CN1465589A - 基因重组萨斯病毒（SARS Virus）外壳S蛋白及其制造工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用基因工程生产一种病毒外壳蛋白，即萨斯病毒(SARS Virus)外壳S蛋白(Spike Membrane Protein，简称Spike Protein，S或E2)的新工艺。鉴定出刺激人体产生保护性抗体的主要抗原外壳S蛋白，依照外壳S蛋白的基因序列，构建原核表达载体，转化大肠杆菌，表达两种外壳S蛋白的多肽，分子量分别约为90000与22000。通过一系列层析方法，纯化获得了上述两种蛋白，并利用重组两种外壳S蛋白的多肽免疫家兔，获得特异性抗体。本发明为临床上预防、诊断和治疗萨斯病毒的感染提供了工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因重组萨斯病毒(SARS Virus)外壳S蛋白及其制造工艺。
背景技术
萨斯病毒(SARS Virus)是一种变异的可以感染人的冠状病毒(HumanCoronavirus)，能引起人呼吸系统的急性炎症，严重时甚至导致死亡。冠状病毒是一种单链RNA病毒，感染的宿主包括鸟类、鸡、猪等，也包括人类，人类感染后表现感冒症状，一般能自愈。但目前它的一种变种萨斯病毒感染人体后有很强的传染性，而且大多患者表现为呼吸系统急性炎症，严重的发生急性呼吸衰竭并死亡。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是通过分子识别的原理，应用人体产生针对萨斯病毒的特异性抗体能鉴定相关抗原的这一特性，鉴定出萨斯病毒的外壳S蛋白是一种能刺激人体产生保护性抗体的主要抗原。在此基础上，利用基因工程的原理，制备出重组外壳S蛋白。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基因重组萨斯病毒(SARS Virus)外壳S蛋白，其组成为图2所列的的基因序列及图3所列的氨基酸序列的蛋白质。
基因重组萨斯病毒外壳S蛋白的制造工艺如下：
a、利用原核细胞生产外壳S蛋白或它的片段；
b、利用外壳S蛋白生产多克隆和单克隆抗体，嵌合抗体或人源化抗体。
所述的原核细胞为大肠杆菌。
所述的利用原核细胞生产外壳S蛋白或它的片段包括以下步骤：
a、十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析分离的病毒外壳S蛋白各种组分，然后电转移到膜上，利用病愈患者的血清孵育已用牛血清白蛋白封闭的膜，再根据常规Western Blot方法，主要显色带为分子量150 000的蛋白质，在此基础上，在SDS-PAGE上，切下150 000这一条带，并测定15个N-端氨基酸序列，利用蛋白质同源序列分析，为萨斯病毒外壳S蛋白；
b、根据萨斯病毒外壳S蛋白的基因序列及氨基酸序列设计PCR引物进行PCR扩增，获得表达萨斯病毒的外壳S蛋白的基因片断，通过NdeI和XhoI双酶切位点，克隆到原核表达载体pET-22b(+)中，构建表达载体pET22-SP1与pET22b-SP2，并转化大肠杆菌成为工程菌；
c、重组外壳S蛋白的纯化：诱导后的工程菌，经超破菌后离心取上清，再经过离子交换层析及除菌、浓缩和冻干方法。
所述的离子交换层析包括DEAE离子交换层析、SP离子交换层析和Q离子交换层析。
所述的利用外壳S蛋白生产多克隆、单克隆抗体，嵌合抗体或人源化抗体包括：利用纯化的重组外壳S蛋白免家兔疫三次，获得特异性的兔抗重组外壳S蛋白，双扩结果显示，稀释度为1∶16，Western Blot方法证明该抗体能识别重组萨斯病毒外壳S蛋白和天然萨斯病毒外壳S蛋白，并纯化该抗体。
所述的外壳S蛋白用于鉴定人萨斯病毒抗原物质。
本发明的有益效果是：
1、根据抗原抗体能特意性识别这一原理，鉴定出萨斯病毒外壳S蛋白为一能刺激人体产生保护性抗体的抗原，为进一步研发疫苗和抗体治疗由萨斯病毒的感染疾病打下了基础。
2、根据萨斯病毒的外壳S蛋白基因片段，建立一系列的表达外壳S蛋白工程菌，表达产生重组的外壳S蛋白及其变异物，为研究外壳S蛋白的结构与功能的研究提供了工具。
3、蛋白及突变蛋白可作为药物组合物的重要成分，用于相关病毒感染的治疗。
4、外壳S蛋白及其抗体可作为预防及治疗萨斯病毒的药物。
外壳S蛋白及其抗体可作为寻找外壳S蛋白受体的重要工具，这可通过目前常规的受体鉴别方法来进行。
附图说明
图1是Western Blot方法鉴定萨斯病毒刺激人体产生抗体的抗原物质。
图2是萨斯病毒(SARS)的外壳S蛋白(Spike protein)的基因序列。
图3是萨斯病毒外壳S蛋白(Spike protein)的氨基酸序列。
图4是pET22b-SP重组质粒的构建过程。
图5是PCR扩增外壳S蛋白基因片断谱图。
图6是外壳S蛋白表达产物的SDS-PAGE(12％)图谱。
图7是纯化后重组外壳S蛋白SDS-PAGE(12％)电泳图谱。
图中，A：基因标记；B、C：S蛋白基因；D：诱导前菌体蛋白；E、F：诱导后菌体蛋白；G、H：纯化后的S蛋白；I、J：纯化后的S蛋白片段。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明并不限于下述实施例：实施例1外壳S蛋白在大肠杆菌细胞中的表达外壳S蛋白的制备
根据编码外壳S蛋白的基因序列，经计算机分析，设计、合成了两对PCR引物(A2：5’TAA AAA CAT ATG AGT GAC CTT GAC CGG TGC 3’，B1AGC ATC AGC GAG TGT CACC GTC CAT TGA)(A2：5’TAA AAA CAT ATG AGTGAC CTT GAC CGG TGC 3’，B2：5’TAA TAA CTC GAG TCA TTA AAA ACC AGAAGG TAG ATC ACG3’)，分别用于扩增不同的外壳S蛋白基因片段，含有用于克隆的限制性内切酶识别位点，扩增出的片段大小分别为2400bp、600bp。扩增出的片段大小分别为2400bp、600bp。在这两对引物的5’-端和3’-端分别引入NdeI和XhoI酶切位点。用高保真的PfμDNA聚合酶扩增。PCR扩增程序为：94℃ 5min：94℃ 45s，65℃ 1.5min，72℃ 3min：最后72℃延伸10min，共30个循环。表达载体的构建
pET-22b质粒购自Novagen公司。PCR产物及pET22b载体分别用NdeI/XhoI双酶切，DE-81滤纸回收纯化相应的条带，将插入的片段和质粒载体按常规方法连接和转化。阳性克隆用NdeI/XhoI双酶切鉴定，同时测序确定，正确的克隆用于表达。pET22b-SP重组质粒的构建过程见图4。如图5所示，利用Pfu酶扩增外壳S蛋白壳外的基因片段分别为2400bp和600bp两个片段。重组的质粒经NdeI/XhoI双酶切鉴定含有预期大小的片段，将阳性克隆进行序列分析。测定结果表明正确。根据图3的氨基酸序列推测2400bp、600bp分别为分子量90000和22000的蛋白，见图6。重组外壳S蛋白的表达及DS-PAGE检测
在3ml含氨苄青霉素的LB培养基中接种一种阳性单菌落，37℃震荡培养过夜后，接种30μl于3ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养3h后，加IPTG至终浓度为1mmol/L，IPTG诱导6h后收获1ml菌液，离心加入50μl 2XSDS上样buffer，100℃煮沸10min。取5μl上样，8％SDS-PAGE检测表达蛋白，考马斯亮蓝染色。用LKB公司UltroScanXL激光光密度扫描仪扫描重组蛋白的表达量。实验证明了重组质粒pET22-SP占菌体总蛋白的10％-15％，表达量可达到80mg/L培养液。2400bp、600bp片段分别表达出90Kd、22Kd的外壳S蛋白及片段，见图7，表达的目的蛋白分别占细菌总蛋白的10％和25％。
纯化方法包括：诱导后的工程菌，经超破菌后离心取上清，再经过离子交换层析及常规除菌、浓缩和冻干方法。实施例2萨斯病毒外壳S蛋白多克隆抗体的制备
选择优质的大耳白兔子4-6只，适应性喂养、观察无病一个星期。常规用卡介苗进行基础免疫兔子。一定量的抗原SDS-PAGE，用考马斯亮蓝染色(或250MmKCl染色)，将目的带切下，用液氮在研钵中将胶磨碎，将胶与佐剂(1∶1)混合，继续研磨成糊状，免疫家兔。时间为基础免疫一星期后，1-2mg抗原/只。制备的胶为1mg抗原/lg胶。
两周(或三周)后加强免疫：1～2mg抗原/只。
一周后加强免疫：1～2mg抗原/只。可用双扩法检测有无抗体产生。
一周后进行第三次加强免疫：1～2mg抗原/只。
1～2周后，取家兔耳缘静脉血，用琼脂双扩散法检测抗外壳S蛋白抗体。用ELISA法测定抗体效价。血清中目的抗体为阳性后，大量抽取兔血，收集的血液37℃放置1～2小时，4℃过夜，再无菌的条件下，离心收集血清，分装(0.2ml)，储存于-70℃。实施例3 萨斯病毒组成蛋白作为刺激人体产生抗体的抗原物质鉴定方法
利用基因工程方法生产的或天然的萨斯病毒外壳蛋白包括外壳S蛋白、或M蛋白、N蛋白及其他蛋白先做十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析分离的病毒外壳S蛋白各种组分，然后转移到膜上，利用病愈患者的血清孵育已用牛血清白蛋白封闭的膜，再根据常规WesternBlot方法，如图1所示，找出阳性显色带，该蛋白即为能刺激人体产生抗体的抗原。本实施例还包括利用常规的免疫共沉淀方法鉴定抗原的方法。
Claims (7)
1、一种基因重组萨斯病毒(SARS Virus)外壳S蛋白，其特征在于：其组成为图2所列的的基因序列及图3所列的氨基酸序列的蛋白质。
2、根据权利要求1所述的基因重组萨斯病毒外壳S蛋白的制造工艺，其特征在于制造工艺包括：
a、利用原核细胞生产外壳S蛋白或它的片段；
b、利用外壳S蛋白生产多克隆、单克隆抗体，嵌合抗体或人源化抗体。
3、根据权利要求2所述的基因重组萨斯病毒外壳S蛋白的制造工艺，其特征在于所述的原核细胞为大肠杆菌。
4、根据权利要求3所述的基因重组萨斯病毒外壳S蛋白的制造工艺，其特征在于所述的利用原核细胞生产外壳S蛋白或它的片段包括以下步骤：
a、十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析分离的病毒外壳S蛋白各种组分，然后电转移到膜上，利用病愈患者的血清孵育已用牛血清白蛋白封闭的膜，再根据常规Western Blot方法，主要显色带为分子量150 000的蛋白质，在此基础上，在SDS-PAGE上，切下150 000这一条带，并测定15个N-端氨基酸序列，利用蛋白质同源序列分析，为萨斯病毒外壳S蛋白；
b、根据萨斯病毒外壳S蛋白的基因序列及氨基酸序列设计PCR引物进行PCR扩增，获得表达萨斯病毒的外壳S蛋白的基因片断，通过NdeI和XhoI双酶切位点，克隆到原核表达载体pET-22b(+)中，构建表达载体pET22-SP1与pET22b-SP2，并转化大肠杆菌成为工程菌；
c、重组外壳S蛋白的纯化：诱导后的工程菌，经超破菌后离心取上清，再经过离子交换层析及除菌、浓缩和冻干方法。
5、根据权利要求4所述的基因重组萨斯病毒外壳S蛋白的制造工艺，其特征在于所述的离子交换层析包括DEAE离子交换层析、SP离子交换层析和Q离子交换层析。
6、根据权利要求3或4所述的基因重组萨斯病毒外壳S蛋白的制造工艺，其特征在于所述的利用外壳S蛋白生产多克隆、单克隆抗体，嵌合抗体或人源化抗体包括：利用纯化的重组外壳S蛋白免家兔疫三次，获得特异性的兔抗重组外壳S蛋白，双扩结果显示，稀释度为1∶16，WesternBlot方法证明该抗体能识别重组萨斯病毒外壳S蛋白和天然萨斯病毒外壳S蛋白，并纯化该抗体。
7、根据权利要求1所述的基因重组萨斯病毒外壳S蛋白，其特征在于所述的外壳S蛋白用于鉴定人萨斯病毒抗原物质。
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|---|---|---|---|---|
| WO2004085650A1 (en) * | 2003-03-24 | 2004-10-07 | The University Of Hong Kong | A high-troughput diagnostic assay for the human virus causing severe acute respiratory syndrome (sars) |
| CN100379869C (zh) * | 2004-08-09 | 2008-04-09 | 生宝生物科技股份有限公司 | 超抗原融合蛋白及其应用方法 |
| CN101102794B (zh) * | 2004-11-11 | 2012-04-25 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 抗sars-冠状病毒的组合物及其应用 |
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