CN117843782A - 靶向人lilrb4的纳米抗体及其应用 - Google Patents
靶向人lilrb4的纳米抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117843782A CN117843782A CN202310444155.3A CN202310444155A CN117843782A CN 117843782 A CN117843782 A CN 117843782A CN 202310444155 A CN202310444155 A CN 202310444155A CN 117843782 A CN117843782 A CN 117843782A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- nanobody
- antibody
- lilrb4
- variant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 101100128416 Homo sapiens LILRB4 gene Proteins 0.000 title claims description 14
- 102000056823 human LILRB4 Human genes 0.000 title claims description 14
- 101000984186 Homo sapiens Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 4 Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 102100025578 Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 4 Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 47
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 36
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 32
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 27
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 14
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 19
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 18
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 18
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 8
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 6
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 4
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 description 3
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 101000984190 Homo sapiens Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000984189 Homo sapiens Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000984185 Homo sapiens Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 5 Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 229940124532 absorption promoter Drugs 0.000 description 2
- -1 absorption promoters Substances 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000054957 human LILRB1 Human genes 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 206010000890 Acute myelomonocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 102100021723 Arginase-1 Human genes 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 101000752037 Homo sapiens Arginase-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000990034 Homo sapiens CMRF35-like molecule 6 Proteins 0.000 description 1
- 101100128414 Homo sapiens LILRB3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000984192 Homo sapiens Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000800287 Homo sapiens Tubulointerstitial nephritis antigen-like Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100025583 Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100025582 Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100025577 Leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 5 Human genes 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 210000004322 M2 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000033835 Myelomonocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000008900 Pancreatic Ductal Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 230000017274 T cell anergy Effects 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100033019 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 Human genes 0.000 description 1
- 101710116241 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 208000011912 acute myelomonocytic leukemia M4 Diseases 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 206010005084 bladder transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000000453 cell autonomous effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000047462 human LILRB2 Human genes 0.000 description 1
- 102000053567 human LILRB3 Human genes 0.000 description 1
- 102000056813 human LILRB5 Human genes 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006371 metabolic abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000008129 pancreatic ductal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 102000009816 urokinase plasminogen activator receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040001269 urokinase plasminogen activator receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Abstract
本发明公开了一种靶向LILRB4的纳米抗体、编码所述纳米抗体的核酸、包含所述核酸的表达载体、包含所述纳米抗体的药物组合物、以及制备药物的用途。
Description
技术领域
本发明属于抗体工程领域,具体涉及一种用于诊断或治疗肿瘤的治疗性单域抗体,特别是涉及一种靶向LILRB4的纳米抗体、其衍生蛋白以及用于制备药物的用途。
背景技术
纳米抗体是目前最小的抗体分子,最初由比利时科学家Hamers在骆驼血液中发现,它是工程化抗体产品中备受关注的一类。纳米抗体主要优点:一是体积是普通抗体的1/10,因为体积小,其在动物组织体内的穿透力强,如,可以通过人体的脑组织,可以达到高密度的肿瘤内部,而普通抗体却不能,这使得可以通过纳米抗体来治疗某些肿瘤或脑部疾病;二是抗原特异性好;三是易于基因改造,方便人工改造以获得对抗不同病原的抗体;四是稳定性高,如,纳米抗体在体内不被自然分解的时间比普通抗体长(意味着药效时间更持久),纳米抗体甚至能从人胃中通过而保持有效性。
LILRB4(又被称作ILT3,LIR5,CD85K)是白细胞免疫球蛋白样受体(LILRs/LIRs)的成员,是一种在抗原呈递细胞(APC)上发现的免疫调节性跨膜蛋白。LILRB4抑制APC活化并通过T抑制细胞诱导免疫耐受性。它已被证明通过诱导T细胞无反应性和CD8+T抑制细胞的分化来调节免疫反应,并且可能对癌症建立免疫耐受发挥作用。其主要在耐受性树突细胞(DC)、骨髓源性抑制细胞和M2巨噬细胞中表达,少量表达在浆细胞表面,并不在造血前体细胞或者干细胞表面表达。LILRB4是单核细胞急性髓系白血病(monocytic AML)的标志分子,其在monocytic AML细胞表面的高度表达。
目前有2款靶向LILRB4的抗体药物处于临床研究阶段,由NGMBiopharmaceuticals开发的NGM831目前处于临床一期,适应症为胰腺癌、乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、子宫颈癌、宫颈内癌、头颈部鳞状细胞癌、膀胱尿路上皮癌、结直肠癌、食道癌、卵巢癌、肾细胞癌、前列腺癌、黑色素瘤、间皮瘤、胆管癌等;Immune-Onc Therapeutics开发的IO-202目前处于临床一期,适应症为急性骨髓性白血病、骨髓单核细胞白血病等。
发明内容
现有技术中的ScFv、Fab或全IgG类抗LILRB4抗体分子,结构复杂、分子较大,虽然能将活性分子连接到LILRB4上,但影响活性分子的功能、方法复杂、负载效率也较低;纳米抗体分子较小、易于操作,但人源化程度低、亲和力不高,延长半衰期的性能有待进一步提高。
针对上述现有技术的不足,本发明提供一系列抗人LILRB4纳米抗体序列及制备方案。提供的抗LILRB4纳米抗体能高亲和力结合人LILRB4,并在细胞学模型上可以明确观察到对T细胞的激活作用,从而对肿瘤具有潜在的治疗价值。
第一方面,本发明提供一种靶向LILRB4的纳米抗体,根据本发明的实施例,所述纳米抗体能够特异性结合LILRB4,且所述纳米抗体中的VHH链的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种:
(1)SEQ ID NO:10所示的CDR1,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;SEQ IDNO:11所示的CDR2,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;和SEQ ID NO:12所示的CDR3,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;
(2)SEQ ID NO:13所示的CDR1,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;SEQ IDNO:14所示的CDR2,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;和SEQ ID NO:15所示的CDR3,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;
(3)SEQ ID NO:16所示的CDR1,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;SEQ IDNO:17所示的CDR2,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;和SEQ ID NO:18所示的CDR3,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体。
进一步,在本发明的一些实施方案中,上述纳米抗体中的VHH链的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种:
(1)SEQ ID NO:10所示的CDR1,SEQ ID NO:11所示的CDR2,和SEQ ID NO:12所示的CDR3;
(2)SEQ ID NO:13所示的CDR1,SEQ ID NO:14所示的CDR2,和SEQ IDNO:15所示的CDR3;
(3)SEQ ID NO:16所示的CDR1,SEQ ID NO:17所示的CDR2,和SEQ ID NO:18所示的CDR3;
(4)SEQ ID NO:13所示的CDR1,SEQ ID NO:19所示的CDR2,和SEQ ID NO:20所示的CDR3;
(5)SEQ ID NO:16所示的CDR1,SEQ ID NO:21所示的CDR2,和SEQ ID NO:18所示的CDR3。
进一步,在本发明的一些实施方案中,上述纳米抗体是人源化的VHH或骆驼源化的VH。
进一步,在本发明的一些实施方案中,上述纳米抗体具有如SEQ ID NO:3、4、5、7、8、9任一项所示的氨基酸序列。
第二方面,本发明提供一种融合蛋白,根据本发明的实施例,其包括能够特异性结合LILRB4的功能结构域,所述功能结构域由上述任一项所述的抗LILRB4的纳米抗体构成。
本发明提供的纳米抗体可以与其他的任意蛋白或物质融合,以实现不同的目的,例如与荧光蛋白、酶或放射性元等结合以实现易于检测的目的,再如与治疗LILRB4介导相关疾病的药物分子融合以实现更佳的治疗目的。与该纳米抗体融合的蛋白类型,本领域技术人员可以根据实际需要或目的合理选择,无论融合何种类型的物质融合,其也在本发明的范围内。
第三方面,本发明提供一种抗LILRB4的抗体,根据本发明的实施例,所述抗体为传统抗体或其功能性片段,所述抗体的重链可变区由前述任一项所述的抗LILRB4的纳米抗体构成;
进一步,上述功能性片段为所述传统抗体的Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv或sdFv结构。
传统抗体在结构上由两条相同的重链和两条相同的轻链组成,轻链具有轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL);重链具有重链可变区(VH)和重链恒定区(CH1,CH2,CH3和/或CH4)。在本发明公开了具有能够特异性结合LILRB4的纳米抗体的结构前提下,本领域技术人员容易想到利用本发明的纳米抗体对传统抗体以改造,例如将本发明纳米抗体的CDR区结构应用到传统抗体上,以获得可以特异性结合LILRB4的传统抗体,这类传统体也是属于本发明的保护范围;进一步地,基于传统抗体的结构,其部分结构例如Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv或sdFv结构等也是具有LILRB4结合特异性的,这也是属于本发明的保护范围。
第四方面,本发明提供了一种治疗疾病的组合物,其包括如上任一项所述的抗LILRB4的纳米抗体、如上所述的融合蛋白或如上所述的抗体,以及药学上可接受的辅料。
上述药学上可接受的辅料是指药学领域的药用辅料,例如:稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、崩解剂、吸附载体、润滑剂等。另外还可以加入其他辅料如香味剂、甜味剂等。即所述的辅料为稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、崩解剂、吸附载体、润滑剂、香味剂、甜味剂中的一种或两种以上。
本发明所提供的药物的剂型并没有严格的限制,可根据药剂领域的现有方法制备成各种剂型,通过口服、鼻吸、直肠、肠胃外或经皮给药等方式施用于需要治疗的患者。
第五方面,本发明提供一种分离的核酸分子,其编码如上任一项所述的单域抗体。
基于本发明公开的内容,本领域技术人员通过本领域常规技术容易获得编码上述纳米抗体以及融合蛋白的多核苷酸分子,并基于密码子的简并性,该多核酸分子是多变的,其具体的碱基序列存在多种可能性,基于此,无论其多核酸分子如何变化,只要其能够编码本发明的单域抗体或融合蛋白即属于本发明的保护范围。
第六方面,本发明提供含有如上所述的核酸分子的载体。
第七方面,本发明提供含有如上所述的载体的重组细胞。
第八方面,本发明提供制备如上任一项所述的纳米抗体的方法,其包括:培养如上所述的重组细胞,从培养产物中分离纯化获得所述纳米抗体。
需要说明的是,制备本发明的纳米抗体、融合蛋白和抗体可以通过化学合成的方法,也可以是通过基因工程技术实现,或者是其他的方法,无论以何种方法制备本发明前述的纳米抗体、融合蛋白或抗体,其都是属于本发明的保护范围。
第九方面,本发明提供一种激活T细胞的方法,包括使T细胞与如上任一项所述的抗LILRB4纳米抗体、如上所述的融合蛋白、如上所述的抗体、如上所述的组合物、如上所述的核酸分子、如上所述的载体、或如上所述的重组细胞接触。
任选地,所述接触包括在癌细胞存在下。
LILRB4在单核细胞、巨噬细胞和树突细胞上表达,可以以细胞自主的方式抑制先天免疫,并通过间接机制抑制T细胞活化。LILRB4是单核细胞性急性髓细胞白血病(AML)的特异性标记,包括难治性和复发性疾病。已表明LILRB4支持肿瘤细胞浸润到组织中,并通过涉及AML细胞中APOE、LILRB4、SHP-2、uPAR和ARG1的信号通路抑制T细胞活性(Deng M.etah,Nature(2018)562:605-09)。
第十方面,提供了本发明如上任一项所述的抗LILRB4纳米抗体、如上所述的融合蛋白、如上所述的抗体、如上所述的组合物、如上所述的核酸分子、如上所述的载体、或如上所述的重组细胞的用途,用于制备由人LILRB4蛋白介导的相关疾病的药物中的用途。
本发明的抗体可以用于治疗以LILRB4为靶点中和LILRB4进而实现治疗疾病的效果,该类疾病包括但不限于肿瘤。所述肿瘤为实体瘤或血液瘤,所述实体瘤为肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、黑素瘤、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胶质瘤、胃癌、肾癌、睾丸癌、食管癌、宫颈癌、鳞茎肺癌、甲状腺癌、肝癌、尿路上癌症或头颈部癌症;所述血液瘤为慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病。
为更好理解本发明,首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
一般,抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述,称为可变区域(CDR),将该段间隔成4个框架区域(FR),4个FR的氨基酸序列相对比较保守,不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构,通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近,重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明不仅包括完整的抗体,还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此,本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源于两个或更多个物种的抗体。通常,轻链与重链两者的可变区均对应于抗体的源于一个哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和力和能力的可变区,而恒定区与抗体中源于另一物种(通常是人)的序列同源以避免在那个物种中引发免疫应答。
“纳米抗体”通常如在WO 2008/020079或WO 2009/138519中所定义,且因而在一个具体的方面通常表示VHH、人源化的VHH或骆驼源化的VH(诸如骆驼源化的人VH),或通常表示序列优化的VHH(例如为了化学稳定性和/或溶解度、与已知人框架区的最大重叠和最大表达而优化)。“纳米抗体”用基因工程方法获得,主要有3类,第一类是从骆驼科动物HCAb获得的重链可变区,为单一的折叠单元,保留了完整的抗原结合活性,是最小的天然抗体片段。第二类是从鲨鱼等软骨鱼IgNAR获得的重链可变区,用VNAR表示。第三类是从人源或鼠源单抗获得的重链或轻链可变区,保留了抗原结合活性,但亲和性和可溶性大为下降。
“Fc区”或“Fc”是指免疫球蛋白重链的C端区,其含有铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域,其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合,包括与位于免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)上的Fc受体结合或与经典补体系统的第一组分(例如C1q)结合,包括天然序列Fc区和变异Fc区。通常,人IgG重链Fc区为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段,但其边界可能有变化。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447,依照EU编号系统)可以存在或可以不存在。Fc还可以指隔离的这一区域,或在包含Fc的蛋白多肽的情况下,例如“包含Fc区的结合蛋白”,还称为“Fc融合蛋白”(例如,抗体或免疫粘合素)。本发明的抗体中天然序列Fc区包括人IgG1,IgG2(IgG2A,IgG2B),IgG3和IgG4。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中,Fc区包含抗体的两条重链的每一条的CH2和CH3恒定结构域;IgM和IgEFc区包含在每条多肽链中的三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。
“特异性结合”是指,两分子间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。术语“免疫结合”是指发生在抗体分子和抗原(对于该抗原而言抗体为特异性的)之间的特异性结合反应。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的平衡解离常数(KD)表示,其中KD值越小,表示亲和力越高。两分子间的的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法定量。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。指特定抗体-抗原相互作用的“结合速率常数”(Ka或Kon)和“解离速率常数”(Kd或Koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出,可用任何有效的方法测量KD、Ka和Kd值。在优选的实施方案中,用生物发光干涉测量法来测量解离常数。在其它优选的实施方案中,可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或KinExa来测量解离常数。
“载体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”,其是指其中可以连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体,其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制起点和游离型哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中,并由此与宿主基因组一起复制。此外,某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。
“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的,并且可以是cDNA。
本发明取得了以下有益的技术效果:
本发明的抗LILRB4纳米抗体能高亲和力结合人LILRB4,并在细胞学模型上可以明确观察到对T细胞的激活作用,从而对肿瘤具有潜在的治疗价值。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述,各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的,而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中,用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中:
图1:FACS检测抗人LILRB4嵌合抗体在RPMI-8226细胞上的结合活性
图2:FACS检测抗人LILRB4人源化抗体在RPMI-8226细胞上的结合活性
图3:ELISA检测抗人LILRB4人源化抗体与人LILRB4重组蛋白的结合
图4:ELISA检测抗人LILRB4人源化抗体与人LILRB1重组蛋白的结合
图5:ELISA检测抗人LILRB4人源化抗体与人LILRB2重组蛋白的结合
图6:ELISA检测抗人LILRB4人源化抗体与人LILRB3重组蛋白的结合
图7:ELISA检测抗人LILRB4人源化抗体与人LILRB5重组蛋白的结合
图8:hz3A6人源化抗体药代动力学曲线图
图9:hz3B3人源化抗体药代动力学曲线图
图10:hz3E2人源化抗体药代动力学曲线图
图11:hz3A6人源化抗体对T细胞的激活曲线图
图12:hz3B3人源化抗体对T细胞的激活曲线图
图13:hz3E2人源化抗体对T细胞的激活曲线图
图14:对照抗体128对T细胞的激活曲线图
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式,然而应当理解,可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反,提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开,并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1:骆驼纳米抗体免疫噬菌体库构建
利用抗原免疫骆驼,分离外周血单核细胞(PBMC)并提取总RNA进行反转录,以反转录产物为模板扩增纳米抗体重链可变区(variable domain of the heavy-chain ofheavy chain antibody,VHH)并连入噬菌体展示载体,电转入大肠杆菌TG1感受态细胞,构建骆驼免疫库。
具体地,骆驼免疫两周一次,共4次。每次注射0.8mg人LILRB4胞外区重组蛋白,佐以弗氏完全/不完全佐剂(Sigma,F5881,F5506),采取皮下多点注射的方式。每次免疫后2周采集1mL血分离血清,用免疫原作为测定抗原,通过ELISA法分别测定血清中全抗体(IgG)和重链抗体(heavy chain antibody,HcAb)的滴度。当血清滴度达到建库要求后,采集100mL骆驼外周血并用分离试剂盒(天津灏洋,Cat:TBD2011CM)分离PBMC,提取PBMC的总RNA反转获得cDNA,作为后续扩增VHH片段的模板。根据相关文献和数据库中检索到驼源VHH抗体的基因,设计并合成VHH抗体库构建引物,PCR扩增出抗体可变区基因序列。随后利用核酸内切酶对载体和扩增的抗体片段进行酶切。采用T4连接酶的连接方式构建连接产物,利用电转染技术将连接产物转入到TG1菌种之中。最终构建了一个1.8×108骆驼抗人LILRB4 VHH抗体免疫库,用于特异性抗人LILRB4纳米抗体的筛选。为检测文库的正确率,随机选取50个克隆进行菌落PCR,结果显示插入率达到90%。
利用Biotinylated-LILRB4-ECD-his(Acro,Cat.LI4-H82E4)作为抗原对所构建的骆驼免疫库进行液相筛选,获得特异性噬菌体展示纳米抗体。通过原始库呈现及筛选和鉴定获得了3株可同时结合人LILRB4的重组蛋白的噬菌体展示的纳米抗体:3A6、3B3和3E2。
实施例2:抗人LILRB4纳米抗体及对照抗体的制备
同靶点对照抗体128(序列来源:WO2019094360,SEQ NO.7和SEQ NO.9)进行可变区基因合成,其轻、重链可变区序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。将轻重链序列分别克隆至含有human kappa/IgG1轻重链恒定区的真核瞬时表达载体中,获得对照抗体轻链和重链表达质粒,转入大肠杆菌扩增,分离获得大量含对照抗体轻链和重链的质粒,提取质粒并进行乙醇沉淀,并根据转染试剂293fectin(Cat:12347019,Gibco)的操作说明,分别将对照抗体的轻、重链质粒转入HEK293细胞中重组表达。细胞转染后5-6天,取培养上清,利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化,获得对照抗体。
根据噬菌体展示的纳米抗体测序结果,设计引物,将3A6、3B3及3E2通过PCR方法克隆至含有人Fc(hFc)编码基因的真核瞬时表达载体中,并在HEK293细胞中重组表达。细胞转染5-6天后,取培养上清,利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化,获得ch3A6、ch3B3和ch3E2重组蛋白。ch3A6可变区序列见SEQ ID NO.3,ch3B3可变区序列见SEQ ID NO.4和ch3E2可变区序列见SEQ ID NO.5,恒定区序列见SEQ ID NO.6。
SEQ.ID NO.1:128重链可变区氨基酸序列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDFSNHYYIYWVRQAPGKGLEWIGCIFSGDSASTYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGMSTNDWASDLWGQGTLVTVSS
SEQ.ID NO.2:128轻链可变区氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASESINSIYLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYDWGDVENTFGGGTKVEIK
SEQ.ID NO.3:ch3A6 VHH氨基酸序列
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAGSGYSYSSFCMGWFRQAPGHEREGVATIAAGGDRTYYADSVKGRFTISQDNANNTMYLQMNSLKPEDTAMYYCALRAWGSCGASPLSGQYYAYWGRGTQVTVSS
ch3A6抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:10、11和12,用下划线标出(根据Kabat CDR的定义)。
SEQ.ID NO.4:ch3B3 VHH氨基酸序列
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFTFSGFCMGWFRQAPGKEREGVASIASGGDRTYYADSVKGRFTISQDNAKNTMYLQMNSLKPEDTAMYYCASRAWESCGNSPLSGQYYAYWGRGTQVTVSSAS
ch3B3抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:13、14和15,用下划线标出(根据Kabat CDR的定义)。
SEQ.ID NO.5:ch3E2 VHH氨基酸序列
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASEYILGSCNVGWYRQAPGNEREWVSTIRGDGTTDYTDSVKGRFTISQDNAKNSVYLQMTSLKPEDTAMYYCSTGGSTPSTGPLCVSGWGQGTQVTVSSAS
ch3E2抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:16、17和18,用下划线标出(根据Kabat CDR的定义)。
SEQ.ID NO.6:hFc恒定区氨基酸序列
ASEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
实施例3:嵌合抗体亲和力检测
利用Fortebio公司的Octet QKe system仪器,采用抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针捕获抗体Fc段的方法测定抗体亲和力。测定时将ch3A6、ch3B3和ch3E2嵌合抗体及对照抗体128,用PBS缓冲液稀释至4ug/ml,流经AHC探针(Cat:18-0015,PALL)表面,时间为120s。LILRB4重组蛋白(购于义翘,Cat.16742-H08H)60nm;作为流动相,结合时间为300s,解离时间为300s。实验完毕,扣除空白对照响应值,用软件进行1:1Langmuir结合模式拟合,计算抗原抗体结合的动力学常数。
动力学参数如下表1所示,结果表明这三株克隆均与LILRB4重组蛋白结合,亲和力优于或相当于对照抗体128。
表1.嵌合抗体与人LILRB4重组蛋白的亲和力测定结果
实施例4:FACS检测抗LILRB4嵌合抗体在RPMI-8226细胞上的结合活性
取2E5个RPMI-8226(南京科佰,Cat.:CBP60244)细胞分别与不同浓度的抗LILRB4嵌合抗体结合,ch3A6、ch3B3和ch3E2嵌合抗体从125nM开始3倍梯度稀释9个梯度。4℃避光孵育60min,充分PBS洗涤后,加入1:200稀释的FITC标记的羊抗人抗体(sigma,F9512),4℃避光孵育30min后充分PBS洗涤,重悬于200ul的PBS中,流式细胞仪检测。
结果显示见图1和表2的EC50值,ch3A6、ch3B3和ch3E2可以剂量依赖的结合人LILRB4阳性细胞RPMI-8226细胞结合。
表2.FACS检测抗人LILRB4嵌合抗体在RPMI-8226细胞上的EC50值
ch3A6 | ch3B3 | ch3E2 | |
EC50(nM) | 0.983 | 0.809 | 0.693 |
实施例5:抗人LILRB4纳米抗体的人源化及重组表达分析
首先对驼源抗体VHH序列进行综合分析,确定抗体与抗原结合的抗原互补决定簇(CDR)区域及支撑抗体保守三维构象的框架区(framework)。随后根据同源性比对结果,选择最近似人源抗体template为基础模板,结合全序列blast结果,进行CDR移植,实现了ch3A6、ch3B3和ch3E2可变区(VHH)在Framework区的人源化,同时为去除CDR区的翻译后修饰(PTM)风险,对CDR区进行突变设计。hz3A6人源化后氨基酸序列见序列7;hz3B3人源化后氨基酸序列见序列8;hz3E2人源化后氨基酸序列见序列9。将人源化设计的hz3A6、hz3B3和hz3E2可变区序列进行全合成,克隆至含有人Fc(hFc)编码基因的真核表达载体上。获得序列正确的表达质粒后,转入HEK293细胞中重组表达,细胞转染5-6天后,取培养上清,利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化,获得的人源化抗体重组蛋白。
SEQ.ID NO.7:hz3A6氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSYSSFCMGWFRQAPGKEREGVATIAAGGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCALRAWGSCGASPLSGQYYAYWGQGTLVTVSS
Hz3A6抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:10、11和12,用下划线标出(根据Kabat CDR的定义)。
SEQ.ID NO.8:hz3B3氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGFCMGWFRQAPGKEREGVASIASGGDRTYYADAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASRAWESCGSSPLSGQYYAYWGQGTLVTVSS
Hz3B3抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:13、19和20,用下划线标出(根据Kabat CDR的定义)。
SEQ.ID NO.9:hz3E2氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYILGSCNVGWYRQAPGKEREWVSTIRGEGTTDYTDAVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSTGGSTPSTGPLCVSGWGQGTLVTVSS
Hz3E2抗原互补决定区CDRs 1、2和3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:16、21和18,用下划线标出(根据Kabat CDR的定义)。
实施例6:人源化LILRB4抗体亲和力检测
利用Fortebio公司的Octet QKe system仪器,采用抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针捕获抗体Fc段的方法测定抗体亲和力。测定时将嵌合抗体及其对应的人源化抗体,对照抗体128,用PBS缓冲液稀释至4ug/ml,流经AHC探针(Cat:18-0015,PALL)表面,时间为120s。LILRB4重组蛋白(购于义翘,Cat.16742-H08H)100nm;作为流动相,结合时间为300s,解离时间为300s。实验完毕,扣除空白对照响应值,用软件进行1:1Langmuir结合模式拟合,计算抗原抗体结合的动力学常数。
动力学参数如下表3所示,结果表明人源化后抗体与嵌合抗体亲和力基本保持一致。
表3.人源化抗体与人LILRB4重组蛋白的亲和力测定结果
实施例7:FACS检测抗LILRB4人源化抗体在RPMI-8226细胞上的结合活性
取2E5个RPMI-8226(南京科佰,Cat.:CBP60244)细胞分别与不同浓度的抗LILRB4人源化抗体结合,hz3A6、hz3B3和hz3E2人源化抗体从200nM开始3倍梯度稀释12个梯度。4℃避光孵育60min,充分PBS洗涤后,加入1:200稀释的FITC标记的羊抗人抗体(sigma,F9512),4℃避光孵育30min后充分PBS洗涤,重悬于200ul的PBS中,流式细胞仪检测。
结果显示见图2和表4的EC50值,hz3A6、hz3B3和hz3E2可以剂量依赖的结合人LILRB4阳性细胞RPMI-8226细胞结合,结合活性与对照抗体128相近。
表4.FACS检测抗人LILRB4人源化抗体在RPMI-8226细胞上的EC50值
hz3A6 | hz3B3 | hz3E2 | 128 | |
EC50(nM) | 0.463 | 0.389 | 0.318 | 0.243 |
实施例8:ELISA检测抗LILRB4人源化抗体同家族交叉活性
将人LILRB1(购于义翘,Cat.16014-H08H)、LILRB2(购于义翘,Cat.14132-H08H)、LILRB3(购于义翘,Cat.11978-H08H)、LILRB4(购于义翘,Cat.16742-H08H)、LILRB5(购于义翘,Cat.17221-H08H)重组蛋白,4℃包被过夜,包被浓度5ug/mL;PBS洗板3次后,加入5%BSA PBS,37℃封闭60min,PBST洗板3次;加入不同稀释倍数的hz3A6、hz3B3和hz3E2人源化抗体和对照抗体128(起始浓度为125nm,3倍梯度依次稀释5个浓度),37℃孵育60min,PBST洗板4次;加入1:5000稀释的HRP-anti-human Fc(Cat:109-035-098,Jackson ImmunoResearch),37℃孵育45min,PBST洗板4次;加入TMB底物显色,37℃孵育10min后,加入2MHCl终止反应;以630nm为参比波长,读取并记录波长450nm下孔板的吸光度A450nm-630nm。
实验结果表明hz3A6、hz3B3和hz3E2人源化抗体和对照抗体128均可以特异性的与人LILRB4重组蛋白结合(图3),而与同家族其他重组蛋白无结合(图4、图5、图6、图7)。
实施例9:抗人LILRB4人源化抗体在小鼠体内的药代动力学研究
选择雌性6周龄Balb/c小鼠(斯贝福)腹腔注射hz3A6、hz3B3和hz3E2人源化抗体,4只/组,500ug/只。分别于给药后2h、4h、8h、24h、48h、79h、120h、151h、192h断尾采血,收集血清并于-20℃保存。使用LILRB4(购于义翘,Cat.16742-H08H)重组蛋白检测血清中抗体含量。
检测结果如表5和图8-10所示,三株纳米抗体在小鼠体内均无明显代谢异常。
表5.抗人LILRB4人源化抗体PK血清检测
组别 | T1/2(小时) |
hz3A6(n=4) | 74±11 |
hz3B3(n=4) | 60±8 |
hz3E2(n=4) | 69±16 |
实施例10:LILRB4细胞模型评价抗人LILRB4人源化抗体对T细胞的激活作用
取对数生长的APOE/TCR Activator/CHO细胞,胰酶消化后1000转离心5分钟去除上清,重悬于新鲜的含10%FBS的F12K培养基中,将重悬的细胞密度调整为4×105/ml。将重悬的细胞接种到白壁透明底的96孔细胞培养板中,100ul/孔细胞悬液,37℃5%CO2培养箱培养过夜。第二天将接种APOE/TCR Activator/CHO细胞的96孔板内F12K+10%FBS培养基吸干,并用150ul/孔的DPBS润洗孔板一次,吸去DPBS,然后用含0.5% BSA的RPMI1640培养基对hz3A6、hz3B3和hz3E2人源化抗体以及对照抗体128进行梯度稀释(起始浓度为256nM,4倍梯度依次稀释11个浓度),加入梯度稀释的2*浓度样品(50ul/孔)到接种好细胞的96孔板中,并另外设置不加抗体的培养基对照孔。取对数期生长的LILRB4 Effector Reporter细胞,细胞离心弃上清,用DPBS洗细胞一次,离心去除DPBS,然后将细胞重悬于新鲜的含0.5%BSA的RPMI1640培养基中,将重悬的细胞密度调整为8×105/ml,然后将细胞加入上述含有抗体的96孔板中,每孔50ul,放置37度培养箱中继续培养5到6小时。将96孔板从培养箱中取出,加入100ul/孔Bright-GloTM萤光素酶检测试剂放置3分钟,放入酶标仪中读取数值。根据每个梯度浓度孔对应的读值,利用Prism Graphpad软件拟合样品对细胞激活的梯度曲线,并且计算样品的半数有效结合浓度(EC50)。
激活梯度曲线如图11-14所示,对应的EC50如表6所示,hz3A6、hz3B3对T细胞的激活效应与对照抗体128近似,hz3E2对T细胞的激活效应稍弱于对照抗体128。
表6.抗人LILRB4人源化抗体对T细胞激活的EC50值
hz3A6 | hz3B3 | hz3E2 | 128 | |
EC50(nM) | 0.18 | 0.21 | 1.04 | 0.34 |
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种靶向LILRB4的纳米抗体,其特征在于,所述纳米抗体能够特异性结合LILRB4,且所述纳米抗体中的VHH链的互补决定区CDR为选自下组的一种或多种:
(1)SEQ ID NO:10所示的CDR1,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;SEQ ID NO:11所示的CDR2,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;和SEQ ID NO:12所示的CDR3,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;
(2)SEQ ID NO:13所示的CDR1,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;SEQ ID NO:14所示的CDR2,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;和SEQ ID NO:15所示的CDR3,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;
(3)SEQ ID NO:16所示的CDR1,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;SEQ ID NO:17所示的CDR2,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体;和SEQ ID NO:18所示的CDR3,或其至多3个氨基酸缺失或取代的变体。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体,其特征在于,所述互补决定区CDR为选自下组的一种或多种:
(1)SEQ ID NO:10所示的CDR1,SEQ ID NO:11所示的CDR2,和SEQ ID NO:12所示的CDR3;
(2)SEQ ID NO:13所示的CDR1,SEQ ID NO:14所示的CDR2,和SEQ ID NO:15所示的CDR3;
(3)SEQ ID NO:16所示的CDR1,SEQ ID NO:17所示的CDR2,和SEQ ID NO:18所示的CDR3;
(4)SEQ ID NO:13所示的CDR1,SEQ ID NO:19所示的CDR2,和SEQ ID NO:20所示的CDR3;
(5)SEQ ID NO:16所示的CDR1,SEQ ID NO:21所示的CDR2,和SEQ ID NO:18所示的CDR3。
3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体,其特征在于,所述纳米抗体是人源化的VHH或骆驼源化的VH。
4.根据权利要求1-3任一项所述的纳米抗体,其特征在于,所述纳米抗体具有如SEQ IDNO:3、4、5、7、8、9任一项所示的氨基酸序列。
5.一种融合蛋白,其特征在于,其包括能够特异性结合LILRB4的功能结构域,所述功能结构域由权利要求1-4任一项所述的抗LILRB4的纳米抗体构成。
6.一种抗LILRB4的抗体,其特征在于,所述抗体为传统抗体或其功能性片段,所述抗体的重链可变区由权利要求1-4任一项所述的抗LILRB4的纳米抗体构成;
任选地,所述功能性片段为所述传统抗体的Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv或sdFv结构。
7.一种药物组合物,其特征在于,其包括权利要求1-4任一项所述的抗LILRB4的纳米抗体、权利要求5所述的融合蛋白或权利要求6所述的抗体,以及药学上可接受的辅料。
8.一种分离的核酸分子,其特征在于,其编码权利要求1-4任一项所述的抗LILRB4纳米抗体、编码权利要求5所述的融合蛋白、或编码权利要求6所述的抗体。
9.一种表达载体,其特征在于,所述表达载体含有权利要求8所述的核酸分子。
10.一种重组细胞,其特征在于,所述重组细胞含有权利要求9所述的表达载体。
11.制备权利要求1-4任一项所述的纳米抗体的方法,其特征在于,其包括:培养权利要求10所述的重组细胞,从培养产物中分离纯化获得所述纳米抗体。
12.一种激活T细胞的方法,包括使T细胞与权利要求1-4任一项所述的抗LILRB4纳米抗体、权利要求5所述的融合蛋白、权利要求6所述的抗体、权利要求7所述的组合物、权利要求8所述的核酸分子、权利要求9所述的载体、或权利要求10所述的重组细胞接触。
任选地,所述接触包括在癌细胞存在下。
13.权利要求1-4任一项所述的抗LILRB4纳米抗体、权利要求5所述的融合蛋白、权利要求6所述的抗体、权利要求7所述的组合物、权利要求8所述的核酸分子、权利要求9所述的载体、或权利要求10所述的重组细胞在制备由人LILRB4蛋白介导的相关疾病的药物中的用途。
任选地,所述疾病为肿瘤。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210611541 | 2022-05-31 | ||
CN2022106115412 | 2022-05-31 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117843782A true CN117843782A (zh) | 2024-04-09 |
Family
ID=90538785
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310444155.3A Pending CN117843782A (zh) | 2022-05-31 | 2023-04-24 | 靶向人lilrb4的纳米抗体及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117843782A (zh) |
-
2023
- 2023-04-24 CN CN202310444155.3A patent/CN117843782A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7317272B2 (ja) | Tigit抗体、その抗原結合断片及びその医療用途 本願は、2019年9月29日に出願された出願番号cn201710908565.3に基づいたものであり、その優先権を主張する。その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。 | |
TWI718206B (zh) | Pd-l1抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 | |
WO2021244089A1 (zh) | 新型冠状病毒(sars-cov-2)刺突蛋白结合分子及其应用 | |
US20230250168A1 (en) | Anti-human claudin 18.2 antibody and application thereof | |
KR20230007406A (ko) | 넥틴-4 (nectin-4) 에 대한 항체 및 이의 응용 | |
JP2019503167A (ja) | Cd38に対する抗原結合性ポリペプチド | |
JP2015524404A (ja) | 高度に保存された標的に対するラクダ科動物由来の配列を含む抗体 | |
CN116478293A (zh) | 治疗分子 | |
JP7044553B2 (ja) | 結合ポリペプチドを含む細菌を特定する方法 | |
EP4289862A1 (en) | Anti-human b7-h3 antibody and application thereof | |
US20230279115A1 (en) | Single variable domain antibody targeting human programmed death ligand 1 (pd-l1) and derivative thereof | |
CN111744013A (zh) | 抗tigit抗体联合pd-1抑制剂治疗疾病的方法和药物组合 | |
WO2021143914A1 (zh) | 一种激活型抗ox40抗体、生产方法及应用 | |
JP2024516581A (ja) | 抗ヒトcd73抗体およびその適用 | |
TWI815136B (zh) | 一種雙特異性抗體及其用途 | |
CN115429894A (zh) | 配体-药物偶联物、其制备方法及其医药用途 | |
CN117843782A (zh) | 靶向人lilrb4的纳米抗体及其应用 | |
CN114716553B (zh) | 靶向人lilrb4的纳米抗体及其应用 | |
CN115109156A (zh) | 一种靶向bcma的纳米抗体及其应用 | |
CN114805580B (zh) | 靶向人lilrb2的纳米抗体及其应用 | |
CN114805568B (zh) | 靶向人lilrb2的纳米抗体及其应用 | |
WO2023025306A1 (zh) | 靶向pd-l1和cldn18.2的双特异性抗体及其制备方法和应用 | |
CN117886942A (zh) | 抗人msln抗体及其应用 | |
CN117843783A (zh) | 抗人cd70抗体及其应用 | |
CN105017424B (zh) | 一种egfr抗体可变区及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication |