JP2023526274A - Ｓａｒｓ－ｃｏｖ２中和単一ドメイン抗体構築物 - Google Patents

Ｓａｒｓ－ｃｏｖ２中和単一ドメイン抗体構築物 Download PDF

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Abstract

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスに結合する単一ドメイン抗体を含む抗体及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスに結合する単一ドメイン抗体を使用する治療方法が提供される。

Description

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２又は「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」は、コロナウイルス病２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こすウイルス株である。例えば、Gorbalenya AE,et al. Nature Microbiology.5(4): 536-544(March 2020)を参照されたい。世界的規模のパンデミックに対処するための治療的処置が必要とされている。
図１Ａ及び１Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス（「ＳＣ２ウイルス」）の侵入を遮断するための一般的な戦略を描写している。本明細書で全般的に考察されるように、ＳＣ２ウイルスのスパイクタンパク質は、ヒト細胞上のＡＣＥ２受容体の細胞外ドメインに結合する三量体構造を、スパイク受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）と考えられる位置で形成する。図１Ａは空間充填モデルを描写し、図１Ｂはリボン図を使用している。図１Ｂは、ＡＣＥ２とスパイクタンパク質との相互作用を遮断することにより、ＳＣ２ウイルスが宿主細胞に侵入することができなくなることを示している。
図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）残基１～１２０８、安定化突然変異Ｐ９８６及びＰ９８７、フューリン切断部位の置換物並びにＣ末端三量体化モチーフの残基を含む、スパイク三量体抗原（本明細書では以下、「スパイクＥＣＤ」と称する）の正しい構造の検証を示している。図２Ａは、ヒトＡＣＥ２受容体に結合するＳＣ２スパイクＥＣＤの構造のモデルを示し、スパイクＥＣＤ内のＲＢＤの位置を示している。他の研究とは対照的に、本発明ではスパイクＥＣＤを使用して抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を作製した。図２Ｂは、低温電子顕微鏡検査（「ｃｒｙｏ－ＥＭ」）を使用して、抗原の正しい三量体スパイクタンパク質ＥＣＤ構造が、本明細書で使用されたことを示している。図２Ｃは、スパイクＥＣＤ－ＡＣＥ２結合分析を使用した抗原検証を描写し、ＫＤが４４ｎＭ、ｋａが３２．６×１０５Ｍ－１ｓ－１、ｋｄが０．０１２ｓ－１であることを示している。
図３は、ＡＣＥ２と競合するものと結合に関して競合する、ＭＡＳＣタンパク質候補「ＡｅｒｏＮａｂ６」の、ＳＣ２スパイクＥＣＤへの結合を描写している。ＭＡＳＣタンパク質（単量体）は、ＭＡＳＣタンパク質を酵母細胞表面に係留するＨＡエピトープタグ付きの「ストーク」タンパク質との融合によって、酵母の表面に提示された。ＭＡＳＣタンパク質を提示する酵母を、アッセイバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン）中で、Ａｌｅｘａ ６４７蛍光団（Ｓｐｉｋｅ－Ａｌｅｘａ ６４７）及び１０μｇ／ｍＬの抗ＨＡ Ａｌｅｘａ ４８８抗体（１２ＣＡ５）で標識した１ｎＭ精製スパイクＥＣＤとともに、室温で３０分間インキュベートした。その後、酵母をアッセイバッファーで洗浄して非結合スパイクＥＣＤを除去し、酵母表面のスパイクＥＣＤ結合量をフローサイトメトリーによって評価した。スパイクＥＣＤの結合は、Ａｌｅｘａ ６４７及びＡｌｅｘａ ４８８の蛍光の同時存在によって示された。ＡＣＥ２との競合を評価するために、上記のアッセイを、１．４μＭのＡＣＥ２－Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１ＦｃドメインへのＡＣＥ２ ＥＣＤを含む融合タンパク質）を用いて繰り返した。スパイクＥＣＤ結合の消失に対応するＡｌｅｘａ ６４７蛍光の減少は、ＭＡＳＣタンパク質が、ＡＣＥ２と競合するエピトープの箇所でスパイクＥＣＤに結合することを示している。
図４Ａ及び４Ｂは、スパイクタンパク質三量体のＲＢＤドメインの「アップ」及び「ダウン」コンフォメーションの概略図を描写している。図４Ａは、「ダウン」又は「オフ」位置のｃｒｙｏ－ＥＭ構造を左側に、ＡＣＥ２受容体とエンゲージした「伸長」又は「オン」位置のｃｒｙｏ－ＥＭ構造を右側に示している。ＡＣＥ２受容体にエンゲージするためにはＲＢＤが伸長しなければならない。図４Ｂは、ＭＡＳＣタンパク質単量体ＡｅｒｏＮａｂ６の約３．０Å分解能でのｃｒｙｏ－ＥＭ構造を示し、ＡｅｒｏＮａｂ６ ＭＡＳＣ単量体が左側のスパイク三量体の「ダウン」コンフォメーションに結合して、それ故にＡＣＥ２の結合を防ぐことを示している。図４Ｂの右側は構造の上面図であり、３つのＡｅｒｏＮａｂ６単量体がスパイク三量体にエンゲージしていることを示している。さらに、この構造は、複数のＲＢＤに同時に結合する多量体型ＡｅｒｏＮａｂ６ ＭＡＳＣタンパク質のリンカー長が最小であることも示している。スパイクＥＣＤに「ダウン」状態で結合した個々のＡｅｒｏＮａｂ６単量体のＮ末端とＣ末端の間の距離は５１Åである。個々のサブユニットを架橋して複数のＲＢＤ単量体に同時にエンゲージするために、これは１５個以上のアミノ酸を必要とする。
図５Ａ及び５Ｂは、本発明のＭＡＳＣタンパク質の作用機序を描写している。図５Ａは、ＡｅｒｏＮａｂ６ ＭＡＳＣタンパク質が、三量体の１つのＲＢＤとＣＤＲ１及びＣＤＲ２を使用してエンゲージし、三量体の第２のＲＢＤとはＣＤＲ３によりエンゲージすることを示している。以下でさらに考察するように、これは、ＲＢＤを極めて高い親和性で「オフ」位置にロックするのに極めて効果的である。また、この構造により、親和性成熟を促進する接触残基も同定される。以下でさらに考察するように、ＡｅｒｏＮａｂ６ ＭＡＳＣは、残基４４６、４４７、４４９、４５３、４５５、４５６、４８３～４８６、４８９～４９０、４９３～４９６、４９８、５０１及び５０５を含む、ＳＣ２スパイクＲＢＤのＡＣＥ２結合領域内で、広範な接触を行う。ＡｅｒｏＮａｂ６ ＭＡＳＣのＣＤＲ３は、残基３４２、３４３、３６７、３７１～３７５、４０４、４３６～４４１によって規定される三次元エピトープで、ＳＣ２スパイク上の隣接するＲＢＤと接触する。このさらなる接触により、ＡｅｒｏＮａｂ６ ＭＡＳＣは、隣接するＲＢＤを「オフ」位置にロックしながら、同時に隣接ＲＢＤでのＡＣＥ２の結合を破壊することができる。図５Ｂは、ＡｅｒｏＮａｂ６ ＭＡＳＣ分子のスパイクタンパク質への結合部位と、ＡＣＥ２のスパイクタンパク質への結合部位が重なることを示している。この重なりは、ＡｅｒｏＮａｂ６ ＭＡＳＣ単量体であってもＡＣＥ２の単量体ＲＢＤへの結合を遮断するという事実の説明となる。
図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃは、より結合価の高いＭＡＳＣタンパク質が作製されるほど効力が増加することを描写している。図６Ａは、単量体ＡｅｒｏＮａｂ６の結合動態を示しており、ＫＤは２１０ｎＭである。図６Ｂは、二量体ＭＡＳＣ融合タンパク質の結合親和性の増加を示し、図６Ｃは、三量体ＭＡＳＣ融合タンパク質でのさらなる増加を示している。二量体及び三量体の融合タンパク質の間での解離速度のさらなる低下は、３つのＳＣ２スパイクＲＢＤすべての、三量体ＭＡＳＣによるエンゲージメントを示唆する。
図７Ａ及び７Ｂは、１つのＭＡＳＣ単量体ＡｅｒｏＮａｂ６の親和性成熟を示している。図７Ａは、スパイク三量体の第１のＲＢＤに結合するｖｈｈＣＤＲ１及びｖｈｈＣＤＲ２、並びに第２のＲＢＤに結合するｖｈｈＣＤＲ３に突然変異が作られたことを示している。図７Ｂは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した、親タンパク質ＡｅｒｏＮａｂ６、及び親和性成熟候補の１つであるＡｅｒｏＮａｂ６ｍの結合動態を示している。この特定の抗原結合ドメインでは、スパイクタンパク質への結合が５００倍に増強していた。
図８Ａ、８Ｂ及び８Ｃは、親和性成熟ＭＡＳＣタンパク質候補ＡｅｒｏＮａｂ６ｍＸ３の結合親和性の増加を示している。図８Ａは、親ＡｅｒｏＮａｂ６、親和性成熟タンパク質であるＡｅｒｏＮａｂ６ｍ、及び三量体スパイクタンパク質に結合するように設計された三量体形態のＡｅｒｏＮａｂ６ｍＸ３を、ＳＰＲによって測定したものである。驚いたことに、しかも好運なことに、三量体ＡｅｒｏＮａｂ６ｍＸ３がスパイクタンパク質から解離する半減期は、少なくとも数週間である。単量体の解離速度及び３つのＲＢＤの同時エンゲージメントによって予測されるＡｅｒｏＮａｂ６ｍＸ３の理論的な解離半減期は１００年を上回る。
図９Ａ、９Ｂ及び９Ｃは、ＡｅｒｏＮａｂ６ ＭＡＳＣタンパク質のヒト化の成功を描写している。図９Ａは、ＡｅｒｏＮａｂ６の開始速度パラメーターを示しており、ラマフレームワーク領域は図９Ｂに示されている。図９Ｃに示すように、ＣＤＲをヒト重鎖フレームワークに移植する（ＩＧＨＶ３－６６）。ヒト化型であるＡｅｒｏＮａｂｈは、図１７に示されているように、ヒトＩＧＨＶ３－６６配列中に２つのアミノ酸置換のみを有する。図９Ｄに示されているように、ヒト化置換はスパイクタンパク質に対する親和性の著しい低下を引き起こさない。
図１０は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含有するレンチウイルス構築物によるヒトＡＣＥ２発現ＨＥＫ２９３細胞の感染を使用する、シュードウイルス中和アッセイを描写している。図に示されているように、三量体ＭＡＳＣ融合タンパク質はＭＡＳＣ単量体よりも高度の中和を示す。加えて、親和性成熟したＭＡＳＣタンパク質も同様に効力の増加を示す。
図１１は、示したＭＡＳＣ被験物質によるＶｅｒｏＥ６細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染の阻害を測定し、７２時間後にウイルス定量を行った、実際のウイルス中和アッセイを示している。示されているように、三量体ＭＡＳＣ融合タンパク質はＭＡＳＣ単量体よりも高度の中和を示す。加えて、親和性成熟したＭＡＳＣタンパク質も同様に効力の増加を示す。真正ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の中和を、プラーク減少中和試験を使用して行った。ＭＡＳＣタンパク質を培地で連続希釈して、１００μＬの５００ ＴＣＩＤ５０ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２と１時間混合した。この混合物をＶｅｒｏＥ６細胞に添加して１時間インキュベートした後、細胞を固体支持体の上に重ねてプラークを発生させ、それを第３日に定量した。最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を、３パラメーターのロジスティック回帰を使用して決定した。
図１２は、データの一部を、示されているＭＡＳＣタンパク質のセットとともにまとめた表を示している。
図１３は、元のスクリーニングにおける一部のｓｄＡＢＤの配列を、ＣＤＲ及び各フレームワークを含めて描写しており、元のクローンの一部ではＦＲ２も変更されていることに注目されたい。
図１４は、図１３中のクローンに対応するＭＡＳＣタンパク質のｓｄＡＢＤの完全長配列を描写している。
図１５は、本発明のいくつかの異なるＭＡＳＣタンパク質の骨格及びＣＤＲセットを描写している。
図１６は、本明細書に開示されるＣＤＲに基づくいくつかのＭＡＳＣ単量体のｓｄＡＢＤ配列を描写している。
図１７Ａ及び１７Ｂは、本発明における一部の使用配列を描写している。図１７Ａは、本明細書におけるデータの生成に使用したスパイク抗原の配列を描写しており、図１７Ｂは、ヒトＡＣＥ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の配列である。ＭＡＳＣタンパク質の同定のために使用するＳＣ２スパイクＥＣＤとしては、９８６／９８７のプロリン置換及びフューリン切断部位の置換（残基６８２～６８５がＧＳＡＳ）を有する、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２の残基１～１２０８をコードする構築物を使用した。Ｃ末端Ｔ４フィブリチン三量体化モチーフが含まれ、その後にライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位、８×ヒスチジンタグ、及びTwin Strep Tag（Wrapp et al Science 2020に記載）が含まれている。ＳＣ２スパイクＥＣＤ構築物を、Ｅｘｐｉ２９３細胞又はＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Thermo）のいずれかにおいて、製造元の指示に従って発現させた。ＳＣ２スパイクＥＣＤを、金属親和性とサイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせて精製した。
図１８は、本発明において特に有用な一部の配列を描写している。ＣＤＲにはそれぞれ下線が施され、ｓｄＡＢＤとリンカーの接合部は「スラッシュ（/）」として示されている。
図１９は、三量体ＭＡＳＣ融合タンパク質ＡｅｒｏＮａｂ６Ｘ３の著しい凍結乾燥安定性を描写している。固定化したスパイクタンパク質のsuperdex S200ゲル濾過又はＳＰＲ分析のいずれかによる凍結乾燥前後の測定により、本発明のＭＡＳＣ融合タンパク質は、結合が保たれるという点で、凝集、変性又は活性低下をいずれも伴わずに凍結乾燥し得ることが示されている。
図２０Ａ、２０Ｂ及び２０Ｃは、三量体ＭＡＳＣ融合タンパク質ＡｅｒｏＮａｂ６Ｘ３による、エアロゾル化に対する著しい安定性を示している。図１８Ａは、３．５μｍの液滴を生み出す廉価なネブライザーを示している。Superdex S200ゲル濾過を使用したところ、その結果、この融合タンパク質は、エアロゾル化前（図１８Ｂ）とエアロゾル化後（図１８Ｃ）を比較して凝集又は変性がなく、エアロゾル化に対して安定であることが示されている。
図２１は、実施例２で達成された親和性の著しい増加を示している。ＮｂＣＯＶ６のナノボディ変異体を提示する酵母を、蛍光性ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２スパイク受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とインキュベートした。酵母細胞表面に結合したＲＢＤの量を、フローサイトメトリーによって定量した。親和性成熟した変異体のプールは、滴定によると親ＮｂＣＯＶ６と比較して効力が増加しており、このことは受容体結合ドメインに対する親和性がより高いことを示す。
図２２は、固定化したＳＣ２スパイクＥＣＤを使用して測定された、元の親抗スパイクＭＡＳＣタンパク質に対するＳＰＲ親和性の比較を示している。
図２３は、固定化したＳＣ２スパイクＥＣＤを使用して測定された、いくつかのＭＡＳＣタンパク質及び融合タンパク質に対するＳＰＲ親和性の比較を示している。
図２４は、ＡｅｒｏＮａｂ６のヒト化戦略を示しており、親クローンのヒトＩＧＨＶ３－６６配列との類似性が高いことを示している。
図２５は、本発明の有用なＣＤＲセット及びフレームワーク領域を示している。
図２６は、ＡｅｒｏＮａｂ６ｍｈ ｓｄＡＢＤ及びＮｂＣＯＶ００３ ｓｄＡＢＤを使用した２つの二量体ＭＡＳＣ構築物の配列を示している。
図２７は、実施例４を裏付けるデータを示している。
図２８は、実施例４を裏付けるデータを示している。
図２９は、実施例４を裏付けるデータを示している。
図３０は、実施例４を裏付けるデータを示している。
図３１は、実施例４を裏付けるデータを示している。
図３２は、Ｎｂ６に関するＣｒｙｏ－ＥＭワークフローを示している。スパイクＳ２Ｐの開コンフォメーション及び閉コンフォメーションが得られる、スパイクＳ２Ｐ－Ｎｂ６複合体に関する分類ワークフローのフローチャート表示である。上から下に順に見ていくと、閉コンフォメーションにあるａｐｏ－スパイクＳ２Ｐの２０Åローパスフィルター処理２Ｄ逆投影像のセットにより、粒子をテンプレート選択した。様々なスパイクＳ２Ｐ図を示唆する２Ｄクラスの抽出された粒子を、切詰め型の非経験的（Ａｂ ｉｎｉｔｉｏ）ジョブから生成された２つのナイーブクラス、及び閉コンフォメーションにあるａｐｏ－スパイクＳ２Ｐの２０Åローパスフィルターボリュームによる、ｃｒｙｏＳＰＡＲＣにおける不均一なリファインメントに供した。スパイクＳ２Ｐの３Ｄクラスの粒子を、６０Åローパスフィルター処理を行ったＴ＝８のｃｒｙｏＳＰＡＲＣ ３Ｄ分類からの同じ入力ボリュームを使用する、ＲＥＬＩＯＮによるアラインメントを行わない３Ｄ分類の２５回の繰り返しに供して、６つのクラスに分類した。スパイクＳ２Ｐの開コンフォメーション及び閉コンフォメーションを表すクラス内の粒子を、ｃｉｓＴＥＭにインポートして、自動リファインメントを行った。表示用の分布プロットをｐｙＥＭにより生成し、ＣｈｉｍｅｒａＸにより可視化した。図Ｓ３に示されているように、局所分解能の推定のためにリファインメントによるハーフマップをｃｒｙｏＳＰＡＲＣにインポートした。
図３３は、Ｎｂ１１に関するＣｒｙｏ－ＥＭワークフローを示している。スパイクＳ２Ｐの開コンフォメーションと閉コンフォメーションが得られる、スパイクＳ２Ｐ－Ｎｂ１１複合体に関する分類ワークフローである。閉コンフォメーションにあるａｐｏ－スパイクＳ２Ｐの２０Åローパスフィルター２Ｄ逆投影像のセットにより、２つの別々のコレクションから粒子をテンプレート選択した。抽出された粒子を１２８ピクセルにＦｏｕｒｉｅクリッピングして、その後に、閉コンフォメーションにある２０Åローパスフィルター処理したボリュームのａｐｏ－スパイクＳ２Ｐ、及び非スパイクＳ２Ｐ粒子を除去するための追加のナイーブクラスを使用して、ｃｒｙｏＳＰＡＲＣにおいて高度な不均一リファインメントを行った。ｃｒｙｏＳＰＡＲＣマイクログラフキュレーション及び不均一なリファインメントの後に、ＡＣＥ２ ＲＢＤ：：ナノボディ境界面の外側の全領域に対応するスパイクＳ２Ｐ密度を減算した。ＡＣＥ２ ＲＢＤ：：ナノボディ境界面の周りにマスクを生成し、ＲＥＬＩＯＮにおけるアラインメントなしでの複数回の３Ｄ分類に使用した。スパイクＳ２Ｐの開コンフォメーション及び閉コンフォメーションを表すクラス内の粒子を選択し、ＲＥＬＩＯＮにおけるリファインメントの前に減算は行わず、ビニングも行わなかった。表示用の分布プロットをｐｙＥＭにより生成し、ＣｈｉｍｅｒａＸにより可視化した。図Ｓ３に示されているように、局所分解能の推定のためにリファインメントによるハーフマップをｃｒｙｏＳＰＡＲＣにインポートした。
図３４は、ｃｒｙｏ－ＥＭマップ及びモデルの分解能を示している。Ａ．ｃｒｙｏＳＰＡＲＣで生成されたスパイクＳ２Ｐ複合体の局所分解能の推定値。すべてのマップ（ｍＮｂ６を除く）は、囲まれた同じボリュームで示されている。すべてのマップは、示されているように同じ尺度で色分けされている。Ｂ．ｃｒｙｏＳＰＡＲＣにおいて計算されたｃｒｙｏ－ＥＭマップに関するGold Standard Fourier Shell Correlation（ＧＳＦＳＣ）プロット。括弧内の分解能の値は、ＦＳＣ＝０．１４３（破線）での値を表す。Ｃ．Ｐｈｅｎｉｘで計算されたモデルマップ相関。括弧内の分解能の値は、ＦＳＣ＝０．５（破線）での値を表す。
図３５は、多量体ナノボディ設計のための距離のモデル化を示している。Ａ．閉状態にあるスパイクＳ２Ｐ：Ｎｂ６複合体のモデル。隣接するＮｂ６のＮ末端とＣ末端との間の最小距離は５２Å（破線）である。Ｂ．アップ状態のＲＢＤのｃｒｙｏ－ＥＭ密度にＮｂ６がドッキングした、開状態にあるスパイクＳ２Ｐ：Ｎｂ６複合体のモデル。両方のナノボディのＮ末端とＣ末端との間の最小距離は７２Åである。Ｎｂ６はＲＢＤ３と立体的に衝突すると考えられるため、開状態のスパイクＳ２Ｐ中のＲＢＤ２とは結合することができない。Ｃ．閉状態のスパイクＳ２Ｐ：Ｎｂ１１複合体のモデル。隣接するＮｂ６のＮ末端とＣ末端との間の最小距離は７１Å（破線）である。Ｄ．開状態のスパイクＳ２Ｐ：Ｎｂ１１複合体のモデル。隣接するＮｂ６のＮ末端とＣ末端の間の最小距離は、ダウン状態のＲＢＤ２に結合したＮｂ１１とアップ状態のＲＢＤ３の間で６８Åである。Ｂについては、Ｎ末端とＣ末端との間の距離のモデル化が可能になるように、ＡからのＮｂ６のモデルをｃｒｙｏ－ＥＭマップにドッキングした。Ｃ及びＤについては、Ｎ末端とＣ末端の間との距離をモデル化するために、一般的なナノボディをｃｒｙｏ－ＥＭマップにドッキングした。
図３６は、スパイクＳ２Ｐの放射線分解ヒドロキシルラジカルフットプリントを示している。Ａ．すべての残基におけるスパイクＳ２Ｐ複合体とＮｂ３－スパイクＳ２Ｐ複合体との間での酸化速度の変化。スパイクＳ２Ｐ－Ｎｂ３複合体の高度に保護された残基のクラスターが、Ｎ末端ドメインに観察される。Ｂ．Ｎｂ３のスパイクＳ２Ｐに対する結合に際して最も高度に保護される２つの残基（Ｍ１７７、Ｈ２０７）の酸化速度プロット。星印を付けたデータポイントは、これらの値がおそらくは高度の酸化媒介性損傷のために一次反応の範囲外にあるため、速度計算から除外している。Ｃ．全ＲＢＤダウンコンフォメーションにおいてスパイク上にマッピングされた酸化速度の変化。
図３７は、多価Ｎｂ３構築物がスパイクＳ２Ｐ：ＡＣＥ２相互作用を阻害することを示している。Ａ．固定化したスパイクＳ２ＰによるＳＰＲ実験により、Ｎｂ３及び一価ＡＣＥ２がスパイクＳ２Ｐに同時に結合し得ることが示されている。Ｎｂ３及び一価ＡＣＥ２の順序は第２の試薬の結合に影響しない。従って、Ｎｂ３はスパイクＳ２Ｐの一価ＡＣＥ２への結合を阻害しない。Ｂ．一価又は三価のＮｂ３のいずれかによる、ＡＣＥ２発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する１ｎＭのスパイクＳ２Ｐ－Ａｌｅｘａ ６４７の結合のナノボディ阻害。Ｎｂ３－ｔｒｉに対する生物学的反復試験ｎ＝２。エラーバーはすべてｓ．ｅ．ｍ．を表す。
図３８は、ｍＮｂ６に関するＣｒｙｏＥＭワークフローを示している。閉コンフォメーションのスパイクＳ２Ｐが得られる、スパイクＳ２Ｐ－ｍＮｂ６複合体の分類ワークフロー。上から下に順に見ていくと、閉コンフォメーションにあるａｐｏ－スパイクＳ２Ｐの２０Åローパスフィルター処理２Ｄ逆投影像のセットにより、２つの別々のコレクションから粒子をテンプレート選択した。抽出された粒子を９６ピクセルにＦｏｕｒｉｅクリッピングし、その後に２Ｄ分類を行った。スパイクＳ２Ｐの２Ｄクラスの粒子を選択して、閉コンフォメーションにある２０Åローパスフィルター処理したボリュームのａｐｏ－スパイクＳ２Ｐ、及び非スパイクＳ２Ｐ粒子を除去するための追加のナイーブクラスを使用して、ｃｒｙｏＳＰＡＲＣにおいて不均一なリファインメントを１回行った。ＲＥＬＩＯＮでは、スパイクＳ２Ｐ３Ｄクラスの粒子を、６０Åローパスフィルター処理を行ったＴ＝８のｃｒｙｏＳＰＡＲＣ ３Ｄ分類からの同じ入力ボリュームを使用する、アラインメントなしでの２回の３Ｄ分類に供して、６つのクラスに分類した。ビニングを行っていない閉コンフォメーションのスパイクＳ２Ｐ粒子を、ｃｉｓＴＥＭにエクスポートして自動リファインメントを行い、その後に、ＲＢＤ：：ナノボディ境界面の周りのマスクを使用して局所リファインメントを行った。表示用の分布プロットをｐｙＥＭにより生成し、ＣｈｉｍｅｒａＸにより可視化した。図Ｓ３に示されているように、局所分解能の推定のためにリファインメントによるハーフマップをｃｒｙｏＳＰＡＲＣにインポートした。
図３９は、ｍＮｂ６及びＮｂ３－ｔｒｉが、ウイルス中和に関して相加的であることを示している。Ｎｂ３－ｔｒｉ濃度を次第に増加させたｍＮｂ６による、ＡＣＥ２発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のシュードタイプ化レンチウイルス感染の阻害。ｍＮｂ６中和は、Ｎｂ３－ｔｒｉの飽和以下用量での阻害活性によって示されるように、Ｎｂ３－ｔｒｉと相加的である。しかし、ｍＮｂ６の効力はＮｂ３－ｔｒｉによって変化せず、このことはウイルス中和に対する相乗効果はないことを示唆する。
図４０は、Ｎｂ６及びその誘導体の安定性を示している。Ａ．２０４ｎｍでのモル楕円率の円二色性測定によって評価したナノボディの熱変性。各ナノボディについて見かけの融解温度（Ｔｍ）を示している。Ｂ．２５℃又は５０℃での１時間のインキュベーションの後、又はエアロゾル化の後の、ＡＣＥ２発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する１ｎＭのスパイクＳ２Ｐ－Ａｌｅｘａ ６４７の結合のナノボディ阻害。Ｃ．エアロゾル化、凍結乾燥、又は５０℃で１時間の熱処理後の、ｍＮｂ６－ｔｒｉによる、ＡＣＥ２発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のシュードタイプ化レンチウイルス感染の阻害。
図４１は、中和アッセイにおけるナノボディの親和性及び有効性を示している。ａ Ｎｂ６、Ｎｂ１１、Ｎｂ１５、Ｎｂ１９に関する生物学的反復試験ｎ＝５による平均値を提示しており、他はすべてｎ＝３の生物学的反復試験として試験した。ｂ Ｎｂ１２、Ｎｂ１７、及びＮｂ１１－ｔｒｉの生物学的反復試験ｎ＝２による平均値を提示しており、他はすべてｎ＝３の生物学的反復試験として試験した。ｃ Ｎｂ３、Ｎｂ３－ｂｉ、及びＮｂ３－ｔｒｉの生物学的反復試験ｎ＝２による平均値。他はすべて、ｎ＝３の生物学的反復試験。ｄ Ｎｂ３、Ｎｂ１７、及びＮｂ１８は、それぞれ大腸菌培養液１リットルあたり４１．３、４．０、及び２．２ミリグラムで発現される。Ｎｂ３はGE S200 Increase 10×300カラム上のサイズ排除クロマトグラフィーで単分散性であり、一方、Ｎｂ１７及びＮｂ１８は多分散性である。ＮＢ－結合なし。ＮＣ－競合なし。ＮＰ－実行せず。
図４２は、低温電子顕微鏡検査によるデータ収集及びリファインメントの統計値を示している。
図４３は、Ｘ線結晶学データの収集及びリファインメントの統計値を示している。
図４４は、Ｘ線結晶学データの収集とリファインメントの統計値を示している。ａ 括弧内の値は最高分解能のシェルに対応する。ｂ Ｒｍｅｒｇｅ＝Σ｜Ｉ－＜Ｉ＞｜／ΣＩ。
図４５は、ナノボディ発現プラスミドを示している。
図４６は、ＡｅｒｏＮａｂ６ｍｈｘ３の生物物理学的安定性を示している。ＡｅｒｏＮａｂ６ｍｈｘ３は熱変性に対して抵抗性である。温度を上昇させながら測定したＡｅｒｏＮａｂｓの円二色性は、２０４ｎｍでβシートの特性が失われることを示している。融解温度（Ｔｍ）は、シグナルの５０％損失として計算した。
図４７は、ｍＮｂ６に結合したスパイクの構造を示している。スパイクに結合したｍＮｂ６のｃｒｙｏ－ＥＭ構造は、スパイクの閉コンフォメーションの安定化を示している。
図４８は、ｍＮｂ６のＸ線構造（ａｐｏ結合及びスパイク結合）を示している。ＣＤＲ１及びＣＤＲ３は、適応的適合機構によって結合する。
図４９は、一次スクリーニングからの他のナノボディを示している。
図５０は、ＡｅｒｏＮａｂ３がアロステリックエピトープを標的とすることを示している。指定用量のＡｅｒｏＮａｂ構築物によるＶｅｒｏＥ６細胞のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染の阻害。ウイルスプラークは７２時間後に定量した。ＡｅｒｏＮａｂ３は、スパイク上の固有のエピトープを標的として、ウイルス感染を中和する。
図５１は、実施例５の伝播試験の実験デザインを示している。
図５２は、実施例５の有効性試験の実験デザインを示している。
図５３は、実施例５に記載されているように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染動物との同居の前にナノ粒子Ａによる処置後のゴールデンシリアンハムスターの肺ウイルス力価を示している。
図５４は、実施例５に記載されているように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染動物との同居の前にナノ粒子Ａを投与した後のゴールデンシリアンハムスターの口腔咽頭スワブウイルス力価を示している。
図５５は、実施例５に記載されているように、ナノ粒子Ａを投与してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたゴールデンシリアンハムスターの肺ウイルス力価を示している。
図５６は、実施例５に記載されているように、ナノ粒子Ａを投与してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたゴールデンシリアンハムスターの口腔咽頭スワブウイルス力価を示している。
図５７は、伝播試験に関して、感染動物との同居の前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による負荷及びナノ粒子Ａの投与を受けた５週齢のゴールデンシリアンハムスターの初期体重の割合を示している。（ハムスターｎ＝４／感染群、ハムスターｎ＝８／ナイーブ群）。同じ形の記号を付した動物を同居させた。黒丸印及び黒四角印で表した群を、試験第０日に感染させた。白抜き丸印で表した動物は、ナイーブとしてプラセボ投与を行った後に、第１群の動物と１日４時間ずつ３日間同居させた。白抜き四角印で表した動物は、ナイーブとしてナノ粒子Ａを投与した後に、第３群の動物と同居させた。一方向ＡＮＯＶＡによって比較した場合、初期体重の割合の差は統計的に有意ではなかった。
図５８は、実施例５に概要を記載した伝播試験に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による負荷及びナノ粒子Ａの投与の後に感染動物と同居させた５週齢ゴールデンシリアンハムスターの肺ウイルス力価を示している。同じ形の記号を付した動物を同居させた。黒丸印及び黒四角印で表した群を、研究第０日に感染させた。白抜き丸印で表した動物は、ナイーブとしてプラセボ投与を行った後に、第１群の動物と１日４時間ずつ３日間同居させた。白抜き四角印で表した動物は、ナイーブとしてナノ粒子Ａを投与した後に、第３群の動物と同居させた。ナノ粒子Ａの投与は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた動物と同居させたナイーブ動物において、肺ウイルス力価を有意に低下させた。
図５９は、実施例５に概要を記載した伝播試験に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による負荷及びナノ粒子Ａの投与の後に感染動物と同居させた５週齢ゴールデンシリアンハムスターの肺重量を示している。同じ形の記号を付した動物を同居させた。黒丸印及び黒四角印で表した群を、研究第０日に感染させた。白抜き丸印で表した動物は、ナイーブとしてプラセボ投与を行った後に、第１群の動物と１日４時間ずつ３日間同居させた。白抜き四角印で表した動物は、ナイーブとしてナノ粒子Ａを投与した後に、第３群の動物と同居させた。一方向ＡＮＯＶＡで比較した場合、肺重量には群間で統計的な差はなかった。
図６０は、実施例５の伝播試験に関して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による負荷及びナノ粒子Ａの投与の後に感染動物と同居させた５週齢ゴールデンシリアンハムスターの口腔咽頭スワブウイルス力価を示している。同じ形の記号を付した動物を同居させた。黒丸印及び黒四角印で表した群を、研究第０日に感染させた。白抜き丸印で表した動物は、ナイーブとしてプラセボ投与を行った後に、第１群の動物と１日４時間ずつ３日間同居させた。白抜き四角印で表した動物は、ナイーブとしてナノ粒子Ａを投与した後に、第３群の動物と同居させた。一方向ＡＮＯＶＡでは、口腔咽頭スワブウイルス力価に有意差は認められなかった。
図６１は、実施例５における有効性試験に関して、ナノ粒子Ａの投与及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染後の５週齢ゴールデンシリアンハムスターの初期体重の割合を示している。（ハムスターｎ＝８／群）ナノ粒子Ａの投与を開始して２時間後に感染させた。一方向ＡＮＯＶＡによって比較した場合、初期体重の割合の差は統計的に有意ではなかった。
図６２は、ナノ粒子Ａの投与及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染後の５週齢ゴールデンシリアンハムスターの肺ウイルス力価を示している。ナノ粒子Ａの投与を開始したところ、２ｍｇ／ｋｇ／日及び０．６３ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、プラセボ投与動物と比較して肺ウイルス力価が有意に低下した。（＊＊プラセボ投与群と比較してＰ＜０．０１）
図６３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の負荷及びナノ粒子Ａの投与後に感染動物と同居させた５週齢ゴールデンシリアンハムスターの肺重量を示している。一方向ＡＮＯＶＡによって比較した場合、肺重量には群間で統計的な差はなかった。
図６４は、実施例５における有効性試験に関して、ナノ粒子Ａの投与及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染後の５週齢ゴールデンシリアンハムスターの口腔咽頭スワブウイルス力価を示している。ナノ粒子Ａを２ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与したところ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させたハムスターの口腔咽頭スワブ力価が有意に低下した（＊プラセボ投与群と比較してＰ＜０．０５）。
Ａ．定義
本明細書で使用される「アミノ酸」及び「アミノ酸本体（amino acid identity）」とは、２０の天然に存在するアミノ酸又は特定の定義された位置で存在し得る非天然類似体のうちの１つを意味する。多くの実施形態では、「アミノ酸」は、２０の天然に存在するアミノ酸のうちの１つを意味する。本明細書の「タンパク質」とは、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドが含まれる。
本明細書の「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失、若しくはタンパク質に化学的に結合した部分に対する変更を意味する。例えば、改変は、タンパク質に結合した変更された炭水化物又はＰＥＧ構造であってもよい。明確にするために、特に断りのない限り、アミノ酸改変は、たいていは、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ中のコドンを有する２０のアミノ酸に対するものである。本明細書の好ましいアミノ酸改変は、置換である。
本明細書の「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置においてアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味する。特に、いくつかの実施形態において、この置換は、生物内で、又はいかなる生物のいずれかにおいても天然に存在しない、特定の位置で天然に存在しないアミノ酸に対するものである。明確にするために、核酸コード配列を変化させるように操作されているが、元のアミノ酸を変化させる（例えば、宿主生物発現レベルを増加させるために、ＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（やはりアルギニンをコードする）に交換する）ようには操作されていないタンパク質は、「アミノ酸置換」ではない。即ち、同じタンパク質をコードする新しい遺伝子を作り出したにもかかわらず、タンパク質が、特定の位置で元の同じアミノ酸を有するならば、それはアミノ酸置換ではない。
本明細書で使用される「アミノ酸挿入」又は「挿入」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸配列の付加を意味する。
本明細書で使用される「アミノ酸欠失」又は「欠失」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸配列の除去を意味する。
本発明のポリペプチドは、本明細書に概説されるように、スパイク三量体タンパク質に特異的に結合する。「特異的結合」又は特定の抗原若しくはエピトープ「に特異的に結合する」又は「に特異的」は、非特異的相互作用とは測定できるほどに異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有さない類似の構造の分子である対照分子の結合と比較して分子の結合を決定することによって、測定することができる。例えば、特異的結合は、類似する対照分子との標的に対する競合によって決定することができる。
特定の抗原若しくはエピトープに対する特異的結合は、例えば、少なくとも約１０－４Ｍ、少なくとも約１０－５Ｍ、少なくとも約１０－６Ｍ、少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、或いは少なくとも約１０－１０Ｍ、少なくとも約１０－１１Ｍ、少なくとも約１０－１２Ｍ、少なくとも約１０－１３Ｍ、少なくとも約１０－１４Ｍ、少なくとも約１０－１５Ｍ又はそれ以上の抗原若しくはエピトープに対するＫＤを有する抗原結合ドメイン（ＳＢＤ）によって表すことができ、ここで、ＫＤは、特定のＡＢＤ－抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合するＡＢＤは、抗原若しくはエピトープに対して対照分子よりも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍又はそれ以上の大きいＫＤを有するであろう。
また、特定の抗原若しくはエピトープに対する特異的結合は、例えば、対照と比べてエピトープに対して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍又はそれ以上の大きい抗原若しくはエピトープに対するＫＡ又はＫａを有する抗体によって表すことができ、ここで、ＫＡ又はＫａは、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は、一般に、当該技術分野において既知であるように、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ又はＯｃｔｅｔを使用して測定される。
本明細書で使用される「親ポリペプチド」又は「前駆体ポリペプチド」（本発明の提供される抗スパイク抗原結合ドメインを含む）は、その後、バリアントを生成するために改変されるポリペプチドを意味する。この場合、例えば、図１３の出発クローンのいずれか１つは、ＡｅｒｏＮａｂ６の場合と同様に「親ポリペプチド」と見なすことができる。親ポリペプチドは、ポリペプチドそれ自体、親ポリペプチドを含む組成物、又はそれをコードするアミノ酸配列を指す場合もある。
本発明のポリペプチドは、本明細書に記載される配列と少なくとも約９０％、９１、９２、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．２、９９．４、９９．６、９９．８、又は１００％の配列同一性を有する。
本明細書で使用される「位置」とは、タンパク質の配列における場所を意味する。位置は、順番に番号付けされるか、又は確立された形式に従って番号付けされてもよい。
本明細書の「可変重鎖ドメイン」又は「ＶＨドメイン」若しくは「ＶＨＨドメイン」とは、ＣＤＲを含有する抗原結合ドメインの領域を意味する。本明細書で論議される分子は、ＶＬドメインを含有しない。これらの実施形態では、各ＶＨは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって次の順序：ＦＲ１－ｖｈｈＣＤＲ１－ＦＲ２－ｖｈｈＣＤＲ２－ＦＲ３－ｖｈｈＣＤＲ３－ＦＲ４で配置された、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）と、４つの「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」とから構成される。ｖｈＦＲ領域は自己集合して、ＦｖドメインであるｓｄＡＢＤを形成する。本明細書の「単一ドメインＦｖ」、「ｓｄＦｖ」又は「ｓｄＡＢＤ」とは、一般にラクダ科動物抗体技術に基づく、３つのＣＤＲだけを有する抗原結合ドメインを意味する。Protein Engineering 9(7):1129-35(1994);Rev Mol Biotech 74:277-302(2001);Ann Rev Biochem 82:775-97(2013)を参照されたい。ｓｄＡＢＤは、定常ドメイン（ラクダ科動物抗体の場合、ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン）の欠如による単一ドメイン抗体とは区別される。
超可変領域は、抗原結合特異性を付与し、一般に、軽鎖可変領域中のおよそアミノ酸残基２４～３４（ＬＣＤＲ１；「Ｌ」は軽鎖を意味する）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）及び８９～９７（ＬＣＤＲ３）からのアミノ酸残基と、重鎖可変領域中のおよそ３１～３５Ｂ（ＨＣＤＲ１；「Ｈ」は重鎖を意味する）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）及び９５～１０２（ＨＣＤＲ３）周辺からのアミノ酸残基を包含し；Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)、並びに／又は超可変ループを形成するこれらの残基（例えば、軽鎖可変領域中の残基２６～３２（ＬＣＤＲ１）、５０～５２（ＬＣＤＲ２）及び９１～９６（ＬＣＤＲ３）と、重鎖可変領域中の２６～３２（ＨＣＤＲ１）、５３～５５（ＨＣＤＲ２）及び９６～１０１（ＨＣＤＲ３）；Chothia and Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917を包含する。本発明の具体的なＣＤＲは、以下に記載されている。
本明細書に記載されるように、スパイク抗原は、図１７Ａに見られる配列及び／又は以下の配列によって定義される。
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT（配列番号３００）。この配列は、時々発生する可能性があるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２における変異から生じるバリアントを含むと解釈される。様々な実施形態では、バリアントは、スパイクタンパク質のＡＣＥ２結合ドメイン中の上記配列とは異なる。いくつかの実施形態では、バリアントは、ＡＣＥ２結合ドメイン以外の部位で、上記配列とは異なる。いくつかの実施形態では、バリアントは、少なくともＡＣＥ２結合ドメイン及び１つの他の部位において、上記配列とは異なる。様々な実施形態では、バリアントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸だけ、上記配列とは異なる。
当該技術分野において理解されるように、ＣＤＲの正確な番号付け及び配置は、様々な番号付けシステムの間で異なる場合がる。しかしながら、可変重鎖配列及び／又は可変軽鎖配列の開示は、関連する（固有の）ＣＤＲの開示を含むことを理解するべきである。従って、各可変重鎖領域の開示はｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３）の開示である。
ＣＤＲ番号付けの有用な比較は、以下の通りであり、Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77(2003)を参照されたい。
Figure 2023526274000002
本明細書の全体を通して、ＩＭＧＴ番号付けシステムが、可変ドメイン中の残基を指す場合に一般的に使用される。
本発明は、ｓｄＡＢＤに集合し得る多数の異なるＣＤＲセットを提供する。単一ドメインＡＢＤ（「ｓｄＡＢＤ」）に関して、ＣＤＲセットは、３つのＣＤＲのみであり、これらは、当該技術分野において同様に「ＶＨＨ」と称されることもある。
ＣＤＲは、抗原結合、又はより具体的にはエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」は、パラトープとして知られる可変領域中の特定の抗原結合部位と相互作用する決定因子を指す。エピトープは、アミノ酸又は糖側鎖などの分子のグループであり、通常、特定の構造特性並びに特定の電荷特性を有する。単一の抗原は、２つ以上のエピトープを有し得る。
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる）及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基（例えば、特定の抗原結合ペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基、言い換えれば、特定の抗原結合ペプチドの占有領域内にあるアミノ酸残基）を含み得る。
エピトープは、構造的又は線状のいずれかであり得る。構造的エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸によって作り出される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって作り出されるものである。構造的エピトープと非構造的エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合が失われるが、後者への結合は失われないことによって区別することができる。
エピトープは、典型的には、少なくとも３個、より通常は、少なくとも５個又は８～１０個のアミノ酸を特有な空間的配座構造中に含む。同じエピトープを認識する抗体は、一方の抗体の、別の抗体の標的抗原への結合をブロックする能力、例えば、「ビニング」を示す簡単な免疫アッセイ法で確認することができる。以下に概説されるように、本発明は、本明細書に列挙される抗原結合ドメイン及び抗体を含むだけではなく、列挙された抗原結合ドメインが結合するエピトープとの結合について競合するものも含む。
Ｂ．序論
当該技術分野において既知であるように、コロナウイルスは、宿主細胞に侵入するための最初の段階で膜融合に依存する、エンベロープに包まれたプラス鎖ＲＮＡウイルスである。更に、多くのコロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の表面は、スパイク糖タンパク質が施されている。スパイクタンパク質は、２つの別個のサブユニットＳ１及びＳ２を有すると機能的に分類され得る３つの同一のスパイクタンパク質単量体のホモ三量体複合体を形成する。Ｓ１サブユニットは、ヒト細胞上のＡＣＥ２受容体に結合する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含有し、一方Ｓ２サブユニットは、ウイルスと細胞膜との融合に関与する。三量体複合体のＲＢＤは、２つの異なる配置：ＡＣＥ２複合体への結合に対してアクセス可能である、図４に表示される、伸長型、若しくは「アップ」配置（本明細書では「オン」配置と呼ばれることもある）、及び受容体にアクセス不能な状態を表す、これもまた図４に表示される、「ダウン」若しくは「オフ」配置にあり得る。即ち、スパイクタンパク質は、「ダウン」配置にあるとき、ＡＣＥ２受容体に結合することができず、細胞に感染できない。
本発明は、スパイクタンパク質に結合するだけではなく、スパイクタンパク質を「オフ」若しくは「ダウン」位置に「ロック」するような方法で、非常に高い親和性で結合する抗原結合ドメインを目的とする。図５に示されるように、本発明のＭＡＳＣタンパク質の結合は、実際には、２つの異なるＲＢＤ（三量体中に存在する３つのうちの）に結合し、従って、スパイクタンパク質を「オフ」に保持するだけではなく、ＡＣＥ２結合部位の一部も占有し、膜融合及び感染を更に防止する。
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスの三量体スパイクタンパク質に非常に高い親和性で多価的に結合する、抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）への多価抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（「ＭＡＳＣ」）融合タンパク質を提供する。抗原結合ドメインは、従来の抗体の典型的な可変重鎖及び可変軽鎖ドメインに代えて、単一可変重鎖ドメイン（本分野では「ＶＨＨ」ドメインと頻繁に呼ばれる）を含有する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に基づいている。単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）は、以下に更に論議されるように、それらが従来のＡＢＤよりもはるかに小さく、一般に高い熱安定性、及び増加した溶解度を有するために、ウイルスタンパク質へ結合するためのそれらの使用において多数の利点を供与する。
更に、他のｓｄＡＢＤについて示されているように、本発明のｓｄＡＢＤは、他の「ナノボディ（Nanobodies）（商標）」と同様に、二量体及び三量体などの多量体構造に集合し得る。一般には、米国特許第９，８３４，５９５号を参照されたい。従って、本発明は、以下により詳細に説明されているように、ドメインリンカーを通して互いに結合されたｓｄＡＢＤを含有し、以下に更に論議されるように、スパイクタンパク質に結合し、ＡＣＥ２受容体を介するヒト細胞へのウイルス侵入を防止する、多価抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（「ＭＡＳＣ」）融合タンパク質を提供する。
これらの多価の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、形式に依存する様々な方法で互いに結合している、本明細書では一般にドメインと称される、いくつかの異なる成分を有する。ドメインのいくつかは、各々が標的スパイクタンパク質に結合する結合ドメインであり、いくつかはドメインリンカーである。従って、一般に、図６に表示されるように、本発明は、ＲＢＤに結合する単一ｓｄＡＢＤを含むＭＡＳＣタンパク質、並びにドメインリンカーを使用して結合された２つのｓｄＡＢＤを含有する（ｓｄＡＢＤ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ）ＭＡＳＣ融合タンパク質及びドメインリンカーを用いて結合された３つのｓｄＡＢＤを含有する（ｓｄＡＢＤ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ－ドメインリンカー－ｓｄＡＢＤ）ＭＡＳＣ融合タンパク質を提供する。以下で論議されるように、これらのドメインリンカーは同じであっても異なっていてもよい。
本発明のＭＡＳＣ融合タンパク質の別の明確な利点は、それらの顕著な熱及び構造安定性のために、ＭＡＳＣ融合タンパク質が、結合並びに中和機能を保持しながら、凍結乾燥及び／又はエアロゾル化することができることである。これらのＭＡＳＣ融合タンパク質を肺系統に直接投与する可能性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスの場合、それが肺に特異的に作用することが知られているために、特に有用である。
従って、本発明は、本明細書に更に説明されるように、ＭＡＳＣタンパク質及びＭＡＳＣ融合タンパク質を提供する。
Ｃ．多価抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（「ＭＡＳＣ」）タンパク質
従って、本発明は、いくつかの異なる形式を取ることができるＭＡＳＣタンパク質を提供する。本明細書で論議されるように、ＭＡＳＣタンパク質は、本明細書で「単量体ＭＡＳＣタンパク質」と称されることもある、本明細書で概説される単一ｓｄＡＢＤであり得る。ＭＡＳＣタンパク質はまた、本明細書に論議されるように、互いに結合して、二量体及び三量体を形成することができる。これらの実施形態では、二量体及び三量体は、一般に、「ＭＡＳＣ融合タンパク質」と称され、単量体の間にドメインリンカーが存在する。
当業者に理解されるように、また以下により詳細に説明されるように、単一ｓｄＡＢＤの多量体に加えて、異なる結合親和性又は特性を有するｓｄＡＢＤを使用して多量体を作製することもできる。即ち、二量体ＭＡＳＣ融合タンパク質は、ｓｄＡＢＤが同一のＣＤＲ及び／又は配列を有する場合の「ホモ二量体」であり得るか、又は一方のｓｄＡＢＤがＣＤＲの１つのセットを有し、他方がＣＤＲの異なるセットを有する場合の「ヘテロ二量体」であり得る。同様に、三量体ＭＡＳＣ融合タンパク質は、ホモ三量体であり得るか、又はそれらは、異なるＣＤＲを有する２つの異なるｓｄＡＢＤ（三量体中に一方を２つと他方を１つ）を利用するヘテロ三量体、若しくは３つの異なるＣＤＲセットを有するヘテロ三量体であり得る。
更に、以下により詳細に論議されるように、ＭＡＳＣ融合タンパク質はまた、ＭＡＳＣタンパク質の血漿中の半減期を延長させるように機能する追加のドメインを含み得る。従って、例えば、単量体、二量体又は三量体のＭＡＳＣタンパク質は、半減期延長ドメインに融合され得る。
本明細書で論議されるように、図１３に表示される多種多様な抗原結合ドメインを表す２１個の異なるクローンを、最初に作製した。これらのクローンの全ては、スパイク三量体に結合した。
更に、本明細書で論議されるように、図１３に示された親ＭＡＳＣタンパク質のいずれも、親和性成熟を受けることができる。例示的な例は、本明細書で論議されるＡｅｒｏＮａｂ６の親和性成熟である。親和性成熟キャンペーンは、その全て組み合わされ得る、ｖｈｈＣＤＲにおける多数の変化をもたらした。
同様に、当業者に理解されるように、図１３の親ＭＡＳＣタンパク質、又は親和性成熟されたＭＡＳＣタンパク質はまた、ヒト化され得る。ヒト化の手法は、当該技術分野において周知である。
以下に更に論議されるように、ＡｅｒｏＮａｂ６ ＭＡＳＣは、残基４４６、４４７、４４９、４５３、４５５、４５６、４８３～４８６、４８９～４９０、４９３～４９６、４９８、５０１、及び５０５）を含むＳＣ２スパイクＲＢＤのＡＣＥ２結合領域内で広範な接触を行う。ＡｅｒｏＮａｂ６ ＭＡＳＣのＣＤＲ３は、残基３４２、３４３、３６７、３７１～３７５、４０４、４３６～４４１によって画定される三次元エピトープにおいてＳＣ２スパイク上の隣接するＲＢＤと接触する。このさらなる接触により、ＡｅｒｏＮａｂ６ ＭＡＳＣは、隣接するＲＢＤを「オフ」位置にロックしながら、同時に隣接ＲＢＤでのＡＣＥ２結合を破壊することができる。
更に、ある種のＡＢＤのＣ末端配列に由来する免疫原性がヒトにおいて存在し得ることが当該技術分野において既知である。従って、一般に、構築物のＣ末端がここに記載するようなｓｄＡＢＤで終端する場合、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６又はＨｉｓ１０のいずれか）を使用することができる。場合によっては、これらは、精製タグとしても使用することができるが、これらの配列は、Holland et al., DOI 10.1007/s10875-013-9915-0及び国際公開第２０１３／０２４０５９号に示されるように、ヒトにおける免疫原性を低減させるためにも使用することができる。
１．単量体構築物
いくつかの実施形態では、ＭＡＳＣタンパク質は、図６に一般的に表示されるように、単一のｓｄＡＢＤであり、従って、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ＦＲを含むｓｄＡＢＤを含む組成物であり、このｖｈｈＣＤＲ１、ｖｈｈＣＤＲ２、及びｖｈｈＣＤＲ３は、図１３、図１５、図１８及び図２５に表示されるセットから選択される。
いくつかの単量体の実施形態では、上述したように、前記ｖｈＣＤＲ１は、配列ＧＩ（Ｉ／Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｌ）ＦＧＲＮＡを有し、前記ｖｈＣＤＲ２は、配列ＴＲＲ（Ｇ／Ｈ／Ｙ／Ｇ／Ｑ）ＳＩＴＹを有し、前記ｖｈＣＤＲ３は、配列ＡＡＤＰＡ（Ｓ／Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ｔ）ＰＡ（Ｐ／Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｖ）ＧＤＹを有する。更に、この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号５を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号８を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１０を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号１１を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号１２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１３を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号１４を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号１５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１６を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号１７を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号１８を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１９を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号２０を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号２１を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２２を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号２３を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号２４を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２５を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号２６を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号２７を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２８を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号２９を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号３０を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３１を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号３２を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号３３を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３４を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号３５を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号３６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３７を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号３８を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号３９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４０を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号４１を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号４２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４３を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号４４を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号４５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４６を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号４７を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号４８を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４９を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号５０を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号５１を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５２を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号５３を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号５４を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５５を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号５６を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号５７を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５８を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号５９を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号６０を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６１を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号６２を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号６３を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６４を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号６５を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号６６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６７を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号６８を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号６９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７０を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号７１を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号７２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７３を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｄＡＢＤは、ｖｈＣＤＲ１が配列番号７４を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号７５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７６を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有し得るか、又は異なり得る。
特に有用な実施形態では、ＭＡＳＣタンパク質は、「ＡｅｒｏＮａｂ６ｍｈ」であり、下記配列を有する。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS
２．二量体構築物
いくつかの実施形態では、ＭＡＳＣタンパク質は、ＭＡＳＣ融合タンパク質であり、図６に一般的に表示されるように、２つのｓｄＡＢＤを含有し、従って、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＦＲ１－ｖｈｈＣＤＲ１－ＦＲ２－ｖｈｈＣＤＲ２－ＦＲ３－ｖｈｈＣＤＲ３－ＦＲ４－ドメインリンカー－ＦＲ１－ｖｈｈＣＤＲ１－ＦＲ２－ｖｈｈＣＤＲ２－ＦＲ３－ｖｈｈＣＤＲ３－ＦＲ４を含むｓｄＡＢＤを含む組成物であり、このｖｈｈＣＤＲ１、ｖｈｈＣＤＲ２、及びｖｈｈＣＤＲ３は、図１３、図１５、図１８及び図２５に表示されるセットから選択される。
多くの実施形態では、二量体を構成する２つのｓｄＡＢＤは同じであり、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
従って、いくつかの二量体の実施形態では、上述されるように、前記ｖｈＣＤＲ１は、配列ＧＩ（Ｉ／Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｌ）ＦＧＲＮＡを有し、前記ｖｈＣＤＲ２は、配列ＴＲＲ（Ｇ／Ｈ／Ｙ／Ｇ／Ｑ）ＳＩＴＹを有し、前記ｖｈＣＤＲ３は、配列ＡＡＤＰＡ（Ｓ／Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ｔ）ＰＡ（Ｐ／Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｖ）ＧＤＹを有する。更に、この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは（ＧＧＧＧＳ）３である。
従って、いくつかの二量体の実施形態では、上述されるように、前記ｖｈＣＤＲ１は、配列ＧＩ（Ｉ／Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｌ）ＦＧＲＮＡを有し、前記ｖｈＣＤＲ２は、配列ＴＲＲ（Ｇ／Ｈ／Ｙ／Ｇ／Ｑ）ＳＩＴＹを有し、前記ｖｈＣＤＲ３は、配列ＡＡＤＰＡ（Ｓ／Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ｔ）ＰＡ（Ｐ／Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｖ）ＧＤＹを有する。更に、この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは（ＧＧＧＧＳ）４である。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号５を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号８を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１０を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号１１を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号１２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１３を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号１４を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号１５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１６を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号１７を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号１８を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１９を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号２０を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号２１を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２２を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号２３を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号２４を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２５を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号２６を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号２７を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２８を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号２９を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号３０を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３１を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号３２を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号３３を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３４を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号３５を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号３６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３７を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号３８を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号３９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４０を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号４１を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号４２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４３を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号４４を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号４５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４６を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号４７を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号４８を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４９を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号５０を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号５１を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５２を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号５３を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号５４を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５５を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号５６を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号５７を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５８を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号５９を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号６０を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６１を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号６２を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号６３を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６４を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号６５を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号６６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６７を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号６８を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号６９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７０を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号７１を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号７２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７３を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの二量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号７４を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号７５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７６を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
特に有用な実施形態では、ＭＡＳＣタンパク質は、「ＡｅｒｏＮａｂ６ｍｈＸ２」であり、下記配列を有する。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS/GGGGSGGGGSGGGGS/EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS
特に有用な実施形態では、ＭＡＳＣタンパク質は、「ＡｅｒｏＮａｂ６ｍｈＸ２」であり、下記配列を有する。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS/GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS/EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS
いくつかの実施形態では、二量体を構成する２つのｓｄＡＢＤは異なる。例えば、一実施形態では、ｓｄＡＢＤの一方は「ＡｅｒｏＮａｂ６ｍｈ」であり、他方は、ＮｂＣｏＶ００３のＣＤＲ、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３を有する。図２６を参照されたい。
３．三量体構築物
いくつかの実施形態では、ＭＡＳＣタンパク質は、ＭＡＳＣ融合タンパク質であり、図６に一般的に表示されるように、３つのｓｄＡＢＤを含有し、従って、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＦＲ１－ｖｈｈＣＤＲ１－ＦＲ２－ｖｈｈＣＤＲ２－ＦＲ３－ｖｈｈＣＤＲ３－ＦＲ４－ドメインリンカー－ＦＲ１－ｖｈｈＣＤＲ１－ＦＲ２－ｖｈｈＣＤＲ２－ＦＲ３－ｖｈｈＣＤＲ３－ＦＲ４を含むｓｄＡＢＤを含む組成物であり、このｖｈｈＣＤＲ１、ｖｈｈＣＤＲ２、及びｖｈｈＣＤＲ３は、図１３、図１５、図１８及び図２５に表示されるセットから選択される。
多くの実施形態では、三量体を構成する３つのｓｄＡＢＤは同じであり、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
従って、いくつかの三量体の実施形態では、上述されるように、前記ｖｈＣＤＲ１は、配列ＧＩ（Ｉ／Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｌ）ＦＧＲＮＡを有し、前記ｖｈＣＤＲ２は、配列ＴＲＲ（Ｇ／Ｈ／Ｙ／Ｇ／Ｑ）ＳＩＴＹを有し、前記ｖｈＣＤＲ３は、配列ＡＡＤＰＡ（Ｓ／Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ｔ）ＰＡ（Ｐ／Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｖ）ＧＤＹを有する。更に、この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは（ＧＧＧＧＳ）３である。
従って、いくつかの三量体の実施形態では、上述されるように、前記ｖｈＣＤＲ１は、配列ＧＩ（Ｉ／Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｌ）ＦＧＲＮＡを有し、前記ｖｈＣＤＲ２は、配列ＴＲＲ（Ｇ／Ｈ／Ｙ／Ｇ／Ｑ）ＳＩＴＹを有し、前記ｖｈＣＤＲ３は、配列ＡＡＤＰＡ（Ｓ／Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ｔ）ＰＡ（Ｐ／Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｖ）ＧＤＹを有する。更に、この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは（ＧＧＧＧＳ）４である。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号５を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号８を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１０を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号１１を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号１２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１３を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号１４を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号１５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１６を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号１７を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号１８を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１９を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号２０を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号２１を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２２を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号２３を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号２４を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２５を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号２６を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号２７を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２８を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号２９を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号３０を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３１を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号３２を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号３３を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３４を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号３５を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号３６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３７を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号３８を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号３９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４０を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号４１を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号４２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４３を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号４４を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号４５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４６を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号４７を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号４８を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４９を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号５０を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号５１を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５２を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号５３を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号５４を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５５を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号５６を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号５７を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５８を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号５９を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号６０を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６１を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号６２を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号６３を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６４を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号６５を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号６６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６７を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号６８を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号６９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７０を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号７１を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号７２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７３を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
いくつかの三量体の実施形態では、２つのｓｄＡＢＤは、各々、ｖｈＣＤＲ１が配列番号７４を有し、ｖｈＣＤＲ２が配列番号７５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７６を有する３つのＣＤＲのセットを有する。この実施形態では、フレームワーク領域は、配列番号１（ＦＲ１）、配列番号２（ＦＲ２）、配列番号３（ＦＲ３）及び配列番号４（ＦＲ４）を有することができ、ドメインリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４から選択される。
特に有用な実施形態では、ＭＡＳＣタンパク質は、「ＡｅｒｏＮａｂ６ｍｈＸ３」であり、下記配列を有する。
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特に有用な実施形態では、ＭＡＳＣタンパク質は、「ＡｅｒｏＮａｂ６ｍｈＸ３」であり、下記配列を有する。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS/GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS/EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS/GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS/EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS
いくつかの実施形態では、二量体を構成する２つのｓｄＡＢＤは異なる。例えば、一実施形態では、ｓｄＡＢＤの一方は「ＡｅｒｏＮａｂ６ｍｈ」であり、他方は、ＮｂＣｏＶ００３のＣＤＲ、配列番号２１、配列番号２２及び配列番号２３を有する。
４．ドメインリンカー
多量体ＭＡＳＣタンパク質を利用する実施形態では、単量体は、「ドメインリンカー」を使用して組換え的に連結されている。任意の好適なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン－セリンポリマー（式中、ｎは、少なくとも１の整数である（一般に、３～４～５である））並びに各ドメインがその生物学的機能を保持することを可能にするのに十分な長さ及び可動性を備えた２つのドメインの組換え連結を可能にする任意のペプチド配列を利用する。図４に示されるように、スパイクＥＣＤに「ダウン」状態で結合した個々のＡｅｒｏＮａｂ６単量体のＮ末端とＣ末端との間の距離は、５１Åである。個々のサブユニットを架橋して、複数のＲＢＤ単量体に同時にエンゲージするために、これは≧１５個のアミノ酸を必要とする。従って、（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４が特に好ましい。図２３に示されるように、三量体構築物中の両方の（ＧＧＧＧＳ）３及び（ＧＧＧＧＳ）４リンカーは、ＳＰＲによって測定されるとき、両方ともスパイクタンパク質三量体への良好な結合を示す。
５．半減期延長ドメイン
ＭＡＳＣタンパク質は、任意選択で、血漿及び肺組織などの生理的環境において半減期の増加を可能にする半減期延長ドメインを含む。そのようなドメインとしては、限定されないが、ｓｃＦｖ又はｓｄＡＢＤのいずれかのＨＳＡ結合ドメイン、並びに以下に論議されるように、ヒト血清アルブミンの全て又は一部が挙げられることが意図される。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（分子量約６７ｋＤａ）は、血漿中の最も豊富なタンパク質であり、約５０ｍｇ／ｍｌ（６００ｕＭ）で存在し、ヒトで２０日程の半減期を有する。ＨＳＡは、血漿ｐＨを維持するように作用し、膠質血圧（colloidal blood pressure）に寄与し、多くの代謝産物及び脂肪酸のキャリアとして機能し、血漿中の主な薬物輸送タンパク質として作用する。
アルブミンとの非共有結合的な会合は、短命のタンパク質の消失半減期を延ばす。例えば、アルブミン結合ドメインのＦａｂフラグメントへの組換え融合は、Ｆａｂフラグメント単独の投与と比較して、マウス及びウサギにそれぞれ静脈内投与されたとき、２５倍及び５８倍のインビボクリアランスの減少並びに２６倍及び３７倍の半減期の延長をもたらした。別の例では、インスリンを脂肪酸でアシル化し、アルブミンとの会合を促進させると、ウサギ又はブタでの皮下注射の際に持続効果が観察された。まとめると、これらの研究は、アルブミン結合と作用の延長の関連を実証している。
一態様では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、半減期延長ドメイン、例えば、ＭＡＳＣタンパク質に対してＮ末端若しくはＣ末端のいずれかに連結している、ＨＳＡに特異的に結合するドメインを含む。多くの実施形態では、半減期延長ドメインは、ＨＳＡに結合する単一ドメイン抗体に由来する単一ドメイン抗原結合ドメインである。このドメインは、スパイクタンパク質に対するｓｄＡＢＤからこれらの結合ドメインを区別するために、一般に、ヒトＨＳＡへの「ｓｄＡＢＤ」（ｓｄＡＢＤ－ＨＳＡ）、或いは、「ｓｄＡＢＤ（１／２）」と本明細書で称される。好適なｓｄＡＢＤ－ＨＳＡドメインは、当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第８，７０３，１３１号を参照されたい（その中の全てのｓｄＡＢＤ－ＨＳＡドメインの配列（具体的には、ＡＬＢ１、ＡＬＢ３、ＡＬＢ４、ＡＬＢ５、ＡＬＢ６、ＡＬＢ７、ＡＬＢ８、ＡＬＢ９及びＡＬＢ１０を含む「ＡＬＢ」）は、参照により明示的に組み込まれる）。同様に、米国特許第１０，１００，１０６号は、追加の単一ドメインアルブミン結合ドメインを含み、配列番号４、７、９、２６及び２７を含む、その配列もまた、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
ＭＡＳＣタンパク質に融合され得る別の好適な半減期ドメインは、ヒトＨＳＡそれ自体の全て又は一部であり、ここでもＮ末端若しくはＣ末端である。ＨＳＡは、ほぼ６５個のアミノ酸の長さの比較的小さなタンパク質であり、当業者に理解されるように、１つ以上の単量体ＭＡＳＣタンパク質に融合することができる。
抗原結合タンパク質の半減期延長ドメインは、ＭＡＳＣタンパク質の薬力学及び薬物動態の変更をもたらす。上記のように、半減期延長ドメインは、消失半減期を延ばす。半減期延長ドメインはまた、抗原結合タンパク質の組織分布、透過、及び拡散の変更を含め、薬力学的特性を変更する。
Ｄ．ＭＡＳＣタンパク質の作製の方法
本発明のＭＡＳＣタンパク質及び融合タンパク質は、当業者に一般に理解されているように作製されるが、それについて以下に概説する。
本発明は、本発明のＭＡＳＣ組成物をコードする核酸組成物を提供する。当技術分野で公知であるように、発明の組成物をコードする核酸は、本発明のＭＡＳＣタンパク質を産生させるために使用される宿主細胞に応じた、当技術分野で公知であるような発現ベクターに組み込むことができる。一般に、核酸は、任意の数の調節エレメント（プロモーター、複製起点、選択マーカー、リボソーム結合部位、誘導因子など）に作動可能に連結されている。発現ベクターは、染色体外ベクター又は組込みベクターであり得る。
次いで、本発明の核酸及び／又は発現ベクターを、多くの実施形態において有用な、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び／又は真菌細胞を、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、２９３細胞）とともに含む、当技術分野で周知の任意の数の様々な種類の宿主細胞に導入して形質転換させる。
本発明の、ＭＡＳＣ融合タンパク質を含むＭＡＳＣタンパク質は、当技術分野で周知の発現ベクターを含む宿主細胞を、タンパク質の発現をもたらす条件下で培養して、その後に精製することによって作製される。
Ｅ．製剤
本発明に従って使用されるＭＡＳＣタンパク質の製剤は、所望の純度を有するタンパク質を、適宜、薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980] に概説されている通り）と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形で、貯蔵用に調製される。
Ｆ．ＭＡＳＣタンパク質の投与
患者におけるＳＣ２ウイルス又はＳＣ２ウイルス感染を予防する、処置する、又は中和するために患者に投与される、ＭＡＳＣタンパク質及びＭＡＳＣ融合タンパク質を含む本発明の組成物。最近報告されたように、ヒトで最もＡＣＥ２の発現が高度なのは鼻内であり、下気道全体では発現が低下していると思われるが、これは、近位の鼻孔では高度で、遠位部、例えば末梢の肺では低くなるというＳＣ２感染の勾配に対応しており（Hou et al, https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.042を参照）、鼻の表面が主要な初期感染部位であるという初期の仮説を裏付ける。感染はその後、肺へと進行する。
従って、当技術分野で理解されているように、本発明のＭＡＳＣタンパク質を投与するためにはいくつかの異なる投与経路を利用することができ、これには、本明細書で概説するように、吸入手法を使用する肺デリバリー、特定の製剤を使用する鼻腔内デリバリー、及び静脈内投与が含まれるが、これらに限定されない。
１．吸入療法
従って、一部の実施形態では、ＭＡＳＣタンパク質は、肺を含む患者の肺呼吸系に投与される。従って、本発明は、本発明のＭＡＳＣタンパク質（ＭＡＳＣ融合タンパク質を含む）の気道へのデリバリーを提供する。
本発明のＭＡＳＣタンパク質の１つの利点は、極めて安定であり、それ故に当技術分野で公知であるように凍結乾燥させることが可能なことである。凍結乾燥されたタンパク質は、後日、液体製剤に復元することができ、次いで、ネブライゼーションによってエアロゾル化して、患者の肺呼吸系に直接デリバリーすることが可能である。例えば、吸入療法用のナノボディ（商標）に関して、いくつかの凍結乾燥手法、条件及び製剤を記載している、米国特許第９，３９３，３０４号を参照されたい。
ある特定の実施形態では、製剤を、ネブライザーを使用して投与することができる。ネブライザーの例には、非限定的な例として、ジェットネブライザー、超音波ネブライザー、振動メッシュネブライザーが挙げられる。これらのクラスでは、液体からエアロゾルを生み出すために異なる方法を使用する。一般に、これらの製剤においてタンパク質の完全性を維持することができる任意のエアロゾル発生デバイスが、本明細書に記載される製剤のデリバリーのために好適である。
一部の実施形態では、振動メッシュネブライザーが使用される。振動メッシュネブライザーは、受動的振動メッシュデバイスと能動的振動メッシュデバイスとに分けられる（Newman 2005, J. Appl. Ther. Res. 5: 29-33）。受動的振動メッシュデバイス（例えば、オムロン マイクロエア（登録商標）ＮＥ－Ｕ２２ネブライザー）は、最大６０００ミクロンサイズの穴を有する穴開きプレートを採用している。トランスデューサーのホーン部に取り付けられた振動性の圧電結晶が、その前に配置された穴開きプレートに「受動的な」振動を誘発し、その結果、穴から流体が押し出されてエアロゾルが発生する。能動的振動メッシュデバイス（例えば、ＡＥＲＯＮＥＢ（登録商標）、Ｐｒｏネブライザー）は、最大１０００個のドーム型の開口部を有するプレート、並びに電流の印加によって収縮及び拡張する振動素子からなるエアロゾル発生器を含む「マイクロポンプ」システムを採用することができる。これにより、メッシュの数マイクロメートルの上下運動がもたらされ、流体が押し出されてエアロゾルが生成される。振動メッシュネブライザーの他の例としては、Akita2 Apixneb（Activaero、現在はVectura、ドイツ）、EFLOW（登録商標）（PARI GmbH（Grafelingen、ドイツ）；米国特許第５，５８６，５５０号も参照されたい）、AERONEB（登録商標）（Aerogen,Inc.、Sunnyvale, Calif.；米国特許第５，５８６，５５０号；同第５，９３８，１１７号；同第６，０１４，９７０号；同第６，０８５，７４０号；同第６，２０５，９９９号も参照されたい）、又はＦＯＸネブライザー（Activaero、現在はVectura、ドイツ）が挙げられ、いずれも小児用に適合化されている。
一部の実施形態では、特にＣＯＶＩＤ１９患者が酸素も必要とする可能性がある場合に、連続流ネブライザーが使用され、連続流を使用して患者への継続的な酸素又は空気の供給を維持することができる。従って、ネブライザーは、追加の空気又はＯ２流の有無にかかわらず使用することができる。好ましくは、ネブライザーは、追加の空気又はＯ２の流れ、例えば、２Ｌ／分の追加空気又はＯ２の流れとともに使用される。
本発明のポリペプチドを患者にデリバリーするための例示的な吸入デバイスは、（ａ）振動可能なメッシュを有するエアロゾル発生器；（ｂ）ネブライジングされる液体のためのリザーバーであって、前記リザーバーが振動可能なメッシュと流体接続しているリザーバー；（ｃ）ガス入口開口部；（ｄ）フェイスマスクであって、ケーシング、エアロゾル入口開口部、患者インターフェース、及び呼気抵抗が０．５から５ｍｂａｒの範囲で選択されるケーシング内の一方向呼気弁又は二方向吸入／呼気弁を有するフェイスマスク；（ｅ）ガス入口開口部からフェイスマスクのエアロゾル入口開口部まで延びる流路であって、エアロゾル発生器が少なくとも部分的に流路に挿入される横方向の開口部を有する流路を有し、１から２０Ｌ／分の流量でガス入口開口部とフェイスマスクのエアロゾル入口開口部の間に一定の流動抵抗を有する流路、を含み得る。
気道へのデリバリー及び／又は吸入によるデリバリーのためのさらなる方法は、当業者には公知であり、例えば、手引き書"Drug Delivery: Principles and Applications" (2005) by Binghe Wang, Teruna Siahaan and Richard Soltero (Eds. Wiley Interscience (John Wiley & Sons)); in "Pharmacology PreTest.TM. (11.sup.th Ed.) Self-Assessment and Review" by Rosenfeld G. C., Loose-Mitchell D. S.;及び"Pharmacology" (3.sup.rd Edition) by Lippincott Williams & Wilkins, New York; Shlafer M. McGraw-Hill Medical Publishing Division, New York; Yang K. Y., Graff L. R., Caughey A. B. Blueprints Pharmacology, Blackwell Publishing.に記載されている。
本発明はまた、本発明のＭＡＳＣタンパク質の吸入によるデリバリーに好適であり、かつ、それを含む組成物の使用に好適である医薬品デバイスにも関する。従って、本発明は、本発明のＭＡＳＣタンパク質を選択された用量で含むそのようなデバイスにも関する。
様々な吸入システムは、例えば、総説（"Pulmonary Drug Delivery", Bechtold-Peters and Luessen, eds., 上記）の１２９ページから１４８ページに記載されている。本発明の方法において、デバイスは、本発明のポリペプチドを含む液体（例えば、微細な固体粒子又は液滴の懸濁液）用の吸入器である。好ましくは、このデバイスは、本発明のポリペプチドを含むエアロゾルデリバリーシステム又はネブライザーである。
本発明の方法に使用されるエアロゾルデリバリーシステムは、本発明の組成物を含む容器、及びそれに接続されたエアロゾル発生器を含み得る。エアロゾル発生器は、本発明の組成物のエアロゾルを発生するように構成及び配置される。
２．鼻腔内投与
以上に考察したように、高度のＡＣＥ２発現パターンから立証されるように、鼻腔及び鼻腔表面はＳＣ２ウイルス感染の主要な初期部位と考えられるように思われる。
従って、一部の実施形態では、ＭＡＳＣ融合タンパク質を含むＭＡＳＣタンパク質が、点鼻薬として鼻腔投与を介して投与される。ＭＡＳＣタンパク質の鼻腔内投与のためのデリバリーシステムは、単純な液滴又は噴霧から液体の単位投与システムまで、多種多様である。例えば、Marx et al., Intranasal Drug Administration-An Attractive Delivery Route for Some Drugs; DOI: 10.5772/59468を参照。上記のように、ＭＡＳＣタンパク質は、凍結乾燥させた上で鼻腔投与のために復元することも、又は凍結乾燥された液体として直接投与することもできる。
３．静脈内投与
さらに、当業者には理解されるであろうが、本発明のＭＡＳＣタンパク質を静脈内投与することもできる。
Ｇ．ＳＣウイルス感染症の診断方法
一部の実施形態では、本明細書に記載される１つ又は複数のＭＡＳＣタンパク質を使用して、生物試料又は非生物試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出することができる。例えば、ＭＡＳＣタンパク質試薬は、当業者に公知のいくつかのイムノアッセイのいずれかを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の有無又はタンパク質発現レベルを検出するためのアッセイに使用することができる。イムノアッセイの手法及びプロトコールは、Price and Newman, "Principles and Practice of Immunoassay," 2nd Edition, Grove's Dictionaries, 1997; and Gosling, “Immunoassays: A Practical Approach,”Oxford University Press, 2000に一般的に記載されている。競合イムノアッセイ及び非競合的イムノアッセイを含む、種々のイムノアッセイ手法を使用することができる。例えば、Self et al., Curr. Opin. Biotechnol., 7:60-65 (1996)を参照。イムノアッセイという用語は、酵素イムノアッセイ法（ＥＩＡ）、例えば、競合的酵素イムノアッセイ法（ＥＭＩＴ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡ（ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ）、及び微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）；キャピラリー電気泳動イムノアッセイ（ＣＥＩＡ）；ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；免疫放射アッセイ（ＩＲＭＡ）；蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）；及び化学発光アッセイ（ＣＬ）を含む手法を範囲に含むが、これらに限定されない。必要に応じて、そのようなイムノアッセイを自動化することができる。イムノアッセイを、レーザー誘導蛍光と組み合わせて使用することもできる。例えば、Schmalzing et al., Electrophoresis, 18:2184-93 (1997); Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci., 699:463-80 (1997)を参照。リポソームイムノアッセイ、例えば、フローインジェクションリポソームイムノアッセイ及びリポソームイムノセンサーも、本発明における使用に好適である。例えば、Rongen et al., J. Immunol. Methods, 204:105-133 (1997)を参照。加えて、タンパク質／抗体複合体の形成が、タンパク質濃度の関数としてピーク速度シグナルに変換される光散乱の増加をもたらす比濁アッセイも、本発明の方法における使用に好適である。比濁アッセイは、Beckman Coulter（Brea, CA; Kit #449430）から市販されており、Behring Nephelometer Analyzer（Fink et al., J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 27:261-276 (1989)）を使用して行うことができる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対するＭＡＳＣタンパク質の特異的な免疫学的結合は、直接的又は間接的に検出することができる。直接標識には、抗体に結合させた蛍光性又は発光性のタグ、金属、色素、放射性核種などが含まれる。ヨウ素１２５（１２５Ｉ）で標識されたＭＡＳＣタンパク質を使用することができる。核酸に特異的な化学発光抗体を使用する化学発光アッセイは、タンパク質レベルの高感度な非放射性検出に好適である。蛍光色素で標識されたＭＡＳＣタンパク質も好適である。蛍光色素の例としては、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、Ｒ－フィコシアニン、Ｂ－フィコエリトリン、Ｒ－フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、リサミンが挙げられるが、これらに限定されない。間接標識としては、当技術分野で周知の様々な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼなどが挙げられる。西洋ワサビペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、４５０ｎｍで検出可能な過酸化水素の存在下で可溶性生成物を生じる発色基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともに使用することができる。アルカリホスファターゼ検出システムは、例えば、４０５ｎｍで容易に検出可能な可溶性生成物を生じる発色基質ｐ－ニトロフェニルリン酸とともに使用することができる。同様に、β－ガラクトシダーゼ検出システムは、４１０ｎｍで検出可能な可溶性生成物を生じる、発色基質ｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）とともに使用することができる。ウレアーゼ検出システムは、尿素－ブロモクレゾールパープル（Ｓｉｇｍａ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ； Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）などの基質とともに使用することができる。
直接標識又は間接標識からのシグナルは、例えば、発色基質からの色を検出するための分光光度計；放射線を検出する放射線測定器、例えば、１２５Ｉ検出用のガンマ線計数器；又は、特定の波長の光の存在下で蛍光を検出する蛍光計を使用して分析することができる。酵素結合抗体の検出のためには、分光光度計、例えば、ＥＭＡＸマイクロプレートリーダー（Molecular Devices; Menlo Park, CA）を製造元の指示に従って使用して、定量分析を行うことができる。必要に応じて、本発明のアッセイを自動化すること、又はロボットで実行することができ、複数の試料からのシグナルを同時に検出することができる。
ＭＡＳＣタンパク質を、種々の固体支持体、例えば、磁気又はクロマトグラフィーマトリックス粒子、アッセイプレート（例えば、マイクロタイターウェル）の表面、固体基質材料又は膜（例えば、プラスチック、ナイロン、紙）の小片に、スティック、スポンジ、紙、ウェルなどの物理的な形態で固定化することができる。アッセイストリップは、固体支持体上のアレイに抗体又は複数の抗体をコーティングすることによって調製することができる。次いで、このストリップを試験試料に浸して、洗浄及び検出段階を経て迅速に処理して、測定可能なシグナル、例えば、着色スポットを生成することができる。
Ｈ．抗原結合ドメインのスクリーニング方法
また、本ＭＡＳＣタンパク質と結合に関して競合する他のＡＢＤをスクリーニングする方法も、本明細書において提供される。ＡＢＤに関して本明細書で使用される「競合する」という用語は、第１のＡＢＤ又はその抗原結合部分が、第２のＡＢＤ又はその抗原結合部分と結合に関して競合することを意味し、第１のＡＢＤとそのコグネイトエピトープとの結合は、ＡＢＤ抗体の非存在下での第１のＡＢＤの結合と比較して、第２のＡＢＤの存在下では検出可能に減少する。第２のＡＢＤのエピトープへの結合が第１のＡＢＤの存在下で検出可能に減少するという代替的な場合もあり得るが、そうである必要はない。即ち、その第２のＡＢＤが第１のＡＢＤのそれぞれのエピトープへの結合を阻害しなくても、第１のＡＢＤは、第２のＡＢＤのそのエピトープへの結合を阻害することができる。しかし、各ＡＢＤが他方のＡＢＤのそのコグネイトエピトープ又はリガンドとの結合を検出可能に阻害する場合には、その程度が同じか、大きいか、又は小さいかにかかわらず、これらのＡＢＤはそれぞれのエピトープの結合に関して互いに「交差競合」すると言われる。競合性ＡＢＤ及び交差競合性ＡＢＤは両方とも、本発明の範囲に含まれる。そのような競合又は交差競合が発生する機序（例えば、立体障害、コンフォメーション変化、共通エピトープ又はその一部への結合など）に拘わらず、当業者は、本明細書に提供される教示に基づいて、そのような競合性及び／又は交差競合性ＡＢＤが範囲に含まれ、本明細書に開示される方法に有用であり得ることを理解するであろう。
多数の種類の競合結合アッセイが公知であり、これには例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)を参照）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)を参照）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)を参照）；Ｉ－１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988)を参照）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)）；及び直接標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)）がある。典型的には、そのようなアッセイは、固体表面又はこれらのいずれかを有するセルに結合した精製抗原、非標識試験用免疫グロブリン及び標識参照免疫グロブリンの使用を伴う。競合阻害は、試験用免疫グロブリンの存在下で固体表面又はセルに結合した標識の量を測定することによって測定される。通常、試験用免疫グロブリンが過剰に存在する。競合アッセイ（競合抗体）によって同定される抗体としては、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び参照抗体が結合したエピトープの十分近位に隣接するエピトープに結合して立体障害が発生する抗体が挙げられる。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、それは参照抗体の共通抗原への特異的結合を少なくとも５０又は７５％阻害する。
競合結合アッセイを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスへの特異的結合に関して本明細書に記載される抗体と競合する抗体を同定することができる。同一抗原に対する２つの抗体間の競合を測定するために、当技術分野で公知のいくつかの競合結合アッセイのいずれかを使用することができる。手短に述べると、異なる抗体が別の抗体の結合を阻害する能力を試験する。例えば、抗体は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗体が結合するエピトープによって区別することができる。これは、捕捉抗体を使用してウェルの表面をコーティングすることによって実施される。次いで、飽和濃度未満のタグ付き抗原を捕捉表面に添加する。このタンパク質は、特異抗体：エピトープ相互作用を通して抗体に結合する。洗浄の後、検出可能な部分（例えば、ＨＲＰ。標識された抗体は検出抗体と定義される）に共有結合性に連結された第２の抗体をＥＬＩＳＡに加える。この抗体が捕捉抗体と同じエピトープを認識した場合、その特定のエピトープはもはや結合に利用可能でなくなるため、標的タンパク質に結合することができなくなる。しかし、この第２の抗体が標的タンパク質上の異なるエピトープを認識する場合には、それは結合することができ、この結合は、妥当な基質を使用して活性のレベル（及びそれ故に結合した抗体）を定量することによって検出することができる。バックグラウンドは、単一の抗体を捕捉抗体及び検出抗体の両方として使用することによって定義され、一方、最大シグナルは、抗原特異的抗体によって捕捉し、抗原上のタグに対する抗体で検出することによって確立することができる。バックグラウンド及び最大シグナルを参照として使用することにより、抗体をペアワイズ法で評価して、エピトープ特異性を決定することができる。
上記のアッセイのいずれかを使用して、第１の抗体の存在下で、抗原に対する第２の抗体の結合が少なくとも３０％、通常は少なくとも約４０％、５０％、６０％又は７５％、多くの場合は少なくとも約９０％減少した場合、第１の抗体は第２の抗体の結合を競合的に阻害すると考えられる。
ＩＶ．実施例
１．１ 実施例１：親ＭＡＳＣタンパク質の同定及び特性決定
（ａ）酵母表面に提示されるナノボディのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイク外部ドメインへの結合
単一のナノボディクローンを表面に表示する酵母について、精製した蛍光標識ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイク外部ドメインへの結合を、フローサイトメトリーによって評価した。およそ１×１０６個の酵母を、Ａｌｅｘａ６４７で標識したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイク外部ドメイン（スパイクＥＣＤ）又は受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とともに２５℃で３０分間インキュベートした。遠心分離及び再懸濁を繰り返して酵母を十分に洗浄した後に、酵母細胞に結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイク外部ドメインの量を、フローサイトメトリーによって測定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイク外部ドメインに結合するナノボディクローンは、Ａｌｅｘａ６４７チャネルにおいて強い蛍光シグナルを示した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイク外部ドメインへの結合は、ヒトＡＣＥ２と競合するエピトープを示す１．４マイクロモル濃度の精製ＡＣＥ２－Ｆｃの存在下では減少した。
Figure 2023526274000003
（ｂ）スパイク外部ドメイン（ＥＣＤ）に対するナノボディの表面プラズモン共鳴
Ｃ末端８×ヒスチジンタグ及びＴｗｉｎ－ｓｔｒｅｐタグを有する安定化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ２外部ドメインをＥｘｐｉ２９３細胞において発現させ、金属アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製した。この抗原をＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ ＸＴを介してＣｙｔｉｖａ表面プラズモン共鳴チップ上に捕捉して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイク外部ドメインに対して生じたナノボディの速度論的性質を分析した。結果を図２２に示す。
１．２ 実施例２：親和性成熟
実施例１に記載されたクローンの１つを親和性成熟させた。元のクローンはｐＮｂＣＯＶ００６Ａであり、配列は以下の通りであった（ＣＤＲには下線を施している）：
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGIIFGRNAMGWYRQAPGKERELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADPASPAPGDYWGQGTQVTVSS
（ａ）親和性成熟の過程：
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３内の各位置の２０種のアミノ酸すべてをコードする縮重オリゴヌクレオチドにより、元のクローンの飽和突然変異誘発ライブラリーを作製した。この変異体のライブラリーを酵母の表面に提示させた。高親和性クローンの選択を、厳しい基準、即ち、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２スパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の濃度を減少させることによって進めた。２回の選択の後、図２に概説しているように、ナノボディ変異体を提示する酵母プールは、親ナノボディと比較して、スパイクＲＢＤに対してより高い親和性での結合を示した。
（ｂ）親和性成熟ライブラリーの結果：
このプールから８つの個々のクローンのシークエンシングを行ったところ、以下の位置の突然変異が親和性の改善の原因であることが示された。さらに、以下の置換の組合せにより、親クローンとの親和性の改善が得られる可能性がある。
ＣＤＲ１
元：ＧＩＩＦＧＲＮＡ
位置３への置換：Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｌ
ＣＤＲ２
元：ＴＲＲＧＳＩＴＹ
位置４への置換：Ｈ／Ｙ／Ｇ／Ｑ
ＣＤＲ３
元：ＡＡＤＰＡＳＰＡＰＧＤＹ
位置６への置換：Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ｔ
位置９への置換：Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｖ
配列収束に基づいて、１つのクローン（ｍＮｂＣＯＶ６）の活性を特別に試験した。下線は親と比較した置換を表す：
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKERELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS
Figure 2023526274000004
ｍＮｂＣＯＶ６は親クローンＮｂＣＯＶ６よりも著しく効力が高い。アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞を、親ナノボディ（ＮｂＣＯＶ６）又は親和性成熟ナノボディ（ｍＮｂＣＯＶ６）のいずれかの濃度を上昇させながら、Ａｌｅｘａ ６４７色素が蛍光コンジュゲートされた１ｎＭの精製及び安定化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイク外部ドメインとともにインキュベートした。ＮｂＣＯＶ６はスパイク外部ドメインの結合を３５９ｎＭのＥＣ５０で阻害したが、親和性成熟ナノボディ（ｍＮｂＣＯＶ６）のＥＣ５０は０．０５６ｎＭであった。蛍光標識したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイク受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を用いて同じ分析を繰り返した。親ＮｂＣＯＶ６は１９０ｎＭのＥＣ５０でＲＢＤ結合を阻害したが、親和性ｍＮｂＣＯＶ６は１．５ｎＭのＥＣ５０で阻害した。
Figure 2023526274000005
１．３ 実施例３：シュードウイルス中和アッセイ
ＺｓＧｒｅｅｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２シュードタイプ化レンチウイルスを、公開プロトコール（https://www.mdpi.com/1999-4915/12/5/513）に従って作製した。形質導入の前日に、２４ウェルプレートの各ウェルに５０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞をプレーティングした。完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋ＰＳＧ）中でナノボディの１０倍連続希釈を行い、シュードタイプ化ウイルスを最終容量２００ｕｌとして添加した。細胞上の培地をナノボディ／シュードタイプ化ウイルス混合物に交換して４時間置いた後、除去した。細胞を完全培地で洗浄し、次いで完全培地でインキュベートした。形質導入の３日後に、細胞をトリプシン処理し、ＺｓＧｒｅｅｎ＋細胞の割合をAttuneフローサイトメーター（ThermoFisher）で測定した。
１．４ 実施例４：極めて高効力の合成ナノボディは、不活性スパイクを安定化することによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、そのスパイクタンパク質と宿主細胞の受容体アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）との相互作用を介して宿主細胞に侵入する。合成ナノボディ配列の酵母表面ディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより、スパイクとＡＣＥ２の相互作用を破壊するナノボディを開発した。低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）により、ナノボディの１つであるＮｂ６が、スパイクの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）をＡＣＥ２と結合することができない到達不能なダウン状態にロックして、十分に不活性なコンフォメーションでスパイクと結合することが明らかになった。親和性成熟及び構造ガイド下での多価性の設計により、スパイクに対してフェムトモル濃度の親和性を有し、ピコモル濃度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を中和する三価ナノボディ、ｍＮｂ６－ｔｒｉが得られた。ｍＮｂ６－ｔｒｉは、エアロゾル化、凍結乾燥及び熱処理の後にも機能を保持しており、この高効力の中和剤の気道上皮への直接的なエアロゾル媒介デリバリーを可能にする。
酵母表面に提示された２×１０９個を上回る合成ナノボディ配列のライブラリーを、スパイク外部ドメインに対する結合剤に関してスクリーニングすることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する単一ドメイン抗体（ナノボディ）を単離した（１７）。突然変異型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（スパイクＳ２Ｐ）を抗原（１５）として使用した。スパイクＳ２Ｐは、Ｓ１ドメインとＳ２ドメインの間の２つのタンパク質分解切断部位のうちの１つを欠き、融合前のコンフォメーションを安定化するために２つの突然変異及び１つの三量体化ドメインを導入されている。スパイクＳ２Ｐをビオチン又は蛍光色素で標識し、最初に磁気ビーズ結合により、次いで蛍光活性化細胞選別により、複数回にわたってナノボディを提示する酵母を選択した（図２７Ａ）。
３回の選択により、スパイクＳ２Ｐに結合する２１種の固有のナノボディが得られ、ＡＣＥ２細胞外ドメインの二量体構築物（ＡＣＥ２－Ｆｃ）の存在下で結合の減少が示された。これらのナノボディは２つのクラスに分類される。クラスＩはＲＢＤに結合し、ＡＣＥ２－Ｆｃと直接競合する（図２７Ｂ）。このクラスのプロトタイプの例はナノボディＮｂ６であり、これはスパイクＳ２Ｐ及びＲＢＤ単独にそれぞれ２１０ｎＭと４１ｎＭのＫＤで結合する（図２７Ｃ；図４２）。ナノボディＮｂ３によって例示されるクラスＩＩは、スパイクＳ２Ｐ（ＫＤ＝６１ｎＭ）に結合するが、ＲＢＤ単独には結合しない（図２７Ｃ、図４２）。過剰なＡＣＥ２－Ｆｃが存在すると、Ｎｂ６及び他のクラスＩナノボディの結合は十分に遮断されるが、Ｎｂ３及び他のクラスＩＩナノボディの結合は中程度に減少する（図２７Ｂ）。これらの結果は、クラスＩナノボディはＲＢＤを標的としてＡＣＥ２の結合を遮断するが、一方、クラスＩＩナノボディは他のエピトープを標的とすることを示唆している。実際、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験により、クラスＩ及びクラスＩＩのナノボディがスパイクＳ２Ｐに同時に結合し得ることが実証されている（図２７Ｄ）。
クラスＩナノボディは、単離されたＲＢＤに結合するナノボディの会合速度定数（ｋａ）が、スパイクＳ２Ｐに結合するものよりも一貫して速いことを示しており（図４１）、これはＲＢＤの到達可能性がＫＤに影響を及ぼすことを示唆している。次に、蛍光標識スパイクＳ２ＰのＡＣＥ２発現ＨＥＫ２９３細胞に対する結合を阻害することに関して、クラスＩ及びクラスＩＩナノボディの有効性を試験した（図２７Ｅ；図４２）。クラスＩナノボディＮｂ６及びＮｂ１１は、ＩＣ５０値がそれぞれ３７０ｎＭ及び５４０ｎＭであり、最も強力なクローンの２つとして見出された。クラスＩＩのナノボディは、このアッセイにおいてほとんど又は全く活性を示さなかった。強力なスパイクＳ２Ｐ結合性と、スパイクＳ２Ｐ又はＲＢＤに対する結合の間のＫａの差が比較的小さいことを兼ね備える２つのクラスＩナノボディであるＮｂ６及びＮｂ１１を優先した。クラスＩＩナノボディでは、精製中の相対的な収量を理由としてＮｂ３を優先した（図４２）。
Ｎｂ６及びＮｂ１１の結合部位を明らかにするために、スパイクＳ２Ｐに結合した低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）構造を決定した（図２８Ａ～Ｂ；図２７～２９；図４４）。どちらのナノボディも、ＡＣＥ２結合部位と重なるＲＢＤエピトープを認識する（図２８Ｅ）。Ｎｂ６及びＮｂ１１について、スパイクＳ２Ｐの開コンフォメーション及び閉コンフォメーションの両方に対するナノボディ結合を解明した。閉じたスパイクＳ２Ｐに結合したＮｂ６の３．０Åマップを得て、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＮｂ６－スパイクＳ２Ｐ複合体のモデル化を可能にした（図２８Ａ）。また、開いたスパイクＳ２Ｐに結合したＮｂ６（３．８Å）、並びに開いたスパイクＳ２Ｐ及び閉じたスパイクＳ２Ｐに結合したＮｂ１１の低分解能マップ（それぞれ４．２Å、３．７Å）も得た。これらの低分解能マップでは、ナノボディの結合方向を定めることはできたが、ＣＤＲを正確にモデル化することはできなかった。
閉じたスパイクＳ２Ｐに結合したＮｂ６は、隣接する２つのＲＢＤ間の境界面にまたがる。接触面の大部分は、Ｎｂ６のＣＤＲ１及びＣＤＲ２による寄与である（図２８Ｃ）。ＣＤＲ３は、上から見て反時計回りに位置する隣接ＲＢＤに接触する（図２８Ｃ）。このため、１つのＮｂ６の結合は２つの隣接ＲＢＤをダウン状態で安定化させ、第２及び第３のＮｂ６分子の結合部位を予め組織化して閉スパイクコンフォメーションを安定化させる可能性が高い。対照的に、ダウン状態のＲＢＤに結合したＮｂ１１は単一のＲＢＤにしか接触しない（図２８Ｄ）。
閉じたスパイクＳ２Ｐに結合したＮｂ６の構造により、すべてのＲＢＤをダウン状態にロックすると予測される二価及び三価のナノボディを設計することができた。１５又は２０アミノ酸いずれかの柔軟なＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを挿入して、閉じたスパイクＳ２Ｐのダウン状態のＲＢＤに結合した隣接Ｎｂ６単量体間の距離を５２Åに広げた（図３６）。これらのリンカーは、Ｎｂ６分子が開いたスパイクに結合するための７２Åの距離をまたぐには短すぎる。さらに、リンカーの長さが長い場合でも、立体的な衝突が、開いたスパイクにおける３つのＲＢＤが単一のアップ状態ＲＢＤとの結合を妨げる（図３６）。対照的に、開いた又は閉じたスパイクＳ２Ｐに結合した隣接Ｎｂ１１単量体間の最小距離は６８Åである。Ｎｂ６構築物による多価結合は、アビディティ増強が理由で、解離速度の著しい減速を示すと予測した。
ＳＰＲ実験では、１５アミノ酸のリンカーを有する二価Ｎｂ６（Ｎｂ６－ｂｉ）及び２つの２０アミノ酸のリンカーを有する三価Ｎｂ６（Ｎｂ６－ｔｒｉ）の両方が、スパイクＳ２Ｐから二相性様式に解離する。解離相は、Ｎｂ６－ｂｉの速度定数ｋｄ１が２．７×１０－２ｓ－１であり、Ｎｂ６－ｔｒｉの速度定数が２．９×１０－２ｓ－１である高速相と、一価Ｎｂ６で観測される速度定数に近い速度定数ｋｄ１（ｋｄ＝５．６×１０－２ｓ－１）及びアビディティ（それぞれ、Ｎｂ６－ｂｉの場合はｋｄ２＝３．１×１０－４ｓ－１、Ｎｂ６－ｔｒｉの場合はｋｄ２＜１．０×１０－６ｓ－１）に依存する低速相という２つの成分に当てはめることができる（図２９Ａ）。高速相の比較的類似したＫｄは、多価構築物に関して観測された結合の一部が単一のスパイクＳ２ＰＲＢＤへのナノボディ結合であることを示唆している。対照的に、Ｎｂ６－ｂｉ及びＮｂ６－ｔｒｉの遅い解離相は、２つ又は３つのＲＢＤのエンゲージメントを示す。１０分間以上にわたるＮｂ６－ｔｒｉの遅い相では解離は観察されず、このことはｋｄ２の１×１０－６ｓ－１が上限であり、サブピコモル濃度の親和性であることを示す。この測定値は、スパイクＳ２Ｐを固定化するために使用される化学構造によって課されるＳＰＲチップからのスパイクＳ２Ｐの固有解離速度によって制限されるため、上限推定値のままである。従って、真の解離速度は著しく低い可能性がある。
二相性解離は、アップ状態とダウン状態のＲＢＤ間の遅い相互変換によって説明することができ、多価結合のためには、より安定なダウン状態への変換が必要である：アップ状態のＲＢＤとエンゲージしたＮｂ６－ｔｒｉの単一ドメインは急速に解離すると考えられる。その後、ＲＢＤがダウン状態になると系は再平衡化し、最終的にＮｂ６－ｔｒｉが閉じたスパイクＳ２ＰにおけるすべてのＲＢＤを捕捉し得るようになる。このことを直接試験するために、Ｎｂ６－ｔｒｉがスパイクＳ２Ｐに結合する会合時間を変化させた。実際に、ｔ１／２が６５ｓである高速相の割合の指数関数的な減少が観察され（図２９Ｂ）、これはスパイクＳ２ＰにおけるＲＢＤのアップ状態とダウン状態の間の変換の時間尺度を反映すると推測される。以上を総合すると、Ｎｂ６の二量化及び三量体化は、ＫＤのそれぞれ７５０倍及び２０万倍超の増加をもたらした。
ｃｒｙｏ－ＥＭによってＮｂ３の結合部位を決定することができなかったため、放射線分解ヒドロキシルラジカルフットプリンティングを使用した。ａｐｏ又はＮｂ３と結合したスパイクＳ２ＰをシンクロトロンＸ線に曝露させて、溶媒に曝露されたアミノ酸をヒドロキシルラジカルで標識し、その後、プロテアーゼ消化したスパイクＳ２Ｐの質量分析によって定量した（１８）。スパイクのＳ１ Ｎ末端ドメイン上の２つの隣接する表面残基（Ｍ１７７及びＨ２０７）は、Ｎｂ３の存在下で、ヒドロキシルラジカルフットプリンティングによる抗体－抗原相互作用の以前の観察と一致するレベルで保護された（図３７）（１９）。以前に発見されたコロナウイルス中和抗体は、宿主細胞受容体と競合しないＦａｂ断片で、スパイクのＮ末端ドメイン内のエピトープに結合する（２０、２１）。さらなるＳＰＲ実験により、Ｎｂ３はスパイクＳ２Ｐに一価ＡＣＥ２と同時に結合し得ることが示された（図３８）。ＡＣＥ２－Ｆｃの存在下で観察されたスパイクＳ２Ｐ結合の部分的な減少は、酵母表面上のＮｂ３の多価提示が原因であるという仮説が立てられた。実際、１５アミノ酸のリンカーを有するＮｂ３の三価構築物（Ｎｂ３－ｔｒｉ）は、スパイクＳ２ＰのＡＣＥ２細胞への結合を４１ｎＭのＩＣ５０で阻害した（図３８）。Ｎｂ３－ｔｒｉがどのようにしてスパイク－ＡＣＥ２相互作用を破壊するかは不明である。
次に、最上位のクラスＩ（Ｎｂ６及びＮｂ１１）及びクラスＩＩ（Ｎｂ３）ナノボディの一価型及び三価型の中和活性を、以前に記述されたアッセイ（２２）を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプ化レンチウイルスに対して試験した。Ｎｂ６及びＮｂ１１はそれぞれ２．０μＭ及び２．４μＭのＩＣ５０値でシュードウイルス感染を阻害した。Ｎｂ３は３．９μＭのＩＣ５０でシュードウイルス感染を阻害した（図２９Ｃ、図４２）。Ｎｂ６－ｔｒｉは阻害活性の２０００倍への増強を示し、ＩＣ５０は１．２ｎＭであり、一方、Ｎｂ１１及びＮｂ３の三量体化はそれぞれ４０倍及び１０倍（５１ｎＭ及び４００ｎＭ）というより緩やかな増加をもたらした（図２９Ｃ）。中和活性は、ＶｅｒｏＥ６細胞の生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染を使用するウイルスプラークアッセイで確認された。今回、Ｎｂ６－ｔｒｉが非常に強力であり、１６０ｐＭという平均ＩＣ５０値でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和することが証明された（図２９Ｄ）。Ｎｂ３－ｔｒｉは１４０ｎＭという平均ＩＣ５０値でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和した（図２９Ｄ）。
Ｎｂ６の効力を、３つのＣＤＲすべてを標的とする飽和突然変異誘発ライブラリーを選択することによって最適化した。２回の選択により、ＣＤＲ１中のＩ２７Ｙ及びＣＤＲ３中のＰ１０５Ｙという２つの浸透性の突然変異を有する高親和性クローンが同定された。これらの突然変異をＮｂ６に組み込んで成熟Ｎｂ６（ｍＮｂ６）を作製したところ、これはスパイクＳ２Ｐに対して５００倍に増加した親和性で結合した（図３０Ａ）。ｍＮｂ６は、シュードウイルス及び生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染の両方を低ナノモル濃度の効力で阻害し、これはＮｂ６と比較して約２００倍の改善であった（図３０Ｂ；図４２）。
２．９Åのｃｒｙｏ－ＥＭ構造は、ｍＮｂ６が閉じたスパイクＳ２Ｐに結合することを示している（図３０Ｃ；図３２）。ｍＮｂ６は、Ｎｂ６に結合したスパイクＳ２Ｐと比較して、ダウン状態のＲＢＤのわずかな再編成を誘発し、中心の３回対称軸から離れるＲＢＤの９°の回転を誘発する。このずれは、ＣＤＲ３とスパイクＳ２Ｐとの間の異なる相互作用から生じている可能性が高く、ＲＢＤを新たな静止位置に押し込む（図３０Ｄ）。Ｉ２７Ｙ置換はＲＢＤ上の元の結合部位におけるＣＤＲ１間の局所接触を最適化するが、Ｐ１０５Ｙ置換はｍＮｂ６におけるＣＤＲ３の顕著な再編成をもたらす（図３０Ｅ～Ｆ）。このコンフォメーション変化により、ｍＮｂ６ＣＤＲ３と隣接ＲＢＤとの間に異なる接触のセットが生じる。ｍＮｂ６単独のＸ線結晶構造により、遊離ｍＮｂ６とスパイクＳ２Ｐ結合ｍＮｂ６（図３０Ｇ；図４３）との間でＣＤＲ１及びＣＤＲ３における劇的なコンフォメーションの違いが明らかになった。結晶構造におけるループコンフォメーションの違いは結晶格子接触から生じる可能性があるが、それらは非結合ｍＮｂ６のコンフォメーション不均一性及びスパイクＳ２Ｐへの結合時に誘導される適合再編成を示唆している。
ｍＮｂ６の結合配向はＮｂ６のものに類似しており、このことは多価設計が同様に結合親和性を増強することを示唆している。Ｎｂ６－ｔｒｉとは異なり、２０アミノ酸のリンカーを有する三価ｍＮｂ６（ｍＮｂ６－ｔｒｉ）は、観察可能な高速相解離も１０分間にわたって測定可能な解離も有さずにスパイクＳ２Ｐに結合し、解離速度定数ｋｄの上限１．０×１０－６ｓ－１（ｔ１／２＞８日）及び１ｐＭ未満のＫＤ（図３０Ａ）が得られた。ｍＮｂ６－ｔｒｉは、シュードウイルス及び生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染アッセイの両方で、それぞれ１２０ｐＭ（５．０ｎｇ／ｍＬ）及び５４ｐＭ（２．３ｎｇ／ｍＬ）のＩＣ５０値であり、さらに効力が増強していることを提示している（図３０Ｂ、図４１）。ＳＰＲによって観察されたピコモル濃度以下の親和性を考慮すると、これらのウイルス中和能はアッセイの下限を反映している可能性が高い。従って、ｍＮｂ６－ｔｒｉは、非常に強力なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和分子である。
次に、クラスＩＩナノボディＮｂ３－ｔｒｉとの相乗作用があるかどうかを検討するために、クラスＩナノボディｍＮｂ６によるウイルス中和を試験した。シュードウイルス中和アッセイでは、Ｎｂ３－ｔｒｉとｍＮｂ６を組み合わせると相加効果が認められた（図３９）。しかし、ｍＮｂ６ウイルスの中和能はＮｂ３－ｔｒｉの濃度の増加に伴っては変化せず、これらの２つのナノボディ間の相乗作用は最小限であることが示唆された。
次に、Ｎｂ６及びその誘導体の安定性を試験した。円二色性から、Ｎｂ６、Ｎｂ６－ｔｒｉ、ｍＮｂ６、及びｍＮｂ６－ｔｒｉの融解温度はそれぞれ６６．９、６２．０、６７．６、及び６１．４℃であることが明らかになった（図４０）。さらに、ｍＮｂ６及びｍＮｂ６－ｔｒｉは凍結乾燥及びエアロゾル化に対して安定であり、サイズ排除クロマトグラフィーによって凝集を示さず、スパイクＳ２Ｐに対する高親和性結合を保持した（図３１Ａ～Ｂ及び図４０）。最後に、ｍＮｂ６－ｔｒｉは、エアロゾル化、凍結乾燥、又は５０℃で１時間の熱処理の後も、シュードウイルス及び生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染の強力な阻害を保持する（図３１Ｃ及び図４０）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の宿主細胞内への侵入を防止する戦略は、ＡＣＥ２－ＲＢＤ相互作用を遮断することを目的としている（２０、２３～３０）。高親和性モノクローナル抗体は潜在的な治療薬として先導的な位置にあるが、哺乳動物細胞の発現によって生産するには高価であり、医療従事者による静脈内投与が必要である。気道の内側を覆う上皮細胞層を通過するのは全身抗体のごく一部であるため（３２）、予防的使用には大量投与が必要である。対照的に、ナノボディは細菌や酵母において安価に製造することができる。ナノボディ固有の安定性により、鼻及び肺の上皮に直接エアロゾル化してデリバリーすることが可能である（３３）。実際、呼吸器合胞体ウイルスを標的とする三量体ナノボディ（ＡＬＸ－０１７１）のエアロゾルデリバリーは、入院中の乳児において測定可能なウイルス量を大幅に減少させるのに有効であることが最近証明された（３４）。最後に、ラクダ由来のナノボディの潜在的な免疫原性は、確立されたヒト化戦略によって軽減することができる（３５）。
ナノボディの多量体化は、アビディティによって標的親和性を改善することが示されている（３３、３６）。Ｎｂ６及びｍＮｂ６の場合、３つのＲＢＤすべてが同時にエンゲージする多量体構築物の構造ガイド下設計により、効力の大きな増加が得られた。さらに、ＲＢＤがＡＣＥ２とエンゲージするにはアップ状態である必要があるため、ＲＢＤ到達可能性のコンフォメーション制御がさらなる中和機構として機能する（３０）。実際、ｍＮｂ６－ｔｒｉがスパイクとエンゲージすると、それが結合部位を直接塞ぐこと、及びＲＢＤを不活性コンフォメーションにロックすることの両方によってＡＣＥ２の結合を妨げる。クラスＩＩ中和ナノボディの発見は、スパイク機能を破壊する潜在的に新しい機序を示している。予防的又は治療的カクテルにおけるクラスＩ及びクラスＩＩナノボディのペアリングは、強力な中和及びエスケープ変異体の防止の両方を提供する可能性がある。従って、抗スパイクナノボディの安定性、効力、及び多様なエピトープエンゲージメントの組合せは、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの継続的な犠牲者数を抑えるための独自の潜在的な予防及び治療戦略を提供する。
材料及び方法：
１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク、ＲＢＤ、及びＡＣＥ２の発現及び精製
以前に記載された構築物を使用して、融合前ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク外部ドメイン（スパイクＳ２Ｐ）の発現及び精製を行った（１５）。ＥｘｐｉＣＨＯ細胞又はＥｘｐｉ２９３Ｔ細胞（ThermoFisher）に対して、MaxTiterプロトコールの製造元の指示に従って、スパイクＳ２Ｐ構築物をトランスフェクトし、トランスフェクションの３～９日後に収集した。清澄にした細胞培養上清をNi-Excelビーズ（Cytiva）にロードし、その後に、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール中で十分に洗浄し、５００ｍＭイミダゾールを補充した同じバッファーで溶出させた。スパイクＳ２Ｐを、100kDa MWCOスピン濃縮装置（Millipore）を使用して濃縮し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０及び２００ｍＭ塩化ナトリウム中のSuperose 6 Increase 10/300カラム（GE Healthcare）によるサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。精製工程はすべて室温で行った。その結果得られた三量体スパイクＳ２Ｐの画分をプールし、ｃｒｙｏ－ＥＭ試験に直接使用するか、又は他の生化学的試験のために濃縮して１５％グリセロールとともに液体窒素中で急速凍結させた。
以前に記載された構築物を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の発現及び精製を行った（３７）。Ｅｘｐｉ２９３Ｔ細胞（ThermoFisher）に、製造元の指示に従ってＲＢＤ構築物をトランスフェクトし、トランスフェクションの３～６日後に収集した。清澄にした細胞培養上清をNi-Excelビーズ（Cytiva）又はHis-Trap Excelカラム（GE Healthcare）にロードし、その後に、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール中で洗浄し、５００ｍＭのイミダゾールを補充した同じバッファーを使用して溶出させた。ＲＢＤを、30kDa MWCOスピン濃縮器（Millipore）を使用して濃縮し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２００ｍＭ塩化ナトリウム中のSuperdex 200 Increase 10/300 ＧＬカラム（GE Healthcare）によるサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。得られた画分をプールし、濃縮して、１０％グリセロールとともに液体窒素中で急速凍結させた。
生化学実験及び酵母ディスプレイ実験のために、スパイクＳ２Ｐ及びＲＢＤを、新たに調製したＡｌｅｘａ ６４７－ＮＨＳ、Ａｌｅｘａ ４８８－ＮＨＳ、又はビオチン－ＮＨＳ（ThermoFisher）の原液により、化学量論数５倍として室温で１時間かけて標識し、その後、ＮＨＳを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０により６０分間かけて停止させた。標識されたタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製し、スピン濃縮器（Millipore）を使用して濃縮し、１０～１５％のグリセロールとともに液体窒素中で急速凍結させた。
ＡＣＥ２－ＥＣＤ（１８－６１４）Ｆｃ融合発現プラスミドを使用して、Ｆｃタグ付けされたＡＣＥ２－ＥＣＤを発現させて精製した（３８）。Ｅｘｐｉ２９３Ｔ細胞（ThermoFisher）を製造元の指示に従って使用して、ＡＣＥ２－Ｆｃ構築物をトランスフェクトし、トランスフェクションの５～７日後に収集した。清澄にした細胞培養上清をMabSelect Pure 1mLカラム（GE Healthcare）にロードした。カラムをバッファーＡ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、タンパク質をバッファーＢ（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）により、１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５を含有する深いウェルブロックに溶出させて、酸性溶出液を中和した。ＡＣＥ２－Ｆｃを、30kDa MWCOスピン濃縮器（Millipore）を使用して濃縮し、ＳＥＣバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ｖ／ｖグリセロール）を入れたSuperdex 200 Increase 10/300GLカラム（GE Healthcare）によるサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。得られた画分をプールし、濃縮して、液体窒素中で急速凍結させた。単量体ＡＣＥ２を得るために、１：５０（ｗ／ｗ）Ｈｉｓタグ付きＴＥＶプロテアーゼをＡＣＥ２－Ｆｃに添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、この混合物を、ＳＥＣバッファー中でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。単量体ＡＣＥ２画分をプールし、Ｈｉｓ樹脂（５０％スラリー１ｍＬ）で洗浄して過剰なＴＥＶを除去した。得られた上清をプールし、濃縮して、液体窒素中で急速凍結させた。
２．抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクナノボディの同定
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＥＣＤに対するナノボディを同定するために、天然のラマ免疫レパートリーにおけるアミノ酸位置特異的バリエーションを再現する合成ナノボディ配列の酵母表面ディスプレイライブラリーを使用した。このライブラリーは、２×１０９種を上回る多様性のあるバリアントをコードし、ノーセオスリシン（nourseothricin）（ＮＴＣ）耐性をエンコードする改変ベクターについて以前に記載されたように（１７）、ナノボディディスプレイのための合成ストーク配列を使用する。１回目の選択では、ＮＴＣを補充したＹＰＧ（酵母エキス－ペプトン－ガラクトース）中で誘導した２×１０１０個の酵母を選択バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）低ビオチンウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）で繰り返し洗浄し、最終的に２００ｎＭビオチン化スパイクＳ２Ｐを含有する１０ｍＬの選択バッファー中に再懸濁させた。酵母を２５℃で３０分間インキュベートした後、低温の選択バッファーで繰り返し洗浄し、最終的に２００μＬのMiltenyi抗ストレプトアビジンマイクロビーズを含有する低温の選択バッファー１０ｍＬ中に再懸濁させた。４℃で３０分間インキュベートした後、酵母を再び低温の選択バッファーで洗浄した。Miltenyi MACS LSカラムでスパイクＳ２Ｐ結合性酵母を捕捉し、ＮＴＣを補充したＹＰＤ（酵母エキス－ペプトン－デキストロース）培地中に回収した。
２回目のラウンドでは、１回目のラウンドで誘導された酵母４×１０８個を、選択バッファー１ｍＬ中にて、Ａｌｅｘａ ６４７で標識した１００ｎＭのスパイクＳ２Ｐとともに２５℃で１時間インキュベートした。低温の選択バッファーで十分に洗浄した後、Sony SH800機器による蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって、スパイクＳ２Ｐ結合性酵母を単離した。同様のアプローチを、Ａｌｅｘａ ６４７で標識した１０ｎＭのスパイクＳ２Ｐに置き換えて、３回目のラウンドでも使用した。３回目のラウンド後の酵母をＹＰＤ＋ＮＴＣ固体培地上にプレーティングし、２ｍＬの深いウェルプレート中でＹＰＧ＋ＮＴＣ培地により７６８個の個々のコロニーを誘導した。個々のクローンを、Beckman Coulter Cytoflex上のフローサイトメトリーによって、４ｎＭのスパイクＳ２Ｐ－Ａｌｅｘａ ４８８に対する結合について試験した。スパイク－ＡＣＥ２相互作用を破壊するナノボディを同定するために、０．５～１μＭのＡＣＥ２－Ｆｃの存在下でスパイクＳ２Ｐ結合を繰り返した。７６８個のクローンのうち、スパイクＳ２Ｐに強く結合し、ＡＣＥ２と競合する２１個のクローンを同定した（図４４）。
３．ナノボディの発現及び精製
ナノボディ配列を、In-Fusion HDクローニング（Takara Bio）を使用してｐＥＴ２６－ｂ（＋）発現ベクター中にクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（New England BioLabs）に導入して形質転換させた後、Terrific Broth中で３７℃にてＯＤ０．７～０．８まで増殖させ、その後に１ｍＭ ＩＰＴＧを使用する遺伝子導入を２５℃で１８～２２時間行った。大腸菌を収集し、ＳＥＴバッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５００ｍＭスクロース、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、1X cComplete protease inhibitor（Roche））中に再懸濁させて２５℃で３０分間置いた後、４５分間の浸透圧ショックを与え、容量２倍の水を添加した。可溶化液にＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、イミダゾールを添加してそれぞれ１５０ｍＭ、２ｍＭ、４０ｍＭとした後に、１７～２０，０００×ｇで１５分間遠心分離し、細胞片を周辺質画分から分離した。次に、細菌培養物１リットルごとに、周辺質画分を、ニッケル洗浄バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール）で平衡化した50% HisPur Ni-NTA樹脂（Thermo Scientific）４ｍＬとともにインキュベートした。この混合物をＲＴで回転させながら１時間インキュベートした後、５０×ｇで遠心分離して樹脂を採取した。その後、樹脂を５倍容量のNickel Washバッファーで３回洗浄し、そのたびに遠心分離を使用して余分な洗浄バッファーを除去した。次いで、結合したタンパク質を溶出バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）で３回洗浄して溶出させた。溶出したタンパク質を、3.5kDa MWCO遠心フィルターユニット（Amicon）を使用して濃縮した後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化したSuperdex 200 Increase 10/300GLカラムに注入した。3.5k MWCO遠心フィルターユニットを使用して再びナノボディ構築物を濃縮し、液体窒素中で急速凍結させた。
４．表面プラズモン共鳴による親和性決定
ナノボディ（Ｎｂ）親和性決定実験は、ナノボディ結合時に約３０反応単位（ＲＵ）の最大反応（Ｒｍａｘ）を達成するために、StreptactinXTを固定化した（Iba Life Sciences）ＣＭ５シリーズＳセンサーチップ（Cytiva Life Sciences）上で１０μｇ／ｍＬでStreptagIIタグ付きスパイクＳ２Ｐを捕捉することによって、Biacore T200及び8K機器（Cytiva Life Sciences）にて実施した。１μＭから３１．２５ｎＭ（一価構築物の場合）又は５０ｎＭから１．５６ｎＭ（親和性成熟及び多量体構築物の場合）までの精製ナノボディの２倍連続希釈物を、捕捉されたスパイクＳ２Ｐ表面上に３０μＬ／分で６０秒間流した後、６００秒間解離流を流した。各サイクルの後に、チップ表面を３Ｍ塩酸グアニジンで再生させた。
これとは別に、８μｇ／ｍＬのビオチン化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤを、プレコンディショニングを行ったシリーズＳセンサーチップＣＡＰチップ（Cytiva Life Sciences）にロードしたところ、ナノボディ結合時におよそ６０ＲＵのＲｍａｘを達成した。スパイクＳ２Ｐ泳動と同じランニングバッファー及び一連の試料（親又は親和性成熟クローン）の２倍連続希釈物をＲＢＤ表面上に３０μＬ／分で６０秒間流した後、６００秒間解離流を流した。チップ表面の再生は、グアニジン塩酸塩／水酸化ナトリウム溶液で行った。
すべての一価クローンに関して得られたセンサーグラムを、Biacore Insight Evaluation Software（Cytiva Life Sciences）又はGraphPad Prism 8.0の会合／解離モデルを使用して、1:1 Langmuir結合モデルに適合させた。Ｎｂ６－ｂｉ及びＮｂ６－ｔｒｉ結合の速度論的パラメーターを決定するために、解離相を各濃度間で共有される２つの解離速度定数に制約される二指数関数的減衰に適合させた。会合相は、各濃度の会合速度定数に同時に適合する会合速度モデルを使用して、別々に適合させた。
ナノボディ競合実験のために、スパイクＳ２Ｐを、以前に考察した通りにStreptactinXT固定化ＣＭ５センサーチップ上にロードした。速度論実験の場合と同様に、一次ナノボディを捕捉したスパイクＳ２Ｐ表面上に３０μＬ／分で６０秒間流して飽和させた。その直後に、一次注入と同じ濃度の一次ナノボディ及び様々なナノボディの混合物の２回目の注入を行った。
５．ＡＣＥ２細胞表面結合競合アッセイ
ナノボディの希釈系列を、ＰＢＥ（ＰＢＳ＋０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）中に作製し、スパイクＳ２Ｐ－Ａｌｅｘａ６４７又はＲＢＤ－Ａｌｅｘａ６４７と混合した。ＡＣＥ２発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をTrypLE Express（ThermoFisher）で解離させ、ＰＢＥ中に再懸濁させた（２２）。細胞をスパイクＳ２Ｐナノボディ溶液と混合し、４５分間インキュベートし、ＰＢＥで洗浄した後、ＰＢＥ中に再懸濁させた。細胞表面のＡｌｅｘａ６４７蛍光強度を、Attune Flow Cytometer（ThermoFisher）で評価した。
６．Ｎｂ６の親和性成熟
Ｎｂ６配列をコードする重なりのあるオリゴヌクレオチドのアセンブリＰＣＲによって、Ｎｂ６の部位飽和突然変異誘発ライブラリーを作製した。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の各位置の個々のオリゴ体を、縮重「ＮＮＫ」コドンで設計した。アセンブルされた遺伝子産物を、前述の酵母表面ディスプレイベクターとの相同組換えを可能にするために、重なりのある末端を有するオリゴヌクレオチドで増幅し、標準的なシリカベースのクロマトグラフィーで精製した（１７）。得られたインサートＤＮＡを酵母ディスプレイベクターｐＹＤＳ２．０とともにサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＢＪ５４６５株（ＡＴＣＣ２０８２８９）に導入して形質転換させ、２×１０８個の形質転換体のライブラリーを作製した。２０℃のＹＰＤ＋ＮＴＣ培地中で２日間誘導した後、２×１０９個の酵母を選択バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）低ビオチンＢＳＡ）で洗浄し、１ｎＭビオチン－スパイクＳ２Ｐとともに２５℃で１時間インキュベートした。その後、酵母を選択バッファーで洗浄し、１ｍＬの選択バッファー中に再懸濁させて、１０μＬのストレプトアビジンマイクロビーズ（Miltenyi）とともに４℃で１５分間インキュベートした。酵母を低温の選択バッファーで再度洗浄し、ＬＳカラム（Miltenyi）を使用する磁気分離によってスパイクＳ２Ｐ結合性酵母を単離した。回収した酵母を３７℃のＹＰＤ＋ＮＴＣ中で増殖させ、２０℃のＹＰＧ＋ＮＴＣにより誘導した。抗原を１００ｐＭのＲＢＤ－Ａｌｅｘａ６４７に置き換えて、上記のように２回目の選択を行った。高親和性クローンを提示する酵母を、Ａｎｔｉ－Ｃｙ５マイクロビーズ（Miltenyi）及びＬＳカラムを使用する磁気分離によって選択した。２回目の選択後のライブラリーの分析により、１０ｐＭのＲＢＤ－Ａｌｅｘａ６４７の明確な結合を有するクローンの集団が明らかになった。そのため、１０ｐＭのＲＢＤ－Ａｌｅｘａ６４７に結合する９６個の個々のクローンをフローサイトメトリーによってスクリーニングした。１０ｐＭのＲＢＤ－Ａｌｅｘａ６４７に堅固に結合することを示した８つのクローンの配列分析により、親和性成熟クローンｍＮｂ６を作製するために使用された２つのコンセンサス突然変異、Ｉ２７Ｙ及びＰ１０５Ｙが明らかになった。
７．ｍＮｂ６の結晶学及び構造決定
精製されたｍＮｂ６を１８．７ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．１μｍの親水性ＰＶＤＦフィルター（Millipore）を使用して濾過した。ｍＮｂ６結晶スクリーニングは、Ｉｎｄｅｘスクリーニング及びＡｍＳＯ４スクリーニング（Hampton Research, Aliso Viejo, CA）において、２：１のタンパク質：リザーバーの懸滴形式で９６ウェルプレートにて設置した。６０を上回る異なるスクリーニング条件で様々な形態を有する結晶が周囲温度で一晩で出現し、さらなる最適化を行わずにスクリーニングから直接得られた。８０％のリザーバー及び２０％ ＰＥＧ４００又は２０％グリセロールを含有する溶液中に迅速に浸漬することによって結晶を凍結保護した後、CrystalCap HT Cryoloops（Hampton Research, Aliso Viejo, CA）にマウントし、低温窒素流（１００Ｋ）で急速凍結させた。すべてのデータは、Advanced Light Source（Berkeley, CA）ビームライン８．３．１で収集した。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．５、１．０Ｍ硫酸アンモニウム中で成長したｍＮｂ６の単結晶は２．０５Åの回折であった。統合及びスケーリングは、インデックス作成及び統合にＸＤＳ、スケーリング及びマージにＸＳＣＡＬＥを使用して、Ｘｉａ２により行った（３９）。構造は、ナノボディＮｂ．ｂ２０１（ＰＤＢ５ＶＮＶ）の構造を探索モデルとして使用し、ＰＨＡＳＥＲを使用して分子置換を解析した（１７、４０）。モデル構築はＣＯＯＴで行い、ＰＨＥＮＩＸ及びＢＵＳＴＥＲでリファインメントを行った（４１～４３）。
６．ｃｒｙｏ－ＥＭによるスパイクナノボディ複合体の構造
Ａ）試料の調製及び顕微鏡検査
スパイクＳ２Ｐナノボディ複合体を調製するために、各ナノボディを２．５μＭで１０分間、スパイクＳ２Ｐに対して３倍モル過剰として氷上でインキュベートした。３００メッシュの1.2/1.3R Au Quantifoilグリッドに３μＬのスパイクＳ２Ｐナノボディ複合体を、予め１５ｍＡで３０秒間グロー放電させたPelco easiGlow放電洗浄システムに添加した。Whatman No.1定性濾紙を使用して、FEI Vitrobot Mark IV（ThermoFisher）で４℃、湿度１００％で４秒間、０のブロッティング力でブロッティングを行った後、液体エタン中で氷包埋法で凍結させた。
各複合体について、Ｋ３カメラ及び２０ｅＶのスリット幅に設定されたバイオ量子エネルギーフィルター（Gatan）を装備したTitan Krios（ThermoFisher）上で、公称倍率１０５，０００倍（物理ピクセルサイズ：０．８３４Å／ｐｉｘ）での３×３のイメージシフト収集戦略で、１２０フレームの超分解能ムービーを収集した。総線量６６ｅ－／Å２に対する収集線量率は８ｅ－／ピクセル／秒であった。各収集はSerialEMの半自動スクリプトで実行した（４４）。
Ｂ）画像処理
すべてのデータセットについて、線量分割超解像ムービーを、MotionCor2によりモーション補正した（４５）。コントラスト伝達関数の決定はcryoSPARC patch CTFを使用して行った（４６）。粒子は、事前のデータ収集から生成された２０Åローパスフィルター処理したアポスパイク２Ｄテンプレートにより選択した。
Ｎｂ６－スパイクＳ２Ｐ及びｍＮｂ６－スパイクＳ２Ｐ粒子を３８４ピクセルのボックスで抽出し、９６ピクセルにビニングし、cryoSPARCで均一にリファインメントを行うために、ビニング解除の前に１回の２Ｄ及び３Ｄ分類に供した。ｐｙＥＭモジュールを使用して、リファインメントされた粒子を、次いで、４０Åにローパスフィルター処理された入力リファインメントマップを使用して、アライメントなしでの３Ｄ分類のためにRelion 3.1にインポートした（４７、４８）。スパイクの閉コンフォメーションを表すクラスの粒子がcisTEMにインポートされ、自動リファインメントの後にＲＢＤ：：ナノボディマスク領域内の局所リファインメントを行った（４９）。局所リファインメントの後に、Ｃ３軸対称性の新しいリファインメントパッケージを作成し、マスキングなしの局所リファインメントの最終ラウンドを行った。各マップの最終的な粒子数は、Ｎｂ６－開：４０，１２５個、Ｎｂ６－閉：５８，４９３個、ｍＮｂ６：５３，６９０個であった。
Ｎｂ１１－スパイクＳ２Ｐ粒子を５１２ピクセルのボックスで抽出し、図３５に示されているように、複数回の３Ｄ分類のために１２８ピクセルにビニングした。均一なリファインメントの後、粒子をRelion 3.1にエクスポートした。ＲＢＤナノボディ複合体に概ね相当する粒子密度は、粒子減算後に保持された。アラインメントなしの３Ｄ分類を粒子減算スタックで行った。堅固なＲＢＤナノボディ密度を有するクラスの粒子を選択し、減算せずにRelionでリファインメントを行い、その後に後処理を行った。２１，５７０個の粒子が最終的なマップに寄与した。各マップの最終的な粒子数は、Ｎｂ１１－開：２１，５７０個、Ｎｂ１１－閉：２７，６１１個であった。すべてのマップについて、最終的な局所分解能推定及びＧＳＦＳＣ決定をcryoSPARCで行った。視野角分布プロットをpyEMモジュールで作成し、ChimeraX（５０）で描出した。
Ｃ）構造モデル化
Ｎｂ６－スパイクＳ２Ｐ及びｍＮｂ６－スパイクＳ２Ｐのモデルを、以前に決定された閉じたスパイクＳ２Ｐの構造（ＰＤＢ：６ＶＸＸ）を使用して構築した（１４）。ＲＢＤの解明された領域を組み込んだ複合モデルを、以前に決定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤのＸ線結晶構造（ＰＤＢ：６Ｍ０Ｊ）を使用して作成した（５１）。Ｎｂ６については、β２アドレナリン受容体ナノボディＮｂ８０（ＰＤＢ：３Ｐ０Ｇ）をテンプレートとして使用し、まずナノボディをＮｂ６－スパイクＳ２Ｐ複合体のcryo-EM密度マップに適合させた（５２）。次いで、相補性決定ループを切り詰めて、RosettaESを使用して再構築した（５３）。ｍＮｂ６の高分解能構造により、ナノボディＣＤＲループの手作業での構築を新規に行うことが可能になったため、Rosettaベースのアプローチはモデル化に使用しなかった。最終的な構造はCOOT及びISOLDEにおいて検査及び手作業での調整が行われ、その後、PHENIXで実際の空間的リファインメントが行われ（４１、４３、５４）、Rosettaを使用してさらなる洗練と緩和が行われた（５５）。グリカンは、炭水化物のコンフォメーションに関する事前の知識を組み込んだグリカン特異的Rosettaプロトコールを利用してリファインメントされ、最も低エネルギーのグリカン幾何構造が保証された（５６）。最終的なグリカンの配置は、手作業で、ＣＣＰ４の下で配布されたPrivateerソフトウェアパッケージを使用して検査した（５７、５８）。最終的なタンパク質モデルを、Molprobity（５９）、EMRinger（６０）、PHENIXで解析し、その統計値を図４２に示した。
本明細書に提示されたＮｂ１１－スパイクＳ２Ｐ複合体のモデルについて、ＰＤＢの配列による最も近いナノボディ（β２アドレナリン受容体Ｎｂ６０、ＰＤＢ ＩＤ：５ＪＱＨ）を、フレームワーク領域のみを使用するCOOTの剛体リファインメントメントによってcryo-EM密度マップに適合化した（６１）。これらのマップの分解能が低いために、ループコンフォメーションの確実な割り当ては行えなかったが、Ｎｂ１１のスパイクＳ２Ｐに対する全体的な配向は十分に制約されていたため、スパイクＳ２Ｐに結合した２つのＮｂ１１分子のＮ末端とＣ末端の間との距離は正確にモデル化することができた。
アポ及びＮｂ３結合スパイクＳ２Ｐの放射線分解ヒドロキシルラジカルフットプリンティング及び質量分析
スパイクＳ２Ｐ及びＮｂ３試料を、２５℃での大規模透析によって１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。１．５倍モル過剰量のＮｂ３を、５μＭのスパイクＳ２Ｐに添加し、複合体を２５℃で２４時間以上インキュベートした。放射線分解フットプリンティングのために、タンパク質濃度及びビームパラメーターをＡｌｅｘａ－４８８蛍光団アッセイを使用して最適化した（１８）。Advanced Light Source（Berkeley, CA）のビームライン３．２．１にて、濃度１～３μＭのＡｐｏスパイクＳ２Ｐ及びスパイクＳ２Ｐ－Ｎｂ３複合体を０～５０ｍｓの間の６つの時点でシンクロトロンＸ線ホワイトビームに曝露させ、曝露直後に１０ｍＭのメチオニンアミドで停止させた。グリカンは、５％ＳＤＳ、５ｍＭ ＤＴＴで９５℃で５分間処理し、続いてPNGase（Promega）で３７℃で２時間消化することによって除去した。ZebaSpinカラム（Thermo Fisher）を使用して、試料を炭酸水素アンモニウム（ＡＢＣ）バッファー（ｐＨ８．０）にバッファー交換した。システインのアルキル化は、８Ｍ尿素及び５ｍＭ ＤＴＴによる３７℃、３０分間の処理の後に、１５ｍＭヨードアセトアミドとともに２５℃の暗所で３０分間インキュベートすることによって行った。すべての試料をさらにZebaSpinカラムを使用してＡＢＣ ｐＨ８．０にバッファー交換し、３７℃で８時間、トリプシン／Lys-C又はGlu-C（Promega）のいずれかと酵素：タンパク質比１：２０（ｗ／ｗ）で消化した。
試料を凍結乾燥させ、１％ギ酸中に２００ｆｍｏｌ／μＬの濃度で再懸濁させた。各ＭＳ分析では、１μＬの試料を５ｍｍのThermo Trap C18カートリッジに注入した後、ナノ溶出ＨＰＬＣ（Bruker）により、１．９μｍのReprosil C18粒子（Dr.Maisch HPLC GmbH）を充填した１５ｃｍカラムで分離した。分離は、５０℃、流量４００μＬ／分で、０．１％ギ酸中にて２％～１７％アセトニトリルを０～２０分間、続いて１７％～２８％アセトニトリルを２０～４０分間の勾配で行われた。溶出液をBruker timsTOF Pro質量分析計にてエレクトロスプレーイオン化し、データ依存ＰＡＳＥＦ取得によりデータを収集した。データベース検索及びＭＳ１ペプチド存在量の抽出は、トリプシン又はＧｌｕＣ酵素特異性のいずれかによりFragPipeプラットフォームを使用して行い、すべてのペプチド及びタンパク質の同定は１％の偽発見率までフィルター処理した（６２）。スパイクタンパク質、一般的な混入タンパク質、及びサッカロミセ・セレビシエプロテオーム（２０２０年７月２３日にダウンロード）の連結タンパク質データベースに対して検索を行った。サッカロミセ・セレビシエプロテオームは、ペプチド及びタンパク質の同定の堅固な偽発見率推定のために、真の陰性同定の十分な集団を生成するために含めたことに注意されたい。最後に、FragPipeから報告されたＭＳ１強度の曲線下面積を、MSstats（６３）を使用して各ペプチド種についてまとめた。
抽出されたイオンクロマトグラムのピーク面積及び関連する側鎖修飾を使用して、各時点での修飾を定量した。ビームライン曝露時間を長くすると、未修飾ペプチドの割合が減少し、部位特異的用量反応プロットとして表すことができる。ヒドロキシルラジカル反応性（ｋｆｐ）の速度は、各残基の固有の反応性及びその溶媒への到達可能性の両方に依存し、Graphpad Prism Version 8の擬一次反応スキームに用量反応を適合させることによって計算した。特定の残基におけるａｐｏスパイクＳ２Ｐとスパイク－Ｎｂ３複合体との間のｋｆｐの比率により、２つの試料間の溶媒到達可能性の変化に関する情報が得られた。これらの変更を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（ＰＤＢ６ＸＲ８）に対してマッピングした（１１）。場合によっては、高度に修飾された残基は、長期曝露時に用量反応の平坦化を示し、これはラジカル誘発損傷と解釈される。これらの過剰に曝露された時点は、ｋｆｐの計算から除外した。
Ｄ）ナノボディ中和に関するシュードウイルスアッセイ
ＺｓＧｒｅｅｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプ化レンチウイルスを、公開プロトコールに従って作製した（２２）。形質導入の前日に、５０，０００個のＡＣＥ２発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２４ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋ＰＳＧ）中でナノボディの１０倍連続希釈を行い、シュードタイプ化ウイルスを最終容量２００μＬとして添加した。培地をナノボディ／シュードタイプ化ウイルス混合物に交換して４時間置いた後、除去した。完全培地で細胞を洗浄した後、３７℃の完全培地でインキュベートした。形質導入の３日後に細胞をトリプシン処理し、ZsGreen+細胞の割合をAttuneフローサイトメーター（ThermoFisher）で測定した。
Ｅ）真正ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株Ｆｒａｎｃｅ／ＩＤＦ０３７２／２０２０は、Pr. Sylvie van der Werfが長を務めるパスツール研究所（パリ、フランス）が所有するNational Reference Centre for Respiratory Virusesにより供与された。このウイルス株を、２％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Invitrogen）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中のＶｅｒｏ Ｅ６細胞で増殖させることによって調製した。ウイルス力価はプラークアッセイで測定した。生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むプラークアッセイはすべて、パスツール研究所パリ（ＩＰＰ）で、ＩＰＰのガイドラインに従い、承認された研究所でバイオセイフティーレベル３（ＢＳＬ－３）の封じ込め手順に従って実施された。実験はすべて、少なくとも３つの生物学的に独立した試料で行われた。
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（ＣＲＬ－１５８６、ＡＴＣＣ）におけるプラーク減少中和試験を使用して、感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和を行った。手短に述べると、ナノボディ（又はＡＣＥ２－Ｆｃ）を２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で８倍に連続希釈し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）と混合して、３７℃、５％ＣＯ２で１時間置いた。その後、この混合物を、１２ウェルプレートに播種したＶｅｒｏ Ｅ６細胞への接種に使用し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間置いた。このウイルス吸着時間の後に、固体アガロースオーバーレイ（ＤＭＥＭ、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び０．８％アガロース）を加えた。細胞をさらに３日間インキュベートし、その後に４％ホルマリンを使用して固定し、クリスタルバイオレットの添加によってプラークを可視化した。各希釈ごとに４つの反復試験用ウェル中のプラーク数を使用して、３パラメーターのロジスティック回帰（GraphPad Prism version 8）を使用して最大半値阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した。
Ｆ）ナノボディ安定性試験
円二色性によるナノボディの熱安定性を、ペルチェ温度制御装置を備えたJasco J710CD分光計を使用して評価した。個々のナノボディ構築物を、リン酸緩衝生理食塩水で５μＭに希釈した。２５℃と８０℃の間でのモル楕円率を、２０４ｎｍ（２ｎｍ帯域幅）で１℃／分の加熱速度で測定した。得られたモル楕円率の値を、最近接スムージング関数を適用した後にGraphPad Prism 8.0で正規化し、プロットした。
ＡＣＥ２発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のナノボディ競合実験のために、ナノボディを２５℃又は５０℃のいずれかで１時間インキュベートした。或いは、各ナノボディを携帯型メッシュネブライザーでエアロゾル化し、最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬで２～５μｍの粒子を生じさせた。この結果得られたエアロゾルを、氷上で冷却した５０ｍＬチューブ中に結露させて収集した。次に、上記のように試料を処理して、スパイクＳ２Ｐ－Ａｌｅｘａ６４７に対する結合に関するＩＣ５０値を決定するか、又は上記のようにシュードウイルス中和試験に使用した。
エアロゾル化及び凍結乾燥に対するｍＮｂ６及びｍＮｂ６－ｔｒｉの安定性を評価するためのさらなる実験では、各構築物の開始濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとした。エアロゾル化は上記のように行った。凍結乾燥のためには、まずナノボディを液体窒素中で急速凍結させ、真空下で溶液を完全に乾燥させた。得られた乾燥物を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁させた。ストレスを受けていない試料、エアロゾル化後の試料、及び凍結乾燥後の試料のサイズ排除クロマトグラフィーを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中のSuperdex 75 Increase 10/300カラムで行った。スパイクＳ２Ｐに対する結合を評価するＳＰＲ実験は、上記の通りに行った。生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの実験では、エアロゾル化、凍結乾燥、又は熱処理した試料を、出荷前に液体窒素で急速凍結させた。
１．５ 実施例５：ゴールデンシリアンハムスターにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染及び伝播の処置のためのナノ粒子Ａの評価
目的：本試験の目的は、野生型ゴールデンシリアンハムスターにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の処置に対するナノ粒子Ａの有効性を評価することであった。さらに、感染動物からナイーブ同腹子へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の直接伝播を減少させるナノ粒子Ａの有効性についても評価された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露されたハムスターの体重減少、肺ウイルス力価及び肺重量に対するナノ粒子Ａ投与の効果を主要評価項目とした。
材料及び方法：
動物：雌性５週齢ゴールデンシリアンハムスターを、この実験のためにCharles River Laboratories (Wilmington, MA）から入手した。ハムスターは使用前に３日間隔離し、ユタ州立大学の Laboratory Animal Research Centerで、Teklad Rodent Diet（Harlan Teklad）と水道水で飼育された。
ウイルス：重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ＵＳＡ＿ＷＡ１／２０２０株を、World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses（WRCEVA）から入手した。このウイルスを、Ｖｅｒｏ ７６細胞において２回継代し、ハムスターへの感染のための作業株を作製した。
実験デザイン－伝播及び有効性試験：合計２４匹の５週齢の雌性ゴールデンシリアンハムスターを、未処置感染動物として利用するための４匹のハムスターからなる２群と、ナノ粒子Ａ投与の有無にかかわらず同居させるための８匹のナイーブハムスターからなる２群にランダムに割り付けた（図５１）。有効性試験については、計３７匹のハムスターを１つの処置用量につき８匹ずつの４群に分け、５匹を正常対照として体重増加を観察した（図５２）。ウイルス負荷について、第１、３、５群のハムスターにケタミン／キシラジン（５０ｍｇ／ｋｇ／５ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射による麻酔を施した後、１００μｌの接種量で１×１０４．３ ５０％細胞培養物感染量（ＣＣＩＤ５０）の用量を鼻腔内投与した。すべての鼻腔内投与は、感染症の場合と同様に動物に麻酔をかけた後、１００μｌの容量で行った。第１群及び３群の動物には処置を行わなかった。第２群及び第４群の動物は感染させなかったが、第１群又は第３群の動物と毎日４時間ずつ、試験第１、２、３日に同居させた。第２群の動物には、プラセボとして生理食塩水を投与した。第４群の動物には、感染動物と同居させる２時間前にナノ粒子Ａを１日１回投与した。ハムスターの体重を感染前及びその後毎日測定し、感染に伴う体重減少を評価した。試験第４日にすべての動物を安楽死させ、肺ウイルス力価及び感染動物から未感染動物へのウイルス伝播を評価した。口腔咽頭スワブを全動物から採取した。
肺組織試料の滴定：肺組織ホモジネートをエンドポイント希釈によって滴定した。Ｖｅｒｏ ７６細胞の集密化単層を含有する９６ウェルマイクロプレートの４つずつの反復試験用ウェルに、肺組織ホモジネートの連続ｌｏｇ１０倍希釈物をプレーティングした。プレートを５％ＣＯ２の３７℃インキュベーター内で６日間インキュベートした。その後、プレートを、細胞変性効果（ＣＰＥ）の存在について、光学顕微鏡下での目視によってスコア化した。各試料のウイルス力価は、Reed-Muench法（Reed-Muench method (Reed LJ and Muench H, A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Hygiene. 1938）を使用する線形回帰によって計算した。
統計及び図面：個々のハムスターの体重を感染当日の初期体重に対する割合に変換した。初期体重に対する割合の曲線を、各投与群とプラセボ投与ハムスターとを比較する一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して比較した。投与動物とプラセボ投与動物とを比較する一方向ＡＮＯＶＡを使用して、肺ウイルス力価及び肺重量を比較した。
本試験では、ゴールデンシリアンハムスターにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝播に対するナノ粒子Ａの鼻腔内投与の有効性を評価した。ナノ粒子Ａの投与を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させたハムスターの肺ウイルス力価及び肺重量の減少についても評価した。
結果：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による負荷及びナノ粒子Ａの投与後に感染動物と同居させた５週齢ゴールデンシリアンハムスターの初期体重に対する割合を図５７に示す。同じ形の記号を付した動物を同居させた。黒丸印及び黒四角印で表した群を、研究第０日に感染させた。白抜き丸印で表した動物は、ナイーブとしてプラセボ投与を行った後に、第１群の動物と１日４時間ずつ３日間同居させた。白抜き四角印で表した動物は、ナイーブとしてナノ粒子Ａを投与した後に、第３群の動物と同居させた。一方向ＡＮＯＶＡによって比較した場合、初期体重に対する割合の差は統計的に有意ではなかった。
図５８は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による負荷及びナノ粒子Ａの投与の後に感染動物と同居させた５週齢ゴールデンシリアンハムスターの肺ウイルス力価を示す。同じ形の記号を付した動物を同居させた。黒丸印及び黒四角印で表した群を、研究第０日に感染させた。白抜き丸印で表した動物は、ナイーブとしてプラセボ投与を行った後に、第１群の動物と１日４時間ずつ３日間同居させた。白抜き四角印で表した動物は、ナイーブとしてナノ粒子Ａを投与した後に、第３群の動物と同居させた。ナノ粒子Ａの投与は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた動物と同居させたナイーブ動物において、肺ウイルス力価を有意に低下させた。このデータを図５３にまとめる。
図５９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による負荷及びナノ粒子Ａの投与の後に感染動物と同居させた５週齢ゴールデンシリアンハムスターの肺重量を示す。同じ形の記号を付した動物を同居させた。黒丸印及び黒四角印で表した群を、研究第０日に感染させた。白抜き丸印で表した動物は、ナイーブとしてプラセボ投与を行った後に、第１群の動物と１日４時間ずつ３日間同居させた。白抜き四角印で表した動物は、ナイーブとしてナノ粒子Ａを投与した後に、第３群の動物と同居させた。一方向ＡＮＯＶＡで比較した場合、肺重量には群間で統計的な差はなかった。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による負荷及びナノ粒子Ａの投与の後に感染動物と同居させた５週齢ゴールデンシリアンハムスターの口腔咽頭スワブウイルス力価を図６０に示す。同じ形の記号を付した動物を同居させた。黒丸印及び黒四角印で表した群を、研究第０日に感染させた。白抜き丸印で表した動物は、ナイーブとしてプラセボ投与を行った後に、第１群の動物と１日４時間ずつ３日間同居させた。白抜き四角印で表した動物は、ナイーブとしてナノ粒子Ａを投与した後に、第３群の動物と同居させた。一方向ＡＮＯＶＡでは、口腔咽頭スワブウイルス力価に有意差は認められなかった。このデータは図５４と図６１にまとめられており、ナノ粒子Ａの投与及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染後の５週齢のゴールデンシリアンハムスターの初期体重に対する割合を示している。一方向ＡＮＯＶＡで比較した場合、初期体重に対する割合の差は統計的に有意ではなかった。
図６２は、ナノ粒子Ａの投与及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染後の５週齢ゴールデンシリアンハムスターの肺ウイルス力価を示す。ナノ粒子Ａの投与を開始したところ、２ｍｇ／ｋｇ／日及び０．６３ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、プラセボ投与動物と比較して肺ウイルス力価が有意に低下した。このデータを図５５にまとめる。
図６３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の負荷及びナノ粒子Ａの投与後に感染動物と同居させた５週齢ゴールデンシリアンハムスターの肺重量を示す。一方向ＡＮＯＶＡによって比較した場合、肺重量には群間で統計的な差はなかった。
ナノ粒子Ａの投与及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染後の５週齢ゴールデンシリアンハムスターの口腔咽頭スワブウイルス力価を図６４に示す。ナノ粒子Ａの２ｍｇ／ｋｇ／日の投与は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したハムスターの口腔咽頭スワブ力価を有意に低下させた。このデータを図５６にまとめる。
結論：本試験では、ゴールデンシリアンハムスターにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の伝播に対するナノ粒子Ａの鼻腔内投与の有効性を評価した。ナノ粒子Ａの投与が、肺ウイルス力価、口腔咽頭スワブ力価及び肺重量に及ぼす影響についても評価した。２ｍｇ／ｋｇ／日の用量でのナノ粒子Ａの投与はナイーブ動物へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝播を有意に減少させた。感染動物に曝露させた８匹のナイーブ動物のうち３匹の肺からはウイルスは検出されなかった。残りの５匹では、肺のウイルス力価がプラセボ投与ナイーブ動物と比較して少なくとも１ ｌｏｇ１０低下した。口腔咽頭スワブ力価はナノ粒子Ａの投与により有意に低下したが、ウイルスはプラセボ投与動物でも一貫して検出されなかった。有効性試験において、２ｍｇ／ｋｇ／日又は０．６３ｍｇ／ｋｇ／日を投与された動物では、プラセボ投与動物と比較して肺ウイルス力価が有意に低下した。また、ナノ粒子Ａの２ｍｇ／ｋｇ／日の投与により、口腔咽頭力価はプラセボ投与動物と比較して有意に低下した。口腔咽頭スワブ力価は、２、０．６３、０．２ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、それぞれ８匹中１匹、８匹中２匹、８匹中３匹でのみ検出された。口腔咽頭スワブ力価は、プラセボ投与群８匹中６匹で検出された。
いずれの動物においても投与による副作用は認められなかった。投与後に体重が減少しなかったことも、ハムスターにおいて投与の忍容性が良好であったことを示している。
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本明細書に記載されているすべての刊行物、特許出願、及び受託番号は、それぞれの個々の刊行物又は特許出願が、引用されている材料について参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (101)

  1. 配列番号３００又は図１７Ａに記載される配列を有するスパイクタンパク質に結合する単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）を含む組成物であって、前記ｓｄＡＢＤが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ＦＲを含み、前記ｖｈｈＣＤＲ１、ｖｈｈＣＤＲ２及び前記ｖｈｈＣＤＲ３が、図１３、図１５及び図２５に表示されるセットから選択される、組成物。
  2. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列ＧＩ（Ｉ／Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｌ）ＦＧＲＮＡを有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列ＴＲＲ（Ｇ／Ｈ／Ｙ／Ｇ／Ｑ）ＳＩＴＹを有し、前記ｖｈＣＤＲ３が配列ＡＡＤＰＡ（Ｓ／Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ｔ）ＰＡ（Ｐ／Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｖ）ＧＤＹを有する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号５を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７を有する、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号８を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１０を有する、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号１１を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号１２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１３を有する、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号１４を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号１５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１６を有する、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号１７を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号１８を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１９を有する、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号２０を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号２１を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２２を有する、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号２３を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号２４を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２５を有する、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号２６を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号２７を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２８を有する、請求項１に記載の組成物。
  11. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号２９を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号３０を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３１を有する、請求項１に記載の組成物。
  12. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号３２を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号３３を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３４を有する、請求項１に記載の組成物。
  13. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号３５を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号３６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３７を有する、請求項１に記載の組成物。
  14. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号３８を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号３９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４０を有する、請求項１に記載の組成物。
  15. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号４１を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号４２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４３を有する、請求項１に記載の組成物。
  16. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号４４を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号４５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４６を有する、請求項１に記載の組成物。
  17. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号４７を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号４８を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４９を有する、請求項１に記載の組成物。
  18. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号５０を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号５１を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５２を有する、請求項１に記載の組成物。
  19. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号５３を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号５４を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５５を有する、請求項１に記載の組成物。
  20. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号５６を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号５７を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５８を有する、請求項１に記載の組成物。
  21. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号５９を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号６０を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６１を有する、請求項１に記載の組成物。
  22. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号６２を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号６３を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６４を有する、請求項１に記載の組成物。
  23. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号６５を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号６６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６７を有する、請求項１に記載の組成物。
  24. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号６８を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号６９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７０を有する、請求項１に記載の組成物。
  25. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号７１を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号７２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７３を有する、請求項１に記載の組成物。
  26. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号７４を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号７５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７６を有する、請求項１に記載の組成物。
  27. 前記ｓｄＡＢＤのフレームワーク配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４を有する、請求項３～２５のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記組成物が、ドメインリンカーを使用して、前記ｓｄＡＢＤに共有結合されている半減期延長ドメインを更に含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 前記半減期延長ドメインが、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ｓｄＡＢＤ、及びＨＳＡの全部又は一部からなる群から選択される、請求項２６に記載の組成物。
  30. 配列番号３００又は図１７Ａに記載される配列を有するスパイクタンパク質に結合するＭＡＳＣ融合タンパク質を含む組成物であって、前記ＭＡＳＣ融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ＦＲ－ドメインリンカー－ＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ＦＲを含み、前記ｖｈｈＣＤＲ１、ｖｈｈＣＤＲ２及び前記ｖｈｈＣＤＲ３が、図１３、図１５及び図２５に表示されるセットから選択される、組成物。
  31. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列ＧＩ（Ｉ／Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｌ）ＦＧＲＮＡを有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列ＴＲＲ（Ｇ／Ｈ／Ｙ／Ｇ／Ｑ）ＳＩＴＹを有し、前記ｖｈＣＤＲ３が配列ＡＡＤＰＡ（Ｓ／Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ｔ）ＰＡ（Ｐ／Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｖ）ＧＤＹを有する、請求項３０に記載の組成物。
  32. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号５を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７を有する、請求項３０に記載の組成物。
  33. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号８を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１０を有する、請求項３０に記載の組成物。
  34. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号１１を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号１２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１３を有する、請求項３０に記載の組成物。
  35. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号１４を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号１５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１６を有する、請求項３０に記載の組成物。
  36. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号１７を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号１８を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１９を有する、請求項３０に記載の組成物。
  37. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号２０を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号２１を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２２を有する、請求項３０に記載の組成物。
  38. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号２３を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号２４を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２５を有する、請求項３０に記載の組成物。
  39. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号２６を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号２７を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２８を有する、請求項３０に記載の組成物。
  40. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号２９を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号３０を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３１を有する、請求項３０に記載の組成物。
  41. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号３２を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号３３を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３４を有する、請求項３０に記載の組成物。
  42. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号３５を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号３６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３７を有する、請求項３０に記載の組成物。
  43. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号３８を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号３９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４０を有する、請求項３０に記載の組成物。
  44. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号４１を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号４２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４３を有する、請求項３０に記載の組成物。
  45. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号４４を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号４５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４６を有する、請求項３０に記載の組成物。
  46. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号４７を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号４８を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４９を有する、請求項３０に記載の組成物。
  47. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号５０を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号５１を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５２を有する、請求項３０に記載の組成物。
  48. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号５３を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号５４を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５５を有する、請求項３０に記載の組成物。
  49. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号５６を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号５７を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５８を有する、請求項３０に記載の組成物。
  50. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号５９を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号６０を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６１を有する、請求項３０に記載の組成物。
  51. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号６２を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号６３を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６４を有する、請求項３０に記載の組成物。
  52. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号６５を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号６６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６７を有する、請求項３０に記載の組成物。
  53. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号６８を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号６９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７０を有する、請求項３０に記載の組成物。
  54. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号７１を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号７２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７３を有する、請求項３０に記載の組成物。
  55. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号７４を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号７５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７６を有する、請求項３０に記載の組成物。
  56. 前記ｓｄＡＢＤのフレームワーク配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４を有する、請求項３２～５４のいずれか一項に記載の組成物。
  57. 前記組成物が、ドメインリンカーを使用して、前記ｓｄＡＢＤに共有結合されている半減期延長ドメインを更に含む、請求項３０～５４のいずれか一項に記載の組成物。
  58. 前記半減期延長ドメインが、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ｓｄＡＢＤ、及びＨＳＡの全部又は一部からなる群から選択される、請求項５５に記載の組成物。
  59. 配列番号３００又は図１７Ａに記載される配列を有するスパイクタンパク質に結合するＭＡＳＣ融合タンパク質を含む組成物であって、前記ＭＡＳＣ融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ＦＲ－ドメインリンカー－ＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ＦＲ－ドメインリンカー－ＦＲ１－ｖｈＣＤＲ１－ＦＲ２－ｖｈＣＤＲ２－ＦＲ３－ｖｈＣＤＲ３－ＦＲを含み、前記ｖｈｈＣＤＲ１、ｖｈｈＣＤＲ２及び前記ｖｈｈＣＤＲ３が、図１３、図１５及び図２５に表示されるセットから選択される、組成物。
  60. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列ＧＩ（Ｉ／Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｖ／Ｌ）ＦＧＲＮＡを有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列ＴＲＲ（Ｇ／Ｈ／Ｙ／Ｇ／Ｑ）ＳＩＴＹを有し、前記ｖｈＣＤＲ３が配列ＡＡＤＰＡ（Ｓ／Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ｔ）ＰＡ（Ｐ／Ｆ／Ｗ／Ｙ／Ｌ／Ｖ）ＧＤＹを有する、請求項５９に記載の組成物。
  61. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号５を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７を有する、請求項５９に記載の組成物。
  62. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号８を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１０を有する、請求項５９に記載の組成物。
  63. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号１１を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号１２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１３を有する、請求項５９に記載の組成物。
  64. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号１４を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号１５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１６を有する、請求項５９に記載の組成物。
  65. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号１７を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号１８を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号１９を有する、請求項５９に記載の組成物。
  66. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号２０を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号２１を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２２を有する、請求項５９に記載の組成物。
  67. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号２３を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号２４を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２５を有する、請求項５９に記載の組成物。
  68. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号２６を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号２７を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号２８を有する、請求項５９に記載の組成物。
  69. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号２９を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号３０を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３１を有する、請求項５９に記載の組成物。
  70. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号３２を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号３３を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３４を有する、請求項５９に記載の組成物。
  71. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号３５を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号３６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号３７を有する、請求項５９に記載の組成物。
  72. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号３８を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号３９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４０を有する、請求項５９に記載の組成物。
  73. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号４１を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号４２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４３を有する、請求項５９に記載の組成物。
  74. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号４４を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号４５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４６を有する、請求項５９に記載の組成物。
  75. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号４７を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号４８を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号４９を有する、請求項５９に記載の組成物。
  76. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号５０を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号５１を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５２を有する、請求項５９に記載の組成物。
  77. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号５３を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号５４を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５５を有する、請求項５９に記載の組成物。
  78. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号５６を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号５７を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号５８を有する、請求項５９に記載の組成物。
  79. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号５９を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号６０を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６１を有する、請求項５９に記載の組成物。
  80. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号６２を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号６３を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６４を有する、請求項５９に記載の組成物。
  81. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号６５を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号６６を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号６７を有する、請求項５９に記載の組成物。
  82. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号６８を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号６９を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７０を有する、請求項５９に記載の組成物。
  83. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号７１を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号７２を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７３を有する、請求項５９に記載の組成物。
  84. 前記ｖｈＣＤＲ１が配列番号７４を有し、前記ｖｈＣＤＲ２が配列番号７５を有し、ｖｈＣＤＲ３が配列番号７６を有する、請求項５９に記載の組成物。
  85. 前記ｓｄＡＢＤのフレームワーク配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４を有する、請求項６１～８３のいずれか一項に記載の組成物。
  86. 前記組成物が、ドメインリンカーを使用して、前記ｓｄＡＢＤに共有結合されている半減期延長ドメインを更に含む、請求項５９～８３のいずれか一項に記載の組成物。
  87. 前記半減期延長ドメインが、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ｓｄＡＢＤ、及びＨＳＡの全部又は一部からなる群から選択される、請求項８４に記載の組成物。
  88. 請求項１～２９、３０～５８及び５９～８７のいずれか一項に記載の組成物をコードする核酸。
  89. 請求項８８に記載の核酸を含む発現ベクター。
  90. 請求項６０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  91. 請求項１～２９、３０～５８及び５９～８７のいずれか一項に記載の組成物を作製する方法であって、請求項９０に記載の宿主細胞を、前記組成物が発現される条件下で培養することと、前記組成物を回収することとを含む方法。
  92. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスによる感染症を治療又は予防する方法であって、請求項１～２９、３０～５８及び５９～８７のいずれか一項に記載の組成物をヒトに投与し、それによって、前記感染症を治療又は予防することを含む方法。
  93. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスを中和する方法であって、請求項１～２９、３０～５８及び５９～８７のいずれか一項に記載の組成物をヒトに投与し、それによって、前記ウイルスを中和することを含む方法。
  94. 前記投与が、静脈内投与を含む、請求項９２又は９３に記載の方法。
  95. 前記投与が、経鼻投与を含む、請求項９２又は９３に記載の方法。
  96. 前記投与が、吸入を含む、請求項９２又は９３に記載の方法。
  97. 前記吸入が、噴霧器を使用して達成される、請求項９６に記載の方法。
  98. 請求項１～２９、３０～５８及び５９～８７のいずれか一項に記載のＭＡＳＣタンパク質を含む凍結乾燥組成物。
  99. 三量体スパイクタンパク質に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物であって、スパイクタンパク質の各単量体が、配列番号３００又は図１７Ａに記載される配列を有し、前記ＡＢＤが、第１の単量体の第１のエピトープに結合し、第２の単量体の第２のエピトープに結合する、組成物。
  100. 前記第１のエピトープが、ＳＣ２スパイクＲＢＤのＡＣＥ２結合領域内の残基４４６、４４７、４４９、４５３、４５５、４５６、４８３～４８６、４８９～４９０、４９３～４９６、４９８、５０１、及び５０５を含み、前記第２のエピトープが、残基３４２、３４３、３６７、３７１～３７５、４０４、４３６～４４１を含む、請求項９９に記載の組成物。
  101. 三量体スパイクタンパク質に結合するＡＢＤを含む組成物であって、スパイクタンパク質の各単量体が、配列番号３００又は図１７Ａに記載される配列を有し、前記結合が、前記スパイクタンパク質のＲＢＤが、非伸長位置にロックされることをもたらす、組成物。
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