WO2021244601A1 - SARS-CoV-2病毒的中和抗体及其应用 - Google Patents
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Definitions
- the fifth aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition
- a pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding fragment, nucleic acid, carrier or cell.
- the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier, preferably Specifically, the pharmaceutically acceptable carrier includes one or more of the following: pharmaceutically acceptable solvents, dispersants, additives, plasticizers, and pharmaceutical excipients.
- the eleventh aspect of the present invention provides the use of the antibody or its antigen-binding fragment, nucleic acid, carrier, cell or pharmaceutical composition for the treatment and prevention of diseases.
- the twelfth aspect of the present invention provides the use of the antibody or its antigen-binding fragment, nucleic acid, kit, or pharmaceutical composition for detection and diagnosis.
- Figure 1 shows the serum titers of four S protein immunized mice
- OctetRED 96 detects the binding of candidate antibody, IgG4 wild-type control antibody and human CD64:
- the results are shown in Figure 10A-10B.
- the affinity of the IgG4 wild-type control antibody to the human CD64 receptor is 3.41E-09M, while the modified candidate antibody CA530 does not bind to CD64, which can greatly reduce the ADE of the candidate antibody. effect.
- the IgG4 wild-type control antibody is the same as in 3.5.1.
- Biacore 8K detects the binding of candidate antibodies CA521, CA521-IgG1 wild-type control antibody and human Fc ⁇ R:
- the buffer system of the antibody before dilution is 10.5mM histidine hydrochloride, 9.5mM histidine, 0.08g/mL trehalose, 0.0002g/mL polysorbate 80, water, and 21.5mg/mL of the antibody, pH6.0.
- Table 13 shows the ADCP effect results of different subtypes of antibody CA521.
- CA304, CA413 and CA521 all have good neutralizing activities, with IC50 of 0.080, 0.089 and 0.132 ⁇ g/mL, respectively.
- mice of 6-8 weeks without specific pathogenicity were lightly anesthetized with isoflurane, and 2 ⁇ 10 3 PFU SARS-CoV-2 mice were adapted to the strain (Military Academy of Medical Sciences, MASCp6) instilled through the nose.
- Three days after injection (3dpi) mouse lung and tracheal tissues were collected for virus titer and organ inspection.
- the experimental protocol was approved by the Animal Experiment Committee of China AMMS Experimental Animal Center. The experimental results are shown in Figure 16A-16B.
- Anti-drug antibodies were detected by ELISA method before administration and 14, 28, 42 and 56 days after administration.
- the ADA (anti-drug antibody) results of all animals before administration and in each group were negative; 14 days after the end of administration, there were 0 (0/6), 1 (1/6), and 0 (0/6) animals in each group.
- the animal ADA results were positive, 28 and 42 days after the end of the administration, 1 (1/6), 1 (1/6), 0 (0/6) animals in each group were positive for the ADA result, and 56 after the end of the administration. In each group, 2 (2/6), 1 (1/6), and 1 (1/6) animals were positive for ADA.
- the IC50 of CA555 antibody blocking the binding of Wuhan-Hu-1 S1+S2 protein to ACE2 was 0.187nM
- the IC50 of blocking the binding of S1+S2 protein of B.1.351 strain to ACE2 was 0.367nM
- the IC50 for blocking the binding of S1+S2 protein of p.1 strain to ACE2 was 0.355nM.
- CA555 not only has excellent blocking ability on the binding of S1+S2 protein of Wuhan-Hu-1 strain to ACE2, but also has good blocking ability on the binding of S1+S2 protein of Brazil and South Africa mutant strains to ACE2. It can be seen from Figure 20 that CA555 also has a good blocking effect on the British strain.
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Abstract
本发明涉及一种SARS-CoV-2病毒的中和抗体，所述中和抗体能结合SARS-CoV-2病毒上的S蛋白，阻断SARS-CoV-2病毒引起的细胞病变或者中和SARS-CoV-2病毒。本发明还涉及编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸；含有所述核酸的细胞；含有所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述细胞的药物组合物；含有所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述药物组合物的试剂盒；以及所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述药物组合物在预防、治疗、检测或诊断与SARS-CoV-2病毒相关的疾病的应用。
Description
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，尤其涉及一种SARS-CoV-2病毒的中和抗体及其应用。
新型冠状病毒(2019-nCoV，又称SARS-CoV-2)在全球范围内引起的疾病COVID-19(Corona Virus Disease-19)，对人类的生命健康带来了极大的威胁，对全球的经济发展也造成了无法估量的损失。
SARS-CoV-2病毒表面的S蛋白(spike protein)组合成一个三聚体，单个S蛋白约含有1300个氨基酸，属于一类膜融合蛋白，决定病毒的宿主范围和特异性，是宿主中和抗体的重要作用位点。S蛋白含有两个亚基(subunit)S1和S2,S1主要包含有受体结合区(receptor binding domain,RBD)，负责识别细胞的受体,S2含有膜融合过程所需的基本元件。目前的研究报道显示，SARS-CoV-2病毒的S1亚基的RBD区可以通过结合人体细胞表面的ACE2(血管紧张素转换酶2)启动感染(亲和力达15nM)，在S1/S2位点发生酶切后S1亚基脱离，暴露S2’酶切位点并进行酶切，发生一系列构象改变后利用FP(融合肽)启动病毒与细胞的膜融合。
新冠病毒(SARS-CoV-2)的突变是病毒的进化方式。在不破坏SARS-CoV-2关键生化表型的前提下，通过抗体靶向位点固定突变，引发抗原表位漂移，以逃避相关抗体的识别。目前已报到的SARS-CoV-2主要突变株包括英国变异株B.1.1.7、南非变异株B.1.351以及巴西变异株P.1。
B.1.1.7的新冠病毒变体是2020年12月英国向世卫组织报告的一种新冠病毒变体，其传播能力要比原始毒株高70％左右，伦敦新冠感染病例超过60％都来自变异病毒。该病毒株最大特点是出现了十几个关键位点的变异，在B.1.1.7突变株谱系中，最值得注意的突变位点是RBD(受体结合区域)中的关键氨基酸突变N501Y。病毒蛋白的结构发生改变后跟人体当中的ACE2受体更容易结合，带来的实际后果就是它的传播力更强。
南非变异株B.1.351出现于2020年8月，截至2020年12月底，南非由B.1.351引起的感染比例已超80％。巴西变异株P.1于2020年12月初在巴西玛瑙斯市出现，到2021年1月中旬已经造成整个城市疫情的大规模爆发。南非变异株B.1.351和巴西变异株P.1除均含有D614G、N501Y以外，还发现存在E484K变异，该突变具有减弱抗病毒中和抗体的效果，也可能导致病毒逃过免疫系统的识别。
针对上述新型冠状病毒，开发特异性抗体阻断病毒S蛋白对宿主细胞的感染对于新冠肺炎的预防和治疗具有重要的意义。
发明内容
本发明提供一种抗体或其抗原结合片段,能结合SARS-CoV-2病毒上的S蛋白，阻断SARS-CoV-2病毒引起的细胞病变或者中和SARS-CoV-2病毒。本发明还提供了编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸；含有所述核酸的细胞；含有所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述细胞的药物组合物；含有所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述药物组合 物的试剂盒；以及所述抗体或其抗原结合片段、所述核酸、所述药物组合物在预防、治疗、检测或诊断与SARS-CoV-2病毒相关的疾病的应用。
本发明的一个方面提供一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体结合新型冠状病毒(即SARS-CoV-2,又称2019-nCoV)上的S蛋白，阻断SARS-CoV-2病毒引起的细胞病变或者中和SARS-CoV-2病毒。
在本申请的方案中，所述新型冠状病毒，即SARS-CoV-2或2019-nCoV为2019年首次发现的新冠病毒原始毒株与后续出现的新冠病毒突变株的统称。进一步的，所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种。
进一步的，所述S蛋白为SARS-CoV-2病毒表面的S蛋白(spike protein)，所述S蛋白含有两个亚基(subunit)S1和S2。更进一步的，所述抗体能结合所述SARS-CoV-2病毒上的S蛋白指的是结合S蛋白的S1和S2亚基中的一个或多个，或结合S1亚基的RBD蛋白。更进一步的，所述抗体或其抗原结合片段结合SARS-CoV-2病毒的RBD的A475、E484、G485、N487、Y489、Q493、S494、Y449、Y453、L455、F456、F486和F490残基。
进一步的，本申请中所述抗体或抗原结合片段能阻断SARS-CoV-2病毒引起的表达ACE2细胞的病变，或阻断SARS-CoV-2病毒对表达ACE2的细胞的感染、入侵等。更进一步的，所述细胞包括天然表达ACE2的细胞或人工表达ACE2的细胞。更进一步的，所述细胞为哺乳动物细胞。更进一步的，所述哺乳动物包括人、以及非人动物如鼠或猴等。
在本发明的一个具体实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段在50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM或1nM浓度以下时仍阻断SARS-CoV-2病毒引起的细胞病变，或者中和SARS-CoV-2病毒。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供包含下述3个轻链互补决定区和/或3个重链互补决定区，可结合SARS-CoV-2病毒S蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含SEQ ID NO:6所示的LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7所示的LCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8所示的LCDR3氨基酸序列；和/或所述抗体或其抗原结合片段的3个重链互补决定区包含SEQ ID NO:9所示的HCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:10所示的HCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:11所示的HCDR3氨基酸序列；所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种，优选为Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株或p.1毒株；更优选为Wuhan-Hu-1毒株。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供包含下述3个轻链互补决定区和/或3个重链互补决定区，可结合SARS-CoV-2病毒S蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含SEQ ID NO:12所示的LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:13所示的LCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:14所示的LCDR3氨基酸序列，和/或所述抗体或其抗原结合片段的3个重链互补决定区包含SEQ ID NO:9所示的HCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:10所示的HCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:11所示的HCDR3氨基酸序列；所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种，优选为Wuhan-Hu-1毒株或B.1.1.7毒株；更优选为Wuhan-Hu-1毒株；更进一步地，所述抗体或其抗原结合片段与Wuhan-Hu-1毒株的RBD的A475、E484、G485、N487、Y489、Q493、S494、Y449、Y453、L455、F456、F486和F490残基结合。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供包含下述3个轻链互补决定区和/或3个重 链互补决定区，可结合SARS-CoV-2病毒S蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含SEQ ID NO:6所示的LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7所示的LCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:15所示的LCDR3氨基酸序列，和/或所述抗体或其抗原结合片段的3个重链互补决定区包含SEQ ID NO:9所示的HCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:16所示的HCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:17所示的HCDR3氨基酸序列；所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种，优选为Wuhan-Hu-1毒株。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供包含下述3个轻链互补决定区和/或3个重链互补决定区，可结合SARS-CoV-2病毒S蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:21所示的LCDR3，和/或所述抗体或其抗原结合片段的3个重链互补决定区包含SEQ ID NO:9所示的HCDR1、SEQ ID NO:10所示的HCDR2和SEQ ID NO:11所示的HCDR；所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种，优选为Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株或p.1毒株；更优选为Wuhan-Hu-1毒株。
在本申请方案中，关于VL(轻链可变区)、VH(重链可变区)、LCDR(轻链互补决定区)、HCDR(重链互补决定区)、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3的各个实施方式可以各自单独实施，也可以任意组合实施。
在本发明的一个具体实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)SEQ ID NO:1所示的轻链可变区，和/或SEQ ID NO:2所示的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段结合SARS-CoV-2病毒S蛋白；所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种，优选为Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株或p.1毒株；更优选为Wuhan-Hu-1毒株；
(2)SEQ ID NO:3所示的轻链可变区，和/或SEQ ID NO:2所示的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段结合SARS-CoV-2病毒S蛋白；所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种，优选为Wuhan-Hu-1毒株或B.1.1.7毒株；更优选为Wuhan-Hu-1毒株；更进一步地，所述抗体或其抗原结合片段与Wuhan-Hu-1毒株的RBD的A475、E484、G485、N487、Y489、Q493、S494、Y449、Y453、L455、F456、F486和F490残基结合；
(3)SEQ ID NO:4所示的轻链可变区，和/或SEQ ID NO:5所示的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段结合SARS-CoV-2病毒S蛋白；所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种，优选为Wuhan-Hu-1毒株；
或者
(4)SEQ ID NO:20所示的轻链可变区，和/或SEQ ID NO:2所示的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段结合SARS-CoV-2病毒S蛋白；所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种，优选为Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株或p.1毒株；更优选为Wuhan-Hu-1毒株。
在本发明的一个具体实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定区的序列为SEQ ID NO:18。
进一步的，所述抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区的序列为SEQ ID NO:19。
在本发明的一个具体实施方式中，提供了下述结合SARS-CoV-2病毒S蛋白的抗体或其抗原结合片段：
| 抗体ID | 轻链可变区序列 | 重链可变区序列 | 轻链恒定区序列 | 重链恒定区序列 |
| CA304 | SEQ ID NO:1 | SEQ ID NO:2 | SEQ ID NO:19 | SEQ ID NO:18 |
| CA521 | SEQ ID NO:3 | SEQ ID NO:2 | SEQ ID NO:19 | SEQ ID NO:18 |
| CA530 | SEQ ID NO:4 | SEQ ID NO:5 | SEQ ID NO:19 | SEQ ID NO:18 |
| CA555 | SEQ ID NO:20 | SEQ ID NO:2 | SEQ ID NO:19 | SEQ ID NO:18 |
具体地，CA304抗体或CA555抗体与SARS-CoV-2病毒S蛋白结合，所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种；优选为Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株或p.1毒株；更优选为Wuhan-Hu-1毒株。
CA521抗体与SARS-CoV-2病毒S蛋白结合，所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种，优选为Wuhan-Hu-1毒株或B.1.1.7毒株；更优选为Wuhan-Hu-1毒株；更进一步地，所述抗体或其抗原结合片段与Wuhan-Hu-1毒株的RBD的A475、E484、G485、N487、Y489、Q493、S494、Y449、Y453、L455、F456、F486和F490残基结合；
CA530抗体与SARS-CoV-2病毒S蛋白结合，所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种，优选为Wuhan-Hu-1毒株。
在本发明的方案中，本发明的所述抗体或其抗原结合片段包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv或dsFv片段等。
本发明的第二方面提供了一种核酸，编码所述抗体或其抗原结合片段。
本发明的第三方面提供了一种载体，其包含编码所述抗体或其抗原结合片段的所述核酸。所述载体可用于表达所述抗体或其抗原结合片段。优选地，所述载体可以是病毒载体；优选地，所述病毒载体包含但不限于慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体等；优选地，所述载体可以是非病毒载体；优选地，所述载体可以是哺乳细胞表达载体；优选地，所述表达载体可以是细菌表达载体；优选地，所述表达载体可以是真菌表达载体。
本发明的第四方面提供了一种细胞，所述细胞包括所述核酸或所述载体，所述细胞可表达所述抗体或其抗原结合片段。优选地，所述细胞为细菌细胞；优选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞等；优选地，所述细胞为真菌细胞；优选地，所述真菌细胞为酵母细胞；优选地，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞等；优选地，所述细胞为哺乳动物细胞；优选地，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人胚胎肾细胞(293)、B细胞、T细胞、DC细胞或NK细胞等。
本发明的第五方面提供了一种药物组合物，其包所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体或细胞，优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体，优选地，所述药学上可接受的载体包括以下中的一种或多种：药学上可接受的溶剂、分散剂、附加剂、塑形剂、药物辅料。
在本发明的具体实施方式中，所述药物组合物包含所述抗体或其抗原结合片段以及缓冲液。进一步的，所述缓冲液包括海藻糖和聚山梨酯80中的一种或多种。更进一步的，所述药物组合物pH为5.5-6.5。更进一步的，所述缓冲液还包括盐酸组氨酸和组氨酸中的一种或多种。更进一步的，基于所述药物组合物的总体积，所述盐酸组氨酸和组氨酸的摩尔比为10.5： 9.5。
进一步的，所述缓冲液包括盐酸组氨酸、组氨酸、海藻糖、聚山梨酯80中的一种或多种。更进一步的，基于所述药物组合物的总体积，所述药物组合物包括0.04-0.1g/mL海藻糖,0.0001-0.0003g/mL聚山梨酯80，以及10-30mg/mL的所述抗体或其抗原结合片段。更进一步的，基于所述药物组合物的总体积，所述药物组合物包括10.5mM盐酸组氨酸,9.5mM组氨酸,0.08g/mL海藻糖，0.0002g/mL聚山梨酯80，以及20±2mg/mL的所述抗体或其抗原结合片段。更进一步的,所述药物组合物还包括水。
更进一步的,针对CA521，CA304，CA555或CA413抗体,所述药物组合物包括10.5mM盐酸组氨酸,9.5mM组氨酸,0.08g/mL海藻糖，0.0002g/mL聚山梨酯80，以及20±2mg/mL的所述抗体或其抗原结合片段。更进一步的,所述药物组合物还包括水。
在本发明的另一个具体实施方式中，针对CA521，CA304，CA555或CA413抗体,所述药物组合物也可以包括10mM CH
3COONa·3H
2O,30mM NaCl,0.03％Tween-20,5％蔗糖,10-30mg/mL的所述抗体。进一步的，所述药物组合物的pH为5.5-6.5。
更进一步的，所述药物组合物的剂型为注射制剂。更进一步的，所述药物组合物可以通过静脉注射或者通过腹腔注射进行给药。更进一步的，所述药物组合物为单位制剂(或单剂量形式的制剂)。在本申请说明书中，所述单位制剂为满足一次给药剂量的制剂。
更进一步的，所述单位制剂中含有治疗有效量的所述抗体或抗体结合片段。更进一步的，所述单位制剂中含有约30mg至约2400mg的所述抗体或抗体结合片段。更进一步的，所述单位制剂中含有约30mg、约100mg、约150mg、约600mg、约1200mg、约2000mg、或约2400mg的所述抗体或抗体结合片段。
更进一步的，所述单位制剂的给药对象为感染SARS-CoV-2病毒的受试者(例如感染新冠的患者)，或与诊断为SARS-CoV-2感染的病例有接触的无症状的受试者，或健康受试者(例如即将前往新冠高风险地区或即将接触感染SARS-CoV-2病毒患者的健康个体)。进一步的，所述感染SARS-CoV-2病毒的患者，例如可以是：1)轻度及中度COVID-19患者，即发病时间≤7天且72小时之内按照NIH(美国国立卫生研究院National Institutes of Health)于2020年4月发布的(COVID-19)的治疗指南确诊的轻度及中度新型冠状病毒肺炎的患者；或者，2)重度及危重COVID-19患者，即前72小时内实验室检查(如RT-PCR检查)确认感染2019-nCoV，按照NIH于2020年4月发布的(COVID-19)的治疗指南确诊的重度及危重新型冠状病毒肺炎患者。
本发明的第六方面提供了一种试剂盒，其包含本发明所述抗体或其抗原结合片段，或包含编码抗体或其抗原结合片段的核酸。本发明的第七方面提供了所述抗体或其抗原结合片段、核酸、载体或细胞在制备治疗或预防疾病的药物组合物中的应用。本发明的第八方面提供了所述抗体或其抗原结合片段或核酸在制备诊断、检测试剂盒中的应用。
本发明的第九方面提供了一种治疗或预防疾病的方法，包括将本发明的所述抗体或抗原结合片段、核酸、载体、细胞或药物组合物给予有需要的受试者。本发明的第十方面提供了一种诊断、检测的方法，包括将本发明的所述抗体或抗原结合片段、核酸、试剂盒或药物组合物给予有需要的受试者或样本。
本发明的第十一方面提供了所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、细胞或药物组合物用于治疗、预防疾病的用途。本发明的第十二方面提供了所述的抗体或其抗原结合片段、核酸、试剂盒、或药物组合物用于检测、诊断的用途。
本发明的第十三方面提供了所述抗体或其抗原结合片段，所述的核酸，或所述的药物组合物用于预防、治疗、检测或诊断与SARS-CoV-2病毒相关的疾病的应用。
在本发明的方案中，所述疾病是COVID-19肺炎及其他相关并发症。进一步的，所述抗体或抗原结合片段能阻断SARS-CoV-2病毒或其假病毒对细胞的感染、入侵等，或者中和SARS-CoV-2病毒或其假病毒。更进一步的，所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株毒株中的一种或多种。
本发明还提供了CA304或CA555抗体用于预防、治疗、检测或诊断与SARS-CoV-2病毒相关的疾病的应用；所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种，优选为Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株或p.1毒株；更优选为Wuhan-Hu-1毒株。
本发明还提供了CA521抗体用于预防、治疗、检测或诊断与SARS-CoV-2病毒相关的疾病的应用；所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种，优选为Wuhan-Hu-1毒株或B.1.1.7毒株；更优选为Wuhan-Hu-1毒株。
表1-1显示了上述SARS-CoV-2病毒各毒株的名称，出现地以及主要的突变情况。
表1-1
本发明提供的抗体或其抗原结合片段具有以下的一种或多种优势：
1、对SARS-CoV-2病毒的S蛋白或S1蛋白或S2蛋白有亲和力；
2、对SARS-CoV-2病毒的Spike RBD蛋白与ACE2的结合有阻断能力；
3、阻断SARS-CoV-2病毒的假病毒对细胞的感染；
4、阻断SARS-CoV-2病毒的真病毒对细胞的感染；
5、副作用和毒性小，安全性高。
图1示出了4种S蛋白免疫小鼠血清滴度；
图2A-图2C示出了ELISA检测各候选抗体对SARS-CoV-2病毒(Wuhan-Hu-1毒株)的Spike S1+S2蛋白的结合灵敏度；
图3A-3B示出了ELISA检测候选抗体对SARS-CoV-2病毒(Wuhan-Hu-1毒株)的S1的结合灵敏度；
图4示出了ELISA检测候选抗体对SARS-CoV-2病毒(Wuhan-Hu-1毒株)的S2的结合灵敏度；
图5示出了ELISA检测候选抗体阻断ACE2与对SARS-CoV-2病毒(Wuhan-Hu-1毒株)的Spike RBD蛋白的结合；
图6A-图6C示出了流式细胞术检测抗体与CHO-K1-2019-nCoV Spike cells(表达Wuhan-Hu-1的Spike蛋白的细胞)的结合；
图7示出了流式细胞术检测抗体阻断SARS-CoV-2病毒(Wuhan-Hu-1毒株)的RBD与293T-hACE2细胞的结合；
图8示出了流式细胞术检测抗体阻断SARS-CoV-2病毒(Wuhan-Hu-1毒株)的hACE2与293F-SARS-CoV-2-Spike cells(表达Wuhan-Hu-1的Spike蛋白的细胞)的结合；
图9示出了ELISA检测抗体与人C1q受体的结合；
图10A-图10B分别示出了OctetRED 96检测IgG4野生型对照抗体和候选抗体CA530与人CD64的结合；
图11示出了CA521对CHO-K1-spike细胞没有明显的ADCC效应；
图12A示出了CA521对Daudi细胞没有CDC效应，图12B示出了CA521对CHO-K1-spike细胞没有CDC效应；
图13示出了候选抗体阻断SARS-CoV-2病毒(Wuhan-Hu-1毒株)的假病毒对细胞的感染的能力；
图14示出了CA521中和抗体体外对SARS-CoV-2病毒(病毒株为BetaCoV/Beijing/IMEBJ01/2020)的中和活性；
图15示出了CA304、CA413和CA521阻断SARS-CoV-2病毒(病毒株为BetaCoV/Beijing/IMEBJ01/2020)的真病毒感染Vero细胞；
图16A-16B示出了抗体给药3天后肺与气管中病毒(SARS-CoV-2的小鼠适应菌株)载量；
图17A示出了SARS-CoV-2病毒(Wuhan-Hu-1毒株)的S-ECD和CA521结合的3D结构模型，图17B示出了S-ECD和CA521结合的结合表位分析；
图18示出了CA521、ACE2、H014、CB6与RBD的结合位点。
图19示出了CA304阻断不同毒株Spike S1+S2蛋白与ACE2的结合。
图20示出了CA555阻断不同毒株Spike S1+S2蛋白与ACE2的结合。
图21示出了CA304对不同毒株的假病毒中和活性。
图22示出了CA555对不同毒株的假病毒中和活性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。应理解，举出以下实施例是为了向本发明所属技术领域的一般专业人员就如何利用本发明之方法和组合物提供一个完整的公开和说明，并非用于限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.抗2019-nCoV(或SARS-CoV-2)单克隆抗体的产生
1.1免疫方案 免疫所用Wuhan-Hu-1的各S蛋白及所用小鼠如表1所示。
表1各S蛋白来源及所用小鼠
共有Wuhan-Hu-1的Spike S1+S2、Spike S1、Spike S2、Spike RBD四种抗原蛋白，分为以下四种免疫方式：(1)Spike S1、Spike S2、Spike RBD三抗原联合免疫(3种抗原免疫剂量相同，混匀后注射)。(2)Spike S1+S2免疫。(3)Spike S1、Spike RBD两抗原联合免疫(2种抗原免疫剂量相同，混匀后注射)。(4)Spike S2。免疫采用腹部皮下多点注射，首免、二免均为20μg抗原蛋白；三免及加强剂量增加到35μg抗原蛋白。首免-二免间隔10天；二免-三免间隔8天；三免-加强间隔7天；加强-取脾间隔2天。4种S蛋白免疫小鼠后，检测小鼠血清滴度结果如图1。
1.2噬菌体库的建立
处死小鼠，解剖取出脾脏，把脾脏用注射器胶塞研磨破碎并用滤网过滤，把滤过的脾细胞冷冻备，提取RNA后获得cDNA，噬菌体库的建立步骤参照Carlos F.Barbas III，Phage display：A laboratory manual中(例如第8和9章)记载的方法进行。构建库的库容数据如表2所示。
表2各S蛋白免疫小鼠构建噬菌体库库容
| 库名 | Q1 | Q2 | Q3 | Q6 | Q7 | Q14/15 | Q18/21 |
| 库容(个) | 7.5×10 9 | 6.5×10 9 | 7.08×10 9 | 7.8×10 9 | 7.5×10 9 | 5.1×10 9 | 7.4×10 9 |
1.3以两种方法进行筛选
1.3.1平板筛选，用Wuhan-Hu-1的Spike S1+S2(义翘神州，40589-V8B1)或Spike S1蛋白(义翘神州，40591-V02H)或Spike S2蛋白(义翘神州，40590-V08B)或Spike RBD蛋白(义翘神州，40592-V05H)包被平板。第二天加入噬菌体库孵育2h，洗涤4-10次后用洗脱缓冲液洗脱特异性结合的噬菌体。
1.3.2磁珠筛选，将Wuhan-Hu-1的Spike S1+S2或Spike S1蛋白或Spike S2蛋白或Spike RBD蛋白按照常规步骤进行生物素化，再与Thermo的磁珠结合，经BSA封闭后与噬菌体库孵育2h，洗涤4-10次后用Elution Buffer洗脱特异性结合的噬菌体。筛选获得抗体克隆及来源见表3。
表3筛选得到anti-2019-nCoV抗体来源表
| 抗体ID | 来源库 | 来源小鼠 | 淘洗方法 |
| CA13 | Q03 | Q03 | 平板筛选 |
| CA14 | Q03 | Q03 | 平板筛选 |
| CA108 | Q03 | Q03 | 磁珠筛选 |
| CA219 | Q06 | Q06 | 平板筛选 |
| CA272 | Q07 | Q07 | 平板筛选 |
| CA304 | Q01 | Q01 | 磁珠筛选 |
| CA310 | Q01 | Q01 | 磁珠筛选 |
| CA313 | Q14/15 | Q14/15 | 磁珠筛选 |
| CA413 | Q1/2 | Q1/2 | 平板筛选 |
| CA417 | Q1/2 | Q1/2 | 平板筛选 |
| CA521 | Q2 | Q2 | 磁珠筛选 |
| CA530 | Q2 | Q2 | 磁珠筛选 |
| CA536 | Q1 | Q1 | 磁珠筛选 |
| CA555 | Q1/2 | Q1/2 | 磁珠筛选 |
实施例2.完整抗体的分子构建与生产
构建阳性克隆CA13\14\108\304\310\413\417\521\530\536\555\219\272\313并测序，各抗体可变区氨基酸序列如下表4：(CDR区以下划线标识，分析系统为IMGT系统。)
表4.活性克隆氨基酸序列的可变区序列
通过常规的分子生物学技术PCR(2×Phanta Max Master Mix厂家：Vazyme货号：P515-P1-AA批号：7E351H9)扩增抗体可变区基因，通过同源重组分别将抗体重链可变区基因连接入带有抗体重链恒定区序列SEQ ID NO:18的核酸序列的载体pCDNA3.4(Life Technology)，将抗体轻链可变区基因连接入带有抗体轻链恒定区序列SEQ ID NO:19的核酸序列的载体pCDNA3.4。本申请实施例中各候选抗体的可变区序列参见表4，重链恒定区序列为SEQ ID NO:18(含有S228P，F234A和L235A突变(编号系统为Eu Numbering系统)，又 称FALA突变)，轻链恒定区序列为SEQ ID NO:19。将测序后的阳性克隆提取质粒后共转染进入HEK293细胞在37℃\8％CO
2\125rpm摇床中培养，瞬时表达7天后上清通过Protein A亲和层析，纯化获得抗体，并通过UV280结合理论消光系数确定抗体浓度。
实施例3.Anti-2019-nCoV抗体分子的表征
3.1 Elisa检测抗体与Wuhan-Hu-1毒株的各S蛋白的结合
用pH 9.6 CBS稀释以下各S蛋白至0.3μg/mL：Spike S1+S2(SB,40589-V08B1)、Spike S1(SB,40591-V02H)和Spike S2(SB,40590-V08B)。包被酶标板，100μL/孔，4℃孵育过夜；洗板后用3％脱脂奶粉封闭；洗板后加入PBST稀释好的抗体100μL(2μg/mL五倍稀释4个梯度：0.4μg/mL，0.08μg/mL，0.016μg/mL，0.0032μg/mL),37℃孵育1h。洗板后加入山羊抗人Fab，37℃孵育1h。洗板后每孔加入100μL TMB底物显色，10min后每孔加入2M H
2SO
4终止显色，用酶标仪读取OD450。稀释之前抗体存在于pH7.4，0.01M PBS缓冲液中。结果显示，随着各个中和抗体浓度的升高，均显示出了其结合Wuhan-Hu-1的Spike S1+S2蛋白的能力(图2A-图2C和表5)。CA304、CA310、CA313、CA413、CA417、CA521、CA530、CA536和CA555显示出了结合Wuhan-Hu-1的Spike S1蛋白的能力(图3A-图3B和表6)。CA13、CA14、CA108、CA219和CA272显示出了结合Wuhan-Hu-1的Spike S2蛋白的能力(图4和表7)。
表5 ELISA检测各候选抗体对Wuhan-Hu-1的Spike S1+S2蛋白的结合灵敏度
表6 ELISA检测各候选抗体对Wuhan-Hu-1的Spike S1蛋白的结合灵敏度
表7 ELISA检测各候选抗体对Wuhan-Hu-1的Spike S2蛋白的结合灵敏度
3.2 ELISA检测抗体阻断Wuhan-Hu-1的Spike RBD蛋白与ACE2的结合
用pH 9.6 CBS稀释Spike RBD(义翘神州,40592-V05H)0.4μg/mL，包被酶标板,100μL/孔，4℃孵育过夜；洗板后用3％脱脂奶粉封闭。洗板后每孔加入PBST稀释好的抗体或ACE2对照蛋白50μl，抗体或ACE2对照蛋白(Novoprotein，C05Y)终浓度为(4μg/mL、1μg/mL、0.25μg/mL、0.0625μg/mL)。然后加入生物素标记的ACE2蛋白(终浓度0.04μg/mL)，50μL/孔，37℃孵育1h；洗板后加入PBST稀释的STREP/HRP，100μL/孔，37℃孵育1h。洗板后每孔加入100μL TMB显色，10min后每孔加入50μL 2M H
2SO
4终止显色，用酶标仪读取OD450。稀释之前抗体存在于pH7.4，0.01M PBS缓冲液中。结果显示CA304、CA310、CA413、CA417、CA521、CA530、CA536和CA555均能抗体阻断Spike RBD蛋白与ACE2的结合见图5和表8。
表8检测候选抗体以及ACE2对照蛋白对Wuhan-Hu-1的Spike RBD蛋白结合灵敏度
3.3检测抗体与Wuhan-Hu-1的各S蛋白的亲和力
3.3.1抗体与Spike S1+S2蛋白和Spike S2蛋白的结合动力学使用基于表面等离振子共振(surface plasmon resonance，SRP)技术的BIAcore 8K仪器测量。
通过GE抗人IgG Fc氨基偶联试剂盒，将抗人IgG抗体氨基偶联到CM5生物传感器芯片上以获得大约1000应答单位(response units，RU)。对于动力学测量，将Spike S2蛋白(义翘神州，40590-V08B)或Spike S1+S2蛋白(义翘神州，40589-V08B1)用HBS-EP
+1×(GE，BR-1006-69)缓冲液2倍连续稀释，50nM起始，2倍稀释4个浓度梯度，并设置0浓度。Startup3次。抗体：2μg/ml，进样时间100s，流速10μL/min；抗原蛋白：结合120s，流速30μL/min，解离600s；再生：用3M MgCl
2缓冲液再生30s，流速30μL/min。使用1:1binding结合模型或Two state reaction结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)计算结合常数(ka)和解离常数(kd)，平衡解离常数(KD)以比率kd/ka计算。稀释之前抗体存在于pH7.4，0.01M PBS缓冲液中。结果显示各候选抗体均能与相应抗原结合，亲和力数据见表9。
表9 Biacore 8K检测候选抗体亲和力
3.3.2抗体与Spike RBD蛋白或与Spike三聚体蛋白的结合动力学使用OctetRED 96仪器检测。
用PBST把抗体稀释至4μg/mL，用PBST把蛋白Spike RBD蛋白(北京义翘神州，目录号：40592-V05H)依次稀释至25nM、12.5nM、6.25nM、3.13nM，以PBST作为空白对照。将抗体结合到FAB2G传感器(Fortebio，目录号：18-5125)上，结合高度为1nm，然后进行结合和解离检测，结合时间200s，解离时间400s，检测结束后用1:1模式计算KD、Kon、Koff。
抗体与三聚体蛋白(三叶草生物制药，SCB-2019)的结合动力学使用OctetRED 96仪器检测。用PBST把抗体稀释至4μg/mL，用PBST把SCB-2019依次稀释至25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM，以PBST作为空白对照。将抗体Load到FAB2G传感器(Fortebio，目录号：18-5125)上，结合高度为1nm，然后进行结合和解离检测，结合时间200S，解离时间400S，检测结束后用1：1模式拟合计算出KD、Kon、Koff。
结果显示CA417、CA304、CA521、CA530、CA413和CA555抗体均能与相应抗原结合，亲和力数据见表10。
表10 ForteBio Octet检测候选抗体Spike RBD以及Spike三聚体亲和力检测
3.4检测抗体与细胞的结合与阻断
3.4.1通过流式细胞术检测抗体与表达Wuhan-Hu-1的Spike蛋白的细胞的结合活性。
0.74μg/mL抗体(CA304、CA413、CA521)或Isotype同型对照(与CA521可变区不同，恒定区相同的无关抗体)与过表达Wuhan-Hu-1的Spike蛋白的CHO-K1(GenScript，RD00819)细胞孵育后，用anti-human IgG Fc/FITC二抗(Biolegend，409310)染色，再用流式细胞仪检测分析(
公司ACEA Biosciences.Inc.，型号2060R)。其中，CA304、CA413的缓冲液体系为：10mM CH
3COONa·3H
2O,30mM NaCl,0.03％Tween-20,5％蔗糖,20mg/mL的所述抗体，pH6.0；CA521的缓冲液体系为10.5mM盐酸组氨酸,9.5mM组氨酸,0.08g/mL海藻糖，0.0002g/mL聚山梨酯80，水，以及21.5mg/mL的所述抗体，pH6.0。
结果如图6A-图6C显示，CA304、CA413、CA521三个抗体均可以与过表达Wuhan-Hu-1 的Spike蛋白的CHO-K1细胞结合，结合活性较好。
3.4.2通过流式细胞术检测抗体的阻断活性。
抗体CA521或Isotype同型对照(与CA521可变区不同，恒定区相同的无关抗体)与3μg/mLWuhan-Hu-1的RBD-Biotin孵育后，再与293T-hACE2细胞(NbBiolab)共孵育1h。用Streptavidin APC二抗(Invitrogen，17-4317-82)染色后用流式细胞仪检测分析。某一抗体浓度下的抑制率＝(0浓度抗体MFI-某浓度抗体MFI)/0浓度抗体MFI*100％。结果显示如图7所示，CA521可以阻断Wuhan-Hu-1的RBD与293T-hACE2细胞的结合，IC50为23nM，而Isotype同型对照无阻断活性。
3.4.3通过流式细胞术检测抗体阻断hACE2与293F-SARS-CoV-2-Spike的结合。
抗体CA521或Isotype同型对照(与CA521可变区不同，恒定区相同的无关抗体)与2μg/mL hACE2-Biotin混合，共同与293F-SARS-CoV-2-Spike(NbBiolab)细胞共孵育，然后用Streptavidin APC二抗(Invitrogen，17-4317-82)将细胞染色，再用流式细胞仪检测分析。结果如图8显示，CA521可以阻断hACE2与293F-SARS-CoV-2-Spike的结合，IC50为0.86nM，而Isotype同型对照无阻断活性。
上述3.4.1-3.4.3中的Isotype同型对照相同，其重链序列(可变区+恒定区)为SEQ ID NO:22,轻链序列(可变区+恒定区)为SEQ ID NO:23。
3.5抗体ADE效应的去除
在SARS和新冠肺炎患者中均观察到ADE(抗体依赖增强作用)迹象。本发明提供的抗体重链恒定区进行了突变改造可以避免ADE效应。
3.5.1 ELISA检测候选抗体、IgG1野生型对照抗体、IgG4野生型对照抗体与C1q蛋白的结合：
用pH9.6 CBS稀释候选抗体至1μg/mL，包被酶标版(苏州海狸，目录号：40301)，然后用2％BSA封闭1h；加入PBST(PBS+0.05％Tween20)稀释好的C1q蛋白孵育1h，加入Shp pAb to C1q-HRP(Abcam,ab46191)孵育，每孔加入100μL TMB(梅科万德，目录号1001)底物显色，10min后每孔加入50μL 2M H
2SO
4终止显色，用酶标仪读取OD450。稀释之前抗体存在于pH7.4，0.01M PBS缓冲液中。
结果如图9显示，相比IgG1野生型对照抗体，候选抗体CA304、CA530、CA521、CA555，与人C1q受体的结合大大降低，由此可以极大降低ADE效应，使抗体安全性更好。
IgG1野生型对照抗体，其重链序列(可变区+恒定区)为SEQ ID NO:24,轻链序列(可变区+恒定区)为SEQ ID NO:25。IgG4野生型对照抗体，其重链序列(可变区+恒定区)为SEQ ID NO:26,轻链序列(可变区+恒定区)为SEQ ID NO:27。
3.5.2 OctetRED 96检测候选抗体、IgG4野生型对照抗体与人CD64的结合：
抗体与CD64蛋白的结合动力学使用OctetRED 96仪器检测。用PBST把抗体稀释至3μg/mL，用PBST把蛋白S-RBD-Fc(ACROBiosystems，目录号：FCA-H52H2)依次稀释至15.4nM、7.7nM、3.85nM、1.93nM，以PBST作为空白对照。将抗体结合到FAB2G传感器(Fortebio，目录号：18-5125)上，然后进行结合和解离检测，检测结束后用1:1模式计算KD、Kon、Koff。稀释之前抗体存在于pH7.4，0.01M PBS缓冲液中。
结果如图10A-图10B显示，IgG4野生型对照抗体与人CD64受体的亲和力为3.41E-09M，而经过改造的候选抗体CA530与CD64无结合，由此可极大的降低候选抗体的ADE效应。 IgG4野生型对照抗体与3.5.1中相同。
3.5.3 Biacore 8K检测候选抗体CA521、CA521-IgG1野生型对照抗体与人FcγR的结合：
CM5芯片(GE Healthcare，BR-1005-30)用His Capture Kit(GE Healthcare，28-9950-56)进行氨基偶联。用1×HBS-EP+缓冲液稀释FcγRI(R&D，1257-Fc)至0.5μg/mL、稀释FcγRIIA R167(R&D，1330-CD/CF)、FcγRIIA H167(Acro，CD1-H5223)、FcγRIIB/C(R&D，1875-CD)至1μg/mL，并以10μL/min的速度注射到芯片上，结合时间90s。将CA521和CA521-IgG1野生型抗体用相同缓冲液分别从不同起始浓度(见表11)2倍稀释成5个浓度梯度。进行进样和解离。最终结合解离曲线使用扣减参比通道和缓冲液通道后的结果。实验数据用稳态拟合模型得到亲和力数据。抗体的缓冲液体系为10.5mM盐酸组氨酸,9.5mM组氨酸,0.08g/mL海藻糖，0.0002g/mL聚山梨酯80，水，以及21.5mg/mL的所述抗体，pH6.0。
表11 Biacore 8K检测抗体与不同Fc受体结合的稀释倍数
| 分析物起始浓度(nM) | FcγRI | FcγRIIA R167 | FcγRIIA H167 | FcγRIIB/C |
| CA521-IgG1野生型 | 40 | 5000 | 5000 | 20000 |
| CA521 | 40 | 20000 | 20000 | 20000 |
抗体CA521、CA521-IgG1野生型与人FcγR的亲和力结果如下表12。
表12不同亚型抗体与人FcγR的亲和力结果
从结果中可看出，相比于CA521-IgG1野生型，与重链恒定区具有突变(S228P+F234A+L235A)改造的CA521对四种Fc受体的亲和力都有明显的降低，由此可以消除ADE效应。CA521-IgG1野生型对照抗体，其重链序列(可变区+恒定区)为SEQ ID NO:28,轻链序列(可变区+恒定区)为SEQ ID NO:29。
3.5.4检测候选抗体ADCP效应
ADCP(抗体依赖的细胞吞噬)是衡量抗体Fc与Fc受体结合生物学活性的一个重要指标。
复苏CD14
+单核细胞，用含GM-CSF、IFN-γ和LPS的1640完全培养基诱导刺激细胞。将CHO-K1-spike(GenScript，RD00819)细胞用CSFE(Invitrogen，65-0850-85)染色后，用无血清1640培养基重悬；将待测抗体用1640无血清培养基稀释为10μg/mL；将CHO-K1-spike细胞、巨噬细胞、待测抗体于96孔细胞培养板中于37℃ 5％CO2培养箱中共同孵育2小时。巨噬细胞和靶细胞比例为1:1，抗体终浓度2μg/mL，反应缓冲液为无血清1640培养基。每孔加入2μL APC-anti-CD206染色后，用100μL DPBS重悬细胞，上机检测。以FITC-H为横坐标、APC-H为纵坐标作图，计算吞噬率＝(FITC
++APC
+细胞比例)/(APC
+细胞比例)*100％。稀释之前的抗体的缓冲液体系为10.5mM盐酸组氨酸,9.5mM组氨酸,0.08g/mL海藻糖，0.0002g/mL聚山梨酯80，水，以及21.5mg/mL的所述抗体，pH6.0。抗体CA521不同亚型的ADCP效应结果见表13。
表13抗体CA521不同亚型的ADCP效应
| 样品 | 吞噬率％ |
| CA521 | 3.33 |
| CA521-IgG1野生型 | 12.74 |
| Isotype同型对照 | 3.76 |
可以看出，经过重链恒定区S228P+F234A+L235A突变改造后，CA521和Isotype同型对照(与CA521可变区不同，恒定区相同的无关抗体)均无ADCP效应，仅为3％左右，为实验背景。而未改造的CA521-IgG1野生型表现出较强的吞噬效应，吞噬率达12.74％。由此可见，改造后的CA521Fc端与Fc受体介导的生物学功能受到了抑制，从而可以有效消除ADE效应。Isotype同型对照与3.4.1-3.4.3中的Isotype同型对照相同。CA521-IgG1野生型对照抗体与3.5.3中相同。
3.6检测候选抗体ADCC和CDC
表14显示了检测候选抗体ADCC和CDC试验材料
本实施例选用病毒刺突蛋白表达量较高的CHO-K1-spike细胞作为靶细胞，研究抗体CA521对靶细胞的毒性作用。选择对CHO-K1-spike细胞具有ADCC作用的CA521-IgG1作为阳性对照，验证ADCC方法的可行性，选择对Daudi细胞具有CDC作用的Rituxan作为系统对照，验证CDC方法的可行性，然后进行抗体CA521对CHO-K1-spike细胞的ADCC和CDC作用的检测。
3.6.1.ADCC检测原理：普洛麦格(Promega)公司改造Jurkat-ADCC效应细胞，使其细胞表面表达高亲和力的FcγRIIIa(V158)受体，能够与抗体Fc端更好地结合；且同时引入NFAT(免疫细胞中表达的转录因子，能够调节基因的转录)与荧光素酶Luciferase基因，使其在ADCC作用激活时，通过细胞内的信号转导，激活Luciferase的表达，与Bio-Lite显色液 中底物作用后发光，从而通过发光强度的检测来反映ADCC的效应强度。
ADCC检测方法：1)靶细胞准备：收集CHO-K1-spike细胞，计数，加入ADCC缓冲液稀释为1 x 10
6细胞/mL；2)CA521抗体样品梯度稀释：取适量样品加入ADCC缓冲液逐步稀释为100μg/mL，以此浓度为起始浓度；取200uL起始浓度样品，加入96孔稀释板中，吸取40uL加入到160uL稀释液中，依次5倍梯度稀释共8个点，备后续使用；3)效应细胞准备：收集Jurkat-ADCC效应细胞培养液于50mL离心管中，1500rpm离心，去上清，加入ADCC缓冲液反复吹吸，重悬细胞，细胞计数，加入ADCC缓冲液稀释为2 x10
6细胞/mL，备后续使用；4)加入靶细胞、CA521抗体和效应细胞：在白色96孔板中加入靶细胞：25uL/孔；在铺有靶细胞的孔中加入梯度稀释的抗体，25uL/孔；加入效应细胞：25uL/孔，使E:T比例为50000:25000细胞/孔；将96孔板放入细胞培养箱(37℃,5％CO
2)培养5h；取出96孔板，室温放置，使其温度平衡到室温；5)显色液显色：加入Bio-Glo显色液：75uL/孔；反应15min；Tecan酶标仪读数(化学发光)。
结果如图11所示，CA521(即样品S20100501,Grp.1)随着样品浓度增加，信号值没有明显变化，表明CA521对CHO-K1-spike细胞没有明显的ADCC效应；CA521-IgG1阳性对照(即Grp.2)，随着样品浓度的增加，信号逐渐增强，表明其对CHO-K1-spike细胞有ADCC效应。CA521-IgG1阳性对照的序列为3.5.3中CA521-IgG1野生型对照抗体的序列。
3.6.2.CDC检测原理：抗体与细胞上的靶点结合，在与补体结合后，激活补体效应，致使靶细胞被杀死。此实验通过AlarmBlue活细胞检测液检测活细胞的数量，从而间接的指示出靶细胞被CDC效应杀死的细胞数目，因此检测到的信号越弱，说明活细胞数目越少，从而表明CDC效应越强。
CDC检测方法：1)靶细胞准备：收集Daudi细胞,CHO-K1-spike细胞，计数，加入ADCC缓冲液稀释为6 x 10
5细胞/mL；2)样品梯度稀释：取10uL样品加入适量ADCC缓冲液稀释为1mg/mL，混匀后取出30uL加入270uL缓冲液配制为100ug/mL，以此浓度为起始浓度；取200uL起始浓度样品，加入96孔稀释板中，吸取40uL加入到160uL稀释液中，依次5倍梯度稀释共8个点，备后续使用；3)加入抗体、靶细胞和补体：在透明96孔板中加入靶细胞：25uL/孔，即15000细胞/孔；加入梯度稀释的样品：12.5uL/孔；37度放置30min；加入补体：补体与ADCC缓冲液以1:1.5稀释，加补体12.5uL/孔，使补体终浓度为10％；37度二氧化碳培养箱培养2小时；显色液显色：加入AlarmaBlue活细胞染色液,5uL/孔，继续放入37度二氧化碳培养箱中培养2h；读数，以560nm激发光，590nm的发射光检测荧光信号。
图12A的Daudi细胞为靶细胞的CDC检测结果显示，阳性对照Rituxan(即Grp.1)随着样品浓度增加，信号逐渐降低，表明活细胞数目逐渐减少，表明Rituxan对Daudi细胞有明显的CDC效应，而CA521(即样品S20100501,Grp.2)随着样品浓度增加，信号值没有明显变化，说明CA521对Daudi细胞没有CDC效应；
图12B的CHO-K1-spike为靶细胞的样品检测结果显示，阴性对照IgG4(即Grp.2)，随着浓度的增加，信号值没有明显变化，阴性对照IgG4对CHO-K1-spike细胞没有CDC效应；CA521随着浓度的增加，信号不显示浓度依赖性曲线，表明其对CHO-K1-spike细胞没有CDC效应。阴性对照IgG4(只有重链)的序列为SEQ ID NO:30。
3.7抗体在假病毒上的中和活性
采用HIV慢病毒载体包装Wuhan-Hu-1的S蛋白的假病毒。假病毒与待检抗体孵育后侵染293T-ACE2细胞,每孔细胞数：3E4cells/孔，病毒量：50μL/孔，最后采用化学发光法检测Luciferase发光值RLU，根据RLU读值计算待检抗体的假病毒抑制率。抗体的缓冲液体系为pH7.4，0.01M PBS缓冲液。
结果显示CA304、CA310、CA413、CA417、CA521、CA530和CA555抗体均能有效阻断假病毒对细胞的感染，其中CA304、CA413、CA521、CA530和CA555的阻断能力最强，分别为0.20nM、0.41nM、0.56nM、0.11nM和0.98nM(图13和表15)。阳性对照为北京义翘神州自产的阳性对照SARS-CoV/SARS-CoV-2Spike抗体，货号：4015D-D001。
表15候选抗体在假病毒上的中和活性
| 抗体ID | IC50(nM) | 抗体ID | IC50(nM) |
| CA304 | 0.20 | CA521 | 0.56 |
| CA310 | 1.28 | CA530 | 0.11 |
| CA413 | 0.41 | CA536 | 4.87 |
| CA417 | 1.42 | CA555 | 0.98 |
| 阳性对照 | 1.58 |
3.8抗体阻断SARS-CoV-2真病毒引起的细胞病变
3.8.1实验材料
表16抗体阻断SARS-CoV-2真病毒引起的细胞病变的实验材料
| 器材名称 | 品牌或生产厂商 | 型号 |
| SARS-CoV-2真病毒 | / | BetaCoV/Beijing/IMEBJ01/2020 |
| Vero细胞 | ATCC | CCL-81 |
| DMEM培养基 | Gibco | 11965092 |
| FBS | Gibco | 10091155 |
3.8.2实验方法：
样品组：每种梯度稀释的抗体与100PFU SARS-CoV-2真病毒混合，37度孵育1小时，加至铺有Vero细胞层的24孔板中，37度孵育1h。阳性对照：SARS-CoV-2真病毒和DMEM培养基母液取等体积混合后，37度孵育1h，加至铺有Vero细胞层的24孔板中，37度孵育1h。阴性对照：DMEM培养基母液37度孵育1小时，加至铺有Vero细胞层的24孔板中，37度孵育1h，所有实验均设置两复孔。
移去抗体和病毒混合液，加入1mL 1.0％(w/v)的用含4％FBS(v/v)DMEM稀释的LMP凝胶，继续37度孵育2天，用溶于4％(v/v)甲醛的1％结晶紫(w/v)染色，通过蚀斑数统计抗体中和效果。所有实验均按经批准的三级生物安全操作程序进行。
结果显示候选抗体CA304、CA530、CA310、CA555在10nM浓度及以上时完全阻断病毒的侵染；CA521、CA417在6.25μg/mL浓度及以上，完全阻断病毒的侵染。抗体的缓冲液体系为pH7.4，0.01M PBS缓冲液。候选抗体阻断真病毒对细胞的感染结果如表17所示。
表17候选抗体阻断真病毒对细胞的感染
-：此浓度抗体阻断了病毒引起的细胞病变
+：此浓度抗体未阻断病毒引起的细胞病变
3.9采用蚀斑减少中和试验法(Plaque Reduction Neutralization Test，PRNT)检测CA521对真病毒的中和活性。
3.9.1.CA521在SARS-CoV-2感染Vero细胞上的中和活性
用细胞维持液将CA521抗体(100mg/5mL)按3倍倍比稀释，与等体积SARS-CoV-2病毒(病毒株为BetaCoV/Beijing/IMEBJ01/2020)混合，37℃孵育1h；将病毒-抗体混合液(200μL/孔)加入含单层致密Vero细胞的24孔培养板中，37℃培养1h；弃病毒抗体混合液，每孔加入适当体积预热的营养琼盖，37℃、5％CO
2培养箱继续培养，在感染后第2天加入适当体积的固定液，室温固定1h，弃固定液和营养琼盖，用固定液清洗1次；加入适当体积的1.0％结晶紫溶液，室温染色1h，弃结晶紫溶液，用固定液清洗1次，计数出斑数，按照公式计算抑制率(抑制率＝(1-抗体组/对照组)×100％)，并采用Graphpad Prism 7软件进行统计分析。研究结果如图14所示，CA521在Vero细胞水平对新冠病毒感染的PRNT
90和PRNT
50分别为1.36μg/mL和0.11μg/mL，分别对应9.11nM和0.737nM，表明中和抗体具有明确的保护细胞免受新型冠状病毒感染的生物学药效。
3.9.2.CA304、CA413和CA521在SARS-CoV-2感染Vero细胞上的中和活性
将5倍连续稀释的单克隆抗体加入到大约100PFU的SARS-CoV-2(病毒株为BetaCoV/Beijing/IMEBJ01/2020)中，在37℃下孵育1h。然后，将混合物加入到24孔板中的Vero细胞单层中，37℃孵育1h。去除混合物，加入1mL含1.0％(w/v)LMP琼脂糖(Promega)和4％(v/v)胎牛血清的DMEM，覆盖于感染细胞上。37℃孵育2天后，用溶解在4％(v/v)甲醛中的1％(w/v)结晶紫染色，以观察斑块。所有实验都是按照经批准的生物安全三级设施的标准操作程序进行的。抗体的缓冲液体系为10.5mM盐酸组氨酸,9.5mM组氨酸,0.08g/mL海藻糖，0.0002g/mL聚山梨酯80，水，以及21.5mg/mL的所述抗体，pH为5.5-6.5。
从结果图15中可看到，CA304、CA413和CA521均有较好的中和活性，IC50分别为0.080、0.089和0.132μg/mL。
3.10抗体动物体内药效实验
无特异性致病性的6-8周雌性Balb/C小鼠被异氟醚轻麻醉，并将溶于30μL DMEM中的2×10
3PFU的SARS-CoV-2的小鼠适应菌株(军事医学科学院，MASCp6)经鼻滴入。小鼠在感染后2小时后给予20mg/kg的CA304(n＝4)或CA413(n＝4)或CA521(n＝4)PBS(n＝7)单次腹腔给药治疗。在注射3天后(3dpi)采集小鼠肺和气管组织，进行病毒滴度和器官检验。实验方案经中国AMMS实验动物中心动物实验委员会批准。实验结果如图16A-16B所示，对照组的Balb/C小鼠感染后第3天肺组织的病毒载量为10
10.43RNA copies/g，抗体给药组感染后 第3天肺组织的病毒载量分别为10
5.35RNA copies/g、10
5.23RNA copies/g和10
5.89RNA copies/g，三个抗体药物给药后分别降低了10
5.08、10
5.2和10
4.54，在气管中同样可有效的降低病毒载量。
本实验中CA521以制剂的形式提供，制剂为含CA521抗体的药物组合物，药物组合物包括10.5mM盐酸组氨酸,9.5mM组氨酸,0.08g/mL海藻糖，0.0002g/mL聚山梨酯80，水，以及21.5mg/mL的所述抗体，pH为pH6.0。
CA304或CA413以制剂形式提供，所述制剂为含所述抗体的药物组合物，药物组合物包括：10mM CH
3COONa·3H
2O,30mM NaCl,0.03％Tween-20,5％蔗糖,20mg/mL的所述抗体pH6.0。
检测结果如图16A-16B和表18所示，显示了抗体给药3天后肺与气管中病毒载量。
表18抗体给药3天后肺与气管中病毒载量
3.11安全药理学
恒河猴安全药理学试验伴随扩展的恒河猴单次给药毒性试验开展(详见A2020131-T005-01)。恒河猴单次静脉注射给予生理盐水或50、200、800mg/kg的CA521(本实验中CA521以制剂的形式提供，制剂为含CA521抗体的药物组合物，药物组合物包括10.5mM盐酸组氨酸,9.5mM组氨酸,0.08g/mL海藻糖，0.0002g/mL聚山梨酯80，水，以及21.5mg/mL的所述抗体，pH为5.5-6.5)，每天观察动物一般状态；给药前及给药后1～2、6～7h、第2、7、14d，采用大动物无创生理信号遥测系统检测II导联心电图、呼吸频率，采用智能无创血压计测定动脉血压。
实验期间，各组猴自主活动正常、精神状况良好，未见中枢神经系统异常行为表现。给药后各检测时间点，各剂量CA521对II导联心电图、呼吸频率、血压等各指标无明显改变。上述结果表明，50、200、800mg/kg的CA521对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统无影响。
3.12药代动力学
18只恒河猴(雌雄各半)分3组，各组猴按11.94mL/kg分别单次静脉注射15、60、240mg/kg的CA521，并于给药前及给药结束即刻(1min)，5分钟、1、6小时、1(24h)、3(72h)、7(168h)、10(240h)、14(336h)、21(504h)、28(672h)、35(840h)、42(1008h)、56(1344h)天采集血样，以ELISA法测定血清中CA521浓度，标准曲线范 围为78.1～10000ng/mL，以Phoenix WinNonlin 6.4计算药动学参数。本实验中CA521以注射剂的形式提供，制剂为含CA521抗体的药物组合物，药物组合物包括10.5mM盐酸组氨酸,9.5mM组氨酸,0.08g/mL海藻糖，0.0002g/mL聚山梨酯80，水，以及21.5mg/mL的所述抗体，pH为5.5-6.5。
恒河猴分别单次静脉注射15、60、240mg/kg的CA521后，各剂量组主要药代动力学参数结果如下表19所示，以恒河猴单次静脉推注给予60mg/kg CA521注射液为例说明主要的药代动力学参数，达峰浓度C
max为1300±86.9μg/mL，末端消除半衰期t
1/2为275±95.9h，暴露量AUC
0-∞为354000±114000h*μg/mL，清除率Cl为0.188±0.0709mL/h/kg，稳态表观分布容积V
ss为71.4±7.76mL/kg，滞留时间MRT
0-∞为417±129h。
表19恒河猴单次静脉注射CA521注射液药代动力学参数
以ELISA法检测给药前及给药结束后14、28、42、56天的抗药抗体。给药前及各组所有动物ADA(抗药抗体)结果均呈阴性；给药结束后14天各组分别有0(0/6)、1(1/6)、0(0/6)只动物ADA结果呈阳性，给药结束后28和42天各组分别有1(1/6)、1(1/6)、0(0/6)只动物ADA结果呈阳性，给药结束后56天各组分别有2(2/6)、1(1/6)、1(1/6)只动物ADA结果呈阳性。
综上，单次静脉注射15、60、240mg/kg CA521后各剂量组动物主要药代动力学参数无明显性别差异。在15～240mg/kg范围内，CA521在恒河猴体内暴露量增加比例与剂量增加比例基本一致。在研究剂量下，给药后56天内部分恒河猴有抗药抗体检出。
3.13毒理研究
经研究，CA521(本实验中CA521以制剂的形式提供，制剂为含CA521抗体的药物组合物，药物组合物包括10.5mM盐酸组氨酸,9.5mM组氨酸,0.08g/mL海藻糖，0.0002g/mL聚山梨酯80，水，以及21.5mg/mL的所述抗体，pH为5.5-6.5)。不会产生ADE效应或风险极低。CA521与正常人体组织和恒河猴组织无交叉反应性。扩展的恒河猴单次给药毒性试验，50、200、800mg/kg的CA521对动物一般状态、体重、摄食量、体温、II导联心电图、呼吸频率及血压、眼科检查、血液学、血生化、尿液、免疫指标、骨髓涂片、注射部位、大体解剖观察、脏器重量与系数及组织病理学检查均未见明显异常。在50～800mg/kg剂量范围内，恒河 猴血清中CA521的暴露量无明显性别差异，暴露量增加与剂量增加基本成比例。10mg/mL的CA521对兔红细胞无溶血和凝聚作用。在本试验条件下，恒河猴单次静脉注射50、200、800mg/kg的CA521，其无毒性反应剂量(NOAEL)为800mg/kg，该剂量下雌、雄猴的AUC0-336h均为1840000h*μg/mL。综上，CA521具有非常好的安全性。
3.14抗体晶体结构解析和结合表位分析
对候选抗体进行晶体结构解析和结合表位分析。2mg/mL纯化的Wuhan-Hu-1Spike蛋白的胞外区(1-1208位氨基酸，聚合成三聚体，水木未来提供)(S-ECD)与6.6mg/mL CA521在冰上孵育1min后进行冷冻电镜分析。样品制备由Thermo Fisher Vitrobot Mark IV完成，3.5μL S-ECD和CA521(具有含FALA突变的SEQ ID NO:18重链恒定区，又称为CA521
FALA)的复合物置于包被有自制连续还原石墨烯氧化膜的辉光放电多孔碳膜上，在100％湿度、8℃条件下，将网格中多余的溶液吸干2.0s，然后将网格快速冻结在经液氮冷却的液态乙烷中。使用装备有Gatan K3直接电子计数摄影机的Thermo Fisher Titan Krios G3i电子显微镜进行数据采集。本实验中抗体存在的缓冲液体系为：10mM CH
3COONa·3H
2O,30mM NaCl,0.03％Tween-20,5％蔗糖,21.5mg/mL的所述抗体,pH6.0。
图17A显示S-ECD和CA521结合的3D结构模型，此模型中可看到，Spike蛋白的3个RBD均与抗体的Fab不对称结合，表明与CA521结合的Spike蛋白只有一种构象，一个Spike三聚体的3个RBD，无论其是Up还是Down构象，均分别与3个Fab结合。图17B对Fab和RBD的结合表面进行可识别电子云密度分析，确定了Spike与Fab的结合位点。RBD残基A475、E484、G485、N487、Y489、Q493和S494周围的氢键和盐桥以及Y449、Y453、L455、F456、F486和F490周围的疏水作用共同促成了RBD与CA521之间的相互作用。13个残基中有9个与ACE2结合位点重叠，包括Y449、Y453、L455、F456、A475、F486、N487、Y489和Q493，其他的4个氨基酸残基，如E484、G485、F490和S494，与这9个参与ACE2直接接触的残基距离不超过2个氨基酸。所有这些残基都位于与ACE2直接结合的受体结合组件(RBM)(438-506)中，因此CA521可以通过直接结合于RBM，阻断病毒与ACE2的结合。RBD与H014(神州细胞)和CB6(君实生物)结合的位点见图18，H014(神州细胞)的结合表位参见Z.Lv et al.,Science 10.1126/science.abc5881(2020)，CB6(君实生物)的结合表位参见Shi,R.et al.A human neutralizing antibody targets the receptor binding site of SARS-CoV-2.Nature.2020Aug；584(7819):120-124https://doi.org/10.1038/s41586-020-2381-y(2020),CA521的结合位点明显不同于二者。CA521与RBM直接结合，一个抗体可以结合一个Spike三聚体的两个RBD，并且全部3个RBD均被Fab占据，由此可以解释CA521优异的结合和阻断活性。
3.15 CA521抗体对新冠假病毒突变株的中和活性
采用抗体为CA521抗体(即CA521
FALA)；SARS-CoV-2假病毒为针对Wuhan-Hu-1株的SARS-Cov-2假病毒；突变株B.1.1.7的假病毒为针对B.1.1.7(hCoV-19/England/QEUH-F56F0F/2021)病毒株的SARS-Cov-2假病毒。
3.15.1试剂耗材见表20
表20 CA521抗体对新冠假病毒突变株的中和活性试剂耗材
3.15.2.实验具体过程：450mLDMEM加入50mL FBS混匀得到DMEM(10％FBS)，用DMEM(10％FBS)将抗体CA521(本实验中CA521以制剂的形式提供，制剂为含CA521抗体的药物组合物，药物组合物包括10.5mM盐酸组氨酸,9.5mM组氨酸,0.08g/mL海藻糖，0.0002g/mL聚山梨酯80，水，以及21.5mg/mL的所述抗体，pH为5.5-6.5)稀释8个不同浓度梯度(0.061～133.4nM和0.61～1334nM两种稀释梯度)，100μl梯度稀释抗体样品与50μL2.0×10
4TCID
50/mL假病毒(Wuhan-Hu-1株的假病毒，或B.1.1.7突变株的假病毒)溶液在37℃下混合后孵育1小时，孵育40分钟后，胰蛋白酶消化Huh-7细胞，将Huh-7细胞的密度用DMEM(10％FBS)调整至4×10
5个/mL，从二氧化碳培养箱中取出96孔细胞板，每孔分别加入100μL Huh-7细胞悬液，放置到二氧化碳培养箱(37℃±1℃，5％±1％CO
2)内继续培养24小时，培养结束后，每孔吸掉150μL上清液，加入100μL显色液Bright-Glo，避光反应2-3分钟后，用酶标仪进行化学发光检测。
3.15.3.结果与分析
计算中和抑制率，使用四参数方程拟合回归模型，以浓度值为X轴，以抑制率为Y轴，使用四参数回归模型拟合生成抗体对不同假病毒突变株中和活性的曲线，利用使用四参数拟合法计算IC50。
根据CA521抗体浓度范围0.061～133.4nM得到的抑制率，拟合四参数曲线并计算IC50,结果如表21所示:
表21 CA521抗体的IC50和最大抑制率Imax(％)
| Wuhan-Hu-1株的假病毒 | B.1.1.7株的假病毒 | |
| Imax(％) | 96.46 | 96.77 |
| IC50(nM) | 0.180 | 0.456 |
由实验结果可知，CA521在0.061～133.4nM范围，对Wuhan-Hu-1株的假病毒和B.1.1.7株的假病毒的中和活性的最大抑制率都可以达到接近100％的水平。CA521抗体对于Wuhan-Hu-1株的假病毒的IC50为0.180nM，对B.1.1.7(hCoV-19/England/QEUH-F56F0F/2021) 株的假病毒的IC50为0.456nM。CA521不仅对Wuhan-Hu-1株的假病毒具有优异的中和活性，对英国突变株的假病毒也具有良好的中和活性。
3.16 ELISA检测CA304，CA555抗体阻断不同突变株S1+S2蛋白与ACE2的结合
3.16.1各毒株Spike S1+S2蛋白来源如下表22所示：
表22各毒株Spike S1+S2蛋白来源
3.16.2.CA304阻断各毒株Spike S1+S2蛋白与ACE2的结合的IC50
实验方法如下：(1)配置CBS缓冲液，用CBS缓冲液将各毒株Spike S1+S2蛋白稀释至0.5μg/mL，按照100μL/孔包被于96孔ELISA板中，4℃过夜。(2)3％脱脂奶粉封闭，300μL/孔，37℃孵育1h后洗板2次。(3)用PBST将抗体从16μg/mL四倍梯度稀释8个浓度，按50μL/孔加入96孔ELISA板中，加入ACE2-FC-biotin(1:5)50μL/孔，使其终浓度分别为0.24μg/mL(Wuhan-Hu-1)、0.02μg/mL(B.1.351)、0.02μg/mL(p.1)、0.2μg/mL(B.1.1.7)。37℃孵育1h后，洗板2次。(4)加入STREP/HRP二抗(1:200稀释)100μL/孔，37℃孵育1h后，洗板5次。(5)每孔加入100μL TMB显色液，显色10min后，每孔加50μL 2M H
2SO
4终止反应。(6)多功能酶标仪读取OD450值。抑制率％＝(无抗体的OD450-OD450)/(无抗体OD450–最高浓度抗体OD450)*100％。实验设置2复孔，数据作图以Mean±standard error表示。实验结果如表23和图19所示。
表23 CA304阻断各毒株Spike S1+S2蛋白与ACE2的结合的IC50
由实验结果可知，CA304抗体阻断Wuhan-Hu-1株的S1+S2蛋白与ACE2的结合的IC50为0.176nM，阻断B.1.351株S1+S2蛋白与ACE2的结合的IC50为0.514nM，阻断B.1.1.7株的S1+S2蛋白与ACE2的结合的IC50为1.751nM，阻断p.1株的S1+S2蛋白与ACE2的结合的IC50为0.753nM。CA304不仅对Wuhan-Hu-1株的S1+S2蛋白与ACE2的结合具有优异 的阻断能力，对巴西、南非突变株的S1+S2蛋白与ACE2的结合也具有良好的阻断能力，对英国株具有一定的阻断能力。
3.16.3.CA555阻断各毒株Spike S1+S2蛋白与ACE2的结合的IC50
实验方法同3.16.2，实验结果如表24以及图20所示。
表24 CA555阻断各毒株Spike S1+S2蛋白与ACE2的结合的IC50
由实验结果可知，CA555抗体阻断Wuhan-Hu-1株的S1+S2蛋白与ACE2的结合的IC50为0.187nM，阻断B.1.351株S1+S2蛋白与ACE2的结合的IC50为0.367nM，阻断p.1株的S1+S2蛋白与ACE2的结合的IC50为0.355nM。CA555不仅对Wuhan-Hu-1株的S1+S2蛋白与ACE2的结合具有优异的阻断能力，对巴西、南非突变株的S1+S2蛋白与ACE2的结合也具有良好的阻断能力。从图20可以看出,CA555对英国株也有良好的阻断效果。
3.17 CA304和CA555对新冠突变株假病毒的中和活性
3.17.1.实验方法同3.15中CA521抗体对新冠假病毒突变株的中和活性，CA304对不同毒株的假病毒中和活性IC50实验结果如下表25以及图21所示。
表25 CA304对不同毒株的假病毒中和活性IC50实验结果
由实验结果可知,CA304抗体对于Wuhan-Hu-1株的假病毒的IC50为0.821nM，对B.1.351株假病毒的IC50为12.18nM，对B.1.1.7株的假病毒的IC50为4.061nM，对p.1株假病毒的IC50为3.531nM。CA304不仅对Wuhan-Hu-1株的假病毒具有优异的中和活性，对英国、巴西突变株的假病毒也具有良好的中和活性，对南非突变株的假病毒具有一定中和活性。
3.17.2.实验方法同3.15中CA521抗体对新冠假病毒突变株的中和活性，CA555对不同毒株的假病毒中和活性IC50实验结果如下表26以及图22所示。
表26 CA555对不同毒株的假病毒中和活性IC50实验结果
由实验结果可知，CA555抗体对于Wuhan-Hu-1株的假病毒的IC50为0.3284nM，对B.1.351株假病毒的IC50为13.89nM，对B.1.1.7株的假病毒的IC50为3.173nM，对p.1株假病毒的IC50为1.585nM。CA304不仅对Wuhan-Hu-1株的假病毒具有优异的中和活性，对英国、巴西突变株的假病毒也具有良好的中和活性，对南非突变株的假病毒具有一定的中和活性。
Claims (10)
- 一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段结合SARS-CoV-2病毒上的S蛋白，优选的，所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种；更优选的，所述抗体或其抗原结合片段结合SARS-CoV-2病毒的RBD的A475、E484、G485、N487、Y489、Q493、S494、Y449、Y453、L455、F456、F486和F490残基。
- 根据权利要求1所述抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含3个轻链互补决定区和/或3个重链互补决定区，其中所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:8所示的LCDR3，和/或所述抗体或其抗原结合片段的3个重链互补决定区包含SEQ ID NO:9所示的HCDR1、SEQ ID NO:10所示的HCDR2和SEQ ID NO:11所示的HCDR3；所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含SEQ ID NO:12所示的LCDR1、SEQ ID NO:13所示的LCDR2和SEQ ID NO:14所示的LCDR3，和/或所述抗体或其抗原结合片段的3个重链互补决定区包含SEQ ID NO:9所示的HCDR1、SEQ ID NO:10所示的HCDR2和SEQ ID NO:11所示的HCDR3；所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:15所示的LCDR3，和/或所述抗体或其抗原结合片段的3个重链互补决定区包含SEQ ID NO:9所示的HCDR1、SEQ ID NO:16所示的HCDR2和SEQ ID NO:17所示的HCDR3；或者所述抗体或其抗原结合片段的3个轻链互补决定区包含SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2和SEQ ID NO:21所示的LCDR3，和/或所述抗体或其抗原结合片段的3个重链互补决定区包含SEQ ID NO:9所示的HCDR1、SEQ ID NO:10所示的HCDR2和SEQ ID NO:11所示的HCDR3。
- 根据权利要求2所述抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示的轻链可变区，和/或SEQ ID NO:2所示的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:3所示的轻链可变区，和/或SEQ ID NO:2所示的重链可变区；所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:4所示的轻链可变区，和/或SEQ ID NO:5所示的重链可变区；或者所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:20所示的轻链可变区，和/或SEQ ID NO:2所示的重链可变区。
- 根据权利要求2或3所述抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包含SEQ ID NO:18所示的重链恒定区，或者包含SEQ ID NO:19所示的轻链恒定区。
- 一种核酸，其编码权利要求1-4任一项所述抗体或其抗原结合片段。
- 一种细胞，其包含权利要求5的核酸。
- 一种药物组合物，其含有权利要求1-4任一项所述抗体或其抗原结合片段，或权利要求5所述的核酸，或权利要求6所述的细胞。
- 根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述药物组合物为单位制剂，该单位制剂含有30毫克和2400毫克之间的权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；优选的， 所述药物组合物含有所述抗体或其抗原结合片段以及缓冲液；更优选的，所述缓冲液包括海藻糖和聚山梨酯80中的一种或多种；更优选的，所述药物组合物pH为5.5-6.5；更优选的，所述缓冲液还包括盐酸组氨酸和组氨酸中的一种或多种；更优选的，所述盐酸组氨酸和组氨酸的摩尔比为10.5：9.5；更优选的，基于所述药物组合物的总体积，所述药物组合物包括0.04-0.1g/mL海藻糖,0.0001-0.0003g/mL聚山梨酯80，以及10-30mg/mL的所述抗体或其抗原结合片段；更优选的，基于所述药物组合物的总体积，所述药物组合物包括10.5mM盐酸组氨酸,9.5mM组氨酸,0.08g/mL海藻糖，0.0002g/mL聚山梨酯80，以及20±2mg/mL的所述抗体或其抗原结合片段。
- 一种试剂盒，其含有权利要求1-4任一项所述抗体或其抗原结合片段，权利要求5所述的核酸，或权利要求7或8所述的药物组合物。
- 权利要求1-4任一项所述抗体或其抗原结合片段，权利要求5所述的核酸，或权利要求7或8所述的药物组合物用于预防、治疗、检测或诊断与SARS-CoV-2病毒相关的疾病的应用；优选地，所述SARS-CoV-2病毒的相关疾病是由SARS-CoV-2病毒引起的COVID-19肺炎及其他相关并发症，更优选的，所述SARS-CoV-2病毒包括Wuhan-Hu-1毒株、B.1.1.7毒株、B.1.351毒株和p.1毒株中的一种或多种。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101102794A (zh) * | 2004-11-11 | 2008-01-09 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 抗sars-冠状病毒的组合物及其应用 |
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Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN101102794A (zh) * | 2004-11-11 | 2008-01-09 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 抗sars-冠状病毒的组合物及其应用 |
| CN109666070A (zh) * | 2017-10-13 | 2019-04-23 | 清华大学 | 单克隆抗体mers-4v2及其编码基因和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| TIAN, X. ET AL.: "Potent Binding of 2019 Novel Coronavirus Spike Protein by a SARS Coronavirus-specific Human Monoclonal Antibody.", EMERG MICROBES INFECT., vol. 9, no. 1, 17 February 2020 (2020-02-17), XP055736759, DOI: 10.1080/22221751.2020.1729069 * |
| ZHOU, G. ET AL.: "Perspectives on Therapeutic Neutralizing Antibodies against the Novel Coronavirus SARS-CoV-2.", INT. J. BIOL. SCI., vol. 16, no. 10, 15 March 2020 (2020-03-15), XP055758309, DOI: 10.7150/ijbs.45123 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024019110A1 (ja) * | 2022-07-20 | 2024-01-25 | 国立感染症研究所長が代表する日本国 | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体 |
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