JP2024516098A - Ｂｃｍａを標的とする多重特異性抗体 - Google Patents
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Abstract
ＢＣＭＡを標的とする多重特異性抗体を提供する。具体的には、多重特異性抗体、これらをコードする核酸、当該核酸を含むベクター、当該ベクターを含む細胞、これらを含む医薬組成物を提供し、さらに、ＢＣＭＡ発現に関連する疾患を持つ被験者を治療するためのこれらの使用を提供する。
Description
本発明は多重特異性抗体、特にＢＣＭＡを標的とする多重特異性抗体に関する。
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー１７（ＴＮＦＲＳ１７）としても知られ、ヒトのＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子によってコードされるタンパク質である。
ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬはＢＣＭＡのリガンドである。そのうち、ＢＡＦＦ（ＢＬｙＳ、ＴＡＬＬ－１、ＴＨＡＮＫ、ｚＴＮＦ４、ＴＮＦＳＦ２０、Ｄ８Ｅｒｔｄ３８７ｅとも呼ばれる。）はＢＣＭＡの高親和性リガンドであり、ＡＰＲＩＬ（増殖誘導リガンドで、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＡＬＬ－２、ＴＲＤＬ－１とも呼ばれる。）はＢＣＭＡの低親和性リガンドである。さらに、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬは、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであるＢ細胞活性化因子受容体（Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＢＡＦＦ－Ｒ）、膜貫通活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用因子（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ａｎｄ ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ；ＴＡＣＩ）のリガンドでもある。ＢＣＭＡはＢＡＦＦ－Ｒ、ＴＡＣＩとともに、Ｂ細胞の増殖、生存、成熟及び分化を制御する。
多発性骨髄腫は悪性の形質細胞疾患である。多発性骨髄腫細胞では、ＢＣＭＡの発現レベルが著しく増加する。ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫に対する免疫療法剤の適切な腫瘍抗原標的となり得る。ＢＣＭＡ結合抗体などの免疫療法剤は、ＢＣＭＡとその天然リガンドであるＢＡＦＦ又は／及びＡＰＲＩＬとの結合を遮断することができる。
ラクダ科動物のＩｇＧ抗体には、軽鎖及び重鎖を含む従来の４本鎖抗体ＩｇＧ１に加え、軽鎖を含まない重鎖のみの抗体（ＨｃＡｂ）ＩｇＧ２及びＩｇＧ３も天然に存在する。重鎖のみの抗体における単一可変領域ドメイン（ＶＨＨ又は単一可変ドメイン）は、抗原に特異的に結合するという特徴を有するとともに、抗原に対する高い親和性を有する。この特性から、ＶＨＨドメインを単独で、または大きな抗原結合分子の一部分として使用する場合、従来のｓｃＦｖ、抗体フラグメントＦａｂなどと比較して著しい利点があり、例えば、抗原に対して高い親和性で特異的に結合するために必要なドメインが１つだけであること、多価や多重特異性の形態に変換可能であること、ＶＨＨドメインの可溶性が高く、凝集する傾向がないこと、分子が小さいため高い組織透過性を示すこと、単一ドメインの抗体であり軽鎖との対合が不要であること、多重特異性抗体を形成するときに軽鎖と重鎖の誤対合がないことなどの利点が挙げられる。
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）及びＴ細胞ＣＤ３受容体を標的とする多重特異性抗体は、ＣＤ３発現Ｔ細胞をＢＣＭＡ発現骨髄腫細胞にリダイレクトすることで、標的細胞に対する細胞毒性を誘導することができる。
潜在的な治療標的として、ＢＣＭＡを標的とする抗体は開発されているが、まだ十分ではなく、より多くの利用可能な選択肢が求められている。
本発明は、ＢＣＭＡを標的とする抗体、特に、ＢＣＭＡと、ＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原とを標的とする多重特異性抗体を提供する。本発明はさらに、提供する抗体をコード可能な核酸、ベクター、細胞、組成物、製造方法及び使用を提供する。
一側面において、本発明は、
（ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）第１の抗原に結合する第３の抗原結合部分とを含む多重特異性抗体であって、
前記第１の抗原はＢＣＭＡであり、前記第２の抗原はＴ細胞活性化抗原であり、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、単一可変ドメインであって、それぞれ独立して、
（ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（ｄ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のうちのいずれか１つを含む、多重特異性抗体を提供する。
（ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）第１の抗原に結合する第３の抗原結合部分とを含む多重特異性抗体であって、
前記第１の抗原はＢＣＭＡであり、前記第２の抗原はＴ細胞活性化抗原であり、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、単一可変ドメインであって、それぞれ独立して、
（ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（ｄ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のうちのいずれか１つを含む、多重特異性抗体を提供する。
いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、それぞれ独立して、
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のうちのいずれか１つを含む。
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のうちのいずれか１つを含む。
いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、及び、前記第３の抗原結合部分は、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。さらに、いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含み、前記第３の抗原結合部分は、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含み、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態において、前記第３の抗原結合部分は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、及び、前記第１の抗原結合部分は、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。さらに、いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含み、前記第３の抗原結合部分は、配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含み、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分と第３の抗原結合部分は、ＢＣＭＡの異なるエピトープに結合する。
前記第２の抗原結合部分は、Ｔ細胞活性化抗原に結合する能力をもたらす。いくつかの実施形態において、前記第２の抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域として、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。より具体的な実施形態において、前記第２の抗原結合部分の重鎖可変領域は、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、その軽鎖可変領域は、配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記多重特異性抗体はさらに、２つのＦｃポリペプチドで構成されるＦｃ領域を含む。
いくつかの実施形態において、多重特異性抗体において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、前記第３の抗原結合部分は、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、及び、前記第２の抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域として、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。より具体的な実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含み、前記第３の抗原結合部分は、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部分の重鎖可変領域は、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含み、その軽鎖可変領域は、配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む。より具体的な実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含み、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部分の重鎖可変領域は、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含み、その軽鎖可変領域は、配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態において、選択可能な一構成形態として、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、単一可変ドメインであり、前記第２の抗原結合部分はＳｃＦｖであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第２の抗原結合部分のＮ末端に融合される。より具体的な実施形態において、多重特異性抗体は２本のポリペプチド鎖で構成され、そのうち、第１のポリペプチド鎖は、上記の第１の抗原結合部分及びＦｃ領域における一方のＦｃポリペプチドを含有し、第２のポリペプチド鎖は、上記の第２の抗原結合部分、第３の抗原結合部分及びＦｃ領域における他方のＦｃポリペプチドを含有する。
別の実施形態において、多重特異性抗体において、前記第３の抗原結合部分は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、前記第１の抗原結合部分は、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、及び、前記第２の抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域として、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。より具体的な実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含み、前記第３の抗原結合部分は、配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部分の重鎖可変領域は、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含み、その軽鎖可変領域は、配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む。より具体的な実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含み、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部分の重鎖可変領域は、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含み、その軽鎖可変領域は、配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む。これらの実施形態において、選択可能な一構成形態として、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、単一可変ドメインであり、前記第２の抗原結合部分はＦａｂであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第１の抗原結合部分のＮ末端に融合される。この実施形態について、より具体的には、多重特異性抗体は３本のポリペプチド鎖で構成され、そのうち、第１のポリペプチド鎖は、上記の第１の抗原結合部分、第３の抗原結合部分及びＦｃ領域における一方のＦｃポリペプチドを含有し、第２のポリペプチド鎖は、上記第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖及びＦｃ領域における他方のＦｃポリペプチドを含有し、第３のポリペプチド鎖は上記第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖である。別の選択可能な構成形態として、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、単一可変ドメインであり、前記第２の抗原結合部分はＳｃＦｖであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第１の抗原結合部分のＮ末端に融合される。この実施形態について、より具体的には、多重特異性抗体は２本のポリペプチド鎖で構成され、そのうち、第１のポリペプチド鎖は、上記の第１の抗原結合部分、第３の抗原結合部分及びＦｃ領域における一方のＦｃポリペプチドを含有し、第２のポリペプチド鎖は、上記第２の抗原結合部分及びＦｃ領域における他方のＦｃポリペプチドを含有する。別の選択可能な構成形態として、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、単一可変ドメインであり、前記第２の抗原結合部分はＦａｂであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合される。この実施形態について、より具体的には、多重特異性抗体は３本のポリペプチド鎖で構成され、そのうち、第１のポリペプチド鎖は、上記の第１の抗原結合部分及びＦｃ領域における一方のＦｃポリペプチドを含有し、第２のポリペプチド鎖は、上記第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖及びＦｃ領域における他方のＦｃポリペプチドを含有し、第３のポリペプチド鎖は、上記の第３の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を含有する。
一側面において、本発明は、上記多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸を提供する。
一側面において、本発明は、本発明による核酸を含むベクターを提供する。
一側面において、本発明は、本発明による核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。
別の側面において、本発明は、上記宿主細胞を培養して上記多重特異性抗体を発現させ、上記多重特異性抗体を系から単離・精製することを含む、本発明による多重特異性抗体の製造方法を提供する。
別の側面において、本発明は、上記多重特異性抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
別の側面において、本発明は、ＢＣＭＡ発現に関連する疾患の治療薬を製造するための上記多重特異性抗体又は上記医薬組成物の使用を提供する。
別の側面において、本発明は、被験者に治療有効量の上記多重特異性抗体又は上記医薬組成物を投与することを含む、被験者におけるＢＣＭＡ発現に関連する疾患を治療するための方法を提供する。
他の側面において、本発明は、
（１）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（４）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
を含む単一可変ドメインを含むＢＣＭＡ結合抗体を提供する。
（１）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（４）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
を含む単一可変ドメインを含むＢＣＭＡ結合抗体を提供する。
いくつかの実施形態において、前記単一可変ドメインは、配列番号４１又は４２で表されるアミノ酸配列を含むが、配列番号２１又は２３で表されるアミノ酸配列を含まない。
本発明は、ＢＣＭＡと、ＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原とを標的とする多重特異性抗体を提供する。いくつかの形態において、特定の単一可変ドメインを用いて様々な形態の多重特異性抗体を構築した結果、それらはいずれも、腫瘍細胞溶解性や安全性などの良好な抗腫瘍効果を示した。
［用語］
「抗体」という用語は、抗原結合部位を含むタンパク質を指し、様々な構造の天然抗体及び人工抗体を含み、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体など）、一本鎖抗体などを例示できるが、これらに限定されない。
「抗体」という用語は、抗原結合部位を含むタンパク質を指し、様々な構造の天然抗体及び人工抗体を含み、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体など）、一本鎖抗体などを例示できるが、これらに限定されない。
「多重特異性」という用語は、抗体が、複数の異なる抗原決定基に特異的に結合でき、例えば、２つ以上の異なる抗原決定基に特異的に結合できることを意味する。通常、二重特異性抗体は、各々が異なる抗原決定基に対して特異的である２つの抗原結合部位を含む。異なる抗原決定基は、同じ細胞上又は異なる細胞上に発現することができる。異なる抗原決定基は、抗原の種類によって異なってもよく（例えば、抗原ＣＤ３、ＢＣＭＡに結合するもの）、同じ抗原上に存在してもよい。抗原決定基は、抗原物質分子の表面や他の部分にある、特定の組成及び構造を有する特殊な化学基であり、対応する抗体又は感作リンパ球と特異的に結合できる構造である。抗原決定基の一例として、抗原性物質であるＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、構造確認済又は構造不明の様々な抗原決定基を有する。本明細書において、抗原上の２つ以上の異なる抗原決定基に結合可能な抗体であれば、多重特異性抗体と呼ばれる。
「Ｎ価抗体」という用語は、抗体にＮ個の抗原結合部位があることを意味する。例えば、「二価抗体」とは、抗体に抗原結合部位が２つあることを意味し、「三価抗体」とは、抗体に抗原結合部位が３つあることを意味する。天然のヒト免疫グロブリン分子は通常、２つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂは通常、１つの抗原結合部位を有する。単一可変ドメイン、ＳｃＦｖは通常、１つの抗原結合部位を有する。
「抗原結合部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を意味する。具体的な抗原結合部分は、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ又は単一可変ドメインであり得る。本明細書における抗原決定基及びエピトープと同義である。
「Ｔ細胞活性化抗原」という用語は、抗体と相互作用すると、Ｔ細胞活性化を誘導し得る、細胞傷害性Ｔリンパ球などのＴリンパ球の表面に発現する抗原を指す。例えば、抗体とＴ細胞活性化抗原の相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを誘発することにより、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。一実施形態において、前記Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３であり、例えば、ＣＤ３のε鎖である。
「Ｔ細胞活性化」という用語は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、活性化マーカーの発現から選択される、細胞傷害性Ｔリンパ球などのＴリンパ球の１つ以上の細胞性応答を指す。本発明の多重特異性抗体はＴ細胞活性化を誘導することができる。Ｔ細胞活性化を測定するための好適な方法は、当分野で公知であり、本明細書にも記載がある。
本発明において、抗原結合部分、抗原、Ｆｃポリペプチド、ペプチドリンカー、ポリペプチド鎖等に関する「第１の」、「第２の」又は「第３の」という用語は、１つ以上の各型の部分が存在する場合、区別を便利にするために用いられる。これらの用語の使用は、明白に記述されない限り、多重特異性抗体の具体的順序又は方向を付与するようには意図されない。
「融合される」という用語は、成分（例えば、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、Ｆｃポリペプチド等）が直接、又は１つ以上のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって連結されることを意味する。
「可変ドメイン」又は「可変領域」という用語は、抗体における当該抗体と抗原との結合に関与するドメインを指す。例えば、天然の４本鎖抗体（例えば、ヒト、鼠などに由来するもの）は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し、ラクダ科やサメなどの動物に由来する重鎖のみの抗体は、単一可変ドメインを有する。天然抗体の各可変ドメインは、一般的に、４つの「フレームワーク領域」と、３つの「相補性決定領域」とから構成される。４つのフレームワーク領域はそれぞれ、フレームワーク領域１（又はＦＲ１）、フレームワーク領域２（又はＦＲ２）、フレームワーク領域３（又はＦＲ３）、及びフレームワーク領域４（又はＦＲ４）と呼ばれる。前記フレームワーク領域は、当分野及び後述においてそれぞれ相補性決定領域１（又はＣＤＲ１）、相補性決定領域２（又はＣＤＲ２）、及び相補性決定領域３（又はＣＤＲ３）と呼ばれる３つの相補性決定領域（又はＣＤＲ）により分離されている。したがって、可変ドメインの一般的な構造は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４で表すことができる。可変ドメインは、抗原結合部位を有することで、抗原に対する特異性を抗体に付与する。
「単一可変ドメイン」という用語は、別の可変ドメインと対合せずに、エピトープに特異的に結合できる可変ドメインを指す。単一可変ドメインは通常、１つのドメインに存在する３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を有する。場合によっては、単一の抗原結合単位（すなわち、実質的に単一可変ドメインからなる機能的抗原結合単位）を形成できる限り（この場合、単一抗原結合ドメインは、別の可変ドメインと相互作用することなく、機能的抗原結合単位を形成できる）、単一可変ドメインは重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨ）であってもよい。単一可変ドメインの別の実例はラクダ科の「ＶＨＨドメイン」（又は「ＶＨＨ」若しくは「ＶＨＨ」と略称する。）である。
「ＣＤＲ」（相補性決定領域）は、「超可変領域（ＨＶＲ）」とも呼ばれ、一般に、配列が高頻度で変わる、及び／又は構造的に規定されたループを形成する抗体可変領域のそれぞれの領域を指す。天然の４本鎖抗体は一般に、６つのＣＤＲ；重鎖可変領域において３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、軽鎖可変領域において（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）３つを含む。重鎖のみの抗体又は単一可変ドメインは一般に、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を有する。
ＣＤＲを定義して分類する方法は複数報告されている。そのうち、Ｋａｂａｔの定義は、配列の可変性に基づいてＣＤＲを分類するものであり、最も多く使用されている（Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造ループの位置に基づいている（Ｃｙｒｕｓ Ｃｈｏｔｈｉａ， ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ， Ｊ ．Ｍｏｌ ．Ｂｉｏｌ ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。ＡｂＭの定義は、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義を折衷したものであり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体構造モデリング用ソフトウェアに使用されている。ＣＤＲの「接触（ｃｏｎｔａｃｔ）」定義は、利用可能な複合結晶構造の解析に基づいている。ただし、同じ抗体可変領域のＣＤＲの境界は、定義及び分類の方法によって異なる場合がある。すなわち、異なる方法で分類・定義される同じ抗体可変領域のＣＤＲ配列が異なる場合がある。そのため、本発明において分類・定義される特定のＣＤＲ配列を用いて抗体を規定する場合、その抗体の範囲には、他の任意の定義（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭの定義など）に変換されたＣＤＲ配列によって規定される抗体も含まれる。
本明細書に記載のＣＤＲ配列は、一般に、Ｋａｂａｔの定義（Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ ．（１９９１））によるものである。
「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」という用語は、本明細書で定義されたＣＤＲ残基以外の可変ドメインのアミノ酸残基を指す。
「Ｆａｂ」という用語は、免疫グロブリンの重鎖のＶＨ及びＣＨ１と、軽鎖のＶＬ及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。本明細書において、Ｆａｂとは、重鎖可変領域ＶＨ及び定常領域ＣＨ１からなるＦａｂ重鎖（ＶＨ－ＣＨ１、ＮからＣ末端方向）と、軽鎖可変領域及び定常領域ＣＬからなるＦａｂ軽鎖（ＶＬ－ＣＬ、ＮからＣ末端方向）とを含む天然型Ｆａｂ分子を意味する。
「ｓｃＦｖ」という用語には、免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬドメインが含まれ、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、抗原結合に必要な構造を形成することができるように、ＶＨとＶＬドメインとの間にあるペプチドリンカーも含む。
「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語には、天然配列Ｆｃ及び変異体Ｆｃが含まれる。ＦｃのＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在してもよく、存在しなくてもよい。特に別段の記載がない限り、Ｆｃ又は定常領域にあるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ， Ｅ．ＡらのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ （１９９１） ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２に記載のようにＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵナンバリングシステムに従う。本明細書で使用するＦｃ領域における一方の「Ｆｃポリペプチド」とは、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃ領域のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常領域を含む。
「エフェクター機能」という用語は、抗体アイソタイプによって異なる抗体Ｆｃドメインに起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）などが挙げられる。
「ＫＤ」という用語は、本明細書で用いる場合、解離定数を指し、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は当分野で公知の方法により測定することができる。抗体のＫＤを測定する方法の一例として、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いる方法、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステムなどのバイオセンサーシステムによる方法が挙げられる。
「治療」という用語は、治療を受けている個体における疾患の自然経過を変えようという臨床介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。望ましい治療効果には、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患進行速度の低減、疾患状態の寛解又は軽減、及び軽快又は予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。
「被験者」という用語は、あらゆるヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」は、哺乳動物及び非哺乳動物を例示できるすべての脊椎動物を包含し、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などが挙げられる。好ましくは、本発明の被験者はヒトである。特に明記しない限り、「患者」又は「被験者」は同じ意味で使用される。
「単離された」という用語は、目的とする化合物（例えば、ＶＨＨ、多重特異性抗体、抗体又は核酸等）がその天然の環境から取り出されたことを意味する。
アミノ酸配列の「同一性百分率（％）」とは、候補配列と本明細書に示される具体的なアミノ酸配列とをアラインメントし、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、最大の配列同一性百分率を達成するために必要に応じてギャップを導入した後の、本明細書に示される具体的なアミノ酸配列のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の百分率を意味する。アミノ酸配列の同一性は、当分野における技術の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて実現することができる。当業者であれば、比較されている配列の完全長にわたる最大アラインメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めて、配列アラインメントに適したパラメータを決定することができる。
本発明の様々な側面について、以下のサブセクションでさらに詳細に説明する。
Ｉ．単一可変ドメイン
本発明は、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）に結合する単一可変ドメインを提供する。単一可変ドメインは、ＢＣＭＡを標的とする薬剤の開発又は薬剤構築のために利用可能なオプションをさらに提供する。前記単一可変ドメインは、ヒトＢＣＭＡに対して良好な親和性を持ち、ターゲティング特性を提供できる。場合によっては、前記単一可変ドメインは、増殖誘導リガンドＡＰＲＩＬとＢＣＭＡとの結合を遮断する能力を提供することができる。特に、いくつかの形態において、前記単一可変ドメインは、ヒトＴＡＣＩ及びＢＡＦＦ－Ｒタンパク質に結合せず、特異性を示す。いくつかの実施形態において、前記単一可変ドメインはサルＢＣＭＡと交差反応する。サルは薬物毒性実験の理想的な実験動物であるため、サルとの交差反応は薬物毒性実験を展開する上で好適である。
本発明は、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）に結合する単一可変ドメインを提供する。単一可変ドメインは、ＢＣＭＡを標的とする薬剤の開発又は薬剤構築のために利用可能なオプションをさらに提供する。前記単一可変ドメインは、ヒトＢＣＭＡに対して良好な親和性を持ち、ターゲティング特性を提供できる。場合によっては、前記単一可変ドメインは、増殖誘導リガンドＡＰＲＩＬとＢＣＭＡとの結合を遮断する能力を提供することができる。特に、いくつかの形態において、前記単一可変ドメインは、ヒトＴＡＣＩ及びＢＡＦＦ－Ｒタンパク質に結合せず、特異性を示す。いくつかの実施形態において、前記単一可変ドメインはサルＢＣＭＡと交差反応する。サルは薬物毒性実験の理想的な実験動物であるため、サルとの交差反応は薬物毒性実験を展開する上で好適である。
本発明は、
（１）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（４）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
を含む、ＢＣＭＡに結合する単一可変ドメインを提供する。
（１）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（４）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
を含む、ＢＣＭＡに結合する単一可変ドメインを提供する。
いくつかの実施形態において、前記単一可変ドメインは、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、前記単一可変ドメインは、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、前記単一可変ドメインは、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、前記単一可変ドメインは、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、前記単一可変ドメインはラクダ科の動物のものである。いくつかの実施形態において、前記単一可変ドメインはヒト化されたものである。
いくつかの実施形態において、前記単一可変ドメインは、配列番号１９、２１、２３、２５、３７、３８、３９、４０、４１又は４２で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのより具体的な実施形態において、前記単一可変ドメインは、配列番号１９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むとともに、配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかのより具体的な実施形態において、前記単一可変ドメインは、配列番号４１で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むとともに、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかのより具体的な実施形態において、前記単一可変ドメインは、配列番号３７又は３８で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むとともに、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかのより具体的な実施形態において、前記単一可変ドメインは、配列番号４２で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むとともに、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかのより具体的な実施形態において、前記単一可変ドメインは、配列番号３９又は４０で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むとともに、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかのより具体的な実施形態において、前記単一可変ドメインは、配列番号２５で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むとともに、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、当該配列を含む単一可変ドメインはＢＣＭＡに結合する能力を保持する。いくつかの実施形態において、配列番号１９、４１、４２及び２５から選択されるアミノ酸配列は、合計１～１８、１～１６、１～１４、１～１２、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３又は１～２個のアミノ酸が置換、插入及び／又は欠失された。いくつかの実施形態において、置換、插入又は欠失は、ＣＤＲ以外の領域（つまり、ＦＲ）において生じる。いくつかの実施形態において、置換、插入又は欠失はＣＤＲ領域、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のうちの１つ、２つ又は３つにおいて生じる。いくつかの実施形態において、置換、插入又は欠失は、ＣＤＲ領域及び非ＣＤＲ領域において生じる。
いくつかの実施形態において、前記単一可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１９、２１、２３、２５、３７、３８、３９、４０、４１又は４２で表されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記単一可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１９、２１、２３、２５、３７、３８、３９、４０、４１又は４２で表されるものである。
いくつかの実施形態において、前記単一可変ドメインはＶＨＨである。いくつかの実施形態において、ＶＨＨはヒト化されたものである。非ヒト由来の単一可変ドメインは、元の単一可変ドメイン配列のアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基を、ヒト抗体のＶＨドメイン中の対応する位置に存在する１つ以上のアミノ酸残基で置換することによって「ヒト化」することができる。ヒト化により免疫原性が低下することが期待される。単一可変ドメインは一般に、Ｎ末端からＣ末端まで、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４で表される構造を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による単一可変ドメインのいずれかと同じエピトープに結合する単一可変ドメインを提供する。いくつかの実施形態において、配列番号１９、２１、２３、２５、３７、３８、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む単一可変ドメインと同じエピトープに結合する単一可変ドメインを提供する。いくつかの実施形態において、前記同じエピトープに結合する単一可変ドメインはラクダ科の動物のもの、又はヒト化されたものである。
当業者に知られている従来の技術を用いて、同じエピトープへの結合の競合性に応じて単一可変ドメインをスクリーニングすることができる。そのため、いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による単一可変ドメインのいずれかと競合してＢＣＭＡに結合する単一可変ドメインを提供する。いくつかの実施形態において、配列番号１９、２１、２３、２５、３７、３８、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む単一可変ドメインと競合してＢＣＭＡに結合する単一可変ドメインを提供する。ＢＣＭＡへの結合は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又は当分野で知られている他の任意の方法によって測定することができる。いくつかの実施形態において、前記ＢＣＭＡに競合的に結合する単一可変ドメインは、ラクダ科の動物のもの、又はヒト化されたものである。
本発明は、ＢＣＭＡに結合する単一可変ドメインのいくつかの例を提供する。本発明による単一可変ドメイン例のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）のアミノ酸配列を下記の表Ｓ１に示す。単一可変ドメイン例の全長アミノ酸配列を下記の表Ｓ２に示す。
（配列番号４１の配列）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＸ１ＶＱＸ２ＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＳＳＮＶＡＣＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＸ３Ｘ４ＥＷＶＸ５ＴＩＶＡＤＦＧＴＴＮＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＸ６ＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＸ７Ｘ８ＥＤＸ９ＡＸ１０ＹＹＣＡＡＴＱＲＧＧＩＤＷＣＤＥＩＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ここで、Ｘ１はＳ又はＬであり、Ｘ２はＰ又はＡであり、Ｘ３はＧ又はＥであり、Ｘ４はＲ又はＬであり、Ｘ５はＡ又はＳであり、Ｘ６はＡ又はＳであり、Ｘ７はＲ又はＫであり、Ｘ８はＡ又はＰであり、Ｘ９はＴ又はＳであり、Ｘ１０はＶ又はＭである。
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＸ１ＶＱＸ２ＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＳＳＮＶＡＣＭＡＷＹＲＱＡＰＧＫＸ３Ｘ４ＥＷＶＸ５ＴＩＶＡＤＦＧＴＴＮＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＸ６ＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＸ７Ｘ８ＥＤＸ９ＡＸ１０ＹＹＣＡＡＴＱＲＧＧＩＤＷＣＤＥＩＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ここで、Ｘ１はＳ又はＬであり、Ｘ２はＰ又はＡであり、Ｘ３はＧ又はＥであり、Ｘ４はＲ又はＬであり、Ｘ５はＡ又はＳであり、Ｘ６はＡ又はＳであり、Ｘ７はＲ又はＫであり、Ｘ８はＡ又はＰであり、Ｘ９はＴ又はＳであり、Ｘ１０はＶ又はＭである。
（配列番号４２の配列）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＸ１１ＶＱＸ１２ＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＸ１３ＴＦＮＳＡＣＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＸ１４ＲＥＧＶＸ１５ＲＩＥＴＧＹＧＧＴＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＸ１６ＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＸ１７Ｘ１８ＥＤＴＡＸ１９ＹＹＣＡＡＫＲＳＷＣＴＰＴＷＷＨＥＬＤＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ここで、Ｘ１１はＳ又はＬであり、Ｘ１２はＰ又はＡであり、Ｘ１３はＦ又はＶであり、Ｘ１４はＥ又はＧであり、Ｘ１５はＡ又はＳであり、Ｘ１６はＡ又はＳであり、Ｘ１７はＲ又はＫであり、Ｘ１８はＡ又はＰであり、Ｘ１９はＶ又はＭである。
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＸ１１ＶＱＸ１２ＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＸ１３ＴＦＮＳＡＣＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＸ１４ＲＥＧＶＸ１５ＲＩＥＴＧＹＧＧＴＶＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＸ１６ＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＸ１７Ｘ１８ＥＤＴＡＸ１９ＹＹＣＡＡＫＲＳＷＣＴＰＴＷＷＨＥＬＤＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ここで、Ｘ１１はＳ又はＬであり、Ｘ１２はＰ又はＡであり、Ｘ１３はＦ又はＶであり、Ｘ１４はＥ又はＧであり、Ｘ１５はＡ又はＳであり、Ｘ１６はＡ又はＳであり、Ｘ１７はＲ又はＫであり、Ｘ１８はＡ又はＰであり、Ｘ１９はＶ又はＭである。
本発明は、上記単一可変ドメインを含むＢＣＭＡ結合抗体を提供する。
いくつかの実施形態において、前記ＢＣＭＡ結合抗体は単一特異性抗体又は多重特異性抗体であり得る。
一実施形態において、前記単一特異性抗体はＦｃドメインを含み、好ましくは、前記ＦｃはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃである。
いくつかの実施形態において、前記単一特異性抗体は、配列番号２７、２９、３１、３３、５１、５３、５５又は５７で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明は、単一特異性抗体の例（例えば、１Ａ１０－Ｖ１、１Ａ１０－Ｖ１、１Ａ１１－Ｖ１、１Ａ１１－Ｖ２等）を提供する。単一可変ドメインをヒトＩｇＧ１のＦｃと融合させ、Ｆｃによりホモ二量体を形成する。
本発明は、本発明によるＢＣＭＡ結合抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸、を提供する。
本発明は、本発明による核酸を含むベクターを提供する。
本発明は、本発明による核酸又は本発明によるベクターを含む、単離された宿主細胞を提供する。
本発明は、本発明による宿主細胞を培養して上記ＢＣＭＡ結合抗体を発現させ、上記ＢＣＭＡ結合抗体を系から単離・精製することを含む、本発明によるＢＣＭＡ結合抗体の製造方法を提供する。
本発明は、本発明によるＢＣＭＡ結合抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
本発明は、被験者に治療有効量の本発明によるＢＣＭＡ結合抗体又は前記医薬組成物を投与することを含む、被験者におけるＢＣＭＡ発現に関連する疾患を治療するための方法を提供する。
ＩＩ．多重特異性抗体
本発明は、腫瘍細胞の表面に発現するＢＣＭＡを標的とすることができ、Ｔ細胞に結合してＴ細胞の殺腫瘍活性を活性化することもできる、単一可変ドメインを含む多重特異性抗体を提供する。
本発明は、腫瘍細胞の表面に発現するＢＣＭＡを標的とすることができ、Ｔ細胞に結合してＴ細胞の殺腫瘍活性を活性化することもできる、単一可変ドメインを含む多重特異性抗体を提供する。
より多く（例えば、２つ）のＦａｂを採用する場合と比較して、単一可変ドメインを採用する場合は、軽鎖と重鎖の誤対合を軽減又は回避することができる。
本発明の多重特異性抗体は、腫瘍細胞の溶解などの優れた抗腫瘍特性も示している。いくつかの実施形態において、本発明の多重特異性抗体は、様々な腫瘍細胞への殺傷を誘導することができ、また、本発明の多重特異性抗体は、異なるＢＣＭＡ発現レベルを有する腫瘍細胞に対して良好な殺腫瘍活性を示している。特に、ＢＣＭＡの発現が低い一部の腫瘍細胞に対してより優れた殺傷特性を示している。
本発明の多重特異性抗体は、良好な抗腫瘍特性を示すとともに、サイトカイン放出レベルが低いため、ＣＤ３標的抗体によって引き起こされるサイトカインストームのリスクを軽減し、安全性を向上させることができる。
上記Ｉの欄に記載のいずれかの単一可変ドメインにより多重特異性抗体を構築することができる。そのため、本発明は、
（ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）第１の抗原に結合する第３の抗原結合部分とを含む多重特異性抗体であって、
前記第１の抗原はＢＣＭＡであり、前記第２の抗原はＴ細胞活性化抗原であり、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、単一可変ドメインであって、それぞれ独立して、
（ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（ｄ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のうちのいずれか１つを含む、
多重特異性抗体を提供する。
（ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）第１の抗原に結合する第３の抗原結合部分とを含む多重特異性抗体であって、
前記第１の抗原はＢＣＭＡであり、前記第２の抗原はＴ細胞活性化抗原であり、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、単一可変ドメインであって、それぞれ独立して、
（ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（ｄ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のうちのいずれか１つを含む、
多重特異性抗体を提供する。
本発明において、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、ＢＣＭＡに結合する単一可変ドメインである。いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に記載の相補性決定領域を含む。いくつかの実施形態において、前記第３の抗原結合部分は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に記載の相補性決定領域を含む。前記多重特異性抗体において、前記第１の抗原結合部分と第３の抗原結合部分は同じであってもよく、異なっていてもよく、独立して本発明による単一可変ドメインを任意に選択して組み合わせることができる。一形態において、前記第１の抗原結合部分と第３の抗原結合部分は同じである。別の形態において、前記第１の抗原結合部分と第３の抗原結合部分は異なっている。
表Ｓ３は、ＣＤＲにより特徴付けられる第１の抗原結合部分と第３の抗原結合部分との様々な組み合わせで構築される多重特異性抗体を例示する。一実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、上記（ｂ）に記載の相補性決定領域を含み、前記第３の抗原結合部分は、上記（ｃ）に記載の相補性決定領域を含み、すなわち、前記第１の抗原結合部分は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、かつ、前記第３の抗原結合部分は、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。別の実施形態において、前記第３の抗原結合部分は、上記（ｂ）に記載の相補性決定領域を含み、前記第１の抗原結合部分は、上記（ｃ）に記載の相補性決定領域を含み、すなわち、前記第３の抗原結合部分は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、かつ、前記第１の抗原結合部分は、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。より具体的な形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号１０で表されるＣＤＲ１、配列番号１１で表されるＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるＣＤＲ３を含み、かつ、前記第３の抗原結合部分は、配列番号１３で表されるＣＤＲ１、配列番号１４で表されるＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるＣＤＲ３を含む。別のより具体的な形態において、前記第３の抗原結合部分は、配列番号１０で表されるＣＤＲ１、配列番号１１で表されるＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるＣＤＲ３を含み、かつ、前記第１の抗原結合部分は、配列番号１３で表されるＣＤＲ１、配列番号１４で表されるＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるＣＤＲ３を含む。
（注）表中の「（Ｘ）＋（Ｙ）」は、多重特異性抗体中の第３の抗原結合部分と第１の抗原結合部分との組み合わせの形態を表す。例えば、（ｂ）＋（ａ）は、多重特異性抗体中の第３の抗原結合部分が（ｂ）に記載の相補性決定領域を含むとともに、第１の抗原結合部分が（ａ）に記載の相補性決定領域を含むことを表す。
さらに、いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はそれぞれ独立して、配列番号１９、４１、４２又は２５で表される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号１９、４１、４２又は２５で表される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号１９、２１、２３、３７、３８、３９、４０又は２５で表される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号１９、４１、４２又は２５で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかのより具体的な実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号１９、２１、２３、３７、３８、３９、４０又は２５で表されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記第３の抗原結合部分は、配列番号１９、４１、４２又は２５で表される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記第３の抗原結合部分は、配列番号１９、２１、２３、３７、３８、３９、４０又は２５で表される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記第３の抗原結合部分は、配列番号１９、４１、４２又は２５で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかのより具体的な実施形態において、前記第３の抗原結合部分は、配列番号１９、２１、２３、３７、３８、３９、４０又は２５で表されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号４１で表される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、前記第３の抗原結合部分は、配列番号４２で表される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第３の抗原結合部分は、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかのより具体的な形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号２１、３７又は３８で表されるアミノ酸配列を含み、前記第３の抗原結合部分は、配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号４２で表される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、前記第３の抗原結合部分は、配列番号４１で表される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第３の抗原結合部分は、配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む。いくつかのより具体的な形態において、前記第１の抗原結合部分は、配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含み、前記第３の抗原結合部分は、配列番号２１、３７又は３８で表されるアミノ酸配列を含む。
一例として、前記第１の抗原結合部分は、配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含み、前記第３の抗原結合部分は、２１、２３、３７、３８、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む。
一例として、前記第３の抗原結合部分は、配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含み、前記第１の抗原結合部分は、２１、２３、３７、３８、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む。
一例として、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む。
一例として、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む。
一例として、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第３の抗原結合部分は、配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含む。
一例として、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む。
一例として、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第３の抗原結合部分は、配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含む。
一例として、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第３の抗原結合部分は、配列番号４０で表されるアミノ酸配列を含む。
一例として、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む。
一例として、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む。
一例として、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第１の抗原結合部分は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
一例として、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。
一例として、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第１の抗原結合部分は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
一例として、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記第１の抗原結合部分は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。
一例として、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、配列番号２１、２３、３７、３８、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む。
表Ｓ４は、全長アミノ酸配列により特徴付けられる第１の抗原結合部分と第３の抗原結合部分の様々な組み合わせにより構築される多重特異性抗体を例示する。
（注）表中の「（Ｘ）＋（Ｙ）」は、多重特異性抗体中の第３の抗原結合部分と第１の抗原結合部分との組み合わせを表す。例えば、「１Ａ１０＋１Ａ１単一可変ドメイン」は、多重特異性抗体中の第３の抗原結合部分が１Ａ１０単一可変ドメインのアミノ酸配列であるとともに、第１の抗原結合部分が１Ａ１単一可変ドメインのアミノ酸配列であることを表す。上記表中の単一可変ドメインのアミノ酸配列は表Ｓ２を参照されたい。
本発明において、前記第１の抗原結合部分はラクダ科の動物のものであってもよく、ヒト化されたものであってもよい。前記第３の抗原結合部分はラクダ科の動物のものであってもよく、ヒト化されたものであってもよい。ヒト化により、免疫原性を低減することができる。いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、ヒト化されたものである。いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、ラクダ科の動物のものである。
本発明の多重特異性抗体において、前記第２の抗原結合部分は、Ｔ細胞活性化抗原を標的とする能力を提供する。前記第２の抗原結合部分はＦａｂ、ＳｃＦｖ又はＳｃＦａｂであり得る。一実施形態において、前記Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３である。一形態において、前記第２の抗原結合部分はＣＤ３結合Ｆａｂである。別の形態において、前記二抗原結合部分はＣＤ３結合ＳｃＦｖである。
いくつかの実施形態において、前記第２の抗原結合部分は、マウス由来のもの、キメラ体、又は、ヒト化されたものである。
いくつかの実施形態において、前記第２の抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域として、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
一形態において、前記重鎖可変領域は、配列番号４９で表される可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号５０で表される可変領域のＬＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態において、前記第２の抗原結合部分は、配列番号４９で表される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５０で表される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。一形態において、前記第２の抗原結合部分の重鎖可変領域は、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、その軽鎖可変領域は、配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む。より具体的な一形態において、前記第２の抗原結合部分の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はこの順でそれぞれ配列番号４９、５０で表されるものである。
本発明の多重特異性抗体はＦｃ領域を含まなくてもよく、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、第３の抗原結合部分は適切なリンカーにより連結されていてもよい。
本発明の多重特異性抗体はＦｃ領域を含んでもよく、Ｆｃ領域は半減期を延長し、Ｆｃ領域関連エフェクターなどの機能を提供することができる。
多重特異性抗体の構成
本発明の多重特異性抗体の各成分は様々な構造で互いに融合することができる。いくつかの実施形態において、前記多重特異性抗体はさらに、（ｉｖ）２つのＦｃポリペプチドで構成されるＦｃ領域を含む。
本発明の多重特異性抗体の各成分は様々な構造で互いに融合することができる。いくつかの実施形態において、前記多重特異性抗体はさらに、（ｉｖ）２つのＦｃポリペプチドで構成されるＦｃ領域を含む。
第３の抗原結合部分は、第１の抗原結合部分又は第２の抗原結合部分と互いに融合することができる。パターン（１）の選択可能な実施形態において、前記第３の抗原結合部分と前記第１の抗原結合部分は互いに融合され、所望によりペプチドリンカーを介して互いに融合される。パターン（２）の選択可能な実施形態において、前記第３の抗原結合部分と前記第２の抗原結合部分は互いに融合され、所望によりペプチドリンカーを介して互いに融合される。
パターン（１）の選択可能な実施形態において、前記第３の抗原結合部分と前記第１の抗原結合部分は互いに融合され、所望によりペプチドリンカーを介して互いに融合される。より具体的な一形態において、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で第１の抗原結合部分のＮ末端に融合される。さらに、いくつかの実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分はＳｃＦｖであり、かつ前記第２の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合される。別の実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分はＦａｂであり、かつ前記第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合される。
一実施形態において、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、単一可変ドメインであり、前記第２の抗原結合部分はＦａｂであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第１の抗原結合部分のＮ末端に融合される。このような構造は図５Ａに概略的に示す。この実施形態について、より具体的には、多重特異性抗体は３本のポリペプチド鎖を有し、そのうち、第１のポリペプチド鎖は、上記の第１の抗原結合部分、第３の抗原結合部分及びＦｃ領域における一方のＦｃポリペプチドを含有し、第２のポリペプチド鎖は、上記第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖及びＦｃ領域における他方のＦｃポリペプチドを含有し、第３のポリペプチド鎖は上記第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖である。
別の実施形態において、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、単一可変ドメインであり、前記第２の抗原結合部分はＳｃＦｖであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第１の抗原結合部分のＮ末端に融合される。このような構造は図５Ｂに概略的に示す。この実施形態について、より具体的には、多重特異性抗体は２本のポリペプチド鎖を有し、そのうち、第１のポリペプチド鎖は、上記の第１の抗原結合部分、第３の抗原結合部分及びＦｃ領域における一方のＦｃポリペプチドを含有し、第２のポリペプチド鎖は、上記第２の抗原結合部分及びＦｃ領域における他方のＦｃポリペプチドを含有する。
第３の抗原結合部分の連結形態について、パターン（２）の選択可能な実施形態において、前記第３の抗原結合部分と前記第２の抗原結合部分は互いに融合され、所望によりペプチドリンカーを介して互いに融合される。より具体的な形態において、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で第２の抗原結合部分のＮ末端に融合される。さらに、いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分はＳｃＦｖであり、かつ前記第２の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合される。別の実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分はＦａｂであり、かつ前記第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合される。ここで、前記第３の抗原結合部分は、前記第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖又はＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。
一実施形態において、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、単一可変ドメインであり、前記第２の抗原結合部分はＳｃＦｖであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第２の抗原結合部分のＮ末端に融合される。このような構造は図５Ｃに概略的に示す。この実施形態について、より具体的には、多重特異性抗体は２本のポリペプチド鎖を有し、そのうち、第１のポリペプチド鎖は、上記の第１の抗原結合部分及びＦｃ領域における一方のＦｃポリペプチドを含有し、第２のポリペプチド鎖は、上記の第２の抗原結合部分、第３の抗原結合部分及びＦｃ領域における他方のＦｃポリペプチドを含有する。
別の実施形態において、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、単一可変ドメインであり、前記第２の抗原結合部分はＦａｂであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端（このような構造は図５Ｄに概略的に示す。）又は前記第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。この実施形態について、より具体的には、多重特異性抗体は３本のポリペプチド鎖を有し、そのうち、第１のポリペプチド鎖は、上記の第１の抗原結合部分及びＦｃ領域における一方のＦｃポリペプチドを含有し、第２のポリペプチド鎖は、上記第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖及びＦｃ領域における他方のＦｃポリペプチドを含有し、第３のポリペプチド鎖は、上記の第３の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を含有する。所望により、多重特異性抗体は３本のポリペプチド鎖を有し、そのうち、第１のポリペプチド鎖は、上記の第１の抗原結合部分及びＦｃ領域における一方のＦｃポリペプチドを含有し、第２のポリペプチド鎖は、上記第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖、第３の抗原結合部分及びＦｃ領域における他方のＦｃポリペプチドを含有し、第３本のポリペプチド鎖は、上記の第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を含有する。
前記第２の抗原結合部分がＳｃＦｖである場合、これに含まれる重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）の並び順は任意であるが、例えば、一実施形態において、前記第２の抗原結合部分のＶＨ及びＶＬはＮ末端からＣ末端へＶＬ－ＶＨの順で並ぶ。別の実施形態において、前記第２の抗原結合部分のＶＨ及びＶＬはＮ末端からＣ末端へＶＨ－ＶＬの順で並ぶ。いくつかの実施形態において、前記第２の抗原結合部分のＶＨ及びＶＬはペプチドリンカーを介して融合されることでＳｃＦｖを形成する。
上記の実施形態のいずれかにおいて、多重特異性抗体の各成分の実現可能な連結、例えば、直接の連結、又は本明細書に記載の若しくは当分野で公知の様々なペプチドリンカー（例えば、１個以上のアミノ酸、一般に約１～５０個のアミノ酸を含むペプチドリンカー）による連結、ヒンジ融合については、当業者であれば適宜選択できる。
前記第３の抗原結合部分は、直接、又は、ペプチドリンカーを介して、第１の抗原結合部分又は第２の抗原結合部分に融合可能である。一実施形態において、前記第３の抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して、第１の抗原結合部分又は第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態において、前記第２の抗原結合部分がＳｃＦｖ構造である場合、その軽鎖可変領域と重鎖可変領域はペプチドリンカーを介して連結される。
各ペプチドリンカーはそれぞれ独立して、例えば、荷電及び／又は柔軟リンカーポリペプチドなどの任意の適切なものを採用することができる。具体的な実施形態において、ペプチドリンカーは、ペプチド結合によって連結した１～５０個のアミノ酸からなり、前記アミノ酸は、２０個の天然アミノ酸から選択される。より好ましい実施形態において、１～５０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、セリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンから選択される。したがって、ペプチドリンカーの一例として、ポリグリシン（特に（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ）５）、ポリ（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）、（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２、（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４、ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ、又は特許出願ＷＯ２０１９１９５５３５の表４に開示されたものなどが挙げられる。
いくつかの実施形態において、前記ペプチドリンカーは、グリシンとセリンとからなるペプチドリンカーであってもよい。いくつかの実施形態において、前記ペプチドリンカーに含まれるアミノ酸の数は０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個であってもよく、又は２０個以上であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳを繰り返して含むペプチドリンカー、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号２）を含むペプチドリンカー、又は、ＧＧＧＰＧＫＲを含むペプチドリンカーである。好ましくは、前記ＧＧＧＧＳを繰り返すペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎである。ここで、ｎは１～１０の任意の数、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０、又は前記数字のいずれか２つで限定された任意の範囲、例えば、１～５、２～５、３～６、２～４、１～４などである。いくつかの実施形態において、前記ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳ、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３又は（ＧＧＧＧＳ）４を含むリンカーポリペプチドである。いくつかの実施形態において、前記第３の抗原結合部分は、ペプチドリンカーＧＧＧＧＳ（配列番号１）又は（ＧＧＧＧＳ）２又は（ＧＧＧＧＳ）３を介して、第１の抗原結合部分又は第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態において、前記第２の抗原結合部分がＳｃＦｖ構造である場合、その軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、ペプチドリンカーＧＧＧＧＳ又は（ＧＧＧＧＳ）２又は（ＧＧＧＧＳ）３を介して連結される。
Ｆｃと融合される場合、典型的には、ヒンジ領域を介して融合される。一実施形態において、前記第１の抗原結合部分は、第１のヒンジを介してＦｃ領域におけるＦｃポリペプチドのうちの１つに融合され、前記第２の抗原結合部分は、第２のヒンジを介してＦｃ領域におけるＦｃポリペプチドのうちの１つに融合される。いくつかの実施形態において、前記第１のヒンジと第２のヒンジは、互いにジスルフィド結合などの共有結合を形成することができる。第１のヒンジ又は／及び第２のヒンジは、ヒトＩｇＧのヒンジ領域のアミノ酸を含んでもよく、ヒトＩｇＧのヒンジ領域は天然のヒンジ領域又はその変異体を含む。いくつかの実施形態において、第１のヒンジ又は／及び第２のヒンジは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、第１のヒンジ又は／及び第２のヒンジは、ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、第１のヒンジは、ＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号３）を含み、第２のヒンジは、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４）を含む。別の実施形態において、第１のヒンジは、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを含み、第２のヒンジは、ＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを含む。いくつかの実施形態において、第１のヒンジと第２のヒンジはいずれも、ＧＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ又はＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを含む。
Ｆｃ領域
多重特異性抗体のＦｃ領域は、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む１対のポリペプチド鎖から構成される。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃ領域は二量体であり、各ＦｃポリペプチドにＩｇＧ重鎖定常領域のＣＨ２及びＣＨ３が含まれる。Ｆｃ領域の２つのＦｃポリペプチドは、互いに安定して会合することができる。一実施形態において、本発明の多重特異性抗体は１つのＦｃ領域を含む。
多重特異性抗体のＦｃ領域は、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む１対のポリペプチド鎖から構成される。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃ領域は二量体であり、各ＦｃポリペプチドにＩｇＧ重鎖定常領域のＣＨ２及びＣＨ３が含まれる。Ｆｃ領域の２つのＦｃポリペプチドは、互いに安定して会合することができる。一実施形態において、本発明の多重特異性抗体は１つのＦｃ領域を含む。
一実施形態において、多重特異性抗体のＦｃ領域はＩｇＧ Ｆｃ領域である。一実施形態において、Ｆｃ領域はＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。別の実施形態において、Ｆｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。より具体的な一実施形態において、Ｆｃ領域は、Ｓ２２８位にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、このアミノ酸置換により、ＩｇＧ４抗体のインビボＦａｂアーム交換が減少する。別の実施形態において、Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域である。より具体的な一実施形態において、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ １Ｆｃ領域である。
いくつかの実施形態において、前記Ｆｃ領域は、アミノ酸置換などの修飾を含む。前記修飾としては、例えば、ヘテロ二量化を促進する修飾、エフェクター機能を変化させる修飾、プロテインＡに対する結合能を変化させる修飾等の修飾が挙げられる。
いくつかの実施形態において、前記Ｆｃはヘテロ二量化を促進する修飾を含む。
本発明の多重特異性抗体は、Ｆｃ領域における２つのＦｃポリペプチドのうちの一方又は他方に融合された、異なる抗原結合部分を含むため、２つのＦｃポリペプチドは、通常、２本の異なるポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現とそれに続く二量体化により、２つのポリペプチドのいくつかの考え得る組み合わせが得られる。組換え産生における多重特異性抗体の収率および純度を向上させるために、当該多重特異性抗体のＦｃ領域に所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが好適である。したがって、具体的な実施形態において、前記Ｆｃ領域は、前記Ｆｃ領域の２つのＦｃポリペプチドの会合を促進するアミノ酸置換を含む。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の２本のＦｃポリペプチド間の最も広範なタンパク質間相互作用の部位はＦｃ領域のＣＨ３ドメインにある。したがって、一実施形態において、この修飾はＦｃ領域のＣＨ３ドメインにある。
具体的な実施形態において、この修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」修飾であり、Ｆｃ領域の２つのＦｃポリペプチドのうちの一方における「ノブ」修飾と、Ｆｃ領域の２つのＦｃポリペプチドのうちの他方における「ホール」修飾とを含む。通常、この方法は、突起（「ノブ」）を一方のＦｃポリペプチドの接触面に導入するとともに、対応する空洞（「ホール」）を他方のＦｃポリペプチドの接触面に導入し、当該突起を当該空洞に位置決めすることにより、ヘテロ二量体の形成を促進し、ホモ二量体の形成を妨害する。突起は、一方のＦｃポリペプチドの接触面に由来する小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファンなど）により置き換えることによって構築される。突起と同一又は類似のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン等）により置き換えることによって、他方のＦｃポリペプチドの接触面に生成される。
したがって、具体的な実施形態において、当該多重特異性抗体の一方のＦｃポリペプチドのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基をこれより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置き換えることによって、他方のＦｃポリペプチドのＣＨ３ドメイン内の空洞に位置決め可能な突起を当該ＦｃポリペプチドのＣＨ３ドメイン内に生じさせる。他方のＦｃポリペプチドのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基をこれより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置き換えることによって、当該ＦｃポリペプチドのＣＨ３ドメイン内に空洞を生じさせる。
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域の一方のＦｃポリペプチドはＴ３６６Ｙ／Ｗ又は／及びＳ３５４Ｃを含み、かつ、他方のＦｃポリペプチドはＹ４０７Ｔ／Ｖ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ又は／及びＬ３６８Ａを含む。より具体的な一例として、前記Ｆｃ領域におけるＦｃポリペプチドのうちの一方はアミノ酸置換Ｔ３６６Ｙ／Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃポリペプチドはアミノ酸置換Ｙ４０７Ｔ／Ｖ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＬ３６８Ａを含む。より具体的な一例において、ＦｃはヒトＩｇＧ１のＦｃであり得る。
いくつかの実施形態において、前記Ｆｃ領域は、エフェクター機能を変化させる修飾を含む。いくつかの実施形態において、当該多重特異性抗体のＦｃ領域は、修飾前のＦｃと比較して、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる修飾が行われた。Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させることは、サイトカイン放出及び副作用を改善するのに有利である。
いくつかの実施形態において、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる修飾はアミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ領域は、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９から選択される１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９から選択される１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ領域はアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。このような１つの実施形態において、当該ＦｃはＩｇＧ１ Ｆｃ、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃである。いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ領域はＰ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態において、当該アミノ酸置換はＰ３２９Ａ、Ｐ３２９Ｒ又はＰ３２９Ｇである。いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ領域は、Ｐ３２９位のアミノ酸置換と、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置における別のアミノ酸置換とを含む。より具体的な実施形態において、上記別のアミノ酸置換はＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ領域はＰ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５位にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態において、当該Ｆｃ領域はアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」）を含む。別のより具体的な実施形態において、当該Ｆｃ領域はアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ａ（「Ｐ３２９Ａ ＬＡＬＡ」）を含む。このような１つの実施形態において、当該ＦｃはＩｇＧ１ Ｆｃ、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃである。
いくつかの実施形態において、前記Ｆｃ領域はアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ａ／Ｇ／Ｒを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
上述したＦｃ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させるアミノ酸置換は、Ｆｃ領域の２本のポリペプチド鎖において生じる。
いくつかの実施形態において、前記Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域における１つのＦｃポリペプチドのＣＨ３領域とプロテインＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｆｒｏｍ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）との結合を減少又は消失させる修飾を含む。いくつかの実施形態において、当該修飾はアミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、前記Ｆｃ領域はアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ又は／及びＹ４３６Ｆを含み、当該アミノ酸置換は一方のＦｃポリペプチドにおいてのみ生じるものであり、他方のＦｃポリペプチドにおいては生じない。一実施形態において、前記Ｆｃ領域は、一方のＦｃポリペプチドにおいてのみ生じるアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ又は／及びＹ４３６Ｆを含む。このような１つの実施形態において、当該ＦｃはＩｇＧ１ Ｆｃ、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃである。
本発明の多重特異性抗体において、前記Ｆｃ領域は、ヘテロ二量化を促進する修飾、エフェクター機能を変化させる修飾、Ｆｃにおける１つのＦｃポリペプチドのＣＨ３領域とプロテインＡとの結合を減少又は消失させる修飾のうちの１つ、２つ又は３つを含むことができる。いくつかの実施形態において、前記Ｆｃは、２つのＦｃポリペプチドの会合を促進する修飾、上記Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させる修飾、及び、Ｆｃにおける１つのＦｃポリペプチドのＣＨ３領域とプロテインＡとの結合を減少又は消失させる修飾を含む。上記各タイプの修飾の具体的な形態は組み合わせ可能である。例えば、一実施形態において、前記Ｆｃ領域は、アミノ酸置換として、
ｉ．Ｙ４０７Ｔ／Ｖ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｔ３６６Ｙ／Ｗ及びＳ３５４Ｃ（ここで、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｙ／Ｗ及びＳ３５４Ｃは同一のＦｃポリペプチドにあり、かつ（ｉ．）における他のアミノ酸置換とは別のＦｃポリペプチドにある）と、
ｉｉ．Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ａと、
ｉｉｉ．一方のＦｃポリペプチドにおいてのみ生じるＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆとを含む。
ｉ．Ｙ４０７Ｔ／Ｖ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｔ３６６Ｙ／Ｗ及びＳ３５４Ｃ（ここで、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｙ／Ｗ及びＳ３５４Ｃは同一のＦｃポリペプチドにあり、かつ（ｉ．）における他のアミノ酸置換とは別のＦｃポリペプチドにある）と、
ｉｉ．Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ａと、
ｉｉｉ．一方のＦｃポリペプチドにおいてのみ生じるＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆとを含む。
より具体的な一実施形態において、ＥＵ番号に基づき、前記Ｆｃ領域におけるＦｃポリペプチドのうちの１つは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、他方のＦｃポリペプチドは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆを含む。このような実施形態において、当該ＦｃはＩｇＧ１ Ｆｃ、特にヒトＩｇＧ１Ｆｃである。
本発明の記載において、アミノ酸置換は、元のアミノ酸－位置－置換アミノ酸の形で示され、アミノ酸残基は三文字記号（Ｘａａ）又は一文字記号（Ｘ）により示される。したがって、例えば、「Ｈ４３５Ｒ」は、位置４３５におけるアミノ酸Ｈがアミノ酸Ｒに置換されたことを意味する。置換アミノ酸は複数含まれてもよく、例えば、Ｔ３６６Ｙ／Ｗは、位置３６６におけるアミノ酸Ｔがアミノ酸Ｙ又はＷに置換されたことを意味する。
いくつかの実施形態において、本発明による多重特異性抗体は三価のものであり、すなわち、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、第３の抗原結合部分はいずれも、対応する抗原への一価の結合を提供する。
本発明は三価多重特異性抗体の例を提供する。
一例として、多重特異性抗体は、それぞれ配列番号６５及び配列番号６７で表される２本のポリペプチド鎖で構成される。いくつかの実施形態において、２本のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号６６及び配列番号６８で表されるものである。
一例として、多重特異性抗体は、それぞれ配列番号６９及び配列番号７１で表される２本のポリペプチド鎖で構成される。いくつかの実施形態において、２本のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号７０及び配列番号７２で表されるものである。
一例として、多重特異性抗体は、それぞれ配列番号５９、配列番号６１及び配列番号６３で表される３本のポリペプチド鎖で構成される。いくつかの実施形態において、２本のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号６０、配列番号６２及び配列番号６４で表されるものである。
一例として、多重特異性抗体は、それぞれ配列番号７３、配列番号６１及び配列番号７５で表される３本のポリペプチド鎖で構成される。いくつかの実施形態において、２本のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列はそれぞれ、配列番号７４、配列番号６２及び配列番号７６で表されるものである。
組成物
本発明は、多重特異性抗体と、１つ以上の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される担体としては、例えば、賦形剤、希釈剤、封入材料、充填剤、緩衝剤又は他の添加剤が挙げられる。
本発明は、多重特異性抗体と、１つ以上の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される担体としては、例えば、賦形剤、希釈剤、封入材料、充填剤、緩衝剤又は他の添加剤が挙げられる。
単離された核酸
本発明は、本発明による多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸を提供する。いくつかの多重特異性抗体の核酸配列を配列表に例示する。
本発明は、本発明による多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸を提供する。いくつかの多重特異性抗体の核酸配列を配列表に例示する。
ベクター
本発明は、上記核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、前記ベクターはクローニングベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは発現ベクターである。具体的な一例として、発現ベクターはｐｃＤＮＡ３．１（＋）である。前記発現ベクターは、本明細書に記載の多重特異性抗体を発現できる任意の発現ベクターであり得る。
本発明は、上記核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、前記ベクターはクローニングベクターである。別の実施形態において、前記ベクターは発現ベクターである。具体的な一例として、発現ベクターはｐｃＤＮＡ３．１（＋）である。前記発現ベクターは、本明細書に記載の多重特異性抗体を発現できる任意の発現ベクターであり得る。
宿主細胞
いくつかの実施形態において、本発明は、上記本発明に係るベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、多重特異性抗体のクローニング又は発現のための適切な宿主細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞、又は、多重特異性抗体を作製するのに適した他の細胞から選択される。哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本発明は、上記本発明に係るベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、多重特異性抗体のクローニング又は発現のための適切な宿主細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞、又は、多重特異性抗体を作製するのに適した他の細胞から選択される。哺乳動物細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞が挙げられる。
多重特異性抗体の製造方法
いくつかの実施形態において、本発明は、上記宿主細胞を培養して上記多重特異性抗体を発現させ、上記多重特異性抗体を系から単離・精製することを含む多重特異性抗体の製造方法を提供する。上記多重特異性抗体を産生させるために、上記多重特異性抗体をコードする核酸を単離するとともに、宿主細胞でのさらなるクローニング又は／及び発現のために１つ以上のベクターを挿入する。前記核酸は、遺伝子スプライシング、化学合成などの当分野で周知の様々な方法によって得ることができる。
いくつかの実施形態において、本発明は、上記宿主細胞を培養して上記多重特異性抗体を発現させ、上記多重特異性抗体を系から単離・精製することを含む多重特異性抗体の製造方法を提供する。上記多重特異性抗体を産生させるために、上記多重特異性抗体をコードする核酸を単離するとともに、宿主細胞でのさらなるクローニング又は／及び発現のために１つ以上のベクターを挿入する。前記核酸は、遺伝子スプライシング、化学合成などの当分野で周知の様々な方法によって得ることができる。
使用
本発明は多重特異性抗体の使用を提供する。いくつかの実施形態において、使用される多重特異性抗体は、ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２及び／又はＰＣ３であり得る。
本発明は多重特異性抗体の使用を提供する。いくつかの実施形態において、使用される多重特異性抗体は、ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２及び／又はＰＣ３であり得る。
本発明は、ＢＣＭＡ発現に関連する疾患の治療薬を製造するための上記多重特異性抗体又は上記医薬組成物の使用を提供する。
本発明は、被験者に治療有効量の上記多重特異性抗体又は上記医薬組成物を投与することを含む、被験者におけるＢＣＭＡ発現に関連する疾患を治療するための方法を提供する。
いくつかの実施形態において、前記疾患は腫瘍又は自己免疫疾患である。
いくつかの実施形態において、前記疾患は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、全身性エリテマトーデス又は関節リウマチである。
本発明は、実施形態の例も提供する。
［実施形態１］
（ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）第１の抗原に結合する第３の抗原結合部分とを含む多重特異性抗体であって、
前記第１の抗原はＢＣＭＡであり、前記第２の抗原はＴ細胞活性化抗原であり、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、単一可変ドメインであって、それぞれ独立して、
（ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（ｄ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のうちのいずれか１つを含む、多重特異性抗体。
（ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）第１の抗原に結合する第３の抗原結合部分とを含む多重特異性抗体であって、
前記第１の抗原はＢＣＭＡであり、前記第２の抗原はＴ細胞活性化抗原であり、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、単一可変ドメインであって、それぞれ独立して、
（ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（ｄ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のうちのいずれか１つを含む、多重特異性抗体。
［実施形態２］
前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、それぞれ独立して、
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のうちのいずれか１つを含む、実施形態１に記載の多重特異性抗体。
前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、それぞれ独立して、
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３
のうちのいずれか１つを含む、実施形態１に記載の多重特異性抗体。
［実施形態３］
前記第１の抗原結合部分は、相補性決定領域として、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、かつ、
前記第３の抗原結合部分は、相補性決定領域として、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、 実施形態２に記載の多重特異性抗体。
前記第１の抗原結合部分は、相補性決定領域として、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、かつ、
前記第３の抗原結合部分は、相補性決定領域として、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、 実施形態２に記載の多重特異性抗体。
［実施形態４］
前記第３の抗原結合部分は、相補性決定領域として、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、かつ、
前記第１の抗原結合部分は、相補性決定領域として、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、 実施形態２に記載の多重特異性抗体。
前記第３の抗原結合部分は、相補性決定領域として、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、かつ、
前記第１の抗原結合部分は、相補性決定領域として、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、 実施形態２に記載の多重特異性抗体。
［実施形態５］
前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、それぞれ独立して、配列番号１９、２１、２３、２５、３７、３８、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、好ましくは、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、それぞれ独立して、配列番号３７又は３９で表されるアミノ酸配列を含む単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、
実施形態１に記載の多重特異性抗体。
前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、それぞれ独立して、配列番号１９、２１、２３、２５、３７、３８、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、好ましくは、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、それぞれ独立して、配列番号３７又は３９で表されるアミノ酸配列を含む単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、
実施形態１に記載の多重特異性抗体。
［実施形態６］
前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、それぞれ独立して、配列番号１９、４１、４２又は２５で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、それぞれ独立して、配列番号１９、４１、４２又は２５で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態７］
前記第１の抗原結合部分は、配列番号４１で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記第１の抗原結合部分は、配列番号４１で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態８］
前記第１の抗原結合部分は、配列番号２１、３７又は３８で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３７で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載の多重特異性抗体。
前記第１の抗原結合部分は、配列番号２１、３７又は３８で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３７で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載の多重特異性抗体。
［実施形態９］
前記第３の抗原結合部分は、配列番号４２で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記第３の抗原結合部分は、配列番号４２で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態１０］
前記第３の抗原結合部分は、配列番号２３、３９又は４０で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載の多重特異性抗体。
前記第３の抗原結合部分は、配列番号２３、３９又は４０で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態９に記載の多重特異性抗体。
［実施形態１１］
前記第１の抗原結合部分は、配列番号４２で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記第１の抗原結合部分は、配列番号４２で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態１２］
前記第１の抗原結合部分は、配列番号２３、３９又は４０で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１１に記載の多重特異性抗体。
前記第１の抗原結合部分は、配列番号２３、３９又は４０で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記第１の抗原結合部分は、配列番号３９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１１に記載の多重特異性抗体。
［実施形態１３］
前記第３の抗原結合部分は、配列番号４１で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～６、１１～１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記第３の抗原結合部分は、配列番号４１で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～６、１１～１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態１４］
前記第３の抗原結合部分は、配列番号２１、３７又は３８で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３７で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１３に記載の多重特異性抗体。
前記第３の抗原結合部分は、配列番号２１、３７又は３８で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３７で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１３に記載の多重特異性抗体。
［実施形態１５］
前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、
（１）配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分；
（２）配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分；
（３）配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分；
（４）配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
（５）配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
（６）配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
（７）配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
（８）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
（９）配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；或いは、
（１０）配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
から選択されるいずれか１つである、実施形態１～５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、
（１）配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分；
（２）配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分；
（３）配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分；
（４）配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
（５）配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
（６）配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
（７）配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
（８）配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
（９）配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；或いは、
（１０）配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
から選択されるいずれか１つである、実施形態１～５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態１６］
前記単一可変ドメインはラクダ科の動物のもの、又はヒト化されたものである、実施形態１～１５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記単一可変ドメインはラクダ科の動物のもの、又はヒト化されたものである、実施形態１～１５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態１７］
前記第１の抗原結合部分と第３の抗原結合部分は同じである、実施形態１～１６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記第１の抗原結合部分と第３の抗原結合部分は同じである、実施形態１～１６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態１８］
前記第１の抗原結合部分と第３の抗原結合部分は異なっている、実施形態１～１６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記第１の抗原結合部分と第３の抗原結合部分は異なっている、実施形態１～１６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態１９］
前記第２の抗原結合部分はＦａｂ、ＳｃＦｖ又はＳｃＦａｂである、実施形態１～１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記第２の抗原結合部分はＦａｂ、ＳｃＦｖ又はＳｃＦａｂである、実施形態１～１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態２０］
前記Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３である、実施形態１～１９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３である、実施形態１～１９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態２１］
前記第２の抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域として、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、
実施形態１～２０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記第２の抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域として、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、
実施形態１～２０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態２２］
前記第２の抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号４９で表される可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号５０で表される可変領域のＬＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１～２０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記第２の抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号４９で表される可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号５０で表される可変領域のＬＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１～２０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態２３］
前記第２の抗原結合部分は、配列番号４９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号５０で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含み、好ましくは、前記第２の抗原結合部分の重鎖可変領域は、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、その軽鎖可変領域は、配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記第２の抗原結合部分は、配列番号４９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号５０で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列の軽鎖可変領域とを含み、好ましくは、前記第２の抗原結合部分の重鎖可変領域は、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、その軽鎖可変領域は、配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～２２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態２４］
前記第２の抗原結合部分は、マウス由来のもの、キメラ体、又は、ヒト化されたものである、実施形態１～２３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記第２の抗原結合部分は、マウス由来のもの、キメラ体、又は、ヒト化されたものである、実施形態１～２３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態２５］
前記第３の抗原結合部分と前記第１の抗原結合部分は互いに融合され、所望によりペプチドリンカーを介して互いに融合される、実施形態１～２４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記第３の抗原結合部分と前記第１の抗原結合部分は互いに融合され、所望によりペプチドリンカーを介して互いに融合される、実施形態１～２４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態２６］
前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で第１の抗原結合部分のＮ末端に融合される、実施形態２５に記載の多重特異性抗体。
前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で第１の抗原結合部分のＮ末端に融合される、実施形態２５に記載の多重特異性抗体。
［実施形態２７］
前記第３の抗原結合部分と前記第２の抗原結合部分は互いに融合され、所望によりペプチドリンカーを介して互いに融合される、実施形態１～２４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記第３の抗原結合部分と前記第２の抗原結合部分は互いに融合され、所望によりペプチドリンカーを介して互いに融合される、実施形態１～２４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態２８］
前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で第２の抗原結合部分のＮ末端に融合される、実施形態２７に記載の多重特異性抗体。
前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で第２の抗原結合部分のＮ末端に融合される、実施形態２７に記載の多重特異性抗体。
［実施形態２９］
（ｉｖ）２つのＦｃポリペプチドで構成されるＦｃ領域をさらに含む、実施形態１～２８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
（ｉｖ）２つのＦｃポリペプチドで構成されるＦｃ領域をさらに含む、実施形態１～２８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態３０］
前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分はＳｃＦｖであり、かつ前記第２の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合される、実施形態２９に記載の多重特異性抗体。
前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分はＳｃＦｖであり、かつ前記第２の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合される、実施形態２９に記載の多重特異性抗体。
［実施形態３１］
前記第２の抗原結合部分は、Ｎ末端からＣ末端の構造がＶＬ－ＶＨ又はＶＨ－ＶＬである、実施形態３０に記載の多重特異性抗体。
前記第２の抗原結合部分は、Ｎ末端からＣ末端の構造がＶＬ－ＶＨ又はＶＨ－ＶＬである、実施形態３０に記載の多重特異性抗体。
［実施形態３２］
前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分はＦａｂであり、かつ前記第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合される、実施形態２９に記載の多重特異性抗体。
前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分はＦａｂであり、かつ前記第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合される、実施形態２９に記載の多重特異性抗体。
［実施形態３３］
前記第３の抗原結合部分は、前記第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖又はＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される、実施形態３２に記載の多重特異性抗体。
前記第３の抗原結合部分は、前記第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖又はＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される、実施形態３２に記載の多重特異性抗体。
［実施形態３４］
前記第２の抗原結合部分はＳｃＦｖであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第１の抗原結合部分のＮ末端に融合される、実施形態２９に記載の多重特異性抗体。
前記第２の抗原結合部分はＳｃＦｖであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第１の抗原結合部分のＮ末端に融合される、実施形態２９に記載の多重特異性抗体。
［実施形態３５］
前記第２の抗原結合部分はＳｃＦｖであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第２の抗原結合部分のＮ末端に融合される、実施形態２９に記載の多重特異性抗体。
前記第２の抗原結合部分はＳｃＦｖであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第２の抗原結合部分のＮ末端に融合される、実施形態２９に記載の多重特異性抗体。
［実施形態３６］
前記第２の抗原結合部分はＦａｂであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第１の抗原結合部分のＮ末端に融合される、実施形態２９に記載の多重特異性抗体。
前記第２の抗原結合部分はＦａｂであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第１の抗原結合部分のＮ末端に融合される、実施形態２９に記載の多重特異性抗体。
［実施形態３７］
前記第２の抗原結合部分はＦａｂであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端又は前記第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される、実施形態２９に記載の多重特異性抗体。
前記第２の抗原結合部分はＦａｂであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端又は前記第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される、実施形態２９に記載の多重特異性抗体。
［実施形態３８］
前記Ｆｃ領域はＩｇＧ Ｆｃ領域である、実施形態２９～３７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記Ｆｃ領域はＩｇＧ Ｆｃ領域である、実施形態２９～３７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態３９］
前記ＩｇＧ Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ Ｆｃ領域であり、好ましくはヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４のＦｃ領域である、実施形態３８に記載の多重特異性抗体。
前記ＩｇＧ Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ Ｆｃ領域であり、好ましくはヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４のＦｃ領域である、実施形態３８に記載の多重特異性抗体。
［実施形態４０］
前記Ｆｃ領域は、前記Ｆｃ領域の２つのＦｃポリペプチドの会合を促進するアミノ酸置換を含む、実施形態２９～３９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記Ｆｃ領域は、前記Ｆｃ領域の２つのＦｃポリペプチドの会合を促進するアミノ酸置換を含む、実施形態２９～３９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態４１］
ＥＵ番号に基づき、前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｙ／Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃポリペプチドは、アミノ酸置換Ｙ４０７Ｔ／Ｖ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＬ３６８Ａを含む、実施形態２９～４０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
ＥＵ番号に基づき、前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドは、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｙ／Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、他方のＦｃポリペプチドは、アミノ酸置換Ｙ４０７Ｔ／Ｖ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＬ３６８Ａを含む、実施形態２９～４０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態４２］
前記Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させるアミノ酸置換を含む、実施形態２９～４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させるアミノ酸置換を含む、実施形態２９～４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態４３］
ＥＵ番号に基づき、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させるアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９から選択される１つ以上の位置にあり、好ましくは、前記Ｆｃ領域の２つのＦｃポリペプチドはいずれも、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む；或いはいずれも、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ａを含む、実施形態４２に記載の多重特異性抗体。
ＥＵ番号に基づき、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させるアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９から選択される１つ以上の位置にあり、好ましくは、前記Ｆｃ領域の２つのＦｃポリペプチドはいずれも、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む；或いはいずれも、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ａを含む、実施形態４２に記載の多重特異性抗体。
［実施形態４４］
前記Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域における１つのＦｃポリペプチドのＣＨ３領域とプロテインＡとの結合を減少又は消失させるアミノ酸置換を含む、実施形態２９～４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
前記Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域における１つのＦｃポリペプチドのＣＨ３領域とプロテインＡとの結合を減少又は消失させるアミノ酸置換を含む、実施形態２９～４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態４５］
ＥＵ番号に基づき、前記Ｆｃ領域は、１つのＦｃポリペプチドにおいてのみ生じるアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ又は／及びＹ４３６Ｆを含む、実施形態４４に記載の多重特異性抗体。
ＥＵ番号に基づき、前記Ｆｃ領域は、１つのＦｃポリペプチドにおいてのみ生じるアミノ酸置換Ｈ４３５Ｒ又は／及びＹ４３６Ｆを含む、実施形態４４に記載の多重特異性抗体。
［実施形態４６］
ＥＵ番号に基づき、前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、他方のＦｃポリペプチドは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆを含む、実施形態２９～３９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
ＥＵ番号に基づき、前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、他方のＦｃポリペプチドは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆを含む、実施形態２９～３９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態４７］
三価である実施形態１～４６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
三価である実施形態１～４６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態４８］
（１）配列番号６５で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６７で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との２本で構成されるもの；
（２）配列番号６９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号７１で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との２本で構成されるもの；
（３）配列番号５９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６１で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６３で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との３本で構成されるもの；或いは、
（４）配列番号７３で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６１で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号７５で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との３本で構成されるもの
である実施形態１～４６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
（１）配列番号６５で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６７で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との２本で構成されるもの；
（２）配列番号６９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号７１で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との２本で構成されるもの；
（３）配列番号５９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６１で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６３で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との３本で構成されるもの；或いは、
（４）配列番号７３で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６１で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号７５で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との３本で構成されるもの
である実施形態１～４６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
［実施形態４９］
（１）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との２本で構成されるもの；
（２）配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との２本で構成されるもの；
（３）配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との３本で構成されるもの；或いは、
（４）配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との３本で構成されるもの
である実施形態１に記載の多重特異性抗体。
（１）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との２本で構成されるもの；
（２）配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との２本で構成されるもの；
（３）配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との３本で構成されるもの；或いは、
（４）配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との３本で構成されるもの
である実施形態１に記載の多重特異性抗体。
［実施形態５０］
実施形態１～４９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
実施形態１～４９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸。
［実施形態５１］
実施形態５０に記載の核酸を含むベクター。
実施形態５０に記載の核酸を含むベクター。
［実施形態５２］
実施形態５０に記載の核酸、又は、実施形態５１に記載のベクターを含む宿主細胞。
実施形態５０に記載の核酸、又は、実施形態５１に記載のベクターを含む宿主細胞。
［実施形態５３］
実施形態１～４９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体の製造方法であって、実施形態５２に記載の宿主細胞を培養して前記多重特異性抗体を発現させ、前記多重特異性抗体を系から単離・精製することを含む、多重特異性抗体の製造方法。
実施形態１～４９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体の製造方法であって、実施形態５２に記載の宿主細胞を培養して前記多重特異性抗体を発現させ、前記多重特異性抗体を系から単離・精製することを含む、多重特異性抗体の製造方法。
［実施形態５４］
実施形態１～４９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
実施形態１～４９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
［実施形態５５］
前記被験者に対して、治療有効量の実施形態１～４９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体又は実施形態５４に記載の医薬組成物を投与することを含む、被験者におけるＢＣＭＡ発現に関連する疾患を治療するための方法。
前記被験者に対して、治療有効量の実施形態１～４９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体又は実施形態５４に記載の医薬組成物を投与することを含む、被験者におけるＢＣＭＡ発現に関連する疾患を治療するための方法。
［実施形態５６］
前記疾患は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、全身性エリテマトーデス又は関節リウマチである、実施形態５５に記載の方法。
前記疾患は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、全身性エリテマトーデス又は関節リウマチである、実施形態５５に記載の方法。
［実施形態５７］
（１）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（４）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
を含む単一可変ドメインを含む、ＢＣＭＡ結合抗体。
（１）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（２）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（４）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
を含む単一可変ドメインを含む、ＢＣＭＡ結合抗体。
［実施形態５８］
前記単一可変ドメインは、配列番号１９、２１、２３、２５、３７、３８、３９、４０、４１又は４２で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５７に記載のＢＣＭＡ結合抗体。
前記単一可変ドメインは、配列番号１９、２１、２３、２５、３７、３８、３９、４０、４１又は４２で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５７に記載のＢＣＭＡ結合抗体。
［実施形態５９］
前記単一可変ドメインは、配列番号３７、３８、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態５８に記載のＢＣＭＡ結合抗体。
前記単一可変ドメインは、配列番号３７、３８、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態５８に記載のＢＣＭＡ結合抗体。
［実施形態６０］
前記単一可変ドメインはラクダ科の動物のもの、又はヒト化されたものである、実施形態５７～５９のいずれか１項に記載のＢＣＭＡ結合抗体。
前記単一可変ドメインはラクダ科の動物のもの、又はヒト化されたものである、実施形態５７～５９のいずれか１項に記載のＢＣＭＡ結合抗体。
［実施形態６１］
配列番号２７、２９、３１、３３、５１、５３、５５又は５７で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５７～６０のいずれか１項に記載のＢＣＭＡ結合抗体。
配列番号２７、２９、３１、３３、５１、５３、５５又は５７で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態５７～６０のいずれか１項に記載のＢＣＭＡ結合抗体。
（実施例１）抗ＢＣＭＡ単一ドメイン抗体ファージディスプレイライブラリーの構築
組換えヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＲＯ、カタログ番号ＢＣ７－Ｈ５２５４）と完全フロイントアジュバントを体積比１：１で混合乳化し、フタコブラクダを初回の皮下多点注射により免疫化した後、２週間毎に、組換えヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ融合タンパク質と不完全フロイントアジュバントを体積比１：１で混合乳化した後、追加免疫化を行った。４回目又は５回目の免疫化後、血清を採取し、抗ヒトＢＣＭＡ抗体の力価を測定した。複数回の免疫化後、フタコブラクダの末梢血を採取し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣのＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡに逆転写し、ラクダ抗体のＶＨＨコード断片を増幅した。
組換えヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＲＯ、カタログ番号ＢＣ７－Ｈ５２５４）と完全フロイントアジュバントを体積比１：１で混合乳化し、フタコブラクダを初回の皮下多点注射により免疫化した後、２週間毎に、組換えヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ融合タンパク質と不完全フロイントアジュバントを体積比１：１で混合乳化した後、追加免疫化を行った。４回目又は５回目の免疫化後、血清を採取し、抗ヒトＢＣＭＡ抗体の力価を測定した。複数回の免疫化後、フタコブラクダの末梢血を採取し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣのＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡに逆転写し、ラクダ抗体のＶＨＨコード断片を増幅した。
増幅されたＶＨＨコード断片をＰｓｔＩ／ＮｏｔＩエンドヌクレアーゼで処理した後、ファージミドベクターｐＭＥＣＳ（ＮＴＣＣプラスミドベクター培養細胞遺伝子寄託センター、カタログ番号ｐＭＥＣＳ）に挿入して組換えベクターを構築し、大腸菌ＴＧ１（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号６０５０２－１）中にエレクトロポレーションして、ライブラリー発現株を構築した。ＶＨＨ発現株を対数増殖期まで培養し、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｎ０３１５Ｓ）を加えてライブラリーを増幅し、２８℃、２００ｒｐｍで一晩振盪した。細菌溶液を遠心処理して上清を取り、上清の１／４量のＰＥＧ６０００／ＮａＣｌ溶液（２０％ＰＥＧ６０００（ｗ／ｖ）、２．５Ｍ ＮａＣｌ）を加え、氷上で１～２時間インキュベートしてファージを沈殿させ、ファージ沈殿物を遠心処理によって回収し、ＰＢＳを用いて再懸濁した後、２０％グリセリンを加えたものを、単一ドメイン抗体ファージディスプレイライブラリーとして－８０℃で保存した。
（実施例２）抗ヒトＢＣＭＡ単一ドメイン抗体のスクリーニング
固相パニング法により、単一ドメイン抗体ファージディスプレイライブラリーをパニングした。パニングにより得られた単クローンを培養し、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で発現誘導して上清を調製した。
固相パニング法により、単一ドメイン抗体ファージディスプレイライブラリーをパニングした。パニングにより得られた単クローンを培養し、イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で発現誘導して上清を調製した。
ヒトＢＣＭＡ－Ｈｉｓ（ＡＣＲＯ、カタログ番号ＢＣＡ－Ｈ５２２ｙ）に対する間接ＥＬＩＳＡによって、選択されたクローンの陽性検定を行った。ヒトＢＣＭＡ－Ｈｉｓにのみ結合し、比較的高いシグナル値を持つ陽性クローンを選んで保存し、配列決定した。陽性クローン１Ａ１、１Ａ１０、１Ａ１１及び１Ｂ１０を選別した。配列解析の結果、１Ａ１は、ＶＨＨヌクレオチド配列が配列番号２０であり、アミノ酸配列が配列番号１９であった。１Ａ１０は、ＶＨＨヌクレオチド配列が配列番号２２であり、アミノ酸配列が配列番号２１であった。１Ａ１１は、ＶＨＨヌクレオチド配列が配列番号２４であり、アミノ酸配列が配列番号２３であった。１Ｂ１０は、ＶＨＨヌクレオチド配列が配列番号２６であり、アミノ酸配列が配列番号２５であった。
（実施例３）抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体の調製
３．１ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体の調製
選別された陽性クローンのＶＨＨ配列をヒトＦｃ領域に連結し、ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体を構築した。具体的には、得られたＶＨＨ配列又は抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨコントロール抗体（ＢＭ）配列（アミノ酸配列はＣＮ１０９１５３７３１Ａの配列番号１２５と同じ）を、ヒトＩｇＧ１定常領域（アミノ酸配列は配列番号５）を含むｐＣＤＮＡ３．１真核生物発現ベクターに挿入し、一過性発現システムＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、カタログ番号Ａ２９１２９）により、これらＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体（ＢＭ－Ｆｃはコントロール）を発現させた。プロテインＡアフィニティーカラムにより精製した後、抗体とヒトＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ－Ｒタンパク質との結合状況を表面プラズモン共鳴法により分析した（方法は３．２を参照）。分析の結果、１Ａ１－Ｆｃ、１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ、及び１Ｂ１０－Ｆｃはいずれも、ＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質に特異的に結合できるが、ヒトＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ－Ｒタンパク質には結合できなかった。配列解析の結果、１Ａ１－Ｆｃは、全長アミノ酸配列が配列番号２７のとおりであり、ヌクレオチド配列が配列番号２８のとおりであった。１Ａ１０－Ｆｃは、全長アミノ酸配列が配列番号２９のとおりであり、ヌクレオチド配列が配列番号３０のとおりであった。１Ａ１１－Ｆｃは、全長アミノ酸配列が配列番号３１のとおりであり、ヌクレオチド配列が配列番号３２のとおりであった。１Ｂ１０－Ｆｃは、全長アミノ酸配列が配列番号３３のとおりであり、ヌクレオチド配列が配列番号３４のとおりであった。
３．１ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体の調製
選別された陽性クローンのＶＨＨ配列をヒトＦｃ領域に連結し、ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体を構築した。具体的には、得られたＶＨＨ配列又は抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨコントロール抗体（ＢＭ）配列（アミノ酸配列はＣＮ１０９１５３７３１Ａの配列番号１２５と同じ）を、ヒトＩｇＧ１定常領域（アミノ酸配列は配列番号５）を含むｐＣＤＮＡ３．１真核生物発現ベクターに挿入し、一過性発現システムＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、カタログ番号Ａ２９１２９）により、これらＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体（ＢＭ－Ｆｃはコントロール）を発現させた。プロテインＡアフィニティーカラムにより精製した後、抗体とヒトＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ－Ｒタンパク質との結合状況を表面プラズモン共鳴法により分析した（方法は３．２を参照）。分析の結果、１Ａ１－Ｆｃ、１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ、及び１Ｂ１０－Ｆｃはいずれも、ＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質に特異的に結合できるが、ヒトＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ－Ｒタンパク質には結合できなかった。配列解析の結果、１Ａ１－Ｆｃは、全長アミノ酸配列が配列番号２７のとおりであり、ヌクレオチド配列が配列番号２８のとおりであった。１Ａ１０－Ｆｃは、全長アミノ酸配列が配列番号２９のとおりであり、ヌクレオチド配列が配列番号３０のとおりであった。１Ａ１１－Ｆｃは、全長アミノ酸配列が配列番号３１のとおりであり、ヌクレオチド配列が配列番号３２のとおりであった。１Ｂ１０－Ｆｃは、全長アミノ酸配列が配列番号３３のとおりであり、ヌクレオチド配列が配列番号３４のとおりであった。
３．２ 表面プラズモン共鳴法による抗体とヒトＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ－Ｒタンパク質との結合の分析
生体分子相互作用解析システム（ＧＥ、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を用いて、抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体の特異性を試験した。Ａｎｔｉ－ｈＩｇＧ（Ｆｃ） Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥ、カタログ番号ＢＲ－１００８－３９）をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリングし、抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体をランニングバッファー（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ－２０（ｗ／ｖ）、ｐＨ ７．４）により２μｇ／ｍｌに希釈し、流速３０μｌ／分で、９０ｓ実験チャネルを通して捕捉した。ヒトＴＡＣＩ又はＢＡＦＦ－Ｒタンパク質をランニングバッファーにより１００ｎＭに希釈し、流速５０μｌ／分で結合させ、結合シグナル曲線を観察した。１Ａ１－Ｆｃ、１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ及び１Ｂ１０－Ｆｃはいずれも、結合曲線が観察されなった。ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ－Ｒタンパク質といずれも非結合であった。
生体分子相互作用解析システム（ＧＥ、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を用いて、抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体の特異性を試験した。Ａｎｔｉ－ｈＩｇＧ（Ｆｃ） Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥ、カタログ番号ＢＲ－１００８－３９）をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリングし、抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体をランニングバッファー（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ－２０（ｗ／ｖ）、ｐＨ ７．４）により２μｇ／ｍｌに希釈し、流速３０μｌ／分で、９０ｓ実験チャネルを通して捕捉した。ヒトＴＡＣＩ又はＢＡＦＦ－Ｒタンパク質をランニングバッファーにより１００ｎＭに希釈し、流速５０μｌ／分で結合させ、結合シグナル曲線を観察した。１Ａ１－Ｆｃ、１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ及び１Ｂ１０－Ｆｃはいずれも、結合曲線が観察されなった。ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ－Ｒタンパク質といずれも非結合であった。
（実施例４）抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体とヒト・カニクイザルＢＣＭＡとの親和性
４．１ 表面プラズモン共鳴法による抗体とヒト・カニクイザルＢＣＭＡとの親和性の測定
生体分子相互作用解析システム（ＧＥ、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を用いて、抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体の親和性を試験した。試験の結果、１Ａ１－Ｆｃ、１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ及び１Ｂ１０－Ｆｃはいずれも、ヒトＢＣＭＡタンパク質に対する高い親和性を有し、このうち１Ａ１０－Ｆｃ及び１Ａ１１－Ｆｃは、カニクイザルＢＣＭＡタンパク質に対する交差反応性を示したが、１Ａ１－Ｆｃ、１Ｂ１０－Ｆｃ及びＢＭ－Ｆｃは、カニクイザルＢＣＭＡタンパク質への結合を示さなかった。
４．１ 表面プラズモン共鳴法による抗体とヒト・カニクイザルＢＣＭＡとの親和性の測定
生体分子相互作用解析システム（ＧＥ、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を用いて、抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体の親和性を試験した。試験の結果、１Ａ１－Ｆｃ、１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ及び１Ｂ１０－Ｆｃはいずれも、ヒトＢＣＭＡタンパク質に対する高い親和性を有し、このうち１Ａ１０－Ｆｃ及び１Ａ１１－Ｆｃは、カニクイザルＢＣＭＡタンパク質に対する交差反応性を示したが、１Ａ１－Ｆｃ、１Ｂ１０－Ｆｃ及びＢＭ－Ｆｃは、カニクイザルＢＣＭＡタンパク質への結合を示さなかった。
４．２ フローサイトメトリーによる抗体と細胞との結合の測定
フローサイトメトリーにより、抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体の、異なるＢＣＭＡ発現レベルを有する標的細胞への結合を確認した。ここで、ＣＨＯ－ｈＢＣＭＡ細胞（愛康得生物医学技術（蘇州）有限公司、カタログ番号ＡＫＤ００１Ａ）は、ＢＣＭＡを高発現する安定発現細胞株であり、Ｕ２６６細胞（中国医学科学院基礎医学研究所基礎医学細胞センター、カタログ番号３１１１Ｃ０００１ＣＣＣ０００６８４）は、ＢＣＭＡ発現レベルが中程度の天然ヒト骨髄腫細胞株であり、ＰＲＭＩ８２２６細胞（中国医学科学院基礎医学研究所基礎医学細胞センター、カタログ番号３１１１Ｃ０００１ＣＣＣ００００８３）は、ＢＣＭＡ発現レベルが低い天然ヒト骨髄腫細胞株であり、ＨＵＶＥＣ細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＡＫＤ００１Ａ ８０００）は、ＢＣＭＡを発現しないヒト臍帯静脈内皮細胞株である。勾配希釈（初期濃度１２６ｎＭ、５倍勾配希釈、６濃度）した抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体で２×１０５個の標的細胞をインキュベートし、氷上で１時間インキュベート後、細胞を洗浄して、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－１７０）を加え、氷上で０．５時間インキュベートし、細胞を洗浄した後、フローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴ）で分析した。
フローサイトメトリーにより、抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体の、異なるＢＣＭＡ発現レベルを有する標的細胞への結合を確認した。ここで、ＣＨＯ－ｈＢＣＭＡ細胞（愛康得生物医学技術（蘇州）有限公司、カタログ番号ＡＫＤ００１Ａ）は、ＢＣＭＡを高発現する安定発現細胞株であり、Ｕ２６６細胞（中国医学科学院基礎医学研究所基礎医学細胞センター、カタログ番号３１１１Ｃ０００１ＣＣＣ０００６８４）は、ＢＣＭＡ発現レベルが中程度の天然ヒト骨髄腫細胞株であり、ＰＲＭＩ８２２６細胞（中国医学科学院基礎医学研究所基礎医学細胞センター、カタログ番号３１１１Ｃ０００１ＣＣＣ００００８３）は、ＢＣＭＡ発現レベルが低い天然ヒト骨髄腫細胞株であり、ＨＵＶＥＣ細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＡＫＤ００１Ａ ８０００）は、ＢＣＭＡを発現しないヒト臍帯静脈内皮細胞株である。勾配希釈（初期濃度１２６ｎＭ、５倍勾配希釈、６濃度）した抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体で２×１０５個の標的細胞をインキュベートし、氷上で１時間インキュベート後、細胞を洗浄して、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－１７０）を加え、氷上で０．５時間インキュベートし、細胞を洗浄した後、フローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴ）で分析した。
図１Ａ－１Ｃ、表１に示すように、１Ａ１－Ｆｃ、１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ及び１Ｂ１０－Ｆｃはいずれも、ＢＣＭＡ発現レベルが高いＣＨＯ－ｈＢＣＭＡ細胞及びＢＣＭＡ発現レベルが中程度のＵ２６６細胞を効果的に標的にして結合でき、ＢＣＭＡ発現レベルが低いＲＰＭＩ８２２６細胞に対しても明らかな結合を示した。１Ａ１０－Ｆｃ及び１Ａ１１－Ｆｃは、ＢＭ－ＦｃよりもＵ２６６細胞への結合に優れた。図１Ｄに示すように、１Ａ１０－Ｆｃ及び１Ａ１１－Ｆｃは、ＢＣＭＡを発現しないＨＵＶＥＣ細胞への結合を示さなかったが、１Ａ１－Ｆｃ及び１Ｂ１０－Ｆｃは、ＢＣＭＡを発現しないＨＵＶＥＣ細胞への結合を示した。
４．３ フローサイトメトリーによる抗体とカニクイザルＢＣＭＡ一過性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞との結合の測定
カニクイザルＢＣＭＡ全長（配列番号６）遺伝子をインビトロで合成し、ｐＣＤＮＡ３．１真核生物発現ベクターに挿入した。メーカーのプロトコールに基づき、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｌ３００００１５）により発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５×１０５／ウェルで６ウェルプレートに播種した。約２４時間後、ウシ胎児血清を含む培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、トランスフェクション試薬をＤＮＡ：Ｌｉｐｏ３０００＝５μｇ：７．５μｌの比率となるように各ウェルに添加した。約６時間後、ウシ胎児血清（ｖ／ｖ）を１０％含む培地に交換した。トランスフェクションの約２４時間後、細胞をフローサイトメトリーで分析した。
カニクイザルＢＣＭＡ全長（配列番号６）遺伝子をインビトロで合成し、ｐＣＤＮＡ３．１真核生物発現ベクターに挿入した。メーカーのプロトコールに基づき、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｌ３００００１５）により発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５×１０５／ウェルで６ウェルプレートに播種した。約２４時間後、ウシ胎児血清を含む培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、トランスフェクション試薬をＤＮＡ：Ｌｉｐｏ３０００＝５μｇ：７．５μｌの比率となるように各ウェルに添加した。約６時間後、ウシ胎児血清（ｖ／ｖ）を１０％含む培地に交換した。トランスフェクションの約２４時間後、細胞をフローサイトメトリーで分析した。
１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ及びＢＭ－Ｆｃ抗体を勾配希釈し（初期濃度１２６ｎＭ、５倍勾配希釈、５濃度、試料希釈液を陰性対照群とした）、カニクイザルＢＣＭＡを一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞と、トランスフェクトしていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞をそれぞれ２×１０５個インキュベートし、氷上で１時間インキュベート後、細胞を洗浄して、加ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－１７０）、氷上で０．５時間インキュベートし、細胞を洗浄した後、フローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴ）で分析した。図２中のＡは、カニクイザルＢＣＭＡを一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ－ＣｙｎｏＢＣＭＡ）を用いたものであり、図２中のＢは、カニクイザルＢＣＭＡをトランスフェクトしていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたものである。Ｆｃキメラ抗体と、カニクイザルＢＣＭＡを一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞との結合のＥＣ５０値及び最大結合ＭＦＩ値（Ｂｍａｘ）を表２に示す。結果によれば、１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃは細胞のカニクイザルＢＣＭＡに結合したが、ＢＭ－Ｆｃ抗体はカニクイザルＢＣＭＡに対して非結合であった。
（実施例５）抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体によるＡＰＲＩＬとＢＣＭＡの結合の遮断
段階希釈（初期濃度２５２ ｎＭ、５倍段階希釈、７濃度）した抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ及びＢＭ－Ｆｃのそれぞれを、１００ ｎｇ／ｍｌのビオチン標識組換えＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質（ＡＣＲＯ、カタログ番号ＢＣＡ－Ｈ５２２ｙ）と１：１の体積比で混合し、室温で１時間インキュベートした後、組換えＡＰＲＩＬタンパク質（ＡＣＲＯ、カタログ番号ＡＰＬ－Ｈ５２４４）が固定化されたＥＬＩＳＡプレートに添加した。また、５０ｎｇ／ｍｌのビオチン標識組換えＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質のみ添加したものを対照群とした。３７℃で１時間インキュベートし、結合しなかったビオチン標識ＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質を洗い流し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１８－４１００－５１）を加え、プレートを５回洗浄してから発色させた。波長４５０ｎｍ及び参照波長６５０ｎｍでの吸光シグナル値を測定した。ＢＣＭＡとＡＰＲＩＬの結合のシグナル値に対する各抗体の各濃度試料の遮断率を下記式により求め、カーブフィッティングを行った。
段階希釈（初期濃度２５２ ｎＭ、５倍段階希釈、７濃度）した抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ及びＢＭ－Ｆｃのそれぞれを、１００ ｎｇ／ｍｌのビオチン標識組換えＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質（ＡＣＲＯ、カタログ番号ＢＣＡ－Ｈ５２２ｙ）と１：１の体積比で混合し、室温で１時間インキュベートした後、組換えＡＰＲＩＬタンパク質（ＡＣＲＯ、カタログ番号ＡＰＬ－Ｈ５２４４）が固定化されたＥＬＩＳＡプレートに添加した。また、５０ｎｇ／ｍｌのビオチン標識組換えＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質のみ添加したものを対照群とした。３７℃で１時間インキュベートし、結合しなかったビオチン標識ＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質を洗い流し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１８－４１００－５１）を加え、プレートを５回洗浄してから発色させた。波長４５０ｎｍ及び参照波長６５０ｎｍでの吸光シグナル値を測定した。ＢＣＭＡとＡＰＲＩＬの結合のシグナル値に対する各抗体の各濃度試料の遮断率を下記式により求め、カーブフィッティングを行った。
遮断率＝（対照群のシグナル値－試料のシグナル値）／対照群のシグナル値×１００％
その結果、図３及び表３に示すように、１Ａ１－Ｆｃ、１Ｂ１０－Ｆｃ、１Ａ１０－Ｆｃ及び１Ａ１１－Ｆｃはいずれも、ＡＰＲＩＬとＢＣＭＡの結合を効果的に遮断できた。
その結果、図３及び表３に示すように、１Ａ１－Ｆｃ、１Ｂ１０－Ｆｃ、１Ａ１０－Ｆｃ及び１Ａ１１－Ｆｃはいずれも、ＡＰＲＩＬとＢＣＭＡの結合を効果的に遮断できた。
図４Ａに示すように、ヒトＢＣＭＡ細胞外領域（配列番号３５）とカニクイザルＢＣＭＡ細胞外領域（配列番号３６）とのアミノ酸配列は、Ｇｌｙ６、Ａｌａ２０、Ｉｌｅ２２、Ａｓｎ３１、Ｖａｌ４５及びＴｈｒ５２に違いがある。クローン１Ａ１０及び１Ａ１１がカニクイザルＢＣＭＡタンパク質との交差反応性を示したことから、これらクローンの考え得るエピトープは、Ｇｌｎ７～Ｈｉｓ１９、及び／又はＰｒｏ２３～Ｓｅｒ３０、及び／又はＡｓｎ３１～Ｓｅｒ４４、及び／又はＴｈｒ４６～Ｇｌｙ５１に位置すると推測される。図４Ｂは、ＰＤＢデータベースにおけるヒトＢＣＭＡの細胞外領域構造（ＰＤＢ番号：２ｋｎ１）を示すものである。図４Ａ、４Ｂに示すように、ヒトＢＣＭＡの細胞外領域は、Ｃｙｓ８－Ｃｙｓ２１と、Ｃｙｓ２４－Ｃｙｓ３７と、Ｃｙｓ２８－Ｃｙｓ４１との３対のジスルフィド結合を含む。ヒトＢＣＭＡとＡＰＲＩＬの主な結合はβ－ヘアピン構造にあるため（Ｂｏｓｓｅｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００６， １８（５）：２６３－２７５）、クローン１Ａ１０－Ｆｃ及び１Ａ１１－Ｆｃの主な結合部位は、Ｇｌｎ７～Ｈｉｓ１９の間、及び／又はＰｒｏ２３～Ｓｅｒ３０の間、及び／又はＡｓｎ３１～Ｓｅｒ４４の間にあると考えられる。
（実施例６）抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨの各クローンのエピトープの違いに関する分析
６．１ ＥＬＩＳＡ（チェッカーボード法）による抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨの各クローン間の競合関係の分析
抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体を２μｇ／ｍｌに希釈して、高吸着ＥＬＩＳＡプレートにコートし、プレートを洗浄してブロックした。２０μｇ／ｍｌの抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体とビオチン標識ＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質（ＡＣＲＯ、カタログ番号ＢＣＡ－Ｈ５２２ｙ）とを室温で０．５時間インキュベートして、抗原抗体混合物を得た。インキュベートされた抗体抗原混合物、又は、ビオチン標識ＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質（対照群）のみをチェッカーボード配置法に従って、ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。結合しなかったビオチン標識ＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質を洗い流し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１８－４１００－５１）を加え、プレートを５回洗浄してから発色させた。波長４５０ｎｍ及び参照波長６５０ｎｍでの吸光シグナル値を測定した。一抗体による別の抗体とＢＣＭＡ－Ｂｉｏとの結合のシグナルに対する遮断率を下記式により求めた。
６．１ ＥＬＩＳＡ（チェッカーボード法）による抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨの各クローン間の競合関係の分析
抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体を２μｇ／ｍｌに希釈して、高吸着ＥＬＩＳＡプレートにコートし、プレートを洗浄してブロックした。２０μｇ／ｍｌの抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体とビオチン標識ＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質（ＡＣＲＯ、カタログ番号ＢＣＡ－Ｈ５２２ｙ）とを室温で０．５時間インキュベートして、抗原抗体混合物を得た。インキュベートされた抗体抗原混合物、又は、ビオチン標識ＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質（対照群）のみをチェッカーボード配置法に従って、ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで添加し、３７℃で１時間インキュベートした。結合しなかったビオチン標識ＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質を洗い流し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１８－４１００－５１）を加え、プレートを５回洗浄してから発色させた。波長４５０ｎｍ及び参照波長６５０ｎｍでの吸光シグナル値を測定した。一抗体による別の抗体とＢＣＭＡ－Ｂｉｏとの結合のシグナルに対する遮断率を下記式により求めた。
遮断率＝（対照群のシグナル値－試料のシグナル値）／対照群のシグナル値×１００％
その結果、表４に示すように、チェッカーボードの対角線「＼」（灰色）は、抗体自己競合の陽性対照群であり、遮断率はいずれも９９％以上であった。１Ａ１１－ＦｃとヒトＢＣＭＡの結合に対する１Ａ１０－Ｆｃの遮断率（３２．６％）は５０％未満であり、１Ａ１０－ＦｃとヒトＢＣＭＡの結合に対する１Ａ１１－Ｆｃの遮断率（２１．６％）も５０％未満であったことから、１Ａ１０－Ｆｃと１Ａ１１－Ｆｃの間に明確な競合関係がなく、１Ａ１０－Ｆｃと１Ａ１１－ＦｃはＢＣＭＡタンパク質上の異なるエピトープに同時に結合できると考えられる。同様に、１Ａ１０－Ｆｃと１Ａ１－Ｆｃの間、１Ａ１０－Ｆｃと１Ｂ１０－Ｆｃの間にも明確な競合関係がなく、１Ａ１０－Ｆｃと１Ａ１－ＦｃはＢＣＭＡタンパク質上の異なるエピトープに同時に結合でき、１Ａ１０－Ｆｃと１Ｂ１０はＢＣＭＡタンパク質上の異なるエピトープに同時に結合できると考えられる。１Ａ１－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ及び１Ｂ１０－Ｆｃ間の相互の遮断率はいずれも、９９％を超えた。
その結果、表４に示すように、チェッカーボードの対角線「＼」（灰色）は、抗体自己競合の陽性対照群であり、遮断率はいずれも９９％以上であった。１Ａ１１－ＦｃとヒトＢＣＭＡの結合に対する１Ａ１０－Ｆｃの遮断率（３２．６％）は５０％未満であり、１Ａ１０－ＦｃとヒトＢＣＭＡの結合に対する１Ａ１１－Ｆｃの遮断率（２１．６％）も５０％未満であったことから、１Ａ１０－Ｆｃと１Ａ１１－Ｆｃの間に明確な競合関係がなく、１Ａ１０－Ｆｃと１Ａ１１－ＦｃはＢＣＭＡタンパク質上の異なるエピトープに同時に結合できると考えられる。同様に、１Ａ１０－Ｆｃと１Ａ１－Ｆｃの間、１Ａ１０－Ｆｃと１Ｂ１０－Ｆｃの間にも明確な競合関係がなく、１Ａ１０－Ｆｃと１Ａ１－ＦｃはＢＣＭＡタンパク質上の異なるエピトープに同時に結合でき、１Ａ１０－Ｆｃと１Ｂ１０はＢＣＭＡタンパク質上の異なるエピトープに同時に結合できると考えられる。１Ａ１－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ及び１Ｂ１０－Ｆｃ間の相互の遮断率はいずれも、９９％を超えた。
６．２ 表面プラズモン共鳴法によるエピトープの違いの分析
生体分子相互作用解析システム（ＧＥ、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）により、エピトープ競合関係を分析した。Ａｎｔｉ－Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥ、カタログ番号２８９９５０５６）をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリングし、ＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質（ＡＣＲＯ、カタログ番号ＢＣＡ－Ｈ５２２ｙ）をランニングバッファーにより１μｇ／ｍｌ程度に希釈し、流速３０μｌ／分で実験チャネルを通して捕捉し、結合時間を調整することによって捕捉シグナルを１８０ＲＵ～１９０ＲＵにした。抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体ＶＨＨ－Ｆｃ １をランニングバッファーにより１０μｇ／ｍｌ（飽和濃度。濃度が増加しても結合シグナル値は変化しない。）に希釈し、シグナルがプラットフォームに到達するまで注入した。注入が終わると、別の抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体ＶＨＨ－Ｆｃ２を直ちに注入した。抗体結合曲線を観察し、２つの抗体の結合シグナル値をそれぞれ記録した。シグナル値の変化を表５に示す。１Ａ１０－Ｆｃ抗体とＢＣＭＡの結合が飽和に達したときのシグナル値は４７２．５ＲＵであり、この時点で１Ａ１１－Ｆｃをさらに注入すると、飽和シグナル値は５７９．０ＲＵとなり、１Ａ１１－Ｆｃを単独で注入したときの飽和シグナル値６５３．１ＲＵと同等になった。逆も同様であり、正順序注入と逆順序注入の蓄積シグナル値は類似した。このように、１Ａ１０－Ｆｃと１Ａ１１－ＦｃはＢＣＭＡタンパク質上の異なるエピトープに同時に結合できると考えられる。
生体分子相互作用解析システム（ＧＥ、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）により、エピトープ競合関係を分析した。Ａｎｔｉ－Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＧＥ、カタログ番号２８９９５０５６）をセンサーチップＣＭ５にアミンカップリングし、ＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質（ＡＣＲＯ、カタログ番号ＢＣＡ－Ｈ５２２ｙ）をランニングバッファーにより１μｇ／ｍｌ程度に希釈し、流速３０μｌ／分で実験チャネルを通して捕捉し、結合時間を調整することによって捕捉シグナルを１８０ＲＵ～１９０ＲＵにした。抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体ＶＨＨ－Ｆｃ １をランニングバッファーにより１０μｇ／ｍｌ（飽和濃度。濃度が増加しても結合シグナル値は変化しない。）に希釈し、シグナルがプラットフォームに到達するまで注入した。注入が終わると、別の抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体ＶＨＨ－Ｆｃ２を直ちに注入した。抗体結合曲線を観察し、２つの抗体の結合シグナル値をそれぞれ記録した。シグナル値の変化を表５に示す。１Ａ１０－Ｆｃ抗体とＢＣＭＡの結合が飽和に達したときのシグナル値は４７２．５ＲＵであり、この時点で１Ａ１１－Ｆｃをさらに注入すると、飽和シグナル値は５７９．０ＲＵとなり、１Ａ１１－Ｆｃを単独で注入したときの飽和シグナル値６５３．１ＲＵと同等になった。逆も同様であり、正順序注入と逆順序注入の蓄積シグナル値は類似した。このように、１Ａ１０－Ｆｃと１Ａ１１－ＦｃはＢＣＭＡタンパク質上の異なるエピトープに同時に結合できると考えられる。
６．３ フローサイトメトリーによるエピトープの違いの分析
細胞膜上に発現されたＢＣＭＡタンパク質は、エピトープの有効な露出について遊離タンパク質とは異なる可能性があるため、１Ａ１０、１Ａ１１との２つのクローンが細胞膜上のＢＣＭＡタンパク質に同時に結合できるかをフローサイトメトリーによりさらに確認した。Ｕ２６６細胞を標的細胞とした。２×１０５個の標的細胞を、２０μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌの抗体１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ単独で、又は、２０μｇ／ｍｌの抗体１Ａ１０－Ｆｃと２０μｇ／ｍｌの抗体１Ａ１１－Ｆｃを１：１の体積比で混合したものを用いてインキュベートし、氷上で１時間インキュベート後、細胞を洗浄して、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－１７０）を添加し、氷上で０．５時間インキュベートし、細胞を洗浄した後、フローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴ）で分析した。結果を表６に示す。同じ抗体を１０μｇ／ｍｌ追加すると、１Ａ１０－Ｆｃ試料の平均蛍光増加率は９０２．０／８２３．５－１＝９．５％となり、１Ａ１１－Ｆｃ試料の平均蛍光増加率は７０２．０／６９７．５－１＝０．６％となったことから、２つの抗体はいずれも１０μｇ／ｍｌが飽和濃度に近いと考えられる。一方、これに加えて別の抗体を１０μｇ／ｍｌ追加すると、すなわち、１０μｇ／ｍｌの１Ａ１０－Ｆｃに１０μｇ／ｍｌの１Ａ１１－Ｆｃを加えると、平均蛍光増加率は１４４３．５／８２３．５－１＝７５．３％となり、１０μｇ／ｍｌの１Ａ１１－Ｆｃに１０μｇ／ｍｌの１Ａ１０－Ｆｃを加えると、平均蛍光増加率は１４４３．５／６９７．５－１＝１０７．０％となった。このように、２つの抗体１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃは、細胞膜上のＢＣＭＡタンパク質の異なるエピトープに同時に結合できると考えられる。
細胞膜上に発現されたＢＣＭＡタンパク質は、エピトープの有効な露出について遊離タンパク質とは異なる可能性があるため、１Ａ１０、１Ａ１１との２つのクローンが細胞膜上のＢＣＭＡタンパク質に同時に結合できるかをフローサイトメトリーによりさらに確認した。Ｕ２６６細胞を標的細胞とした。２×１０５個の標的細胞を、２０μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌの抗体１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ単独で、又は、２０μｇ／ｍｌの抗体１Ａ１０－Ｆｃと２０μｇ／ｍｌの抗体１Ａ１１－Ｆｃを１：１の体積比で混合したものを用いてインキュベートし、氷上で１時間インキュベート後、細胞を洗浄して、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－１７０）を添加し、氷上で０．５時間インキュベートし、細胞を洗浄した後、フローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴ）で分析した。結果を表６に示す。同じ抗体を１０μｇ／ｍｌ追加すると、１Ａ１０－Ｆｃ試料の平均蛍光増加率は９０２．０／８２３．５－１＝９．５％となり、１Ａ１１－Ｆｃ試料の平均蛍光増加率は７０２．０／６９７．５－１＝０．６％となったことから、２つの抗体はいずれも１０μｇ／ｍｌが飽和濃度に近いと考えられる。一方、これに加えて別の抗体を１０μｇ／ｍｌ追加すると、すなわち、１０μｇ／ｍｌの１Ａ１０－Ｆｃに１０μｇ／ｍｌの１Ａ１１－Ｆｃを加えると、平均蛍光増加率は１４４３．５／８２３．５－１＝７５．３％となり、１０μｇ／ｍｌの１Ａ１１－Ｆｃに１０μｇ／ｍｌの１Ａ１０－Ｆｃを加えると、平均蛍光増加率は１４４３．５／６９７．５－１＝１０７．０％となった。このように、２つの抗体１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃは、細胞膜上のＢＣＭＡタンパク質の異なるエピトープに同時に結合できると考えられる。
（実施例７）抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラモノクローナル抗体及びそのヒト化モノクローナル抗体の構築、発現、精製
ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体１Ａ１０－Ｆｃ及び１Ａ１１－Ｆｃをそれぞれヒト化した。そのうち、キメラ抗体１Ａ１０－Ｆｃのヒト化により、１Ａ１０－Ｖ１及び１Ａ１０－Ｖ２という２つのヒト化抗体が得られた。キメラ抗体１Ａ１１－Ｆｃのヒト化により、１Ａ１１－Ｖ１及び１Ａ１１－Ｖ２という２つのヒト化抗体が得られた。上記抗体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を表７に示す。
ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体１Ａ１０－Ｆｃ及び１Ａ１１－Ｆｃをそれぞれヒト化した。そのうち、キメラ抗体１Ａ１０－Ｆｃのヒト化により、１Ａ１０－Ｖ１及び１Ａ１０－Ｖ２という２つのヒト化抗体が得られた。キメラ抗体１Ａ１１－Ｆｃのヒト化により、１Ａ１１－Ｖ１及び１Ａ１１－Ｖ２という２つのヒト化抗体が得られた。上記抗体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を表７に示す。
抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体及びそのヒト化抗体をコードするＤＮＡ配列（配列番号３０、５２、５４、３２、５６、５８。対応する名称を表７に示す。）を合成し、それぞれｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクターにクローニングした。ＥｘｐｉＣＨＯ発現キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ２９１３３）を用いて各抗体を発現させた。まず、構築した抗体ＤＮＡ配列を含む発現ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｓ、Ｔｈｅｒｍｏ社）にトランスフェクトした。次に、細胞をＥｘｐｉＣＨＯ発現培地中で、３７℃、８％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気のインキュベーター内で、１３０ｒｐｍで回転するオービタルシェーカー上で培養した。培養上清を回収し、プロテインＡ磁気ビーズ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｌ００２７３）を用いてタンパク質の精製を行った。ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ｌｉｔｅ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりタンパク質濃度を測定した。
（実施例８）抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体及びそのヒト化抗体と、抗原であるヒトＢＣＭＡとの結合
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）により、ヒトＢＣＭＡタンパク質に対する被験抗体の親和性の測定を以下のとおり実施した。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）により、ヒトＢＣＭＡタンパク質に対する被験抗体の親和性の測定を以下のとおり実施した。
Ａｎｔｉ－ｈＩｇＧ（Ｃｙｔｉｖａ，カタログ２９２３４６００）をカップリングしたチップＣＭ５（Ｃｙｔｉｖａ，カタログ２９１４９６０３）を用いて、一定量の被験抗体（１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ、１Ａ１０－Ｖ１、１Ａ１０－Ｖ２、１Ａ１１－Ｖ１、１Ａ１１－Ｖ２を含む。）を捕捉した後、ヒトＢＣＭＡをチップ表面に流し、ソフトウェアＢｉａｃｏｒｅにより反応シグナルをリアルタイムで検出することで、結合曲線及び解離曲線を得た。実験で使用したバッファーは、Ｂｉａｃｏｒｅ汎用バッファー（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ－２０（ｗ／ｖ）、ｐＨ ７．４）であった。チップＣＭ５の表面にカップリングしたＡｎｔｉ－ｈＩｇＧの反応値が９０００ＲＵ程度に達し、被験抗体（１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ、１Ａ１０－Ｖ１、１Ａ１０－Ｖ２、１Ａ１１－Ｖ１、１Ａ１１－Ｖ２を含む。）を約２００ＲＵ捕捉した後、各濃度のヒトＢＣＭＡ（１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ）と被験抗体（１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ、１Ａ１０－Ｖ１、１Ａ１０－Ｖ２、１Ａ１１－Ｖ１、１Ａ１１－Ｖ２を含む。）との相互作用のシグナル値を測定した。フローセルの流速は５０μｌ／分とし、結合時間は２４０ｓとし、解離時間は１４００ｓとし、３Ｍ ＭｇＣｌ２（ＧＥ）による再生は６０ｓとし、ベースラインは安定していた。ｂｉａｃｏｒｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅのａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ １：１の結合モデルにより計算して結果を得た。抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体及びそのヒト化抗体（１Ａ１０－Ｆｃ、１Ａ１１－Ｆｃ、１Ａ１０－Ｖ１、１Ａ１０－Ｖ２、１Ａ１１－Ｖ１、１Ａ１１－Ｖ２を含む。）のヒトＢＣＭＡに対する親和性を表８に示す。
（実施例９）抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３多重特異性抗体の構築、発現、精製
Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ（Ｒｉｄｇｗａｙ， ｅｔ ａｌ．， １９９６）技術を利用したＦｃ改変により、ヒトＩｇＧ１としてａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体を作製した。多重特異性抗体の構築中に形成されたホモ二量体をプロテインＡアフィニティー精製において除去するのに好適であることから、Ｆｃ領域におけるポリペプチド配列のうちの一方は、プロテインＡに対するＦｃの親和性を低下させるＨ４３５Ｒ、Ｙ４３６Ｆ変異（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７）を含むように設計された。
Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ（Ｒｉｄｇｗａｙ， ｅｔ ａｌ．， １９９６）技術を利用したＦｃ改変により、ヒトＩｇＧ１としてａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体を作製した。多重特異性抗体の構築中に形成されたホモ二量体をプロテインＡアフィニティー精製において除去するのに好適であることから、Ｆｃ領域におけるポリペプチド配列のうちの一方は、プロテインＡに対するＦｃの親和性を低下させるＨ４３５Ｒ、Ｙ４３６Ｆ変異（Ｊｅｎｄｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７）を含むように設計された。
本実施例において、本発明の４つのａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体を構築し、それぞれＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２及びＰＣ３と命名した。そのうち、ＢＣ２４の構成は図６Ａに示すとおりであり、ＰＣ１の構成は図６Ｂに示すとおりであり、ＰＣ２の構成は図６Ｃに示すとおりであり、ＰＣ３の構成は図６Ｄに示すとおりである。構築された多重特異性抗体において、ＢＣＭＡに結合する抗原結合ドメインは、抗ヒトＢＣＭＡ ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体及びそのヒト化抗体に由来するものであり、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインは、ｓｐ３４抗体（Ｓｉｌｖａｎａ Ｐｅｓｓａｎｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｔ３／Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ： ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ２０－ｋｄ Ｔ３ （Ｔ３－ｄｅｌｔａ ａｎｄ Ｔ３‐ｅｐｓｉｌｏｎ） ｓｕｂｕｎｉｔｓ， ＥＭＢＯ Ｊ． １９８５ Ｆｅｂ； ４（２）： ３３７－３４４．）をヒト化することで得られたものである。
ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体ＢＣ２４は３本のポリペプチド鎖を有し、これらポリペプチド鎖のうちの１本（Ａ１０－ｌｉｎｋｅｒ－Ａ１１－Ｆｃと命名）は、１Ａ１０－Ｆｃ及び１Ａ１１－Ｆｃの単一可変ドメインにそれぞれ由来する２つのＢＣＭＡに結合する抗原結合ドメインをタンデムに含む。当該ポリペプチド鎖Ａ１０－ｌｉｎｋｅｒ－Ａ１１のアミノ酸配列は配列番号５９で表されるものであり、ヌクレオチド配列は配列番号６０で表されるものである。ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体ＢＣ２４の残りの２本のポリペプチド鎖は、ＣＤ３に結合するＦａｂ型抗原結合ドメインを含むように形成され、これら２本のポリペプチド鎖はそれぞれ、ａｎｔｉ－ＣＤ３－ＨＣ－Ｆｃ（アミノ酸配列は配列番号６１で表されるものであり、ヌクレオチド配列は配列番号６２で表されるものである。）と、ａｎｔｉ－ＣＤ３－ＬＣ（アミノ酸配列は配列番号６３で表されるものであり、ヌクレオチド配列は配列番号６４で表されるものである。）と命名された。
ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体ＰＣ１は２本のポリペプチド鎖を有し、これらポリペプチド鎖のうちの一方（ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ａ１０－ｖ１－ｌｉｎｋｅｒ－Ａ１１－ｖ１－Ｆｃと命名）は、ヒト化抗体１Ａ１０－Ｖ１及び１Ａ１１－Ｖ１の単一可変ドメインにそれぞれ由来する２つのＢＣＭＡに結合する抗原結合ドメインをタンデムに含む。Ｆｃにおける一方のポリペプチド鎖のＮ末端は、ＢＣＭＡに結合する抗原結合ドメイン（１Ａ１１－Ｖ１由来）と融合されている。当該ポリペプチド鎖ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ａ１０－ｖ１－ｌｉｎｋｅｒ－Ａ１１－ｖ１－Ｆｃのアミノ酸配列は配列番号６５で表されるものであり、ヌクレオチド配列は配列番号６６で表されるものである。ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体ＰＣ１の他方のポリペプチド鎖（ａｎｔｉ－ＣＤ３－ｓｃＦｖ－Ｆｃと命名）は、ＣＤ３に結合する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をタンデムに含むＳｃＦｖ構造となる、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインを含む。Ｆｃにおける他方のポリペプチド鎖のＮ末端は、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインと融合されている。当該ポリペプチド鎖ａｎｔｉ－ＣＤ３－ｓｃＦｖ－Ｆｃのアミノ酸配列は配列番号６７で表されるものであり、ヌクレオチド配列は配列番号６８で表されるものである。
ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体ＰＣ２は２本のポリペプチド鎖を有し、これらポリペプチド鎖のうちの一方（ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ａ１０－ｖ１－Ｆｃと命名）は、ヒト化抗体１Ａ１０－ｖ１の単一可変ドメインに由来する１つのＢＣＭＡに結合する抗原結合ドメインを含む。Ｆｃにおける一方のポリペプチド鎖のＮ末端は、ＢＣＭＡに結合する抗原結合ドメインと融合されている。当該ポリペプチド鎖ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ａ１０－ｖ１－Ｆｃのアミノ酸配列は配列番号６９で表されるものであり、ヌクレオチド配列は配列番号７０で表されるものである。ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体ＰＣ２の他方のポリペプチド鎖（ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ａ１１－ｖ１－ｌｉｎｋｅｒ－ａｎｔｉ－ＣＤ３－ｓｃＦｖ－Ｆｃと命名）は、ＣＤ３に結合する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をタンデムに含むＳｃＦｖ構造となる、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインと、ヒト化抗体１Ａ１１－ｖ１の単一可変ドメインに由来するＢＣＭＡに結合する抗原結合ドメインとをタンデムに含む。Ｆｃにおける他方のポリペプチド鎖のＮ末端は、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインと融合されている。当該ポリペプチド鎖ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ａ１１－ｖ１－ｌｉｎｋｅｒ－ａｎｔｉ－ＣＤ３－ｓｃＦｖ－Ｆｃのアミノ酸配列は配列番号７１で表されるものであり、ヌクレオチド配列は配列番号７２で表されるものである。
ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体ＰＣ３は３本のポリペプチド鎖を有し、これらポリペプチド鎖のうちの１本（ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ａ１１－ｖ１－Ｆｃ）は、ヒト化抗体１Ａ１１－ｖ１の単一可変ドメインに由来する１つのＢＣＭＡに結合する抗原結合ドメインを含む。Ｆｃにおける一方のポリペプチド鎖のＮ末端は、ＢＣＭＡに結合する抗原結合ドメインと融合されている。当該ポリペプチド鎖ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ａ１１－ｖ１－Ｆｃのアミノ酸配列は配列番号７３で表されるものであり、ヌクレオチド配列は配列番号７４で表されるものである。ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体ＰＣ３の残りの２本のポリペプチド鎖は、ＣＤ３に結合するＦａｂ形式の抗原結合ドメインを含むように形成されている。Ｆａｂ軽鎖のＮ末端は、ヒト化抗体１Ａ１０－ｖ１の単一可変ドメインに由来するＢＣＭＡに結合する抗原結合ドメインと融合されている。Ｆｃにおける他方のポリペプチド鎖のＮ末端は、ＣＤ３に結合する抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖と融合されている。これら２本のポリペプチド鎖はそれぞれ、ａｎｔｉ－ＣＤ３－ＨＣ－Ｆｃ（アミノ酸配列は配列番号６１で表されるものであり、ヌクレオチド配列は配列番号６２で表されるものである。）と、ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ａ１０－ｖ１－ｌｉｎｋｅｒ－ａｎｔｉ－ＣＤ３－ＶＬ（アミノ酸配列は配列番号７５で表されるものであり、ヌクレオチド配列は配列番号７６で表されるものである。）と命名された。
本実施例において、セルジーン社のａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３二重特異性抗体をコントロール抗体（配列はＵＳ２０１９０２６３９２０Ａ１に記載）として用いた。本実施例で使用したａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３二重特異性コントロール抗体Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（以下、セルジーンＢＭ又はｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭという。）は、ＢＣＭＡに結合するＦａｂ型抗原結合ドメイン２つと、ＣＤ３に結合するＦａｂ型抗原結合ドメイン１つとを含む。その一方のａｎｔｉ－ＢＣＭＡアームはａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ｆａｂ－Ｆｃ構造のものであり、ポリペプチド鎖ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－ＨＣ－Ｆｃ（アミノ酸配列は配列番号７７で表されるものであり、ヌクレオチド配列は配列番号７８で表されるものである。）と、ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－ＬＣ（アミノ酸配列は配列番号７９で表されるものであり、ヌクレオチド配列は配列番号８０で表されるものである。）とを含むとともに、精製工程の収率を高めるためにａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－ＨＣ－Ｆｃ（配列番号７７）にＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ変異を加えたものである。ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３二重特異性コントロール抗体ＢＭの他方のａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３アームの構造はａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ｆａｂ－ＣＤ３－Ｆａｂ－Ｆｃ構造であり、ポリペプチド鎖ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－ＶＨ－ａｎｔｉ－ＣＤ３－ＶＬ－Ｆｃ（アミノ酸配列は配列番号８１、ヌクレオチド配列は配列番号８２で表されるものである。）と、ａｎｔｉ－ＣＤ３－ＶＨ－ＣＬ（アミノ酸配列は配列番号８３、ヌクレオチド配列は配列番号８４で表されるものである。）と、ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－ＬＣ（アミノ酸配列は配列番号７９で表されるものであり、ヌクレオチド配列は配列番号８０で表されるものである。）とを含む。
各ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体について、抗体を構成する各ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列をそれぞれｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターに插入し、対応するポリペプチド鎖を発現する発現ベクターを得た。タンパク質の発現は、ＣＭＶプロモーターによって駆動される。ポリアデニル化は、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ｐｏｌｙＡシグナル配列によって駆動される。また、各ベクターには自律複製のためのＯｒｉ配列が含まれている。
これらの抗体分子を生成させるために、ＥｘｐｉＣＨＯ発現キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ２９１３３）を用いて各抗体の組み合わせを発現させた。まず、対応する発現ベクターを特定の比率（ＰＣ１におけるトランスフェクション比率は、ベクター（ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ａ１０－ｖ１－ｌｉｎｋｅｒ－Ａ１１－ｖ１－Ｆｃ）：ベクター（ａｎｔｉ－ＣＤ３－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）が１：１．５であり、ＰＣ２におけるトランスフェクション比率は、ベクター（ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ａ１０－ｖ１－Ｆｃ）：ベクター（ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ａ１１－ｖ１－ｌｉｎｋｅｒ－ａｎｔｉ－ＣＤ３－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）が１：１．５であり、ＰＣ３におけるトランスフェクション比率は、ベクター（ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ａ１１－ｖ１－Ｆｃ）：ベクター（ａｎｔｉ－ＣＤ３－ＨＣ－Ｆｃ）：ベクター（ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－Ａ１０－ｖ１－ｌｉｎｋｅｒ－ａｎｔｉ－ＣＤ３－ＶＬ）が１：１．５：１．５であり、ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭのトランスフェクション比率は、ベクター（ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－ＨＣ－Ｆｃ）：ベクター（ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－ＬＣ）：ベクター（ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ－ＶＨ－ａｎｔｉ－ＣＤ３－ＶＬ－Ｆｃ）：ベクター（ａｎｔｉ－ＣＤ３－ＶＨ－ＣＬ）が１：２：１：１．５であり、ＢＣ２４におけるトランスフェクション比率は、ベクター（Ａ１０－ｌｉｎｋｅｒ－Ａ１１－Ｆｃ）：ベクター（ａｎｔｉ－ＣＤ３－ＨＣ－Ｆｃ）：ベクター（ａｎｔｉ－ＣＤ３－ＬＣ）が１：１．５：２である。）で、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｓ、Ｔｈｅｒｍｏ社）にトランスフェクトした。次に、細胞をＥｘｐｉＣＨＯ発現培地中で、３７℃、８％ＣＯ２含有湿潤雰囲気でのインキュベーター内で、１３０ｒｐｍで回転するオービタルシェーカー上で培養した。１０～１４日間培養した後、細胞培養上清を回収し、遠心処理によって細胞を除去した。上清をＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ １００ （ＧＥ）システムでアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びゲルクロマトグラフィーによって精製した。
精製したタンパク質試料のタンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数を用いて２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって求めた。
サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＳＥＣ）により、各チューブに収集された試料の純度を検出した。具体的には、分析用サイズ排除カラムＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ｃｏｌｕｍｎ（ＷＡＴＥＲＳ）を用いて、２５℃、１６ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３４ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０のランニングバッファー中で分子の凝集含有量を分析した。ＳＥＣ結果に基づき、９５％を超えた純度を有する試料を合わせた。
Ｗａｔｅｒｓ ＬＣ－ＭＳシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，ＵＳＡ，ＵＫ）を用いて完全分子量分析を行った。ＭＡｂＰａｃ ＲＰ ４ μｍ ２．１×５０ ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳＡ）カラムを採用し、Ａ相（０．１％ ギ酸水溶液）、Ｂ相（０．１％ ギ酸アセトニトリル溶液）を移動相とし、測定波長を２８０ｎｍとした。１μｇのタンパク質を液体質量分析計に注入し、グラジエントは５．５分以内で５％Ｂ～１００％Ｂとした。質量分析計は陽イオンモードとし、スキャン範囲は２００～４０００ｍ／ｚとした。ＭａｓｓＬｙｎｘ ４．１によりデータを収集し、ＵＮＩＦＩ １．８．２．１６９によりデータ処理を行った。ＬＣ－ＭＳ分析は、上述した各ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体試料の測定分子量が理論的分子量と一致していることを示した。図１８は、ＰＣ１の完全分子量の測定結果を示す。試料のメインピーク分子量は１０８５１６Ｄａであり、ＰＣ１の理論的分子量と一致している。相同な不純物のピークは観察されなかった。
（実施例１０）Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体と抗原の結合ＳＰＲ
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）により、ヒトＣＤ３ｅ又はヒトＢＣＭＡタンパク質に対する被験抗体の親和性の測定を以下のとおり実施した。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）により、ヒトＣＤ３ｅ又はヒトＢＣＭＡタンパク質に対する被験抗体の親和性の測定を以下のとおり実施した。
Ａｎｔｉ－ｈＩｇＧ（Ｃｙｔｉｖａ，カタログ２９２３４６００）をカップリングしたチップＣＭ５（Ｃｙｔｉｖａ，カタログ２９１４９６０３）を用いて、一定量のａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、セルジーンＢＭを含む。）を捕捉し、ヒトＣＤ３ｅ（Ａｃｒｏ、品番ＣＤＥ－Ｈ５２２３）又はヒトＢＣＭＡをチップ表面に流し、ソフトウェアＢｉａｃｏｒｅにより反応シグナルをリアルタイムで検出することで、結合曲線及び解離曲線を得た。実験で使用したバッファーは、Ｂｉａｃｏｒｅ汎用バッファー（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ－２０（ｗ／ｖ）、ｐＨ ７．４）であった。チップＣＭ５の表面にカップリングしたＡｎｔｉ－ｈＩｇＧの反応値が９０００ ＲＵ程度に達し、ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、セルジーンＢＭを含む。）を約２００ＲＵ捕捉した後、各濃度のヒトＣＤ３ｅタンパク質（１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ）又はヒトＢＣＭＡ（１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ）とａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、セルジーンＢＭを含む。）との相互作用のシグナル値を測定した。フローセルの流速は５０μｌ／分とし、結合時間は２４０ｓとし、解離時間は１４００ｓとし、３Ｍ ＭｇＣｌ２（ＧＥ）による再生は６０ｓとし、ベースラインは安定していた。ｂｉａｃｏｒｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅのａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ １：１の結合モデルにより計算して結果を得た。ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、セルジーンＢＭを含む。）のヒトＣＤ３ｅタンパク質又はヒトＢＣＭＡに対する親和性を表１０に示す。
（実施例１１）Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体と多発性骨髄腫細胞表面ＢＣＭＡとの結合
フローサイトメトリーにより、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭを含む。）と、ＢＣＭＡを発現したＮＣＩ－Ｈ９２９細胞（ＢＣＭＡ高発現細胞株、南京科佰生物から入手）、ＭＭ１Ｓ細胞（ＢＣＭＡ中発現細胞株、北納生物から入手）及びＲＰＭＩ－８２２６細胞（ＢＣＭＡ低発現細胞株、中国医学科学院基礎医学研究所細胞資源センターから入手）上のＢＣＭＡとの結合を分析した。陰性対照はトラスツズマブを用いた。
フローサイトメトリーにより、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭを含む。）と、ＢＣＭＡを発現したＮＣＩ－Ｈ９２９細胞（ＢＣＭＡ高発現細胞株、南京科佰生物から入手）、ＭＭ１Ｓ細胞（ＢＣＭＡ中発現細胞株、北納生物から入手）及びＲＰＭＩ－８２２６細胞（ＢＣＭＡ低発現細胞株、中国医学科学院基礎医学研究所細胞資源センターから入手）上のＢＣＭＡとの結合を分析した。陰性対照はトラスツズマブを用いた。
詳細な実験手順は以下のとおりである。
対数増殖期のＮＣＩ－Ｈ９２９細胞（ＢＣＭＡ＋＋＋）、ＭＭ１Ｓ細胞（ＢＣＭＡ＋＋）及びＲＰＭＩ－８２２６細胞（ＢＣＭＡ＋）のそれぞれを、２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ培地（Ｈｙｃｌｏｎ、カタログ番号ＳＨ３０８０９．０１）を用いて、細胞密度が５×１０６～１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整し、９６ウェルＵ字型細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号：３７９９）に１ウェルあたり５０μｌずつ播種した。上記培地を用いて様々な濃度の被験抗体を調製し、ＢＣＭＡ高発現及び中発現の細胞については、抗体濃度は最大４４０ｎＭで、５倍段階希釈して合計９濃度段階とし、ＢＣＭＡ低発現細胞については、抗体濃度は最大２２００ｎＭで、５倍段階希釈して合計１０濃度段階とした。各濃度の抗体を上記９６ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり５０μｌずつ添加し、よく混ぜた後、４℃で１時間インキュベートした。予冷したランニングバッファー（ＭＡＣＳ、カタログ番号１３０－０９１－２２１）を加えて細胞を洗浄した後、上清を捨て、予冷した蛍光標識ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－１１６－１７０）を１ウェルあたり１００μｌずつ加えて再懸濁させ、よく混ぜた後、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、予冷したランニングバッファー１００μｌを加えて細胞を再懸濁させ、よく混ぜた後、フローサイトメーターＡｔｔｕｎｅ ＴＭ ＮｘＴでフローコレクションを行い、ソフトウェアＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ５によりデータ分析を行った。
図７～９、表１１は、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞（ＢＣＭＡ＋＋＋）、ＭＭ１Ｓ細胞（ＢＣＭＡ＋＋）及びＲＰＭＩ－８２２６細胞（ＢＣＭＡ＋）に対するＡｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体の結合能力を示す。結果によれば、ＢＣＭＡ高・中発現の標的細胞において、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３及びＢＣ２４はいずれも、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭよりも、標的抗原に対する最大結合量に優れていた。ＢＣＭＡ低発現の標的細胞において、ＰＣ３及びＢＣ２４は、他の試料よりも、標的抗原に対する結合に優れていた。
（実施例１２）Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体とＴ細胞表面ＣＤ３との結合
フローサイトメトリーにより、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭを含む。）とＴ細胞表面ＣＤ３との結合を分析した。陰性対照はトラスツズマブを用いた。
フローサイトメトリーにより、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭを含む。）とＴ細胞表面ＣＤ３との結合を分析した。陰性対照はトラスツズマブを用いた。
詳細な実験手順は以下のとおりである。
ヒトＰＢＭＣ細胞は、以下のように、ＣＤ３磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９７－０４３）によるＣＤ３＋Ｔ細胞の分離を行った。凍結保存したＰＢＭＣを起こし、２回遠心洗浄して計数した。１０７個の細胞当たり８０μｌのランニングバッファー（ＭＡＣＳ、カタログ番号１３０－０９１－２２１）の割合でバッファーを加え、１０７個の細胞当たり２０μｌのＣＤ３磁気ビーズを加えて、よく混ぜた後、４℃で１５分間インキュベートした。１０７個の細胞当たり１～２ｍｌのバッファーを加えて細胞を洗浄し、遠心処理して上清を捨てた後、５００μｌのバッファーを加えて細胞ペレットを再懸濁させた。ＬＳ分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０４２－４０１）をＭｉｄｉＭＡＣＳ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｋｉｔ （ＬＳ）磁気スタンド（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０－０９１－０５１）に設置し、すすいだ後、細胞懸濁液を加え、３回洗浄した。ＬＳ分離カラムを磁気スタンドから取り外し、清潔な遠心管に置き、５ｍｌのバッファーを加えて、分離により得られたＣＤ３＋Ｔ細胞を回収した。計数後、２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＲＰＭＩ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０８０９．０１）を用いて、ＣＤ３＋Ｔ細胞を細胞密度が５×１０６～１０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整し、９６ウェルＵ字型細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号：３７９９）に１ウェルあたり５０μｌずつ播種した。上記培地を用いて様々な濃度の被験抗体を調製し、抗体濃度は最大２２００ｎＭで、５倍段階希釈して合計１０濃度段階とした。各濃度の抗体を上記９６ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり５０μｌずつ添加し、よく混ぜた後、４℃で１時間インキュベートした。予冷したランニングバッファー（ＭＡＣＳ、カタログ番号１３０－０９１－２２１）を加えて細胞を洗浄した後、上清を捨て、予冷した蛍光標識ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－１１６－１７０）を１ウェルあたり１００μｌずつ加えて再懸濁させ、よく混ぜた後、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、予冷したランニングバッファー１００μｌを加えて細胞を再懸濁させ、よく混ぜた後、フローサイトメーターＡｔｔｕｎｅ ＴＭ ＮｘＴでフローコレクションを行い、ソフトウェアＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ５によりデータ分析を行った。
図１０、表１２は、ＣＤ３＋Ｔ細胞に対するＡｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体の結合能力を示す。結果によれば、各Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体はいずれも、ＣＤ３＋Ｔ細胞に結合可能であった。
（実施例１３）Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体による多発性骨髄腫標的細胞ＮＣＩ－Ｈ９２９の殺傷
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核球）でＴ細胞を与え、抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭを含む。）により誘導される標的細胞（ＮＣＩ－Ｈ９２９ ＢＣＭＡ＋＋＋、南京科佰生物から入手）への殺傷効果を研究した。陰性対照はトラスツズマブを用いた。
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核球）でＴ細胞を与え、抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭを含む。）により誘導される標的細胞（ＮＣＩ－Ｈ９２９ ＢＣＭＡ＋＋＋、南京科佰生物から入手）への殺傷効果を研究した。陰性対照はトラスツズマブを用いた。
詳細な実験手順は以下のとおりである。
標的細胞ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含む１６４０実験用培地を用いて、細胞密度が５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整し、９６ウェル細胞培養プレート（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、カタログ番号：００３０７３０１９９）に１ウェルあたり５０μｌずつ播種した。実験用培地を用いて様々な濃度の被験抗体を調製し、抗体濃度は最大８ｎＭで、５倍段階希釈して合計１０濃度段階とした。各濃度の抗体を上記９６ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり５０μｌで添加した。エフェクター細胞であるヒトＰＢＭＣを、実験用培地を用いて、細胞密度が２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整し、１ウェルあたり１００μｌずつ加えた。投与群（標的細胞５０μｌ＋エフェクター細胞１００μｌ＋抗体５０μｌ）、標的細胞群（標的細胞５０μｌ＋培地１５０μｌ）、エフェクター細胞群（ヒトＰＢＭＣ １００μｌ＋培地１００μｌ）、標的細胞＋エフェクター細胞群（標的細胞５０μｌ＋エフェクター細胞１００μｌ＋培地５０μｌ）、ブランク対照群（培地２００μｌ）及び溶解液対照群（培地２００μｌ＋溶解液２０μｌ）、標的細胞最大放出群（標的細胞５０μｌ＋培地１５０μｌ＋溶解液２０μｌ）を設け、エフェクター細胞と標的細胞の比を１０：１とし、２４時間共培養した。測定の４５分前に、標的細胞最大放出群及び溶解液対照群に溶解液（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ１８２Ａ）を２０μｌ／ウェルで添加した。ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイキットＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）（ｃｙｔｏｔｏｘ ９６ ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）を用いて細胞溶解率を測定した。
溶解率（％）＝（ＯＤ投与群－ＯＤ標的細胞＋エフェクター細胞群）／（ＯＤ標的細胞最大放出群－ＯＤ標的細胞群）×１００％
図１１、表１３は、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体が誘導したエフェクター細胞によるＮＣＩ－Ｈ９２９／ＢＣＭＡ＋＋＋腫瘍細胞の溶解率を示す。ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体ＰＣ１は、ＰＣ２及びＰＣ３よりも優れた細胞殺傷効果を誘導した。ＰＣ１のＥＣ５０は約０．０６７ｎＭであり、ＰＣ２及びＰＣ３のＥＣ５０はそれぞれ約０．５３ｎＭ及び０．１９ｎＭであった。ＢＣ２４及びＣｅｌｇｅｎｅ ＢＭは、ＰＣ１、ＰＣ２及びＰＣ３よりもＮＣＩ－Ｈ９２９への殺傷効果に優れた。ＢＣ２４のＥＣ５０は約０．０２２ｎＭであり、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭのＥＣ５０は約０．０４４ｎＭであった。
図１１、表１３は、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体が誘導したエフェクター細胞によるＮＣＩ－Ｈ９２９／ＢＣＭＡ＋＋＋腫瘍細胞の溶解率を示す。ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体ＰＣ１は、ＰＣ２及びＰＣ３よりも優れた細胞殺傷効果を誘導した。ＰＣ１のＥＣ５０は約０．０６７ｎＭであり、ＰＣ２及びＰＣ３のＥＣ５０はそれぞれ約０．５３ｎＭ及び０．１９ｎＭであった。ＢＣ２４及びＣｅｌｇｅｎｅ ＢＭは、ＰＣ１、ＰＣ２及びＰＣ３よりもＮＣＩ－Ｈ９２９への殺傷効果に優れた。ＢＣ２４のＥＣ５０は約０．０２２ｎＭであり、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭのＥＣ５０は約０．０４４ｎＭであった。
（実施例１４）Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体による多発性骨髄腫標的細胞ＭＭ１Ｓへの殺傷
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核球）でＴ細胞を与え、抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭを含む。）により誘導される標的細胞（ＭＭ１Ｓ ＢＣＭＡ＋＋、北納生物から入手）への殺傷効果を研究した。陰性対照はトラスツズマブを用いた。
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核球）でＴ細胞を与え、抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭを含む。）により誘導される標的細胞（ＭＭ１Ｓ ＢＣＭＡ＋＋、北納生物から入手）への殺傷効果を研究した。陰性対照はトラスツズマブを用いた。
詳細な実験手順は以下のとおりである。
標的細胞であるＭＭ１Ｓ細胞を、２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含む１６４０実験用培地を用いて、細胞密度が５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整し、９６ウェル細胞培養プレート（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、カタログ番号：００３０７３０１９９）に１ウェルあたり５０μｌずつ播種した。実験用培地を用いて様々な濃度の被験抗体を調製し、抗体濃度は最大８ｎＭで、５倍段階希釈して合計１０濃度段階とした。各濃度の抗体を上記９６ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり５０μｌで添加した。エフェクター細胞であるヒトＰＢＭＣを、実験用培地を用いて、細胞密度が２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整し、１ウェルあたり１００μｌずつ加えた。投与群（標的細胞５０μｌ＋エフェクター細胞１００μｌ＋抗体５０μｌ）、標的細胞群（標的細胞５０μｌ＋培地１５０μｌ）、エフェクター細胞群（ヒトＰＢＭＣ １００μｌ＋培地１００μｌ）、標的細胞＋エフェクター細胞群（標的細胞５０μｌ＋エフェクター細胞１００μｌ＋培地５０μｌ）、ブランク対照群（培地２００μｌ）及び溶解液対照群（培地２００μｌ＋溶解液２０μｌ）、標的細胞最大放出群（標的細胞５０μｌ＋培地１５０μｌ＋溶解液２０μｌ）を設け、エフェクター細胞と標的細胞の比を１０：１とし、２４時間共培養した。測定の４５分前に、標的細胞最大放出群及び溶解液対照群に溶解液（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ１８２Ａ）を２０μｌ／ウェルで添加した。ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイキットＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）（ｃｙｔｏｔｏｘ ９６ ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）を用いて細胞溶解率を測定した。
溶解率（％）＝（ＯＤ投与群－ＯＤ標的細胞＋エフェクター細胞群）／（ＯＤ標的細胞最大放出群－ＯＤ標的細胞群）×１００％
図１２、表１４は、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体が誘導したエフェクター細胞によるＭＭ１Ｓ／ＢＣＭＡ＋＋腫瘍細胞の溶解率を示す。ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体ＰＣ１は、ＰＣ２及びＰＣ３よりも優れた細胞殺傷を誘導した。ＰＣ１のＥＣ５０は約０．００８４ｎＭであり、ＰＣ２及びＰＣ３のＥＣ５０はそれぞれ約０．０６１ｎＭ及び０．０４１ｎＭであった。ＰＣ３は、より良い最大溶解率を示した。Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭは、ＭＭ１Ｓに対する殺傷効果が最も弱く、ＥＣ５０が約０．０８５ｎＭであり、最大溶解率が２３％であった。
図１２、表１４は、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体が誘導したエフェクター細胞によるＭＭ１Ｓ／ＢＣＭＡ＋＋腫瘍細胞の溶解率を示す。ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体ＰＣ１は、ＰＣ２及びＰＣ３よりも優れた細胞殺傷を誘導した。ＰＣ１のＥＣ５０は約０．００８４ｎＭであり、ＰＣ２及びＰＣ３のＥＣ５０はそれぞれ約０．０６１ｎＭ及び０．０４１ｎＭであった。ＰＣ３は、より良い最大溶解率を示した。Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭは、ＭＭ１Ｓに対する殺傷効果が最も弱く、ＥＣ５０が約０．０８５ｎＭであり、最大溶解率が２３％であった。
（実施例１５）Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体による多発性骨髄腫標的細胞ＲＰＭＩ－８２２６への殺傷
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核球）でＴ細胞を与え、抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭを含む。）により誘導される標的細胞（ＲＰＭＩ－８２２６ ＢＣＭＡ＋、中国医学科学院基礎医学研究所基礎医学細胞センターから入手）への殺傷作用を研究した。陰性対照はトラスツズマブを用いた。
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核球）でＴ細胞を与え、抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭを含む。）により誘導される標的細胞（ＲＰＭＩ－８２２６ ＢＣＭＡ＋、中国医学科学院基礎医学研究所基礎医学細胞センターから入手）への殺傷作用を研究した。陰性対照はトラスツズマブを用いた。
詳細な実験手順は以下のとおりである。
標的細胞であるＲＰＭＩ－８２２６細胞を、２％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含む１６４０実験用培地を用いて、細胞密度が５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整し、９６ウェル細胞培養プレート（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、カタログ番号：００３０７３０１９９）に１ウェルあたり５０μｌずつ播種した。実験用培地を用いて様々な濃度の被験抗体を調製し、抗体濃度は最大８ｎＭで、５倍段階希釈して合計１０濃度段階とした。各濃度の抗体を上記９６ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり５０μｌで添加した。エフェクター細胞であるヒトＰＢＭＣを、実験用培地を用いて、細胞密度が２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整し、１ウェルあたり１００μｌずつ加えた。投与群（標的細胞５０μｌ＋エフェクター細胞１００μｌ＋抗体５０μｌ）、標的細胞群（標的細胞５０μｌ＋培地１５０μｌ）、エフェクター細胞群（ヒトＰＢＭＣ １００μｌ＋培地１００μｌ）、標的細胞＋エフェクター細胞群（標的細胞５０μｌ＋エフェクター細胞１００μｌ＋培地５０μｌ）、ブランク対照群（培地２００μｌ）及び溶解液対照群（培地２００μｌ＋溶解液２０μｌ）、標的細胞最大放出群（標的細胞５０μｌ＋培地１５０μｌ＋溶解液２０μｌ）を設け、エフェクター細胞と標的細胞の比を１０：１とし、２４時間共培養した。測定の４５分前に、標的細胞最大放出群及び溶解液対照群に溶解液（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ１８２Ａ）を２０μｌ／ウェルで添加した。ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイキットＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）（ｃｙｔｏｔｏｘ ９６ ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）を用いて細胞溶解率を測定した。
溶解率（％）＝（ＯＤ投与群－ＯＤ標的細胞＋エフェクター細胞群）／（ＯＤ標的細胞最大放出群－ＯＤ標的細胞群）×１００％
図１３、表１５は、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体が誘導したエフェクター細胞によるＲＰＭＩ－８２２６／ＢＣＭＡ＋腫瘍細胞の溶解率を示す。Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体ＰＣ１は、ＢＣ２４と比較して、ＲＰＭＩ－８２２６に対する最大溶解率が同等であったが、より低いＥＣ５０を示した。ＰＣ２とＰＣ３は、ＲＰＭＩ－８２２６に対する殺傷効果が同等であり、ＰＣ２及びＰＣ３のＥＣ５０がそれぞれ０．０１８５ｎＭ及び０．０１４２ｎＭであり、最大溶解率がいずれも３９％であった。Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭは、ＲＰＭＩ－８２２６に対する殺傷効果が最も弱く、ＥＣ５０が０．２７ｎＭであり、最大溶解率が２９％であった。
図１３、表１５は、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体が誘導したエフェクター細胞によるＲＰＭＩ－８２２６／ＢＣＭＡ＋腫瘍細胞の溶解率を示す。Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体ＰＣ１は、ＢＣ２４と比較して、ＲＰＭＩ－８２２６に対する最大溶解率が同等であったが、より低いＥＣ５０を示した。ＰＣ２とＰＣ３は、ＲＰＭＩ－８２２６に対する殺傷効果が同等であり、ＰＣ２及びＰＣ３のＥＣ５０がそれぞれ０．０１８５ｎＭ及び０．０１４２ｎＭであり、最大溶解率がいずれも３９％であった。Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭは、ＲＰＭＩ－８２２６に対する殺傷効果が最も弱く、ＥＣ５０が０．２７ｎＭであり、最大溶解率が２９％であった。
（実施例１６）Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体により誘導されるＴ細胞活性化
ＣＤ６９及びＣＤ２５はＴ細胞活性化マーカーである。本実施例は、骨髄腫標的細胞の存在下での多重特異性抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭを含む。）によるＴ細胞の活性化の分析に関する。陰性対照（ＮＣ）はトラスツズマブを用いた。
ＣＤ６９及びＣＤ２５はＴ細胞活性化マーカーである。本実施例は、骨髄腫標的細胞の存在下での多重特異性抗体（ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭを含む。）によるＴ細胞の活性化の分析に関する。陰性対照（ＮＣ）はトラスツズマブを用いた。
詳細な実験手順は以下のとおりである。
標的細胞であるＮＣＩ－Ｈ９２９細胞及びＭＭ１Ｓをそれぞれ、２％ ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含む１６４０実験用培地を用いて、細胞密度が５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整し、９６ウェル細胞培養プレート（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、カタログ番号：００３０７３０１９９）に１ウェルあたり５０μｌずつ播種した。実験用培地を用いて様々な濃度の被験抗体を調製し、抗体濃度は最大８ｎＭで、５倍段階希釈して合計１０濃度段階とした。各濃度の抗体を上記９６ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり５０μｌで添加した。エフェクター細胞であるヒトＰＢＭＣを、実験用培地を用いて、細胞密度が２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整し、１ウェルあたり１００μｌずつ加えた。投与群（標的細胞５０μｌ＋エフェクター細胞１００μｌ＋抗体５０μｌ）、非投与群（培地５０ｕｌ＋エフェクター細胞１００μｌ＋抗体５０μｌ）、標的細胞群（標的細胞５０μｌ＋培地１５０μｌ）、エフェクター細胞群（ヒトＰＢＭＣ １００μｌ＋培地１００μｌ）、標的細胞＋エフェクター細胞群（標的細胞５０μｌ＋エフェクター細胞１００μｌ＋培地５０μｌ）、ブランク対照群（培地２００μｌ）を設け、陰性コントロール抗体ＮＣとしてトラスツズマブを用い、エフェクター細胞と標的細胞の比を１０：１とし、２４時間共培養した。遠心処理して上清を除去し、予冷したランニングバッファー（ＭＡＣＳ、カタログ番号１３０－０９１－２２１）を用いて細胞を遠心洗浄し、上清の除去後にランニングバッファーを１ウェルあたり１００μｌずつ加え、細胞をよく混ぜて、ＣＤ４－ＢＶ４２１（ＢＤ、カタログ番号５６４７１３）、ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ、カタログ番号５５７７４６）、ＣＤ２５－ＡＰＣ（ＢＤ、カタログ番号５５５４３４）、ＣＤ６９－ＦＩＴＣ（ＢＤ、カタログ番号５５５５３０）をそれぞれ１ウェルあたり２．５μｌ添加し、氷上で３０分間インキュベートした。予冷したランニングバッファーで細胞を洗浄し、ランニングバッファーを７５μｌ／ウェルで添加して細胞を再懸濁させ、よく混ぜた後、フローサイトメーターで分析した。
図１４、１５は、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体濃度が８ｎＭであったときの、標的細胞ＮＣＩ－Ｈ９２９又はＭＭ１Ｓの存在下及び非存在下でのＴ細胞の活性化度を示し、縦軸は、活性化マーカーＣＤ２５又はＣＤ６９が陽性であるＣＤ８又はＣＤ４細胞の割合を表し、横軸は群別を表す。図中、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋／ＣＤ４＋は、ある群のＣＤ４細胞のうちＣＤ２５が陽性であるＣＤ４細胞が占める割合を表し、ＣＤ４＋ＣＤ６９＋／ＣＤ４＋は、ある群のＣＤ４細胞のうちＣＤ６９が陽性であるＣＤ４細胞が占める割合を表し、ＣＤ８＋ＣＤ２５＋／ＣＤ８＋は、ある群のＣＤ８細胞のうちＣＤ２５が陽性であるＣＤ８細胞が占める割合を表し、ＣＤ８＋ＣＤ６９＋／ＣＤ８＋は、ある群のＣＤ８細胞のうちＣＤ６９が陽性であるＣＤ８細胞が占める割合を表す。結果によれば、標的細胞の非存在下では、Ｔ細胞はほとんど活性化されなかったが、標的細胞の存在下では、抗体ＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＣ３はＴ細胞を活性化できた。
（実施例１７）Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体により誘導されるサイトカインの放出
ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γの含有量を測定することによって、標的細胞の存在下での多重特異性抗体により誘導されるサイトカインの放出を研究した。サイトカイン放出量により多重特異性抗体の安全性を評価した。
ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γの含有量を測定することによって、標的細胞の存在下での多重特異性抗体により誘導されるサイトカインの放出を研究した。サイトカイン放出量により多重特異性抗体の安全性を評価した。
詳細な実験手順は以下のとおりである。
標的細胞であるＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を、２％ ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含む１６４０実験用培地を用いて、細胞密度が５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整し、９６ウェル細胞培養プレート（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、カタログ番号：００３０７３０１９９）に１ウェルあたり５０μｌずつ播種した。実験用培地を用いて様々な濃度の被験抗体を調製し、抗体濃度は最大８ｎＭで、５倍段階希釈して合計１０濃度段階とした。各濃度の抗体を上記９６ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり５０μｌで添加した。エフェクター細胞であるヒトＰＢＭＣを、実験用培地を用いて、細胞密度が２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調整し、１ウェルあたり１００μｌずつ加えた。標準品群、投与群（標的細胞５０μｌ＋エフェクター細胞１００μｌ＋抗体５０μｌ）、標的細胞群（標的細胞５０μｌ＋培地１５０μｌ）、エフェクター細胞群（ヒトＰＢＭＣ １００μｌ＋培地１００μｌ）、標的細胞＋エフェクター細胞群（標的細胞５０μｌ＋エフェクター細胞１００μｌ＋培地５０μｌ）、エフェクター細胞＋抗体群（エフェクター細胞１００μｌ＋抗体５０μｌ＋培地５０μｌ）、ブランク対照群（培地２００μｌ）を設け、エフェクター細胞と標的細胞の比を１０：１とし、２４時間共培養した。遠心処理して上清を取り、ｈｕｍａｎ－ＩＬ２ ｋｉｔ（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ番号６２ＨＩＬ０２ＰＥＧ）、ｈｕｍａｎ－ＩＬ６ ｋｉｔ（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ番号６２ＨＩＬ０６ＰＥＧ）、ｈｕｍａｎ－ＴＮＦ－α ｋｉｔ（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ番号６２ＨＴＮＦＡＰＥＧ）、ｈｕｍａｎ－ＩＦＮ－γ ｋｉｔ（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ番号６２ＨＩＦＮＧＰＥＧ）アッセイキットを使用し、キットの説明書に従って試料を処理し、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、品番Ｐａｒａｄｉｇｍ）を用いて測定分析を行った。
全試料のＲａｔｉｏ値を求め、標準品Ｒａｔｉｏ（Ｎｅｔ）をＹ軸とし、Ｌｏｇ（標準品の濃度値）をＸ軸とし、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて４パラメータフィッティングを行い、標準品及び被験品のＲａｔｉｏ（Ｎｅｔ）値をそれぞれ代入してそのｌｏｇ（濃度測定値）を得、被験品の各サイトカインの濃度測定値を算出した。
図１６、表１６は、各濃度のＡｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体とＮＣＩ－Ｈ９２９細胞とエフェクター細胞との２４時間共培養後のサイトカインＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γの放出量を示す。各被験抗体はいずれも、ＩＬ－２の放出が低かった。本発明のＢＣ２４、ＰＣ１、ＰＣ２及びＰＣ３多重特異性抗体は、Ｃｅｌｇｅｎｅ ＢＭよりも低いサイトカインＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γの放出レベルを有し、より良い安全性を示した。
（実施例１８）マウス腫瘍モデルにおけるＡｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３二重抗体による多発性骨髄腫標的細胞ＮＣＩ－Ｈ９２９の増殖阻害
ヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞マウスモデルを用いて、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体の抗腫瘍活性を分析した。ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞が７．５×１０６個／匹、ｈＰＢＭＣヒト末梢リンパ球が０．５×１０６個／匹となるように、両者を混合した後、滅菌条件下で８～１０週齢の雌Ｂ－ＮＤＧマウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ社から入手。証明書番号：３２０７２６２００１００１７９０３４）の右腋窩に接種した。皮下移植腫瘍の接種後、腫瘍体積が１００～３００ｍｍ３に達した時点で、動物をランダムに（１）モデル群（ブランク対照群、生理食塩水）と、（２）ＰＣ１群（被験抗体ＰＣ１）との２群に分けた。０日目にマウスを群分けし、週２回で１週間投与し、投与量は１．５ｍｐｋ、投与体積は１０ｍｌ／ｋｇとした。３日ごとに体重及び腫瘍径を測定し、動物の状態を毎日観察し、１７日目に観察を中止した。実験中、それぞれ０、４、８、１１、１４、１７日目に腫瘍体積を測定した。下記の式により腫瘍体積及び腫瘍阻害率を算出した。
ヒト骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞マウスモデルを用いて、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体の抗腫瘍活性を分析した。ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞が７．５×１０６個／匹、ｈＰＢＭＣヒト末梢リンパ球が０．５×１０６個／匹となるように、両者を混合した後、滅菌条件下で８～１０週齢の雌Ｂ－ＮＤＧマウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ社から入手。証明書番号：３２０７２６２００１００１７９０３４）の右腋窩に接種した。皮下移植腫瘍の接種後、腫瘍体積が１００～３００ｍｍ３に達した時点で、動物をランダムに（１）モデル群（ブランク対照群、生理食塩水）と、（２）ＰＣ１群（被験抗体ＰＣ１）との２群に分けた。０日目にマウスを群分けし、週２回で１週間投与し、投与量は１．５ｍｐｋ、投与体積は１０ｍｌ／ｋｇとした。３日ごとに体重及び腫瘍径を測定し、動物の状態を毎日観察し、１７日目に観察を中止した。実験中、それぞれ０、４、８、１１、１４、１７日目に腫瘍体積を測定した。下記の式により腫瘍体積及び腫瘍阻害率を算出した。
腫瘍体積（ＴＶ）＝（長さ×幅２）／２
相対的腫瘍体積（ＲＴＶ）＝ＴＶｔ／ＴＶ０
（式中、ＴＶ０は群分け時の腫瘍体積であり、ＴＶｔは各測定時の腫瘍体積である。）
相対的腫瘍体積（ＲＴＶ）＝ＴＶｔ／ＴＶ０
（式中、ＴＶ０は群分け時の腫瘍体積であり、ＴＶｔは各測定時の腫瘍体積である。）
相対的腫瘍成長率Ｔ／Ｃ（％）＝（ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ）×１００％
（式中、ＴＲＴＶは治療群のＲＴＶであり、ＣＲＴＶはブランク対照群のＲＴＶである。）
（式中、ＴＲＴＶは治療群のＲＴＶであり、ＣＲＴＶはブランク対照群のＲＴＶである。）
腫瘍阻害率（ＴＧＩ）＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％。
実験結果を図１７に示す。モデル群と比較して、ＰＣ１抗体投与群はヒト多発性骨髄腫ＮＣＩ－Ｈ９２９皮下移植腫瘍の成長を著しく阻害した。ＰＣ１抗体は、８、１１、１４、１７日目の腫瘍阻害率がそれぞれ８４．４％、９０．９％、９４．２％、９５．５％であった。
（実施例１９）カニクイザルにおけるＡｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体の１回の静脈内注射の薬物動態
カニクイザル（番号１Ｍ０１－１Ｍ０３、２Ｍ０１－２Ｍ０３、一用量群あたり３匹、雄、体重：２～３ｋｇ）にＰＣ１注射液を１回静脈内注入した。ＰＣ１多重特異性抗体の投与量は１又は９ｍｇ／ｋｇとし、静脈内注入時間は３０分とした。投与前及び投与後の各時点で血液サンプルを採取し、１時間以内に血液サンプルを４０００ｒｐｍで約１０分間（２～８℃）遠心処理して血清を単離した。ＥＬＩＳＡ法により各時点の血液サンプル中の薬物濃度を測定した。サンプリングは、０時間（投与前）、投与完了から０．５、４、２４、４８、９６、１６８、２４０、３３６時間後に行った。
カニクイザル（番号１Ｍ０１－１Ｍ０３、２Ｍ０１－２Ｍ０３、一用量群あたり３匹、雄、体重：２～３ｋｇ）にＰＣ１注射液を１回静脈内注入した。ＰＣ１多重特異性抗体の投与量は１又は９ｍｇ／ｋｇとし、静脈内注入時間は３０分とした。投与前及び投与後の各時点で血液サンプルを採取し、１時間以内に血液サンプルを４０００ｒｐｍで約１０分間（２～８℃）遠心処理して血清を単離した。ＥＬＩＳＡ法により各時点の血液サンプル中の薬物濃度を測定した。サンプリングは、０時間（投与前）、投与完了から０．５、４、２４、４８、９６、１６８、２４０、３３６時間後に行った。
各パラメータは以下のとおりである。
Ｃｍａｘ：観察された最大薬物濃度
ＡＵＣ：血漿中濃度－時間曲線下面積
Ｔ１／２：半減期
Ｃｌ：クリアランス率
ＭＲＴ：薬物保持時間
実験結果によれば、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体を１ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇで１回静脈内注入した結果、薬物の最終消失半減期ｔ１／２はそれぞれ１０５時間、１１２時間であり、Ｃｍａｘはそれぞれ１９、２００μｇ／ｍＬであり、ＡＵＣｌａｓｔはそれぞれ７００ｈ・μｇ／ｍＬ、７２００ｈ・μｇ／ｍＬであった。血清中の本薬剤の曝露量は実質的に用量に比例して増加することが分かった。
ＡＵＣ：血漿中濃度－時間曲線下面積
Ｔ１／２：半減期
Ｃｌ：クリアランス率
ＭＲＴ：薬物保持時間
実験結果によれば、Ａｎｔｉ－ＢＣＭＡ／ａｎｔｉ－ＣＤ３多重特異性抗体を１ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇで１回静脈内注入した結果、薬物の最終消失半減期ｔ１／２はそれぞれ１０５時間、１１２時間であり、Ｃｍａｘはそれぞれ１９、２００μｇ／ｍＬであり、ＡＵＣｌａｓｔはそれぞれ７００ｈ・μｇ／ｍＬ、７２００ｈ・μｇ／ｍＬであった。血清中の本薬剤の曝露量は実質的に用量に比例して増加することが分かった。
Claims (17)
- （ｉ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分と、
（ｉｉ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分と、
（ｉｉｉ）第１の抗原に結合する第３の抗原結合部分とを含む多重特異性抗体であって、
前記第１の抗原はＢＣＭＡであり、前記第２の抗原はＴ細胞活性化抗原であり、前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はいずれも、単一可変ドメインであって、それぞれ独立して、
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（ａ）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；或いは、
（ｄ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３のうちのいずれか１つを含む、多重特異性抗体。 - 前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、それぞれ独立して、
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、或いは、
（ｃ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ のうちのいずれか１つを含む、請求項１に記載の多重特異性抗体。 - 前記第１の抗原結合部分は、相補性決定領域として、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、かつ、前記第３の抗原結合部分は、相補性決定領域として、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項２に記載の多重特異性抗体。
- 前記第３の抗原結合部分は、相補性決定領域として、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、かつ、前記第１の抗原結合部分は、相補性決定領域として、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項２に記載の多重特異性抗体。
- 前記第１の抗原結合部分は、配列番号２１、３７又は３８で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第３の抗原結合部分は、配列番号２３、３９又は４０で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；或いは
前記第１の抗原結合部分は、配列番号３７で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。 - 前記第１の抗原結合部分は、配列番号２３、３９又は４０で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第３の抗原結合部分は、配列番号２１、３７又は３８で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；或いは
前記第１の抗原結合部分は、配列番号３９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第３の抗原結合部分は、配列番号３７で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。 - 前記第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、
（１）配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分；
（２）配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分；
（３）配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分；
（４）配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
（５）配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
（６）配列番号３８で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号２３、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
（７） 配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
（８） 配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；
（９） 配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分；或いは、
（１０） 配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む第３の抗原結合部分及び配列番号３７で表されるアミノ酸配列を含む第１の抗原結合部分から選択されるいずれか１項である、請求項１～６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。 - 前記Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３である、請求項１～７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第２の抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、相補性決定領域として、配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号４４で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号４５で表されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む；或いは
前記重鎖可変領域は、配列番号４９で表される可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号５０で表される可変領域のＬＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。 - 前記第２の抗原結合部分は、配列番号４９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列の重鎖可変領域と、配列番号５０で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含む；或いは前記第２の抗原結合部分の重鎖可変領域は、配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、その軽鎖可変領域は、配列番号５０で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- （ｉｖ）２つのＦｃポリペプチドで構成されるＦｃ領域をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
- （１）前記第２の抗原結合部分はＳｃＦｖであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第１の抗原結合部分のＮ末端に融合される；
（２）前記第２の抗原結合部分はＳｃＦｖであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第２の抗原結合部分のＮ末端に融合される；
（３）前記第２の抗原結合部分はＦａｂであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第１の抗原結合部分のＮ末端に融合される；或いは、
（４）前記第２の抗原結合部分はＦａｂであり、前記第１の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記Ｆｃ領域における一方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、前記Ｆｃ領域における他方のＦｃポリペプチドのＮ末端に融合され、前記第３の抗原結合部分は、Ｃ末端で前記第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端又は前記第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される、請求項１１に記載の多重特異性抗体。 - 前記Ｆｃ領域はＩｇＧ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４のＦｃ領域であり、
所望により、前記Ｆｃ領域は、前記Ｆｃ領域の２つのＦｃポリペプチドの会合を促進するアミノ酸置換を含んでもよく、又は／及び、
前記Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減させるアミノ酸置換を含んでもよく、又は／及び、
前記Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域における１つのＦｃポリペプチドのＣＨ３領域とプロテインＡとの結合を減少又は消失させるアミノ酸置換を含んでもよい、請求項１１～１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。 - （１）配列番号６５で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６７で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との２本で構成されるもの；
（２）配列番号６９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号７１で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との２本で構成されるもの；
（３）配列番号５９で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６１で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６３で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との３本で構成されるもの；
（４）配列番号７３で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６１で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号７５で表される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との３本で構成されるもの；
（５）配列番号６５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との２本で構成されるもの；
（６）配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との２本で構成されるもの；
（７）配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との３本で構成されるもの；或いは、
（８）配列番号７３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖と、配列番号７５で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖との３本で構成されるものである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。 - 請求項１～１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 被験者におけるＢＣＭＡ発現に関連する疾患を治療するための方法であって、前記被験者に対して、治療有効量の請求項１～１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体又は請求項１５に記載の医薬組成物を投与することを含み、前記疾患は、リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、全身性エリテマトーデス又は関節リウマチである、前記方法。
- 単一可変ドメインを含むＢＣＭＡ結合抗体であって、前記単一可変ドメインは、
（２）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（３）配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
（１）配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号９で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；或いは、
（４）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、ＢＣＭＡ結合抗体。
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