CN116472284A - Sars-cov2中和单结构域抗体构建体 - Google Patents

Abstract

提供了包含与SARS‑CoV2病毒结合的单结构域抗体的抗体，以及使用与SARS‑CoV2病毒结合的单结构域抗体的治疗方法。

Description

SARS-COV2中和单结构域抗体构建体

背景技术

严重急性呼吸综合征冠状病毒2或“SARS-CoV-2”是一种引起冠状病毒病(COVID-19)的病毒株。参见例如戈尔巴伦尼亚(Gorbalenya)AE等人，自然微生物学(NatureMicrobiology).5(4):536-544(2020年3月)。需要进行治疗性处理来解决全球大流行病。

附图说明

图1A和1B描绘了阻断SARS-CoV2病毒(“SC2病毒”)进入的一般策略。如本文所普遍讨论的，SC2病毒的刺突蛋白形成三聚体结构，该三聚体结构在被视为刺突受体结合结构域(RBD)的位置与人类细胞上的ACE2受体的细胞外结构域结合。图1A描绘了空间填充模型，并且图1B使用了带状图。图1B显示，通过阻断ACE2-刺突蛋白相互作用，SC2病毒不能再进入宿主细胞。

图2A、2B和2C显示了刺突三聚体抗原正确结构的验证，其包括残基细胞外结构域(ECD)残基1-1208，稳定突变P986和P987，弗林蛋白酶裂解位点的取代和C末端三聚基序(下文称为“刺突ECD”)。图2A显示了结合人ACE2受体的SC2刺突ECD的结构模型，显示了RBD在刺突ECD内的位置。与其它研究不同的是，在本发明中，刺突ECD被用来生成抗原结合结构域(ABD)。图2B显示，使用低温电子显微术(“低温-EM”)，本文使用了正确的抗原的三聚刺突蛋白ECD结构。图2C描绘了使用刺突ECD-ACE2结合测定进行的抗原验证，显示K_D为44nM，k_a为32.6X 10⁵M^-1s^-1，并且k_d为0.012s^-1。

图3描绘了候选MASC蛋白“AeroNab6”与SC2刺突ECD的结合，该蛋白与ACE2竞争与SC2刺突ECD的结合。MASC蛋白(单体)通过与HA-表位标记的“茎”蛋白融合而展示在酵母表面，该“茎”蛋白将MASC蛋白拴在酵母细胞表面。使展示MASC蛋白的酵母在室温下与1nM纯化的用Alexa 647荧光团标记的刺突ECD(刺突-Alexa647)和10μg/mL抗HA Alexa488抗体(12CA5)在测定缓冲液(20mM HEPES pH 8.0，150mM氯化钠和0.1％牛血清白蛋白)中一起孵育30分钟。随后用测定缓冲液清洗酵母以去除未结合的刺突ECD，并通过流式细胞术评估刺突ECD在酵母表面的结合量。Alexa 647和Alexa 488荧光的同时存在表明刺突ECD结合。为了评估与ACE2的竞争，用1.4μM ACE2-Fc(包括ACE2 ECD与人IgG1 Fc结构域的融合蛋白)重复上述测定。Alexa 647荧光的减少对应于刺突ECD结合的丧失，表明MASC蛋白在与ACE2竞争的表位与刺突ECD结合。

图4A和4B描绘了刺突蛋白三聚体的RBD结构域的“向上”和“向下”构象示意图。图4A显示了左侧“向下”或“关闭”位置的低温-EM结构，以及在右侧“延伸”或“开启”位置与ACE2受体接合。RBD必须延伸以便与ACE2受体接合。图4B显示了MASC蛋白单体AeroNab6的低温-EM结构，分辨率约为表明AeroNab6 MASC单体与左侧刺突三聚体的“向下”构象结合，从而阻止ACE2的结合。图4B的右侧是该结构的俯视图，显示了与刺突三聚体接合的三个AeroNab6单体。此外，此结构显示了AeroNab6 MASC蛋白的多聚体形式的最小接头长度，该蛋白同时结合了超过一个的RBD。在“向下”状态下，与刺突ECD结合的单个AeroNab6单体的N末端和C末端之间的距离为/>这需要>15个氨基酸来桥接单个亚单位，以同时接合多个RBD单体。

图5A和5B描绘了本发明的MASC蛋白的作用机制。图5A显示AeroNab6 MASC蛋白利用CDR1和CDR2与三聚体的一个RBD接合，并利用CDR3与三聚体的第二个RBD接合。这对于以极高的亲和力将RBD锁定在“关闭”位置极为有效，下文将进一步讨论。此结构还识别了促进亲和力成熟的接触残基。如下文进一步讨论的，AeroNab6MASC在SC2刺突RBD的ACE2结合区内进行了广泛的接触，包含残基446、447、449、453、455、456、483-486、489-490、493-496、498、501和505。AeroNab6 MASC的CDR3在由残基342、343、367、371-375、404、436-441定义的三维表位处与SC2刺突上的邻近RBD接触。这种额外的接触使AeroNab6 MASC能够将邻近的RBD锁定在“关闭”位置，同时破坏ACE2在邻近RBD的结合。图5B显示了AeroNab6 MASC分子与刺突蛋白的结合位点和ACE2与刺突蛋白的结合位点之间的重叠。这种重叠解释了AeroNab6MASC单体仍然阻止ACE2与单体RBD结合的事实。

图6A、6B和6C描绘了效力随较高价MASC蛋白的制备而增加。图6A显示了单体AeroNab6结合动力学，KD值为210nM。图6B显示了二聚MASC融合蛋白的结合亲和力的增加，并且图6C显示了三聚MASC融合蛋白的进一步增加。二聚和三聚融合蛋白之间解离动力学的进一步降低表明三聚MASC对所有三个SC2刺突RBD的接合。

图7A和7B显示了一个MASC单体AeroNab6的亲和力成熟。图7A显示与第一个RBD结合的vhhCDR1和vhhCDR2发生了突变，并且与刺突三聚体的第二个RBD结合的vhhCDR3发生了突变。图7B显示了通过表面等离子体共振(SPR)测量的亲本蛋白AeroNab6和一个亲和力成熟的候选物AeroNab6_m的结合动力学。对于这个特定的抗原结合结构域，与刺突蛋白的结合增强了500倍。

图8A、8B和8C显示了亲和力成熟的MASC蛋白候选物AeroNab6_mX3的结合亲和力的增加。图8A是亲本AeroNab6，AeroNab6_m是亲和力成熟的蛋白，并且AeroNab6_mX3是设计为与三聚刺突蛋白结合的三聚体形式，该结合通过SPR测量。令人惊讶和意外的是，三聚AeroNab6_mX3与刺突蛋白解离的半衰期为至少数周。由单体解离动力学和三个RBD的同时接合预测的AeroNab6_mX3的理论解离半衰期是>100年。

图9A、9B和9C描绘了AeroNab6 MASC蛋白的成功人源化。图9A显示了AeroNab6的起始动力学参数，图9B显示了美洲驼框架区。如图9C所示，CDR被移植到人重链框架(IGHV3-66)上。如图17所示，人源化版本AeroNabh在人IGHV3-66序列中只有两个氨基酸取代。如图9D所示，人源化取代并没有造成对刺突蛋白亲和力的明显损失。

图10描绘了假病毒中和测定，其利用了含有SARS-CoV2刺突蛋白的慢病毒构建体对表达人ACE2的HEK293细胞的感染。如图所示，三聚MASC融合蛋白显示出比MASC单体更高的中和作用。此外，亲和力成熟的MASC蛋白也显示出增加的效力。

图11显示了真实的病毒中和测定，其测量了所示MASC测试物对VeroE6细胞的SARS-CoV2感染的抑制作用，在72小时后进行病毒定量。如图所示，三聚MASC融合蛋白显示出比MASC单体更高的中和作用。此外，亲和力成熟的MASC蛋白也显示出更高的效力。对真实SARS-CoV2的中和作用是使用斑块还原中和测试进行的。将MASC蛋白在培养基中连续稀释，并与100μL 500TCID50的SARS-CoV2混合1小时。将该混合物加入到VeroE6细胞中并孵育1小时，之后用固体支持物覆盖细胞以允许形成斑块，并在第3天对其进行量化。使用3参数逻辑回归确定半数最大抑制浓度(IC50)。

图12显示了一些数据的总结表格，其中标明了MASC蛋白集。

图13描绘了原始筛选中一些sdABD的序列，包含CDR和每个框架，注意到一些原始克隆中的FR2也被改变了。

图14描绘了与图13中的克隆对应的MASC蛋白的sdABD的全长序列。

图15描绘了本发明的一些不同的MASC蛋白的框架骨架和CDR集。

图16描绘了基于本文所公开的CDR的一些MASC单体的sdABD序列。

图17A和17B描绘了本发明中使用的一些序列。图17A描绘了用于生成本文数据的刺突抗原的序列，并且图17B是人ACE2细胞外结构域(ECD)的序列。用于MASC蛋白识别的SC2刺突ECD使用编码SARS-Cov2的残基1-1208的构建体，该构建体具有在986/987处的脯氨酸取代，和弗林蛋白酶裂解位点的取代(残基682-685的GSAS)。包含C末端T4 fibritin三聚基序，然后是鼻病毒3C蛋白酶裂解位点，8x组氨酸标签和Twin Strep标签(如若普(Wrapp)等人，科学(Science)2020中所述)。SC2刺突ECD构建体按照制造商的说明在Expi293或ExpiCHO细胞(赛默公司(Thermo))中表达。SC2刺突ECD通过金属亲和力和尺寸排除色谱法的组合纯化。

图18描绘了在本发明中特别使用的一些序列。每个CDR都有下划线，并且sdABD和接头之间的联结显示为斜线(“/”)。

图19描绘了三聚MASC融合蛋白AeroNab6X3的显著冻干稳定性。通过superdexS200凝胶过滤或SPR分析对固定刺突蛋白进行的冻干前和冻干后测量表明，本发明的MASC融合蛋白在冻干后不会发生聚集、变性或活性损失，因为保留了结合。

图20A、20B和20C显示了三聚MASC融合蛋白AeroNab6X3对气溶胶化的显著稳定性。图18A显示了产生3.5μm液滴的廉价雾化器。使用Superdex S200凝胶过滤的结果显示将气溶胶化前(图18B)和气溶胶化后(图18C)相比，融合蛋白对气溶胶化是稳定的，没有聚集或变性。

图21显示了实例2中实现的亲和力的显著增加。将展示NbCOV6的纳米抗体变体的酵母与荧光SARS-Cov2刺突受体结合结构域(RBD)一起孵育。通过流式细胞术对与酵母细胞表面结合的RBD的量进行量化。与亲本NbCOV6相比，亲和力成熟的变体池滴定的效力增加，表明与受体结合结构域的亲和力更高。

图22显示了使用固定SC2刺突ECD测量的原始亲本抗刺突MASC蛋白的SPR亲和力的比较。

图23显示了使用固定SC2刺突ECD测量的一些MASC蛋白和融合蛋白的SPR亲和力的比较。

图24显示了AeroNab6的人源化策略，表明亲本克隆与人IGHV3-66序列的密切相似性。

图25显示了有用的CDR集和本发明的框架区。

图26显示了使用AeroNab6mh sdABD和NbCOV003 sdABD的两个二聚MASC构建体的序列。

图27显示了支持实例4的数据。

图28显示了支持实例4的数据。

图29显示了支持实例4的数据。

图30显示了支持实例4的数据。

图31显示了支持实例4的数据。

图32显示了Nb6的低温-EM工作流程。该流程图显示了刺突^S2P-Nb6复合物的分类工作流程，产生了开放和封闭的刺突^S2P构象。从上到下，用封闭构象的apo-刺突^S2P的低通滤波2D反投影集来模板挑取颗粒。利用由截断的从头工作生成的两个初始类别，以及/>低通滤波体积的封闭构象的apo-刺突^S2P使2D类的提取颗粒(表明各种刺突^S2P视图)在cryoSPARC中进行一轮异质精修。使用来自cryoSPARC 3D分类的相同输入体积，低通滤波至T＝8，使刺突^S2P 3D类的颗粒在RELION中进行3D类的25次迭代而不进行比对分为6类。使代表开放和封闭刺突^S2P构象的类别的颗粒导入cisTEM以供自动精修。用pyEM生成视角分布图，并用ChimeraX进行可视化。如图S3所示，使精修的半图导入cryoSPARC以供局部分辨率估计。

图33显示了Nb11的低温-EM工作流程。刺突^S2P-Nb11复合物的分类工作流程产生开放和封闭的刺突^S2P构象。用封闭构象的apo-刺突^S2P的低通滤波2D反投影集从两个单独的集合模板挑取颗粒。在使用/>低通滤波体积的封闭构象的apo-刺突^S2P和额外的去除非刺突^S2P颗粒的初始类别在cryoSPARC中进行广泛的异质精修之前，使提取的颗粒傅里叶裁剪为128像素。在cryoSPARC显微照片管理和异质精修之后，减去ACE2 RBD::纳米抗体界面以外所有区对应的刺突^S2P密度。在ACE2 RBD::纳米抗体界面周围生成掩膜，并将该掩膜用于RELION中的多轮3D分类而不进行比对。在RELION中进行精修之前，选择代表开放和封闭刺突^S2P构象的类别的颗粒，不对其进行缩减，对其进行合并。用pyEM生成视角分布图，并用ChimeraX进行可视化。如图S3所示，使精修的半图导入cryoSPARC以供局部分辨率估计。

图34显示了低温-EM图和模型的分辨率。A.在cryoSPARC中生成的刺突^S2P复合物的局部分辨率估计。所有图(除mNb6外)都以相同的闭合体积显示。如图所示，所有图的颜色都在同一比例尺上。B.在cryoSPARC中计算的低温-EM图的金标准傅里叶壳层相关(GSFSC)图。括号内的分辨率值代表FSC＝0.143的值(虚线)。C.在Phenix中计算的模型与图的相关性。括号内的分辨率值代表FSC＝0.5的值(虚线)。

图35显示了多聚体纳米抗体设计的距离建模。A.封闭状态的刺突^S2P:Nb6复合物的模型。相邻Nb6的N末端和C末端之间的最小距离是(虚线)。B.开放状态的刺突^S2P:Nb6复合物的模型，Nb6停入向上状态的RBD的低温-EM密度。两个纳米抗体的N末端和C末端之间的最小距离是/>Nb6不能结合开放刺突^S2P中的RBD2，因为这将与RBD3发生立体冲突。C.封闭状态的刺突^S2P:Nb11复合物的模型。相邻Nb6的N末端和C末端之间的最小距离是/>(虚线)。D.开放状态的刺突^S2P:Nb11复合物。在与向下状态的RBD2和向上状态的RBD3结合的Nb11之间，相邻Nb6的N末端和C末端之间的最小距离是/>对于B，使A的Nb6的模型停入低温-EM图中，以使得能够对N末端和C末端之间的距离进行建模。对于C和D，使通用的纳米抗体停入低温-EM图中，以对N末端和C末端之间的距离进行建模。

图36显示了刺突^S2P的辐射分解羟基自由基足迹。A.刺突^S2P和Nb3-刺突^S2P复合物之间在所有残基处的氧化率变化。在N末端结构域观察到在刺突^S2P-Nb3复合物中的高度保护的残基簇。B.Nb3与刺突^S2P结合后，两个(M177,H207)受保护最多的残基的氧化率图。标有星号的数据点被排除在速率计算之外，因为这些值落在一阶反应之外，这可能是由于广泛的氧化介导损伤。C.在所有RBD向下构象中映射到刺突的氧化率变化。

图37显示了多价Nb3构建体抑制刺突^S2P:ACE2相互作用。A.固定刺突^S2P的SPR实验表明，Nb3和单价ACE2可以同时结合刺突^S2P。Nb3和单价ACE2的顺序并不影响第二个试剂的结合。因此，Nb3不会抑制刺突^S2P与单价ACE2的结合。B.单价或三价Nb3对1nM刺突^S2P-Alexa647与表达ACE2的HEK293T细胞结合的纳米抗体抑制。对于Nb3-tri，n＝2次生物学重复。所有的误差条代表s.e.m。

图38显示了mNb6的低温EM工作流程。刺突^S2P-mNb6复合物的分类工作流程产生封闭的刺突^S2P构象。从上到下，用封闭构象的apo-刺突^S2P的低通滤波2D反投影集从两个单独的集合模板挑取颗粒。在2D分类之前，使提取的颗粒傅里叶裁剪为96像素。选择刺突^S2P2D类的颗粒以用于使用/>低通滤波体积的封闭构象的apo-刺突^S2P和额外的去除非刺突^S2P颗粒的初始类别在cryoSPARC中进行一轮异质精修。在RELION中，使用cryoSPARC 3D分类的相同输入体积，低通滤波至/>T＝8，使刺突^S2P 3D类的颗粒进行两轮3D分类而不进行比对分为6类。使刺突^S2P封闭构象的合并颗粒导出到cisTEM以供自动精修，然后使用RBD::纳米抗体界面周围的掩膜进行局部精修。用pyEM生成视角分布图，并用ChimeraX进行可视化。如图S3所示，使精修的半图导入cryoSPARC以供局部分辨率估计。

图39显示了mNb6和Nb3-tri对病毒的中和作用是相加的。随着Nb3-tri浓度的增加，mNb6抑制表达ACE2的HEK293T细胞的假型慢病毒感染。mNb6的中和作用与Nb3-tri是相加的，这由Nb3-tri的亚饱和剂量下的抑制活性所证明。然而，mNb6的效力未被Nb3-tri改变，表明对病毒中和作用没有协同作用。

图40显示了Nb6及其衍生物的稳定性。A.由在204nm处摩尔椭圆度的圆二色性测量评估的纳米抗体的热变性。指出每个纳米抗体的表观熔化温度(T_m)。B.在25℃或50℃孵育1小时后或气溶胶化后，纳米抗体对1nM刺突^S2P-Alexa 647与表达ACE2的HEK293T细胞的结合的抑制。C.气溶胶化、冻干或50℃热处理1小时后，mNb6-tri对表达ACE2的HEK293T细胞的假型慢病毒感染的抑制。

图41显示了纳米抗体在中和测定中的亲和力和功效。^a给出了Nb6、Nb11、Nb15、Nb19的n＝5个生物学重复的平均值，所有其它纳米抗体都用n＝3个生物学重复进行测试。^b给出了Nb12、Nb17和Nb11-tri的n＝2个生物学重复的平均值，所有其它纳米抗体都用n＝3个生物学重复进行测试。^c对于Nb3、Nb3-bi和Nb3-tri，n＝2个生物学重复的平均值。对于所有其它纳米抗体，n＝3个生物学重复。^d Nb3、Nb17和Nb18的表达量分别为每升大肠杆菌培养物41.3毫克、4.0毫克和2.2毫克。根据尺寸排除色谱法，Nb3在GE S200增加10x300柱上是单分散的，而Nb17和Nb18是多分散的。NB——无结合。NC——无竞争。NP——未进行。

图42显示了低温电子显微术的数据收集和精修统计。

图43显示了X射线晶体学的数据收集和精修统计。

图44显示了X射线晶体学的数据收集和精修统计。^a括号内的值对应于最高分辨率壳层。^b R_合并＝Σ|I-<I>|/ΣI。

图45显示了纳米抗体表达质粒。

图46显示了AeroNab6mhx3的生物物理稳定性。AeroNab6mhx3对热变性有抗性。随着温度的升高，所测量的AeroNabs的圆二色性显示在204nm处的β-片特征损失。解链温度(Tm)按照50％的信号损失计算。

图47显示了与mNb6结合的刺突结构。与刺突结合的mNb6的低温-EM结构显示了封闭的刺突构象的稳定性。

图48显示了mNb6的X射线结构(apo-和刺突-结合)。CDR1和CDR3通过适应性拟合机制结合。

图49显示了初筛的其它纳米抗体。

图50显示了AeroNab3靶向变构表位。指定剂量的AeroNab构建体抑制SARS-CoV2对VeroE6细胞的感染。72小时后对病毒斑块进行量化。AeroNab3靶向刺突上的独特表位来中和病毒感染。

图51显示了实例5的传播研究的实验设计。

图52显示了实例5的功效研究的实验设计。

图53显示了如实例5所述，在与SARS-CoV-2感染的动物共同居住之前，用纳米颗粒A处理后的金色叙利亚仓鼠的肺部病毒滴度。

图54显示了如实例5所述，在与SARS-CoV-2感染的动物共同居住之前，用纳米颗粒A处理后的金色叙利亚仓鼠的口咽拭子病毒滴度。

图55显示了如实例5所述，用纳米颗粒A处理并感染有SARS-CoV-2的金色叙利亚仓鼠的肺部病毒滴度。

图56显示了如实例5所述，用纳米颗粒A处理并感染有SARS-CoV-2的金色叙利亚仓鼠的口咽拭子病毒滴度。

图57显示了，对于传播研究，5周龄的金色叙利亚仓鼠在受到SARS-CoV-2攻击后和在与受感染动物共同居住前用纳米颗粒A处理后的初始体重百分比。(n＝4只仓鼠/感染组，n＝8只仓鼠/未感染组)形状符号相同的动物共同居住。闭合圆圈和闭合方块表示的组在研究第0天被感染。开放圆圈表示的动物在与第1组的动物共同居住前是未感染的和安慰剂处理的，该共同居住为每天4小时，持续3天。开放方块表示的动物在与第3组的动物共同居住前是未感染的和纳米颗粒A处理的。在用单因素ANOVA比较时，初始体重百分比的差异没有统计学意义。

图58显示了，对于实例5中概述的传播研究，5周龄金色叙利亚仓鼠在受到SARS-CoV-2攻击后和在与受感染的动物共同居住前用纳米颗粒A处理后的肺部病毒滴度。形状符号相同的动物共同居住。闭合圆圈和闭合方块表示的组在研究第0天被感染。开放圆圈表示的动物在与第1组的动物共同居住前是未感染的和安慰剂处理的，该共同居住为每天4小时，持续3天。开放方块表示的动物在与第3组的动物共同居住前是未感染的和纳米颗粒A处理的。纳米颗粒A处理显著降低了与SARS-CoV-2感染动物共同居住的未感染动物的肺部病毒滴度。

图59显示了，对于实例5中概述的传播研究，5周龄金色叙利亚仓鼠在受到SARS-CoV-2攻击后和在与受感染的动物共同居住前用纳米颗粒A处理后的肺部重量。形状符号相同的动物共同居住。闭合圆圈和闭合方块表示的组在研究第0天被感染。开放圆圈表示的动物在与第1组的动物共同居住前是未感染的和安慰剂处理的，该共同居住为每天4小时，持续3天。开放方块表示的动物在与第3组的动物共同居住前是未感染的和纳米颗粒A处理的。在用单因素ANOVA比较时，各组之间的肺部重量没有统计学上的差异。

图60显示了，对于实例5中概述的传播研究，5周龄金色叙利亚仓鼠在受到SARS-CoV-2攻击后和在与受感染的动物共同居住前用纳米颗粒A处理后的口咽拭子病毒滴度。形状符号相同的动物共同居住。闭合圆圈和闭合方块表示的组在研究第0天被感染。开放圆圈表示的动物在与第1组的动物共同居住前是未感染的和安慰剂处理的，该共同居住为每天4小时，持续3天。开放方块表示的动物在与第3组的动物共同居住前是未感染的和纳米颗粒A处理的。单因素ANOVA确定口咽拭子病毒滴度无显著差异。

图61显示了，对于实例5的功效研究，5周龄金色叙利亚仓鼠用纳米颗粒A处理和感染SARS-CoV-2后的初始体重百分比。(n＝8只仓鼠/组)在感染前2小时开始用纳米颗粒A处理。在用单因素ANOVA比较时，初始体重百分比的差异没有统计学意义。

图62显示了5周龄金色叙利亚仓鼠用纳米颗粒A处理和感染SARS-CoV-2后的肺部病毒滴度。与安慰剂处理的动物相比，开始以2mg/kg/d和0.63mg/kg/d的剂量用纳米颗粒A处理显著降低了肺部病毒滴度。(**与安慰剂处理的动物相比，P<0.01)。

图63显示了5周龄金色叙利亚仓鼠在受到SARS-CoV-2攻击后和在与受感染的动物共同居住前用纳米颗粒A处理后的肺部重量。在用单因素ANOVA比较时，各组之间的肺部重量没有统计学上的差异。

图64显示了，对于实例5的功效研究，5周龄金色叙利亚仓鼠用纳米颗粒A处理和感染SARS-CoV-2后的口咽拭子病毒滴度。以2mg/kg/d的剂量用纳米颗粒A处理显著降低了感染SARS-CoV-2的仓鼠的口咽拭子滴度。(*与安慰剂处理的动物相比，P<0.05。)

具体实施方式

A.定义

如本文所使用的“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指20种天然存在的氨基酸中的一种或可存在于特定的定义位置处的任何非天然类似物。在许多实施例中，“氨基酸”意指20种天然存在的氨基酸中的一种。本文的“蛋白”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包含蛋白、多肽、寡肽和肽。

本文的“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或者与蛋白化学连接的部分的变更。例如，修饰可以是连接至蛋白之变更的碳水化合物或PEG结构。为了清楚起见，除非另有说明，否则氨基酸修饰总是指由DNA编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中有密码子的20种氨基酸。本文中的较佳氨基酸修饰是取代。

本文的“氨基酸取代”或“取代”意指用不同氨基酸替换在亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸。具体地，在一些实施例中，取代是不在特定位置天然存在的氨基酸，即不在有机体内天然存在或不在任何有机体中天然存在的氨基酸。为清楚起见，工程改造为改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)更换为CGA(仍编码精氨酸)以提高宿主生物体的表达水平)的蛋白不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管创建了编码相同蛋白的新基因，但如果该蛋白在起始的特定位置具有相同的氨基酸，就不是氨基酸取代。

如本文所使用的“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸序列的添加。

如本文所使用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸序列的移除。

本发明的多肽特异性地与本文概述的刺突三聚蛋白结合。“特异性结合”或“特异性结合于”特定抗原或表位，或“对”特定抗原或表位“具有特异性”意指与非特异性相互作用可测量地不同的结合。特异性结合可以例如通过与对照分子的结合相比测定分子的结合来测量，该对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，可以通过与类似于靶标的对照分子竞争来确定特异性结合。

对特定抗原或表位的特异性结合可以表现为例如抗原结合结构域(SBD)对抗原或表位的KD为至少约10^-4M、至少约10^-5M、至少约10^-6M、至少约10^-7M、至少约10^-8M、至少约10^{- 9}M、可替代地至少约10^-10M、至少约10^-11M、至少约10^-12M、至少约10^-13M、至少约10^-14M、至少约10^-15M或更大，其中KD是指特定ABD-抗原相互作用的解离速率。通常情况下，特异性结合抗原的ABD的KD是对照分子对抗原或表位的KD的20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。

另外，针对特定抗原或表位的特异性结合可以通过例如抗体表现，所述抗体对抗原或表位的KA或Ka是对照物针对所述表位的KA或Ka的至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍，其中KA或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率。一般使用本领域已知的Biacore分析或Octet来测量结合亲和力。

如本文所使用的“亲本多肽”或“前体多肽”(包含本发明重新列举的抗刺突抗原结合结构域)意指随后被修饰以生成变体的多肽。在这种情况下，例如，图13的起始克隆中的任何一个都可以被认为是“亲本多肽”，AeroNab6的情况就是如此。亲本多肽可以指多肽本身，包括亲本多肽的组合物，或编码它的氨基酸序列。

本发明的多肽与本文所述的序列具有至少约90％、91％、92％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％的序列同一性。

如本文所使用的“位置”意指蛋白序列中的位置。位置可以按顺序编号，或者可以按照既定格式编号。

本文的“可变重结构域”或“VH结构域”或“VHH结构域”意指含有CDR的抗原结合结构域的区。本文讨论的分子不含VL结构域。在这些实施例中，每个VH由三个高变区(“互补决定区”，“CDR”)和四个“框架区”或“FR”构成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1-vhhCDR1-FR2-vhhCDR2-FR3-vhhCDR3-FR4。vhFR区自组合形成作为Fv结构域的sdABD。通常基于骆驼科抗体技术，本文的“单结构域Fv”、“sdFv”或“sdABD”意指只有三个CDR的抗原结合结构域。参见蛋白质工程(Protein Engineering)9(7):1129-35(1994)；分子生物技术综述(Rev Mol Biotech)74:277-302(2001)；生物化学年报(Ann Rev Biochem)82:775-97(2013)。sdABD与单结构域抗体的区别在于缺少恒定结构域(对于骆驼科抗体是CH2-CH3结构域)。

高变区赋予抗原结合特异性，并且一般涵盖来自轻链可变区中约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)，以及重链可变区中约31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)周围的氨基酸残基；卡巴特(Kabat)等人，免疫学相关蛋白的序列(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST)，第5版，公共卫生服务(Public Health Service),国家卫生研究院(National Institutes ofHealth),马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Md.)(1991)，和/或那些形成高变环的残基(例如，轻链可变区的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3))；乔斯亚(Chothia)和莱斯克(Lesk)(1987)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196:901-917。本发明的具体CDR描述如下。

如本文所述，刺突抗原由图17A中发现的序列和/或以下序列定义：MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLAD AGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO:300)。此序列被解释为包含可能不时出现的SARS-CoV-2中的突变所产生的变体。在各种实施例中，变体与上述序列的不同之处在于刺突蛋白的ACE2结合结构域。在一些实施例中，变体与上述序列的不同之处在于ACE2结合结构域以外的位点。在一些实施例中，变体与上述序列的不同之处在于至少ACE2结合结构域和一个其它位点。在各种实施例中，变体与上述序列的不同之处在于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸。

如本领域技术人员将理解，CDR的确切编号和放置在不同编号系统之间可以是不同的。然而，应理解，可变重和/或可变轻序列的公开包含相关(固有)CDR的公开。因此，每个可变重区的公开是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开。

CDR编号的有用比较如下，参见拉弗朗斯(Lafranc)等人，发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)27(1):55-77(2003)：

表1

在本说明书中，当提及可变结构域中的残基时，一般使用IMGT编号系统。

本发明提供了大量可以组装成sdABD的不同CDR集。在单结构域ABD(“sdABD”)的背景下，CDR集仅是三个CDR；这些有时在本领域也被称为“VHH”结构域。

CDR有助于形成抗原结合，或更具体地为表位结合位点。“表位”是指与被称为补位的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的决定簇。表位是如氨基酸或糖侧链的分子的聚组，并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单一抗原可以具有多于一个表位。

表位可包括直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹内。

表位可以是构象的也可以是线性的。构象表位通过来自线性多肽链的不同区段的空间并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象和非构象表位的区别可以在于在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合丧失。

呈独特空间构象的表位通常包括至少3个并且更通常至少5个或8到10个氨基酸。可以在展示一种抗体阻断另一种抗体与目标抗原结合的能力的简单免疫测定(例如“分库(binning)”)中检验识别相同表位的抗体。如下所概述，本发明不仅包含本文列举的抗原结合结构域和抗体，还包含竞争与所列举的抗原结合结构域结合的表位结合的抗原结合结构域和抗体。

B.引言

如本领域所知，冠状病毒是包膜的正链RNA病毒，其依靠膜融合作为进入宿主细胞的早期步骤。此外，许多冠状病毒(特别是SARS-CoV2)的表面都装饰有刺突糖蛋白。刺突蛋白形成三个相同的刺突蛋白单体的同源三聚体复合物，其在功能上可分为两个不同的亚单位，即S1和S2。S1亚单位含有与人类细胞上的ACE2受体结合的受体结合结构域(RBD)，而S2亚单位参与病毒膜和细胞膜的融合。三聚体复合物的RBD可以呈两种不同的构象：如图4所描绘的可与ACE2复合物结合的延伸或“向上”构象(有时在本文也称为“开放”构象)；以及也如图4所描绘的代表受体不可及状态的“向下”或“关闭”构象。也就是说，刺突蛋白在呈“向下”构象时不能与ACE2受体结合并且不能感染细胞。

本发明涉及抗原结合结构域，其不仅与刺突蛋白结合，而且其结合方式是以极高的亲和力将刺突蛋白“锁定”在“关闭”或“向下”位置。如图5所示，本发明的MASC蛋白的结合实际上与(在三聚体中存在的三个RBD中的)两个不同的RBD结合，因此不仅使刺突蛋白“关闭”，而且还占据ACE2结合位点的一部分以进一步防止膜融合和感染。

本发明提供与抗原结合结构域(ABD)的多价抗SARS-CoV2(“MASC”)融合蛋白，其以多价方式以极高亲和力与SARS-CoV2病毒的三聚刺突蛋白结合。抗原结合结构域是基于单结构域抗体(sdAb)的，该sdAb含有单可变重结构域(在本领域经常被称为“VHH”结构域)，而不是传统抗体的典型可变重和可变轻结构域。单结构域抗原结合结构域(sdABD)在其结合病毒蛋白的用途中有许多优势，因为它们显著小于传统ABD，通常具有高热稳定性，并增加了溶解度，下面将进一步讨论。

此外，正如对其它sdABD所显示的那样，本发明的sdABD可以组装成多聚体结构，如二聚体和三聚体，类似于其它“纳米抗体^TM”；一般参见美国专利第9,834,595号。因此，如下文所更充分地描述的，本发明提供了多价抗SARS-CoV2(“MASC”)融合蛋白，其含有通过结构域接头连接在一起的sdABD，该sdABD与刺突蛋白结合并防止病毒经由ACE2受体进入人类细胞，如下文所进一步讨论的。

在这些多价实施例中，本发明的融合蛋白有几个不同的组分，在本文一般称为结构域，其根据形式以各种方式连接在一起。结构域中的一些是各自与靶刺突蛋白结合的结合结构域，并且一些是结构域接头。因此，如图6所一般图示的，本发明提供包括与RBD结合的单一sdABD的MASC蛋白，以及含有两个使用结构域接头连接的sdABD(sdABD-结构域接头-sdABD)的MASC融合蛋白和含有三个使用结构域接头连接的sdABD(sdABD-结构域接头-sdABD-结构域接头-sdABD)的MASC融合蛋白。如下文所讨论的，这些结构域接头可以是相同的或不同的。

本发明的MASC融合蛋白的另一个明显优势是，由于其显著的热稳定性和结构稳定性，MASC融合蛋白可以被冻干和/或气溶胶化同时保留结合和中和功能。将这些MASC融合蛋白直接施用于肺部系统的可能性对于SARS-CoV2病毒来说特别有用，因为已知它特异性地作用于肺部。

因此，本发明提供了MASC蛋白和MASC融合蛋白，如在本文进一步描述的。

C.多价抗SARS-CoV2(“MASC”)蛋白

因此，本发明提供的MASC蛋白可以采取几种不同的形式。如本文所讨论的，MASC蛋白可以是本文概述的单一sdABD，有时在本文中被称为“单体MASC蛋白”。MASC蛋白也可以连接在一起以形成如本文所讨论的二聚体和三聚体。在这些实施例中，二聚体和三聚体一般被称为“MASC融合蛋白”，并且在单体之间存在结构域接头。

如本领域技术人员所理解的和下面更充分描述的，除了单一sdABD的多聚体外，还可以使用具有不同结合亲和力或特性的sdABD制备多聚体。也就是说，二聚MASC融合蛋白可以是“同源二聚体”，其中sdABD具有相同的CDR和/或序列，或者是“异源二聚体”，其中一个sdABD具有一个CDR集，另一个具有不同的CDR集。类似地，三聚MASC融合蛋白可以是同源三聚体，或者它们可以是异源三聚体，该三聚MASC融合蛋白或者利用两个具有不同CDR的不同sdABD(三聚体中的一个sdABD有两个CDR，另一个sdABD有一个CDR)，或者利用具有含三个不同CDR集的异源三聚体。

此外，如下面更充分讨论的，MASC融合蛋白还可以包含额外的用于延长MASC蛋白在血浆中的半衰期的结构域。因此，例如，单体、二聚或三聚MASC蛋白可以与半衰期延长结构域融合。

如本文所讨论的，最初制备了21个不同的克隆，代表如图13所描绘的各种抗原结合结构域。所有这些克隆都与刺突三聚体结合。

此外，如本文所讨论的，图13中所示的亲本MASC蛋白中的任一个都可以经历亲和力成熟。示范性实例是本文讨论的AeroNab6的亲和力成熟。亲和力成熟活动导致了vhhCDR的一些变化，所有这些变化都可以组合。

类似地，如本领域技术人员所理解的，图13的亲本MASC蛋白或亲和力成熟MASC蛋白也可以被人源化。人源化技术在本领域是众所周知的。

如下文进一步讨论的，AeroNab6 MASC在SC2刺突RBD的ACE2结合区内进行了广泛的接触，包含残基446、447、449、453、455、456、483-486、489-490、493-496、498、501和505。AeroNab6 MASC的CDR3在由残基342、343、367、371-375、404、436-441定义的三维表位处与SC2刺突上的邻近RBD接触。这种额外的接触使AeroNab6MASC能够将邻近RBD锁定在“关闭”位置，同时破坏ACE2在邻近RBD的结合。

此外，本领域已知可能存在源于某些ABD的C末端序列的人类免疫原性。因此，一般来说，当构建体的C末端终止于sdABD时，如这里所描绘的，可以使用组氨酸标签(His6或His10)。这些在一些情况下也可用作纯化标签，但这些序列也可用于降低人类免疫原性，如霍兰德(Holland)等人，DOI 10.1007/s10875-013-9915-0和WO2013/024059所示。

1.单体构建体

在一些实施例中，MASC蛋白是如图6所一般描绘的单一sdABD，并且因此是包括sdABD的组合物，该sdABD从N到C末端包括FR1-vhCDR1-FR2-vhCDR2-FR3-vhCDR3-FR，其中vhhCDR1、vhhCDR2和vhhCDR3结构域选自图13、图15、图18和图25中描绘的集。

在一些单体实施例中，所述vhCDR1具有序列GI(I/Y/W/F/V/L)FGRNA，所述vhCDR2具有序列TRR(G/H/Y/G/Q)SITY，并且所述vhCDR3具有序列AADPA(S/V/L/I/T)PA(P/F/W/Y/L/V)GDY，如上所讨论的。此外，在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ IDNO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:5，vhCDR2具有SEQ ID NO:6，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:7。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:8，vhCDR2具有SEQ ID NO:9，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:10。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:11，vhCDR2具有SEQ ID NO:12，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:13。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:14，vhCDR2具有SEQ ID NO:15，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:16。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:17，vhCDR2具有SEQ ID NO:18，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:19。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:20，vhCDR2具有SEQ ID NO:21，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:22。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:23，vhCDR2具有SEQ ID NO:24，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:25。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:26，vhCDR2具有SEQ ID NO:27，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:28。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:29，vhCDR2具有SEQ ID NO:30，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:31。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:32，vhCDR2具有SEQ ID NO:33，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:34。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:35，vhCDR2具有SEQ ID NO:36，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:37。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:38，vhCDR2具有SEQ ID NO:39，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:40。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:41，vhCDR2具有SEQ ID NO:42，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:43。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:44，vhCDR2具有SEQ ID NO:45，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:46。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:47，vhCDR2具有SEQ ID NO:48，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:49。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:50，vhCDR2具有SEQ ID NO:51，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:52。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:53，vhCDR2具有SEQ ID NO:54，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:55。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:56，vhCDR2具有SEQ ID NO:57，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:58。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:59，vhCDR2具有SEQ ID NO:60，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:61。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:62，vhCDR2具有SEQ ID NO:63，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:64。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:65，vhCDR2具有SEQ ID NO:66，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:67。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:68，vhCDR2具有SEQ ID NO:69，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:70。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:71，vhCDR2具有SEQ ID NO:72，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:73。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一些实施例中，sdABD具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:74，vhCDR2具有SEQ ID NO:75，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:76。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，或者可以不同。

在一个特别有用的实施例中，MASC蛋白是“AeroNab6mh”，并且具有以下序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSIT YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQV TVSS。

2.二聚构建体

在一些实施例中，如图6所一般描绘的，MASC蛋白是MASC融合蛋白并含有两个sdABD，并且因此是包括sdABD的组合物，所述sdABD从N到C末端包括FR1-vhhCDR1-FR2-vhhCDR2-FR3-vhhCDR3-FR4-结构域接头-FR1-vhhCDR1-FR2-vhhCDR2-FR3-vhhCDR3-FR4，其中vhhCDR1、vhhCDR2和vhhCDR3结构域选自图13、图15、图18和图25中描述的集。

在许多实施例中，构成二聚体的两个sdABD是相同的，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

因此，在一些二聚体实施例中，所述vhCDR1具有序列GI(I/Y/W/F/V/L)FGRNA，所述vhCDR2具有序列TRR(G/H/Y/G/Q)SITY，并且所述vhCDR3具有序列AADPA(S/V/L/I/T)PA(P/F/W/Y/L/V)GDY，如上所讨论的。此外，在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头是(GGGGS)₃。

因此，在一些二聚体实施例中，所述vhCDR1具有序列GI(I/Y/W/F/V/L)FGRNA，所述vhCDR2具有序列TRR(G/H/Y/G/Q)SITY，并且所述vhCDR3具有序列AADPA(S/V/L/I/T)PA(P/F/W/Y/L/V)GDY，如上所讨论的。此外，在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头是(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:5，vhCDR2具有SEQ ID NO:6，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:7。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:8，vhCDR2具有SEQ ID NO:9，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:10。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:11，vhCDR2具有SEQ ID NO:12，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:13。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:14，vhCDR2具有SEQ ID NO:15，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:16。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQ ID NO:17，vhCDR2具有SEQ ID NO:18，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:19。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:20，vhCDR2具有SEQ ID NO:21，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:22。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:23，vhCDR2具有SEQ ID NO:24，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:25。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:26，vhCDR2具有SEQ ID NO:27，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:28。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:29，vhCDR2具有SEQ ID NO:30，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:31。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:32，vhCDR2具有SEQ ID NO:33，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:34。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:35，vhCDR2具有SEQ ID NO:36，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:37。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:38，vhCDR2具有SEQ ID NO:39，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:40。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:41，vhCDR2具有SEQ ID NO:42，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:43。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:44，vhCDR2具有SEQ ID NO:45，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:46。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:47，vhCDR2具有SEQ ID NO:48，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:49。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:50，vhCDR2具有SEQ ID NO:51，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:52。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:53，vhCDR2具有SEQ ID NO:54，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:55。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:56，vhCDR2具有SEQ ID NO:57，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:58。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:59，vhCDR2具有SEQ ID NO:60，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:61。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:62，vhCDR2具有SEQ ID NO:63，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:64。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:65，vhCDR2具有SEQ ID NO:66，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:67。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:68，vhCDR2具有SEQ ID NO:69，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:70。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:71，vhCDR2具有SEQ ID NO:72，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:73。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些二聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:74，vhCDR2具有SEQ ID NO:75，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:76。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一个特别有用的实施例中，MASC蛋白是“AeroNab6mhX2”，并且具有以下序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS/GGGGSGGGGSGGGGS/EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS。

在一个特别有用的实施例中，MASC蛋白是“AeroNab6mhX2”，并且具有以下序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS/GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS/EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS。

在一些实施例中，构成二聚体的两个sdABD是不同的。例如，在一个实施例中，sdABD中的一个是“AeroNab6mh”，并且另一个具有NbCoV003、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的CDR；参见图26。

3.三聚构建体

在一些实施例中，如图6所一般描绘的，MASC蛋白是MASC融合蛋白并且含有三个sdABD，并且因此是包括sdABD的组合物，该sdABD从N到C末端包括FR1-vhhCDR1-FR2-vhhCDR2-FR3-vhhCDR3-FR4-结构域接头-FR1-vhhCDR1-FR2-vhhCDR2-FR3-vhhCDR3-FR4，其中vhhCDR1、vhhCDR2和vhhCDR3结构域选自图13、图15、图18和图25中描绘的集。

在许多实施例中，构成三聚体的三个sdABD是相同的，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

因此，在一些三聚体实施例中，所述vhCDR1具有序列GI(I/Y/W/F/V/L)FGRNA，所述vhCDR2具有序列TRR(G/H/Y/G/Q)SITY，并且所述vhCDR3具有序列AADPA(S/V/L/I/T)PA(P/F/W/Y/L/V)GDY，如上所讨论的。此外，在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头是(GGGGS)₃。

因此，在一些三聚体实施例中，所述vhCDR1具有序列GI(I/Y/W/F/V/L)FGRNA，所述vhCDR2具有序列TRR(G/H/Y/G/Q)SITY，并且所述vhCDR3具有序列AADPA(S/V/L/I/T)PA(P/F/W/Y/L/V)GDY，如上所讨论的。此外，在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头是(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:5，vhCDR2具有SEQ ID NO:6，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:7。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:8，vhCDR2具有SEQ ID NO:9，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:10。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:11，vhCDR2具有SEQ ID NO:12，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:13。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:14，vhCDR2具有SEQ ID NO:15，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:16。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:17，vhCDR2具有SEQ ID NO:18，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:19。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:20，vhCDR2具有SEQ ID NO:21，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:22。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:23，vhCDR2具有SEQ ID NO:24，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:25。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:26，vhCDR2具有SEQ ID NO:27，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:28。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:29，vhCDR2具有SEQ ID NO:30，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:31。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:32，vhCDR2具有SEQ ID NO:33，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:34。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:35，vhCDR2具有SEQ ID NO:36，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:37。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:38，vhCDR2具有SEQ ID NO:39，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:40。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:41，vhCDR2具有SEQ ID NO:42，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:43。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:44，vhCDR2具有SEQ ID NO:45，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:46。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:47，vhCDR2具有SEQ ID NO:48，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:49。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:50，vhCDR2具有SEQ ID NO:51，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:52。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:53，vhCDR2具有SEQ ID NO:54，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:55。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:56，vhCDR2具有SEQ ID NO:57，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:58。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:59，vhCDR2具有SEQ ID NO:60，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:61。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:62，vhCDR2具有SEQ ID NO:63，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:64。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:65，vhCDR2具有SEQ ID NO:66，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:67。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:68，vhCDR2具有SEQ ID NO:69，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:70。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:71，vhCDR2具有SEQ ID NO:72，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:73。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一些三聚体实施例中，两个sdABD各自具有含三个CDR的集，其中vhCDR1具有SEQID NO:74，vhCDR2具有SEQ ID NO:75，并且vhCDR3具有SEQ ID NO:76。在此实施例中，框架区可以具有SEQ ID NO:1(FR1)、SEQ ID NO:2(FR2)、SEQ ID NO:3(FR3)和SEQ ID NO:4(FR4)，并且结构域接头选自(GGGGS)₃和(GGGGS)₄。

在一个特别有用的实施例中，MASC蛋白是“AeroNab6mhX3”，并且具有以下序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS/GGGGSGGGGSGGGGS/EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS/GGGGSGGGGSGGGGS/EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS。

在一个特别有用的实施例中，MASC蛋白是“AeroNab6mhX3”，并且具有以下序列：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS/GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS/EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS/GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS/EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKGLELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS。

在一些实施例中，构成二聚体的两个sdABD是不同的。例如，在一个实施例中，sdABD中的一个是“AeroNab6mh”，并且另一个具有NbCoV003、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的CDR。

4.结构域接头

在利用多聚MASC蛋白的实施例中，单体使用“结构域接头”重组连接。虽然可以使用任何合适的接头，但许多实施例利用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包含例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少一的整数(并且一般是从3到4到5)，以及允许重组附接两个结构域的任何肽序列，该结构域的长度和柔性足以允许每个结构域保留其生物功能。如图4所示，与“向下”状态的刺突ECD结合的单个AeroNab6单体的N和C末端之间的距离是这需要≥15个氨基酸来桥接单个亚单位，以同时接合多个RBD单体。因此，特别优选的是(GGGGS)₃和(GGGGS)₄接头。如图23所示，三聚构建体中的(GGGGS)₃和(GGGGS)₄接头都显示出由SPR测量的与刺突蛋白三聚体的良好结合。

5.半衰期延长结构域

MASC蛋白任选包含使得在生理环境(如血浆和肺组织)中的半衰期增加的半衰期延长结构域。此类结构域被认为包含但不限于HSA结合结构域、scFvs或sdABD，以及全部或部分人血清白蛋白，如下文所讨论的。

人血清白蛋白(HSA)(分子质量约67kDa)是血浆中最丰富的蛋白，以约50mg/ml(600uM)存在，并且在人体中的半衰期为约20天。HAS用于维持血浆pH，有助于胶体血压，充当许多代谢物和脂肪酸的载剂，并用作血浆中的主要药物转运蛋白。

与白蛋白的非共价缔合延长了短寿命蛋白的消除半衰期。例如，与单独施用Fab片段相比，在分别向小鼠和兔静脉内施用时，白蛋白结合结构域与Fab片段的重组融合导致体内清除率降低了25倍和58倍，并且半衰期延长了26倍和37倍。在另一个实例中，当胰岛素与脂肪酸酰化以促进与白蛋白的缔合时，在向兔或猪皮下注射时观察到持久的效果。这些研究共同证明了白蛋白结合和延长作用之间的联系。

在一个方面，本文所述的抗原结合蛋白包括半衰期延长结构域，例如与HSA特异性结合的结构域，其附接在MASC蛋白的N或C末端。在许多实施例中，半衰期延长结构域是来自与HSA结合的单结构域抗体的单结构域抗原结合结构域。此结构域在本文一般被称为与人HSA的“sdABD”(sdABD-HSA)，可替代地“sdABD(1/2)”，以区分这些结合结构域与和刺突蛋白的sdABD。合适的sdABD-HSA结构域在本领域是众所周知的，参见例如USP 8,703,131，其中的所有sdABD-HSA结构域(“ALB”，具体包含ALB1、ALB3、ALB4、ALB5、ALB6、ALB7、ALB8、ALB9和ALB10)的序列明确地通过引用并入。类似地，USP 10,100,106含有额外的单结构域白蛋白结合结构域，其序列也具体地通过引用并入本文，包含SEQ ID NO:4、7、9、26和27。

另一个可以与MASC蛋白融合的合适的半衰期结构域是人类HSA本身的全部或部分，还是N或C末端。HSA是相对小的蛋白，大约有65个氨基酸长，并且可以与单体MASC蛋白中的一个或多个融合，正如本领域技术人员所理解的。

抗原结合蛋白的半衰期延长结构域提供了MASC蛋白的药效学和药代动力学变更。如上，半衰期延长结构域延长了消除半衰期。半衰期延长结构域还变更了药效学特性，包含变更抗原结合蛋白的组织分布、渗透和扩散。

D.制备MASC蛋白的方法

本发明的MASC蛋白和融合蛋白的制备如本领域技术人员一般所理解的和下面所概述的。

本发明提供编码本发明的MASC组合物的核酸组合物。如本领域所知，编码本发明组合物的核酸可被并入表达载体，如本领域所知的并取决于用于生产本发明MASC蛋白的宿主细胞。一般来说，核酸与任何数量的调控元件(启动子、复制原点、可选择标记物、核糖体结合位点、诱导剂等)可操作地连接。表达载体可以是染色体外或整合载体。

然后将本发明的核酸和/或表达载体转化到本领域众所周知的任何数量的不同类型的宿主细胞中，包含哺乳动物、细菌、酵母、昆虫和/或真菌细胞，其中在许多实施例中使用哺乳动物细胞(如CHO细胞、293细胞)。

本领域众所周知，本发明的MASC蛋白(包含MASC融合蛋白)通过在导致蛋白表达的条件下培养包括表达载体的宿主细胞然后进行纯化来制备。

E.制剂

根据本发明使用的MASC蛋白的制剂通过将具有所需纯度的蛋白与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(如雷明顿制药科学(Remington's PharmaceuticalSciences)第16版，奥索尔，A.(Osol,A.)编辑[1980]所一般概述的)混合来制备以供以冻干制剂或水溶液形式储存。

F.MASC蛋白的施用

向患者施用包括MASC蛋白和MASC融合蛋白的本发明组合物以预防、治疗或中和患者的SC2病毒或SC2病毒感染。正如最近的报道，似乎人类中ACE2的最高表达是在鼻子里，其中整个下呼吸道的表达减少，对应于SC2感染的梯度，从近端鼻道的高位到远端区域如肺周边的低位(参见侯(Hou)等人，https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.042)，这支持鼻表面可能是感染的主要初始位点的早期假设。然后，感染进入肺部。

因此，正如本领域所理解的，有许多不同的施用途径可以用来施用本发明的MASC蛋白，包含但不限于如本文所概述的使用吸入技术的肺部递送、使用特定制剂的鼻内递送和静脉内施用。

1.吸入疗法

因此，在一些实施例中，将MASC蛋白施用于患者的肺部系统，包含肺部。因此，本发明提供了将本发明的MASC蛋白(包含MASC融合蛋白)递送到呼吸道。

本领域已知，本发明的MASC蛋白的一个益处是它们非常稳定并且因此可以冻干。然后，冻干的蛋白可以在以后重构成液体制剂，然后通过雾化气溶胶化以直接递送到患者的肺部系统。参见例如美国专利第9,393,304号，其描述了一些用于吸入疗法的纳米抗体^TM的冻干技术、条件和制剂。

在某些实施例中，制剂可以使用雾化器施用。在非限制性实例中，雾化器的实例包含射流式雾化器、超声雾化器和振动网雾化器。这些类别使用不同的方法从液体中产生气溶胶。一般来说，任何能够保持这些制剂中蛋白完整性的气溶胶产生装置都适合于递送本文所述的制剂。

在一些实施例中，使用振动网雾化器。振动网雾化器分为被动式和主动式振动网装置(纽曼(Newman)2005,应用疗法研究杂志(J.Appl.Ther.Res.)5:29-33)。被动式振动网装置(例如欧姆龙(Omron)MICROAIR.RTM.NE-U22雾化器)采用具有多达6000微米大小的孔的穿孔板。附接到换能器喇叭上的振动压电晶体在位于其前面的穿孔板上引起“被动”振动，导致液体通过孔挤压并产生气溶胶。主动式振动网装置(例如AERONEB.RTM.Pro雾化器)可以采用“微泵”系统，该系统包括由具有多达1000个圆顶开口的板和振动元件组成的气溶胶发生器，该振动元件在施加电流时收缩和膨胀。这导致网向上和向下移动几微米，挤压液体并生成气溶胶。振动网雾化器的其它实例包含Akita2 Apixneb(艾克蒂维罗(Activaero)，现在的维克图拉(Vectura)，德国)、EFLOW.RTM.(帕瑞有限公司(PARI GmbH),格拉菲林根(Grafelingen),德国；还参见美国专利第5,586,550号)、AERONEB.RTM.(亚罗擎公司(Aerogen,Inc.),桑尼韦尔(Sunnyvale),加利福尼亚州(Calif.)；参见美国专利第5,586,550号、第5,938,117号、第6,014,970号、第6,085,740号、第6,205,999号)或FOX雾化器(艾克蒂维罗，现在的维克图拉，德国)，所有所述雾化器都适合于儿科使用。

在一些实施例中，使用连续流雾化器，特别是在COVID19患者可能也需要氧气的情况下，因此可以使用连续流来维持对患者的连续氧气或空气供应。因此，雾化器可以在有或没有额外空气或O₂流的情况下使用。优选地，雾化器在有额外的空气或O₂流的情况下使用，如2L/min的额外空气或O₂流。

用于向患者递送本发明多肽的示例性吸入装置可包括(a)具有可振动网的气溶胶发生器；(b)用于待雾化液体的储存器，所述储存器与可振动网流体连接；(c)气体进入开口；(d)面罩，其具有外壳、气溶胶进入开口、患者接触表面和外壳中的单向呼气阀或双向吸入/呼气阀，其呼气阻力选择范围为0.5mbar至5mbar；以及(e)从气体入口开口延伸至面罩的气溶胶进入开口的流动通道，该流动通道具有横向开口，气溶胶发生器至少部分地通过该横向开口插入流动通道，气体进入开口和面罩的气溶胶进入开口之间的流动阻力恒定，流速为1L/min至20L/min。

其它向呼吸道递送和/或通过吸入递送的方法是技术人员已知的，并且例如描述于手册“药物递送：原理与应用(Drug Delivery:Principles and Applications)”(2005)，王炳和(Binghe Wang)、特鲁纳·萨哈恩(Teruna Siahaan)、理查德·索特洛(RichardSoltero)(编辑。威利国际科学出版社(Wiley Interscience)(约翰·威利父子出版公司(John Wiley&Sons)))；“药理学测试前TM(第11版增刊)自我评估和综述(PharmacologyPreTest.TM.(11.sup.th Ed.)Self-Assessment and Review)”，罗森菲尔德G.C.(Rosenfeld G.C.),洛斯-米切尔D.S.(Loose-Mitchell D.S.)；和“药理学”(第3版增刊)，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins),纽约(NewYork)；史拉弗M.(Shlafer M.)麦格劳-希尔医学出版部(McGraw-Hill MedicalPublishing Division),纽约(New York)；杨K.Y.(Yang K.Y.),格拉夫L.R.(Graff L.R.),考伊A.B.(Caughey A.B.)蓝图药理学(Blueprints Pharmacology),布莱克韦尔出版社(Blackwell Publishing)。

本发明还涉及药物装置，其适合于通过吸入本发明的MASC蛋白进行递送并适合于使用包括该蛋白的组合物。因此，本发明涉及包括选定剂量的本发明的MASC蛋白的此类装置。

各种吸入系统例如描述于综述("肺部药物递送(Pulmonary Drug Delivery)"，贝赫托尔德-彼得斯(Bechtold-Peters)和吕森(Luessen)编辑，同上)的第129至148页。在本发明的方法中，该装置是用于包括本发明多肽的液体(例如细小固体颗粒或液滴的悬浮液)的吸入器。优选地，这种装置是包括本发明多肽的气溶胶递送系统或雾化器。

本发明方法中使用的气溶胶递送系统可以包括了包括本发明组合物的容器和与之相连的气溶胶发生器。气溶胶发生器被构造和布置为生成本发明组合物的气溶胶。

2.鼻内施用

如上所讨论的，高ACE2表达模式证明鼻腔和鼻表面似乎可能是SC2病毒感染的主要初始位点。

因此，在一些实施例中，MASC蛋白(包含MASC融合蛋白)经由鼻施用作为鼻喷雾施用。存在各种各样的用于鼻内施用MASC蛋白的递送系统，范围从简单的滴剂或喷雾到液体的单位给药系统；参见例如马克思(Marx)等人，鼻内药物施用-对某些药物有吸引力的递送途径(Intranasal Drug Administration–An Attractive Delivery Route for SomeDrugs)；DOI:10.5772/59468。如上，MASC蛋白可以冻干然后重构以用于鼻施用，或者直接作为冻干液体施用。

3.静脉内施用

此外，如本领域技术人员所理解的，本发明的MASC蛋白也可以静脉内施用。

G.诊断SC病毒感染的方法

在一些实施例中，本文所述的一种或多种MASC蛋白可用于检测生物或非生物样品中的SARS-CoV2。例如，使用本领域技术人员已知的若干免疫测定中的任一种，MASC蛋白试剂可用于检测SARS-CoV2的存在或不存在或蛋白表达水平的测定。免疫测定技术和方案一般描述于普赖斯(Price)和纽曼(Newman)，“免疫测定的原理和实践(Principles andPractice of Immunoassay)”，第2版，格罗夫字典(Grove's Dictionaries)，1997；和高斯林(Gosling)，“免疫测定：实践方法(Immunoassays:A Practical Approach)”，牛津大学出版社(Oxford University Press)，2000。可以使用各种免疫测定技术，包含竞争性和非竞争性免疫测定。参见例如塞尔夫(Self)等人，生物技术的最新观点(Curr.Opin.Biotechnol.),7:60-65(1996)。术语免疫测定涵盖的技术包含但不限于酶免疫测定(EIA)，如酶扩大免疫测定技术(EMIT)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、IgM抗体捕获ELISA(MAC ELISA)和微粒酶免疫测定(MEIA)；毛细管电泳免疫测定(CEIA)；放射免疫测定(RIA)；免疫放射测定(IRMA)；荧光偏振免疫测定(FPIA)；和化学发光测定(CL)。如果需要，此类免疫测定可以是自动化的。免疫测定也可与激光诱导荧光结合使用。参见例如诗玛津(Schmalzing)等人，电泳(Electrophoresis)，18:2184-93(1997)；鲍(Bao，J.)，色谱学杂志B-生物医学和生命的分析技术(J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.)，699:463-80(1997)。脂质体免疫测定如流动注射脂质体免疫测定和脂质体免疫传感器也适合用于本发明。参见例如荣恩(Rongen)等人，免疫方法杂志(J.Immunol.Methods),204:105-133(1997)。此外，散射浊度测定适用于本发明的方法，其中蛋白质/抗体复合物的形成导致光散射增加，该光散射作为蛋白质浓度的函数被转换为峰率信号。散射浊度测定可从贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter)(加利福尼亚州布雷亚(Brea,CA)；试剂盒编号449430)商业获得，并可使用贝林(Behring)浊度分析仪实施(芬克(Fink)等人，临床化学和临床生物化学杂志(J.Clin.Chem.Clin.Biochem.),27:261-276(1989))。

可以直接或间接地检测MASC蛋白与SARS-CoV2的特异性免疫结合。直接标记物包含附接在抗体上的荧光或发光标签、金属、染料、放射性核素等。可以使用用碘-125(125I)标记的MASC蛋白。使用核酸特异性化学发光抗体的化学发光测定适用于敏感的、非放射性的蛋白质水平检测。用荧光染料标记的MASC蛋白也是合适的。荧光染料的实例包含但不限于DAPI、荧光素、赫斯特(Hoechst)33258、R-藻青素、B-藻红素、R-藻红素、罗丹明、德克萨斯红和丽丝胺。间接标记物包含本领域众所周知的各种酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、脲酶等。辣根过氧化物酶检测系统可与例如发色底物四甲基联苯胺(TMB)一起使用，其在过氧化氢存在下产生可在450nm处检测到的可溶性产物。碱性磷酸酶检测系统可与发色底物对硝基苯磷酸酯一起使用，其例如产生可容易在405nm处检测到的可溶性产物。类似地，β-半乳糖苷酶检测系统可与发色底物邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷(ONPG)一起使用，其产生可在410nm处检测到的可溶性产物。脲酶检测系统可与底物如脲-溴甲酚紫(西格玛免疫化学公司(Sigma Immunochemicals)；密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))一起使用。

可以分析来自直接或间接标记物的信号，例如，使用分光光度计检测来自发色底物的颜色；使用辐射计数器检测辐射，如用于检测125I的伽马计数器；或者使用荧光计在某个波长的光的存在下检测荧光。对于酶联抗体的检测，可以使用分光光度计如EMAX酶标仪(分子仪器公司(Molecular Devices)；加利福尼亚州门罗帕克市(Menlo Park,CA))按照制造商的说明进行定量分析。如果需要，本发明的测定可以自动化或以机器人方式进行，并且可以同时检测多个样品的信号。

MASC蛋白可以固定在各种固体支持物上，如磁性或色谱基质颗粒、测定板(例如，微量滴定孔)的表面、固体基质材料或膜(例如，塑料、尼龙、纸)的碎片，呈棍、海绵、纸、孔等物理形式。可以通过将抗体或多个抗体以阵列方式涂布在固体支持物上来制备测定条。然后将此条浸入测试样品中，并通过洗涤和检测步骤快速处理以生成可测量的信号，如彩色斑点。

H.筛选抗原结合结构域的方法

本文还提供了筛选与本MASC蛋白竞争结合的其它ABD的方法。本文关于ABD所使用的术语“竞争”意指第一ABD或其抗原结合部分与第二ABD或其抗原结合部分竞争结合，其中在第二ABD存在的情况下可检测到第一ABD与其同源表位的结合与在没有ABD抗体的情况下第一ABD的结合相比减少。另一种情况是，在第一ABD存在的情况下可检测到第二ABD与其表位的结合也减少，但不一定是这种情况。也就是说，第一ABD可以抑制第二ABD与其表位的结合，而第二ABD不抑制第一ABD与其各自表位的结合。然而，如果每个ABD都可检测到地抑制另一个ABD与其同源表位或配体的结合，不管程度相同、更大还是更小，ABD被说成是相互“交叉竞争”与其各自表位的结合。竞争性和交叉竞争性的ABD都涵盖在本发明中。无论此类竞争或交叉竞争发生的机制是什么(例如，空间位阻、构象变化、或与共同表位或其部分的结合等等)，根据本文提供的教导，技术人员会明白此类竞争性和/或交叉竞争性ABD都被涵盖并可用于本文公开的方法。

许多类型的竞争性结合测定是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见斯塔赫利(Stahli)等人，酶促方法(Methods in Enzymology)9:242-253(1983))；固相直接生物素-亲和素EIA(参见科克兰(Kirkland)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)137:3614-3619(1986))；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见哈罗(Harlow)和莱恩(Lane)，抗体，实验室手册(Antibodies,A Laboratory Manual),冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)(1988))；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见莫雷尔(Morel)等人，分子免疫学(Molec.Immunol.)25(1):7-15(1988))；固相直接生物素-亲和素EIA(张(Cheung)等人，病毒学(Virology)176:546-552(1990))；和直接标记的RIA(莫尔登豪尔(Moldenhauer)等人，斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)32:77-82(1990))。通常情况下，此类测定涉及使用结合到固体表面或带有未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白中的任一种的细胞的纯化抗原。竞争性抑制通过在测试免疫球蛋白存在下确定与固体表面或细胞结合的标记的量来测量。测试免疫球蛋白通常过量存在。通过竞争测定鉴别的抗体(竞争抗体)包含与参考抗体结合于相同表位的抗体，和结合于足够接近参考抗体结合的表位的相邻表位以发生位阻的抗体。通常情况下，当竞争性抗体过量存在时，其将参考抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少50％或75％。

竞争性结合测定可用于识别与本文所述抗体竞争的抗体以供与SARS-CoV2病毒特异性结合。本领域已知的许多竞争性结合测定中的任一种都可以用来测量两种抗体之间对同一抗原的竞争。简而言之，测试不同的抗体抑制另一种抗体的结合的能力。例如，可以用夹心ELISA测定通过抗体结合的表位来区分抗体。这是通过使用捕获抗体包被孔的表面进行的。然后将亚饱和浓度的标记抗原添加到捕获表面。这种蛋白质将通过特异性抗体:表位相互作用与抗体结合。洗涤后，将已经与可检测部分(例如，HRP，标记的抗体定义为检测抗体)共价连接的第二种抗体添加到ELISA中。如果这个抗体识别与捕获抗体相同的表位，则其将无法与靶蛋白结合，因为所述特定表位将不再可用于结合。然而，如果此第二抗体识别靶蛋白上的不同表位，则其将能够结合，并且这种结合可以通过使用相关底物量化活性水平(并且因此结合的抗体)来检测。通过使用单一抗体作为捕获抗体和检测抗体两者来定义背景，而最大信号可以通过用抗原特异性抗体捕获并且用针对抗原上标签的抗体进行检测来建立。通过使用背景和最大信号作为参考，可以成对评估抗体以确定表位特异性。

如果在第一抗体存在的情况下，使用上述测定中的任一种，第二抗体与抗原的结合减少至少30％，通常至少约40％、50％、60％或75％，并且常常至少约90％，则第一抗体被认为竞争性地抑制第二抗体的结合。

IV.实例

1.1实例1：亲本MASC蛋白的识别和表征

(a)酵母表面展示的纳米抗体与SARS-CoV2刺突胞外域的结合

通过流式细胞术评估表面展示单一纳米抗体克隆的酵母与纯化的荧光标记的SARS-CoV2刺突胞外域的结合。将大约1x10⁶个酵母与SARS-CoV2刺突胞外域(刺突ECD)或用Alexa647标记的受体结合结构域(RBD)一起在25℃下孵育30分钟。通过反复离心和重悬大量洗涤酵母后，用流式细胞术测量与酵母细胞结合的SARS-CoV2刺突胞外域的量。与SARS-CoV2刺突胞外域结合的纳米抗体克隆在Alexa647通道中显示出强烈的荧光信号。在1.4微摩尔纯化的ACE2-Fc存在的情况下，与SARS-CoV2刺突胞外域的结合减少，表明表位与人类ACE2竞争。

表1

+++：强信号

++：中等信号

+：低信号

-：无信号

(b)纳米抗体与刺突胞外域(ECD)的表面等离子体共振

带有C末端8x组氨酸标签和Twin-strep标签的稳定的SARS-CoV2胞外域在Expi293细胞中表达，并使用金属亲和色谱法和尺寸排除色谱法进行纯化。此抗原经由StreptactinXT被捕获到思拓凡(Cytiva)表面等离子体共振芯片上，以分析针对SARS-CoV2刺突胞外域的纳米抗体的动力学特性。结果显示在图22中。

1.2实例2：亲和力成熟

实例1中描述的克隆中的一个是亲和力成熟的。原始克隆是pNbCOV006A，其序列如下(CDR加下划线)：

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGIIFGRNAMGWYRQAPGKERELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADPASPAPGDYWGQGTQVTVSS。

(a)亲和力成熟过程：

通过编码CDR1、CDR2和CDR3内每个位置的所有20个氨基酸的退化寡核苷酸生成原始克隆的饱和诱变文库。这个变体文库被展示在酵母的表面。用严格的标准(即SARS-Cov2刺突蛋白受体结合结构域(RBD)的浓度不断降低)逐步选择高亲和力克隆。两轮选择后，展示纳米抗体变体的酵母池与亲本纳米抗体相比显示出更高的结合刺突RBD的亲和力，如图2中所概述。

(b)亲和力成熟文库结果：

对来自这个池的八个单独克隆进行测序，表明以下位置的突变是提高亲和力的原因。此外，以下取代的组合可能产生对亲本克隆的亲和力的改善。

CDR1

原始：GIIFGRNA

对第3位的取代：Y/W/F/V/L

CDR2

原始：TRRGSITY

对第4位的取代：H/Y/G/Q

CDR3

原始：AADPASPAPGDY

对第6位的取代：V/L/I/T

对第9位的取代：F/W/Y/L/V

基于序列收敛，我们特别测试了一个克隆(mNbCOV6)的活性。下划线代表与亲本相比的取代：

QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGYIFGRNAMGWYRQAPGKERELVAGITRRGSITYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADPASPAYGDYWGQGTQVTVSS

mNbCOV6的效力显著高于亲本克隆NbCOV6。在增加浓度的亲本纳米抗体(NbCOV6)或亲和力成熟的纳米抗体(mNbCOV6)的存在下，将表达血管紧张素转换酶2(ACE2)受体的HEK293细胞与荧光缀合有Alexa 647染料的1nM纯化、稳定的SARS-CoV2刺突胞外域一起孵育。NbCOV6抑制刺突胞外域结合的EC50为359nM，而亲和力成熟的纳米抗体(mNbCOV6)的EC50为0.056nM。用荧光标记的SARS-CoV2刺突受体结合结构域(RBD)重复同样的测定。亲本NbCOV6抑制RBD结合的EC50为190nM，而亲和力mNbCOV6抑制的EC50为1.5nM。

表3

	RBD抑制EC50	刺突三聚体抑制EC50
			亲本克隆(NbCOV6)	190nM	359nM
亲和力成熟(mNbCOV6)	1.5nM	0.056nM

1.3实例3：假病毒中和测定

ZsGreen SARS-CoV-2-假型慢病毒根据已发表的方案(https://www.mdpi.com/1999-4915/12/5/513)生成。在转导前一天，在24孔板的每一孔中铺板50,000个HEK293T-ACE2细胞。在完全培养基(DMEM+10％ FBS+PSG)中生成10倍连续稀释的纳米抗体，并加入假型病毒至200ul的最终体积。用纳米抗体/假型病毒混合物替换细胞的培养基，持续四小时，然后取出。用完全培养基洗涤细胞，然后在完全培养基中孵育。转导后3天，将细胞胰蛋白酶化，在Attune流式细胞仪(赛默飞世尔(ThermoFisher))上测量ZsGreen+细胞的比例。

1.4实例4：超强的合成纳米抗体通过稳定无活性的刺突来中和SARS-CoV-2

SARS-CoV-2病毒经由其刺突蛋白与宿主细胞受体血管紧张素转换酶2(ACE2)之间的相互作用进入宿主细胞。通过筛选合成纳米抗体序列的酵母表面展示文库，我们开发了破坏刺突和ACE2之间相互作用的纳米抗体。低温电子显微术(低温-EM)显示，一种纳米抗体Nb6以完全无活性的构象与刺突结合，其受体结合结构域(RBD)被锁定在其不可及的向下状态，无法结合ACE2。亲和力成熟和结构指导的多价设计产生了三价纳米抗体mNb6-tri，其对刺突的亲和力为飞摩尔级并且对SARS-CoV-2感染的中和作用为皮摩尔级。mNb6-tri在气溶胶化、冻干和热处理后仍然保持功能，这使得这种有效的中和剂在气溶胶介导下直接递送到气道上皮。

通过筛选酵母表面展示文库中与刺突胞外域结合的>2x10⁹个合成纳米抗体序列，分离出中和SARS-CoV-2的单结构域抗体(纳米抗体)(17)。SARS-CoV-2刺突(刺突^S2P)的突变形式用作抗原(15)。刺突^S2P缺少S1和S2结构域之间的两个溶蛋白性裂解位点中的一个，并引入两个突变和三聚体化结构域以稳定融合前构象。刺突^S2P用生物素或荧光染料标记，并且首先通过磁珠结合然后通过荧光激活的细胞分选，在展示纳米抗体的酵母上进行多轮选择(图27A)。

三轮选择产生了21个独特的纳米抗体，其与刺突^S2P结合并在存在ACE2细胞外结构域的二聚构建体(ACE2-Fc)的情况下显示出结合减少。这些纳米抗体分为两类。第I类与RBD结合，并且直接与ACE2-Fc竞争(图27B)。这一类的典型实例是纳米抗体Nb6，其分别以210nM和41nM的KD与刺突^S2P和单独的RBD结合(图27C；图42)。以纳米抗体Nb3为例的第II类与刺突^S2P结合(KD＝61nM)，但未展示与单独RBD的结合(图27C，图42)。在存在过量ACE2-Fc的情况下，Nb6和其它第I类纳米抗体的结合被完全阻断，而Nb3和其它第II类纳米抗体的结合则适度减少(图27B)。这些结果表明，第I类纳米抗体靶向RBD来阻止ACE2结合，而第II类纳米抗体则靶向其它表位。事实上，表面等离子体共振(SPR)实验证明第I类和第II类纳米抗体可以同时结合刺突^S2P(图27D)。

第I类纳米抗体显示，与刺突^S2P相比，纳米抗体与分离的RBD结合的缔合速率常数(ka)始终较快(图41)，这表明RBD可及性影响KD。接下来，测试第I类和第II类纳米抗体用以抑制荧光标记的刺突^S2P与表达ACE2的HEK293细胞结合的功效(图27E；图42)。第I类纳米抗体Nb6和Nb11显示是最有效克隆中的两个，IC50值分别为370nM和540nM。第II类纳米抗体在此测定中几乎没有显示任何活性。两种第I类纳米抗体被优先考虑，即Nb6和Nb11，它们兼具强刺突^S2P结合与较小的刺突^S2P或RBD结合之间的Ka差异。对于第II类纳米抗体，因为Nb3在纯化期间的相对产量，故优先考虑Nb3(图42)。

为了限定Nb6和Nb11的结合位点，确定了与刺突^S2P结合的低温电子显微术(低温-EM)结构(图28A至B；图27至29；图44)。两种纳米抗体都识别与ACE2结合位点重叠的RBD表位(图28E)。对于Nb6和Nb11，我们解析了纳米抗体与刺突^S2P的开放和封闭构象的结合。我们获得了Nb6与封闭的刺突^S2P结合的图，这使得能够对Nb6-刺突^S2P复合物(包含互补决定区(CDR))进行建模(图28A)。我们还获得了与开放的刺突^S2P结合的Nb6/>以及与开放和封闭的刺突^S2P结合的Nb11(分别为/>和/>)的低分辨率图。根据这些低分辨率图，我们可以确定纳米抗体的结合取向，但不能准确地对CDR进行建模。

与封闭的刺突^S2P结合的Nb6横跨在两个相邻的RBD之间的界面上。大部分的接触面由Nb6的CDR1和CDR2贡献(图28C)。从上面看，CDR3与相邻的逆时针定位的RBD接触(图28C)。因此，一个Nb6的结合使两个相邻的RBD稳定在向下状态，并可能为第二和第三Nb6分子预组织结合位点以稳定封闭的刺突构象。相比之下，与向下状态RBD结合的Nb11只接触单一RBD(图28D)。

与封闭的刺突^S2P结合的Nb6结构使我们能够工程改造二价和三价的纳米抗体，预测该纳米抗体将所有RBD锁定在下行状态。我们插入了灵活的15或20个氨基酸的Gly-Ser接头，以跨越与封闭刺突^S2P中下降状态RBD结合的相邻Nb6单体之间的距离(图36)。这些接头太短无法跨越与开放的刺突结合的Nb6分子之间的/>距离。此外，即使有更长的接头长度，立体冲突也会阻止开放的刺突中三个RBD与单一向上状态RBD的结合(图36)。相比之下，与开放或封闭的刺突^S2P结合的相邻Nb11单体之间的最小距离为/>我们预测，Nb6构建体的多价结合将展示出由于增强的亲合力而显著减缓的解离速率。

在SPR实验中，带有15个氨基酸接头的二价Nb6(Nb6-bi)和带有两个20个氨基酸接头的三价Nb6(Nb6-tri)都以双相方式与刺突^S2P解离。解离相可以拟合为两个组分：快速相，Nb6-bi的动力学速率常数kd1为2.7x10-2s-1，Nb6-tri的动力学速率常数kd1为2.9x10-2s-1，这接近于单价Nb6观察到的动力学速率常数(kd＝5.6x10-2s-1)，和取决于亲合力的缓慢相(分别地，Nb6-bi的kd2＝3.1x10-4s-1和Nb6-tri的kd2<1.0x10-6s-1)(图29A)。快速相的较相似的Kd表明，观察到的多价构建体的结合有一部分是纳米抗体与单个刺突^S2P RBD的结合。相比之下，Nb6-bi和Nb6-tri的缓慢解离相表明有两个或三个RBD参与。10分钟内没有观察到Nb6-tri缓慢相的解离，表明kd2的上限为1x10-6s-1和亚皮摩尔级亲和力。这个测量值仍然是上限估计值，因为该测量值受到用于固定刺突^S2P的化学方法所施加的刺突^S2P与SPR芯片的内在解离速率的限制。因此，真正的解离速率可能显著更低。

双相解离可以用向上状态RBD和向下状态RBD之间的缓慢相互转换来解释，转换到多价结合所需的更稳定的向下状态：Nb6-tri的单一结构域与向上状态RBD的接合会迅速解离。然后，随着RBD翻转到向下状态，系统将重新平衡，最终允许Nb6-tri将所有RBD困在封闭的刺突^S2P中。为了直接测试这一点，改变Nb6-tri与刺突^S2P结合的缔合时间。事实上，我们观察到快速相百分比呈指数下降，t^1/2为65s(图29B)，我们推测这反映了刺突^S2P中RBD向上和向下状态之间的转换时间尺度。综上所述，Nb6的二聚化和三聚化分别得到750倍和>200,000倍的KD增加。

由于无法通过低温-EM确定Nb3的结合位点，因此采用放射性羟基自由基足迹。将apo或Nb3结合的刺突^S2P暴露于同步X射线辐射以用羟基自由基标记溶剂暴露的氨基酸，随后通过蛋白酶消化的刺突^S2P的质谱法进行量化(18)。在Nb3的存在下，刺突的S1 N末端结构域上的两个相邻的表面残基(M177和H207)受到保护，保护程度与先前通过羟基自由基足迹的抗体-抗原相互作用的观测结果一致(图37)(19)。以前发现的冠状病毒中和抗体与刺突的N末端结构域内的表位结合，其Fab片段与宿主细胞受体无竞争性(20、21)。进一步的SPR实验表明，Nb3能与单价ACE2同时结合刺突^S2P(图38)。据推测，Nb3在酵母表面的多价展示可能是在存在ACE2-Fc的情况下观察到的刺突^S2P结合部分下降的原因。事实上，带有15个氨基酸接头的Nb3三价构建体(Nb3-tri)抑制刺突^S2P与ACE2细胞的结合，IC50为41nM(图38)。Nb3-tri如何破坏刺突-ACE2相互作用仍不清楚。

接下来，使用先前描述的测定测试我们的最高第I类(Nb6和Nb11)和第II类(Nb3)纳米抗体的单价和三价版本对SARS-CoV-2假型慢病毒的中和活性(22)。Nb6和Nb11抑制假病毒感染，IC50值分别为2.0μM和2.4μM。Nb3抑制假病毒感染，IC50为3.9μM(图29C，图42)。Nb6-tri显示出2000倍的抑制活性增强，IC50为1.2nM，而Nb11和Nb3的三聚化导致更温和的分别为40倍和10倍的增加(51nM和400nM)(图29C)。中和活性通过病毒斑块测定得到证实，该测定使用活SARS-CoV-2病毒感染VeroE6细胞。在这里，Nb6-tri被证明是非常有效的，中和SARS-CoV-2的平均IC50为160pM(图29D)。Nb3-tri中和SARS-CoV-2的平均IC50为140nM(图29D)。

通过选择靶向所有三个CDR的饱和诱变文库优化Nb6的效力。两轮选择识别具有两个渗透性突变的高亲和力克隆：CDR1的I27Y和CDR3的P105Y。我们将这些突变并入Nb6以生成成熟Nb6(mNb6)，其与刺突^S2P的结合亲和力提高了500倍(图30A)。mNb6对假病毒和活SARS-CoV-2感染都有抑制作用，效力为低纳摩尔级，与Nb6相比提高了约200倍(图30B；图42)。

低温-EM结构显示，mNb6与封闭的刺突^S2P结合(图30C；图32)。与和Nb6结合的刺突^S2P相比，mNb6诱发了向下状态的RBD的轻微重排，从而诱发RBD远离中心三倍对称轴旋转9°。这种偏差可能来自于CDR3与刺突^S2P之间不同的相互作用，其将RBD推到新的静止位置(图30D)。虽然I27Y取代优化CDR1在RBD上其原始结合位点的局部接触，但是P105Y取代导致CDR3在mNb6中明显重排(图30E-F)。这种构象变化使mNb6 CDR3和相邻的RBD之间产生不同的接触集。单独的mNb6的X射线晶体结构显示，自由的和刺突^S2P结合的mNb6之间的CDR1和CDR3存在巨大的构象差异(图30G；图43)。尽管晶体结构中环构象的差异可能来自晶格接触，但它们表明未结合的mNb6的构象异质性和与刺突^S2P结合后的诱导契合重排。

mNb6的结合取向与Nb6的结合取向相似，表明多价设计同样会增强结合亲和力。与Nb6-tri不同，带有20个氨基酸接头的三价mNb6(mNb6-tri)与刺突^S2P结合时没有观察到快速相解离，并且在十分钟内没有可测量的解离，得出解离速率常数kd的上限为1.0x10-6s-1(t1/2>8天)，并且KD为<1pM(图30A)。mNb6-tri在假病毒和活SARS-CoV-2感染测定中展示出进一步的效力增加，IC50值分别为120pM(5.0ng/mL)和54pM(2.3ng/mL)(图30B，图41)。鉴于通过SPR观察到的亚皮摩尔级亲和力，这些病毒中和效力可能反映测定的下限。因此，mNb6-tri是特别有效的SARS-CoV-2中和分子。

接下来，测试了第I类纳米抗体mNb6的病毒中和作用，观察其是否与第II类纳米抗体Nb3-tri有潜在的协同作用。在假病毒中和测定中，当Nb3-tri与mNb6组合时，观察到累加作用(图39)。然而，随着Nb3-tri浓度的增加，mNb6病毒中和的效力没有变化，这表明这两种纳米抗体之间的协同作用很小。

接下来，测试Nb6及其衍生物的稳定性。圆二色性显示Nb6、Nb6-tri、mNb6和mNb6-tri的解链温度分别为66.9℃、62.0℃、67.6℃和61.4℃(图40)。此外，mNb6和mNb6-tri对冻干和气溶胶化都是稳定的，通过尺寸排除色谱法显示没有聚集，并保持与刺突^S2P的高亲和力结合(图31A至B和图40)。最后，mNb6-tri在气溶胶化、冻干或在50℃下热处理1小时后，仍对假病毒和活SARS-CoV-2感染保持有效的抑制作用(图31C和图40)。

防止SARS-CoV-2进入宿主细胞的策略旨在阻止ACE2-RBD相互作用(20、23-30)。尽管高亲和力单克隆抗体作为潜在的治疗方法处于领先地位，但通过哺乳动物细胞表达来生产该抗体是昂贵的，并且需要由医疗专业人士进行静脉内施用。预防性使用需要大剂量，因为只有一小部分全身性抗体穿过气道内部的上皮细胞层(32)。相比之下，纳米抗体可以在细菌或酵母中以低廉的价格生产。纳米抗体固有的稳定性使得气溶胶直接递送到鼻和肺上皮细胞(33)。事实上，最近证明，靶向呼吸道合胞病毒的三聚纳米抗体(ALX-0171)的气溶胶递送有效地显著减少住院婴儿的可测量病毒载量(34)。最后，骆驼科动物衍生的纳米抗体的潜在免疫原性可以通过既定的人源化策略得到缓解(35)。

纳米抗体多聚化已显示通过亲合力提高靶标亲和力(33、36)。在Nb6和mNb6的情况下，结构指导设计的同时与所有三个RBD接合的多聚构建体产生巨大的效力增加。此外，由于RBD必须处于上升状态才能与ACE2接合，所以RBD可及性的构象控制可以作为额外的中和机制(30)。事实上，当mNb6-tri与刺突接合时，其通过直接闭塞结合位点和将RBD锁定为非活性构象来阻止ACE2结合。第II类中和纳米抗体的发现证明破坏刺突功能的潜在新机制。在预防或治疗混合物中，将第I类和第II类纳米抗体搭配可以提供有效的中和作用并防止逃逸变体。因此，我们的抗刺突纳米抗体的稳定性、效力和多样化表位接合的组合提供了独特的潜在预防和治疗策略，以限制COVID-19大流行病的持续损失。

材料和方法：

1.SARS-CoV-2刺突、RBD和ACE2的表达和纯化

先前描述的构建体用于表达和纯化融合前的SARS-CoV-2刺突胞外域(刺突^S2P)(15)。根据MaxTiter方案的制造商说明，用刺突^S2P构建体转染ExpiCHO或Expi293T细胞(赛默飞世尔)，并在转染后3-9天收获。将澄清的细胞培养上清液装入Ni-Excel珠(思拓凡)，然后在20mM HEPES pH 8.0、200mM氯化钠和10mM咪唑中进行大量洗涤，并在补充有500mM咪唑的相同缓冲液中洗脱。刺突^S2P用100kDa MWCO离心浓缩仪(密理博(Millipore))浓缩，并在20mM HEPES pH 8.0和200mM氯化钠中在Superose 6增加(Increase)10/300柱(GE医疗(GEHealthcare))上通过尺寸排除色谱法进一步纯化。所有的纯化步骤都在室温下进行。将得到的三聚刺突^S2P级份合并，并直接用于低温-EM研究或浓缩和在液氮中用15％甘油闪冻以供其它生化研究。

我们使用以前描述的构建体来表达和纯化SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)(37)。根据制造商的说明，用RBD构建体转染Expi293T细胞(赛默飞世尔)，并在转染后3-6天收获。将澄清的细胞培养上清液装入Ni-Excel珠(思拓凡)或His-Trap Excel柱(GE医疗)，然后在20mM HEPES pH 8.0、200mM氯化钠和10mM咪唑中洗涤，并使用补充有500mM咪唑的相同缓冲液洗脱。RBD使用30kDa MWCO离心浓缩仪(密理博)浓缩，并在20mM HEPES pH 8.0和200mM氯化钠中在Superdex 200Increase 10/300GL柱(GE医疗)上通过尺寸排除色谱法进一步纯化。将得到的级份合并，浓缩，并在液氮中用10％甘油闪冻。

对于生化和酵母展示实验，刺突^S2P和RBD用新鲜制备的Alexa 647-NHS、Alexa488-NHS或生物素-NHS(赛默飞世尔)原液在室温下以5倍化学计量学标记1小时，然后用10mMTris pH 8.0淬灭NHS 60分钟。标记的蛋白质通过尺寸排除色谱法进一步纯化，用离心浓缩仪(密理博)浓缩，并在液氮中用10-15％甘油闪冻。

我们使用ACE2-ECD(18-614)Fc融合表达质粒来表达和纯化Fc标记的ACE2-ECD(38)。根据制造商的说明，用ACE2-Fc构建体转染Expi293T细胞(赛默飞世尔)，并在转染后5-7天收获。将澄清的细胞培养上清液装入MabSelect Pure 1mL柱(GE医疗)。用缓冲液A(20mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl)洗涤柱，并用缓冲液B(100mM柠檬酸钠pH 3.0,150mMNaCl)将蛋白质洗脱入含有1M HEPES pH 7.5的深孔块以中和酸性洗脱物。使用30kDa MWCO离心浓缩仪(密理博)浓缩ACE2-Fc，并在SEC缓冲液(20mM HEPES pH 7.5、150mM NaCl、5％v/v甘油)中在Superdex 200Increase 10/300GL柱(GE医疗)上通过尺寸排除色谱法进一步纯化。将得到的级份合并，浓缩，并在液氮中闪冻。为了获得单体ACE2，将1:50(w/w)His标记的TEV蛋白酶加入到ACE2-Fc中，并在4℃孵育过夜。然后在SEC缓冲液中通过尺寸排除色谱法对该混合物进行纯化。将单体ACE2级份合并，用His-树脂(1mL的50％浆液)洗涤，以去除多余的TEV。将得到的上清液合并，浓缩并在液氮中闪冻。

2.抗SARS-CoV2刺突纳米抗体的识别

为了识别针对SARS-CoV-2刺突ECD的纳米抗体，我们使用合成纳米抗体序列的酵母表面展示文库，其概况了天然美洲驼免疫库中的氨基酸位置特异性变化。该文库编码多种多样的>2x10⁹个变体，并使用合成茎序列来展示纳米抗体，如以前在编码诺尔丝菌素(NTC)抗性的修饰载体中所描述的(17)。对于第一轮选择，将2x10¹⁰个在补充有NTC的YPG(酵母提取物-蛋白胨-半乳糖)中诱导的酵母在选择缓冲液(20mM HEPES，pH7.5，150mM氯化钠，0.1％(w/v)低生物素牛血清白蛋白，BSA)中反复洗涤，并且最后重新悬浮在10mL含有200nM生物素化刺突^S2P的选择缓冲液中。将酵母在25℃下孵育30分钟，然后在冷选择缓冲液中反复洗涤，并且最后重新悬浮在含有200μL美天旎(Miltenyi)抗链霉亲和素微珠的10mL冷选择缓冲液中。在4℃下孵育30分钟后，再次用冷选择缓冲液洗涤酵母。在美天旎MACS LS柱上捕获刺突^S2P结合酵母，并在补充有NTC的YPD(酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖)培养基中回收。

对于第2轮，将第1轮的4x10⁸个诱导酵母与Alexa647标记的100nM刺突^S2P在1mL选择缓冲液中在25℃下一起孵育1小时。在用冷选择缓冲液大量洗涤后，在索尼SH800仪器上通过荧光激活细胞分选(FACS)分离出刺突^S2P结合的酵母。第3轮使用类似的方法，用Alexa647标记的10nM刺突^S2P代替。将第3轮后的酵母在YPD+NTC固体培养基上铺板，并且768个单独的集落用YPG+NTC培养基在2mL深孔板上诱导。在贝克曼库尔特流式细胞仪(BeckmanCoulter Cytoflex)上通过流式细胞术测试每个单独克隆与4nM刺突^S2P-Alexa488的结合。为了识别破坏刺突-ACE2相互作用的纳米抗体，在存在0.5-1μM ACE2-Fc的情况下重复刺突^S2P结合。在768个克隆中，我们识别了21个强烈结合刺突^S2P并与ACE2竞争的克隆(图44)。

3.纳米抗体的表达和纯化

使用In-Fusion HD克隆(宝生物(Takara Bio))将纳米抗体序列克隆到pET26-b(+)表达载体中，转化为BL21(DE3)大肠杆菌(纽英伦生物技术公司(New EnglandBioLabs))，在37℃在极品肉汤(Terrific Broth)中生长至OD 0.7-0.8，然后在25℃使用1mM IPTG进行基因诱导18-22小时。收获大肠杆菌并在25℃下将其重新悬浮在SET缓冲液(200mM Tris，pH 8.0，500mM蔗糖，0.5mM EDTA，1X cOmplete蛋白酶抑制剂(罗氏(Roche)))中，持续30分钟，然后添加两倍体积的水进行45分钟的渗透压冲击。在裂解液中加入NaCl、MgCl2和咪唑，分别达到150mM、2mM和40mM，然后以17-20,000xg离心15分钟，将细胞碎片与周质级份分离。然后将每升细菌培养物的周质级份与4mL 50％的HisPur Ni-NTA树脂(赛默科学(Thermo Scientific))一起孵育，该树脂已在镍清洗缓冲液(20mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl，40mM咪唑)中平衡。此混合物在RT旋转孵育1小时，然后以50xg离心以收集树脂。然后用5体积的镍清洗缓冲液洗涤树脂3次，每次都用离心去除多余的清洗缓冲液。然后用洗脱缓冲液(20mM HEPES,pH 7.5,150mM NaCl,500mM咪唑)洗脱结合的蛋白质，洗涤三次。使用3.5kDa MWCO离心过滤装置(Amicon)浓缩洗脱的蛋白质，然后注入用20mM HEPES,pH 7.5,150mM NaCl平衡的Superdex 200Increase 10/300GL柱。使用3.5k MWCO离心过滤装置再次浓缩纳米抗体构建体，并在液氮中闪冻。

4.通过表面等离子体共振确定亲和力

纳米抗体(Nb)亲和力确定实验在Biacore T200和8K仪器(思拓凡生命科学)上，通过在StreptactinXT固定的(Iba生命科学(Iba Life Sciences))CM5系列S传感器芯片(思拓凡生命科学)上捕获10μg/mL的StreptagII标记的刺突^S2P来进行以达到纳米抗体结合时的最大反应(Rmax)为大约30反应单位(RU)。使1μM至31.25nM(对于单价构建体)或50nM至1.56nM(对于亲和力成熟和多聚构建体)的2倍连续稀释的纯化纳米抗体以30μL/分钟在捕获的刺突^S2P表面流动60秒，然后进行600秒的解离流动。每个循环之后，用3M盐酸胍再生芯片表面。

另外，将8μg/mL的生物素化SARS-CoV-2RBD加载到预处理过的系列S传感器芯片CAP芯片(思拓凡生命科学)上以达到纳米抗体结合时的Rmax为大约60RU。使在与刺突^S2P运行相同的运行缓冲液和样品系列(亲本或亲和力成熟的克隆)中的2倍连续稀释液以30μL/分钟在RBD表面流动60秒，然后进行600秒的解离流动。用盐酸胍/氢氧化钠溶液进行芯片表面再生。

使用Biacore Insight评价软件(思拓凡生命科学)或GraphPad Prism 8.0中的缔合/解离模型，将得到的所有单价克隆的传感图拟合至1:1的朗缪尔(Langmuir)结合模型。为了确定Nb6-bi和Nb6-tri结合的动力学参数，将解离相拟合至双指数衰减，约束为每个浓度之间共享的两个解离速率常数。缔合相使用缔合动力学模型分别拟合，同时拟合每个浓度的缔合速率常数。

对于纳米抗体竞争实验，将刺突^S2P加载到如前所述的StreptactinXT固定的CM5传感器芯片。与动力学实验一样，一级纳米抗体以30μL/分钟在捕获的刺突^S2P表面上流动60秒以达到饱和。紧接着，以与第一次注射相同的浓度，第二次注射一级和可变纳米抗体的混合物。

5.ACE2细胞表面结合竞争测定

在PBE(PBS+0.5％(w/v)BSA+2mM EDTA中生成纳米抗体的稀释系列，并与刺突^S2P-Alexa647或RBD-Alexa647混合。用TrypLE Express(赛默飞世尔)解离表达ACE2的HEK293T细胞，并重新悬浮于PBE(22)。将细胞与刺突^S2P-纳米抗体溶液混合并孵育45分钟，在PBE中洗涤，然后重新悬浮在PBE中。在Attune流式细胞仪(赛默飞世尔)上评估细胞表面Alexa647荧光强度。

6.Nb6的亲和力成熟

通过对编码Nb6序列的重叠寡核苷酸进行组装PCR生成Nb6的位点饱和诱变文库。设计在CDR1、CDR2和CDR3的每个位置都带有退化“NNK”密码子的单独寡核苷酸。用两端重叠的寡核苷酸扩增组装的基因产物，以使得能够与如前所述的酵母表面展示载体进行同源重组，并且能够用标准的硅基色谱法进行纯化(17)。将得到的插入DNA与酵母展示载体pYDS2.0一起转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)株BJ5465(ATCC 208289)中，以产生2x10⁸个转化体的文库。在YPD+NTC培养基中于20℃诱导2天后，将2x10⁹个酵母在选择缓冲液(20mM HEPES，pH 8.0，150mM氯化钠，0.1％(w/v)低生物素BSA)中洗涤，并在25℃下与1nM生物素-刺突^S2P一起孵育1小时。随后在选择缓冲液中洗涤酵母，重新悬浮在1mL选择缓冲液中，并与10μL链霉亲和素微珠(美天旎)在4℃下一起孵育15分钟。用冷的选择缓冲液再次洗涤酵母，并使用LS柱(美天旎)通过磁分离分离出刺突^S2P结合的酵母。使回收的酵母于37℃在YPD+NTC中生长，并于20℃在YPG+NTC中诱导。如上进行第二轮选择，替换为用100pMRBD-Alexa647作为抗原。使用抗Cy5微珠(美天旎)和LS柱通过磁分离选择展示高亲和力克隆的酵母。第二轮选择后的文库分析揭示了与10pM RBD-Alexa647有明显结合的克隆群。因此，通过流式细胞术筛选出与10pM RBD-Alexa647结合的96个单独的克隆。对八个显示与10pM RBD-Alexa647有力结合的克隆进行的序列分析揭示了用来生成亲和力成熟的克隆mNb6的两个共有突变I27Y和P105Y。

7.mNb6晶体学和结构确定

将纯化的mNb6浓缩至18.7mg/mL，并使用0.1μm的亲水PVDF过滤器(密理博)进行过滤。将mNb6晶体筛选以悬滴形式以2:1蛋白质:池液设置在Index和AmSO4筛选(汉普顿研究(Hampton Research)，加利福尼亚州阿利索维耶霍(Aliso Viejo,CA))的96孔板中。在60多种不同的筛选条件下具有各种形态的晶体似乎在环境温度下过夜，并直接从筛选获得而无需进一步优化。通过下述方式冷冻保护晶体：快速浸泡在含有80％池液和20％ PEG400或20％甘油的溶液中，然后安装在CrystalCap HT Cryoloops(汉普顿研究，加利福尼亚州阿利索维耶霍)中，并在低温氮气流(100K)中快速冷却。所有的数据都在高级光源(加利福尼亚州伯克利(Berkeley,CA))光束线8.3.1收集。将在0.1M Tris.HCl pH 8.5,1.0M硫酸铵中生长的mNb6单晶衍射至用Xia2进行整合和缩放，使用XDS进行索引和整合，并使用XSCALE进行缩放和合并(39)。使用纳米抗体Nb.b201(PDB 5VNV)的结构作为搜索模型，使用PHASER通过分子替换解析结构(17、40)。用COOT进行模型建立，并用PHENIX和BUSTER进行精修(41-43)。

6.低温-EM得到的刺突-纳米抗体复合物的结构

A)样品制备和显微术

为了制备刺突^S2P-纳米抗体复合物，将每个纳米抗体在冰上以3倍摩尔过量与2.5μM的刺突^S2P一起孵育10分钟。将3μL刺突^S2P-纳米抗体复合物加入之前用Pelco easiGlow辉光放电清洁系统在15mA辉光放电30秒的300目1.2/1.3R Au Quantifoil网格中。使用Whatman 1号定性滤纸，在FEI Vitrobot Mark IV(赛默飞世尔)中，在4℃和100％湿度下，以0的印迹力进行印迹4秒，然后投入液态乙烷中冷冻。

对于每个复合物，采用3x3图像转换收集策略，在配备有K3相机和Bioquantum能量过滤器(加坦(Gatan))的Titan Krios(赛默飞世尔)上以105,000x的名义放大率(物理像素大小：/像素)收集120帧的超分辨率影片，缝隙宽度设置为20eV。收集剂量速率为8e^-/像素/秒，总剂量为/>每次收集都用SerialEM的半自动脚本进行(44)。

B)图像处理

对于所有数据集，用MotionCor2对剂量分割的超分辨率影片进行运动校正(45)。对比度传递函数确定用cryoSPARC补丁CTF进行(46)。用由先前的数据集合生成的低通滤波apo刺突2D模板挑取颗粒。

Nb6-刺突^S2P和mNb6-刺突^S2P颗粒用384像素盒提取，分库为96像素，并进行单轮2D和3D分类，然后进行合并以供在cryoSPARC中的同质精修。然后使用pyEM模块将精修颗粒导入Relion3.1以使用低通滤波至的输入精修图进行3D分类而不进行比对(47、48)。将代表刺突封闭构象的类别的颗粒导入cisTEM，并进行自动精修，然后在RBD::纳米抗体掩膜区域内进行局部精修(49)。在局部精修之后，创建与C3轴对称的新精修包以进行最后一轮局部精修而不进行掩膜。各图的最终颗粒计数如下：Nb6-开放：40,125，Nb6-封闭：58,493，mNb6：53,690。

Nb11-刺突^S2P颗粒用512像素盒提取，分库为128像素以进行多轮3D分类，如图35所述。在同质精修后，将颗粒导出到Relion3.1。颗粒缩减后保留大致对应于RBD-纳米抗体复合物的颗粒密度。在颗粒缩减堆栈上进行3D分类而不进行比对。选择RBD-纳米抗体密度稳健的类别中的颗粒，不进行缩减并在Relion中进行精修，然后进行后处理。21,570个颗粒用于最终图。各图的最终颗粒计数如下：Nb11-开放：21,570，Nb11-封闭：27,611。对于所有图，最终的局部分辨率估计和GSFSC确定在cryoSPARC中进行。视角分布图用pyEM模块生成，并用ChimeraX可视化(50)。

C)结构建模

Nb6-刺突^S2P和mNb6-刺突^S2P的模型使用以前确定的封闭刺突^S2P的结构(PDB:6VXX)建立(14)。使用先前确定的SARS-CoV-2RBD的X射线晶体结构(PDB:6M0J)建立并入RBD解析区域的复合模型(51)。对于Nb6，β2-肾上腺素能受体纳米抗体Nb80(PDB:3P0G)作为模板用于首先将纳米抗体拟合到Nb6-刺突^S2P复合物的低温-EM密度图(52)。然后用RosettaES截断并重建互补决定环(53)。mNb6的较高分辨率结构使得能够手工重新建立纳米抗体CDR环，因此没有使用基于Rosetta的方法进行建模。最终的结构在COOT和ISOLDE中检查和手动调整，然后在PHENIX中进行实空间精修(41、43、54)，并使用Rosetta进一步精修和弛豫(55)。利用聚糖特异性Rosetta方案精修聚糖，该方案并入了碳水化合物构象的现有知识以确保最低能量的聚糖几何结构(56)。最终的聚糖安置通过手动和使用CCP4下分销的Privateer软件包进行检查(57、58)。用Molprobity(59)、EMRinger(60)和PHENIX分析最终的蛋白质模型，统计结果报告于图42。

对于这里呈现的Nb11-刺突^S2P复合物的模型，通过COOT中的刚体精修，仅用框架区将PDB中序列最接近的纳米抗体(β2-肾上腺素能受体Nb60，PDB ID：5JQH)拟合至低温-EM密度图(61)。虽然这些图的较低分辨率排除了环构象的可信分配，但Nb11相对于刺突^S2P的总体取向受到了很好的约束，从而使得能够准确地对两个与刺突^S2P结合的Nb11分子的N末端和C末端之间的距离进行建模。

apo和Nb3结合的刺突^S2P的放射性羟基自由基足迹和质谱法

在25℃下通过大量透析将刺突^S2P和Nb3样品缓冲液交换到10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中。将1.5倍摩尔过量的Nb3加入到5μM的刺突^S2P中，并在25℃下将该复合物孵育24小时。对于放射性足迹，使用Alexa-488荧光团测定优化蛋白质浓度和光束参数(18)。在0-50ms的6个时间点，将浓度为1-3μM的apo刺突^S2P和刺突^S2P-Nb3复合物暴露于加利福尼亚州伯克利高级光源光束线3.2.1的同步X射线白光中，并在暴露后立即用10mM蛋氨酸酰胺淬灭。通过用5％ SDS，5mM DTT在95℃下处理五分钟，然后在37℃下进行PNGase(普洛麦格(Promega))消化2小时来去除聚糖。使用ZebaSpin柱(赛默飞世尔)将样品缓冲液交换到碳酸氢铵(ABC)缓冲液(pH 8.0)中。半胱氨酸的烷基化通过在37℃下用8M尿素和5mM DTT处理30分钟，然后在25℃下用15mM碘乙酰胺在黑暗中孵育30分钟来实现。所有样品用ZebaSpin柱进一步缓冲液交换到ABC pH8.0中，并用胰蛋白酶/Lys-C或Glu-C(普洛麦格)以1:20(w/w)的酶:蛋白质比在37℃下消化8小时。

将样品冻干并重新悬浮在1％的甲酸中，浓度为200fmol/μL。对于每个MS分析，将1μL的样品注射到5mm的Thermo Trap C18筒上，然后通过nanoElute HPLC(布鲁克(Bruker))在用1.9μm的Reprosil C18颗粒(德国迈可HPLC公司(Dr.Maisch HPLC GmbH))包装的15cm柱上分离。分离在50℃和400μL/min的流速下通过0.1％甲酸中的以下梯度进行：2％到17％的乙腈，从0分钟到20分钟，然后是17％到28％的乙腈，从20分钟到40分钟。洗脱液电喷雾电离到布鲁克timsTOF Pro质谱仪中，并使用数据依赖性PASEF采集来收集数据。使用FragPipe平台利用胰蛋白酶或GluC酶的特异性进行MS1肽丰度的数据库搜索和提取，并且将所有的肽和蛋白质识别过滤到1％的错误发现率(62)。对刺突蛋白、常见的污染蛋白和酿酒酵母蛋白质组的连续蛋白质数据库进行搜索(2020年7月23日下载)。注意，包含酿酒酵母蛋白质组以生成足够的真阴性识别群体以用于肽和蛋白质识别的稳健错误发现率估计。最后，用MSstats总结FragPipe报告的每个肽物种的MS1强度曲线下面积(63)。

提取的离子色谱图的峰面积和相关的侧链修饰用于量化每个时间点的修饰。增加光束线暴露时间会减少未被修饰的肽的比例，并且可表示为位点特异性剂量反应图。羟基自由基反应率(k_fp)取决于每个残基的固有反应性及其溶剂可及性，并通过在GraphpadPrism Version 8中将剂量反应拟合到伪一级反应方案来计算。apo刺突^S2P和刺突-Nb3复合物之间在特定残基的k_fp比率提供了关于两个样品之间溶剂可及性变化的信息。将这些变化映射到SARS-CoV-2刺突(PDB 6XR8)(11)。在一些情况下，大量修饰的残基在长时间暴露时显示出剂量反应的平坦化，我们将其解释为自由基引起的损伤。这些过度暴露的时间点被排除在k_fp的计算之外。

D)纳米抗体中和的假病毒测定

ZsGreen SARS-CoV-2-假型慢病毒根据已发表的方案生成(22)。在转导前一天，在24孔板的每一孔中铺板50,000个表达ACE2的HEK293T细胞。在完全培养基(DMEM+10％ FBS+PSG)中生成10倍连续稀释的纳米抗体，并加入假型病毒至200μL的最终体积。用纳米抗体/假型病毒混合物替换培养基四小时，然后去除。用完全培养基洗涤细胞，然后在完全培养基中于37℃孵育。转导后三天，将细胞胰蛋白酶化，并在Attune流式细胞仪(赛默飞世尔)上测量ZsGreen+细胞的比例。

E)真实的SARS-CoV-2中和测定

SARS-CoV-2(分离株法国/IDF0372/2020)由巴斯德研究所(Institut Pasteur)(法国巴黎(Paris,France))主持和由西尔维-范德韦尔夫教授(Pr.Sylvie van der Werf)领导的国家呼吸道病毒参考中心(National Reference Centre for RespiratoryViruses)供应。通过在补充有2％(v/v)胎牛血清(FBS，英杰(Invitrogen))的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中的Vero E6细胞中繁殖来制备病毒原液。病毒滴度通过斑块测定确定。所有涉及活SARS-CoV-2的斑块测定都在巴黎巴斯德研究所(IPP)，按照IPP指南，在批准的实验室中遵循生物安全3级(BSL-3)遏制程序进行。所有的实验都在至少三个生物学上独立的样品中进行。

在Vero E6细胞(CRL-1586，ATCC)中使用斑块减少中和测试对传染性SARS-CoV-2进行中和。简而言之，将纳米抗体(或ACE2-Fc)在含有2％(v/v)FBS的DMEM中连续稀释八倍，并在37℃、5％ CO₂下与50个斑块形成单位(PFU)的SARS-CoV-2混合一小时。然后在37℃、5％ CO2下使用该混合物接种在12孔板中种的Vero E6细胞，持续一小时。在这个病毒吸附时间之后，加入固体琼脂糖覆盖物(DMEM，10％(v/v)FBS和0.8％琼脂糖)。在用4％福尔马林固定细胞之前，再孵育细胞3天，并通过添加水晶紫来可视化斑块。使用每个稀释度的四份孔中斑块的数量，利用3参数逻辑回归(GraphPad Prism版本8)来确定半数最大抑制浓度(IC₅₀)。

F)纳米抗体稳定性研究

通过圆二色性使用配备有Peltier温度控制的Jasco J710 CD光谱仪来评估纳米抗体的热稳定性。将单个纳米抗体构建体在磷酸盐缓冲盐水中稀释到5μM。在25℃至80℃，以1℃/分钟的加热速率在204nm(2nm带宽)处测量摩尔椭圆度。将得到的摩尔椭圆度值归一化，并在应用最近邻平滑函数后在GraphPad Prism 8.0中绘制。

对于在表达ACE2的HEK293T细胞上的纳米抗体竞争实验，将纳米抗体在25℃或50℃孵育一小时。可替代地，每个纳米抗体用便携式网状雾化器进行气溶胶化，从而产生2-5μm的颗粒，最终浓度为0.5mg/mL。所产生的气溶胶通过冷凝到在冰上冷却的50mL管来收集。然后如上所述处理样品以确定与刺突^S2P-Alexa647结合的IC50值，或将样品用于上述假病毒中和研究。

评估mNb6和mNb6-tri对气溶胶化和冻干的稳定性的进一步实验使用的每个构建体的起始浓度为0.5mg/mL。如上所述进行气溶胶化。对于冻干，首先将纳米抗体在液氮中闪冻，并在真空下将溶液干燥完全。将得到的干燥材料重新悬浮在20mM HEPES pH7.5,150mMNaCl中。在Superdex 75Increase 10/300柱上，在20mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl中，对未受压、气溶胶化后和冻干后的样品进行尺寸排除色谱法。如上所述进行评估与刺突^S2P的结合的SPR实验。对于活SARS-CoV-2病毒实验，将气溶胶化、冻干或热处理的样品在运输前在液氮中闪冻。

1.5实例5：纳米颗粒A处理金色叙利亚仓鼠的SARS-CoV-2感染和传播的评价

目的：本研究的目的是评估纳米颗粒A处理野生型金色叙利亚仓鼠的SARS-CoV-2感染的功效。此外，还评价了纳米颗粒A在减少SARS-CoV-2从受感染动物直接传播给未感染的同窝幼鼠的功效。纳米颗粒A处理对暴露于SARS-CoV-2的仓鼠的体重减轻、肺部病毒滴度和肺部重量的影响是主要终点。

材料和方法：

动物：雌性5周龄金色叙利亚仓鼠从查尔斯河实验室(Charles RiverLaboratories)(马萨诸塞州威尔明顿市(Wilmington,MA))获得以用于本实验。仓鼠在使用前隔离3天，并在犹他州立大学实验动物研究中心(Laboratory Animal Research Centerof Utah State University)用Teklad鼠粮(哈兰-特克勒德(Harlan Teklad))和自来水饲养。

病毒：严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)USA_WA1/2020毒株从世界新发病毒和虫媒病毒参考中心(WRCEVA)获得。使病毒在Vero 76细胞中进行两次传代，以生成用于感染仓鼠的工作原液。

实验设计-传播和功效研究：将共24只5周龄雌性金色叙利亚仓鼠随机分为每组4只仓鼠的2组，用作未经处理的感染动物，以及每组8只未感染仓鼠的2组，该未感染仓鼠用于与有和没有纳米颗粒A处理的仓鼠共同居住(图51)。对于功效研究，共有37只仓鼠根据处理剂量被分为4组，每组8只动物，其余5只动物用作体重增加的正常对照(图52)。对于病毒攻击，第1、3和5组的仓鼠通过IP注射氯胺酮/甲苯噻嗪(50mg/kg/5mg/kg)麻醉，然后通过鼻内途径攻击，剂量为在100μl的接种量中1x 104.3的50％细胞培养感染剂量(CCID50)。所有的鼻内处理都是在麻醉动物后以100μl体积施用，与对感染的处理相同。第1组和第3组的动物未经处理。第2组和第4组的动物未被感染，但在研究的第1、2和3天，每天与第1组或第3组的动物共同居住4小时。第2组的动物用作为安慰剂的生理盐水处理。第4组的动物在与受感染的动物共同居住前2小时用纳米颗粒A处理，每天一次。感染前对仓鼠进行称重，此后每天称重以评价与感染相关的体重下降。所有动物在研究的第4天被安乐死，以评价肺部病毒滴度和病毒从受感染的动物到未感染动物的传播。收集所有动物的口咽拭子。

肺组织样品的滴定：通过终点稀释滴定肺组织匀浆。将肺组织匀浆的连续log10稀释液铺板于含有汇合单层Vero 76细胞的96孔微板的四份孔中。在37℃的培养箱中，在5％CO2下，将板孵育6天。然后在光学显微镜下通过视觉观察对板是否存在致细胞病变效应(CPE)进行评分。每个样品的病毒滴度通过线性回归使用里德-明奇(Reed-Muench)法(里德LJ(Reed LJ)和明奇H(Muench H)，估计百分之五十终点的简单方法(A simple method ofestimating fifty per cent endpoints),美国卫生杂志(American Journal ofHygiene).1938)计算。

统计和数字：将单独仓鼠的体重转换为感染当天初始体重的百分比。使用单因素方差分析(ANOVA)比较初始体重百分比曲线，从而将各治疗组和安慰剂处理仓鼠进行比较。使用单因素ANOVA比较肺部病毒滴度和肺部重量，从而将处理动物与安慰剂处理动物进行比较。

这项研究评价了纳米颗粒A的鼻内处理对金色叙利亚仓鼠的SARS-CoV-2传播的功效。还评价了纳米颗粒A处理对感染SARS-CoV-2的仓鼠的肺部病毒滴度和肺部重量的减少。

结果：图57显示了5周龄金色叙利亚仓鼠在受到SARS-CoV-2攻击后和在与受感染的动物共同居住前用纳米颗粒A处理后的初始体重百分比。形状符号相同的动物共同居住。闭合圆圈和闭合方块表示的组在研究第0天被感染。开放圆圈表示的动物在与第1组的动物共同居住前是未感染的和安慰剂处理的，该共同居住为每天4小时，持续3天。开放方块表示的动物在与第3组的动物共同居住前是未感染的和纳米颗粒A处理的。在用单因素ANOVA比较时，初始体重百分比的差异没有统计学意义。

图58显示了5周龄金色叙利亚仓鼠在受到SARS-CoV-2攻击后和在与受感染的动物共同居住前用纳米颗粒A处理后的肺部病毒滴度。形状符号相同的动物共同居住。闭合圆圈和闭合方块表示的组在研究第0天被感染。开放圆圈表示的动物在与第1组的动物共同居住前是未感染的和安慰剂处理的，该共同居住为每天4小时，持续3天。开放方块表示的动物在与第3组的动物共同居住前是未感染的和纳米颗粒A处理的。纳米颗粒A处理显著降低了与SARS-CoV-2感染动物共同居住的未感染动物的肺部病毒滴度。此数据总结在图53中。

图59显示了5周龄金色叙利亚仓鼠在受到SARS-CoV-2攻击后和在与受感染的动物共同居住前用纳米颗粒A处理后的肺部重量。形状符号相同的动物共同居住。闭合圆圈和闭合方块表示的组在研究第0天被感染。开放圆圈表示的动物在与第1组的动物共同居住前是未感染的和安慰剂处理的，该共同居住为每天4小时，持续3天。开放方块表示的动物在与第3组的动物共同居住前是未感染的和纳米颗粒A处理的。在用单因素ANOVA比较时，各组之间的肺部重量没有统计学上的差异。

图60显示了5周龄金色叙利亚仓鼠在受到SARS-CoV-2攻击后和在与受感染的动物共同居住前用纳米颗粒A处理后的口咽拭子病毒滴度。形状符号相同的动物共同居住。闭合圆圈和闭合方块表示的组在研究第0天被感染。开放圆圈表示的动物在与第1组的动物共同居住前是未感染的和安慰剂处理的，该共同居住为每天4小时，持续3天。开放方块表示的动物在与第3组的动物共同居住前是未感染的和纳米颗粒A处理的。单因素ANOVA确定口咽拭子病毒滴度无显著差异。此数据总结在图54中并且图61显示了5周龄金色叙利亚仓鼠用纳米颗粒A处理和感染SARS-CoV-2后的初始体重百分比。在用单因素ANOVA比较时，初始体重百分比的差异没有统计学意义。

图62显示了5周龄金色叙利亚仓鼠用纳米颗粒A处理和感染SARS-CoV-2后的肺部病毒滴度。与安慰剂处理的动物相比，开始以2mg/kg/d和0.63mg/kg/d的剂量用纳米颗粒A处理显著降低了肺部病毒滴度。此数据总结在图55中。

图63显示了5周龄金色叙利亚仓鼠在受到SARS-CoV-2攻击后和在与受感染的动物共同居住前用纳米颗粒A处理后的肺部重量。在用单因素ANOVA比较时，各组之间的肺部重量没有统计学上的差异。

图64显示了5周龄金色叙利亚仓鼠用纳米颗粒A处理和感染SARS-CoV-2后的口咽拭子病毒滴度。以2mg/kg/d的剂量用纳米颗粒A处理显著降低了感染SARS-CoV-2的仓鼠的口咽拭子滴度。此数据总结在图56中。

结论：本研究评价了鼻内纳米颗粒A处理对金色叙利亚仓鼠SARS-CoV-2感染传播的功效。还评价了纳米颗粒A处理对肺部病毒滴度、口咽拭子滴度和肺部重量的影响。以2mg/kg/d的剂量用纳米颗粒A处理显著降低了SARS-CoV-2对未感染动物的传播。在八只暴露于感染动物的未感染动物中，有三只动物的肺部没有检测到病毒。在其余五只动物中，与安慰剂处理的未感染动物相比，肺部病毒滴度至少减少了一log10。虽然即使在安慰剂处理动物中也没有持续检测到病毒，但纳米颗粒A治疗显著降低了口咽拭子滴度。在功效研究中，与安慰剂处理动物相比，用2mg/kg/d或0.63mg/kg/d处理的动物的肺部病毒滴度的肺部病毒滴度显著降低。与安慰剂处理动物相比，2mg/kg/d剂量的纳米颗粒A也显著降低了口咽滴度。在2mg/kg/d、0.63mg/kg/d和0.2mg/kg/d的剂量下，八只动物中分别只有一只、两只和三只检测到口咽拭子滴度。在八只安慰剂处理动物中，有六只检测到口咽拭子滴度。

在动物中的任一只中都没有观察到处理的不良反应。处理后没有体重下降也表明仓鼠对处理的耐受性良好。

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本说明书中提及的所有出版物、专利申请和登录号通过引用并入本文，其程度与每个单独的出版物或专利申请明确且单独地指示通过引用并入其引用的材料相同。

Claims (101)

1.一种组合物，其包括与具有SEQ ID NO：300或图17A所述序列的刺突蛋白结合的单结构域抗原结合结构域(sdABD)，其中所述sdABD从N至C末端包括FR1-vhCDR1-FR2-vhCDR2-FR3-vhCDR3-FR，其中所述vhhCDR1、vhhCDR2和所述vhhCDR3选自图13、图15和图25中描绘的集。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有序列GI(I/Y/W/F/V/L)FGRNA，所述vhCDR2具有序列TRR(G/H/Y/G/Q)SITY，并且所述vhCDR3具有序列AADPA(S/V/L/I/T)PA(P/F/W/Y/L/V)GDY。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：5，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：6，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：7。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：8，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：9，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：10。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：11，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：12，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：13。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：14，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：15，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：16。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：17，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：18，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：19。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：20，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：21，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：22。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：23，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：24，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：25。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：26，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：27，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：28。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：29，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：30，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：31。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：32，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：33，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：34。

13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：35，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：36，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：37。

14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：38，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：39，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：40。

15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：41，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：42，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：43。

16.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：44，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：45，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：46。

17.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：47，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：48，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：49。

18.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：50，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：51，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：52。

19.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：53，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：54，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：55。

20.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：56，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：57，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：58。

21.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：59，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：60，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：61。

22.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：62，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：63，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：64。

23.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：65，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：66，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：67。

24.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：68，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：69，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：70。

25.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：71，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：72，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：73。

26.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：74，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：75，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：76。

27.根据权利要求3至25中任一权利要求所述的组合物，其中所述sdABD的框架序列具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

28.根据权利要求1至25中任一权利要求所述的组合物，其中所述组合物进一步包括使用结构域接头共价附接到所述sdABD的半衰期延长结构域。

29.根据权利要求26所述的组合物，其中所述半衰期延长结构域选自由抗人血清白蛋白(HSA)sdABD和全部或部分HSA组成的群组。

30.一种组合物，其包括与具有SEQ ID NO：300或图17A所述序列的刺突蛋白结合的MASC融合蛋白，其中所述MASC融合蛋白从N至C末端包括FR1-vhCDR1-FR2-vhCDR2-FR3-vhCDR3-FR-结构域接头-FR1-vhCDR1-FR2-vhCDR2-FR3-vhCDR3-FR，其中所述vhhCDR1、vhhCDR2和所述vhhCDR3选自图13、图15和图25中描绘的集。

31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有序列GI(I/Y/W/F/V/L)FGRNA，所述vhCDR2具有序列TRR(G/H/Y/G/Q)SITY，并且所述vhCDR3具有序列AADPA(S/V/L/I/T)PA(P/F/W/Y/L/V)GDY。

32.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：5，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：6，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：7。

33.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：8，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：9，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：10。

34.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：11，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：12，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：13。

35.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：14，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：15，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：16。

36.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：17，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：18，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：19。

37.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：20，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：21，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：22。

38.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：23，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：24，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：25。

39.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：26，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：27，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：28。

40.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：29，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：30，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：31。

41.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：32，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：33，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：34。

42.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：35，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：36，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：37。

43.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：38，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：39，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：40。

44.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：41，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：42，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：43。

45.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：44，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：45，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：46。

46.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：47，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：48，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：49。

47.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：50，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：51，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：52。

48.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：53，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：54，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：55。

49.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：56，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：57，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：58。

50.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：59，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：60，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：61。

51.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：62，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：63，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：64。

52.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：65，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：66，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：67。

53.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：68，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：69，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：70。

54.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：71，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：72，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：73。

55.根据权利要求30所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：74，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：75，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：76。

56.根据权利要求32至54中任一权利要求所述的组合物，其中所述sdABD的框架序列具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

57.根据权利要求30至54中任一权利要求所述的组合物，其中所述组合物进一步包括使用结构域接头共价附接到所述sdABD的半衰期延长结构域。

58.根据权利要求55所述的组合物，其中所述半衰期延长结构域选自由抗人血清白蛋白(HSA)sdABD和全部或部分HSA组成的群组。

59.一种组合物，其包括与具有SEQ ID NO：300或图17A所述序列的刺突蛋白结合的MASC融合蛋白，其中所述MASC融合蛋白从N至C末端包括FR1-vhCDR1-FR2-vhCDR2-FR3-vhCDR3-FR-结构域接头-FR1-vhCDR1-FR2-vhCDR2-FR3-vhCDR3-FR-结构域接头-FR1-vhCDR1-FR2-vhCDR2-FR3-vhCDR3-FR，其中所述vhhCDR1、vhhCDR2和所述vhhCDR3选自图13、图15和图25中描绘的集。

60.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有序列GI(I/Y/W/F/V/L)FGRNA，所述vhCDR2具有序列TRR(G/H/Y/G/Q)SITY，并且所述vhCDR3具有序列AADPA(S/V/L/I/T)PA(P/F/W/Y/L/V)GDY。

61.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：5，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：6，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：7。

62.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：8，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：9，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：10。

63.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：11，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：12，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：13。

64.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：14，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：15，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：16。

65.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：17，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：18，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：19。

66.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：20，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：21，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：22。

67.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：23，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：24，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：25。

68.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：26，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：27，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：28。

69.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：29，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：30，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：31。

70.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：32，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：33，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：34。

71.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：35，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：36，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：37。

72.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：38，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：39，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：40。

73.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：41，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：42，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：43。

74.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：44，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：45，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：46。

75.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：47，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：48，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：49。

76.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：50，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：51，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：52。

77.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：53，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：54，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：55。

78.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：56，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：57，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：58。

79.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：59，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：60，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：61。

80.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：62，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：63，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：64。

81.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：65，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：66，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：67。

82.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：68，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：69，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：70。

83.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：71，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：72，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：73。

84.根据权利要求59所述的组合物，其中所述vhCDR1具有SEQ ID NO：74，所述vhCDR2具有SEQ ID NO：75，并且vhCDR3具有SEQ ID NO：76。

85.根据权利要求61至83中任一权利要求所述的组合物，其中所述sdABD的框架序列具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

86.根据权利要求59至83中任一权利要求所述的组合物，其中所述组合物进一步包括使用结构域接头共价附接到所述sdABD的半衰期延长结构域。

87.根据权利要求84所述的组合物，其中所述半衰期延长结构域选自由抗人血清白蛋白(HSA)sdABD和全部或部分HSA组成的群组。

88.一种编码根据权利要求1至29、30至58和59至87中任一权利要求所述的组合物的核酸。

89.一种包括根据权利要求88所述的核酸的表达载体。

90.一种包括根据权利要求60所述的表达载体的宿主细胞。

91.一种制备根据权利要求1至29、30至58和59至87中任一权利要求所述的组合物的方法，所述方法包括在表达所述组合物的条件下培养根据权利要求90所述的宿主细胞和回收所述组合物。

92.一种治疗或预防SARS-CoV2病毒感染的方法，所述方法包括向人施用根据权利要求1至29、30至58和59至87中任一权利要求所述的组合物，从而治疗或预防所述感染。

93.一种中和SARS-CoV2病毒的方法，所述方法包括向人施用根据权利要求1至29、30至58和59至87中任一权利要求所述的组合物，从而中和所述病毒。

94.根据权利要求92或93所述的方法，其中所述施用包括静脉内施用。

95.根据权利要求92或93所述的方法，其中所述施用包括鼻施用。

96.根据权利要求92或93所述的方法，其中所述施用包括吸入。

97.根据权利要求96所述的方法，其中所述吸入是使用雾化器实现的。

98.一种冻干组合物，其包括根据权利要求1至29、30至58和59至87中任一权利要求所述的MASC蛋白。

99.一种组合物，其包括与三聚刺突蛋白结合的抗原结合结构域(ABD)，所述刺突蛋白的每个单体具有SEQ ID NO：300或图17A所述的序列，其中所述ABD与第一单体的第一表位结合并与第二单体的第二表位结合。

100.根据权利要求99所述的组合物，其中所述第一表位包括SC2刺突RBD的ACE2结合区域内的残基446、447、449、453、455、456、483-486、489-490、493-496、498、501和505，并且所述第二表位包括残基342、343、367、371-375、404和436-441。

101.一种组合物，其包括与三聚刺突蛋白结合的ABD，所述刺突蛋白的每个单体具有SEQ ID NO：300或图17A所述的序列，其中所述结合导致所述刺突蛋白的RBD被锁定在非延伸位置。