CN111856029B - Il-17a蛋白在膀胱癌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种IL‑17A蛋白在膀胱癌中的应用，属于生物医学技术领域。IL‑17A蛋白作为生物标志物在膀胱癌诊断、治疗和/或预后评估中的应用。本发明发现，在膀胱癌组织内，IL‑17A高表达，参与了膀胱癌的发生及侵袭过程；并且，IL‑17A具有促进膀胱癌细胞增殖，一定程度抑制其凋亡过程，其发生的机制与IL‑17A诱导IL‑6活化，进而激活JAK/Stat3通路激活有关。因此，可以将IL‑17A作为生物标志物，用于对膀胱癌的诊断、治疗和/或预后评估。

Description

IL-17A蛋白在膀胱癌中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种IL-17A蛋白在膀胱癌中的应用。
背景技术
膀胱癌是发生于膀胱黏膜组织中的实体恶性肿瘤，其发病率位于泌尿系统恶性肿瘤中第一位，占全部恶性肿瘤的4％左右。血尿、尿频、排尿疼痛感是一般膀胱癌早期的主要临床症状。膀胱癌发生目前认为与吸烟有关，吸烟是膀胱癌发病的主要危险因素之一，据统计，吸烟者膀胱癌发病率是不吸烟者的5倍；从事橡胶、金属工业、燃料生产等与有毒有害物质接触过多职业的员工患膀胱癌的风险明显增加，说明膀胱癌也可能是一种职业病。
免疫系统的激活在膀胱癌发生发展中发挥重要作用。固有免疫系统具有促癌效应，而适应性免疫系统发挥抗癌作用。近年来随着肿瘤免疫研究的不断深入，通过调节机体自然免疫机制并通过具有抗原性的肿瘤疫苗诱发机体产生特异性抗体的治疗方法，逐渐在肿瘤临床治疗中开展使用。然而，目前对于利用免疫系统对膀胱癌进行抗癌治疗的研究仍不充分。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种IL-17A蛋白作为生物标志物，在膀胱癌中的应用，本发明发现，IL-17A蛋白可诱导IL-6活化，进而激活JAK/Stat3通路激活，从而促进膀胱癌细胞增殖。
本发明公开了一种IL-17A蛋白作为生物标志物在膀胱癌诊断、治疗和/或预后评估中的应用。
本发明通过研究发现，在膀胱癌组织内，IL-17A高表达，参与了膀胱癌的发生及侵袭过程；并且，IL-17A具有促进膀胱癌细胞增殖，一定程度抑制其凋亡过程，其发生的机制与 IL-17A诱导IL-6活化，进而激活JAK/Stat3通路激活有关。因此，可以将IL-17A作为生物标志物，用于对膀胱癌的诊断、治疗和/或预后评估。
本发明公开了一种IL-17A蛋白作为膀胱癌细胞模型促进剂中的应用。
在其中一个实施例中，所述膀胱癌细胞为人体膀胱癌T24细胞。
在其中一个实施例中，所述膀胱癌细胞模型用于膀胱癌药物的研究开发中。
在其中一个实施例中，所述IL-17A蛋白通过激活IL-6-Stat3通路促进膀胱癌细胞增殖。
本发明还公开了一种膀胱癌细胞模型，以IL-17A蛋白作为促进细胞增殖的促进剂。
本发明还公开了一种IL-17A抑制剂在制备用于膀胱癌药物中的应用。
在其中一个实施例中，所述膀胱癌细胞为人体膀胱癌T24细胞。
在其中一个实施例中，所述IL-17A抑制剂通过影响IL-6-Stat3通路抑制膀胱癌细胞增殖。
本发明还公开了一种用于膀胱癌的药物组合物，包括IL-17A抑制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种IL-17A蛋白作为生物标志物在膀胱癌诊断、治疗和/或预后评估中的应用，可利用IL-17A蛋白在膀胱癌组织内高表达，参与了膀胱癌的发生及侵袭过程的机制，从而将 IL-17A作为生物标志物，用于对膀胱癌的诊断、治疗和/或预后评估。
本发明的一种IL-17A蛋白作为膀胱癌细胞模型促进剂中的应用，利用IL-17A蛋白，可诱导IL-6活化，进而激活JAK/Stat3通路激活，从而促进膀胱癌细胞增殖，实现膀胱癌细胞模型的建立。
本发明的一种IL-17A抑制剂在制备用于膀胱癌药物中的应用，利用IL-17A具有促进膀胱癌细胞增殖，抑制其凋亡的特点，通过抑制IL-17A的活性，达到抑制膀胱癌细胞增殖，促进其凋亡，从而实现抑制膀胱癌的作用。
附图说明
图1为不同膀胱组织HE染色(×100)图；
图2为膀胱炎和膀胱癌组织IL-17A表达情况(SP×200)；
图3为膀胱炎和膀胱癌组织IL-17RA表达情况(SP×400)；
图4为膀胱炎和膀胱癌组织IL-17E表达情况(SP×200)；
图5为膀胱炎和膀胱癌组织IL-17RB表达情况(SP×200)；
图6为膀胱炎和膀胱癌组织IL-17F表达情况(SP×200)；
图7为膀胱炎和膀胱癌组织IL-17RC表达情况(SP×200)；
图8为膀胱炎和膀胱癌组织IL-6表达情况(SP×200)；
图9为膀胱炎和膀胱癌组织Stat3表达情况(SP×200)；
图10为不同恶性程度膀胱组织中Stat3表达的免疫组化染色(SP×400)；
图11为IL-17A重组蛋白对T24细胞迁移能力的影响；
图12为不同浓度IL-17A重组蛋白对T24细胞凋亡的影响；
图13为不同浓度IL-17A重组蛋白刺激对T24细胞IL-6、IL-6R、JAK1、p-JAK1、Stat3、 p-Stat3蛋白Western blot电泳图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例
一、膀胱癌患者膀胱组织及血清中相关因子表达情况。
1、研究对象与主要试剂
1.1研究对象
选取2016年10月至2017年12月间吉林医药学院、北华大学附属医院、吉林市人民医院收治的膀胱癌患者107例。入选标准：①有明确的手术指征，无手术禁忌症，行手术治疗；②术后病理学检查证实为膀胱癌。排除标准：①术前CT检查有远处转移的患者；②肝肾等重要器官功能严重异常的患者；③膀胱癌复发的患者；④凝血功能障碍；⑤近3个月有免疫抑制剂治疗史，或免疫功能异常者；⑥术前接受过放化疗、生物治疗等其他膀胱癌治疗的患者。另取同期收治的膀胱炎患者23例；膀胱癌和膀胱炎患者均取膀胱组织进行病理检查。选取同期健康体检的志愿者50名，收集外周血进行研究。膀胱癌患者中男性93例，女性14例；年龄39～75岁，平均年龄(59.83±7.19)岁；膀胱炎患者中男性20例，女性3例；年龄35～72 岁，平均年龄(58.29±5.31)岁；健康志愿者中男性44例，女性6例；年龄40～75岁，平均年龄(58.50±4.15)岁。受试者性别、年龄之间无明显统计学差异(P>0.05)，具有可比性。本研究符合北华大学医学伦理学要求，受试者均自愿参与并签署知情同意书。
1.2主要试剂
本研究使用的抗体主要有：兔抗人IL-17A(NBP1-42746，1：100)、鼠抗人IL-17E(NB100-56541，1：8000)、鼠抗人IL-17RB(NBP1-39952，1：300)、兔抗人IL-17F(NBP2-21684，1：200)、兔抗人IL-17RC(NBP1-83112，1：200)，鼠抗人IL-6(NBP1-42846，1：600)，抗体均购于美国NOVUS Biologicals公司；兔抗人-stat3(MA1-13042，1：200)以及兔抗人 p-stat3(44-384G，1:400)购自Invitrogen公司；羊抗人IL-17RA(ab133416，1：400)购自中国香港Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的兔/鼠PV-9000和辣根过氧化物酶标记的羊 PV-9003二抗购自北京中杉金桥试剂有限公司；DAB显色试剂盒(K135222E)购自北京中杉金桥试剂有限公司；30％过氧化氢溶液购自武汉博士德公司；血清VEGF Elisa检测试剂盒 (BMS277/2TEN)、血清TGF-βElisa检测试剂盒(BMS249/4TEN)、IFN-γElisa检测试剂盒 (BMS228TEN)和血清MMP-9Elisa检测试剂盒(BMS2016/2TEN)均购于美国BIOSCIENCE 公司。
2、研究方法
2.1HE染色
所有组织标本采集后立即用10％甲醛磷酸盐缓冲溶液固定，石蜡包埋，切片为约4毫米厚的切片，52℃下干燥至少2小时，室温保存，二甲苯固定后梯度酒精(100％酒精5min，95％酒精5min，90％酒精5min，90％酒精5min，90％酒精5min，80％酒精5min，75％酒精5min， 70％酒精5min)脱蜡入水，苏木素染色10min，自来水冲洗，浸入0.5％盐酸乙醇中分化10s，冲洗后切片返蓝30s，自来水冲洗2～3min，浸入伊红染液中3min，自来水冲洗后分别使用梯度乙醇溶液(70％、80％、95％和100％)分别处理1min，二甲苯透明2min，封片后光学显微镜下观察。
2.2免疫组化染色
PBS配制：磷酸二氢钠14.2g，磷酸二氢钾2.7g，氯化钠80g，氯化钾2g，去离子水8000ml，用PH仪调溶液PH值为7.4，最后加去离子水至10000ml。
抗原修复液配方：
A液配制：21.01g柠檬酸加1000ml双蒸水，B液29.14g柠檬酸钠加1000ml双蒸水。
取A液810ml加B液190ml即可配成1000ml 0.1M ph 6.0的柠檬酸修复液用，PH仪调至PH值为6。
经切片经梯度酒精(100％酒精5min，95％酒精5min，90％酒精5min，90％酒精5min， 90％酒精5min，80％酒精5min，75％酒精5min，70％酒精5min)脱蜡入水，柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液内高温高亚进行抗原修复，PBS冲洗3次，每次5min，然后将切片与3％H2O2溶液封闭30min，以阻断内源性过氧化物酶。将预先确定最佳的稀释度抗体(IL-17A、IL-17E、IL-17RB、IL-17F、IL-17RC、IL-6、stat3)滴加到载玻片上(含5％血清PBS缓冲液)，4℃过夜，PBS洗涤切片3次，每次5min，洗涤后滴加辣根过氧化物酶PV-9000或PV-9003，37℃孵育1小时，PBS冲洗3次，每次5min，DAB溶液显色3-5min，当棕黄色阳性颗粒的染色强度高于背景时，放入自来水中终止反应，苏木素轻度复染，用自来水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。
2.3免疫组化染色阳性结果判断标准
由两位经验丰富的病理医师培训后进行双盲阅片。IL-17家族相关配体及受体、IL-6、stat3 和VEGF的阳性表达为细胞膜和(或)胞浆出现棕黄色颗粒。用Image-Pro Plus软件分析免疫组织化学染色图片的过程如下：拍摄样品照片、选取图片上目标区域(Areaof Interesting， AOI)、测量该区域的累计光密度值(Integrated Option Density，IOD)、选择并测量有效统计区域的面积、计算光密度平均值(IOD/area)、计算同一块组织上的各照片的平均值以及标准差、用统计学方法分析个实验组的光密度平均值之间是否有显著性差异。将拍好的照片用 Image-Pro Plus 9.1软件对染色阳性的部分进行客观的定量分析，以每组所拍照片的平均值作为量化后的数值。
2.3血清VEGF、TGF-β、IFN-γ、MMP-9水平检测
采集患者及健康志愿者空腹外周静脉血3mL，3000r/min离心10min，收集血清，酶联免疫吸附法检测血清血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β(TGF-β)、γ干扰素(IFN-γ)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)水平。Elisa的原理为：应用定性夹心免疫检测技术，用合成的抗原包被微孔板板条，将样品或标准品加入孔中并孵育，如果存在针对这些抗原的抗体，这些抗体就会与抗原结合，并固定在上面，洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后加入酶结合物，经第二次孵育后，酶结合物就会与第一次孵育结合上的抗体相结合，洗板除去未结合的酶结合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育时会发生酶-底物反应，只有那些含抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化，加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应，并在相应波长处测量OD值，进而计算标本中抗原的含量或浓度。Elisa试剂盒内包括：预包被板、酶标记抗体、标准品、EIA缓冲液、标记抗体稀释液、显色剂、终止液和浓缩洗涤液。
Elisa操作方法如下：
(1)包被：用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml稀释后的抗体溶液，4℃环境下过夜，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min。
(2)加样：加一定稀释的待检样品于上述已包被的孔中，置37℃孵育1小时。然后用洗涤缓冲液洗3次，每次3min。
(3)加酶标抗体：在各孔内加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min。
(4)加底物液显色：在各反应孔中加入现配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃孵育10～30min。
(5)终止反应：在各反应孔中加入2M终止反应液0.05ml。
(6)结果判定：在白色背景上，肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，初步判断靶标抗原的阳性。最后在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，根据公式计算各种靶标抗原的血清分泌水平。
2.4统计学分析
本研究数据使用SPSS 23.0处理，以均值±标准差表示，使用Mann-Whitney U检验法对两个未配对组之间进行比较，p<0.05做为差异有统计学意义的标准。
3、结果
3.1不同膀胱组织HE染色
膀胱壁由粘膜、粘膜下膜、肌膜和外膜组成。正常膀胱上皮组织中细胞成条索样规则排列，中央静脉及汇管区结构形态正常，细胞形态圆形，核位于中央，胞浆分染，形态正常；膀胱炎组织静脉扩张充血，细胞体积增大，胞浆淡染，疏松，个别发生嗜酸性变性；Ⅰ级膀胱癌其乳头表面被复的细胞为较正常的移性上皮，层次增多，细胞大小不一，核大深染，但极性无明显紊乱；而膀胱移行细胞癌Ⅱ级肿瘤呈乳头状、菜花状或斑块状，细胞异型性较明显，可见瘤巨细胞，甚至可侵犯肌层；膀胱移行细胞癌Ⅲ级：肿瘤呈菜花状或扁平斑块状，细胞异型性明显，瘤巨细胞多见，可见病理性核分裂，瘤细胞可侵及肌层深部，并可达邻近的器官。
膀胱组织典型的HE染色如图1所示。其中，A为膀胱炎组织(cystitis tissue)；B为膀胱癌组织(bladder cancer tissue)。
3.2膀胱炎和膀胱癌组织中IL-17A表达
Th17细胞主要分泌IL-17家族成员，因此本研究利用免疫组织化学染色法检测了IL-17A 的表达情况。
结果显示：IL-17A主要表达于单核细胞、移行上皮细胞、癌细胞和部分血管内皮细胞。膀胱炎、膀胱癌组织中IL-17A阳性表达率分别为4.18％±0.74％和16.44％±1.52％。膀胱癌组织中IL-17A阳性表达率明显高于膀胱炎，两者比较差异显著(p<0.01)。IL-17A典型的免疫组织化学染色结果见图2所示，其中，A为膀胱炎组织；B为膀胱癌组织；C为统计学分析结果。随着膀胱癌恶性度增加，IL-17A表达增强。
3.3膀胱炎和膀胱癌组织中IL-17RA表达
IL-17A的受体主要是IL-17RA，因此本研究利用免疫组织化学染色法检测了IL-17RA的表达情况，结果显示：IL-17RA阳性颗粒成棕黄色，主要表达于单核细胞、腺上皮细胞和癌细胞。其在膀胱炎和膀胱癌组织中阳性表达率分别为：13.29％±1.05％、和19.61％±1.69)％。 IL-17RA在膀胱癌组织的表达明显高于膀胱炎组织，两者比较差异显著(p<0.05)。
IL-17RA典型的免疫组织化学染色结果见图3所示，其中，A为膀胱炎组织；B为膀胱癌组织；C为统计学分析结果。随膀胱癌恶性度增加，IL-17RA的表达增强，与Ⅰ～Ⅱ期膀胱癌相比，IL-17A在Ⅲ～Ⅲ期膀胱癌的表达明显增强(p<0.05)。
3.4膀胱炎和膀胱癌组织中IL-17E表达
IL-17E也称IL-25，与哮喘、过敏性皮肤病及恶性肿瘤的发生密切相关。IL-17E主要表达单核细胞、血管内皮细胞和癌细胞。膀胱炎、膀胱癌组织中IL-17E阳性表达率分别为7.05％±0.96％和9.48％±1.04％，虽然膀胱癌组织中IL-17E阳性表达率高于膀胱炎组织，但两者之间统计学差异不显著(p>0.05)。
IL-17E典型的免疫组织化学染色结果见图4所示，其中，A为膀胱炎组织；B为膀胱癌组织；C为统计学分析结果。随膀胱癌恶性度增加，IL-17E的阳性表达率降低。
3.5膀胱炎和膀胱癌组织中IL-17RB表达情况
IL-17E既可以与IL-17RA结合，也可以与受体IL-17RB结合，因此本研究检测了IL-17RB 在膀胱炎及膀胱癌的表达差异。结果显示IL-17RB主要表达单核细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞和癌细胞。膀胱炎和膀胱癌组织中IL-17RB阳性表达率分别为8.13％±1.26％和 12.39％±1.51％，即膀胱癌组织中IL-17RB阳性表达高于膀胱炎组织，但两者之间比较差异差异并不显著(p>0.05)。IL-17RB典型的免疫组织化学染色结果见图5所示，其中，A为膀胱炎组织；B为膀胱癌组织；C为统计学分析结果。
3.6膀胱炎和膀胱癌组织中IL-17F表达情况分析
IL-17F主要表达于单核细胞，血管内皮细胞和癌细胞。膀胱炎和膀胱癌组织中IL-17F阳性表达率分别为9.60％±0.95)％和14.09％±1.16)％，膀胱癌组织中IL-17F阳性表达率明显高于膀胱炎组织，两者比较差异显著(p<0.05)。
IL-17F典型的免疫组织化学染色结果见图6所示，其中，A为膀胱炎组织；B为膀胱癌组织；C为统计学分析结果。随着膀胱癌恶性度增加，IL-17F的表达增强，与Ⅰ～Ⅱ期膀胱癌相比，Ⅲ～Ⅲ期膀胱癌组织IL-17F的表达明显增强(p<0.05)。
然而，在后续以重组蛋白进行细胞水平实验中，IL-17F并未表现出对癌细胞具有明显的促进增殖作用。
3.7膀胱炎和膀胱癌组织中IL-17RC表达
IL-17FA的受体IL-17RC主要表达于单核细胞，血管内皮细胞和癌细胞。其在膀胱炎和膀胱癌组织中的阳性表达率分别为6.40％±1.06％和9.37％±1.49％。膀胱癌组织中IL-17RC阳性表达率明显高于膀胱炎组织，两者比较差异显著(p<0.05)。
IL-1RC典型的免疫组织化学染色结果见图7所示，其中，A为膀胱炎组织；B为膀胱癌组织；C为统计学分析结果。随着膀胱癌恶性度增加，IL-17RC的表达增强(p<0.05)。
3.8膀胱炎和膀胱癌组织中IL-6表达情况
IL-17A的下游调节基因IL-6的表达产物IL-6蛋白主要表达血管内皮细胞、平滑肌细胞和癌细胞。在膀胱炎和膀胱癌组织中IL-6阳性表达率分别为38.49％±2.48)％和84.21％±6.92％。膀胱癌组织中IL-6阳性表达率明显高于膀胱炎组织，两者比较差异显著(p<0.01)。
IL-6典型的免疫组织化学染色结果见图8所示，其中，A为膀胱炎组织；B为膀胱癌组织；C为统计学分析结果。随着膀胱癌恶性度的增加，IL-6的表达增强，与Ⅰ～Ⅱ期膀胱癌组织相比，Ⅲ～Ⅲ期膀胱癌IL-6的表达明显增强(p<0.05)。
3.9膀胱炎和膀胱癌组织中Stat3表达
IL-6的下游基因Stat3的表达产物主要表达血管内皮细胞、癌细胞，少量表达移行上皮。在膀胱炎和膀胱癌组织中Stat3阳性表达率分别为9.74％±1.37％和42.39％±6.14％。膀胱癌组织中Stat3阳性表达率明显高于膀胱炎组织，两组比较差异显著(p<0.01)。
Stat3典型的免疫组织化学染色结果见图9所示，其中，A为膀胱炎组织；B为膀胱癌组织；C为统计学分析结果。
3.10不同恶性程度膀胱癌组织中Stat3表达情况分析
Ⅰ～Ⅱ期膀胱癌和Ⅲ～Ⅲ期膀胱癌组织Stat3阳性表达率分别为41.93％±3.85％和 81.40％±7.14％。Ⅲ～Ⅲ期膀胱癌组织Stat3阳性表达率明显高于Ⅰ～Ⅱ期，差异显著(p<0.01)。
Stat3典型的免疫组织化学染色结果见图9所示，其中，A为Ⅰ～Ⅱ期膀胱癌组织(Ⅰ～Ⅱ stage bladder cancer tissue)；B为Ⅲ～Ⅲ期膀胱癌组织(Ⅲ～Ⅲstage bladdercancer tissue)；C为统计学分析结果。
3.11膀胱癌患者和健康志愿者血清中VEGF、TGF-β、IFN-γ和MMP-9水平比较膀胱癌患者血清VEGF、TGF-β、MMP-9水平明显高于健康志愿者，差异有统计学差异 (p<0.01)；膀胱癌患者血清IFN-γ水平明显低于膀胱癌患者，差异具有统计学差异(p<0.05)，结果见表1。
表1 膀胱癌患者和健康体检的志愿者血清中VEGF、TGF-β、IFN-γ、MMP-9水平比较(pg/ml,)
3.12不同恶性程度膀胱癌患者血清中VEGF、TGF-β、IFN-γ、MMP-9水平比较
Ⅲ～Ⅲ期膀胱癌患者血清VEGF、TGF-β、MMP-9水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期膀胱癌患者，两组比较差异显著(p<0.01)；Ⅲ～Ⅲ期膀胱癌患者血清IFN-γ水平明显低于Ⅰ～Ⅱ期膀胱癌患者，两组比较差异显著(p<0.05)，结果见表2。
表2 不同恶性程度膀胱癌患者血清中VEGF、TGF-β、IFN-γ和MMP-9水平比较 (pg/ml,)
上述结果显示，膀胱癌组织IL-17A、IL-17F、IL-6和stat3高表达，且随癌恶性度增加而增加，而膀胱癌患者血清中VEGF、TGF-β和MMP-9分泌明显高于正常志愿者，且随膀胱癌恶性度的增加而增加，因而推测IL-17A或IL-17F通过IL-6途径介导膀胱癌的发生发展。因此本研究利用IL-17A或IL-17F重组蛋白干扰膀胱癌细胞，体外观察其对癌细胞的增殖或凋亡作用，并探讨相关机制，为膀胱癌的靶向治疗提供理论依据。
二、IL-17调控Stat3信号通路对膀胱癌细胞增殖影响及机制研究。
1、材料与方法
1.1材料与试剂
人膀胱移型细胞癌T24细胞来自美国ATCC公司；胎牛血清、DMEM培养基购于美国Gibco公司；兔抗人-stat3(MA1-13042，1：200)以及兔抗人p-stat3(44-384G，1:400)购自Invitrogen公司；IL-17A重组蛋白购自Abcom公司；鼠抗人IL-6、IL-6R单克隆抗体，兔抗人JAK1、p-JAK1、Stat3、p-Stat3多克隆抗体，均购自Invitrogen公司；FITC/PI购自上海前尘生物科技有限公司；试剂Trizol溶液购自invitrogen公司；EPC处理水和SYBR Green PCR试剂盒购自Termo公司，细胞计数试剂盒-8来自美国Glpbio公司；异丙醇、无水乙醇和氯仿等购自国药集团；丙烯酰胺、N，N’-亚甲双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、TEMED、甘油、溴酚蓝、巯基乙醇、甲醇、脱脂奶粉、Tween20、BCIP和NBT均为国产分析纯试剂。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养
T24细胞放于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃5％CO2浓度的培养箱中孵育，0.25％的胰蛋白酶消化传代，收集对数生长期细胞进行实验。
1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖能力
将T24细胞消化计数后，接种于无胎牛血清的DMEM培养基中，分别加入不同浓度的IL-17A重组蛋白(0ng/ml、1ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)，设置5个平行复孔，分别培养24h、48h、72h、96h时，滴加CCK-8溶液10μL/孔反应2h，上酶标仪读取450nm波长处各孔的吸光度。CCK-8实验的步骤为：
(1)将T24细胞以104-105个细胞/孔的密度在96孔板中，在100μL培养基中培养，将细胞在CO2培养箱中于37℃培养24小时。
(2)将10μl不同浓度的待测物质加入板中。
(3)将培养板在培养箱中孵育适当的时间(24、48、72和96小时)。
(4)每个孔中加入10μl CCK-8溶液
(5)将培养板在培养箱中孵育1-4小时。
(6)振动器上轻轻混合1分钟，使用酶标仪测量450nm处的吸光度。
1.2.3 Transwell细胞迁移实验
制备T24细胞悬液，将4×105个细胞接种于Transwell小室的上室，设含50ng/mlIL-17A 的无胎牛血清的DMEM培养基为观察组，对照组向Transwell小室的上室中加入无胎牛血清的DMEM培养基；给药组和对照组Transwell小室的下室中均加入含25％胎牛血清的DMEM 培养基，37℃5％CO2浓度的培养箱中孵育24h，取出小室，4％多聚甲醛固定30min，0.1％结晶紫染色10min，光学显微镜下随机选取10个视野，计数迁移细胞数。
1.2.4 IL-17A重组蛋白对细胞凋亡的影响
置空白对照组、IL-17A(1ng/ml)处理组、IL-17A(50ng/ml)处理组、IL-17A(100ng/ml) 处理组。取对数生长期T24细胞，1×106个/孔接种于6孔板中，4℃过夜，弃去上清，向各组培养孔中加入对应浓度的IL-17A，空白对照组不加IL-17A，37℃5％CO2浓度的培养箱中孵育48h，磷酸缓冲液洗涤3次，按试剂盒说明书加入Annexin V FITC/PI试剂，暗室中反应30min，滴加400μl Binding Buffer，混合均匀，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.2.5 RT-PCR检测
将T24细胞消化计数后，以相同细胞数量接种4个培养瓶中，向10％胎牛血清的DMEM 培养基分别加入浓度为0ng/ml、1ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的IL-17A重组蛋白，37℃5％CO2浓度的培养箱中孵育48h弃去培养液，收集细胞，Trizol法提取细胞总RNA。
收集与IL-17A重组蛋白孵育后的细胞内加入相应剂量的Trizol，室温孵育5min，注射器反复抽吸，细胞充分裂解并剪切RNA；4℃低温下12000g离心5min，弃沉淀；加入200-300μl 氯仿，剧烈振荡15～30s，室温孵育2～3min；4℃低温下12000g离心15min；吸取上层水相到另一离心管内。同时保留下层混合物(置于4℃冰箱)，以备提取DNA；向上清液中加入异丙醇500μl，室温孵育10min；4℃低温下12000g离心10min，小心弃上清液，RNA沉于离心管的管底；加入75％乙醇1ml，充分混匀，4℃低温下12000g离心5min；弃上清，干燥后加入适量的DEPC水完全溶解RNA，取1μl RNA加入DEPC水99μl(100倍稀释)，利用紫外分光光度计测OD260及OD280。
计算OD260/OD280的比值，当两者比值接近1.8～2.0进行逆转录。
RNA定量：RNA浓度(μg/ml)＝OD260×40×100
取10μg总RNA加DEPC水至13.5μl，加入oligo-dT(1μg/μl)1.5μl，65℃水中孵育10min，立即置于冰上；再加入DEPC水21.5μl、5×逆转录缓冲液10μl、dNTP(10mmol/L)2.5μl、 MMLV(200u/μl)1μl；38℃水浴1h，70℃水浴10min，立即将Effend管置于冰上；再加入 50μl TE缓冲液，冷冻备用。IL-6、IL-6R、JAK1、p-JAK1、Stat3、p-Stat3、β-actin引物序列由上海启因生物科技有限公司设计合成。目的基因的引物序列为：
IL-6上游：5′-GTCTGCCTTCAAGAACCACATCCA-3′，(SEQ.ID.No.1)
下游：5′-TCTAACTACGCCATAT GCTC-3′；(SEQ.ID.No.2)
IL-6R上游：5′-GAGTTAGGTCCACGGACTACGGTCT-3′，(SEQ.ID.No.3)
下游：5′-TCAC TATACCCCCAATCCTATC-3′；(SEQ.ID.No.4)
JAK1上游：5′-TCACTAAACCCCTTCATCTCG-3′，(SEQ.ID.No.5)
下游：5′-TCACTCACTGGACGAAAACCC-3′；(SEQ.ID.No.6)
p-JAK1上游：5′-GTGGTTTGCAC CGAACGGTCGGG-3′；(SEQ.ID.No.7)
下游：5′-GGAGACTGTGTACGTCGAGGGCC-3′；(SEQ.ID.No.8)
β-actin上游：5′-AGCATCTACCCGTGTCACACCCACT-3′，(SEQ.ID.No.9)
下游：5′-GGTAACCGTT ACTCGCCAAGGCGAC-3′。(SEQ.ID.No.10)
PCR的反应条件：94℃5min，94℃30s，56℃30s，共40个循环，延伸72℃30s。扩增产物行2％琼脂糖凝胶电泳，计算IL-6、IL-6R、JAK1、p-JAK1、Stat3、p-Stat3 mRNA的相对表达量。
1.2.6 Western blot检测
将T24细胞消化计数后，以相同细胞数量接种至4个培养瓶中，向无胎牛血清的DMEM 培养基分别加入浓度为0ng/ml、1ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的IL-17A重组蛋白，37℃5％CO2 浓度的培养箱中孵育6h，弃去培养液，收集对照组及共孵育组细胞，PBS充分洗涤2次，加入150ul超声裂解缓冲液(50mM NaH2PO4,10mM Tris-HCl,250mM NaCl,PMSF 1μg/ml,Aprotitin 2μg/ml,pH8.0)，超声反复裂解，2 000rpm 4℃，低温条件下离心40min，上清即为总蛋白提取液。将牛血清白蛋白配制成0μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、375μg/ml和500μg/ml 不同的浓度，不同浓度的BSA的OD595值，计算蛋白含量与OD595值的回归曲线公式。将与不同IL-17A重组蛋白孵育后并提取的蛋白适当稀释，取40μl，加入2ml 5倍稀释的BIORAD蛋白质，检测OD595值，计算样本的蛋白浓度。
取蛋白40μg蛋白加入等体积的5×上样缓冲液。将样品置于100℃沸水中热变性5min，按前述分组顺序加样，样品第一孔加蛋白markers。75v 30min，150v 60min衡压电泳，直至溴酚蓝接近分离胶底部时，关闭电源。行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜至PVDF，5％脱脂奶粉封闭2h，摇床上TBST洗膜10min×3，鼠抗人IL-6单克隆抗体(1:200稀释)，鼠抗人IL-6R 单克隆抗体(1:500稀释)，兔抗人JAK1、p-JAK1多克隆抗体(1:500稀释)，兔抗人Stat3、 p-Stat3多克隆抗体(1:1000稀释)，鼠抗人β-actin单克隆抗体(1:1000稀释)，4℃过夜，TBST洗膜10min×3；滴加HRP标记的鼠抗人IgG、兔抗人IgG，均为1:2000稀释，室温孵育60min，TBST洗膜10min×3；再用TBS洗膜5min。暗室中显影、采集图像并分析各条带灰度值。
1.3统计学分析
本研究数据使用SPSS 23.0处理，以均值±标准差表示，组间差异用方差分析，P<0.05做为差异有统计学意义的标准。
2、结果。
2.1不同浓度IL-17A重组蛋白对T24细胞增殖能力的影响
本研究用CCK-8法检测IL-17A重组蛋白对膀胱癌细胞增殖作用。结果显示：不同浓度 IL-17A重组蛋白与T24细胞共孵育，T24细胞的增殖水平均随培养时间的延长而增加，表现出明显的时间及剂量依赖关系。其中IL-17A重组蛋白浓度50ng/ml、100ng/ml的细胞增殖水平明显高于0ng/ml、1ng/ml，差异显著(p<0.05)；IL-17A重组蛋白浓度50ng/ml与100ng/ml 的细胞增殖水平之间差异无统计学意义(p>0.05)；IL-17A重组蛋白浓度1ng/ml与0ng/ml的细胞增殖水平之间差异无统计学差异(p>0.05)。结果见表3。
表3 不同浓度IL-17A重组蛋白刺激对T24细胞增殖能力的影响 (OD，)
注：与IL-17A重组蛋白0ng/ml相比，a p<0.05；与IL-17A重组蛋白1ng/ml相比，b p<0.05
Note:Compared with IL-17A recombinant protein 0ng/ml,a p<0.05；compared with IL-17A recombinant protein 1ng/ml,b p<0.05
2.2 IL-17A重组蛋白对T24细胞迁移能力的影响
为了检测IL-17A重组蛋白对膀胱癌细胞侵袭能力，本研究利用Transwell小室检测细胞在不同浓度的血清培养液中转移能力。结果显示IL-17A重组蛋白浓度100ng/ml和0ng/ml时细胞穿过Transwell小室底的细胞数分别为(128.50±7.26)个/(mm2)、(49.71±3.93)个/(mm2)； IL-17A重组蛋白组处理组癌细胞的迁移能力明显高于对照组(p<0.05)。Transwell小室上、上的细胞经结晶紫染色后，典型的细胞形态见图11所示，其中，A～C为对照组(0ng/ml)； D～F为IL-17A重组蛋白处理组(100ng/ml)。
2.3 IL-17A重组蛋白对T24细胞凋亡能力的影响
为了检测IL-17A重组蛋白对膀胱癌细胞的凋亡抑制能力，本研究用流式细胞术检测了IL-17A重组蛋白在浓度50ng/ml和100ng/ml时对细胞凋亡的作用。
结果显示：IL-17A重组蛋白在浓度50ng/ml和100ng/ml时，细胞凋亡率明显低于0ng/ml 和1ng/ml，差异显著(p<0.05)；但IL-17A重组蛋白浓度50ng/ml与100ng/ml的细胞凋亡率之间差异不明显(p>0.05)；IL-17A重组蛋白浓度1ng/ml与0ng/ml的细胞凋亡率之间差异不明显(p>0.05)。结果如图12和表4所示。其中，图12中，A为L-17A重组蛋白浓度为0ng/ml 的A组，B为L-17A重组蛋白浓度为1ng/ml的B组，C为L-17A重组蛋白浓度为50ng/ml 的C组，C为L-17A重组蛋白浓度为100ng/ml的D组。
表4 不同IL-17A重组蛋白刺激对T24细胞凋亡率的影响
注：与IL-17A重组蛋白0ng/ml相比，a p<0.05；与IL-17A重组蛋白1ng/ml相比，b p<0.05
Compared with IL-17A recombinant protein 0ng/ml,a p<0.05；comparedwith IL-17A recombinant protein 1ng/ml,b p<0.05
2.4不同浓度IL-17A重组蛋白对T24细胞IL-6、IL-6R、JAK1、p-JAK1、Stat3和p-Stat3 mRNA表达的影响
为了探讨IL-17A重组蛋白对膀胱癌细胞促增殖抑制抑制细胞凋亡效应，本研究应用 RT-PCR法检测了IL-17A重组蛋白对细胞增殖及凋亡相关基因的影响。
结果显示：随着IL-17A重组蛋白浓度的增加，T24细胞IL-6、IL-6R、p-JAK1、p-STAT3 mRNA的表达量相对增加，其中L-17A重组蛋白50ng/ml和100ng/ml浓度时，细胞IL-6、IL-6R、 p-JAK1、p-Stat3 mRNA相对表达量明显高于0ng/ml对照组，差异明显统计学差异(p<0.05)； 100ng/ml IL-17A重组蛋白与50ng/ml组IL-6、IL-6R、p-JAK1、p-Stat3 mRNA相对表达量差异不明显(p>0.05)。IL-17A重组蛋白对相关基因表达见表5。
表5 不同浓度IL-17A重组蛋白对T24细胞IL-6,IL-6R,JAK1,p-JAK1,Stat3 andp-Stat3 mRNA 表达比较/>
注：与IL-17A重组蛋白0ng/ml相比，a p<0.05；与IL-17A重组蛋白1ng/ml相比，b p<0.05
2.5不同浓度IL-17A重组蛋白刺激对T24细胞IL-6、IL-6R、JAK1、p-JAK1、Stat3、p-Stat3 蛋白表达的影响
为了探讨IL-17A重组蛋白对膀胱癌细胞促增殖、抑制细胞凋亡效应及相关机制，本研究应用Western blot法检测了IL-17A重组蛋白对细胞增殖及凋亡相关蛋白的影响。
结果显示：随着IL-17A重组蛋白浓度的增加，T24细胞IL-6、IL-6R、p-JAK1、p-Stat3蛋白的相对表达量逐渐增加，其中L-17A重组蛋白50ng/ml、100ng/ml浓度组的IL-6、IL-6R、 p-JAK1、p-Stat3蛋白相对表达量明显高于0ng/ml浓度组，差异明显(p<0.05)；100ng/ml浓度组L-6、IL-6R、p-JAK1、p-Stat3蛋白相对表达量明显高于50ng/ml浓度组(p<0.05)；JAK1、 Stat3蛋白相对表达量在各浓度组之间无明显统计学差异(p>0.05)。结果如图13和下表6所示。图13中，1为0ng/ml IL-17A重组蛋白；2为1ng/ml IL-17A重组蛋白；3为50ng/ml IL-17A 重组蛋白；4为100ng/ml IL-17A重组蛋白。
表6 不同浓度IL-17A重组蛋白刺激对T24细胞IL-6、IL-6R、JAK1、p-JAK1、Stat3、p-Stat3 蛋白相对表达量比较
注：与IL-17A重组蛋白0ng/ml相比，a p<0.05；与IL-17A重组蛋白1ng/ml相比，b p<0.05
本研究显示，随着IL-17A重组蛋白浓度的增加，细胞增殖明显，并表现为时间及剂量的依赖性，说明IL-17A重组蛋白具有促进膀胱癌细胞增殖的效应；利用流式细胞术及transwell 小室实验发现：IL-17A重组蛋白高剂量组细胞的凋亡明显减少，但细胞侵袭作用明显，结合 CCK-8实验结果说明IL-17A重组蛋白的抗凋亡效应及促进癌细胞转移侵袭的能力。
为了探讨IL-17A重组蛋白对膀胱癌细胞促增殖及抗凋亡的相关机制，本研究利用RT-PCR及Western法检测了IL-17A下游相关基因和蛋白的表达变化，结果显示IL-17A重组蛋白处理组，其下游相关基因IL-6、IL-6R、p-JAK1和p-Stat3表达水平明显增加，提示人膀胱癌T24细胞中IL-17能够介导IL-6、IL-6R高表达，结合前期研究可推测IL-17A在人膀胱癌细胞中可通过诱导IL-6高表达激活蛋白激酶B信号传导因子，进而活化JAK1/Stat3信号通路。
JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由多细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等诸多功能。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分构成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。JAK属于细胞内非受体酪氨酸激酶家族，包括JAK1、JAK2、和JAK3三种亚型。而JAK1在3种亚型中对恶性肿瘤发生、发展促进作用最明显，在肝癌、白血病等多种恶性肿瘤中均存在高表达。
本研究中IL-17A重组蛋白处理人膀胱癌T24细胞后JAK1活化为p-JAK1，引发Stat3磷酸化，活化后的Stat3进入细胞核，与DNA结合后影响基因表达。随着IL-17A重组蛋白浓度的增加，人膀胱癌T24细胞中亦存在p-JAK1、p-Stat3表达上调。IL-17A重组蛋白浓度 50ng/ml、100ng/ml的细胞增殖水平明显高于0ng/ml、1ng/ml，提示人膀胱癌T24细胞中IL-17A 表达上调可提升细胞增殖水平。经50ng/ml IL-17A重组蛋白处理后，治疗组膀胱癌细胞迁移和侵袭细胞数明显高于未经IL-17A重组处理的对照组，提示人膀胱癌T24细胞中IL-17A可促进人膀胱癌细胞的迁移和侵袭。IL-17A重组蛋白浓度50ng/ml和100ng/ml的细胞凋亡率明显低于0ng/ml和1ng/ml，也从侧面验证了IL-17A细胞因子抑制细胞凋亡的作用。
IL-17A具有促进膀胱癌细胞增殖效应，一定程度抑制膀胱癌细胞凋亡，其发生的机制与 IL-17A诱导IL-6活化，进而激活JAK/Stat3通路激活有关。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 北华大学
<120> IL-17A蛋白在膀胱癌中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtctgccttc aagaaccaca tcca 24
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctaactacg ccatatgctc 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagttaggtc cacggactac ggtct 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcactatacc cccaatccta tc 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcactaaacc ccttcatctc g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcactcactg gacgaaaacc c 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
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<400> 7
gtggtttgca ccgaacggtc ggg 23
<210> 8
<211> 23
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ggagactgtg tacgtcgagg gcc 23
<210> 9
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agcatctacc cgtgtcacac ccact 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggtaaccgtt actcgccaag gcgac 25

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1.一种IL-17A蛋白在膀胱癌细胞模型中作为促进细胞增殖促进剂中的应用，所述膀胱癌细胞为人体膀胱癌T24细胞，包括以下方法：将IL-17A重组蛋白与T24细胞共孵育，所述IL-17A重组蛋白浓度为50ng/ml或100ng/ml；所述IL-17A蛋白通过激活IL-6-Stat3通路促进膀胱癌细胞增殖。
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Increase expression of IL-17A, IL6, STAT3, TGF-β and VEGF in Bladder Cancer: potential biomarkers?;Yanbo Liu 等;《research square》;20200402 *

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