CN117886942A - 抗人msln抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗人MSLN抗体、融合蛋白，及其应用，该抗人MSLN抗体能高亲和力结合重组人MSLN抗原，并能通过结合在细胞表面的MSLN诱导抗原抗体复合物内化。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体地，涉及抗人MSLN抗体或其抗原结合片段及其应用，更具体地，涉及抗人MSLN抗体或其抗原结合片段、编码该抗体的核酸，表达该抗体的载体和细胞，制备该抗体的方法，含有该抗体的药物组合物、以及该抗体在制备药物中的用途。
背景技术
纳米抗体是目前最小的抗体分子，其分子量是普通抗体的1/10。纳米抗体除具备单克隆抗体的抗原反应性外，还拥有一些独特的功能特性，如分子质量小，稳定性强、可溶性好、易表达、靶向性强、人源化简单等，尤其是适合抗体和Car-T/M/NK等疗法的开发。
癌症是目前造成人类死亡率最高的疾病之一。抗癌抗体的最新临床和商业成功引起了对基于抗体的疗法的极大兴趣。由此，治疗癌症的抗癌抗体有待进一步研究。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出抗人MSLN抗体及其制备方法和应用。
间皮素(mesothelin，MSLN)最初发现是一个能被单克隆抗体K1特异性识别的抗原，从与K1发生反应的HELA细胞系基因文库中提取CDNA并克隆出了MSLN基因，由于该基因编码生成的膜结合蛋白主要位于正常间皮细胞表面，故命名为间皮素。近年来发现MSLN作为一种肿瘤分化抗原，在恶性间皮瘤、肺癌、食管癌、胰腺癌、宫颈癌以及卵巢癌等恶性肿瘤中呈过度表达。研究表明MSLN是一个40kDa的膜结合蛋白，通过糖基化磷脂酰肌醇锚定于细胞膜。它的前体蛋白是一种长约71kDa的糖蛋白，可以被蛋白酶分解为两部分，其中一部分是分子量大小为31kDa的巨核细胞强化因子MPF，另一部分即为MSLN。
MSLN在恶性间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌和肺腺癌等多种人类癌症中呈现高表达。在健康组织中，MSLN仅表达于间皮细胞，而在重要器官中没有表达。但由于间皮素基因敲除小鼠未发现表型异常，所以间皮素的生理学功能目前尚不清楚。但有研究表明异常的MSLN表达通过促进癌细胞增殖，局部浸润和转移以及赋予对细胞毒剂诱导凋亡的抗性，实现肿瘤的恶性转化和侵袭性。具体可能通过其GPI域直接激活细胞内途径或其受体CA125/MUC16相互作用双向起作用，组成性激活NF-κB，PI3K和MAPK的细胞内途径，从而促进细胞增殖和对凋亡的抵抗。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种抗人MSLN抗体。据本发明的实施例，该抗人MSLN抗体包括：
至少一个结合人MSLN的免疫球蛋白单一可变结构域(ISVD)，所述ISVD具有三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区，其中，所述CDR1、CDR2及CDR3选自下列之一：
(1)所述CDR1具有SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；
(2)所述CDR1具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；
(3)所述CDR1具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列；
(4)所述CDR1具有SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列；
(5)所述CDR1具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列；
(6)所述CDR1具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列；
(7)所述CDR1具有SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列；
(8)所述CDR1具有SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列；
(9)所述CDR1具有SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列；
(10)所述CDR1具有SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列；
(11)所述CDR1具有SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列；
(12)所述CDR1具有SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列；
(13)所述CDR1具有SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列；
(14)所述CDR1具有SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列。
根据本发明实施例的抗人MSLN抗体能高亲和力结合重组人MSLN抗原，阻断MSLN和其受体CD27的结合，并能通过结合在细胞表面的MSLN诱导抗原抗体复合物内化，并激活淋巴细胞杀伤肿瘤细胞。
根据本发明的实施例，所述至少一个结合人MSLN的免疫球蛋白ISVD为人源化的骆驼科VHH。
根据本发明的实施例，该抗体包括至少一个与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14所示的氨基酸序列具有至少80％一致性的VHH。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种融合蛋白。根据本发明的实施例，该融合蛋白包括：第一结构域，所述第一结构域具有前述的抗人MSLN抗体；以及第二结构域，所述第二结构域包括用于延长体内半衰期和/或对效应细胞具有结合作用的多肽。
根据本发明的实施例，所述第二结构域包括血清白蛋白片段、聚乙二醇片段和结合HSA的纳米抗体中的一种或多种的组合。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码前述的抗人MSLN抗体或编码前述的融合蛋白。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种载体。根据本发明的实施例，该载体包括前述的核酸。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种分离的细胞。根据本发明的实施例，该细胞包括前述的载体。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备前述的抗人MSLN抗体或其抗原结合片段的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
(1)在合适的条件下，培养前述的细胞；以及
(2)分离回收前述的抗人MSLN抗体。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包括：前述的抗人MSLN抗体或前述的融合蛋白；以及药学上可接受的载体。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种抗体-药物缀合物。根据本发明的实施例，该抗体-药物缀合物包括与治疗剂共价结合的前述的抗人MSLN抗体。
根据本发明的另一方面，本发明提供了前述的抗人MSLN抗体或前述的融合蛋白或前述的抗人MSLN抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的嵌合抗体与鼠MSLN重组蛋白的结合结果示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的FACS检测抗MSLN嵌合抗体在human MSLN/293细胞上的结合活性结果示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的FACS检测抗MSLN嵌合抗体在Hela细胞上的结合活性的结果示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的组件或具有相同或类似功能的组件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
定义
术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段，分别例如VHH结构域或VH/VL结构域)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。
术语“单克隆抗体”指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体显示对特定表位的单结合特异性和亲和性。
术语“单域抗体(VHH)”、“纳米抗体(nanobody)”具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常从羊驼免疫血清中先获得天然缺失轻链和重链恒定区域1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。
术语“单域抗体(VHH)”是指基本上由本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，其中所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。因此，单域抗体(VHH)的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。单域抗体(VHH)因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。
术语“重链单域抗体”、“VHH结构域”、“VHH”、“VHH抗体片段”、“VHH抗体”以及“纳米抗体”(“Nanobody”为Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用。
术语“特异性结合”意指此结合对于抗原是选择性的，并且能与不想要的或非特异性的相互作用区别开来。抗原结合模块结合特异性抗原决定簇的能力能经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术，例如表面等离振子共振技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等,Glyco J17,323-329(2000))，以及免疫荧光技术。
术语“人源化抗体”指具有基本来自非人物种免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子其余的免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。所述抗原结合位点可包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包含移植到可变结构域中适当构架区的互补性决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的，或者通过一个或多个氨基酸替换进行修饰，例如进行修饰以与人免疫球蛋白更为相近。某些形式的人源化抗体保留了全部CDR序列(例如含有来自羊驼的全部三个CDR的人源化纳米抗体)。其他形式具有一个或多个相对于原始抗体而言发生了改变的CDR。
两个多肽序列之间的“序列一致性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”指示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。
术语“药物组合物”指其形式使得其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受该组合物施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。
“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“抗原”是抗体可选择性结合的预定抗原。靶标抗原可为多肽、蛋白、核酸、细胞、脂质、半抗原或其它天然存在或合成化合物。在本文的一些实施方案中，靶标抗原是表达CLD18A2的细胞，更优选地，是表达CLD18A2分子中的其中一部分。
抗人MSLN抗体和融合蛋白
本发明提供了特异性结合MSLN的抗体及其抗原结合片段。根据本发明实施例的抗人MSLN抗体能高亲和力结合重组人MSLN抗原，并能通过结合在细胞表面的MSLN诱导抗原抗体复合物内化。
单一可变结构域抗体是这样的抗体，它们的互补决定区是单一可变结构域多肽的部分。实例包括，但不限于，重链抗体、天然没有轻链的抗体、从常规4-链抗体衍生的单一可变结构域抗体、工程化抗体和单一可变结构域支架，其不同于从抗体衍生的那些支架。单一可变结构域抗体可以是本领域中任一种单一可变结构域抗体或者任一将来的单一可变结构域抗体。单一可变结构域抗体可以来自任何物种，包括，但不限于，小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔、牛。根据本发明的一个方面，此处所用的单一可变结构域抗体是称作无轻链的重链抗体的天然存在的单结构域抗体。为了阐明，从天然缺少轻链的重链抗体衍生的该可变结构域被称为VHH或者nanobody，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区别。这种VHH分子可以来自在骆驼科物种，例如在骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼和驮马中产生的抗体。除了骆驼科之外的其他物种可以产生天然缺少轻链的重链抗体；这种VHHs在本发明的范围内。
本发明实施例提供了与MSLN特异性结合的VHHs。
根据本发明的一些实施例，如通过Kabat编码定义的，chC3的VHH具有SEQ ID NO：15所示的CDR1、SEQ ID NO：16所示的CDR2和SEQ ID NO：17所示的CDR3。
根据本发明的一些实施例，如通过Kabat编码定义的，chC5的VHH具有SEQ ID NO：18所示的CDR1、SEQ ID NO：19所示的CDR2和SEQ ID NO：20所示的CDR3。
根据本发明的一些实施例，如通过Kabat编码定义的，chB1的VHH具有SEQ ID NO：21所示的CDR1、SEQ ID NO：22所示的CDR2和SEQ ID NO：23所示的CDR3。
根据本发明的一些实施例，如通过Kabat编码定义的，chB9的VHH具有SEQ ID NO：24所示的CDR1、SEQ ID NO：24所示的CDR2和SEQ ID NO：26所示的CDR3。
根据本发明的一些实施例，如通过Kabat编码定义的，chB10的VHH具有SEQ ID NO：27所示的CDR1、SEQ ID NO：28所示的CDR2和SEQ ID NO：29所示的CDR3。
根据本发明的一些实施例，如通过Kabat编码定义的，chC9的VHH具有SEQ ID NO：30所示的CDR1、SEQ ID NO：31所示的CDR2和SEQ ID NO：32所示的CDR3。
根据本发明的一些实施例，如通过Kabat编码定义的，chA2的VHH具有SEQ ID NO：33所示的CDR1、SEQ ID NO：34所示的CDR2和SEQ ID NO：35所示的CDR3。
根据本发明的一些实施例，如通过Kabat编码定义的，chC1的VHH具有SEQ ID NO：36所示的CDR1、SEQ ID NO：37所示的CDR2和SEQ ID NO：38所示的CDR3。
根据本发明的一些实施例，如通过Kabat编码定义的，chC7的VHH具有SEQ ID NO：39所示的CDR1、SEQ ID NO：40所示的CDR2和SEQ ID NO：41所示的CDR3。
根据本发明的一些实施例，如通过Kabat编码定义的，chC8的VHH具有SEQ ID NO：42所示的CDR1、SEQ ID NO：43所示的CDR2和SEQ ID NO：44所示的CDR3。
根据本发明的一些实施例，如通过Kabat编码定义的，chD8的VHH具有SEQ ID NO：45所示的CDR1、SEQ ID NO：46所示的CDR2和SEQ ID NO：47所示的CDR3。
根据本发明的一些实施例，如通过Kabat编码定义的，chD10的VHH具有SEQ ID NO：48所示的CDR1、SEQ ID NO：49所示的CDR2和SEQ ID NO：50所示的CDR3。
根据本发明的一些实施例，如通过Kabat编码定义的，chE2的VHH具有SEQ ID NO：51所示的CDR1、SEQ ID NO：52所示的CDR2和SEQ ID NO：53所示的CDR3。
根据本发明的一些实施例，如通过Kabat编码定义的，chE11的VHH具有SEQ ID NO：54所示的CDR1、SEQ ID NO：55所示的CDR2和SEQ ID NO：56所示的CDR3。在一些实施方案中，抗体可以具有重链可变区(VH)，所述重链可变区包含互补决定区(CDR)1、2、3，其中CDR1区包含与chC3、chC5、chB1、chB9、chB10、chC9、chA2、chC1、chC7、chC8、chD8、chD10、chE2和chE11的VH CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR2区包含与chC3、chC5、chB1、chB9、chB10、chC9、chA2、chC1、chC7、chC8、chD8、chD10、chE2和chE11的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且CDR3区包含与chC3、chC5、chB1、chB9、chB10、chC9、chA2、chC1、chC7、chC8、chD8、chD10、chE2和chE11VH CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成。
本发明所提供的抗MSLN抗原的纳米抗体的氨基酸序列可以包括：a)如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14所示的氨基酸序列；或，b)与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14具有80％以上序列相同性的氨基酸序列、且具有a)所限定的氨基酸序列的功能；具体的，所述b)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14其中之一所示的多肽片段的功能的多肽片段，例如，与MSLN的特异性结合能力。所述b)中的氨基酸序列可与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。本发明所提供的抗MSLN的纳米抗体可以高亲和力结合重组人MSLN抗原，阻断MSLN和其受体的结合。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种融合蛋白。根据本发明的实施例，该融合蛋白包括：第一结构域，所述第一结构域具有前述的抗人MSLN抗体；以及第二结构域，所述第二结构域包括用于延长体内半衰期和/或对效应细胞具有结合作用的多肽。所述融合蛋白可以是一种结合分子，所述结合分子能够与重组人MSLN抗原特异性结合。
所述第二结构域中，用于延长体内半衰期的片段可以包括血清白蛋白片段、聚乙二醇片段、结合HSA的结构域(例如，结合HSA的纳米抗体)等。所述第二结构域中，对效应细胞具有结合作用的片段可以包括免疫球蛋白Fc区等，优选选自人免疫球蛋白Fc区。所述人免疫球蛋白Fc区中包括用于改变Fc介导的效应功能的突变，所述效应功能包括CDC活性、ADCC活性、ADCP活性中的一种或多种的组合。所述免疫球蛋白可以选自IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM等中的一种或多种的组合，所述IgG具体可以选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型等中的一种或多种的组合。纳米抗体融合蛋白中包含的免疫球蛋白Fc区可以使所述融合蛋白形成二聚体，同时延长所述融合蛋白的体内半衰期和增加Fc介导的相关活性。在本发明一具体实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区可以是人IgG1的Fc区，更具体可以是野生型IgG1Fc序列，所述序列可以被引入用于改变Fc介导的效应功能的突变，例如，a)改变Fc介导的CDC活性的突变；b).改变Fc介导的ADCC活性的突变；或c).改变Fc介导的ADCP活性的突变。
核酸、载体和细胞
本发明实施例还提供了包括本文公开的分离的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)的重组载体(例如表达载体)、引入了重组载体的宿主细胞(即，使得所述宿主细胞含有多核苷酸和/或含多核苷酸的载体)、以及通过重组技术产生重组抗体多肽或其片段。
如本文所用，“载体”是当载体被引入宿主细胞时能够将一个或多个目标多核苷酸递送至所述宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已引入表达载体的宿主细胞中递送和表达一个或多个目标多核苷酸作为编码的多肽。因此，在表达载体中，目标多核苷酸通过与调控组件诸如启动子、增强子和/或多聚腺苷酸尾可操作地连接而定位于载体中表达，所述调控组件位于载体内或宿主细胞的基因组中的目标多核苷酸的整合位点处或所述整合位点附近或所述整合位点两侧，使得目标多核苷酸将在引入了所述表达载体的宿主细胞中得以翻译。
可以通过本领域已知的方法，例如电穿孔、化学转染(例如DEAE-葡聚糖)、转化、转染以及感染和/或转导(例如用重组病毒)将载体引入到宿主细胞中。因此，载体的非限制性实施例包括病毒载体(可用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体以及与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体。
本发明实施例提供了用上文描述的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞。优选的原核宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。优选地，真核细胞选自：原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于CHO和COS细胞。优选的真菌细胞是酿酒酵母。
制备抗MSLN抗体的方法
可以使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，将人MSLN的分离片段用作免疫原以产生抗体。可以通过多次注射(例如皮下或腹腔注射)抗原肽或蛋白质而在动物中产生多克隆抗体。在一些实施方案中，将抗原肽或蛋白质与至少一种佐剂一起注射。在一些实施方案中，可以将抗原肽或蛋白质与待免疫物种中具有免疫原性的药剂缀合。可以多次向动物注射抗原肽或蛋白质。
免疫原通常用于通过免疫合适的受试者(例如表达至少一个人免疫球蛋白基因座的人或转基因动物)来制备抗体。合适的免疫原性制剂可以含有例如重组表达的多肽或化学合成的多肽(例如人MSLN的片段)。制剂可以进一步包含佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂、或类似的免疫刺激剂。
药物组合物和用途及治疗方法
本发明实施例还提供了含有本发明实施例所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)的药物组合物。本文所述的任何抗体或抗原结合片段中的两种或更多种(例如，两种、三种或四种)可以以任何组合存在于药物组合物中。可以以本领域已知的任何方式配制药物组合物。
药物组合物还可以含有药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理上兼容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。药学可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加抗体的贮存期限或效力。
在一个方面，本发明提供了前述的抗人MSLN抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。
本发明提供了一种或多种抗体或其抗原结合片段可以用于多种治疗目的。在一个方面，本公开提供了用于治疗受试者癌症的方法、降低受试者肿瘤体积随时间增加的速率的方法、降低发生转移的风险的方法、或降低受试者发生另外转移的风险的方法。在一些实施方案中，治疗可以停止、减慢、延缓或抑制癌症的进展。在一些实施方案中，治疗可导致受试者癌症的一个或多个症状的数量、严重程度和/或持续时间减少。
在一个方面，本公开的特征在于如下方法，所述方法包括向有需要的受试者(例如，患有、或鉴定为患有或诊断为患有癌症的受试者)施用治疗有效剂量的本文公开的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗有癌症风险的患者。可以用本领域已知的多种方法来鉴定患有癌症的患者。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等着，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
实施例1：骆驼纳米抗体免疫噬菌体库构建
利用MSLN重组抗原免疫骆驼，分离外周血单核细胞(PBMC)并提取总RNA进行反转录，以反转录产物为模板扩增纳米抗体重链可变区(variable domain of the heavy-chain of heavy chain antibody,VHH)并连入噬菌体展示载体，电转入大肠杆菌TG1感受态细胞，构建骆驼免疫库。
具体地，骆驼免疫两周一次，共4次。每次注射0.8mg MSLN胞外区重组蛋白，佐以弗氏完全/不完全佐剂(Sigma，F5881,F5506)，采取皮下多点注射的方式。每次免疫后2周采集1mL血分离血清，用免疫原作为测定抗原，通过ELISA法分别测定血清中全抗体(IgG)和重链抗体(heavy chain antibody，HcAb)的滴度。当血清滴度达到建库要求后，采集100mL骆驼外周血并用分离试剂盒(天津灏洋，Cat:TBD2011CM)分离PBMC，提取PBMC的总RNA反转获得cDNA，作为后续扩增VHH片段的模板。根据相关文献和数据库中检索到驼源VHH抗体的基因，设计并合成VHH抗体库构建引物，PCR扩增出抗体可变区基因序列。随后利用核酸内切酶对载体和扩增的抗体片段进行酶切。采用T4连接酶的连接方式构建连接产物，利用电转染技术将连接产物转入到TG1菌种之中。最终构建了一个1.8×108骆驼抗人MSLN VHH抗体免疫库，用于特异性抗人MSLN纳米抗体的筛选。为检测文库的正确率，随机选取50个克隆进行菌落PCR，结果显示插入率达到90％。
通过固相筛选的方法对所构建的骆驼免疫库进行筛选，获得特异性噬菌体展示纳米抗体。通过原始库呈现及筛选和鉴定获得了14株可结合人MSLN的重组蛋白的噬菌体展示的纳米抗体，分别为C3，C5，B1，B9，B10，C9，A2，C1，C7，C8，D8，D10，E2和E11。
实施例2：抗人MSLN纳米抗体的制备
根据噬菌体展示的纳米抗体测序结果，设计引物，将不同纳米抗体通过PCR方法克隆至含有人Fc(hFc)编码基因的真核瞬时表达载体中，并在HEK293细胞中重组表达。细胞转染5-6天后，取培养上清，利用ProA亲和层析柱(购自GE Healthcare，Cat:17-5199-02)对表达上清进行纯化，获得不同重组蛋白，其中，chC3可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：1；chC5可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：2，chB1可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：3，chB9可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：4，chB10可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：5，chC9可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：6，chA2可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：7，chC1可变区氨基酸序列见SEQ IDNO：8，chC7可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：9，chC8可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：10，chD8可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：11，chD10可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：12，chE2可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：13，chE11可变区氨基酸序列见SEQ ID NO：14。
SEQ ID NO：1:chC3 VHH氨基酸序列(CDRs1、2和3分别为SEQ ID NO：15、16和17)
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCEASGYSFSSACMGWFRQAPGKEREGVAHINGVGRTLYADSVKGRFTISNDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYHCAARPVRRGDCYGPYNSWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：2:chC5 VHH氨基酸序列(CDRs1、2和3分别为SEQ ID NO：18、19和20)
QVQLQESGGGLVQAGGSLKLSCRASGYISSRCGMTWYRQAPGKERDTVAYISSIGTTTYADSVKGRFTISQDNGKNTLYLQMNSLRTEDTAVYYCAASSGSTCVRNLWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：3:chB1 VHH氨基酸序列(CDRs1、2和3分别为SEQ ID NO：21、22和23)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVASGYTYRTNCIGWFRQVPGKEREGVAGISTGGGMTYYADSVKGRFTISQDNAKKAVYLEMNSLTPEDTAMYYCAADGLPGPFCSATWLVRRDQPYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：4:chB9 VHH氨基酸序列(CDRs1、2和3分别为SEQ ID NO：24、25和26)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGYTYTNCMGWFRQVPGKEREGVAVISIDGGNPYYADSVKGRFTISQDNAKKAVYLEMNSLTPEDTAMYYCAADGLPGPFCSAPWLVRLDQPYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：5:chB10 VHH氨基酸序列(CDRs1、2和3分别为SEQ ID NO：27、28和29)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCVVSGFTYSSYCMGWFRQAPGKGRELVSTISGAGGTYYPDSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCMADAVVWRCGLQSHEYAHVGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：6:chC9 VHH氨基酸序列(CDRs1、2和3分别为SEQ ID NO：30、31和32)
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGDTVLSYCMGWFRQASGKEREEVAFSGSDGSTRYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAADIPRCMVVGGTPNPFFWGRGTQVTVSS
SEQ ID NO：7:chA2 VHH氨基酸序列(CDRs1、2和3分别为SEQ ID NO：33、34和35)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASRYTYSSNCMGWFRQVPGKEREGIAVISADAGTTYYADSVKGRFTISQDNAKKAVYLEMNSLTPEDTAMYYCAADGLPGPFCSAPWLVRRDQPYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：8:chC1 VHH氨基酸序列(CDRs1、2和3分别为SEQ ID NO：36、37和38)
QVQLQESGGGSVQPGGSLRLSCAASGNTYSRNCMGWYRQVSGKEREGVASISPGGGSTYYTDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAMYYCAAFSRRDWYCDINTNVRLAQMIDAWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：9:chC7 VHH氨基酸序列(CDRs1、2和3分别为SEQ ID NO：39、40和41)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSISSSYCMGWFRQAPGKEREGVATIGADGTTTYAEGVKGRFTISKDNAKGTLYLEMNSLKPEDTAMYSCAARRSYCNGGYCGICRSDSRVAYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：10:chC8 VHH氨基酸序列(CDRs1、2和3分别为SEQ ID NO：42、43和44)
QVQLQESGGGLVQAGGSLKLSCVASGYIFTHCGMGWYRQAPGDERELIASISKDGTTRYKDSVKGRFTISQDNAKNTLYVQMNSLKTEDTAVYYCAAGWGSTYCTGGLELGYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：11:chD8 VHH氨基酸序列(CDRs1、2和3分别为SEQ ID NO：45、46和47)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSTYSRMCMDWFRQAPGQERERVAHIDFDGRTRYADSVRGRFTISKDNAKKISYLQMNSLKPEDTGMYYCGASLYYGGSCRPYDNDNWGPGTQVTVSS
SEQ ID NO：12:chD10 VHH氨基酸序列(CDRs1、2和3分别为SEQ ID NO：48、49和50)
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTGSSSSDCMGWFRQAPGKEREGVAVIDADGRTTYRDSVKGRFTLSKDNAKNTLYLQMNNLKPEDTAMYYCAAILGTCSHPIFALLPRGYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：13:chE2 VHH氨基酸序列(CDRs1、2和3分别为SEQ ID NO：51、52和53)
QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIYSTYCVGWFRQTPGKEREGVATIGNDGSTHYADSVKGRFTISKDNAKNSLYLEMNSLKPEDTAMYYCAARRSYCNGGYCGLCRSDSRVPYNYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO：14:chE11 VHH氨基酸序列(CDRs1、2和3分别为SEQ ID NO：54、55和56)
QVQLQESGGGLVQPGGSLKLSCAFSGGIFSQFTMAWFRQAPGKEREGVAAIETDGITTYDPSVKGRFTISKDNAKDTLYLHMINLKPEDTAMYYCAAETDDFTYWGQGTQVTVSS
实施例3：嵌合抗体亲和力检测
1.检测与人MSLN的结合
利用Fortebio公司的Octet QKe system仪器，采用抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针捕获抗体Fc段的方法测定实施例2得到的嵌合抗体亲和力。测定时将不同嵌合抗体，用PBS缓冲液稀释至4ug/ml，流经AHC探针(Cat:18-0015，PALL)表面，时间为120s。人MSLN重组蛋白(购于ACRO，Cat#MSN-H5223)60nm；作为流动相，结合时间为300s，解离时间为300s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数。
动力学参数如下表1所示，结果表明除chB10外，chC3、chC5、chB1、chB9、chC9、chA2、chC1、chC7、chC8、chD8、chD10、chE2和chE11均可以与人MSLN重组蛋白结合，不同纳米抗体结合活性不同。
表1.嵌合抗体与人MSLN重组蛋白的亲和力测定结果
| Sample | KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) |
| chC3 | 2.48E-09 | 3.75E+05 | 9.32E-04 |
| chC5 | 1.76E-09 | 4.42E+05 | 7.77E-04 |
| chB1 | 7.77E-09 | 4.93E+04 | 3.83E-04 |
| chB9 | 1.79E-08 | 1.75E+04 | 3.13E-04 |
| chB10 | 1.84E-06 | 6.10E+02 | 1.12E-03 |
| chC9 | <1.0E-12 | 3.46E+05 | <1.0E-07 |
| chA2 | 9.75E-09 | 5.53E+04 | 5.39E-04 |
| chC1 | 3.63E-08 | 8.66E+04 | 3.15E-03 |
| chC7 | 1.06E-07 | 7.66E+04 | 8.15E-03 |
| chC8 | 2.05E-09 | 3.82E+05 | 7.84E-04 |
| chD8 | 2.61E-09 | 3.22E+05 | 8.41E-04 |
| chD10 | 1.34E-08 | 5.18E+04 | 6.97E-04 |
| chE2 | 3.66E-06 | 1.16E+03 | 4.24E-03 |
| chE11 | 2.89E-08 | 3.27E+05 | 9.45E-03 |
2.检测与猴MSLN的结合
利用Fortebio公司的Octet QKe system仪器，采用抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针捕获抗体Fc段的方法测定抗体亲和力。测定时将chC3、chC5、chC8和chD8嵌合抗体，用PBS缓冲液稀释至4ug/ml，流经AHC探针(Cat:18-0015，PALL)表面，时间为120s。猴MSLN重组蛋白(购于ACRO，Cat#MSLN-C52H6)60nm；作为流动相，结合时间为300s，解离时间为300s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数，动力学参数如下表2所示，结果表明chC3、chC5、chC8和chD8可以与猴MSLN重组蛋白结合，为后续研究提供种属交叉基础。
表2.嵌合抗体与猴MSLN重组蛋白的亲和力测定结果
| 样本 | KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) |
| chC3 | 1.11E-06 | 2.34E+05 | 2.59E-01 |
| chC5 | 1.28E-08 | 3.44E+05 | 4.40E-03 |
| chC8 | 1.27E-08 | 1.25E+05 | 1.59E-03 |
| chD8 | 8.79E-09 | 6.95E+05 | 6.11E-03 |
实施例4：ELISA检测抗MSLN嵌合抗体与鼠MSLN的结合
经过人MSLN与鼠MSLN进行序列比对，可知二者同源性为59％，相似度较低。将鼠MSLN重组蛋白(购于ACRO，Cat#MSLN-M52H3)4℃包被过夜，包被浓度1ug/mL；PBS洗板3次后，加入5％ BSA PBS，37℃封闭60min，PBST洗板3次；加入不同稀释倍数的实施例2得到的chC3，chC5，chC9，chB1，chD8，chA2，chC8，chE11，chD10抗体(起始浓度为66nm，3倍梯度依次稀释8个浓度)，37℃孵育60min，PBST洗板4次；加入1:5000稀释的HRP-anti-human Fc(Cat：109-035-098，Jackson Immuno Research)，37℃孵育45min，PBST洗板4次；加入TMB底物显色，37℃孵育10min后，加入2M HCl终止反应；以630nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度A450nm-630nm。实验结果如图1所示，结果表明chC5和chD8可以特异性的与鼠MSLN在高浓度下有交叉。
实施例5：FACS检测抗MSLN嵌合抗体重组表达人MSLN的293细胞(human MSLN/293)的结合活性
利用瞬转人MSLN的293细胞(human MSLN/293)，检测实施例2得到的嵌合抗体与人MSLN结合情况，取2E5细胞分别与不同浓度的抗MSLN抗体结合，将chB1、chC3、chC9、chA2、chC1、chC5、chC7、chC8、chD8、chD10、chE2和chE11从132nm开始5倍梯度稀释8个梯度。4℃避光孵育60min，充分PBS洗涤后，加入1:200稀释的FITC标记的羊抗人抗体(sigma,F9512)，4℃避光孵育30min后充分PBS洗涤，重悬于200ul的PBS中，流式细胞仪检测，结果如图2和表3所述，其中chC3、chC9、chC5、chC8和chD8嵌合抗体与人MSLN的293细胞有很好的结合能力，EC50如表3所示。
表3.FACS检测抗MSLN嵌合抗体在human MSLN/293细胞上的EC50
| EC50(nM) | |
| chC3 | 7.876 |
| chC9 | 7.185 |
| chC5 | 6.314 |
| chC8 | 6.928 |
| chD8 | 7.372 |
实施例6：FACS检测抗MSLN嵌合抗体在Hela细胞上的结合活性
利用2E5细胞分别与实施例2得到的不同浓度的抗MSLN嵌合抗体结合，不同嵌合抗体从66nm开始3倍梯度稀释11个梯度；4℃避光孵育60min，充分PBS洗涤后，加入1:200稀释的FITC标记的羊抗人抗体(sigma,F9512)，4℃避光孵育30min后充分PBS洗涤，重悬于200ul的PBS中，流式细胞仪检测。结果如图3所示，chC8、chD8、chC3、chC5和chC9与Hela细胞表面MSLN有较好的结合活性，具体EC50值见表4所示，其中chC8和chD8未拟合出EC50。
表4.FACS检测抗MSLN嵌合抗体在human MSLN/293细胞上的EC50
| 抗体 | EC50(nM) |
| chC8 | / |
| chD8 | / |
| chC3 | 0.131 |
| chC5 | 0.1256 |
| chC9 | 1.544 |
实施例7：抗MSLN抗体介导MSLN/HEK-293细胞发生内化作用
MSLN/HEK-293(瞬转24h后)细胞，分为5×10E5cells/样品/100uL，500uL含5％BSA的PBS封闭细胞表面受体，冰上孵育30min。随后4℃，1,500rpm离心3min，弃上清。将实施例2得到的工作抗体chC3、chC5、chC8、chD8及Isotype用RPMI 1640(含10％ FBS)稀释至10ug/mL，加入细胞中，一组放37℃电热恒温培养箱，一组放4℃冰箱做为阴性对照；每管加入1mL冰冷PBS洗涤细胞1遍，最后加入200uL二抗Goat Anti human IgG Fc-FITC(购自Jackson Immuno Research，Cat：109-035-098)(1:200)，重悬细胞，冰水孵育45min然后4℃，1,500rpm离心3min，弃上清，每管加入1mL冰冷PBS洗涤细胞1遍，重悬于200uL流式缓冲液中，流式细胞仪检测。按照如下公式，计算内吞率：
tx时间点的％MFI＝37℃孵育样品的MFI×100/4℃孵育对照样品的MFI
tx时间点的内吞百分比＝100-tx时间点的％MFI
(tx表示一抗与细胞孵育的x时间)
实验结果见表5，结果表明，chC3、chC5、chC8和chD8在37℃条件下内化进入细胞内，在细胞质内呈点状分布，能介导MSLN/HEK-293细胞的内化。
表5.抗MSLN抗体内化比例分析
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (12)
1.抗人MSLN抗体，其特征在于，包括至少一个结合人MSLN的免疫球蛋白单一可变结构域(ISVD)，所述ISVD具有三个分别为CDR1、CDR2及CDR3的互补决定区，其中，所述CDR1、CDR2及CDR3选自下列之一：
(1)所述CDR1具有SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列；
(2)所述CDR1具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；
(3)所述CDR1具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列；
(4)所述CDR1具有SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列；
(5)所述CDR1具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列；
(6)所述CDR1具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列；
(7)所述CDR1具有SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列；
(8)所述CDR1具有SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列；
(9)所述CDR1具有SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列；
(10)所述CDR1具有SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列；
(11)所述CDR1具有SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列；
(12)所述CDR1具有SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列；
(13)所述CDR1具有SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列；
(14)所述CDR1具有SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列，所述CDR2具有SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列，所述CDR3具有SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述至少一个结合人MSLN的免疫球蛋白ISVD为人源化的骆驼科VHH。
3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，包括至少一个与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14所示的氨基酸序列具有至少80％一致性的VHH。
4.一种融合蛋白，其特征在于，包括：
第一结构域，所述第一结构域具有权利要求1-3任一项所述的抗人MSLN抗体；以及
第二结构域，所述第二结构域包括用于延长体内半衰期和/或对效应细胞具有结合作用的多肽。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二结构域包括血清白蛋白片段、聚乙二醇片段和结合HSA的纳米抗体中的一种或多种的组合。
6.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-3任一项所述的抗人MSLN抗体，或编码权利要求4或5所述的融合蛋白。
7.一种载体，其特征在于，包括权利要求6所述的核酸。
8.一种分离的细胞，其特征在于，包括权利要求7所述的载体。
9.一种制备权利要求1-3任一项所述的抗人MSLN抗体的方法，其特征在于，包括：
(1)在合适的条件下，培养权利要求8所述的细胞；以及
(2)分离回收权利要求1-3任一项所述的抗人MSLN抗体。
10.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求1-3任一项所述的抗人MSLN抗体或权利要求4或5所述的融合蛋白；以及
药学上可接受的载体。
11.一种抗体-药物缀合物，其特征在于，包括与治疗剂共价结合的、权利要求1-3任一项所述的抗人MSLN抗体。
12.权利要求1-3任一项所述的抗人MSLN抗体或权利要求4或5所述的融合蛋白或权利要求11所述的抗体-药物缀合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。
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