CN101102794A - 抗sars-冠状病毒的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了特异性结合冠状病毒如SARS-CoV并能中和由该病毒所致感染的结合分子组合物。所述组合物适于诊断、预防和/或治疗由冠状病毒如SARS-CoV所致疾病。

Description

抗SARS-冠状病毒的组合物及其应用

发明领域

本发明涉及医药学领域。本发明特别涉及包含能特异性结合及中和SARS-冠状病毒(SARS-CoV)的结合分子的组合物。所述组合物可用于诊断SARS-CoV及预防和/或治疗SARS-CoV所致疾病。

发明背景

近年来在人群中观察到一种新的及在一些病例中致死的临床综合征，现在称作严重急性呼吸综合征(SARS)(Holmes，2003)。该综合征是由一种称作SARS-CoV的新冠状病毒(Ksiazek et al.，2003)所致。SARS-CoV的基因组序列已经确定(Rota et al.，2003；Marra et al.，2003)。然而，关于这种病毒还需要更多的了解，及需要诊断、预防和/或治疗该病毒及所述综合征的手段和方法。本发明提供了用于诊断、预防和/或治疗SARS-CoV的手段和方法。

附图简述

图1示出ELISA结果，其中测定了称作SC03-014和SC03-022的单链噬菌体抗体与固定化的UV失活的SARS-CoV制备物(左侧)或者固定化FBS(右侧)的结合。图中也示出了称作SC02-006的对照单链噬菌体抗体的结合。在Y轴上示出在492nm的吸光度。

图2示出IgG CR03-014、CR03-022、对照IgG及无IgG与失活的SARS-CoV制备物的ELISA结合。在Y轴上示出了在492nm的吸光度。

图3示出scFv噬菌体抗体SC03-014、SC03-022和对照scFv噬菌体抗体与在HEK293T细胞(左侧)或模拟转染的HEK293T细胞(右侧)上表达的全长S蛋白的FACS结合。在Y轴上示出平均荧光强度。

图4示出抗体CR03-014、CR03-022和对照抗体与S565片段(SARS-CoV的S蛋白的第1-565位氨基酸；左列)、S318-510片段(SARS-CoV的S蛋白的第318-510位氨基酸；中间列)及不相关的对照myc标记的抗原(右列)的ELISA结合。在Y轴上示出在492nm的吸光度。

图5示出抗体CR03-014、CR03-022和对照抗体的稀释液与SARS-CoV的S蛋白的S565片段的ELISA结合。在Y轴上示出在492nm的吸光度，X轴上示出抗体的量(μg/ml)。

图6示出结合S565片段的竞争性ELISA。图6A示出生物素酰化的抗体CR03-014在无竞争抗体下或者与1μg/ml、5μg/ml或25μg/ml竞争抗体CR03-014、CR03-022或对照抗体之间的竞争。图6B示出生物素酰化的抗体CR03-022在无竞争抗体下或与上述竞争抗体之间的竞争。Y轴示出％最大结合，X轴上示出竞争抗体的量(μg/ml)。

图7示出使用抗S蛋白抗体的夹心ELISA。固定化抗体CR03-014和CR03-022用于捕获S蛋白片段S318-510。使用生物素酰化的抗体CR03-014、CR03-022或对照抗体检测结合的片段。在Y轴上示出在492nm的吸光度。

图8示出抗SARS单克隆抗体CR03-014和CR03-022与SARS-CoV毒株Frankfurt 1的S蛋白的第318-510位氨基酸区域(称作WT S318-510)及WT S318-510片段的天然发生的变体(变体A，突变K344R；变体B，突变S353F；变体C，突变R426G和N437D；变体D，突变Y436H；变体E，突变Y442S；变体F，突变N479S；变体G，突变K344R、F360S、N479K和T487S；变体H，突变K344R、F360S、L472P、D480G和T487S；变体I，突变K344R和F501Y)的结合。对照是不相关的myc-His标记的蛋白质。在Y轴上示出在492nm的吸光度。

图9示出SARS-CoV野生型毒株(SARS-CoV毒株HKU 39849)与抗体CR03-014的逃逸病毒(escape viruses)的核苷酸和氨基酸序列对比。在感染2天后收获病毒感染的细胞，分离总RNA。产生cDNA并用于DNA测序。图中示出了含有突变的区域，突变以黑体字示出。氨基酸上方的数字表示来自包括信号肽的S蛋白的氨基酸数。图9中的序列也以SEQ ID No：118-121表示。

图10示出抗SARS单克隆抗体CR03-014和CR03-022与SARS-CoV毒株Frankfurt 1的S蛋白的第318-510位氨基酸区域(称作FRA1 S318-510)及具有P462L取代的CR03-014抗体的逃逸变体的结合。Y轴上示出了在492nm的吸光度。

发明描述

下文描述了本发明中使用的术语的定义。

定义

结合分子

如本文所用，术语“结合分子”是指完整的免疫球蛋白，包括单克隆抗体如嵌合的、人源化的或人的单克隆抗体，或者是指一种免疫球蛋白的包含抗原结合结构域和/或可变区的片段，其与所述完整免疫球蛋白竞争特异性结合所述免疫球蛋白的结合配偶体例如SARS-CoV。不论结构如何，所述抗原结合片段结合由完整免疫球蛋白识别的相同抗原。抗原结合片段可包含肽或多肽，所述肽或多肽包含所述结合分子的氨基酸序列的至少2个连续氨基酸残基、至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少30个连续氨基酸残基、至少35个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列。

如本文所用，术语“结合分子”包括本领域已知的所有免疫球蛋白类别和亚类。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，结合分子可分为5种主要类别的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

抗原结合片段特别包括Fab、F(ab′)、F(ab′)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、diabodies、triabodies、tetrabodies、至少含有足以赋予与(多)肽的特异性抗原结合的免疫球蛋白的片段的(多)肽，等。上述片段可以合成产生或者通过酶促或化学切割完整免疫球蛋白而产生或者可以通过重组DNA技术遗传工程化产生。产生方法为本领域所熟知，例如并入作参考的Antibodies：A Laboratory Manual，Edited by：E.Harlow and D，Lane(1988)，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York所描述。结合分子或其抗原结合片段可具有一或多个结合位点。如果有多于一个的结合位点，则所述结合位点可以相同或不同。

结合分子可以是裸的或者未缀合的结合分子，但也可以是免疫缀合物的一部分。裸的或未缀合的结合分子是指未与效应成分或标记例如毒性物质、放射性物质、脂质体、酶缀合的、可操纵地连接的或经物理方法或在功能性上相结合的结合分子。应理解裸的或未缀合的结合分子不排除已经被稳定化、多聚体化、人源化或以除了附着于效应成分或标记之外的任何其它方式操作的结合分子。因此，本发明包括所有翻译后修饰的裸的和未缀合的结合分子，包括在天然产生结合分子的细胞环境中产生的修饰、通过重组产生结合分子的细胞产生的修饰及在最初的结合分子制备后通过人工导入的修饰。当然，术语裸的或未缀合的结合分子不排除结合分子在被给予机体后与效应细胞和/或分子形成功能结合物的能力，因为有一些这样的相互作用是发挥生物学作用必需的。

生物学样品

如本文所用，术语“生物学样品”包含多种类型样品，包括生物来源的血液及其它液体样品、固体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞及其后代。该术语还包含在获得后已经以任何方式处理的样品，如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或多核苷酸。该术语包含得自任何物种的多种临床样品，也包括培养细胞、细胞上清和细胞溶解物。

互补决定区(CDR)

如本文所用，术语“互补决定区”是指结合分子如免疫球蛋白的可变区中的序列，其通常主要提供在形状和电荷分布方面与抗原上被识别的表位互补的抗原结合位点。CDR区可以特异于线性表位、不连续表位或者蛋白质或蛋白质片段的构象表位，这些表位以其天然构象存在于蛋白质上或者在一些情况中作为例如通过在SDS中增溶而变性的形式存在于蛋白质上。表位也可以由翻译后修饰的蛋白质组成。

调节表达的核酸序列

如本文所用，术语“调节表达的核酸序列”是指可操纵地连接的编码序列在特定宿主生物体中的表达所需的多核苷酸序列和/或影响可操纵地连接的编码序列在特定宿主生物体中的表达的多核苷酸序列。所述调节表达的核酸序列例如合适的转录起始序列、转录终止序列、启动子序列、增强子序列；阻抑或激活序列；有效的RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(例如核糖体结合位点)；增强蛋白质稳定性的序列；及当需要时增强蛋白质分泌的序列，可以是在选择的宿主生物体中有活性的任何核酸序列，及可以衍生自编码对于宿主生物体是同源或异源的蛋白质的基因。本领域技术人员熟知调节表达的序列的鉴别和应用。

功能变体

如本文所用，术语“功能变体”是指包含与亲代结合分子的核苷酸和/或氨基酸序列相比改变了一或多个核苷酸和/或氨基酸的核苷酸序列和/或氨基酸序列但仍能竞争性结合亲代结合分子的结合配偶体例如SARS-CoV的结合分子。换句话说，亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或含有所述氨基酸序列的结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。所述功能变体可具有保守的序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域已知的标准技术导入，例如定点诱变和随机PCR介导的诱变，并且可以包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。

保守的氨基酸取代包括氨基酸残基由具有相似结构或化学性质的氨基酸残基置换。本领域已经明确了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。本领域技术人员清楚也可以应用除了上述之外的其它氨基酸残基家族分类。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如将氨基酸残基用具有不同结构或化学性质的氨基酸残基置换。相似的小变化也可以包括氨基酸缺失或插入或者这两者。确定氨基酸残基可以被取代、插入、或缺失而不消除其免疫学活性的指导可以使用本领域熟知的计算机程序发现。

核苷酸序列中的突变可以是在基因座产生的单一改变(点突变)，如转换或颠换突变，或者可以在一个单基因座插入、缺失或改变多个核苷酸。另外，可以在核苷酸序列内的任意数目的基因座中产生一或多个改变。突变可以通过本领域已知的合适方法进行。

宿主

如本文所用，术语“宿主”是指其中已经导入载体如克隆载体或表达载体的生物体或细胞。所述生物体或细胞可以是原核或真核生物体或细胞。应理解这个术语不仅是指特定对象生物体或细胞，也是指这种生物体或细胞的后代。由于突变或环境影响导致在后续的世代中可以发生某些修饰，因此这种后代实际上与亲代生物体或细胞不相同，但仍包括在本文所用术语“宿主”范围内。

人

术语“人”当用于描述本文定义的结合分子时，是指直接衍生自人或基于人序列的分子。当结合分子衍生自或基于人序列及随后被修饰时，在本说明书中仍认为是人结合分子。换句话说，术语人当用于描述结合分子时意在包括这样的结合分子，它们具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区，其基于在或不在人或人淋巴细胞中发生的可变区或恒定区或修饰形式的可变区或恒定区。因此，人结合分子可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，包含取代和/或缺失(例如，通过例如体外随机或位点特异性诱变或者体内体细胞突变而引入的突变)。本文所用术语“基于”是指核酸序列可以从模板中精确拷贝，或者通过易错PCR方法而具有小突变，或者通过精确的模板匹配或具有小修饰的模板匹配而合成产生。基于人序列的半合成分子在本文也被认为是人分子。

分离的

术语“分离的”当用于描述本发明的结合分子时，是指所述结合分子基本上不含其它蛋白质或多肽，特别是不含具有不同抗原特异性的其它结合分子，也基本上不含其它细胞材料和/或化学物质。例如，当所述结合分子是重组产生的时，它们优选基本上不含培养基，当所述结合分子是通过化学合成产生的时，它们优选基本上不含化学前体或其它化学物质，即它们从参与蛋白质合成的化学前体或其它化学物质中分离出。术语“分离的”当用于描述编码本发明结合分子的核酸分子时，是指这样的核酸分子，其中编码所述结合分子的核苷酸序列不含其它核苷酸序列、特别是不含编码结合除SARS-CoV之外的结合配偶体的结合分子的核苷酸序列。另外，术语“分离的”是指与在其天然宿主中天然伴随天然核酸分子的其它细胞成分例如与其天然伴随的核糖体、聚合酶或基因组序列充分分离的核酸分子。另外，“分离的”核酸分子，如cDNA分子，可以基本上不含其它细胞材料，或者当通过重组技术产生时基本是不含培养基，或者当经化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。

单克隆抗体

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指具有单一分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体展示对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”是指展示单一结合特异性的具有衍生自或基于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区或者衍生自全合成序列的可变区和恒定区的抗体。制备单克隆抗体的方法是无关的。

核酸分子

如本文所用，术语“核酸分子”是指核苷酸的聚合形式，包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义和反义链，及上述的合成形式和混和聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者各种类型核苷酸的修饰形式。该术语还包括单链和双链形式的DNA。另外，多核苷酸可包括通过天然发生的和/或非天然发生的核苷酸键连接在一起的任一或两个天然发生的和修饰的核苷酸。核酸分子可以经化学或生物化学方法修饰，或者可以含有非天然的或衍生的核苷酸碱基，这易于由本领域技术人员所意识到。这类修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一或多个天然发生的核苷酸、核苷酸间修饰如不带电荷的键{例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等}、带电荷的键(例如硫代磷酸、二硫代磷酸等)、悬垂部分(例如多肽)、嵌插剂(intercalators)(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和修饰的键(例如α异头(anomeric)核酸等)。该术语还包括任何拓朴构象，包括单链、双链、部分双链体、三链体、发夹状、环状和扣锁构象。该术语还包括模拟多核苷酸通过氢键及其它化学相互作用而结合指定序列的能力的合成分子。这类分子为本领域所已知，包括例如其中分子主链的磷酸键由肽键取代的那些分子。除非特别指出，则提及核酸序列时均包含其互补序列。因此，提及具有特定序列的核酸分子时应理解包含具有其互补序列的互补链。所述互补链也可用于例如反义治疗、杂交探针和PCR引物目的。

可操纵地连接

术语“可操纵地连接”是指两或多个核酸序列元件通常经物理方式连接并且彼此存在功能关系。例如，如果启动子能起始或调节编码序列的转录或表达则该启动子与所述编码序列是可操纵地连接的，在这种情况中编码序列应理解为是在所述启动子的“控制”下。

药物学可接受的赋形剂

“药物学可接受的赋形剂”是指与活性分子如药物、活性物质(agent)或结合分子组合的用以制备合适或方便的剂量形式的任何惰性物质。“药物学可接受的赋形剂”是在应用剂量和浓度对于受体无毒性并且与包含药物、药剂或结合分子的配制品的其它成分相容的赋形剂。

特异性结合

如本文所用，针对结合分子如抗体与其结合配偶体例如抗原之间的相互作用而提及的术语“特异性结合”，是指所述相互作用依赖于结合配偶体上特定结构的存在，例如抗原决定簇或表位的存在。换句话说，甚至当所述结合配偶体存在于其它分子或生物体的混合物中时，所述抗体也优先结合或识别所述结合配偶体。所述结合可以由共价或非共价相互作用或者这两种作用介导。再换句话说，术语“特异性结合”是指免疫特异性结合抗原或其片段及非免疫特异性结合其它抗原。免疫特异性结合抗原的结合分子可以以较低亲和性结合其它肽或多肽，根据例如放射性免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、BIACORE或者本领域已知的其它测定法确定。免疫特异性地结合抗原的结合分子或其片段可以与相关抗原交叉反应。优选地，免疫特异性地结合抗原的结合分子或其片段与其它抗原不交叉反应。

治疗有效量

术语“治疗有效量”是指本发明所述结合分子有效预防、改善和/或治疗SARS-CoV感染所致病症的量。

治疗

术语“治疗”是指用以治愈疾病或阻止或者至少延迟疾病进展的治疗性处理和预防措施。需要治疗的对象包括已经患有SARS-CoV感染所致病症以及需要防止SARS-CoV感染的对象。从SARS-CoV感染中部分或全部痊愈的对象也需要治疗。预防包括抑制或降低SARS-CoV的传播或者抑制或降低与SARS-CoV感染相关的一或多种症状的发生、发展或进展。

载体

术语“载体”是指一种核酸分子，其中可以插入另一种核酸分子以用于将其导入宿主中以便其复制、在一些情况中表达。换句话说，载体能转运与其连接的核酸分子。克隆以及表达载体均涵盖在本发明所用术语“载体”中。载体包括但不限于质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)及衍生自噬菌体或植物或动物(包括人)的病毒的载体。载体包含由指定宿主识别的复制起源，在表达载体情况中还包含由宿主识别的启动子及其它调节区。含有另一种核酸分子的载体通过转化、转染，或者通过利用病毒进入机制而导入细胞中。某些载体能在其被导入的宿主中自主复制(例如具有细菌复制起源的载体可以在细菌中复制)。其它载体可以在导入宿主时整合进宿主基因组中，从而与宿主基因组一起复制。

发明概述

本发明提供了能特异性结合SARS-CoV并具有SARS-CoV中和活性的结合分子的组合物。在一个优选的实施方案中，所述结合分子是人结合分子。本发明还提供了本发明的组合物在预防和/或治疗患有SARS-CoV所致病症或处于产生SARS-CoV所致病症的危险中的对象中的应用。除此之外，本发明涉及本发明的组合物在诊断/检测SARS-CoV中的应用。

发明详述

本发明第一方面涉及包含至少两种结合分子的组合物。在一个实施方案中，所述结合分子是免疫球蛋白。根据本发明，仍具有完整免疫球蛋白的希望的功能性和/或活性的免疫球蛋白的片段仍认为是免疫球蛋白。优选地，所述至少两种结合分子即免疫球蛋白能特异性结合冠状病毒。冠状病毒包括但不限于禽类传染性支气管炎病毒、禽类传染性喉气管炎病毒、肠冠状病毒、马冠状病毒、冠状病毒1群物种(Group 1 species)例如人类冠状病毒229E或人类冠状病毒NL63、冠状病毒2群物种如人冠状病毒OC43或鸡肠冠状病毒、冠状病毒3群物种、人类肠冠状病毒4408及SARS-CoV。所述组合物可以被给予哺乳动物以治疗、预防或减轻与冠状病毒感染相关的一或多个症状。

在本发明的一个实施方案中，本发明涉及协同组合物，及呈现协同的冠状病毒中和活性的组合物。换句话说，所述组合物包含能特异性结合冠状病毒并且具有冠状病毒中和活性的至少两种结合分子即免疫球蛋白，其特征在于所述结合分子协同起作用中和冠状病毒。如本文所用，术语“协同”是指结合分子当组合应用时的组合作用高于它们单独应用时的累加作用。换句话说，所述组合物的中和活性高于每种免疫球蛋白单独的中和活性的总和。在一个实施方案中，呈现协同的冠状病毒中和活性的组合物中存在的结合分子即免疫球蛋白当作为单独结合分子应用时无一具有冠状病毒中和活性。或者，呈现协同的冠状病毒中和活性的组合物中的至少两种结合分子中的一种结合分子当单独应用时可具有冠状病毒中和活性。在优选的实施方案中，至少两种结合分子即免疫球蛋白当单独应用时均具有冠状病毒中和活性。在一个实施方案中，呈现协同的冠状病毒中和活性的组合物中的至少两种结合分子之一可结合冠状病毒，而另一结合分子可结合冠状病毒的细胞相关受体。或者，这两种结合分子均可以结合冠状病毒或细胞相关受体。

在本发明的一个优选实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV，包括动物或人SARS-CoV。优选地，所述SARS-CoV是人SARS-CoV。另一方面，本发明提供了包含能特异性结合SARS-CoV并优选具有SARS-CoV中和活性的至少两种结合分子即免疫球蛋白的组合物。所述组合物优选呈现协同的SARS-CoV中和活性。换句话说，所述组合物包含具有SARS-CoV中和活性的至少两种结合分子即免疫球蛋白，其特征在于所述结合分子协同起作用中和SARS-CoV。所述组合物的SARS-CoV中和活性高于每种免疫球蛋白单独的中和活性的总和。在本发明的一个优选实施方案中，所述组合物中的结合分子协同起作用中和多个SARS-CoV毒株(见表1的一些已知SARS-CoV的基因组序列和S蛋白基因的列表)。在另一个实施方案中，所述组合物中每种免疫球蛋白均能中和多个(不同的)SARS-CoV毒株，优选人SARS-CoV毒株。在另一个实施方案中，本发明组合物中的至少一种结合分子即免疫球蛋白能中和动物SARS-CoV。本发明组合物中的结合分子可通过一些作用模式中和冠状病毒感染性如SARS-CoV感染性，所述作用模式包括但不限于防止冠状病毒与宿主细胞上的可能受体附着、抑制RNA释放进入细胞质中、阻止RNA转录或翻译，或者抑制或负调节冠状病毒复制。另外，所述结合分子可通过固定补体而起作用或者能有助于有包膜冠状病毒的裂解。它们也可以作为调理素而起作用并通过促进冠状病毒经Fc或C3b受体吸收或者通过使冠状病毒凝集使其更容易被吞噬而增加冠状病毒的吞噬。所述组合物中的结合分子可具有相似或不同的作用模式。在一个特定的实施方案中，相对于不存在所述组合物的条件下病毒对宿主细胞的感染性，所述组合物中和冠状病毒如SARS-CoV的感染性的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。测定病毒中和活性的方法为本领域技术人员所已知。这种测定方法例如下文所描述。

本发明组合物中的结合分子即免疫球蛋白能特异性结合有活性的或者失活/减毒形式的冠状病毒如SARS-CoV。失活/减毒病毒的方法为本领域所熟知，包括但不限于加热失活、通过UV照射失活、通过γ射线照射失活。所述结合分子也能特异性结合冠状病毒的一或多个片段，包括衍生自冠状病毒的一或多种蛋白质和/或(多)肽制备物。优选地，所述片段至少包含由本发明的结合分子识别的抗原决定簇。本文所用术语“抗原决定簇”是指能以足够高的亲和性结合本发明的结合分子以形成可检测的抗原结合分子复合物的一种成分，如冠状病毒(如SARS-CoV)、(多)肽、蛋白质、糖蛋白、其类似物或片段。

在一个实施方案中，所述结合分子即免疫球蛋白能特异性结合冠状病毒的表面可及蛋白质，所述蛋白质包括但不限于内膜和外膜蛋白、贴于细胞壁的蛋白质、潜在的分泌蛋白质。这方面的SARS-CoV相关蛋白质是刺突(spike)(S)蛋白、膜(基质)蛋白、(小)包膜蛋白、Orf3、Orf4、Orf7、Orf8、Orf9、Orf10和Orf14。冠状病毒的各种已知毒株如SARS-CoV的蛋白质和潜在蛋白质的氨基酸序列可见于EMBL数据库和/或其它数据库。例如SARS冠状病毒Urbani的完整基因组可见于EMBL数据库，登记号为AY278741，SARS冠状病毒HSR 1的完整基因组的登记号为AY323977，SARS冠状病毒Frankfurt 1的完整基因组的登记号为AY291315，SARS冠状病毒TOR2的完整基因组登记号为AY274119。

在一个实施方案中，本发明组合物中的至少一种结合分子即免疫球蛋白能特异性结合SARS-CoV的S蛋白。另一结合分子可结合靶细胞上存在的或与其相结合的SARS-CoV的受体。这种受体例如是ACE-2受体(见Li et al.，2003所述)。在另一个实施方案中，本发明组合物中的所有结合分子均能特异性结合SARS-CoV的S蛋白。

在另一个实施方案中，本发明组合物中的至少一种结合分子能特异性结合SARS-CoV的S蛋白的胞外结构域。这个结构域由S蛋白的第15-1195位氨基酸组成。在一个特定实施方案中，本发明组合物中的至少一种结合分子能特异性结合SARS-CoV的S蛋白的第318-510位氨基酸。本发明组合物中的中和性结合分子即免疫球蛋白可与冠状病毒如SARS-CoV的重叠的竞争表位反应，但优选与其不同的/独立的非竞争性表位反应。

本发明另一方面是包含至少两种能特异性结合冠状病毒如SARS-CoV的结合分子的组合物，其中所述结合分子能与冠状病毒的不同的非竞争性表位反应。优选地，所述冠状病毒是人类冠状病毒，更优选地所述冠状病毒是SARS-CoV。包含至少两种结合分子其中每种结合分子均结合病毒上的不同表位或位点的组合物与包含至少两种结合分子其中每种结合分子结合病毒上的重叠表位或位点的组合物相比更适于防止病毒的抗性变体的逃逸。

在一特定的实施方案中，由本发明组合物中的结合分子即免疫球蛋白识别的不同的非竞争性表位位于SARS-CoV的S蛋白上，特别是位于S蛋白的胞外结构域，更特别地位于S蛋白的第318-510位氨基酸内。另一方面，本发明组合物的至少一种结合分子即免疫球蛋白能与人和动物SARS-CoV的S蛋白的第318-510位氨基酸反应。在另一个实施方案中，本发明组合物的至少一种结合分子即免疫球蛋白与包含SEQ ID NO：128所示氨基酸序列的表位反应。所述表位可以由11、11-15、11-20、11-25、11-30、11-35、11-40、11-45个或者更多个氨基酸组成。另一方面，本发明组合物中的至少一种结合分子即免疫球蛋白能与其中第479位氨基酸是除了天冬酰胺之外的氨基酸的SARS-CoV的S蛋白的第318-510位氨基酸反应，反应程度与和其中第479位氨基酸是天冬酰胺的SARS-CoV的S蛋白的第318-510位氨基酸的反应程度相似。换句话说，第479位氨基酸的取代不明显影响本发明组合物中的至少一种免疫球蛋白与SARS-CoV的S蛋白的第318-510位氨基酸的结合。上述“相似程度”是指与所述结合分子结合其中第479位氨基酸是天冬酰胺的SARS-CoV的S蛋白的第318-510位氨基酸相比，所述结合分子以至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、优选至少100％的量结合其中第479位氨基酸是除了天冬酰胺之外的氨基酸的SARS-CoV的S蛋白的第318-510位氨基酸。结合可以通过本领域技术人员熟知的方法测定，例如通过ELISA测定。

本发明组合物中的结合分子优选是人结合分子，即免疫球蛋白。它们可以是完整的免疫球蛋白分子如多克隆或单克隆抗体，特别是人单克隆抗体，或者所述结合分子可以是抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab′)、F(ab′)2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、diabodies、triabodies、tetrabodies及含有至少足以赋予与SARS-CoV或其片段的特异性抗原结合的免疫球蛋白的片段的(多)肽。所述人结合分子优选是人单克隆抗体。所述组合物中的结合分子可以是非分离或分离形式。所述组合物可进一步包含至少一种其它治疗剂。优选地，所述治疗剂可用于预防和/或治疗冠状病毒例如SARS-CoV所致病症。

典型地，结合分子可以低于0.2×10^-4M、1.0×10^-5M、1.0×10^-6M、1.0×10^-7M、优选地低于1.0×10^-8M、更优选低于1.0×10^-9M、更优选低于1.0×10^-10M、更优选低于1.0×10^-11M、特别优选低于1.0×10^-12M的亲和性常数(Kd值)结合其结合配偶体，即冠状病毒或其片段。所述亲和性常数可根据抗体同种型而变化。例如，对于IgM同种型的亲和性结合是指结合亲和性至少为大约1.0×10^-7M。亲和性常数可例如使用表面等离子共振测定，即例如使用BIACORE系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden)检测生物传感器基质中蛋白质浓度的改变而可以分析实时生物特异性相互作用的一种光学现象。

所述结合分子可结合可溶形式的冠状病毒，例如样品中的冠状病毒，或者可以结合与载体或基质如微滴定平板、膜和珠等结合或附着的冠状病毒。载体或基质可以由玻璃、塑料(例如聚苯乙烯)、多糖、尼龙、硝化纤维或者特氟隆等制成。这种支持物的表面可以是固体的或者有孔的，可以是任何常规形状。另外，所述结合分子可以结合纯化/分离或者非纯化/分离形式的冠状病毒。

在一个优选的实施方案中，本发明的组合物的结合分子即免疫球蛋白包含至少3个CDR3区，优选地重链CDR3区，其包含SEQ IDNO：I或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。在另一个实施方案中，包含SEQ ID NO：1所示重链CDR3区的结合分子进一步包含轻链CDR3区，所述轻链CDR3区包含SEQ ID NO：129所示氨基酸序列。在另一个实施方案中，包含SEQ ID NO：1所示重链CDR3区的结合分子进一步包含重链CDR1、重链CDR2、轻链CDR1和轻链CDR2区域，所述区域分别包含SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132和SEQ ID NO：133所示氨基酸序列。在另一个实施方案中，包含SEQ ID NO：2所示重链CDR3区的结合分子进一步包含轻链CDR3区，该轻链CDR3区包含SEQ ID NO：134所示氨基酸序列。在另一个实施方案中，包含SEQ ID NO：2所示重链CDR3区的结合分子进一步包含重链CDR1、重链CDR2、轻链CDR1和轻链CDR2区域，所述区域分别具有SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138所示氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的结合分子包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明组合物中的结合分子即免疫球蛋白包含一种包含重链可变区的结合分子的至少一个CDR区，该重链可变区包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。在另一个实施方案中，其包含2、3、4、5、或者甚至所有6个CDR区。

在另一个实施方案中，本发明的结合分子包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列及所述轻链可变区包含SEQ ID NO：8所示氨基酸序列，或者所述重链可变区包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列及所述轻链可变区包含SEQ IDNO：10所示氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，具有冠状病毒如SARS-CoV中和活性的结合分子以IgG1或IgA形式给予。

另一方面，本发明的组合物可包含本文定义的结合分子的至少一种功能变体。所述组合物也可以仅由本发明所述的结合分子的功能变体组成。如果变体能与亲代结合分子竞争特异性结合冠状病毒如SARS-CoV或其片段，则认为分子是所述结合分子的功能变体。换句话说，当功能变体仍能结合冠状病毒如SARS-CoV或其片段时。优选地所述功能变体能中和冠状病毒如SARS-CoV感染性并应与一种或多种其它结合分子(或其它功能变体)形成呈现协同的冠状病毒如SARS-CoV中和活性的组合物。功能变体的中和活性与亲代结合分子相比可较高或较低。

功能变体包括但不限于与一级结构序列基本相同但含有在亲代结合分子中未发现的化学和/或生物化学的例如体外或体内修饰的衍生物。这种修饰为本领域技术人员所熟知，包括乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、糖基化、甲基化、PEG化、蛋白酶解加工、磷酸化等。

或者，功能变体可以是包含与亲代结合分子的氨基酸序列相比含有一或多个氨基酸的取代、插入或组合这些修饰的氨基酸序列的结合分子。另外，功能变体可包含在氨基末端或羧基末端或这两端的氨基酸序列截短。功能变体与亲代结合分子相比具有相同或不同的较高或较低结合亲和性，但仍能结合冠状病毒如SARS-CoV或其片段，优选仍能中和冠状病毒如SARS-CoV感染性。例如功能变体与亲代结合分子相比具有增加或降低的结合冠状病毒如SARS-CoV或其片段的结合亲和性。优选地，可变区包括但不限于构架区、高变区、特别是CDR3区的氨基酸序列被修饰。通常地，轻链和重链可变区包含三个高变区，包含三个CDR，和更保守的区域，即所谓的构架区(FR)。所述高变区包含来自CDR的氨基酸残基及来自高变环的氨基酸残基。落入本发明范围内的功能变体与本文定义的亲代结合分子具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约95％至大约99％、及特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。可以使用本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或Bestfit优化排列要进行对比的氨基酸序列，并确定相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过用本领域已知的一般分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括易错PCR、寡核苷酸定向诱变及定点诱变。

另一方面，本发明包括包含至少一种免疫缀合物的组合物，所述免疫缀合物即包含至少一种本发明的结合分子或其功能变体及进一步包含至少一个标记的分子。本发明还包含由免疫缀合物组成的组合物。所述组合物可进一步包含另一种分子，如具有不同特异性的治疗剂或者免疫缀合物。  在另一个实施方案中，本发明的免疫缀合物可包含一个以上的标记。这些标记可以彼此相同或不同，并可以与所述结合分子非共价结合/缀合。所述标记也可以通过共价键与所述结合分子直接结合/缀合。或者，所述标记可以通过一或多个连接化合物与所述结合分子结合/缀合。将标记与结合分子缀合的技术为本领域技术人员所熟知。

本发明的免疫缀合物的标记可以是治疗剂，但优选是可检测的部分/物质。包含一种包含可检测的物质的免疫缀合物的组合物可诊断性用于评估对象是否已经感染冠状病毒如SARS-CoV，或者监测冠状病毒如SARS-CoV的产生或进展作为临床测试程序的一部分，以例如确定指定的治疗方案的功效。然而，它们也可用于其它检测和/或分析和/或诊断目的。可检测的部分/物质包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属和非放射性顺磁性金属离子。用于标记结合分子以进行检测和/或分析和/或诊断目的的标记依赖于特定的检测/分析/诊断技术和/或使用的方法，如(组织)样品的免疫组织化学染色、流式细胞计量术、扫描激光血细胞计数检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、生物测定(例如中和测定)、Western印迹应用等。对于组织样品的免疫组织化学染色，优选的标记是催化可检测的产物产生和局部沉积的酶。另外，本发明的组合物也可以附着于特别用于冠状病毒或其片段的体外免疫测定或纯化的固体支持物。这种固体支持物可以是有孔或无孔的、平面或非平面的。本发明的结合分子或其功能片段可以与标记序列如一种肽融合以促进纯化。或者，一种抗体可以与另一种抗体缀合形成抗体异源缀合物。另一方面，本发明的结合分子可以与一或多种抗原缀合/附着。优选地，这些抗原是由被给予结合分子-抗原缀合物的对象的免疫系统识别的抗原。

通过直接或通过例如接头间接缀合而化学产生免疫缀合物后，所述免疫缀合物可以作为包含本发明的结合分子和合适的标记的融合蛋白而产生。融合蛋白可以通过本领域已知的方法产生，例如通过构建包含同框的编码结合分子的核苷酸序列及编码合适标记的核苷酸序列的核酸分子，然后表达所述核酸分子而重组产生。

本发明的另一方面提供了编码本发明组合物中存在的至少一种结合分子或其功能变体的核酸分子。这种核酸分子可用作中间体以用于克隆目的，例如用于上述亲和性成熟过程中。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子是分离的或纯化的。

技术人员意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是可以使用标准遗传密码直接被翻译以提供与从亲代核酸分子翻译的相同的氨基酸序列的核酸序列。

优选地，所述核酸分子编码包含CDR3区、优选包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的重链CDR3区的结合分子。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子编码包含轻链CDR3区的结合分子，该轻链CDR3区包含SEQ ID NO：129或SEQ ID NO：134所示氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子编码包含重链CDR1区、重链CDR2区、轻链CDR1区、和/或轻链CDR2区的结合分子，所述重链CDR1区包含SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：135所示氨基酸序列，所述重链CDR2区包含SEQ ID NO：131或SEQ IDNO：136所示氨基酸序列，所述轻链CDR1区包含SEQ ID NO：132或SEQ ID NO：137所示氨基酸序列，所述轻链CDR2区包含SEQ ID NO：133或SEQ ID NO：138所示氨基酸序列。

更优选地，所述核酸分子编码包含重链可变区的结合分子，所述重链可变区包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。

在另一个实施方案中，所述核酸分子编码包含包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的轻链可变区的结合分子，或者它们编码包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的轻链可变区。

在本发明的一个特定实施方案中，编码本发明的结合分子的重链可变区的核酸分子包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示核苷酸序列。

在本发明的另一个特定实施方案中，编码本发明的结合分子的轻链可变区的核酸分子包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示核苷酸序列。本发明的核酸分子甚至可含有本发明组合物中存在的至少两种结合分子的核苷酸序列或其部分。

本发明的另一方面提供了包含本发明的一或多种核酸分子的载体，即核酸构建体。载体可衍生自质粒如F、R1、RP1、Col、pBR322、TOL、Ti等；粘粒；噬菌体如λ、lambdoid、M13、Mu、P1、P22、Q_β、T-even、T-odd、T2、T4、T7等；植物病毒；或者动物病毒。载体可用于克隆和/或表达本发明的结合分子，及可用于基因治疗目的。包含与一或多种调节表达的核酸分子可操纵地连接的本发明的一或多种核酸分子的载体也包括在本发明内。本发明的组合物中存在的结合分子可以在单独的载体上表达，但也可以在同一载体上表达。载体的选择依赖于重组程序及使用的宿主。在宿主细胞中导入载体可通过磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、lipofectamin转染或电穿孔实现。载体可以自主复制或者可以与其已经整合进其中的染色体一起复制。优选地，所述载体含有一或多种选择标记。所述标记的选择可依赖于选择的宿主细胞，其对于本发明不是关键的并且已经为本领域技术人员所熟知。所述标记包括但不限于卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、zeocin、单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、小鼠二氢叶酸还原酶基因(dhfr)。包含与一或多种编码可用于分离结合分子的蛋白质或肽的核酸分子可操纵地连接的一或多种编码上述结合分子的核酸分子的载体也包括在本发明中。这些蛋白质或肽包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、结合金属的聚组氨酸、绿色荧光蛋白、萤光素酶和β-半乳糖苷酶。

含有一或多个拷贝的上述载体的宿主是本发明的另一主题。优选地，所述宿主是宿主细胞。宿主细胞包括但不限于哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌来源的细胞。细菌细胞包括但不限于革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌、链霉菌和葡萄球菌属的一些菌种，或者革兰氏阴性细菌如埃希氏菌属如大肠杆菌及假单胞菌属的一些菌种。在真菌细胞中优选使用酵母细胞。在酵母中的表达可以通过使用酵母株如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和Hansenula polymorpha而实现。另外，昆虫细胞如来自果蝇的细胞和Sf9细胞可用作宿主细胞。除此之外，宿主细胞可以是植物细胞。使用哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、BHK细胞或者Bowes黑素瘤细胞的表达系统是本发明优选的。哺乳动物细胞提供了具有翻译后修饰的表达的蛋白质，其与哺乳动物来源的天然分子最相似。由于本发明涉及可给予人类的分子，因此特别优选完全的人表达系统。因此，更优选所述宿主细胞是人细胞。人细胞例如是HeLa、911、AT1080、A549、293和HEK293T细胞。优选的哺乳动物细胞是人视网膜细胞如911细胞，或者是于1996年2月29日以保藏号96022940保藏在European Collection of Cell Cultures(ECACC)，CAMR，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG, Great Britain、商标是PER.C6^(PER.C6是Crucell Holland B.V.的注册商标)的细胞系。对于本申请，“PER.C6”是指以保藏号96022940保藏的细胞或其祖先、上游或下游传代以及来自保藏的细胞的祖先的后代及任何前述细胞的衍生物。在优选的实施方案中，人生产细胞包含可表达形式的编码腺病毒E1区的核酸序列的至少功能部分。在更优选的实施方案中，所述宿主细胞衍生自人视网膜并用包含腺病毒E1序列的核酸永生化，如于1996年2月29日以保藏号96022940保藏在EuropeanCollection of Cell Cultures(ECACC)，CAMR，Salisbury，Wiltshire SP4OJG，Great Britain的商标为PER.C6^的细胞系，及其衍生物。在宿主细胞中生产重组蛋白可以根据本领域熟知的方法进行。商标为PER.C6^的细胞作为感兴趣的蛋白质的生产平台的应用已经在WO00/63403中描述，所述文献在此以其全文并入作参考。

生产结合分子或其功能变体的方法为本领域技术人员所熟知。一种方法包括如下步骤：a)在有益于结合分子或其功能变体表达的条件下培养上述定义的宿主细胞，b)任选地，回收所述表达的结合分子或功能变体。表达的结合分子或其功能变体可以回收自无细胞(cellfree)提取物，但优选回收自培养基中。从无细胞培养物或培养基中回收蛋白质如结合分子的方法为本领域技术人员所熟知。通过上述方法可获得的结合分子或其功能变体也是本发明的一部分。或者，在宿主如宿主细胞中表达之后，结合分子或其功能变体可以通过常规肽合成仪合成产生或在无细胞翻译系统中使用衍生自本发明的DNA分子的RNA核酸产生。通过上述合成生产方法或无细胞翻译系统可获得的结合分子或其变体也是本发明的一部分。在另一个实施方案中，本发明的结合分子、优选特异性结合冠状病毒如SARS-CoV或其片段的人结合分子可以由转基因非人哺乳动物产生，例如由表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或兔产生。优选地，所述转基因非人哺乳动物具有包含编码上述所有或部分人结合分子的人重链转基因和人轻链转基因的基因组。所述转基因非人哺乳动物可以用冠状病毒如SARS-CoV或其片段的纯化或富集制备物免疫。免疫非人哺乳动物的方案为本领域所熟知。见并入作参考的Using Antibodies：A LaboratoryManual，Edited by：E.Harlow，D.Lane(1998)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York及Current Protocols inImmunology，Edited by：J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W.Strober(2001)，John Wiley & Sons Inc.，New York所述。免疫方案通常包括不用或用佐剂如Freund′s完全佐剂和Freund′s不完全佐剂多次免疫，但也可包括裸DNA免疫。在另一个实施方案中，人结合分子是由衍生自已经暴露于SARS-CoV的转基因动物或人对象的B细胞或浆细胞产生。在另一个实施方案中，人结合分子是由通过得自上述转基因非人哺乳动物或人对象的B细胞与永生化的细胞融合而制备的的杂交瘤产生。可得自上述转基因非人哺乳动物或人对象的B细胞、浆细胞和杂交瘤以及可得自上述转基因非人哺乳动物或人对象的人结合分子也是本发明的一部分。

鉴别结合分子、优选地人结合分子如人单克隆抗体或其片段或者编码所述结合分子的核酸分子的方法可包括如下步骤：a)将结合分子、优选人结合分子的噬菌体文库与冠状病毒如SARS-CoV或其片段接触，b)至少一次选择结合所述冠状病毒或其片段的噬菌体，c)分离及回收与所述冠状病毒或其片段结合的噬菌体。所述选择步骤可以通过将噬菌体文库与失活的冠状病毒接触而进行。所述冠状病毒可以是分离或未分离的，例如存在于感染个体的血清和/或血液中。或者，所述选择步骤可以在存在冠状病毒片段如冠状病毒(如SARS-CoV)的胞外部分、一或多种衍生自冠状病毒的蛋白质或(多)肽、包含这些蛋白质或(多)肽的融合蛋白等的条件下进行。鉴别和获得结合分子例如抗体的噬菌体展示方法是本领域技术人员已知的现在已经充分建立的方法。所述方法例如在美国专利No.5,696,108；Burton andBarbas，1994；de Kruif et al.，1995b；及Phage Display：A LaboratoryManual.Edited by：CF Barbas，DR Burton，JK Scott and GJ Silverman(2001)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork中描述。所有这些参考文献在此均以全文并入作参考。为了构建噬菌体展示文库，将人单克隆抗体重链和轻链可变区基因集合以例如单链Fv(scFv)或Fab形式在噬菌体表面上表达，优选丝状噬菌体、颗粒(见de Kruif et al.，1995b)。表达抗体片段的噬菌体大文库典型含有大于1.0×10⁹的抗体特异性，并可以从在未免疫或免疫的个体的B淋巴细胞中表达的免疫球蛋白V区装配。在特定的实施方案中，结合分子的噬菌体文库、优选scFv噬菌体文库，是从分离自得自已经接种或暴露于冠状病毒如SARS-CoV的细胞的RNA中制备的。RNA可以分离自骨髓或外周血，优选外周血淋巴细胞。所述对象可以是接种或暴露于冠状病毒的动物，但优选是已经接种或暴露于冠状病毒的人对象。优选地，所述人对象是从冠状病毒感染恢复的对象。

或者，噬菌体展示文库可以从已经在体外部分装配的免疫球蛋白可变区构建，以在文库中导入另外的抗体多样性(半合成文库)。例如，在体外装配的可变区在对于抗体特异性重要的分子区域如CDR区域中含有合成产生的、随机或部分随机的DNA序列。冠状病毒特异性噬菌体抗体可选自文库，通过将冠状病毒(失活或活性形式)或靶抗原如冠状病毒抗原固定在固相上，随后将所述冠状病毒(失活或活性形式)或靶抗原暴露于噬菌体文库以允许与表达特异于所述固相结合的抗原的抗体片段的噬菌体结合。未结合的噬菌体通过洗涤除去，从所述固相中洗脱结合的噬菌体以感染大肠杆菌，随后增殖。通常需要进行多次选择和增殖以足以富集特异性结合所述冠状病毒(失活或活性形式)或靶抗原的噬菌体。如果需要，在将噬菌体文库暴露于冠状病毒(失活或活性形式)或靶抗原之前，可以首先将噬菌体文库通过暴露于与固相结合的非靶抗原而缩减。也可以选择结合复合抗原如冠状病毒蛋白或(多)肽的复合混合物或表达一或多种冠状病毒蛋白或(多)肽的宿主细胞的噬菌体。抗原特异性噬菌体抗体可以选自文库，通过将其上结合一种失活的冠状病毒制备物的固相与噬菌体抗体文库一起保温，以使得例如噬菌体的scFv或Fab部分与冠状病毒制备物的蛋白/多肽结合而进行。在经过保温及几次洗涤以除去未结合的和松散附着的噬菌体之后，洗脱其scFv或Fab部分与所述制备物结合的噬菌体，用于感染大肠杆菌以扩增新的特异性。通常需要一或多次选择以从大量未结合的噬菌体中分离感兴趣的噬菌体。或者，可以将冠状病毒的已知蛋白质或(多)肽在宿主细胞中表达，这些细胞可用于选择特异于所述蛋白质或(多)肽的噬菌体抗体。使用这些宿主细胞的噬菌体展示方法可进行扩展和改良，通过在筛选期间加入过量的不包含靶分子或者包含与靶分子相似但不相同的非靶分子的宿主细胞缩减不相关的结合者，从而显著增强发现相关结合分子的机会(这种方法称作Mabstract^TM方法，Mabstract是Crucell Holland B.V.的在审商标申请，也见于并入作参考的美国专利No.6,265,150所述)。使用上述鉴别方法可以发现对抗其的结合分子的冠状病毒例如是SARS-CoV。

获得结合分子、优选人结合分子或编码这种结合分子的核酸分子的方法可包括如下步骤：a)进行上述鉴别结合分子、优选人结合分子如人单克隆抗体或其片段或者编码所述结合分子的核酸分子的方法，b)从回收的噬菌体中分离人结合分子和/或编码人结合分子的核酸。一旦经上述鉴别结合分子或编码结合分子的核酸分子的方法确立或鉴别了新的单克隆噬菌体抗体，则可以从细菌或噬菌体中分离编码scFv或Fab的DNA，组合标准分子生物学技术产生编码具有希望特异性的二价scFv或完整人免疫球蛋白(例如IgG、IgA或IgM)的构建体。这些构建体可以转染进合适的细胞系中，可以产生完整的人单克隆抗体(见HuIs et al.，1999；Boel et al.，2000)。

除了至少两种结合分子之外，本发明的组合物还可包含稳定分子，如白蛋白或聚乙二醇或盐。优选地，使用的盐是保持所述结合分子的希望的生物活性并且不带来任何不希望的毒理学作用的盐。这种盐例如包括但不限于酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括但不限于得自无毒的无机酸，例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等的盐，以及得自无毒的有机酸如脂族单和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等的盐。碱加成盐包括但不限于得自碱土金属如钠、钾、镁、钙等的盐，以及得自无毒的有机胺如N，N′-联苯基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的盐。如果需要，本发明的结合分子可以包被于一种材料中或包被在其上，以保护所述结合分子免于酸或可使所述结合分子失活的其它天然或非天然条件的作用。

另一方面，本发明提供了包含至少两种编码本发明定义的结合分子的核酸分子的组合物。所述组合物可包含水溶液如含有盐(例如NaCl或上述盐)、去污剂(例如SDS)和/或其它合适成分的水溶液。

另外，本发明涉及包含本发明组合物的药物组合物。本发明的药物组合物进一步包含至少一种药物学可接受的赋形剂。

本发明的药物组合物可进一步包含至少一种其它的治疗、预防和/或诊断剂。优选地，所述进一步的治疗和/或预防剂是能预防和/或治疗冠状病毒如SARS-CoV感染和/或其所致病症的物质。治疗和/或预防剂包括但不限于抗病毒剂。这类物质可以是结合分子、小分子、有机或无机化合物、酶、多核苷酸序列等。

抗病毒剂的实例为本领域技术人员所熟知。目前用于治疗例如SARS-CoV感染的患者的物质是α-干扰素、类固醇和潜在的复制酶抑制剂。另外，感染SARS-CoV的患者目前是通过输入暴露于该病毒后已经产生抗体的正在痊愈/已经痊愈的SARA患者捐献的血液产生的血清进行治疗。在实验阶段的能预防和/或治疗SARS-CoV或其它冠状病毒感染和/或SARS-CoV或其它冠状病毒所致病症的物质在本发明中也可以用作治疗和/或预防剂。

本发明的药物组合物在用于人体之前可以在合适的动物模型系统中测试。这种动物模型系统包括但不限于雪貂、小鼠、大鼠、鸡、牛、猴、猪、狗、兔等。

典型地，药物组合物必须是无菌的，并且在生产和贮存条件下是稳定的。本发明的组合物可以是粉末，在给予之前或在给予时于合适的药物学可接受的赋形剂中重配。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冻干，其产生活性成分加上来自预先过滤灭菌的溶液的任何其它希望的成分的粉末。

或者，本发明的组合物可以在溶液中，并且在给予之前或给予时可以加入和/或混和合适的药物学可接受的赋形剂，以提供可注射形式的单位剂量。优选地，本发明中使用的药物学可接受的赋形剂适于高药物浓度，可以保持合适的流动性，如果需要则可以延迟吸收。

所述药物组合物的最佳给予途径的选择受一些因素的影响，包括组合物中活性分子的物理-化学性质、临床情形的紧急性及活性分子的血浆浓度与希望的治疗作用的关系。例如，如果需要，本发明的组合物可以与保护其免于快速释放的载体一起制备，如控制释放配制备物，包括植入体、经皮帖剂及微囊化输送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。另外，可能需要用防止组合物中的结合分子失活的材料或化合物包被所述组合物或与其共同给药。例如，所述组合物的结合分子可以在合适的载体中给予对象，所述载体例如是脂质体或稀释剂。

给予途径可分为两种主要类别，口服和肠道外给予。这两种类别包括本领域技术人员熟知的几种给予途径。优选的给予途径是静脉内注射、特别优选肌内注射。

口服剂型可以配制为几种形式，并可含有药物学可接受的赋形剂，包括但不限于惰性稀释剂、粒化和分解剂、结合剂、润滑剂、防腐剂、色素、香料或甜味剂、植物油、矿物质油、增湿剂、和增稠剂。

本发明的药物组合物也可以配制为肠道外给予剂型。肠道外给予剂型可以是水性或非水性等渗无菌无毒注射或灌注溶液或悬浮液。所述溶液或悬浮液可包含在应用的剂量和浓度对受体无毒性的物质。这些物质为本领域技术人员所熟知，包括1，3-丁二醇、Ringer′s溶液、Hank′s溶液、等渗氯化钠溶液、油或脂肪酸、局部麻醉剂、防腐剂、缓冲剂、增粘剂或增溶剂、水溶性抗氧化剂、脂溶性抗氧化剂和金属螯合剂。

另一方面，本发明的药物组合物可用作药物。因此，使用本发明的药物组合物治疗和/或预防冠状病毒感染的方法是本发明的另一部分。本发明的(药物)组合物可用于诊断、预防、治疗冠状病毒所致的一或多种病症。本发明的药物组合物适于治疗患有冠状病毒所致病症的仍未治疗的患者，及适于治疗患有冠状病毒所致病症并已经或正在进行治疗的患者。它们起到抗冠状病毒的进一步感染的保护作用和/或将阻止与冠状病毒相关的症状的出现或进展。它们甚至还可用于冠状病毒所致病症的预防中，例如暴露于冠状病毒的人，如照顾疑似患者的医院员工的预防。优选地，所述(药物)组合物可用于检测、预防和/或治疗人冠状病毒如SARS-CoV感染的方法中。

上述组合物和药物组合物可与可用于诊断、预防和/或治疗冠状病毒感染的其它分子联合应用。它们可以在体外、离体(ex vivo)或在体内应用。例如，本发明的药物组合物可以与抗冠状病毒如SARS-CoV的疫苗共同给予。或者，所述疫苗可以在给予本发明的药物组合物之前或之后给予。本发明的药物组合物与疫苗的给予可适于暴露后预防，也可以降低活的减毒疫苗在无免疫活性的(immunocompromised)受体中可能的负作用。

结合分子典型以治疗或诊断有效量配制成本发明的组合物和药物组合物。可以调节剂量方案以提供最佳的希望应答(例如治疗应答)。合适的剂量范围可例如是0.05-100mg/kg体重，优选0.1-15mg/kg体重。

典型地，本发明的组合物和药物组合物中两种结合分子的摩尔比可以在1∶100-100∶1之间变化，优选1∶50-50∶1，更优选1∶25-25∶1，特别是1∶10-10∶1，更特别是1∶5-5∶1。另外，例如可以给予单次剂量(single bolus)，在一定时间给予若干分次剂量，或者根据治疗情形的紧急性而按比例降低或增加剂量。本发明的分子和组合物优选是无菌的。使这些分子和组合物无菌的方法为本领域所熟知。可用于诊断、预防和/或治疗的其它分子可以以给予本发明的结合分子相似的剂量方案给予。如果单独给予其它分子，可以在给予本发明的一或多种结合分子或药物组合物之前(例如2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或6周之前)、同时或随后(例如2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或6周后)给予。精确的剂量方案通常在对人患者进行临床试验期间挑选。

当给予人类作为体内治疗剂时，人结合分子和包含所述人结合分子的药物组合物是特别有用及通常优选的，因为针对给予的抗体的受体免疫应答通常显著低于给予单克隆鼠、嵌合或人源化的结合分子产生的应答。

另一方面，本发明涉及本发明的(药物)组合物在制备诊断、预防、治疗冠状病毒所致病症的药物中的应用。优选所述冠状病毒是人冠状病毒，如SARS-CoV。

接下来，包含至少一种本发明的组合物或者至少一种本发明的药物组合物的试剂盒也是本发明的一部分。任选地，本发明试剂盒的上述成分包装在合适容器中，并对诊断、预防和/或治疗指定疾病作出标记。(药物)组合物中的结合分子可单独包装。上述成分可以贮存在单位剂量或多剂量容器中，例如在密封的安瓿、小瓶、瓶子、注射器和试管中，呈水溶液、优选无菌的溶液形式或冻干的、优选无菌的用于重配的制备物形式。所述容器可以由各种材料制成，具有无菌入口(例如所述容器可以是静脉内注射溶液袋或者具有可由皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。所述试剂盒可进一步包含具有药物学可接受的缓冲液的多个容器。其可进一步包括从商业和使用者角度需要的材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器、一或多种合适宿主的培养基。试剂盒中还包括通常包含在治疗、预防或诊断产品的商业包装中的说明书，其含有关于例如使用这种治疗、预防或诊断产品的适应症、用法、剂量、生产、给予、禁忌症和/或注意事项。

本发明进一步涉及一种检测样品中的SARS-CoV的方法，所述方法包括如下步骤：a)将样品与诊断有效量的本发明组合物或药物组合物接触，和b)确定所述组合物或药物组合物是否特异性结合样品的分子。所述样品可以是生物学样品，包括但不限于来自(潜在)感染的对象的血液、血清、尿、组织或其它生物学材料，或者非生物学样品如水、饮料等。(潜在)感染的对象可以是人，但是怀疑携带冠状病毒如SARS-CoV的动物也可以使用所述组合物或药物组合物测试冠状病毒的存在。可以首先对样品进行处理使其更适于检测方法。处理是指对怀疑含有和/或含有冠状病毒的样品进行处理，由此所述冠状病毒分解为抗原性成分如蛋白质、(多)肽或其它抗原性片段。优选地，将所述组合物或药物组合物与所述样品在使得所述组合物或药物组合物中的结合分子与样品中可能存在的冠状病毒或其抗原性成分之间形成免疫复合物的条件下接触。免疫复合物的形成表示样品中存在冠状病毒，然后通过合适手段检测和测定。这些方法包括同质或异质结合免疫测定，如放射性免疫测定(RIA)、ELISA、免疫荧光、免疫组织化学、FACS、BIACORE及Western印迹分析。

优选的测定技术、特别是用于大规模临床筛选患者血清和血液及血液衍生产品的优选测定技术是ELISA和Western印迹技术。ELISA试验是特别优选的，并且为本领域技术人员所熟知。

另一方面，本发明提供了一种筛选特异性结合冠状病毒如SARS-CoV的与由本发明的结合分子或其功能变体所结合的表位不同的非重叠表位的结合分子或其功能变体的方法，所述方法包括如下步骤：a)将待被筛选的结合分子或其功能变体、本发明的结合分子或其功能变体和冠状病毒或其片段接触，b)测定被筛选的结合分子或其功能变体是否能与本发明的结合分子或其功能变体竞争特异性结合所述冠状病毒或其片段。如果被筛选的结合分子或其功能变体不能与本发明的结合分子或其功能变体竞争对所述冠状病毒或其片段的特异性结合，则其很可能结合不同的非重叠的表位。在进一步的步骤中，可以确定与本发明的结合分子相比结合不同的非重叠表位的被筛选的结合分子是否具有冠状病毒中和活性。在再进一步的步骤中，可以确定与本发明的结合分子相比结合不同的非重叠表位并具有冠状病毒中和活性的被筛选的结合分子与本发明的结合分子是否形成呈现协同的冠状病毒中和活性的组合物。筛选非竞争性结合分子及测定(协同)中和活性的测定为本领域技术人员所熟知。

实施例

为了例证本发明，提供了如下实施例。所述实施例非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：使用暴露于SARS-CoV的患者的周围血淋巴细胞构建scFv噬菌体展示文库

淋巴细胞得自痊愈自SARS-CoV的患者(见Rickerts et al.2003)，在液氮中冷冻。将所述淋巴细胞在37℃水浴中快速解冻并移至湿冰上。将所述淋巴细胞用冷DMEM培养基在50ml试管中稀释至终体积为50ml，在350×g离心5分钟。将获得的细胞沉淀悬浮于5mlDMEM中，使用台盼蓝排除法显现死亡的细胞，经显微镜确定细胞密度。将所有细胞(～5×10⁶)再次以350×g离心5分钟，轻轻倒出细胞并悬浮于剩余液体(DMEM)中。使用有机相分离(TRIZOL^TM)及随后的乙醇沉淀从这些细胞中制备总RNA。将获得的RNA溶解于经DEPC处理的超纯水中，通过OD 260nm测定法确定浓度。之后，将RNA稀释为100ng/μl浓度。接着，如下将1μgRNA转变为cDNA：向10μl总RNA中加入13μl DEPC处理的超纯水及1μl随机六聚体(500ng/μl)，将获得的混合物在65℃加热5分钟，在湿冰上迅速冷却。然后，向混合物中加入8μl 5×First-Strand缓冲液、2μl dNTP(每种10mM)、2μl DTT(0.1 M)、2μl Rnase抑制剂(40U/μl)和2μlSuperscript^TMIII MMLV逆转录酶(200U/μl)，在室温温育5分钟，在50℃温育1小时。通过加热失活即通过将混合物在75℃温育15分钟而终止反应。

将获得的cDNA产物用DEPC处理的超纯水稀释至终体积为200μl。获得的cDNA产物的50倍稀释溶液(于10mM Tris缓冲液中稀释)的OD 260nm为0.1。

将5-10μl稀释的cDNA产物用作模板，使用特异性寡核苷酸引物对免疫球蛋白γ重链家族和κ或λ轻链序列进行PCR扩增(见表2-9)。PCR反应混合物除了稀释的cDNA产物之外，还含有25pmol有义引物和25pmol反义引物、20mM Tris-HCl(pH 8.4)、50mM KCl、2.5mM MgCl₂、250mM dNTP及1.25单位Taq聚合酶，终体积为50μl。在96℃加热盖热循环仪中，将获得的混合物快速解链2分钟，随后进行30次扩增循环：96℃30秒，60℃30秒及72℃60秒。在第一轮扩增中，将9个有义定向引物(见表2，覆盖所有重链可变区家族)与称作HuCIgG 5′-GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT-3′(SEQID NO：87)的IgG特异性恒定区反义引物组合，产生大约650碱基对的9个产物。将这些产物在2％琼脂糖凝胶上纯化，使用Qiagen凝胶提取柱从凝胶中分离。将每种分离产物的1/10用于如上述相同PCR中，使用同样的9个有义引物(覆盖所有重链可变区家族)，从而将每个有义引物与4个J区特异性反义引物(见表3)之一组合。这样产生大约350碱基对的36个产物。将获得的产物在2％琼脂糖凝胶上纯化，使用Qiagen凝胶提取柱从凝胶中分离。在第三轮循环中，将每种分离的产物的1/10进行再次扩增，使用与第二轮循环相同的引物，附加条件是将使用的引物用限制位点(见表4)扩展以使得能在噬菌体展示载体pDV-C05(见SEQ ID NO：88)中定向克隆。这样再次产生36个产物。将使用(VH)有义引物获得的这些产物集合成9部分。在接下来的步骤中，将2.5μg集合部分和100μg pDV-C05载体用Ncol和Xhol消化并通过凝胶纯化。之后，如下在16℃进行连接过夜。向500ngpDV-C05载体中加入70ng集合部分，形成总体积为50μl连接混合物，含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl₂、10mM DTT、1mMATP、25μg/ml BSA及2.5μl T4 DNA连接酶(400u/μl)。对每个集合部分均进行这个程序。通过本领域技术人员熟知的方法对连接混合物进行苯酚/氯仿纯化，随后进行氯仿提取及乙醇沉淀。将获得的DNA溶解于50μl超纯水中，将每个连接混合物的2.5μl等份根据厂商(Stratagene)指导电穿孔进40μl的TG1感受态大肠杆菌中，一式二份进行实验。将转化体在37℃于含有补加了50μg/ml氨苄青霉素和4.5％葡萄糖的2TY琼脂的共27个培养皿中生长过夜(每个集合部分3个培养皿，培养皿直径为240mm×240mm)。通过从琼脂平板中刮下所述转化体而获得可变重链区(亚)文库。使用Qiagen^TM试剂盒，将这个(亚)文库直接用于质粒DNA制备。

以与上述针对重链区所述相似的三轮PCR循环及相同的反应参数从相同cDNA制备物中扩增轻链免疫球蛋白序列，附带条件是使用表5-9中描述的引物。第一轮扩增使用17个轻链可变区有义引物(11个是针对λ轻链(见表5)及6个是针对κ轻链(见表6))，每一个引物与识别C-κ恒定区的反义引物(称作HuCk5′-ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-S′(见SEQ ID NO：89))或者识别C-λ恒定区的反义引物(HuCλ25′-TGAACATTCTGTAGGGGCCACTG-3′(见SEQ ID NO：90)或者HuCλ7 5′-AGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG-3′(见SEQ ID NO：91))组合(在使用之前将HuCλ2和HuCλ7反义引物等摩尔浓度混和)，产生大约600碱基对的17个产物。将这些产物在2％琼脂糖凝胶上纯化，使用Qiagen凝胶提取柱从凝胶中分离。将每种分离产物的1/10用于如上述相同PCR中，使用相同的17个有义引物，从而每个λ轻链有义引物与三种Jλ区特异性反义引物(见表7)之一组合，每个κ轻链有义引物与五种Jκ区特异性反义引物(见表8)之一组合。这样产生大约350碱基对的63种产物。将获得的产物在2％琼脂糖凝胶上纯化，使用Qiagen凝胶提取柱从凝胶中分离。在第三轮循环中，将每种分离产物的1/10用与第二轮循环相同的引物再次进行扩增，附带条件是所用引物用限制位点(见表9)扩展，以使得能在重链(亚)文库载体中定向克隆。这样再次产生63种产物。将这些产物集合成共10部分。选择该数目以保持文库中不同轻链家族的自然分布以过量或不足量代表特定家族。使用家族中等位基因的数目确定文库中代表(representation)的百分比(见表10)。接着，将所述部分用Sail和Notl消化，在经相同限制酶切割的重链(亚)文库载体中连接，使用上述针对重链(亚)文库所述相同连接程序和体积。也如上述针对重链(亚)文库所述对所得到的确定的文库进行连接纯化和随后的转化。将转化体在含有补加了50μg/ml氨苄青霉素和4.5％葡萄糖的2TY琼脂的30个培养皿中生长(每个集合部分3个培养皿，培养皿直径为240mm×240mm)。将所有细菌收获在含有50μg/ml氨苄青霉素和4.5％葡萄糖的2TY培养基中，与甘油混和成15％(v/v)浓度，在-80℃以1.5ml等份冷冻。

实施例2：具有特异性识别SARS-CoV的单链Fv片段的噬菌体的选择

使用抗体噬菌体展示文库和技术选择抗体片段，所述技术基本如美国专利6,265,150和WO 98/15833所述，这两个文献均以其全文并入作参考。除非特别指出，所有程序均在室温进行。如下制备失活的SARS-CoV制备物(Frankfurt 1毒株)。一旦观察到致细胞病变作用(CPE)，就收获用SARS-CoV毒株Frankfurt 1感染的Vero细胞的培养基。将收获的培养基在3000rpm离心15分钟以除去细胞碎片。收集获得的上清，在3000rpm再次离心15分钟，移至干净的试管中。随后，将超速离心管充填10ml无菌的于PBS中的25％甘油。将20ml澄清的上清轻轻应用于甘油垫上，将试管在4℃在20,000rpm离心2小时。弃去上清，将病毒沉淀再悬浮于1ml TNE缓冲液(10mMTris-HCl pH 7.41mM EDTA、200mM NaCl)，在-80℃贮存。接着，将再悬浮的病毒沉淀在干冰上以45kGy进行γ射线照射。随后，测试其在细胞培养物中感染性的丧失。如果确定感染性丧失，则获得的失活的SARS-CoV制备物可用于选择特异性结合SARS-CoV的单链噬菌体抗体。

在4℃将失活的病毒制备物和加热失活的胎牛血清(FBS)在单独的Maxisorp^TM塑料管(Nunc)表面上包被过夜。将该管在含有2％FBS和2％脱脂奶粉(2％PBS-FM)的3ml PBS中封闭2小时。2小时后，将FBS包被的试管倒空，用PBS洗涤3次。向该管中加入基本如全文并入作参考的De Kruif et al.(1995a)及其中引用的参考文献所述制备的表达单链Fv片段(scFv)的500μl(大约10¹³cfu)噬菌体展示文库、500μl 4％PBS-FM和2ml 2％PBS-FM。将该管密封，在室温缓慢旋转2小时。随后，将获得的封闭的噬菌体文库(3ml)移至已经用PBS洗涤3次的SARS-CoV制备物包被的管中。加入Tween-20至终浓度为0.05％，使其在室温或在37℃在缓慢转轮上结合2小时。将该管倒空，用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤10次，随后用PBS洗涤10次。加入1ml甘氨酸-HCL(0.05M，pH 2.2)以洗脱结合的噬菌体，将该管缓慢摇动10分钟。为了中和目的，将洗脱的噬菌体加入500μl1M Tris-HCl pH 7.4中。向此混合物中加入5ml指数生长的XL-I蓝细菌培养物。将获得的培养物在37℃不摇动温育30分钟。然后，将细菌铺板于含有氨苄青霉素、四环素和葡萄糖的TYE琼脂平板上。将该平板在37℃过夜温育之后从该平板中刮下集落用于制备富集噬菌体文库，基本如De Kruif et al.(1995a)和WO 02/103012(这两个文献均并入本文作参考)所述进行。简而言之，将刮下的细菌用于接种含有氨苄青霉素、四环素和葡萄糖的2TY培养基，在37℃生长至OD600nm为-0.3。加入CT或VCSM13辅助噬菌体，使其感染所述细菌，之后将培养基更换为含有氨苄青霉素、四环素和卡那霉素的2TY。在30℃持续温育。第二天，通过离心从2TY培养基中除去细菌，之后将获得的上清中的噬菌体使用聚乙二醇6000/NaCl沉淀。最后，将噬菌体溶解于小体积的含有1％BSA的PBS中，过滤灭菌并用于下一轮的选择中。进行2-3次选择/再感染程序。在每一轮选择后，将各个大肠杆菌集落用于制备单克隆噬菌体抗体。基本上是将各个集落生长至对数期，用VCSM13辅助噬菌体感染，之后过夜进行噬菌体抗体生产。在ELISA中测试含有噬菌体抗体的上清与包被于96孔平板的SARS-CoV制备物的结合活性。在上述选择中，获得称作SC03-014的噬菌体抗体。如先前De Kruifet al.(1995a and 1995b)及其中引用的参考文献所述产生噬菌体抗体SC03-014的ScFv(所述文献全文并入作参考)。将scFv的缓冲液调节为1×PBS。

另外，基本如前所述从表达单链Fv片段(scFv)的免疫噬菌体展示文库(这个文库的构建见实施例1所述)中选择抗体片段。为了进行下文所述选择，使用经UV失活的SARS-CoV制备物。如下制备经UV失活的SARS-CoV(Frankfurt 1毒株)。一旦观察到致细胞病变作用(CPE)，就收获用0.1moi(感染复数)SARS-CoV毒株Frankfurt 1感染的Vero细胞的培养基。将细胞在-20℃冷冻及解冻一次。将收获的培养基在3000rpm离心15分钟以除去细胞碎片。收集获得的上清，在3000rpm离心15分钟，移至干净试管中。随后，将超速离心管充填10ml无菌的于PBS中25％v/v甘油。将20ml澄清的上清轻轻置于甘油垫上，将试管在4℃在Beckman SW28转子中以20,000rpm离心2小时。弃去上清，将病毒沉淀再悬浮于1ml TNE缓冲液(10mMTris-HCl pH 7.4、1mM EDTA、200mM NaCl)中，在-80℃贮存。接着，将再悬浮的病毒沉淀在4℃经UV照射15分钟(UV-B照射280-350nm；λmax 306nm)。随后，测试其在细胞培养物中的感染性的丧失。如果确定感染性丧失，则获得的失活的SARS-CoV制备物用于进一步实验。

与上述选择相反，不使用加热失活的胎牛血清包被的Maxisorp^TM管(Nunc)进行预先扣除(pre-subtraction)。向SARS-CoV包被的管中加入500μl(大约10¹³cfu)表达单链Fv片段(scFv)的免疫噬菌体展示文库、1体积的4％PBS-FM和Tween-20，终浓度为0.05％。

为了进行仅一轮选择的免疫噬菌体展示文库选择，在37℃或者在室温在缓慢转轮上进行结合，随后在37℃不搅动温育30分钟。进行如下选择和洗涤：在37℃温育，用含有0.05％Tween-20的PBS(PBST)洗涤5次，及用PBS洗涤5次；在37℃温育，用PBST洗涤10次及用PBS洗涤10次；在室温温育，用PBST洗涤10次及用PBS洗涤10次。如上述洗脱并处理结合的噬菌体。在ELISA中测试衍生自各个集落的噬菌体与包被于96孔平板的SARS-CoV的结合活性。从免疫噬菌体展示文库中选择，获得称作SC03-022的噬菌体抗体。

实施例3：SARS-CoV特异性单链噬菌体抗体的确认

将上述筛选中获得的选择的单链噬菌体抗体在ELISA中确认其特异性，即与如前述制备的经UV失活的SARS-CoV制备物的结合。另外，还测试单链噬菌体抗体与10％FBS的结合。为此，将UV失活的SARS-CoV制备物或10％FBS制备物包被在Maxisorp^TM ELISA平板上。在包被后，将该平板在2％PBS-FM中封闭。将选择的单链噬菌体抗体在等体积的4％PBS-FM中温育以获得封闭的噬菌体抗体。倒空该平板，用PBS洗涤3次，之后加入封闭的噬菌体抗体。温育1小时，将平板在含有0.05％Tween-20的PBS中洗涤，使用与过氧化物酶缀合的抗M13抗体检测结合的噬菌体抗体(使用OD 492nm测定)。作为对照，同时使用无单链噬菌体抗体或者甲状腺球蛋白的对照单链噬菌体抗体(SC02-006)(见De Kruif et al.1995a和1995b)进行所述程序。这两种对照均作为阴性对照。如图1所示，观察到称作SC03-014和SC03-022的选择的噬菌体抗体显著结合于固定的UV失活的SARS-CoV制备物，而没有观察到与FBS的结合。

实施例4：特异于SARS-CoV的scFv的鉴定

根据标准技术从选择的特异性单链噬菌体抗体(scFv)克隆中获得质粒DNA，并确定核苷酸序列。称作SC03-014和SC03-022的scFv的核苷酸序列(包括用于克隆的限制位点)分别示于SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：94。称作SC03-014和SC03-022的scFv的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：95。特异性结合SARS-CoV制备物的scFv的VH和VL基因相同性(见Tomlinson IM，Williams SC，Ignatovitch 0，Corbett SJ，Winter G.V-BASE Sequence Directory.Cambridge United Kingdom：MRC Centre for Protein Engineering(1997))及重链CDR3组成在表11中描述。

实施例5：从选择的抗SARS-CoV单链Fv中构建完全的人免疫球蛋白分子(人单克隆抗SARS-CoV抗体)

将称作SC03-014和SC03-022的scFv的重链和轻链可变区使用寡核苷酸经PCR扩增，以添加分别用于在IgG表达载体pSyn-C03-HCγ1(见SEQ ID No：96)和pSyn-C05-Cκ(见SEQ ID No：97)中表达的限制位点和/或序列。将scFv SC03-014的VL基因使用寡核苷酸5K-Iacctgtctcgagttttccatggctgacatccagat gacccagtctccatcctcc(SEQ ID NO：98)和sy3K-C gctgggggcggccac ggtccgtttgatctccaccttggtccc(SEQ ID NO：99)扩增，并将PCR产物克隆进载体pSyn-C05-Cκ中。将scFv SC03-022的V_L基因使用寡核苷酸5K-Jacctgtctcgagttttccatggctgacatcgtgatgacccagtctccag(SEQ ID NO：100)和sy3K-Fgctgggggcggccacggtccgcttgatctccaccttggtccc(SEQ ID NO：101)扩增，并将PCR产物克隆进载体pSyn-C05-Cκ中。所有构建体的核苷酸序列均根据本领域技术人员已知的标准技术检验。将scFv SC03-014的V_H基因使用寡核苷酸5H-Bacctgtcttgaattctccatggccgaggtgcagctggtggagtctg(SEQ ID NO：102)和sy3H-A gcccttggtgctagcgctggagacggtcaccagggtgccctggcccc(SEQ IDNO：103)扩增。将scFv SC03-022的V_H基因使用寡核苷酸5H-Hacctgtcttgaattctccatggccgaggtgcag ctggtgcagtctgg(SEQ ID NO：104)和sy3H-C gcccttggtgctagcgct ggagacggtcacggtggtgccctggcccc (SEQ ID NO：105)扩增。之后，将PCR产物克隆进载体pSyn-C03-HC γ1中，核苷酸序列根据本领域技术人员已知的标准技术检验。

将编码抗SARS-CoV人IgG1重链的所得表达构建体pgG103-014C03和pgG103-022C03分别组合pSyn-C05-VkI(V_LSC03-014)和pgG103-022C05(V_L SC03-022)在HEK293T或PER.C6^细胞中瞬时表达，获得含有IgG1抗体的上清。称作CR03-014和CR03-022的抗体重链的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：106和SEQID NO：108。抗体CR03-014和CR03-022的重链的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：109。

抗体CR03-014和CR03-022的轻链的核苷酸序列分别示于SEQID NO：110和SEQ ID NO：112。抗体CR03-014和CR03-022的轻链的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：111和SEQ ID NO：113。随后，使用通常用于免疫球蛋白的标准纯化方法经过蛋白A柱和大小排阻柱纯化重组的人单克隆抗体(见例如并入本文作参考的WO 00/63403所述)。

实施例6：重组人抗SARS-CoV抗体的SARS-CoV中和活性筛选分析

在Vero细胞(ATCC CCL 81)上进行SARS-CoV中和分析。该中和分析中使用的SARS-CoV毒株是Frankfurt 1毒株(这个毒株的完整基因组见EMBL数据库登记号#AY291315所示)(Rickerts et al.2003)。使用效价为4×10³TCID₅₀/ml(50％组织培养物感染剂量/ml)的毒株病毒原种，效价根据本领域技术人员已知的Spearman和Kaerber方法计算。如上所述产生的重组人抗SARS-CoV抗体通过在PBS中从1∶4开始对未稀释的材料(2.5mg/ml)进行系列2倍稀释(稀释范围1∶4-1∶512)而筛选。在筛选分析中中和效价≥1∶4认为是SARS-CoV抗体反应性的特定指征。SARS康复期患者血清用作中和分析的阳性对照。

通常地，所述中和分析如下进行。将25μl各个抗体稀释液与25μl病毒悬浮液(＝大约100 TCID₅₀/25μl)混和，在37℃温育1小时。然后将该悬浮液一式三份用移液管移至96孔平板中。接着，加入再悬浮于含有10％w/v FCS和抗生素的DMEM中的50μl新鲜的Vero细胞经胰蛋白酶化及均质的悬浮液(将T75培养瓶的铺满细胞单层1∶3划开)。接种的细胞在37℃培养3-4天，每天观察致细胞病变作用(CPE)的发展。将CPE与阳性对照物(病毒接种的细胞)和阴性对照物(模拟接种的细胞)对比。各个细胞培养物中完全不存在CPE定义为保护(＝100％效价降低)。在66％的孔中产生保护的最高抗体/血清稀释度定义为中和抗体效价。一式三份将该实验进行3次(见表12A、B和C)。测试IgG CR03-014、CR03-022、阴性对照IgG1和来自SARS患者的阳性对照血清的SARS-CoV中和活性。从表12A、B和C中显然可见IgG CR03-014和CR03-022展示明显的中和活性。在上述分析中CR03-014 IgG中和Frankfurt 1毒株效价为128(n＝1)或256(n＝2)。CR03-022 IgG中和Frankfurt 1毒株效价为32(n＝1)或64(n＝2)。这些效价相应于组织培养孔中最终抗体中和浓度，对于CR03-014为2.4μg/ml(n＝2)和4.9μg/ml(n＝1)，对于CR03-022为9.8μg/ml(n＝2)和19.5μg/ml(n＝1)。根据这些浓度，这两种中和抗体均可适于预防和/或治疗SARS-CoV感染所致病症。

另外，使用不同的SARS-CoV毒株评价抗SARS-CoV抗体的保护作用的强度和范围。将SARS-CoV毒株HKU-36、HKU-39849、HKU-66、HKU-61567、GZ43和GZ50在FRhK-4细胞上传代两或三代，之后进行测试(见表13)。将毒株HKU-61644在Vero细胞上传代，在传代1和15代后测试。如下对FRhK-4细胞进行SARS-CoV中和分析。在维持培养基(MM，补加了1％w/v FCS的MEM)中制备500μl抗体原种溶液(100μg/ml)。从这个原种溶液中制备2倍系列稀释液。将220μl原种溶液(100μg/ml)一式两份加入96孔平板中，从中取110μl与110μl MM在9个连续孔中的每一个孔中混和。弃去第10个孔的110μl。这样获得含有110μl 0.2-100μg/ml抗体的10个孔。将110μl抗体稀释液与110μl不同的2000 TCID₅₀/ml浓度的SARS-CoV分离株混和，根据本领域技术人员已知的Reed和Muench方法计算效价。在这个阶段，抗体浓度在存在1000 TCID₅₀/ml SARS-CoV条件下在220μl体积中在0.1-50μg/ml之间变化。将含有抗体/病毒混合物的96孔平板在37℃预温育1-2小时。向含有在100μl MM中铺满的FRhK-4细胞的第二个96孔组织培养平板的孔中一式四份加入100μl抗体/病毒混合物，在37℃温育。在这个最后的温育步骤期间，在抗体浓度在0.05-25μg/ml之间变化的条件下存在100 TCID₅₀的SARS-CoV。将细胞在37℃培养，在第72和96小时观察CPE的产生。将CPE与阳性对照物(SARS-CoV接种的细胞)和阴性对照物(仅与MM温育的细胞)对比。抗体中和效价确定为提供一式四份细胞培养物的100％保护的抗体浓度。单克隆抗SARS-CoV抗体CR03-014在12.5μg/ml浓度100 TCID₅₀完全中和所有测试的SARS-CoV分离株(见表13)。这个结果表明抗体CR03-014能中和各种SARS-CoV分离株。

在另外的实验中，如前针对Frankfurt 1毒株所述进行SARS-CoV中和分析，以确定SARS-CoV中和抗体CR03-014和CR03-022之间的协同性。将大约相似潜能的抗体CR03-014和CR03-022的原种溶液以不同比率混和。为了均衡与CR03-022相比CR03-014的估计高4倍的潜能，将2.5mg/ml的CR03-014抗体原种溶液稀释4倍为625μg/ml。随后，将抗体CR03-014和CR03-022以如下比率混和(混合物A：CR03-014 0％，CR03-022 100％；混合物B：CR03-014 10％，CR03-022 90％；混合物C：CR03-014 50％，CR03-022 50％；混合物D：CR03-014 90％，CR03-022 10％；混合物E：CR03-014 100％，CR03-022 0％)。当混合物中抗体具有加和作用时，所述混合物应以与混合物中存在的各个抗体相同的效价中和SARS-CoV。当混合物中抗体具有协同作用时，所述混合物应以高于混合物中存在的各个抗体的效价中和SARS-CoV。在一式三份孔中如上述进行两次中和分析。组合这两次分析的结果。保护至少66％的孔(6个测试孔的4个孔)定义为中和抗体效价。各个混合物的中和效价示于表14。从表14中可以推断所述混合物具有如下效价：混合物A，64；混合物B，256；混合物C，＞1024；混合物D，256；混合物E，16。从这个结果可以推断当组合测试这两种抗体时(混合物B-D)，中和效价高于抗体CR03-014和CR03-022单独效价。总之，这些数据表明抗体CR03-014和CR03-022呈现协同SARS-CoV中和活性。

在另一个实施方案中，如下对FRhK-4细胞(ATCC CRL-1688)进行SARS-CoV中和分析，示出抗SARS-CoV抗体之间的协同性。使用效价为2×10³TCID₅₀/ml的称作HK-39849(GenBank登记号AY278491)的SARS-CoV毒株，效价根据本领域技术人员已知的Reed和Muench方法计算。通过在维持培养基(MM)(1％w/v FCS于具有抗生素的MEM中)中从200μg/ml浓度开始经1.46倍系列稀释(稀释范围200-6.7μg/ml)一式两份筛选人抗SARS-CoV抗体。测试4种不同组合物：单独的抗体CR03-014、单独的抗体CR03-022、对照IgG1抗体、及抗体CR03-014和CR03-022组合(每种抗体的起始浓度为200μg/ml)。将110μl病毒悬浮液与110μl各个重组人抗SARS-CoV抗体稀释液混和，在37℃温育1小时。然后将100μl这种悬浮液一式两份经移液管移至含有于100μl MM中的80％铺满单层的FRhK-4细胞的96孔平板中。将FRhK-4细胞在37℃培养，在3-4天后观察CPE发展。将CPE与阳性对照物(病毒接种的细胞)和阴性对照物(模拟接种的细胞或者仅与重组抗体温育的细胞)对比。在各个细胞培养物中完全不存在CPE定义为保护(＝100％效价降低)。如前述使用组合指数(combination index，CI)概念量化协同作用(Chou and Talalay，1984)。根据产生加和作用的物质组合的概念，其在混合物中的浓度(cmixt)与具有与混合物相同作用的单独物质的浓度(ceffect)的比率总和是1。这个总和是CI。当这个总和低于1时，所述制剂协同作用。对于两种成分的系统，如在本发明中，如下计算CI：

C1mixt是混合物中第一种成分导致一定水平抑制作用(f)的浓度，c1effect是第一种成分单独(在无第二种成分的条件下)引起与两种成分的混合物相同的抑制作用的浓度，c2mixt和c2effect是第二种成分的相应浓度。

为了确定抗体CR03-014和CR03-022的CI，如上述进行中和分析。CR03-014在7.6μg/ml、CR03-022在50.0μg/ml、每一种抗体组合加入时在2.4μg/ml达到对毒株HKU39849的100 TCID₅₀的完全中和。这个结果导致CI为2.4/7.6+2.4/50.0＝0.36。CR03-014在5.9μg/ml、CR03-022在30.2μg/ml及每一种抗体组合加入时在1.7μg/ml达到50％中和。这个结果导致CI为1.7/5.9+1.7/30.2＝0.34。因此，CR03-014和CR03-022混合物获得的50和100％中和CI数值均低于1，这表明这两种抗体在对抗SARS-CoV中协同作用。

实施例7：抗SARS抗体与SARS-CoV、SARS-CoV刺突蛋白及其片段的结合

如下进行检测抗SARS抗体与SARS-CoV结合的ELISA。将ELISA平板的孔用于50mM碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中经UV失活的SARS-CoV制备物包被过夜。将该平板的孔用含有0.05％Tween的PBS洗涤3次，在37℃用含有1％BSA的PBS封闭2小时。接着，将在含有1％BSA的PBS中稀释的抗体在室温温育1小时。将孔用含有0.05％Tween的PBS洗涤3次，使用鼠抗Hu-IgG HRP缀合物在室温温育1小时。用O-苯二胺底物进行显影，通过加入1 M H₂SCM终止反应，在492nm测定吸光度。如图2所示，抗体CR03-014和CR03-022在ELISA中均能结合失活的SARS-CoV制备物，与针对无关抗原的阴性对照IgG相反。

为了检测抗体CR03-014和CR03-022的靶位，使用另一种结合分析。分析单链噬菌体抗体SC03-014和SC03-022结合重组表达SARS-CoV的蛋白质的HEK293T细胞的能力。为此，将HEK293T细胞用具有编码SARS-CoV毒株Frankfurt 1的刺突(S)蛋白的cDNA序列的质粒或者对照载体转染。为了进行流式细胞计量术，首先将单链噬菌体抗体在4℃在等体积的4％PBS-M中封闭15分钟，之后用于转染的HEK293T细胞染色。将封闭的噬菌体抗体加入模拟转染的HEK293T细胞及用SARS-CoV的S蛋白转染的HEK293T细胞中。所述单链噬菌体抗体与细胞的结合通过使用生物素酰化的抗-M13抗体(Santa Cruz Biotechnology)及随后的链霉抗生物素-藻红蛋白(Caltag)观察。如图3所示，单链噬菌体抗体SC03-014和SC03-022能结合刺突蛋白基因(刺突)转染的HEK293T细胞，而模拟转染的HEK293T细胞未观察到结合。对照单链噬菌体抗体既不识别刺突蛋白基因转染的HEK293T细胞，也不识别模拟转染的HEK293T细胞。这些数据提示这两种抗体均是SARS-CoV的S蛋白的抗体。

为了进一步确定S蛋白内所述抗体的结合位点的位置，进行分析，其中分析所述抗体结合SARS-CoV的S蛋白的一部分(portion)的能力。S蛋白的核苷酸和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：115。编码N末端565个氨基酸的DNA(称作S565的部分)作为KpnI-BamAI片段在pAdapt(Havenga et al.，2001)中克隆，所述pAdapt通过插入称作pcDNA3.1/myc-His C(Invitrogen)载体的多接头而修饰(称作pAdapt/myc-His C)。相应于S蛋白氨基酸残基318-510的片段(称作S318-510的部分)在S基因cDNA上使用如下寡核苷酸引物扩增：EcoRIspikeFor318 5′-cctggaattctccatggccaacatcaccaacc-3′(SEQ ID NO：116)和XfoaIspikeRev5105′-gaagggccctctagacacggtggcagg-3′(SEQ ID NO：117)。将所得片段用EcoRl-Xbal消化，克隆进pHAVT20/myc His A中产生pHAVT20/myc-His A S318-510。在这个载体中，与HAVT20前导序列融合的片段S318-510的表达在人全长立即早期CMV启动子的控制下。使用标准技术在HEK293T细胞中进行DNA转染以瞬时表达。直接使用来自培养物上清的S蛋白衍生的片段，或者使用Ni-NTA(Qiagen)从培养物上清中纯化所述片段。如下进行评估抗体与S蛋白衍生的片段结合的ELISA。将ELISA平板的孔用于50mM碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中的5μg/ml抗-myc抗体包被过夜。将该平板的孔用含有0.05％Tween的PBS洗涤3次，在37℃用含有1％BSA的PBS封闭2小时。将用抗myc抗体包被的孔与在含有1％BSA的PBS中稀释的myc标记的片段S565或S318-510在室温温育1小时。将孔用含有0.05％Tween的PBS洗涤3次。接着，将在含有1％BSA的PBS中稀释的抗体CR03-014、CR03-022或对照抗体在室温温育1小时。如前述检测结合的抗体。如图4所示，抗体CR03-014和CR03-022均能结合S565和S318-510片段，但不结合无关的对照myc标记的抗原。对照抗体不结合任何片段。

为了将抗体与S565片段的结合亲和性分等，对IgG浓度进行滴定(将所述抗体在含有1％ELK的PBS中稀释)，随后进行如上述ELISA。单克隆抗体滴定示出CR03-014和CR03-022结合S565的亲和性相似(见图5)。为了研究可能由于协同机制而发生的亲和性改变，利用BIAcore分析研究CR03-014和CR03-022相继或同时与重组受体结合结构域片段S318-510结合的K_D。在BIAcore3000^TM上在25℃进行表面等离振子共振分析。CM5传感器芯片和运行缓冲液HBS-EP来自Biacore AB(Uppsala Sweden)。将重组S318-510片段使用胺偶联程序固定在CM5芯片上，产生大约1,000共振单位(RU)的应答水平。进行动力学分析以确定单克隆抗体的结合率(k_a)、解离率(k_d)常数及亲和性(K_D)。因此，使用两倍稀释法在HBS-EP中制备0.4-250 nM系列浓度的IgG。将样品一式两份以30μl/分钟流速注入(注入时间＝2分钟，解离时间＝5分钟)。将传感器芯片表面用5μl 5nM NaOH脉冲再生。使用Biacore评估软件(BIAevalution，July 2001)拟合所有注入浓度的结合和解离曲线。确定CR03-014和CR03-022的K_D分别为16.3nM和0.125nM，同时结合的抗体的K_D为5.71nM，CR03-014与CR03-022饱和的S318-510的结合K_D为14.8nM。与对于CR03-014和CR03-022的剂量降低指数分别为3和20相比，单克隆抗体的同时或相继结合均不改变K_D，这可以解释其通过合作结合进行的协同中和作用。

为了进一步探究S蛋白中的抗体结合位点，对固定的S318-510片段进行竞争性ELISA。将捕获的S318-510与非饱和量的生物素酰化的抗体在无竞争抗体或存在1、5和25μg/ml竞争抗体(抗体CR03-014、CR03-022或对照抗体)的条件下温育。结合的生物素酰化的抗体用链霉抗生物素缀合的HRP(BD Pharmingen)检测，如上述进行显影。图6A示出单克隆抗体CR03-014的结合在存在过量的未标记的单克隆抗体对照物或抗体CR03-022的条件下不受影响。图6B示出抗体CR03-022的结合在存在过量的未标记的单克隆抗体对照物或抗体CR03-014的条件下不受影响。正如所期望的，这两种生物素酰化的CR03-014和CR03-022的结合被其未标记的对应物有效地降低(见图6A和B)。这些结果表明抗体CR03-014和CR03-022不彼此竞争与S3 18-510片段的结合，识别不同/独特的非竞争性表位。

为了证实这些发现，进行抗体夹心ELISA。用于50mM碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中5μg/ml抗体CR03-014和CR03-022将微滴定平板孔包被过夜。如前述进行S318-510片段的捕获、生物素酰化的抗体的结合及随后ELISA反应显影。图7示出CR03-014捕获的S318-510可以由生物素酰化的CR03-022结合，但是不结合CR03-014。CR03-022捕获的S318-510仅可以由生物素酰化的CR03-014结合，但是不结合CR03-022。这个结果表明CR03-014和CR03-022均能同时结合S蛋白衍生的片段S318-510中不同的表位，进一步表明这两种抗体均结合不同的非竞争的表位。

实施例8：单克隆抗SARS-CoV抗体与变体S318-510片段的结合的构建和评估

如下确定S蛋白的318-510区域中的多样性。编辑了含有编码完整人SARS-CoV或其片段的多于146个基因组或基因的列表。在114个案例中，鉴别了编码全长刺突(S)蛋白的开放读框。对刺突氨基酸残基318-510的排列对比揭示了30种刺突蛋白，其中318-510区域与Frankfurt 1毒株的刺突蛋白的相应区域(见Genbank登记号AY291315)不同，其在本文用作野生型。突变、毒株和Genbank编号示于表15。为了研究CR03-014和CR03-022是否结合目前所有已知的人SARS-CoV分离株的S蛋白，产生具有不同氨基酸取代的8种重组刺突318-510片段(变体A-F及变体H和I)，如表15所示。另外，产生相应于4种动物SARS样CoV的序列(Genbank登记号AY304486-AY304489；也见于表1，分别为SARS-CoV SZ3、SZ13、SZ16和SZ1)的318-510片段(变体G)。分离自狸和狸猫的这4种SARS样CoV含有氨基酸取代K344R、F360S、N479K和T487S(见Guan etal.2003所述)。为此，使用Stratagene′s QuikChange II定向诱变试剂盒根据厂商指导，将上述取代导入pHAVT20/myc-His A S318-510载体中。在一个序列含有多个氨基酸取代的情况中，对每个单一取代重复进行诱变、序列分析和确认过程。为了排除在质粒中导入感兴趣的基因之外的突变，将突变的(592 bp EcoRI-XbaI)片段再克隆进EcoRI-XbaI切割的pHAVT20/myc-His A中。将所得质粒转染进HEK293T细胞中，CR03-014和CR03-022的结合通过如前述ELISA评估。如图8所示，CR03-014能结合变体A-E和变体H和I的程度与结合野生型片段程度相似。CR03-014与变体F(N479S取代)的结合显著低于与其它片段的结合。未观察到CR03-014与片段G(K344R、F360S、N479K和T487S取代)的结合。抗体CR03-022能结合所有变体S318-510片段，结合程度与结合野生型(未突变的)S318-510片段程度相似。总之，这个结果表明残基N479直接或间接参与CR03-014的结合，是CR03-014结合位点的一部分或者对于S蛋白中CR03-014结合位点的正确构象非常重要。因为抗体CR03-022能结合由所有人SARS-CoV分离株的氨基酸残基318-510组成的重组片段(如表15所述)及另外也能结合动物SARS样CoV，因此CR03-022一般适于治疗和/或预防SARS-CoV分离株。

特别适于治疗和/或预防人SARS-CoV分离株的是CR03-014和CR03-022这两种抗体的组合，因为这两种抗体均能特异性结合人SARS-CoV，在中和人SARS-CoV中起协同作用。换句话说，CR03-014和CR03-022的组合物包含协同的人SARS-CoV中和活性。这种组合的其它优势是其能中和人SARS-CoV以及动物SARS样CoV的能力。实施例9：SARS-CoV的CR03-014和CR03-022逃逸(escape)病毒的产生

为了进一步阐明由人单克隆抗体CR03-014和CR03-022识别的表位，产生CR03-014和CR03-022的逃逸病毒。产生CR03-014的逃逸病毒的方法在下文描述。产生CR03-022的逃逸病毒的方法与前者相同，除了在所有相应步骤中使用60μg/ml抗体而不是20μg/ml抗体之外。将SARS-CoV毒株HKU 39849的系列稀释物(0.5ml)(稀释范围10^-1至10^-8)与恒定量的(20μg/ml，导致TCID₅₀/ml～3 log降低)抗体CR03-014(0.5ml)在37℃/5％CO₂条件下温育1小时，之后加入含有FRhK-4细胞的孔中。在37℃/5％CO₂条件下使病毒与细胞附着1小时，然后除去病毒并将细胞用培养基洗涤两次。最后，将细胞在存在20μg/ml选择抗体CR03-014的条件下在0.5ml培养基中温育2天。然后，收获这样的孔中的含有潜在逃逸病毒的培养基，所述孔具有示出CPE(致细胞病变作用)的最高病毒稀释度，在4℃贮存直至进一步使用。随后，将病毒样品冷冻/解冻一次，在培养基中制备系列稀释物。将病毒稀释物加入含有FRhK-4细胞的孔中，在存在20μg/ml的CR03-014条件下在37℃/5％CO₂温育1-2小时。然后用含有20μg/ml的CR03-014的琼脂糖覆盖孔，在37℃/5％CO₂温育3-5天。使用Pasteur移液管挑取各个逃逸病毒噬斑，冷冻/解冻一次，将逃逸病毒在FRhK-4细胞上扩增。为了分析所述逃逸病毒，进行如下实验。

首先，为了鉴别每个逃逸病毒的SARS-CoV刺突蛋白的可能的突变，确定SARS-CoV刺突开放读框(ORF)的核苷酸序列。分离每个逃逸病毒和野生型SARS-CoV病毒的病毒RNA，通过标准RT-PCR转变为cDNA。随后，将该cDNA用于SARS-CoV刺突ORF的核苷酸测序，以鉴别突变。图9示出了对获得的5个E014逃逸病毒进行测序的数据。所有逃逸病毒在第1385位均具有一个核苷酸突变(C突变为T)，这样导致在刺突蛋白中第462位氨基酸P突变为L。显然，P462L导致表位识别的丧失，随后丧失CR03-014对SARS-CoV的中和。这个结果表明除了第479位氨基酸，第462位氨基酸也参与CR03-014与SARS-CoV的S蛋白的结合。对获得的5个E022逃逸病毒测序的数据如下。其中4个逃逸病毒在第2588位具有一个核苷酸突变(C突变为T)，这样导致在刺突蛋白中第863位的氨基酸T突变为I。

其次，对每个E014和E022逃逸病毒确定中和指数(NI)。如果中和指数小于2.5log，则认为该病毒是逃逸病毒变体。确定NI的方法是针对下文E014逃逸病毒提供的。针对E022逃逸病毒的方法与前者相同，除了在所有相应步骤中均使用60μg/ml而不是20μg/ml单克隆抗体之外。从在仅用病毒感染的FRhK-4细胞培养物中产生的感染性病毒颗粒数(TCID₅₀/ml)中减去用病毒加上单克隆抗体(20μg/ml)感染的FRhK-4细胞培养物中产生的感染性病毒颗粒数(TCID₅₀/ml)确定中和指数(在无单克隆抗体条件下log TCID₅₀/ml病毒减去存在单克隆抗体条件下log TCID₅₀/ml病毒)。指数低于2.5log认为是逃逸的证据。因此，将每种逃逸病毒与野生型SARS-CoV(100 TCID₅₀)在37℃/5％CO₂条件下与20μg/ml的CR03-014温育1小时，之后加入FRhK-4细胞中。在37℃/5％CO₂条件下使病毒与细胞附着1小时，之后除去接种体，将细胞用培养基洗涤两次，之后补充含有20μg/ml的CR03-014的培养基。在37℃/5％CO₂条件下温育2天后，收获培养基，确定每个病毒的TCID₅₀/ml。如表16所示，用于确定NI的抗体浓度当对野生型SARS-CoV病毒进行处理时导致病毒效价降低～3log。因此，野生型SARS-CoV被CR03-014中和，根据NI为3.3而判断。相反，对于每种逃逸病毒NI＜2.5，因此所述每种逃逸病毒不再被CR03-014中和。根据NI为3.3判断，野生型SARS-CoV病毒也被CR03-022中和(见表17所示)。每种E022逃逸病毒的NI＞2.5，因此推断所述每种逃逸病毒仍被CR03-022中和。所述5个E022逃逸病毒中有4个病毒的氨基酸取代在CR03-022对SARS-CoV的中和中明显不起作用。在实验进程中其可能被非特异性诱导。这个结果与Poon et al.(2005)的发现一致，其观察到当SARS-CoV在FRhK-4细胞中多次传代时在第863位的突变(T突变为I)。CR03-022的中和表位不能通过产生逃逸病毒的方式确定。这可能是S蛋白上结合区的功能限制所致。在这个区域中发生的突变对病毒稳定性不利，因此在上述实验中未分离。

为了证实抗体CR03-014与逃逸变体无结合，基本如上述构建在第462位P突变为L的重组S318-510片段。在HEK293T细胞中对所得质粒进行DNA转染以瞬时表达，直接使用来自培养物上清的片段。如前述进行ELISA。简而言之，将所述片段在抗myc包被的微滴定平板孔上捕获。随后，加入抗体CR03-014和CR03-022，使用抗人IgG HRP缀合物检测抗体的结合。如图10所示，抗体CR03-014不能结合在第462位P被L取代的S318-510片段。CR03-022的结合不受这种氨基酸取代的影响。这进一步表明抗体CR03-022能结合S蛋白上不同的/独特的非竞争性表位，提示CR03-022可用于补偿CR03-014对SARS-CoV变体的潜在中和缺失。

另外，对E14逃逸病毒进行交叉中和分析。表18明确示出CR03-022中和E14逃逸病毒至与野生型病毒相似水平，进一步例证了CR03-022结合与CR03-014相比不同的表位，其不再中和E14逃逸病毒。这个结果与图10所示ELISA数据一致。不能进行相反实验，因为不能产生CR03-022的逃逸病毒。从上述结果可以推断CR03-014和CR03-022的组合阻止中和抗性SARS-CoV变体的逃逸，因此是预防和治疗SARS-CoV的理想的免疫球蛋白制备物。

实施例10：通过人抗SARS单克隆抗体CR03-014评估人巨噬细胞中SARS-CoV感染的潜在增强

已知在由冠状病毒所致的某些疾病中，天然免疫(prior immunity)或被动抗体增加了疾病的严重性。在猫科动物感染性腹膜炎中，巨噬细胞是病毒复制的主要靶细胞，抗病毒抗体增强该病毒在体外巨噬细胞培养物中的复制。巨噬细胞也是在死于SARS-CoV的患者肺部细胞浸润中见到的主要细胞(Nicholls et al.2003)。由此关注的是抗体依赖性增强(ADE)是否与SARS-CoV的发病机理相关。为了研究这个问题，测试了在存在如下抗体条件下当用SARS-CoV感染巨噬细胞时ADE是否发生：中和性抗SARS-CoV单克隆抗体CR03-014、非中和性抗SARS-CoV单克隆抗体CR-03-015、单克隆抗体CR-JA(抗狂犬病单克隆抗体，在此用作对照抗体)、暴露于SARS-CoV的康复期个体的血清及健康个体的血清。

人周围血单核细胞(PBMC)得自健康血液供体的富含白细胞的淡黄色上层(The Hong Kong Red Cross Blood Transfusion Service，HongKong)。PBMC通过Ficoll-Paque梯度离心分离(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。为了分离单核细胞，使2×10⁷PBMC附着在皮氏培养皿(Greiner，Frickenhausen，Germany)中补加了20mM HEPES、2mM谷氨酰胺、0.6μg/ml青霉素和60μg/ml链霉素及5％热失活的自体同源血浆的RPMI 1640培养基中1小时。在用培养基洗涤后，用移液管分离附着的单核细胞，以2×10⁵细胞/孔的密度重新接种在24孔平板补充的RPMI 1640培养基中。

为了检测单核细胞制备物的纯度，也接种单核细胞并使其附着于玻璃盖玻片上。所述玻璃盖玻片上单核细胞的纯度通过用CD14 R-藻红蛋白(R-PE)-缀合的小鼠抗人单克隆抗体(BD Biosciences，SanDiego，U.S.A.)染色而证实。

每2-3天置换一次单核细胞培养物的培养基，使细胞在体外分化14天。单核细胞分化为巨噬细胞通过巨噬细胞的典型形态学证实。获得的人单核细胞衍生的初级巨噬细胞用于进一步的实验。在进行ADE实验前两天，将补充的RPMI 1640培养基置换为巨噬细胞无血清培养基(Macrophage Serum Free medium，SFM)(Invitrogen，Carlsbad，CA，U.S.A.)。

为了研究亚中和剂量抗体对巨噬细胞中病毒感染的作用，将300μl于MM培养基(包括1％FCS和0.6μg/ml青霉素及60μg/ml链霉素的MEM)中系列10倍稀释的单克隆抗体CR03-014、CR03-015和CR-JA、SARS-CoV康复期个体血清及健康个体血清与300μl的SARS-CoV混和。与SARS-CoV混和的MM培养基作为病毒对照物。将病毒/单克隆抗体混合物及病毒/血清混合物在37℃温育1小时。然后，将250μl混合物一式两份加入含有巨噬细胞的孔中。在37℃病毒吸附1小时后，除去病毒接种体，将感染的细胞用巨噬细胞SFM培养基洗涤，在补加了0.6μg/ml青霉素和60μg/ml链霉素的巨噬细胞SFM培养基中温育。在感染后第0、1、2、3、5和7天收集培养物上清样品，在-70℃贮存以进行病毒滴定实验。基本如上述滴定SARS-CoV及确定TCID₅₀。

为了检测巨噬细胞内的病毒(由于失败的感染所致)及检测巨噬细胞内SARS-CoV RNA的潜在转录，在感染后第3、6和24小时从感染的巨噬细胞中分离RNA，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)根据厂商指导进行。使用Superscript II逆转录酶(Invitrogen)根据厂商指导用寡-dT引物进行逆转录。用10μl的RNA产生互补DNA，通过200U的Superscript II逆转录酶(Invitrogen)在含有25 ng寡-dTi2-i8引物、10mM二硫苏糖醇及0.5mM三磷酸脱氧核苷酸的20μl反应物中进行逆转录。将反应物在42℃温育50分钟，随后进行加热失活步骤(72℃，15分钟)。通过加入180μl缓冲液AE(Qiagen)将反应混合物稀释10倍，在-20℃贮存。

实时定量PCR使用FastStart DNA Master SYBR Green I荧光反应(Roche)进行。将5μl稀释的互补NDA在含有4mM MgCl₂、0.5mM正向引物(Actin-LF：CCCAAGGCCAACCGCGAGAAGAT(SEQ IDNO：122))和0.5mM反向引物(Actin-LR：GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG(SEQ ID NO：123))的20μl反应物中扩增。使用如下条件在LightCycler(Roche)中进行反应：95℃10分钟，随后进行40次95℃0秒、66℃5秒和72℃9秒循环。含有靶序列的质粒用作阳性对照。在每个循环中延伸步骤结束时(87℃)捕获这些反应的荧光信号。为了确定该分析的特异性，将PCR产物在分析结束时进行解链曲线分析(65-95℃；2℃/秒)。通过Superscript II逆转录酶(Invitrogen)根据厂商指导使用SARS-CoV的聚合酶基因的有义(负链检测)或反义(正链检测)引物实现逆转录。使用5μL的RNA产生互补DNA，通过200 U的Superscript II逆转录酶(Invitrogen)于含有0.1μM基因特异性引物、10mM二硫苏糖醇和0.5mM三磷酸脱氧核苷酸的20μl反应物中进行逆转录。将反应物在42℃温育50分钟，随后进行加热失活步骤(72℃，15分钟)。将反应物通过加入180μL缓冲液AE(Qiagen)稀释10倍，在-20℃贮存。将2μl稀释的互补DNA在含有3.5mM  MgCl₂、0.25μM正向引物(coro3：5′-TACACACCTCAGCGTTG-3′(SEQ ID NO：124))和0.25μM反向引物(coro4：5′-CACGAACGTGACGAAT-3′(SEQ ID NO：125))的20μl反应物中扩增。使用如下条件在LightCycler(Roche)中进行反应：95℃10分钟，随后进行50次95℃10秒、60℃5秒及72℃9秒循环。含有靶序列的质粒用作阳性对照。在每次循环中延伸步骤结束时捕获这些反应的荧光信号。为了确定该分析的特异性，将PCR产物在该分析结束时进行解链曲线分析(65-95℃；0.1℃/秒)。将病毒RNA的数据针对β-肌动蛋白管家基因的RNA水平标准化。

在用SARS-CoV感染巨噬细胞后，每天在显微镜下监测所述细胞。在用SARS-CoV感染10天后，未检测到可检测的致细胞病变作用，也未检测到巨噬细胞的失败感染转变为生产性感染(productiveinfection)。在巨噬细胞感染之前将SARS-CoV与不同浓度的单克隆抗体CR03-014、CR03-015、CR-JA、康复期个体血清或健康个体血清预温育未改变这个结果。

在感染后第0、1、2、3、5和7天从感染的巨噬细胞培养物中获取的上清等份在FRhk-4细胞上的滴定未揭示任何证据表明测试的单克隆抗体和血清显著增强SARS-CoV在巨噬细胞中的复制(数据未示出)。

另外，在分子水平测定抗体对SARS-CoV对巨噬细胞(失败的)感染及巨噬细胞中SARS-CoV基因转录的作用。为此，如前述在不同时间点从感染的巨噬细胞中提取总RNA。随后，使用实时RT-PCR分析总RNA的SARS-CoV病毒正链RNA和病毒负链RNA转录物。将SARS-CoV RNA水平针对β-肌动蛋白mRNA水平标准化。结果示出正链SARS-CoV RNA在与SARS-CoV温育的所有巨噬细胞培养物中均检测到，证实SARS-CoV对巨噬细胞失败的感染。在存在抗SARS-CoV单克隆抗体CR03-014或CR03-015或康复期个体血清的条件下经SARS-CoV感染的巨噬细胞培养物中观察到的正链RNA水平未显著高于在存在对照单克隆抗体CR-JA或健康个体血清或者无单克隆抗体或血清的条件下SARS-CoV感染的巨噬细胞培养物中的相应水平(数据未示出)。另外，测定负链RNA的存在情况，其是在SARS-CoV感染巨噬细胞后SARS-CoV基因转录活性的指征。再一次未观察到负链RNA与抗SARS-CoV抗体的存在与否之间的相关性(数据未示出)。

总之，分析巨噬细胞内感染性病毒产生和病毒相关的RNA水平的实验示出在经抗-SARS-CoV单克隆抗体CR03-014和CR03-015和SARS患者康复期血清中存在的抗-SARS-CoV抗体处理的人巨噬细胞中SARS-CoV复制无抗体依赖性增强。

实施例11：通过PEPSCAN-ELISA鉴别由重组人抗SARS-CoV抗体识别的表位

从SARS-CoV蛋白质中合成15-mer线性和环状肽，使用先前所述的信用卡形式小型PEPSCAN卡(455个肽形式/卡)(参见WO84/03564、WO 93/09872、Slootstra et al.1996所述)筛选。所有肽均在氨基末端乙酰化。简而言之，产生SARS-CoV Urbani的刺突蛋白的线性或环状形式的系列重叠肽(EMBL数据库中表面刺突糖蛋白的蛋白质id是AAP13441)，通过PEPSCAN分析测试其与本发明的重组人抗SARS-CoV抗体的结合。

由于上述Urbani刺突蛋白在其它SARS-CoV毒株中也发现其相同或高度同源形式，因此在所述分析方法中发现的抗原性肽不仅可用于检测SARS-CoV毒株Urbani及预防和/或治疗SARS-CoV毒株Urbani所致疾病，而且也可用于一般性检测SARS-CoV及预防和/或治疗一般性的SARS-CoV所致疾病。EMBL数据库中SARS-CoV毒株T0R2、Frankfurt 1和HSR 1的表面刺突糖蛋白的蛋白质id是AAP41037、AAP33697和AAP72986。毒株T0R2、Frankfurt 1和HSR1的完整基因组的EMBL数据库登记号分别为AY274119、AY291315和AY323977。在这些登记号下可以发现这些毒株的其它(潜在)蛋白质的氨基酸序列。

在所有环状肽中，第2位和第14位的氨基酸被置换为半胱氨酸(乙酰-XCXXXXXXXXXXXCX-缩微字符卡)。如果在制备的肽中存在除了第2位和第14位半胱氨酸之外的其它半胱氨酸，则所述其它半胱氨酸由丙氨酸置换。使用标准的Fmoc-化学方法合成所述环状肽及使用三氟酸清除剂去保护。随后，将去保护的肽在所述卡上与于碳酸氢铵(20mM，pH 7.9/acetonitril(1∶1(v/v))中1，3-二(溴甲基)苯的0.5mM溶液反应。将所述卡在所述溶液中轻轻摇动30-60分钟，完全覆盖在溶液中。最后，将该卡用过量的水彻底洗涤，在70℃在含有于PBS(pH 7.2)中的1％SDS/0.1％β-巯基乙醇的破坏缓冲液中超声30分钟，随后在水中超声45分钟。

在基于PEPSCAN的酶联免疫吸附测定(ELISA)中测试重组人抗-SARS-CoV抗体CR03-014和CR03-022与每种线性和环状肽的结合。将含有共价连接的肽的455孔信用卡形式聚丙烯卡与抗体(1-10μg/ml；在含有5％马血清(v/v)和5％卵清蛋白(w/v)的封闭溶液中稀释)一起在4℃温育过夜。在洗涤后，将所述肽与抗人抗体过氧化物酶(1/1000稀释)一起在25℃温育1小时，随后在洗涤后加入过氧化物酶底物2，2′-连氮基-二-3-乙基苯噻唑啉磺酸盐(ABTS)和2μl/ml 3％H₂O₂。将对照物(线性和环状)仅与抗人抗体过氧化物酶一起温育。1小时后测定生色情况。ELISA的生色用CCD相机和图像处理系统量化。所述配置包括CCD相机和55 mm镜头(Sony CCD Video CameraXC-77RR，Nikon micro-nikkor 55mm f/2.8镜头)，相机适配器(SonyCamera adaptor DC-77RR)和Image Processing Software packageOptimas，version 6.5(Media Cybernetics，Silver Spring，MD 20910，U.S.A.)。Optimas在奔腾II计算机系统上运行。

测试重组人抗SARS-CoV-抗体CR03-014和CR03-022与如前述合成的15-mer线性和环状肽的结合情况。如下计算肽与重组人抗SARS-CoV抗体的相关结合。计算每种抗体对于各自蛋白质的平均OD值(所有肽的OD值总和/肽的总数)。接下来，计算这个平均值的标准误差。将标准误差乘以2，将获得的数值加上所述平均值获得校正因数。然后将每种肽的OD值除以该校正因数。如果发现数值为0.9或更高，则认为在特定肽与各自抗体之间存在相关结合。特别感兴趣的是包含一些反应肽的结构域，即包含连续肽的结构域，其中结构域中至少大多数的肽与所述抗体具有反应性。

单克隆抗体CR03-014与SARS-CoV刺突蛋白中的肽或包含一些肽的结构域不特异性反应，表明CR03-014可能识别不连续的非线性表位。单克隆抗体CR03-022与两个结构域中的一系列环状肽反应(数据未示出)。所述结构域包含SARS-CoV刺突蛋白的氨基酸残基430-449和484-503，分别具有氨基酸序列ATSTGNYNYKYRYLRHGKLR(SEQ ID NO：126)和YTTTGIGYQPYRVWLSFEL(SEQ ID NO：127)。引人注目的是这两个结构域均具有基序TXTGXXXXXYR(SEQ ID NO：128)，表明这个基序对于抗体CR03-022与SARS-CoV刺突蛋白的结合是至关重要的。

表1：目前已知的SARS-CoV基因组序列和刺突基因。

SARS分离株	基因/基因组	Genbank	FASTA
				SARS coronavirus AS	SARS coronavirus AS，complete genome.	AY427439	37576845
SARS coronavirus BJ01	SARS coronavirus BJ01，complete genome.	AY278488	30275666
				SARS coronavirus BJ02	SARS coronavirus BJ02，complete genome.	AY278487	31416292
SARS coronavirus BJ03	SARS coronavirus BJ03，complete genome.	AY278490	31416305
				SARS coronavirus BJ04	SARS coronavirus BJ04，completeg enome.	AY279354	31416306
SARS coronavirus BJ2232
				SARS coronavirus BJ302
SARS coronavirus CUHK-AG01	SARS coronavirus CUHK-AG01，complete genome.	AY345986	33114190
				SARS coronavirus CUHK-AG02	SARS coronavirus CUHK-AG02，complete genome.	AY345987	33114202
SARS coronavirus CUHK-AG03	SARS coronavirus CUHK-AG03，complete genome.	AY345988	33114214
				SARS coronavirus CUHK-L2
SARS coronavirus CUHK-Su10	SARS coronavirus CUHK-Su10，complete genome.	AY282752	38304867
				SARS coronavirus CUHK-W1	SARS coronavirus CUHK-W1，complete genome.	AY278554	30027610
SARS coronavirus cw037
				SARS coronavirus cw049
SARS coronavirus FRA	SARS coronavirus FRA，complete genome.	AY310120	33578015
				SARS coronavirus Frankfurt 1	SARS coronavirus Frankfurt 1，complete genome.	AY291315	31581502
SARS coronavirus GD01	SARS coronavirus GD01，complete genome.	AY278489	31416290
				SARS coronavirus GD03T0013	SARS coronavirus GD03T0013 spike glycoprotein gene，complete cds.	AY525636	41764105
SARS coronavirus GD69	SARS coronavirus GD69，complete genome.	AY313906	37960831
				SARS coronavirus GZ-A	SARS coronavirus GZ-A，partial genome.	AY394977	37624320
SARS coronavirus GZ-B	SARS corona virus GZ-B，complete genome.	AY394978	37624321
				SARS coronavirus GZ-C	SARS coronavirus GZ-C，complete genome.	AY394979	37624322
SARS coronavirus GZ-D	SARS coronavirus GZ-D，partial genome.	AY394980	37624323
				SARS coronavirus GZ02	SARS coronavirus GZ02，complete genome.	AY390556	41323719
SARS coronavirus GZ43	SARS coronavirus GZ43，partial genome.	AY304490	34482141
				SARS corona virus GZ50	SARS coronavirus Gz50，complete genome.	AY304495	34482146
SARS coronavirus GZ60	SARS coronavirus GZ60，partial genome.	AY304491	34482142
				SARS coronavirus HB
SARS coronavirus HGZ8L1-A	SARS coronavirus HGZ8L1-A，partial genome.	AY394981	37624324
				SARS coronavirus HGZ8L1-B	SARS coronavirus HGZ8L1-B，partial genome.	AY394982	37624325
SARS coronavirus HGZ8L2	SARS coronavirus HGZ8L2，complete genome.	AY394993	37624336
				SARS coronavirus HKU-36871	SARS coronavirus HKU-36871，partial genome.	AY304492	34482143
SARS coronavirus HKU-39849	SARS coronavirus HKU-39849，complete genome.	AY278491	30023963
				SARS coronavirus HKU-65806	SARS coronavirus HKU-65806，partial genome.	AY304493	34482144
SARS coronavirusHKU-66078	SARS coronavirus HKU-66078，partial genome.	AY304494	34482145
				SARS coronavirus HongKong/03/2003

SARS coronavirus HPZ-2003
				SARS coronavirus HSR 1	SARS coronavirus HSR 1，complete genome.	AY323977	33115118
SARS coronavirus HSZ-A	SARS coronavirus HSZ-A，partial genome.	AY394984	37624327
				SARS coronavirus HSZ-Bb	SARS coronavirus HSZ-Bb，complete genome.	AY394985	37624328
SARS coronavirus HSZ-Bc	SARS coronavirus HSZ-Bc，complete genome.	AY394994	37624337
				SARS coronavirus HSZ-Cb	SARS coronavirus HSZ-Cb，complete genome.	AY394986	37624329
SARS coronavirus HSZ-Cc	SARS coronavirus HSZ-Cc，complete genome.	AY394995	37624338
				SARS coronavirus HSZ2-A	SARS coronavirus HSZ2-A，complete genome.	AY394983	37624326
SARS coronavirus HZS2-Bb	SARS coronavirus HZS2-Bb，partial genome.	AY395004	37624347
				SARS coronavirus HZS2-C	SARS coronavirus HZS2-C，complete genome.	AY394992	37624335
SARS coronavirus HZS2-D	SARS coronavirus HZS2-D，complete genome.	AY394989	37624332
				SARS coronavirus HZS2-E	SARS coronavirus HZS2-E，complete genome.	AY394990	37624333
SARS coronavirus HZS2-Fb	SARS coronavirus HZS2-Fb，completegenome.	AY394987	37624330
				SARS coronavirus HZS2-Fc	SARS coronavirus HZS2-Fc，complete genome.	AY394991	37624334
SARS coronavirus JMD	SARS coronavirus JMD，partial genome.	AY394988	37624331
				SARS coronavirus LC1	SARS coronavirus LC1.complete genome.	AY394998	37624341
SARS coronavirus LC2	SARS coronavirus LC2，complete genome.	AY394999	37624342
				SARS coronavirus LC3	SARS coronavirus LC3，complete genome.	AY395000	37624343
SARS coronavirus LC4	SARS coronavirus LC4，complete genome.	AY395001	37624344
				SARS coronavirus LC5	SARS coronavirus LC5，complete genome.	AY395002	37624345
SARS coronavirus NS-1	SARS coronavirus NS-1，complete genome.	AY508724	40795744
				SARS coronavirus PUMC01	SARS coronavirus PUMC01，complete genome.	AY350750	38231927
SARS coronavirus PUMC02	SARS coronavirus PUMC02，complete genome.	AY357075	38231932
				SARS coronavirus PUMC03	SARS coronavirus PUMC03，complete genome.	AY357076	38231937
SARS coronavirus sf098
				SARS coronavirus sf099
SARS coronavirusShanghaiQXC1	SARS coronavirus ShanghaiQXC1，complete genome.	AY463059	40457433
				SARS coronavirusShanghaiQXC2	SARS coronavirus ShanghaiQXC2，complete genome.	AY463060	40457448
SARS coronavirus ShanhgaiLY	SARS coronavirus Shanhgai LY spike glycoprotein gene，complete cds.	AY322205S3	32454341
				SARS coronavirus Sin0409
SARS coronavirus Sin2500	SARS coronavirus Sin2500，complete genome.	AY283794	30468042
				SARS coronavirus Sin2677	SARS coronavirus Sin2677，complete genome.	AY283795	30468043
SARS coronavirus Sin2679	SARS coronavirus Sin2679，complete genome.	AY283796	30468044
				SARS coronavirus Sin2748	SARS coronavirus Sin2748，complete genome.	AY283797	30468045
SARS coronavirus Sin2774	SARS coronavirus Sin2774，complete genome.	AY283798	37361915
				SARS coronavirus Sin3408	SARS coronavirus Sin3408，complete genoma	AY559083	45644998
SARS coronavirus Sin3408L	SARS coronavirus Sin3408L，complete genome	AY559097	45645024
				SARS coronavirus Sin3725V	SARS coronavirus Sin3725V，complete genome	AY559087	45645004
SARS coronavirus Sin3765V	SARS coronavirus Sin3765V，complete genome	AY559084	45645000
				SARS coronavirus Sin842	SARS coronavirus Sin842，complete genome	AY559081	45644994

SARS coronavirus Sin845	SARS coronavirus Sin845，complete genome	AY559093	45645019
				SARS coronavirus Sin846	SARS coronavirus Sin646，complete genome	AY559094	45645021
SARS coronavirus Sin847	SARS coronavirus Sin847，complete genome	AY559095	45645022
				SARS coronavirus Sin648	SARS coronavirus Sin648，complete genome	AY559085	45645001
SARS coronavirus Sin849	SARS coronavirus Sin649，complete genome	AY559086	45645003
				SARS coronavirus Sin850	SARS coronavirus Sin850，complete genome	AY559096	45645023
SARS coronavirus Sin852	SARS coronavirus Sin852，complete genome	AY559082	45644996
				SARS coronavirus Sin_WNV
SARS coronavirus Sino1-11	SARS coronavirus Sino1-11，complete genome.	AY485277	38506482
				SARS coronavirus Sino3-11	SARS coronavirusSino3-11，complete genome.	AY485278	38505491
SARS coronavirus SinP1	SARS coronavirus SinP1，complete genome	AY559088	45645007
				SARS coronavirus SinP2	SARS coronavirus SinP2，complete genome	AY559089	45645010
SARS coronavirus SinP3	SARS coronavirus SinP3，complete genome	AY559090	45645013
				SARS coronavirus SinP4	SARS coronavirus SinP4，complete genome	AY559091	45645016
SARS coronavirus SinP5	SARS coronavirus SinP5，complete genome	AY559092	45645017
				SARS coronavirus SoD	SARS coronavirus SoD，completegenome.	AY461660	38385714
SARS coronavirus SZ1	SARS coronavirus SZ1，partial genome.	AY304489	34482140
				SARS coronavirus SZ13	SARS coronavirus SZ13，partial genome.	AY304487	34482138
SARS coronavirus SZ16	SARS coronavirus SZ16，complete genome.	AY304488	34482139
				SARS coronavirus SZ3	SARS coronavirus SZ3，complete genome.	AY304486	34482137
SARS coronavirus Taiwan
				SARS coronavirus Taiwan JC-2003
SARS coronavirus Taiwan TC1	SARS coronavirus Taiwan TC1，complete genome.	AY338174	32493129
				SARS coronavirus Taiwan TC2	SARS coronavirus Taiwan TC2，complete genome.	AY338175	32493130
SARS coronavirus Taiwan TC3	SARS coronavirus Taiwan TC3，complete genome.	AY348314	33188324
				SARS coronavirus Tor2	SARS coronavirus TOR2，complete genome.	AY274119	30248028
SARS coronavirus TW
				SARS coronavirus TW-GD1
SARS coronavirus TW-GD2
				SARS coronavirus TW-GD3
SARS coronavirus TVW-GD4
				SARS coronavirus TW-GD5
SARS coronavirus TW-HP1
				SARS coronavirus TW-HP2
SARS coronavirus TW-HP3
				SARS coronavirus TW-HP4
SARS coronavirus TW-JC2
				SARS coronavirus TW-KC1
SARS coronavirus TW-KC3
				SARS coronavirus TW-PH1
SARS coronavirus TW-PH2

SARS coronavirus TW-YM1
				SARS coronavirus TW-YM2
SARS coronavirus TW-YM3
				SARS coronavirus TW-YM4
SARS coronavirus TW1	SARS coronavirus TW1，complete genome.	AY291451	30698326
				SARS coronavirus TW10	SARS coronavirus TW10，complete genome.	AY502923	40548873
SARS coronavirus TW11	SARS coronavirus TW11，complete genome.	AY502924	40548885
				SARS coronavirus TW2	SARS coronavirus TW2，complete genome.	AY502925	40548897
SARS coronavirus TW3	SARS coronavirus TW3，complete genome.	AY502926	40548909
				SARS coronavirus TW4	SARS coronavirus TW4，complete genome.	AY502927	40548921
SARS coronavirus TW5	SARS coronavirus TW5，complete genome.	AY502928	40548933
				SARS coronavirus TW6	SARS coronavirus TW6，complete genome.	AY502929	40548945
SARS coronavirus TW7	SARS coronavirus TW7，complete genome.	AY502930	40548957
				SARS coronavirus TW8	SARS coronavirus TW8，complete genome.	AY502931	40548969
SARS coronavirus TW9	SARS coronavirus TW9，complete genome.	AY502932	40548981
				SARS coronavirus TWC	SARS coronavirus TWC，complete genome.	AY321118	31873092
SARS coronavirus TWC2	SARS coronavlrus TWC2，complete genome.	AY362698	33518724
				SARS coronavirus TWC3	SARS coronavirus TWC3，complete genome.	AY362699	33518725
SARS coronavirus TWH	SARS coronavirus TWH genomic RNA，complete genome.	AP006557	33411399
				SARS coronavirus TWJ	SARS coronavirus TWJ genomic RNA，complete genome.	AP006558	33411414
SARS coronavirus TWK	SARS coronavirus TWK genomic RNA，complete genome.	AP006559	33411429
				SARS coronavirus TWS	SARS coronavirus TWS genomic RNA，completegenome.	AP006550	33411444
SARS coronavirus TWY	SARS coronavirus TWY genomic RNA，complete genome.	AP006561	33411459
				SARS coronavirus Urbani	SARS coronavirus Urbani，complete genome.	AY278741	30027617
SARS coronavirus Vietnam
				SARS coronavirus WHU	SARS coronavirus WHU，complete genome.	AY394850	40795428
SARS coronavirus xw002
				SARS coronavirus ZJ01	SARS coronavirus ZJ01，complete genome.	AY297028	30910859
SARS coronavirus ZMY1	SARS coronavirus ZMY1，complete genome.	AY351680	33304219
				SARS coronavirus ZS-A	SARS coronavirus ZS-A，complete genome.	AY394997	37624340
SARS coronavirus ZS-B	SARS coronavirus ZS-B，complete genome.	AY394996	37624339
				SARS coronavirus ZS-C	SARS coronavirus ZS-C，complete genome.	AY395003	37624346
	SARS coronavirus，TOR2 complete genome，curated	NC_004718	30271926
					SARS coronavirus ZJ01，partial genome.	AY286320	39980888
	SARS coronavirus BJ302 clone 1 spike glycoprotein gene，conplete	AY429072	38016580
					SARS coronavirus BJ302 clone 2 spike glycoprotein gene，complete	AY429073	38016582
	SARS coronavirus BJ302 clone 3 spike glycoprotein gene，complete	AY429074	38016584
					SARS coronavirus BJ302 clone 4 spike glycoprotein gene，complete	AY429075	38016586
	SARS coronavirus BJ302 clone 5 spike glycoprotein gene，complete	AY429076	38016588
					SARS coronavirus BJ302 clone 6 spike glycoprotein gene，complete	AY429077	38016590

	SARS coronavirus BJ302 clone 7 spike glycoprotein gene，complete	AY429078	38016592
					SARS coronavirus BJ302 clone 8 spike glycoprotein gene，complete	AY429079	38016594

表2：人IgG重链可变区引物(有义)。

引物名称	引物核苷酸序列	SEQ ID NO
			HuVH1B/7A	5′-CAGRTGCAGCTGGTGCARTCTGG-3′	SEQ ID NO：11
HuVH1C	5′-SAGGTCCAGCTGGTRCAGTCTGG-3′	SEQ ID NO：12
			HuVH2B	5′-SAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3′	SEQ ID NO：13
HuVH3B	5′-SAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3 ′	SEQ ID NO：14
			HuVH3C	5′-GAGGTGCAGCTGGTGGAGWCYGG-3′	SEQ ID NO：15
HuVH4B	5′-CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG-3′	SEQ ID NO：16
			HuVH4C	5′-CAGSTGCAGCTGCAGGAGTCSGG-3′	SEQ ID NO：17
HuVH5B	5′-GARGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3′	SEQ ID NO：18
			HuVH6A	5′-CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG-3′	SEQ ID NO：19

表3：人IgG重链可变区引物(有义)。

引物名称	引物核苷酸序列	SEQ ID NO
			HuJH1/2	5′-TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3′	SEQ ID NO：20
HuJH3	5′-TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC-3′	SEQ ID NO：21
			HuJH4/5	5′-TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC-3′	SEQ ID NO：22
HuJH6	5′-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3′	SEQ ID NO：23

表4：用Sfi1/Nco1限制位点扩展的人IgG重链可变区引物(有义)和用XhoI/BstEII限制位点扩展的人IgG重链J区引物(反义)。

引物名称	引物核苷酸序列	SEQ ID NO
			HuVH1B/7A-NcoI	5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTGCAGCTGGTGCARTCTGG-3′	SEQ ID NO：24
HuVH1C-NcoI	5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTCCAGCTGGTRCAGTCTGG-3′	SEQ ID NO：25
			HuVH2B-NcoI	5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGG-3′	SEQ ID NO：26

HuVH3B-NcoI	5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3′	SEQ ID NO：27
			HuVH3C-NcoI	5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGWCYGG-3′	SEQ ID NO：28
HuVH4B-NcoI	5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG-3′	SEQ ID NO：29
			HuVH4C-NcoI	5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGSTGCAGCTGCAGGAGTCSGG-3′	SEQ ID NO：30
HuVH5B-NcoI	5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3′	SEQ ID NO：31
			HuVH6A-NcoI	5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG-3′	SEQ ID NO：32
HuJH1/2-XhoI	5′-GAGTCATTCTCGACTCGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3′	SEQ ID NO：33
			HuJH3-XhoI	5′-GAGTCATTCTCGACTCGAGACGGTGACCATTGTCCC-3′	SEQ ID NO：34
HuJH4/5-XhoI	5′-GAGTCATTCTCGACTCGAGACGGTGACCAGGGTTCC-3′	SEQ ID NO：35
			HuJH6-XhoI	5′-GAGTCATTCTCGACTCGA	SEQ ID NO：36

GACGGTGACCGTGGTCCC-3′

表5：人λ链可变区引物(有义)。

引物名称	引物核苷酸序列	SEQ ID NO
			HUVλ1A	5′-CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACC-3′	SEQ ID NO：37
HuVλ1B	5′-CAGTCTGTGYTGACGCAGCCGCC-3′	SEQ ID NO：38
			HuVλ1C	5′-CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCC-3′	SEQ ID NO：39
HUVλ2	5′-CARTCTGCCCTGACTCAGCCT-3′	SEQ ID NO：40
			HuVλ3A	5′-TCCTATGWGCTGACTCAGCCACC-3′	SEQ ID NO：41
HuVλ3B	5′-TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC-3′	SEQ ID NO：42
			HuVλ4	5′-CACGTTATACTGACTCAACCGCC-3′	SEQ ID NO：43
HuVλ5	5′-CAGGCTGTGCTGACTCAGCCGTC-3′	SEQ ID NO：44
			HuVλ6	5′-AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA-3′	SEQ ID NO：45
HuVλ7/8	5′-CAGRCTGTGGTGACYCAGGAGCC-3′	SEQ ID NO：46
			HuVλ9	5′-CWGCCTGTGCTGACTCAGCCMCC-3′	SEQ ID NO：47

表6：人κ链可变区引物(有义)。

引物名称	引物核苷酸序列	SEQ ID NO
			HuVκ1B	5′-GACATCCAGWTGACCCAGTCTCC-3′	SEQ ID NO：48
HuVκ2	5′-GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC-3′	SEQ ID NO：49
			HuVκ3	5′-GAAATTGTGWTGACRCAGTCTCC-3′	SEQ ID NO：50
HuVκ4	5′-GATATTGTGATGACCCACACTCC-3′	SEQ ID NO：51
			HuVκ5	5′-GAAACGACACTCACGCAGTCTCC-3′	SEQ ID NO：52
HuVκ6	5′-GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC-3′	SEQ ID NO：53

表7：人λ链J区引物(反义)。

引物名称	引物核苷酸序列	SEQ ID NO
			HuJλ1	5′-ACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC-3′	SEQ ID NO：54
HuJλ2/3	5′-ACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3′	SEQ ID NO：55
			HuJλ4/5	S′-ACYTAAAACGGTGAGCTGGGTCCC-3′	SEQ ID NO：56

表8：人λ链J区引物(反义)。

引物名称

引物核苷酸序列

SEQ ID NO

HuJκ1	5′-ACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3′	SEQ ID NO：57
			HuJκ2	5′-ACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3′	SEQ ID NO：58
HuJκ3	5′-ACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3′	SEQ ID NO：59
			HuJκ4	5′-ACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC-3′	SEQ ID NO：60
HuJκ5	5′-ACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3′	SEQ ID NO：61

表9：用Sai1限制位点扩展的人κ链可变区引物(有义)、用Not1限制位点扩展的人κ链J区引物(反义)、用Sai1限制位点扩展的人λ链可变区引物(有义)和用Not1限制位点扩展的人λ链J区引物(反义)。

引物名称	引物核苷酸序列	SEO ID NO
			HuVκ1B-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGGACATCCAGWTGACCCAGTCTCC-3′	SEQ ID NO：62
HuVκ2-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGGATGTTGTGATGACTCAGTCTCC-3′	SEQ ID NO：63
			HuVκ3B-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGGAAATTGTGWTGACRCAGTCTCC-3′	SEQ ID NO：64
HuVκ4B-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCG	SEQ ID NO：65

	ACGGATATTGTGATGACCCACACTCC-3′
			HuVκ5-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGGAAACGACACTCACGCAGTCTCC-3′	SEQ ID NO：66
HuVκ6-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC-3′	SEQ ID NO：67
			HuJκ1-NotI	5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3′	SEQ ID NO：68
HuJκ2-NotI	5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3′	SEQ ID NO：69
			HuJκ3-NotI	5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3′	SEQ ID NO：70
HuJκ4-NotI	5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC-3′	SEQ ID NO：71
			HuJκ5-NotI	5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3′	SEQ ID NO：72
HuVλ1A-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACC-3′	SEQ ID NO：73
			HuVλ1B-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGCAGTCTGTGYTGACGCAGCCGCC-3′	SEQ ID NO：74
HuVλ1C-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGCAGTCTGTCGTGACGCAGCCG	SEQ ID NO：75

	CC-3′
			HuVλ2-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGCARTCTGCCCTGACTCAGCCT-3′	SEQ ID NO：76
HuVλ3A-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGTCCTATGWGCTGACTCAGCCACC-3′	SEQ ID NO：77
			HuVλ3B-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC-3′	SEQ ID NO：78
HuVλ4-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGCACGTTATACTGACTCAACCGCC-3′	SEQ ID NO：79
			HuVλ5-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGCAGGCTGTGCTGACTCAGCCGTC-3′	SEQ ID NO：80
HuVλ6-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGAATTTTATGCTGACTCAGCCCCA-3′	SEQ ID NO：81
			HuVλ7/8-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGCAGRCTGTGGTGACYCAGGAGCC-3′	SEQ ID NO：82
HuVλ9-SalI	5′-TGAGCACACAGGTCGACGCWGCCTGTGCTGACTCAGCCMCC-3′	SEQ ID NO：83
			HuJλ1-NotI	5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC-3′	SEQ ID NO：84
HuJλ2/3-NotI	5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3′	SEQ ID NO：85

HuJλ4/5-NotI

5′-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACYTAAAACGGTGAGCTGGGTCCC-3′

SEQ ID NO：86

表10：不同轻链产物在10个部分中的分布

轻链产物	等位基因数目	部分编号	等位基因/部分
				Vk1B/Jk1-5	19	1 and 2	9.5
Vk2/Jk1-5	9	3	9
				Vk3B/Jk1-5	7	4	7
Vk4B/Jk1-5	1	5	5
				Vk5/Jk1-5	1
Vk6/Jk1-5	3
				Vλ1A/J11-3	5	6	5
Vλ1B/J11-3
	Vλ1C/J11-3
Vλ2/J11-3		5	7	5
	Vλ3A/J11-3				9	8	9
Vλ3B/J11-3
	Vλ4/J11-3	3	9	5
Vλ5/J11-3					1
	Vλ6/J11-3	1
Vλ7/8/J11-3					3	10	6
	Vλ9/J11-3	3

表11：能够结合SARS-CoV的单链Fv的数据

scFv命名	核苷酸序列SEQ ID NO	氨基酸序列SEQ ID NO	HCDR3	VH-生殖系	VL-生殖系
						SC03-014	92	93	GISPFYFDY(SEQ IDNO：1)	VH3 DP29(VH3-72)	VkI DPK9(02/012)
SC03-022	94	95	GSGISTPMDV(SEQ IDNO：2)	VH5-51(DP-73)	VKIV(B3-DPK24)

表12A：SARS-CoV中和实验I

	抗体	CR03-014			CR03-022			cIgG1			康复期血清
														稀释		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
4x	A	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-	-	-
														8x	B	-	-	-	+	+	+	+	+	+	-	-	-
16x	C	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-	-	-
														32x	D	-	-	-	-	-	+	+	+	+	-	-	-
64x	E	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-	-	-
														128x	F	-	-	-	+	+	+	+	+	+	-	-	-
256x	G	-	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+
														512x	H	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+

表12B：SARS-CoV中和实验II

	抗体	CR03-014			CR03-022			cIgG1			康复期血清
														稀释		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
4x	A	-	-	-	-	-	+	+	+	+	-	-	-
														8x	B	-	-	-	+	+	-	+	+	+	-	-	-
16x	C	-	-	-	+	-	-	+	+	+	-	-	-
														32x	D	-	-	-	+	+	-	+	+	+	-	-	-
64x	E	-	+	-	-	-	-	+	+	+	-	-	-
														128x	F	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+	-	-
256x	G	-	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+
														512x	H	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+

表12C：SARS-CoV中和实验III

	抗体	CRR03-014			CR03-022			cIgG1			康复期血清
														稀释		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
4x	A	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-	-	-
														8x	B	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-	-	-
16x	C	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-	-	-
														32x	D	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-	-	-
64x	E	-	-	-	-	+	+	+	+	+	-	-	-
														128x	F	-	-	-	+	+	+	+	+	+	-	+	-
256x	G	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
														512x	H	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+

-：无CPE

+：CPE

表13：体外中和分析中示出的单克隆抗SARS-CoV抗体CR03-014针对100 TCID₅₀的不同SARS-CoV分离株达到完全保护的浓度

SARS-CoV毒株*	产生针对100 TCID50100％保护的CR03-014的浓度(μg/ml)
		36(3)	12.5
39849(3)	12.5
		66(2)	12.5
61567(2)	12.5
		61644(1)	12.5
61644(15)	12.5
		GZ431	12.5
GZ501	12.5

^*：括号中示出了相应毒株的传代数。

¹：毒株GZ43和GZ50的传代史未知。

表14：几种CR03-014和CR03-022混合物的SARS-CoV中和实验

混和物	CR03-014(625μg/ml)％	CR03-022(2.5mg/ml)％	在所示稀释度被保护的孔							效价
											16x	32x	64x	128x	256x	512x	1024x

A	0	100	6/6	6/6	5/6	3/6	3/6	0/6	0/6	64
											B	10	90	6/6	6/6	6/6	6/6	6/6	2/6	0/6	256
C	50	50	6/6	6/6	6/6	6/6	6/6	6/6	4/6	＞1024
											D	90	10	ND	6/6	6/6	6/6	4/6	1/6	0/6	256
E	100	0	5/6	2/6	0/6	0/6	0/6	0/6	0/6	16

表15：具有与SARS-CoV Frankfurt 1毒株的S蛋白的318-510区域不相同的S蛋白的318-510区域的SARS-CoV毒株

突变	毒株	Genbank
			K344R	GZ02GZ60JMDZS-BGZ43HGZ8L1-AZS-AZS-C	AY390556AY304491AY394988AY394996AY304490AY394981AY394997AY395003
K344RF501Y	GD01	AY278489
			K344RF360SL472PD480GT487S	GD03T0013	AY525636
S353F	Sin3408Sin3765VSin845Sin847	AY559083AY559084AY559093AY559095

	Sin849Sin852Sin3725VSin842Sin846Sin848Sin850	AY559086AY559082AY559087AY559081AY559094AY559085AY559096
			R426GN437D	Shanghai LY	AY322205S3
Y436H	GZ-C	AY394979
			Y442S	Sino1-11	AY485277
N479S	BJ302 cl.2BJ302 cl.4BJ302 cl.6BJ302 cl.3BJ302 cl.5BJ302 cl.8	AY429073AY429075AY429077AY429074AY429076AY429079

与Frankfurt 1的S蛋白相对比的氨基酸取代示于左栏。毒株和GenBank登记号示于第二和第三栏。

表16：E014逃逸病毒的中和指数

逃逸病毒	Log(TCID50/ml)无mAb	Log(TCID50/ml)有mAb	NI
				E014-C06	7.45	7.53	0
E014-C07	7.07	6.85	0.22
				E014-C08	7.83	7.1	0.73
E014-C09	7.53	6.85	0.68
				E014-C10	6.77	7.1	0
WL SARS-	7.23	3.93	3.3

CoV

表17：推测的E022逃逸病毒的中和指数

病毒	Log(TCTD50/ml)无mAb	Log(TCID50/ml)有mAb	NT	逃逸
					Wt SARS-CoV	7.3	4	3.3	No
E22-2	7.3	2.5	4.8	No
					E22-3	7.45	2.5	4.95	No
E22-5	7.3	2.7	4.6	No
					E22-6	7.3	2.95	4.35	No
E22-9	8.1	3.7	4.4	No

表18：对于CR03-014的两个代表性逃逸病毒的CR03-022中和效价

病毒	效价(μg/ml)a	效价(μg/ml)b
			野生型	35.46	50.00
E14-6	25.00	50.00
			E14-7	31.50	50.00

^a：CR03-022对于每一种病毒的50％中和效价以μg/ml表示

^b：CR03-022对于每一种病毒的100％中和效价以μg/ml表示

参考文献

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序列表

<110>克鲁塞尔荷兰公司

<120>抗SARS-冠状病毒的组合物及其应用

<130>0114 WO 00 ORD

<160>138

<170>PatentIn version  3.1

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>HCDR3 of SC03-014

<400>1

Gly  Ile  Ser  Pro  Phe  Tyr  Phe Asp Tyr

1              5

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>HCDR3 of SC03-022

<400>2

Gly Ser Gly Ile Ser Thr Pro Met Asp Val

1               5                   10

<210>3

<211>366

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Variable heavy chain of  SC03-014

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(3 66)

<223>

<400>3

atg gcc gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtc cag cct    48

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val  Gln Pro

1               5                   10                  15

gga ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt         96

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

            20                  25                  30

gac cac tac atg gac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag        144

Asp His Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

tgg gtt ggc cgt act aga aac aaa gct aac agt tac acc aca gaa tac        192

Trp Val Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr

     50                 55                  60

gcc gcg tct gtg aaa ggc aga ttc acc atc tca aga gat gat tca aag        240

Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys

65                  70                  75                  80

aac tca ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aaa acc gag gac acg gcc        288

Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala

                85                  90                  95

gtg tat tac tgt gca agg ggg att tcg ccg ttt tac ttt gac tac tgg        336

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ile Ser Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp

            100                 105                 110

ggc caa ggt acc ctg gtc acc gtc tcg agt                                366

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>4

<211>122

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Variable heavy chain of SC03-014

<400>4

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1               5                   10                  15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

            20                  25                  30

Asp His Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Val Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr

    50                  55                  60

Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys

65                  70                  75                  80

Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala

                85                  90                  95

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ile Ser Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp

            100                 105                 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>5

<211>363

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Variable heavy chain of SC03-022

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(363)

<223>

<400>5

atg gcc cag atg cag ctg gtg caa tct gga aca gag gtg aaa aag ccg         48

Met Ala Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro

1               5                   10                  15

ggg gag tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac ggc ttt atc         96

Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Ile

            20                  25                  30

acc tac tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag        144

Thr Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

tgg atg ggg atc atc tat cct ggt gac tct gaa acc aga tac agc ccg        192

Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro

    50                  55                  60

tcc ttc caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc aac acc        240

Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr

65                  70                  75                  80

gcc tac ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc ata tat        288

Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr

                85                  90                  95

tac tgt gcg ggg ggt tcg ggg att tct acc cct atg gac gtc tgg ggc        336

Tyr Cys Ala Gly Gly Ser Gly Ile Ser Thr Pro Met Asp Val Trp Gly

            100                 105                  110

caa ggg acc acg gtc acc gtc tcg agc                                    363

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>6

<211>121

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Variable heavy chain of SC03-022

<400>6

Met Ala Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro

1               5                   10                  15

Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Ile

            20                  25                  30

Thr Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu

        35                  40                  45

Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro

    50                  55                  60

Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr

65                  70                  75                  80

Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr

                85                  90                  95

Tyr Cys Ala Gly Gly Ser Gly Ile Ser Thr Pro Met Asp Val Trp Gly

            100                 105                 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>7

<211>318

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Variable light chain of SC03-014

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(318)

<223>

<400>7

gag ctc acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga gac aga         48

Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

1               5                   10                  15

gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agc tac tta aat         96

Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

            20                  25                  30

tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc tat gct        144

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala

        35                  40                  45

gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc agt gga        192

Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

    50                  55                  60

tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct gaa gat        240

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

65                  70                  75                  80

ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac agt acc cct cca acg ttc        288

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe

                85                  90                  95

ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt                                318

Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>8

<211>106

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Variable light chain of SC03-014

<400>8

Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

1               5                   10                  15

Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

            20                  25                  30

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala

        35                  40                  45

Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

65                  70                  75                  80

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe

                85                  90                  95

Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

            100                 105

<210>9

<211>348

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Variable light chain of SC03-022

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(348)

<223>

<400>9

gac atc cag ttg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc         48

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agc cag agt gtt tta tac agc         96

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

             20                 25                  30

tcc atc aat aag aac tac tta gct tgg tac cag cag aaa cca gga cag        144

Ser Ile Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

        35                  40                  45

cct cct aag ctg ctc att tac tgg gca tct acc cgg gaa tcc ggg gtc        192

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

    50                  55                  60

cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc        240

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65                  70                  75                  80

atc agc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag caa        288

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

                85                  90                  95

tat tat agt act ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag gtg gaa atc        336

Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

            100                 105                 110

aaa cgt gcg gcc                                                            348

Lys Arg Ala Ala

        115

<210>10

<211>116

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Variable light chain of SC03-022

<400>10

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

            20                  25                  30

Ser Ile Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

        35                  40                  45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

    50                  55                  60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65                  70                  75                  80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

                85                  90                  95

Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

            100                 105                 110

Lys Arg Ala Ala

        115

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH1B/7A

<400>11

cagrtgcagc tggtgcartc tgg                                                           23

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH1C

<400>12

saggtccagc tggtrcagtc tgg                                                           23

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH2B

<400>13

saggtgcagc tggtggagtc tgg                                                           23

<210>14

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH3B

<400>14

saggtgcagc tggtggagtc tgg                                                           23

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH3C

<400>15

gaggtgcagc tggtggagwc ygg                                                           23

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH4B

<400>16

caggtgcagc tacagcagtg ggg                                                           23

<210>17

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH4C

<400>17

cagstgcagc tgcaggagtc sgg                                                           23

<210>18

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH5B

<400>18

gargtgcagc tggtgcagtc tgg                                                           23

<210>19

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH6A

<400>19

caggtacagc tgcagcagtc agg                                                           23

<210>20

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJH1/2

<400>20

tgaggagacg gtgaccaggg tgcc                                                          24

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJH3

<400>21

tgaagagacg gtgaccattg tccc                                                          24

<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJH4/5

<400>22

tgaggagacg gtgaccaggg ttcc                                                         24

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJH6

<400>23

tgaggagacg gtgaccgtgg tccc                                                         24

<210>24

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH1B/7A-NcoI

<400>24

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagrtgc agctggtgca rtctgg                      56

<210>25

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH1C-NcoI

<400>25

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccsaggtcc agctggtrca gtctgg                      56

<210>26

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH2B-NcoI

<400>26

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagrtca ccttgaagga gtctgg            56

<210>27

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH3B-NcoI

<400>27

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccsaggtgc agctggtgga gtctgg            56

<210>28

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223> Primer HuVH3C-NcoI

<400>28

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgaggtgc agctggtgga gwcygg            56

<210>29

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH4B-NcoI

<400>29

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtgc agctacagca gtgggg            56

<210>30

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH4C-NcoI

<400>30

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccagstgc agctgcagga gtcsgg            56

<210>31

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVH5B-NcoI

<400>31

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgargtgc agctggtgca gtctgg            56

<210>32

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223> Primer HuVH6A-NcoI

<400>32

gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gcccaggtac agctgcagca gtcagg            56

<210>33

<211>36

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJH1/2-XhoI

<400>33

gagtcattct cgactcgaga cggtgaccag ggtgcc                                         36

<210>34

<211>36

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJH3-XhoI

<400>34

gagtcattct cgactcgaga cggtgaccat tgtccc                                         36

<210>35

<211>36

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJH4/5-XhoI

<400>35

gagtcattct cgactcgaga cggtgaccag ggttcc                                         36

<210>36

<211>36

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJH6-XhoI

<400>36

gagtcattct cgactcgaga cggtgaccgt ggtccc                                         36

<210>37

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda1A

<400>37

cagtctgtgc tgactcagcc acc                                                           23

<210>38

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda1B

<400>38

cagtctgtgy tgacgcagcc gcc                                                           23

<210>39

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda1C

<400>39

cagtctgtcg tgacgcagcc gcc                                                           23

<210>40

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223> Primer HuVlambda2

<400>40

cartctgccc tgactcagcc t                                                              21

<210>41

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda3A

<400>41

tcctatgwgc tgactcagcc acc                                                           23

<210>42

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda3B

<400>42

tcttctgagc tgactcagga ccc                                                           23

<210>43

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda4

<400>43

cacgttatac tgactcaacc gcc                                                           23

<210>44

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda5

<400>44

caggctgtgc tgactcagcc gtc                                                           23

<210>45

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda6

<400>45

aattttatgc tgactcagcc cca                                                           23

<210>46

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda7/8

<400>46

cagrctgtgg tgacycagga gcc                                                              23

<210>47

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda9

<400>47

cwgcctgtgc tgactcagcc mcc                                                              23

<210>48

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVkappa1B

<400>48

gacatccagw tgacccagtc tcc                                                              23

<210>49

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVkappa2

<400>49

gatgttgtga tgactcagtc tcc                                                           23

<210>50

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223> Primer HuVkappa3

<400>50

gaaattgtgw tgacrcagtc tcc                                                           23

<210>51

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVkappa4

<400>51

gatattgtga tgacccacac tcc                                                           23

<210>52

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVkappa5

<400>52

gaaacgacac tcacgcagtc tcc                                                           23

<210>53

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVkappa6

<400>53

gaaattgtgc tgactcagtc tcc                                                           23

<210>54

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJlambda1

<400>54

acctaggacg gtgaccttgg tccc                                                          24

<210>55

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJlambda2/3

<400>55

acctaggacg gtcagcttgg tccc                                                          24

<210>56

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJlambda4/5

<400>56

acytaaaacg gtgagctggg tccc                                                          24

<210>57

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJkappa1

<400>57

acgtttgatt tccaccttgg tccc                                                          24

<210>58

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJkappa2

<400>58

acgtttgatc tccagcttgg tccc                                                          24

<210>59

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJkappa3

<400>59

acgtttgata tccactttgg tccc                                                   24

<210>60

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJkappa4

<400>60

acgtttgatc tccaccttgg tccc                                                   24

<210>61

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJkappa5

<400>61

acgtttaatc tccagtcgtg tccc                                                   24

<210>62

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVkappa1B-SalI

<400>62

tgagcacaca ggtcgacgga catccagwtg acccagtctc c                                41

<210>63

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVkappa2-SalI

<400>63

tgagcacaca ggtcgacgga tgttgtgatg actcagtctc c                                41

<210>64

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVkappa3B-SalI

<400>64

tgagcacaca ggtcgacgga aattgtgwtg acrcagtctc c                                 41

<210>65

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVkappa4B-SalI

<400>65

tgagcacaca ggtcgacgga tattgtgatg acccacactc c                                 41

<210>66

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVkappa5-SalI

<400>66

tgagcacaca ggtcgacgga aacgacactc acgcagtctc c                                 41

<210>67

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVkappa6-SalI

<400>67

tgagcacaca ggtcgacgga aattgtgctg actcagtctc c                                 41

<210>68

<211>48

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJkappa1-NotI

<400>68

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatttccacc ttggtccc                        48

<210>69

<211>48

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJkappa2-NotI

<400>69

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccagc ttggtccc                        48

<210>70

<211>48

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJkappa3-NotI

<400>70

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatatccact ttggtccc                        48

<210>71

<211>48

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJkappa4-NotI

<400>71

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt gatctccacc ttggtccc                        48

<210>72

<211>48

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJ？kappa5-NotI

<400>72

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacgttt aatctccagt cgtgtccc                        48

<210>73

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda1A-SalI

<400>73

tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtgctg actcagccac c                                 41

<210>74

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda1B-SalI

<400>74

tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtgytg acgcagccgc c                                 41

<210>75

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda1C-SalI

<400>75

tgagcacaca ggtcgacgca gtctgtcgtg acgcagccgc c                                 41

<210>76

<211>39

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda2-SalI

<400>76

tgagcacaca ggtcgacgca rtctgccctg actcagcct                                    39

<210>77

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda3A-SalI

<400>77

tgagcacaca ggtcgacgtc ctatgwgctg actcagccac c                                 41

<210>78

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda3B-SalI

<400>78

tgagcacaca ggtcgacgtc ttctgagctg actcaggacc c                                 41

<210>79

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda4-SalI

<400>79

tgagcacaca ggtcgacgca cgttatactg actcaaccgc c                                 41

<210>80

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda5-SalI

<400>80

tgagcacaca ggtcgacgca ggctgtgctg actcagccgt c                                 41

<210>81

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda6-SalI

<400>81

tgagcacaca ggtcgacgaa ttttatgctg actcagcccc a                                 41

<210>82

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda7/8-SalI

<400>82

tgagcacaca ggtcgacgca grctgtggtg acycaggagc c                                 41

<210>83

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuVlambda9-SalI

<400>83

tgagcacaca ggtcgacgcw gcctgtgctg actcagccmc c                                 41

<210>84

<211>48

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJlambda1-NotI

<400>84

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtgacc ttggtccc                         48

<210>85

<211>48

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJlambda2/3-NotI

<400>85

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacctag gacggtcagc ttggtccc                        48

<210>86

<211>48

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuJlambda4/5-NotI

<400>86

gagtcattct cgacttgcgg ccgcacytaa aacggtgagc tgggtccc                         48

<210>87

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223> Primer HuCIgG

<400>87

gtccaccttg gtgttgctgg gctt                                                          24

<210>88

<211>4914

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Vector pDV-C05

<400>88

aagcttgcat gcaaattcta tttcaaggag acagtcataa tgaaatacct attgcctacg      60

gcagccgctg gattgttatt actcgcggcc cagccggcca tggccgaggt gtttgactaa     120

tggggcgcgc ctcagggaac cctggtcacc gtctcgagcg gtacgggcgg ttcaggcgga     180

accggcagcg gcactggcgg gtcgacggaa attgtgctca cacagtctcc agccaccctg     240

tctttgtctc caggggaaag agccaccctc tcctgcaggg ccagtcagag tgttagcagc     300

tacttagcct ggtaccaaca gaaacctggc caggctccca ggctcctcat ctatgatgca     360

tccaacaggg ccactggcat cccagccagg ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc     420

actctcacca tcagcagcct agagcctgaa gattttgcag tttattactg tcagcagcgt     480

agcaactggc ctccggcttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaacg tgcggccgca     540

tataccgata ttgaaatgaa ccgcctgggc aaaggggccg catagactgt tgaaagttgt     600

ttagcaaaac ctcatacaga aaattcattt actaacgtct ggaaagacga caaaacttta     660

gatcgttacg ctaactatga gggctgtctg tggaatgcta caggcgttgt ggtttgtact     720

ggtgacgaaa ctcagtgtta cggtacatgg gttcctattg ggcttgctat ccctgaaaat     780

gagggtggtg gctctgaggg tggcggttct gagggtggcg gttctgaggg tggcggtact     840

aaacctcctg agtacggtga tacacctatt ccgggctata cttatatcaa ccctctcgac     900

ggcacttatc cgcctggtac tgagcaaaac cccgctaatc ctaatccttc tcttgaggag     960

tctcagcctc ttaatacttt catgtttcag aataataggt tccgaaatag gcagggtgca    1020

ttaactgttt atacgggcac tgttactcaa ggcactgacc ccgttaaaac ttattaccag    1080

tacactcctg tatcatcaaa agccatgtat gacgcttact ggaacggtaa attcagagac    1140

tgcgctttcc attctggctt taatgaggat ccattcgttt gtgaatatca aggccaatcg    1200

tctgacctgc ctcaacctcc tgtcaatgct ggcggcggct ctggtggtgg ttctggtggc    1260

ggctctgagg gtggcggctc tgagggtggc ggttctgagg gtggcggctc tgagggtggc    1320

ggttccggtg gcggctccgg ttccggtgat tttgattatg aaaaaatggc aaacgctaat    1380

aagggggcta tgaccgaaaa tgccgatgaa aacgcgctac agtctgacgc taaaggcaaa    1440

cttgattctg tcgctactga ttacggtgct gctatcgatg gtttcattgg tgacgtttcc    1500

ggccttgcta atggtaatgg tgctactggt gattttgctg gctctaattc ccaaatggct    1560

caagtcggtg acggtgataa ttcaccttta atgaataatt tccgtcaata tttaccttct    1620

ttgcctcagt cggttgaatg tcgcccttat gtctttggcg ctggtaaacc atatgaattt    1680

tctattgatt gtgacaaaat aaacttattc cgtggtgtct ttgcgtttct tttatatgtt    1740

gccaccttta tgtatgtatt ttcgacgttt gctaacatac tgcgtaataa ggagtcttaa    1800

taagaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca    1860

acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg    1920

caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta    1980

ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata cgtcaaagca accatagtac    2040

gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct    2100

acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg    2160

ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt    2220

gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gatttgggtg atggttcacg tagtgggcca    2280

tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga    2340

ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg gctattcttt tgatttataa    2400

gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac    2460

gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca attttatggt gcactctcag tacaatctgc    2520

tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga    2580

cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc    2640

atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata    2700

cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact    2760

tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg    2820

tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt    2880

atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct    2940

gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca    3000

cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc    3060

gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc    3120

cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg    3180

gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta    3240

tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc    3300

ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt    3360

gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg    3420

cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct    3480

tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc    3540

tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct    3600

cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac    3660

acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc    3720

tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat    3780

ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg    3840

accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc    3900

aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa    3960

ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag    4020

gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta    4080

ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta    4140

ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag    4200

ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg    4260

gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg    4320

cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag    4380

cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc    4440

cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa    4500

aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg    4560

ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct    4620

gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa    4680

gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg    4740

cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag    4800

ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga    4860

attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgcc          4914

<210>89

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223> Primer HuCkappa

<400>89

acactctccc ctgttgaagc tctt                                             24

<210>90

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuClambda2

<400>90

tgaacattct gtaggggcca ctg                                              23

<210>91

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer HuClambda7

<400>91

agagcattct gcaggggcca ctg                                              23

<210>92

<211>747

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>SC03-014

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(747)

<223>

<400>92

tcc atg gct gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag         48

Ser Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

1               5                   10                  15

cct ggg ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt         96

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

            20                  25                  30

agc gac tac ttg atg aac tgg gtc cgc cag gcg ccc ggg aag ggg ctg        144

Ser Asp Tyr Leu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

        35                  40                  45

gag tgg gtt ggc cgt att aga agc aaa gct aac agt tac gcg aca gca        192

Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Ser Tyr Ala Thr Ala

    50                  55                  60

tat gct gcg tcg gtg aaa ggc agg ttc acc atc tcc aga gat gat tca        240

Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser

65                  70                  75                  80

aag aac acg gcg tat ctg caa atg aac agc ctg aaa acc gag gac acg        288

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr

                85                  90                  95

gcc gtg tat tac tgt gct aaa gac ggc agc cgg ttc ccc gcc cgc ttc        336

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Gly Ser Arg Phe Pro Ala Arg Phe

            100                 105                 110

gat tac tgg ggc cag ggc acc ctg gtg acc gtg ctc gag ggt acc gga        384

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Gly Thr Gly

        115                 120                 125

ggt tcc ggc gga acc ggg tct ggg act ggt acg agc gag ctc acc cag        432

Gly Ser Gly Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gly Thr Ser Glu Leu Thr Gln

    130                 135                 140

tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga gac aga gtc acc atc act        480

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

145                 150                 155                 160

tgc cgg gca agt cag agc att agc agc tac tta aat tgg tat cag cag        528

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

                165                 170                 175

aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc tat gct gca tcc agt ttg        576

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

            180                 185                 190

caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat        624

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

        195                 200                 205

ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct gaa gat ttt gca act tac        672

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

    210                 215                 220

tac tgt caa cag agt tac agt acc cct cca acg ttc ggc caa ggg acc        720

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

225                 230                 235                 240

aag gtg gag atc aaa cgt gcg gcc gca                                    747

Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala

                245

<210>93

<211>249

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>SC03-014

<400>93

Ser Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

1               5                   10                  15

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

            20                  25                  30

Ser Asp Tyr Leu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

        35                  40                  45

Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Ser Tyr Ala Thr Ala

    50                  55                  60

Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser

65                  70                  75                  80

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr

                85                  90                  95

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Gly Ser Arg Phe Pro Ala Arg Phe

            100                 105                 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Gly Thr Gly

        115                 120                 125

Gly Ser Gly Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gly Thr Ser Glu Leu Thr Gln

    130                 135                 140

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

145                 150                 155                 160

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

                165                 170                 175

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu

            180                 185                 190

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

        195                 200                 205

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

    210                 215                 220

Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr

225                 230                 235                 240

Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala

                245

<210>94

<211>762

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>SC03-022

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(762)

<223>

<400>94

gcc atg gcc cag atg cag ctg gtg caa tct gga aca gag gtg aaa aag         48

Ala Met Ala Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys

1               5                   10                  15

ccg ggg gag tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac ggc ttt         96

Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Phe

            20                  25                  30

atc acc tac tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg        144

Ile Thr Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu

        35                  40                  45

gag tgg atg ggg atc atc tat cct ggt gac tct gaa acc aga tac agc        192

Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser

    50                  55                  60

ccg tcc ttc caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc aac        240

Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn

65                  70                  75                  80

acc gcc tac ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc ata        288

Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile

                85                  90                  95

tat tac tgt gcg ggg ggt tcg ggg att tct acc cct atg gac gtc tgg        336

Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Ser Gly Ile Ser Thr Pro Met Asp Val Trp

            100                 105                 110

ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcg agc ggt acg ggc ggt tca ggc        384

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Gly Gly Ser Gly

        115                 120                 125

gga acc ggc agc ggc act ggc ggg tcg acg gac atc cag ttg acc cag        432

Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Leu Thr Gln

    130                 135                 140

tct cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc gag agg gcc acc atc aac        480

Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn

145                 150                 155                 160

tgc aag tcc agc cag agt gtt tta tac agc tcc atc aat aag aac tac        528

Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Ile Asn Lys Asn Tyr

                165                 170                 175

tta gct tgg tac cag cag aaa cca gga cag cct cct aag ctg ctc att        576

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

            180                 185                 190

tac tgg gca tct acc cgg gaa tcc ggg gtc cct gac cga ttc agt ggc        624

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

        195                 200                 205

agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag gct        672

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

    210                 215                 220

gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag caa tat tat agt act ccg tac        720

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr

225                 230                 235                 240

act ttt ggc cag ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgt gcg gcc                762

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala

                245                 250

<210>95

<211>254

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>SC03-022

<400>95

Ala Met Ala Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys

1               5                   10                  15

Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Phe

            20                  25                  30

Ile Thr Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu

        35                  40                  45

Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser

    50                  55                  60

Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn

65                  70                  75                  80

Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile

                85                  90                  95

Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Ser Gly Ile Ser Thr Pro Met Asp Val Trp

            100                 105                 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Thr Gly Gly Ser Gly

        115                 120                 125

Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Leu Thr Gln

    130                 135                 140

Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn

145                 150                 155                 160

Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Ile Asn Lys Asn Tyr

                165                 170                 175

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

            180                 185                 190

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

        195                 200                 205

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

    210                 215                     220

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr

225                 230                 235                 240

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala

                245                 250

<210>96

<211>6778

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Vector pSyn-C03-HCgamma1

<400>96

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg      60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg     120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc     180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgct aggtggtcaa tattggccat tagccatatt     240

attcattggt tatatagcat aaatcaatat tggctattgg ccattgcata cgttgtatcc     300

atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaaca ttaccgccat gttgacattg     360

attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat     420

ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc     480

ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca     540

ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta     600

tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta     660

tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat     720

cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga     780

ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca     840

aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg     900

taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc     960

ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc gatccagcct    1020

ccgcggccgg gaacggtgca ttggaagctg gcctggatgg cctgactctc ttaggtagcc    1080

ttgcagaagt tggtcgtgag gcactgggca ggtaagtatc aaggttacaa gacaggttta    1140

aggagatcaa tagaaactgg gcttgtcgag acagagaaga ctcttgcgtt tctgataggc    1200

acctattggt cttactgaca tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc actcccagtt    1260

caattacagc tcgccaccat ggcctgcccc ggcttcctgt gggccctggt gatcagcacc    1320

tgcctggaat tcagcatgag cagcgctagc accaagggcc ccagcgtgtt ccccctggcc    1380

cccagcagca agagcaccag cggcggcaca gccgccctgg gctgcctggt gaaggactac    1440

ttccccgagc ccgtgaccgt gagctggaac agcggcgcct tgaccagcgg cgtgcacacc    1500

ttccccgccg tgctgcagag cagcggcctg tacagcctga gcagcgtggt gaccgtgccc    1560

agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc    1620

aaggtggaca aacgcgtgga gcccaagagc tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc    1680

cctgcccccg agctgctggg cggaccctcc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac    1740

accctcatga tcagccggac ccccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gagccacgag    1800

gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc    1860

aagccccggg aggagcagta caacagcacc taccgggtgg tgagcgtgct caccgtgctg    1920

caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgagcaacaa ggccctgcct    1980

gcccccatcg agaagaccat cagcaaggcc aagggccagc cccgggagcc ccaggtgtac    2040

accctgcccc ccagccggga ggagatgacc aagaaccagg tgtccctcac ctgtctggtg    2100

aagggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac    2160

aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac agcgacggca gcttcttcct gtacagcaag    2220

ctcaccgtgg acaagagccg gtggcagcag ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac    2280

gaggccctgc acaaccacta cacccagaag agcctgagcc tgagccccgg caagtgataa    2340

tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca    2400

tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc    2460

ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg    2520

gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct    2580

ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg    2640

tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc    2700

gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt    2760

ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc    2820

cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt    2880

agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt    2940

aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt    3000

gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa    3060

aaatttaacg cgaattaatt ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag    3120

gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg    3180

gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag    3240

caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc    3300

attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg    3360

cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa    3420

agctcccggg agcttgtata tccattttcg gatctgatca agagacagga tgaggatcgt    3480

ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc    3540

tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc    3600

tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg    3660

aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag    3720

ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg    3780

ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg    3840

caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac    3900

atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg    3960

acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc    4020

ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg    4080

aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gatcgctatc    4140

aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc    4200

gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc    4260

ttcttgacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc aagcgacgcc    4320

caacctgcca tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg    4380

aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca tgctggagtt    4440

cttcgcccac cccaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat    4500

cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact    4560

catcaatgta tcttatcatg tctgtatacc gtcgacctct agctagagct tggcgtaatc    4620

atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg    4680

agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat    4740

tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg    4800

aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct    4860

cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc    4920

ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg    4980

ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg    5040

cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg    5100

actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac    5160

cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca    5220

tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt    5280

gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc    5340

caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag    5400

agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac    5460

tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt    5520

tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtttttttg tttgcaagca    5580

gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc    5640

tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag    5700

gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata    5760

tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat    5820

ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg    5880

ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc    5940

tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc    6000

aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc    6060

gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc    6120

gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc    6180

ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa    6240

gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat    6300

gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata    6360

gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca    6420

tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag    6480

gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc    6540

agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc    6600

aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata    6660

ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta    6720

gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtc      6778

<210>97

<211>6267

<212>DNA

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<220>

<223>Vector pSyn-C05-Ckappa

<400>97

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg      60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg     120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgttaa ttaacatgaa     180

gaatctgctt agggttaggc gttttgcgct gcttcgctag gtggtcaata ttggccatta     240

gccatattat tcattggtta tatagcataa atcaatattg gctattggcc attgcatacg     300

ttgtatccat atcataatat gtacatttat attggctcat gtccaacatt accgccatgt     360

tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc     420

ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc     480

aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg     540

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat     600

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc     660

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta     720

ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag     780

cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt     840

tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa     900

atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt     960

cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga    1020

tccagcctcc gcggccggga acggtgcatt ggaatcgatg actctcttag gtagccttgc    1080

agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca ggtttaagga    1140

gatcaataga aactgggctt gtcgagacag agaagactct tgcgtttctg ataggcacct    1200

attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtccactc ccagttcaat    1260

tacagctcgc caccatggcc tgccccggct tcctgtgggc cctggtgatc agcacctgcc    1320

tcgagttcag cggccctaag cggaccgtgg ccgctcccag cgtgttcatc ttccccccct    1380

ccgacgagca gctgaagagc ggcaccgcca gcgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc    1440

cccgggaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct gcagagcggc aacagccagg    1500

agagcgtgac cgagcaggac agcaaggact ccacctacag cctgagcagc accctcaccc    1560

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tgagcagccc cgtgaccaag agcttcaacc ggggcgagtg ttaatagact taagtttaaa    1680

ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc    1740

cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga    1800

aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga    1860

cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat    1920

ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag    1980

cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag    2040

cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt    2100

tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca    2160

cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata    2220

gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca    2280

aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttggc    2340

catttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt    2400

ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt    2460

atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca    2520

gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta    2580

actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga    2640

ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct attccagaag    2700

tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata    2760

tccattttcg gatctgatca gcacgtgatg aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc    2820

gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc    2880

gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat    2940

agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg    3000

ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg gaattcagcg agagcctgac ctattgcatc    3060

tcccgccgtg cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt    3120

ctgcagccgg tcgcggaggc catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc    3180

gggttcggcc cattcggacc acaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata    3240

tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt    3300

gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc    3360

cggcacctcg tgcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata    3420

acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac    3480

atcttcttct ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg    3540

aggcatccgg agcttgcagg atcgccgcgg ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt    3600

gaccaactct atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt    3660

cgatgcgacg caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc    3720

agaagcgcgg ccgtctggac cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga    3780

cgccccagca ctcgtccgag ggcaaaggaa tagcacgtgc tacgagattt cgattccacc    3840

gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc    3900

ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct    3960

tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca    4020

ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctgtataccg    4080

tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt    4140

tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt    4200

gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg    4260

ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg    4320

cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg    4380

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat    4440

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc    4500

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc    4560

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga    4620

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt    4680

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg    4740

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc    4800

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg    4860

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc    4920

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg    4980

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc    5040

gctggtagcg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa    5100

gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa    5160

gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa    5220

tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc    5280

ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga    5340

ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca    5400

atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc    5460

ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat    5520

tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc    5580

attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt    5640

tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc    5700

ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg    5760

gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt    5820

gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg    5880

gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga    5940

aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg    6000

taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg    6060

tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt    6120

tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc    6180

atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca    6240

tttccccgaa aagtgccacc tgacgtc                                        6267

<210>98

<211>54

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Oligonucleotide 5K-I

<400>98

acctgtctcg agttttccat ggctgacatc cagatgaccc agtctccatc ctcc              54

<210>99

<211>42

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Oligonucleotide sy3K-C

<400>99

gctgggggcg gccacggtcc gtttgatctc caccttggtc cc                           42

<210>100

<211>49

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Oligonucleotide 5K-J

<400>100

acctgtctcg agttttccat ggctgacatc gtgatgaccc agtctccag                    49

<210>101

<211>42

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Oligonucleotide sy3K-F

<400>101

gctgggggcg gccacggtcc gcttgatctc caccttggtc cc                            42

<210>102

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Oligonucleotide 5H-B

<400>102

acctgtcttg aattctccat ggccgaggtg cagctggtgg agtctg                          46

<210>103

<211>47

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Oligonucleotide sy3H-A

<400>103

gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac cagggtgccc tggcccc                         47

<210>104

<211>47

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Oligonucleotide 5H-H

<400>104

acctgtcttg aattctccat ggccgaggtg cagctggtgc agtctgg                         47

<210>105

<211>47

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Oligonucleotide sy3H-C

<400>105

gcccttggtg ctagcgctgg agacggtcac ggtggtgccc tggcccc                         47

<210>106

<211>1350

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>IgG heavy chain of CR03-014

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1350)

<223>

<400>106

gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtc cag cct gga ggg         48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt gac cac         96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His

            20                  25                  30

tac atg gac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtt        144

Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

ggc cgt act aga aac aaa gct aac agt tac acc aca gaa tac gcc gcg        192

Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala

    50                  55                  60

tct gtg aaa ggc aga ttc acc atc tca aga gat gat tca aag aac tca        240

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65                  70                  75                  80

ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aaa acc gag gac acg gcc gtg tat        288

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

                85                  90                  95

tac tgt gca agg ggg att tcg ccg ttt tac ttt gac tac tgg ggc cag        336

Tyr Cys Ala Arg Gly Ile Ser Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

            100                 105                 110

ggc acc ctg gtg acc gtc tcc agc gct agc acc aag ggc ccc agc gtg        384

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

        115                 120                 125

ttc ccc ctg gcc ccc agc agc aag agc acc agc ggc ggc aca gcc gcc        432

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

    130                 135                 140

ctg ggc tgc ctg gtg aag gac tac ttc ccc gag ccc gtg acc gtg agc        480

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145                 150                 155                 160

tgg aac agc ggc gcc ttg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccc gcc gtg        528

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

                165                 170                 175

ctg cag agc agc ggc ctg tac agc ctg agc agc gtg gtg acc gtg ccc        576

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

            180                 185                 190

agc agc agc ctg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aac cac aag        624

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

        195                 200                 205

ccc agc aac acc aag gtg gac aaa cgc gtg gag ccc aag agc tgc gac        672

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

    210                 215                 220

aag acc cac acc tgc ccc ccc tgc cct gcc ccc gag ctg ctg ggc gga        720

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225                 230                 235                 240

ccc tcc gtg ttc ctg ttc ccc ccc aag ccc aag gac acc ctc atg atc        768

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

                245                 250                 255

agc cgg acc ccc gag gtg acc tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gag        816

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

            260                 265                 270

gac ccc gag gtg aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cac        864

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

        275                 280                 285

aac gcc aag acc aag ccc cgg gag gag cag tac aac agc acc tac cgg        912

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

    290                 295                 300

gtg gtg agc gtg ctc acc gtg ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag        960

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305                 310                 315                 320

gag tac aag tgc aag gtg agc aac aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag       1008

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

                325                 330                 335

aag acc atc agc aag gcc aag ggc cag ccc cgg gag ccc cag gtg tac       1056

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

            340                 345                 350

acc ctg ccc ccc agc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtg tcc ctc       1104

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

        355                 360                 365

acc tgt ctg gtg aag ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg       1152

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

    370                 375                 380

gag agc aac ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc acc ccc cct gtg       1200

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385                 390                 395                 400

ctg gac agc gac ggc agc ttc ttc ctg tac agc aag ctc acc gtg gac       1248

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

                405                 410                 415

aag agc cgg tgg cag cag ggc aac gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac      1296

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

            420                 425                 430

gag gcc ctg cac aac cac tac acc cag aag agc ctg agc ctg agc ccc                        1344

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

        435                 440                 445

ggc aag                                                                                1350

Gly Lys

    450

<210>107

<211>450

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>IgG heavy chain of CR03-014

<400>107

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His

            20                  25                  30

Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala

    50                  55                  60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

                85                  90                  95

Tyr Cys Ala Arg Gly Ile Ser Pro Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

            100                 105                 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

        115                 120                 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

    130                 135                 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145                 150                 155                 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

                165                 170                 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

            180                 185                 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

        195                 200                 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

    210                 215                 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225                 230                 235                 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

                245                 250                 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

            260                 265                 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

        275                 280                 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

    290                 295                 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305                 310                 315                 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

                325                 330                 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

            340                 345                 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

        355                 360                 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

    370                 375                 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385                 390                 395                 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

                405                 410                 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

            420                 425                 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

        435                 440                 445

Gly Lys

    450

<210>108

<211>1347

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>IgG heavy chain of CR03-022

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1347)

<223>

<400>108

gag gtg cag ctg gtg cag tct gga aca gag gtg aaa aag ccg ggg gag         48

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1               5                   10                  15

tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac ggc ttt atc acc tac         96

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Ile Thr Tyr

            20                  25                  30

tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg        144

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

ggg atc atc tat cct ggt gac tct gaa acc aga tac agc ccg tcc ttc        192

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

    50                  55                  60

caa ggc cag gtc acc atc tca gcc gac aag tcc atc aac acc gcc tac        240

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc ata tat tac tgt        288

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

gcg ggg ggt tcg ggg att tct acc cct atg gac gtc tgg ggc cag ggc        336

Ala Gly Gly Ser Gly Ile Ser Thr Pro Met Asp Val Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

acc acc gtg acc gtc tcc agc gct agc acc aag ggc ccc agc gtg ttc        384

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

        115                 120                 125

ccc ctg gcc ccc agc agc aag agc acc agc ggc ggc aca gcc gcc ctg        432

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

    130                 135                 140

ggc tgc ctg gtg aag gac tac ttc ccc gag ccc gtg acc gtg agc tgg        480

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145                 150                 155                 160

aac agc ggc gcc ttg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccc gcc gtg ctg        528

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

                165                 170                 175

cag agc agc ggc ctg tac agc ctg agc agc gtg gtg acc gtg ccc agc        576

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

            180                 185                 190

agc agc ctg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aac cac aag ccc        624

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

        195                 200                 205

agc aac acc aag gtg gac aaa cgc gtg gag ccc aag agc tgc gac aag        672

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

    210                 215                 220

acc cac acc tgc ccc ccc tgc cct gcc ccc gag ctg ctg ggc gga ccc        720

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225                 230                 235                 240

tcc gtg ttc ctg ttc ccc ccc aag ccc aag gac acc ctc atg atc agc        768

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

                245                 250                 255

cgg acc ccc gag gtg acc tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gag gac        816

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

            260                 265                 270

ccc gag gtg aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cac aac        864

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

        275                 280                 285

gcc aag acc aag ccc cgg gag gag cag tac aac agc acc tac cgg gtg        912

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

    290                 295                 300

gtg agc gtg ctc acc gtg ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag        960

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305                 310                 315                 320

tac aag tgc aag gtg agc aac aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aag       1008

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

                325                 330                 335

acc atc agc aag gcc aag ggc cag ccc cgg gag ccc cag gtg tac acc       1056

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

            340                 345                 350

ctg ccc ccc agc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtg tcc ctc acc       1104

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

        355                 360                 365

tgt ctg gtg aag ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag       1152

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

    370                 375                 380

agc aac ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg       1200

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385                 390                 395                 400

gac agc gac ggc agc ttc ttc ctg tac agc aag ctc acc gtg gac aag       1248

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

                405                 410                 415

agc cgg tgg cag cag ggc aac gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag      1296

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

            420                 425                 430

gcc ctg cac aac cac tac acc cag aag agc ctg agc ctg agc ccc ggc      1344

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

        435                 440                 445

aag                                                                  1347

Lys

<210>109

<211>449

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>IgG heavy chain of CR03-022

<400>109

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1               5                   10                  15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Ile Thr Tyr

            20                  25                  30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

    50                  55                  60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Gly Gly Ser Gly Ile Ser Thr Pro Met Asp Val Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

        115                 120                 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

    130                 135                 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145                 150                 155                 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

                165                 170                 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

            180                 185                 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

        195                 200                 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

    210                 215                 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225                 230                 235                 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

                245                 250                 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

            260                 265                 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

        275                 280                 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

    290                 295                 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305                 310                 315                 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

                325                 330                 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

            340                 345                 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

        355                 360                 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

    370                 375                 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385                 390                 395                 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

                405                 410                 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

            420                 425                 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

        435                 440                 445

Lys

<210>110

<211>642

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>IgG light chain of CR03-014

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(642)

<223>

<400>110

gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga         48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agc tac         96

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc        144

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc        192

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct        240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac agt acc cct cca        288

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

                85                  90                  95

acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgg acc gtg gcc gct        336

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

            100                 105                 110

ccc agc gtg ttc atc ttc ccc ccc tcc gac gag cag ctg aag agc ggc        384

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

        115                 120                 125

acc gcc agc gtg gtg tgc ctg ctg aac aac ttc tac ccc cgg gag gcc        432

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

    130                 135                 140

aag gtg cag tgg aag gtg gac aac gcc ctg cag agc ggc aac agc cag        480

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145                 150                 155                 160

gag agc gtg acc gag cag gac agc aag gac tcc acc tac agc ctg agc        528

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

                165                 170                 175

agc acc ctc acc ctg agc aag gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac        576

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

            180                 185                 190

gcc tgc gag gtg acc cac cag ggc ctg agc agc ccc gtg acc aag agc   624

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

        195                 200                 205

ttc aac cgg ggc gag tgt                                           642

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

    210

<210>111

<211>214

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>IgG light chain of CR03-014

<400>111

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

            100                 105                 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

        115                 120                 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

    130                 135                 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145                 150                 155                 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

                165                 170                 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

            180                 185                 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

        195                 200                 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

    210

<210>112

<211>660

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>IgG light chain of CR03-022

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(660)

<223>

<400>112

gac atc gtg atg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc         48

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agc cag agt gtt tta tac agc         96

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

             20                 25                  30

tcc atc aat aag aac tac tta gct tgg rac cag cag aaa cca gga cag        144

Ser Ile Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

        35                  40                  45

cct cct aag ctg ctc att tac tgg gca tct acc cgg gaa tcc ggg gtc        192

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

    50                  55                  60

cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc        240

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65                  70                  75                  80

atc agc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag caa        288

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

                85                  90                  95

tat tat agt act ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag gtg gag atc        336

Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

            100                 105                 110

aag cgg acc gtg gcc gct ccc agc gtg ttc atc ttc ccc ccc tcc gac        384

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

        115                 120                 125

gag cag ctg aag agc ggc acc gcc agc gtg gtg tgc ctg ctg aac aac        432

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

    130                 135                 140

ttc tac ccc cgg gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac aac gcc ctg        480

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145                 150                 155                 160

cag agc ggc aac agc cag gag agc gtg acc gag cag gac agc aag gac        528

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

                165                 170                 175

tcc acc tac agc ctg agc agc acc ctc acc ctg agc aag gcc gac tac        576

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

            180                 185                 190

gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag ggc ctg agc        624

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

        195                 200                 205

agc ccc gtg acc aag agc ttc aac cgg ggc gag tgt                        660

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

    210                 215                 220

<210>113

<211>220

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>IgG light chain of CR03-022

<400>113

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

            20                  25                  30

Ser Ile Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

        35                  40                  45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

    50                  55                  60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65                  70                  75                  80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

                85                  90                  95

Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

            100                 105                 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

        115                 120                 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

    130                 135                 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145                 150                 155                 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

                165                 170                 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

            180                 185                 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

        195                 200                 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

    210                 215                 220

<210>114

<211>3789

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>S protein of SARS-CoV strain Frankfurt 1

<220>

<221>CDS

<222>(10)..(3777)

<223>

<400>114

ggtaccgcc atg ttc atc ttc ctg ctg ttc ctg acc ctg acc agc ggc agc       51

          Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser

          1               5                   10

gat ctg gat agg tgc acc acc ttc gac gac gtg cag gcc cct aat tac         99

Asp Leu Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr

15                  20                  25                  30

acc cag cac acc agc tct atg cgg ggc gtg tac tac ccc gac gag atc        147

Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile

                35                  40                  45

ttc aga agc gac acc ctg tac ctg aca cag gac ctg ttc ctg ccc ttc        195

Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe

            50                  55                  60

tac agc aac gtg acc ggc ttc cac acc atc aac cac acc ttc ggc aac        243

Tyr Ser Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn

        65                  70                  75

ccc gtg atc cct ttc aag gac ggc atc tac ttc gcc gcc acc gag aag        291

Pro Val Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys

    80                  85                  90

agc aat gtg gtg cgg ggc tgg gtg ttc ggc agc acc atg aac aac aag        339

Ser Asn Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys

95                  100                 105                 110

agc cag agc gtg atc atc atc aac aat agc acc aac gtg gtg atc agg        387

Ser Gln Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg

                115                 120                 125

gcc tgc aac ttc gag ctg tgc gac aac cct ttc ttc gcc gtg tcc aaa        435

Ala Cys Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys

            130                 135                 140

cct atg ggc acc cag acc cac acc atg atc ttc gac aac gcc ttc aac        483

Pro Met Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn

        145                 150                 155

tgc acc ttc gag tac atc agc gac gcc ttc agc ctg gat gtg agc gag        531

Cys Thr Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu

    160                 165                 170

aag agc ggg aac ttc aag cac ctg cgg gag ttc gtg ttc aag aac aag        579

Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys

175                 180                 185                 190

gac ggc ttc ctg tac gtg tac aag ggc tac cag ccc atc gac gtg gtg        627

Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val

                195                 200                 205

aga gat ctg ccc agc ggc ttc aac acc ctg aag ccc atc ttc aag ctg        675

Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu

            210                 215                 220

ccc ctg ggc atc aac atc acc aac ttc cgg gcc atc ctg acc gcc ttc        723

Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe

        225                 230                 235

agc cct gcc cag gac atc tgg ggc acc agc gcc gct gcc tac ttc gtg        771

Ser Pro Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val

    240                 245                 250

ggc tac ctg aag ccc acc acc ttc atg ctg aag tac gac gag aac ggc        819

Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly

255                 260                 265                 270

acc atc acc gat gcc gtg gac tgc agc cag aac ccc ctg gcc gag ctg        867

Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu

                275                 280                 285

aag tgc agc gtg aag agc ttc gag atc gac aag ggc atc tac cag acc        915

Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr

            290                 295                 300

agc aac ttc aga gtg gtg ccc agc ggc gat gtg gtg agg ttc ccc aac        963

Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn

        305                 310                 315

atc acc aac ctg tgc cct ttc ggc gag gtg ttc aac gcc acc aag ttc       1011

Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe

    320                 325                 330

cct agc gtg tac gcc tgg gag cgg aag aag atc agc aac tgc gtg gcc       1059

Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala

335                 340                 345                 350

gat tac agc gtg ctg tac aac agc acc ttc ttc agc acc ttc aag tgc       1107

Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys

                355                 360                 365

tac ggc gtg agc gcc acc aag ctg aac gac ctg tgc ttc agc aac gtg       1155

Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val

            370                 375                 380

tac gcc gac agc ttc gtg gtg aag ggc gac gac gtg aga cag atc gcc       1203

Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala

        385                 390                 395

cct ggc cag acc ggc gtg atc gcc gac tac aat tac aag ctg ccc gac       1251

Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp

    400                 405                 410

gac ttc atg ggc tgc gtg ctg gcc tgg aac acc aga aac atc gac gcc       1299

Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala

415                 420                 425                 430

acc tcc acc ggc aac tac aac tac aag tac cgc tac ctg agg cac ggc       1347

Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly

                435                 440                 445

aag ctg aga ccc ttc gag cgg gac atc agc aac gtg ccc ttc agc cct       1395

Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Set Asn Val Pro Phe Set Pro

            450                 455                 460

gac ggc aag ccc tgc acc ccc cct gcc ctg aac tgc tac tgg ccc ctg       1443

Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu

        465                 470                 475

aac gac tac ggc ttc tac acc acc acc ggc atc ggc tac cag cct tac       1491

Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr

    480                 485                 490

aga gtg gtg gtg ctg agc ttc gag ctg ctg aac gcc cct gcc acc gtg       1539

Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val

495                 500                 505                 510

tgc ggc ccc aag ctg agc acc gac ctg atc aag aac cag tgc gtg aac       1587

Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn

                515                 520                 525

ttc aac ttc aac ggc ctg acc ggc acc ggc gtg ctg acc cct agc agc       1635

Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser

            530                 535                 540

aag agg ttc cag ccc ttc cag cag ttc ggc agg gac gtg agc gat ttc      1683

Lys Arg Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe

        545                 550                 555

acc gac agc gtg agg gat cct aag acc agc gag atc ctg gac atc agc      1731

Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser

    560                 565                 570

cct tgc agc ttc ggc ggc gtg agc gtg atc acc ccc ggc acc aac gcc      1779

Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala

575                 580                 585                 590

agc tcc gag gtg gcc gtg ctg tac cag gac gtg aac tgc acc gac gtg      1827

Ser Ser Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val

                595                 600                 605

agc acc gcc atc cac gcc gac cag ctg acc ccc gcc tgg aga atc tac      1875

Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr

            610                 615                 620

agc acc ggc aac aac gtg ttc cag acc cag gcc ggc tgc ctg atc ggc      1923

Ser Thr Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly

        625                 630                 635

gcc gag cac gtg gac acc agc tac gag tgc gac atc ccc atc gga gcc      1971

Ala Glu His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala

    640                 645                 650

ggc atc tgc gcc agc tac cac acc gtg agc ctg ctg aga agc acc agc      2019

Gly Ile Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser

655                 660                 665                 670

cag aag agc atc gtg gcc tac acc atg agc ctg ggc gcc gac agc agc      2067

Gln Lys Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser

                675                 680                 685

atc gcc tac agc aac aac acc atc gcc atc ccc acc aac ttc agc atc      2115

Ile Ala Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile

            690                 695                 700

agc atc acc acc gag gtg atg ccc gtg agc atg gcc aag acc agc gtg      2163

Ser Ile Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val

        705                 710                 715

gac tgc aac atg tac atc tgc ggc gac agc acc gag tgc gcc aac ctg      2211

Asp Cys Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu

    720                 725                 730

ctg ctg cag tac ggc agc ttc tgc acc cag ctg aac aga gcc ctg agc      2259

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser

735                 740                 745                 750

ggc atc gcc gcc gag cag gac aga aac acc agg gag gtg ttc gcc cag      2307

Gly Ile Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln

                755                 760                 765

gtg aag cag atg tat aag acc ccc acc ctg aag tac ttc ggc ggc ttc      2355

Val Lys Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe

            770                 775                 780

aac ttc agc cag atc ctg ccc gat cct ctg aag ccc acc aag cgg agc      2403

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser

        785                 790                 795

ttc atc gag gac ctg ctg ttc aac aag gtg acc ctg gcc gac gcc ggc      2451

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

    800                 805                 810

ttt atg aag cag tac ggc gag tgc ctg ggc gat atc aac gcc agg gac      2499

Phe Met Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp

815                 820                 825                 830

ctg atc tgc gcc cag aag ttc aat ggc ctg acc gtg ctg ccc ccc ctg      2547

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

                835                 840                 845

ctg acc gac gac atg atc gcc gcc tac aca gcc gcc ctg gtg agc ggc      2595

Leu Thr Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly

            850                 855                 860

acc gcc acc gcc ggc tgg acc ttt ggc gcc gga gcc gcc ctg cag atc      2643

Thr Ala Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

        865                 870                 875

ccc ttc gcc atg cag atg gcc tac cgg ttc aat ggc atc ggc gtg acc      2691

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

    880                 885                 890

cag aac gtg ctg tac gag aac cag aag cag atc gcc aac cag ttc aac      2739

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn

895                 900                 905                 910

aag gcc atc agc cag atc cag gag agc ctg acc acc aca agc acc gcc      2787

Lys Ala Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala

                915                 920                 925

ctg ggc aag ctg cag gac gtg gtg aac cag aac gcc cag gcc ctg aat      2835

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

            930                 935                 940

acc ctg gtg aag cag ctg agc agc aac ttc ggc gcc atc agc tcc gtg      2883

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

        945                 950                 955

ctg aac gac atc ctg agc cgg ctg gac aag gtg gag gcc gag gtg cag      2931

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

    960                 965                 970

atc gac aga ctg atc acc ggc aga ctg cag agc ctg cag acc tac gtg      2979

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

975                 980                 985                 990

acc cag cag ctg atc aga gcc gcc gag atc aga gcc agc gcc aac ctg      3027

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu

                995                 1000                1005

gcc gcc acc aag atg agc gag tgc gtg ctg ggc cag agc aag aga          3072

Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg

            1010                1015                1020

gtg gac ttc tgc ggc aag ggc tac cac ctg atg agc ttc ccc cag          3117

Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln

            1025                1030                1035

gcc gct ccc cac ggc gtg gtg ttc ctg cac gtg acc tac gtg cct          3162

Ala Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro

            1040                1045                1050

agc cag gag agg aat ttc acc acc gcc cct gcc atc tgc cac gag          3207

Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu

            1055                1060                1065

ggc aag gcc tac ttc ccc aga gag ggc gtg ttc gtg ttc aat ggc          3252

Gly Lys Ala Tyr Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly

            1070                1075                1080

acc agc tgg ttc atc acc cag cgg aac ttc ttc agc ccc cag atc          3297

Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile

            1085                1090                1095

atc aca acc gac aac acc ttc gtg agc ggc aac tgc gac gtg gtg          3342

Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val

            1100                1105                1110

atc ggc atc att aac aat acc gtg tac gac ccc ctg cag ccc gag          3387

Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu

            1115                1120                1125

ctg gat agc ttc aag gag gag ctg gac aag tac ttc aag aac cac        3432

Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His

            1130                1135                1140

acc agc ccc gat gtg gac ttc ggc gac atc agc ggc atc aat gcc        3477

Thr Ser Pro Asp Val Asp Phe Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn  Ala

            1145                1150                1155

agc gtg gtg aac atc cag aag gag atc gac cgg ctg aac gag gtg        3522

Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val

            1160                1165                1170

gcc aag aac ctg aac gag agc ctg atc gac ctg cag gag ctg ggc        3567

Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly

            1175                1180                1185

aag tac gag cag tac atc aag tgg ccc tgg tac gtg tgg ctg ggc        3612

Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly

            1190                1195                1200

ttc atc gcc ggc ctg atc gcc atc gtg atg gtg acc atc ctg ctg        3657

Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu

            1205                1210                1215

tgc tgc atg acc agc tgc tgc tcc tgc ctg aag ggc gcc tgc agc        3702

Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser

            1220                1225                1230

tgt ggc agc tgc tgc aag ttc gac gag gac gat agc gag ccc gtg        3747

Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val

            1235                1240                1245

ctg aag ggc gtg aag ctg cac tac acc tga tgaattctcg ag              3789

Leu Lys Gly Val  Lys Leu His Tyr Thr

            1250                1255

<210>115

<211>1255

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>S protein of SARS-CoV strain Frankfurt 1

<400>115

Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu

1               5                   10                  15

Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln

            20                  25                  30

His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg

        35                  40                  45

Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser

    50                  55                  60

Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val

65                  70                  75                  80

Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn

                85                  90                  95

Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln

            100                 105                 110

Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys

        115                 120                 125

Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met

    130                 135                 140

Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr

145                 150                 155                 160

Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser

                165                 170                 175

Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly

            180                 185                 190

Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp

        195                 200                 205

Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu

    210                 215                 220

Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro

225                 230                 235                 240

Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr

                245                 250                 255

Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile

            260                 265                 270

Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys

        275                 280                 285

Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn

    290                 295                 300

Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr

305                 310                 315                 320

Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser

                325                 330                 335

Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr

            340                 345                 350

Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly

        355                 360                 365

Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala

    370                 375                 380

Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly

385                 390                 395                 400

Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe

                405                 410                 415

Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser

            420                 425                 430

Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu

        435                 440                 445

Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly

    450                 455                 460

Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp

465                 470                 475                 480

Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

                485                 490                 495

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

            500                 505                 510

Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn

        515                 520                 525

Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg

    530                 535                 540

Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp

545                 550                 555                 560

Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys

                565                 570                 575

Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser

            580                 585                 590

Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr

        595                 600                 605

Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr

    610                 615                 620

Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu

625                 630                 635                 640

His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile

                645                 650                 655

Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys

            660                 665                 670

Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala

        675                 680                 685

Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile

    690                 695                 700

Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys

705                 710                715                  720

Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu

                725                 730                 735

Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile

            740                 745                 750

Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys

        755                 760                 765

Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe

    770                 775                 780

Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile

785                 790                 795                 800

Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met

                805                 810                 815

Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile

            820                 825                 830

Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr

        835                 840                 845

Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala

    850                 855                 860

Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe

865                 870                 875                 880

Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn

                885                 890                 895

Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala

            900                 905                 910

Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly

        915                 920                 925

Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu

    930                 935                 940

Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn

945                 950                 955                 960

Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp

                965                 970                 975

Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln

            980                 985                 990

Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala

        995                 1000                1005

Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp

    1010                1015                1020

Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ala Ala

    1025                1030                1035

Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln

    1040                1045                1050

Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Glu Gly Lys

    1055                1060                1065

Ala Tyr Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Phe AsnGly Thr Ser

    1070                1075                1080

Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr

    1085                1090                1095

Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly

    1100                1105                1110

Ile Ile Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp

    1115                1120                1125

Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser

    1130                1135                1140

Pro Asp Val Asp Phe Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val

    1145                1150                1155

Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys

    1160                1165                1170

Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr

    1175                1180                1185

Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe Ile

    1190                1195                1200

Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu Cys Cys

    1205                1210                1215

Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys Gly

    1220                1225                1230

Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys

    1235                1240                1245

Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

    1250                1255

<210>116

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer EcoRIspikeFor318

<400>116

cctggaattc tccatggcca acatcaccaa cc                                    32

<210>117

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Primer XbaIspikeRev510

<400>117

gaagggccct ctagacacgg tggcagg                                          27

<210>118

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Region of S protein

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(21)

<223>

<400>118

cct ttc tcc cct gat ggc aaa                                                         21

Pro Phe Ser Pro Asp Gly Lys

1               5

<210>119

<211>7

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Region of S protein

<400>119

Pro Phe Ser Pro Asp Gly Lys

1               5

<210>120

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Region of S protein

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(21)

<223>

<400>120

cct ttc tcc ctt gat ggc aaa                                                         21

Pro Phe Ser Leu Asp Gly Lys

1               5

<210>121

<211>7

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Region of S protein

<400>121

Pro Phe Ser Leu Asp Gly Lys

1                       5

<210>122

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>forward primer Actin-LF

<400>122

cccaaggcca accgcgagaa gat                                                           23

<210>123

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>reverse primer Actin-LR

<400>123

gtcccggcca gccaggtcca g                                                             21

<210>124

<211>17

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>forward primer coro3

<400>124

tacacacctc agcgttg                                                                  17

<210>125

<211>16

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>reverse primer coro4

<400>125

cacgaacgtg acgaat                                                                   16

<210>126

<211>20

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Peptide

<400>126

Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His

1               5                   10                  15

Gly Lys Leu Arg

            20

<210>127

<211>20

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Peptide

<400>127

Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu

1               5                   10                  15

Ser Phe Glu Leu

            20

<210>128

<211>11

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Peptide

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>X can be any amino acid

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X can be any amino acid

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X can be any amino acid

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>X can be any amino acid

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X can be any amino acid

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>X can be any amino acid

<400>128

Thr Xaa Thr Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Arg

1               5                   10

<210>129

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>LCDR3 of SC03-014

<400>129

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr

1               5

<210>130

<211>5

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>HCDR1 of SC03-014

<400>130

Asp His Tyr Met Asp

1               5

<210>131

<211>19

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>HCDR2 of SC03-014

<400>131

Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser

1               5                       10              15

Val Lys Gly

<210>132

<211>11

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>LCDR1 of SC03-014

<400>132

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1               5                   10

<210>133

<211>7

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>LCDR2 of SC03-014

<400>133

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1               5

<210>134

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>LCDR3 of SC03-022

<400>134

Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr

1               5

<210>135

<211>5

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>HCDR1 of SC03-022

<400>135

Thr Tyr Trp Ile Gly

1               5

<210>136

<211>17

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>HCDR2 of SC03-022

<400>136

Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

1               5                   10                  15

Gly

<210>137

<211>17

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>LCDR1 of SC03-022

<400>137

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Ile Asn Lys Asn Tyr Leu

1               5                   10                  15

Ala

<210>138

<211>7

<212>PRT

<213>Artificial sequence

<220>

<223>LCDR2 of SC03-022

<400>138

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1               5

关于微生物保藏的说明

(PCT细则13之二)

A.对说明书第23页，第19-22行所述的微生物的说明。
		B.保藏事项                                其它保藏在补充页中□
保藏单位名称欧洲动物细胞保藏中心
		保藏单位地址(包括邮政编码和国名)英国威尔特郡
保藏日期1996年2月29日	保藏编号ECACC 96022940
		C.补充说明(必要时)                              本栏有补充页□
		D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)
		E.补充说明(必要时)

PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重印)

Claims (13)

1.一种包含至少两种免疫球蛋白的组合物，特征在于所述免疫球蛋白能特异性结合SARS-CoV并具有SARS-CoV中和活性，该组合物的中和活性高于每种免疫球蛋白单独的中和活性的总和。

2.权利要求1的组合物，特征在于所述免疫球蛋白能与SARS-CoV的不同的、非竞争性表位反应。

3.权利要求1或2的组合物，特征在于所述免疫球蛋白能与SARS-CoV的S蛋白的不同的、非竞争性表位反应。

4.权利要求1-3任一项的组合物，特征在于所述免疫球蛋白能与SARS-CoV的S蛋白的第318-510位氨基酸的不同的、非竞争性表位反应。

5.权利要求1-4任一项的组合物，特征在于至少一种免疫球蛋白与包含SEQ ID NO：128所示氨基酸序列的表位反应。

6.权利要求1-5任一项的组合物，特征在于至少一种免疫球蛋白能与人和动物SARS-CoV的S蛋白的第318-510位氨基酸反应。

7.权利要求1-6任一项的组合物，特征在于至少一种免疫球蛋白能与其中第479位氨基酸是除了天冬酰胺之外的氨基酸的SARS-CoV的S蛋白的第318-510位氨基酸反应，反应程度和其与其中第479位氨基酸是天冬酰胺的SARS-CoV的S蛋白的第318-510位氨基酸的反应程度相似。8.权利要求1-7任一项的组合物，特征在于每种免疫球蛋白均能中和多种SARS-CoV毒株。

9.权利要求1-8任一项的组合物，特征在于两种免疫球蛋白的摩尔比率为1∶100至100∶1。

10.权利要求1-9任一项的组合物，特征在于第一种免疫球蛋白至少包含具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的重链CDR3区，第二种免疫球蛋白至少包含具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的重链CDR3区。

11.一种包含权利要求1-10任一项的组合物的药物组合物，所述药物组合物进一步包含一种药物学可接受的赋形剂。

12.用作药物的权利要求11的药物组合物。

13.权利要求11的药物组合物用于诊断、预防、治疗SARS-CoV所致疾病。

14.权利要求11的药物组合物在制备诊断、预防、治疗SARS-CoV所致疾病的药物中的应用。

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