光度读数确定的浓度示于表15中。通过目视检查浓缩物未检测到聚集体。因此，在PBS，pH 7.4中，ZAZ3363、ZAZ3364和ZAZ3422的溶解度被确定为至少60mg/ml。未稀释滤液的吸光度读数显示浓度非常接近0mg/ml。
表15：在连续浓缩Z-ABD-Z样品之后的浓度
实施例11
Biacore结合的跨物种分析
材料和方法
Z-ABD-Z多肽ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)、ZAZ3364(SEQ ID NO:1245)和ZAZ3365(SEQ ID NO:1246)与hIL-17A和食蟹猴IL-17A(cIL-17A,SEQ ID NO:1229；Evitria，定制订购)的相互作用以及ZAZ3220(SEQ ID NO:1236)与hIL-17A和恒河猴IL-17A(rmIL-17-A,SEQID NO:1230；Cusabio，目录号CSB-EP011597MOV)的相互作用在Biacore 2000中进行分析。HSA被固定在CM5芯片表面的羧化的葡聚糖层上的流通池中。根据制造商的方案使用胺偶联化学反应以及使用HBS-EP作为运行缓冲液进行固定。表面上的HSA固定水平分别为953RU(用于ZAZ3363、ZAZ3364和ZAZ3365)和493RU(用于ZAZ3220)。在芯片上的一个流通池表面被活化和灭活用作在分析物注入期间的空白。在结合实验中，HBS-EP用作运行缓冲液，且流动速率为30μl/min。将ZAZ3363、ZAZ3364和ZAZ3365在HBS-EP运行缓冲液中稀释至终浓度为200nM，并注射5min，随后注射IL-17A变体。将ZAZ3220在HBS-EP运行缓冲液中稀释至500nM的终浓度，并注射4min，随后注射IL-17A变体。将hIL-17A和cIL-17A各自在HBS-EP运行缓冲液中稀释至终浓度为2.5nM、10nM和40nM，并在具有HSA上捕获的ZAZ3363、ZAZ3364和ZAZ3365的表面上注射5min。在解离10min之后，用两次注射10mM HCl再生表面。将hIL-17A和rmIL-17A在HBS-EP运行缓冲液中稀释至终浓度分别为0.1nM、0.3nM、0.9nM、2.7nM和8.1nM以及2.7nM、8.1nM、24.3nM、72nM和216nM，并在具有HSA上捕获的ZAZ3220的表面上注射6min。在解离5min之后，用两次注射10mM HCl再生表面。使用BiaEvaluation软件分析结果。
结果
通过在包含HSA的表面上注射Z-ABD-Z多肽，随后注射IL-17A变体，在Biacore仪器中测试hIL-17A和cIL-17A与ZAZ3363、ZAZ3364和ZAZ3365的结合，以及hIL-17A和rmIL-17A与ZAZ3220的结合。所有测试的Z变体显示与测试的IL-17A变体结合，即ZAZ3363、ZAZ3364和ZAZ3365显示与人类和食蟹猴IL-17A的结合(图6)以及ZAZ3220与人类和恒河猴IL-17A的结合。
实施例12
Biacore结合特异性分析
在该实施例中，两种Z-ABD-Z多肽的特异性通过分析其与IL-17家族的一组蛋白、与其他白细胞介素和其他丰富的血浆蛋白的潜在相互作用来测试。还分析了同一组分析蛋白与ABD变体PEP07843的潜在相互作用。
材料和方法
在Biacore 2000仪器中分别分析ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)或ZAZ3422(SEQ IDNO:1247)与24种或12种不同蛋白的组(表16中指定的)的相互作用。将HSA和ABD变体PEP07843(SEQ ID NO:1225，相应于具有GSS的N-末端延伸的PP013(SEQ ID NO:1224))固定在CM5芯片表面上，并且如实施例11描述的制备空白表面。表面上的配体固定水平，对于ZAZ3363运行中使用的芯片的HSA和PEP07843分别为1315RU和99RU，对于ZAZ3422运行中使用的芯片的HSA和PEP07843分别为791RU和100RU。在结合实验中，HBS-EP用作运行缓冲液，且流动速率为30μl/min。将ZAZ3363和ZAZ3422在HBS-EP或补充有500mM NaCl的HBS-EP中稀释至终浓度为200nM，并注射7min，随后注射分析物。将分析物，即24种或12种不同蛋白的组各自在HBS-EP或补充有500mM NaCl的HBS-EP中稀释至终浓度为0.4nM至250nM并注射5min。在解离7min(ZAZ3363)或10min(ZAZ3422)之后，用四次(ZAZ3363)或五次(ZAZ3422)注射10mM NaOH和两次注射10mM HCl再生表面。使用BiaEvaluation软件分析结果。
表16：用ZAZ3363和ZAZ3422测试分析物蛋白
供应商：1Peprotech；2R&D Systems；3Roche/Apoteket AB；4Bethyl；5ProSpec；6Sino Biological Inc；7Sigma
结果
ZAZ3363和ZAZ3422的特异性通过研究其分别与24种或12种分析物蛋白的相互作用在Biacore仪器中进行测试。在包含HSA的表面上注射Z-ABD-Z多肽，随后注射分析物蛋白。对于ZAZ3363和ZAZ3422检测到的仅有的相互作用为被hIL-17A的强结合和被hIL-17A/F的较弱结合，如预期的并且与实施例8中呈现的结果相一致。还评价了分析物蛋白与ABD变体PEP07843的潜在相互作用，但未检测到相互作用。因此，Z-ABD-Z多肽表现为高度特异性的。
实施例13
使用 对Z-ABD-Z、IL-17A和HSA复合物的动力学测量
准确地确定高亲和力相互作用的动力学参数的SPR的技术限制以及通过SPR确定两个二聚体靶之间的亲和力的更高复杂性保证了使用动力学排除测定技术进一步分析与HSA复合的Z-ABD-Z多肽对IL-17A的结合，以及单独的或与IL-17A复合的Z-ABD-Z多肽对HSA的结合。测量溶液相中未修饰分子之间的平衡结合亲和力和动力学(Darling和Brault,2004.Assay and Drug Dev Tech 2(6):647-657)。
材料和方法
Z-ABD-Z多肽ZAZ3220(SEQ ID NO:1236)、ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)和ZAZ3422(SEQ ID NO:1247)、以及HSA(Novozymes，目录号230-005)、人类IL-17A(Peprotech，目录号200-17)、生物素化的(如实施例1中描述的)人类IL-17A、小鼠单克隆抗HSA抗体(Abcam，目录号10241)和在内部产生的山羊多克隆抗Z抗体被运送至进行测量和分析的Sapidyne Instruments Inc(Boise,Idaho,USA)。
Z-ABD-Z/HSA与IL-17A的结合：为了确定亲和力，即KD，与HSA复合的各自Z-ABD-Z多肽用作恒定结合配偶体(CBP)，且IL-17A用作滴定剂。使用Pro软件和应用最小二乘分析来进行数据分析，以将KD和活性结合位点浓度(ABC)的最佳解决方案拟合为表示1:1可逆双分子相互作用的曲线。
对于ka的确定，使用与用于动力学实验、与用于平衡实验的捕获试剂相同的固定的IL-17A，施加直接结合曲线分析。在平衡前测量样品中的游离的Z-ABD-Z/HSA的量，产生数据点，其当样品向平衡移动时监测游离的Z-ABD-Z/HSA的减少。
Z-ABD-Z和Z-ABD-Z/IL-17A与HSA的结合：在IL-17A的存在或不存在下，进一步分析Z-ABD-Z多肽ZAZ3363与HSA的结合。为了确定KD，游离的或与IL-17A复合的ZAZ3363用作恒定结合配偶体(CBP)，且HSA用作滴定剂。使用如以上描述的Pro软件进行数据分析。
对于ka的确定，使用与用于动力学实验、与用于平衡实验的捕获试剂相同的固定的HSA，施加直接结合曲线分析。在平衡前测量样品中的ZAZ3363/IL-17A的量，产生数据点，其当样品向平衡移动时监测游离的ZAZ3363/IL-17A的减少。
结果
在第一组测量中，分别与HSA复合的Z-ADB-Z多肽ZAZ3220、ZAZ3363和ZAZ3422显示以非常高的亲和力结合IL-17A，其KD值范围为亚皮摩尔至飞摩尔。当假定在这些Z-ABD-Z多肽和二聚体IL-17A之间单价结合时计算的动力学参数示于表17中。
在第二组测量中，测量了在游离的或与IL-17A复合的ZAZ3363与HSA之间的相互作用。来自这些分析的计算的动力学参数示于表18中。ZAZ3363对HSA的亲和力不受IL-17A的存在显著地影响。
总之，使用技术的测量指示，Z-ABD-Z多肽对IL-17A的亲和力非常高。测量的KD<0.33pM优于对两种临床上最先进的比较物苏金单抗(KD＝122pM；WO2006/013107和WO2012/125680)和ixekizumab(KD＝2pM；WO2007/070750)报告的亲和力。另外，证明了同时结合IL-17A和白蛋白两者，即在Z-ABD-Z融合蛋白中两种结合功能均是完整的。
表17：Z-ABD-Z多肽结合IL-17A的动力学参数
*95％置信区间
**对于KD未分辨到95％置信区间
表18：Z-ABD-Z多肽结合HSA的动力学参数
*95％置信区间
实施例14
NHDF测定中Z-ABD-Z多肽的表征
材料和方法
NHDF测定中IL-17A诱导的IL-6产生的阻断：将NHDF细胞(Lonza，目录号CC-2511)培养于供给促生长因子(Lonza，目录号CC-5034)的成纤维细胞基础培养基(Lonza，目录号CC-3132)中。在实验的前一天，以100μl将5000个细胞/孔接种到半区96孔培养板(Greiner，目录号675180)。在实验当天，在单独的96孔板中制备具有在Z和ABD部分之间的不同接头长度的IL-17A特异性Z-ABD-Z多肽(ZAZ3174(SEQ ID NO:1233)、ZAZ3175(SEQ ID NO:1234)、ZAZ3176(SEQ ID NO:1235)、ZAZ3220(SEQ ID NO:1236)、ZAZ3221(SEQ ID NO:1237)、ZAZ3234(SEQ ID NO:1238)、ZAZ3235(SEQ ID NO:1239)、ZAZ3236(SEQ ID NO:1240)、ZAZ3237(SEQ ID NO:1241)、ZAZ3269(SEQ ID NO:1242)和ZAZ3270(SEQ ID NO:1243))的稀释物。将Z-ABD-Z多肽在包含0.9nM hIL-17A和8μM HSA的培养基中以三倍步骤从190nM滴定至0.003nM。还制备了标准IL-17A曲线(6.2-0.0001nM)以及包含具有0.9nM IL-17A的培养基或单独的培养基的对照。将具有过夜培养的NHDF细胞的板中的培养基弃去，并且将100μl/孔的样品转移至细胞板，将其在37℃置于培养箱中18-24h。第二天，使用如实施例3中描述的IL-6特异性ELISA定量上清液中的IL-6含量。在随后的基本上如以上描述的NHDF测定中但使用来自ATCC的NHDF细胞系(目录号PSC-201-012)分析了另外的Z-ABD-Z多肽(ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)、ZAZ3364(SEQ ID NO:1245)、ZAZ3365(SEQ ID NO:1246)和ZAZ3422(SEQ ID NO:1247))。将这些Z-ABD-Z多肽在40℃孵育2周和4周之后还分析了多肽的阻断能力。
结果
在NHDF测定中研究了Z-ABD-Z多肽阻断IL-17A诱导的IL-6产生的能力。首先，观察到，与单体His6-Z格式相比，Z-ABD-Z格式显著增加了阻断能力，如图7A中示出的，在图7A中展示了His6-Z10241和ZAZ3220(包括Z10241)的抑制曲线。ZAZ3220曲线的形状表明，达到了该细胞测定的检测极限，具有ZAZ3220的一对一抑制作用，并且Z-ABD-Z多肽具有比能够从该实验预期的甚至更好的抑制作用是可能的。预期的是，由于通过结合同型二聚体IL-17A获得的强亲合力效应，ZAZ3220的效力增加至测定极限。其次，具有不同接头长度并包含Z变体Z06282(SEQ ID NO:1206)和Z12876(SEQ ID NO:1218)的Z-ABD-Z多肽的比较表明，接头的长度对阻断能力具有较小作用。包含具有不同接头长度的Z06282的一组Z-ABD-Z多肽展示在图7B中。还在将另外的Z-ABD-Z多肽ZAZ3363、ZAZ3364、ZAZ3365和ZAZ3422在40℃孵育2周和4周之后，在随后的NHDF测定中分析Z-ABD-Z多肽。甚至在40℃孵育四周之后，IL-17A抑制能力被保留。反映不同Z-ABD-Z多肽抑制IL-17A的能力的计算的IC50值归纳于表19中。这些IC50值比目前在临床开发中的IL-17A抑制单克隆抗体苏金单抗AIN457(WO2006/013107和WO2012/125680)的报告的hIL-6产生中和活性(IC50＝2.1±0.1nM)低三倍以上。
表19：来自NHDF测定的计算的IC50值
实施例15
hIL-17A的体内中和
人类IL-17A能够结合并刺激小鼠IL-17受体，导致小鼠KC(CXCL1)趋化因子的升高和随后的分泌。
材料和方法
KC小鼠模型中hIL-17A的体内中和：进行剂量范围实验以鉴定用于诱导小鼠KC的人类IL-17A的最佳剂量。这些实验揭示，在IL-17A施用之后2小时收集的小鼠血清中，150μg/kg剂量的人类IL-17A诱导合适的KC水平。在该模型中在两种不同的情形分析ZAZ3174(SEQ ID NO:1233)和ZAZ3220(SEQ ID NO:1236)。在第一个实验中，在皮下注射人类IL-17A之前9小时，ZAZ3174以三种不同剂量：0.25mg/kg、2.5mg/kg和25mg/kg被s.c.施用至小鼠。在施用人类IL-17A之后2小时处死小鼠，并且根据制造商的说明，使用商购可得试剂盒(KCQuantikine；R&D Systems，目录号D1700)通过ELISA确定KC水平。在第二个实验中，在皮下注射人类IL-17A之前9小时，ZAZ3220以三种不同剂量：0.05mg/kg、0.1mg/kg和0.4mg/kg被s.c.施用至小鼠。在施用人类IL-17A之后2小时处死小鼠，并且如以上通过ELISA确定KC水平。
结果
KC小鼠模型中hIL-17A的体内中和：测定的Z-ABD-Z多肽阻断人类IL-17A刺激小鼠IL-17受体的能力，导致以剂量依赖性方式抑制小鼠KC的升高。ZAZ3174在所描述条件下以2.5mg/kg的剂量完全阻断KC的诱导，如图8A中示出的。第二个实验揭示，包含亲和力成熟的Z变体的Z-ABD-Z多肽ZAZ3220以0.4mg/kg的剂量完全阻断IL-17A诱导的KC应答(图8B)。与ZAZ3174相比，这相应于6倍增加的体内阻断作用。用0.1mg/kg ZAZ3220获得72％的抑制。
实施例16
Z-ABD-Z多肽在大鼠体内的药代动力学
该实施例描述了两个单独的实验，其中在皮下(s.c.)和/或静脉内(i.v.)注射后确定两种不同的Z-ABD-Z多肽在大鼠中的药代动力学参数。
材料和方法
在第一个实验中，配制于PBS中的ZAZ3220(SEQ ID NO:1236)以相应于57nmol/kg的1.2mg/kg的剂量被i.v.施用(n＝3)至Sprague Dawley(SD)雄性大鼠(Charles River,Germany)。在施用之后的不同时间点0.08h、8h、24h、48h、72h、120h、168h、240h、336h、408h和504h，从每一只大鼠的尾静脉收集血液样品。
在第二个实验中，配制于PBS中的ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)以相应于64nmol/kg的1.2mg/kg的剂量被i.v.(n＝5)或s.c.(n＝6)施用至SD雄性大鼠。在i.v.施用后的时间点0h、0.08h、0.5h、1h、3h、8h、24h、72h、120h、168h、216h、264h、336h、408h、456h和504h或在s.c.施用后的时间点0h、0.08h、0.5h、1h、3h、8h、24h、72h、120h和168h，从每一只大鼠的尾静脉收集血液样品。
从血液样品制备血清，并将其储存于-20℃直到分析。使用PK-ELISA进行来自大鼠的血清中ZAZ3220和ZAZ3363的定量。
PK-ELISA：将96孔、半区板(50μl/孔)用4μg/孔的在包被缓冲液(Sigma，目录号C3041)中的山羊抗-Z Ig(内部生产)在4℃包被过夜。第二天，将板用PBS+0.5％酪蛋白封闭1.5h。将在PBS-酪蛋白+10％大鼠血清池(测定基质)中最小稀释10x的单独大鼠血清添加至板，并以2倍稀释系列进行滴定。包含在一个板上的为每一种Z-ABD-Z多肽的标准品(在300ng/ml和3pg/ml之间滴定)，并且包含在每一个板上的为稀释至浓度在测定的线性范围内的每一种Z-ABD-Z多肽的四个对照。将标准品和对照在测定基质中稀释。稀释的标准品、对照和样品在单独的板中制备并转移至包被的ELISA板。将板在RT孵育1.5h，随后与定制的检测兔抗-ABD Ig(4μg/ml,CUV002)孵育1.5h并且与驴抗兔IgG-HRP(JacksonImmunoresearch，目录号711-035-152)孵育1h。将反应用TMB(Thermo Fisher)进行显影，并且在15min之后显影反应用2M H2SO4来终止。在ELISA读取器(Victor3,Perkin Elmer)中在450nm处测量吸光度。使用GraphPad Prism5和四参数对数(4-PL)曲线拟合从标准曲线计算样品中各自Z-ABD-Z变体的浓度。
药代动力学分析：药代动力学分析是基于单独大鼠血清浓度与时间的关系。使用Microsoft Excel和GraphPad Prism并应用两室模型估计终末半衰期(T1/2)和生物利用度。
结果
Z-ABD-Z多肽ZAZ3220和ZAZ3363在单次施用1.2mg/kg至SD大鼠后的平均血清浓度-时间谱分别示于图9A和图9B中，并且使用两室分析计算的药代动力学参数归纳于表20中。ZAZ3220和ZAZ3363两者在i.v.施用后估计的半衰期(t1/2)为约49h。s.c.施用的ZAZ3363的t1/2为45h，且生物利用度被计算为45％。
表20：Z-ABD-Z多肽在单次i.v.或s.c.施用至SD大鼠后的平均药代动力学参数
Cmax：峰值血清浓度；Tmax：达到峰值血清浓度的时间；AUC0-t：-从时间零至最后可定量浓度的浓度-时间曲线下面积：T1/2：半衰期；MRT：平均滞留时间；CL：清除；F：绝对生物利用度百分比，被计算为F＝[(平均AUCs.c.×剂量i.v.)/(平均AUCi.v.×剂量s.c.)]×100
实施例17
Z变体对兔眼睛的局部施用
对眼睛的局部施用有益于眼部紊乱，例如葡萄膜炎或干眼病。局部施用使极高的局部药物浓度具有最小的全身副作用风险。在该实施例中，在兔中研究将Z变体分子局部施用于眼睛的可能性。在四次重复的局部给药之后，在前房(房水)中、玻璃体液和血清中测量Z变体分子和对照IgG的浓度。
材料和方法
Z变体的产生：Z变体Z10199(SEQ ID NO:1217)来源于Z06282(SEQ ID NO:1206)，但起始AE被亚克隆，没有任何标签，但其中C-末端添加氨基酸残基VD。基本上如实施例2中描述进行表达，并且通过阴离子交换和反相层析进行纯化。将样品缓冲液交换为PBS pH7.2，并且使用红10柱(Hyglos)去除内毒素。
动物研究：在时间点0、1、2和3小时，将48nmol(1滴，50μl)的Z10199和ZAZ3174(SEQID NO:1233)分别局部施用至兔的每一只眼睛(n＝2/分子)。将对照人类IgG抗体(Xolair；Novartis)以相同方式施用至两只不同的兔。作为阴性对照，一只兔被施用仅PBS。在每一次施用之后，眼睑在约30s期间保持关闭，以将样品保持在角膜上。在4h之后，收集玻璃体液、房水和血清。将样品离心去除组织碎片和聚集体，并且通过ELISA分别定量Z10199、ZAZ3174和抗体的水平。
通过ELISA定量：使用内部产生的多克隆山羊抗-蛋白Z免疫球蛋白用于捕获、内部产生的多克隆兔抗-蛋白Z免疫球蛋白作为一抗和山羊抗-兔IgG-HRP(Dako目录号P0448)作为二抗，进行夹心ELISA分析收集的样品中Z10199和ZAZ3174分别的浓度。通过在RT与ImmunoPure TMB孵育15min进行检测，并且通过添加2M H2SO4终止反应。用微板读取器Victor3测量在450nm处的吸收。由用同一分子制备的标准曲线和使用GraphPad prism5和非线性回归公式计算Z10199的浓度。
收集的样品中的IgG浓度通过IgG ELISA试剂盒(Abcam 100547)分析，并使用提供的标准曲线通过制造商描述来进行且通过如以上的非线性回归进行分析。
结果
图10示出了，Z10199和ZAZ3174两者在局部施用之后均渗透眼睛，并且以低nM浓度存在于房水和玻璃体液中。相比之下，在房水或玻璃体液中未检测到对照IgG抗体。对于Z变体和IgG两者，血清样品可以被认为是阴性的。因此，本公开内容的Z变体分子可以通过该可选的施用途径递送，其不能用于抗体，并且可以实现避免全身暴露的局部作用。
实施例18
ZAZ3363制品在大鼠中十二指肠施用的药代动力学分析
材料和方法
测试项目：将ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)以浓度为50mg/ml(OAF1和OAF2)或100mg/ml(PBS)配制于1)OAF1：0.12M鹅脱氧胆酸钠(sodium chenodeoxycholate)(Sigma，目录号C8261)和0.12M没食子酸丙酯(Sigma，目录号P3130)，pH 7.4；2)OAF2：50mg/m癸酸钠(Sigma，目录号C4151)；或3)50mM磷酸钠(PBS)，pH 7.0。
NHDF细胞测定：在实施例14中描述的IL-17依赖性NHDF细胞测定中证实了配制于OAF1、OAF2或PBS中的ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)的活性。
十二指肠施用：将雄性Sprague Dawley大鼠(Charles River)用异氟烷麻醉，并制造小切口以定位十二指肠。将留置导管(R-DUOD,AgnTho’s,Sweden)手术插入十二指肠，距离其在最小脉管系统区域中原点20mm。将导管经皮穿刺至动物背部。用缝合闭合腹部肌肉组织，同时腹部皮肤切口和肩胛骨下外置部位用不锈钢伤口夹封闭。将这些动物放置恢复5-6天，然后进行研究。在手术之前，s.c施用术后镇痛(卡洛芬(carprofen)5mg/kg和丁丙诺啡(buprenorphine)0.05mg/kg)。在手术后两天，卡洛芬也每天施用一次。当必要时施用另外的丁丙诺啡剂量。在恢复期期间(3-5天)以及实验期间，在饮用水中施用抗生素(恩氟沙星(enrofloxacin)0.3mg/ml)。为了掩蔽恩氟沙星的苦味，将一块糖添加至500ml的饮用水中。为了确保维持开放，十二指肠导管每天用无菌水(0.2-0.5ml)冲洗。
在时间点零，以0.5ml的体积，将配制于OAF1或OAF2(n＝2)中的以5.4μmol/kg体重的剂量或者配制于PBS(n＝2)中的以10.8μmol/kg的ZAZ3363直接施用到十二指肠。在施用之后在1h、3h、8h、24h、72h、120h和168h，在异氟烷麻醉下采取血样，并通过标准程序制备血清。通过实施例16中描述的定量PK-ELISA测量血清中ZAZ3363的浓度，但滴定70ng/ml和1ng/ml之间的ZAZ336为标准品。
药代动力学分析：药代动力学分析是基于单独大鼠血清浓度与时间的关系。使用Microsoft Excel和GraphPad Prism估计终末半衰期(T1/2)和生物利用度。
结果
配制的ZAZ3363的活性：在NHDF细胞测定中，比较分别配制于OAF1和OAF2中的ZAZ3363与PBS中的制剂的活性。图11示出了与PBS配制的ZAZ3363相比的OAF1(图11A)和与PBS配制的ZAZ3363相比的OAF2的滴定曲线(图11B)。实验显示，两种制剂中ZAZ3363的活性与PBS制剂中的相同，即ZAZ3363的生物学活性不受不同赋形剂的影响。
ZAZ3363的十二指肠内摄取：在十二指肠内施用(i.d.)的大鼠模型中检查OAF1、OAF2和PBS配制的ZAZ3363的肠摄取。实验显示，与PBS相比，OAF1和OAF2制剂的摄取增加(图12)。如表21中示出的，OAF1、OAF2和PBS的生物利用度分别为0.2、0.8和0.0007。尽管观察到极大的个体差异，OAF2配制的ZAZ3363显示出最佳摄取，与PBS中的制剂相比好平均1160倍。OAF1中ZAZ3363的制剂比PBS制剂好平均260倍。
表21：ZAZ3363在三种不同制剂中十二指肠内施用之后的生物利用度和T1/2
制剂 T1/2(h) 生物利用度(％)
PBS 43 0.0007+/-0.0002
OAF1 43 0.2+/-0.02
OAF2 50 0.8+/-1.2
实施例19
NHDF测定中抗-IL-17A/抗-TNF复合物的表征
材料和方法
复合物和对照抗体的产生：构建靶向IL-17A和TNF的两种不同复合物以及对TNF具有亲和力的抗体。使用重链序列(HC)和轻链序列(LC)HCAda(SEQ ID NO:1231)和LCAda(SEQID NO:1232)构建与商购可得的单克隆抗体阿达木单抗具有相同CDR序列和特异性的被表示为“Ada”的抗体。经由柔性15残基(GGGGS)3接头将IL-17A靶向Z变体Z14253(SEQ ID NO:1219)部分遗传地融合至HCAda或LCAda的C-末端，分别产生复合物HCAda-Z14253和LCAda-Z14253。构建的复合物的示意图示于图13A中。通过Evitria AG(Switzerland)进行基因合成、克隆、通过在CHO细胞中瞬时基因表达产生和利用蛋白A亲和层析纯化。
NHDF测定中IL-17A诱导的IL-6产生的阻断：基本上如实施例14中描述进行NHDF测定，将研究样品HCAda-Z14253和LCAda-Z14253及其比较物在包含0.9nM rhIL-17A的培养基中以三倍步骤从63nM滴定至0.003nM。比较物为ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)、抗-TNF的抗体Ada以及如实施例2中描述的经由VDSS接头重组融合至ABD变体PP013(SEQ ID NO:1224)的阴性对照Z变体Z04726(SEQ ID NO:1223；靶向taq聚合酶)(被表示为Z04726-PP013)。还制备了标准IL-17A曲线(6.2-0.0001nM)以及包含具有0.9nM IL-17A的培养基或单独的培养基的对照。使用实施例3中描述的IL-6特异性ELISA定量上清液中的IL-6含量。
NHDF测定中TNF或TNF/IL-17A诱导的IL-8产生的阻断：将NHDF(Lonza，目录号CC-2511)细胞培养于供给促生长因子(Lonza，目录号CC-5034)的成纤维细胞基础培养基(Lonza，目录号CC-3132)中。在实验的前一天，以100μl将5000个细胞/孔接种到半区96孔培养板(Greiner，目录号675180)。在实验当天，在单独的96孔板中制备HCAda-Z14253和LCAda-Z14253及以上描述的比较物的稀释物。将复合物和比较物在包含0.1nM人类TNF(R&DSystems，目录号2210-TA/CF)或0.05nM和0.1nM rhIL-17A的混合物的培养基中以三倍步骤从5nM滴定至0.0007nM。还制备了包含具有0.1nM TNF或0.05nM和0.1nM rhIL-17A的混合物的培养基或单独的培养基的对照。将具有过夜培养的NHDF细胞的板中的培养基弃去，并且将100μl/孔的样品转移至细胞板。将板在37℃置于培养箱中18-24h。第二天，使用IL-8特异性ELISA定量上清液中的IL-8含量。
IL-8 ELISA：通过DuoSet ELISA试剂盒(R&D systems，目录号DY208)定量IL-8。将半区板(Costar，目录号3690)以50μl/孔用在PBS中的4μg/ml抗-IL-8捕获抗体在4℃包被过夜。在分析当天，将板在自来水中润洗两次，并且然后用PBS+1％BSA封闭2h。以2倍稀释系列(20-0.01ng/ml)滴定的IL-8标准品(R&D Systems，目录号890806)和来自细胞测定板的上清液被添加至包被的ELISA板(50μl/孔)中，并在RT孵育1.5h。将板在自动ELISA洗涤器中洗涤4次，并且添加20ng/ml(50μl/孔)生物素化的抗-IL-8检测抗体。在孵育另外1h之后，洗涤板，并且将50μl的经8000x稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP(Thermo Fisher，目录号N100)添加至每孔。在另外一个小时的孵育和洗涤之后，将板用50μl TMB(Thermo Fisher，目录号34021)/孔进行显影并且反应用50μl 2M H2SO4来终止。在多标记物读取器(Victor3,PerkinElmer)中读取吸光度。
结果
NHDF测定中IL-17A诱导的IL-6产生的阻断：在NHDF测定中研究两种复合物HCAda-Z14253和LCAda-Z14253关于它们阻断IL-17A诱导IL-6产生的能力。来自NHDF测定的结果示于图13B中。HCAda-Z14253和LCAda-Z14253两者均具有与ZAZ3363相似的阻断IL-17A的能力。如预期的，对于Ada或阴性对照Z04726-PP013未观察到抑制。
NHDF测定中TNF或TNF/IL-17A诱导的IL-8产生的阻断：在NHDF测定中研究两种复合物HCAda-Z14253和LCAda-Z14253关于它们阻断TNF或TNF/IL-17A混合物诱导IL-8产生的能力。来自NHDF测定的结果显示，关于特异性TNF阻断能力，HCAda-Z14253和LCAda-Z14253与抗-TNF抗体Ada具有相似的抑制特性(图13C)。然而，在其中研究了对TNF和IL-17两者的阻断作用的组合测定中，与Ada和ZAZ3363相比，HCAda-Z14253和LCAda-Z14253具有优异的抑制特性(图13D)。
实施例20
Z-ABD-Z多肽在猴体内的药代动力学
该实施例描述了在施用Z-ABD-Z多肽ZAZ3363的食蟹猴中进行的经过10天的重复剂量研究。结果用于估计食蟹猴中ZAZ3363的半衰期。
材料和方法
在第1天、第4天、第7天和第10天，ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)以20mg/kg(n＝2；1只雄性和1只雌性)和40mg/kg(n＝4；2只雄性和2只雌性)作为短i.v.输注被施用。结合在第1天(在时间点0(给药前)、在施用之后5min、0.5h、1h、2h、6h、24h和48h)的第一剂量和在第10天(在时间点0(给药前)、在施用之后5min、0.5h、1h、2h、6h、24h、48h、5天、7天、10天、12天、14天和21天)的最后剂量，收集血浆样品用于确定ZAZ3363浓度。基于在胰蛋白酶消化ZAZ3363之后获得的肽通过LC-MS/MS进行血浆样品中ZAZ3363的定量。使用非分区方法(其中单独分析第1天和第10天)和分区方法(对于每一个动物组合评价第1天和第10天的数据)两者评价浓度-时间谱。
结果
ZAZ3363在第1天和第10天施用之后的平均血浆浓度-时间谱分别示于图14A和图14B中。尽管事实上ZAZ3363未作为以完全PK评价的单剂量施用，但多次给药之后的可用结果允许预测在单剂量之后的浓度-时间谱。根据双分区行为，血浆浓度在两个阶段降低。由这一重复剂量研究和第二重复剂量研究(数据未示出)估计的第二阶段的t1/2为约4-7.5天，这与报告的猴白蛋白的t1/2(Deo等，1974,J Nutr 104:858-64)相一致。未观察到显著的性别差异。
实施例21
Z-ABD-Z多肽在犬中的口服施用
材料和方法
胶囊的制备：将ZAZ3363(SEQ ID NO:1244)以100mg/ml的浓度配制于OAF1(参见实施例18)中。将制剂冻干并填充于硬壳胶囊中随后肠溶包被(由Catalent PharmaSolutions,Beinheim,France进行)。每一个胶囊包含约25mg ZAZ3363。
动物研究：动物研究在Huntingdon Life Science(Cambridgeshire,UK)进行。禁食的比格犬(n＝3；雌性个体)各自接受包含ZAZ3363的六个胶囊(约150mg)。在施用后0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时和96小时时采取血清样品。
定量：使用基本上如实施例16中描述的PK夹心ELISA定量血清样品中ZAZ3363的浓度，但在第一包被步骤中使用内部产生的单克隆抗-Z IgG。
结果
ZAZ3363的单独犬血清浓度与时间谱示于图15中。结果显示，ZAZ3363在所有三种动物中的肠吸收，但个体之间有一些变化。ZAZ3363血清浓度达到2-30nM的最大值。在循环中后，ZAZ3363的血清水平保持稳定至少高达96h，这归因于与在ZAZ3363内的ABD部分PP013(SEQ ID NO:1223)与犬白蛋白的相互作用。先前已经证明了PP013结合犬白蛋白的能力(WO2012/004384)。
实施方案的逐项列举
1.IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含IL-17A结合基序BM，所述基序由选自以下的氨基酸序列组成：
i)EX2DX4AX6X7EIX10X11LPNL X16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29
其中，彼此独立地，
X2选自A、H、M和Y；
X4选自A、D、E、F、K、L、M、N、Q、R、S和Y；
X6选自A、Q和W；
X7选自F、I、L、M、V、W和Y；
X10选自A和W；
X11选自A、D、E、F、G、L、M、N、Q、S、T和Y；
X16选自N和T；
X17选自H、W和Y；
X18选自A、D、E、H和V；
X20选自A、G、Q、S和W；
X21选自A、D、E、F、H、K、N、R、T、V、W和Y；
X25选自A、D、E、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T和V；
X26选自K和S；
X28选自I、L、N和R；且
X29选自D和R；
和
ii)与在i)中定义的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。
2.根据项目1所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列i)中：
X2选自A、H和M；
X4选自A、D、E、F、L、M、N、Q、R和Y；
X11选自A、D、E、F、G、L、M、N、S、T和Y；
X18选自A、D、E和V；
X20选自A、G、Q和W；
X21选自E、F、H、N、R、T、V、W和Y；
X25选自A、D、E、G、H、I、L、N、Q、R、S、T和V；且
X28选自I、N和R。
3.根据项目2所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列i)中：
X16为T；
X17为W；
X21选自E、F、H、W、T和Y；
X25选自A、D、E、G、H、I、L、N、Q、R、S和T；
X26为K；且
X29为D。
4.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)满足以下11个条件I-XI中的至少6个：
I.X2为A；
II.X4选自D、E和Q；
III.X6为A；
IV.X7选自F和V；
V.X16为T；
VI.X17为W；
VII.X18选自A和D；
VIII.X20为W；
IX.X26为K；
X.X28为R；且
XI.X29为D。
5.根据项目4所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)满足所述11个条件I-XI中的至少7个。
6.根据项目5所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)满足所述11个条件I-XI中的至少8个。
7.根据项目6所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)满足所述11个条件I-XI中的至少9个。
8.根据项目7所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)满足所述11个条件I-XI中的至少10个。
9.根据项目8所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)满足所述11个条件I-XI的全部。
10.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，其中X2X6、X2X10或X6X10为AA。
11.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，其中X2X17、X2X20、X6X17、X6X20、X10X17或X10X20为AW。
12.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，其中X2X28、X6X28或X10X28为AR。
13.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，其中X17X28或X20X28为WR。
14.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，其中X17X20为WW。
15.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)为选自由SEQ IDNO:1-1216组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
16.根据项目15所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)为选自由SEQ ID NO:1-66、1200、1206和1214组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
17.根据项目16所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)为选自由SEQ ID NO:1-66组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
18.根据项目17所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)为选自由SEQ ID NO:1-35组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
19.根据项目18所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)为选自由SEQ ID NO:1-27组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
20.根据项目19所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)为选自由SEQ ID NO:1-10组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
21.根据项目20所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)为选自由SEQ ID NO:1-7组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
22.根据项目21所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)为选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
23.根据项目22所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)为SEQ ID NO:1中从位置8至位置36的序列。
24.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，其中所述IL-17A结合基序形成三螺旋束蛋白结构域的一部分。
25.根据项目24所述的IL-17A结合多肽，其中所述IL-17A结合基序基本上形成所述三螺旋束蛋白结构域内具有相互连接环的双螺旋的一部分。
26.根据项目25所述的IL-17A结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自细菌受体结构域。
27.根据项目26所述的IL-17A结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的结构域或其衍生物。
28.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列结合模块BMod：
iii)K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ；
其中
[BM]为如项目1-23的任一项中定义的IL-17A结合基序，条件是X29为D；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；
Xf选自A和S；和
iv)与由iii)定义的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
29.根据项目1-27中任一项所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列结合模块BMod：
v)K-[BM]-QPEQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ；
其中
[BM]为如项目1-23的任一项中定义的IL-17A结合基序，条件是X29为R；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；
Xf选自A和S；和
vi)与由v)定义的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
30.根据项目28或29所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xa为A。
31.根据项目28或29所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xa为S。
32.根据项目28-31中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xb为N。
33.根据项目28-31中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xb为E。
34.根据项目28-33中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xc为A。
35.根据项目28-33中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xc为S。
36.根据项目28-33中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xc为C。
37.根据项目28-36中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xd为E。
38.根据项目28-36中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xd为N。
39.根据项目28-36中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xd为S。
40.根据项目28-39中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xe为D。
41.根据项目28-39中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xe为E。
42.根据项目28-39中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xe为S。
43.根据项目37和39-42中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的XdXe选自EE、ES、SD、SE和SS。
44.根据项目43所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的XdXe为ES。
45.根据项目43所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的XdXe为SE。
46.根据项目43所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的XdXe为SD。
47.根据项目28-46中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xf为A。
48.根据项目28-46中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)或v)中的Xf为S。
49.根据项目28或29所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A且Xf为A。
50.根据项目28或29所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A且Xf为A。
51.根据项目28或29所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C且Xf为A。
52.根据项目28或29所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S且Xf为S。
53.根据项目28或29所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S且Xf为A。
54.根据项目28或29所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A且Xf为S。
55.根据项目28或29所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C且Xf为S。
56.根据项目49所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为ND且Xf为A。
57.根据项目50所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A；XdXe为ND且Xf为A。
58.根据项目51所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为ND且Xf为A。
59.根据项目52所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为ND；且Xf为S。
60.根据项目53所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为ND且Xf为A。
61.根据项目55所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为ND且Xf为S。
62.根据项目49所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为SE且Xf为A。
63.根据项目50所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A；XdXe为SE且Xf为A。
64.根据项目51所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为SE且Xf为A。
65.根据项目52所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为SE且Xf为S。
66.根据项目54所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A；XdXe为SE且Xf为S。
67.根据项目55所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为SE且Xf为S。
68.根据项目49所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为ES且Xf为A。
69.根据项目50所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A；XdXe为ES且Xf为A。
70.根据项目51所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为ES且Xf为A。
71.根据项目52所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为ES且Xf为S。
72.根据项目55所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为ES且Xf为S。
73.根据项目49所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为A；XdXe为SD且Xf为A。
74.根据项目50所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A；XdXe为SD且Xf为A。
75.根据项目51所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为A；Xb为N；Xc为C；XdXe为SD且Xf为A。
76.根据项目52所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为S；XdXe为SD且Xf为S。
77.根据项目54所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为A；XdXe为SD且Xf为S。
78.根据项目55所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列iii)或v)中，Xa为S；Xb为E；Xc为C；XdXe为SD且Xf为S。
79.根据项目28所述的IL-17A结合多肽，其中所述序列iii)为选自由SEQ ID NO:1-1216组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
80.根据项目79所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)为选自由SEQ ID NO:1-66、1200、1206和1214组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
81.根据项目80所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)为选自由SEQ ID NO:1-66组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
82.根据项目81所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)为选自由SEQ ID NO:1-35组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
83.根据项目82所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)为选自由SEQ ID NO:1-27组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
84.根据项目83所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)为选自由SEQ ID NO:1-10组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
85.根据项目84所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)为选自由SEQ ID NO:1-7组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
86.根据项目85所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)为选自由SEQ ID NO:1-4组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
87.根据项目86所述的IL-17A结合多肽，其中序列iii)为SEQ ID NO:1中从位置7至位置55的序列。
88.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
vii)YA-[BMod]-AP；
其中[BMod]为如项目28-87的任一项中定义的IL-17A结合模块；和
viii)与由vii)定义的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。
89.根据项目1-87中任一项所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
ix)FA-[BMod]-AP；
其中[BMod]为如项目28-87的任一项中定义的IL-17A结合模块；和
x)与由ix)定义的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。
90.根据项目1-87中任一项所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xi)FN-[BMod]-AP；
其中[BMod]为如项目28-87的任一项中定义的IL-17A结合模块；和
xii)与由xi)定义的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。
91.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK；
ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK；
ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK；
AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK；
VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDAQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDAQAP；
AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAP；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAP；
AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；
AEAKFAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAP；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK；
AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAP；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK；
AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAP；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDSQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK；
AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSEAQAPK；
VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLESAQAPK；
VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSDSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLSDAQAPK；
VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSDSQAPK；
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；和
ADAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]为如项目1-23的任一项中定义的IL-17A结合基序。
92.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xiii)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]为如项目1-23的任一项中定义的IL-17A结合基序；和
xiv)与xiii)中定义的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。
93.根据项目92所述的IL-17A结合多肽，其中序列xiii)选自SEQ ID NO:1-1216。
94.根据项目93所述的IL-17A结合多肽，其中序列xiii)选自1-66、1200、1206和1214。
95.根据项目94所述的IL-17A结合多肽，其中序列xiii)选自SEQ ID NO:1-66。
96.根据项目95所述的IL-17A结合多肽，其中序列xiii)选自SEQ ID NO:1-35。
97.根据项目96所述的IL-17A结合多肽，其中序列xiii)选自SEQ ID NO:1-27。
98.根据项目97所述的IL-17A结合多肽，其中序列xiii)选自SEQ ID NO:1-10。
99.根据项目98所述的IL-17A结合多肽，其中序列xiii)选自SEQ ID NO:1-7。
100.根据项目99所述的IL-17A结合多肽，其中序列xiii)选自SEQ ID NO:1-4。
101.根据项目100所述的IL-17A结合多肽，其中序列xiii)为SEQ ID NO:1。
102.根据项目1-91中任一项所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xv)AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]为如项目1-23的任一项中定义的IL-17A结合基序；和
xvi)与xv)中定义的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。
103.根据项目102所述的IL-17A结合多肽，其中序列xv)选自SEQ ID NO:1217-1222。
104.根据项目103所述的IL-17A结合多肽，其中序列xv)选自SEQ ID NO:1218-1222。
105.根据项目104所述的IL-17A结合多肽，其中序列xv)选自SEQ ID NO:1219-1222。
106.根据项目105所述的IL-17A结合多肽，其中序列xv)选自SEQ ID NO:1219和SEQ ID NO:1222。
107.根据项目106所述的IL-17A结合多肽，其中序列xv)为SEQ ID NO:1219。
108.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽能够结合IL-17A，以使得相互作用的KD值为至多1x10-6M，诸如至多1x10-7M，诸如至多1x10-8M，诸如至多1x10-9M。
109.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽能够结合选自由人类IL-17A和鼠(murine)IL-17A组成的组的IL-17A分子。
110.根据项目109所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽能够结合人类IL-17A。
111.根据项目109所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽能够结合鼠IL-17A。
112.根据项目109-111中任一项所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽能够结合人类IL-17A和鼠IL-17A。
113.根据项目109、110和112中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中所述人类IL-17A包含氨基酸序列SEQ ID NO:1226或其抗原性有效片段。
114.根据项目109、111和112中任一项所述的IL-17A结合多肽，其中所述鼠IL-17A包含氨基酸序列SEQ ID NO:1227或其抗原性有效片段。
115.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽在C-末端和/或N-末端包含另外的氨基酸。
116.根据项目115所述的IL-17A结合多肽，其中所述另外的氨基酸改进和/或简化所述多肽的产生、纯化、体内或体外的稳定、偶联或检测。
117.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽呈多聚体形式，所述多聚体形式包含至少2个IL-17A结合多肽单体单元，所述单体单元的氨基酸序列可以是相同或不同的。
118.根据项目117所述的IL-17A结合多肽，其中所述IL-17A结合多肽单体单元被共价地偶联在一起。
119.根据项目118所述的IL-17A结合多肽，其中所述IL-17A结合多肽单体单元被表达为融合蛋白。
120.根据项目117-119中任一项所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽呈二聚体形式。
121.融合蛋白或缀合物，所述融合蛋白或缀合物包括：
-第一部分，所述第一部分由根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽组成；和
-第二部分，所述第二部分由具有期望的生物学活性的多肽组成。
122.根据项目121所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物学活性为治疗活性。
123.根据项目121所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物学活性为结合活性。
124.根据项目123所述的融合蛋白或缀合物，其中所述结合活性为白蛋白结合活性，所述白蛋白结合活性增加所述融合蛋白或缀合物的体内半衰期。
125.根据项目124所述的融合蛋白或缀合物，所述融合蛋白或缀合物包含两个IL-17A结合多肽，每一个如项目1-116的任一项中定义的，在所述两个IL-17A结合多肽之间具有白蛋白结合部分。
126.根据项目125所述的融合蛋白或缀合物，所述融合蛋白或缀合物能够结合IL-17A，以使得相互作用的KD值为至多1x10-10M，诸如至多1x10-11M，诸如至多1x10-12M，诸如至多1x10-13M。-
127.根据项目124-126中任一项所述的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分包含链球菌G蛋白的白蛋白结合结构域或其衍生物。
128.根据项目123所述的融合蛋白或缀合物，其中所述结合活性发挥抑制生物学活性的作用。
129.根据项目123所述的融合蛋白或缀合物，其中所述结合活性发挥刺激生物学活性的作用。
130.根据项目121所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物学活性为酶促活性。
131.根据项目122所述的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分为治疗活性多肽。
132.根据项目131所述的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分为免疫应答改变剂，例如抗炎剂。
133.根据项目121-122和130-132中任一项所述的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分选自由人类内源酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子和淋巴因子及其激动剂、拮抗剂及抑制剂组成的组。
134.根据项目131所述的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分为毒性化合物。
135.根据项目123所述的融合蛋白或缀合物，其中所述结合活性为对免疫应答相关因子，例如炎症相关因子的结合。
136.复合物，所述复合物包含至少一种根据项目1-117中任一项所述的IL-17A结合多肽或至少一种根据项目121-135中任一项所述的融合蛋白或缀合物、和至少一种抗体或其抗原结合片段。
137.根据项目136所述的复合物，其中所述至少一种抗体或其抗原结合片段选自全长抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fc片段、Fv片段、单链Fv片段、(scFv)2和结构域抗体组成的组。
138.根据项目137所述的复合物，其中所述至少一种抗体或其抗原结合片段选自由全长抗体、Fab片段和scFv片段组成的组。
139.根据项目138所述的复合物，其中所述至少一种抗体或其抗原结合片段为全长抗体。
140.根据项目136-139中任一项所述的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体或其抗原结合片段。
141.根据项目136-140中任一项所述的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由人类抗体、人源化抗体和嵌合抗体，及其抗原结合片段组成的组。
142.根据项目141所述的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段为人类抗体或人源化抗体，或其抗原结合片段。
143.根据项目136-142中任一项所述的复合物，其中所述抗体或其抗原结合片段对抗原具有亲和力，所述抗原诸如选自由与血管发生相关紊乱相关的抗原和与免疫应答相关的抗原或与免疫系统紊乱相关的抗原组成的组。
144.根据项目143所述的复合物，其中所述抗原与血管发生相关紊乱相关。
145.根据项目143所述的复合物，其中所述抗原与免疫应答或免疫系统紊乱相关，例如与炎症相关。
146.根据项目136-145中任一项所述的复合物，所述复合物为融合蛋白或缀合物。
147.根据项目136-146中任一项所述的复合物，其中所述IL-17A结合多肽被附接至所述抗体或其抗原结合片段的重链的N-末端或C-末端。
148.根据项目136-146中任一项所述的复合物，其中所述IL-17A结合多肽被附接至所述抗体或其抗原结合片段的轻链的N-末端或C-末端。
149.根据项目136-146中任一项所述的复合物，其中所述IL-17A结合多肽被附接至所述抗体或其抗原结合片段的轻链和重链的N-末端和/或C-末端。
150.根据项目146-149中任一项所述的复合物，所述复合物为融合蛋白。
151.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，所述IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物还包含例如选自由非肽接头、柔性的氨基酸接头、刚性的氨基酸接头和可裂解的氨基酸接头组成的组的至少一种接头。
152.根据项目151所述的融合蛋白或缀合物，其中所述接头被布置在所述第一部分和所述第二部分之间。
153.根据项目151所述的复合物，其中所述接头被布置在所述IL-17A结合多肽和所述抗体或其抗原结合片段之间。
154.根据项目151-153中任一项所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，其中所述接头为柔性的接头，所述柔性的接头包含选自由甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸组成的组的氨基酸残基。
155.根据项目154所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，其中所述接头包含具有选自以下通式的序列：
(GnSm)p和(SnGm)p，
其中，独立地，
n＝1-7，
m＝0-7，
n+m≤8且
p＝1-10。
156.根据项目155所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，其中n＝1-5。
157.根据项目155-156中任一项所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，其中m＝0-5。
158.根据项目155-157中任一项所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，其中p＝1-5。
159.根据项目156-158中任一项所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，其中n＝4，m＝1且p＝1-4。
160.根据项目159所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，其中所述接头包含选自由G4S、(G4S)2、(G4S)3和(G4S)4组成的组的序列。
161.根据项目160所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，其中所述接头包含序列G4S。
162.根据项目155-159中任一项所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，其中所述通式为GT(GnSm)p。
163.根据项目162所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，其中所述接头包含序列GTG4S。
164.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，所述IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物还包含标记物。
165.根据项目164所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，其中所述标记物选自由荧光染料和金属、发色团染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性核素和颗粒组成的组。
166.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，所述IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物包括由经由半胱氨酸残基的巯基基团或赖氨酸残基的胺基基团缀合至所述IL-17A结合多肽的聚氨基聚羧酸盐螯合剂提供的螯合环境。
167.根据任一项前述项目所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，所述IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物包含一个或更多个聚乙二醇部分。
168.多核苷酸，所述多核苷酸编码根据项目1-163中任一项所述的多肽。
169.包括根据项目168所述的多核苷酸的表达载体。
170.包括根据项目169所述的表达载体的宿主细胞。
171.制备根据项目1-163中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括
-在容许所述多肽由所述表达载体表达的条件下培养根据项目170所述的宿主细胞，和
-分离所述多肽。
172.组合物，所述组合物包含根据项目1-167中任一项所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
173.根据项目172所述的组合物，所述组合物还包含至少一种另外的活性剂，诸如选自由治疗活性多肽、免疫应答改变剂、抗炎剂和毒性化合物组成的组的剂。
174.根据项目1-167中任一项所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物或根据项目172-173中任一项所述的组合物，用于口服、局部、静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌内、鼻内、含服、舌下或栓剂施用，诸如用于口服施用或诸如用于局部施用。
175.根据项目1-167中任一项所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物或根据项目172-173中任一项所述的组合物，用于作为药物、诊断剂或预后剂使用。
176.根据项目175所述的用于使用的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物，其中所述多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物体内调控IL-17A功能。
177.根据项目175-176中任一项所述的用于使用的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物，其中所述多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物抑制IL-17A信号传导。
178.根据项目175-177中任一项所述的用于使用的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物，其中所述多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物阻断IL-17A对至少一种其同源受体的结合。
179.根据项目175-178中任一项所述的用于使用的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物，用于在IL-17A相关状况的治疗、诊断或预后中使用。
180.根据项目179所述的用于使用的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物，其中所述IL-17A相关状况选自由炎性疾病、自身免疫性疾病和癌症组成的组。
181.根据项目180所述的用于使用的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物，其中所述IL-17A相关状况选自由炎性疾病和自身免疫性疾病组成的组。
182.根据项目181所述的用于使用的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物，其中所述IL-17A相关状况选自由炎性状况、过敏性状况、超敏反应、自身免疫性疾病、严重感染和移植物排斥组成的组。
183.根据项目182所述的用于使用的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物，其中所述IL-17A相关状况选自由类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、银屑病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、葡萄膜炎和干眼病组成的组。
184.根据项目183所述的用于使用的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物，其中所述IL-17A相关状况为银屑病。
185.根据项目179所述的用于在预后中使用的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物，其中所述IL-17A相关状况为癌症，诸如选自由胃癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌和腺癌组成的组的癌症。
186.检测IL-17A的方法，所述方法包括：提供怀疑包含IL-17A的样品，使所述样品与根据项目1-167中任一项所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物或根据项目172-173中任一项所述的组合物接触，以及检测IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物的结合以指示所述样品中IL-17A的存在。
187.用于确定受试者中IL-17A的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
-使所述受试者、或从受试者分离的样品与根据项目1-167中任一项
所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物或根据项目
172-173中任一项所述的组合物接触，以及
-获得相应于已在所述受试者中结合或与所述样品结合的IL-17A结
合多肽、融合蛋白、缀合物、复合物或组合物的量的值。
188.根据项目187所述的方法，所述方法还包括将所述值与参考比较的步骤。
189.根据项目187或188所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物受试者，诸如人类受试者。
190.根据项目187-189中任一项所述的方法，所述方法在体内进行。
191.根据项目187-189中任一项所述的方法，所述方法在体外进行。
192.治疗IL-17A相关状况的方法，所述方法包括将有效量的根据项目1-167中任一项所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物或根据项目172-173中任一项所述的组合物施用至需要其的受试者。
193.根据项目192所述的方法，其中所述IL-17A相关状况选自由炎性疾病、自身免疫性疾病和癌症组成的组。
194.根据项目193所述的方法，其中所述IL-17A相关状况选自由炎性疾病和自身免疫性疾病组成的组。
195.根据项目194所述的方法，其中所述IL-17A相关状况选自由炎性状况、过敏性状况、超敏反应、自身免疫性疾病、严重感染和移植物排斥组成的组。
196.根据项目195所述的方法，其中所述IL-17A相关状况选自由类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、银屑病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、葡萄膜炎和干眼病组成的组。
197.根据项目196所述的方法，其中所述IL-17A相关状况为银屑病。

Claims (17)

1.IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含IL-17A结合基序BM，所述基序由选自以下的氨基酸序列组成：
i)EX2DX4AX6X7EIX10X11LPNL X16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29
其中，彼此独立地，
X2选自A、H、M和Y；
X4选自A、D、E、F、K、L、M、N、Q、R、S和Y；
X6选自A、Q和W；
X7选自F、I、L、M、V、W和Y；
X10选自A和W；
X11选自A、D、E、F、G、L、M、N、Q、S、T和Y；
X16选自N和T；
X17选自H、W和Y；
X18选自A、D、E、H和V；
X20选自A、G、Q、S和W；
X21选自A、D、E、F、H、K、N、R、T、V、W和Y；
X25选自A、D、E、G、H、I、L、M、N、Q、R、S、T和V；
X26选自K和S；
X28选自I、L、N和R；且
X29选自D和R；
和
ii)与在i)中定义的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列i)中，
X2选自A、H和M；
X4选自A、D、E、F、L、M、N、Q、R和Y；
X11选自A、D、E、F、G、L、M、N、S、T和Y；
X18选自A、D、E和V；
X20选自A、G、Q和W；
X21选自E、F、H、N、R、T、V、W和Y；
X25选自A、D、E、G、H、I、L、N、Q、R、S、T和V；且
X28选自I、N和R。
3.根据权利要求2所述的IL-17A结合多肽，其中，在序列i)中，
X16为T；
X17为W；
X21选自E、F、H、W、T和Y；
X25选自A、D、E、G、H、I、L、N、Q、R、S和T；
X26为K；且
X29为D。
4.根据任一项前述权利要求所述的IL-17A结合多肽，其中序列i)为选自由SEQ ID NO:1-1216组成的组的序列中从位置8至位置36的序列。
5.根据任一项前述权利要求所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列结合模块BMod：
iii)K-[BM]-DPSQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ；
其中
[BM]为如权利要求1-4的任一项中定义的IL-17A结合基序，条件是X29为D；
Xa选自A和S；
Xb选自N和E；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；
Xf选自A和S；和
iv)与由iii)定义的序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的IL-17A结合多肽，其中所述序列iii)为选自由SEQ ID NO:1-1216组成的组的序列中从位置7至位置55的序列。
7.根据任一项前述权利要求所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
vii)YA-[BMod]-AP；
其中[BMod]为如权利要求5-6的任一项中定义的IL-17A结合模块；和
viii)与由vii)定义的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。
8.根据任一项前述权利要求所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xiii)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]为如权利要求1-4的任一项中定义的IL-17A结合基序；和
xiv)与xiii)中定义的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的IL-17A结合多肽，其中序列xiii)选自SEQ ID NO:1-1216。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xv)AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；
其中[BM]为如权利要求1-4的任一项中定义的IL-17A结合基序；和
xvi)与xv)中定义的序列具有至少86％同一性的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的IL-17A结合多肽，其中序列xv)选自SEQ ID NO:1217-1222。
12.根据任一项前述权利要求所述的IL-17A结合多肽，所述IL-17A结合多肽能够结合IL-17A，以使得相互作用的KD值为至多1x 10-6M，诸如至多1x 10-7M，诸如至多1x 10-8M，诸如至多1x 10-9M。
13.融合蛋白或缀合物，所述融合蛋白或缀合物包括：
-第一部分，所述第一部分由根据任一项前述权利要求所述的IL-17A结合多肽组成；和
-第二部分，所述第二部分由具有期望的生物学活性的多肽组成。
14.复合物，所述复合物包含至少一种根据权利要求1-12中任一项所述的IL-17A结合多肽或至少一种根据权利要求13所述的融合蛋白或缀合物、和至少一种抗体或其抗原结合片段。
15.多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1-14中任一项所述的多肽。
16.组合物，所述组合物包含根据权利要求1-14中任一项所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
17.根据权利要求1-14中任一项所述的IL-17A结合多肽、融合蛋白、缀合物或复合物或根据权利要求16所述的组合物，用于作为药物、诊断剂或预后剂使用。
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