KR101896124B1 - 항-인간 호흡기 세포융합 바이러스(ｒｓｖ) 항체 및 사용 방법 - Google Patents

항-인간 호흡기 세포융합 바이러스(ｒｓｖ) 항체 및 사용 방법 Download PDF

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KR101896124B1
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로버트 앤서니 윌리암슨
자한기르 와디아
자한기르 와디아
가브리엘 파스쿠알
엘리사 키오
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Abstract

호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 융합(F) 단백질에 면역특이적으로 결합하는 항체들 또는 그의 항원들이 본 발명에서 제공된다. 또한 바이러스 감염의 예방, 치료 및 진단 및/또는 RSV-매개 질환의 하나 이상의 증상의 치료를 위한 방법을 제공한다. 또한 RSV F 단백질에 면역특이적으로 결합하는 항체들을 생성하는 방법이 제공된다.

Description

항-인간 호흡기 세포융합 바이러스(ＲＳＶ) 항체 및 사용 방법 {ANTI-HUMAN RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS(RSV) ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
관련 출원
2010년 7월 9일자로 출원된 미국 가출원번호 61/399,310호, 발명의 명칭 "ANTIBODIES AGAINST HUMAN RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS(RSV) AND METHODS OF USE", Robert Anthony Williamson, Jehangir Wadia, Gabriel Pascual, Elissa Keogh 및 2010년 11월 5일자로 출원된 미국 가출원번호 61/456,454호, 발명의 명칭 "ANTI-HUMAN RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS (RSV) ANTIBODIES AND METHODS OF USE", Robert Anthony Williamson, Jehangir Wadia, Gabriel Pascual and Elissa Keogh에 대하여 우선권의 이익을 주장한다. 상기 출원들 각각의 대상(subject matter)은 그 전체로 참조로써 포함된다.
본 출원은 2010년 8월 13일자로 출원된 미국 출원번호 12/806,498, 공개 US-2011-0076268 A1호, 발명의 명칭 "ANTIBODIES AGAINST HUMAN RESPIRATORY SYNCTIAL VIRUS (RSV) AND METHODS OF USE" 및 2010년 8월 13일자로 출원된 국제출원번호 PCT/US10/045549, 공개번호 WO 2011/020079 및 발명의 명칭 "ANTIBODIES AGAINST HUMAN RESPIRATORY SYNCTIAL VIRUS (RSV) AND METHODS OF USE"와 관련이 있고, 둘 다는 2009년 8월 13일자로 출원된 미국 가출원번호 61/274,395, 발명의 명칭"ANTIBODIES AGAINST HUMAN RESPIRATORY SYNCTIAL VIRUS (RSV) AND METHODS OF USE"를 우선권으로 주장한다.
상기 출원들 각각의 대상은 그 전체로 참조로서 포함된다.
전자적으로 제공된 서열목록의 참조에 의한 포함
서열목록의 전자 버전이 본원과 함께 제출되며, 이의 내용은 그 전체로 참조로써 포함된다. 상기 전자 파일은 458 킬로바이트 크기이며, 1161seq.PC1.txt.라 명명하였다.
기술 분야
호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 F 단백질 및/또는 RSV에 면역특이적으로 결합하거나/하고, RSV를 중화하는 항체들 및 그의 항원-결합 단편들(fragments) 제공된다. 또한, 항-RSV 항체들 및 그의 항원-결합 단편들을 사용하는 진단 및 치료 방법들이 제공된다. 상기 치료방법들은 RSV 감염의 예방 또는 치료 및/또는 RSV 감염의 하나 이상의 증상들, 예를 들면, 유아 감염 및 장기 이식과 관련된 감염의 개선을 위하여 상기 제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에서 제공된 다수의 상이한 항-RSV 항체들 및 그의 항원-결합 단편들 및/또는 다른 항-RSV 항체들 및 그의 항원-결합 단편들과의 조합이 병용 치료를 위하여 사용될 수 있다. 항-RSV 항체들 및 그의 항원-결합 단편들의 혼합물을 포함하는 조성물이 또한 제공된다.
호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 유아 및 영아의 중증 호흡기 질환의 중요한 원인이며, 유아 모세기관지염의 주된 원인이다(Welliver (2003) J Pediatr 143:S112). 대략 전세계 6천4백만 호흡기 질환의 경우들 및 160,000 사망이 RSV 유도 질환에 기인한다. 미국에서만, 수 만 명의 유아 입원이 파라믹소바이러스들(paramyxoviruses), 예를 들면, RSV 및 파라인플루엔자 바이러스(PIV)에 의한 감염에 기인한다(Shay 등 (1999) JAMA 282:1440-1446). 중증 RSV 감염은 어린이 및 유아, 특히 미성숙 유아에서 대부분 종종 발생한다. 근본적인 건강 문제, 예를 들면, 만성 폐질환 또는 선천성 심장병은 중병의 위험을 심각하게 증가시킬 수 있다. RSV 감염은 또한 노인, 만성 폐질환을 갖는 개인 및 면역약화된 성인, 예를 들면 골수 이식 수혜자에게 중병을 야기할 수 있다.
백신 개발, 항바이러스성 화합물(리바비린)들, 안티센스 약제들, RNA 간섭 기술, 및 항체 생성물들, 예를 들면 면역글로불린 또는 정맥주입(intravenous) 단일클론 항체들을 포함한, RSV 감염의 예방 및 치료에 대한 여러 접근들이 조사하였다.공여자(donor)로부터 단리된 정맥주입 면역글로불린(RSV-IGIV; RespiGam®) 및 단일클론 항체, 팔리비주맙(SYNAGISTM)이 고위험 어린이의 RSV 예방용으로 승인하였다. 그러나, RSV용 백신 또는 상업상 사용이능한 치료제는 아직 사용이능하지 않다. 오직 리바비린만이 RSV 감염의 치료용으로 승인하였다. RSV 감염의 치료에 효과적이기 위하여는, 낮은 특이성 때문에 RSV-IG 및 팔리비주맙과 같은 항체 생성물의 고 용량(dose), 빈번한 투여 및/또는 큰 부피가 요구된다. 또한, 정맥주입 면역글로불린과 같은 제품의 사용은 공여자 효능(donor availability)에 좌우된다. 따라서, RSV 감염의 예방 또는 치료를 위한 추가의 약제에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염 및 RSV-매개 질환 또는 병태의 예방 또는 치료를 위한, 단리된 폴리펩티드들, 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 제공한다. 또한, 본 발명은 RSV 감염의 진단 또는 모니터용, 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편들을 제공한다. 본 발명은 RSV에 면역특이적으로 결합하여 중화시키는 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 몇몇 예에서, 상기 본 발명에서 제공되는 폴리펩티드는, 상기 폴리펩티드가 항체 또는 항원-결합 단편 내에 포함되어 있을 때, RSV에 면역특이적으로 결합하여 중화시킨다. 또한, 항체 또는 항원-결합 단편이 RSV에 면역특이적으로 결합하여 중화시키는 경우, 본 발명에서 제공되는 폴리펩티드를 포함하는 항체 및 항원-결합 단편들이 제공된다. 본 발명에서 제공되는 폴리펩티드, 항체 및 항원-결합 단편들은 F 단백질에 특이적으로 결합할 뿐 아니라 RSV를 중화할 수 있다. 본 발명은 RSV 서브타입 (subtype) A 및 B를 중화시킬 수 있는, 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 항원-결합 단편들을 제공한. 본 발명은 RSV의 F 단백질에 면역특이적으로 결합하는, 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 항원-결합 단편들을 제공한다.
본 발명은 SEQ ID NOS: 405, 411, 417, 423, 429, 437-441, 458, 464, 470 또는 482-484에 기재된 아미노산 잔기의 서열 또는 SEQ ID NOS: 405, 411, 417, 423, 429, 437-441, 458, 464, 470 또는 482-484와 적어도 또는 적어도 약 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 갖는 VH CDR1; SEQ ID NOS: 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 또는 471에 기재된 아미노산 잔기의 서열 또는 SEQ ID NOS: 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 또는 471와 적어도 또는 적어도 약 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 갖는 VH CDR2; SEQ ID NOS: 407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 또는 472에 기재된 아미노산 잔기의 서열 또는 SEQ ID NOS: 407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 또는 472와 적어도 또는 적어도 약 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상이 서열 동일성을 갖는 아미노산을 갖는 서열을 갖는 VH CDR3; SEQ ID NOS: 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 또는 473에 기재된 아미노산 잔기의 서열 또는 SEQ ID NOS: 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 또는 473와 적어도 또는 적어도 약 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 갖는 VL CDR1; SEQ ID NOS: 409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 또는 474에 기재된 아미노산 잔기의 서열 또는 SEQ ID NOS: 409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 또는 474와 적어도 또는 적어도 약 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 갖는 VL CDR2; 및 SEQ ID NOS: 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 또는 475에 기재된 아미노산 잔기의 서열 또는 SEQ ID NOS: 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 또는 475와 적어도 또는 적어도 약 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상 서열 동일성을 갖는 아미노산의 서열을 갖는 VL CDR3을 함유하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 융합 (F) 단백질에 면역특이적으로 결합하고 및/또는 RSV를 중화시킨다.
특히, 본 발명은 SEQ ID NO:405 또는 437에 기재된 VHCDR1, SEQ ID NO:406에 기재된 VHCDR2, SEQ ID NO:407에 기재된 VHCDR3, SEQ ID NO: 408에 기재된 VLCDR1, SEQ ID NO::409에 기재된 VLCDR2, 및 SEQ ID NO: 410에 기재된 VLCDR3 을 함유하는 항체, 또는 SEQ ID NOS: 405-410 또는 437 중 어느 것과 적어도 또는 약 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 CDRs을 함유하는 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 464 또는 483에 기재된 VHCDR1, SEQ ID NO: 465에 기재된 VHCDR2, SEQ ID NO: 466에 기재된 VHCDR3, SEQ ID NO: 467에 기재된 VLCDR1, SEQ ID NO: 468에 기재된 VLCDR2 및 SEQ ID NO: 469에 기재된 VLCDR3 , 또는 SEQ ID NO: 464-469 또는 483 중 어느 것과 적어도 또는 약 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 CDRs을 함유하는 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 411 또는 438에 기재된 VHCDR1, SEQ ID NO: 412에 기재된 VHCDR2, SEQ ID NO: 413에 기재된 VHCDR3, SEQ ID NO: 414에 기재된 VLCDR1, SEQ ID NO: 415에 기재된 VLCDR2 및 SEQ ID NO: 416에 기재된 VLCDR3, 또는 SEQ ID NO: 411-416 또는 438 중 어느 것과 적어도 또는 약 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 CDRs을 함유하는 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 417 또는 439에 기재된 VHCDR1, SEQ ID NO: 418에 기재된 VHCDR2, SEQ ID NO: 419에 기재된 VHCDR3, SEQ ID NO: 420에 기재된 VLCDR1, SEQ ID NO: 421에 기재된 VLCDR2 및 SEQ ID NO: 422에 기재된 VLCDR3, 또는 SEQ ID NO: 417-422 또는 439 중 어느 것과 적어도 또는 약 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 CDRs을 함유하는 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 423 또는 440에 기재된 VHCDR1, SEQ ID NO: 424에 기재된 VHCDR2, SEQ ID NO: 425에 기재된 VHCDR3, SEQ ID NO: 426에 기재된 VLCDR1, SEQ ID NO: 427에 기재된 VLCDR2 및 SEQ ID NO: 428에 기재된 VLCDR3, 또는 SEQ ID NO: 423-428 또는 440 중 어느 것과 적어도 또는 약 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 CDRs을 함유하는 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 429 또는 441에 기재된 VHCDR1, SEQ ID NO: 430에 기재된 VHCDR2, SEQ ID NO: 431에 기재된 VHCDR3, SEQ ID NO: 432에 기재된 VLCDR1, SEQ ID NO: 433에 기재된 VLCDR2 및 SEQ ID NO: 434에 기재된 VLCDR3, 또는 SEQ ID NO: 429-434 또는 441 중 어느 것과 적어도 또는 약 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 CDRs을 함유하는 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 458 또는 482에 기재된 VHCDR1, SEQ ID NO: 459에 기재된 VHCDR2, SEQ ID NO: 460에 기재된 VHCDR3, SEQ ID NO: 461에 기재된 VLCDR1, SEQ ID NO: 462에 기재된 VLCDR2 및 SEQ ID NO: 463에 기재된 VLCDR3, 또는 SEQ ID NO: 458-463 또는 482 중 어느 것과 적어도 또는 약 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 CDRs을 함유하는 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 470 또는 484에 기재된 VHCDR1, SEQ ID NO: 471에 기재된 VHCDR2, SEQ ID NO: 472에 기재된 VHCDR3, SEQ ID NO: 473에 기재된 VLCDR1, SEQ ID NO: 474에 기재된 VLCDR2 및 SEQ ID NO: 475에 기재된 VLCDR3, 또는 SEQ ID NO: 470-475 또는 484 중 어느 것과 적어도 또는 약 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 CDRs을 함유하는 항체를 제공한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 그들의 항원-결합 단편은 중사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 396에 개시된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 실시예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그들의 항원-결합 단편은 VH domain을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO:396의 아미노산 1-121로 기대된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 실시예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그들의 항원-결합 단편은 경사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 395에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 실시예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 그들의 항원-결합 단편은 VL 영역을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 395의 아미노산 1-110으로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 예에서, 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 30D8이다.
본 발명은 가변 중사슬(VH) 및 가변 경사슬(VL)을 함유하는 단리된 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 396에 기재된 중사슬과 SEQ ID NO: 395에 기재된 경사슬을 함유하는 항체 또는 항원-결합 단편과 동일한 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 융합 (F) 단백질 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합한다.
몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그들의 항원-결합 단편은, SEQ ID NO: 405 또는 437에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; SEQ ID NO: 406에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 SEQ ID NO: 407에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 함유한다.
몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그들의 항원-결합 단편은, SEQ ID NO: 408에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; SEQ ID NO: 409에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및 SEQ ID NO: 410에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 함유한다.
몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 중사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 398에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 VH 도메인을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 398의 아미노산 1-125로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 경사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 397에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 VL 도메인을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 397의 아미노산 1-107로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 예에서, 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 104E5이다.
본 발명은 가변 중사슬 (VH) 및 가변 경사슬 (VL)을 함유하는 단리된 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 398에 기재된 중사슬과 SEQ ID NO: 397에 기재된 경사슬을 함유하는 항체 또는 항원-결합 단편과 동일한 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 에피토프에 면역특이적으로 결합한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 411 또는 438에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; SEQ ID NO: 412에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 SEQ ID NO: 413에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 함유한다.
몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 414에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; SEQ ID NO: 415에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및 SEQ ID NO: 416에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3를 함유한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 중사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 400에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 VH 도메인을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 400의 아미노산 1-124로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 경사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 399에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 기재된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 VL 도메인을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 399의 아미노산 1-108로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 예에서, 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 38F10이다.
본 발명은 가변 중사슬 (VH) 및 가변 경사슬 (VL)을 함유하는 단리된 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 400에 기재된 중사슬과 SEQ ID NO: 399에 기재된 경사슬을 함유하는 항체 또는 항원-결합 단편과 동일한 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 에피토프에 면역특이적으로 결합한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 417 또는 439에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; SEQ ID NO: 418에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 SEQ ID NO: 419에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 함유한다.
몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 420에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; SEQ ID NO: 421에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및 SEQ ID NO: 422에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3를 함유한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 중사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 402에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 VH 도메인을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 402의 아미노산 1-125로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 경사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 401에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 기재된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 VL 도메인을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 401의 아미노산 1-113으로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 예에서, 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 14G3이다.
본 발명은 가변 중사슬 (VH) 및 가변 경사슬 (VL)을 함유하는 단리된 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 402에 기재된 중사슬과 SEQ ID NO: 401에 기재된 경사슬을 함유하는 항체 또는 항원-결합 단편과 동일한 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 에피토프에 면역특이적으로 결합한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 423 또는 440에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; SEQ ID NO: 424에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 SEQ ID NO: 425에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 함유한다.
몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 426에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; SEQ ID NO: 427에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및 SEQ ID NO: 428에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3를 함유한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 중사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 404에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 VH 도메인을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 404의 아미노산 1-123으로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 경사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 403에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 기재된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 VL 도메인을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 403의 아미노산 1-117으로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 예에서, 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 90D3이다.
본 발명은 가변 중사슬 (VH) 및 가변 경사슬 (VL)을 함유하는 단리된 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 404에 기재된 중사슬과 SEQ ID NO: 403에 기재된 경사슬을 함유하는 항체 또는 항원-결합 단편과 동일한 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 에피토프에 면역특이적으로 결합한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 429 또는 441에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; SEQ ID NO: 430에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 SEQ ID NO: 431에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 함유한다.
몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 432에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; SEQ ID NO: 433에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및 SEQ ID NO: 434에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3를 함유한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 중사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 452에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 VH 도메인을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 452의 아미노산 1-124로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 경사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 453에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 기재된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 VL 도메인을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 453의 아미노산 1-111로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 예에서, 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 56E11이다.
본 발명은 가변 중사슬 (VH) 및 가변 경사슬 (VL)을 함유하는 단리된 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 452에 기재된 중사슬과 SEQ ID NO: 453에 기재된 경사슬을 함유하는 항체 또는 항원-결합 단편과 동일한 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 에피토프에 면역특이적으로 결합한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 458 또는 482에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; SEQ ID NO: 459에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 SEQ ID NO: 460에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 함유한다.
몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 461에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; SEQ ID NO: 462에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및 SEQ ID NO: 463에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3를 함유한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 중사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 454에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 VH 도메인을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 454의 아미노산 1-133으로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 경사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 455에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 기재된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 VL 도메인을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 455의 아미노산 1-107로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 예에서, 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 17C9이다.
본 발명은 가변 중사슬 (VH) 및 가변 경사슬 (VL)을 함유하는 단리된 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 454에 기재된 중사슬과 SEQ ID NO: 455에 기재된 경사슬을 함유하는 항체 또는 항원-결합 단편과 동일한 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 에피토프에 면역특이적으로 결합한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 464 또는 483에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; SEQ ID NO: 465에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 SEQ ID NO: 466에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 함유한다.
몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 467에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; SEQ ID NO: 468에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및 SEQ ID NO: 469에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3를 함유한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 중사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 456에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 VH 도메인을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 456의 아미노산 1-118로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 경사슬을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 457에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 기재된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 VL 도메인을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 457의 아미노산 1-109로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 특정 예에서, 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 69F6이다.
본 발명은 가변 중사슬 (VH) 및 가변 경사슬 (VL)을 함유하는 단리된 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 456에 기재된 중사슬과 SEQ ID NO: 457에 기재된 경사슬을 함유하는 항체 또는 항원-결합 단편과 동일한 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 에피토프에 면역특이적으로 결합한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 470 또는 484에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1; SEQ ID NO: 471에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2; 및 SEQ ID NO: 472에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 함유한다.
몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 473에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1; SEQ ID NO: 474에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2; 및 SEQ ID NO: 475에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3를 함유한다.
본 발명은 가변 중사슬 (VH) 및 가변 경사슬 (VL)을 함유하는 단리된 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NOS: 396, 398, 400, 402, 404, 452, 454 또는 456에 기재된 중사슬과 SEQ ID NOS: 395, 397, 399, 401, 403, 453, 455 또는 457에 기재된 경사슬을 함유하는 항체 또는 항원-결합 단편과 동일한 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 에피토프에 면역특이적으로 결합한다.
몇몇예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1)을 함유하고, 이것은 SEQ ID NOS: 405, 411, 417, 423, 429, 437-441, 458, 464, 470 또는 482-484에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, .본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 VH CDR2을 함유하고, 이것은 SEQ ID NOS: 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 또는 471에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 VH CDR3를 함유하고, 이것은 SEQ ID NOS: 407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 또는 472에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 VL CDR1을 함유하고, 이것은 SEQ ID NOS: 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 또는 473에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 VL CDR2을 함유하고, 이것은 SEQ ID NOS: 409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 또는 474에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예에서, 본 발명에 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 VL CDR3을 함유하고, 이것은 SEQ ID NO: 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 또는 475에 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 갖는, RSV F 단백질의 부분에 면역특이적으로 결합하는 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편들을 제공한다.
본 발명은 인간 또는 인간화 항체 또는 그의 항원-결합 단편인, 항원-결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 항원-결합 단편은 키메라 항체이다. 몇몇 예에서, 상기 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 항원-결합 단편은 단일-사슬 Fv(scFv), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, 디아바디, Fd, 또는 Fd' 단편이다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 항원-결합 단편은 펩티드 링커를 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 펩티드 링커는 약 1 내지 약 50개의 아미노산을 포함한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편들은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 접합되어 있다. 몇몇 예에서, 상기 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 항원-결합 단편은 치료용 또는 진단용 시약을 포함한다. 진단용 시약의 예는 효소, 형광 화합물, 전자 전달 시약 및 방사성표지를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 단백질 전달 도메인(protein transduction domain)을 포함하는, 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편들을 제공한다. 몇몇 예에서, 상기 단백질 전달 도메인은 SEQ ID NO: 284-355에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 중에서 선택된다. 몇몇 예에서, 상기 단백질 전달 도메인은 HIV-TAT 단백질 전달 도메인이다.
다량체화 도메인에 접합된 본 발명에서 제공되는 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제1 항원-결합 부분; 및 제2 다량체화 도메인에 접합된 항바이러스성 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 제2 항원-결합 부분을 포함하는, 다가 항체가 본 발명에서 제공된다. 상기 예에서, 제1 다량체화 도메인 및 제2 다량체화 도메인은 상보적이거나 동일하며, 이에 의하여 상기 제1 항원-결합 부분 및 제2 항원-결합 부분은 다가 항체를 형성한다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 다가 항체는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가적 항원-결합 부분들을 포함한다. 다가 항체의 예는 2가, 3가, 4가, 5가, 6가 또는 7가 항체를 포함한다. 본 발명에서 제공되는 다가 항체는 헤테로 2가 또는 호모 2가 항체를 포함한다. 본 발명에서 제공되는 다가 항체는 다중특이적 항체를 포함한다. 몇몇 예에서, 다가 항체는 2중 특이적, 3중 특이적, 또는 4중 특이적 항체이다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 다가 항체는 단일사슬 Fv (scFv), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, 디아바디, Fd, 또는 Fd' 단편인 항원-결합 단편을 포함한다. 본 발명에서 제공되는 다가 항체의 제1 항원-결합 부분 및/또는 제2 항원-결합 부분은 공유결합 또는 비공유결합에 의하여 다량체화 도메인에 접합될 수 있다. 몇몇 예에서, 상기 항원-결합 부분은 링커, 예를 들면 화학적 링커 또는 폴리펩티드 링커를 통해 다량체화 도메인에 접합된다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 다가 항체의 다량체화 도메인은 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 류신 지퍼, 상보적 소수성 영역, 상보적 친수성 영역, 또는 양립가능한 단백질-단백질 상호작용 도메인 중에서 선택된다. 몇몇 예에서, Fc 도메인은 IgG, IgM 또는 IgE Fc 도메인이다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 다가 항체는 2 이상의 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함한다. 특정 예에서, 본 발명에서 제공되는 다가 항체는 2 이상의 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함한다.
다량체화 도메인에 접합된, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제1 항원-결합 부분; 및 제2 다량체화 도메인에 접합된, 팔리비주맙, 모타비주맙, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 또는 그의 항원-결합 단편 중에서 선택되는, 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제2 항원 결합 부분을 포함하는 다가 항체가 본 발명에서 제공된다.
다량체화 도메인에 접합된, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제1 항원-결합 부분; 및 제2 다량체화 도메인에 접합된, 파라인플루엔자 바이러스 (PIV) 또는 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV)의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항바이러스성 항체를 포함하는 제2 항원-결합 부분을 포함하는 다가 항체가 본 발명에서 제공된다.
본 발명은 본 발명에서 제공되는 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 본 발명에서 제공되는 다가 항체, 및 항바이러스성 약제를 포함하는 조합물을 제공한다. 몇몇 예에서, 상기 항바이러스성 약제는 리바비린이다. 본 발명은 단일 조성물 또는 개별 조성물로써 제형화된, 본 발명에서 제공되는 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 항바이러스성 약제를 포함하는 조합물을 제공한다.
본 발명은 본 발명에서 제공되는 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 본 발명에서 제공되는 다가 항체, 및 하나 이상의 추가적 항바이러스성 항체를 포함하는 조합물을 제공한다. 몇몇 예에서, 상기 조합물은 2 이상의 상이한 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 조합물은 본 발명에서 제공되는 항체 또는 항원-결합 단편 중에서 선택되는 2 이상의 상이한 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편들을 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 조합물은 본 발명에서 제공되는 항체 또는 항원-결합 단편, 및 팔리비주맙, 모타비주맙, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 또는 그의 항원-결합 단편들 중에서 선택되는 항체를 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 조합물은 본 발명에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 파라인플루엔자 바이러스 (PIV) 또는 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV)의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 중에서 선택되는 항체를 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 PIV 항원은 인간 PIV 타입 1, 인간 PIV 타입 2, 인간 PIV 타입 3, 및/또는 인간 PIV 타입 4의 항원이다. 몇몇 예에서, 상기 PIV 항원은 PIV 뉴클레오캡시드 인단백질, PIV 융합 (F) 단백질, PIV 인단백질, PIV 거대 (large: L) 단백질, PIV 매트릭스 (M) 단백질, PIV 헤마글루티닌-뉴라미니다제 (HN) 당단백질, PIV RNA-의존성 RNA 폴리머라제, PIV Y1 단백질, PIV D 단백질, PIV C 단백질, 및 이들의 대립유전자 변이체들 중에서 선택된다. 몇몇 예에서, hMPV 항원은 hMPV A 타입 또는 hMPV B 타입의 항원이다. 몇몇 예에서, hMPV 항원은 hMPV 서브타입(subtype) A1, hMPV 서브타입 A2, hMPV 서브타입 B1, 또는 hMPV 서브타입 B2의 항원이다. 몇몇 예에서, hMPV 항원은 hMPV 뉴클레오단백질, hMPV 인단백질, hMPV 매트릭스 단백질, hMPV 소형 소수성 단백질, hMPV RNA-의존성 RNA 폴리머라제, hMPV F 단백질, hMPV G 단백질, 및 이들의 대립유전자 변이체들 중에서 선택된다.
본 발명은 본 발명에서 제공되는 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 본 발명에서 제공되는 다가 항체, 및 하나 이상의 추가적 항바이러스성 항체를 포함하는 조합물을 제공하고, 상기 하나 이상의 추가적 항바이러스성 항체는 단일-사슬 Fv (scFv), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, 디아바디, Fd, 또는 Fd' 단편이다.
본 발명은 본 발명에서 제공되는 임의의 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본 발명에서 제공되는 임의의 다가 항체, 또는 본 발명에서 제공되는 임의의 조합(병용), 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물은 겔, 연고, 액체, 현탁액, 에어로졸, 정제, 환제, 산제, 또는 비강 스프레이로써 제형화될 수 있다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물은 폐의, 비강내의, 또는 비경구의 투여를 위하여 제형화된다. 몇몇 예에서 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물은 단일 투여량 투여를 위하여 제형화된다. 몇몇 예에서 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물은 지속 방출용으로 제형화된다.
본 발명은 본 발명에서 제공되는 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 본 발명에서 제공되는 다가 항체, 및 하나 이상의 추가적 항바이러스성 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 몇몇 예에서, 상기 약학적 조성물은 2 이상의 상이한 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편들을 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 약학적 조성물은 본 발명에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 중에서 선택되는 2 이상의 상이한 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 약학적 조성물은 본 발명에서 제공되는 항체 또는 항원-결합 단편, 및 팔리비주맙, 모타비주맙, AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 또는 이들의 항원-결합 단편들 중에서 선택되는 항체를 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 약학적 조성물은 본 발명에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 파라인플루엔자 바이러스 (PIV) 또는 인간 메타뉴모바이러스(hMPV)의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 중에서 선택되는 항체를 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 PIV 항원은 인간 PIV 타입 1, 인간 PIV 타입 2, 인간 PIV 타입 3, 및/또는 인간 PIV 타입 4의 항원이다. 몇몇 예에서, 상기 PIV 항원은 PIV 뉴클레오캡시드 인단백질, PIV 융합 (F) 단백질, PIV 인단백질, PIV 거대 (L) 단백질, PIV 매트릭스 (M) 단백질, PIV 헤마글루티닌-뉴라미니다제 (HN) 당단백질, PIV RNA-의존성 RNA 폴리머라제, PIV Y1 단백질, PIV D 단백질, PIV C 단백질, 및 이들의 대립유전자 변이체들 중에서 선택된다. 몇몇 예에서, hMPV 항원은 hMPV 타입 A 또는 hMPV 타입 B의 항원이다. 몇몇 예에서, hMPV 항원은 hMPV 서브타입 A1, hMPV 서브타입 A2, hMPV 서브타입 B1, 또는 hMPV 서브타입 B2의 항원이다. 몇몇 예에서, hMPV 항원은 hMPV 뉴클레오단백질, hMPV 인단백질, hMPV 매트릭스 단백질, hMPV 소형 소수성 단백질, hMPV RNA-의존성 RNA 폴리머라제, hMPV F 단백질, a hMPV G 단백질, 및 이들의 대립유전자 변이체들 중에서 선택된다.
본 발명은, 본 발명에서 제공되는 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에서 제공되는 다가 항체, 및 하나 이상의 추가적 항바이러스성 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 상기 하나 이상의 추가적 항바이러스성 항체는 단일-사슬 Fv (scFv), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, 디아바디, Fd, 또는 Fd' 단편이다.
본 발명은 본 발명에서 제공되는 단리된 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 본 발명에서 제공되는 다가 항체, 및 항바이러스성 약제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 몇몇 예에서, 상기 항바이러스성 약제는 리바비린이다.
본 발명은 치료적 유효량의 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물을 피험자에 투여하는 것을 포함하는 피험자에 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물을 피험자에 투여하는 것을 포함하는 피험자에 바이러스 감염의 하나 이상의 증상를 치료하거나 억제하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물을 피험자에 투여하는 것을 포함하는 피험자에 바이러스 감염을 예방하는 방법을 제공한다. 특정 예에서, 상기 바이러스 감염은 RSV 감염이다. 특정 예에서, 상기 RSV 감염은 상기도 감염이다.
투여는 이에 제한되지 않는 임의의 경로, 예를 들면, 국소적으로, 비경구로, 국부적으로, 또는 전신적으로, 예를 들면, 비강내로, 근육내로, 피내로, 복강내로, 정맥내로, 피하로, 경구로, 또는 폐의 투여에 의하여 달성될 수 있다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물은 네뷸라이저 또는 흡입기에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물은 임의의 적합한 피험자, 예를 들면, 포유동물, 예를 들어 인간에게 투여될 수 있다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물은 인간 유아, 미숙하게 태어나거나, RSV 감염에 대한 입원의 위험이 있는 인간 유아, 노인, 낭포성 섬유증, 기관지폐이형성증, 선천성 심장질환, 선천성 면역결핍증, 후천성 면역결핍증, 백혈병 또는 비호지킨 림프종을 갖는 인간 피험자, 또는 이식, 예를 들면 골수 이식 또는 간 이식을 갖는 인간 피험자에 투여된다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물은 RSV 시즌 동안(예를 들면, 10월부터 5월) 1회, 2회, 3회, 4회 또는 5회 투여된다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물은 RSV 시즌 전 1달, 2달 또는 3달 내에 1회, 2회, 3회, 4회 또는 5회 투여된다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물은 하나 이상의 항바이러스성 약제와 함께 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 상기 항바이러스성 약제는 리바비린이다. 몇몇 예에서, 상기 약학적 조성물 및 항바이러스성 약제는 단일 조성물 또는 개별 조성물로써 제형화된다. 본 발명에서 제공되는 방법에서, 상기 약학적 조성물 및 항바이러스성 약제는 순차적으로, 동시에 또는 간헐적으로 투여될 수 있다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물은 호르몬 치료제, 면역치료제 또는 항-염증제와 함께 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물은 하나 이상의 추가적 항바이러스성 항체 또는 그의 항원-결합 단편들과 함께 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물 및 하나 이상의 추가적 항바이러스성 항체는 단일 조성물 또는 개별 조성물로써 제형화된다. 상기 약학적 조성물 및 하나 이상의 추가적 항-RSV 항체들은 순차적으로, 동시에 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 상기 항원-결합 단편은 단일-사슬 Fv (scFv), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, 디아바디, Fd, 또는 Fd' 단편이다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물은 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편들, 예를 들면, 팔리비주맙, 모타비주맙, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2 또는 이들의 항원-결합 단편들 중에서 선택되는 하나 이상의 추가적 항체들과 함께 투여될 수 있다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 약학적 조성물은 파라인플루엔자 바이러스 (PIV) 또는 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV)의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 중에서 선택되는 하나 이상의 추가적 항바이러스성 항체들과 함께 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 상기 PIV 항원은 인간 PIV 1형, 인간 PIV 2형, 인간 PIV 3형, 및/또는 인간 PIV 4형의 항원이다. 몇몇 예에서, 상기 PIV 항원은 PIV 뉴클레오캡시드 인단백질, PIV 융합 (F) 단백질, PIV 인단백질, PIV 거대 (L) 단백질, PIV 매트릭스 (M) 단백질, PIV 헤마글루티닌-뉴라미니다제 (HN) 당단백질, PIV RNA-의존성 RNA 폴리머라제, PIV Y1 단백질, PIV D 단백질, PIV C 단백질, 및 이들의 대립유전자 변이체들 중에서 선택된다. 몇몇 예에서, hMPV 항원은 hMPV A형 또는 hMPV B형의 항원이다. 몇몇 예에서, hMPV 항원은 hMPV 아형 A1, hMPV 아형 A2, hMPV 아형 B1, 또는 hMPV 아형 B2의 항원이다. 몇몇 예에서, hMPV 항원은 hMPV 뉴클레오단백질, hMPV 인단백질, hMPV 매트릭스 단백질, hMPV 소형 소수성 단백질, hMPV RNA-의존성 RNA 폴리머라제, hMPV F 단백질, hMPV G 단백질, 및 이들의 대립유전자 변이체들 중에서 선택된다.
본 발명은, (a) 본 발명에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편들을 사용하여 액, 세포, 또는 조직 시료에서 RSV 항원의 수준을 분석하는 단계; (b) 상기 분석된 RSV 항원의 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계, 이에 의해 상기 RSV 항원의 대조군 수준과 비교할 때 상기 분석된 RSV 항원의 수준의 증가가 RSV 감염을 나타내는 것임을 포함하는 RSV 감염을 검출하는 방법을 제공한다. 몇몇 예에서, 상기 세포 또는 조직 시료는 인간 피험자로부터 얻어진다. 몇몇 예에서, 상기 세포 또는 조직 시료는 혈액, 소변, 타액, 폐 객담, 세척액 또는 림프 시료이다.
본 발명은, 본 발명에서 제공되는 상기 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편들을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 본 발명에서 제공되는 상기 폴리펩티드, 항체 또는 항원-결합 단편들을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 본 발명에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본 발명에서 제공되는 핵산, 또는 본 발명에서 제공되는 벡터를 함유하는 단리된 세포를 제공한다. 본 발명에서 제공되는 세포는 예를 들어 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명에서 제공되는 핵산 또는 본 발명에서 제공되는 벡터를 포함하는 형질전환 동물을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명에서 제공되는 단리된 세포들을 상기 코딩된 항체를 발현하는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하거나, 또는 본 발명에서 제공되는 형질전환 동물로부터 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 분리함으로써, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현시키는 방법을 제공한다. 몇몇 예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 형질전환 동물의 혈청 또는 젖으로부터 단리된다.
본 발명은 하나 이상의 용기 내 본 발명에서 제공되는 폴리펩티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본 발명에서 제공되는 다가 항체, 또는 본 발명에서 제공되는 조합(병용), 및 사용설명서를 포함하는 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 피험자의 바이러스 감염의 예방을 위한 본 발명에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 피험자의 바이러스 감염의 치료를 위한 본 발명에서 제공되는 항체 또는 항원-결합 단편의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 피험자의 바이러스 감염의 하나 이상의 증상을 치료하거나 예방하기 위한 본 발명에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 피험자의 바이러스 감염의 예방용 의약의 제형화를 위한 본 발명에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 피험자에 바이러스 감염의 치료용 의약의 제형화를 위한 본 발명에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 피험자에 바이러스 감염의 하나 이상의 증상을 예방하거나 억제하기 위한 본 발명에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다.
본 발명은 항-RSV 중화 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 RSV는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 존재하에 바이러스 복제의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 라운드 후 항체 또는 그것의 항원-결합 단편에 의해 중화를 피하는 바이러스를 생산하지 않는다. 또한, 본 발명은 항-RSV 중화 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공하고, 여기서 RSV는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 존재하에 바이러스 복제의 최대 20 라운드 후 항체 또는 그것의 항원-결합 단편에 의한 중화를 피하는 바이러스를 생산하지 않는다. 몇몇 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 30D8로 명명된 항체와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 30D8로 명명된다. 몇몇 예에서, 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편은 특이적으로 RSV F 단백질에 결합한다. 또 다른 예에서, 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편은 Fab 또는 scFv 이다.
도 1은 RSV F 단백질의 전융합(prefusion) 형태의 3D 모델이다. 항체 58C5의 결합에 중요한 것으로 실시예 12에 동정된 아미노산 잔기는 검은 공간 충전 모형으로 표시하였다. 잔기가 전융합 RSV F 단백질의 3D 모델 상에 표시될 때, 이들은 스파이크의 제한된 영역 위에 무리를 이루고 항체 58C5의 항체 풋프린트를 나타낸다.
도 2는 전-융합 및 후-융합 형태의 항체 58C5의 결합에 중요한 RSV F 단백질 잔기를 함유하는 RSV F 단백질의 D3 영역의 3D 모델 X-선 구조를 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 항체 58C5의 결합에 중요한 잔기는 전융합 모델에서만 무리를 이룬다. 후융합 모델에서, 잔기들은 단백질 표면의 대부분의 영역에 걸쳐 분포된다.
도 3은 RSV 단백질의 전융합 형태의 3D 모델이다. 실시예 12에서 30D8의 결합에 중요하다고 동정된 아미노산 잔기들은 검은 공간 충전 모형으로 표시하였다. 잔기는 줄기/대 영역 바로 위의 막대사탕(lollipop)의 저부에서 D1 영역에 무리를 이룬다.
개요
A.정의
B. 개요
1. 호흡기 세포융합 바이러스
C. 항- RSV 항체
1. 일반적 항체 구조 및 기능성 도메인들
a. 항체의 구조 및 기능성 도메인들
b. 항체 단편들
2. 예시적인 항-RSV 항체들
a. 유도체 항체
i. 단일 사슬 항체들
ii. 항-이디오타입 항체들
iii. 다중-특이적 항체들 및 항체 다량체화
D. 항-RSV 항체의 추가적인 변형들
1. 면역원성 감소를 위한 변형들
2. Fc 변형들
3. 페길화
4. 검출가능한 모이어티의 접합
5. 치료 모이어티의 접합
6. 결합 특이성 개선을 위한 변형
D. 항-RSV 항체들의 분리방법
F. 항-RSV 항체, 및 그의 변형된 또는 변이체 형들 및 항체를 코딩하는 핵산의 제조방법
1. 핵산들
2. 벡터들
3. 세포 발현 시스템들
a. 원핵 발현
b. 효모균 세포들
c. 곤충 세포들
d. 포유류 세포들
e. 식물들
4. 항체들의 정제
G. 항-RSV 항체 특성들 및 활성들의 평가
1. 결합 분석들
3. 항체의 바이러스 중화 효과들을 분석하기 위한 인 비트로 분석들
4. 항-RSV 항체들의 효능을 평가하기 위한 인 비보 동물 모델들
5. 항체 효능을 측정하기 위한 인 비트로 및 인 비보 분석들
H. 진단적 용도
1. 병원성 감염의 인 비트로 검출
2. 병원성 감염의 인 비보 검출
3. 감염 모니터링
I. 예방 및 치료 용도들
1. 치료를 위한 피험자들
2. 투여량
3. 투여 경로들
4. 병용 치료들
a. 병용 치료를 위한 항바이러스성 항체들
i. 항-RSV 항체들
ii. 다른 호흡기 바이러스에 대한 항체
5. 유전자 치료
J. 약학적 조성물, 병용들 및 제조물품/키트
1. 약학적 조성물
2. 제조물품들/키트
3. 병용들
K. 실시예들
A. 정의
달리 정의된 바 없다면, 본 발명에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 지닌다. 본원의 전체 개시를 통해 언급되는 모든 특허, 특허출원, 공개된 출원 및 공보, Genbank 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 다른 출판물은, 달리 알려진 바 없다면, 그 전체가 참조로써 병합된다. 본 발명에서 용어들에 대한 복수의 정의가 존재하는 경우, 본 섹션의 것들이 우선한다. URL 또는 다른 그러한 식별자 또는 주소로 참조된 경우, 그러한 식별자는 바뀔 수 있으며, 인터넷 상의 특정 정보는 변화될 수 있으나, 동등한 정보가 인터넷을 검색하여 발견될 수 있다. 본원의 참조는 그 사용이능성 및 상기 정보의 공중의 보급성을 증명한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "항체"는 천연의 혹은 부분 또는 전부 합성된, 예를 들면 재조합으로 제조된, 전장 면역글로불린의 특이성 결합력을 보유하는 면역글로불린 분자의 가변 영역의 일부 이상을 포함하는 임의의 단편을 포함하는, 면역글로불린 및 면역글로불린 단편을 나타낸다. 따라서, 항체는 면역글로불린 항원-결합 도메인 (항체 결합 부위)와 상동이거나, 실질적으로 상동인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 항체는 항체 단편들, 예를 들면, 항-RSV 항체 단편들을 포함한다. 따라서, 본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 항체는 합성 항체, 재조합적으로 제조된 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 인간 항체, 비-인간 항체, 인간화 항체, 키메라항체, 인트라바디 및 항체 단편, 이에 제한되지 않으나, 예를 들면, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 이황화-결합 Fv (dsFv), Fd 단편, Fd' 단편, 단일-사슬 Fv (scFv), 단일-사슬 Fab (scFab), 디아바디, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 또는 상기 중 임의의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 발명에서 제공되는 항체는 임의의 면역글로불린 타입 (예를 들면, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 IgY), 임의의 분류 (예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스 (예를 들면, IgG2a 및 IgG2b)의 구성원들을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 항체의 "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은 전장의 항체보다는 덜하지만, 항원에 결합하는 항체의 가변 영역의 일부 이상 (예를 들면, 하나 이상의 CDR 및/또는 하나 이상의 항체 결합 부위)를 포함하고, 따라서 결합 특이성, 및 전장 항체의 특이적 결합력을 일부 이상을 보유하는, 전장 항체의 임의의 부분을 나타낸다. 따라서, 항원-결합 단편은 항체 단편이 유래되는 항체와 동일한 항원에 결합하는 항원-결합 부분을 함유하는 항체 단편을 말한다. 항체 단편은 전장 항체의 효소 처리에 의해 제조되는 항체 유도체뿐 아니라 합성에 의하여, 예를 들면 재조합적으로 제조된 유도체들을 포함한다. 항체 단편은 항체 중에 포함되어 있다. 항체 단편의 예는 이에 제한되지 아니하나, Fab, Fab', F(ab')2, 단일-사슬 Fv(scFv), Fv, dsFv, 디아바디, Fd 및 Fd' 단편들 및 다른 단편들, 예를 들면, 변형된 단편들 (예를 들어, [Methods in Molecular Biology, Vol 207: 재조합 Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov] 참조)을 포함한다. 상기 단편은 예를 들면, 이황화 가교 및/또는 펩티드 링커에 의해 함께 연결된 다중사슬을 포함할 수 있다. 항체 단편은 일반적으로 약 또는 50개 이상의 아미노산을, 전형적으로는 약 또는 200 개 이상의 아미노산을 포함한다.
항원-결합 단편은 (상응하는 영역의 치환에 의해서와 같이) 항체 프레임워크 내에 삽입시 항원에 면역특이적으로 결합하는 (즉, 약 또는 107- 108 M-1 이상의 Ka를 나타내는) 항체를 생성하는 임의의 항체 단편을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "치료용 항체"는 인간을 포함한 동물의 치료를 위하여 투여되는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 나타낸다. 상기 항체들은 폴리펩티드의 제조에 관한 임의의 공지된 방법에 의해 제조될 수 있고, 따라서, 이에 제한되지 아니하나 재조합적으로 제조된 항체, 인위적으로 제조된 항체, 및 세포 또는 조직 및 다른 공급원으로부터 추출된 치료용 항체를 포함한다. 임의의 공급원으로부터 분리되거나, 제조된 바와 같이, 치료용 항체는 길이에 있어 이질적이거나 번역 후 변형, 예를 들면 당화 (즉, 탄수화물 함량)에 있어서 상이할 수 있다. 치료용 항체의 이질성은 또한 치료용 항체의 공급원에 따라 상이할 수 있다. 따라서, 치료용 항체에 대한 언급은 제조되거나 단리된 이질성 집단을 나타낸다. 이질성 제제를 의도하는 경우, 이는 그렇게 언급될 것이다. 본 발명에서 치료용 항체에 대한 언급은 적절하게 그들의 단량체, 이량체 또는 기타 다량체 형태에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "중화 항체"는 병원체에 결합하여, 세포를 감염시키거나/시키고 피험자에 질환을 야기하는 병원체의 능력을 방해하는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 중화 항체의 예는 바이러스, 박테리아 및 진균 병원체에 결합하는 중화 항체이다. 전형적으로, 본 발명에서 제공되는 중화 항체는 병원체의 표면에 결합한다. 병원체가 바이러스인 예에서, 바이러스에 결합하는 중화 항체는 바이러스의 표면상의 단백질에 결합한다. 바이러스의 분류에 따라, 표면 단백질은 캡시드 단백질 (예를 들면, 비-외피보유 바이러스의 캡시드 단백질) 또는 바이러스성 외피 단백질 (예를 들면, 외피보유 바이러스의 바이러스성 외피 단백질)일 수 있다. 몇몇 예에서, 단백질은 당단백질이다. 바이러스의 바이러스 감염성 억제력은 예를 들어 시험관 내 중화 분석, 예를 들어 베로(Vero) 숙주 세포를 사용한 플라크 감소 분석에 의하여 측정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "외피보유 바이러스"는 바이러스 캡시드를 둘러싼 바이러스성 단백질을 포함하는 지질 이중층인 외부 막 또는 외피를 소유하는 동물 바이러스이다. 바이러스의 외피 단백질은 감염성 입자의 조합에 참여하고, 또한 숙주세포의 수용체에 결합하여 바이러스 외피와 숙주세포의 막 사이의 융합을 유도함으로써 바이러스 침투에 관여한다. 외피보유 바이러스는 구상 또는 사상 (막대-모양) 중 어느 하나일 수 있다. 외피보유 바이러스의 예는 이에 제한되지 아니하나, 허피스바이러스과, 폭스바이러스과, 헤파드나바이러스과, 토가바이러스과, 아레나바이러스과, 플라비바이러스과, 오르토믹소바이러스과, 파라믹소바이러스과, 번야바이러스과, 랍도바이러스과, 필로바이러스과, 코로나바이러스과 및 보르나바이러스과 패밀리의 구성원들을 포함한다. 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)는 파라믹소바이러스과 패밀리, 뉴모바이러스 서브패밀리의 음성 센스 단일 가닥 RNA 외피보유 바이러스이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "비-외피보유 바이러스" 또는 "나출 바이러스"는 바이러스성 외피를 결여한 바이러스이다. 숙주세포의 감염을 위하여, 비-외피보유 바이러스는 표적 세포에 부착(attachment)을 위한 바이러스성 캡시드의 단백질을 사용한다. 비-외피보유 바이러스의 예는 이에 제한되지 아니하나, 아데노바이러스과, 파필로마바이러스과, 파르보바이러스과, 폴리오마바이러스과, 써코바이러스과, 레오바이러스과, 피코르나바이러스과, 칼리시바이러스과, 및 아스트로바이러스과 패밀리를 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 병원체의 "표면 단백질"은 병원체의 외부 표면에 위치한 임의의 단백질이다. 표면 단백질은 외부 환경 (즉, 바깥쪽 표면)에 부분적으로 또는 전체적으로 노출될 수 있다. 표면 단백질의 예는 막 단백질, 예를 들면, 바이러스성 외피의 표면 또는 박테리아 외부 막에 위치한 단백질(예를 들면, 막 당단백질)이다. 막 단백질은 막투과 단백질 (즉, 지질 이중층을 관통하는 단백질들) 또는 비-막투과 세포 표면 연합 단백질인 단백질들 (예를 들어, 병원체의 표면에 다른 단백질의 부착과 같은, 막의 표면에 앵커되거나 공유적으로 부착됨)일 수 있다. 다른 표면 단백질의 예는 외부 환경에 최소한 부분적으로 노출된 비-외피보유 외피보유 바이러스의 바이러스성 캡시드 단백질을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "단일클론 항체"는 단일클론 항체들의 집단 내 각각의 개별적 항체 분자가 다른 것들과 동일한 것을 의미하는, 동일한 항체의 집단을 나타낸다. 이러한 성질은 복수의 상이한 서열들을 갖는 항체들을 포함하는 항체들의 다중클론 집단의 그것과 대조된다. 단일클론 항체는 많은 널리 공지된 방법 (Smith 등 (2004) J. Clin . Pathol . 57, 912-917; 및 Nelson 등, J Clin Pathol (2000), 53, 111-117)에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는 B 세포의 불멸화, 예를 들어 하이브리도마 세포주를 생성하기 위하여 미엘로마 세포와의 융합을 통해, 또는 B 세포를 EBV와 같은 바이러스에 감염시켜 생산될 수 있다. 또한, 재조합 기술을 사용하여 항체를 코딩하는 뉴클레오티드의 인공 서열을 운반하는 플라스미드로 숙주세포를 형질전환하여 숙주세포의 클론 집단으로부터 인 비트로에서 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "통상의 항체(conventional antibody)"는 2개의 중사슬 (H 및 H' 으로 나타낼 수 있음) 및 2개의 경사슬 (L 및 L' 으로 나타낼 수 있음) 및 2개의 항체 결합 부위를 포함하는 항체를 나타내며, 여기서, 각 중사슬은 전장 면역글로불린 중사슬 또는 항원-결합력을 보유하는 그의 임의의 기능적 영역 (예를 들면, 중사슬은 이에 제한되지 아니하나 VH 사슬, VH-CH1 사슬 및 VH-CH1-CH2-CH3 사슬을 포함한다)일 수 있고, 각 경사슬은 전장 경사슬 또는 그의 임의의 기능적 영역 (예를 들면, 경사슬은 이에 제한되지 아니하나 VL 사슬 및 VL-CL 사슬을 포함한다)일 수 있다. 각 중사슬 (H 및 H')는 1개의 경사슬 (각각, L 및 L')과 짝을 이룬다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 전장 항체는 2개의 전장 중사슬 (예를 들면, VH-CH1-CH2-CH3 또는 VH-CH1-CH2-CH3-CH4) 및 2개의 전장 경사슬 (VL-CL) 및 힌지 영역을 갖는 항체, 예를 들면, 항체 분비 B 세포에 의해 천연적으로 제조된 인간 항체들 및 인위적으로 제조된 동일한 도메인을 갖는 항체들이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, Fv 항체 단편은 비공유적 상호작용에 의하여 연결된 1개의 가변 중사슬 도메인 (VH) 및 1개의 가변 경사슬 도메인 (VL)으로 구성된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, dsFv 는 VH-VL 쌍을 안정화하는 조작된 분자간 이황화 결합을 갖는 Fv를 나타낸다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, Fd 단편은 항체 중사슬의 가변 도메인 (VH) 및 1개의 불변 영역(constant region) 도메인 (CH1)을 포함하는 항체의 단편이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, Fab 단편은 파파인을 사용한 전장 면역글로불린의 소화로부터 생성되는 항체 단편들 또는 인위적으로, 예를 들면 재조합 방법에 의해 제조된 동일한 구조를 갖는 단편이다. Fab 단편은 (VL 및 CL을 포함하는) 경사슬 및 중사슬의 가변 도메인 (VH) 및 중사슬의 1개의 불변 영역 도메인 (CH1)을 포함하는 다른 사슬을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, F(ab')2 단편은 pH 4.0-4.5에서 펩신을 사용한 면역글로불린의 소화로부터 생성되는 항체 단편, 또는 인위적으로, 예를 들면 재조합 방법에 의하여 제조된 동일한 구조를 갖는 단편이다. F(ab')2 단편은 2개의 Fab 단편을 필수적으로 포함하며, 여기서 각 중사슬 부분은 추가적인 몇개의 아미노산, 예를 들면 두 단편들을 결합하는 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기들을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, Fab' 단편은 F(ab')2 단편의 1개의 절반 (1개의 중사슬 및 1개의 경사슬)를 포함하는 단편이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, Fd' 단편은 F(ab')2 단편의 1개의 중사슬 부분을 포함하는 항체의 단편이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, Fv' 단편은 항체 분자의 VH 및 VL 도메인 만을 포함하는 단편이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, hsFv 는 Fab 단편 내에 정상적으로 존재하는 불변 도메인이 헤테로이량체 코일드-코일 도메인으로 치환된 항체 단편을 나타낸다 (예를 들어, [Arndt et al. (2001) J Mol Biol . 7:312:221-228] 참조).
본 발명에서 사용된 바와 같이, scFv 단편은 임의의 순서로 폴리펩티드 링커에 의해 공유 결합된, 가변 경사슬 (VL) 및 가변 중사슬 (VH)를 포함하는 항체 단편을 나타낸다. 상기 링커는 2개의 가변 도메인이 실질적인 간섭 없이 가교되도록 하는 길이이다. 링커의 예는 일부 Glu 또는 Lys 잔기가 용해도 증가를 위하여 전체에 분산되어 있는 (Gly-Ser)n 잔기들이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "유도체"는 예를 들면, 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가의 도입에 의하여, 폴리펩티드에 임의의 종류의 분자의 공유결합 (예를 들면, 당화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지의 보호/차폐기에 의한 유도체화, 단백질가수분해 절단, 세포성 리간드 또는 다른 단백질에 결합)에 의하여 변형된 항-RSV 항체 또는 그의 단편의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 유도체는 당 분야의 통상의 기술자에게 알려진 기술을 사용한 화학적 변형, 이에 제한되지 아니하나, 예를 들면 특이적 화학 절단, 아세틸화, 포르밀화에 의해 변형될 수 있다. 또한, 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 유도체는 하나 이상의 비-고전적 아미노산을 포함할 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드 유도체는 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 유사하거나 동일한 기능(예를 들면, RSV의 중화)을 소유한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 다른 항체로부터 유도되는 항체 단편들, 예를 들면 모노클론 항체의 언급시 "-로부터 유도되는"이라는 구는 본래의 항체의 결합 특이성을 보유하는 항체 단편들 (예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2, 단일-사슬 Fv (scFv), Fv, dsFv, 디아바디, Fd 및 Fd' 단편들)의 조작을 나타낸다. 상기 단편들은 당 분야에 공지된 다양한 방법들, 이에 제한되지 아니하나, 예를 들면, 효소적 절단, 화학적 가교결합, 재조합적 수단 또는 이들의 조합에 의해 유도될 수 있다. 일반적으로, 상기 유도된 항체 단편은 동일하거나 실질적으로 동일한 부모 항체의 중사슬 가변 영역 (VH) 및 경사슬 가변 영역 (VL)을 공유하며, 따라서, 항체 단편과 부모 항체는 동일한 에피토프에 결합한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "부모 항체(parent antibody)" 또는 "기원 항체(source antibody)"는 항체 단편 (예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2, 단일-사슬 Fv (scFv), Fv, dsFv, 디아바디, Fd 및 Fd' 단편들)이 유도되는 항체를 나타낸다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "에피토프"는 항체의 파라토프가 결합하는 항원 상의 임의의 항원성 결정자를 나타낸다. 에피토프 결정자는 일반적으로 분자의 화학적 활성인 표면 그룹핑, 예를 들면, 아미노산 또는 당 측쇄를 포함하며, 일반적으로 특이적 3차원 구조 특성뿐 아니라 특이적 전하 특성이 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 키메라 단백질은 2개 이상의 상이한 폴리펩티드 유래 또는 하나의 폴리펩티드의 2개의 비-연속적 부분 유래의 부분들을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 따라서, 키메라 폴리펩티드는 일반적으로 하나의 폴리펩티드의 전부 또는 일부 유래의 아미노산 잔기들의 서열 및 다른 상이한 폴리펩티드의 전부 또는 일부 유래의 아미노산들의 서열을 포함한다. 상기 두 부분들은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있고, 펩티드 결합, 다른 공유 결합, 또는 등장성 pH 7 완충 염수와 같은 평형 조건 및 생리적 조건 하에서 키메라 폴리펩티드의 실질적인 부분의 통일성을 유지하기에 충분한 세기의 다른 비공유 결합을 통해 연결될 수 있다. 본원의 목적을 위하여, 키메라 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드, 예를 들면, 다량체화 도메인, 외인성 면역글로불린 불변 도메인 또는 프레임워크 영역, 또는 진단용 또는 치료용 폴리펩티드에 연결된 항-RSV 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 것들을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 융합 단백질은 예를 들면, 2개의 폴리펩티드를 코딩하는 2개의 핵산을 근접하여, 예를 들면, 벡터의 길이를 따라 서로 이웃하게 포함하는 벡터로부터 융합 단백질을 발현시킴으로써 함께 결합된, 2개의 구별되는 폴리펩티드에 상응하는 아미노산 서열들을 포함하도록 조작된 폴리펩티드이다. 일반적으로, 본 발명에서 제공되는 융합 단백질은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 외인성 폴리펩티드 또는 펩티드, 예를 들면, 진단용 또는 치료용 폴리펩티드의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 융합 단백질은 펩티드 결합을 통하여 직접 또는 간접적으로 연결된 2개 이상의 단백질 또는 펩티드 유래의 2개 이상의 부분들을 포함하는 키메라 단백질이다. 2개의 분자는 구축물 내에 이웃하거나, 링커 또는 스페이서 폴리펩티드에 의하여 분리되어 있을 수 있다. 스페이서는 폴리펩티드의 성질, 예를 들면, 용해도 또는 세포내 이송을 변경하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "링커" 또는 "스페이서" 펩티드는 2개의 폴리펩티드 서열 (또는 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산)을 결합하는 아미노산의 짧은 서열을 나타낸다. "폴리펩티드 링커"는 2개의 폴리펩티드 서열을 결합하는 아미노산의 짧은 서열을 나타낸다. 폴리펩티드 링커의 예는 펩티드 전달 도메인을 항체에 연결하는 링커, 또는 2개의 항체 사슬을 합성 항체 단편, 예를 들면 scFv 단편 내에 결합하는 링커이다. 링커는 널리 공지되어 있고, 임의의 링커는 상기 제공된 방법에서 사용될 수 있다. 폴리펩티드 링커의 예는 일부 Glu 또는 Lys 잔기가 용해도 증가를 위하여 전체에 분산되어 있는 (Gly-Ser)n 아미노산 서열이다. 다른 링커의 예는 본원에 기재되어 있으며; 이들 및 다른 공지의 링커들 중 임의의 것이 상기 제공된 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "항체 힌지 영역" 또는 "힌지 영역"은 다른 항체 도메인들과 상동성을 갖지 않는 CH1 및 CH2 도메인 사이의, 감마, 델타 및 알파 항체 아이소타입(isotype)의 중사슬 내 천연적으로 존재하는 폴리펩티드 영역을 나타낸다. 상기 영역은 프롤린 잔기들이 풍부하며, IgG, IgD 및 IgA 항체에 유연성을 제공하여, Fab 부분의 2개의 "팔들" (각각은 1개의 항체 결합 부위를 포함함)이 움직일 수 있도록 하여, 이들이 항원에 결합할 때 서로에 대하여 다양한 각을 갖게 한다. 이러한 유연성은 Fab 팔들이 움직여 항체 결합 부위와 배열되도록 하여, 세포 표면 또는 다른 항원 상의 에피토프와 상호작용하게 한다. 상기 힌지 영역 내 2개의 사슬간 이황화 결합은 2개의 중사슬 사이의 상호작용을 안정하게 한다. 본 발명에서 제공되는 일부 구현예에서, 인위적으로 제조된 항체 단편은 예를 들어, 2개의 항체 사슬 사이의 상호작용을 통하여 안정성을 촉진하기 위한, 하나 이상의 힌지 영역을 포함한다. 힌지 영역은 이량체화 도메인의 예이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 디아바디는 이량체 scFv 이며; 디아바디는 일반적으로 scFv 보다 더 짧은 펩티드 링커를 가지며, 우선적으로 이량체화한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 인간화 항체는 인간에 투여시 면역반응이 일어나지 않도록 "인간" 아미노산 서열을 포함하도록 변형된 항체를 나타낸다. 인간화 항체는 일반적으로 비-인간 종 면역글로불린 유래 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 면역글로불린으로부터 주로 유래한 항체 분자의 나머지를 포함한다. 상기 항체의 제조방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 비가변 영역의 아미노산 조성이 인간 항체에 기초하는 항체를 코딩하도록 변경될 수 있다. 상기 영역의 동정 방법은 공지되어 있으며, 면역글로불린의 가변 및 비-가변 영역을 동정하도록 설계된 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 이디오타입은 면역글로불린 분자의 가변 영역에 특이적인 하나 이상의 항원성 결정자의 세트이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 항-이디오타입 항체는 항체 또는 T 세포 수용체의 서열의 항원-특이적 부분에 대한 항체이다. 원칙적으로, 항-이디오타입 항체는 특이적 면역반응을 억제한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, Ig 도메인은 각각이 루프에 의해 연결된 아미노산의 항-평행 베타 스트랜드를 포함하는, 2개의 베타-병풍 시트를 포함하는, 면역글로불린 (Ig) 폴드라고 불리는, 구조에 의해 구별되는, 당업자에 의해 그렇게 인식되는 도메인이다. Ig 폴드 내 상기 2개의 베타 시트는 소수성 상호작용 및 보존적 사슬내 이황화 결합에 의하여 서로 샌드위치 구조를 이룬다. 항체 사슬 내 개별적인 면역글로불린 도메인은 추가로 기능에 기초하여 구별될 수 있다. 예를 들어, 경사슬은 1개의 가변 영역 도메인 (VL) 및 1개의 불변 영역 도메인 (CL)을 포함하는 반면, 중사슬은 1개의 가변 영역 도메인 (VH) 및 3 또는 4개의 불변 영역 도메인 (CH)를 포함한다. 각각의 VL, CL, VH 및 CH 도메인은 면역글로불린 도메인의 예이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 가변 도메인 또는 가변 영역은 상이한 항체들 중에 변하는 아미노산 서열을 포함하는 항체 중사슬 또는 경사슬의 특이적 Ig 도메인이다. 각 경사슬 및 각 중사슬은 1개의 가변 영역 도메인, VL 및 VH 를 각각 가진다. 가변 도메인은 항원 특이성을 제공하고, 따라서 항원 인식을 담당한다. 각 가변 영역은 항원-결합 부위 도메인의 일부인 CDR 및 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "항원-결합 도메인(antigen-binding domain)", "항원-결합 부위(antigen-binding site)", "항원 조합 부위(antigen-combining site)" 및 "항체 결합 부위(anbody-combining site)"는 동의어로 사용되어, 동족 항원을 인식하여 물리적으로 상호작용하는 항체 내 도메인을 나타낸다. 천연의 통상적인 전장 항체 분자는 2개의 통상적인 항원-결합 부위를 가지며, 각각은 중사슬 가변 영역의 부분 및 경사슬 가변 영역의 부분을 포함한다. 통상적인 항원-결합 부위는 가변 영역 도메인 내에 항-평행 베타 스트랜드를 연결하는 루프를 포함한다. 항원 조합 부위는 가변 영역 도메인의 다른 부분들을 포함할 수 있다. 각각의 통상적인 항원-결합 부위는 중사슬 유래의 3개의 초가변 영역 및 경사슬 유래의 3개의 초가변 영역을 포함한다. 초가변 영역들은 또한 상보성-결정 영역 (CDR)이라 불린다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "초가변 영역", "HV", "상보성-결정 영역" 및 "CDR" 및 "항체 CDR"은 상호교환적으로 사용되어, 항체의 항원-결합 부위를 함께 형성하는 각각의 가변 영역 내의 복수의 부분들 중 하나를 나타낸다. 각각의 가변 영역 도메인은 CDR1, CDR2, CDR3 이란 이름의 3개의 CDR을 포함한다. 상기 3개의 CDR 은 선형 아미노산 서열을 따라서 비연속적이나, 접힌 폴리펩티드 내에서 가까이에 위치한다. 상기 CDR 은 가변 도메인의 베타 시트의 평행 가닥(strand)를 결합하는 루프 내에 위치한다. 본원에 기재된 바와 같이, 당업자는 Kabat 또는 Chothia 넘버링(numbering)에 기초하여 CDR을 인지하고, 동정할 수 있다 (예를 들어, [Kabat, E.A. 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 및 [Chothia, C. 등 (1987) J. Mol . Biol. 196:901-917] 참조).
본 발명에서 사용된 바와 같이, 프레임워크 영역 (FR)은 베타 시트 내에 위치하는 항체 가변 영역 도메인 내의 도메인이며; FR 영역은 이들의 아미노산 서열과 관련하여 초가변영역 보다 비교적 더욱 보존적이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "불변 영역" 도메인은 가변 영역 도메인의 서열 보다 상대적으로 더욱 보존적인 아미노산 서열을 포함하는 항체 중사슬 또는 경사슬 내의 도메인이다. 통상의 전장 항체 분자에서, 각 경사슬은 단일 경사슬 불변 영역 (CL) 도메인을 가지며, 각 중사슬은 하나 이상의 중사슬 불변 영역 (CH) 도메인을 포함하며, 이는 CH1, CH2, CH3 및 CH4를 포함한다. 전장 IgA, IgD 및 IgG 아이소타입은 CH1, CH2 CH3 및 힌지 영역을 포함하는 반면, IgE 및 IgM 은 CH1, CH2 CH3 및 CH4를 포함한다. CH1 및 CL 도메인은 항체 분자의 Fab 팔을 확장하여, 항원과의 상호작용 및 항체 팔의 회전에 기여한다. 항체 불변 영역은 이펙터 기능, 예를 들면 이에 제한되지 아니하나, 항체가 특이적으로, 예를 들면, 다양한 세포, 생체분자 및 조직과의 상호작용을 통하여 결합하여 항원, 병원체 및 독소의 제거를 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 항체의 기능적 영역은 최소한 항체의 VH, VL, CH (예를 들면, CH1, CH2 또는 CH3), CL 또는 힌지 영역 도메인, 또는 최소한 이들의 기능적 영역을 포함하는 항체의 부분이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, VH 도메인의 기능적 영역은 (예를 들어, 전체 VH 도메인의 하나 이상의 CDR을 보유함으로써) 전체 VH 도메인의 결합 특이성의 일부 이상을 보유하는 전체 VH 도메인의 최소한의 부분이며, 따라서, VH 도메인의 기능적 영역은, 단독으로 또는 다른 항체 도메인 (예를 들면, VL 도메인) 또는 그의 영역과 조합하여 항원에 결합한다. VH 도메인의 기능적 영역의 예는 VH 도메인의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3를 포함하는 영역이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, VL 도메인의 기능적 영역은 (예를 들어, 전체 VL 도메인의 하나 이상의 CDR을 보유함으로써) 전체 VL 도메인의 결합 특이성의 일부 이상을 보유하는 전체 VL 도메인의 최소한의 부분이며, 따라서, VL 도메인의 기능적 영역은, 단독으로 또는 다른 항체 도메인 (예를 들면, VH 도메인) 또는 그의 영역과 조합하여 항원에 결합한다. VL 도메인의 기능적 영역의 예는 VL 도메인의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3를 포함하는 영역이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 관련한 "특이적으로 결합" 또는 "면역특이적으로 결합"은 본 발명에서 상호교환적으로 사용되며,
항체의 항체 결합 부위(들) 및 항원 사이에 비공유적 상호작용에 의하여 동족 항원과 하나 이상의 비공유 결합을 형성하는 항체 또는 항원-결합 단편의 능력을 나타낸다. 항원은 단리된 항원이거나 바이러스에서 제시될 수 있다. 일반적으로, 바이러스 항원 또는 바이러스에 면역특이적으로 결합하는 (또는 특이적으로 결합하는) 항체는 상기 바이러스 항원에 (또는 바이러스 내 항원 또는 바이러스에) 약 또는 1×107 M-1 또는 1×108 M-1 또는 그 이상의 친화력 상수 Ka 로 (또는 1×10-7 M 또는 1×10-8 M 이하의 해리상수 (Kd)로) 결합하는 것이다. 친화력 상수는 항체 반응에 대한 표준 역학적 방법론, 예를 들어, 면역분석, 표면 플라스몬 공명 (SPR) ([Rich 및 Myszka (2000) Curr . Opin . Biotechnol 11:54; Englebienne (1998) Analyst. 123:1599]), 등온 적정 칼로리측정법 (ITC) 또는 다른 당 분야에 공지된 역학적 상호작용 분석법 (예를 들어, [Paul, ed., Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, New York, pages 332-336 (1989)] 참조; 또한 항-RSV 항체의 결합 친화력 계산을 위한 SPR 및 ITC 법에 대한 예를 기재하는 미국특허 No. 7,229,619 참조)에 의하여 결정될 수 있다. 결합 속도의 실시간 탐지 및 모니터를 위한 장치 및 방법이 공지되어 있으며, 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어, BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Sweden 및 GE Healthcare Life Sciences; Malmqvist (2000) Biochem . Soc . Trans. 27:335). 바이러스 항원 (또는 바이러스)에 면역특이적으로 결합하는 항체는 다른 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 또는 바이러스에 동일하거나 더 낮은 결합 친화력으로 결합할 수 있다. 일반적으로, RSV F 단백질 (또는 RSV 바이러스)에 면역특이적으로 결합하는, 본 발명에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 다른 항원들과 교차-반응하지 않거나, 그러한 항원들에 대하여 실질적으로 (10-100배 이상) 더 낮은 친화력으로 교차 반응한다. 특별한 바이러스 항원 (예를 들면, RSV F 단백질)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편은 예를 들어 면역분석법, 예를 들면, 방사성면역분석법(RIA), 효소-연결 면역흡착 분석법(ELISA), 표면 플라스몬 공명 또는 당업자에게 공지된 다른 기술들에 의해 동정될 수 있다. RSV F 단백질 상의 에피트프에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 일반적으로 실험적 기술들, 예를 들면, 이에 제한되지 아니하나, 면역분석법, 표면 플라스몬 공명 또는 당업자에게 공지된 다른 기술을 사용하여 결정된 임의의 교차-반응성 에피토프에 대하여 더 높은 결합 친화력으로 (단백질 또는 바이러스에서 제시되는) 상기 에피토프에 결합하는 것이다. 단리된 RSV 단백질(즉, 재조합적으로 제조된 단백질), 예를 들면 RSV F 단백질에 면역특이적 결합이 항체가 바이러스의 동일한 면역특이적 결합 및/또는 중화작용을 나타낼 것을 필수적으로 의미하지는 않는다. 상기 측정법 및 성질들은 별개이다. 바이러스 또는 바이러스에서 제시되는 항원에 대한 항체 또는 항원-결합 단편들의 친화력이 결정될 수 있다. 본원의 목적을 위하여, 친화력 또는 관련 용어를 기술할 때, 표적, 예를 들면 단리된 단백질 또는 바이러스가 동정될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표면 플라스몬 공명"은 예를 들면, BiaCore 시스템 (GE Healthcare Life Sciences)을 사용한, 바이오센서 매트릭스 내 단백질 농도의 변경을 탐지함으로써 실시간 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학적 현상이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "다가" 항체는 2 이상의 항원-결합 부위를 포함하는 항체이다. 다가 항체는 2가, 3가, 4가, 5가, 6가, 7가 또는 고차 결합가 항체를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "단일특이적" 항체는 2 이상의 항원-결합 부위를 포함하며, 각 항원-결합 부위가 동일한 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "다중특이적" 항체는 2 이상의 항원-결합 부위를 포함하고, 2 이상의 항원-결합 부위가 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "이중특이적" 항체는 2 이상의 항원-결합 부위를 포함하고, 2개의 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 다중특이적 항체이다. "삼중특이적" 항체는 3 이상의 항원-결합 부위를 포함하고, 3개의 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 다중특이적 항체이며, "사중특이적" 항체는 4 이상의 항원-결합 부위를 포함하고, 4개의 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 다중특이적 항체이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "헤테로2가" 항체는 2개의 항원-결합 부위를 포함하고, 각 항원-결합 부위가 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 이중특이적 항체이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "호모2가" 항체는 2개의 항원-결합 부위를 포함하고, 각 항원-결합 부위가 동일한 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 단일특이적 항체이다. 호모2가 항체는 이에 제한되지 아니하나, 통상의 전장 항체, 조작 또는 합성 전장 항체, 2개의 동일한 항원-결합 단편들의 임의의 다량체, 또는 동일한 항원-결합 도메인을 포함하는 2개의 항원-결합 단편들의 임의의 다량체를 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 다량체화 도메인은 폴리펩티드 분자와 하나 이상의 추가적 폴리펩티드 분자 사이의 안정한 상호작용을 촉진하며, 제1 도메인과의 안정한 다량체를 형성하는 동일하거나 상이한 다량체화 도메인일 수 있는, 상보적인 다량체화 도메인을 각각 포함하는 아미노산 서열을 나타낸다. 일반적으로, 폴리펩티드는 다량체화 도메인에 직접 또는 간접적으로 결합된다. 다량체화 도메인의 예는 면역글로불린 서열 또는 그의 부분, 류신 지퍼, 소수성 영역, 친수성 영역 및 양립가능한 단백질-단백질 상호작용 도메인을 포함한다. 예를 들어, 상기 다량체화 도메인은 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형을 포함한 IgG, IgA, IgE, IgD 및 IgM 및 그의 변형된 형태 유래의 Fc 도메인 또는 그의 부분일 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 이량체화 도메인은 2개의 폴리펩티드 서열 (이에 제한되지 아니하나, 예를 들면, 항체 사슬) 사이의 상호작용을 촉진하는 다량체화 도메인이다. 이량체화 도메인은 이에 제한되지 아니하나 2개의 폴리펩티드 서열들 사이의 이황화결합의 형성을 촉진하는 시스테인 잔기들을 포함하는 아미노산 서열, 예를 들면, 전장 항체 힌지 영역의 전부 또는 일부, 또는 폴리펩티드 사이의 상호작용을 촉진하는 것으로 알려진 아미노산 서열인 하나 이상의 이량체화 서열 (예를 들면, 류신 지퍼, GCN4 지퍼)을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "Fc" 또는 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한, 항체 중사슬의 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 따라서, Fc 는 IgA, IgD 및 IgE의 마지막 2개 불변 영역 면역글로불린 도메인, 또는 IgE 및 IgM의 마지막 3개 불변 영역 면역글로불린 도메인을 나타낸다. 선택적으로, Fc 도메인은 상기 도메인들의 신축성 힌지 N-말단의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. IgA 및 IgM에 대하여, Fc 는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG의 Fc 도메인의 예로, Fc 도메인은 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3, 선택적으로, Cγ1 및 Cγ2 사이의 힌지의 전부 또는 일부를 포함한다. Fc 영역의 경계는 변할 수 있지만, 전형적으로, 힌지 영역의 일부 이상을 포함한다. 추가로, Fc 는 또한 임의의 대립유전자 또는 종 변이체 또는 임의의 변이체 또는 변형된 형태, 예를 들면, FcR에 대한 결합을 변경하거나, Fc-매개 이펙터 기능을 변경하는 임의의 변이체 또는 변형된 형태를 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "Fc 키메라"는 하나 이상의 폴리펩티드가 Fc 영역 또는 그의 유도체에 직접 또는 간접적으로 연결된 키메라 폴리펩티드를 나타낸다. 전형적으로, Fc 키메라는 다른 폴리펩티드, 예를 들면, 항-RSV 항체 단편과 면역글로불린의 Fc 영역을 결합한다. 변형된 Fc 폴리펩티드의 변이체는 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "단백질 전달 도메인" 또는 "PTD"는 단백질, 예를 들면, 본 발명에서 제공되는 항체에 접합되어 표적 세포 내로의 단백질의 부착 및/또는 흡수를 촉진할 수 있는 펩티드 도메인이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "태그" 또는 "에피토프 태그"는 본 발명에서 제공되는 항체와 같은 폴리펩티드의 N- 또는 C- 말단에 일반적으로 부가된 아미노산 서열을 나타낸다. 폴리펩티드에 융합된 태그의 도입은 폴리펩티드 정제 및/또는 검출을 용이하게 할 수 있다. 일반적으로, 태크 또는 태그 폴리펩티드는 항체에 의해 인식되는 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기들을 갖거나 검출 또는 정체를 위하여 제공될 수 있지만, 연결된 키메라 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 만큼 충분히 짧은 폴리펩티드를 나타낸다. 태그 폴리펩티드는 전형적으로 그에 특이적으로 결합하는 항체가 그에 연결된 폴리펩티드 내 에피토프와 실질적으로 교차-반응하지 않도록 충분히 고유한 항체이다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 5 또는 6개 이상의 아미노산을 가지며, 통상 약 8-50개 아미노산 잔기들 사이, 전형적으로 9-30개 잔기들 사이이다. 태그는 다량체 내에 하나 이상의 키메라 폴리펩티드에 연결될 수 있으며, 다량체의 검출 또는 시료 또는 혼합물로부터 그의 회수를 가능하게 한다. 상기 태그는 널리 공지되어 있으며, 용이하게 합성되고 설계될 수 있다. 태그 폴리펩티드의 예는 친화성 정제를 위하여 사용되는 것들을 포함하며, His 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5, (Field 등 (1988) Mol . Cell . Biol . 8:2159-2165); c-myc 태그 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (예를 들어 [Evan 등 (1985) Molecular and Cellular Biology 5 :3610-3616] 참조); 및 단순포진바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 (Paborsky 등 (1990) Protein Engineering 3:547-553 (1990)를 포함한다. 에피토프-태그된 항체의 검출에 사용하기 위한 항체는 전형적으로 본 발명에서 이차 항체로써 언급된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "폴리펩티드"는 공유결합된 2 이상의 아미노산들을 의미한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본 발명에서 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "펩티드"는 2 내지 약 또는 40 개의 아미노산 길이인 폴리펩티드를 지칭한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "아미노산"은 아미노기와 카르복실산기를 포함하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 둘 이상의 아미노산을 포함한다. 본원의 목적을 위하여, 제공되는 항체 내에 포함된 아미노산은 20개의 천연-발생 아미노산(표 1), 비천연 아미노산 및 아미노산 유사체(즉, α-탄소가 측쇄를 갖는 아미노산)을 포함한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 본원에 나타난 폴리펩티드의 다양한 아미노산 서열들 내에 발생하는 아미노산들은 그들의 널리 공지된, 3-문자 또는 1-문자 약어 (표 1 참조)에 따라 확인된다. 다양한 핵산 분자 및 단편들 내에 발생하는 뉴클레오티드들은 당 분야에서 통상적으로 사용되는 표준 1-문자 명명법으로 명명된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는 그 펩티드 결합에서 폴리펩티드의 화학적 소화(가수분해)시 형성되는 아미노산을 나타낸다. 본원에 기재된 아미노산 잔기는 일반적으로 "L" 이성체 형태이다. "D" 이성체 형태 내 잔기는 원하는 기능적 성질이 폴리펩티드에 의해 유지되는 한 임의의 L-아미노산 잔기로 대체될 수 있다. NH2는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노기를 나타낸다. COOH는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 존재하는 유리 카르복실기를 나타낸다. J. Biol . Chem., 243:3557-59(1968)에 기재되고, 37 C.F.R. §§1.821-1.822를 채택한 표준 폴리펩티드 명명법을 유지하면서, 아미노산 잔기들에 대한 약어를 표 1에 나타낸다:
[표 1]
Figure 112012100085696-pct00001
본원에 식으로 나타난 아미노산 잔기들의 모든 서열은 아미노 말단부터 카르복시 말단으로의 통상적인 방향인 좌측에서 우측으로의 방향성을 가진다. 또한, "아미노산 잔기"라는 구는 대응 표(표 1)에 기재된 아미노산 및 변형된, 비천연 아미노산 및 희귀 아미노산을 포함하도록 정의된다. 또한, 아미노산 잔기 서열의 시작 또는 끝의 대쉬(dash)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가적 서열에, 또는 아미노-말단기, 예를 들면, NH2에, 또는 카르복실-말단기, 예를 들면, COOH에 대한 펩티드 결합을 나타낸다.
펩티드 또는 단백질에서, 아미노산의 적절한 보존적 치환은 당업자에게 공지되어 있으며, 생성되는 분자의 생물학적 활성을 변경시키지 않고 일반적으로 만들어 질 수 있다. 당업자는 일반적으로 폴리펩티드의 비본질적 영역 내 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인식한다 (예를 들면, Watson 등, Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224 참조).
그러한 치환은 아래 표 2에 기재된 예시적인 치환체들에 따라 이루어질 수 있다:
[표 2]
Figure 112012100085696-pct00002
다른 치환들이 또한 허용될 수 있으며, 다른 공지의 보존적 또는 비보존적 치환에 따라 또는 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "천연적으로 발생하는 아미노산"은 폴리펩티드 내에 존재하는 20개의 L-아미노산을 나타낸다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "비-천연 아미노산"은 천연 아미노산과 유사한 구조를 가지나 천연 아미노산의 구조 및 반응성을 흉내내도록 구조적으로 변형된 유기 화합물을 지칭한다. 비-천연적으로 발생하는 아미노산은 예를 들면 20개의 천연-발생 아미노산 이외의 아미노산 또는 유사체를 포함하며, 아미노산의 D-이소스테레오머를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비-천연 아미노산의 예는 당업자에게 공지되어 있으며, 이에 제한되지 아니하나, 2-아미노아디프산 (Aad), 3-아미노아디프산 (Baad), β-알라닌/β-아미노-프로피온산 (Bala), 2-아미노부티르산 (Abu), 4-아미노부티르산/피페리딘산 (4Abu), 6-아미노카프로산 (Acp), 2-아미노헵타노산 (Ahe), 2-아미노이소부티르산 (Aib), 3-아미노이소부티르산 (Baib), 2-아미노피멜산 (Apm), 2,4-디아미노부티르산 (Dbu), 데스모신 (Des), 2,2'-디아미노피멜산 (Dpm), 2,3-디아미노프로피온산 (Dpr), N-에틸글리신 (EtGly), N-에틸아스파라긴 (EtAsn), 히드록시리신 (Hyl), 알로-히드록시리신 (Ahyl), 3-히드록시프롤린 (3Hyp), 4-히드록시프롤린 (4Hyp), 이소데시모신 (Ide), 알로-이소류신 (Aile), N-메틸글리신, 사르코신 (MeGly), N-메틸이소류신 (MeIle), 6-N-메틸리신 (MeLys), N-메틸발린 (MeVal), 노르발린 (Nva), 노르류신 (Nle) 및 오르니틴 (Orn)을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "천연 폴리펩티드" 또는 "천연 핵산" 분자는 각각 자연계에서 발견될 수 있는 폴리펩티드 또는 핵산 분자이다. 천연 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 야생형 형태이다. 천연 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 폴리펩티드의 우세형 또는 임의의 그의 대립유전자 또는 기타 천연 변이체일 수 있다. 본 발명에서 제공되는 변이체 폴리펩티드 및 핵산 분자는 천연형 폴리펩티드 및 핵산 분자와 비교하여 변형들을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 야생형은 유전자 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 코팅 서열에 의해 코딩되는 형태이다. 일반적으로, 유전자, 또는 그에 의해 코딩되는 분자의 야생형은 기능 또는 구조를 변경하는 돌연변이 또는 기타 변형들을 포함하지 않는다. 용어 야생형은 또한 종 간 발생하는 대립유전자 변이를 갖는 형태들을 포함한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 우세형은 유전자로부터 제조된 주된 형태인 분자의 형태를 나타낸다. "우세 형"은 공급원에 따라 다양하다. 예를 들어, 상이한 세포 또는 조직 형은 예를 들어 선택적 스플라이싱 및/또는 선택적 단백질 프로세싱에 의하여 폴리펩티드의 상이한 형태들을 생성할 수 있다. 각 세포 또는 조직 형에서, 상이한 폴리펩티드는 "우세형"일 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "대립유전자 변이체" 또는 "대립유전자 변이"는 동일한 염색체 위치를 차지하는 유전자의 둘 이상의 임의의 선택적인 형태를 의미한다. 대립유전자 변이는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하고, 군집 내 표현형의 다형성(polymorphism)을 초래한다. 유전자 돌연변이는 침묵적이거나(코딩된 폴리펩티드에 변화 없음), 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 용어 "대립유전자 변이체"는 또한 유전자의 대립유전자 변이체에 의해 코딩되는 단백질을 지시하기 위하여 본 발명에서 사용된다. 전형적으로 유전자의 참조 형태는 군집 또는 한 종의 참조 구성원으로부터의 폴리펩티드의 야생형 형태 및/또는 우세형 형태를 코딩한다. 전형적으로, 대립유전자 변이체는 종 간 변이체를 포함하며, 전형적으로 동일 종으로부터의 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 아미노산 동일성을 가지며; 동일성의 정도는 유전자, 및 비교가 이종간인지 종내인지에 좌우된다. 일반적으로, 이종간 대립유전자 변이체는 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 약 또는 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성 또는 그 이상을 가지며, 폴리펩티드의 야생형 및/또는 우세형 형태와 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 포함한다. 본 발명에서 대립유전자 변이체에 대한 언급은 일반적으로 동일한 종의 구성원 간의 단백질 내 변이를 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 본 발명에서 "대립유전자 변이체"와 상호교환적으로 사용되는 "대립유전자"는 그들의 유전자 또는 일부의 대안적인 형태를 의미한다. 대립유전자는 상동 염색체 상의 동일 장소 또는 위치를 차지한다. 피험자가 한 유전자의 2개의 동일한 대립유전자를 가지는 경우 그 피험자는 그 유전자 또는 대립유전자에 대해 동형접합성(homozygous)이라고 언급된다. 피험자가 한 유전자의 2개의 상이한 대립유전자를 가지는 경우 그 피험자는 그 유전자에 대해 이형접합성(heterozygous)이라고 언급된다. 특정 유전자의 대립유전자는 단일 뉴클레오티드 또는 여러 뉴클레오티드에서 서로 상이할 수 있으며, 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 유전자의 대립유전자는 또한 돌연변이를 포함하는 유전자의 형태일 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "종 변이체"는 다른 종들, 마우스 및 인간과 같은 상이한 포유류 종들 및 바이러스 및 박테리아와 같은 미생물 종들을 포함한 이종 간 폴리펩티드의 변이체를 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드 "도메인"은 구조적으로 및/또는 기능적으로 구분가능하거나 정의가능한 폴리펩티드의 부분 (3개 이상, 통상 5, 10 이상의 아미노산들의 서열)이다. 폴리펩티드 도메인의 예는 하나 이상의 구조적 모티프 (예를 들면, 루프 영역으로 연결된 알파 헬릭스 및/또는 베타 스트랜드의 조합)으로 이루어진 폴리펩티드 내에 독립적으로 접힌 구조를 형성할 수 있거나/있고, 특별한 기능적 활성, 예를 들면, 효소활성, 이량체화 또는 항원-결합에 의해 인식되는 폴리펩티드의 부분이다. 폴리펩티드는 하나 이상, 전형적으로 1 초과의 구별된 도메인들을 가질 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 하나 이상의 구조적 도메인 및 하나 이상의 기능적 도메인을 가질 수 있다. 단일의 폴리펩티드 도메인은 구조 및 기능에 기초하여 구별될 수 있다. 도메인은 연속적 선형 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 도메인은 복수의 불연속적인 아미노산 부분들을 포함할 수 있으며, 이는 폴리펩티드의 선형 아미노산 서열을 따라 불연속적이다. 일반적으로, 폴리펩티드는 복수의 도메인을 가진다. 예를 들어, 항체 분자의 각 중사슬 및 각 경사슬은 복수의 면역글로불린 (Ig) 도메인을 포함하며, 각각은 약 110개 아미노산 길이이다.
당업자는 폴리펩티드 도메인에 친숙하며, 다른 그러한 도메인과 구조적 및/또는 기능적 상동성에 의하여 이들을 확인할 수 있다. 본원의 예로써, 정의가 제공되나, 명칭에 의해 특정 도메인을 인식하는 것은 당 분야의 기술 수준 내에 잘 알려진 것으로 이해된다. 필요하다면, 적절한 소프트웨어를 사용하여 도메인을 확인할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드의 기능적 영역은 1개 이상의 기능적 도메인(특별한 기능, 예를 들어 항원-결합, DNA 결합, 리간드 결합 또는 이량체화, 또는 효소 활성, 예를 들어 키나제 활성 또는 단백질가수분해 활성을 통하여, 예를 들면 생체물질과 상호작용할 수 있는 능력을 부여함)을 포함하는 폴리펩티드의 영역이다; 폴리펩티드의 기능적 영역의 예는 항체 도메인, 예를 들면, VH, VL, CH, CL, 및 이들의 부분, 예를 들면, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 CDR, 또는 항원-결합 부분들, 예를 들면, 항체 결합 부위가 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드의 구조적 영역은 1 이상의 구조적 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 영역이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드, 예를 들면, 항체의 "성질"은 이에 제한되지 아니하나 결합 특이성, 구조적 배치 또는 형태, 단백질 안정성, 단백질가수분해에 대한 저항성, 구조적 안정성, 열적 내성, 및 pH 조건에 대한 내성을 포함한 폴리펩티드에 의해 나타나는 임의의 성질을 의미한다. 성질의 변화는 폴리펩티드의 "활성"을 변경할 수 있다. 예를 들어, 항체 폴리펩티드의 결합 특이성의 변화는 항원에 결합능 및/또는 다양한 결합 활성들, 예를 들면, 친화력 또는 결합력 또는 폴리펩티드의 인 비보 활성을 변경할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드, 예를 들면, 항체의 "활성" 또는 "기능적 활성"은 폴리펩티드에 의해 나타나는 임의의 활성을 나타낸다. 상기 활성들은 실험적으로 결정될 수 있다. 활성의 예는 이에 제한되지 아니하나 예를 들어 항원-결합, DNA 결합, 리간드 결합 또는 이량체화, 효소활성, 예를 들어, 키나제 활성 또는 단백질가수분해 활성을 통한 생체분자와 상호작용하는 능력을 포함한다. 항체(항체 단편 포함)에 대하여, 활성은 이에 제한되지 아니하나 특정 항원에 특이적으로 결합하는 능력, 항원-결합의 친화력 (예를 들면, 고 또는 저 친화력), 항원-결합의 결합력 (예를 들면, 고 또는 저 결합력), 결합속도(on-rate), 해리속도(off-rate), 이펙터 기능, 예를 들어, 항원 중화 또는 제거, 바이러스 중화 촉진능, 및 인 비보 활성, 예를 들면, 병원체의 감염 또는 침습을 예방하거나, 제거를 촉진하거나, 특별한 조직 또는 체액 또는 세포를 투과하는 능력을 포함한다. 활성은 알려진 측정법, 예를 들면, ELISA, 유세포분석기, 표면 플라스몬 공명 또는 결합- 또는 해리-속도를 측정하는 동등한 측정법, 면역조직화학법 및 면역형광조직학 및 현미경관찰, 세포-기반 측정법, 유세포 분석 및 결합 분석법 (예를 들면, 패닝(panning) 분석)을 사용하여 인 비트로 또는 인 비보에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 항체 폴리펩티드에 대하여, 활성은 결합 친화력, 결합력 및/또는 결합계수(예를 들면, 결합-/해리-속도), 및 기타 인 비트로 활성을 측정하거나, 다양한 인 비보 효과, 예를 들어, 면역 효과, 예를 들면, 항원 제거, 항체의 조직 내 침투 또는 국재화, 질환으로부터 보호, 예를 들면, 감염, 혈청 또는 기타 체액 항체 역가, 또는 당 분야에 널리 알려진 다른 분석법에 의해 측정될 수 있다. 폴리펩티드가 활성을 나타낸다는 것을 지시하는 측정 결과는 인 비보 폴리펩티드의 활성과 관련될 수 있으며, 여기서, 인 비보 활성은 치료 활성 또는 생물학적 활성으로써 언급될 수 있다. 변형된 폴리펩티드의 활성은 비변형 폴리펩티드의 활성의 백분률의 임의의 수준, 예를 들면, 비변형 폴리펩티드에 비교하여 활성의 1%, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 변형된 (예를 들면, 변이체) 항체의 기능 및 활성을 결정하는 측정법은 당 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "치료 활성"은 치료용 폴리펩티드의 인 비보 활성을 나타낸다. 일반적으로, 치료 활성은 질환 또는 상태를 치료하는데 사용되는 활성이다. 변형된 폴리펩티드의 치료 활성은 비변형 폴리펩티드의 치료 활성의 백분률의 임의의 수준, 예를 들면, 비변형 폴리펩티드와 비교하여 치료활성의 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % 이상일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "하나 이상의 활성을 나타낸다" 또는 "하나 이상의 활성을 보유한다"는 변형을 포함하지 않는 표적 또는 비변형 폴리펩티드와 비교하여 변형된 폴리펩티드, 예를 들어, 상기 제공된 방법에 따라 제조된 변이체, 예를 들어, 변형된, 예를 들면 변이체 항체 또는 기타 치료용 폴리펩티드 (예를 들면, 변형된 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편)에 의해 나타나는 활성을 나타낸다.
표적 폴리펩티드의 활성을 보유하는 변형된, 또는 변이체 폴리펩티드는 개선된 활성을 나타내거나, 비변형 폴리펩티드의 활성을 보유할 수 있다. 몇몇 예에서, 변형된, 또는 변이체 폴리펩티드는 표적 또는 비변형 폴리펩티드와 비교하여 증가된 활성을 보유할 수 있다. 몇몇 예에서, 변형된 또는 변이체 폴리펩티드는 비변형 또는 표적 폴리펩티드와 비교하여 감소된 활성을 보유할 수 있다. 변형된, 또는 변이체 폴리펩티드의 활성은 비변형 또는 표적 폴리펩티드의 활성의 백분률의 어느 수준, 예를 들면, 비변형 또는 표적 폴리펩티드와 비교하여 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % 이상의 활성일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 다른 구현예에서, 활성의 변화는 비변형 또는 표적 폴리펩티드 보다 약 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배 이상 더 크다. 활성의 보유의 측정은 보유된 활성에 좌우된다. 그러한 측정은 인 비트로 또는 인 비보에서 수행될 수 있다. 활성은 예를 들어 당 분야에 공지되고, 하기 실시예에 기재된 활성 측정법, 이에 제한되지 아니하나 예를 들면 ELISA 및 패닝 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 비변형 또는 표적 폴리펩티드와 비교한 변형된 또는 변이체 폴리펩티드의 활성은 또한 폴리펩티드의 투여 후 인 비보 치료적 또는 생물학적 활성 또는 결과에 의하여 측정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "평가"는 시료 내 존재하는 프로테아제 또는 이의 도메인의 활성에 대한 절대값의 획득 및 또한 상기 활성의 수준을 나타내는 지표, 비율, 백분률, 시각적 또는 활성의 수준을 지시하는 다른 값의 획득과 관련한 정량적 및 정성적 결정을 포함하는 것을 의도한다. 평가는 직접적 또는 간접적일 수 있으며, 실제 검출되는 화학 종은 물론 단백질 가수분해 산물 그 자체일 필요는 없으나, 예를 들면 그의 유도체 또는 어떤 추가 물질일 수 있다. 예를 들면, SDS-PAGE 및 쿠마시 블루를 사용한 단백질 염색에 의한 보체 단백질의 절단 산물의 검출.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "핵산"은 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산 (RNA)을 포함한, 일반적으로 인산이에스테르 결합에 의해 2 이상 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체를 나타낸다. 또한, 용어 "핵산"은 핵산의 유사체, 예를 들면, 펩티드 핵산(PNA), 포스포로티오네이트 DNA 및 기타 유사체 및 유도체 또는 그의 조합이 포함된다. 핵산 분자는 또한 예를 들어, 뉴클레오티드 유사체 또는 인산이에스테르 결합 이외의 "골격" 결합, 예를 들어, 인산삼에스테르 결합, 포스포르아미데이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테로 결합 또는 펩티드 결합 (펩티드 핵산)을 포함하는 DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 상기 용어는 또한 뉴클레오티드 유사체, 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중-가닥 핵산으로부터 만들어진 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 등가물, 유도체, 변이체 및 유사체와 같은 것들을 포함한다. 디옥시리보뉴클레오티드는 디옥시아데노신, 디옥시시티딘, 디옥시구아노신 및 디옥시티미딘을 포함한다. RNA에 대하여 우라실 염기는 우리딘이다.
핵산은 예를 들어 핵산분자의 중량 분별을 가능하게 하는 중량 변형 뉴클레오티드; 핵산분자의 검출을 허용하게 하는 형광, 방사성, 발광성 또는 화학발광성 표지를 포함하는 뉴클레오티드; 또는 반응성 기, 예를 들면, 핵산분자의 고체 지지체에 고정을 촉진하는 비오틴 또는 티올기를 포함하는 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 분자는 또한 선택적으로 절단가능한, 예를 들어 화학적으로, 효소적으로 또는 광분해적으로 절단가능한 하나 이상의 골격 결합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 하나 이상의 디옥시리보뉴클레오티드에 이어 하나 이상의 리보뉴클레오티드, 이어서 하나 이상의 디옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 서열은 염기 가수분해에 의해 리보뉴클레오티드 서열에서 절단될 수 있다. 핵산은 또한 상대적으로 절단에 저항성인 하나 이상의 결합, 예를 들어 키메릭(chimeric) 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함할 수 있으며, 이는 펩티드 핵산 결합에 의해 연결된 뉴클레오티드, 및 인산이에스테르 결합 또는 다른 적절한 결합에 의해 연결된 3' 말단에 하나 이상 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 이는 폴리머라제에 의해 확장될 수 있다. 펩티드 핵산 서열은 널리 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, Weiler 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25:2792-2799 참조).
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산 분자"는 디옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)을 포함한, 일반적으로 인산이에스테르 결합에 의해 서로 결합된 2 이상의 연결된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어 뉴클레오티드 유사체, 또는 인산이에스테르 결합 이외의 "골격" 결합, 예를 들어 인산삼에스테르 결합, 포스포르아미데이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합 또는 펩티드 결합 (펩티드 핵산)을 포함하는 DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 (핵산 분자)는 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 디옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA) 뿐 아니라 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체들을 포함한다. 상기 용어는 또한 뉴클레오티드 유사체, 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중-가닥 폴리뉴클레오티드로부터 만들어진 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 등가물, 유도체, 변이체 및 유사체를 포함한다. 디옥시리보뉴클레오티드는 디옥시아데노신, 디옥시시티딘, 디옥시구아노신 및 디옥시티미딘을 포함한다. RNA에 대하여 우라실 염기는 우리딘이다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 중량 분별을 가능하게 하는 중량 변경 뉴클레오티드; 폴리뉴클레오티드의 검출을 가능하게 하는 형광, 방사성, 발광성 또는 화학발광성 표지를 포함하는 뉴클레오티드; 또는 반응성 기, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드의 고체 지지체에 고정을 촉진하는 비오틴 또는 티올기를 포함하는 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 선택적으로 절단가능한, 예를 들어 화학적으로, 효소로 또는 광분해로 절단가능한 하나 이상의 골격 결합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 디옥시리보뉴클레오티드에 이어 하나 이상의 리보뉴클레오티드, 이어서 하나 이상의 디옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 서열은 염기 가수분해에 의해 리보뉴클레오티드 서열에서 절단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 상대적으로 절단에 저항성인 하나 이상의 결합, 예를 들어 키메릭 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함할 수 있으며, 이는 펩티드 핵산 결합에 의해 연결된 폴리펩티드, 및 인산이에스테르 결합 또는 다른 적절한 결합에 의해 연결된 3' 말단에 하나 이상 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 이는 폴리머라제에 의해 확장될 수 있다. 펩티드 핵산 서열은 널리 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, Weiler 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25:2792-2799 참조). 핵산 분자(폴리뉴클레오티드)의 예는 합성 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 듀플렉스, 필인(fill-in) 프라이머를 포함한 프라이머 및 올리고뉴클레오티드 듀클렉스 카세트를 포함한 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "DNA 구성물(construct)"은 자연계에서 발견되지 않는 방식으로 결합되고 병치된 DNA 분절을 포함하는, 단일 또는 이중 가닥의, 선형 또는 원형 DNA 분자이다. DNA 구성물은 인간 조작의 결과로써 존재하며, 조작된 분자의 클론 및 다른 카피들을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "DNA 분절(segment)"은 특이한 성질을 가지는 더 큰 DNA 분자의 부분이다. 예를 들면, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분절은 더 큰 DNA 분자, 예를 들면, 5'에서 3' 방향으로 해독시 특정 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드 또는 플라스미드 단편의 일부분이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 양성 가닥 폴리뉴클레오티드는 음성 가닥 또는 "안티센스" 가닥에 상보적인 "센스 가닥" 또는 폴리뉴클레오티드 듀플렉스를 나타낸다. 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 경우, 센스 가닥은 폴리펩티드로 번역되는 mRNA 가닥과 동일한 가닥인 반면, 안티센스 가닥은 상기 가닥에 상보적이다. 듀플렉스의 양성 및 음성 가닥은 서로 상보적이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 유전자 요소는 폴리펩티드 또는 단백질 또는 그의 영역을 코팅하는 유전자 또는 그의 임의의 영역을 나타낸다. 몇몇 예에서 유전자 요소는 융합 단백질이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 핵산 분자의 조절 영역은 작동가능하게 연결된 유전자의 발현에 양성적 또는 음성적으로 영향을 주는 시스-액팅 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 조절 영역은 유전자의 유도성(즉, 발현 증가를 위한 물질 또는 자극을 필요로 함) 발현을 수여하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 유도인자(inducer)가 존재하거나 농도가 증가한 경우, 유전자 발현이 증가될 수 있다. 조절 영역은 또한 유전자 발현의 억제를 수여하는 서열을 포함한다 (즉, 물질 또는 자극이 전사를 감소시킴). 억제인자(repressor)가 존재하거나 농도가 증가한 경우, 유전자 발현은 감소될 수 있다. 조절 영역은 다양한 인 비보 생물학적 활성, 예를 들면, 세포 증식, 세포 성장 및 사멸, 세포 분화 및 면역 조절에 영향을 주거나, 조절하거나, 제어하는 것으로 알려져 있다. 조절 영역은 일반적으로 하나 이상의 트랜스-액팅 단백질에 결합하며, 이는 유전자의 전사를 증가시키거나 감소시킨다.
유전자 조절 영역의 특별한 예는 프로모터 및 인핸서이다. 프로모터는 전사 또는 번역 시작 부위 주변, 일반적으로 번역 시작 부위의 5'에 위치한다. 프로모터는 대개 번역 시작 부위의 1 Kb 이내에 위치하나, 더 멀리, 예를 들어, 2Kb, 3Kb, 4Kb, 5Kb 이상에서 10 Kb 까지 위치할 수 있다. 인핸서는 유전자의 5' 또는 3'에 위치하거나, 엑손 또는 인트론 내 또는 그의 부분에 위치하는 경우 유전자 발현에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 인핸서는 또한 유전자로부터 상당한 거리, 예를 들어, 약 3 Kb, 5 Kb, 7 Kb, 10 Kb, 15 Kb 이상의 위치에서 작용할 수 있다.
조절 영역은 도한 프로모터 영역에 추가로 번역을 촉진하는 서열, 인트론에 대한 스플라이싱 신호, 프레임 내 mRNNA의 번역을 허용하는 유전자의 정확한 판독 프레임의 유지, 정지 코돈, 리더 서열 및 융합 파트너 서열, 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), 다중유전자 또는 폴리시스트론 메세지의 제작 요소, 관심있는 유전자의 전사체의 적절한 폴리아데닐화를 제공하는 폴리아데닐화 신호, 및 정지 코돈을 포함하며, 임의로 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 핵산 서열, 영역, 요소 또는 도메인을 언급할 때의 "작동가능하게 연결된"은 상기 핵산 영역들이 서로 기능적으로 관련된 것을 의미한다. 예를 들어, 리더 펩티드를 코딩하는 핵산은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 이에 의하여 핵산 분자는 전사되고, 번역되어 기능적 융합 단백질을 발현할 수 있으며, 여기서, 리더 서열은 융합 폴리펩티드의 분비를 달성한다. 몇몇 예에서 제1 폴리펩티드 (예, 리더 서열)를 코딩하는 핵산은 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되며, 핵산 분자는 단일 mRNA 전사체로써 전사되나, mRNA 전사체의 번역은 두 폴리펩티드가 1개로 발현하게 된다. 예를 들어 앰버 정지 코돈은 제1 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 제2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 사이에 위치하여, 부분적 앰버 억제자 세포내로 도입시 생성되는 단일 mRNA 전사체는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 생성하도록 번역되거나, 제1 폴리펩티드 만을 생성하도록 번역될 수 있다. 다른 예에서, 프로모터는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 이에 의하여 프로모터는 핵산의 전사를 조절하거나 매개한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 예를 들어, 합성 핵산 분자 또는 합성 유전자 또는 합성 펩티드의 언급과 관련한 "합성"은 재조합 방법 및/또는 화학적 합성법에 의해 생성된 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자를 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 재조합 DNA 방법을 사용한 재조합 수단에 의한 제조는 클로닝된 DNA에 의해 코딩되는 단백질 발현을 위한 분자 생물학의 잘 알려진 방법의 사용을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "발현"은 폴리뉴클레오티드의 전사 및 번역에 의하여 폴리펩티드가 생성되는 과정을 의미한다. 폴리펩티드의 발현 수준은 당 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 숙주세포로부터 폴리펩티드의 양을 결정하는 방법에 의하여 평가될 수 있다. 상기 방법은 이에 제한되지 아니하나 ELISA에 의한 세포 용해물 내 폴리펩티드의 정량, 전기영동 후 쿠마시 블루로 염색, 로우리 단백질 측정 및 브래드포드 단백질 측정법을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 벡터를 수용하고, 유지하고, 재생산하고, 증폭하는데 사용되는 세포이다. 숙주 세포는 또한 벡터에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있다. 벡터 내 포함된 핵산은 숙주 세포가 분열하여 핵산이 증폭할 때 복제된다. 한 예에서, 숙주 세포는 유전자 패키지이며, 이는 그 표면에 다양한 폴리펩티드를 발현한다. 다른 예에서, 숙주 세포는 유전자 패키지로 감염된다. 예를 들어, 숙주 세포는 파지-표시 양립성 숙주세포일 수 있으며, 이는 파지 또는 파지미드 벡터로 형질전환되어, 변이체 폴리펩티드를 포함한 융합 단백질들을 발현하는 파지의 패키지를 수용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "벡터"는 적절한 숙주 세포 내로 형질전환시 하나 이상의 외인성 단백질을 발현할 수 있는 복제가능한 핵산이다. 벡터에 대한 언급은 일반적으로 제한효소 절단 및 결찰에 의하여 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산이 도입될 수 있는 벡터들을 포함한다. 벡터에 대한 언급은 또한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터들을 포함한다. 벡터는 핵산의 증폭을 위하여, 또는 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현/표시를 위하여 숙주 세포 내로 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 도입하는데 사용된다. 벡터는 일반적으로 에피솜으로 남아 있으나, 게놈의 염색체 내로 유전자 또는 그의 부분의 통합을 달성하도록 설계될 수 있다. 또한, 인공 염색체, 예를 들면, 효모 인공 염색체 및 포유류 인공 염색체인 벡터가 고려된다. 상기 비히클의 선택 및 사용은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 벡터는 또한 "바이러스 벡터(virus vector)" 또는 "바이러스성 벡터(viral vector)"를 포함한다. 바이러스성 벡터는 (비히클 또는 셔틀로써) 외래 유전자를 세포 내로 운반하도록 외래 유전자에 작동가능하게 연결된 제작된 바이러스이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "발현 벡터"는 DNA 단편의 발현을 실행할 수 있는 조절 서열, 예를 들면 프로모터 영역과 작동가능하게 연결된 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 상기 추가적 분절들(segments)은 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함할 수 있으며, 임의적으로는 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 선별마커, 인핸서, 폴리아데닐화 서열 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 두 요소를 모두 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예를 들면, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입시, 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 다른 벡터를 의미한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능한 것들 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "올리고"는 동의어로 사용된다. 올리고뉴클레오티드는 제한된 길이의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 당업자는 올리고뉴클레오티드가 일반적으로 약 또는 250 이하, 전형적으로 약 또는 200 이하, 전형적으로 약 또는 100 이하의 뉴클레오티드 길이인 것으로 인식한다. 전형적으로 본 발명에서 제공되는 올리고뉴클레오티드는 합성 올리고뉴클레오티드이다. 합성 올리고뉴클레오티드는 약 또는 250 또는 200 뉴클레오티드 보다 적은 길이, 예를 들면, 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 보다 짧은 길이의 뉴클레오티드를 포함한다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드이다. 끝의 "머"는 올리고뉴클레오티드의 길이를 나타내는데 사용될 수 있으며, 예를 들어, "100-머" 는 100 뉴클레오티드 길이를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 언급하는데 사용될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 합성 올리고뉴클레오티드의 예는 양성 및 음성 가닥 올리고뉴클레오티드, 무작위화 올리고뉴클레오티드, 참조 서열 올리고뉴클레오티드, 주형 올리고뉴클레오티드 및 필-인 프라이머가 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 합성 올리고뉴클레오티드는 화학 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드이다. 화학적 올리고뉴클레오티드 합성법은 널리 공지되어 있다. 임의의 공지된 합성법이 상기 제공된 방법에서 설계되고 사용될 수 있다. 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 보호기를 포함하는 단일 뉴클레오티드 단량체들 또는 뉴클레오티드 삼중체를 화학적으로 결합하여 만들어질 수 있다. 전형적으로, 포스포라미디트, 보호기를 갖는 단일 뉴클레오티드는 한번에 하나씩 첨가된다. 합성은 전형적으로 올리고뉴클레오티드의 3' 말단과 함께 시작된다. 3' 터미날 포스포라미디트는 고체 지지체에 부착되고, 합성은 맨 마지막의 5' 말단에 각각의 포스포라미디트를 첨가함으로써 진행된다. 각각의 첨가 후, 보호기가 가장 최근에 첨가된 염기의 5' 인산기로부터 제거되고, 다른 포스포라미디트의 첨가를 가능하게 한다. 자동화 합성기는 일반적으로 약 150 까지에서 약 200 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 전형적으로, 상기 제공된 방법에서 설계되고, 사용되는 올리고뉴클레오티드는 포스포라미디트 단량체로부터 표준 시아노에틸 화학을 사용하여 합성된다. 이러한 표준법으로 제조된 합성 올리고뉴클레오티드는 Integrated DNA Technologies (IDT) (Coralville, IA) 또는 TriLink Biotechnologies (San Diego, CA)로부터 구입할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "프라이머"는 적절한 조건 하(예를 들면, 4개의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합화제, 예를 들면 DNA 중합효소, RNA 중합효소 또는 역전사효소의 존재)에 적절한 완충액 및 적절한 온도에서 주형-유도(template-directed) 핵산 합성의 개시점으로써 작용할 수 있는 핵산 분자(보다 전형적으로, 서열 동일성을 공유하는 분자들의 풀(pool))를 의미한다. 특정 핵산 분자가 "프로브" 및 "프라이머"로서 제공될 수 있음이 이해될 수 있다. 그러나, 프라이머는 신장을 위한 3' 히드록시기를 가진다. 프라이머는 다양한 방법, 예를 들면 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역-전사효소(RT)-PCR, RNA PCR, LCR, 다중 PCR, 팬핸들(panhandle) PCR, 캡쳐 PCR, 발현 PCR, 3' 및 5' RACE, 제자리(in situ) PCR, 라이게이션-매개 PCR 및 다른 증폭 프로토콜에서 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "프라이머 쌍"은 (예를 들면, PCR에 의해) 증폭되는 서열의 5' 말단과 특이적으로 혼성화하는 5' (상류) 프라이머 및 증폭되는 서열의 3' 말단의 상보물과 특이적으로 혼성화하는 3' (하류) 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 (예를 들면, 프라이머의 2개의 풀)를 의미한다. "프라이머"는 동일한 핵산 분자의 풀로 언급되기 때문에, 프라이머 쌍은 일반적으로 프라이머들의 2 풀의 쌍이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "단일 프라이머" 및 "단일 프라이머 풀"은 동의어로써, 프라이머들의 풀(pool)을 나타내며, 여기서, 풀 내의 각 프라이머는 다른 프라이머 구성원들, 예를 들어, 프라이머들의 풀과 서열 동일성을 가지며, 여기서, 구성원들이 약 또는 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 이상 또는 100 % 동일성을 공유한다. (모두 서열 동일성을 공유하는) 하나의 프라이머 풀 내의 프라이머들은 ((예를 들면, PCR에 의해) 증폭되는 서열의 5' 말단과 특이적으로 혼성화하는) 5' (상류) 프라이머 및 (증폭되는 서열의 3' 말단의 상보물과 특이적으로 혼성화하는) 3' (하류) 프라이머로써 작용한다. 따라서, 하나의 프라이머는 상보적 가닥의 합성을 프라임하고, 중합효소 증폭 반응에서 핵산을 증폭하기 위하여 다른 프라이머 없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 2개의 뉴클레오티드와 관련한 상보성은 2개의 핵산 분자의 혼성화시 서로 2개의 뉴클레오티드가 염기쌍을 이룰 수 있는 능력을 말한다. 상보성을 공유하는 2 핵산 분자는 상보적인 핵산 분자로써 언급되며; 상보적인 핵산 분자의 예는 폴리뉴클레오티드 듀플렉스 내 양성 및 음성 가닥이다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 핵산 분자 또는 그의 영역은 다른 핵산 분자 또는 그의 영역에 상보적이며, 2개의 분자 또는 영역은 서로 특이적으로 혼성화한다. 두 상보적인 핵산 분자는 백분률 상보성으로 묘사될 수 있다. 예를 들면, 서로 특이적으로 혼성화하나, 서로에 관하여 5개의 부조화를 포함하는, 각각 100 뉴클레오티드 길이인 두 핵산 분자는 95% 상보적이라고 언급된다. 100% 상보성으로 가지고 혼성화하는 2개의 핵산 분자에 대하여, 두 분자의 전체 길이를 따라 상보성이 존재할 필요는 없다. 예를 들어, 길이상 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자는 길이상 500개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자의 연속하는 20개 뉴클레오티드 부분에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 만약 20개 뉴클레오티드 부분을 따라 부조화가 발생하지 않으면, 20개 뉴클레오티드 분자는 100% 상보성으로 혼성화한다. 전형적으로, 상보적인 핵산 분자는 상보적인 뉴클레오티드들 사이에 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % 4 %, 3 %, 2 % 또는 1 % 미만의 부조화로 (다른 말로, 약 또는 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 , 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 이상의 상보성으로) 배열된다. 다른 예에서, 상보적인 핵산 분자는 약 또는 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 , 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 상보성 이상을 포함한다. 한 예에서, 상보적인 핵산 분자는 5, 4, 3, 2 또는 1 미만으로 부조화된 뉴클레오티드를 포함한다. 한 예로, 상보적인 뉴클레오티드는 100 % 상보적이다. 필요하다면, 상보성의 백분율은 특정될 수 있다. 전형적으로 2 분자는 이들이 높은 엄격성 조건 하에서 특이적으로 혼성화하도록 선택된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 핵산 분자의 상보적인 가닥은 폴리뉴클레오티드 듀플렉스 내 핵산 분자에 반대되는 가닥과 같은 분자에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오티드의 서열, 예를 들면, 핵산 분자를 의미한다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 듀플렉스 내에, 양성 가닥 올리고뉴클레오티드의 상보적인 가닥은 듀플렉스 내에 양성 가닥 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하는 음성 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 상기 제공된 방법의 한 예에서, 중합효소 반응은 전형적으로 올리고뉴클레오티드 프라이머를 폴리뉴클레오티드에 혼성화하여 시작하는, 듀플렉스를 형성하는 폴리고뉴클레오티드의 상보적인 가닥을 합성하는데 사용된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "특이적으로 혼성화한다"는 핵산 분자(예를 들면, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드)의 다른 핵산 분자에 상보적 염기-쌍에 의한 어닐링(annealing)을 의미한다. 당업자는 특이적 혼성화에 영향을 미치는 인 비트로 및 인 비보 매개변수, 예를 들면 특정 분자의 길이 및 조성에 익숙하다. 인 비트로 혼성화에 특히 관련된 매개변수는 추가로 어닐링 및 세척 온도, 완충액 조성 및 염 농도를 포함한다. 2 핵산 분자는 서로 특이적으로 혼성화하기 위하여 100 % 상보성을 나타낼 필요는 없다. 예를 들면, 서열 상보성, 예를 들어 약 또는 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 % 또는 50 % 이상의 상보성을 공유하는 2 상보적 핵산 분자는 서로 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 인 비트로 혼성화 방법에서 사용되는 매개변수, 예를 들면, 버퍼 성분, 시간 및 온도는 2 핵산 분자의 특이적 혼성화를 위하여 요구되는 백분률 상보성을 변화하는 엄격성에서 조정될 수 있다. 당업자는 특별한 적용을 위하여 핵산 분자의 표적 핵산 분자와 특이적 혼성화를 달성하기 위한 이러한 매개변수들을 쉽게 조정할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "1차 서열"은 폴리펩티드 내 아미노산 잔기들의 서열 또는 핵산 분자 내의 뉴클레오티드들의 서열을 나타낸다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 두 단백질 또는 핵산 사이의 "유사성"은 단백질의 아미노산 서열 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성을 나타낸다. 유사성은 잔기들의 서열 및 그안에 포함된 잔기들의 동일성의 정도에 기초할 수 있다. 단백질 또는 핵산 사이의 유사성의 정도를 평가하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 서열 유사성을 평가하는 한 방법에서, 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 서열들 사이에 최고 수준의 동일성을 나타내는 방식으로 배열된다. "동일성"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 다르지 않은 정도를 나타낸다. 아미노산 서열, 및 어느 정도에서 뉴클레오티드 서열의 배열(alignment)은 또한 아미노산(또는 뉴클레오티드)의 보존적 차이 및/또는 빈번한 치환을 고려할 수 있다. 보존적 차이는 관련된 잔기들의 물리-화학적 성질을 보존하는 것들이다. 배열은 전체적(서열의 전체 길이에 대하여 그리고 모든 잔기들을 포함한, 비교되는 서열의 배열)이거나 지역적(가장 유사한 지역 또는 지역들 만을 포함한 서열의 부분의 배열)일 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드 또는 핵산 분자 또는 그의 영역이 다른 폴리펩티드 또는 핵산 분자 또는 영역에 대하여 "동일성" 또는 "상동성"을 포함하거나 가질 때, 2 분자 및/또는 영역은 약 또는 40% 서열 동일성 이상을 공유하며, 전형적으로 약 또는 50 % 서열 동일성 이상을, 예를 들면, 약 또는 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 이상 또는 100 % 서열 동일성을 공유한다; 동일성의 정확한 백분율은 필요하면 특정될 수 있다. 제2 핵산 분자 또는 영역에 동일하거나 상동인 핵산 분자 또는 그의 영역은 제2 핵산 분자 또는 영역에 100 % 상보적인 핵산 분자 또는 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 동일성은 선택적으로 두 이론적인 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 사이에, 또는 핵산 또는 폴리펩티드 분자와 이론적인 서열 사이에 비교될 수 있다.
서열 "동일성"은 그 자체로 당 분야에서 인식된 의미를 가지며, 두 핵산 또는 폴리펩티드 분자들 또는 영역들 사이의 서열 동일성의 백분율은 공개된 기술을 사용하여 계산될 수 있다. 서열 동일성은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전제 길이를 따라 또는 그 분자의 영역을 따라 측정될 수 있다. (예를 들어: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991 참조). 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 동일성을 측정하는 많은 방법들이 존재하지만, 용어 "동일성"은 당업자에게 널리 알려져 있다 (Carrillo, H. & Lipman, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).
2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 길이를 따라서 비교되는 서열 동일성은 분자의 전체 길이를 따라서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기들의 백분율을 나타낸다. 예를 들면, 폴리펩티드 A 가 100개 아미노산을 가지고, 폴리펩티드 B 가 폴리펩티드 A의 아미노산 1-95에 동일한 95개 아미노산을 가진다면, 그러면 폴리펩티드 B 는 서열 동일성이 폴리펩티드 B의 전체 길이와 비교하여 폴리펩티드 A의 전체 길이를 따라 비교될 때 95 % 동일성을 가진다. 대안적으로, 폴리펩티드 A와 폴리펩티드 B 사이의 서열 동일성은 각 폴리펩티드의 20 아미노산 유사 영역과 같은 영역을 따라서 비교될 수 있다. 이 경우, 폴리펩티드 A 및 B 가 그 영역을 따라 20개 동일한 아미노산을 가진다면, 상기 영역에 대한 서열 동일성은 100 % 이다. 대안적으로, 서열 동일성은 다른 분자의 영역과 비교하여 분자의 길이를 따라서 비교될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드 A 와 폴리펩티드 B 사이의 서열 동일성은 동일한 길이이나 아미노산 치환, 예를 들면 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드를 따라서 비교될 수 있다. 아래 논의되고, 당업자에게 알려진 바와 같이, 동일성을 평가하는 다양한 프로그램 및 방법들이 당업자에게 알려져 있다. 높은 수준의 동일성, 예를 들면, 90 % 또는 95 % 동일성은 소프트웨어 없이 쉽게 결정될 수 있다.
임의의 두개의 핵산 분자가 약 또는 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 가지는지 여부는 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들면, Pearson 등(1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:2444(다른 프로그램은 GCG 프로그램 패키지를 포함한다(Devereux, J., 등, Nucleic Acids Research 12(I):387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., 등, J Molec Biol 215:403(1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, 및 Carillo 등(1988) SIAM J Applied Math 48:1073)에서와 같은 디폴트 매개변수들을 사용한 "FASTA" 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 생물공학 정보를 위한 국립센터(the National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스의 BLAST 함수가 상동성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 다른 상업적으로 또는 대중적으로 사용이능한 프로그램은 DNAStar "MegAlign" 프로그램(Madison, WI) 및 위스콘신대학 유전학 컴퓨터 그룹(the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG)) "Gap" 프로그램(Madison WI)을 포함한다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 백분율 상동성 또는 동일성은 예를 들어 GAP 컴퓨터 프로그램을 사용한 서열 정보를 비교하여 결정될 수 있다(예를 들면, Needleman 등 (1970) J. Mol . Biol . 48:443, Smith 및 Waterman에 의해 개정(1981) Adv . Appl . Math . 2:482). 요약하면, 상기 GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것 내의 기호의 전체 갯수로 나눈, 유사한, 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)들의 수로써 유사성을 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 매개변수는 (1) 1진법(unary) 비교 매트릭스(동일성에 대해 1의 값을, 비동일성에 대해 0의 값을 포함) 및 Schwartz 및 Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 기술된 것과 같은 Gribskov 등(1986) Nucl . Acids Res . 14:6745의 편중 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대하여 3.0의 페널티 및 각각의 갭 내 각각의 기호에 대하여 추가의 0.10 페널티; 및 (3) 말단 갭에 대한 페널티 없음을 포함할 수 있다.
일반적으로, 백분율 서열 동일성의 결정을 위하여, 서열들은 가장 높은 차수의 매치가 얻어지도록 배열된다 (예를 들어: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data , Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073 참조). 서열 동일성에 대하여, 보존적 아미노산의 수가 표준 배열 알고리즘 프로그램으로 결정되어, 각 공급자에 의해 발표된 디폴트 갭 패널티로 사용될 수 있다. 실질적으로 상동인 핵산 분자는 관심 있는 핵산의 길이를 따라서 전형적으로 보통의 엄격성 또는 높은 엄격성으로 특이적으로 혼성화한다. 또한 혼성화 핵산 분자 내에 코돈 대신에 축퇴성 코돈을 포함하는 핵산 분자가 고려된다.
따라서, 용어 "동일성"은, 특정 수와 연관시, 제1 및 제2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 영역들의 서열들 사이, 및/또는 이론적 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 사이에 비교를 나타낸다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "~에 90% 이상 동일한"은 제1 핵산 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 90 내지 99.99 백분율 동일성을 나타낸다. 90% 이상의 수준의 동일성은 예증 목적을 위하여 100 아미노산의 제1 및 제2 폴리펩티드 길이를 비교한다고 상정하여 제1 폴리펩티드 내 아미노산의 10% 이하(즉, 100개 중 10개)가 제2 폴리펩티드의 아미노산과 다르다는 사실을 나타낸다. 유사한 비교를 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 사이에 행할 수 있다. 제1 및 제2 서열 사이의 상기 차이는 폴리펩티드의 전체 길이에 걸쳐 무작위적으로 분포된 점 돌연변이로서 나타날 수 있거나, 또는 이들은 최대 허용가능한, 예를 들면 10/100 아미노산 차이(약 90% 동일성)까지 길이를 달리하는 하나 이상의 위치 내 모여 있을 수 있다. 차이는 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 치환, 삽입, 부가 또는 결실로서 정의된다. 상기 약 85 내지 90% 초과의 상동성 또는 동일성의 수준에서, 결과는 프로그램 및 갭 매개변수 세트에 독립적이고; 그러한 높은 수준의 동일성은 종종 소프트웨어에 의지함이 없이 수동 배열에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 서열의 배열은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 2 이상의 서열을 배열하기 위한 상동성의 사용을 의미한다. 전형적으로, 50% 이상의 동일성으로 관련된 둘 이상의 서열이 배열된다. 서열들의 배열된 세트는 상응하는 위치에서 배열되는 2 이상의 서열을 의미하며, EST와 같은 RNA 및 게놈 DNA 서열과 배열되는 다른 cDNA로부터 유래한 배열 서열(aligning sequence)을 포함할 수 있다.
관련된 또는 변이체 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의하여 배열될 수 있다. 상기 방법들은 전형적으로 매칭을 최대화하고, 수동 배열 및 많은 입수가능한 배열 프로그램(예를 들면, BLASTP) 및 당업자에게 공지된 다른 것들을 사용한 방법들과 같은 방법들을 포함한다. 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 배열함으로써, 당업자는 안내된 대로, 보존적이고 동일한 아미노산 잔기들을 사용하여 유사한 부분 또는 위치들을 확인할 수 있다. 더구나, 당업자는 또한 인간 및 비-인간 서열들 사이에 상응하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기들을 찾기 위하여 안내된 대로 보존적 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기들을 사용할 수 있다. 상응하는 위치는 또한 구조적 배열에 기초하여, 예를 들면 단백질 구조의 컴퓨터 가상 배열을 사용함에 의할 수 있다. 다른 예에서, 상응하는 영역들이 확인될 수 있다. 당업자는 또한 인간 및 비-인간 서열들 사이에 상응하는 아미노산 잔기들을 찾기 위하여 안내된 대로 보존적 아미노산 잔기들을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "유사한" 또는 "대응하는" 부분, 위치 또는 영역은 매칭을 최대화하기 위하여 당업자에게 공지된 배열 방법을 사용하여 가장 높은 차수의 매칭이 얻어지도록 2 이상의 관련된 폴리펩티드 또는 핵산 서열(분자의 서열, 분자의 영역 및/또는 이론적 서열을 포함)을 배열시 서로 배열되는 부분, 위치 또는 영역이다. 다른 말로, 2 유사한 위치 (또는 부분 또는 영역)은 2 이상의 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 최대-맞춤 배열로 배열된다. 유사한 부분/위치/영역은 2 이상의 서열이 배열시 선형 핵산 또는 아미노산 서열을 따라 위치에 기초하여 확인된다. 유사한 부분은 서로 임의의 서열 유사성을 공유할 필요는 없다. 예를 들어, 각각 100 뉴클레오티드 길이인 2개의 상동인 핵산 분자의 서열의 (매칭을 최대화하는) 배열은 100 뉴클레티드 중 70 개가 동일한 것으로 판명될 수 있다. 다른 동일하지 않은 30개의 아미노산의 일부 또는 전부를 함유하는 이들 핵산 분자의 부분은 서열 동일성을 공유하지 않는 유사한 부분이다. 선택적으로, 유사한 부분은 서로 서열 동일성의 일부 백분율, 예를 들면 약 또는 50　%, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 그의 분수를 포함할 수 있다. 몇몇 예에서, 유사한 부분은 100% 동일하다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "변형(modification)"은 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 핵산분자 내 뉴클레오티드 서열의 변형에 관한 언급으로, 각각 아미노산 및 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및 치환을 포함한다. 폴리펩티드를 변형하는 방법은 당업자에게 통상적인 것으로, 예를 들면 재조합 DNA 방법론을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 핵산 또는 폴리펩티드 서열 언급시 "결실"은 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 천연형 또는 야생형 서열과 같은 서열과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 결실을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 핵산 또는 아미노산 서열 언급시 "삽입"은 표적, 천연형, 야생형 또는 다른 관련 서열 내에 하나 이상의 추가적 뉴클레오티드 또는 아미노산의 포함을 묘사한다. 따라서, 야생형 서열과 비교하여 하나 이상의 삽입을 포함하는 핵산 분자는 서열의 선형 길이 내에 하나 이상의 추가적 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, 핵산 및 아미노산 서열에 대한 "부가"는 다른 서열과 비교하여 어느 말단에 뉴클레오티드 또는 아미노산의 부가를 묘사한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "치환"은 천연형, 표적, 야생형 또는 다른 핵산 분자 또는 폴리펩티드 서열 내 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 분자의 길이 (잔기의 수로써 묘사됨)의 변경 없이 대안적인 뉴클레오티드 또는 아미노산으로의 교체를 의미한다. 따라서, 분자 내 하나 이상의 치환은 분자의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 수를 변경하지 않는다. 특정 폴리펩티드와 비교하여 치환 돌연변이는 폴리펩티드 서열의 길이를 따라 아미노산 잔기의 수에 의하여 표현될 수 있다. 예를 들어, 이소류신(Ile; I)의 시스테인 (Cys:C)으로 치환인 19번 위치에 아미노산의 변형을 갖는 변형된 폴리펩티드는 I19C, Ile19C 또는 간단히 변형된 19번 위치에 아미노산이 시스테인인 것을 지시하는 C19 로 표현될 수 있다. 이러한 예에서, 치환을 갖는 분자는 비변형 폴리펩티드의 Ile 19에 변형을 가진다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 결합 성질은 하나 이상의 결합 파트너를 가지는 여부 및 방법에 관한 분자, 예를 들면 폴리펩티드의 특성이다. 결합 성질은 결합 파트너(들)에 결합하는 능력, 결합 파트너에 결합하는 친화력 (예를 들면, 고 친화력), 결합 파트너에 결합하는 결합력, 결합 파트너와의 결합의 세기 및 결합 파트너와의 결합 특이성을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 친화력은 둘 이상의 분자, 예를 들면 결합 파트너와의 상호작용의 세기, 전형적으로 2 결합 파트너 사이의 비공유 상호작용의 세기를 묘사한다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 항원 에피토프에 대한 친화력은 단일 항체 결합 부위와 에피토프 사이의 전체 비공유 상호작용의 세기의 측정값이다. 저-친화력 항체-항원 상호작용은 약하며, 분자들은 빠르게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화력 항체-항원-결합은 강하고, 분자들은 더 긴 시간 동안 결합한 채 남아있다. 친화력을 계산하는 방법, 예를 들어, 결합/해리상수 결정 방법은 널리 공지되어 있다. 친화력은 실험적으로 평가될 수 있거나, 친화력들은 상대적으로, 예를 들어 특정 항원에 대한 한 항체의 친화력과 다른 항체를 비교함으로써 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 항체 결합력은 다가 항체와 그의 인식 항원, 예를 들어, 항원과 연합되는 다중 결합 부위를 포함하는 항체들과 반복 에피토프 또는 에피토프 어레이의 다중 상호작용들의 세기를 나타낸다. 고 결합력 항체는 저 결합력 항체와 비교하여 더 높은 세기의 상기 상호작용을 가진다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "결합한다"는 다른 분자와 이끄는 상호작용인 분자의 참여를 의미하며, 안정한 연합을 초래하여 2 분자는 서로 가까이에 있게 된다. 결합은 이에 제한되는 것은 아니나 비공유 결합, 공유 결합 (예를 들면, 가역적 및 비가역적 공유 결합)을 포함하며, 분자들, 예를 들면 이에 제한되지 아니하나 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 및 저분자, 예를 들면, 약물을 포함한 화학적 화합물을 포함한다. 결합의 예는 항체-항원 상호작용 및 수용체-리간드 상호작용이다. 항체가 특정 항원에 "결합"할 때, 결합은 항체 결합 부위에서의 인식 항체-항원 상호작용을 통한 항체에 의한 항원의 특이적 인식을 의미한다. 결합은 또한 폴리펩티드의 다중사슬, 예를 들면 이황화 결합을 통해 상호작용하는 항체 사슬들의 연합을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "친화력 상수"는 항원에 대한 항체의 친화력을 측정하는데 사용되는 결합 상수(Ka)를 의미한다. 친화력 상수가 클수록, 항원에 대한 항체의 친화력이 더 높다. 친화력 상수는 몰농도 역수의 단위 (즉, M-1)로 표현되며, 항원 반응에 대한 표준 역학 방법론 (예를 들어, 면역분석, 표면 플라스몬 공명, 또는 당 분야의 공지된 다른 역학 상호작용 분석법)에 의해 측정되는 결합-해리 반응에 대한 속도 상수로부터 계산될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 항체 결합 친화력의 언급에서 사용시 용어 "동일한"은 결합 상수 (Ka) 가 참조 항체의 약 1 내지 100 배, 또는 1 내지 10 배 이내인 것을 의미한다 (참조 항체 보다 1-100 배 더 큰 친화력 또는 1-100 배 더 작은 친화력, 또는 임의의 수치 값 또는 범위 또는 상기 범위 내의 값).
본 발명에서 사용된 바와 같이, 결합 상수 (Ka) 언급에서 사용시 "실질적으로 동일한"은 참조 항체의 결합 상수, Ka 보다 약 5 내지 5000 배 이상, 또는 미만 이내인 것을 의미한다 (참조 항체 보다 5-5000 배 이상 또는 5-5000 배 이하). 항체에 대한 결합 친화력은 또한 해리 상수 또는 Kd 로써 표현될 수 있다. 해리 상수는 결합 상수의 역수, Kd = 1/Ka 이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 다른 항체의 언급에서 항체를 기술하기 위해 사용시 "동일한 결합 특이성을 갖는"이란 구는 항체가 참조 항체와 동일한 항원성 에피토프의 전부 또는 부분에 특이적으로 결합하는 (면역특이적으로 결합하거나, 바이러스에 특이적으로 결합하는) 것을 의미한다. 따라서, 58c5 로써 기재된 항체와 동일한 결합 특이성을 갖는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 58c5 로써 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 동일한 에피토프의 전부 또는 일부에 특이적으로 결합한다. 에피토프는 단리된 단백질 내 또는 바이러스 내 단백질 내에 존재할 수 있다. 동일한 에피토프에 결합하는 2 항체의 능력은 당 분야의 공지의 분석법, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 분석법 및 항체 경쟁 분석법으로 결정할 수 있다. 전형적으로, 동일한 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체는 에피토프에 대한 결합을 경쟁할 수 있으며, 이는 예를 들어 인 비트로 결합 경쟁 분석법 (예를 들면 경쟁 ELISA)에 의하여, 당 분야에 공지된 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 전형적으로, 제2 항체와 동일한 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 제1 항체는 약 또는 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % 만큼 에피토프에 대한 결합을 경쟁할 수 있으며, 여기서, 경쟁 백분율은 에피토프에 대한 제1 항체의 결합을 대신하는 제2 항체의 능력을 측정한다. 경쟁 분석법의 예에서, 항원은 표지된 항체의 미리 결정된 제한 희석물 (예를 들면, 50-70% 포화 농도) 및 미표지 경쟁 항체의 연속 희석물의 존재 하에 배양된다. 경쟁은 경쟁 항체의 존재 하에 결합의 감소에 대하여 항원에 대한 표지된 항체의 결합을 측정함으로써 결정된다. 다양한 표지 기술 및 검출 방법, 예를 들면, 방사성측정, 형광, 효소 및 발색측정 검출법을 포함한 상기 분석법의 변이는 당 분야에 공지되어 있다. 제2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 제1 항체의 능력은 또한 예를 들어 단일클론 항체-저항성 돌연변이체 (Monoclonal Antibody-Resistant Mutant: MARM)를 사용한 바이러스 중화 분석법에 의하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 제1 항-RSV 항체가 야생형 RSV를 중화시키나, 특정 돌연변이체 RSV를 중화시키지 못하는 경우, 야생형 RSV를 중화시키나 상기 특정 돌연변이체 RSV를 중화시키지 못하는 제2 항체는 일반적으로 제1 항체와 동일한 RSV 상의 에피토프에 결합한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "단일클론 항체 회피 돌연변이체"로도 언급되는 "단일클론 항체 저항성 돌연변이체" (MARM)는 또한 야생형 RSV 바이러스를 중화시키는 단일클론 항체에 의한 중화에 내성을 나타내는 돌연변이체 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 이다. 실제로, RSV MARM의 50%를 중화시키는데 필요한 항체의 농도는 항체를 피한다고 간주되는 MARM에 참조 야생형 감염성 바이러스 입자의 등가량을 중화시키는데 요구되는 농도보다 적어도 약 또는 적어도 10배 커야 한다.
바이러스 복제의 각 연속적 라운드 이후, 항체의 농도를 증가시키는 것이 바이러스 중화 효과들을 생성하는데 요구되도록, MARM은 항체의 존재 하에 바이러스 복제의 연속적인 라운드에 걸쳐 단일클론 항체의 존재하에 야생형 RSV를 배양하여 생성된다. 세포병변 효과 (CPE)는 항체에 의하여 더이상 효과적으로 중화되지 않는 돌연변이체 바이러스가 생성될 때까지 항체의 농도 증가의 존재하에서만 관찰된다. 제2 항체와 비교하여 제1 항체의 존재 하에 MARM 의 출연을 위하여 더 많은 라운드의 복제가 필요하다면, 제1 항체는 제2 항체가 결합하는 에피토프와 다른 에피토프에 결합한다고 결론내릴 수 있다. 제1 항체가 제2 항체에 대항하여 생성된 MARM을 중화시킬 수 있다면, 항체가 다른 에피토프에 특이적으로 결합하거나 상호작용한다고 결론내릴 수 있다. MARM은 경쟁 결합 분석법에 비교된 항체의 항원 결합 에피토프를 더욱 정교하게 맵핑할 수 있으며, 따라서, 한 항체가 항원에 대한 결합에 있어 다른 것에 경쟁할 수 있으나, 그 경쟁자의 MARM을 중화할 수 있다. 몇몇 항체의 경우, MARM을 발생하는데 오직 수회의 선택 라운드가 요구되고; 다른 항체의 경우 더 많은 라운드가 요구된다. 본 발명의 특정 항체의 경우, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 또는 그 이상의 라운드 후 MARM이 발생하지 않는다. 몇몇 경우, MARM이 발생되는 것이 불가능하다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, EC50 은 항체가 인 비트로 중화 분석법, 예를 들면, 본원에 기재된 바이러스 플라크 감소 분석법 (예를 들면, 감염에 대한 베로 숙주 세포 또는 다른 숙주 세포를 사용한 플라크 감소 분석법) 또는 당 분야에 공지된 다른 바이러스 중화 분석법에서 바이러스 감염 50%를 억제할 수 있는 유효 농도를 나타낸다. 전형적으로, 중화 바이러스는 인 비트로 중화 분석법, 예를 들면 바이러스 플라크 감소 분석법에서 바이러스 억제에 대하여 2 nM 이하의 EC50을 가지는 것이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "결합 파트너"는 다른 분자와 예를 들어 공유 또는 비공유 상호작용, 예를 들면, 인식 항원과 항체의 상호작용을 통해 특이적으로 상호작용하는 분자 (예를 들어, 폴리펩티드, 지질, 당지질, 핵산분자, 탄수화물 또는 기타 분자)를 말한다. 결합 파트너는 천연적으로 또는 인위적으로 생성될 수 있다. 한 예에서, 원하는 변이체 폴리펩티드는 하나 이상의 결합 파트너를 사용하여, 예를 들어 인 비트로 및 인 비보 방법을 사용하여 선택된다. 인 비트로 방법의 예는 고체 지지체, 예를 들면, 비드, 플레이트, 컬럼, 매트릭스 또는 기타 고체 지지체에 커플링된 결합 파트너; 또는 다른 선택성 분자, 예를 들면 비오틴 분자에 커플링된 결합 파트너에 이어서 다른 선택성 분자를 고체 지지체에 커플링시키는 이후 선택을 사용한 선택을 포함한다. 전형적으로, 인 비트로 방법은 결합되지 않은 폴리펩티드를 제거하는 세척 단계, 이어서 선택된 변이체 폴리펩티드(들)의 용출을 포함한다. 상기 방법은 선택된 폴리펩티드로부터 변이체 폴리펩티드를 선별하기 위한 반복적인 공정에서 1회 이상 반복될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 이황화 결합 (S-S 결합 또는 이황화 가교라고도 불림)은 티올기의 커플링 유래의 단일 공유 결합이다. 단백질 내 이황화 결합은 시스테인 잔기의 티올기 사이에 형성되며, 폴리펩티드 도메인들, 예를 들면, 항체 도메인들 사이의 상호작용을 안정화한다.
본 발명에서 사용된 바와 같은, "커플링된" 또는 "접합된(conjugated)"은 공유 또는 비공유 상호작용에 의하여 부착된 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 대한 모이어티(moiety), 예를 들면 진단용 또는 치료용 모이어티의 부착을 언급시 "항체에 접합된" 또는 "항체에 연결된"이라는 구 또는 그의 문법적 변형들은 모이어티가 임의의 공지된 펩티드 결합 수단, 예를 들면, 재조합 수단에 의한 융합 단백질의 생성에 의하여 또는 화학적 수단에 의하여 번역후에 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 부착된 것을 의미한다. 접합은 접합을 달성하기 위한 다양한 결합제, 이에 제한되지 아니하나 펩티드 또는 화합물 링커 또는 화학적 교차-결합 시약 중 어느 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "파지 디스플레이(pharge display)"는 사상 박테리오파지의 표면에 폴리펩티드의 발현을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "파지-디스플레이 양립가능한 세포(pharge display compatible cell)" 또는 "파지-디스플레이 숙주 세포"는 파지에 의하여 감염되어, 폴리펩티드, 예를 들면 변이체 폴리펩티드를 포함한 융합 단백질을 표시하는 파지의 생성을 지지할 수 있으며, 따라서 파지 표시에 사용될 수 있는 숙주 세포, 전형적으로 박테리아 숙주세포이다. 파지 디스플레이 양립가능한 세포의 예는 이에 제한되지 아니하나 XL1-블루 세포를 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "패닝(panning)"은 결합 파트너에 대한 특이성을 갖는 분자, 예를 들어, 포획 분자 (예를 들면, 항원) 또는 아미노산 또는 뉴클레오티드뉴클레오티드뉴클레오티드의 영역, 부분 또는 위치를 표시하는 파지의 분리를 위한 친화력-기반 선택 절차를 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "디스플레이 단백질" 또는 "유전적 패키지 표시 단백질"은 디스플레이 단백질이 관심 있는 폴리펩티드 (예를 들면, 감소된 발현이 요구되는 폴리펩티드)에 융합시 (예를 들면, 융합 단백질의 일부로써 포함시) 폴리펩티드가 유전자 패키지의 외부 표면 상에 디스플레이되도록 유전자 패키지 상의 폴리펩티드의 디스플레이를 위한 임의의 유전자 패키지 폴리펩티드를 의미한다. 디스플레이 단백질은 전형적으로 유전자 패키지, 예를 들면, 파지와 같은 바이러스 유전자 패키지의 유전자 패키지의 외부 표면 또는 외부 구획 (예를 들면, 막, 세포벽, 외피 또는 다른 외부 표면 또는 구획) 상에 또는 그 안에 존재하며, 따라서, 관심 있는 폴리펩티드에 융합시 폴리펩티드는 유전자 패키지 상에 디스플레이된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 외피 단백질은 디스플레이 단백질, 유전자 패키지의 외부 표면에 존재하여, 관심 있는 폴리펩티드에 융합시 폴리펩티드가 유전자 패키지의 외부 표면 상에 디스플레이되도록 하는 그의 최소한의 부분이다. 일반적으로, 외피 단백질은 바이러스 외피 단백질, 예를 들면, 파지 외피 단백질이다. 바이러스 외피 단백질, 예를 들면, 파지 외피 단백질은 숙주 세포 내에서 조립 동안 바이러스 입자와 연합한다. 한 예에서, 외피 단백질은 유전자 패키지 상에 폴리펩티드의 디스플레이를 위하여 본 발명에서 사용된다; 외피 단백질은 융합 단백질의 부분으로써 발현되며, 이는 외피 단백질 아미노산 서열 및 표시되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다. 외피 단백질은 전장 외피 단백질 또는 유전자 패키지의 표면 상에 폴리펩티드의 디스플레이를 수행할 수 있는 그의 임의의 부분일 수 있다.
외피 단백질의 예는 파지 외피 단백질, 예를 들면, 이에 제한되지 아니하나, (i) 사상 파지의 소수 외피 단백질, 예를 들면, 유전자 III 단백질 (gIIIp, cp3), 및 (ii) 사상 파지의 주 외피 단백질 (바이러스 외피 상에 10 카피 이상, 예를 들면, 수십, 수백 또는 수천 카피로 존재함), 예를 들면, 유전자 VIII 단백질 (gVIIIp, cp8); 다른 파지 외피 단백질에 융합물, 예를 들면, 유전자 VI 단백질, 유전자 VII 단백질, 또는 유전자 IX 단백질 (예를 들면, WO 00/71694 참조); 및 이들 단백질의 부분 (예를 들면, 도메인 또는 단편), 예를 들어, 이에 제한되지 아니하나 파지 입자에 안정하게 혼입되는 도메인들, 예를 들면, gIIIp 또는 gVIIIp 의 앵커 도메인을 포함한다. 또한, 더 큰 펩티드의 발현을 위하여 최적화된 gVIIIp 의 돌연변이체, 예를 들면, 표면 표시 특성이 개선된 돌연변이체, 예를 들면, 돌연변이체 gVIIp (예를 들어, Sidhu 등 (2000) J. Mol . Biol. 296:487-495 참조)가 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "질환 또는 장애"는 감염, 후천성 상태, 유전적 상태를 포함하나 이에 제한되지 않는 원인 또는 상태로부터 기인하고, 확인가능한 증상을 특징으로 하는 피험자 내 병리학적 상태를 의미한다. 본 발명에서 관심 있는 질환 및 장애는 RSV 감염 또는 RSV 감염의 위험을 증가시키는 것들을 수반하는 것이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "감염" 및 "RSV 감염"은 숙주 내 RSV 수명 주기의 모든 단계 (이에 제한되지 아니하나 세포 또는 생체 조직 내 RSV에 의한 침습 및 복제), 뿐 아니라 RSV에 의한 침습 및 복제로부터 기인한 병리학적 상태를 나타낸다. RSV에 의한 침습 및 증식은 이에 제한되지 아니하나 다음의 단계들을 포함한다: RSV 입자의 세포에 도킹, 세포막과 바이러스의 융합, 세포 내로 바이러스 유전 정보의 도입, RSV 단백질의 발현, 새로운 RSV 입자의 생성 및 세포로부터 RSV 입자의 방출. RSV 감염은 상 기도 RSV 감염 (URI), 하 기도 RSV 감염 (LRI), 또는 이들의 조합일 수 있다. 몇몇 예에서, RSV에 의한 침습 및 복제로부터 야기되는 병리학적 상태는 급성 RSV 질환이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "급성 RSV 질환"은 RSV 감염의 결과로써 폐 또는 하기도의 임상적 중대 질환을 의미하며, 이는 폐렴 및/또는 기관지염으로써 나타날 수 있으며, 여기서 상기 징후는 예를 들면 저산소증, 질식, 호흡곤란, 가쁜 호흡, 천명 및 청색증을 포함할 수 있다. 급성 RSV 질환은 발병한 피험자에 의료적 개입, 예를 들면, 입원, 산소 주입, 기관내삽입 및/또는 통풍을 얻도록 필요로 한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 질환 또는 상태를 가진 피험자를 "치료하는 것"은 피험자의 증상이 부분적으로 또는 전체적으로 완화되거나, 또는 치료 후 정적인 상태로 남는 것을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 요법 및/또는 치유를 포함한다. 예방은 잠재적 질환의 방지 및/또는 증상의 악화 또는 질환의 진행의 방지를 의미한다. 치료는 또한 본 발명에서 제공되는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 본 발명에서 제공되는 조성물의 임의의 약제학적 사용을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "예방(prevention)" 또는 예방(prophylaxis), 및 이들의 문법적으로 동등한 형태들은 질환 또는 상태를 발전시킬 위험을 감소시키는 방법을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 유효한 약제(제제)"는 임의의 치료제 또는 생물활성제, 예를 들어 마취제, 혈관수축제, 분산제, 저분자 약물 및 치료용 단백질을 포함하는 통상적인 치료 약물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "치료 효과"는 질환 또는 상태의 증상을 변경, 전형적으로는, 개선하거나 완화하거나, 질환 또는 상태를 치유하는 피험자의 치료로부터 얻어지는 효과를 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "치료적 유효량" 또는 "치료적으로 효과적인 용량(투여량)"은 피험자에 투여 후 치료 효과를 생성하기에 최소한 충분한, 약제, 화합물, 물질, 또는 화합물을 포함하는 조성물의 양을 의미한다. 따라서, 질병 또는 장애의 증상을 예방, 치유, 개선, 정지 또는 부분적 정지에 필요한 양을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "치료 효능"은 약제, 화합물, 물질 또는 화합물을 함유하는 조성물이 투여되는 피험자에 치료 효과를 생성하는 약제, 화합물, 물질 또는 화합물을 포함하는 조성물의 능력을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "예방적 유효량" 또는 "예방적으로 효과적인 용량(투여량)"은 피험자에 투여시 예를 들면, 질병 또는 증상의 개시 또는 재발을 방지하거나 지연하거나, 바이러스 감염의 발생을 감소시키는, 의도된 예방적 효과를 가지는, 약제, 화합물, 물질 또는 화합물을 함유하는 조성물의 양을 의미한다.
충분한 예방적 효과는 1회 용량의 투여에 의해 필수적으로 발생하는 것은 아니며, 연속적 용량의 투여 후 발생할 수 있다. 따라서, 예방적으로 유효한 양은 1회 이상 투여로 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 제공되는 항체와 관련한 용어 "면역치료적으로" 또는 "면역치료"는 예방용 뿐 아니라 치료용 투여를 나타낸다. 따라서, 제공되는 치료용 항체는 질병의 가능성 및/또는 중증도를 경감하기 위하여 바이러스 감염 (예를 들면, RSV 감염)이 걸릴 위험이 있는 피험자에 투여되거나, 활성 바이러스 감염 (예를 들면, RSV 감염)을 이미 나타내는 피험자에 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 치료, 예를 들면, 약학적 조성물 또는 다른 치료제의 투여에 의한 특정 질환 또는 장애의 증상의 개선은 조성물 또는 치료제의 투여로 기여되거나, 연관될 수 있는 증상의 영구적 또는 일시적, 지속적 또는 순간적인 임의의 경감을 나타낸다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "진단적으로 유효한" 양은 피험자에 투여 후 화합물의 검출에 최소한 충분한, 약제, 화합물, 물질 또는 검출가능한 화합물을 함유하는 조성물의 양을 나타낸다. 일반적으로, 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예를 들면, 검출가능하게-표지된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 피험자에 투여되는 제2 약제에 의해 검출될 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 진단적으로 유효한 양은 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 특이적인 RSV 항원을 갖는 위치의 검출을 가능하게 하는데 충분한, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 양이다. 본 발명에서 제공된 항체를 항원의 인 비보 검출을 위하여 사용함에 있어서, 검출가능하게 표지된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 진단적으로 유효한 용량으로 주어진다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 표지 또는 검출가능 모이어티는 분자 (예를 들면, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편)에 직접 또는 간접적으로 부착하거나, 연결될 수 있거나, 그와 연합할 수 있으며, 인 비보 및/또는 인 비트로에서 검출될 수 있는 검출가능 마커 (예를 들면, 형광 분자, 화학발광 분자, 생물발광 분자, 조영제 (예를 들면, 금속), 방사성핵종, 발색단, 검출가능 펩티드 또는 검출가능한 생성물의 형성을 촉매하는 효소)이다. 검출 방법은 당 분야의 임의의 공지된 방법, 예를 들면, 공지의 인 비보 및/또는 인 비트로 검출법 (예를 들면, 시각적 조사에 의한 이미지화, 자기 공명 (MR) 분광학, 초음파 신호, X-선, 감마 선 분광학 (예를 들면, 양성자 방출 단층촬영술 (PET) 스캐닝, 단일-광자 방출 단층촬영 (SPECT)), 형광 분광학 또는 흡수)일 수 있다. 간접적 검출은 물리적 현상, 예를 들면, 검출가능 모이어티에 직접 또는 간접적으로 결합하는 원자, 분자 또는 조성물의 에너지 또는 입자 방출 또는 흡수의 측정 (예를 들면, 1차 항체 (예를 들면, 본 발명에서 제공된 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편)에 결합하는 표지된 2차 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 검출)을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "피험자"는 포유동물, 예를 들면 인간을 포함한 포유동물을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 환자는 인간 피험자를 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 동물은 임의의 동물, 예를 들면, 이에 제한되지 아니하나 인간, 고릴라 및 원숭이를 포함하는 영장류; 마우스 및 랫트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 염소, 소, 사슴, 양과 같은 반추동물; 돼지와 같은 양류 및 기타 동물을 포함한다. 비인간 동물은 고려되는 동물로써 인간을 제외한다. 본 발명에서 제공되는 폴리펩티드는 임의의 출처, 동물, 식물, 원핵세포 및 진균 유래이다. 대부분 폴리펩티드는 포유동물 기원을 포함한 동물 기원이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "노인"는 연령으로 인하여, 감소된 면역 반응을 가지고, 백신화에 감소된 응답을 가지는 피험자를 말한다. 전형적으로 노인 피험자는 65세 이상의 연령, 더욱 전형적으로 70 세 이상의 연령인 인간이다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "인간 유아" 는 약 또는 24개월 이하 (예를 들면, 약 또는 16 개월 이하, 약 또는 12 개월 이하, 약 또는 6 개월 이하, 약 또는 3 개월 이하, 약 또는 2 개월 이하, 약 또는 1 개월 이하의 연령)인 인간을 말한다. 전형적으로, 인간 유아는 38 주 초과의 수태령에 태어난다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "미숙하게 태어난 인간 유아"는 약 또는 40 주 이하의 수태령, 전형적으로 약 또는 38 주 이하의 수태령에 태어난 인간을 말한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "단위 제형(복용 형태)"는 인간 및 동물 피험자에 적절하고, 당업계에 알려진 바와 같이 개별 포장된 물리적으로 단리된 단위를 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "단일 복용 제형"은 직접 투여를 위한 제형을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이,"제조물품"은 제조되어 판매되는 제품을 의미한다. 본 출원을 통해 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 포장 물품 내 포함된 본 발명에서 제공되는 조성물을 포괄하는 의도이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "유체(fluid)"는 흐를 수 있는 임의의 조성물을 의미한다. 따라서, 유체는 반-고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 겔, 로션, 크림 및 다른 기타 조성물의 형태인 조성물을 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 단리된 또는 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들면, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편) 또는 이들의 생물학적으로 활성인 부분 (예를 들면, 단리된 항원-결합 단편)은 상기 단백질이 유래한 세포 또는 조직으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나 또는 화학적으로 합성시 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 것이다. 제제는, 순도를 측정하기 위하여 당업자에 의해 사용되는 분석 표준 방법, 예를 들면, 박층 크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 결정되어, 쉽게 검출가능한 불순물이 없는 것으로 나타나거나, 추가 정제가 물질의 물리적 및 화학적 성질, 예를 들면, 효소 및 생물학적 활성을 탐지가능하게 변경하지 않도록 충분히 순수하다면, 실질적으로 없는 것으로 결정될 수 있다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 제조하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 그러한 경우, 추가 정제가 화합물의 특이적 성질을 증가시킬 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "세포 추출물" 또는 "융해물(용해물)"은 융해되거나 파괴된 세포로부터 만들어진 제제 또는 분획을 말한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 단리된 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 출처 내에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 단리된 것이다. "단리된(isolated)" 핵산 분자, 예를 들면 cDNA 분자는 재조합 기술로 생성시 다른 세포성 재료 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성시 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 것일 수 있다. 본 발명에서 제공되는 단리된 핵산 분자의 예는 제공되는 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이 "대조군"은 그것이 시험 매개변수로 처리되지 않았거나, 혈장 시료인 경우, 관심 있는 상태로 영향받지 아니한 정상 지원자 유래일 수 있다는 것을 제외하고 시험 시료와 실질적으로 동일한 시료를 말한다. 대조군은 또한 내부 대조군일 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "조성물"은 임의의 혼합물을 나타낸다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 임의의 조합을 나타낸다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "병용(조합)(combination)"은 2개 이상의 항목 간의 임의의 연합을 의미한다. 조합은 2개 이상의 별개의 항목, 예를 들면, 2개의 조성물 또는 2개의 집합물일 수 있고, 이들의 혼합물, 예를 들면 2개 이상의 항목의 단일 혼합물일 수 있으며, 또는 이들의 변형일 수 있다. 일반적으로 조합의 요소들은 기능적으로 연합되거나 또는 관련되어 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 병용 치료는 2 이상의 상이한 치료제, 예를 들면, 2 이상의 상이한 항-RSV 항체들 및/또는 항-RSV 항체들 및 이들의 항원-결합 단편단편단편를 의미한다. 상이한 치료제는 별개로, 순차로, 간헐적으로 제공되어 투여되거나, 단일 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 키트는 임의적으로 기타 요소들, 예를 들면 부가의 시약들, 및 이에 제한되지 아니하나 활성화, 투여, 진단 및 생물학적 활성 또는 성질의 평가를 포함하는 목적을 위한 상기 조합 또는 그의 요소들의 사용설명서를 포함하는 포장된 조합물이다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "하나의" "한" 및 "상기"는 문맥상 명백하게 반대로 구술되지 않는다면 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "면역글로불린 도메인"을 포함하는 폴리펩티드에 대한 언급은 하나 또는 복수의 면역글로불린 도메인을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 용어 "또는"은 선택사항 만을 나타내는 것으로 명시적으로 지시되거나, 선택사항들이 상호 배타적이지 않은 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로서 표현될 수 있다. "약"은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서, "약 5개의 아미노산"은 "약 5개의 아미노산" 및 또한 "5개의 아미노산"을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, "임의적인" 또는 "임의적으로"는 이어서 기재되는 사건 또는 환경이 발생하거나 발생하지 않고, 그 기재가 상기 사건 또는 환경이 발생하는 경우의 예 및 그것이 발생하지 않는 예를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 임의적 변이체 부분은 그 부분이 변이이거나 비변이인 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, 보호기, 아미노산, 및 다른 화합물에 대한 약어는 달리 기재되어 있지 않으면, 그들의 통상적인 사용법, 인식된 약어 또는 생화학 명명법에 대한 IUPAC-IUB 위원회에 따른다(Biochem. (1972) 11(9):1726-1732 참조).
B. 개관
본 발명에서는 호흡기 세포융합 바이러스에 결합하여 이를 중화시키는 항-RSV 항체들 또는 상기 항체들의 항원-결합 단편들이 제공된다. 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들은 RSV의 표면에서 하나 이상의 에피토프들을 인지하는 중화 항체들이다. 특히, 본 발명에서 제공되는 상기 항체들은 RSV 융합(F) 단백질과 결합한다. 본 발명에서 제공되는 상기 항체들은 예방 요법에 사용될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 상기 항체들은 또한 치료제로도 사용될 수 있다.
예를 들면, 본 발명에서 제공되는 상기 항체들은, 하기의 내용에 한정되지는 않으나, 피험자들 사이에서의 바이러스 전염의 억제, 숙주 내에서의 바이러스 감염 확립의 억제, 및 피험자 내에서의 바이러스성 로드(load)의 감소를 포함하여, 병원성 질환의 저지 및/또는 확산용으로 사용될 수 있다. 상기 항체는 또한, RSV 감염의 하나 이상의 증상을 억제, 치료, 및/또는 완화하거나, RSV 감염 기간을 감소시키는데 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 제공되는 항체들을 통한 환자들의 치료는 RSV 감염에 관련된 사망률(mortality) 및/또는 이환율(morbidity)을 감소시킬 수 있다.
RSV 지속은 항체에 의해 중화될 수 없는 회피 돌연변이(escape mutant)들의 생성에 관련된다. 따라서, 치료상 항-바이러스 항체들의 발전을 위한 주요 과제들은, 1) 다양한 균주들(strains) 또는 혈청형(serotypes)에 걸쳐 보존되고, 2) 상기 진화 바이러스가 회피 돌연변이를 생성시키기 어려운, 중화 에피토프를 가지는 항체들을 생성하거나 동정하는 것이다. 본 발명에서 제공되는 항체들은 다양한 RSV 서브타입 및 RSV 균주에 결합한다. 본 발명에서 제공되는 항체들은 또한 종래에 존재하던 항체들과 비교하여 향상된 바이러스 중화 활성 나타낸다. 상기 제공되는 항체들은, RSV가 일반적으로 중화에 저항하기 위한 회피 돌연변이들을 생성될 것 같은 곳, 복제의 연속적인 라운드들(successive rounds)을 넘어 효과적으로 바이러스를 중화한다. MARM들의 생성을 제한하는 능력은, 본 발명에서 제공되는 상기 항체들이 생성된 회피 돌연변이 형태의 변이(variation)에 덜 민감한 에피토프에 결합하는 것을 의미한다. 그러므로, 이러한 에피토프는 다른 공지된 항-RSV 항체들의 에피토프들과는 다르다. 따라서, 상기 제공되는 항-RSV 항체들은 예방 요법 외에, RSV 감염의 치료용으로도 유용하다. 현재, RSV 감염에 대하여 알려진 항체 치료제가 없으며, 승인된 항체 치료제가 없는 실정이다. 따라서, 본 발명에서 제공되는 상기 항체들은, 고령 환자, 예를 들어, 근접성이 환자들 사이에 바이러스 확산 위험을 증가시키는, 그룹 또는 은퇴 가정에서의 고령 환자 사이에서 RSV 감염 치료용으로 특히 중요하다. 또한, 본 발명에서 제공되는 상기 항체들을 통한 치료는, 팔리비주맙(palivizumab)을 통한 RSV의 예방 치료에서 투여요법(dosage regimen)을 준수하지 않는 것이 바이러스 내성을 점점 더 일으키기 때문에, 투여요법을 준수하지 않는 것이 바이러스 회피의 위험을 증가시키는 상황에서 중요하다(예를 들면, Adams 등, (2010) Clin Infect Dis. 51(2):185-188 참조).
일반적으로, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들은 RSV F 단백질과 높은 친화성으로 결합한다. 기존의 승인된 항-RSV 항체들(예를 들면, 팔리비주맙; 시나지스(Synagis))과 비교하여, 본 발명에서 제공되는 상기 높은 친화성 항-RSV 항체들은, RSV 감염의 예방 및/또는 치료, RSV 감염의 하나 이상의 증상들을 예방, 치료, 및/또는 완화, 또는 RSV 감염 기간을 감소하기 위하여 덜 자주 투여하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들은 치료상 항체로서, 즉, RSV 감염 치료용으로 유용하다. 덜 자주 투여하는 것은 투여요법 보다 쉽게 준수하는 것을 가능하게 하고, 그에 따라 상기 항-RSV 항체에 대한 바이러스 내성 증가를 일으키는 약물 남용의 가능성을 줄여준다. RSV에 면역특이적으로 결합하는 항체를 적게 복용하는 것은 또한 면역글로불린 치료의 부작용의 가능성을 감소시킬 수 있다.
일반적으로, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들은, 바이러스의 복제, 또는 감염 세포와 다른 세포의 세포 대 세포 융합(즉, 합포체 형성)의 억제를 포함하는, 예를 들어, 상기 바이러스와 표적 세포막과의 회합(association), 상기 바이러스의 상기 표적 세포막 및/또는 세포 입구(cell entry)와의 융합, 새로운 바이러스성 입자들의 생산 같은, 상기 바이러스의 하나 이상의 활성들을 억제하거나 감소시키는 능력을 가진다. 상기 제공된 항-RSV 항체들은 또한 RSV 감염에 대하여 면역 반응을 증가시키는데 사용될 수 있다.
1. 호흡기 세포융합 바이러스
인간 RSV는 파라믹소바이러스(Paramixoviridae) 과(科)(family)의 뉴모바이러스 (Pnemovirus) 아과(亞科)(subfamily)의 구성원(member)에 해당한다. 인간 RSV에는, 2개의 구별되는 서브 그룹, 그룹 A 및 그룹 B가 존재한다. 부가적으로, 각각의 서브타입은, A1 및 A2, 그리고 B1 및 B2의 2개의 균주들(strains)로 더욱 세분화된다. RSV는 11개의 바이러스성 단백질들을 코딩하는 대략 15,000개의 뉴클레오티드펩티드놈을 가진, 외피보유(enveloped), 비-분적된(non-segmented), 음성-센스 RNA 바이러스이다.
RSV는 2개의 주요 표면 당단백질들인, 당단백질 G 및 당단백질 F를 코딩한다. 당단백질 F, 또는 상기 융합 단백질이 바이러스와 세포막의 융합을 촉진하는 동안, 당단백질 G, 또는 상기 부착 단백질은 바이러스를 세포 수용체에 결합을 매개하고, 세포 세포질 내로 상기 바이러스의 리보뉴클레오단백질의 침투를 가능하게 한다(Lopez 등, (1998) J. Virology 72:6922-6928). 또한, 당단백질 F는 합포체의 형성을 초래하는, 감염된 세포들과 그들의 이웃 세포들의 세포막 융합을 촉진시킨다. 상기 F 단백질은 2개의 이황화-결합된(linked) 서브유닛, F1 및 F2를 포함하고, 상기 F1 및 F2는 비활성, N-글리코실화 전구체의 단백질 가수분해 분열(proteolytic cleavage )에 의해 생성된다. 상기 G 단백질은 80-90 kDa 타입 II 트랜스멤브레인 당단백질이고, 32kDa 전구체 단백질에 부착된 N- 및 O-연결(linked) 올리고당을 포함한다.
RSV F 또는 G 당단백질에 대항하여 제조된 항체들은 인 비트로(in vitro)에서 고효율로 RSV를 중화시키는 것과 인 비보 (in vivo)에서 예방효과를 가진다는 것이 입증하였다(참조, 예를 들면, Walsh 등, (1986) J. Gen . Microbiol. 67:505; Beeler 등, (1989) J. Virol. 63:2941-2950, Garcia-Borenno 등, (1989) J. Virol. 63:925-932, Taylor 등, (1984) Immunology 52:137-142, 미국등록특허 제 5,824,307호 및 제6,818,216호 참조). RSV F 단백질에 대항하는 항체들은 또한 RSV-감염 세포들과 이웃하는 비감염 세포들의 융합을 억제하는데 효과적이다.
RSV F 단백질에 면역특이적으로 결합하는 다양한 단일클론 항체들의 분석 결과는 3개의 비-중복(non-overlapping) 항원 부위들(antigenic sites), A, B 및 C 와 하나의 가교 부위(bridge site), AB를 동정하게 하였다 (Beeler 등, (1989) J. Virol. 63:2941-2950). 항원 부위 A 에피토프 4(Beeler 등, (1989) J. Virology. 63(7):2841-2950)에 결합하는 단일클론 항체 1129는, 이로부터 인간화 팔리비주맙(SYNAGIS®)이 생성되었던 부모 항체에 해당한다(Johnson 등, (1997) J. Infect.Disease 176:1215-1224 및 미국등록특허 제5,824,307호 참조). 또한, 추가적인 RSV F 단백질 에피토프들이 동정하였다. 예를 들면, 상기 인간 항-RSV Fab 단편 Fab 19(Barbas 등, (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10164-10168 및 Crowe 등, (1994) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:1386-1390 참조)는 Beeler 등에 의하여 동정된 상기 에피토프들과는 다른 항원 부위 A의 에피토프와 결합한다(Crowe 등, (1998) Virology. 252:373-375 및 Barbas 등, (1992) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 89:10164-10168 참조).
상기 RSV G 단백질은 RSV A 및 B 하위그룹과 단지 53%의 아미노산 유사성(similarity)을 나타내는 반면, 상기 RSV F 단백질은 RSV A 및 B 하위그룹과 91% 이상의 유사성을 나타낸다(Sullender (2000) Clin . Microbiol . Rev. 13:1-15). A 및 B 바이러스 서브타입들은 대부분의 RSV 전염병에서 같이 유행(epidemic)되기 때문에, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 항원-결합 단편들과 같이, RSV의 A 및 B 서브타입을 중화시키는 항체가 바람직하다.
대부분의 RNA 바이러스와 같이, 인간 RSV는 선택압(selective pressure)하에서 신속한 돌연변이를 겪는 능력이 있다. 단일클론성 항체를 사용한 인 비트로 RSV 탈출 돌연변이의 선택은 문헌에 잘 기록되어 있다 (예를 들면, Garcia-Barreno et al. (1989) J. Virol. 63:925-932). 예를 들면, 아미노산 잔기 N262, I266, N268, K272, S275, N276, P389 또는 R429에서의 단일 아미노산 돌연변이, 또는 RSV A2 F 단백질 중 F32 및 K272 또는 A241 및 K421에서 이중 아미노산 돌연변이가 공지의 항-RSV 단일클론성 항체의 탈출을 수행한다는 것이 나타났다 (예를 들면, Crowe et al. (1998) Virology 252:373-375; Zhao et al., (2004) J. Infectious Disease 190:1941-1946 and Liu et al., (2007) Virology Journal 4:71 참조). 이에 더하여, 팔리비주맙(palivizumab) (SYNAGIS®)은 인 비트로 뿐만 아니라 인 비보에서 회피 돌연변이를 위해 선택되는 것이 나타났고, 단리된 돌연변이 중 몇몇은 목화쥐에서 팔리비주맙 예방에 완전히 내성이라는 것이 나타났다(예를 들면, Zhao et al. (2005) J. Virol . 79:3962-3968 and Zhao et al. (2004) J. Infect . Dis . 190:1941-1946 참조). 예를 들면, RSV F 단백질에서 단일 아미노산 돌연변이는 팔리비주맙으로부터 회피를 가져왔다는 것이 증명하였다 (Zhao et al., (2004) J. Infectious Disease 190:1941-1946 참조). 그러므로, 본 발명의 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편과 같은, 회피 돌연변이의 발생 없이 연속적인 복제 라운드에 걸쳐 RSV 바이러스가 효과적으로 중화된 항체가 바람직하다.
호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염은 유아 및 소아의 하 기도 질환lower respiratory tract disease)의 주요 원인이다. RSV 감염은 또한 미국에서 1세 미만 아이의 세기관지염(bronchiolitis), 또는 폐의 작은 기도의 염증, 및 폐렴의 가장 일반적인 원인이다. 게다가, RSV 감염은 또한 노인 호흡기 질환의 하나의 중요한 원인으로 인식된다. RSV 감염에 관련된 증상들 및 상태들은, 예를 들어, 천식(asthma), 천명(wheezling), 반응성 기도 질환(RAD), 및 만성 폐색성 폐질환 (COPD)를 포함한다. 이에 따라, 본 발명에서 기재된 바와 같이, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들은 RSV 감염의 예방 및 치료 및/또는 상기 RSV-매개 질환들의 하나 이상의 증상 완화에 사용될 수 있다.
C. 항- RSV 항체들
본 발명에서 제공되는 것은 치료, 예방 및 진단 용도로 사용될 수 있는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들이다. 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 예를 들어, RSV에 대한 피험자의 수동 면역 또는 바이러스성 감염을 가진 피험자의 치료를 위하여 사용될 수 있다. 하나의 예에서, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 예방용, 즉, RSV 감염 예방용으로 사용된다. 다른 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 치료상 항체, 즉, RSV 감염 치료용으로 사용된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 RSV에 대한 피험자의 수동 면역용으로 사용된다. 상기 제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 또한 인 비트로 (in vitro) 및 인 비보 (in vivo)에서 RSV 감염의 검출용 또는 RSV 감염의 모니터용으로도 사용될 수 있다.
1. 일반적인 항체 구조 및 기능적 도메인들
항체들은 B 세포들에 의하여 막-결합 및 분비 형들로 생산된다. 항체들은 특히 동족 상호작용(cognate interaction)을 통하여 항원 에피토프들을 인식하고 결합한다. 동족 항원들(cognate antigens)에 결합하는 항체는, 독소(toxins), 병원균들(pathogens) 및 다른 감염성 매개물들(infectious agents)의 중화 및 정리(clearance)를 하게 하는 다중의 이펙터(effector) 기능들을 개시할 수 있다.
항체 특이성의 다양성은 B 세포 발생시 재조합 이벤트들로 인하여 자연적으로 생긴다. 이러한 이벤트들을 통하여, 항체 분자의 가변영역(variable region)들을 코딩하는 다중의(multiple) 항체 V, D 및 J 유전자 분절들(segments)의 다양한 조합들은, 수많은 다양한 항체들을 가진 자연 항체 레퍼토리(repertoire)를 생성하기 위하여 불변영역(constant region) 유전자에 연결된다. 인간 항체 레퍼토리는 1010 보다 많은 다른 항원 특이성을 포함하고, 따라서 이론적으로 어떠한 외부 항원도 특이적으로 인식할 수 있다. 항체들은 자연적으로 생산된 항체들뿐만 아니라, 합성으로, 즉, 재조합적으로, 생산된, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함하는 항체 단편들을 포함하는, 항체 단편들과 같은, 항체들을 포함한다.
접힌(folded) 항체 폴리펩티드에서, 결합 특이성은 가변영역의 중쇄(heavy chain) 및/또는 경쇄(light chain)의 부분들(portions)을 포함하는 항원-결합 부위 도메인들에 의하여 부여된다. 상기 항체 분자에 있는 다른 도메인들은, 신호 전달 및 다른 세포들, 폴리펩티드들 및 생분자들(biomolecules)와의 상호작용과 같은 이벤트들에 참여함으로써 이펙터 기능들을 제공한다. 이러한 이펙터 기능들은 상기 항체에 의해 인지되는 감염제(infecting agent)의 중화 및/또는 정리를 야기한다. 항체 폴리펩티드들의 도메인들은 특정 특성들을 변경하기 위한 본 발명의 방법들에 따라 변화될 수 있다.
a. 항체의 구조적 및 기능적 도메인들
전장(full-length) 항체는 여러 사슬, 도메인 및 영역을 포함한다. 종래의 전장 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하며, 각각의 중쇄 및 경쇄는 복수의 면역글로불린(Ig) 도메인들을 포함한다. Ig 도메인은 Ig 폴드(fold)라 불리는 구조로 특징지어지고, 상기 Ig 폴드는 2개의 베타-주름 시트들(beta-pleated sheets)을 포함하며, 각각의 베타-주름 시트들은 루프들에 의해 연결되는 역-평행 가닥들을 포함한다. 상기 Ig 폴드 내의 2개의 베타 쉬트들은 소수성 상호작용 및 보존된 사슬-내 이황화 결합에 의해 함께 포개진다(sandwiched). 상기 항체 사슬들 내의 Ig 영역들은 가변(V) 및 불변(C) 영역 도메인들이다. 각각의 중쇄는 이황화결합에 의해 경쇄와 연결되고, 상기 2개의 중쇄들은 이황화결합들에 의해 서로 연결된다. 상기 중쇄들의 연결은 힌지 영역(hinge region)로 알려진, 상기 중쇄의 유연한 부위에 의해 매개된다.
각각의 전장의 통상의 항체의 경쇄는 하나의 가변영역 도메인(VL) 및 하나의 불변영역 도메인(CL)을 포함한다. 각각의 종래의 전장 항체의 각각의 중쇄는 하나의 가변영역 도메인(VH) 및 3 또는 4개의 불변영역 도메인(CL)을 포함하고, 일부 경우에는 힌지 부위를 포함한다. 위에서 논의된 재조합 이벤트들에 의하여, 상기 가변영역 도메인들을 코딩하는 핵산 서열들은 항체마다 다르며, 특정 항체에 대하여 항원-특이성을 부여하게 된다. 반면에, 상기 불변영역들은 항체들 사이에서 더 보전적인 서열들에 의해 코딩된다. 이러한 영역들은 항체에 기능적 특성, 예를 들어, 감염성 매개물들을 정리를 야기하기 위하여 면역 시스템의 세포들 및 혈청 단백질과 상호작용하는 능력을 부여한다. 항체들의 다른 류들, 예를 들어, IgM, IgD, IgG, IgE 및 IgA는 다른 보존 영역들을 가지면, 그들에게 구별되는 이펙터 기능들을 제공하도록 한다.
각각의 가변영역 도메인은 상보적 결정 영역(CDRs)으로 불리는 세 개의 부분들(portions) 또는 높은 가변 핵산 서열들에 의해 코딩되는 초가변(HV) 영역들을 포함한다. 상기 CDR들은 가변영역 Ig 도메인의 베타 쉬트들을 연결하는 상기 루프들 내에 위치한다. 더불어, 상기 3개의 중쇄 CDR들(CDR1, CDR2 및 CDR3) 및 3개의 경쇄 CDR들(CDR1, CDR2 및 CDR3)은 통상의 항체의 항원-결합 부위(항체 결합 부위)를 형성하고, 상기 항원-결합 부위는 동족 항원과 물리적으로 상호작용을 하고 상기 항체의 특이성을 제공한다. 전체(whole) 항체는 2개의 동일한 항체 결합 부위를 포함하고, 각각은 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄로부터의 CDR들로 구성된다. 상기 CDR들은 상기 베타 가닥들을 연결하는 상기 루프들 내에 포함되므로, 상기 3개의 CDR들은 상기 가변영역의 선형 아미노산 서열을 따라 인접하지 않는다. 상기 항체 폴리펩티드의 접힘으로 인해, 상기 CDR 루프들은 매우 가까이에 위치하고, 상기 항원 결합 부위를 형성한다. 상기 가변부위 도메인들의 상기 베타 쉬트들은 프레임워크 영역(FR)들을 형성하고, 프레임워크 영역은 예를 들어 안정성과 같은 항체의 다른 특성들에 중요한, 보다 보존된 서열들을 포함한다.
b. 항체 단편들
본 발명에서 제공되는 항체들은 항체 단편들을 포함하고, 상기 항체 단편들은 상기 전장 항체들의 전체 서열보다 적은 서열을 포함하나, 적어도 상기 전장 항체의 특이 결합능력 부분을 유지하는 전장 항체의 유도체들이다. 상기 항체 단편들은 또한 상기 부모 항체의 결합 친화성을 유지하기 위하여, 항체 프레임워크(예를 들면, 키메라 항체들)에 삽입될 수 있는 항체의 항원-결합 부분들을 포함할 수 있다. 항체 단편들의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 단일-사슬 Fv (single-chain Fv; scFv), Fv, dsFv, 디아바디, Fd 및 Fd' 단편들, 및 변형된 단편들(예를 들면, Methods in Molecular Biology, Vol 207: 재조합 nnAntibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanov 참조)을 포함하는 다른 단편들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체 단편들은 이황화 가교들로 연결되는 것과 같이 서로 연결된 다중 사슬을 포함할 수 있으며, 재조합으로 생산될 수 있다. 항체 단편들은 또한 2개 이상의 도메인들을 연결하기 위하여 펩티드 링커들과 같은 합성 링커들을 포함할 수 있다. 항원-결합 단편들을 생성하기 위한 방법들은 당 분야에 널리 알려져 있으며, 본 발명에서 제공되는 어떤 항체도 변형하기 위하여 사용될 수 있다. 항체 분자들의 단편들은 예를 들어 효소에 의한 분열(cleavage)로 생성될 수 있다. 예를 들면, 파파인(papain)에 의한 프로테아제 분열로, 상기 중쇄 불변영역들의 이량체(dimer), 상기 Fc 도메인은, 2개의 Fab 영역들(즉, 상기 가변영역들을 포함하고 있는 부분들)로부터 쪼개진다.
단일 사슬 항체들은 특정 항체의 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)을 연결함으로써 재조합적으로 조작될 수 있다. 상기 가변영역들을 위한 상기 특정 핵산 서열들은 예를 들어, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 및 다른 재조합 핵산 기술들과 같은 표준 분자생물학 방법들에 의해 클로닝될(cloned) 수 있다. sFvs의 제조방법은 예를 들어, Whitlow와 Filpula (1991) Methods, 2: 97-105; Bird 등, (1988) Science 242:423-426; Pack 등, (1993) Bio/Technology 11:1271-77; 및 미국등록특허 제4,946,778호, 제5,840,300호, 제5,667,988호, 제5,658,727호, 제5,258,498호에 설명되어 있다. 단일 사슬 항체들은 또한 표적 항원에 결합에 대하여 단일 사슬 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 이러한 라이브러리의 구축 및 스크리닝 방법들은 당 분야에 널리 알려져 있다.
2. 예시적인 항- RSV 항체
본 발명은 RSV에 결합하고 RSV를 중화시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 특히 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 RSV F 단백질에 면역특이적으로 결합한다. 예를 들면, 본 발명의 항-RSV 항체는 단리된 또는 정제된 또는 재조합 RSV F 단백질에 면역특이적으로 결합한다. 또 다른 예에서, 본 발명의 항-RSV 항체는 RSV 비리온 또는 글리코단백질 F를 암호화하는 RSV 바이러스 (RSV F 단백질)에 면역특이적으로 결합한다.
본 발명의 항-RSV 항체는 본 분야의 항-RSV 항체와 다른 또는 유리한 특성을 나타낸다. 예를 들면, 본 발명의 항체는, 단리된 또는 정제된 또는 재조합 RSV F 단백질에 대한 또는 RSV 바이러스 또는 천연 F 단백질을 발현하는 비론에 대한 낮은 또는 향상된 결합 친화성과 같은, RSV F 단백질에 낮은 또는 향상된 결합 친화성을 나타내는 항-RSV 항체를 포함한다. 또 다른 예에서, 본 발명의 항체는 RSV의 향상된 또는 더 나은 중화 활성을 나타내는 항-RSV 항체를 포함한다. 특정 예에서, 본 발명의 항-RSV 항체는 다른 선행기술 또는 기존의 항-RSV 항체와 비교하여 발생된 회피 돌연변이(MARMs) 형태의 변형을 덜 민감한 RSV 상의 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 항-RSV 항체, 예를 들면 항체 30D8 E또는 그것의 전장 또는 기타 항체 단편의 존재하에, RSV는 바이러스 복제의 10회 이상의 라운드 후 그리고 일반적으로 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 라운드 후에 회피 돌연변이를 발생할 수 없다.
항-RSV 항체는 항체 sc5 또는 58c5, 또는 그들의 전장 또는 기타 항체 단편 형태를 포함한다(예를 들면, U.S. Patent publication No. US2011/0076268 및 International Published PCT Application No. WO2011/020079 참조). 58c5는 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중사슬과 SEQ ID NO:5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 함유하는 Fab 단편이다. 58c5의 항체 또는 항원-단편 형태 및 58c5와 동일한 에피토프에 결합하는 것은 GASINSDNYYWT (SEQ ID NO:2) 또는 SEQ ID NO:435와 같이 기재된 상보성 결정영역(CDRs) VH CDR1, HISYTGNTYYTPSLKS (SEQ ID NO:3)와 같이 기재된 VH CDR2, 및 CGAYVLISNCGWFDS (SEQ ID NO:4)와 같이 기재된 VH CDR3를 갖는 중사슬; 및 QASQDISTYLN (SEQ ID NO:6)와 같이 기재된 CDRs VL CDR1, GASNLET (SEQ ID NO:7)와 같이 기재된 VL CDR2 및 QQYQYLPYT (SEQ ID NO:8)와 같이 기재된 VL CDR3을 갖는 경사슬을 함유한다. 일반적으로, 58c5의 항체 단편 형태는 SEQ ID NO:1의 아미노산 1-125에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 및 SEQ ID NO:5의 아미노산 1-107에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. sc5는 SEQ ID NO:9에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 SEQ ID NO:13에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 함유하는 Fab 단편이다. sc5의 항체 또는 항원-단편 형태 및 sc5와 동일한 에피토프에 결합하는 것은 상보성 결정 영역(CDRs) GDSISGSNWWN (SEQ ID NO:10) or SEQ ID NO:436로 기재된 VH CDR1, EIYYRGTTNYKSSLKG (SEQ ID NO:11)로 기재된 VH CDR2 및 GGRSTFGPDYYYYMDV (SEQ ID NO:12)로 기재된 VH CDR3을 갖는 중사슬; 및 and a light chain having CDRs RASQNIKNYLN (SEQ ID NO:14)로 기재된 VL CDR1, AASTLQS (SEQ ID NO:15)로 기재된 VL CDR2, 및 QQSYNNQLT (SEQ ID NO:16)로 기재된 VL CDR3를 갖는 경사슬을 함유한다. 일반적으로, sc5의 항체 단편 형태는 SEQ ID NO:9 의 아미노산 1-125에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인과 SEQ ID NO:13의 아미노산 1-107에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다.
본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 단일클론 항체들, 다중특이적 항체들, 이중특이적 항체들, 인간 항체들, 인간화 항체들, 카멜라이즈드(camelised) 항체들, 키메라 항체들, 단일-사슬 Fv (scFv)들, 단일 사슬 항체들, 단일 도메인 항체들, Fab 단편들, F(ab') 단편들, 이황화-연결 Fv(sdFv)들, 및 항-이디오타입(anti-Id) 항체들, 내부체(intrabody)들, 또는 상기 언급된 어떠한 것들의 항원-결합 단편들을 포함한다. 특히, 항체들은 면역글로불린 분자들 및 면역글로불린 분자들의 면역학적으로 활성인 단편들, 즉, 항원-결합 부위를 포함하는 분자들을 포함한다. 면역글로불린 분자들은 어떠한 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 단일클론 항체들, 다중특이적 항체들, 인간 항체들, 인간화 항체들, 카멜라이즈드 항체들, 키메라 항체들, 단일-사슬 Fv(scFv)들, 단일 사슬 항체들, 단일 도메인 항체들, Fab 단편들, F(ab') 단편들, 이황화-연결 Fv(sdFv)들, 및 항-이디오타입(anti-Id) 항체들, 내부체들, 또는 상기 언급된 어떠한 것들의 항원-결합 단편들을 포함하는 형태로 치료 및 예방 방법에 사용될 수 있다. 특히, 상기 항체들은 면역글로불린 분자들 및 면역글로불린 분자들의 면역학적으로 활성인 단편들, 즉, 항원-결합 부위를 포함하는 분자들을 포함한다. 면역글로불린 분자들은 어떠한 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
RSV F 단백질과 면역특이적으로 결합하는, 본 발명에서 제공되는 예시적인 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 및 69F6를 포함하고, 이들은 본 명세서의 여러 곳에서 상세하게 언급된 Fab 단편이다. 본 발명에서 제공되는 예시적인 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 또한 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함하고, 상기 중쇄는 가변 중사슬(VH) 도메인 및 불변 중사슬 도메인 1(CH1)을 포함하고, 상기 경쇄는 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 및 69F6의 가변 경사슬(VL) 도메인 및 불변 경사슬 도메인(CL)을 포함한다. 예를 들면, 본 발명에서 제공되는 예시적인 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, SEQ ID NO: 396, 398, 400, 402, 404, 452, 454 또는 456에 기재된 아미노산 서열을 가진 중쇄 및/또는 SEQ ID NO: 395, 397, 399, 401, 403, 453, 455 또는 457에 기재된 아미노산 서열을 가진 경쇄를 포함하는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함한다. 특정 예에서, 상기 항-RSV 항체는 SEQ ID NO: 396에 기재된 아미노산 서열을 가진 중쇄 및 SEQ ID NO: 395에 기재된 아미노산 서열을 가진 경쇄를 보유하는 Fab 단편이다. 특정 예에서, 상기 항-RSV 항체는 SEQ ID NO: 398에 기재된 아미노산 서열을 가진 중쇄 및 SEQ ID NO: 397에 기재된 아미노산 서열을 가진 경쇄를 보유하는 Fab 단편이다. 특정 예에서, 항-RSV 항체는 SEQ ID NO: 400에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중사슬과 SEQ ID NO:399에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 함유하는 Fab 단편이다. 특정 예에서 항-RSV 항체는 SEQ ID NO: 402에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중사슬과 SEQ ID NO:401에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 함유하는 Fab 단편이다. 특정 예에서 항-RSV 항체는 SEQ ID NO: 404에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중사슬과 SEQ ID NO:403에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 함유하는 Fab 단편이다. 특정 예에서 항-RSV 항체는 SEQ ID NO: 452에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중사슬과 SEQ ID NO:453에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 함유하는 Fab 단편이다. 특정 예에서 항-RSV 항체는 SEQ ID NO: 454에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중사슬과 SEQ ID NO:455에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 함유하는 Fab 단편이다. 특정 예에서 항-RSV 항체는 SEQ ID NO: 456에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중사슬과 SEQ ID NO:457에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 함유하는 Fab 단편이다.
본 발명에서 제공되는 상기 항체들은 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6의 전장 항체 형태들을 포함한다. 본 발명에서 제공되는 상기 항체들은 또한 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6의 상기 항원-결합 부위(예를 들어, CDR들)를 포함하는 전장 항체 형태들을 포함한다. 본 발명에서 제공되는 전장 항-RSV 항체들 및 그의 항원-결합 단편들은, 당 분야에서 알려진 어느 인간 불변영역과 같은, 당 분야에서 알려진 어느 경사슬 및 중사슬 불변영역도 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 제공되는 전장 항체는 인간 경쇄 카파(κ), 인간 경쇄 람다(λ)인 경사슬 불변영역(CL)을 함유할 수 있다. 본 발명에 제공된 전장 항체들은 어느 이소타입이고, 특히 IgG인 중사슬 불변영역 (CH1-linker-CH2-CH3)을 함유할 수 있다. 불변영역은 서브클라스 IgG1 (SEQ ID NO:356)의 불변영역, IgG2 (SEQ ID NO:357)의 불변영역, IgG3 (SEQ ID NO:358)의 불변영역 또는 IgG4 (SEQ ID NO:359)의 불변영역일 수 있다. 특히, 본 발명의 항체 중 어느 것의 전장 항체 형태는 IgG, 서브클라스 IgG1의 불변영역을 함유한다.
본 발명에서 제공되는 상기 항체들은 RSV F 단백질에 면역특이적으로 결합하는 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 및 69F6의 다른 항체 단편 형태들을 포함한다. 그러한 단편들은 RSV F 단백질에 결합하는 능력을 유지하는, 그의 어떠한 항원-결합 단편도 포함하거나 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6의 항원-결합 단편(들)을 포함하고 있는 조작된 항체를 포함한다. 그러한 항체들은 예를 들어, 키메라 항체들, 단일-사슬 Fv(scFv)들, 단일 사슬 항체들, 단일 영역 항체들, Fab 단편들, F(ab') 단편들, 이황화-연결 Fv(sdFv)들, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체들, 내부체들, 또는 상기 언급된 모든 것들의 항원-결합 단편들을 포함한다. 특정 예에서, 상기 항체는 Fab 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6이다.
본 발명에서 제공되는 예시적인 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6의 VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 아미노산 서열을 각각 가지는 VH 도메인 및/또는 가변 경사슬 VL 도메인을 포함하는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함한다. 예를 들면, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 398 또는 402의 아미노산 1-125, SEQ ID NO:396의 아미노산 1-121, SEQ ID NO:404의 아미노산 1-123, SEQ ID NO:400 또는 452의 아미노산 1-124, SEQ ID NO:454의 아미노산 1-133 또는 SEQ ID NO:456의 아미노산 1-118에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인 및/또는 SEQ ID NO: 397, 403 또는 455의 아미노산 1-107, SEQ ID NO: 399의 아미노산 108, SEQ ID NO: 395의 아미노산 1-110, SEQ ID NO: 401의 아미노산 1-113, SEQ ID NO: 453의 아미노산 1-111 또는 SEQ ID NO: 457의 아미노산 1-109에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 예시적인 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6의 상기 VH 도메인 및/또는 VL 도메인과 개별적으로 적어도 약 80%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 포함하는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함한다. 예를 들면, 상기 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 398 또는 402의 아미노산 1-125, SEQ ID NO:396의 아미노산 1-121, SEQ ID NO:404의 아미노산 1-123, SEQ ID NO:400 또는 452의 아미노산 1-124, SEQ ID NO:454의 아미노산 1-133 또는 SEQ ID NO:456의 아미노산 1-118에 기재된 아미노산 서열과 80%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인 및/또는 SEQ ID NO: 397, 403 또는 455의 아미노산 1-107, SEQ ID NO: 399의 아미노산 108, SEQ ID NO: 395의 아미노산 1-110, SEQ ID NO: 401의 아미노산 1-113, SEQ ID NO: 453의 아미노산 1-111 또는 SEQ ID NO: 457의 아미노산 1-109에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, SEQ ID NO: 398 또는 402의 아미노산 1-125, SEQ ID NO:396의 아미노산 1-121, SEQ ID NO:404의 아미노산 1-123, SEQ ID NO:400 또는 452의 아미노산 1-124, SEQ ID NO:454의 아미노산 1-133 또는 SEQ ID NO:456의 아미노산 1-118에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인 및/또는 SEQ ID NO: 397, 403 또는 455의 아미노산 1-107, SEQ ID NO: 399의 아미노산 108, SEQ ID NO: 395의 아미노산 1-110, SEQ ID NO: 401의 아미노산 1-113, SEQ ID NO: 453의 아미노산 1-111 또는 SEQ ID NO: 457의 아미노산 1-109에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에서 제공되는 것은 SEQ ID NO: 396의 아미노산 1-121에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 적어도 또는 약 80% 내지 99%가 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인을 포함하고, SEQ ID NO: 395의 아미노산 1-110에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 적어도 또는 약 80% 내지 99%가 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이다.
그러므로, 본 발명에서 제공되는 것은 SEQ ID NO: 398의 아미노산 1-125에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 적어도 또는 약 80% 내지 99% 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인을 포함하고, SEQ ID NO: 397의 아미노산 1-107에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 약 80% 내지 99%가 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
그러므로, 본 발명에서 제공되는 것은 SEQ ID NO: 400의 아미노산 1-124에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 적어도 또는 약 80% 내지 99% 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인을 포함하고, SEQ ID NO: 399의 아미노산 1-108에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 약 80% 내지 99%가 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
그러므로, 본 발명에서 제공되는 것은 SEQ ID NO: 402의 아미노산 1-125에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 적어도 또는 약 80% 내지 99% 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인을 포함하고, SEQ ID NO: 401의 아미노산 1-113에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 약 80% 내지 99%가 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
그러므로, 본 발명에서 제공되는 것은 SEQ ID NO: 404의 아미노산 1-123에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 적어도 또는 약 80% 내지 99% 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인을 포함하고, SEQ ID NO: 403의 아미노산 1-107에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 약 80% 내지 99%가 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
그러므로, 본 발명에서 제공되는 것은 SEQ ID NO: 452의 아미노산 1-124에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 적어도 또는 약 80% 내지 99% 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인을 포함하고, SEQ ID NO: 453의 아미노산 1-111에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 약 80% 내지 99%가 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
그러므로, 본 발명에서 제공되는 것은 SEQ ID NO: 454의 아미노산 1-133에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 적어도 또는 약 80% 내지 99% 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인을 포함하고, SEQ ID NO: 455의 아미노산 1-107에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 약 80% 내지 99%가 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
그러므로, 본 발명에서 제공되는 것은 SEQ ID NO: 456의 아미노산 1-118에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 적어도 또는 약 80% 내지 99% 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH 도메인을 포함하고, SEQ ID NO: 457의 아미노산 1-109에 기재된 아미노산 서열과 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 것과 같이, 약 80% 내지 99%가 동일한, 예를 들어 90% 내지 99% 또는 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
또한, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6의 상기 CDR들 중에서 선택되는 하나 이상의 VH 상보성 결정 영역(CDR)들을 포함하는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들이 제공된다. 예를 들면, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NOS: 405, 411, 417, 423, 429, 437-441, 458, 464, 470 또는 482-484에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1을 함유한다. 예를 들면, 항-RSV 항체 또는 그들의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 GFTFSGHTIA (SEQ ID NO:405), GGTFDTYTIS (SEQ ID NO:411), GFSITDFGIH (SEQ ID NO:417), GASISSDNHYWS (SEQ ID NO:423), GFTLKNYEMN (SEQ ID NO:429), GHTIA (SEQ ID NO:437), TYTIS (SEQ ID NO:438), DFGIH (SEQ ID NO:439), SDNHYWS (SEQ ID NO:440), NYEMN (SEQ ID NO:441), GVSINSNNYFWA (SEQ ID NO:458), GDSFNDYFWT (SEQ ID NO:464), GYSFTSYWIA (SEQ ID NO:470), SNNYFWA (SEQ ID NO:482), DYFWT (SEQ ID NO:483) 또는 SYWIA (SEQ ID NO:484)을 갖는 VH CDR1을 함유할 수 있다.
다른 예에서, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 또는 471에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 WVSTNNGNTEYAQKIQG (SEQ ID NO:406), RIIPSLGETNYAHKLQG (SEQ ID NO:412), LISYNEVNIHYGESVRG (SEQ ID NO:418), SIYYTGGTNYNPSLKS (SEQ ID NO:424), YISSSGNVVKYVDSVQG (SEQ ID NO:430), NIYYGGSTHYNASLQS (SEQ ID NO:459), EISHSGSTNYSPSLKS (SEQ ID NO:465) or IIFPNDSDATYSPSFQG (SEQ ID NO:471)을 가지는 VH CDR2를 포함할 수 있다.
다른 예에서, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 또는 472에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 EWLVMGGFAFDH (SEQ ID NO:407), RITGPVDWVWDYGMDV (SEQ ID NO:413), DVWEDSWLSLACFQE (SEQ ID NO:419), GLFFITARPYWYFDL (SEQ ID NO:425) or GFSIDKYDSSVDEY (SEQ ID NO:431), SESIFWDYYYGLDV (SEQ ID NO:460), GVRSRPPPSYRGSGSPPYYHYGMDV (SEQ ID NO:466) or QYYLGSFES (SEQ ID NO:472)을 가지는 VH CDR3를 포함할 수 있다.
특정 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 405에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 406에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 407에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다. 또 다른 특정 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 437에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 406에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 407에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다.
특정 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 411에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 412에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 413에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다. 또 다른 특정 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 438에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 412에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 413에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다.
또 다른 특정 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 417에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 418에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 419에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다. 다른 특정 예에서, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 439에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 418에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 419에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다.
특정 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 423에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 424에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 425에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다. 또 다른 특정 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 440에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 424에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 425에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다.
특정 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 429에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 430에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 431에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다. 또 다른 특정 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 441에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 430에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 431에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다.
특정 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 458에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 459에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 460에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다. 또 다른 특정 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 482에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 459에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 460에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다.
특정 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 464에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 465에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 466에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다. 또 다른 특정 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 483에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 465에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 466에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다.
특정 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 470에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 471에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 472에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다. 또 다른 특정 예에서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 484에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 471에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2, 및 SEQ ID NO: 472에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3을 포함한다.
또한, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6의 CDR들 중에서 선택되는 하나 이상의 VL 상보성 결정 영역(CDR)들을 포함하는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들이 제공된다. 예를 들면, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 또는 473에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 GANNIGSQNVH (SEQ ID NO:408), RASQNIKTYLN (SEQ ID NO:414), RASQSISNWLA (SEQ ID NO:420), RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID NO:426), RASQSISNFLN (SEQ ID NO:432), TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO:461), RASQNINTWLA (SEQ ID NO:467) 또는 QASDISNYLN (SEQ ID NO:473)에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1을 함유할 수 있다.
또 다른 예에서, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 또는 474에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 DDRDRPS(SEQ ID NO:409), AVSNLQS (SEQ ID NO:415), KASNLED (SEQ ID NO:421), TLSYRAS (SEQ ID NO:427), AASSLQG (SEQ ID NO:433), EVTKRPS (SEQ ID NO:462), AASFLQS(SEQ ID NO:468) 또는 DASYLDT (SEQ ID NO:474)에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2를 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 또는 475에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 QVWDSSRDQAVI (SEQ ID NO:410), QQSFSIPLT (SEQ ID NO:416), QQYNSYSGLS (SEQ ID NO:422), MQRMEFPFT (SEQ ID NO:428), QQTYISLYT (SEQ ID NO:434), SSYAGSRHVV (SEQ ID NO:463), QQANSFPRT (SEQ ID NO:469) or QQYDDLRGGFT (SEQ ID NO:475)에 기재된 아미노산 서열을 가지는 하나의 VL CDR3를 포함할 수 있다.
하나의 특정 예에서, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 408에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1, SEQ ID NO: 409에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2, 및 SEQ ID NO: 410에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3를 포함한다. 또 다른 특정 예에서, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 414에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1, SEQ ID NO: 415에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2, 및 SEQ ID NO: 416에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함한다. 또 다른 특정 예에서, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 420에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1, SEQ ID NO: 421에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2, 및 SEQ ID NO: 422에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함한다.
또 다른 특정 예에서, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 426에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1, SEQ ID NO: 427에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2, 및 SEQ ID NO: 428에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함한다. 또 다른 특정 예에서, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 432에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1, SEQ ID NO: 433에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2, 및 SEQ ID NO: 434에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함한다. 또 다른 특정 예에서, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 461에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1, SEQ ID NO: 462에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2, 및 SEQ ID NO: 463에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함한다. 또 다른 특정 예에서, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 467에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1, SEQ ID NO: 468에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2, 및 SEQ ID NO: 469에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함한다. 또 다른 특정 예에서, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 473에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1, SEQ ID NO: 474에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2, 및 SEQ ID NO: 475에 기재된 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3을 포함한다.
상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 RSV F 단백질에 면역특이적으로 결합하는 능력이 유지된다면, 본 발명에서 제공되는 CDR들의 어떠한 조합도 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 생성을 위하여 선택될 수 있다. 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 당 분야에서 알려진 하나의 항체 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 예시적인 프레임워크 영역들은 인간 프래임워크 영역들(예를 들어, Chothia et al. (1998) J. Mol . Biol. 278: 457-479 참조)을 포함하는, 단리된 자연적으로 발생한 또는 컨센서스(consensus) 프래임 워크 영역들로부터 선택될 수 있다. 몇몇 예에서, 상기 항체 프레임워크 영역은 인간 프레임워크 영역이다. 몇몇 예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6의 프레임워크 영역을 포함한다.
본 발명에서 제공되는 예시적인 단리된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 본 발명에서 제공되는 어떤 항체들과 같이, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) F 단백질 상의 동일 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 어떠한 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편들이든 이를 포함한다. 하나의 예에서, 본 발명에서 제공되는 것은 30D8과 같은 상기 동일 에피토프에 결합하는 항체이며, 이것은 SEQ ID NO: 396에 기재된 중쇄 및 SEQ ID NO: 395에 기재된 경쇄를 포함하는 항체이다. 다른 예에서, 본 발명에서 제공되는 것은 104E5와 같은 상기 동일 에피토프에 결합하는 항체이며, 이것은 SEQ ID NO: 398에 기재된 중쇄 및 SEQ ID NO: 397에 기재된 경쇄를 포함한다. 또 다른 예에서, 38F10과 같은 에피토프에 결합하는 항체가 제공되고, 이것은 SEQ ID NO:400에 기재된 중사슬 및 SEQ ID NO:399에 기재된 경사슬을 함유하는 항체이다. 또 다른 예에서, 14G3와 같은 에피토프에 결합하는 항체가 제공되고, 이것은 SEQ ID NO:402에 기재된 중사슬 및 SEQ ID NO:401에 기재된 경사슬을 함유하는 항체이다. 또 다른 예에서, 90D3와 같은 에피토프에 결합하는 항체가 제공되고, 이것은 SEQ ID NO:404에 기재된 중사슬 및 SEQ ID NO:403에 기재된 경사슬을 함유하는 항체이다. 또 다른 예에서, 56E11과 같은 에피토프에 결합하는 항체가 제공되고, 이것은 SEQ ID NO:452에 기재된 중사슬 및 SEQ ID NO:453에 기재된 경사슬을 함유하는 항체이다. 또 다른 예에서, 17C9와 같은 에피토프에 결합하는 항체가 제공되고, 이것은 SEQ ID NO:454에 기재된 중사슬 및 SEQ ID NO:455에 기재된 경사슬을 함유하는 항체이다. 또 다른 예에서, 69F6과 같은 에피토프에 결합하는 항체가 제공되고, 이것은 SEQ ID NO:456에 기재된 중사슬 및 SEQ ID NO:457에 기재된 경사슬을 함유하는 항체이다. 통상적으로, 이와 같은 항체들은 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄((VL) 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함한다.
본 발명에서 제공되는 상기 항체들 또는 항원-결합 단편들은, 적어도 약 1×108 M-1, 적어도 약 2.5×108 M-1, 적어도 약 5×108 M-1, 적어도 약 1×109 M-1, 적어도 약 5×09 M-1, 적어도 약 1×1010 M-1, 적어도 약 5×010 M-1, 적어도 약 1×1011 M-1, 적어도 약 5×1011 M-1, 적어도 약 1×1012 M-1, 적어도 약 5×1012 M-1, 적어도 약 1×1013 M-1, 적어도 약 5×1013 M-1, 적어도 약 1×1014 M-1, 적어도 약 5×1014 M-1, 적어도 약 1×1015 M-1, 또는 적어도 약 5×1015 M-1의 상기 RSV F 단백질 에피토프에 대한 결합 친화력 상수(Ka)를 나타낸다. 본 발명에서 제공되는 상기 항체들은, SEQ ID NO: 25에 기재된 RSV A2 균주 F 단백질의 세포외 도메인과 같은 재조합으로 정제된 F 단백질에 대한 결합 친화성을 나타낼 수 있다. 본 발명에서 제공되는 상기 항체들은 또한, 세포에서 RSV의 감염 및 발현에 의해 생성되는 것과 같은, 천연의 RSV F 단백질에 대한 결합 친화성을 나타낼 수 있다. 본 발명에서 제공되는 상기 항체들은 재조합 F 단백질 대 천연 RSV F 단백질에 대하여 같거나 다른 결합 친화성을 가질 수 있다. 예를 들면, 실시예 5는 30D8이 천연의 RSV F 단백질보다 재조합 F 단백질에 높은 결합 친화성을 가지는 것을 보여준다. 반대로, sc5(예를 들면, U.S. Patent publication No. US2011/0076268 and International Published PCT Application No. WO2011/020079 참조)는 RSV F 단백질이 천연 또는 재조합 F 단백질인가에 관계없이 비슷한 결합 친화성을 나타낸다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 상기 항체들 또는 항원-결합 단편들은, 약 1×10-8 M 미만, 약 4×10-9 M 미만, 약 2×10-9 M 미만, 약 1×10-9 M 미만, 약 2×0-10 M 미만, 약 1×10-10 M 미만, 약 2×10-11 M 미만, 약 1×10-11 M 미만, 약 2×10-12 M 미만, 약 1×10-12 M 미만, 약 2×10-13 M 미만, 약 1×10-13 M 미만, 약 2×10-14 M 미만, 약 1×10-14 M 미만, 적어도 약 2×10-15 M 미만, 약 1×10-15 M 미만, 또는 약 2×10-16 M 미만의 상기 RSV F 단백질 에피토프에 대한 해리상수를 가진다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 상기 항체들 또는 항원-결합 단편들은, RSV의 중화에 대한 인 비트로 (in vitro) 마이크론중화(microneutralization) 분석에서, 약 0.005 nM 미만, 약 0.01 nM 미만, 약 0.025 nM 미만, 약 0.05 nM 미만, 약 0.075 nM 미만, 약 0.1 nM 미만, 약 0.5 nM 미만, 약 0.75 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 1.25 nM 미만, 약 1.5 nM 미만, 약 1.75 nM 미만 또는 약 2 nM 미만의 EC50을 가진다. 특정 예에서, 본 발명에서 제공되는 상기 단리된 항-RSV 항체들 또는 항원-결합 단편들은, 약 0.005 nM 내지 약 2 nM; 약 0.005 nM 내지 약 1 nM; 약 0.005 nM 내지 약 0.5 nM; 약 0.01 nM 내지 약 1 nM; 약 0.05 nM 내지 약 1 nM; 약 0.05 nM 내지 약 0.5 nM; 또는 약 0.1 nM 내지 약 0.5 nM의 인 비트로 (in vitro) 플라크 감소 분석에서, RSV의 중화에 대한 EC50을 가진다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 하나의 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, RSV 중화에 대한 인 비트로 (in vitro) 마이크론중화 분석에서 다양한 항-RSV 항체들에 대한 단일클론 항체 회피 돌연변이(MARM)들을 중화한다. 특정 예에서, 본 발명에서 제공되는 하나의 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 이로부터 MARM이 생성되는 부모 RSV 균주의 중화에 대한 EC50이거나 거의 같은 EC50의 중화에 대한 EC50를 가지면서 MARM을 중화한다. 만약 제1항체가 제2항체에 대하여 생성된 MARM을 제거할 수 있다면, 상기 항체들은 다른 에피토프들에 특이적으로 결합하거나 상호작용하는 것으로 결론지을 수 있다.
몇몇 예에서, 본 발명의 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 생성된 회피 돌연변이 (MAR MS)의 형태의 변형이 덜한 에피토프에 결합한다. 몇몇 예에서, RSV는 본 발명의 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 존재하에 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 바이러스 복제 라운드 후 회피 돌연변이를 생성할 수 없다. 특정 예에서, RSV는 본 발명의 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 존재하에 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 바이러스 복제 연속 라운드 후 회피 돌연변이를 생성하지 않는다. 또 다른 특정 예에서, RSV는 본 발명에 제공된 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로부터 회피를 수행할 수 없다. 예를 들면, 실시예 11A는 30D8의 존재하에 12 라운드의 바이러스 복제 후 RSV가 회피를 수행할 수 없다는 것을 나타낸다. 반대로, RSV는 오직 7 라운드의 바이러스 복제 후 Motavizumab® 회피를 할 수 있었다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 하나의 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 상기 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 부존재인 경우의 이의 숙주 세포 수용체에 대한 RSV의 결합에 대하여, 적어도 약 99 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 80 %, 적어도 약 75 %, 적어도 약 70 %, 적어도 약 65 %, 적어도 약 60 %, 적어도 약 55 %, 적어도 약 50 %, 적어도 약 45 %, 적어도 약 40 %, 적어도 약 35 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 25 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 15 %, 또는 적어도 약 10 %까지의 이의 숙주 세포 수용체에 대한 RSV의 결합을 억제한다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 하나의 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 상기 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 부존재인 경우의 RSV 복제에 대하여, 적어도 약 99 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 80 %, 적어도 약 75 %, 적어도 약 70 %, 적어도 약 65 %, 적어도 약 60 %, 적어도 약 55 %, 적어도 약 50 %, 적어도 약 45 %, 적어도 약 40 %, 적어도 약 35 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 25 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 15 %, 또는 적어도 약 10 % 만큼 RSV 복제를 억제한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 15일 이상, 20일 이상, 25일 이상, 30일 이상, 40일 이상, 45일 이상, 50일 이상, 55일 이상, 60일 이상, 3달 이상, 4달 이상 또는 5달 이상의 반감기를 가진다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 반감기를 증가시키는 방법은 당 분야에 알려져 있다. 그러한 방법들은 예를 들어, 본 발명의 여러 곳에서 언급된 바와 같이, 페길화(PEGylation), 당화(glycosylation), 및 아미노산 치환을 포함한다.
a. 유도체 항체
본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 키메라 항체들과 같은 유도체 항체 또는 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, 단일-사슬 Fv(scFv), Fv, dsFv, 디아바디, Fd 및 Fd' 단편들과 같은 다른 항원-결합 항체들을 생성하기 위하여 사용될 수 있다. 일반적으로, 부모 항체로부터 유도된 유도체 항체 또는 항원-결합 단편은 상기 부모 항체의 결합 특이성을 유지한다. 항체 단편들은 당 분야에서 당업자에게 알려진 기술에 의하여 생성될 수 있다. 예를 들면, Fab 및 F(ab')2 단편들은 파파인(Fab 단편들을 생산하기 위한) 또는 펩신((F(ab')2 단편들을 생산하기 위한)과 같은 효소들을 사용하여, 면역글로불린 분자들의 단백질 가수분해 분열에 의하여 생산될 수 있다. F(ab')2 단편들은 상기 가변영역, 상기 경쇄 불변영역 및 상기 중쇄의 CH1 도메인을 포함한다. 또한, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 당 분야에서 알려진 다양한 파지 디스플레이 방법들을 사용하여 생성될 수 있다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 항원-결합 가변영역들은, 키메라 전장 항체들, Fab, Fab', F(ab')2 또는 다른 항원-결합 단편들을 생성하기 위하여, 당 분야에서 알려진 하나 이상의 불변영역들에 재조합적으로 융합될 수 있다. 항체 단편들로부터 전장 항체들을 제조하기 위한 예시적 방법들은 당 분야에 알려져 있고 본 발명에서 제공된다. 키메라 항체들을 제조하기 위한 방법들은 당 분야에 알려져 있다 (예를 들면, Morrison (1985) Science 229:1202; Oi 등, (1986) BioTechniques 4:214; Gillies 등, (1989) J. Immunol . Methods 125:191-202; 및 미국등록특허 제5,807,715호, 제4,816,567, 및 제4,816,397호 참조).
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체의 하나 이상의 CDR들 및 이종(heterologous) 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역들을 포함하는 키메라 항체들은, 예를 들어 CDR-그라프팅(grafting) (EP특허 제239,400호; PCT 공개공보 WO 제91/09967호; 및 미국등록특허 제5,225,539호, 제5,530,101호, 및 제5,585,089호), 가공(veneering) 또는 재포장(resurfacing)(EP특허 제592,106호; EP특허 제519,596호; Padlan (1991) Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka 등, (1994) Protein Engineering 7(6):805-814; 및 Roguska 등, (1994) PNAS 91:969-973), 및 사슬 셔플링(shuffling)(미국등록특허 제5,565,332호)을 포함한 당 분야에 알려진 다양한 기술들을 사용하여 생산될 수 있다.
몇몇 예에서, 항체들은 30D8의 하나 이상의 CDR들 (예를 들어, SEQ ID NO: 405-410 및 437에 기재된 하나 이상의 CDR들) 및 이종 프레임워크 영역을 포함한다. 몇몇 예에서, 항체들은 104E5의 하나 이상의 CDR들 (예를 들어, SEQ ID NOS: 411-416 및 438에 기재된 하나 이상의 CDR들) 및 이종 프레임워크 영역를 포함한다. 몇몇 예에서, 항체들은 30F10의 하나 이상의 CDR들 (예를 들어, SEQ ID NO: 417-422 및 439에 기재된 하나 이상의 CDR들) 및 이종 프레임워크 영역을 포함한다. 몇몇 예에서, 항체들은 14G3의 하나 이상의 CDR들 (예를 들어, SEQ ID NOS: 423-428 및 440에 기재된 하나 이상의 CDR들) 및 이종 프레임워크 영역를 포함한다. 몇몇 예에서, 항체들은 90D3의 하나 이상의 CDR들 (예를 들어, SEQ ID NO: 429-434 및 441에 기재된 하나 이상의 CDR들) 및 이종 프레임워크 영역을 포함한다. 몇몇 예에서, 항체들은 56E11의 하나 이상의 CDR들 (예를 들어, SEQ ID NOS: 458-463 및 482에 기재된 하나 이상의 CDR들) 및 이종 프레임워크 영역를 포함한다. 몇몇 예에서, 항체들은 17C9의 하나 이상의 CDR들 (예를 들어, SEQ ID NO: 464-469 및 483에 기재된 하나 이상의 CDR들) 및 이종 프레임워크 영역을 포함한다. 몇몇 예에서, 항체들은 69F6의 하나 이상의 CDR들 (예를 들어, SEQ ID NOS: 470-475 및 484에 기재된 하나 이상의 CDR들) 및 이종 프레임워크 영역를 포함한다. 프레임워크 영역에서 프레임워크 잔기들은, 항원-결합을 향상하는 것과 같이 변경하기 위하여, 상기 CDR 공여자(donor) 항체로부터 대응하는 잔기로 치환될 수 있다. 이러한 프레임워크 치환은, 당 분야에서 널리 알려진 방법들에 의하여, 예를 들어, 항원-결합에 중요한 프레임워크 잔기들을 동정을 위한 CDR 및 프레임워크 잔기들의 상호작용들의 모델링(modeling) 및 특정 위치들(positions)에서 특이한(unusual) 프레임워크 잔기들을 동정하기 위한 서열 비교에 의하여, 동정된다(예를 들어, 미국등록특허 제5,585,089호; 및 Riechmann 등, (1988) Nature 332:323 참조).
몇몇 예에서, 상기 유도체 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 적어도 약 1×108 M-1, 적어도 약 2.5×108 M-1, 적어도 약 5×108 M-1, 적어도 약 1×109 M-1, 적어도 약 5×109 M-1, 적어도 약 1×1010 M-1, 적어도 약 5×1010 M-1, 적어도 약 1×1011 M-1, 적어도 약 5×1011 M-1, 적어도 약 1×1012 M-1, 적어도 약 5×1012 M-1, 적어도 약 1×1013 M-1, 적어도 약 5×1013 M-1, 적어도 약 1×1014 M-1, 적어도 약 5×1014 M-1, 적어도 약 1×1015 M-1, 또는 적어도 약 5×1015 M-1의 RSV F 단백질 에피토프에 대한 결합 친화력 상수 (Ka)를 가진다.
몇몇 예에서, 상기 유도체 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 약 1×10-8 M 미만, 약 4×10-9 M 미만, 약 2×10-9 M 미만, 약 1×10-9 M 미만,, 약 2×10-10 M 미만, 약 1×10-10 M 미만, 약 2×10-11 M 미만, 약 1×10-11 M 미만, 약 2×10-12 M 미만, 약 1×10-12 M 미만, 약 2×10-13 M 미만, 약 1×10-13 M 미만, 약 2×10-14 M 미만, 약 1×10-14 M 미만, 약 2×10-15 M 미만, 약 1×10-15 M 미만, 또는 약 2×10-16 M 미만의 RSV F 단백질 에피토프에 대한 해리 상수 (Kd)를 가진다.
몇몇 예에서, 유도체 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 RSV의 중화에 대한 인 비트로 미세중립화(microneutralization) 분석에서 다양한 항-RSV 항체에 대하여 단일클론성 항체 회피 돌연변이(MARMs)를 중화시킨다. 특정 예에서, 본 발명의 항-RSV 또는 그것의 항원-결합 단편은 그로부터 MARM이 발생된 부모 RSV 균주의 중화에 대한 EC50과 같거나 또는 거의 같은 중화에 대한 EC50으로 MARM을 중화시킨다.
몇몇 예에서, 유도체 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편은 발생된 회피 돌연변이의 형태의 변화를 덜 겪는 에피토프에 결합한다. 몇몇 예에서, RSV는 본 발명의 유도체 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 존재하에 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 연속적인 바이러스 복제 라운드 후 회피 돌연변이를 생성할 수 없다. 또 다른 특정 예에서, RSV는 유도체 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로부터 회피를 수행할 수 없다.
몇몇 예에서, 상기 유도체 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 RSV의 중화에 대한 인 비트로 (in vitro) 마이크론중화 분석에서 약 0.005 nM 미만, 약 0.01 nM 미만, 약 0.025 nM 미만, 약 0.05 nM 미만, 약 0.075 nM 미만, 약 0.1 nM 미만, 약 0.5 nM 미만, 약 0.75 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 1.25 nM 미만, 약 1.5 nM 미만, 약 1.75 nM 미만, 또는 약 2 nM 미만의 EC50를 가진다. 특정 예에서, 유도체 항-RSV 항체들 또는 항원-결합 단편들은, 약 0.005 nM 내지 약 2 nM; 약 0.005 nM 내지 약 1 nM; 약 0.005 nM 내지 약 0.5 nM; 약 0.01 nM 내지 약 1 nM; 약 0.05 nM 내지 약 1 nM; 약 0.05 nM 내지 약 0.5 nM; 또는 약 0.1 nM 내지 약 0.5 nM의 인 비트로 (in vitro) 플라크 감소 분석에서, RSV의 중화에 대한 EC50을 가진다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 어떠한 유도체가, 제공되는 상기 방법들과 같이, 치료 요법들(therapeutic regimens), 예방 치료들 및/또는 진단기술들에 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유도체 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 RSV 감염의 치료, 예방 및/또는 모니터용 또는 RSV 감염의 하나 이상의 증상 완화용으로 RSV에 결합하기 위하여 사용될 수 있다.
i. 단일 사슬 항체들
특정 예에서, 상기 항-RSV 항체는 단일 사슬 항체이다. 단일-사슬 항체는 본 발명에서 제공되는 어떠한 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 항원-결합 영역들로부터 생성될 수 있다. 재조합 기술들을 사용하여 단일 사슬 항체들을 생성하는 방법들은 예를 들어, Marasco 등, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:7889-7893, Whitlow 및 Filpula (1991) Methods, 2: 97-105; Bird 등, (1988) Science 242:423-426; Pack 등, (1993) Bio/Technology 11:1271-77; 및 미국등록특허 제4,946,778호, 제5,840,300호, 제5,667,988호, 제5,658,727호에서 설명된 것들과 같이 당 분야에 알려져 있다.
단일 사슬 항체는 본 발명에서 제공되는 어떠한 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 (VL) 도메인 또는 그의 기능적 영역 및 중쇄 가변 (VH) 영역 또는 그의 기능적 부위를 포함할 수 있다. 몇몇 예에서, 상기 단일 사슬 항체의 상기 VL 도메인 또는 그의 기능적 영역은, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 상보성 결정 영역 1(CDR1), 상보성 결정 영역 2(CDR2) 및/또는 상보성 결정 영역 3(CDR3)를 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 단일 사슬 항체의 상기 VH 도메인 또는 그의 기능적 부위는, 본 발명에서 제공되는 어떠한 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 하나의 상보성 결정 영역 1(CDR1), 하나의 상보성 결정 영역 2(CDR2) 및/또는 하나의 상보성 결정 영역 3(CDR3)를 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 단일 사슬 항체는 펩티드 링커를 더 포함한다. 이러한 실시예들에서, 펩티드 링커는 상기 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 상기 중쇄 가변 도메인(VH) 사이에 위치될 수 있다.
상기 단일 사슬 항체는 상기 항체의 하나 이상의 도메인들 사이에 하나의 펩티드 스페이서(spacer), 또는 링커를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 상기 경쇄 가변 도메인(VL)은 유연한(flexible) 링커 펩티드를 통하여 상기 중쇄 도메인(VH)과 커플링될 수 있다. 다양한 펩티드 링커들은 당 분야에 널리 알려져 있고, 상기 제공된 방법들에서 사용될 수 있다. 펩티드 링커는 일련의 글리신(Gly) 잔기들 또는 세린(Ser) 잔기들을 포함할 수 있다. 예시적인 폴리펩티드 링커들은 m이 1 내지 6, 일반적으로(generally) 1 내지 4, 보통(typically) 2 내지 4이고, n이 1 내지 30, 또는 1 내지 10, 및 보통(typically) 1 내지 4이고, 용해도를 증대시키기 위하여 도처에 분산된 일부 글루탐산(Glu) 또는 리신(Lys) 잔기들을 가진 아미노산 서열들 (Gly-Ser)n, (GlymSer)n 또는 (SermGly)n 펩티드들이다 (예를 들면, 결합들(conjugates)에 사용하는 예시적인 링커들을 제공하는 PCT 공개공보 WO 96/06641 참조). 예시적인 펩티드 링커들은 서열 GGSSRSSSSGGGGSGGGG(SEQ ID NO: 267), GSGRSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 268), EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO: 269), EGKSSGSGSESKSTQ(SEQ ID NO: 270), EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO: 271), GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO: 272), KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO: 273), 및 ESGSVSSEELAFRSLD(SEQ ID NO: 274)를 가진 펩티드들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 상기 링커 펩티드들은 1-50 아미노산 길이이다. 본 발명에서 사용되는 상기 링커들은 또한 세포내 사용이능성, 혈청 안정성, 특이성 및 용해도를 증가시킬 수 있거나, 증가된 유연성을 제공할 수 있거나 입체장애를 완화할 수 있다. 연결 모이어티들(Linking moieties)은, 예를 들면, Huston 등, (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883, Whitlow 등, (1993) Protein Engineering 6:989-995, 및 Newton 등, (1996) Biochemistry 35:545-553에서 설명된다. 다른 적합한 펩티드 링커들은 본 발명에 선행문헌으로 기재된 미국등록특허 제4,751,180호 또는 제4,935,233호에 설명된 어떤 것들을 포함한다.
ii . 항- 이디오타입 항체들
본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 당 분야에서 당업자에게 널리 알려진 기술들을 사용하여 상기 항체가 면역특이적으로 결합하는 상기 RSV F 단백질 항원을 "모방(mimic)"하는 항-이디오타입 항체들을 생성하기 위하여 사용될 수 있다(예를 들면, Greenspan & Bona (1989) FASEB J. 7(5):437-444; 및 Nissinoff (1991) J. Immunol . 147(8):2429-2438 참조). 예를 들면, RSV에 결합하고 이의 숙주 세포 수용체에 대한 RSV의 결합을 경쟁적으로 억제하는 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 항원-결합 단편들은, 당 분야에서 널리 알려진 분석들에 의하여 결정된 바와 같이, 하나의 RSV 항원을 "모방(mimic)"하고 상기 RSV 수용체들에 결합하는, 즉, 상기 숙주 세포와의 결합에 대하여 상기 바이러스와 경쟁하여, 숙주 세포들의 바이러스에 의한 감염률을 감소시키는 항-이디오타입들을 생성시키기 위하여 사용될 수 있다. 몇몇 예에서, 항-항-이디오타입들은 당업자에게 널리 알려진 기술들에 의하여 제조될 수 있다. 상기 항-항-이디오타입들은 상기 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 결합 도메인을 모방하고, 그 결과로서 RSV에 결합하고 중화한다.
iii . 다중-특이적 항체들 및 항체 다량체화
본 발명에서 제공되는 2개 이상의 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 2가, 3가, 4가, 5가, 6가, 7가 또는 그 이상의 원자가 (즉, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 그 이상의 항원-결합 부위들)의 유도체 항체들과 같은, 다가 (multivalent) 유도체 항체들 또는 다량체(multimer)를 형성하기 위하여 조작될 수 있다. 그러한 다가 유도체 항체들은 단일특이적, 2중특이적, 3중특이적, 또는 그 이상의 다중특이적이 될 수 있다. 몇몇 예에서, 상기 다가 유도체 항체들은 단일 특이적이고, 동일 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 2개 이상의 항원-결합 도메인들을 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 다가 유도체 항체들은 다중특이적이고, 2개 이상의 다른 에피토프들에 면역특이적으로 결합하는 2개 이상의 항원-결합 도메인들을 포함한다. 일부 특정 예에서, 상기 다가 유도체 항체들은 2가이고, 2개의 항원-결합 도메인들을 포함한다. 그러한 2가 항체들은 호모2가 또는 헤테로2가 항체들이 될 수 있고, 상기 동종2가 또는 이종2가 항체들은 각각 동일 또는 다른 에피토프들에 면역특이적으로 결합한다.
몇몇 예에서, 상기 다중특이적 항체들은 RSV의 2개 이상의 에피토프들에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 다중특이적 항체들을 조작하는 기술들은 당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 공유, 비-공유, 또는 화학 결합을 통하여 2개 이상의 항원-결합 단편들을 연결하는 것을 포함한다. 몇몇 예에서, 다가 유도체 항체들은 2개 이상의 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 이량체화(dimerization)에 의해 형성될 수 있다. 2개의 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들 사이의 다합체화는 자연적으로 발생할 수 있고, 또는 2개 이상의 폴리펩티드들의 강제적인 연결에 의하여 발생할 수 있다. 하나의 예에서, 항-RSV 항체들의 다량체들은 다른 항-RSV 항체들의 시스테인 잔기들 사이에 형성된 이황화 결합들에 의하여 연결될 수 있다. 다른 실시예에서, 다가 유도체 항체들은 상기 항체 또는 그것의 항원-결합 단편에 융합된 펩티드 모이어티들에 공유 또는 비-공유 상호작용을 통하여 연결된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함한다. 그러한 펩티드들은 펩티드 링커들(스페이서들), 또는 다량체화를 촉진하는 특성을 가지는 펩티드일 수 있다. 몇몇 예에서, 다가 유도체 항체들은, 예를 들어 헤테로-2기능(heterobifunctional) 링커들을 사용하는 것처럼, 화학 결합을 통하여 2개의 항체들 사이에서 형성될 수 있다.
항체가 생체적합하고(예를 들어, 인간을 포함한 동물 투여용), RSV의 하나 이상의 에피토프들에의 결합 및/또는 RSV의 중화와 같은 이의 활성을 유지한다면, 어떠한 다중특이 및/또는 다가 유도체 항체도, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들로부터 생성될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 상기 다중특이 및 다가 유도체 항체들에 대하여, 상기 유도체 항체는 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6에 의하여 인식되는 에피토프에 적어도 면역특이적이다. 본 발명의 다중특이적인 그리고 다가의 유도체 항체는 58c5 또는 sc5에 의해 인식되는 에피토프에 대해서도 면역특이적일 수 있다.
몇몇 예에서, 다중특이 및/또는 다가 항체는 SEQ ID NO: 2, 10, 405, 411, 417, 423, 429, 435-441, 458, 464, 470 또는 482-484에 기재된 상기 아미노산 서열들을 가지는 VH CDR1, SEQ ID NO: 3, 11, 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 또는 471에 기재된 상기 아미노산 서열들을 가지는 VH CDR2, SEQ ID NO: 4, 12, 407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 또는 472에 기재된 상기 아미노산 서열들을 가지는 VH CDR3, SEQ ID NO: 6, 14, 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 또는 473에 기재된 상기 아미노산 서열들을 가지는 VL CDR1, SEQ ID NO: 7, 15, 409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 또는 474에 기재된 상기 아미노산 서열들을 가지는 VL CDR2, SEQ ID NO: 8, 16, 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 또는 475에 기재된 상기 아미노산 서열들을 가지는 VL CDR3, 또는 그의 어떠한 조합을 포함한다.
몇몇 예에서, 다중특이적 항체들은 하나의 RSV F 단백질 (예를 들어, SEQ ID NO: 282, 382 또는 485에 기재된 아미노산 서열을 가지는 RSV F 단백질)의 2개 이상의 에피토프들에 면역특이적으로 결합하는 것으로 생성될 수 있다. 예를 들면, 상기 다중특이적 항체들은 RSV F 단백질의 상기 A, B, 또는 C 항원 영역들(antigenic regions)에서 2개 이상의 다른 에피토프들에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 몇몇 예에서, 다중특이적 항체들은 RSV F 단백질의 에피토프 및 다른 RSV 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 것으로 생성될 수 있다. 예를 들면, 상기 다중특이적 항체들은 RSV F 단백질의 에피토프 및 다른 RSV 표면 당단백질의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 몇몇 예에서, 상기 다중특이적 항체들은 RSV F 단백질의 에피토프와 RSV 부착 단백질 (예를 들어, SEQ ID NO: 275에 기재된 아미노산 서열을 가지는), RSV RNA 폴리머라아제 베타 서브유닛 거대구조 단백질 (L 단백질) (예를 들어, SEQ ID NO: 276에 기재된 아미노산 서열을 가지는), RSV 뉴클레오캡시드 단백질 (예를 들어, SEQ ID NO: 277에 기재된 아미노산 서열을 가지는), RSV 뉴클레오단백질 (N) (예를 들어, SEQ ID NO: 278에 기재된 아미노산 서열을 가지는), RSV 인단백질 P (예를 들어, SEQ ID NO: 279에 기재된 아미노산 서열을 가지는), RSV 매트릭스 단백질 (예를 들어, SEQ ID NO: 280에 기재된 아미노산 서열을 가지는), RSV 소형 소수성 (SH) 단백질 (예를 들어, SEQ ID NO: 281에 기재된 아미노산 서열을 가지는), RSV RNA-의존성 폴리머라아제, RSV G 단백질 (예를 들어, SEQ ID NO: 282에 기재된 아미노산 서열을 가지는), 또는 상기 언급된 어떤 것들의 대립유전자 변이체 중에서 선택된 RSV 단백질의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 몇몇 예에서, 상기 다중특이적 항체들은 RSV F 단백질의 에피토프 및 RSV G 단백질의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있다.
몇몇 예에서, 상기 다중특이적 항체는 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6로부터 유도된 항-RSV 항원-결합 단편 및 다른 항-RSV 항체로부터 유도된 항-RSV 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들면, 다른 항-RSV 항체는 58c5 또는 sc5로부터 유래된 항체 또는 항원-결합 단편일 수 있다. 몇몇 예에서, 상기 다중특이적 항체는 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 h는 69F6로부터 유도된 항-RSV 항원-결합 단편 및 팔리비주맙(SYNAGIS®), 및 이의 유도체, 예를 들면 그러나 이에 제한되지 않는 모타비주맙(NUMAX®), AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S(예를 들어, 미국등록특허 제5,824,307호 및 제6,818,216호 참조) 중에서 선택된 항-RSV 항체로부터 유도된 항-RSV 항원-결합 단편을 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 다중특이적 항체는 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6로부터 유도된 항-RSV 항원-결합 단편 및 인간 항-RSV 항체로부터 유도된 항-RSV 항원-결합 단편을 포함하고, 상기 인간 항-RSV 항체로는 rsv6, rsv11, rsv13, rsv19 (즉, Fab 19), rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, 및 RF-2와 같은 것이 있으나 이제 제한되지 않는다 (예를 들면, 미국등록특허 제6,685,942 및 제5,811,524호 참조). 몇몇 예에서, 상기 다중특이적 항체는 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6로부터 유도된 항-RSV 항원-결합 단편 및 항-RSV 마우스 단일클론 항체, 예를 들면 그러나 이에 제한되지 않는 MAb들 1153, 1142, 1200, 1214, 1237, 1129, 1121, 1107, 1112, 1269, 1269, 1243 (Beeler 등, (1989) J. Virology 63(7):2841-2950), MAb151 (Mufson 등, (1987) J. Clin . Microbiol. 25:1635-1539), MAb들 43-1 및 13-1 (Fernie 등, (1982) Proc . Soc . Exp . Biol . Med . 171:266-271), MAb들 1436C, 1302A, 1308F, 및 1331H (Anderson 등, (1984) J. Clin. Microbiol. 19:934-936), 및 그의 인간화 유도체로부터 유도된 항-RSV 항원-결합 단편을 포함한다. 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6로부터 유도된 항-RSV 항원-결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체를 생성하기 위하여 사용될 수 있는 추가적인 예시 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 예를 들어 미국등록특허 제6,413,771호, 제5,840,298호, 제5,811,524호, 제6,656,467호, 제6,537,809호, 제7,364,742호, 제7,070,786호, 제5,955,364호, 제7,488,477호, 제6,818,216호, 제5,824,307호, 제7,364,737호, 제6,685,942호, 및 제5,762,905호 그리고 미국공개특허 제2007-0082002호, 제2005-0175986호, 제2004-0234528호, 제2006-0198840호, 제2009-0110684호, 제2006-0159695호, 제2006-0013824호, 제2005-0288491호, 제2005-0019758호, 제2008-0226630호, 제2009-0137003호, 및 제2009-0092609호에 설명되어 있는 항-RSV 항체들 또는 항원-결합 단편들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 하기의 표 2A 및 2B는 항-RSV 항체 중사슬(표 2a) 및 경사슬(표 2b)에 대한 SEQ ID NOS를 기재한다. 중사슬 및 경사슬의 전장길이 서열, 중가변 도메인과 경 가변 도메인의 전장 서열, 및 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, DRL2 및/또는 CDRL3의 서열을 포함하여 기재하였다.
[표 2a]
Figure 112012100085696-pct00003
[표 2b]
Figure 112012100085696-pct00004
몇몇 예에서, 다중특이적 항체들 또는 항원-결합 단편들은 RSV F 단백질의 에피토프 및 다른 이종 폴리펩티드(heterogous polypeptide) 또는, 예를 들어, 고체 지지물질과 같은 다른 항원성 물질(antigenic material)의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있다(예를 들면, PCT 국제공개특허 WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360, 및 WO 92/05793; 미국등록특허 제4,474,893호, 제4,714,681호, 제4,925,648호, 제5,573,920호, 및 제5,601,819호; Tutt 등, (1991) J. Immunol . 147:60-69; 및 Kostelny 등, (1992) J. Immunol. 148:1547-1553 참조).
(1) 펩티드 링커를 통한 다량체화
펩티드 링커들은 다가 항체들을 생산하기 위하여 사용될 수 있으며, 상기 다가 항체들로는, 예를 들어 하나의 다량체화 파트너(multimerization partenr)가 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편인 다량체가 있다. 하나의 예에서, 펩티드 링커들은 제1 폴리펩티드의 C-말단과 제2 폴리펩티드의 N-말단이 융합될 수 있다. 이러한 구조는 적어도 하나의, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 가용성 폴리펩티드들이 그들의 각각의 터미날(termini)에서 펩티드 링커들을 통하여 다른 폴리펩티드와 연결되는 것이 여러 번 반복되어 형성될 수 있다. 예를 들면, 다량체 폴리펩티드는 서열 Z1-X-Z2를 가질 수 있고, Z1 및 Z2는 각각 항-RSV 항원-결합 단편의 서열에 해당하며 (예를 들어, 항-RSV 단일 사슬 항체; 예를 들어, 단일 사슬 항체들의 다량체화를 설명하고 있는 미국등록특허 제6,759,518호 참조), X는 펩티드 링커의 서열이다. 몇몇 예에서, Z1 및/또는 Z2는 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항원-결합 단편이다. 다른 실시예에서, Z1 및 Z2는 다른 항-RSV 항원-결합 단편들이고, 적어도 Z1 또는 Z2는 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편으로부터 유도된 것이다. 몇몇 예에서, 상기 다량체 폴리펩티드는 Z1-X-Z2-(X-Z)n의 서열을 가지고, "n"은 어떠한 정수도 되며, 일반적으로는 1 또는 2가 된다. 일반적으로, 상기 펩티드 링커는 상기 합체의 결합 특이성을 저해하지 않으면서, 각각의 항-RSV 항원-결합 단편이 그것의 각각의 에피토프에 결합하는 것을 가능하게 하기 위하여 충분한 길이이다.
(2) 헤테로- 2기능성 결합제(linkage agents)을 통한 다량체화
다가 항체를 만들기 위해 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편과 다른 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편과의 연결(linkage)은 직접 또는 간접적일 수 있다. 예를 들면, 2개 이상의 항-RSV 항체들 또는 항원-결합 단편들의 연결은 화학적 연결에 의하여 달성되거나 또는 당 분야에서 알려지거나 본 발명에서 제공되는 헤테로-2기능성 링커들에 의하여 촉진될 수 있다.
아미노기 및 티올(thiol)기 사이의 공유결합들을 형성하고 단백질 내로 티올 그룹을 도입하기 위하여 사용되는 수많은 이종-2기능성 교차-결합 시약들(cross-linking reagents)은 당 분야의 당업자에게 알려져 있다 (예를 들면, 그러한 시약들의 제조와 사용을 설명하고 그러한 시약들을 위한 상업출처(commercial source)에 대하여 제공하고 있는 the PIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992-1993 참조; 참조, 예를 들어, Cumber 등, (1992) Bioconjugate Chem. 3:397-401; Thorpe 등, (1987) Cancer Res . 47:5924-5931; Gordon 등, (1987) Proc . Natl . Acad Sci. 84:308-312; Walden 등, (1986) J. Mol . Cell Immunol. 2:191-197; Carlsson 등, (1978) Biochem . J. 173: 723-737; Mahan 등, (1987) Anal . Biochem. 162:163-170; Wawryznaczak 등, (1992) Br . J. Cancer 66:361-366; Fattom 등, (1992) Infection & Immun. 60:584-589 참조). 이러한 시약은 2 개의 항체들 사이 또는 각각의 항체들 및 링커 사이에 공유결합을 형성하기 위하여 사용될 수 있다. 예시적인 시약들로는 하기의 시약들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP; 이황화물 링커); 설포숙신이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-프로피오나미도]헥사노에이트(설포-LC-SPDP); 숙신이미딜옥시카보닐-α-메틸 벤질 티오설페이트(SMBT, 방해된(hindered) 디설페이트 링커); 숙신이미딜 6-[3-(2-피리딜디티오) 프로피오나미도]-헥사노에이트(LC-SPDP); 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC); 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)뷰틸레이트(SPDB; 방해된(hindered) 이황화결합 링커); 설포숙신이미딜 2-(7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세트아마이드) 에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(SAED); 설포숙신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세테이트(SAMCA); 설포숙신이미딜-6-[알파-메틸-알파-(2-피리딜디티오)톨루아미이도]-헥사노에이트(설포-LC-SMPT); 1,4-디-[3'-(2'-피리딜디티오)프로피오-아미도]부탄(DPDPB); 4-숙신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α-(2-피리딜티오)톨루엔(SMPT, 방해된(hindered) 디설페이트 링커); 설포숙신이미딜-6-[α-methyl-α-(2-피리미딜디-티오)톨루아미도]헥사노에이트(설포-LC-SMPT); m-말레이미도벤조일-N-하이드록시-숙신이미드 에스터(MBS); m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포-숙신이미드 에스터(설포-MBS); N-숙신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(SIAB; 티오에스터 링커); 설포숙신이미딜-(4-아이오도아세틸)아미노 벤조에이트(설포-SIAB); 숙신이미딜-4-(p-말레이미도-페닐l)부틸레이트(SMPB); 설포숙신이미딜-4-(p-말레이미도-페닐)부틸레이트(설포-SMPB); 및 아지도벤조일 하이드라자이드(ABH). 몇몇 예에서, 상기 링커들은, 유동성 또는 가용성을 증가시키거나 입체 장애를 제공하거나 제거하기 위한 것들과 같은, 펩티드 링커들과 조합되여 사용될 수 있다.
(3) 폴리펩티드 다량체화 도메인
다가 및/또는 다중특이적 유도체 항체들을 형성하기 위한 2개 이상의 항원-결합 단편들의 상호작용은, 직접적 또는 간접적이든, 그들 스스로 상호작용하여 안정한 구조를 형성할 수 있는 어떤 모이어티 또는 다른 폴리펩티드에 대한 그들의 결합에 의해 용이해질 수 있다. 예를 들면, 각각의 코딩된 폴리펩티드 사슬들은 다량체화에 의하여 연결될 수 있고, 상기 폴리펩티드들의 다합체화는 다량체화 도메인에 의하여 매개될 수 있다. 일반적으로, 상기 다량체화 도메인은 제1 키메라 폴리펩티드 및 제2 키메라 폴리펩티드 사이에 안정한 단백질-단백질 상호작용의 형성을 제공한다. 키메라 폴리펩티드들은, 예를 들어, 다량체화 도메인을 가진 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 하나의 사슬 (예를 들어, 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인)의 결합 (직접적으로 또는 간접적으로)을 포함한다. 일반적으로, 상기 다량체화 도메인은 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 하나의 중쇄 영역에 연결된다. 그러한 키메라 폴리펩티드들은 상기 항체 사슬을 코딩하고 있는 핵산을 상기 다량체화 도메인을 코딩하고 있는 핵산에 융합하기 위한 재조합 기술들을 사용하여 융합 단백질로서 생성될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 상기 다가 및/또는 다중특이적 유도체 항체들에 대하여, 적어도 하나의 다량체화 파트너는 다량체화 도메인에 직접 또는 간접적으로 결합된 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 호모- 또는 헤테로다량체의 폴리펩티드들은 각각의 키메라 폴리펩티드들의 공동-발현으로부터 생성될 수 있다. 제1 및 제2 키메라 폴리펩티드들은 같거나 다를 수 있다.
일반적으로, 다량체화 도메인은 다른 폴리펩티드와 안정한 단백질-단백질 상호작용을 형성할 수 있는 어떠한 폴리펩티드도 포함한다. 예를 들면, 상기 다량체화 도메인들은 면역글로불린 서열 (예를 들어, Fc 도메인), 류신 지퍼, 소수성 영역, 친수성 영역, 또는 호모- 또는 헤테로다량체의 상기 키메라 분자들 사이에서 분자간 이황화결합을 형성하는 유리(free) 티올을 통하여 상호작용할 수 있다. 또한, 다량체화 도메인은 예를 들어, 미국등록특허 제5,731,168호에 설명된 바와 같이, 홀 또는 포켓을 포함하는 아미노산 서열에 대하여 상보적인 융기(protuberance)를 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그러한 다량체화 도메인은, 입체 상호작용들(steric interactions)이 안정한 상호작용을 촉진할 뿐만 아니라 키메라 단량체들의 혼합물로부터 호모이량체 보다 헤테로이량체의 형성을 더욱 촉진하도록 조작될 수 있다.
몇몇 예에서, 다가 및/또는 다중특이적 항체들은 다량체화 도메인을 통하여 2개의 항-RSV 항원-결합 단편들의 결합들에 의하여 생성된다. 이러한 실시예들에서, 적어도 하나의 상기 항원-결합 단편들은, 예를 들어 58c5, sc5, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6와 같은 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로부터 유도된다.
예를 들어, 항-RSV 항원-결합 단편과 같은 항원-결합 폴리펩티드는 키메라 폴리펩티드를 형성하기 위하여 다량체화 도메인에 접합될 수 있다. 하나 이상의 사슬 (예를 들어, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인)을 포함하고 있는 항-RSV 항원-결합 단편들에 대하여, 상기 다량체화 도메인은 상기 사슬들의 하나에 접합될 수 있으며, 일반적으로 중쇄에 결합할 수 있다. 상기 항원-결합 단편은 일반적으로 상기 다량체화 도메인의 N- 또는 C-말단에 상기 항원-결합 단편의 N- 또는 C-말단을 통하여 연결된다. 일반적으로, 상기 다량체화 도메인은 상기 항원-결합 단편의 C-말단 (예를 들어, 단일 사슬 항체의 C-말단 또는 상기 항원-결합 단편의 하나의 사슬의 C-말단)에 접합된다. 상기 결합은 링커를 통하여 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 또한, 상기 키메라 폴리펩티드는 융합 단백질이 될 수 있거나, 공유 또는 비-공유 상호작용들을 통하는 것과 같이 화학 결합에 의하여 형성될 수 있다. 예를 들면, 다량체화 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 제조할 때, 항-RSV 항원-결합 단편의 전부 또는 일부를 코딩하고 있는 핵산은 상기 다합체화 영역 서열을 코딩하고 있는 핵산에, 직접 또는 간접적으로 또는 선택적으로 링커 영역을 통하여, 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 상기 구성체(construct)는 상기 항-RSV 항원-결합 단편 (또는 상기 항원-결합 단편의 단일 사슬)의 상기 C-말단이 상기 다량체화 도메인의 상기 N-말단에 결합하는 키메라 항체를 코딩한다.
본 발명에서 제공되는 다가 항체는 직접 또는 간접적으로 2개의 같거나 다른 항-RSV 항원-결합 단편들을 직접 또는 간접적으로 다량체화 도메인에 결합함으로써 형성된 두 개의 키메라 단백질들을 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 다량체화 도메인이 폴리펩티드인 경우, 항-RSV 항원-결합 단편(또는 상기 항원-결합 단편의 단일 사슬) 다량체화 도메인 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 융합은 적절한 발현 벡터 내로 삽입된다. 상기 결과로 만들어진 항-RSV 항원-결합 단편-다량체화 도메인 키메라 단백질들은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포들 내에서 발현될 수 있고, 다량체로 조립될 수 있도록 할 수 있으며, 여기서 다량체화 도메인들은 상호작용하여 다가 항체들을 형성한다. 항-RSV 항원-결합 단편들에 대한 다량체화 도메인들의 화학 결합은 또한 상기 언급한 바와 같이 헤테로-2기능성 링커들을 사용하여 달성될 수 있다. 몇몇 예에서, 상기 다가 항체들은 다른 에피토프들에 결합하는 2개 이상의 항-RSV 항원-결합 단편들로부터 유도되는 다중특이적 항체들이다.
상기 결과로 만들어진 키메라 폴리펩티드들, 및 그것들로부터 형성된 다가 항체들은, 예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 친화성 크로마토그래프와 같이 당 분야에서 알려진 적절한 방법에 의하여 정제될 수 있다. 다른 항-RSV 항원-결합 키메라 폴리펩티드들을 코딩하는 2개의 핵산 분자들이 세포들 내로 형질전환되는 곳에서, 호모- 및 헤테로이량체들의 형성이 일어날 것이다. 발현의 조건들은 헤테로이량체 형성이 호모이량체 형성보다 유리할 수 있도록 조정될 수 있다.
(a) 면역글로불린 도메인
다량체화 도메인들은 추가적인 아미노산 서열의 다량체화 도메인과 분자간 이황화결합을 형성하기 위하여 반응할 수 있는 유리 티올 모이어티를 포함하는 것들을 포함한다. 예를 들면, 다량체화 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgM, 및 IgE과 같은 면역글로불린 분자들의 부분(portion)을 포함할 수 있다. 일반적으로, 다량체화 도메인으로 사용되기 위하여 선택되는 면역글로불린의 부분은 상기 불변영역(Fc)이다. 상기 Fc 영역을 포함하는, 항체-유도 폴리펩티드들의 다양한 부분들에 융합된 폴리펩티드들을 포함하는 융합 단백질의 제조법이 개시되어 왔다 (예를 들어, Ashkenazi 등, (1991) PNAS 88: 10535; Byrn 등, (1990) Nature, 344:677; 및 Hollenbaugh와 Aruffo, (1992) "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins," in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pp. 10.19.1-10.19.11 참조).
인간에는, 각각 항체의 상기 IgD, IgG, IgM, IgA, 및 IgE 클래스들을 생기게 하는 델타(δ), 감마(γ), 뮤 (μ), 알파 (α) 및 입실론(ε)으로 표시되는 그의 중쇄들에 기초하여 분류되는 5개의 항체 아이소타입이 있다. 상기 IgA 및 IgG 클래스들은 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 서브클래스를 포함한다. 면역글로불린 중쇄들 사이의 서열 차이는, 예를 들어, 불변(C) 도메인의 수, 힌지 영역의 존재, 및 사슬간 이황화결합들의 수와 위치가 다른 다양한 아이소타입(isotype)들을 발생시킨다. 예를 들면, IgM 및 IgE 중쇄들은 상기 힌지 영역를 대체하는 추가의(extra) C 도메인(C4)를 포함한다. IgM 및 IgE의 상기 Fc 영역들은 Cμ4 및 Cε4 도메인들를 통하여 이량체화(dimerization)되는 반면, IgG, IgD, 및 IgA의 상기 Fc 영역들은 그의 Cγ3, Cδ3, 및 Cα3 도메인들을 통하여 서로 쌍(pair)을 이룬다. IgM 및 IgA는 각각 10개 및 4개의 항원-결합 부위를 가진 다가 구조들을 형성한다.
본 발명에서 제공되는 항원-결합 키메라 폴리펩티드들은 전장 면역글로불린 폴리펩티드들(즉, 전장 면역글로불린의 모든 도메인들을 포함)을 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 항원-결합 키메라 폴리펩티드는 전체 길이보다 짧다 (예를 들어, 상기 키메라 폴리펩티드는 항원-결합 도메인 및 하나 이상의 면역글로불린 도메인들을 포함할 수 있고, 여기서 키메라 폴리펩티드가 전장 면역글로불린이 아니다). 몇몇 예에서, 상기 항-RSV 항원-결합 키메라 폴리펩티드들은 1가 또는 헤테로- 또는 호모- 다가 항체들, 예를 들면, 2가, 3가, 4가, 5가, 6가, 7가 또는 그 이상의 원자가 항체들로서 조립된다(assembled). 변화하는 구조들의 사슬들 또는 기본 유닛들(basic units) (예를 들어, 하나 이상의 이종의 불변영역들 또는 도메인들)은 1가 및 헤테로- 및 호모-다가 항체들을 조립하는데 사용될 수 있다. 항-RSV 항원-결합 키메라 폴리펩티드들은 적절한 핵산 분자로 형질전환되는 포유류 세포들에 의하여 쉽게 생산될 수 있고 분비될 수 있다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 핵산 융합 분자는 상기 다가 항체의 상기 항-RSV 항원-결합 부분들이 같거나 다른 다가 항체를 생산하기 위하여 숙주 세포 내로 형질전환될 수 있다. 일반적으로, 상기 다가 항체의 적어도 하나의 상기 항-RSV 항원-결합 부분들은, 예를 들어 58c5, sc5, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6와 같은, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편으로부터 유도된다.
(i) Fc 도메인
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항원-결합 단편을 포함하는 다가 및/또는 다중특이적 항체들을 생성하기 위하여 사용될 수 있는 예시적인 다량체화 도메인들은 선택된 면역글로불린 분자의 중쇄 불변영역 또는 도메인으로부터 유도된 폴리펩티드들을 포함한다. 인간 IgG 서브-타입에 대한 중쇄 불변영역들의 예시적인 서열들은 SEQ ID NO: 356 (IgG1), SEQ ID NO: 357 (IgG2), SEQ ID NO: 358 (IgG3), 및 SEQ ID NO: 359 (IgG4)에 기재된다. 예를 들면, SEQ ID NO: 356에 기재된 상기 예시적인 중쇄 불변영역에 대하여, 상기 CH1 도메인은 아미노산 1-103에 상응하고, 상기 힌지영역은 아미노산 104-119에 상응하고, 상기 CH2 도메인은 아미노산 120-223에 상응하며, 그리고 상기 CH3 영역은 아미노산 224-330에 상응한다.
하나의 예에서, 면역글로불린 폴리펩티드 키메라 단백질은 면역글로불린 폴리펩티드의 상기 Fc 영역을 포함한다. 일반적으로, 그러한 융합은 적어도 기능적으로 활성인 힌지, 면역글로불린 중쇄의 불변영역의 CH2 및 CH3 영역들을 유지한다. 예를 들면, IgG1의 전장 Fc 서열은 SEQ ID NO: 356에 기재된 상기 서열의 아미노산 104-330을 포함한다. hIgG1에 대한 예시적인 Fc 서열은 SEQ ID NO: 360으로 명시되고, SEQ ID NO: 356의 아미노산 104-119와 대응하는 상기 힌지 서열 및 SEQ ID NO: 356로 명시되는 CH2 및 CH3 영역을 위한 완전한 서열을 포함한다. 다른 예시적인 Fc 폴리펩티드는 PCT 출원 WO 93/10151에 명시되며, 인간의 IgG1 항체의 Fc 부위(SEQ ID NO: 361)의 상기 N-말단 힌지영역에서 천연 C-말단까지 확장되는 단일 사슬 폴리펩티드이다. 상기 결합이 만들어지는 정확한 위치(site)는 중요하지 않다: 특정 위치들은 당 분야에서 널리 알려져 있고 상기 항-RSV 항원-결합 키메라 폴리펩티드의 생물학적 활성, 분비, 또는 결합 특성들을 최적화시키기 위하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 다른 예시적인 Fc 폴리펩티드 서열들은 SEQ ID NO: 356에 기재된 상기 서열의 아미노산 C109 또는 P113에서 시작된다 (예를 들어, 미국특허 제2006/0024298호 참조).
hIgG1 Fc에 더하여, 다른 Fc 부위들 또한 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항원-결합 키메라 폴리펩티드들에 포함될 수 있다. 예를 들면, 상기 Fc 융합은, 항체들의 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 인간 서브클래스를 포함하는), IgA (IgA1 및 IgA2 인간 서브클래스를 포함하는), IgD, IgE, 및 IgM 클래스들을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 상기 항체 클래스들의 어떠한 것에 속하는 면역글로불린 유전자들에 의하여 실질적으로(substantially) 코딩되는 면역글로불린 서열들을 포함할 수 있다.
몇몇 예에서, Fc 영역은 예를 들어, 면역 반응의 매개에 있어서 상기 Fc 영역의 상기 이펙터 기능들과 같은, 상기 영역의 기능적 특성들에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들면, Fc/FcγR 상호작용에 의하여 매개되는 이펙터 기능들이 최소화될 곳에서, 보체 또는 이펙터 세포들을 적게(poorly) 리크루트(recruit)하는 IgG 아이소타입들과의 융합이, 예를 들어 IgG2 또는 IgG4, 사용될 수 있다. 변형된(modified) Fc 영역들은 또한 항-RSV 항원-결합 단편들을 가진 키메라에 사용을 위한 본 발명에서 고려될 수 있다.
예시적인 변형로 하기 문헌 참조, 예를 들어, 미국등록특허 제7,217,797호; 및 미국공개특허 제2006/0198840호, 제2006/0024298호 및 제2008/0287657호; 그리고 국제공개특허 WO 2005/063816. Fc 영역들의 예시적인 아미노산 변형(modification)은 또한 본 발명 명세서의 여러 곳에서 제공된다.
일반적으로, 2가 항체는 하나의 Fc 폴리펩티드에 대하여 2개의 같거나 다른 항-RSV 항원-결합 단편들을 직접 또는 간접적으로 연결함으로써 제조되는 2개의 키메라 단백질들의 이량체(dimer)이다. 몇몇 예에서, 상기 키메라 단백질을 코딩하는 유전자 융합은 적절한 발현 벡터 내로 삽입된다. 상기 결과로 만들어지는 키메라 단백질은 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포들 내에서 발현될 수 있고, 조립되도록 허용되며, 여기서 사슬간 황화결합들은 Fc 모이어티들 사이에 형성하여 이가 항-RSV 항체들이 산출된다(yield). 일반적으로, 숙주 세포 및 발현 시스템은 키메라 단백질의 당화(glycosylation)를 허용하도록 포유류 발현 시스템이다. 상기 결과로 만들어진, Fc 모이어티들을 포함하는 키메라 폴리펩티드들, 및 그것들로부터 형성된 다가 항체들은 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼의 친화성 크로마토그래피에 의하여 쉽게 정제될 수 있다. 다른 항-RSV 키메라 폴리펩티드들을 코딩하는 2개의 핵산이 세포들 내로 형질전화되는 경우, Fc-도메인을 수반하는 항-RSV 키메라 분자들이 이황화-결합된 호모이량체들 또한 발현할 것이기 때문에 헤테로이량체의 형성은 생화학적으로 달성되어야 한다. 따라서, 호모이량체들은 사슬-간(inter-chain) 이황화물들의 분열(disruption)에는 유리하나, 사슬-내(intra-chain) 이황화물에는 영향을 주지 않는 조건 하에서 감소될 수 있다. 일반적으로, 다른 세포외 부분들을 가진 키메라 단량체들은 같은 몰의 양으로 혼합되고, 호모- 및 헤테로이량체들의 혼합물을 형성하기 위하여 산화된다. 이러한 혼합물의 상기 구성요소들은 크로마토그래피 기술들에 의하여 단리된다.
그 대신에, 헤테로이량체의 형성은 항-RSV 항원-결합 단편, 그 뒤로(followed by) hIgG의 상기 Fc-영역, 그 뒤로 c-jun 또는 c-fos 류신 지퍼들을 포함하는 항-RSV 항원-결합 융합 분자들의 유전자 조작 및 발현에 의하여 한쪽으로 치우치게(biased) 될 수 있다. 상기 류신 지퍼들이 대부분 헤테로이량체들을 형성하기 때문에, 원할 때 상기 류신 지퍼들은 상기 이종이합체들의 형성을 추진(dirve)하기 위하여 사용될 수 있다. Fc 영역들을 포함하는 항-RSV 키메라 폴피펩티드들은 또한 금속 킬레이트 또는 다른 에피토프를 가진 태그(tag)를 포함하도록 조작될 수 있다. 상기 태그된 도메인은, 웨스턴 블랏, 면역침강, 또는 바이오분석에서 활성 고갈(depletion)/차단(blocking)의 검출이 허용되도록, 금속-킬레이트 크로마토그래피, 및/또는 항체들에 의하여 빠른 정제용으로 사용될 수 있다.
D. 항- RSV 항체들의 추가적인 변형들
본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 더욱 변형될 수 있다. 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편의 변형은 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 면역원성(immunogenicity)의 감소, 단백질 가수분해에 대한 민감도 감소 및/또는 산화에 대한 민감도 감소와 같이 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 반감기 향상, 그리고 상기 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 결합 특성을 변경 또는 향상하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는 항체의 하나 이상의 특성들을 향상시킬 수 있다. 예시적인 변형에는 상기 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 1차 아미노산 서열의 변형 및 상기 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 번역 후 변형의 변경(alteration)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 번역 후 변형에는 예를 들어, 당화(glycosylation), 아세틸화(acetylation), 페길화(pegylation), 인산화(phosphorylation), 아미드화(amidation), 보호/차폐기에 의한 유도체화(derivatization), 단백질 가수분해의 분열, 세포 리간드 또는 다른 단백질의 결합을 포함한다. 다른 예시적인 변형에는 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 하나 이상의 특성들을 변경 또는 향상시키기 위하여 상기 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편에 하나 이상의 이종 펩티드들의 부착을 포함한다.
일반적으로, 상기 변형들은 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 증가된 면역원성을 야기하지 않으며 또는 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 RSV에 대한 결합에 상당하게 부정적인 영향을 끼치지 않는다. RSV F 단백질에 대한 변형된 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 결합을 평가하는 방법들은 본 발명에서 제공되고 당 분야에서 알려져 있다. 예를 들면, 변형된 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, ELISA, 표면 플라스몬 공명(SPR) 또는 인 비트로(in vitro) 마이크론중화 분석들을 통하는 것과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 방법들에 의하여 RSV F 단백질에 대한 결합에 대해 평가될 수 있다.
본 발명은 본 발명에서 제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들 중 어느 것의 반감기를 향상시키는 방법을 제공한다. 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 반감기를 향상시키는 것은 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 치료 효율성을 증가시킬 수 있고, RSV 감염 예방 또는 치료, RSV 감염의 하나 이상의 증상들을 예방, 치료, 및/또는 완화, 또는 RSV 감염의 기간을 감소하는 것과 같은 예방 및/또는 치료용으로 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 덜 자주 투여할 수 있게 할 수 있다.
본 발명에서 제조된 상기 항-RSV 항체들 또는 항원-결합 단편들의 변형은 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가, 자연 돌연변이 또는 부모 항체로부터의 인간 조작(human manipulation) 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 항체들과 같은 폴리펩티드들의 변형 방법들은 당 분야에서 알려져 있으며, 본 발명에서 제공되는 어떠한 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 변형을 위하여 사용될 수 있다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 약물동태학적(pharmacokinetic) 특성들은 당 분야에서 당업자에게 알려진 기술들에 의한 Fc 변형을 통하여 강화될 수 있다. 당 분야에서 당업자에게 알려진 표준 기술들은, 하나 이상의 아미노산 치환을 가진 폴리펩티드를 생산하기 위하여, 본 발명에서 제공되는 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 분자에서의 돌연변이들을 도입하는데 사용될 수 있다. 돌연변이를 도입하기 위한 예시적인 기술들은 특정 부위 돌연변이 유발(site directed mutagenesis) 및 PCR-매개 돌연변이 유발을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 및 그의 항원-결합 단편들은 정제를 용이하게 하기 위하여 이종 펩티드의 부착에 의하여 변형될 수 있다. 일반적으로 그러한 펩티드들은 상기 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 C- 또는 N-말단에서 상기 펩티드에 융합된 항체를 포함하는 융합 단백질로서 발현된다. 정제를 위하여 일반적으로 사용되는 예시적인 펩티드들은 헥사-히스티딘 펩티드들, 헤마글루티닌(HA) 펩티드들 및 플레 그태그 펩티드들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(예를 들어, Wilson 등, (1984) Cell 37:767; Witzgall 등, (1994) Anal Biochem 223:2, 291-8 참조). 상기 융합은 반드시 직접적일 필요는 없으며, 링커 펩티드를 통하여 발생할 수 있다. 몇몇 예에서, 상기 링커 펩티드는, 프로테아제 분열 부위(cleavage site)를 특이적으로 인식하여 프로테아제를 통한 분열에 의한 정제 후에 정제 펩티드의 제거를 가능하게 하는 프로테아제 분열 부위를 포함한다.
본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 또한 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)에서, 항체 또는 항원-결합 단편을 특정 세포 유형(예를 들어, 호흡기 상피 세포들)에 표적화하는 이종 폴리펩티드의 부착에 의하여 변형될 수 있다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 특정 세포 표면 수용체에 특이적인 항체 또는 특정 세포 수용체와 상호작용을 하는 다른 폴리펩티드에 대한 융합 또는 접합에 의하여 특정 세포 유형에 대해 표적화될 수 있다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표적세포 수용체에 대해 표적화 될 수 있고/있거나 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 단백질 전달 도메인(protein transduction domain)(예를 들어, TAT 펩티드)과 같은 세포 표면 당단백질에 결합하는 펩티드와 융합 또는 접합에 의하여 상기 표적세포에 표적화될 수 있다. 예시적인 단백질 전달 도메인들은 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1) TAT(Ruben 등, (1989) J. Virol. 63:1-8; 예를 들어, GRKKRRQRRR (TAT 48-57) SEQ ID NO: 330과 같은 SEQ ID NO: 326-337), 헤르페스 바이러스 외피 단백질(tegument protein) VP22(ELLIOT 및 O'HARE (1997) Cell 88:223-233; 예를 들어, SEQ ID NO: 342), 드로스필라 멜라노가스터 안테나페디아(Drosophila melanogaster Antennapedia) (Antp) 단백질의 호메오틱 단백질(homeotic protein)(Penetratin PTD; Derossi 등, (1996) J. Biol . Chem. 271:18188-18193; 예를 들어, SEQ ID NO: 311-314), 프로테그린(protegrin) 1(PG-1) 항-미생물 펩티드 SynB(예를 들어, SynB1, SynB3, 및 Syn B4; Kokryakov 등, (1993) FEBS Lett. 327:231-236; 예를 들어, 각각 SEQ ID NO: 232-325) 및 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor)(Jans (1994) FASEB J. 8:841-847; 예를 들어, SEQ ID NO: 307)과 같은 단백질로부터 유도된 PTD들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. PTD들은 또한 폴리아르기닌(polyarginine) 펩티드(Futaki 등, (2003) J. Mol . Recognit. 16:260-264; Suzuki 등, (2001) J. Biol . Chem. 276:5836-5840; 예를 들어, SEQ ID NO: 315-316), 트랜스포탄(transportan)(Pooga 등, (1988) FASEB J. 12:67-77; Pooga 등, (2001) FASEB J. 15:1451-1453; 예를 들어, SEQ ID NO: 338-341), MAP (Oehlke 등, (1998) Biochim . Biophys. Acta. 1414:127-139; 예를 들어, SEQ ID NO: 305), KALA (Wyman 등, (1997) Biochemistry 36:3008-3017; 예를 들어, SEQ ID NO: 303) 및 예를 들어 다양한 β-양이온성 펩티드들(Akkarawongsa 등, (2008) Antimicrob . Agents and Chemother. 52(6):2120-2129)과 같은 다른 양이온성 펩티드들과 같은 합성 PTD들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 및 그의 항원-결합 단편들은 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 진단 및/또는 치료 모이어티에 대한 부착에 의하여 변형될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 및 그의 항원-결합 단편들은, 공유 부착(attachment)이 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 이의 대응하는 에피토프에 결합하는 것이 방해하지 않도록, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 대한 진단 또는 치료 분자와 같은 어떤 종류의 분자의 공유결합에 의하여 변형될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 공유 부착이 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 RSV에 결합하는 것을 방해하지 않도록, 분자의 공유부착에 의하여 더 변형될 수 있다. 몇몇 예에서, 상기 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, N 말단 또는 C 말단에서 이종 폴리펩티드에 재조합으로 융합되거나, 이종 폴리펩티드 또는 조성물(composition)에 화학적으로 접합될 수 있으며, 화학적 결합은 공유 및 비-공유 접합을 포함한다. 예를 들면, 상기 이종 폴리펩티드 또는 다른 조성물은 진단 폴리펩티드 또는 다른 진단 모이어티 또는 치료 폴리펩티드 또는 다른 치료 모이어티가일 수 있다. 예시적인 진단 및 치료 모이어티들은 약들(drugs), 방사성핵종(radionuclezotide)들, 독들소, 형광 분자들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(예를 들어, PCT 국제공개특허 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국등록특허 제5,314,995호; 및 EP특허 제396,387호 참조). 진단 폴리펩티드 또는 진단 모이어티들은 예를 들면 인 비보(in vivo ) 또는 인 비트로(in vitro) 검출을 위한 표지들로서 사용될 수 있다. 치료 폴리펩티드 또는 치료 모이어티들은 예를 들면 RSV 감염과 같은 바이러스성 감염의 치료용 또는 바이러스성 감염의 하나 이상의 증상들의 치료용으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 추가적인 융합 단백질들은 유전자-셔플링(shuffling), 모티프-셔플링, 엑손-셔플링, 및/또는 코돈-셔플링(종합하면 "DNA 셔플링"으로 불리움)을 통하여 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 활성을 변경시키기 위하여, 예를 들어 높은 친화성 및 낮은 해리율을 가진 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 제조하기 위하여 사용될 수 있다(일반적으로, 미국등록특허 제5,605,793호; 제5,811,238호; 제5,830,721호; 제5,834,252호; 및 제5,837,458호, 그리고 Patten 등, (1997) Curr . Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson 등, (1999) J. Mol . Biol. 287:265-76; 및 Lorenzo와 Blasco (1998) Biotechniques 24(2):308-13 참조).
상기 제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 고체 지지체에 부착될 수 있고, 이는 면역분석들 또는 표적 항원의 정제에 유용하다. 예시적인 고체 지지체는 유리, 셀룰로오스, 폴리아크릴아마이드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드 또는 폴리프로필렌를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
1. 면역원성( immunogenicity )을 감소하기 위한 변형들
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 상기 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 인간 피험자와 같은 피험자의 면역원성을 감소시키기 위하여 더 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 하나 이상의 아미노산은, 피험자의 면역시스템에 노출될 때 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 면역원성을 제거하거나 감소하도록, 인간 T-세포에 대한 잠재적인 에피토프들을 변경시키기 위한 변형을 할 수 있다. 예시적인 변형에는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 및 삽입을 포함하며, 이는 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 면역원성을 제거하거나 감소시킨다. 일반적으로, 그러한 변형들은 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 각각의 항원에 대한 결합특이성을 변경시키지 않는다. 상기 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 면역원성 감소는 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 하나 이상의 특성들, 예를 들어 상기 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 치료 효능을 향상 및/또는 인 비보에서(in vivo) 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 반감기 향상과 같은 특성들을 향상시킨다.
2. Fc 변형들
본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 야생형 또는 변형 Fc 영역을 포함할 수 있다. 본 발명 명세서의 여러 곳에서 언급된 바와 같이, Fc 영역은, 예를 들어 58c5, sc5, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6, 또는 58c5, sc5, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6로부터 유도된 항원-결합 단편과 같은 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항원-결합 단편에 연결될 수 있다. 몇몇 예에서, 상기 Fc 영역은 상기 Fc 폴리펩티드의 하나 이상의 특성들을 변경하기 위하여 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 Fc 영역은, 야생형 면역글로불린 중쇄의 Fc 부위의 상기 이펙터 기능과 비교하여 (즉, 보다 많은 또는 보다 적은) 이펙터 기능들을 변경하기 위하여 변형될 수 있다. 항체의 Fc 영역들은, 이펙터 기능들로 언급된 중요한 기능적 능력들(functional capabilities)의 배열을 주는(impart), 다수의 Fc 수용체, 및 리간드와 상호작용한다. Fc 이펙터 기능들은, 예를 들면, Fc 수용체 결합, 보체 결합(complement fixation), 및 T 세포 격감 활성(T cell depleting activity)을 포함한다(예를 들어, 미국등록특허 제6,136,310호 참조). T 세포 격감 활성, Fc 이펙터 기능, 및 항체 안정성을 분석하는 방법들은 당 분야에서 알려져 있다. 예를 들면, IgG 분자의 Fc 영역은 FcγR들과 상호작용한다. 이러한 수용체들은 예를 들어, 단핵구(monocyte)들, 대식세포들, 호중구들(neutrophils), 수지상세포들, 호산구들(eosinophils), 비만세포들, 혈소판들, B 세포들, 거대(large) 과립구들, 랑게르한스 세포들(Langerhans’ cells), 자연 살해(NK) 세포들, 및 γδT 세포를 포함한 다양한 면역세포들 내에서 발현된다. 상기 Fc/FcγR 복합체의 형성은 결합된 항원의 부위에 이러한 이펙터 세포들을 리크루트(recruit)하며, 일반적으로 세포들 내에서 신호 이벤트들(signal events) 및 염증 매개물질(mediator)의 방출, B 세포 활성화, 엔도시토시스(endocytosis), 식세포활동(phagocytosis), 세포독성(cytotoxic) 공격과 같은 중요한 순차적인 면역 반응들을 불러일으킨다. 세포독성 및 식세포 이펙터 기능들을 매개하는 능력은 표적 세포들을 파괴하는 항체들에 의한 잠재적인 메커니즘(potential mechanism)이다. FcγR들을 발현하는 세포독성 세포들에 의해 표적 세포에 결합한 항체의 인식 및 용해(lysis)는 항체 의존성 세포-매개 세포독성(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC)로 불린다. 다양한 항체 아이소타입들을 대한 다른 Fc 수용체들은 FcεR 들(IgE), FcαR들(IgA), 및 FcμR들(IgM)을 포함한다.
따라서, 변형된 Fc 도메인은 상기 Fc 수용체에 대하여 증가된 또는 낮은 또는 친화성이 없는을 포함하나, 이에 제한되지 않는 변경된 친화성을 가질 수 있다. 예를 들면, 상기 다른 IgG 서브클래스들은 FcγR들에 대하여 다른 친화성을 가지며, IgG1 및 IgG3가 일반적으로 IgG2 및 IgG4 보다 상기 수용체들에 잘 결합한다. 또한, 다른 FcγR들은 다른 이펙터 기능들을 매개한다. FcγR1, FcγRIIa/c, 및 FcγRIIIa는 면역 복합체 유발 활성화(immune complex triggered activation)의 양성 조절자들이며, 면역수용체 티로신-계 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif; ITAM)을 가지는 세포내 영역을 가짐으로써 특징지어진다. 그러나, FcγRIIb는 면역수용체 티로신-계 억제 모티프(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif; ITIM)을 가지고, 따라서 억제적이다. 그러므로, 수용체에 대한 Fc 부위의 친화성의 변경은 상기 Fc 영역에 의하여 유도되는 상기 이펙터 기능들을 조절할 수 있다.
하나의 예에서, Fc 영역은 예를 들면, 항체-의존성 세포의 세포독성, ADCC와 같은 이펙터 기능들을 보다 잘 매개하기 위하여 특정 FcγR들에 최적화된 결합을 위하여 변형되어 사용된다. 그러한 변형 Fc 영역들은 하나 이상의 아미노산 잔기들에서의 변형을 포함할 수 있으며(Kabat numbering scheme에 따라, Kabat 등, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services), 아미노산 위치들(positions) 249, 252, 259, 262, 268, 271, 273, 277, 280, 281, 285, 287, 296, 300, 317, 323, 343, 345, 346, 349, 351, 352, 353, 및 424를 포함하나, 이제 제한되지 않는다. 예를 들면, Fc 영역에서의 변형은 SEQ ID NO: 356에 기재된 예시적인 IgG1 서열의 하나 이상의 G119S, G119A, S122D, S122E, S122N, S122Q, S122T, K129H, K129Y, D132Y, R138Y, E141Y, T143H, V147I, S150E, H151D, E155Y, E155I, E155H, K157E, G164D, E166L, E166H, S181A, S181D, S187T, S207G, S307I, K209T, K209E, K209D, A210D, A213Y, A213L, A213I, I215D, I215E, I215N, I215Q, E216Y, E216A, K217T, K217F, K217A, 및 P279L, 또는 그의 조합과 대응하도록 만들어질 수 있다. 이러한 돌연변이를 포함하는 변형된 Fc는 예를 들어, 상기 활성 수용체(activating receptor) FcγIIIa와 같은 FcR에 대한 증대된 결합도를 가질 수 있고/있거나 상기 억제 수용체(inhibitory receptor) FcγRIIb에 대한 감소된 결합도를 가질 수 있다(예를 들어 미국특허 제2006/0024298호 참조). FcR들에 대한 증가된 결합을 가지도록 변형된 Fc 영역들은 환자의 바이러스(예를 들어, RSV)에 감염된 세포들의 파괴를 용이하는데 보다 효과적일 수 있다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 상기 항체들 또는 항원-결합 단편들은 상기 인 비보(in vivo) 반감기 및 상기 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 약물동태를 증가시키기 위하여, 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 FcRn 수용체와의 상호작용을 향상시키기 위하여 보다 변형될 수 있다(참조, 예를 들어, 미국등록특허 제7,217,797호, 미국공개특허 제2006/0198840호 및 제2008/0287657호). FcRn은 신생아(neonatal) FcR이고, 이의 결합은 엔도솜들(endosomes)으로부터 혈류(bloodstream)로 엔도시토시스된(endocytosed) 항체 또는 그것의 항원-결합 단편 리사이클(recycle)된다. 전장 분자의 큰 크기 때문에 신장 여과의 배제(preclusion)와 커플링된, 이러한 과정은 1 내지 3 주의 바람직한 항체 혈청 반감기를 갖게 한다. Fc의 FcRn에 대한 결합은 또한 항체 수송(transport)의 역할을 한다.
Fc 영역의 예시적인 변형들에는, CH2 도메인에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이(Kabat numbering, Kabat 등, (1991)) 251-256, 285-90, 308-314 및/또는 상기 Fc 중쇄 불변영역의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기 385-389, 및 428-436에서의 돌연변이와 같은, 미국등록특허 제7,217,797호; 미국공개특허 제2006/0198840호, 제2006/0024298호 및 제2008/0287657호, 그리고 국제공개특허 WO 2005/063816에 설명 상기 Fc의 돌연변이를 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 여기서 변형은 변형되지 않은 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 비교하여 Fc 수용체 결합 친화성 및 혈청 반감기가 변경된다.
몇몇 예에서, 상기 IgG 불변 도메인은 IgG 중쇄 불변영역의 CH2 도메인의 250, 251, 252, 254, 255, 256, 263, 308, 309, 311, 312 및 314의 아미노산 위치 및/또는 상기 CH3 영역의 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434, 436, 및 459의 아미노산 위치에서의 Fc 부위에서 변형된다. 그러한 변형은 SEQ ID NO: 356에 기재된 예시적인 IgG1 서열에서 CH2에서 Gly120, Pro121, Ser122, Phe124, Leu125, Phe126, Thr133, Pro174, Arg175, Glu177, Gln178, 및 Asn180 아미노산들 및 CH3에서 Gln245, Val246, Ser247, Thr249, Ser283, Gly285, Ser286, Phe288, 및 Met311 아미노산들에 대응한다. 몇몇 예에서, 상기 변형은 하나 이상의 표면-노출 잔기들에서 일어나고, 상기 변형은 치환되는 잔기와 유사한 전하, 극성, 소수성을 가지는 잔기와 치환이다.
특정 예에서, Fc 중쇄 불변영역는 하나 이상의 아미노산 위치 251, 252, 254, 255, 및 256 (Kabat numbering)에서 변형되며, 위치 251은 Leu 또는 Arg으로 치환되고, 위치 252는 Tyr, Phe, Ser, Trp 또는 Thr으로 치환되며, 위치 254는 Thr 또는 Ser으로 치환되고, 위치 255는 Leu, Gly, Ile 또는 Arg으로 치환되고/치환되거나 위치 256은 Ser, Arg, Gln, Glu, Asp, Ala, Asp 또는 Thr으로 치환된다. 몇몇 예에서, Fc 중쇄 불변영역는 하나 이상의 아미노산 위치 308, 309, 311, 312, 및 314 에서 변형되며, 위치 308은 Thr 또는 Ile로 치환되고, 위치 309는 Pro로 치환되고, 위치 311은 세린 또는 Glu로 치환되고, 위치 312는 Asp로 치환되고/치환되거나, 위치 314는 Leu로 치환된다. 몇몇 예에서, Fc 중쇄 불변영역은 하나 이상의 아미노산 위치 428, 433, 434, 및 436에서 변형되며, 위치 428은 Met, Thr, Leu, Phe, 또는 Ser으로 치환되고, 위치 433은 Lys, Arg, Ser, Ile, Pro, Gln, 또는 His로 치환되고, 위치 434는 Phe, Tyr, 또는 His로 치환되고/치환되거나, 위치 436는 His, Asn, Asp, Thr, Lys, Met, 또는 Thr로 치환된다. 몇몇 예에서, Fc 중쇄 불변영역은 하나 이상의 아미노산 위치 263 및 459에서 변형되며, 위치 263은 Gln 또는 Glu로 치환되고/치환되거나, 위치 459는 Leu 또는 Phe으로 치환된다.
몇몇 예에서, Fc 중쇄 불변영역은 보체 단백질 C1q에 대한 결합을 증대시키기 위하여 변형될 수 있다. FcR들과의 상호작용에 더하여, Fc는 또한 보체 의존성 세포독성(CDC)을 매개하기 위한 보체 단백질 C1q와 상호작용한다. C1q는 C1 복합체 형성을 위해 세린 프로테아제 C1r 및 C1s와 복합체를 형성한다. C1q는, 2개의 IgG에 대한 결합이 보체 케스케이드(cascade)를 활성화시키는데 충분함에도 불구하고, 6개의 항체와 결합할 수 있다. FcR과의 Fc 상호작용과 유사하게, 다른 IgG 서브클래스들은 C1q와 다른 친화성을 가지며, IgG1 및 IgG3가 일반적으로 IgG2 및 IgG4보다 상당히 더 잘 결합을 한다. 따라서, C1q에 대한 증가된 결합을 가지는 변형된 Fc는 증대된 CDC를 매개할 수 있고, 바이러스(예를 들어, RSV)에 감염된 세포들의 파괴를 증대시킬 수 있다. C1q에 대한 결합을 증가시키는 Fc 영역에서의 예시적인 변형은 위치 345 및 353 (Kabat numbering)에서의 아미노산 변형을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 변형들은 SEQ ID NO: 356에 기재된 예시적인 IgG1 서열에서 K209W, K209Y, 및 E216S에 대응하는 것을 포함한다.
다른 실시예에서, FcγR들과의 결합을 감소하거나 제거하기 위한 치환들을 갖는 다양한 Fc 돌연변이가 또한 알려진다. 그러한 돌연변이 단백질들(muteins)은 Fc에 의해 매개되는 이펙터 기능을 감소하거나 제거하기 위해 필요한 예에서 유용하다. 이러한 예는, 길항작용이나 표적 항원을 가지고 있는 세포들을 죽이지 않는 것이 바람직한 경우에 종종 해당합니다. 그러한 Fc의 예는 미국등록특허 제5,457,035호에 설명된 Fc 돌연변이 단백질이고, 이는 아미노산 위치 248, 249 및 251(Kabat numbering)에서 변형된 것이다. SEQ ID NO: 356에 기재된 IgG1 서열에서, 아미노산 117은 Leu에서 Ala로 변형되고, 아미노산 118은 Leu에서 Glu로 변형되며, 아미노산 120은 Gly에서 Ala로 변형된다. 유사한 돌연변이들은 예를 들어, 예시적인 Fc 서열과 같은 어떠한 Fc 서열에서 만들어질 수 있다. 이러한 돌연변이는 Fc 수용체들에 대한 감소된 친화성을 나타낸다.
본 발명에서 제공되는 상기 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 변형된 Fc 영역들을 포함하도록 조작될 수 있다. 예를 들면, 항체들의 상기 불변영역들에 대한 폴리펩타이들의 융합 또는 접합(즉, Fc 융합 단백질의 생성) 방법들은 당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국등록특허 제5,336,603호, 제5,622,929호, 제5,359,046호, 제5,349,053호, 제5,447,851호, 제5,723,125호, 제5,783,181호, 제5,908,626호, 제5,844,095호, 및 제5,112,946호; EP 제307,434호; EP 제367,166호; EP 제394,827호; PCT 공개특허 WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631, 및 WO 99/04813; Ashkenazi 등, (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:10535-10539; Traunecker 등, (1988) Nature 331:84-86; Zheng 등, (1995) J. Immunol. 154:5590-5600; 및 Vil 등, (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:11337-11341 (1992)에 설명되어 있고, 본 발명 명세서의 여러 곳에서 기재되어 있다. 몇몇 예에서, FcRn 결합 친화성의 증가 및/또는 반감기의 향상시키는 하나 이상의 변형을 가지는 변형된 Fc 영역은 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 융합될 수 있다.
3. 페길화( Pegylation )
본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 반감기의 증가 및/또는 약물동태학적 프로파일을 향상시키기 위하여 고분자량 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 폴리머 분자들과 접합될 수 있다. 접합(conjugation)은 당 분야에서 당업자에게 알려진 기술들에 의하여 수행될 수 있다. 치료 항체들의 PEG와의 접합은 기능 저하 없이 약물동태를 증대시키기 위한 것으로 알려져 왔다(예를 들어, Deckert 등, Int . J. Cancer 87: 382-390, 2000; Knight 등, Platelets 15: 409-418, 2004; Leong 등, Cytokine 16: 106-119, 2001; 및 Yang 등, Protein Eng. 16: 761-770, 2003 참조). PEG는, 상기 항체들 또는 항원-결합 단편들의 N- 또는 C-말단에 대한 PEG의 위치-특이적 접합 또는 리신 잔기들에 존재하는 입실론(epsilon)-아미노기들을 통하여, 다중기능성 링커와 함께 또는 다중기능성 링커 없이 상기 항체들 또는 항원-결합 단편들에 부착될 수 있다. 생물학적 활성의 최소한의 손실을 가져오는 선형(linear) 또는 가지가 있는(branched) 폴리머 유도체가 사용될 수 있다. 접합의 정도(degree)는 상기 항체에 대한 PEG 분자들의 적절한 접합을 보장하기 위하여 SDS-PAGE 및 질량분석에 의하여 모니터될 수 있다. 미반응 PEG는 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온-교환 크로마토그래피에 의하여 항체-PEG 컨주게이트들(conjugates)로부터 분리될 수 있다. PEG-유도 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 예를 들어, 본 발명 명세서에 기재된 면역분석과 같은 당 분야에서 당업자에게 알려진 방법들에 의하여, 인 비보(in vivo) 효능 뿐만 아니라 RSV 항원에 대한 결합 활성에 대하여 테스트될 수 있다.
4. 검출가능한 모이어티의 접합
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 및 항체 단편들은 검출가능한 모이어티와의 접합에 의해 더 변형될 수 있다. 상기 검출가능한 모이어티들은 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 선택된 검출가능한 모이어티에 따라, 상기 검출가능한 모이어티는 인 비보(in vivo) 및/또는 인 비트로(in vitro)에서 검출될 수 있다. 검출가능한 모이어티들은, 예를 들어, RSV에 대한 노출 또는 RSV의 국소화(localization) 검출을 위한 진단 방법들 또는 RSV에 대한 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합 친화성을 결정하는 결합분석에 사용될 수 있다. 상기 검출가능한 모이어티들은 또한 예를 들어, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 정제와 같은, 상기 항-RSV 항체들의 제조방법에 사용될 수 있다. 일반적으로, 검출가능한 모이어티들의 접합이 표적 에피토프에 대한 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합을 방해하지 않도록, 검출가능한 모이어티들이 선택된다. 일반적으로, 상기 검출가능한 모이어티의 선택은 요구되는 민감성, 화합물과의 접합의 용이성, 안정성 요구들, 사용가능한 기구(instrumentation), 및 처리 규정들(disposal provisions)에 따라 결정된다. 당 분야의 당업자는 표지들에 익숙하며, 사용되는 분석법에 적합하고 양립가능한 검출가능한 표지를 동정할 수 있다. 검출가능한 모이어티들로 항체를 표지하는 방법은 당 분야에서 알려져 있으며, 예를 들어, 재조합 및 화학적 방법을 포함한다.
상기 검출가능한 모이어티는 검출가능한 물리적 또는 화학적 특성이 있는 어떠한 물질일 수 있다. 그러한 검출가능한 표지는 면역분석들의 분야에서 잘 개발되어 왔으며, 일반적으로 그러한 방법들에서 유용한 대부분의 어떠한 표지들은 제공되는 방법들에 적용될 수 있다. 따라서, 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의하여 검출가능한 어떤 조성물(composition)이다. 유용한 표지는 형광 염료들(예를 들어, 플루오레신 이소시아네이트, 텍사스 레드, 로다민(rhodamine), 및 유사 염료), 방사성표지(radiolabels)(예를 들어, 3H, 125I, 35S, 14C, 또는 32P), 특히, 감마 및 양전자(positron) 방출 방사성 동위원소들(예를 들어, 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, 및 56Fe), 금속이온(예를 들어, 111In, 97Ru, 67Ga, 68Ga, 72As, 89Zr, 및 201Tl), 효소(예를 들어, 서양고추냉이 퍼록시다제, 알칼라인 포스포타제(alkaline phosphatase) 및 ELISA에 보통 사용되는 다른 것들), 전자 전달 시약(예를 들면, 금속 결합 단백질들 및 화합물들 포함), 발광성(luminescent) 및 화학발광성 표지들(예를 들면, 루시페린 및 2,3-디하이드로프탈라진디온들, 예를 들어, 루미놀), 자성 비드(예를 들면, DYNABEADS™), 및 콜로이드성 금 또는 유색 유리 또는 플라스틱 비드들(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등)과 같은 비색 표지을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 다양한 표지 및 신호 생성 시스템의 검토를 위하여, 예를 들어 미국등록특허 제4,391,904호 참조한다.
5. 치료 모이어티의 접합
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 및 항원-결합 단편들은 치료 모이어티와의 접합에 의하여 더 변형될 수 있다. 예시적인 치료 모이어티들에는 세포독소(cytotoxin)(예를 들어, 세포분열 억제제 또는 세포파괴제), 치료제 또는 방사성 금속 이온(예를 들어, 알파-방출자(emitters))를 포함하나, 이에 제한되지 않는다, 예시적인 세포독소 또는 세포독소제들은 파클리칵솔(paclitaxol), 사이토칼락신 B(cytochalasin B), 그라미시딘 D(gramicidin D), 브롬화 에티듐(ethidium bromide), 에머틴(emetine), 마이토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안트라센 디온, 미스라마이신(mithramycin), 악티노마이신 D(actinomycin D), 1-디하이드로테스테스테론(1-dehydrotestosterone), 당질코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로파놀올(propranolol), 및 퓨로마이신(puromycin) 그리고 그의 유사물 또는 동족체와 같은, 세포에 해로운 어떠한 물질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 치료제들은 항대사성물질들(antimetabolites)(예를 들어, 메토트랙세이트(methotrexate), 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈(cytarabine), 5-플루오로우라실 디카바진), 알킬화제들(예를 들어, 메클레로타민(mechlorethamine), 티오에파 클로람부실(thioepa chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 카뮤스틴(carmustine)(BSNU) 및 롬부스틴(lomustine)(CCNU), 사이클로포스파미드, 부술판(busulfan), 디브로모매니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신 C(mitomycin C), 및 시스-디클로로디아민 플라티늄 (II) (DDP) 시스플라틴(cisplatin)), 안트라사이클린들(anthracyclines)(예를 들어, 다우놀비신(daunorubicin)(예전에는 다우노마이신(daunomycin)) 및 독소루비신(doxorubicin)), 항생제들(예를 들어, 닥티노마이신(dactinomycin)(예전에는 악티노마이신(actinomycin)), 블레오마이신(bleomycin), 미스라마이신(mithramycin), 및 안스라마이신(anthramycin) (AMC)), 세포분열 저지제들(예를 들어, 빈크리스틴(vincristine) 및 빈블라스틴(vinblastine)), 및 지도부딘(zidovudine), 아시클로비어(acyclovir), 강시클로비어(gangcyclovir), 비다라빈(vidarabine), 이독수리딘(idoxuridine), 트리풀루리딘(trifluridine), 및 리바비린(ribavirin)과 같은 뉴클레오티드 유사체들; 포스카메트(foscamet), 아마타딘(amantadine), 리만타딘(rimantadine), 사퀴나비어(saquinavir), 인디나비어(indinavir), 리토나비어(ritonavir), 및 알파-인터페론을 포함하나, 이에 제한되지 않는 항바이러스제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 및 항원-결합 단편들은 치료 폴리펩티드인 치료 모이어티에 대한 접합에 의해 더 변형될 수 있다. 예시적인 치료 폴리펩티드는 아브린(abrin), 리신 A(ricin A), 슈도모나스 엑소톡신(pseudomonas exotoxin), 또는 디프로테리아 톡신(diphtheria toxin)과 같은 독소(toxin); 또는 면역증강제, 예를 들면 사이토카인(cytokine), 예를 들면 그러나 이에 제한되지 않는 인터페론(예를 들어, IFN-α, β, γ, ω), 림포카인, 조혈 성장 인자, 예를 들면 예를 들어, 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-7(IL-7), 인터류킨-10(IL-10), 인터류킨-12(IL-12), 인터류킨-14(IL-14), 및 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis Factor; TNF)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
6. 결합 특이성을 향상시키기 위한 변형들
본 발명에서 제공되는 상기 항-RSV 항체들 및 항체 단편들의 결합 특이성은 파지 디스플레이와 같은 기술들에 의해 변경되거나 향상시킬 수 있다. 파지 디스플레이에 대한 방법들은 일반적으로 라이브러리의 항체 종들의 클로닝 및 발현을 위한, 사상파지(파지미드) 표면 발현 벡터 시스템의 사용을 포함한다. 조합(combinatorial) 라이브러리 생산을 위한 다양한 파지미드 클로닝 시스템은 다른 자들에 의하여 설명되어 왔다. 본 발명에서 참조문헌으로 기재된, Kang 등, (1991) Proc. Natl . Acad . Sci ., USA, 88:4363-4366; Barbas 등, (1991) Proc . Natl . Acad. Sci ., USA, 88:7978-7982; Zebedee 등, (1992) Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 89:3175-3179; Kang 등, (1991) Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 88:11120-11123; Barbas 등, (1992) Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 89:4457-4461; 및 Gram 등, (1992) Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 89:3576-3580에서 설명된 파지미드의 조합 항체 라이브러리들의 제조를 참조한다.
특정 예에서, VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA 서열들은 동물 cDNA 라이브러리(예를 들어, 림프 조직의 인간 또는 뮤린의 cDNA 라이브러리)으로부터 증폭된다. VH 및 VL 도메인을 코딩하는 상기 DNA는, PCR에 의하여 scFv 링커와 함께 재조합되고, 파지미드 벡터(예를 들어, p CANTAB 6 또는 pComb 3 HSS) 내로 클로닝된다. 상기 벡터는 E. coli에서 전기 천공되고 상기 E. coli는 헬퍼 파지로 감염된다. 이러한 방법에 사용되는 파지는 일반적으로 fd 및 M13을 포함하는 사상 파지이며, 상기 VH 및 VL 도메인은 보통 상기 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII에 재조합으로 융합된다. RSV 항원, 예를 들어, RSV F 단백질에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현하는 파지는 예를 들어, 표지된 항원 또는 고체 표면이나 비드에 결합되거나(bound) 포획된(captured) 항원을 사용하여, 항원에 따라 선택되고, 동정될 수 있다. 파지 디스플레이에 의해 상기 항체들을 만드는데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예에는, 예를 들어, 각각이 본 발명 명세서의 참조문헌으로 기재된, Brinkman 등, (1995) J. Immunol . Methods 182:41-50; Ames 등, (1995) J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough 등, (1994) Eur . J. Immunol . 24:952-958; Persic 등, (1997) Gene 187:9-18; Burton 등, (1994) Advances in Immunology 57:191-280; PCT 공개공보 WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401, 및 WO97/13844; 그리고 미국등록특허 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호, 제5,733,743호 및 제5,969,108호에 설명된 방법들을 포함한다.
상기 참조문헌들에 설명된 바와 같이, 파지 선택 후에, 상기 파지로부터 상기 항체 코딩 영역들은 분리될 수 있고, 인간 항체들을 포함한 전체 항체들 또는 어떤 다른 원하는 항원-결합 단편을 생성하기 위하여 사용될 수 있으며, 본 발명 명세서에 설명된 것과 같은 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 박테리아를 포함한 어떠한 원하는 숙주 세포에서 발현될 수 있다. Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편들을 재조합적으로 생산하는 기술들은 PCT 공개공보 WO 92/22324; Mullinax 등, (1992) BioTechniques 12(6):864-869; Sawai 등, (1995) AJRI 34:26-34; 및 Better 등, (1988) Science 240: 1041-1043에 설명된 방법과 같은, 당 분야에서 알려진 방법들을 사용하여 또한 사용될 수 있다.
상기 결과로 만들어진 파지미드 라이브러리는, 표적 세포에 증가된 결합과 같은 향상된 특성을 가진 추가 항체들을 생산하고 그 다음에 동정하기 위하여, 상기 항체들 또는 항원-결합 단편들의 면역특이성을 증가 및/또는 변경시키도록 조작될 수 있다. 예를 들면, DNA를 코딩하는 상기 중쇄 및 경쇄 각각 또는 모두는, 상기 면역글로불린 폴리펩티드의 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR)에서 돌연변이를 일으킬 수 있으며, 그 다음에 바람직한 면역반응 및 중화 능력을 위하여 스크리닝될 수 있다. 상기 결과로 만들어진 항체들은 중화 능력을 결정하기 위하여 본 발명 명세서에 기재된 하나 이상의 분석법으로 스크리닝될 수 있다.
인간에 있어서 인 비보(in vivo) 항체의 사용 및 인 비트로(in vitro) 검출 분석을 포함한 일부 사용을 위하여, 인간 또는 키메라 항체들이 사용된다. 완전하게 인간 항체들은 인간 피험자의 치료용으로 특히 바람직하다. 인간 항체들은, 인간 면역글로불린 서열들 또는 인간 면역글로불린 서열들과 상동(homologous) 합성 서열들로부터 유도된 항체 라이브러리들을 사용하는 상기 설명된 파지 디스플레이 방법들을 포함하는, 당 분야에서 알려진 다양한 방법들에 의하여 만들어질 수 있다. 각각이 본 발명 명세서의 참조문헌으로 기재된, 미국등록특허 제4,444,887호 및 제4,716,111호; 그리고PCT 공개공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741을 참조한다.
E. 항- RSV 항체들의 분리 방법
항-RSV 항체들 또는 항원-결합 단편들은, 뮤린 하이브리도마(예를 들어, Olsson 및 Kaplan (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77:5429-5431 참조; 그러한 항체들은 본 문헌의 여러 곳에서 기재된 바와 같이 인간에 사용을 위하여 인간화될 수 있음), 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 형질전환 마우스들(예를 들어, Kellerman 및 Green (2000) Curr . Opin Biotechnol. 13:593-597 참조), 파지 디스플레이(예를 들어, Mancini (2004) New Microbiol. 27:315-28 참조), 및 B 세포와 같은 성숙(mature) 인간 면역 세포로부터의 분리(예를 들어, Banchereau 및 Rousset (1992) Adv Immunol. 52: 125-262, Crotty 및 Ahmed (2004) Semin Immunol. 16: 197-203, Carsetti (2004) Methods Mol Biol. 271: 25-35., McHeyzer-Williams 및 McHeyzer-Williams (2005) Annu Rev Immunol . 23:487-513 참조)를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당 분야에서 널리 알려진 다양한 기술들에 의하여 동정되고 분리될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 예시적인 방법에서, 본 발명에서 제공되는 상기 인간 항-RSV 항체들 및 그의 항원-결합 단편들은 인식되고 인간 B 세포들로부터 분리될 수 있다.
인간 항체 분비세포로부터 안정적인 하이브리도마를 얻기 어렵기 때문에, 인간 항체-분비세포를 생산하고 분리하는데 광범위하게 사용되어온 예시적인 방법은 엡스타인바 바이러스(Epstein Barr Virus; EBV)로 인간 B 세포를 불멸화하는 것이며, 상기 EBV는 다클론성 B 세포 활성 및 증식을 유도하는데 또한 알려져 있다(예를 들어, Sugimoto 등, (2004) Cancer Res. 64:3361-3364.; Bishop 및 Busch (2002) Microbes Infect. 4:853-857 참조). 항체-분비 세포들은, 예를 들어, 환자 또는 상기 항원에 노출될 수 있는 개인 또는 표지된 항원을 사용하여 미리-선택된 건강한 피험자로부터의 말초 혈액, 림프 노드들, 비장, 편도선, 또는 늑막액과 같은, 인간 B 세포 EBV 불멸화에 의하여 생산되어 왔다(예를 들어, Casali 등, (1986) Science 234:476-9, Yamaguchi 등, (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:2416-2420, Posner 등, (1991) J Immunol. 146:4325-4332, Raff 등, (1988) J Exp Med. 168:905-917, Steenbakkers 등, (1993) Hum Antibod Hybrid . 4:166-173, Steenbakkers 등, (1994) Mol Biol Rep. 19:125-134, Evans 등, (1988) J Immunol 140:941-943, 및 Wallis R 등, (1989) J Clin Invest 84:214-219 참조).
낮은 형질전화능력(transformability), 낮은 클론능력(clonability), 및 EBV-감염 인간 B 세포의 고유 불안정성과 이종성(heterogeneity) 때문에(Chan 등, (1986) J Immunol 136:106- 112 및 James와 Bell (1987) J Immunol Methods. 100:5-40), 예를 들어, 골수종(myeloma) 세포주와의 세포 융합과 같이 알려진 기술들이 사용될 수 있다(예를 들어, Bron 등, (1984) PNAS 81:3214-3217; Yamaguchi 등, (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:2416-2420; Posner 등, (1991) J Immunol. 146:4325-4332, Niedbala와 Stott (1998) Hybridoma 17:299-304; Li 등, (2006) Proc Natl Aacd Sci USA 103:3557-62 참조). EBV 불멸화를 향상시키는 추가적인 기술들은 예를 들어, 종양형성의(oncogenic) 바이러스에 의한 불멸화, 종양형성 유전자들(oncogenes)에 의한 형질전환, 미니-전기세포융합(mini-electrofusion), 및 단일공정에서 마우스-인간 헤테로융합(heterofusion)을 포함한다(예를 들어, 미국등록특허 제4,997,764호; Steenbakkers 등, (1993) Hum Antibod Hybrid . 4:166- 173; Dessain 등, (2004) J Immunol Methods. 291:109-22 참조). 인간 단일클론 항체들은, 항원 존재 또는 부재에서 당 분야에서 개시된 세포 배양의 다양한 조작법을 조합함으로써 활성화되고 불멸화되는 B 세포로부터 분리될 수 있다(예를 들어, Borrebaeck C 등, (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 3995-3999, Davenport 등, (1992) FEMS Microbiol Immunol . 4:335-343, Laroche-Traineau 등, (1994) Hum Antib Hybrid . 5:165-177, Morgenthaler 등, (1996) J. Clin Endocrinology. 81:3155-3161, Niedbala와 Kurpisz (1993) Immunol Lett . 35:93-100, Mulder 등, (1993) Hum Immunol. 36:186-192, Hur 등, (2005) Cell Prolif. 38:35-45, Traggiai 등, (2004) Nat Med 10:871-875, Tsuchiyama 등, (1997) Hum Antibodies 8:43-47; 그리고 PCT 공개공보 WO 91109115, WO 041076677, WO 88101642, WO 90102795, WO 96140252, 및 WO 02146233 참조).
성숙 B 세포들로부터 인간 항체들을 분리하는 방법은, 일반적으로 성체 B 세포 집단의 분리 및 특정 항원에 대하여 상기 B 세포에 의해 발현되는 항체를 스크리닝하는 것을 포함한다. 항체-분비 세포들의 다양한 집단들은 특정한 프로파일을 가지는 인간 공여자(예를 들어, 천연의, 백신접종된, 대략 최근에 감염된, 그리고 혈청반응 양성(seropositive)의 개인들)로부터, 및 B 세포가 존재하고 그들의 활성이 발휘되는 다른 조직들(예를 들어, 혈액, 편도선, 비장, 림프 노드)로부터 분리될 수 있다(Viau와 Zouali (2005) Clin Immunol . 114:17-26). 본 발명에서 제공되는 예시적인 방법에서, 본 발명에서 제공되는 항-말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)들의 시료로부터 분리될 수 있으며, 상기 PBMC는 인간 공여자 및/또는 의료 종사자와 같은 RSV에 노출되었거나 노출될 가능성이 높은 건강한 인간 공여자로부터 단리된 B 세포를 포함한다.
생물학적 시료로부터 PBMC들을 분리한 후에, 항체-분비 세포의 특이적 선택은, 세포 표면에서 세포 표면 마커들의 발현 및, 만일 적절하다면, 세포들의 증식활성, 물질대사적 및/또는 형태학적 상태뿐 아니라 다른 단백질을 기초로 하여, 당 분야에서 개시된 다양한 방법들 중 어느 하나를 사용하여, 수행될 수 있다. 특히, 인간 시료들로부터 항체-분비 세포들을 정제하는 다양한 기술들은 양성 또는 음성 선택을 위하여 다른 수단 및 조건들을 사용할 수 있다. 이러한 세포들은 항체들을 발현하고 분비하는 세포들(예를 들어, 인간 B 세포)에 특이적인 세포 표면 마커들을 발현하는 것들을 물리적으로 분리함으로써 더욱 쉽고 효율적으로 선택될 수 있다. 특정 프로토콜들이 알려져 있으며, 문헌에서 찾을 수 있다(예를 들어, Callard와 Kotowicz "Human B-cell responses to cytokines" in Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F. (ed.) Oxford University Press, 2000, 17-31 참조).
B 세포와 같은 특정 면역 세포들의 선택은, 일반적으로 B 세포 특이적 세포 표면 단백질에 결합하고, 고체 지지체(예를 들어, 마이크로비드들 또는 플라스틱플레이트들)에 연결될 수 있거나 형광-활성 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS)를 사용하여 검출될 수 있는 형광색소(fluorochrome)로 표지될 수 있는 항체들을 사용하여 수행된다. 예를 들면, 인간 B 세포들은 CD19, CD27를 결합한 지지체들(마이크로 비드들과 같은), 및/또는 CD22 마이크로비드에 대한 인간 그들의 친화성, 또는 EBV 불멸화 이전에 특정 아이소타입에 특이적인 항체들에 대한 결합 친화성의 결여(lack)에 대한 그들의 친화성을 기초로 선택하였다(예를 들어, Li 등, (1995) Biochem Biophys Res Commun 207:985-993, Bernasconi 등, (2003) Blood 101:4500-4504 및 Traggiai 등, (2004) Nat Med 10:871-875 참조). 정제를 위한 상기 세포 마커의 선택은 예를 들어, 상기 선택 과정(process)에 의하여 촉발되고 세포 성장 및 생존능력을 변경할 수 있는 세포내 신호에 기인하여 상기 불멸화 과정(process)의 효율성에 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, 항원 인지 및 B 세포 활성과 관련한 신호 전달 경로를 조절하는 B-세포 제한 트랜스멤브레인 단백질(B-cell restricted transmembrane protein)인 CD22는 초기 B 세포 선택을 위한 예시적인 분자이다. 상기 CD22 양성 집단이 다른 아이소타입들 및 특이성들을 가지는 항체들을 발현하는 세포들을 포함하기 때문에, 다른 세포 표면 마커들이 또한 자극 단계(stimulation phase) 이전 또는 이후에 세포 선택에 사용될 수 있다.
몇몇 예에서, 항체-분비 세포의 특정 농축(enrichment)은 상기 CD22-기반 선택에 더하여 CD27-기반 선택을 적용함으로써 얻을 수 있다. CD27은 체세포적으로 돌연변이된(somatically mutated) 가변영역 유전자들을 가지는 인간 B 세포에 대한 마커로 알려져 있다(Borst J 등, (2005) Curr Opin Immunol. 17:275-281.). CD5, CD24, CD25, CD86, CD38, CD45, CD70, 또는 CD69와 같은 추가적인 마커들은 또한 세포들의 원하는 집단을 위해 격감(deplete)하거나 농축(enrich)하게 하는데 사용될 수 있다. 따라서, 공여자의 상기 항원(예를 들어, RSV 항원)에 노출된 이력(history) 및 상기 항체 역가와 같은 인자들에 따라, 전체 CD22-농축된(enriched) B 세포들, 또는 CD27 양성 B 세포들과 같은 더 농축된 B 세포 계군(subpopulation)이 선택될 수 있다.
세포 선택에 이어, 그리고 상기 세포들의 불멸화 이전에, 상기 세포들의 집단은 적절한 자극제에 노출될 수 있다. 예시적인 자극제들은, 예를 들어, 다중클론 활성자들(polyclonal activator), 예를 들면 그러나 이에 제한되지 않는 선척적 면역 반응들의 작동자(innate immune responses)(예를 들어, CpG 올리고뉴클레오티드들(Bernasconi 등, (2003) Blood 101:4500-4504, Bernasconi 등, (2002) Science 298:2199-2202, Bourke 등, (2003) Blood 102:956-63; 예를 들어, Cell Sciences, Canton, MA으로부터 얻을 수 있는 CpG2006, CpG2395, 및 CpG2395와 같은 CpG 뉴클레오티드)과 같은 톨-유사 수용체 작동자들(toll-like agonists) 및 면역조절(immunomodulatory) 분자, 예를 들면 사이토카인들(예를 들어, 면역증강 활성들을 가지는 것으로 알려진 인터류킨들, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, 및 IL-13(Callard와 Kotowicz "Human B-cell responses to cytokines" in Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F (ed.) Oxford University Press, 2000, 17-31 참조)) 및 TNF 수용체 패밀리의 세포막 수용체들의 작동자, 특히 NF-κB 경로 및 B 세포에서의 증식을 활성화하는 것들, 예를 들면 그러나 이에 제한되지 않는 APRIL, BAFF, CD 40 리간드(CD40L)(예를 들어, Schneider (2005) Curr Opin Immunol. 17:282-289, He 등, (2004) J Immunol. 172:3268-3279, Craxton 등, (2003) Blood 101:4464-4471, 및 Tangye 등, (2003) J Immunol.170:261-269 참조)를 포함한다. 하나 이상의 다중클론 활성자들(polyclonal activator)과 조합한 또는 순차적으로 조합한 EBV 불멸화를 사용하는 예시적인 B 세포 자극 방법은 당 분야에 알려져 있다(예를 들어, Traggiai 등, (2004) Nat Med 10:871-875, Tsuchiyama 등, (1997) Hum Antibodies 8:43-47, Imadome 등, (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:7836-7840, 그리고 PCT 공개공보 WO 07/068758, WO 04/76677, WO 91/09115, 및 WO 94/24164 참조). 자극제들의 조합은 상기 불멸화 단계 이전에 동시에 또는 순차적으로(예를 들어, 초기 세포 선택 후에 제1 자극제를 즉시 가하고, 수시간 또는 수일 후에 제2 자극제를 첨가함)으로 세포배양배지에 첨가될 수 있다. 상기 자극제들은 희석된 저장용액(stock solution)으로부터 상기 세포배양배지에 직접 첨가될 수 있거나, 예를 들어, 리포솜 또는 흡수(uptake) 및 면역증강(immunostimulatory) 활성을 향상시킬 수 있는 다른 화합물을 사용하여 적절히 제형화된(formulated) 후에 첨가될 수 있다(Gursel 등, (2001) J Immunol . 167:3324-3328). 상기 자극제들은 또한 고체 매트릭스들(마이크로비드 또는 세포 배양 플레이트들에 직접적으로)에 부착될 수 있고, 상기 고체 매트릭스는 상기 시약(들)의 효과적인 제거를 가능하게 할 수 있다. 상기 세포들은 신선한 배양배지로 1회 이상 세척될 수 있고, 선택적으로, 더욱 희석하고 상기 자극제들의 어떠한 잔존 효과(remaining effect)를 제거하기 위하여 정상 세포배양배지에서(예를 들어, 1 내지 6일) 유지될 수 있다. 상기 자극제(들)은 또한 상기 세포배양 내로 특정 화합물들을 첨가함으로써 억제될 수 있다.
상기 세포들은 세포 자극 후에 그리고 상기 선택되고 상기 불멸화 시약으로 자극된 세포들을 노출하기 전에(즉, 파지 자극 단계 및 불멸화 단계 사이에) 상기 발현된 항체의 아이소타입에 기반하여 더욱 선택될 수 있다. 상기 세포들의 아이소타입-기반 선택은 양성(상기 특정 세포들의 분리를 허용) 또는 음성(원하지 않는 세포들의 제거를 허용) 선택을 위한 수단을 적용함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 자극된 IgG 양성 세포들의 집단은 양성적으로(FACS 또는 자성 세포 분리기에 의하여) 또는 상기 세포 집단으로부터 IgM을 발현하는 세포를 격감시키고, 그 결과로서 IgG를 발현하는 세포를 농축화시킴으로써 선택될 수 있다. 형광 활성 또는 자성 세포 분리기들 사용하여 항체-분비 세포들을 분리하는 기술들은 문헌에 알려져 있다(예를 들어, Li 등, (1995) Biochem Biophys Res Commun 207:985-993, Traggiai 등, (2004) Nat Med 10:871-875 참조). 항체-분비 세포들의 근원(source) 및 그것들의 최종 용도에 따라, IgD 또는 IgA 발현 세포들과 같은 다른 아이소타입 발현 세포들의 격감(또는 농축)이 또한 수행될 수 있다. 그러한 정확한 분리가 요구된다면(예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체들을 발현하는 인간 B 세포들의 선택), 유사한 접근이 특정 서브클래스에 기초하여 세포 분리용으로 사용될 수 있다.
다양한 바이러스 불멸화 제제들(immortalization agents)이 당 분야에 알려져 있으며, 불멸화된 항체-분비 세포들(immortalized antibody-secreting cells)을 얻기위해 항체-분비 세포들에 사용될 수 있다. 감염시키고 항체-분비 세포들을 불멸화하는 바이러스들은 일반적으로 림프영양성 바이러스들(lymphotropic viruses)로서 알려져 있다. 이러한 바이러스들의 예시로는 헤르페스바이러스들 (hespesviruses)의 감마 클래스에 포함된 것들이 있다. 이 바이러스 패밀리의 구성원들은 종-특이적 방식(species-specific manner)으로 림프구를 감염시키고, 림프증식장애(lymphoproliferative disorder) 및 악성종양들(malignancies)의 진행과 관련된다(Nicholas (2000) J. Mol Pathol. 53:222-237 및 Rickinson (2001) Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356:595-604). 제공된 방법들에서 불멸화 제제로서 사용되는 예시적인 바이러스들은, EBV, 또한 헤르페스 바이러스 4로 알려짐), 및 HHV-8(인간 헤르페스 바이러스 8, 또한 KSHV, 카포시 육종 관련 헤르페스바이러스(Kaposi's Sarcoma associated Herpesvirus)로 알려짐)을 포함하며, 이는 인간 림프구들을 감염시키고 불멸화할 수 있다. 방법들에서 사용되는 다른 예시적인 바이러스들은, MHV-68(뮤린 헤르페스바이러스 68(murine herpesvirus 68)), HVS(헤르페스바이러스 사미리(herpesvirus Samiri)), RRV(붉은털원숭이 라디노바이러스(Rhesus Rhadinovirus)), LCV (프리메이트 림포크립토바이러스(primate Lymphocryptovirus)), EHV-2(말 헤르페스 바이러스 2(Equine Herpesvirus 2)) HVA(헤르페스바이러스 아텔레스(Herpesvirus Ateles)), 및 AHV-1(알셀라핀 헤르페스 바이러스 1(Alcelaphine Herpesvirus 1)을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 이는 이들 사이에 몇몇 공통된 보존된 유전적 특징들(common genetic features) 및 다른 포유류 숙주세포들에서 유사한 병원성 효과(pathogenic effect)를 갖는 다른 종양형성의(oncogenic), 림프영양성 바이러스들이다.
불멸화에 사용되는 바이러스들로부터의 특이적 바이러스 단백질을 포함하는 재조합 DNA 구성체들(constructs)은 또한 B 세포들의 불멸화에 사용되어 왔다( Damania (2004) Nat Rev Microbiol. 2:656-668 및 Kilger et al. (1998) EMBO J. 17:1700-1709) 참조). 바이러스 유전자들을 포함하는 유사한 벡터들이 제공된 방법으로 세포들에 형질도입(transduce)될 수 있다. 이러한 구성체들을 만드는 방법은 당 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 레트로바이러스 시스템(retroviral system) 또는 바이러스 유사 입자들(virus-like particles)의 사용 및 패키징 세포주들(packaging cell lines)을 포함하며, 패키징 세포주들은 이런 입자들의 형성을 위한 트랜스(trans)에 필요한 모든 인자들을 제공한다.
불멸화 단계(immortalization phase)는 한 시간 내지 몇 시간 사이, 최대 2 내지 4 일간 지속될 수 있다. 불멸화 단계의 길이는 세포 생존율(cell viability), 및 불멸화 효율(efficiency of immortalization)과 같은 다양한 인자들에 의존하여 조정될 수 있다. 몇몇 예에서, 세포들은 EBV로 약 4 내지 24 시간의 기간동안 불멸화된다. 특정 예에서, 세포는 EBV로 약 16시간의 기간동안 불멸화된다.
B 세포들의 EBV-매개(mediated) 불멸화는 주요 EBV 수용체로 생각되는 세포 표면 수용체 CD21의 발현을 요구한다. CD21은 대부분의 B 세포 계군들(subpopulations)에 존재하고, CD19 및 B 세포 항원 수용체와 복합체를 형성함으로써 B 세포 반응들을 조절한다(Fearon and Carroll (2000) Ann Rev Immun. 18:393-422). 세포를 EBV로 형질전환(transform)하는 능력은 B 세포 자극제들(stimulating agents)을 추가함으로써 향상시킬 수 있으나, 높은 효율로 EBV 불멸화가 허용되도록, 세포 표면상에 CD21이 유지되는 것이 보장되는 상태여야 한다.
불멸화 단계 다음에, 불멸화된 세포들은 영양 세포층들(feeder cell layers) 상에서 낮은 밀도로 배양될 수 있다. 영양층은 조사된 비-동종이계 말초혈액 세포 제제(irradiated non-allogeneic peripheral blood cell preparation), 림포블라스토이드(lymphoblastoid) 또는 섬유아세포(fibroblast) 세포주들, 제대혈 림프구들(cord blood lymphocytes), 또는 다른 종류의 배아세포들(embryonic cells)에 의해 구성될 수 있다. 이런 특성들을 갖는 세포주의 예는 B 세포들의 성장 및 증식(proliferation)을 효과적으로 뒷받침하는 EL4-B5, 돌연변이 EL4 흉선종(mutant EL4 thymoma) 세포주들이다. 다른 예시적인 영양 세포들은 본 발명에서 여러 곳에서 설명된 것과 같은 조사된 B 세포 격감된 PMBC 영양세포들(B-cell depleted PMBC feeder cells)를 포함한다. B 세포 집단(population)을 자극하는 데 사용되는 것들과 같은, 성장 프로모터들(Growth promoting agents)은, 또한 불멸화 후에 불멸화된 B 세포 집단을 유지하는데 사용될 수 있다.
세포들의 불멸화된 집단들은 특히 항체 분리(isolation), 동정(characterization) 및 생산과 관련된 일련의 적용들(applications)에 사용될 수 있다. 몇몇 예에서, 세포들에 의해 발현된 항체들 또는 이러한 항체들의 단편들(fragments)을 코딩하는 DNA 라이브러리들(libraries)은, 일반적인 재조합 기술들을 사용하여 세포의 대량의 집단(bulk population)으로부터 단리된 DNA로부터 구성될 수 있다. 본 발명에서 설명된 바와 같은 몇몇 예에서, 불멸화된 세포들은 더 배양되어 항체-분비 세포들의 풀들(pools)로 분리될 수 있다. 세포들의 풀들은, 예를 들어, 영양 세포층들 상에서 배양될 수 있다.
몇몇 예에서, 세포들의 풀들로부터의 세포 배양 상청액들은, 특정 항원 특이성을 갖는 항체들(예를 들어, RSV F 단백질에 면역특이적으로 결합하는 항체들)을 발현하는 세포들의 동정을 위하여, 1 이상의 라운드들(rounds)로 스크리닝된다. 항체들을 스크리닝하고 결합 특이성을 특정하기 위한 예시적인 방법들은 본 발명에서 여러 곳에서 설명되며, 당 분야에 알려져 있다. 특정 항원이 동정될 때, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 부분(portion)을 코딩하는 DNA가 잘 알려진 재조합 방법들을 사용하여 세포들의 풀들로부터 분리될 수 있다. 본 발명에서 설명된 바와 같이, 세포들의 풀들로부터 단리된 DNA는 그리고 나서 발현되고(예를 들어, 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서), 원하는(desired) 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 각각의 클론들의 동정을 위해 재-스크리닝될 수 있다. 항체의 발현 및 정제 방법은 본 분야의 당업자에게 잘 알려져 있고 F 섹션에 기재되어 있다.
본 발명에서 설명된 바와 같은 몇몇 예에서, 불멸화된 세포들은, 표지된 항원을 사용하여, 세포 분류기(예를 들어, FACS)를 사용하여 단리된 단일 세포일 수 있다. 특정 예에서, 항-RSV 항체들을 발현하는 세포들은, 원하는 세포들을 표지하기 위하여, 알렉사 플루오르 647(Alexa Fluor 647)로 표지된 RSV F 항원을 사용하여 분리될 수 있다. 분류 다음에, 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 DNA는 그리고나서, 잘 알려진 재조합 방법들을 사용하여 분리될 수 있다. 세포들의 풀들로부터 단리된 DNA는 RSV 항원에 결합하는지 확인하기 위하여 (예를 들어, 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서) 발현될 수 있다.
일반적으로, 특정 항원에 결합하는 각각의 항체들의 동정에 사용되는 스크리닝 방법은 이러한 항체들의 항원-결합 부분(portion)의 동정을 야기한다. 항원-결합 단편으로부터 전장(full length) 또는 다른 유도체 항체들을 생성하기 위하여, VH 및/또는 VL 사슬 또는 그의 항원 부분들을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 분리될 수 있고, VH 불변 영역(예를 들어, 인간 감마 1 불변 영역), VL 불변 영역(예를 들어, 인간 카파 또는 람다 불변 영역들) 각각을 발현하는 벡터들에 클로닝될 수 있다. VH 및 VL 도메인들은 또한 선택된 불변 영역들을 발현하는 벡터에 클로닝될 수 있다. 중사슬 전환 벡터들 및 경사슬 전환 벡터들은 그리고 나서 당 분야의 당업자들에게 알려진 기술들을 사용하여 세포주들을 공동-형질감염(co-transfect)시켜 전장 항체들, 예를 들어, IgG를 발현하는 안정적인 또는 일시적인(transient) 세포주를 생성한다.
F. 항- RSV 항체들, 및 그의 변형된 또는 변이체 형들 및 항체들을 코딩하는 핵산들을 생산하는 방법
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 화학적 합성 및 재조합 발현 기술들을 포함하는 항체들의 제조를 위한 당 분야에 알려진 어떤 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 숙주 세포들 및 벡터들의 다양한 조합들(combinations)이 핵산들(예를 들어, 제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들)을 수용(receive), 유지, 재생산 및 증폭하고, 핵산들에 의해 코딩된 폴리펩티드들을 발현하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포 및 벡터의 선택은 증폭, 폴리펩티드 발현, 및/또는 파지와 같은 유전적 패키지상의 디스플레이(display)를 원하는지 여부에 의존한다. 숙주 세포들의 형질전환을 위한 방법들은 잘 알려져 있다. 어떤 형질전환(transformation) 방법(예를 들어, 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 감염(infection), 전기천공법(electroporation) 및 소노포레이션(sonoporation))이 숙주세포를 핵산들로 형질전환하는데 사용될 수 있다. 단일클론 항체들 및 Fab 단편들 및 단일사슬 항체들과 같으나, 이에 제한되지 않는 항체 단편들과 같은 항체의 생산을 위한 절차들은 당 분야에서 잘 알려져 있다.
단일클론 항체들은 하이브리도마(hybridoma), 재조합 발현, 파지 디스플레이 기술들 또는 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는 당 분야에 알려진 다양한 기술들을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체들은 당 분야에 알려진 것 및 교시된 것, 예를 들어, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 5630681 (Elsevier N.Y. 1981)을 포함하는 하이브리도마 기술들을 사용하여 생산될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함하는, 본 발명에서 열거된 어떤 세트와 같은 폴리펩티드들은, 인 비보 또는 인 비트로 방법들을 포함하는 당 분야의 당업자에 알려진 어떤 방법에 의해 생산될 수 있다. 원하는 폴리펩티드들은, 예를 들어, 분석, 투여 및 치료에 필요한 것과 같은, 단백질들의 요구량들(required amounts) 및 형들(forms)을 생산하는데 적합한 어떤 생물(organism)에서 발현될 수 있다. 발현 숙주들은 E. coli, 효모균(yeast), 식물들, 곤충 세포들, 인간 세포주들을 포함하는 포유류 세포들 및 혈청(serum), 우유 및 알들에서 생산을 포함하는 형질전환(transgenic) 동물들(예를 들어, 토끼들, 마우스들, 랫트들, 및 염소들, 양 및 소와 같으나, 이에 제한되지 않는 가축)과 같은 원핵 및 진핵 생물들을 포함한다. 발현 숙주들은 발현된 세포 상에 존재하는 번역 후 변형들(post-translational modifications)의 종류들 뿐만 아니라 단백질 생산 수준들이 다를 수 있다. 발현 숙주의 선택은 이것 및 조절 및 안전성(safety) 고려, 생산 비용들 및 필요 및 정제를 위한 방법들과 같은 다른 인자들에 기초로 될 수 있다.
1. 핵산들( Nucleic Acids )
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자들이 본 발명에서 제공된다. 몇몇 예에서, 단리된 핵산 분자는 58c5인 항체를 코딩한다. 몇몇 예에서, 단리된 핵산 분자는 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6의 항원-결합 단편을 코딩한다. 몇몇 예에서, 단리된 핵산 분자는 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 90D3, 56E11, 17C9 또는 69F6의 항체 형태 또는 기타 항원-결합 단편 형태를 암호화한다.
몇몇 예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 396, 398, 400, 402, 404, 452, 454 또는 456에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중사슬(heavy chain)을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩한다. 몇몇 예에서, 제공된 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 443, 445, 447, 449, 451, 477, 479 또는 481에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함한다.
몇몇 예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 395, 397, 399, 401, 403, 453, 455 또는 457에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경사슬(light chain)을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩한다. 몇몇 예에서, 제공된 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 442, 444, 446, 448, 450, 476, 478 또는 480에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 포함한다.
몇몇 예에서, 제공된 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 405, 411, 417, 423, 429, 437-441, 458, 464, 470 또는 482-484에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1을 포함하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 코딩한다. 몇몇 예에서, 제공된 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 406, 412, 418, 424, 430, 459, 465 또는 471에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2를 포함하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 코딩한다. 몇몇 예에서, 제공된 단리된 핵산은 SEQ ID NO:407, 413, 419, 425, 431, 460, 466 또는 472에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 코딩한다.
몇몇 예에서, 제공된 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: : 408, 414, 420, 426, 432, 461, 467 또는 473에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1을 포함하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 코딩한다. 몇몇 예에서, 제공된 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 409, 415, 421, 427, 433, 462, 468 또는 474에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2을 포함하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 코딩한다. 몇몇 예에서, 제공된 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 410, 416, 422, 428, 434, 463, 469 또는 475에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 코딩한다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 코딩하는 핵산 분자들은 핵산 분자들의 조작(manipulation)을 위한 잘 알려진 재조합 기술들을 사용하여 준비될 수 있다(예를 들어, Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 및 Ausubel et al., eds. (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY에 설명된 기술들 참조). 몇몇 예에서, 재조합 DNA 기술들, 특정 부위 돌연변이 유발(site directed mutagenesis), 및 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)(PCR)과 같으나, 이에 제한되지 않는 방법들이, 예를 들어, 아미노산 치환들(substitutions), 결실들(deletions), 및/또는 삽입들(insertions)을 생성하는, 다른 아미노산 서열을 갖는 변형된 항체들 또는 그의 항원-결합 단편을 생성하는데 사용될 수 있다.
몇몇 예에서, 일상적인 재조합 DNA 기술들을 사용하여 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 하나 이상의 CDR들이 프래임워크 영역(framework region) 내로 삽입된다. 프래임워크 영역들은, 인간 프래임워크 영역들(예를 들어, 예시적인 프래임워크 영역들을 위한 Chothia et al. (1998) J. Mol . Biol. 278: 457-479 참조)을 포함하는, 자연적으로 발생한 또는 컨센서스(consensus) 프래임 워크 영역들로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, 프래임워크 영역들 및 CDR들의 조합에 의해 생성된 폴리펩티드는 부모(parent) 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 항원-결합 특이성을 유지하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩한다. 폴리펩티드의 변경들(alterations)은 당 분야의 기술 범위 내에서 코딩된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 하나 이상의 특성들을 향상시키기 위해 이루어질 수 있다. 몇몇 예에서, 폴리펩티드의 하나 이상의 변형 들(modifications)은 프래임워크 영역들 내에서 아미노산 치환들이 생산되도록 만들어질 수 있고, 이것은, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 이것의 항원과의 결합을 향상시킨다. 또한, 이러한 방법들은, 하나 이상의 사슬 내(intrachain) 이황화(disulfide) 결합들이 결여된 항체 분자들을 생성하도록, 사슬 내 이황화 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 영역의 시스테인 잔기들의 아미노산 치환들 또는 결실들을 만드는데 사용될 수 있다.
2. 벡터
본 발명은 항-RSV 항체들 또는 그들의 항원-결합 단편들을 코딩하는 (중사슬 및 경사슬을 코딩하는) 핵산 또는 핵산들을 포함하는 벡터들을 제공한다. 일반적으로, 항체의 중사슬을 코딩하는 핵산이 벡터에 클론되고 항체의 경사슬을 코딩하는 핵산이 그 벡터에 클론된다. 유전자들은 그들의 이중 발현을 위해 단일 벡터에 또는 별개의 벡터들에 클론된다. 필요에 따라, 벡터들은 또한 다른 항체 형태들을 생성하기 위해 추가의 불변영역(들) 또는 힌지 영역들을 코딩하는 추가의 서열을 함유할 수 있다.
많은 발현 벡터들이 사용 가능하고, 당 분야에 당업자에게 알려져 있으며, 폴리펩티드들의 발현에 사용될 수 있다. 발현 벡터의 선택은 숙주 발현 시스템의 선택에 의해 영향받을 것이다. 이러한 선택은 당업자의 기술 수준 범위 내에 있다. 일반적으로, 발현 벡터들은 전사 프로모터 및 임의적으로 인핸서, 번역 신호, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함할 수 있다. 안정한 형질전환에 사용되는 발현 벡터들은 일반적으로 형질전환된 세포들의 선택 및 유지를 가능하게 하는 선별 마커을 가진다. 몇 가지 경우에서, 복제 기점(origin of replication)은 세포에서 벡터의 복제수(copy number)를 증폭하는데 사용될 수 있다.
벡터들은 또한 연결된(ligated) 핵산 분자, 예를 들어, 국소화(localization)를 위한 것과 같은 에피토프 태그(epitope tag), 예를 들어, 헥사-히스(hexa-his) 태그 또는 myc 태그, 또는 정제를 위한 태그, 예를 들어, GST 융합, 및 단백질 분비 및/또는 막 연관성(membrane association)을 지시하기 위한 서열과 작동가능하게 연결된 추가적인 핵산 서열들을 포함할 수 있다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편의 발현은 당 분야에 알려진 어떤 프로모터/인핸서에 의해 조절될 수 있다. 적절한 박테리아 프로모터들은 당 분야에 잘 알려져 있으며, 하기에서 설명된다. 포유류 세포들, 효모균 세포들 및 곤충 세포들을 위한 다른 적절한 프로모터들은 당 분야에 잘 알려져 있으며, 몇 가지는 하기에서 예시된다. 이종의(heterologous) 핵산의 발현을 지시하는데 사용되는 프로모터의 선택은 특정 적용(particular application)에 의존하며, 당업자의 기술 범위 내이다. 사용될 수 있는 프로모터들은 SV40 초기(early) 프로모터(Bernoist and Chambon, (1981) Nature 290:304-310), Rous sarcoma virus(라우스 육종 바이러스)의 3' 긴 터미날 반복(long terminal repeat)에 포함된 프로모터(Yamamoto et al . (1980) Cell 22:787-797), 헤르페스 티미딘 키나제(thymidine kinase) 프로모터(Wagner et al ., (1981) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:1441-1445), 메탈로티오네인(metallothionein) 유전자의 조절 서열들(regulatory sequences)(Brinster et al., (1982) Nature 296:39-42)를 포함하는 진핵 발현 벡터들; β-락타마제(β-lactamase) 프로모터(Jay et al ., (1981) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:5543) 또는 tac 프로모터(DeBoer et al ., (1983) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 80:21-25)와 같은 원핵 발현 벡터들; "Useful Proteins from 재조합 Bacteria" in Scientific American 242:79-94 (1980)) 또한 참조; 노팔린 합성효소(nopaline syntase) 프로모터(Herrera-Estrella et al ., (1984) Nature 303:209-213) 또는 꽃양배추 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 35S RNA 프로모터(Gardner et al ., (1981) Nucleic Acids Res . 9:2871), 및 광합성 효소 리보스 비스포스페이트 카르복실라제(photosynthetic enzyme ribose bisphosphate carboxylase) 프로모터(Herrera-Estrella et al ., (1984) Nature 310:115-120)를 포함하는 식물 발현 벡터들; Gal4 프로모터, 알콜 디하이드로게나제(alcohol dehydrogenase) 프로모터, 포스포글리세롤(phosphoglycerol) 키나제 프로모터, 알칼라인 포스파다제(alkaline phosphatase) 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내며, 형질전환 동물들에 사용되는 다음의 동물 전사 조절 영역들(following animal transcriptional control regions): 췌장 선포 세포들(pancreatic acinar cells)에서 활성인 엘라스타제(elastase) I 유전자 조절 영역(Swift et al ., (1984) Cell 38:639-646; Ornitz et al ., (1986) Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol . 50:399-409; MacDonald, (1987) Hepatology 7:425-515)와 같은 효모균 및 다른 진균(fungi)으로부터의 프로모터 구성요소들; 췌장 베타 세포들에 활성인 인슐린 유전자 조절 영역(Hanahan et al., (1985) Nature 315:115-122), 림프구양세포들(lymphoid cells)에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역(Grosschedl et al ., (1984) Cell 38:647-658; Adams et al ., (1985) Nature 318:533-538; Alexander et al ., (1987) Mol . Cell Biol . 7:1436-1444), 고환 세포들(testicular cells), 유방세포들(breast cells), 림프구양세포들 및 비만 세포들(mast cells)에서 활성인 마우스 유방암 바이러스(mammary tumor virus) 조절 영역(Leder et al ., (1986) Cell 45:485-495), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역(Pinckert et al ., (1987) Genes and Devel . 1:268-276), 간에서 활성인 알파-태아단백질(fetoprotein) 유전자 조절 영역(Krumlauf et al ., (1985) Mol . Cell . Biol . 5:1639-403); Hammer et al ., (1987) Science 235:53-58), 간에서 활성인 알파-1 항트립신(antitrypsin) 유전자 조절 영역(Kelsey et al., (1987) Genes and Devel . 1:161-171), 골수 세포들(myeloid cells)에서 활성인 베타 글로빈(globin) 유전자 조절 영역(Magram et al ., (1985) Nature 315:338-340); Kollias et al ., (1986) Cell 46:89-94), 뇌의 희소돌기아교세포들(oligodendrocyte cells)에서 활성인 마이엘린 염기성 단백질(myelin basic protein) 유전자 조절 영역(Readhead et al ., (1987) Cell 48:703-712), 골격근(skeletal muscle)에서 활성인 미오신 경사슬 2(myosin light chain 2) 유전자 조절 영역(Shani (1985) Nature 314:283-286), 및 시상하부(hypothalamus)의 생식샘자극세포(gonadotroph)에서 활성인 생식선자극-방출 호르몬(gonadotrophic releasing hormone) 유전자 조절영역(Mason et al ., (1986) Science 234:1372-1378)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
프로모터 이외에, 발현 벡터는 일반적으로 전사 단위(transcription unit) 또는 숙주 세포들을 내에서 항체, 또는 이의 부분의 발현에 필요한 모든 추가적인 구성요소들을 포함하는 발현 카세트(expression casette)를 포함한다. 전형적인 발현 카세트는 항체 사슬 및, 효율적인 전사의 폴리아데닐화(polyadenylation), 리보솜 결합 부위들(ribosome binding sites) 및 번역 종결에 필요한 신호들을 코딩하는 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.
카세트의 추가적인 구성요소들은 인핸서들을 포함할 수 있다. 또한, 카세트는 일반적으로 효율적인 종결을 제공하기 위한 구조 유전자(structural gene)의 하류(downstream)의 전사 종결 영역을 포함한다. 종결 영역은 프로모터 서열와 동일한 유전자로부터 얻을 수 있거나 다른 유전자들로부터 얻을 수 있다.
몇 가지 발현 시스템들은 티미딘 키나제(thymidine kinase) 및 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase)와 같은 유전자 증폭을 제공하는 마커들을 가진다. 다른 실시예로, 폴리헤드론 프로모터(polyhedron promoter) 또는 다른 강력한 베큘로바이러스 프로모터의 아래 방향에 배아항체 사슬을 코딩하는 핵산을 가지는 곤충 세포들에서의 베큘로바이러스(baculovirus) 벡터를 사용하는 것과 같은, 유전자 증폭을 포함하지 않는 높은 수율의 발현 시스템들이 또한 적합할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 항-RSV 항체의 중사슬 및/또는 경사슬 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 함유하는 벡터가 제공된다. 몇몇 예에서, 본 발명의 벡터는 항체의 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 기능적으로 연결된 항체의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 벡터는 CH1, CH2, 힌지, CH3 또는 CH4 및/또는 CL 중 하나 또는 모두에 대한 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, Fabs의 발현에 대해, 벡터는 CH1 또는 CL (카파 또는 람다 경사슬)에 대한 서열을 함유한다. 불변영역 또는 힌지 영역의 서열은 본 분야의 당업자에게 알려져 있고 (예를 들면, U.S. Published Application No. 20080248028 참조) 본 발명에 기재되어 있다.
DNA 단편들을 벡터에 삽입하기 위한 당 분야의 당업자에 알려진 어떤 방법들이 본 발명에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터들을 구성하는데 사용될 수 있다. 이 방법들은 인 비트로 재조합 DNA 및 합성 기술들 및 인 비보 재조합(유전적 재조합)을 포함할 수 있다. 클로닝 벡터에 삽입은, 예를 들어, 상보적 점착성 말단(complementary cohesive termini)을 가지는 클로닝 벡터에 DNA 단편을 연결함으로써(ligating) 달성될 수 있다. 만일 DNA 단편화에 사용된 상보적 제한 부위들(complementary restriction sites)이 클로닝 벡터들에 존재하지 않는다면, DNA 분자들의 말단들은 효소적으로 변형될 수 있다. 다른 실시예로, 원하는 어떤 부위는 핵산 서열들(링커들(linkers))을 DNA 말단에 연결함으로써(ligating) 생산될 수 있다; 이러한 연결된 링커들은 제한 엔도뉴클라아제 인식 서열들(restriction endonuclease recognition sequenses)을 코딩하는 특이적인 화학적으로 합성된 핵산들을 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항체들 또는 항원-결합 단편들을 생산하는데 유용한 예시적인 플라스미드 벡터들은 HCMV 즉시 초기 인핸서(HCMV immediate early enhancer)/프로모터 또는 MHC 클래스 I 프로모터와 같은 강력한 프로모터, HCMV 즉시 초기 유전자 인트론 A(HCMV immediate early gene intron A)과 같은 전사의 프로세싱(processing)을 강화하기 위한 인트론(intron), 및 후기 SV40 폴리A 신호(late SV40 polyA signal)와 같은 폴리아데닐화(polyA) 신호를 포함한다. 플라스미드는 항체의 전장 중 및 경사슬들, 단일사슬 Fv 단편 또는 다른 면역글로불린 단편들의 발현을 가능할 수 있도록 다중시스트론(multicistronic)일 수 있다.
3. 세포 발현 시스템( Cell Expression Systems )
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 코딩하는 핵산들은 적합한 숙주에서 발현될 수 있다. 벡터들 및 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 코딩하는 핵산들을 포함하는 세포들이 제공된다. 일반적으로, 이종의(heterologous) DNA을 발현하고 분비경로(secretory pathway)를 가지도록 조작될 수 있는 어떤 세포형(cell type)이 적합하다.
발현 숙주들은, 박테리아 세포(예를 들어, E. coli), 효모균 세포들, 진균(fungal) 세포들, 고세균(Archae), 식물 세포들, 곤충 세포들 및 인간 세포들을 포함하는 동물 세포들과 같은, 원핵 및 진핵 생물들을 포함한다. 발현 벡터들은 발현된 단백질들 상에 존재하는 번역 후 변형들의 종류들뿐만 아니라 단백질 생산 수준들이 다를 수 있다. 또한, 발현 숙주의 선택은 보통 사용된 벡터 및 전사 및 번역 구성요소들의 선택과 관련된다. 예를 들어, 발현 숙주의 선택은 보통, 그러나 항상은 아니며, 사용된 전구 서열(precursor sequence)의 선택에 의존한다. 예를 들어, 많은 이종의(heterogous) 신호서열들은 단지 동일 종들의 숙주세포에서 발현될 수 있다(즉, 곤충 세포 신호서열은 곤충 세포에서 최적으로 발현된다). 이와 대조적으로, 예를 들어, 효모균, 곤충, 또는 포유류 숙주 세포들에서 잘 작동하는 인간 혈청 알부민(hHSA) 신호서열, 곤충 및 포유류 세포들에서 기능을 하는 것으로 입증되어 온 조직 플라스미노겐 활성자(tissue plasminogen activator) 프리(pre)/프로(pro) 서열과 같은, 다른 신호서열들이 이종의 숙주들에서 사용될 수 있다(Tan et al ., (2002) Protein Eng. 15:337). 발현 벡터의 선택은 이것 및 조절 및 안전성 고려, 생산 비용들 및 필요 및 정제를 위한 방법들과 같은 다른 인자들에 기초로 될 수 있다. 따라서, 벡터 시스템은 사용된 숙주세포와 양립가능해야 한다.
진핵 숙주들에서의 발현은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 패리토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모균들, 드로스필라(Drosophila) 세포들 및 인시류(lepidopteran) 세포들과 같은 곤충세포들, 담배, 옥수수, 쌀, 조류(algae), 및 개구리밥(lemna)과 같은 식물들 및 식물 세포들에서의 발현을 포함한다. 발현을 위한 진핵 세포들은 또한 중국 햄스터 난소(CHO) 세포들 또는 어린(baby) 햄스터 신장(BHK) 세포들과 같은 포유류 세포주들을 포함한다. 진핵 발현 숙주들은 또한, 예를 들어, 혈청, 우유 및 알들에서의 생산을 포함하는, 형질전환 동물들에서의 생산을 포함한다.
재조합 분자들은 유전자 서열의 수많은 복제를 생성되도록, 예를 들어, 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 감염(infection), 전기천공법(electroporation) 및 소노포레이션(sonoporation)을 통해 숙주 세포들에 도입될 수 있다. 일반적으로 표준 형질 감염 방법들(standard transfection methods)이 다량의 항체 사슬들을 발현하는 박테리아, 포유류, 효모균, 또는 곤충을 생산하는데 사용되며, 이는 그리고 나서, 표준 방법들(예를 들어, Colley et al . (1989) J. Biol. Chem., 264:17619-17622; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed.), 1990 참조)을 사용하여 정제된다. 진핵 및 원핵 세포들의 형질전환은 표준 방법들(예를 들어, Morrison (1977) J. Bact. 132:349-351; Clark-Curtiss and Curtiss (1983) Methods in Enzymology, 101, 347-362 참조)에 따라 수행된다. 예를 들어, 왜래(foreingn) 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포들에 도입하기 위한 잘 알려진 어떤 절차들(procedures)이 사용될 수 있다. 이는 칼슘 포스페이트 형질감염(calcium phosphate transfection), 폴리브렌(polybrene), 원형질체 융합(protoplast fusion), 전기천공법, 유전자총(biolistics), 리포솜들(liposomes), 마이크로주입, 플라스마 벡터들(plasma vectors), 바이러스 벡터들(예를 들어, 베큘로바이러스(baculovirus), 우두 바이러스(vaccinia virus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 다른 바이러스들), 및 클로닝된 게놈 DNA(genomic DNA), cDNA, 플라스미드 DNA, 코스미드(cosmid) DNA, 합성 DNA 또는 다른 왜래 유전적 물질을 숙주세포에 도입하기 위한 잘 알려진 어떤 다른 방법들의 사용을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 목적을 위해, 숙주세포는 항-RSV 항체의 적어도 하나의 VH 사슬 또는 중사슬을 코딩하는 제1 벡터와 항-RSV 항체의 적어도 하나의 VL 사슬 또는 경사슬을 코딩하는 제2 벡터로 형질감염된다. 숙주 세포는 또한 중사슬과 경사슬 둘 다 또는 그들의 일부를 코딩하는 단일 벡터로 형질감염될 수 있다.
한 예에서, 항체의 중사슬을 코딩하는 핵산은 제1 벡터에 결찰되고, 항체의 경사슬을 코딩하는 핵산은 제2 발현벡터로 결찰된다. 발현 벡터는 일반적으로 이들이 그들로부터 단백질의 비교가능한 발현 (중사슬 및 경사슬)을 허용하도록 충분히 호환적이지만, 같거나 또는 다를 수 있다. 제1 및 제2 발현 벡터는 일반적으로 숙주 세포에 공동-형질감염, 즉 1:1 비율로 형질감염된다. 벡터의 예는 pg1HC 및 pkLC을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다 (Tiller et al. (2008) Journal of Immunological Methods, 329:112-24). 다른 발현 벡터는 L 사슬 발현벡터 pAG4622와 중사슬 발현 벡터 pAH4604를 포함한다(Coloma et al. (1992) J Immunol. Methods, 152:89-104). pAG4622 벡터는 인간 κ L 사슬의 C-영역 도메인을 코딩하는 게놈성 서열과 선택 마커를 함유한다. pAH4604 벡터는 인간 H 사슬 γ1 C-영역 도메인을 코딩하는 서열과 hisD 선택마커를 함유한다.
또 다른 예에서, 중사슬 및 경사슬은 중사슬과 경사슬 모두에 대한 발현 카세트를 갖는 단일 벡터에 클론될 수 있다. 한 예에서, 중사슬과 경사슬을 코딩하는 유전자가 포유동물 발현 벡터 pTT5에 클론될 수 있다(NRC Biotechnology Research). 또 다른 예에서, 중사슬과 경사슬, 또는 그들의 일부를 코딩하는 유전자는 pCALM (SEQ ID NO:102)에 클론될 수 있다.
전장 Ig의 발현을 위해, VH-CH1-hinge-CH2- CH3를 코딩하는 서열이 제1 발현 벡터에 클론될 수 있고 VL-CL 도메인을 코딩하는 서열은 제2 발현 벡터에 클론될 수 있다. Fab를 생성하기 위해, VH-CH1을 코딩하는 서열은 제1 발현 벡터에 클론될 수 있고, VL-CL 도메인을 코딩하는 서열은 제2 발현 벡터에 클론될 수 있다. 통상의 항체의 경우, 중사슬은 경사슬과 쌍을 이루고 Fab 단량체가 생성된다.
발현은 당업자에게 알려져 있는 어느 세포 발현 시스템일 수 있다. 발현을 위한 예시적인 세포는 293FS 세포, HEK293-6E 세포 또는 CHO 세포이나 이것으로 한정되는 것은 아니다. 다른 발현 벡터와 숙주 세포가 아래에 기재된다. 발현 후, 항체 중사슬 및 경사슬은 전장 항체 또는 그것의 단편을 형성하기 위해 이황화 결합에 의해 쌍을 이룬다.
a. 원핵 발현( Prokaryotic Expression )
원핵생물들(Prokaryotes), 특히 E. coli,는 다량의 단백질들을 생산하기 위한 시스템을 제공하며, 제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 발현하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, E. coli 숙주 세포들은 제공된 변이체 폴리펩티드들의 증폭 및 발현에 사용된다. E. coli의 형질전환은 당 분야의 당업자에게 잘 알려진 간단하고 신속한 기술이다. E. coli를 위한 발현 벡터들은 유도 프로모터(inducible promotor)를 포함하고, 이러한 프로모터들은 높은 수준의 단백질 발현을 유도하고 숙주세포들에 어떤 독성을 나타내지 않는 단백질을 발현하는데 유용하다. 유도 프로모터들의 예들은 lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 tac 프로모터, T7 및 SP6 RNA 프로모터들 및 온도 조절 λPL 프로모터(temperature regulated λL promoter)을 포함한다.
본 발명에서 제공되는 어떤 것과 같은, 단백질들은, E. coli의 세포질 환경(cytoplasmic environment) 내에서 발현될 수 있다. 몇몇 폴리펩티드들에 대하여, 세포질 환경은, 단백질의 응집체들을 포함하는 봉입체들(inclusion bodies)의 형성을 야기할 수 있다. 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)와 같은 환원제들 및 구아니딘-HCL 및 요소(urea)와 같은 변성물이, 단백질을 재용해시키고, 이어서 가용성 단백질의 후속의 재접힘(subsequent refolding)에 사용될 수 있다. 대안적 접근(선택적 접근)은 산화 환경, 샤페로닌 유사(chaperonin-like) 및 설파이드 이성질화효소들(isomerases)을 제공하고 가용성 단백질의 생산으로 이끌 수 있는 박테리아의 주변세포질 공간(periplasmic space)에서의 단백질들의 발현이다. 예를 들어, 단백질들의 파지 디스플레이를 위하여, 파지에서 조립될 수 있도록 단백질들이 주변세포질(periplasm)로 전달된다(exported). 일반적으로, 단백질을 주변세포질로 지시하는 리더 서열(leader sequence)은 발현될 단백질에 융합된다. 리더는 그리고나서 주변세포질 내의 신호 펩티다제에 의해 제거된다. 주변세포질-표적(periplasmic-targeting) 서열들의 예들은 펙테이트 리아제 유전자로부터의 pelB 리더 및 알칼리성 포스파다제 유전자로부터 유래된 리더를 포함한다. 몇몇 경우들에서, 주변세포질 발현은 발현된 단백질을 배양 배지(culture medium)로의 누출을 가능하게 한다. 단백질들의 분비는 배양 상청액으로부터의 빠르고 간단한 정제를 가능하게 한다. 분비되지 않는 단백질들은 삼투성 용혈(osmotic lysis)에 의해 주변세포질로부터 얻을 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 몇몇 경우들에서, 단백질들은 불용성이 될 수 있으며, 변성제들 및 환원제들이 용해 및 재접힘을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 유도 및 성장의 온도는 또한 발현 수준 및 용해도에 영양을 줄 수 있으며, 일반적으로 25℃ 내지 37℃ 사이의 온도들이 사용된다. 일반적으로, 박테리아는 비-당화 단백질을 생산한다. 따라서, 만일 단백질들이 기능을 위해 당화가 요구된다면, 숙주 세포들에서 정제한 후 인 비트로로 당화를 추가할 수 있다.
b. 효모균 세포( Yeast Cells )
사카로마이세스 세레비지에, 사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 피치아 패리토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모균들이 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 발현하는데 사용할 수 있는 잘 알려진 효모균 발현 숙주들이다. 효모균은 에피솜 복제 벡터들로 형질전환되거나 또는 상동재조합에 의한 염색체 통합에 의해 형질전환될 수 있다. 일반적으로, 유도 프로모터들은 유전자 발현을 조절하는데 사용된다. 이러한 프로모터들의 예들은, GAL1, GAL7 및 GAL5 및 CUP1, AOX1 또는 다른 피치아 또는 다른 효모균 프로모터와 같은 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터들을 포함한다. 발현 벡터들은 보통, 형질전환된 DNA의 선택 및 유지를 위하여, LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3와 같은 선별 마커들을 포함한다. 효모균 내에서 발현된 단백질들은 보통 가용성이다. Bip과 같은 세페로닌들 및 단백질 디설퍼이드 이성질화효소와의 공동-발현이 발현 수준 및 용해도를 향상시킬 수 있다. 또한, 효모균에서 발현된 단백질들은, 사카로마이세스 세레비지에로부터의 효모균 교배형 알파-인자 분비 신호와 같은 분비 신호 펩티드 융합들 및 Aga2p 교배 부착 수용체(mating adhesion receptor) 또는 아르술라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans) 글루코아밀라제(glucoamylase)와 같은 효모균 세포 표면 단백질들과의 융합들을 사용하여 분비되도록 지시될 수 있다. Kex-2 프로테아제에 대한 것과 같은 프로테아제 절단 부위는, 분비경로가 종료(exit)될 때, 발현된 폴리펩티드들로부터 융합된 서열들을 제거하도록 조작될 수 있다. 효모균은 또한 Asn-X-Ser/Thr 모티프들(motifs)에서 당화가 가능하다.
c. 곤충세포( Insect Cells )
바람직하게 베큘로바이러스 발현을 사용하는, 곤충세포들은 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 발현하는데 사용될 수 있다. 곤충세포들은 높은 수준의 단백질을 발현하고 고등 진핵생물에 의해 사용되는 번역 후 변형들 대부분이 가능하다. 베큘로바이러스는 안전성을 개선하고 진핵 발현의 조절 우려들(regulatory concerns)를 감소시키는 제한적인 숙주범위를 갖는다. 일반적 발현벡터들은 베큘로바이러스의 폴리헤드린 프로모터와 같은 높은 수준 발현을 위한 프로모터를 사용한다. 일반적으로 사용되는 베큘로바이러스 시스템들은 오토그라파 캘리포니카 핵다각체 병 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)(AcNPV), 및 누에나방(Bombyx mori) 핵다각체 병 바이러스(BmNPV), 수포도프테레 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터 유래한 Sf9, 멸강나방(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 제왕나비(Danaus plexippus)(DpN1)와 같은 곤충 세포주를 포함한다. 높은 수준의 발현을 위하여, 발현될 분자의 뉴클레오티드 서열이 바이러스의 폴리헤드린 개시 코돈의 바로 하류에 융합된다. 인간 항체를 발현할 수 있는 베큘로바이러스 재조합물을 생성하기 위해, pAcUW51 (PharMingen)와 같은 이중-발현 트란스퍼가 사용된다. 포유류 분비 신호들은 곤충세포에서 정확히 프로세싱되고, 발현된 단백질을 배양 배지로 분비하는데 사용될 수 있다. 또한, 멸강나방(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 제왕나비(Danaus plexippus)(DpN1) 세포주들은 포유류 세포 시스템들과 유사한 당화 패턴들을 가진 단백질들을 생산한다.
곤충세포들에 있어서의 대안적인 발현 시스템은 안정되게 형질전환된 세포들의 사용이다. 슈나이더 2(Schnieder 2)(S2) 및 Kc 세포들(드로스필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)) 및 C7 세포들(흰줄숲모기(Aedes albopictus))와 같은 세포주들이 발현에 사용될 수 있다. 드로스필라 메탈로티오네인 프로모터들이 카드뮴 또는 구리로 중금속 유도 존재 하에서 높은 수준의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 발현 벡터들은 일반적으로 네오마이신 및 하이그로마이신과 같은 선별마커들의 사용에 의해 유지된다.
항체의 발현을 위한 베큘로바이러스 벡터의 예는 바이시트론성 벡터 pAc-κFc (Progen, Biotechnik; Catalog No. PR3001); pAc-λFc (Progen; PR3003) ; pAc-κCH3 (Progen; PR3000) 및 pAc- λCH3 (Progen; PR3002)이다.
d. 포유류 세포들 Mammalian Cells )
포유류 발현 시스템들은 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 발현하는데 사용될 수 있다. 발현 구성체들(expression constructs)은 아데노바이러스 또는 우두 바이러스와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 바이러스 감염, 또는 리포솜, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란과 같은 직접적인 DNA 전달 및 전기천공법 및 마이크로주입과 같은 물리적인 수단에 의해 포유류 세포에 전달될 수 있다. 포유류 세포용 발현벡터들은 일반적으로 mRNA 캡 부위(cap site), TATA 박스(box), 번역 개시 서열(Kozak 컨센서스 서열) 및 폴리아데닐화 구성요소들을 포함한다. 이러한 벡터들은 보통 높은 수준 발현을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예를 들어 SV40 프로모터-인핸서, 인간 사이토메칼로바이러스(cytomegalovirus)(CMV) 프로모터 및 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)의 긴 터미날 반복을 포함한다. 이러한 프로모터-인핸서들은 많은 세포형에서 활성이다. 조직 및 세포-형 프로모터들 및 인핸서 영역들은 또한 발현에 사용될 수 있다. 예시적인 조직 및 세포-형 프로모터/인핸서 영역들은 엘라스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유방암 바이러스, 알부민, 알파 태아단백질(fetoprotein), 알파 1 항트립신, 베타 글로빈, 마이엘린 염기성 단백질, 미오신 경사슬 2, 및 생식선자극-방출 유전자 조절(gonadotropic releasing hormone gene control)과 같은 유전자들로부터 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 선별 마커들은 발현 구성체를 가진 세포를 선택하고 유지하는데 사용될 수 있다. 선별 마커 유전자들의 예들은 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아데노신 디아미나제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아미노글루코사이드 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 환원효소 및 티미딘 키나제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체는 NEOR/G418 시스템, 디하드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 시스템 또는 글루타민 합성효소 (GS) 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. GS 시스템은 중사슬과 경사슬 모두를 발현하기 위해, pEE12/pEE6와 같은 조인트 발현 벡터를 사용한다. TCR-ζ 및 FcεRI-γ와 같은 세포 표면 신호 분자들과의 융합은 세포 표면에서 활성상태인 단백질의 발현을 지시할 수 있다.
많은 세포주들이 마우스, 랫트, 인간, 원숭이, 닭 및 햄스터 세포들을 포함하는 포유류 발현에 사용가능하다. 예시적인 세포주들은 CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0(비분비성) 및 다른 골수종(myeloma) 세포주들, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주들, 림프구들, 섬유아세포들, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, W138, BT483, HS578T, HTB2, BT20, T47D, 293S, 2B8, 및 HKB 세포들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 세포주들은 또한 세포 배양 배지로부터 단리된 단백질들의 정제를 용이하게 하는 무혈청 배지에 적응된 세포주들 또한 사용이능하다. 이런 예 중 하나는 무혈청 EBNA-1 세포주이다(Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng . 84:332-42.).
항체의 발현을 위한 예시적인 포유류 벡터는 pTT5 (NRC Biotechnology Research Institute) 및 pCALM ( SEQ ID NO:102에 기재)를 포함한다.
e. 식물( Plants )
형질전환 식물 세포들 및 식물들은 본 발명에서 설명된 어떤 것과 같은 폴리펩티드들이 발현될 수 있다. 발현 구성체들은 일반적으로 직접적인 미세입자투사법 및 원형질체 내로의 PEG-매개 전달과 같은 직접적인 DNA 전달을 사용 및 아그로박테리움-매개 형질전환으로 식물들에 전달될 수 있다. 발현 벡터들은 프로모터 및 인핸서 서열들, 전사 종결 구성요소들 및 번역 조절 구성요소들을 포함할 수 있다. 발현 벡터들 및 형질전환 기술들은 보통 애기장대(Arabidopsis) 및 담배(tobacco)과 같은 쌍자엽 식물(dicot) 숙주들, 옥수수 및 쌀과 같은 단자엽식물(monocot) 숙주들 사이에서 나뉜다. 발현에 사용된 식물 프로모터들의 예들은 꽃양배추 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 프로모터, 노팔린 합성효소(nopaline syntase) 프로모터, 리보스 비스포스페이트 카르복실라제(ribose bisphosphate carboxylase) 프로모터 및 유비퀴틴(ubiquitin) 및 UBQ3 프로모터들을 포함한다. 하이그로마이신, 포스포만노스(phosphomannose) 이성질화효소 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제와 같은 선별마커들은 보통 형질전환된 세포들의 선택 및 유지를 용이하게 하는데 사용된다. 형질전환된 식물 세포들은 세포들, 응집체들(캘러스(callus) 조직)로서 배양에서 유지되거나 완전한 식물들로 재생될 수 있다. 형질전환 식물 세포들은 또한 프로테아제 또는 변형된 프로테아제를 생산하도록 조작된 조류(algae)를 포함할 수 있다(예를 들어, Mayfield et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:438-442 참조). 식물들은 포유류 세포들과 다른 당화 패턴들을 가지기 때문에, 이는 이들 숙주들 내에서 생산된 단백질의 선택에 영향을 미칠 수 있다.
4. 항체의 정제( Purification of Antibodies )
숙주 세포들로부터 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함하는 폴리펩티드들의 정제를 위한 방법들은 선택된 숙주 세포들 및 발현 시스템들에 의존될 것이다. 분비된 분자들을 위하여, 세포들을 제거한 후, 단백질들은 배양 배지로부터 정제된다. 세포 내 발현을 위하여, 세포들은 용해될 수 있으며(lysed) 단백질들이 추출물들로부터 정제될 수 있다. 한 실시예에서, 폴리펩티드들은 폴리펩티드들을 포함하는 원심분리 및 세포 용해(예를 들어, 드라이 아이스/에탄올 용기 내에서 반복된 동결-융해에 의해), 이어서 상청액의 원심분리 및 유지에 의해 숙주세포들로부터 단리된다. 형질전환 식물들 및 동물들과 같은 형질전환 생물들이 발현에 사용될 때, 조직들 또는 기관들은 용해된(lysed) 세포 추출물을 만들기 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 또한, 형질전환 동물 생산은 우유 또는 알들에서 폴리펩티드들의 생산을 포함할 수 있으며, 이는 수집될 수 있으며, 만일 필요하다면, 당 분야에서 있어서의 표준 방법들을 사용하여 단백질들이 추가로 추출되고 추가로 정제될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들과 같은 단백질들은, 예를 들어, SDS-PAGE, 크기 분획(size fraction) 및 크기 배제 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전 및 음이온 교환과 같은 이온 교환 크로마토그래피를 포함하나, 이에 제한되지 않는 당 분야에서 알려진 표준 단백질 정제 기술들을 사용하여 용해된 세포 추출물로부터 정제될 수 있다. 친화성 정제술은 또한 제제들의 효능 및 순도를 향상시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제들과 결합하는 항체들, 수용체들 및 다른 분자들이 친화성 정제에서 사용될 수 있다. 발현 구성체들은 또한 myc 에피토프, GST 융합 또는 His6와 같은 단백질에 친화성 태그를 부가하도록 조작될 수 있고, 각각 myc 항체, 글루타티온 수지 및 Ni-수지로 친화성 정제될 수 있다. 순도는 겔 전기영동 및 염색(staining) 및 분광광도법 기술을 포함하는 당 분야에 알려진 어느 방법에 의해 평가될 수 있다.
통상적으로, 항체 및 그들의 일부는 본 분야의 당업자에게 알려진 어느 공정에 의해 정제된다. 항체들은 SDS-PAGE, 크기분획 및 크기 배제 크로마토그래피, 황산 암모늄 침전법, 킬레이트 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 또는 칼럼 크로마토그래피를 포함하여 본 분야에 알려진 표준 단백질 정제술을 사용하여 실질적으로 순수하게 정제될 수 있지만, 그것으로 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 항체는 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 항체를 정제하는 방법의 예는 칼럼 크로마토그래피에 의한 것이고, 여기서 고체 지지체 칼럼 재료는 높은 친화력으로 면역글로불린에 결합하는, 단백질 G, Streptococcus 기원 세포 표면-관련 단백질에 결합한다. 항체는 60%, 70%, 80% 순도로 그리고 통상적으로 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 순도까지 정제될 수 있다. 순도는 SDS-PAGE 및 쿠마시브(coomassie ) 염색에 의해서와 같이, 표준 방법에 의해 평가될 수 있다.
단리된 폴리펩티드들은, 그리고 나서, 예를 들어, 겔(예를 들어, SDS-Page 겔) 상의 분리, 크기 분획(Sephacryl™ S-200 HiPrep™ 16x60 크기 배제 칼럼(Amersham from GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ))에 의해 분석될 수 있다. 단리된 폴리펩티드들은 또한, 바람직한 결합 파트너들에 결합하는 그들의 능력을 결정하기 위하여, 일반적으로 결합 분석들, 고체 지지체, 예를 들어, 플레이트(예를 들어, ELISA-기반 결합 분석들) 또는 비드에 결합된 결합 파트너를 사용하는 결합 분석들로 분석될 수 있다. 하기 섹션들에서 설명된 결합 분석들은, 침전된 폴리펩티드를 표현하는(displaying) 파지의 결합을 평가하는데 사용되고, 또한 숙주 세포 용해물로부터 직접 단리된 폴리펩티드들을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 결합 분석들은, 예를 들어, 분석 플레이트의 웰과 같은 고체 지지체 상에 항체를 코팅하고 고체 지지체 상에 단리된 폴리펩티드를 배양하고, 이어서 세척 및 제2 시약, 예를 들어, 효소-표지된 항체들 및 기질로 검출함으로써, 항체 폴리펩티드들이 하나 이상의 항원들에 결합하는지 여부를 결정하기 위해 수행될 수 있다.
G. 항- RSV 항체 특성 및 활성의 평가
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 당 분야의 당업자에 잘 알려진 다양한 방법들로 특징화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 인간 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus)(RSV)의 F 단백질에 면역특이적으로 결합하는 능력에 관해 분석될 수 있다. 이러한 분석들은, 예를 들어, 용액에서(예를 들어, Houghten (1992) Bio / Techniques 13:412-421), 비드들에서(Lam (1991) Nature 354:82-84), 칩들에서(Fodor (1993) Nature 364:555-556), 박테리아에서(미국특허번호 제5,223,409호), 포자들(spores)에서(미국특허번호 제5,571,698호; 제5,403,484호; 및 제5,223,409호), 플라스미드들에서(Cull et al. (1992) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 89:1865-1869) 또는 파지에서(Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 87:6378-6382; 및 Felici (1991) J. Mol . Biol. 222:301-310) 수행될 수 있다. RSV 항원 또는 그것의 항원-결합 단편에 면역특이적으로 결합하는 것으로 동정된 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 또한 RSV 항원에 대한 그들의 특이성 및 친화성에 대해 분석될 수 있다. 결합 특이성, 또는 에피토프는, 예를 들어, 다른 항-RSV 항체들을 사용하는 경쟁 분석 및/또는 단일클론 항체-저항성 돌연변이체들(Monoclonal Antibody-Resistant Mutants)(MARMs)를 사용하는 바이러스 중화 분석들에 의해 결정될 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 사용하는 인 비트로 분석들 및 인 비보 동물 모델들은, 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들과 접촉 또는 투여에 의해 초래된 RSV 중화 수준을 측정하는데 사용할 수 있다.
1. 결합 분석( Binding Assays )
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 선택된 표적(예를 들어, RSV 바이러스 또는 단리된 RSV F 단백질)에 결합하는 그들의 능력 및 이러한 표적들에 대한 특이성에 대해, 당 분야의 당업자에 알려진 어떤 방법에 의해 평가될 수 있다. 예시적인 분석들은 하기 실시예 5 및 8에서 제공되며, 여기 하기에서 설명된다. 결합 분석들은 용액, 현탁액 내 또는 고체 지지체 상에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원들은 고체 지지체(예를 들어, 탄소 또는 플라스틱 표면, 조직 배양 디쉬 또는 칩)에 고정화할 수 있으며, 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 접촉될 수 있다. 결합되지 않는 항체 또는 표적 단백질은 세척될 수 있으며, 결합된 복합체들은 그리고나서 검출될 수 있다. 결합 분석들은, 비이온성 계면활성제(예를 들어, 0.1% 트리톤 X-100(Triton X-100) 또는 트위 20(Tween 20))를 갖는 높은 이온 강도(완충용액(예를 들어, 0.3-0.4 M NaCl) 및/또는 블로킹 단백질들(예를 들어, 소 혈청 알부민 또는 젤라틴(gelatin))을 사용하는 것과 같은, 비특이적 결합을 감소시키는 조건들 하에서 수행될 수 있다. 음성 대조군들(Negative controls)은 또한 이러한 분석들에서 배경 결합(background binding)의 기준(measure)으로서 포함될 수 있다. 결합 친화성들은 스캐차드(Scatchard) 분석(Munson et al ., (1980) Anal . Biochem ., 107:220), 표면 플라스몬 공명, 등온성 열량측정, 또는 당 분야의 당업자에 알려진 다른 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
면역 특이적 결합 및 교차-반응성을 분석하는데 사용될 수 있는 예시적인 면역 분석들은, 웨스턴 블롯, 방사성면역분석, ELISA(효소 결합 면역흡착 분석), 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)(MSD, Gaithersburg, Maryland), "샌드위치(sandwich)" 면역분석들, 면역침강분석법들, 엘리스폿(ELISPOT), 침강소 반응, 겔 확산 침전 반응들, 면역확산분석법들, 응집 분석들, 보체-고정 분석법, 면역방사계수측정법, 형광 면역분석법들, 단백질 A 면역분석법들과 같으나, 이에 제한되지 않는 기술들을 사용하는 경쟁적 및 비-경쟁적 분석 시스템들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 분석들은 당 분야에서 일상적이며, 잘 알려져 있다(예를 들어, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, 본 발명에서 참조문헌으로 기재된 것 참조). 다른 분석 포맷들은 특이적 분자들(예를 들어, 항체들) 및 방출 캡슐화된 제제들 또는 마커들에 결합되도록 디자인된 리포솜을 사용하는 리포솜 면역분석들(liposome immunoassays)(LIA)을 포함한다. 방출된 화합물들은 그리고나서 표준 기술들에 따라 검출된다(Monroe et al ., (1986) Amer. Clin . Prod . Rev . 5:34-41 참조). 제한의 수단으로써 의도된 것이 아닌 예시적인 면역분석들이 하기에서 간단하게 설명된다.
면역침강 프로토콜들은 일반적으로, 단백질 포스파타제 및/또는 프로테아제 억제제들(예를 들어, EDTA, PMSF, 아프로티닌, 소듐 바나데이트)를 보충한 RIPA 완충용액(1 % NP-40 또는 트리톤 X-100, 1% 소듐 디옥시콜레이트, 0.1 % SDS, 0.15 M NaCl, 0.01 M 소듐 포스페이트, pH 7.2, 1% 트라시롤(Trasylol))와 같은 용해 완충용액에서 세포들의 집단을 용해, 흥미있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 세포 용해물에 첨가, 40℃에서 시간기간 동안(예를 들어, 1 내지 4시간) 배양, 단백질 A 및/또는 단백질 G 세파로오스 비드들을 세포 용해물에 첨가, 40℃에서 약 1시간 또는 그 이상동안 배양, 용해 완충용액에서 비드들의 세척 및 SDS/시료 완충용액에서 비드들의 재현탁을 포함한다.
흥미있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편들의 특정 항원을 면역침전시키는 능력은, 예를 들어, 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가될 수 있다. 당 분야의 당업자는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 항원에 대한 결합을 증가시키고 배경을 감소시키도록(예를 들어, 세파로오스 비드들을 갖는 세포 용해물의 프리-클리어링(pre-clearing)) 변경될 수 있는 계수들에 관해 정통하다. 면역침전 프로토콜들에 관한 추가적인 논의를 위하여, 예를 들어, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.16.1를 참조한다. 웨스턴 블롯 분석은 일반적으로 단백질 시료들의 준비, 폴리아크릴아마이드 겔에서 단백질 시료들의 전기영동(예를 들어, 항원의 분자량에 의존하는 8% 내지 20 % SDS-PAGE), 폴리아크릴아마이드 겔로부터 단백질 시료에서 니트로셀룰로오스(nitrocelluose), PVDF 또는 나일론(nylon)와 같은 막으로의 전달(transferring), 블로킹 용액(예를 들어, 3% BSA 또는 탈지유를 갖는 PBS)에서 막의 블록킹, 세척 완충용액(예를 들어, PBS-트윈 20)에서 세척, 막을 블로킹 완충용액에서 희석된 1차 항체 또는 그의 항원-결합 단편(즉, 흥미있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편)으로 블로킹, 세척 완충용액에서 막을 세척, 막을 블록킹 완충용액에서 희석된 효소의 기질(예를 들어, 서양고추냉이 퍼록시다제 또는 알칼라인 포스파타제) 또는 방사성 분자(예를 들어, 32P or 125I)에 컨쥬게이트된 제2 항체(제1 항체, 예를 들어, 항-인간 항체를 인식하는)로 블로킹, 세척 완충용액에서 막을 세척 및 항원의 존재를 검출을 포함한다. 당 분야의 당업자는 검출된 신호를 증가시키고 배경 노이즈(background noise)를 감소시키도록 변경될 수 있는 파라미터들에 관해 정통하다. 웨스턴 블롯 프로토콜들에 관한 추가적인 논의를 위하여, 예를 들어, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.8.1를 참조한다.
ELISA들은 항원의 준비, 96-웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트의 웰을 항원으로 코팅, 효소의 기질(예를 들어, 서양고추냉이 퍼록시다제 또는 알칼라인 포스파타제)과 같은 검출가능한 화합물에 접합된 흥미있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 웰에 첨가 및 시간 기간동안 배양, 및 항원의 존재를 검출을 포함한다. ELISA들에서, 흥미있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출가능한 화합물과 접합되지 않아야 하며; 대신에 검출가능한 화합물에 접합된 제2 항체(관심있는 항체를 인식하는)가 웰에 첨가될 수 있다. 또한, 웰을 항원으로 코팅하는 대신에, 항체가 웰에 코팅된다. 이 경우에는, 관심있는 항원을 코팅된 웰에 첨가한 후 검출가능한 화합물에 접합된 제2 항체가 첨가될 수 있다. 당 분야의 당업자는 당 분야에 알려진 다른 다양한 ELISA들 뿐만 아니라 검출된 신호를 증가시키도록 변형될 수 있는 파라미터들에 관해 정통하다. ELISA들에 관한 추가적인 논의를 위하여, 예를 들어, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1를 참조한다. 실시예 5 및 8는 항-RSV 항체들의 RSV F 단백질에 대한 결합을 위한 결합 분석의 예가 된다.
항원에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합 친화성 및 항체-항원 상호작용의 해리속도(off-rate)는, 예를 들어, 경쟁적 결합 분석들에 의해 결정될 수 있다. 경쟁적 결합 분석 중 하나의 실시예는 증가되는 양의 비표지된 항원 존재 하에서 관심있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 표지된 항원(예를 들어, 3H 또는 125I)의 배양, 및 표지된 항원에 결합된 항체 또는 항원-결합 단편의 검출을 포함하는 방사성면역분석들이다. RSV 항원에 대한 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화성 및 결합 해리속도들은 스캐차드 플롯 분석(Scatchard plot analysis)에 의한 데이터로부터 결정될 수 있다. 제2 항체와의 경쟁은 또한 방사성면역분석들을 사용하여 결정될 수 있다. 이 경우에서, RSV 항원은, 증가되는 양의 비표지된 제2 항체 존재 하에서, 표지된 화합물(예를 들어, 3H 또는 125I)에 접합된 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편과 함께 배양된다. 몇몇 예에서, 표면 플라스몬 공명(예를 들어, BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Sweden and GE Healthcare Life Sciences; Malmqvist (2000) Biochem. Soc. Trans. 27:335 참조) 동력학적 분석은 RSV 항원에 대한 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 결합 및 해리 속도들을 결정하는데 사용될 수 있다. 표면 플라스몬 공명 동력학적 분석은, 그들의 표면 상에 항체들 또는 그것의 항원-결합 단편들로 고정한 칩들로부터 RSV 항원의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 또한 당 분야의 당업자에게 알려진 기술들을 사용하여 이것의 숙주 세포 수용체에 대한 RSV의 결합을 억제시키는 그들의 능력에 관하여 분석될 수 있다. 예를 들어, RSV에 대한 수용체를 발현하는 세포들은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 존재 또는 부존재 하에서 RSV와 접촉될 수 있으며, RSV의 결합을 억제하기 위한 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 능력은, 예를 들어, 유세포분석 또는 섬광 분석에 의해 측정될 수 있다. RSV(예를 들어, F 당단백질 또는 G 당단백질과 같은 RSV 항원) 또는 항체 또는 항체 단편은, RSV 및 이것의 숙주 세포 수용체 사이의 상호작용을 검출가능하도록, 방사능을 가진 표지(예를 들어, 32P, 35S, and 125I) 또는 형광 표지(플루오레신 이소시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 피코에리트린(phycoerythrin), 피코시아닌(phycocyanin), 알로피코시아닌(allophycocyanin), o-프탈알데히드(o-phthaldehyde) 및 플루오레사민(fluorescamine))과 같은 검출가능한 화합물로 표지될 수 있다.
항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 RSV가 이것의 수용체에 결합하는 것을 억제하는 능력은 또한 무-세포 분석(cell-free assay)으로 결정될 수 있다. 예를 들어, RSV 또는 F 당단백질과 같은 RSV 항원은 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 접촉될 수 있고, 항체 또는 항체 단편의 RSV 또는 RSV 항체가 이것의 숙주 세포 수용체에 결합하는 것을 억제하는 능력이 결정될 수 있다. 몇몇 예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 고체 지지체에 고정되고, RSV 또는 RSV 항원은 검출가능한 화합물로 표지된다. 몇몇 예에서, RSV 또는 RSV 항원은 고체 지지체에 고정되고, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 검출가능한 화합물로 표지된다. RSV 또는 RSV 항원은, 부분적으로 또는 완전히 정제될 수 있거나(예를 들어, 다른 폴리펩티드들이 부분적으로 또는 완전히 없는), 또는 세포 용해물의 일부일 수 있다. 몇몇 예에서, RSV 항원은 RSV 항원 및 글루타티오닌-S-트랜스퍼라제과 같은 도메인을 포함하는 융합단백질일 수 있다. 몇몇 예에서, RSV 항원은 당 분야의 당업자에게 잘 알려진 기술들을 사용하여 비오티닐화될 수 있다(예를 들면, biotinylation kit, Pierce Chemicals; Rockford, Ill.)
2. 결합 특이성( binding specificity )
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원 결합 단편들의 결합 특이성, 또는 에피토프는, 표면 플라스몬 공명 분석들, 경쟁 분석들 및 단일클론 항체-저항성 돌연변이체들(MARMs)을 사용하는 바이러스 중화를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당 분야의 당업자에게 알려진 어떤 분석에 의해 결정될 수 있다. 에피토프는 단리된 단백질, 즉, 단리된 F 단백질 내, 또는 바이러스 내의 단백질 내에 있을 수 있다. 두 개의 항체들의 동일한 에피토프에 결합하는 능력은, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 분석들 및 항체 경쟁 분석들과 같은 당 분야에서 알려진 분석들에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 동일한 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체들은 에피토프에 대한 결합에 대해 경쟁할 수 있으며, 이는, 예를 들어, 당 분야의 알려진 기술을 사용하여 인 비트로 결합 경쟁 분석(예를 들어, 경쟁 ELISA)에 의해 측정될 수 있다. 일반적으로, 제2 항체와 동일한 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 제1 항체는 약 또는 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % 까지 에피토프에 대한 결합을 경쟁할 수 있으며, 여기서, 경쟁 백분율은 에피토프에 대한 제1 항체의 결합을 대신하는 제2 항체의 능력을 측정한다. 예시적인 경쟁 분석들에서, 항원은 소정의 표지된 항체의 제한적인 희석(예를 들어, 50-70 % 포화 농도), 및 비표지된 경쟁하는 항체의 연속 희석물의 존재 하에서 배양된다. 경쟁은, 경쟁하는 항체의 존재 하에서 결합의 어떠한 감소에 대해 표지된 항체의 항원에 대한 결합을 측정함으로써 결정된다. 다양한 표지 기술들 및 예를 들어, 방사측정의(radiometric), 형광의(fluorescent), 효소의(enzymatic) 및 비색계의(colorimetric) 검출을 포함하는 검출 방법들을 포함하는, 다양한 이러한 분석들이 당 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 하기 실시예 10에서 예시된 바와 같이, 항체 30D8 및 모타비주맙은 RSV F 단백질에 대한 결합에 대해 경쟁하지 않으며, 따라서 항체 30D8은 모타비주맙과 다른 에피토피에 결합한다는 것을 나타낸다.
제2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 제1 항체의 능력은 또한, 예를 들어, 단일클론 항체-저항성 돌연변이체들을 사용하는 바이러스 중화 분석에 의해 결정될 수 있다. MARM은 야생형 RSV 바이러스를 중화시키는 단일클론 항체에 의해 중화되지 않는 돌연변이 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 즉, MARM은 RSV 회피 돌연변이체이다. MARM들은, 항체에 의해 중화되지 않는 돌연변이 바이러스가 생길 때까지, 각각의 바이러스 복제의 연속적인 라운드 후, 세포병리 효과들(CPE)가 항체들의 농도 증가의 존재에서 관찰되도록, 항체 존재 하에서 바이러스 복제의 연속적인 라운드들 동안, 단일클론 항체 존재 하에서 야생형 RSV를 배양함으로써 생성된다. 만일 제1 항체는 제2 항체에 대항하여 형성된 MARM을 중화시킬 수 있다면, 이는 항체들이 다른 에피토프들에 특이적으로 결합하거나 상호작용한다고 결론낼 수 있다. 예를 들어, 제1 항-RSV 항체가 야생-형 RSV를 중화시키나, 다른 특정 돌연변이 RSV(즉, MARM)를 중화시키지 못하는 경우에는, 야생-형 RSV를 중화시키나, 특정 돌연변이 RSV를 중화시키지 않는 제2 항체는 일반적으로 제1 항체와 같이 RSV 상에 동일한 에피토프에 결합한다. 제1 항-RSV 항체가 야생-형 RSV를 중화시키나, 특정 돌연변이 RSV를 중화시키지 못하는 경우에는, 야생-형 RSV 및 특정 돌연변이 RSV를 중화시키는 제2 항체는 제1 항체와 같이 RSV 상에 동일한 에피토프에 결합하지 않는다.
예를 들어, 하기 실시예 9에서 예시된 바와 같이, 본 발명에서 제공되는 IgG 58c5는 MAb 1129, 팔리주맙(palizumab) 및 모타비주맙에 대한 부모 항체(Johnson et al . (1997) J. Infect . Diseases 176:1215-1224 및 미국특허번호 제5,824,307호 참조)에 대항하여 생성된 MARM 1129, Fab 19에 대항하여 생성된 MARM 19(Barbas et al. (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10164-10168 참조) 및 MAb 151에 대항하여 생성된 MARM 151(Mufson et al., (1985) J. Gen . Virol, 66:2111-2124 참조)를 포함하는 다양한 항-RSV 항체들에 대항하여 이전에 형성된 MARM들을 중화시킬 수 있다. 따라서, 58c5는 항체들 F19, MAb 151 및 MAb 1129과 F 단백질 상의 다른 에피토프에 결합한다.
하기 실시예 11에서 예시된 바와 같이, MARM들은 모타비주밥 및 58c5의 IgG 형태에 대항하여 생성하였다. 선택의 5-7 라운드(rounds) 후에 생성된 모타비주맙 MARM은, 야생형 RSV F 단백질과 비교하여 단일 아미노산 돌연변이(K272E, SEQ ID NO: 486)을 포함한다. 아미노산 K272에서의 돌연변이는 모타비주맙의 부모 항체의 결합을 방해하는 알려진 돌연변이들과 일치한다(Zhao et al., (2004) J. Infectious Disease 190:1941-1946 참조). 선택의 10 라운드들(rounds) 후에 생성된 IgG 58c5 MARM은, 야생형 RSV F 단백질과 비교하여 3 아미노산 돌연변이들을 포함한다(N63K, M115K 및 E295G, SEQ ID NO: 487). IgG 58c5 MARM에 있어서, 회피에 영향을 미치는 돌연변이들은, RSV F 단백질에 면역특이적으로 결합하는 다양한 단일클론 항체들에 대한 항원 부위들(antigenic sites)로서 이전에 동정되지 않아왔다(예를 들어, Beeler et al. (1989) J. Virology 63(7):2841-2950, Crowe et al . (1998) Virology 252:373-375; Zhao et al., (2004) J. Infectious Disease 190:1941-1946; Liu et al., (2007) Virology Journal 4:71 참조). 38D8의 IgG 형태의 존재하에 12 라운드의 바이러스 복제 후, RSV 바이러스는 중화를 회피할 수 없었다 (하기 실시예 11 참조). MARMs의 발생을 제한하는 항체 30D8의 능력은 30D8이 회피 돌연변이의 발생을 덜 겪는 에피토프에 결합하고, 그 결과 항체 38D8이 RSV 감염의 치료를 위한 치료용 항체로서 유용하다는 것을 의미한다.
이에 더하여, 하기 실시예 11에 나타낸 바와 같이, 30D8은 모타비주맙 MARM 및 58c5 MARM 둘 다를 중화시키고, 58c5는 모타비주맙 MARM을 중화시키고, 모타비주맙은 58c5 MARM을 중화시킨다. 그러므로, 30D8은 58c5 및 모타비주맙과 다른 RSV F 단백질의 에피토프와 결합한다. 이에 더하여, 58c5는 30d8 및 모타비주맙과 다른 RSV F의 에피토프와 결합한다.
3. 항체들의 바이러스 중화 효과를 분석하기 위한 인 비트로 분석
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 바이러스 중화의 검출에 대해 당 분야에 알려진 어떤 적합한 방법에 의해 분석될 수 있다. 바이러스 중화의 검출을 위한 방법들은, 플라크 분석들 및 신시튬(syncytium) 형성의 억제에 대한 분석들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 분석들은, 예를 들어, 바이러스 부착, 바이러스 침입 및 바이러스의 세포-대-세포 확산(cell-to-cell spread)의 억제를 평가하는데 사용될 수 있다(예를 들어, Burioni et al ., (1994) Proc . Natl . Acad . Sci. U.S.A. 91:355-359; Sanna et al. (2000) Virology 270:386-396l; 및 De Logu et al ., (1998) J Clin Microbiol 36:3198-3204 참조). 당 분야의 당업자는 바이러스 중화를 평가할 수 있는 어떤 분석을 확인할 수 있다.
표준 플라크 분석들은, 예를 들어, 플라크 감소 분석, 플라크 크기 감소 분석, 중화 분석 및 중화 동력학적 분석을 포함한다. 이 분석들은, 바이러스에 의한 표적 세포 단일층의 감염 후, 바이러스 플라크들(즉, 용해된 세포들의 면적들)의 형성을 측정한다. 플라크 감소 분석들에 사용될 수 있는 예시적인 표적 세포주들은, 베로(Vero) 세포들, MRC-5 세포들, RC-37 세포들, BHK-21/C13 세포들 및 HEp-2 세포들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 당 분야의 당업자는 플라크 분석에 사용하기 위한 적절한 표적 세포주를 확인할 수 있다. 플라크 분석을 위한 적절한 세포주의 선택은, 예를 들어, 세포 전염 및 바이러스가 증식하고 표적 세포를 용해시키는 능력과 같은, 알려진 인자들에 의존할 수 있다. 실시예 6 및 9는 인 비트로 중화 분석들을 예시한다.
플라크 감소 분석들은, 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편의 용액 내에서 바이러스 중화에 영향을 미치는 능력을 측정하는데 사용될 수 있다. 예시적인 플라크 감소 분석들에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 바이러스는 표적 세포들의 첨가 전에 전(pre)-배양된다. 표적 세포들은 그리고나서 항체/바이러스 혼합물로 감염시키고, 소정의 감염 기간 후 플라크 분석이 수행된다. 당 분야의 당업자는 당 분야의 알려진 예들을 기반으로 필요한 배양 시간을 결정할 수 있다. 표적 세포들의 감염 후에 생산된 바이러스 플라크들의 수의 감소는, 표적 세포 및/또는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 부착, 내재화(internalization)와 독립적으로, 표적세포들에 대한 바이러스의 결합을 막는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 능력을 나타낸다.
플라크 크기 감소 분석들은 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 바이러스 세포-대-세포 확산의 억제하는 능력을 측정하는데 사용될 수 있다. 예시적인 플라크 크기 감소 분석들에서, 표적 세포들은 먼저 소정의 감염 기간 동안 바이러스로 감염되고, 그리고나서 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 감염된 세포에 첨가된다. 당 분야의 당업자는 당 분야에서 알려진 예들을 기반으로 필요한 배양 시간을 결정할 수 있다. 바이러스 플라크들의 크기(즉, 직경)의 감소는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 바이러스 세포-대-세포 확산을 막을 수 있음을 나타낸다.
바이러스 중화 분석은, 바이러스 노출 전에 표적세포와 항체 또는 그의 항원-결합 단편과의 회합(association)에 의해, 표적 세포 표면에서 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 바이러스가 바이러스 중화에 영향을 미치는 능력을 측정하는데 사용될 수 있다. 예시적인 바이러스 중화 분석들에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 표적세포에 대한 결합이 허용되도록, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 표적세포들을 소정의 기간 동안 전-배양한다. 전-배양 기간 후에, 결합되지 않는 항체를 제거하고 표적세포들을 바이러스로 감염시킨다. 이 분석에서 플라크들의 수의 감소는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 표적 세포에 대한 부착 및/또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 내재화에 의존하는 바이러스 감염을 막는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 능력을 나타낸다. 이 분석은 또한 항체 또는 항원-결합 단편 농도들 및 전-배양 시간을 다양하게 함으로써 중화 동력학(neutralization kinectics)을 측정하는데 사용될 수 있다.
신시튬 형성의 억제에 대한 예시적인 분석들은, 융합성 바이러스 균주(fusogenic viral strain)를 사용할 때 합포체(syncytia)의 형성을 차단함으로써, 바이러스 세포병리 효과들(cytopathic effects)의 항체-매개 억제를 측정하는데 사용될 수 있다. 당 분야의 당업자는 분석에 사용될 적절한 융합성 바이러스 균주를 확인할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 항원-결합 단편들은 또한 당 분야 당업자에게 알려진 기술들을 사용하여 RSV 복제를 억제하거나 하향조절(downregulate)하는 그들의 능력이 분석될 수 있다. 예를 들어, RSV 복제는 Johnson et al. (1997) Journal of Infectious Diseases 176:1215-1224에서 설명된 바와 같은 플라크 분석에 의해 분석될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 EH는 항원-결합 단편들은 또한 RSV 폴리펩티드들의 발현을 억제하거나 하향조절하는 그들의 능력이 분석될 수 있다. 웨스턴 블롯 분석, 노던 블롯 분석 및 RT-PCR을 포함하나, 이에 제한되지 않는 당 분야의 당업자에게 알려진 기술들이 RSV 폴리펩티드들의 발현을 측정하는데 사용될 수 있다.
4. 항- RSV 항체들의 효능을 평가하기 위한 인 비보 동물 모델
동물 모델들을 사용하는 인 비보 연구들은 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 항원-결합 단편들을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 동물 모델들을 사용하는 인 비보 연구들은 이러한 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 투여의 어떤 독성을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 항-RSV 항체들의 RSV 바이러스 감염을 억제하거나 치료하는 능력을 평가하기 위하여 그리고 어떤 독성을 평가하기 위하여 인 비보 동물 모델들에 사용되는 것들과 같은, 다양한 분석들이 당 분야의 당업자에게 사용이능하다. 항-RSV 항체들의 치료적 효과는 바이러스 감염의 동물 모델들을 포함하는 병원성 감염의 동물 모델들을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 동물 모델들은 알려져 있으며, 코튼랫(cotton rat), 근교배 마우스(inbred mouse), 송아지(calf), 흰족제비(ferret), 햄스터, 기니피그, 침팬지, 올빼미원숭이(owl monkey), 붉은털원숭이들(rhesus monkey), 아프리카 녹색 원숭이(African green monkey), 세버스 원숭이(cebus monkey), 다람쥐원숭이(squirrel monkey), 보넷 원숭이(bonnet monkey), 비비(baboon)과 같으나, 이에 제한되지 않는 RSV 감염에 대한 동물 모델들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(예를 들어, RSV 감염의 예시적인 모델들을 위한, 본 발명에서 언급된 인용문헌들을 포함하는 Prince et al. (1978) Am . J. Pathol. 93:771-791; Prince et al. (1979) Infect . Immunol . 26:764-766; Byrd and Prince (1997) Clinical Infectious Diseases 25:1363-1368 참조). 항체 또는 항원-결합 단편 또는 조성물의 독성의 인 비보 테스트를 위한, 당 분야에서 알려진 어떤 동물 모델 시스템이, 랫트들, 마우스들, 소들(cows), 원숭이들, 및 토끼들을 포함하나, 이에 제한되지 않는 것이 사용될 수 있다.
5. 항체 효능을 측정하기 위한 인 비트로 및 인 비보 분석
바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 효능은 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 바이러스의 복제를 억제하는 능력, 바이러스가 전염되는 것을 억제하거나 이들의 숙주 내에서 자리잡는 것을 예방하는 능력, RSV 감염의 발생을 감소시키는 능력, 또는 RSV 감염과 관련된 하나 이상의 증상을 예방, 개선, 경감시키는 능력을 검출함으로써 입증될 수 있다. 치료는, 만일 예를 들어, 바이러스 로드(load)의 감소, 하나 이상의 증상의 개선, RSV 감염의 지속기간(duration)의 감소, 여기에서 제공된 항체 또는 조성물의 투여 후 사망률 및/또는 이환율(morbidity)의 감소가 있다면 치료의 힘이 있는 것으로 생각된다. 또한, 치료는, 만일 하나 이상의 RSV 항원에 면역특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 투여 후 면역 반응이 증가가 있다면 치료의 힘이 있는 것으로 생각된다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-2, IL-3, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 및 IL-15와 같은 사이토카인들의 발현을 유도하는 능력에 관해 인 비트로 및 인 비보로 테스트될 수 있다. 당 분야의 당업자에게 알려진 기술들이 사이토카인들의 발현 수준을 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 사이토카인들의 발현 수준은, 예를 들어, RT-PCR 및 노던 블롯 분석에 의해 사이토카인들의 RNA 수준을 분석함으로써, 및 예를 들어, 면역 침강에 이어 웨스턴 블롯 분석 또는 ELISA에 의해 사이토카인 수준을 분석함으로써 측정될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 인간 면역 세포들(예를 들어, T-세포들, B-세포들, 자연 살해 세포들)을 포함하는 면역 세포들의 생물학적 활성을 조절하는 능력에 관해 인 비트로 및 인 비보로 시험될 수 있다. 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편의 면역 세포들의 생물학적 활성을 조절하는 능력은 항원의 발현의 검출, 면역 세포들의 에펙터(effector) 기능의 검출 또는 면역 세포들의 분화의 검출에 의해 평가될 수 있다. 당 분야의 당업자에게 알려진 기술들이 이들의 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 증식(proliferation)은 3H-티미딘 병합(3H-thymidine incorporation) 분석법 및 트립판 블루 세포 계수에 의해 분석될 수 있다. 항원 발현은, 예를 들어, 웨스턴 블롯, 면역조직화학 방사면역측정법, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), "샌드위치" 면역분석법, 면역침강분석법, 침강소(precipitin) 반응, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 분석법, 응집 분석법, 보체-고정 분석법, 면역방사계수측정법, 형광 면역분석법, 단백질 A 면역분석법 및 FACS 분석법과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비경쟁적 분석 시스템을 포함하나, 이에 제한되지 않는 면역분석법에 의해 분석될 수 있다. 신호 분자의 활성화는, 예를 들어, 키나제 분석법) 및 전기영동 이동 ㅂ분석(EMSAs)에 의해 분석될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 또한 그들의 바이러스 복제 억제 또는 바이러스 로드의 감소 능력에 관해 인 비트로, 엑스 비보 및 인 비보 분석으로 테스트될 수 있다. 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 또한 RSV 감염의 시간 경과를 감소시키는 그들의 능력에 관해 분석될 수 있다. 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 또한 RSV 감염으로 고통받는 인간의 생존 기간을 적어도 또는 약 25%, 적어도 또는 약 50%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 95%, 또는 적어도 또는 약 99% 증가시키는 그들의 능력에 관해 분석될 수 있다. 또한, 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 RSV 감염으로 고통받는 인간의 입원 기간을 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 95%, 또는 적어도 또는 약 99% 감소시키는 그들의 능력에 관해 분석될 수 있다. 당 분야의 당업자에게 알려진 기술들이 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 기능을 인 비보로 분석하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 방법들과 용도에 따라, 인간 피험자들에 대한 임상 실험은 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 예방적 및/또는 치료적 효능을 입증하기 위해서 수행될 필요가 없다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 사용하는 인 비트로 및 동물 모델 연구는 인간에 추론될 수 있으며 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 예방적 및/또는 치료적 유용성을 입증하는데 충분하다.
H. 진단적 용도
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 RSV의 검출, 정제 및/또는 중화를 위한 진단 분석에 사용될 수 있다. 예시적인 진단적 분석은 RSV의 인 비트로 및 인 비보 검출을 포함한다. 예를 들어, 단리된 생물학적 시료(예를 들어, 객담)에서 또는 인 비보로 RSV의 수준을 정성적 및 정량적으로 측정하기 위해 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 사용하는 분석이 제공된다.
본 발명에서 설명된 바와 같이 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 인 비트로 또는 인 비보 검출을 위해 검출가능한 모이어티와 접합될 수 있다. 이러한 항체들은, 예를 들어, 점막 부위와 같은 인 비보 부위에서, 예를 들어, 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 국소화 및/또는 지속(persistence)을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 검출가능한 모이어티와 커플링된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 당 분야에서 알려진 어떠한 적합한 방법에 의해 인 비보로 검출될 수 있다. 검출가능한 모이어티와 연결된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 또한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여 후 피험자로부터 얻은 단리된 조직 및 액(fluid) 시료와 같은 단리된 생물학적 시료에서 검출될 수 있다.
1. 병원성 감염의 인 비트로 검출
일반적으로, RSV는 피험자 또는 환자로부터 얻은 생물학적 시료(예를 들어, 혈액, 혈청, 객담 소변 및/또는 다른 적절한 세포들 또는 조직들)에서 하나 이상의 RSV 단백질들 및/또는 이러한 단백질들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들의 존재에 기초하여 피험자 또는 환자에서 검출될 수 있다. 이러한 단백질들은 피험자 또는 환자에서 RSV 존재 또는 부존재를 가리키는 마커로서 사용될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 생물학적 시료에서 약제에 결합하는 항원 및/또는 에피토프의 수준을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
시료에서 폴리펩티드 마커를 검출하기 위한 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 것에 대한 다양한 분석 포맷들이 당 분야의 당업자에게 알려져 있다(예를 들어, Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 참조). 일반적으로, 피험자 또는 환자에서 RSV 존재 또는 부존재는 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 갖는 피험자 또는 환자로부터 얻은 생물학적 시료에 접촉시키고 시료에서 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 결합하는 폴리펩티드 수준을 검출함으로써 측정될 수 있다.
몇몇 예에서, 분석은 시료의 나머지(remainder)로부터 표적 폴리펩티드에 결합하고 제거하도록 고체 지지체에 고정화된 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 사용을 포함한다. 결합된 폴리펩티드는 그리고 나서 리포터 그룹을 포함하며 항체/폴리펩티드 복합체에 특이적으로 결합하는 검출 시약을 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 검출 시약들은, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 항체에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 결합제에 특이적으로 결합하는 다른 제제를 포함할 수 있다.
몇몇 예에서, 폴리펩티드를 리포터 그룹으로 표지하고 시료와 함께 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 배양한 후 고정화된 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 결합하도록 허용하는 경쟁적 분석이 사용될 수 있다. 시료의 구성성분들이 표지된 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 대한 폴리펩티드의 결합을 억제하는 정도는 고정화된 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과의 시료의 반응성을 보여준다. 상기 설명한 바와 같이, 이러한 분석에 사용하는데 적합한 폴리펩티드들은 전체 길이 RSV F 단백질들 및 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 결합하는 RSV F 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 그(전장 RSV F 단백질들)의 부분들(portions)을 포함한다.
고체 지지체는 단백질에 부착될 수 있는 당 분야의 당업자에게 알려진 어떠한 물질일 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 마이크로타이터 플레이트 내의 테스트 웰 또는 니트로셀룰로오스 또는 다른 적합한 막이 될 수 있다. 지지체는 또한 글라스, 섬유글라스, 라텍스와 같은 비드(bead) 또는 디스크(disc) 또는 폴리스티렌(polystyrene) 또는 폴리비닐클로라이드(polyvinyl chloride)와 같은 플라스틱 물질일 수 있다. 지지체는 또한 마그네틱 입자 또는 예를 들어, 미국특허번호 5,359,681호에서 개시된 것과 같은 광섬유 센서일 수 있다. 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 당 분야의 당업자에게 알려진 다양한 기술들을 사용하여 고체 지지체에 고정될 수 있다. 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 마이크로타이터 플레이트 또는 막에 흡착시킴으로써 고정화될 수 있다. 이러한 경우에는, 흡착은 적합한 양의 시간 동안, 고체 지지체와 함께, 적합한 완충용액에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다양하나, 일반적으로 약 1 시간 및 약 1 일 사이이다. 일반적으로, 약 10 ng 내지 약 10 ㎍, 및 일반적으로 약 100 ng 내지 약 1 ㎍ 범위 양의 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 플라스틱 마이크로타이터 플레이트(폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드와 같은)의 웰에 접촉하는 것은 적절한 양의 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 고정화시키는데 충분하다.
항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 고체 지지체의 공유부착(covalent attachment)은 일반적으로 먼저 지지체와 지지체 및 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편 상의 하이드록시기 또는 아미노기와 반응하는 이작용기성 시약을 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 벤조퀴논을 사용하여 적절한 폴리머 코팅을 갖는 지지체와 공유결합되거나 지지체 상의 알데하이드 그룹과 결합 파트너 상의 아민 및 활성 수소의 축합에 의해 공유적으로 부착될 수 있다(Pierce immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, A12 내지 A13 참조).
몇몇 예에서, 분석은 플로우-쓰로우(flow-through) 또는 스트립 테스트 포멧으로 수행될 수 있으며, 여기서 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 니트로셀룰로오스와 같은 막 상에 고정된다. 플로우-쓰로우 테스트에서, 시료 내의 폴리펩티드들은 시료가 막을 통과할 때 고정된 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 결합한다. 두 번째, 표지된 결합제는 그리고나서 제2 결합제를 포함하는 용액이 막을 통해 흐를 때 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편-폴렙펩티드 복합제와 결합한다.
제공된 RSV 단백질들 또는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들과 함께 사용하기 위해 적합한 분야의 추가적인 분석 프로토콜이 존재한다. 상기 설명은 단지 예시하기 위한 목적에 의한 것이다. 예를 들어, 생물학적 시료에서 이러한 폴리펩티드와 결합하는 항체들을 검출하기 위해 RSV 폴리펩티드를 사용하는 것을 쉽게 변경할 수 있음을 당 분야의 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 단백질-특이적 항체들의 검출은 RSV 감염의 동정을 가능하게 한다.
감도를 향상시키기 위하여, 다중 RSV 단백질 마커들이 특정 시료 내에서 분석될 수 있다. 다른 RSV 폴리펩티드들에 특이적인 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들이 단일 분석 내에서 병용될 수 있음이 명백할 것이다. 또한 다중 프라이머들 또는 프로브들이 동시에 사용될 수 있다. RSV 단백질 마커들의 선택은 최적의 민감도가 생기는 조합들을 결정하기 위한 일상적인 실험들을 기초로 할 수 있다. 또한, 또는 그 대신에, 본 발명에서 제공되는 RSV 단백질에 대한 분석은 다른 알려진 RSV 항원들에 대한 분석들과 함께 병행될 수 있다.
2. 병원성 감염의 인 비보 검출
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 인 비보 진단제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 예를 들어, 자기공명 영상, X-선 영상, 컴퓨터화된 방출 단층촬영 및 다른 이미지 기술들과 같은 검출 방법들을 사용하는 감염된 조직들(예를 들어, 폐 내의 RSV 감염)의 이미지를 제공할 수 있다. RSV 감염된 조직들의 이미지화를 위하여, 예를 들어, 항-RSV 항체의 항체 부분이 일반적으로 RSV에 결합될 것이고(예를 들어, RSV F 단백질 에피토프), 영상화제(imaging agent)는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 커플링된 상자성(paramagnetic), 방사성 또는 형광 제제과 같은 이미지를 검출할 수 있는 제제일 것이다. 일반적으로, 진단제로서의 사용을 위해, 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 직접적으로 또는 간접적으로 이미지화제에 커플링될 수 있다.
많은 적절한 이미지화제는, 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들에 대한 그들의 부착을 위한 방법들과 같이, 당 분야에 알려져 있다(예를 들어, 미국특허번호 제5,021,236호 및 제4,472,509호 참조). 예시적인 부착 방법들은, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 부착된 DTPA와 같은 유기 킬레이트제를 사용하는 금속 킬레이트 복합체의 사용을 포함한다(미국특허번호 제4,472,509호). 항체들은 또한 글루타르알데하이드 또는 페리오데이트와 같은 커플링제 존재 하에서 효소와 반응시킬 수 있다. 플루오레세인 마커와의 컨쥬게이트들은 커플링화제들 존재 하에서 제조되거나 이소티오시아네이트와 반응시켜 제조된다.
인 비보 진단 영상을 위해, 특정한 방사능 동위원소를 선택할 때 사용이능한 검출 장치의 종류가 고려된다. 선택된 방사능 동위원소는 특정한 종류의 장치로 검출할 수 있는 붕괴의 종류를 갖는다. 인 비보 진단을 위한 방사능 동위원소의 선택에 있어서의 다른 인자는 방사능 동위원소의 반감기가 표적에 의해 최대 흡수 시간(time of maximum uptake)에도 여전히 검출할 수 있도록 충분히 길며, 숙주에 대하여 해로운 방사능을 최소화하도록 충분히 짧아야 한다는 것이다. 일반적으로, 인 비보 이미지에 사용되는 방사능 동위원소는 입자 방출이 부족할 것이나, 140 내지 250 keV 범위에서 다수의 양자를 생성할 것이며, 이는 종래의 감마 카메라에 의해 쉽게 검출될 수 있다.
인 비보 진단을 위해, 방사능 동위원소들은 중간 작용기(intermediate functional group)을 사용함으로써 본 발명에서 제공되는 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들과 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 금속 이온들로서 존재하는 방사능 동위원소들을 항체에 결합시키는데 사용될 수 있는 예시적인 중개자 작용기들은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)과 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 유사한 분자들과 같은 이작용기성 킬레이트제를 포함한다. 제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들에 결합될 수 있는 금속이온들의 예로는 72비소, 211아스타틴, 14탄소, 51크롬, 36염소, 57코발트, 58코발트, 67구리, 152유로퓸, 67갈륨, 68갈륨, 3수소, 123요오드, 125요오드, 131요오드, 111인듐, 59철, 32인, 186레늄, 188레늄, 97루테늄, 75셀렌, 35황, 99m테크니슘(99 mTechnicium), 201타륨, 90이트륨 및 89지르코늄을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 자기공명이미지(MRI) 또는 전자스핀공명(ESR) 경우와 같이, 인 비보 진단의 목적을 위해 상자성 방사능 동위원소로 표지될 수 있다. 일반적으로, 진단 이미지를 시각화하기 위한 어떠한 종래의 방법도 사용될 수 있다. 일반적으로, 감마 및 양전자 방출 방사능들이 카메라 이미지에 사용되고, 상자성 방사능들이 MRI에 사용된다. 이러한 기술들에 바람직하게 유용한 원소들은 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, 및 56Fe를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 상자성 이온들은 크롬(III), 망간(II), 철 (III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 다스프로슘(III), 홀뮴(III) 및 에르븀(III)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, X-선 이미지에 있어서, 유용한 이온들로는 란탄(III), 금(III), 납(II) 및 비스무트(III)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
투여된 검출가능하게 표지된 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 농도는 RSV와의 결합이 백그라운드(background)와 비교할 때 검출가능할 정도이면 충분하다. 또한, 최고의 표적 대 백그라운드 신호 비율을 위해, 검출가능하게 표지된 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 순환계로부터 빠르게 제거되는 것이 바람직하다.
인 비보 진단을 위해 검출가능하게 표지된 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여량은 나이, 성별, 개인의 질환 정도와 같은 인자에 따라 다양할 것이다. 인간 단일클론 항체의 투여량은, 예를 들어, 약 0.1 ㎎/㎡ 내지 약 500 ㎎/㎡, 0.1 ㎎/㎡ 내지 약 200 ㎎/㎡, 또는 약 0.1 내지 약 10 ㎎/㎡로 다양할 수 있다. 이러한 투여량들은, 예를 들어, 다중 주입이 제공되었는지 여부, 조직, 및 당 분야의 당업자에게 알려진 다른 인자에 따라 다양할 수 있다.
3. 감염 모니터링
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 병원성 질환 치료의 과정을 모니터하기 위한 인 비트로 및 인 비보에 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, RSV에 감염된 세포 수의 증가 또는 감소 또는 체내 또는 다양한 체액들에 존재하는 RSV 바이러스의 농도 변화들이 측정될 수 있다. 이러한 방법들을 사용하여, 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 병원성 질환을 겨냥한 특정 치료 요법이 효과적인지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
I. 예방 및 치료 용도
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들 및 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함하는 약학적 조성물은 예방 및 치료용으로 피험자에 투여될 수 있다. 예를 들어, 제공된 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 RSV 감염과 같은 질환 또는 상태의 치료용으로 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 제공된 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 숙주의 RSV 감염의 성립(establishment)의 억제 또는 피험자 사이의 RSV 전염의 억제를 포함하나, 이에 제한되지 않는 RSV 감염의 예방 및 또는 확산과 같은 예방적 용도로 피험자에게 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 피험자의 RSV 바이러스 로드를 감소 용도로 피험자에 투여될 수 있다. 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 또한 RSV 감염의 하나 이상의 증상들을 예방, 치료, 및/또는 완화 또는 RSV 감염의 감소의 감소 용도로 피험자에게 투여될 수 있다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편 부존재인 경우의 RSV 감염의 발생에 대하여 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 65%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 55%, 적어도 또는 약 50%, 적어도 또는 약 45%, 적어도 또는 약 40%, 적어도 또는 약 35%, 적어도 또는 약 30%, 적어도 또는 약 25%, 적어도 또는 약 20%, 적어도 또는 약 15%, 또는 적어도 또는 약 10% 만큼 RSV 감염의 발생을 억제시킨다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편 부존재인 경우의 RSV 감염의 하나 이상의 증상들의 심각도(severity)에 대하여 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 65%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 55%, 적어도 또는 약 50%, 적어도 또는 약 45%, 적어도 또는 약 40%, 적어도 또는 약 35%, 적어도 또는 약 30%, 적어도 또는 약 25%, 적어도 또는 약 20%, 적어도 또는 약 15%, 또는 적어도 또는 약 10% 만큼 RSV 감염의 하나 이상의 증상들의 심각도를 감소시킨다.
1. 치료를 위한 피험자들
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 치료에 대한 피험자 또는 지원자는 RSV 바이러스에 노출된 인간 환자와 같은 피험자, RSV 감염의 하나 이상의 증상들을 나타내는 인간 환자와 같은 피험자 및 RSV 감염의 위험에 처한 인간 환자와 같은 피험자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 RSV 바이러스 감염들은, 예를 들어, 세기관지염 및 폐렴을 포함하는 급성 RSV 질환, RSV 상기도 감염(upper respiratory tract infection; URI) 및/또는 RSV 하 기도 감염(LRI)과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 RSV 바이러스들에 의해 생긴 것들을 포함한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 치료에 대한 피험자는 포유류이다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 치료에 대한 피험자는 영장류이다. 특정 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 치료에 대한 피험자는 인간이다.
제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 어떤 RSV-매개 질환의 치료를 위해 인간 환자와 같은 피험자에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 천식, 천명(wheezing), 반응성 기도 질환(reactive airway disease; RAD), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 RSV 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상들 또는 상태들을 경감시키기 위해 피험자에 투여될 수 있다. 이러한 질환들 및 상태는 잘 알려져 있으며, 의사 또는 당업자에 의해 쉽게 진단된다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 재발된 RSV 바이러스-매개 질환의 유지 또는 억제 요법(maintenance or suppression therapy)을 위해 RSV 바이러스 감염을 갖는 인간 환자와 같은 피험자에 투여될 수 있다.
제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 미숙아로 태어난 유아(조산아)(a prematurely born (pre-term) infant)(예를 들면, 예를 들어, 29주차, 30주차, 31주차, 32주차, 33주차, 34주차, 35주차, 36주차 또는 37주차 수태령과 같은 38주차 수태령 미만의 인간 유아); 유아(예를 들어, 37주차 수태령 초과의 인간 유아); 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 기관지폐이형성증(bronchopulmonary dysplasia), 선천성 심장질환(congenital heart disease), 선천성 면역 결핍증(congenital immunodeficiency), 또는 후천성 면역 결핍증(acquired immunodeficiency) (예를 들어, AIDS 환자), 백혈병(leukemia), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma)을 갖는 피험자, 예를 들어, 이식(예를 들어, 골수 이식 또는 신장 이식)의 수혜자와 같은 면역이 억제된 환자, 또는 양로원들(nursing homes) 또는 재활센터들(rehabilitation centers)의 개인들을 포함하는 노령 피험자를 포함하나, 이에 제한되지 않은 RSV 바이러스 감염의 위험에 처한 인간 환자와 같은 피험자에 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 취학 연령의 동기들을 갖는 보육원에 출석하는 것, 환경의 대기오염에 노출, 선천성 기도 이상(congenital airway abnormalities), 및/또는 심각한 근신경계 질환(neuromuscular disease)과 같으나, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 환경적 위험 인자들에 노출된 미숙아 또는 유아와 같은 피험자에 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 만성 폐질환 또는 선천성 심부전(heart failure), 폐고혈압(pulmonary hypertension), 및 청색증성 심장질환(cyanotic heart disease)을 포함하는 선천성 심장병을 갖는 유아 또는 2세 미만의 어린이와 같은 피험자에 투여될 수 있다.
다양한 병원체들 및 병원성 감염에 대한 테스트들이 당 분야에 알려져 있고, 피험자가 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 치료에 대한 지원자가 될지 아닐지를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, RSV 바이러스 감염에 대한 테스트들이 알려져 있으며, 예를 들어, 바이러스 배양 플라크 분석, 항원 검출 테스트, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 테스트들 및 다양한 항체 혈청학적 테스트를 포함한다. 바이러스 감염에 대한 테스트들은 조직 또는 척수액, 혈액, 또는 소변과 같은 액 시료들로부터 얻은 시료들로 수행할 수 있다. 추가적인 테스트들은 폐렴의 징후를 보여줄 수 있는 흉부 X-선, 화학 스크리닝, 전혈구 계수(complete blood count) 또는 동맥혈 가스(ABGs) 분석과 같은 다른 혈액 테스트들, 및 혈액내 산소량을 측정하기 위한 산소측정법(oximetry)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 1 년 중 특정시기 동안 RSV 감염의 위험이 증가한 피험자에 투여될 수 있다. RSV 시즌은 일반적으로 10월로부터 5월에 걸친다. 유아 노인, 또는 면역저하 환자와 같이 이 시기 동안 바이러스 감염에 대한 증가된 감수성을 나타내는 피험자들은, RSV 시즌 바로 전 또는 RSV 시즌 동안 RSV 감염의 예방 및/또는 치료를 위해 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들이 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 RSV 시즌 동안 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 투여된다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 RSV 시즌 전 한 달, 두 달 또는 세 달 내에 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 투여된다.
2. 투여량
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 처리된 환자에 바람직하지 않은 부작용들 없이 치료적으로 유용한 효과를 발휘되도록 충분한 양으로 투여된다. 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료적으로 유효한 농도는 본 발명에서 제공되거나 당 분야에 알려진 분석을 사용하는 것에 의한 것과 같이 알려진 인 비트로 및 인 비보 시스템들에서 폴리텝티드들을 테스트하는 것에 의해 경험적으로(empirically) 결정될 수 있다.
치료적으로 투여되기 위한 유효량의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어, 치료적 목적들, 투여 경로, 및 환자의 상태에 의존할 것이다. 또한, 주치의는 질환의 심각도 및 유형, 환자의 건강, 체중, 성별, 식이요법, 시간 및 투여 경로를 포함하는 약물들의 작용을 변경하는 것으로 알려진 다양한 인자들, 다른 약물 들 및 다른 관련된 임상적 인자들을 고려한다. 따라서, 임상의는 최적의 치료 효과를 얻기 위해 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여량을 적정하고, 요구되는 바와 같이 투여 경로를 변경할 필요가 있을 것이다. 일반적으로, 임상의는 투여량이 원하는 효과를 달성할 때까지 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여할 것이다. 이 치료의 진행은 종래의 분석들에 의해 쉽게 모니터될 수 있다. 바이러스 감염의 치료를 모니터하기 위한 예시적인 분석들이 당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 바이러스 역가 분석을 포함한다.
일반적으로, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 투여를 위한 투여량 범위들은 병원체 매개 질환(예를 들어, 바이러스 질환)의 증상(들)을 개선시키거나, 또는 바이러스 감염 가능성을 감소시키는 원하는 효과를 야기할만큼 크다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 피험자에 면역 반응을 유도하기 위해 유효량이 투여된다. 투여량은 고점도 증후군(hyperviscosity syndromes), 폐부종(pulmonary edema) 또는 선천성 심부전과 같은 불리한 부작용들이 야기되지 않을 만큼 크지 않다. 일반적으로, 투여량은 환자의 나이, 상태, 성별 및 질환 정도에 따라 다양할 것이며, 당 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 만일 어떤 불리한 부작용의 출현이 생기면 개별 의사에 의해 조정될 수 있다. RSV 감염의 예방 또는 치료 및/또는 RSV 감염의 하나 이상의 증상들의 개선을 위한 예시적인 투여량들은, 예를 들어, 약 또는 0.01 ㎎/㎏, 약 또는 0.1 ㎎/㎏, 약 또는 0.5 ㎎/㎏, 약 또는 1 ㎎/㎏, 약 또는 5 ㎎/㎏, 약 또는 10 ㎎/㎏, 약 또는 15 ㎎/㎏, 약 또는 20 ㎎/㎏, 약 또는 25 ㎎/㎏, 약 또는 30 ㎎/㎏, 약 또는 35 ㎎/㎏, 약 또는 40 ㎎/㎏, 약 또는 45 ㎎/㎏, 약 또는 50 ㎎/㎏, 약 또는 100 ㎎/㎏, 약 또는 150 ㎎/㎏, 약 또는 200 ㎎/㎏, 약 또는 250 ㎎/㎏,또는 약 또는 300 ㎎/㎏과 같은 약 또는 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 또는 300 ㎎/㎏를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편들은 원하는 혈청 역가를 달성하기 위한 유효 투여량으로 피험자에 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, RSV 감염의 예방 또는 치료 및/또는 RSV 감염의 하나 이상의 증상의 개선을 위해, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 투여 후에 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 다음 투여 전에, 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일 또는 40일에서, 적어도 또는 약 1㎍/㎖, 적어도 또는 약 2㎍/㎖, 적어도 또는 약 3㎍/㎖, 적어도 또는 약 4㎍/㎖, 적어도 또는 약 5㎍/㎖, 적어도 또는 약 6㎍/㎖, 적어도 또는 약 7㎍/㎖, 적어도 또는 약 8㎍/㎖, 적어도 또는 약 9㎍/㎖, 적어도 또는 약 10㎍/㎖, 적어도 또는 약 15㎍/㎖, 적어도 또는 약 20㎍/㎖, 적어도 또는 약 25㎍/㎖, 적어도 또는 약 30㎍/㎖, 적어도 또는 약 40㎍/㎖, 적어도 또는 약 50㎍/㎖, 적어도 또는 약 60㎍/㎖, 적어도 또는 약 70㎍/㎖, 적어도 또는 약 80㎍/㎖, 적어도 또는 약 90㎍/㎖ 또는 적어도 또는 약 100㎍/㎖의 혈청 역가가 달성하기 위한 유효량으로 투여될 수 있다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 폐들로부터의 삽관(intubation) 샘플, 객담, 또는 세척액(lavage)에서 바람직한 역가를 달성하기 위한 유효량으로 피험체에 폐전달에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시예들에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, RSV 감염의 예방 또는 치료 및/또는 RSV 감염의 하나 이상의 증상의 개선을 위해, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 투여의 투여 후에 및 항체 또는 항원-결합 단편의 다음 투여(dose) 투여 전에, 약 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일 또는 40일에서, 폐들로부터의 삽관 샘플 또는 세척액에 있어서 10ng/㎎(폐 단백질 ㎎ 당 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편 ng) 또는 약 10ng/㎎, 15ng/㎎ 또는 약 15ng/㎎, 20ng/㎎ 또는 약 20ng/㎎, 25ng/㎎ 또는 약 25ng/㎎, 30ng/㎎ 또는 약 30ng/㎎, 40ng/㎎ 또는 약 40ng/㎎, 50ng/㎎ 또는 약 50ng/㎎, 60ng/㎎ 또는 약 60ng/㎎, 70ng/㎎ 또는 약 70ng/㎎, 80ng/㎎ 또는 약 80ng/㎎, 90ng/㎎ 또는 약 90ng/㎎, 100ng/㎎ 또는 약 100ng/㎎, 110ng/㎎ 또는 약 110ng/㎎, 120ng/㎎ 또는 약 120ng/㎎, 130ng/㎎ 또는 약 130ng/㎎, 140ng/㎎ 또는 약 140ng/㎎ 또는 150ng/㎎ 또는 약 150ng/㎎의 역가를 달성하기 위한 유효량으로 투여될 수 있다.
바이러스 감염의 치료를 위하여, 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 투여량은 질환의 종류 및 심각도에 따라 다양할 수 있다. 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 단일 복용(single dose), 다중 분리 투여들, 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 며칠 또는 그 이상을 넘어 반복된 투여 동안에, 상태에 따라, 치료는 질환 증상들의 원하는 억제가 일어나거나 환자 상태에 있어서의 바람직한 개선이 달성될 때가지 반복될 수 있다. 반복된 투여들을 치료의 진행에 따라 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 증가된 또는 감소된 투여량을 포함한다. 다른 투여 요법들(dosage regimens)이 또한 고려된다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 하루에 또는 며칠 이상에 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 이상 투여될 수 있다. 특정 실시예들에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 이상 RSV 감염의 예방 또는 치료 및/또는 하나 이상의 RSV 감염의 증상의 개선을 위해 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제1 투여, 제2 투여, 제3 투여, 제4 투여, 제5 투여, 제6 투여, 제7 투여, 제8 투여, 제9 투여 후에 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 이후 투여 전에 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일, 40일에, 적어도 또는 약 1㎍/㎖, 적어도 또는 약 2㎍/㎖, 적어도 또는 약 3㎍/㎖, 적어도 또는 약 4㎍/㎖, 적어도 또는 약 5㎍/㎖, 적어도 또는 약 6㎍/㎖, 적어도 또는 약 7㎍/㎖, 적어도 또는 약 8㎍/㎖, 적어도 또는 약 9㎍/㎖, 적어도 또는 약 10㎍/㎖, 적어도 또는 약 15㎍/㎖, 적어도 또는 약 20㎍/㎖, 적어도 또는 약 25㎍/㎖, 적어도 또는 약 30㎍/㎖, 적어도 또는 약 40㎍/㎖, 적어도 또는 약 50㎍/㎖, 적어도 또는 약 60㎍/㎖, 적어도 또는 약 70㎍/㎖, 적어도 또는 약 80㎍/㎖, 적어도 또는 약 90㎍/㎖, 적어도 또는 약 100㎍/㎖의 혈청 역가(serum titer)를 달성하는 유효량(amount effective)으로 투여된다. 특정 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 4회 RSV 감염의 예방 또는 치료 및/또는 하나 이상의 RSV 감염의 증상의 개선을 위해 제4 투여 후에 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 다음 투여 전에 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일, 40일에, 적어도 또는 약 72㎍/㎖의 혈청 역가를 달성하는 유효량으로 투여된다.
몇몇 예에서, 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 2 또는 그 이상의 투여 차례(sequence)로 투여하였고, 투여들은 선택된 시간 간격에 의해 분리하였다. 몇몇 예에서, 선택된 시간 간격은 적어도 또는 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1달, 2달, 또는 3달이다.
몇몇 예에서, RSV 시즌 바로 전에 1회 또는 그 이상으로, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 예방적으로 유효량이 투여된다. 몇몇 예에서, RSV 시즌 동안 1회 또는 그 이상 및/또는 RSV 시즌 동안 1회 또는 그 이상으로, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 예반적으로 유효량이 투여된다.
특정 투여량 또는 투여 요법의 치료적 효능은 또한, 예를 들어, 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 하나 이상의 투여량의 투여-전 및 투여 후 피험자에서 바이러스 역가 측정에 의해서 평가될 수 있다. 투여량 및/또는 투여의 빈도는 피험자에 바이러스의 원하는 제거율에 따라 변경될 수 있다.
당 분야의 당업자에 의해 이해될 것과 같이, 최적의 치료 요법은 다양할 것이며, 최적의 치료 투여량 및 투여 빈도를 결정하기 위해 하나 이상의 치료의 사이클(cycle) 전, 및 후의 환자의 질환의 상태 및 전반적인 건강을 평가하는 것은 치료 방법의 범위에 속한다. 이것은 또한 어떤 특정 피험자를 위하여, 특정한 투여 요법들이, 개별적인 요구 및 약학적 제제들을 투여하거나 투여를 감독하는 인간의 전문적인 판단에 따라 시간에 지남에 따라 조절될 수 있고, 본 발명에서 열거된 투여들은 단지 예시적인 것이며 이의 범위를 제한하기 위한 것이 아니라는 것으로 이해될 것이다. 질환 또는 상태의, 예를 들어 바이러스 감염(예를 들어, RSV 바이러스 감염), 치료를 위해 투여될 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 양은, 표준 임상 기술(예를 들어, 바이러스 역가 또는 항원 검출 분석들)에 의해 결정될 수 있다. 또한, 인 비트로 분석들 및 동물 모델들이 최적의 투여 범위들을 확인하는데 도움을 주는데 사용될 수 있다. 동물 모델들을 기초로 최적 투여 범위들을 확인하는 방법들은 당 분야 당업자에게 잘 알려져 있다.
3. 투여 경로
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 예를 들어, 전신 또는 국소 투여를 포함하는 폴리펩티드들의 투여를 위한 당 분야에 알려진 어떤 방법에 의해 피험자에 투여할 수 있다. 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 피험자에 비경구의(예를 들어, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 또는 강내(intracavity)), 국소(topical), 경막외(epidural) 또는 점막(예를 들어, 비강의 또는 경구의)과 같은 경로에 의해 투여될 수 있다. 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 피험자에 국소의 활동(exertion) 또는 경피성 작용을 위해 질환 부위에 외부로부터 투여될 수 있다. 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함하는 조성물들은, 예를 들어, 주입(injection) 또는 정맥 주사(bolus injection)에 의해, 상피 또는 점막피부 내층(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막)를 통한 흡수에 의해, 어떤 종래의 경로에 의해 투여될 수 있다. 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함하는 조성물들은, 다른 생물학적으로 활성인 제제들과 함께 투여될 수 있다. 투여 방식은, RSV 바이러스와 같은 바이러스에 감염된, 오염된 또는 관련된 액, 세포들, 또는 조직들에 접촉이 일어날 수 있는 신체 위, 내부 또는 주위 영역들에 조성물의 국소적 또는 다른 투여를 포함할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 폐(예를 들어, 폐의 에어로졸)와 같은 표적 기관들에 직접적으로 전달하기 위해 국소적 또는 에어로졸 경로들에 의해 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 제공된 항-RSV 항체들 또는 이이 항원 결합 단편은 펌프와 같은(예를 들어, Langer (1990) Science 249:1527-1533; Sefton (1987) CRC Crit . Ref . Biomed . Eng . 14:20; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507; 및 Saudek et al. (1989) N. Engl . J. Med. 321:574 참조) 또는 당 분야 알려지고 본 발명에서 여러 곳에서 설명된 다양한 폴리머의 사용을 통해 조절 방출 제제로서 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 조절된 또는 지속된 방출 시스템은 치료의 표적에, 예를 들어, 폐들에, 근접하여 위치될 수 있으며, 따라서 단지 전신 용량의 일부(fraction)만이 요구될 수 있다(예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138(1984) 참조).
특정 예에서, 제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 폐 전달 의해 투여될 수 있다(예를 들어, 미국특허번호 제6,019,968호, 제5,985,320호, 제5,985,309호, 제5,934,272호, 제5,874,064호, 제5,855,913호, 제5,290,540호, 및 제4,880,078호; PCT 공개번호 제WO 92/19244호, 제WO 97/32572호, 제WO 97/44013호, 제WO 98/31346호, 및 제WO 99/66903호 참조). 폐 전달의 예시적인 방법들은 당 분야에 알려져 있으며, 흡입기들(예를 들어, 가압 정량식 흡입기들(pressurized metered dose inhalers; MDI), 건조 분말 흡입기들(dry powder inhalers ; DPI), 네뷸라이저들(예를 들어, 제트(jet) 또는 초음파 네뷸라이저들(nebulizers)) 및 다른 단일 호흡 액체 시스템들), 기관내 점적 투여(instillation) 및 흡입제(insufflation)와 같은 에어로졸 방법들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 예에서, 폐 전달은 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들과, 예를 들어, 계면활성제, 지방산, 당류, 킬레이트제 및 프로테아제 저해제와 같은 효소 저해제와 같은 침투증강제를 포함하는 복합제제(co-formulation)의 투여 또는 공동 투여(co-administration)에 의해 증진될 수 있다.
폐 전달과 같은 전달을 위한 적절한 방법은 당 분야의 당업자에 의해 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물의 투여량의 특성들을 기초로 선택될 수 있다. 이러한 특성은 용해도, 흡습성(hygroscopicity), 결정 특성들, 녹는점, 밀도, 점도, 프플로우(flow), 안정도 및 분해 프로파일을 포함하고, 이에 제한되지 않는다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 바이러스에 대한 점막면역효능을 증가시킨다. 따라서, 특정 실시예들에서, 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 점막 표면에 투여된다. 예를 들어, 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 경구의(예를 들어, 구강의(buccal), 설하선(sublingual)), 눈의(예를 들어, 각막의(corneal), 결막의(conjunctival), 눈으로(intravitreally), 내-수용성 주입(intra-aqueous injection)), 비강내의(intranasal), 생식기의(genital)(예를 들어, 질의(vaginal)), 직장의(rectal), 폐의(pulmonary), 위의(stomachic), 또는 장(intestinal)과 같은 경로로 전달될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 예를 들어, 주사(injection)에 의해 또는 시간이 지남에 따라 점진적인 주입(infusion) 또는 장용제(enterally)(즉, 소화관(digestive tract))에 의해 비경구적으로(parenterally)와 같은, 전신적으로(systemically) 투여될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 또한 예를 들어, 액체 용액들, 젤들, 연고들(ointments), 분말들(powders)의 국소 장치(installation) 또는 장치(application)(예를 들어, 기관지경(bronchoscope) 또는 다른 인공기도기(artificial airway)를 사용하는 기관내 장치(intratracheal installation) 및 흡입제(insufflation))에 의해, 또는 흡입제(예를 들어, 비강 스프레이(nasal spray), 흡입기들(예를 들어, 가압 정량식 흡입기들(MDI), 건조 분말 흡입기들(DPI), 네뷸라이저들(예를 들어, 제트 또는 초음파 네뷸라이저들) 및 다른 단일 호흡 액체 시스템들)에 의해 국소적으로(topically) 투여될 수 있다. 투여는 바이러스들의 노출 전 또는 바이러스 노출 이후에 수행될 수 있다.
4. 병용 치료법( Combination therapies )
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 질환 또는 상태의 예방 및/또는 치료를 위한 하나 이상의 치료제들 또는 치료와 병행되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 예방을 위한 하나 이상의 바이러스제들과 병용하여 투여될 있다. 또 다른 예에서, 호흡기 바이러스 감염과 같은 바이러스 감염의 예방을 위한 하나 이상의 항바이러스제들과 병용되어 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 호흡기 바이러스 감염은 RSV 감염이다. 항바이러스제들은 병원성 감염을 감소시키거나 및/또는 제거하는 제제들 또는 병원성 감염의 하나 이상의 증상을 경감시키는 제제들을 포함할 수 있다. 몇몇 예에서, 다수의 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은(예를 들어, 하나 이상의 항바이러스성 항체들) 또한 병용되어 투여될 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 항체들은 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
몇몇 예에서, 다수의 항체들은 RSV 감염 또는 다중 바이러스 감염들이 예방을 위해 병용되어 투여될 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 항체는 본 발명의 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이다. 또 다른 예에서, 다수의 항체가 RSV 감염 또는 다중 바이러스 감염의 치료를 위해 병용되어 투여될 수 있고, 여기서 적어도 하나의 항체들은 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 몇몇 예에서, 제공된 항-RSV 항체들은 RSV와 같은 바이러스에 결합하고 중화시키는 하나 이상의 항바이러스성 항체들과 병용되어 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 RSV 감염과 같은 바이러스 감염의 하나 이상의 증상들을 억제시킬 수 있거나 경감시킬 수 있는 하나 이상의 항체들과 병용되어 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 둘 또는 그 이상의 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 병용되어 투여될 수 있다.
하나 이상의 추가적인 제제들이 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 동시에, 순차적으로 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 제제들은, 예를 들어, 동일 약학적 조성물의 일부 또는 동일 전달 방법으로서 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 공동 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 제제들은 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 동시에, 그러나 다른 전달 수단들에 의해 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 공동 투여될 수 있다. 제제들은 또한 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여와 다른 시간에 투여할 수 있으나, 결합된 예방적 또는 치료적 효과를 가지기 위하여 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여에 충분히 근접한 시간에 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 추가적인 제제들은 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여 다음 또는 그 전에 선택된 시간 간격에 의해 분리되어 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 시간 간격은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1달, 2달, 또는 3달이다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 추가적인 제제들은 여러 번 투여되며, 및/또는 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 여러 번 투여된다.
몇몇 예에서, 병용의 투여는 병용의 부존재 시 감염의 발생에 대하여 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 65%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 55%, 적어도 또는 약 50%, 적어도 또는 약 45%, 적어도 또는 약 40%, 적어도 또는 약 35%, 적어도 또는 약 30%, 적어도 또는 약 25%, 적어도 또는 약 20%, 적어도 또는 약 15%, 또는 적어도 또는 약 10% 만큼 RSV 감염의 발생을 억제한다. 몇몇 예에서, 병용의 투여는 병용의 부존재 시 RSV 감염의 하나 이상의 증상들의 감염의 심각도에 대하여, 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 65%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 55%, 적어도 또는 약 50%, 적어도 또는 약 45%, 적어도 또는 약 40%, 적어도 또는 약 35%, 적어도 또는 약 30%, 적어도 또는 약 25%, 적어도 또는 약 20%, 적어도 또는 약 15%, 또는 적어도 또는 약 10% 만큼 RSV 감염의 하나 이상의 증상들의 감염의 심각도를 감소시킨다.
몇몇 예에서, 병용은 병용의 부존재 시 RSV의 이의 숙주 세포의 수용체에 대한 결합에 대하여, 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 65%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 55%, 적어도 또는 약 50%, 적어도 또는 약 45%, 적어도 또는 약 40%, 적어도 또는 약 35%, 적어도 또는 약 30%, 적어도 또는 약 25%, 적어도 또는 약 20%, 적어도 또는 약 15%, 또는 적어도 또는 약 10% 만큼 RSV의 이의 숙주 세포의 수용체에 대한 결합을 억제한다. 몇몇 예에서, 병용은 병용의 부존재 시 RSV 복제에 대하여, 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 65%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 55%, 적어도 또는 약 50%, 적어도 또는 약 45%, 적어도 또는 약 40%, 적어도 또는 약 35%, 적어도 또는 약 30%, 적어도 또는 약 25%, 적어도 또는 약 20%, 적어도 또는 약 15%, 또는 적어도 또는 약 10% 만큼 RSV 복제를 억제한다.
RSV 감염 또는 이의 하나 이상의 증상들의 예방, 관리, 치료, 또는 개선하는데 유용하다고 알려지거나 또는 사용되거나 또는 사용되어온 어떤 치료가 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 병용되어 사용될 수 있다(Gilman et al., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, 2001; The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Berkow, M. D. et al. (eds.), 17th Ed., Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, Rahway, N.J., 1999; Cecil Textbook of Medicine, 20th Ed., Bennett and Plum (eds.), W.B. Saunders, Philadelphia, 1996, RSV 감염 또는 이의 하나 이상의 증상들의 예방, 치료, 관리, 또는 개선하는데 사용되어 왔거나 사용되는 치료들(예를 들어, 예방 또는 치료제들에 관한 정보에 대하여 참조). 이러한 제제들의 예들은 면역조절제들(immunomodulatory agents), 항염증제(예를 들어, 아드레노코르티코이드들(adrenocorticoids), 코르티코스테로이드들(corticosteroids)(예를 들어, 베클로메타손(beclomethasone), 부데소니드(budesonide), 플루니솔리드(flunisolide), 플루티카손(fluticasone), 트리암시놀론(triamcinolone), 메틸프레드니솔론(methylprednisolone), 프레드니솔론(prednisolone), 프레드니손(prednisone), 하이드로코르티손(hydrocortisone)), 글루코코르티코이드들(glucocorticoids), 스테로이드들, 비스테로이드성 항-염증 약물들(예를 들어, 아스피린(aspirin), 이부프로펜(ibuprofen), 디클로페낙(diclofenac), 및 COX-2 억제제들), 진통제들(pain relievers), 뉴코트리엔(leukotriene) 길항제들(예를 들어, 몬테루카스트(montelukast), 메틸 잔틴들(methyl xanthines), 자퓨류카스트(zafirlukast) 및 질류톤(zileuton)), β2-작용제들(예를 들어, 밤부테롤(bambuterol), 비톨테롤(bitolterol), 클렌부테롤(clenbuterol), 페노테롤(fenoterol), 포르모테롤(formoterol), 인다카테롤(indacaterol), 이소데타린(isoetharine), 메타프로테레놀(metaproterenol), 피르부테롤(pirbuterol), 프로카테롤(procaterol), 리프로테롤(reproterol), 리미테롤(rimiterol), 살부타몰(salbutamol)(알부테롤(Albuterol), 벤톨린(Ventolin)), 레보살부타몰(levosalbutamol), 살메테롤(salmeterol), 툴로부테롤(tulobuterol) 및 테르부탈린(terbutaline)) 및 항콜린제(예를 들어, 이프라트로피움 브로마이드(ipratropium bromide) 및 옥시트로리품 브로마이드(oxitropium bromide))과 같은 기관지 확장제들(bronchodilators), 설파살라진(sulphasalazine), 페니실라민(penicillamine), 댑손(dapsone), 항히스타민들(antihistamines), 항말라리아제(예를 들어, 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine)), 및 항바이러스제들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 또한 면역글로불린의 정맥 주사, 추가 산소 및 액들의 투여 또는 보조 호흡(assisted breathing)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 RSV 감염의 치료를 위한 하나 이상의 치료와 병용되어 투여될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 또한 글루코코르티코이드들, PPARγ 리간드들, 및 혈관내피성장인자(vascular endothelial cell growth factor; VEGF)과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 폐 성숙(lung maturation) 및 표면활성제 단백질(surfactant protein) 발현을 조절하는 하나 이상의 제제들과 병용되어 투여될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 사용하는 치료와 병용하기 위해 선택될 수 있는 예시적인 항바이러스제들은 뉴클레오시드 유사체들, 뉴클레오티드 유사체들, 면역조절제들(예를 들어 인터페론들) 및 면역증강제들(immunostimulants)을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 항바이러스 화합물들, 항바이러스 단백질들, 항바이러스 펩티드들, 항바이러스 단백질 컨쥬게이트들 및 항바이러스 펩티드 컨쥬게이트들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체들 및/또는 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 및 그의 항원-결합 단편들을 사용하는 병용치료가 항체들 및/또는 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 및 그의 항원-결합 단편들과 다른 항체들 및 항-RSV 항체들 및 그의 항원-결합 단편들의 조합으로서 고려된다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들과 병용투여될 수 있는 바이러스 감염들의 치료를 위한 예시적인 항바이러스제들은 이의 토토머 형들(tautomeric forms), 유사체들(analogs), 아이소머들(isomers), 다형체들(polymorphs), 용매들(solvates), 유도체들(derivatives) 또는 염(salts)들을 포함하는, 아시클로버(acyclovir), 팜시클로버(famciclovir), 간시클로버(ganciclovir), 펜시클로버(penciclovir), 발라시클로버(valacyclovir), 발간시클로버(valganciclovir), 아이독슈리딘(idoxuridine), 트리플루리딘(trifluridine), 브리부딘(brivudine), 시도포비어(cidofovir), 도코사놀(docosanol), 포미비르센(fomivirsen), 포스카넷(foscarnet), 트로마타딘(tromantadine), 이미퀴모드(imiquimod), 포도필로톡시(podophyllotoxin), 엔테카비어(entecavir), 라미부딘(lamivudine), 텔비부딘(telbivudine), 클레부딘(clevudine), 아데포비어(adefovir), 테노포비어(tenofovir), 보세프레비어(boceprevir), 텔라프레비어(telaprevir), 플레코나닐(pleconaril), 아비돌(arbidol), 아만타딘(amantadine), 리만타딘(rimantadine), 오셀타미비어(oseltamivir), 자나미비어(zanamivir), 페라미비어(peramivir), 이노신(inosine), 인터페론(예를 들어, 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a), 리바비린(ribavirin)/타리바비린(taribavirin), 아바카비어(abacavir), 엠트리시타빈(emtricitabine), 라미부딘(lamivudine), 디다노신(didanosine), 지도부딘(zidovudine), 아프리시타빈(apricitabine), 스탐피딘(stampidine), 엘부시타빈(elvucitabine), 라시비어(racivir), 암독소비어(amdoxovir), 스타부딘(stavudine), 잘시타빈(zalcitabine), 테노포비어(tenofovir), 에파비어렌즈(efavirenz), 네비라핀(nevirapine), 에트라비린(etravirine), 닐피비린(rilpivirine), 로비리드(loviride), 델라비르딘(delavirdine), 아타자나비어(atazanavir), 포삼프레나비어(fosamprenavir), 로피나비어(lopinavir), 다루나비어(darunavir), 넬피나비어(nelfinavir), 리토나비어(ritonavir), 사퀴나비어(saquinavir), 티프라나비어(tipranavir), 암프레나비어(amprenavir), 이디나비어(indinavir), 엔푸비르티드(enfuvirtide), 마라비록(maraviroc), 비크리비록(vicriviroc), 프로 140(PRO 140), 이발리주맙(ibalizumab), 랄테그라비어(raltegravir), 엘비테그라비어(elvitegravir), 베비리맷(bevirimat), 비베콘(vivecon)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들과 병용투여될 수 있는 RSV 감염들의 예방 및/또는 치료를 위한 예시적인 항바이러스제들은 리바비린(ribavirin), NIH-351(Gemini Technologies), 재조합 RSV 백신(Aviron), RSVf-2(Intracel), F-50042(Pierre Fabre), T-786(Trimeris), VP-36676(ViroPharma), RFI-641(American Home Products), VP-14637(ViroPharma), PFP-1 및 PFP-2(American Home Products), RSV 백신(Avant Immunotherapeutics), F-50077(Pierre Fabre), 및 다른 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 또한 세포 점막 면역과 같은 세포 면역을 자극할 수 있는 하나 이상의 제제들과 병용투여될 수 있다. 세포 면역을 자극할 수 있는 어떤 제제들이 사용될 수 있다. 예시적인 면역증강제는 GM-CSF(granulocyte macrophage colony stimulating factor), 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-7(IL-7), 인터류킨-10(IL-10), 인터류킨-12(IL-12), 인터류킨-14(IL-14), 및 종양 괴사 인자(TNF)와 같은, 인터페론들(예를 들어, IFN-α, β, γ, ω), 림포카인들 및 조혈성장인자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
항병원성 제제들과의 병용치료들을 위해, 이러한 화합물의 투여를 위한 투여량들은 당 분야에서 알려져 있거나 알려진 임상적 인자(예를 들어, 피험자의 종들(species), 크기, 체표면적, 나이, 성별, 면역성(immunocompetence), 및 일반적 건강(general health), 투여 기간 및 경로, 질환의 종류 및 단계(stage), 및 다른 항-병원성 제제들과 같은 다른 치료제들을 동시에 투여하는지 여부)에 따라 당 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다.
a. 병용 치료용 항바이러스성 항체
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 하나 이상의 추가적인 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들과 병용되어 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 추가적인 항체들은 항바이러스성 항체들이다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 추가적인 항체들은 바이러스 항원에 결합한다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 추가적인 항체들은 바이러스 캡시드 단백질 또는 바이러스 외피 단백질과 같은 표면 단백질인 바이러스 항원에 결합한다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 추가적인 항체들은 감염된 세포 표면 상에 발현된 바이러스 항원에 결합한다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 추가적인 항체들은 세포내에(intracellularly)(즉, 감염된 세포 내) 발현된 바이러스 항원에 결합한다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 추가적인 항체들은 RSV, 파라인플루엔자 바이러스(PIV) 또는 인간 메타뉴모바이러스(hMPV)와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 호흡기 질환을 야기하는 바이러스에 결합한다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 병용하여 사용하기 위한 항체들은 단일클론 항체, 다중특이적 항체, 합성 항체, 인간 항체들, 인간화 항체들, 키메라 항체, 내부체(intrabodies), 단일-사슬 Fv들(scFv), 단일사슬 항체들, Fab 단편들, F(ab') 단편들, 이황화 결합된 Fv들(scFv) 및 항-이디오타입(anti-idiotypic; anti-Id) 항체들(예를 들어, 본 발명에서 제공되는 항체들에 대한 항-Id 항체들을 포함하는), 및 상기 중 어떤 것의 에피토프-결합 단편들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 병용하여 사용하기 위한 항체들은 면역글로불린 분자의 어떤 종류(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 병용하여 사용하기 위한 항체들은 조류들 및 포유류들(예를 들어, 인간, 뮤린(murine), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니 피그, 낙타, 말, 또는 닭)을 포함하는 어떤 동물 기원(origin)으로부터일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 병용하여 사용하기 위한 항체들은 인간 또는 인간화 항체일 수 있다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 병용하여 사용하기 위한 항체들은 단일특이적(monospecific), 이중특이적(bispecific), 삼중특이적(trispecific) 또는 더 큰 다중특이적(multispecificity)일 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 병용하여 사용하기 위한 항체들은 예를 들어, 공유 부착에 의한 것과 같이, 어떤 종류의 분자의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 부착에 의해 변경된 유도체 항체들을 포함한다. 예시적인 항체 또는 그의 항원-결합 단편 유도체들은 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 알려진 보호/차폐기들에 의한 유도체화, 단백질 가수분해, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 결합에 의해 변경된 항체들을 포함하거나, 또는 FcRN 수용체에 대한 높은 친화성을 갖는 이종성 Fc 도메인을 포함한다(미국특허번호 제7,083,784호 참고). 어떤 다수의 화학적 변경들이 특정 화학적 분해, 아세틸화, 포밀화 또는 투니카마이신(tunicamycin) 존재 하의 합성을 포함하나, 이에 제한되지 않는 알려진 기술들에 의해 수행될 수 있다. 또한, 유도체는 하나 이상의 비-전형적 아미노산들을 포함할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 병용하여 사용하기 위한 하나 이상의 항체들은 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 동시에, 순차적으로 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 하나 이상의 추가적인 항체들은, 예를 들어, 동일 약학적 조성물의 일부 또는 동일 전달 방법으로서 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 공동 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 추가적인 항체들은, 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 동시에, 그러나 다른 전달 수단들에 의해 공동-투여될 수 있다. 하나 이상의 추가적인 항체들은, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 다른 시간에 투여할 수 있으나, 결합된 예방적 또는 치료적 효과를 가지기 위하여 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여에 충분히 근접한 시간에 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 추가적인 항체들은 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여 다음 또는 그 전에 선택된 시간 간격에 의해 분리되어 투여될 수 있다. 몇몇 예에서, 시간 간격은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1달, 2달, 또는 3달이다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 추가적인 항체들은 여러 번 투여되며, 및/또는 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 여러 번 투여된다.
i. 항- RSV 항체
몇몇 예에서, 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들이다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 RSV 감염의 예방 및/또는 치료를 위해 하나 이상의 추가적인 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들과 함께 병용되어 투여된다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 예시적인 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, RSV에 면역특이적으로 결합하고 중화시키는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함한다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 추가적인 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 RSV A 서브타입(subtype) 및/또는 RSV B 서브타입에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, RSV 부착 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 276에 기재된 아미노산 서열을 갖는), RSV RNA 폴리머라제 베타 서브유닛 거대 구조 단백질(RSV polymerase beta subunit large structural protein)(L 단백질)(예를 들어, SEQ ID NO: 276에 기재된 아미노산 서열을 갖는), RSV 뉴클레오캡시드 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 277에 기재된 아미노산 서열을 갖는), RSV 뉴클레오단백질(N)(예를 들어, SEQ ID NO: 278에 기재된 아미노산 서열을 갖는), RSV 인단백질 P(예를 들어, SEQ ID NO: 279에 기재된 아미노산 서열을 갖는), RSV 매트릭스 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 280에 기재된 아미노산 서열을 갖는), RSV 소형 소수성(SH) 단백질(SEQ ID NO: 281에 기재된 아미노산 서열을 갖는), RSV RNA-의존성 폴리머라제, RSV F 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 282에 기재된 아미노산 서열을 갖는), RSV G 단백질(예를 들어, SEQ ID NO: 283에 기재된 아미노산 서열을 갖는), 또는 상기 중 어떤 것의 대립유전자 변이체(allelic variant)에 결합하는 항-RSV 항체를 포함한다. 특정 실시예들에서, 하나 이상의 항바이러스성 항체들은 RSV F 단백질에 결합하는 항-RSV 항체를 포함한다. 특정 실시예들에서, RSV F 단백질에 결합하는 하나 이상의 항-RSV 항체들은 RSV F 당단백질의 A, B, C, I, II, IV, V, 또는 VI 항원 부위들(antigenic sites)에 결합한다(예를 들어, Lopez et al . (1998) J. Virol. 72:6922-6928 참조).
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, 팔리비주맙(SYNAGIS®), 모타비주맙(NUMAX®), AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, (미국특허번호 제5,824,307호 및 제6,818,216호 참조), rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23 (미국특허번호 제6,685,942호 참조), RF-1, RF-2 (미국특허번호 제5,811,524호 참조), 또는 그의 항원 결합 단편들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 예에서, 병용치료를 위한 하나 이상의 항바이러스성 항체들은 팔리비주맙(SYNAGIS®), 모타비주맙(NUMAX®), AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, 또는 RF-2의 VH 사슬 및/또는 VL 사슬의 아미노산 서열을 갖는 VH 사슬 및/또는 VL 사슬을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 몇몇 예에서, 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은 팔리비주맙(SYNAGIS®), 모타비주맙(NUMAX®), AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, A4B4-F52S, rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, 또는 RF-2의 하나 이상의 CDR들(CDRs)을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 몇몇 예에서, 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은 MAb들(MAbs) 1153, 1142, 1200, 1214, 1237, 1129, 1121, 1107, 1112, 1269, 1269, 1243(Beeler et al. (1989) J. Virology 63(7):2841-2950), MAb151(Mufson et al. (1987) J. Clin. Microbiol. 25:1635-1539), MAb들 43-1 및 13-1(Fernie et al. (1982) Proc . Soc. Exp . Biol . Med . 171:266-271), MAb들 1436C, 1302A, 1308F, 및 1331H(Anderson et al . (1984) J. Clin . Microbiol. 19:934-936)와 같으나, 이에 제한되지 않는 항-RSV 마우스 단일클론항체로부터의 하나 이상의 CDR들을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료에 사용될 수 있는 추가적인 예시적인 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 예를 들어, 미국특허번호 제6,413,771호, 제5,840,298호, 제5,811,524호, 제6,656,467호, 제6,537,809호, 제7,364,742호, 제7,070,786호, 제5,955,364호, 제7,488,477호, 제6,818,216호, 제5,824,307호, 제7,364,737호, 제6,685,942호, 및 제5,762,905호 및 미국공개번호 제2007-0082002호, 제2005-0175986호, 제2004-0234528호, 제2006-0198840호, 제2009-0110684호, 제2006-0159695호, 제2006-0013824호, 제2005-0288491호, 제2005-0019758호, 제2008-0226630호, 제2009-0137003호, 및 제2009-0092609호에서 설명된 항-RSV 항체들 또는 항원-결합 단편들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, SEQ ID NO: 103, 113, 122, 131, 137, 144, 149, 155, 161, 167, 172, 176, 179, 182, 186, 190, 194, 198, 201, 205, 210, 215, 222, 226, 233, 239, 246, 252, 257, 362, 및 366에 기재된 것 중 어떤 아미노산 서열을 갖는 VH 사슬을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, SEQ ID NO: 104, 114, 123, 132, 138, 145, 150, 156, 162, 168, 173, 187, 206, 227, 232, 234, 240, 247, 253, 및 258에 기재된 것 중 어떤 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, SEQ ID NO: 105, 115, 124, 1608, 및 1612에 기재된 것 중 어떤 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 실시예들에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, 아미노산 서열 TSGMSVG(SEQ ID NO: 105), TAGMSVG(SEQ ID NO: 115), AYAMS(SEQ ID NO: 363), 또는 GYTMH(SEQ ID NO: 367)을 갖는 VH CDR1을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, SEQ ID NO: 106, 125, 133, 157, 236, 259, 364 및 368에 기재된 것 중 어떤 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, 아미노산 서열 DIWWDDKKDYNPSLKS(SEQ ID NO: 106) 또는 DIWWDDKKHYNPSLKD(SEQ ID NO: 125), GISGSGDSTDYADSVKG(SEQ ID NO: 364), 또는 SITGGSNFINYSDSVKG(SEQ ID NO: 368)을 갖는 VH CDR2를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, SEQ ID NO: 107, 116, 126, 139, 188, 241, 365 및 369에 기재된 것 중 어떤 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, 아미노산 서열 SMITNWYFDV(SEQ ID NO: 107), DMIFNFYFDV(SEQ ID NO: 126), HLPDYWNLDYTRFFYYMDV(SEQ ID NO: 365), 또는 APIAPPYFDH(SEQ ID NO: 369)을 갖는 VH CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, SEQ ID NO: 108, 117, 127, 134, 140, 146, 152, 158, 164, 169, 174, 177, 180, 183, 189, 191, 195, 199, 202, 207, 211, 216, 220, 223, 228, 236, 242, 248, 254, 260, 263, 370, 374 및 378에 기재된 것 중 어떤 아미노산 서열을 갖는 VL 사슬을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, SEQ ID NO: 109, 118, 128, 135, 141, 147, 153, 159, 165, 170, 175, 178, 181, 184, 192, 196, 200, 203, 208, 212, 217, 221, 224, 229, 237, 243, 249, 255, 261 및 264에 기재된 것 중 어떤 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, SEQ ID NO: 110, 119, 129, 142, 154, 166, 244, 250, 265, 371, 375 및 379에 기재된 것 중 어떤 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, 아미노산 서열 KCQLSVGYMH(SEQ ID NO: 110), SASSRVGYMH(SEQ ID NO: 154), RATQSISSNYLA(SEQ ID NO: 1616), KASQNINDNLA(SEQ ID NO: 375), 또는 RATQSVSNFLN(SEQ ID NO: 379)을 갖는 VL CDR1을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, SEQ ID NO: 111, 120, 136, 143, 160, 171, 185, 218, 225, 230, 238, 245, 251, 256, 262, 266, 372, 376 및 380에 기재된 것 중 어떤 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, 아미노산 서열 DTSKLAS(SEQ ID NO: 111), DTLLLDS(SEQ ID NO: 218), GASNRAT(SEQ ID NO:372), GASSRAT(SEQ ID NO: 376), 또는 DASTSQS(SEQ ID NO: 380)을 갖는 VL CDR2를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, SEQ ID NO: 112, 121, 193, 373, 377 및 381에 기재된 것 중 어떤 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, 아미노산 서열 FQGSGYPFT(SEQ ID NO: 112), QQYDISPYT(SEQ ID NO:373), QQYGGSPYT(SEQ ID NO: 377), 또는 QASINTPL (SEQ ID NO: 381)을 갖는 VL CDR3을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. .
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어, RSV 고면역 글로블린(hyperimmune globulin)(RSV IVIG; RespiGam®; MedImmune Inc, Gaithersburg, MD; 예를 들어, Groothius et al. (1993) New Eng. J. Med 329:1524-1530 참조)과 같은 항-RSV 항체들이 농축된(enriched) 고면역 혈청(hyperimmune serum) 또는 면역글로불린과 병용되어 투여될 수 있다.
ii . 다른 호흡기 바이러스에 대한 항체
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, 예를 들어, 항-인간 메타뉴모바이러스(hMPV) 항체, 항-파라인플루엔자 바이러스(PIV) 항체, 항-조류(avian) 뉴모바이러스(APV) 항체 또는 당 분야에 알려진 다른 항-바이러스 항체 중에서부터 선택된 RSV 이외의 호흡기 바이러스에 대한 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, 항-PIV 항체, 예를 들어, PIV 뉴클레오캡시드 인단백질, PIV 융합 (F) 단백질, PIV 인단백질, PIV 거대 (L) 단백질, PIV 매트릭스 (M) 단백질, PIV 헤마글루티닌-뉴라미니다제(hemagglutinin-neuraminidase) (HN) 당단백질, PIV RNA-의존성 폴리머라제(RNA-dependent RNA polymerase), PIV Y1 단백질, PIV D 단백질, PIV C 단백질과 같은 PIV 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체, 또는 상기 중 어떤 것의 대립유전자 변이체(allelic variant)이다. 특정 실시예들에서, PIV 항원은 PIV F 단백질이다. 몇몇 예에서, 항-PIV 항체는 인간 PIV 타입 1, 인간 PIV 타입 2, 인간 PIV 타입 3, 및/또는 인간 PIV 타입 4의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체이다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 병용치료를 위한 하나 이상의 추가적인 항바이러스성 항체들은, 항-hMPV 항체, 예를 들어, hMPV 뉴클레오단백질, hMPV 인단백질, hMPV 매트릭스 단백질, hMPV, hMPV 소형 소수성 단백질, hMPV-의존성 RNA 폴리머라제, hMPV F 단백질, hMPV G 단백질과 같은 hMPV 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체, 또는 상기 중 어떤 것의 대립유전자 변이체이다. 특정 실시예들에서, hMPV 항원은 PIV F 단백질이다. 몇몇 예에서, 항-hMPV 항체는 hMPV 타입 A 및/또는 hMPV 타입 B의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체이다. 몇몇 예에서, 항-hMPV 항체는 hMPV 서브-타입 A1 및/또는 A2 및/또는 hMPV 서브-타입 B1 및/또는 B2의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 병용되어 투여된 항체들은 당 분야에서 알려진 어떤 종류의 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 병용되어 투여된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 단일클론 항체, 인간 항체, 비-인간 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 내부체, 및 Fab 단편, Fab' 단편, (Fab')2 단편, Fv 단편, 이황화 결합된 Fv(sdFv), Fd 단편, Fd' 단편, 단일-사슬 Fv(scFv), 단일-사슬 Fab(scFab), 디아바디, 항-이디오타입(anti-Id) 항체과 같으나, 이에 제한되지 않는 항체 단편, 또는 상기 중 어떤 것의 항원-결합 단편들을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체와 병용되어 투여된 항체들은 어떤 면역글로불린 타입(예를 들어, IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 IgY), 어떤 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스(예를 들어, IgG2a 및 IgG2b)의 구성원들을 포함할 수 있다.
몇몇 예에서, 항바이러스성 항체들 또는 항원-결합 단편들의 병용투여는 항-RSV 항체 또는 항원 결합 단편의 부존재 시 RSV 감염의 발생에 대하여, 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 65%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 55%, 적어도 또는 약 50%, 적어도 또는 약 45%, 적어도 또는 약 40%, 적어도 또는 약 35%, 적어도 또는 약 30%, 적어도 또는 약 25%, 적어도 또는 약 20%, 적어도 또는 약 15%, 또는 적어도 또는 약 10% 만큼 RSV 감염의 발생을 억제한다. 몇몇 예에서, 항바이러스성 항체들 또는 항원-결합 단편들의 병용투여는 항바이러스성 항체들 또는 항원-결합 단편들의 병용의 부존 시 RSV 감염의 하나 이상의 증상들의 심각도에 대하여, 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 65%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 55%, 적어도 또는 약 50%, 적어도 또는 약 45%, 적어도 또는 약 40%, 적어도 또는 약 35%, 적어도 또는 약 30%, 적어도 또는 약 25%, 적어도 또는 약 20%, 적어도 또는 약 15%, 또는 적어도 또는 약 10% 만큼 RSV 감염의 하나 이상의 증상들의 감염의 심각도를 감소시킨다.
몇몇 예에서, 항바이러스성 항체들 또는 항원-결합 단편들의 병용은 항바이러스성 항체들 또는 항원-결합 단편들의 병용의 부존재 시 RSV의 이의 숙주 세포의 수용체에 대한 결합에 대하여, 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 65%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 55%, 적어도 또는 약 50%, 적어도 또는 약 45%, 적어도 또는 약 40%, 적어도 또는 약 35%, 적어도 또는 약 30%, 적어도 또는 약 25%, 적어도 또는 약 20%, 적어도 또는 약 15%, 또는 적어도 또는 약 10% 만큼 RSV의 이의 숙주 세포의 수용체에 대한 결합을 억제한다. 몇몇 예에서, 항바이러스성 항체들 또는 항원-결합 단편들의 병용은 항바이러스성 항체들 또는 항원-결합 단편들의 병용의 부존재 시 RSV 복제에 대하여, 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 65%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 55%, 적어도 또는 약 50%, 적어도 또는 약 45%, 적어도 또는 약 40%, 적어도 또는 약 35%, 적어도 또는 약 30%, 적어도 또는 약 25%, 적어도 또는 약 20%, 적어도 또는 약 15%, 또는 적어도 또는 약 10% 만큼 RSV 복제를 억제한다.
5. 유전자 치료
몇몇 예에서, 항-RSV 항체들, 항원-결합 단편들 및/또는 이의 유도체들을 코딩하는 서열들을 포함하는 핵산들은, 유전자 치료에 의해, RSV 감염과 관련된 하나 이상의 증상들을 치료, 예방 또는 개선하기 위해 투여된다. 유전자 치료는 핵산이 발현된 또는 발현될 수 있는 피험자에 투여함으로써 수행되는 치료를 나타낸다. 이 실시예에서, 핵산들은 예방적 또는 치료적 효과를 매개하는 그들의 코딩된 항체 또는 항원-결합 단편을 생산한다.
당 분야에서 사용이능한 유전자 치료를 위한 어떤 방법들이 항-RSV 항체들, 항원-결합 단편들 및/또는 이의 유도체들을 코딩하는 핵산의 투여를 위해 사용될 수 있다. 예시적인 방법들이 하기에 설명된다.
유전자 치료의 방법들의 일반적인 리뷰를 위하여, 예를 들어, Goldspiel et al. (1993) Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) Ann . Rev . Pharmacol . Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) Science 260:926-932; Morgan and Anderson (1993) Ann . Rev . Biochem. 62:191-217; 및 TIBTECH 11(5):155-215를 참조한다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에서 일반적으로 알려진 방법들은 Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); 및 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)에서 설명된다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 조성물은 항-RSV 항체, 항원-결합 단편 및/또는 이의 유도체를 코딩하는 핵산들을 포함하며, 여기서 핵산들은 적절한 숙주에서 항-RSV 항체, 항원-결합 단편 및/또는 이의 유도체를 발현시키는 발현 벡터의 일부이다. 바람직하게는, 이러한 핵산들은 항체 코딩 영역에 작동적으로 연결된 이종 프로모터와 같은 프로모터들을 가지며, 상기 프로모터는 유도적(inducible), 구조적(constitutive), 및 임의로, 조직-특이적이다. 다른 특정 예에서, 핵산 분자들은, 항체 코딩 서열들 및 어떤 다른 원하는 서열들이 게놈 내에 원하는 부위에 상동 재조합을 촉진하는 영역들에 의해 측접되는 데 사용되고, 따라서 핵산들이 코딩하는 항체의 염색체내 발현(intrachromosomal expression)을 위해 제공된다(Koller and Smithies (1989) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 86:8932-8935; Zijlstra et al. (1989) Nature 342:435-438). 몇몇 예에서, 발현된 항체 분자는 단일사슬 항체이다. 몇몇 예에서, 핵산 서열들은 항체의 중 및 경사슬들, 또는 그것의 항원-결합 단편들을 코딩하는 서열들을 포함한다. 특정 예에서, 핵산 서열들은 항-RSV Fab 단편을 코딩하는 서열들을 포함한다. 특정 예에서, 핵산 서열들은 전장 항-RSV 항체를 코딩하는 서열들을 포함한다. 몇몇 예에서, 코딩된 항-RSV 항체는 키메라 항체이다.
핵산의 피험자에의 전달은 피험자가 직접적으로, 이 경우 핵산 또는 핵산-전달 벡터들(nuceic acid-carring vectors)에 직접적으로 노출시키며, 또는 간접적으로, 이 경우 먼저 세포를 인 비트로로 핵산으로 형질전화시키고, 그리고 나서, 피험자에 이식시킨다. 이러한 두 가지 접근이 각각 인 비보 또는 엑스 비보 유전자 치료로서 알려져 있다.
몇몇 예에서, 핵산 서열들은 직접적으로 인 비보로 투여되며, 여기서 이것은 발현되어 코딩된 산물을 생산한다. 이는 당 분야의 알려진 어떤 다수의 방법들, 예를 들어, 그들을 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성하고, 그들이 세포내(intracellular)가 되도록 투여함으로써, 예를 들어, 결함이 있는(defective) 또는 약화시킨(attenuated) 레트로바이러스(retroviral) 또는 다른 바이러스 벡터들을 사용하여 감염시키는 것에 의해(미국특허번호 4,980,286호 참조), 또는 네이키드(naked) DNA의 직접적인 주입에 의해, 또는 마이크로입자 주입기(microparticle bombardment)(예를 들어, 유전자 총(gene gun); Biolistic, Dupont)를 사용, 또는 지질들 또는 세포-표면 수용체들 또는 형질감염제들로 코팅, 리포솜들, 마이크로입자들 또는 마이크로캡슐제들 내로 캡슐화하는 것에 의해, 또는 이들을 핵으로 들어가는 것으로 알려진 펩티드와 연결(linkage)시켜 투여하는 것에 의해, 예를 들어, 수용체들을 특이적으로 발현하는 세포 형들에 표적화 하는데 사용될 수 있는, 수용체-매개 내포작용(endocytosis)(예를 들어, Wu and Wu (1987) J. Biol . Chem . 262:4429-4432 참조)를 행하는 리간드와 연결하여 이를 투여하는 것에 의해 달성될 수 있다. 몇몇 예에서, 리간드가 융합성(fusogenic) 바이러스 펩티드를 포함하여 엔도솜을 방해하는 핵산-리간드 복합체들은 형성될 수 있고, 상기 복합체는 핵산이 리소좀 분해를 피하도록 해준다. 몇몇 예에서, 핵산은 세포 특이적 흡수(uptake) 및 발현을 위해, 특이적인 수용체를 표적화 함으로써, 표적화될 수 있다(PCT 공개번호 제WO 92/06180호; 제WO 92/22635호; 제WO92/203 16호; 제WO93/14188호, 및 제WO 93/20221호 참조). 다른 실시예로, 핵산은 발현되도록 상동성 재조합에 의해, 세포내로 도입되고 숙주세포 DNA 내로 병합될 수 있다(Koller and Smithies (1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:8932-8935; and Zijlstra et al. (1989) Nature 342:435-438).
몇몇 예에서, 항-RSV 항체, 항원-결합 단편들 및/또는 이의 유도체들을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터가 사용된다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있다(예를 들어, Miller et al. (1993) Meth . Enzymol . 217:581-599 참조). 레트로바이러스 벡터들은 바이러스 게놈의 정확한 패키징 및 숙주세포 DNA로의 통합에 필요한 구성요소들을 포함한다. 유전자 치료에 사용될 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 서열들은 하나 이상의 벡터들에 클로닝(cloned)되고, 이는 피험자에 유전자 전달을 용이하게 한다. 레트로바이러스 벡터들에 관한 보다 구체적인 것들은 예를 들어, Boesen et al. (1994) Biotherapy 6:291-302에서 찾을 수 있다. 유전자 치료에 레트로 바이러스 벡터들의 사용을 설명하는 다른 인용문헌들은 예를 들어, Clowes et al. (1994) J. Clin . Invest. 93:644-651; Klein et al. (1994) Blood 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg (1993) Human Gene Therapy 4:129-141; 및 Grossman and Wilson (1993) Curr . Opin. in Genetics and Devel . 3:110-114을 포함한다.
아데노바이러스는 또한 유전자 치료에 사용될 수 있는 바이러스 벡터들이다. 아데노바이러스는 호흡기 상피에 유전자를 전달하기 위한 특히 매력있는 운반체이다. 아데노바이러스들은 자연적으로 호흡기 상피를 감염시켜 그곳에 온화한(mild) 질환을 야기한다. 아데노바이러스-기반 전달 시스템들에 관한 다른 표적은 간, 중추신경계, 내피세포들, 및 근육을 포함한다. 아데노바이러스는 비-분열 세포들(non-dividing cells)을 감염시킬 수 있다는 장점이 있다. Kozarsky and Wilson (1993) Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503는 아데노바이러스-기반 유전자 치료의 리뷰를 제시한다. Bout et al. (1994) Human Gene Therapy 5:3-10는 유전자들을 붉은털원숭이들(rhesus monkeys)의 호흡기 상피로 전달하기 위한 아데노바이러스 벡터들의 사용을 설명했다. 유전자치료에 있어서 아데노 바이러스의 다른 예들은 예를 들어, Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155; Mastrangeli et al. (1993) J. Clin . Invest. 91:225-234; PCT 공개번호 제WO94/12649호; 및 Wang et al. (1995) Gene Therapy 2:775-783에서 찾을 수 있다. 특정 예에서, 아데노바이러스들은 본 발명에서 제공되는 항-RSV 바이러스들, 항원-결합 단편들 및/또는 이의 유도체들을 코딩하는 핵산을 전달하는데 사용된다.
아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus; AAV)는 또한 유전자 치료에 사용될 수 있다(Walsh et al. (1993) Proc . Soc . Exp . Biol . Med. 204:289-300; 및 미국특허 제5,436,146호). 특정 예에서, 아데노-관련 바이러스(AAV)는 본 발명에서 제공되는 항-RSV 바이러스들, 항원-결합 단편들 및/또는 이의 유도체들을 코딩하는 핵산을 전달하는데 사용된다.
유전자 치료에 대한 다른 접근은, 전기천공법, 리포펙션법, 칼슘 포스페이트 매개의 형질감염, 또는 바이러스 감염과 같은 방법들과 같은 방법들에 의해 조직 배양에서 유전자를 세포들에 전달하는 것을 포함한다. 일반적으로, 전달의 방법은 선택할 수 있는 마커의 세포들에 대한 전달을 포함한다. 세포들은 그리고 나서 전달된 유전자를 취하고 발현하는 이들 세포들을 분리하기 위해 선택(selection) 하에 둔다. 유전자를 발현하는 세포들은 그리고 나서 피험자에 전달된다.
몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체, 항원-결합 단편들 및/또는 이의 유도체들을 코딩하는 핵산은 생성된 재조합 세포가 인 비보 투여 전에 세포에 도입된다. 이러한 도입은 형질감염, 전기천공법, 마이크로주입법, 핵산 서열들을 포함하는 바이러스 또는 바이러스 박테리오파지 벡터를 사용하는 감염, 세포 융합, 염색체-매개 유전자 전달, 마이크로세포-매개 유전자 전달, 및 원형질체 융합을 포함하나, 이에 제한되지 않는 당 분야의 어떤 방법에 의해 수행될 수 있다. 당 분야에서 외부 유전자들을 세포로의 도입에 대한 다수의 기술들이 알려져 있으며(예를 들어, Loeffler and Behr (1993) Meth . Enzymol. 217:599-618; Cohen et al . (1993) Meth . Enzymol. 217:618-644; Cline (1985) Pharmacol . Ther. 29:69-92 참조), 수혜세포들(recipient cells)의 필요한 발생 및 생리 작용이 방해되지 않는다면, 다수의 기술들이 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체, 항원-결합 단편 및/또는 이의 유도체를 코딩하는 핵산의 투여에 사용될 수 있다. 기술은, 핵산이 세포에 의해 발현가능하고, 일반적으로 유전되고, 이들의 자손 세포(cell progeny)에 의해 발현가능하도록, 안정적인 전달을 위해 제공된다.
생성된 재조합 세포들은 당 분야에 알려진 다양한 방법들에 의해 피험자에 전달될 수 있다. 재조합 혈액 세포들(예를 들어, 조혈줄기세포 또는 조혈전구세포)는 정맥주사로 투여될 수 있다. 투여를 위한 세포들의 양은, 예를 들어, 원하는 예방적 및/또는 치료적 효과 및 환자 상태를 포함하는 다양한 인자들에 의존하며, 당 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다.
유전자 치료의 목적으로 핵산이 도입될 수 있는 세포들은 어떤 원하는, 사용이능한 세포 형을 포함하며, 상피세포들(epithelial cells), 내피세포들(endothelial cells), 각질형성세포들(keratinocytes), 섬유아세포들(fibroblasts), 근육 세포들, 간세포들(hepatocytes); T 림프구들, B 림프구들, 단핵구들, 대식세포들, 호중구들, 호산구들, 거핵구들, 과립구들과 같은 혈액세포들; 다양한 줄기 또는 전구 세포들, 바람직하게는 예를 들어, 골수, 제대혈(umbilical cord blood), 말초혈액(peripheral blood), 태아의 간(fetal liver)로부터 수득할 수있는 것과 같은 조혈줄기세포 또는 조혈전구세포을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시예들에서, 유전자 치료에 사용되는 세포는 피험자에 대한 자가조직(autologus)이다.
재조합 세포들을 유전자 치료에 사용하는 몇몇 예에서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체, 항원-결합 단편들 및/또는 이의 유도체들을 코딩하는 핵산 서열들은 그들이 세포들 또는 이들의 자손에 의해 발현될 수 있도록 세포들에 도입되고, 재조합 세포들은 그리고 나서 치료적 효과를 위해 인 비보로 투여된다. 특정 예에서, 줄기 또는 전구 세포들이 사용된다. 인 비트로에서 분리될 수 있고 유지될 수 있는 어떤 줄기 및/또는 전구 세포들은 사용될 수 있다(예를 들어, PCT 공개번호 제WO 94/08598호; Stemple and Anderson (1992) Cell 7 1:973-985; Rheinwald (1980) Meth . Cell Bio . 21A:229; 및 Pittelkow and Scott (1986) Mayo Clinic Proc. 61:771 참조).
특정 예에서, 유전자 치료의 목적을 위해 도입될 핵산은, 핵산의 발현이 전사의 적절한 인듀서(inducer)의 존재 또는 부존재를 조절함으로써 조절가능하도록, 코딩 영역과 작동적으로 연결된 유도 프로모터를 포함한다.
J. 약학적 조성물, 조합물 및 제조물품/ 키트
1. 약학적 조성물
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물이 본 발명에서 제공된다. 약학 조성물은 치료적, 예방적, 및/또는 진단적 적용에 사용될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 제제화될 수 있다. 일반적으로는, 이러한 약한 조성물들은 이것의 특이적인 에피토프에 대한 결합(예를 들어, RSV F 단백질에 대한 결합)과 같이, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 생물학적 특성을 상당히 손상시키지 않을 구성성분들을 사용한다. 각각의 구성성분은 다른 구성성분들과 양립되며, 환자에 해롭지 않다는 의미에서 약학적 및 생리학적으로 허용가능하다. 제제들은 단위 투여제형으로 편리하게 제공될 수 있으며, 정제들, 환제들, 분말제, 액체 용액들 또는 현탁액들(예를 들어, 주사가능한, 섭취가능한(ingestible) 및 국소의 제형들(예를 들어, 눈의 점안약, 젤들 또는 연고들), 에어로졸들(예를 들어, 비강 스프레이들), 리포솜들, 좌제들, 주사가능하며 주입가능한 용액 및 지속방출(sustained release) 제형들을 포함하나, 이에 제한되지 않는 약학 분야에서 잘 알려진 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa.; Avis, et al . (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, NY; 및 Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, NY을 참조한다. 전신적으로 투여될 때, 치료적 조성물은 살균의, 발열원-없는(pyrogen-free), 일반적으로 미세먼지(particulate matter) 없는, 및 pH, 등장성(isotonicity), 및 안정성을 상당히 고려한 비경구적으로 허용가능한 용액이다. 이러한 상태들은 당 분야의 당업자에 알려져 있다. 비경구적으로 투여될 수 있는 조성물들을 제조하기 위한 방법들이 잘 알려져 있거나, 당 분야의 당업자에게 명백할 것이며, 보다 자세한 것은, 예를 들어, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Formerly Remington's Pharmaceutical Sciences)", 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995)에 설명된다.
본 발명에서 제공되는 약학적 조성물들은 다양한 제형들(forms), 예를 들어, 고형, 반고형, 액체, 분말, 수용액, 또는 동결건조 제형일 수 있다. 적절한 약학적 담체들의 예들은 당 분야에 알려져 있고, 물, 완충제들(buffering agents), 식염수, 인산 완충 식염수, 다양한 종류의 습윤제, 살균된 용액들, 알콜들, 아라비아 고무, 식물 유지, 벤질 알콜들, 젤라틴, 글리세린, 락토스, 수크로스, 아밀로스 또는 전분(starch)과 같은 탄수화물들, 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 활석(talc), 규산, 점착성의(viscous) 파라핀, 퍼퓸 오일(perfume oil), 지방산 모노글리세라이드들 및 디글리세라이드들, 펜타에리트리톨(pentaerythritol) 지방산 에스테르들, 하이드록시 메틸셀룰로오스, 분말들, 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 제공되는 약학 조성물들은, 예를 들어, 항산화제들, 방부제들(preservatives), 항미생물제들, 진통제들(analgesic agents), 바인더들, 붕해제들(disintegrants), 착색제(coloring), 희석제들, 부형제들(excipients), 증량제들(extenders), 유동화제(glidants), 가용화제(solubilizer), 안정화제들, 강장제들(tonicity agents), 운반체들(vehicles), 점도제들(viscosity agents), 향미제들(flavoring agents), 오일/물 에멀전들(emulsions)과 같은 에멀전들, 아카시아, 한천, 알긴산, 알긴산 나트륨, 벤토나이트(bentonite), 카보머(carbomer), 카라기닌(carrageenan), 카복시메틸셀룰로오스, 셀루로오스, 콜레스테롤, 젤라틴, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 옥토시놀-9(octoxynol 9), 올레일 알콜(oleyl alcohol), 포비돈(povidone), 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트(propylene glycol monostearate), 소듐 라우릴 설페이트(sodium lauryl sulfate), 소르비탄(sorbitan) 에스테르들, 스테아릴 알콜, 트래거캔스 고무(tragacanth), 잔탄검, 및 이의 유도체들과 같은 에멀전화 및 현탁제들, 용매들, 및 결정 셀룰로오스, 마이크로결정 셀룰로오스, 시트르산, 덱스트린, 덱스트로스, 액체 글루코오스, 젖산, 락토오스, 마그네슘 클로라이드, 포타슘 메타포스페이트(potassium metaphosphate), 전분, 등과 같은 기타 성분(miscellaneous ingredient)을 포함하는 다른 첨가제들(additivives)을 포함할 수 있다(일반적으로, Alfonso R. Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins 참조). 이러한 담체들 및/또는 첨가제들은 종래의 방법들에 의해 제형화될 수 있으며, 환자에 적합한 투여량으로 투여될 수 있다. 지질들, 뉴클레아제 억제제들(nuclease inhibitors), 폴리머들, 및 킬레이트제들과 같은 안정화제들이 조성물들이 체내에서 분해되는 것으로부터 보호할 수 있다.
사용하는데 적합한 약학적 조성물들은 하나 이상의 항-RSV 항체들이 그들의 의도된 목적을 달성하는데 유효량으로 포함된 조성물들을 포함한다. 치료적으로 유효량의 결정은 당 분야의 당업자의 능력 범위에서 당연하다. 치료적으로 유효 투여량의 결정은 본 발명에서 설명된 바와 같은 인 비트로 및 인 비보 방법들을 사용함으로써 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 약제학적 제제 내에 있을 때, 투여를 위해 단위 투여형으로 제공될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 저장을 위해 동결건조될 수 있으며, 사용하기 전에 적합한 담체에서 재구성(reconstitute)될 수 있다. 이 기술들은 종래의 면역글로불린들 및 단백질 제제들에 유효하다는 것을 보여왔고, 당 분야에 알려진 동결건조 및 재구성 기술들이 사용될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제어방출 또는 지속방출 조성물로서 제공될 수 있다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제어방출 또는 지속방출을 달성할 수 있는 환제들 및 캡슐제의 제형을 위한 폴리머 물질은 당 분야에서 알려져 있다(예를 들어, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas (1983) J., Macromol . Sci . Rev . Macromol . Chem . 23:61 참조; 또한 Levy et al. (1985) Science 228:190; During et al. (1989) Ann . Neurol . 25:351; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 7 1:105; 미국특허번호 제5,679,377호, 제5,916,597호, 제5,912,015호, 제5,989,463호, 제5,128,326호; PCT 공개번호 제WO 99/15154호 및 제WO 99/20253호 참조). 지속방출 제형들에 사용되는 폴리머들의 예들로는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리세라이드들(PLG), 폴리무수물들, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리아크릴아마이드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락티드들(PLA), 폴리(락티드-코-글리콜라이드들)(PLGA), 및 폴리오르쏘에스테르들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 지속방출 제형에 사용되는 폴리머는 불활성이고, 여과할 수 있는 불순물들이 없으며, 저장시 안정하고, 살균성, 및 생분해성이다. 지속방출 제형의 생산을 위한 당 분야에서 알려진 어떤 기술이, 본 발명에서 제공되는 하나 이상의 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함하는 지속방출 제형을 생산하는데 사용될 수 있다.
몇몇 예에서, 약학적 조성물은 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 하나 이상의 추가적인 항체들을 포함한다. 몇몇 예에서, 하나 이상의 추가적인 항체들은, 팔리비주맙(SYNAGIS®), 및 이의 유도체들, 예를 들면 그러나 이에 제한되지 않는, 모타비주맙(NUMAX®), AFFF, P12f2, P12f4, P11d4, A1e9, A12a6, A13c4, A17d4, A4B4, A8c7, 1X-493L1, FR H3-3F4, M3H9, Y10H6, DG, AFFF(1), 6H8, L1-7E5, L2-15B10, A13a11, A1h5, A4B4(1), A4B4L1FR-S28R, 및 A4B4-F52S (미국특허번호 제5,824,307호 및 제6,818,216호 참조), rsv6, rsv11, rsv13, rsv19, rsv21, rsv22, rsv23 (예를 들어, 미국특허번호 제5,824,307호, 제6,685,942호 및 제6,818,216호 참조), 인간 항-RSV 항체, 예를 들면 그러나 이에 제한되지 않는, rsv6, rsv11, rsv13, rsv19(즉, Fab 19), rsv21, rsv22, rsv23, RF-1, RF-2(예를 들어, 미국특허번호 제6,685,942호 및 제5,811,524호), 항-RSV 마우스 단일클론 항체로부터 유도된 인간화 항체, 예를 들면 그러나 이에 제한되지 않는, MAb들 1153, 1142, 1200, 1214, 1237, 1129, 1121, 1107, 1112, 1269, 1269, 1243(Beeler et al. (1989) J. Virology 63(7):2841-2950), MAb151(Mufson et al. (1987) J. Clin . Microbiol. 25:1635-1539), MAb들 43-1 및 13-1(Fernie et al. (1982) Proc . Soc . Exp . Biol . Med . 171:266-271), MAb들 1436C, 1302A, 1308F, 및 1331H(Anderson et al . (1984) J. Clin . Microbiol. 19:934-936), 또는 그의 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물에 사용될 수 있는 추가적인 예시적 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들은, 예를 들어, 미국특허번호 제6,413,771호, 제5,840,298호, 제5,811,524호, 제6,656,467호, 제6,537,809호, 제7,364,742호, 제7,070,786호, 제5,955,364호, 제7,488,477호, 제6,818,216호, 제5,824,307호, 제7,364,737호, 제6,685,942호, 및 제5,762,905호 및 미국공개번호 제2007-0082002호, 제2005-0175986호, 제2004-0234528호, 제2006-0198840호, 제2009-0110684호, 제2006-0159695호, 제2006-0013824호, 제2005-0288491호, 제2005-0019758호, 제2008-0226630호, 제2009-0137003호, 및 제2009-0092609호에서 설명된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
2. 제조물품들/ 키트들
항-RSV 항체들 또는 항-RSV 항체들을 코딩하는 핵산들, 또는 유도체 또는 이의 생물학적으로 활성인 부분(portion)의 약학적 조성물은, 포장재료, RSV-매개 질환(disease) 또는 장애(disorder) 예방(즉, 백신접종, 수동면역 및/또는 치료에 유효한 약학적 조성물, 및 백신접종 및/또는 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 항체 또는 핵산분자를 지시하는 라벨을 포함하는 제조물품으로 포장될 수 있다. 약학적 조성물들은 단일 투여 또는 다중 투여를 위한 약학적 조성물의 양을 포함하는 단위 투여형으로 포장될 수 있다. 포장된 조성물들은 제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함하는 약학적 조성물들의 동결건조된 분말을 포함할 수 있으며, 이것은 투여 전에 재구성(예를 들어, 물 또는 식염수와 함께)될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 제조 물품들은 포장 재료를 포함한다. 약학적 제품들을 포장하는데 사용되는 포장 재료는 당업자에게 잘 알려져 있다. 약학적 포장 재료의 예들은, 블리스터 포장(blister packs), 병(bottles), 튜브(tubes), 흡입기, 흡입기들(예를 들어, 가압 정량식 흡입기들(MDI), 건조 분말 흡입기들(DPI), 네뷸라이저(예를 들어, 제트 또는 초음파 네뷸라이저들) 및 다른 단일 호흡 액체 시스템들), 펌프(pumps), 백(bags), 바이알(vials), 컨테이너(containers), 시린지(syringes), 병, 및 선택된 제형 및 투여 및 치료의 의도된 방식(mode)에 적합한 어느 포장 재료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 약학적 조성물은 또한 감염을 막도록 피임에 사용되는 장벽 또는 다른 보호 장치에 포함되거나, 적용되거나, 또는 코팅될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들, 이의 항체들을 코딩하는 핵산 분자들, 약학적 조성물들 또는 조합물들은 또한 키트류로서 제공될 수 있다. 키트는 임의로 사용에 대한 지시, 장치 및 추가 시약들(reagents)(예를 들어, 조성물들의 희석 및/또는 동결건조된 단백질의 재구성을 위한 멸균된 물 또는 식염수 용액들)과 같은 하나 이상의 구성요소, 및 방법들의 수행을 위한 튜브, 컨테이너 및 시린지와 같은 구성요소들을 포함한다. 예시적인 키트는 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 포함할 수 있고, 임의적으로 사용을 위한 지시들, 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 피험자에 투여하기 위한 장치, 피험자에서 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 검출하기 위한 장치, 피험자로부터 얻은 시료들에서 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 검출하기 위한 장치, 및 추가적인 치료제를 피험자에 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다.
키트는 임의적으로 지시들을 포함한다. 지시들은 일반적으로 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 설명하는 명확한(tangible) 표현을 포함하고, 임의적으로, 키트에 포함된 다른 구성요소, 및 피험자의 적절한 상태, 적절한 투여량, 투여 요법(dosing regimens), 및 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 투여하기 위한 적절한 투여방법을 결정하기 위한 방법 등을 포함하는 투여 방법들을 포함한다. 지시들은 또한 피험자의 치료기간의 감소를 모니터하기 위한 안내(guidance)를 포함한다.
키트는 또한 본 발명에서 설명된 약학적 조성물 및 진단을 위한 물품(idem)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 키트는 피험자에서 선택된 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 농도, 양 또는 활성을 측정하기 위한 물품을 포함할 수 있다.
몇몇 예에서, 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 단리된 생물학적 시료(예를 들어, 피험자로부터 얻은 혈액, 객담, 세척액, 폐 삽관 시료, 타액(saliva), 소변 또는 림프와 같은 액 시료)에서 RSV 검출을 위한 진단 키트에 제공된다. 몇몇 예에서, 진단 키트는 하나 이상의 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 패널 및/또는 하나 이상의 대조 항체들(즉, 비-RSV 결합 항체들)을 포함하며, 여기서 패널에 있어서의 항체들은 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 항원-결합 단편이다.
본 발명에서 제공되는 키트들은 또한 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 피험자에 투여하기 위한 장치를 포함한다. 당 분야에서 알려진 약물들(medications)을 피험자에 투여하기 위한 어떤 다양한 종류의 장치들이 여기에서 제공된 키트들에 포함될 수 있다. 예시적인 장치들은, 흡입기(예를 들어, 가압 정량식 흡입기(MDI), 건조 분말 흡입기(DPI), 네뷸라이저(예를 들어, 제트 또는 초음파 네뷸라이저들) 및 다른 단일 호흡 액체 시스템), 피하주사바늘, 정맥주사바늘, 카테터(catheter), 및 점안기와 같은 액체 디스펜서를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로 키트의 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 투여하기 위한 장치는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 투여의 원하는 방법과 양립될 것이다. 예를 들어, 폐 투여에 의해 전달될 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 키트내에 포함될 수 있거나, 흡입기 또는 네뷸라이저 내에 포함될 수 있다.
3. 조합물( Combination )
본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들 및 제2 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 다른 치료적 또는 진단적 제제와 같은, 제2 제제의 조합물들이 제공된다. 조합물은 본 발명에서 제공되는 방법들에 부합하는 그의 치료를 유효하게 하기 위한 어떤 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조합물은 어떤 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 항바이러스제를 포함할 수 있다. 조합물들은 또한 하나 이상의 추가적인 치료적 항체들과 함께 본 발명에서 제공되는 항-RSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 제공된 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들의 조합물들은, 또한 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들 또는 본 발명에서 설명된 바와 같은 항-RSV 항체들 또는 그의 항원-결합 단편들을 코딩하는 핵산들을 포함하는 숙주 세포들을 포함하는 약학적 조성물들을 포함할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 조합물들은 단일 조성물(single composition)로서 또는 개별적 조성물들(separate compositions)로 제제화될 수 있다.
K. 실시예
다음 실시예들은 단지 설명을 위한 목적들을 위해 포함되었으며, 발명의 범위에 제한하는 것을 의도하지 않았다.
실시예 1
RSV F 단백질의 발현
이 실시예에서, 호흡기 세포융합 바이러스 균주 A2(Respiratory Syncytial Virus strain A2)로부터의 RSV 융합 단백질(F 단백질)을 발현하였고, 융합 당단백질의 F0 및 F1 서브유닛들 모두를 인식하는 항-RSV 단일클론 항체 클론 2F7을 사용하는 ELISA 플레이트들 상에서 포획(capture)함으로써 정제하였다. 첫 번째 실시예에서, 재조합 RSV F 단백질을 클로닝하였고 293F 세포들에서 발현하였다. 두 번째 실시예에서, 천연의(천연) RSV F 단백질은 RSV A2 균주로 HEp-2 세포들을 감염시켜 발현하였다.
A. 재조합 RSV F 단백질
이 실시예에서, A2 RSV 균주로부터의 RSV F 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하고 발현시켰다. 단지 세포외 도메인을 포함하는 RSV A2 F 유전자(SEQ ID NO: 21)는, GeneArt (Burlingame, CA)에 의해 표준 DNA 합성 프로토콜(standard DNA synthesis protocol)에 따라 합성하였다. RSV A2 F 유전자는 코작(Kozak) 서열(SEQ ID NO: 21의 뉴클레오티드들 7-16), c-myc 서열(SEQ ID NO: 21의 뉴클레오티드들 1600-1629), 및 6X-히스 태그(6X-His tag)(SEQ ID NO: 21의 뉴클레오티드들 1645-417)을 포함하도록 조작하였다. 또한, NheI(SEQ ID NO: 22) 및 HindIII(SEQ ID NO: 23) 제한 부위들(restriction sites)은 5' 및 3' 말단들에서 각각 조작하여 발현 벡터에 클로닝되도록 하였다. DNA는 표준 분자 생물학 기술들을 사용하여 절단(digest)하였고, 유사하게 절단된 포유류 발현 벡터 pcDNA™3.1/myc-His(-) C(SEQ ID NO:24, Invitrogen)에 연결하였다(ligated). RSV A2 F 유전자를 포함하는 벡터가 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) XL1-Blue 세포들(Strategene)에 형질전환하였다. 각각의 콜로니들을 선택하고 성장시키고, 플라스미드 DNA를 정제하였다. 단리된 벡터 내에 RSV A2 F 유전자 삽입물(insert)의 존재를 DNA 서열검정(sequencing)에 의해 확인하고, 삽입물을 포함하는 하나의 클론(clone)을 사용하여 DNA를 대량으로 제조하였다(Megaprep kit, Qiagen).
제조자의 지시들에 따라 FreeStyle™293 Expression System(Invitrogen)를 사용하여 RSV A2 F 단백질을 포유류 세포들에서 발현시켰다. 즉, 3 x 107 세포들을 30 ㎍의 RSV A2 F/pcDNA3.1/myc-His(-) C 플라스미드 DNA 및 5 ㎍의 pAdVAntage (Promega)와 함께 공동-형질감염시키고, 37 ℃에서 72 시간 동안 배양하였다. 세포들을 원심분리에 의해 펠렛화하고, 3 ㎖의 차가운 용해(lysis) 완충용액(300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 1% 트리톤 X-100, Complete™ Protease Inhibitor cocktail(Cat. No. sc-29131, Santa Cruz), pH 8)을 모든 3 x 107 RSV F-형질감염된 293-F 세포들을 위해 첨가하였다. 혼합물을 4 ℃에서 30 분 동안 흔들어주었고, 이어서 4 ℃에서 30 분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 맑아진 상청액을 새로운 튜브에 옮기고, 사용을 준비할 때까지 -80 ℃에서 동결시켰다. ELISA 플레이트 상에서 포획하기 전에, 상청액을 녹이고(thaw), 간단하게 원심분리하고, 0.8 % 탈지분유를 포함하는 PBS로 1:1 부피/부피(V/V)로 희석하였다(0.4 % 분유의 최종 농도).
B. 천연의(천연) RSV F 단백질
이 실시예에서, RSV A2 균주(SEQ ID NO: 382)로부터의 천연의 RSV F 단백질이 다음과 같이 RSV 감염된 HEp-2 세포들로부터 정제하였다. 간단하게, HEp-2세포들이 완전한 EMEM(ATCC 30-2003; 10 % FBS, 1 % L-글루타민 및 1 % 펜-스트렙(pen-Strep)을 포함)을 사용하여 10-층 세포 배양 적층기(stacker) (Corning 3270)에 시드하고, 37 ℃ 및 5 % CO2에서 배양하였다. 세포들이 80 % 컨플루언스(confluence)에 도달했을 때, 0.01-1의 감염 다중도(MOI)로 HEp-2 단일층을 RSV A2 바이러스(ATCC VR-1540)로 감염시켰다. 명백한 세포 합포체(syncytia)가 관찰될 때까지, 감염된 세포들을 3-5일 동안 배양하였다. 감염된 세포들을 PBS로 한 번 세척하고, 세포들을 5 mM EDTA를 갖는 500 ㎖ PBS를 배양 스트렉커(stracker)에 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 배양함으로써 수확하였다. 세포들을 50 ㎖ 코니칼(conical) 튜브에 모았고(튜브 당 5 x 107 세포들), 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 세포 펠렛들은 PBS로 2X 세척하였고, 1200 rpm으로 5 분 동안로 원심분리하였다. 세포 펠렛들은 -20 ℃에서 추가 공정 전까지 보관하였다. 동결된 세포들을 해동시키고, 3 ㎖의 차가운 용해 완충용액(300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 1 % 트리톤 X-100, Complete™ Protease Inhibitor cocktail(Cat. No. sc-29131, Santa Cruz), pH 8)을 각각의 세포 펠렛에 첨가하였다. 세포들은 4 ℃에서 30 분 동안 흔들었고, 이어서 초음파 처리(sonication)하였고(10 % 파워(power)에서 3펄스 각각 10초 동안), 최종적으로 4 ℃에서 30 분 동안 14,000rpm으로 원심분리 하였다. 맑아진 상청액을 새로운 튜브에 옮기고, 사용을 준비할 때까지 -80 ℃에서 동결시켰다. ELISA 플레이트 상에서 포획(capture)하기 전에, 상청액을 해동시키고, 단순히 원심분리하고, 1:2000로 희석하였다.
C. 항- RSV mAb 로 포획
ELISA 플레이트들은 PBS에서 항-RSV mAb(Cat. No. NB110-37246, clone 2F7, Novus Biologicals)의 1:400 희석의 50 ㎕/웰을 사용하여 코팅하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하고, 플레이트들을 ELISA에 즉각 사용하였다(실시예 2 및 4 참조). 다른 실시예로, 플레이트들을 -20 ℃에서 최대 2주 동안 동결시켰다. 사용하기 바로 전에, 플레이트들을 37 ℃에서 2 시간 동안 1x PBS에서 4 % 탈지분유로 블로킹하였다. 플레이트들을 용해물(용해물)의 첨가 전에, 0.05 % 트윈-20을 포함하는 PBS(세척 완충용액)로 2번 세척하였다. RSV F 단백질(재조합 또는 천연)의 포획을 상기 준비된 용해물 중 어느 하나의 50㎕을 항-RSV mAb ELISA 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양함으로써 수행하였다.
실시예 2
EBV -형질전환된 B 세포들로부터 항- RSV Fab 항체들의 분리
이 실시예에서, 항-RSV 항체들은 자극된 엡스타인-바르 바이러스(stimulated Epstein Barr virus) 형질전환된 공여자 기억 B 세포들(donor memory B cells)으로부터 분리하였고, 자극된 엡스타입-바르 바이러스 형질전환된 공여자 기억 B 세포들은 RSV F 단백질에 대한 결합에 관하여 스크리닝되고, 이어서 인 비트로 항체 생성하였다.
섹션 A 및 B는 EBV-변형된 B 세포의 생성 및 클로닝 및 RSV F 단백질에의 결합에 대한 스크리닝을 위한 약간 다른 2 가지 과정을 기재한다. 차이는 다음과 같다: (1)단계 1에서 PMBCs의 기원; (2) 단계 2에서 IgG+ B 세포의 단리 (섹션 A에서 IgM, IgD 및 IgA 발현 세포가 열화되고 그리고 추가적으로 섹션 B에서 CD3 양성 세포가 열화됨); 및 (3) 단계 3에서 조사된 B-세포 열화된 공급기 세포의 제조
A. EBV -변형 B 세포의 생성 및 클로닝 그리고 RSV F 단백질과의 결합에 대한 스크리닝 (공정 A)
아이들과의 접촉을 통해 RSV에 노출될 수 있는 보육 노동자(child care worker)로부터 말초 혈액 단핵 세포들(PBMCs)을 얻었다. PMBC들은 제조자의 지시들에 따라, Ficoll Hypaque로 밀도구배 원심분리로 분리하였다.
1. CD22 + 분리 및 CD22 + B 세포들의 활성화
CD22 마그네틱 비드(Miltenyi, cat.# 130-046-401) 및 LS 컬럼(Miltenyi, cat.# 130-042-401)를 사용하여 공여자 PBMC들로부터 3.2 x 106 CD22+ B 세포들을 분리하였다. 단리된 CD22+ B 세포들은 10 % 열-불활성화된 낮은 IgG 우태아 혈청(heat-inactivated low IgG)(FBS, Invitrogen, cat.# 16250-078), 1 % 항생제들(Hyclone, cat.# SV30010), 1 % 소듐 피르베이트(sodium pyruvate)(Hyclone, cat. # SH30239.01) 및 1 % L-글루타민(Hyclone, cat. # SH30034.01)을 포함하는 RPMI(Hyclone, cat.# SH30096.01)에서 48 웰 플레이트에서 웰 당 1 x 106 세포들로 배양하였다. 증식 및 항체 생성을 유도하기 위하여, 단리된 B 세포들은 다중클론성 B 세포 자극제들(polyclonal B cell stimulating agents)의 선택으로 활성화하였다.
2. IgG + B 세포들의 EBV -매개 불멸화
4.5 x 106 활성화된 CD22+ B 세포들을 세척하였고, 40 ㎕의 FITC-접합된 항-IgM(BD Biosciences, cat.# 555782), 40 ㎕의 FITC-접합된 항-IgD(BD Biosciences, cat.# 555778) 및 4 ㎕의 FITC-결합된 항-IgA(Jacksons Immunoresearch, cat. 309-096-043) 항체들과 함께 4 ℃에서 15 분 동안 배양하였다. 세포들은 PBS(0.5 % BSA 및 2 mM EDTA를 포함)내에서 1x 세척하였고, 90 ㎕의 동일한 완충용액으로 재현탁하였다. IgG+ B 세포들은, 제조자 지침에 따라 10 ㎕ 항-FITC 마그네틱 비드(Miltenyi, cat.# 130-048-701) 및 LS 칼럼(Miltenyi, cat.# 130-042-401)을 사용하여 IgM, IgD, IgA를 발현하는 세포들을 네거티브 선택함으로써 농축하였다(enriched).
B 세포들의 대량 불멸화를 16 시간 동안 0.5 ㎖ EBV 상청액(10 % FCS, B95-8 세포들로부터의 ATCC Cat. No. VR-1492를 갖는 RMPI-1640에서 50 % 부피/부피(v/v))과 함께 1.87 x 106 IgG+, CD22+ 농축된(enriched) B 세포들을 배양함으로써 수행하였다. 감염 후에, 세포들을 세척하고 (10% 열-불활성화된 낮은 IgG 우태아 혈청(FBS, Invitrogen, cat. # 16250-078), 1 % 항생제들(Hyclone, cat.# SV30010), 1% 소듐 피르베이트(Hyclone, cat.# SH30239.01) 및 1 % L-글루타민(Hyclone, cat.# SH30034.01), 200 IU/㎖ rhIL-2 (R&D Systems Cat. # 202-IL-50)을 포함하는 RPMI(Hyclone, cat.# SH30096.01)에서 두 개의 웰의 각각에서 106/㎖, 24 웰 플레이트의 웰 당 0.5 x 106 조사된 배양보조세포와 함께 추가로 9일 동안)배양하였다.
3. B 세포 클로닝
a. B 세포 클로닝을 위한 조사된 B-세포 격감 배양보조세포들의 제조
조사된 B-세포 격감 배양보조세포들을 EBV-형질전환된 B 세포들의 성장 유지에 사용하였다. 3명의 건강한 공여자들의 혼합물들로부터 PBMC들을 피콜 분리(Ficoll separation)하여 얻었고, 3250 라드(rads)로 조사(UCSD Moore' Cancer Center)하고, 그리고 항-CD19 마그네틱 비드(Miltenyi Biotec, Cat. No. 130-050-301) 및 LD 칼럼(Miltenyi Biotec, cat.# 130-091-509)을 사용하여 B 세포들을 격감시켰다. 즉, 피콜 분리에 의해 얻어진, 동결되고 조사된 PMBC들을 해동시키고, 두 번 세척하고 계수하였다. 그리고나서 세포들을 300 g로 10 분간 원심분리하였고, 상청액을 흡입하였다. 세포 펠렛을 매 107 세포들 당 80 ㎕ MACS 완충용액(0.5 % BSA 및 2mM EDTA를 갖는 PBS)으로 재현탁하고, 20㎕ CD19 마이크로비드들(MicroBeads)(매 107 세포들 당)를 첨가하였다. 완전히 섞은 후, 세포들을 4 ℃에서 15분 동안 배양하였다. 세포들을 그리고나서 1-2 ㎖ 완충용액(매 107 세포들 당)을 첨가라여 세척하고, 이어서 300 g로 10 분간 원심분리하고, 상청액을 흡입하였다. 그리고나서 최대 108 세포를 500 ㎕ 완충용액에 재현탁 하였다. 마그네틱 분리(Magnetic separation)는 LD 칼럼(세포들의 빠르고 온화한(gentle) 분리가 가능하도록 플라스틱 코팅으로 덮인 강자성 구체로 이루어진)을 MACS 분리기의 자기장에 둠으로써 수행하였다. LD 칼럼은 2 ㎖ 완충용액으로 세척하였고, 세포 현탁액을 칼럼 위에 적용하였다. 2x 1㎖ 완충용액의 첨가 후에 그들이 칼럼을 통과할 때 비(Non)-B 세포들을 모았다.
b. B 세포 클로닝
대략 20 EBV-형질전환된 B 세포들을 다중클론성 B 세포 자극제들 및 96 웰 플레이트에서 웰 당 50,000 조사된 B-세포 격감된 조사된 배양보조세포들과 함께 공동 배양하였고, 13일 동안 성장시켰다. 총 120 96-웰 플레이트들을 생성하였다.
5. B 세포 상청액의 RSV F 단백질에 대한 결합에 관한 스크리닝
각각의 웰로부터의 상청액들을 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고, 세포들을 PBS내에서 1X 세척하고, 10 ㎕/㎖ 2-머캅토에탄올을 포함하는 100 ㎕ RLT 완충용액(Qiagen, cat.# 79216)에서 -80 ℃로 동결하였다. RSV F 단백질에 결합할 수 있는 항체들을 생산하는 웰들을 결정하기 위해, 상청액을 ELISA에 사용하였다. 간단하게, ELISA는 다음과 같이 수행하였다: (1) RSV F 단백질 ELISA 플레이트들은 다음의 변경들을 갖는 96-웰 하프 에어리어 플레이트들(96-well half area plates)을 사용하여 실시예 1에서 설명된 바와 같이 준비하였다: 항-RSV mAb(클론 2F7, 마우스 복수액(ascites fluid), Cat. No. ab43812, Abcam)이 포획 항체로서 사용하였고, RSV F 단백질은 4 ℃에서 밤새도록 포획 항체와 함께 배양하였다. (2) 2 웰들 각각으로부터 10 ㎕ B 세포 상청액(총 20 ㎕ 풀된(pooled))이 96 하프-웰 ELISA 플레이트에 첨가하였고, 37 ℃에서 2 시간동안 배양하였다. 혈액 은행 공여자 풀로부터의 혈장(Ficoll Hypaque 분리 후에 모음 및 동결, 1:1000 희석)을 양성 대조군으로서 사용하였다. (3) 플레이트들이 상기와 같이 4X로 세척하였고, 50 ㎕의 염소 항-인간 Fc IgG HRP-접합 항체(0.05% 트윈 20을 갖는 PBS에서 1:1000 희석)이 각각의 웰에 첨가하였고, 플레이트가 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. (4) 플레이트들이 상기와 같이 6X로 세척하였고, 50 ㎕의 1:1 부피/부피(v/v) TMB:퍼옥사이드 용액(Pierce, Cat No. 34021) 기질을 사용하여 현상하였고, 7 분 동안 현상시켰다. 반응을 50 ㎕의 2N H2SO4를 첨가함으로써 즉각적으로 정지시키고, 450㎚에서 흡광도를 ELISA 플레이트 리더(plate reader)를 사용하여 측정하였다. 양성 결합은 0.5 보다 큰(0.5-0.9는 중간의(moderate) 결합, ＞ 1은 강한 결합) OD450 및 백그라운드의 3배 이상의 반응에 의해 표시하였다.
두 개의 풀된 웰 중 어느 것이 항-RSV 항체들을 포함하는지를 결정하기 위하여, 각각의 웰로부터 20 ㎕의 B 세포 상청액(PBS/0.05% 트윈 20으로 1:2 부피/부피(v/v) 희석된)이 포획된 RSV F 단백질에 대하여 개별적으로 재테스트 하였다.
총 18개의 플레이트들(또는 1080개의 웰들)을 RSV F 용해물(실시예 1에서 정제된 것과 같은)에 결합하는지에 관해 스크리닝하였다. 6개의 웰들을 RSV F 용해물에 대한 바인더로 동정하였다. 6개의 웰들 중 5개가 추가적인 ELISA에 의해 재확인하였고, PCR(하기에서 설명됨)에 의해 항-RSV 항체들을 생성하는데 사용하였다.
B. EBV -변형 B 세포의 발생 및 클로닝 그리고 RSV F 단백질로의 결합에 관한 스크리닝(공정 B)
말초혈액 단핵세포(PMBCs)를 샌디에고 혈액 은행 공여자로부터 얻었다. PBMCs를 Ficoll Hypaquefp 걸쳐 제조사 지침에 따라 밀도 원심분리로 단리하였다.
1. CD22 + 단리 및 CD22 + B 세포의 활성화
10.5 x 106 CD22+ B 세포를 CD22 마그네틱 구슬을 사용하여 공여자 PBMCs로부터 단리하고, 단리된 CD22+ B 세포를 상기 섹션 A.1에 기재된 바와 같이 24 웰 플레이트에서 배양하고 활성화하였다.
2. IgG + B 세포의 EBV -매개 불멸화
a. IgG + B 세포의 단리
11.3 x 106 활성화 CD22+ B 세포를 세척하고 비오틴-컨쥬게이트된 항-IgM 110 ㎕(BD Biosciences, cat. # 555781), 비오틴-컨쥬게이트된 항-IgD 22 ㎕(BD Biosciences, cat. # 555777) 및 비오틴-컨쥬게이트된 항-IgA 22 ㎕(Invitrogen, cat. # 62-7440) 및 비오틴-컨쥬게이트된 항-CD3 220 ㎕(BD Bioscience, cat. # 555331)항체들로 15분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 PBS (0.5% BSA 및 2 mM EDTA 함유) 중에 1X 세척하고 동일한 완충액 1.045mL에 재현탁하였다. IgG+ B 세포를 제조사의 지침에 따라 55 ㎕ 항-비오틴 마그네틱 비드(Miltenyi, cat.# 130-090-485) 및 LD 칼럼 (Miltenyi, cat.# 130-042-901)을 사용하여 IgM, IgD, IgA 및 CD의 역선택에 의해 강화하였다.
b. EBV 변형 세포의 배양을 위한 조사된 배양보조세포의 제조
조사된 배양보조세포를 사용하여 EBV-변형 B 세포의 성장 유지를 도왔다. 2~3명의 건장한 공여자의 혼합물로부터 PBMC를 얻었고 Ficoll 분리에 의해 단리시키고, 3300 rads로 조사하고 (UCSD Moore's Cancer Center), 디메틸술폭시드(Sigma cat. # D2650-100) 10%를 함유하는 FBS에서 바이알 당 5 x 106 세포로 냉동시켰다. 사용 전에, 세포 한 바이알을 해동시키고, 10 % 열-불활성화된 저 IgG 우태아 혈청 (Invitrogen, cat. # 16250-078), 1% 항생물질 (Hyclone, cat. # SV30010), 1 % 소듐 피루베이트 (Hyclone, cat.# SH30239.01) 및 1 % L-글루타민 (Hyclone, cat. # SH30034.01)를 함유하는 RPMI (Hyclone, cat.# SH30096.01) 3X으로 세척하였다. 세포를 계수하고, 1 x 106 cells/ml에 재현탁시키고 그리고 48 웰 플레이드의 웰당 0.25 x 106 세포로 플레이트 하였다.
c. EBV -매개 불멸화
0.58 x 106 IgG+, CD22+ 농축 B 세포를 0.5 ml EBV 상등액 (RMPI-1640 중 10% FCS 50% v/v, B 95-8 세포로부터 ATCC Cat. No. VR-1492)으로 16시간 동안 배양하여 B 세포의 벌크 불멸화를 수행하였다. 감염 후, 세포를 하나의 웰에서 10% 열-불활성화된 저 IgG 우태아 혈청(Invitrogen, cat.# 16250-078), 1% 항생물질 (Hyclone, cat.# SV30010), 1% 소듐 피루베이트 (Hyclone, cat. # SH30239.01) 및 1% L-글루타민 (Hyclone, cat.# SH30034.01)을 함유하는 RPMI (Hyclone, cat.# SH30096.01) 중에서 48 웰 플레이트의 웰 당 0.5 x 106 의 조사 배양보조세포로 세척하고 배양하였다. 48시간 후, 200 IU/ml rhIL-2 (R&D Systems, cat. #202-IL-50)을 첨가하고 세포를 추가로 7일 동안 배양하였다.
3. B 세포 클로닝
a. B 세포의 클로닝을 위한 조사된 B-세포 열화 배양보조세포의 제조
조사된 B-세포 열화 배양보조세포를 B 세포 클로닝을 위해 제조하였다. 5~6명의 건강한 공여자로부터 연막(buffy coats)을 얻었고 밤새도록 실온에서 보관하였다. PBMCs를 Ficoll 분리법으로 단리하고, 항-CD19 마그네틱 구슬(Miltenyi Biotec, Cat. No. 130-050-301) 및 LD 칼럼 (Miltenyi Biotec, cat. # 130-042-901)을 사용하여 B 세포를 열화시켰다.
즉, Ficoll 분리법으로부터 얻은 냉동된 PMBCs를 해동시키고, 2회 세척하고 계수하였다. 그리고 나서, 세포를 300 g에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 흡입하였다. 세포 펠렛을 매 107 세포 당 80 ㎕ MACS 완충액(0.5% BSA 및 2 mM EDTA를 갖는 PBS)에 재현탁시키고 20 ㎕ CD19 MicroBeads (107 세포 당)를 첨가하였다. 완전히 혼합시킨 후, 세포를 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그리고 나서 세포를 1-2 mL 완충액(107 세포 당)를 첨가하여 세척하고, 이어서 300 g에서 10분 동안 원심분리시키고 상청액을 흡입하였다. 그리고 나서 최대 108 세포를 500 ㎕ 완충액에 재현탁시켰다. MACS 분리기의 자기장에 (신속하고 부드러운 세포 분리를 위한 플라스틱 코팅으로 덮인 강자성 비드로 이루어진) LD 칼럼을 놓음으로써 마그네틱 분리를 수행하였다. LD 칼럼을 2 mL 완충액으로 세척하고 세포 현탁물을 칼럼의 최상부에 놓았다. 2 x 1 mL 완충액의 첨가 후, 비-B 세포가 칼럼을 통과함에 따라 그들을 수집하였다. 세포를 300g에서 10분 동안 원심분리하고 2 % 저 IgG 우태아 혈청을 함유하는 PBS 중의 5 x 106 cells/mL에 재현탁하였다. 세포를 4000 rads (at the UCSD Moore's Cancer Center)로 조사하고, 300g 에서 6분 동안 원심분리하고, 90 % 저 IgG FBS 및 10 % 디메틸술폭시드 (DMSO, 25 x 106 cells/mL) 중에서 재현탁시키고 그리고 액체 질소 중에서 냉동보관하였다.
사용 전에 세포를 해동시키고 10% 열-불활성화된 저 IgG 우태아 혈청(Invitrogen, cat. # 16250-078), 1 % 항생물질 (Hyclone, cat. # SV30010), 1 % 비필수 아미노산(Hyclone, cat. # SH30238.01) 및 1 % L-글루타민(Hyclone, cat. # SH30034.01)을 함유하는 Iscove's 변형 둘베코 배지(IMDM, Hyclone #SH30228.01) 로 3회 세척하였다.
b. B 세포 클로닝
대략 100 EBV-변형 B-세포를 96웰 플레이트에서 다클론성 B 세포 자극제 및 웰 당 50,000 조사 B-세포 열화 배양보조세포와 공동배양하고, 10 % 열-불활성화 저 IgG 우태아 혈청(Invitrogen, cat. # 16250-078), 1 % 항생물질 (Hyclone, cat. # SV30010), 1 % 비필수 아미노산(Hyclone, cat. #SH30238.01) 및 1% L-글루타민(Hyclone, cat. # SH30034.01)을 함유하는 IMDM (Hyclone, cat. # SH30228.01) 중에서 13일 동안 성장시켰다. 총 120 96-웰 플레이트를 생성하였다.
4. RSV F 단백질에 결합에 대한 B 세포 상등액의 스크리닝
각 웰의 상등액을 ELISA로 스크리닝하여 어느 웰이 RSV F 단백질에 결합할 수 있는 항체를 생성했는지를 측정하였다. ELISA를 섹션 A.5에 기재된 바와 같이 (실시예 1에 기재된 바와 같이) RSV F 단백질로 코팅된 96-웰 하프-영역 ELISA 플레이트에서 수행하였다. 상기와 같이, 2개의 풀된 웰 중 어느 것이 항-RSV 항체를 함유하는가를 결정하기 위해, 각각의 웰로부터 20 ㎕ of B 세포 상등액(1:2 v/v with PBS/0.05% Tween 20로 희석)을 캡쳐된 RSV F 단백질에 대해 개별적으로 재시험하였다.
총 120개의 플레이트 (또는 7200 웰)을 (실시예 1에서 정제된 바와 같은) RSV F 용해물에 대한 결합에 관하여 스크리닝하였다. 29개의 웰이 RSV F 용해물에 대한 결합제로서 동정하였다. 25개 웰 중 10개를 추가의 ELISA에 의해 재확인하였고 PCR에 의해 항-RSV 항체를 생성하는데 사용하였다.
C. PCR 에 의한 항- RSV 항체
RSV F 단백질에 결합하는 항체들의 생산을 위한 EBV-형질전환된 B 세포들의 최초의 스크리닝 다음에, 각각의 항체들을 코딩하는 유전자들이 PCR에 의해 B 세포 RNA로부터 증폭하였다. A섹션로부터 히트(hits)로서 동정된 5개의 웰들이 클로닝을 위해 선택하였다. 상기 섹션 B 중에서 히트로 확인된 10개의 웰을 클로닝을 위해 선택하였다.
1. RNA 추출
RNA는 다음의 변경들과 함께 제조자의 지시들에 따라 RNeasy Micro Kit (Qiagen, Cat. No. 1402-2408)를 사용하여 B 세포들(RSV F 단백질에 대한 양성 바인더에 대응하는 각각의 웰들에 대한)로부터 추출하였다: 1) B 세포들이 베타-머캅토에탄올(완충용액 ㎖ 당 10 ㎕)을 갖는 100 ㎕ RLT 완충용액에서 동결하였고; 2) 세포들은 균질화되지 않았고; 3) RNA를 70 % 에탄올(RNase-프리 물에서)로 침전시키고; 및 4) DNase 처리를 제조자의 보충 프로토콜에 따라 칼럼에서("in-column")에서 수행하였다. RNA를 최종 26 ㎕ 부피로 용리시켰다.
2. 첫 번째 가닥 cDNA 합성
RNA 추출 다음에, cDNA는 Superscript III(Invitrogen; Cat No. 19090-051) 첫 번째 가닥 합성 프로토콜에 따라 생성하였다. 간단하게, 8 ㎕ RNA(상기 바와 같이 단리된), 1 ㎕ 올리고(oligo) dT 프라이머 및 1 ㎕ dNTP들이 멸균된 0.2 ㎖ 튜브에서 합쳐졌고, 65 ℃에서 5 분 동안 배양하였고, 이어서 얼음에서 1 분 동안 배양하였다. 그 뒤에, 2 ㎕ 0.1 mM DTT, 4 ㎕ 25 mM MgCl2, 2 ㎕ RT 완충용액, 1 ㎕ RNaseOut, 및 1㎕ SuperScript III RT를 튜브에 첨가하였고, 반응 혼합물을 50 ℃에서 50 분 동안 배양하였고, 이어서 80 ℃에서 15 분 동안 배양하였다. cDNA는 즉시 사용되거나 장기간 보관을 위해 80℃에서 동결하였다.
3. PCR 증폭에 의한 IgG 중사슬 및 카파 ( Kappa ) 및 람다 ( Lambda ) 경사슬 유전자들의 분리
B 세포 첫 번째 가닥 cDNA 합성 반응(상기 참조)으로부터 PCR 증폭에 의해 IgG 중사슬들 및 카파 및 람다 경사슬을 생성하였다. 카파 경사슬 유전자들이 단일-단계(single-step) PCR에 의해 증폭하였고, 반면에 중사슬 유전자들 및 람다 경사슬 유전자들은 두-단계(two-step), 네스티드(nested) PCR 접근을 사용하여 증폭하였다. 증폭된 중 및 경사슬 유전자들은 그 뒤에 "오버랩 PCR(overlap PCR)"을 사용하여 단일 카세트(single cassette)에 연결하였다(linked).
단계 I. 증폭 또는 IgG 중사슬 유전자 및 람다 경사슬 유전자
단계 I에서, 중사슬 A, 첫 번째 가닥 합성(상기 참조)에 의해 생성된 2 ㎕ cDNA는, PCR에 의해 IgG 중사슬을 개별적으로 증폭하기 위한 주형(template)으로서 사용하였다. 이 단계에서, 단계 I 프라이머들의 풀들이 사용하였다(하기 표 3A 참조). 반응 조건들은 다음과 같았다:
PCR 단계 I: 중사슬 A:
시약 ㎕
H2O 16
10x 완충용액 2.5
10x 인핸서 완충용액 2.5
dNTP (각각 10 mM) 0.75
cDNA 2.0
VH 풀 판독기(pool leader) (각각 9 μM) 0.5
VH 리버스 풀(Reverse pool) (20 μM) 0.25
Pfx50 0.5
25
선택적으로, 단계 I에서, 중사슬 B, 첫번째 스트랜드 합성에서 생성된 2.5 ㎕ cDNA(상기 참조)를 PCR에 의한 IgG 중사슬을 개별적으로 증폭하기 위한 주형으로 사용하였다. 이 단계에서, 단계 I 프라이머의 동일한 풀을 전방 프라이머로 사용하였고, VH 감마-1(a/b) 역을 역 프라이머로 사용하였다 (표 3A 참조). 반응 조건은 다음과 같았다:
PCR 단계 I: 중사슬 B:
시약 ㎕
H2O 15.5
10x 완충용액 2.5
10x 인핸서 완충용액 2.5
dNTP (각각 10 mM) 0.75
cDNA 2.5
VH 풀 판독기(pool leader) (각각 9 μM) 0.5
VH 리버스 풀(Reverse pool) (20 μM) 0.25
Pfx50 0.5
25
단계 I, 람다 경사슬에서, 첫번째 스트랜드 합성에서 생성된 2.5 ㎕ cDNA(상기 참조)를 PCR에 의한 IgG 중사슬을 개별적으로 증폭하기 위한 주형으로 사용하였다. 이 단계에서, 단계 I 프라이머의 동일한 풀을 정방향 프라이머로 사용하였고, pCALCL(T)-R을 역방향 프라이머로 사용하였다 (표 3B 참조). 반응 조건은 다음과 같았다:
PCR 단계 I: 람다 경사슬 :
시약 ㎕
H2O 16
10x 완충용액 2.5
10x 인핸서 완충용액 2.5
dNTP (각각 10 mM) 0.75
cDNA 2.0
Vλ 풀 (각각 14.2 μM) 0.5
pCALCL(T)-R (20 μM) 0.25
Pfx50 0.5
25
PCR 반응에 대하여, 반응 증폭에 대한 특이성을 더하기 위하여 터치다운 접근(touchdown approach)을 시행하였다. 각각의 터치다운 단계에서, 어닐링 온도는 각 사이클에서 1 ℃ 만큼 감소하였다. PCR 써모사이클러(thermocycler) 조건들은 다음과 같았다.
1) 2 분 동안 94 ℃
2) 10 사이클:
15 초 동안 94 ℃; 20 초 동안 62 ℃(터치다운); 1 분 동안 68 ℃
3) 25 사이클:
15 초 동안 94 ℃; 20 초 동안 52 ℃; 1 분 동안 68 ℃
4) 3 분 동안 68 ℃
5) 4 ℃ 유지(hold)
생성된 반응 혼합물들은 어떤 추가적인 정제 없이 단계 II(하기 참조)를 위한 주형 DNA로서 사용하였다.
[표 3A]
Figure 112012100085696-pct00005
[표 3B]
Figure 112012100085696-pct00006
단계 II . IgG 중사슬 및 람다 경사슬 유전자들의 증폭
단계 II에서, 단계 I로부터의 중사슬 및 람다 경사슬 반응 혼합물들은, 각각의 사슬의 프레임워크 1 영역부터 불변 영역(중사슬의 CH1, 경사슬의 CL)의 말단까지 증폭하는 정방향 및 역방향 프라이머들의 풀을 갖는 제2 라운드 PCR 반응들을 위한 주형으로 사용하였다.
중사슬 정방향 프라이머들 (표 4 참조)은 SfiI 제한부위(SEQ ID NO: 41)를 도입하도록 디자인하였다. 반응 조건들은 다음과 같았다:
PCR II : 중사슬
시약 ㎕
H2O 12.75
10x 완충용액 2.5
10X 인핸서 2.5
dNTP (각각 10 mM) 0.75
단계 I 반응물 2.5
pCAL24VH-F 풀 (2 μM) 2.5
CH1-R Pool-Sfi (20 μM) 1
Pfx50 0.5
25
람다 경사슬 정방향 프라이머들(표 6 참조)을 SfiI 제한부위(SEQ ID NO: 41)를 도입하도록 디자인하였다. 반응 조건들은 다음과 같았다:
PCR II : 람다 경사슬
시약 ㎕
H2O 15.5
10x 완충용액 2.5
10X 인핸서 2.5
dNTP (각각 10 mM) 0.75
단계 I 반응물 2.5
Vλ 프라이머 풀 (2 μM) 2.5
pCALCL(T)R (20 μM) 1
Pfx50 0.5
25
단계 II 반응들을 위한 PCR 써모사이클러 조건들은 다음과 같았다:
1) 2 분 동안 94 ℃
2) 30 사이클:
15 초 동안 94 ℃; 20 초 동안 52 ℃; 1 분 동안 68 ℃
3) 3 분 동안 68 ℃
4) 4℃ 유지
카파 경사슬 유전자들을 증폭하기 위하여, 첫 번째 가닥 합성(상기 참조)에 의해 생성된 2 ㎕ cDNA는, PCR에 의해 IgG 카파 경사슬들을 개별적으로 증폭하기 위한 주형으로서 사용하였다. 경사슬 카파 정방향 프라이머들(표 5 참조)은 프라이머 풀들로서 사용하였고, SfiI 제한부위(SEQ ID NO: 41)를 도입하도록 디자인하였다.
반응 조건들은 다음과 같았다:
PCR II : 카파 경사슬
시약 ㎕
H2O 16
10x 완충용액 2.5
10X 인핸서 2.5
dNTP (각각 10 mM) 0.75
첫 번째 가닥 cDNA 2
Vκ 프라이머 풀 (9.1 μM) 0.5
pCALCK(G)L (20 μM) 0.25
Pfx50 0.50
25
단계 II 반응들을 위한 PCR 써모사이클러 조건들은 다음과 같았다:
1) 2 분 동안 94 ℃
2) 35 사이클:
15 초 동안 94℃; 20 초 동안 54 ℃; 1 분 동안 68℃
3) 3 분 동안 68 ℃
4) 4 ℃ 유지
증폭한 다음에, PCR 반응 생성물들을 1 % 아가로스 겔 상에서 분리하였고, 중사슬(675 bp) 및 경사슬(650 bp)에 대응하는 밴드를 겔 추출(gel extraction)(Qiagen Gel Extraction Kit; Cat. No. 28706)로 정제하였다. PCR 생성물들을 30 ㎕에 용리하였다.
[표 4]
Figure 112012100085696-pct00007
[표 5]
Figure 112012100085696-pct00008
[표 6]
Figure 112012100085696-pct00009
단계 III , 오버랩 PCR
단계 III에서, 단계 II에서 생성된 중사슬 및 경사슬 DNA 분절들(segments)은 1) 오버랩 반응에서 경사슬의 3’말단 및 중사슬의 5’말단을 어닐하는 Fab 링커(lingker)(하기 표 7 참조)와 연결하였고(linked), 2) Sfi 정방향 및 역방향 프라이머들과 함께 증폭하였고, 이것은 경사슬-링커-중사슬을 포함하는 1200 염기쌍(base pair)(bp) 항체 단편의 증폭을 허용하였다.
Fab 카파 링커는 FabLinker-Rev 또는 FabLinker-Rev-IT* 프라이머 (하기 표 7 참조)를 사용하여 2g12/pCAL 벡터(SEQ ID NO: 81)로부터 증폭하였다. Fab 링커의 형성을 위한 PCR 반응조건들은 다음과 같았다:
Fab 카파 링커
시약 ㎕
H2O 19.75
10x 완충용액 2.5
dNTP (각각 10 mM) 0.75
2g12/pCAL 벡터 (10 ng) 1
Fab링커CK-Fwd (20 μM) 0.25
역방향 프라이머(20 μM) 0.25
Pfx50 0.5
25
Fab 람다 링커는 28d11/pCAL 벡터(SEQ ID NO: 1636)로부터 증폭하였다. Fab 카파 링커의 형성을 위한 PCR 반응 조건들은 다음과 같았다:
Fab 람다 링커
시약 ㎕
H2O 35.5
10x 완충용액 5
10x 인핸서 5
dNTP (각각 10 mM) 1.5
28d11/pCAL 벡터 (10 ng) 1
Fab링커Cλ-Fwd (20 μM) 0.5
Fab링커-Rev IT* (20 μM) 0.5
Pfx50 0.5
25
Fab 링커들의 형성을 위한 PCR 써모사이클러 조건들은 다음과 같았다:
1) 2 분 동안 94 ℃
2) 30 사이클:
15 초 동안 94 ℃; 20 초 동안 54 ℃; 1 분 동안 68 ℃
3) 3 분 동안 68 ℃
4) 4℃ 유지
PCR 반응물을 1 % 아가로스 겔 상에서 이동시키고, 120 bp 링커를 Qiagen Gel Extraction 프로토콜에 따라 겔 추출하였다. 2 ㎕의 정제된 링커를 각각의 오버랩 반응에 사용하였다.
오버랩을 위한 PCR 반응 조건들은 다음과 같았다(첫 번째 15 사이클들 후에, Sfi F/R 프라이머들은 PCR 반응에 첨가하였다):
PCR III : 오버랩( Overlap )
시약 ㎕
H2O 24.5
10x 완충용액 5
10X 인핸서 5
dNTP (각각 10 mM) 1.5
경사슬 생성물 5
중사슬 생성물 5
링커 2
Sfi F/R 프라이머들 (20 μM) 1
Pfx50 1
50
PCR 써모사이클러 조건들은 다음과 같았다:
1) 2 분 동안 94 ℃
2) 15 사이클:
15 초 동안 94 ℃; 1 분 동안 68 ℃;
Sfi F/R 프라이머들(1 ㎕)을 첨가, 그리고나서:
3) 2 분 동안 94 ℃
4) 30 사이클:
15 초 동안 94 ℃; 20 초 동안 60℃; 2 분 동안 68 ℃
5) 3 분 동안 68 ℃
6) 4℃ 유지
증폭한 다음에, 총 50 ㎕ PCR 오버랩 반응 생성물 경사슬-링커-중사슬의 10 ㎕가 크기를 결정하기 위해서 1 % 아가로스 겔 상에서 분리하였고, 남아있는 40 ㎕의 PCR 생성물은 Qiagen PCR 정제 키트(Qiagen; Cat. No. 28106)에 의해 30 ㎕ 총 부피로 정제하였다. 간단하게, PBI 완충용액의 5배 PCR 반응 부피가 PCR 생성물에 첨가하였다. 혼합물을 QIA 스핀 칼럼에 결합시키고, PE 완충용액으로 2번 세척하였다. 시료가 30 ㎕에 용리하였고, 모든 30㎕가 용리되도록 최대 속도(top speed)로 1.5 분 동안 스핀(회전)하였다. 일반적으로 수율은 50㎕ 오버랩 반응 당 약 1㎍의 오버랩 생성물이었다.
[표 7]
Figure 112012100085696-pct00010
단계 IV . Sfi 에 의한 소화 및 pCAL 또는 pCAL IT * 발현 벡터로의 클로닝
오버랩 PCR 반응 및 PCR 생성물의 정제 다음에, 반응 생성물을 SfiI로 절단하였다. 다음을 절단을 위해 용출액(eluate)(상기 참조)에 첨가하였다:
4 ㎕ 반응 완충용액 2 (New England Biolabs)
0.4 ㎕ BSA
1.6 ㎕ SfiI 효소 (New England Biolabs)
4 ㎕ H 2 O
40 ㎕ 총부피
반응물을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 절단 다음에, 절단된 오버랩 생성물들을 1 % 아가로스 겔 상에서 분리하였고, 항체(~1.45 kB)에 대응하는 밴드를 겔 추출(Qiagen Gel Extraction Purification Kit Cat. No. 28706)에 의해 정제하였다. 간단하게, 겔 슬라이스(gel slice)를 500 ㎕의 완충용액 QC(Qiagen)로 절단하였다. 150㎕의 이소프로판올(isopropanol)을 절단물(digest)에 첨가하였고, 시료를 QiaSpin 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 완충용액 PE(Qiagen)으로 두 번 세척하고, 시료를 30 ㎕의 EB 완충용액(Qiagen)에 용리시켰다. 대략 1 ㎍의 PCR 오버랩 생성물로부터 약 15 ng/㎕의 절단된 시료를 회수하였다.
최종적으로, 절단된 오버랩 생성물을 pCAL (SEQ ID NO: 86) 또는 pCAL IT*(SEQ ID NO: 394) 박테리아 발현 벡터에 결찰하였다(ligated). 결찰(ligation) 반응 조건들은 다음과 같았다:
25 ng SfiI 절단된 pCAL 또는 pCAL IT* 벡터
25 ng 절단된 오버랩 생성물
2 ㎕ T4 리가아제 반응 완충액
1 ㎕ T4 리가제 ( Ligase )( NEB Cat . No . MC202L , 400,000 유닛( Units )/㎖)
H2O로 20 ㎕ 총부피로 조정하였다.
시료를 실온에서 1 시간 동안 결찰하였다. 형질전환에 들어가기 전에 1 ㎕의 결찰물 4 ㎕의 H2O에 희석하였다.
단계 V. E. coli 에 형질전환
결찰 후, 결찰물(ligation product)을 DH5α Max Efficiency 세포들 (Invitrogen; Cat No. 18258; 유전자형(Genotype): F-φ80lacZ△M15△(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1)에 형질전환하였다. 간단하게, 1㎕ 결찰물(1/5 희석)을 50 ㎕ DH5α에 첨가하였고, 얼음에서 30 분 동안 배양하였다. 42 ℃ 에서 45 초 동안 열 쇼크(heat shock)에 이어 얼음에서 2 분으로 형질전환을 수행하였다. 0.9 ㎖ SOC 배지를 첨가하고, 세포들을 흔들어주면서 37 ℃에서 1시간 동안 회수하였다. 세포들을 카르베니실린(carbenicillin)(100 ㎍/㎖) 및 20 mM 글루코오스가 보충된 LB 플레이트들에 플레이트하였다. 플레이트들을 37 ℃에서 밤새도록 배양하였다.
단계 VI . 개별적인 콜로니들의 선택
각각의 항체 증폭을 위하여, 총 88 개별적인 콜로니들이 선택하였고, 96-웰 플레이트에서 1 카르베니실린(100 ㎍/㎖)이 보충된 1 ㎖ 슈퍼 브로스(Super Broth)(SB)에서 37 ℃에서 2 시간 동안 성장시켰다. 각각의 배양액(culture)의 500㎕를 40 mM 글루코오스(최종 20 mM) 및 100 ㎍/㎖ 카르베니실린이 보충된 SB 500 ㎕를 갖는 다른 96-웰 포맷 박테리아 플레이트에 옮김으로써 자손 플레이트(daughter plate)를 생성하였다. 원래의(original) 또는 어머니(mother) 플레이트들은 100 ㎍/㎖ 카르베니실린이 보충된 SB 500㎕이 공급하였다. 원래의 플레이트를 30 ℃에서 밤새도록 성장시키고, 자손 플레이트(글루코오스 포함)를 37 ℃에서 밤새도록 성장시켰다. 30 ℃ 플레이트로부터의 세포 용해물을 박테리아 ELISA(하기 실시예 4 참조)에 사용하였고 37 ℃ 플레이트 배양물들을 미니-프렙(mini-prep) DNA preparations (Qiagen)을 위해 사용하였다.
요약
상기 섹션 A로부터 히트(hits)로 동정된 5개의 웰들이 카파 경사슬 프라이머들을 사용하여 증폭하였고, pCAL 발현 벡터에 클로닝하였다. 상기 섹션 B에서 히드로 동정된 10 개의 웰을 카파 경사슬 프라이머로 증폭시키고 pCAL IT* 발현 벡터로 클론시켰다. 하나의 웰을 부가적으로 람다 경사슬 프라이머로 증폭시키고 pCAL IT* 발현 벡터로 클론하였다.
실시예 3
단일 세포 분류( Single Cell Sorting )에 의한 항- RSV Fab 항체들의 분리
이 실시예에서, 항-RSV 항체들은 CD19/CD27/IgG 양성(positive) 세포들로부터 분리하였다. CD19/CD27/IgG 양성 세포들은 1) B 세포 분리; 및 2) FACS 단일 세포 분류에 의해 얻어졌다. 분류된 세포들은 그리고나서 Fab 항체들의 인 비트로 생산을 위한 주형으로 역할을 하는 RNA를 분리하는데 사용하였다.
B 세포 분리
B 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec, Cat. No. 130-091-151)를 사용하여 PBMC들(익명의 혈액 은행 공여자로부터 채취됨)로부터 분리하였다. 키트가 자기적(magnetic) 표지 및 CD2, CD14, CD16, CD36, CD43, 및 CD235a-발현하는 세포들(활성화된 B 세포들, 형질 세포들(plasma cells) 및 CD5+ B-1a 세포들) 및 비(non)-B 세포들(예를 들어, T 세포들, NK 세포들, 수지상 세포들, 대식세포들, 과립구들, 및 적혈구 세포들(erythroid cells))의 격감(depletion)에 의해 매우 순수한 B 세포들을 분리하는데 사용하였다. 제조자들의 프로토콜에 따라, 비-B 세포들을, 제1 표지 시약(Biotin-Antibody Cocktail)으로서 비오틴-접합 단일 클론 항체들 및 제2 표지 시약(Anti-Biotin MicroBeads)으로서 항-비오틴 단일클론 항체 접합 마이크로비드들의 칵테일을 사용하여 비직접적으로 자기적으로 표지하였다. 비-B 세포들을, 그리고나서 자기적 분리에 의해 순수한 휴지기(resting)의 B 세포들로부터 제거하였다.
간단하게, Ficoll 분리로부터 수득된 동결 PMBC들을 해동시키고, 두 번 세척하고 계수하였다(counted). 그리고 나서 세포들을 300 g로 10 분 동안 원심분리하였고, 상청액을 흡입하였다. 세포 펠렛을 40 ㎕ MACS 완충용액(매 107 세포들 당)에 재현탁 하였고, 10 ㎕ 비오틴-항체 칵테일(매 107 세포들 당)을 첨가하였다. 완전히 섞고난 후, 세포들을 4 ℃에서 10 분 동안 배양하였다. 배양 기간 후에, 30 ㎕ 완충용액(매 107 세포들 당) 및 20 ㎕ 항-비오틴 마이크로비드들(매 107 세포들 당)을 첨가하였다. 완전히 섞은 후, 세포들을 4 ℃에서 15 분 동안 배양하였다. 그리고나서, 세포들을 1-2 ㎖ 완충용액(매 107 세포들 당)을 첨가하여 세척하였고, 이어서 300 g로 10 분간 원심분리하였고, 상청액을 흡입하였다. 그리고나서, 최대 108 세포를 500㎕ 완충용액에서 재현탁하였다.
LS 칼럼(세포들의 빠르고 온화한 분리가 가능하도록 플라스틱 코팅으로 덮인 강자성 구체들로 이루어진)을 MACS 분리기의 자기장에 둠으로써 마그네틱 분리를 수행하였다. LS 칼럼을 3 ㎖ 완충용액으로 세척하고 세포 현탁액을 칼럼 상에 적용하였다. 3 x 3 ㎖ 완충용액의 첨과 후에 그들이 칼럼을 통과할 때 비표지된 B 세포들을 모았다.
단일 세포 분류
이 실시예에서, 단리된 B 세포들을 FACSAria Flow Cytometer(BD Biosciences)를 사용하여 항원 특이성에 의해 분류하였다. 선택된 세포들은 CD19/CD27/IgG 양성이었다. RSV-F 항원은 제조자의 지시(Molecular Probes, A-20186)에 따라 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647로 표지하였다.
즉, 단리된 B 세포들을 16개의 단리된 튜브들에 나누었다(aliquotted). 14개의 튜브들에 1x105 세포들을 수용하고, FACSAria에서 광전자배증관 세팅들(photomultiplier settings) 및 분류 파라미터들을 결정하는데 사용하였다. 남은 1.8x106 세포들을 최종 농도 20nM에서 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647/RSV-F로 표지하였다. 항체 첨가 15분 전에, 표지된 단백질을 시료에 첨가하였다. IgG 항체를 1:50으로 희석시켜 사용할 때, CD19 및 CD27 항체들을 1:20으로 희석시켜 사용하였다. 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647/RSV-F 단백질 및 항체들의 첨가 다음에, 튜브들을 얼음에서 30분 동안 배양하였고, 이어서 두 번 세척하였다. 단일 세포 분류는 FACSAria Flow Cytometer(유세포분석기)(BD Biosciences)를 사용하여 수행하였다. 표지들은 PE-Cy5(항-인간 CD19), PE-Cy7(항-인간 CD27), PE(염소 항-인간 IgG Fcg), 퍼시픽 블루(Pacific Blue)(마우스 항-인간 CD3), FITC(마우스 항-인간 IgD, 마우스 항-인간 IgM, 마우스 항-인간 IgA 및 마우스 항-인간 CD14), 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide) 및 알렉사 플루오르 647 (표지된 RSV-F 단백질)를 포함하였다.
세포 분류를 먼저 죽은 세포들을 제외하고, 이어서 CD3 양성 세포들을 제외하여 수행하였다. CD19 및 CD27 양성 세포들을 추가동정하였고, 이 군집 내에서, 세포들을 IgG Fcγ 발현에 대해 게이트하였다(gated).
IgD, IgM 및 IgA를 발현하는 세포들을 남은 세포들에서 배제하였다. 최종적으로, CD19/CD27/IgG Fcγ 양성 세포들은 RSV-F 결합에 관해 분류하였고, 각각의 양성 B 세포를 2 ㎕ cDNA 반응 완충용액(Superscript III 10X 완충용액, Invitrogen; Cat No. 19090-051), 0.5 ㎕ RNaseOUT 및 7.5 ㎕ 멸균수를 포함하는 96웰 플레이트의 개개의 웰에 넣었다. 플레이트들을 -80 ℃에서 추가 공정(process) 전까지 보관하였다.
첫 번째 가닥 cDNA 합성
분류한 다음에, cDNA를 Invitrogen 첫 번째 가닥 합성 프로토콜에 따라 각각에 웰에서 개별적으로 생성하였다. 즉, 0.5 ㎕ 10 % NP-40, 1 ㎕ 올리고(oligo) dT 프라이머 및 1 ㎕ dNTP들을 각각의 웰에 첨가하였고, 플레이트가 65 ℃에서 5 분 동안 배양하였고, 이어서 얼음에서 1 분 동안 배양하였다. 다음으로, 2 ㎕ DTT, 4 ㎕ MgCl2 및 1 ㎕ SuperScript III RT가 첨가하였고, 반응 혼합물을 50 ℃에서 1 시간 동안 배양하였고, 이어서 85 ℃에서 5 분 동안 배양하였다. cDNA는 즉시 사용되거나 장기간 보관을 위해 80℃에서 동결시켰다.
IgG 중사슬 및 카파 경사슬 증폭
IgG 경사슬들 및 카파 경사슬들을 PCR의 4개의 순차적인 단계에 의해 순차적으로 생성하였다.
단계 1. 증폭
단계 I에서, 첫 번째 가닥 합성(상기 참조)에 의해 생성된 2.5 ㎕ cDNA를 PCR에 의해 카파 경사슬들 및 IgG 중사슬들을 개별적으로 증폭하기 위한 주형으로 사용하였다. 이 단계에서, 단계 I 프라이머들의 풀을 사용하였다(하기 표 8 및 9 참조). 반응 조건들은 다음과 같다:
PCR 단계 I:
H2O 16
10x 완충용액 2.5
10x 인핸서 완충용액 2.5
dNTP (각각 10 mM) 0.75
cDNA 2.5
단계 I 풀 (각각 20 μM) 0.25
역방향 프라이머 (20 μM) 0.25
Pfx50 0.25
25㎕
PCR 써모사이클러 조건들은 다음과 같다.
1) 2 분(2:00)동안 94 ℃
2) 10 사이클:
15 초(0:15) 동안 94℃; 20 초(0:20) 동안 62℃(터치다운); 1 분(1:00) 동안 68℃
3) 40 사이클:
15 초(0:15) 동안 94℃; 20 초(0:15) 동안 52℃; 1 분(1:00) 동안 68℃
4) 3 분(3:00) 동안 68℃
5) 4℃ 유지
반응 혼합물들을 어떤 추가적인 정제 없이 단계 II(하기 참조)를 위한 주형 DNA로서 사용하였다.
[표 8]
Figure 112012100085696-pct00011
[표 9]
Figure 112012100085696-pct00012
단계 II . 증폭
단계 II에서, 단계 I로부터의 반응 혼합물들을 각각 경사슬 또는 중사슬 중 어느 하나를 위한 정방향 및 역방향 프라이머들의 풀을 갖는 제2 PCR 반응들을 위한 주형들로 사용하였다. 이 반응들은 각 사슬의 프레임워크 1 영역으로부터 DNA를 증폭하였다. 경사슬 정방향 프라이머들(표 10 참조)을 SfiI 제한부위(SEQ ID NO: 41)를 도입하도록 디자인하였다. 반응 조건들은 다음과 같다:
PCR II : 경사슬
H2O 15.75
10x 완충용액 2.5
10X 인핸서 2.5
dNTP (각각 10 mM) 0.75
단계 I 반응물 2.5
Vk 프라이머 풀 (9.1 μM) 0.5
pCALCK(G)L (20 μM) 0.25
Pfx50 0.25
25㎕
중사슬 정방향 프라이머들(표 11 참조)은 SalI 제한부위(SEQ ID NO: 96)를 도입하도록 디자인하였다. 반응 조건들은 다음과 같았다:
PCR II: 중사슬
H2O 14.25
10x 완충용액 2.5
10X 인핸서 2.5
dNTP (각각 10 mM) 0.75
단계 I 반응물 2.5
pCAL24VH-F 풀 (2 μM) 2
SalI JH-Rev 풀 (20 μM) 0.25
Pfx50 0.25
25㎕
PCR 써모사이클러 조건들은 다음과 같았다:
1) 2 분 동안 94 ℃
2) 50 사이클:
15 초 동안 94 ℃; 20 초 동안 54 ℃; 1 분 동안 68℃
3) 3 분 동안 68℃
4) 4 ℃ 유지
증폭 후, PCR 반응 생성물들을 1 % 아가로스 겔 상에서 분리하였고, 중사슬(400 bp) 및 경사슬(650 bp)에 대응하는 밴드를 겔 추출(Qiagen)에 의해 정제하였다.
[표 10]
Figure 112012100085696-pct00013
[표 11]
Figure 112012100085696-pct00014
단계 III . 오버랩 PCR
단계 III에서, 단계 II에서 생성된 중사슬 및 경사슬 DNA 분절들(segments)을 1) 오버랩 반응에서 경사슬의 3’말단 및 중사슬의 5’말단을 어닐하는 Fab 링커(lingker)(하기 표 12 참조)와 연결하였고, 2) 경사슬의 5’말단을 어닐하는 Sfi 정방향 프라이머(하기 표 12 참조) 및 중사슬의 3’말단을 어닐하는 JH 역방향 프라이머들(상기 표 11 참조)과 함께 증폭하였고, 이것에 의해 경사슬-링커-중사슬을 포함하는 1200 염기쌍(bp) 항체 단편이 증폭되었다. 반응 조건들은 다음과 같다(링커는 상기 실시예 2에서 설명된 바와 같이 형성하였다):
H2O 24.5
10x 완충용액 5
10X 인핸서 5
dNTP (각각 10 mM) 1.5
경사슬 5
중사슬 5
링커 2
Sfi F/JH-R 프라이머들 (20 μM) 1
Pfx50 1
50㎕
PCR 써모사이클러 조건들은 다음과 같았다:
링커와 함께 오버랩(Overlap with Lingker)
1) 2 분 동안 94 ℃
2) 15 사이클:
15초 동안 94 ℃; 1 분 동안 68℃
프라이머들을 첨가
3) 2 분 동안 94 ℃
4) 30 사이클:
15 초 동안 94 ℃; 20 초 동안 60 ℃; 1 분 동안 68 ℃
5) 3 분 동안 68 ℃
6) 4 ℃ 유지
증폭한 다음에, PCR 반응 생성물 경사슬-링커-중사슬을 1 % 아가로스 겔 상에서 분리하였고 겔 추출(Qiagen)로 정제하였다.
단계 IV . CH 1 영역의 도입
오버랩 다음에, 증폭된 경사슬-링커-중사슬을 Sal I으로 절단시키고, 중사슬 불변 영역의 3’말단에 SfiI 제한 영역을 도입하는 Sal1 절단된 중사슬 불변 영역 1(CHγ1 영역)에 결찰하였다. 결찰 반응 조건들은 다음과 같았다:
2 ㎕의 결찰 반응 완충용액
2 ㎕의 CH1
5 ㎕의 단계 III으로부터의 1.2 kB 겔 정제 생성물
10 ㎕의 물
1 ㎕ T4 리가제
결찰 반응 혼합물은 상온에서 30분 동안 배양하였다.
결찰 후, 전장 Fab는 SfiI 정방향 및 역방향 프라이머들(하기 표 12 참조)과 함께 PCR에 의해 증폭되어 1.45 kb 단편이 증폭하였다.
반응 조건들은 다음과 같았다:
H2O 31.5
10x 완충용액 5
10X 인핸서 5
dNTP (각각 10 mM) 1.5
연결 반응 혼합물 5
Sfi F/R 프라이머들 (20 μM) 1
Pfx50 1
50㎕
PCR 써모사이클러 조건들은 다음과 같았다:
1) 2 분 동안 94 ℃
2) 30 사이클:
15 초 동안 94 ℃; 20 초 동안 60 ℃; 1 분 동안 68 ℃
3) 3 분 동안 68 ℃
4) 4 ℃ 유지
반응 생성물은 단일 카세트에서 경사슬 및 중사슬이 서로 연결된 1.45kB 단편이었다.
[표 12]
Figure 112012100085696-pct00015
단계 V. Sfi 로 절단 및 pCAL 발현 벡터에 클로닝
오버랩 PCR 반응 및 PCR 생성물의 정제 다음에, 반응 생성물을 SfiI로 절단하였다. 30 ㎕ 용출액(eluate)(상기 참조)에, 다음이 절단을 위해 첨가하였다:
4 ㎕ 반응 완충용액 2 (New England Biolabs)
0.4 ㎕ BSA
1.6 ㎕ SfiI 효소 (New England Biolabs)
4 ㎕ H 2 O
40 ㎕ 총부피
반응물을 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 절단 다음에, 절단된 오버랩 생성물들을 1 % 아가로스 겔 상에서 분리하였고, 항체(~1.45 kB)에 대응하는 밴드를 겔 추출(Qiagen Gel Extraction Purification Kit Cat. No. 28706)에 의해 정제하였다. 간단하게, 겔 슬라이스를 500 ㎕의 완충용액 QC(Qiagen)로 절단하였다. 150㎕의 이소프로판올을 절단물(digest)에 첨가하였고, 시료를 QiaSpin 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 완충용액 PE(Qiagen)으로 두 번 세척하고, 시료를 30 ㎕의 EB 완충용액(Qiagen)에 용리하였다. 거의 1 ㎍의 PCR 오버랩 생성물로부터 약 15 ng/㎕의 절단된 시료가 회복하였다.
최종적으로, 절단된 오버랩 생성물이 pCAL 박테리아 발현 벡터(SEQ ID NO: 86)에 연결하였다(ligated). 연결(ligation) 반응 조건들은 다음과 같았다:
25 ng SfiI 절단된 pCAL 벡터
25 ng 절단된 오버랩 생성물
1 ㎕ T4 리가제 ( NEB Cat . No . MC202L , 400,000 유닛/㎖)
20㎕ 총부피
시료를 상온에서 1 시간 동안 결찰하였다. 형질전환에 들어가기 전에, 1㎕의 결찰물을 4㎕의 H2O에서 희석하였다.
단계 VI . E. coli 에 형질전환
결찰 후, 결찰물이을DH5α Max Efficiency 세포들 (Invitrogen; Cat No. 18258; 유전자형: F-φ80lacZ△M15△(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1)에 형질전환하였다. 즉, 1 ㎕ 결찰물(1/5 희석)을 50 ㎕ DH5α에 첨가하였고, 얼음에서 30 분 동안 배양하였다. 형질전환을 42 ℃에서 45 초 동안 열 쇼크(heat shock)에 이어 얼음에서 2 분에 의해 수행하였다. 0.9 ㎖ SOC 배지를 첨가하였고, 세포들을 흔들어주면서 37 ℃에서 1 시간 동안 회수하였다. 세포들을 카르베니실린(100 ㎍/㎖) 및 20 mM 글루코오스가 보충된 LB 플레이트들에 플레이트하였다. 플레이트들을 37 ℃에서 밤새도록 배양하였다.
단계 VII . 개별적인 콜로니들의 선택
총 88 개별적인 콜로니들을 선별하였고, 96-웰 플레이트에서 1 카르베니실린(100 ㎍/㎖)이 보충된 1 ㎖ 슈퍼 브로스(SB)에서 37 ℃에서 2 시간 동안 성장하였다. 각각의 배양액(culture)의 500 ㎕를 40 mM 글루코오스(최종 20 mM) 및 100 ㎍/㎖ 카르베니실린이 보충된 SB 500 ㎕를 갖는 다른 96-웰 포맷 박테리아 플레이트에 옮김으로써 자손 플레이트(daughter plate)를 생성하였다. 원래의(original) 또는 어머니(mother) 플레이트들을 100 ㎍/㎖ 카르베니실린이 보충된 SB 500 ㎕이 공급하였다. 원래의 플레이트를 30 ℃에서 밤새도록 성장시키고, 자손 플레이트(글루코오스 포함)를 37 ℃에서 밤새도록 성장시켰다. 30 ℃ 플레이트로부터의 세포 용해물을 박테리아 ELISA들(하기 실시예 4 참조)에 사용하였고 37 ℃ 플레이트 배양물들을 미니-프렙(mini-prep) DNA 제제 (Qiagen)을 위해 사용하였다.
실시예 4
RSV F 단백질에 결합하는 항체
이 실시예에서, 실시예들 2 및 3에서 생성된 Fab 항체들을, 정제된 RSV F1 용해물(용해물)에 결합하는 그들의 능력에 대해 ELISA에 의해 테스트하였다. 즉, 1 부피가 총 3부피로 희석된(PBS/3 % BSA/0.01 % 트윈20로) 50㎕ 박테리아 세포 용해물을 미리 RSV F1 용해물로 코팅된 96-웰 ELISA 플레이트(상기 실시예 1 참조)에 첨가하였다. 플레이트를 3 7℃에서 2 시간 동안 배양하거나, 또는 대신에 4 ℃에서 밤새도록 배양하였고, 이어서 세척 완충용액(PBS/0.05% 트윈20)으로 4x 세척하였다. PBS/3 % BSA/0.01% 트윈20에서 1:1000 희석된 50 ㎕ 염소 항-인간 IgG F(ab)-HRP 항체(Jackson Labs Cat. No. 109-036-097)를 첨가하였고, 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다.
세척 완충용액으로 6x 세척한 다음에, 50 ㎕ 1:1 부피/부피(v/v) TMB:퍼록사이드 용액(Pierce, Cat No. 34021)이 첨가하였고, 7 분 동안 현상되도록 하였다. 반응은 50 ㎕의 2N H2SO4를 첨가함으로써 즉각적으로 정지하였고, 450 ㎚에서 흡광도(absorbance)가 ELISA 플레이트 리더(plate reader)를 사용하여 측정하였다. 양성 결합은 0.5 보다 큰 (0.5-0.9는 중간의 결합, ＞ 1은 강한 결합) OD450 및 백그라운드의 3배 이상의 반응에 의해 표시하였다.
RSV F1 용해물에 결합에 더하여, 몇몇 양성 및 음성 대조군 항체들을 또한 사용하였다. 혈액 은행 공여자들의 풀로부터의 혈장(Ficoll Hypaque 분리 후에 모음 및 동결, 1:1000 희석)을 RSV F1 용해물 결합에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 각각의 박테리아 세포 용해물이 온전한(intact) Fab를 포함하는지 결정하는 양성 대조군으로서, 어피니퓨어(Affinipure) 염소 항-인간 F(ab)2 항체(1㎍/㎖ Jackson Immunoresearch Cat. No. 109-006-097)를 온전한 Fab를 포획하기 위해 96-웰 ELISA 플레이트를 코팅하는데 사용하였다. 이 항체는 오직 IgG 항체의 F(ab) 부분(portion)에 결합한다. Fab 발현은 그리고나서 항-HA 퍼록시다제(Roche, Cat. # 12013819001; 박테리아 발현된 Fab들이 HA-태그(tag)를 갖는다)를 사용함으로써 검출하였다. 액틴(Actin)(1 ㎍/㎖, Sigma Cat. No. A3653)을 어느 단백질에 결합하는 Fab에 대한 음성 대조군으로서 사용하였고, 마우스 항-액틴 항체(1.25 ㎍/㎖, Sigma Cat. No. A3853) 및 염소 항-마우스 IgG F(ab)-HRP 항체(Santa Cruz Biotech Cat. No. SC3697)를 사용하는 ELISA 반응에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 마우스 항-RSV mAb(클론 2F7, 마우스 복수액, Cat. No. ab43812, Abcam)을 RSV F 단백질에 대한 결합의 특이성에 대한 음성 대조군으로서 포함시키고, 이 항체를 ELISA 플레이트에서 RSV F 단백질에 결합하는데 사용하였고 따라서 인간 항-RSV 항체들의 스크리닝 동안에 ELISA 플레이트들에서 제시되었다.
A. EBV -형질전환된 B 세포들로부터 생성된 Fab 들에 대한 세포 용해물들의 결합( 실시예 2, 섹셩 A 및 C, 카라 경사슬 , pCAL 벡터로 클론됨 참조)
상기 실시예 2에서 생성된 88 세포 용해물들을 1) 항-Fab 항체에 결합하는 그들의 능력; 및 2) RSV F1 용해물에 결합하는 그들의 능력에 관해, ELISA에 의해 테스트하였다. ELISA는, 88 세포 용해물들 중 59 세포 융해물들이 RSV F 용해물에 결합하는데 반해, 88 세포 용해물들 중 76 세포 융해물들이 Fab 생성에 대해 양성임을 확인하였다. ELISA는 76 세포 융해물들 중 72 세포 융해물들이 Fab을 생산하였고, 초기의 59 양성 히트들(hits) 중 46 양성 히트들은 RSV F 용해물에 대한 바인더로서 재확인되었음을 나타내었다.
양성 바인더들 중 셋을 상응하는 DNA 프렙(prep)의 DNA 서열화에 의해 동정하였다. 서열검정은, 그들 모두가 동일한 서열을 가졌고 다음의 경 및 중사슬들을 가지는 Fab 58c5로서 동정되었음을 나타내었다:
Fab 58 c5
경사슬
EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVPSRFTGSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 5)
중사슬
QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNTYYTPSLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(SEQ ID NO: 1)
B. 단일 세포 분류로부터 생성된 Fab 들에 대한 세포 융해물들의 결합( 실시예 3 참조)
결과는 실시예 3에서 생성된 88 세포 용해물들 중 64 세포 융해물들이 RSV F1 단백질에 결합한다는 것을 나타낸다. 24 양성 바인더들을 대응하는 DNA 프렙의 DNA 서열결정에 의해 동정하였다.
동정된 양성 바인더들 중 하나는 다음의 경 및 중사슬들을 갖는 Fab sc5이었다:
Fab sc5
경사슬
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIKNYLNWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYSCQQSYNNQLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 13)
중사슬
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCTVSGDSISGSNWWNWVRQPPGKGLEWIGEIYYRGTTNYKSSLKGRVTMSVDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYCARGGRSTFGPDYYYYMDVWGRGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(SEQ ID NO: 9)
C. EBV -형질전환 B 세포로부터 생성된 Fab 들에 대한 세포 용해물들의 결합(실 시예 2, 섹션 B 및 C 참조, 카파 또는 람다 경사슬 , pCAL IT * 벡터로 클론)
하기 실험에서, ELISA 분석을 다음의 변형과 함께 상기와 같이 수행하였다: 58c5 및 sc5 Fab를 발현하는 세균 상등액을 RSV F1 용해물(재조합 기원) 및 HEp2 용해물 (음성 RSV F 기원)에 대한 결합을 위한 양성 대조로서, 3 % BSA 및 0.01 % Tween20을 함유하는 PBS 중 1:3 희석으로 사용하였다.
Fab 30 D8
30D8의 경우, 실시예 2에서 생성된 77 세포 용해물을 ELISA에 의해 1)항-Fab 항체에 결합하는 능력; 및 2) RSV F1 용해물에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. ELISA는 70개의 세포 용해물이 Fab 생산물에 대해서는 양성인 반면, 77 개의 세포 용해물 중 63개는 RSV F 용해물에 결합한다는 것을 나타내었다. 8개 클론에 대한 확인 ELISA는 8개 세포 용해물 중 8개가 Fab를 생산하였고 시험된 8개의 히트 중 6개가 RSV F 용해물에 대한 바인더로 확인하였다. 양성 바인더 중 3개를 서열화하였고 모두 다음의 경사슬 및 중사슬을 갖는 동일한 항체를 함유하였다 (30D8):
경사슬
QSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLVVYDDRDRPSGIPDRFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECS (SEQ ID NO:395)
중사슬
EVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTEYAQKIQGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC (SEQ ID NO:396)
Fab 104 E5
104E5의 경우, 실시예 2에서 생성된 88 세포 용해물을 ELISA에 의해 1)항-Fab 항체에 결합하는 능력; 및 2) RSV F1 용해물에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. ELISA는 15개의 세포 용해물이 Fab 생산물에 대해서는 양성인 반면, 88 개의 세포 용해물 중 4개는 RSV F 용해물에 결합한다는 것을 나타내었다. 24개 클론에 대한 확인 ELISA는 24개 세포 용해물 중 10개가 Fab를 생산하였고 시험된 24개의 히트 중 7개가 RSV F 용해물에 대한 바인더로 확인하였다. 양성 바인더 중 2개를 서열화하였고 모두 다음의 경사슬 및 중사슬을 갖는 동일한 항체를 함유하였다 (104E5):
경사슬
DIQMTQSPSSLPASVGDRVTITCRASQNIKTYLNWYQQKPGRAPKLLISAVSNLQSGVPSRFSGTGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSFSIPLTFGGGAKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:397)
중사슬
QVQLEQSGAEVKKPGSSVKVSCKPSGGTFDTYTISWVRQAPGQRLEWLGRIIPSLGETNYAHKLQGRVTITADKATSVVYMDLSDLTSEDAAVYYCAFRITGPVDWVWDYGMDVWGQGTTVSVSSASSKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC (SEQ ID NO:398)
Fab 38F10
38F10의 경우, 실시예 2에서 생성된 88 세포 용해물을 ELISA에 의해 1)항-Fab 항체에 결합하는 능력; 및 2) RSV F1 용해물에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. ELISA는 65개의 세포 용해물이 Fab 산물에 대해서는 양성인 반면, 88 개의 세포 용해물 중 40개는 RSV F 용해물에 결합한다는 것을 나타내었다. 16개의 클론에 대한 확인 ELISA는 16개 세포 용해물 중 13개가 Fab를 생산하였고 시험된 16개의 히트 중 13개가 RSV F 용해물에 대한 바인더로 확인하였다. 양성 바인더 중 5개를 서열화하였고 모두 다음의 경사슬 및 중사슬을 갖는 동일한 항체를 함유하였다 (38F10):
경사슬
DIQLTQSPPTLSASVGDRVSMTCRASQSISNWLAWYQQKPGKAPKLLIQKASNLEDGVPSRFTASGFGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSGLSFGGGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:399)
중사슬
EVQLLESGGDVVQPGKSLRLSCTASGFSITDFGIHWVRQAPGKGLEWVALISYNEVNIHYGESVRGRFTISRDIAKNTVYLQMNGLRPEDTGVYFCARDVWEDSWLSLACFQEWGQGSLVVVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (SEQ ID NO:400)
Fab 14 G3
14G3의 경우, 실시예 2에서 생성된 88 세포 용해물을 ELISA에 의해 1)항-Fab 항체에 결합하는 능력; 및 2) RSV F1 용해물에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. ELISA는 71개의 세포 용해물이 Fab 생산물에 대해서는 양성인 반면, 88 개의 세포 용해물 중 13개는 RSV F 용해물에 결합한다는 것을 나타내었다. 16개의 클론에 대한 확인 ELISA는 16개 세포 용해물 중 14개가 Fab를 생산하였고 시험된 16개의 히트 중 5개가 RSV F 용해물에 대한 바인더로 확인하였다. 양성 바인더 중 4개를 서열화하였고 모두 다음의 경사슬 및 중사슬을 갖는 동일한 항체를 함유하였다(14G3):
경사슬
DVVMTQTPLSLSVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDVGIYYCMQRMEFPFTFGQGTRLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:401)
중사슬
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGASISSDNHYWSWIRQPPGKGLEWIASIYYTGGTNYNPSLKSRLALSIDTSGDQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRGLFFITARPYWYFDLWGRGTLVAVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC (SEQ ID NO:402)
Fab 90 D3
90D3의 경우, 실시예 2에서 생성된 88 세포 용해물을 ELISA에 의해 1)항-Fab 항체에 결합하는 능력; 및 2) RSV F1 용해물에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. ELISA는 80개의 세포 용해물이 Fab 생산물에 대해서는 양성인 반면, 88 개의 세포 용해물 중 2개는 RSV F 용해물에 결합한다는 것을 나타내었다. 8개의 클론에 대한 확인 ELISA는 8개 세포 용해물 중 7개가 Fab를 생산하였고 시험된 8개의 히트 중 3개가 RSV F 용해물에 대한 바인더로 확인하였다. 양성 바인더 중 2개를 서열화하였고 모두 다음의 경사슬 및 중사슬을 갖는 동일한 항체를 함유하였다 (90D3):
경사슬
AIRLTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQSISNFLNWYQQKPGRAPKLLISAASSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYISLYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:403)
중사슬
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCVGSGFTLKNYEMNWVRQAPGQGLQYISYISSSGNVVKYVDSVQGRFTISRDNAGNSLYLQMNNLRAEDTATYYCVRGFSIDKYDSSVDEYWGQGIAVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (SEQ ID NO:404)
D. 부가적인 항- RSV 항체
3개의 추가적 항체들 Fabs 56E11, 17C9 및 69F6을 상기 실시예 2, 섹션 B와 C에 기재된 바에 따라 단리하였고, 카파와 람다 경사슬 모두에 대해 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 중사슬과 경사슬의 서열을 다음에 기재하였다.
Fab 56 E11
경사슬
QAVLTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPRLIISEVTKRPSGVPGRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSYAGSRHVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPAECS (SEQ ID NO:453)
중사슬
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGVSINSNNYFWAWIRQPPGKGLEWIGNIYYGGSTHYNASLQSRVTISVDTSKSQFSLKLNSVTSADTAVYYCAASESIFWDYYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (SEQ ID NO:452)
Fab 17 C9
경사슬
EIVLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQNINTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASFLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYFCQQANSFPRTFGQGTKVEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:455)
중사슬
QVQLQQWGAGLVRPSETLSLTCAVYGDSFNDYFWTWIRQTPGKGLEWIGEISHSGSTNYSPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSAVTAADTTVYFCARGVRSRPPPSYRGSGSPPYYHYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC (SEQ ID NO:454)
Fab 69F6
경사슬
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTISCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPRLLIYDASYLDTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQYDDLRGGFTFGPGTKVDVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:457)
중사슬
QMQLVQSGAEVRKPGESLKIACKGSGYSFTSYWIAWVRQMPGKGLEWLGIIFPNDSDATYSPSFQGQVTMSVDKSISTAYLQWNSLKASDTAVYFCARQYYLGSFESWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (SEQ ID NO:456)
단리된 Fab들의 항체 도메인들 및 CDR 영역들을 하기 표 13A-13C에 제공하였다.
[표 13A]
Figure 112012100085696-pct00016
[표 13B]
Figure 112012100085696-pct00017
[표 13C]
Figure 112012100085696-pct00018
실시예 5
단리된 Fab 의 발현 및 정제
이 실시예에서, 세포 용해물을 사용하는 ELISA에 의해 RSV F 용해물에 결합하는 것으로 결정되었던 개별적인 Fab 항체들을, 그 후에 발현하였고 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 박테리아 세포들로부터 정제하였다.
각각의 개별적인 Fab 항체를 코딩하는 DNA를 탑 10(Top 10) 세포(Invitrogen)에 발현을 위해 형질전환시켰다. 각각의 Fab 항체는 2 ℓ SB에서 37 ℃에서 0.8의 OD600까지 성장하였다. 단백질 발현을 1 mM IPTG를 첨가함으로써 유도하였고, 30 ℃에서 밤새도록 허용하였다. 발현 다음에, 박테리아 배양물을 원심분리하였고, 세포 펠렛을 프로테아제 억제제(Complete Protease Inhibitor Cocktail, Santa Cruz Biotech, Cat. # sc-29131)을 갖는 10 ㎖ 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline)(PBS)에서 재현탁하였다. 리소자임(Lysozyme)(0.2 ㎎)을 재현탁 세포에 첨가하였고, 혼합물을 상온에서 15 분 동안 배양하였다. 세포들을 2번의 동결/해동 사이클들에 의해 용해하였다(lysed). 즉, 재현탁된 박테리아 세포들을 에탄올/드라이 아이스 배스에서 동결하였고, 이어서 37 ℃ 물 용기에서 해동하였다. 용해되자마자, 박테리아 용해물을 18000 rpm으로 원심분리하였고, 상청액을 0.4 마이크론 필터(micron filter)를 통과시켜 여과하고 멸균하였다.
각각의 개별적인 Fab 항체를 그리고나서 친화성 칼럼 크로마토그래피(affinity column chromatography)에 의해 정제하였다. 즉, 여과된 상청액을 Fab 단백질이 결합하는 것을 허용하는 항-Fab/단백질 A 칼럼을 가로질러 천천히 통과시켰다. 50 ㎖ PBS로 세척한 다음에, 결합된 Fab를 9 ㎖의 0.2 M 글리신(glycine), pH 2.2로 용리하였고, 1 ㎖의 2 M 트리스(Tris)를 포함하는 코니칼 튜브에 모았고, 이에 의해 용리된 단백질을 중화하였다(neutralizing). 그리고 나서, 용리된 Fab를 4 ℓ PBS에 대해 10K MWCO 삼투 카세트(Pierce)를 사용하여 투석하였다. 단백질을 4 ℃에서 밤새도록 보관하였고, 그 다음에 10 kDa Amicon Ultra Filter (Millipore)를 사용하여 1 ㎖이 부피로 농축하였다. 그리고나서, 각각의 정제된 Fab 항체의 RSV F 용해물(재조합 출처(재조합 source), 실시예 1A) 및 HEp2 용해물(천연의 출처(천연 source), 실시예 1B)에 대한 결합을 ELISA(상기 표 4 참조)에 의해 재확인하였다. 또한, 각각의 정제된 Fab 항체를 실시예 6에서 설명된 분석(assay)를 사용하여 RSV를 중화시키는 이들의 능력에 관해 시험하였다.
RSV F 용해물 및 정제된 RSV F 단백질에 대한 Fab 58 c5 및 sc5 의 결합
형질감염된 293 세포들(재조합)로부터의 포획된 RSV F 단백질 또는 RSV A2 감염된 Hep2 세포들(천연의)로부터의 정제된 RSV F 단백질 중 어느 하나에 대한 항체 58c5 및 sc5의 결합을 ELISA으로 측정하였다. 결과는 Fab 58c5 및 Fab sc5가 투여량 의존방식으로 RSV F 단백질(재조합)에 결합하나, 오직 sc5만이 정제된 F 단백질(천연의)를 인식할 수 있다는 것을 나타낸다(하기 표 14-15 참조).
[표 14]
Figure 112012100085696-pct00019
[표 15]
Figure 112012100085696-pct00020
RSV F 용해물 및 정제된 RSV F 단백질에 대한 Fabs 30 D8 , 104 E5 , 38F10, 90D3 및 14 G3 의 결합
Fabs 30D8, 104E5, 38F10, 90D3 및 14G3의 결합에 대한 평가된 EC50s을 하기 표 16에 기재하였다. Fabs 30D8 및 14G3 둘 다 대략 5 nM (각각, 3.8 nM 및 8.2 nM)에서 RSV F1 용해물(재조합)에 결합한다. Fabs 104E5 및 90D3은 대략 80 pM의 EC50로 천연 RSV 균주 A2 F 단백질에 결합하고 Fab 38F10은 177 pM의 EC50로 천연 RSV 균주 A2 F 단백질에 결합한다.
[표 16A]
Figure 112012100085696-pct00021
정제된 RSV F 단백질에 대한 Fabs 56 E11 , 17 C9 및 69F6의 결합
Fabs 56E11, 17C9 및 69F6의 결합에 대해 평가된 EC50을 하기 표 16에 기재하였다. Fab 56E11는 EC50 545 pM으로 RSV F1 용해물(재조합)에 결합한다. Fabs 17C9 및 69F6은 RSV F1 용해물(재조합)에 각각 136 pM 및 135 pM의 EC50으로 결합한다.
[표 16B]
Figure 112012100085696-pct00022
실시예 6
RSV 중화 분석
이 실시예에서, 항-RSV 항체들은, 플라크 감소 분석에 의해 평가된 대로, 용액에서 RSV 바이러스에 결합하고 중화시키는 그들에 능력에 관해 분석하였다. 이 실험에서, RSV 바이러스 및 항체들을 표적 세포 없이 전(pre)-배양하였다. 그리고 나서 혼합물을 세포들에 첨가하였고, 바이러스 감염을 본 발명에서 설명된 표준 플라크 감소 분석에 의해 측정하였다. 항-RSV 항체들을, RSV A2(ATCC Cat. No. VR-1540), RSV B-wash(ATCC Cat. No. VR-1580, 균주 18537), 및 RSV B-1 (ATCC Cat. No. 1400)를 포함하는, 몇몇 RSV 바이러스 균주들을 중화시키는 그들의 능력에 관해 분석하였다.
베로 세포들(ATCC, cat no: CCL-81; Manassas, VA)을 숙주 세포 감염을 위해 사용하였다. 베로 세포들을 1 % L-글루타민(HyClone, cat no: SH30034.01) 및 1 % 페니실린(Penicillin)-스트렙토마이신(Streptomycin) 용액(HyClone, cat no: SV30010)이 보충된, 10% 우태아 혈청(FBS)를 갖는 DMEM(HyClone, cat no: SH 30285.01)에서 성장시켰다. 베로 세포들을 5 % CO2를 갖는 37 ℃ 배양기에서 유지시키고, 주당 2회 계대배양 하였다.
실험 첫째 날(제1일)에, 베로 세포들을 24-웰 세포 배양 플레이트들에서 배양하였다. 세포들을, 둘째 날까지 세포 단일 층들(>90 % 컨플루언스)의 형성이 허용되는 밀도(웰 당 대략 1x106 세포들)로 플레이트하였다. 둘째 날, 각각의 항체를 보통의(plain) 이글스(Eagle's) 최소 필수 매질(EMEM, ATCC, cat no: 30-2003)에서 순차적으로 희석하였다(시험된 최종 항체 농도들: 20 ㎍/㎖, 4 ㎍/㎖, 0.8 ㎍/㎖, 0.16 ㎍/㎖, 0.032 ㎍/㎖, 및 0.006 ㎍/㎖). RSV 바이러스를 또한 보통의 EMEM에서 2 x 103 pfu/㎖ (100 pfu/50 ㎕)의 농도로 희석하였다. 그리고, 110 ㎕의 희석된 RSV 바이러스를 110 ㎕의 각각의 희석된 항체 용액에 첨가하였고, 피펫팅(pipetting)으로 혼합하였다. 바이러스 대조군 시료에 대하여, 110 ㎕의 희석된 RSV 바이러스를 110 ㎕의 보통의 EMEM에 첨가하였다. 항체-바이러스 또는 바이러스 대조군 혼합물들을 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 배양 다음에, 배양 배지는 베로 숙주 세포들을 포함하는 24-웰 세포 배양 플레이트들로부터 옮겼고(decanted), 100 ㎕ 전-배양된 바이러스-항체 또는 바이러스 대조군 혼합물을 그리고 나서 각각의 웰에 옮겼다.
각각의 테스트 및 대조군 시료를 3중으로 제조하였다. 세포들을 그리고 나서, 매 15분마다 혼합하면서 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다.
배양기간 다음에, 바이러스-항체 또는 바이러스 대조군 혼합물을 포함하는 배양 배지를 흡입하였고, 1㎖의 오버레이 배지(overlay medium)를 각각의 웰에 첨가하였다(EMEM, 2 % FBS, 1 % L-글루타민, 0.75 % 메틸셀룰로오스가 포함된 오버레이 배지). 24-웰 세포 배양 플레이트들을 그리고나서 37 ℃에서(5% CO2를 갖는) 대략 72 시간 동안 배양하였다. 세포 플레이트들을 10 % 포르말린으로 상온에서 1시간 동안 고정시켰고, ddH20로 10번 세척하였고, 37 ℃에서 1 시간 동안 0.05 % 트윈20을 갖는 PBS에서 5 % 탈지분유(NFDM)로 블로킹시켰다.
배양 다음에, 블로킹 용액을 따라 옮기고(decanted), 200 ㎕의 마우스 항-RSV 항체(ab10018, Abcam, 5 % NFDM에서 1:1000 희석)를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트들을 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였고, ddH20로 10번 세척하였고, 200 ㎕의 염소 항-마우스 HRP-접합 IgG(Pierce, Cat. No. 31432, 5 % NFDM에서 1:1000 희석)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트들을 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. ddH20로 10번 세척하였고, 200 ㎕의 TrueBlue™ 퍼옥시다제 기질(KPL Cat. No. 50-78-02)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트들을 상온에서 10 분 동안 현상하였다. 플레이트들을 ddH20로 2번 세척하고, 종이 타월 상에서 건조시키고, 푸른색 플라크를 계수하였다. ED50(50% 중화를 위한 유효 희석(effective dilution))을 Prism(GraphPad)을 사용하여 계산하였다. 플라크 감소율을 다음 공식에 따라 계산하였다.
플라크 감소율(백분위수) = (1 - 각각의 항체 희석에서의 평균 플라크 수/바이러스 대조군 웰들에서의 평균 플라크수)*100
데이터를 하기 표 17-19에 표시하였다. 표 17은 다양한 RSV 균주에 대한 각각의 Fab에 대한 ED50을 열거한다. 표 18은 다양한 균주들에 대한 그리고 Fab 58c5에 대한 다양한 농도들에서 플라크 계수를 기재한다. 표 19은 Fab 58c5에 대한 플라크 감소율을 열거한다. 표 20은 RSV A2에 대해 Fabs 56E11, 17C9, 69F6 및 30D8에 대한 플라스 감소률을 열거한다. 결과는 Fab 58c5가 RSV의 모든 3개의 균주들을 중화시킬 수 있는 반면, Fab sc5는 비록 훨씬 높은 항체 농도들일지라도, 단지 RSV A2 및 RSV B-1만을 중화시킨다는 것을 나타낸다. 중화 분석에서 얻은 데이터 및 Fab 단편의 분자량(대략 50kDa)을 기초로 하여, RSV A2의 인 비트로 중화에 대한 Fab 58c5의 EC50가 대략 320pM이고, 반면 RSV A2의 인 비트로 중화에 대한 Fab 30D8의 ED50는 대략 3배 낮았다(107 pM). Fab 30D8는 Fab 58c5보다 RSV B-1 및 RSV B/wash에 대해 더 효과적임을 예측하였다.
[표 17]
Figure 112012100085696-pct00023
ND: 측정 안됨
[표 18]
Figure 112012100085696-pct00024
[표 19]
Figure 112012100085696-pct00025
[표 20]
Figure 112012100085696-pct00026
*30D8은 양성대조로서 사용하였다
실시예 7
IgG 의 클로닝 및 발현
이 실시예에서, RSV를 중화할 가능성을 보여준 Fab 항체들은, pCALM 포유류 발현 벡터(SEQ ID NO: 102)에 클로닝함으로써 IgG로 변환하였다. 각각의 항체에 대한 특이적인 프라이머들이 생성하였고, 원래 pCAL 벡터에 클로닝된 것(실시예 2 참조)과 같이 각각의 Fab의 중 및 경사슬들이 PCR에 의해 증폭하였다. 경사슬 증폭은 650 bp 단편을 낳았고, 중사슬 증폭은 400 bp 단편을 낳았다. 또한, 링커를 중사슬 및 경사슬의 오버랩이 허용되도록 생성하였다. 링커는 또한 표준 중사슬 불변 영역을 포함했다. 중 및 경사슬들의 오버랩은, 양 말단에 SfiI 제한 영역들(SEQ ID NO: 41)을 갖는 각각의 항체에 대한 2.1 kB 카세트를 야기한다. 각각의 카세트를 SfiI로 절단하였고(digested), pCALM 벡터에 클로닝하였다. 박테리아에서 정확한 서열을 확인한 후, 포유류 형질감염을 위한 DNA가 Maxi Prep Kit(Qiagen)를 사용하여 분리하였다.
각각의 IgG를 발현하기 위하여, 각각의 pCALM 벡터를 약 2억 293F 세포들을 감염시키는데 사용하였고, 약 200 마이크로그램의 IgG가 야기되었다. 293F 세포들을 293펙틴(fectin)(Invitrogen, Cat. No. 51-0031)으로 형질감염시키고, 72 시간 동안 IgG를 생산하도록 허용하였다. 형질감염 후 72 시간이 지난 후, 세포 배지를 회수하였고, 세포들을 제거하기 위해 원심분리하였고, 0.4 마이크론 여과 단위를 통해 필터 멸균시켰다. 단백질 A 칼럼을 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제를 수행하였다. 발현된 IgG를 포함하는, 여과된 배지를 단백질 A 칼럼을 통해 2번 통과시켰다. 50 ㎖ PBS로 세척한 다음, IgG를 9㎖의 0.2 M 글리신, pH 2.2로 용리시켰고 중화를 수행하도록 2M 트리스(Tris)에 모았다. 용리물을 10kDa 투석 카세트(Pierce)를 사용하여 4리터의 PBS에 대해 투석하였다. 시료를 10kDa Amicon Ultra(Millipore)와 함께 1 ㎖이하로 농축시켰다.
실시예 8
IgG 결합 분석
이 실시예에서, 상기 실시예 7에서 생성된, 58c5, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 56E11, 17C9 및 69F6의 IgG 형(IgG form), 및 항-RSV 모타비주맙(Motavizumab)(Wu et al . (2007) J. Mol . Biol . 368(3):652-665)이 RSV F 단백질(재조합) 또는 RSV F 단백질(천연의) 용해물에 결합하는 그들의 능력에 관해 ELISA(상기 실시예 4 참조)에 의해 시험였다. 결합에 대해 추산된 EC50(각각의 IgG를 적정함으로써 결정됨)를 하기 표 21에 기재하였다. 30D8의 IgG 형은 10배 덜 친화력을 갖는 58c5, 104E, 38F10, 56E11, 17C9 및 69F6의 IgG 형과 가장 높은 친화력을 가졌다. 이에 더하여, 30D8의 IgG 형은 RSV 균주 A2 F 단백질에 대해 모타비주맙보다 10배 큰 친화력을 갖는다.
[표 21]
Figure 112012100085696-pct00027
실시예 9
IgG RSV 중화 분석
이 실시예에서, 상기 실시예 7에서 생성된, 58c5, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 56E11, 17C9 및 69F6의 IgG 형 및 항-RSV 항체 모타비주맙(Wu et al . (2007) J. Mol . Biol . 368(3):652-665)을 다양한 RSV 균주들을 중화시키는 그들의 능력에 관해 시험하였다. 또한, 58c5의 IgG 형이 다양한 단일클론 항체 저항 RSV 회피 돌연변이체들(MARMs)을 중화시키는 이의 능력에 관해 분석하였다. MARM은 이에 대항하여 생성된 항체에 의해 더 이상 중화될 수 없는 돌연변이 RSV 균주이다. 따라서, 58c5의 특정 MARM을 중화시키는 능력은 58c5의 결합 에피토프가 MARM이 생성된 항체의 그것과 다르다는 것을 나타낸다.
A. RSV 의 중화
58c5, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 56E11, 17C9 및 69F6의 IgG 형을 중화시키는 그들의 능력에 관해 시험하였다(상기 실시예 6에 설명된 바 같이). 데이터는 하기 표 22-24에서 나타낸다. 표 22는 각각의 균주에 대한 ED50(50% 중화를 위한 유효 희석)을 열거한다. 표 23은 다양한 RSV 균주들에 대한 그리고 다양한 항체 농도들에서 플라크 계수들을 열거한다. 표 22는 다양한 RSV 균주들에 대한 그리고 58c5의 IgG 형의 다양한 항체 농도들에서 플라크 감소율을 열거한다. 결과는 58c5, 30D8, 104E5, 38F10, 14G3, 56E11 및 17C9의 IgG 형은 다양한 농도에서 모든 3개의 RSV 균주를 중화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 69F6의 IgG 형은 RSV 균주 A2에 대해 선택적이다. 중화 분석에서 얻은 데이터 및 IgG 단편의 분자량(거의 150kDa)을 기초로 하여, RSV A2의 인 비트로 중화에 대한 58c5의 IgG 형의 ED50는 대략 133 pM이 될 것임을 추산하였다. 69F6의 IgG 형은 RSV 균주 A2에 대해 선택적이다. 중화 분석에서 얻은 자료들과 IgG 단편의 분자량 (대략 150 kDa)을 기준으로, RSV A2의 인 비트로 중화에 대한 58c5의 IgG 형의 ED50는 대략 133 pM이다. RSV A2의 인 비트로 중화에 대한 30D8 및 14G3의 IgG 형의 ED50는 각각 89 pM 및 106 pM이다.
RSV의 3개의 균주에 대해 30D8과 항-RSV 항체 모타비주맙의 중화 활성 비교(Wu et al . (2007) J. Mol . Biol . 368(3):652-665)는 IgG 30D8이 더욱 강력한 중화 항체임을 나타낸다. RSV 균주 A2에 대해, 30D8의 IgG형은 중화에서 4배 개선됨을 나타낸다(89 pM 대 360 pM). 30D8의 IgG형은 모타비주맙보다 RSV 균주 B-1을 중화하는데 15배 더 낫다. RSV 균주 B/wash의 경우, 30D8의 IgG형은 중화에서 15배 증가를 나타낸다(115 pM 대 2.9 nM). 30D8의 IgG형은 추가로 RSV의 Long 및 B/9320 균주 둘 다를 중화시키는 것을 나타낸다.
[표 22]
Figure 112012100085696-pct00028
[표 23]
Figure 112012100085696-pct00029
[표 24]
Figure 112012100085696-pct00030
B. RSV 단일클론 항체 저항성 RSV 회피 돌연변이체들의 중화
58c5의 IgG 형은 또한, 상기 실시예 6에서 설명한 바와 같이, 몇몇 단일클론 항체 저항 RSV 회피 돌연변이체들(반더빌트 대학의 James Crowe 박사에 의해 제공됨)를 중화시키는 이들의 능력에 관해 테스트하였다. 하기 표23에 열거된, MARM들은 RSV 야생-형 균주 A2로부터 유도하였다. 인간 Fab 19에 대항하여 생성된 MARM 19(예를 들어, Crowe et al., Virology, 252:373-375 (1998) 참조)은 이소류신 266의 메티오닌으로의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 뮤린 mAb 151에 대항하여 생성된 MARM 151은 리신 272의 아스파라긴으로의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 팔리비주맙(SYNAGIS)에 대한 부모 항체인 뮤린 mAb 1129에 대항하여 생성된 MARM 1129는 세린 275의 페닐알라닌으로의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
58c5의 IgG 형은 또한 몇몇 RSV 단일클론 항체 저항성 돌연변이체들(MARMs)를 중화시키는 이들이 능력에 관해 테스트하였다. 데이터는 하기 표 25-26에 기재된다. 표 25은 다양한 항체 농도들에서 다양한 MARM들에 대항한 중화에 대한 플라크 계수들을 열거한다. 표 26는 다양한 항체 농도에서 다양한 MARM들에 대항한 중화에 대한 플라크 감소율을 열거한다. 결과들은 58c5의 IgG형이 모든 3개의 RSV MARM들을 중화시킬 수 있음을 나타낸다. 따라서, 58c5의 IgG형은 Fab 19, 뮤린 mAb 1129 및 뮤린 mAb 151과 RSV 균주 A2의 다른 에피토프에 결합한다.
[표 25]
Figure 112012100085696-pct00031
[표 26]
Figure 112012100085696-pct00032
실시예 10
경쟁 분석
이 실시예에서 경쟁분석을 수행하였고, 여기서 Fabs 58c5, 30D8, 56E11, 17C9 및 69F6을 RSV F 단백질에 대한 모타비주맙 IgG과 경쟁하는 그들의 능력을 시험하였다 (Wu et al . (2007) J. Mol . Biol. 368(3):652-665). Fabs 58c5 및 30D8을 재조합 RSV F 단백질에 결합하는, 17C9 및 69F6의 IgG 형에 대하여 비교한 그들의 능력에 대해 부가적으로 시험하였다. Fabs 56E11, 17C9 및 69F6을 재조합 RSV F 단백질에 결합하기 위한 58c5 및 30D8의 IgG 형에 대하여 비교한 그들의 능력을 부가적으로 시험하였다. 경쟁에 대한 양성 대조로서, 다양한 항체의 IgG 형을 동일 항체의 각각의 Fab 형에 대한 경쟁 능력에 대해 시험하였다.
간단하게, 재조합 또는 천연의 RSV 균주 A2 F 단백질 중 어느 하나를 갖는, ELISA 플레이트들은 상기 실시예 1에서 설명된 바와 같이 준비하였다. 플레이트들은 37 ℃에서 2 시간 동안 1x PBS에서 4 % 탈지분유로 블로킹하였고, 이어서 세척 완충용액(PBS/0.05 % 트윈20)으로 4x 세척하였다. Fab를 PBS/3 % BSA/0.01 % 트윈20에서 9 ㎍/㎖ 내지 0.0001 ㎍/㎖ (테스트된 실제 농도들: 9, 3, 1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01, 0.003, 0.001, 0.0003, 0.0001 ㎍/㎖)로 적정하였다. 시험된 항체의 IgG 형 및 모타비주맙은 0.5 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖, 0.05 ㎍/㎖ 및 0.01 ㎍/㎖ 중 어느 하나의 고정된 농도로 첨가하였다(하기 표 27에 나타낸 바와 같이). 50 ㎕의 각각의 희석된 Fab 및 IgG의 고정된 농도를 플레이트의 각각의 웰에, 이중으로 하기 표 26에서 나타낸 바와 같이, 동시에 첨가하였고 그리고 플레이트들을 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였고, 이어서 세척 완충용액으로 4x 세척하였다. 염소-항 인간 IgG Fc-감마 HRP(Jackson ImmunoResearch, Cat. No. 109-035-098, 1:1000 희석이, 첨가하였고, 플레이트들이 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 완충용액으로 6x 세척한 다음에, 50 ㎕ 1:1 부피/부피(v/v) TMB:퍼록사이드 용액(Pierce, Cat No. 34021)을 첨가하였고, 7분 동안 현상시켰다. 반응을 50 ㎕의 2N H2SO4를 첨가함으로써 즉각 정지시키고, 450㎚에서 흡광도를 ELISA 플레이트 리더를 사용하여 측정하였다.
[표 27]
Figure 112012100085696-pct00033
결과를 하기 표 28에 요약하였다. Fabs 58C5, 30D3, 56E11, 17C9 및 69F6은 RSV 균주 A2 F 단백질과 결합하는데 있어서 모타비주맙과 경쟁하지 않는다. Fab 30D8은 시험된 항체들 중 어느 것과 결합하는데 경쟁하지 않았다. Fab 58C5는 RSV F 단백질과 결합하는데 69F6의 IgG의 IgG 형과 경쟁하였다. Fabs 56E11 및 69F6 둘 다는 RSV F 단백질과 결합하는데 58c5의 IgG 형과 경쟁하였다. 항체 58C5, 69F6 및 56E11는 RSV 융합 단백질 상의 통상의 에피토프 결합부위를 공유한다.
[표 28]
Figure 112012100085696-pct00034
ND: 측정 안됨
실시예 11
RSV MARM 생성 및 중화 분석
이 실시예에서, 단일클론 항체 저항 RSV 회피 돌연변이체들(MARMs)은 모타비주맙 및 58C5의 IgG 형에 대해 생성하였다. 30D8의 IgG 형에 대하여, 12 라운드의 선택이 수행하였고 회피 돌연변이는 동정되지 않았다. 모타비주맙, 58c5 및 30D8의 IgG형 및 Fabs 56E11, 17C9 및 69F6를 새롭게 형성된 MARM들을 중화시키는 그들의 능력에 관해 추가로 분석하였다.
A. MARM 생성
1. 모타비주맙
3 로그(logs)만큼(중화 분석에 의해 RSV A2 바이러스의 99.9% 억제에 대응) RSV 바이러스 역가를 감소시키는 모타비주맙 IgG의 농도가 이전에 3.2㎍/㎖으로 결정되었다. RSV A2 바이러스 입자들(2 x 106)을 모타비주맙 IgG 희석물과 함께 전배양하였고, (상기 실시예 6에서 설명된 바와 같이) 이 혼합물을 사용하여 베로 세포 단일층들을 감염시켰다. 아직 세포독성 효과를 보여주는 가장 높은 항체 농도를 갖는 웰들을 선택의 추가 라운드 동안 선택하였다. 10회 선택 라운드 후에, 8 ㎍/㎖ 모타비주맙의 존재 하에서 성장된 바이러스로부터의 플라크를 얻었다. 이 플라크들로부터의 바이러스 입자들을 중화 분석으로 테스트 하였고(상기 실시예 6에서 설명된 바와 같이), 양성 입자들로부터의 RNA를 RNeasy 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 제조하였다. 6개의 회피 돌연변이체들을 선택하였고, F 유전자를 PCR에 의해 증폭하였다. DNA를 서열검정하였고, 모든 6개의 클론은, 부모 RSV A2 균주(SEQ ID NO: 485에 기재)와 비교할 때, 272 위치의 리신의 글루탐산으로의 단일 아미노산 치환(K272E, SEQ ID NO: 486)을 코딩하였다.
하기 표 29는 각각의 선택의 라운드 동안에 세포 병변 효과(CPE)를 보여주는 가장 높은 항체 농도가 기재된다. 하기 표 29에 나타낸 바와 같이, 모타비주맙 회피 돌연변이체들은 선택의 7 라운드들 후에 동정하였고, 중화분석에 의해 결정된 바와 같은 RSV A2 바이러스의 99.9% 억제에 대응하는 모타비주맙의 농도(즉, > 3.2 ㎍/㎖) 보다 훨씬 큰 CPE를 나타내는 항체 농도에 의해 동정된 바와 같다.
[표 29]
Figure 112012100085696-pct00035
2. 58 C5
3 로그만큼(중화 분석에 의해 RSV A2 바이러스의 99.9% 억제에 대응) RSV 바이러스 역가를 감소시키는 58C5의 IgG 형의 농도가 0.8 ㎍/㎖임을 측정하였다. RSV A2 바이러스 입자들(2 x 106)을 58C5의 IgG 형의 희석물과 함께 전 배양하였고, (상기 실시예 6에서 설명된 바와 같이) 이 혼합물을 사용하여 베로 세포 단일층들을 감염시켰다. 아직 세포독성 효과를 나타내는 가장 높은 항체 농도를 갖는 웰들이 선택의 추가적인 라운드들 동안 선택하였다. 선택의 12 라운드들 후에, 2 ㎍/㎖의 58C5의 IgG 형의 존재 하에서 성장된 바이러스로부터의 플라크들이 얻어졌다. 이 플라크들로부터의 바이러스 입자들을 중화 분석으로 테스트 하였고(상기 실시예 6에서 설명된 바와 같이), 양성 입자들로부터의 RNA가 RNeasy 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 준비하였다. 5개의 회피 돌연변이체들을 선택하였고, F 유전자를 PCR에 의해 증폭하였다. DNA를 서열 검정하였고, 모든 5개의 클론들은, 부모 RSV A2 균주(SEQ ID NO: 485에 기재)와 비교할 때, 3개의 아미노산 치환물(N63K, M115K 및 E295G; SEQ ID NO: 487)을 암호화하였다.
하기 표 30은 각각의 선택의 라운드 동안에 세포 병변 효과(CPE)를 보여주는 가장 높은 항체 농도를 기재한다. 하기 표 28에 나타낸 바와 같이, 58C5의 IgG 형 회피 돌연변이체들은 선택의 10 라운드들 후에 동정되었고, 중화분석에 의해 결정된 바와 같은 RSV A2 바이러스의 99.9% 억제에 대응하는 58C5의 IgG 형의 농도(즉, > 0.8 ㎍/㎖) 보다 훨씬 큰 CPE를 보여주는 항체 농도에 의해 동정된 바와 같다.
[표 30]
Figure 112012100085696-pct00036
3. 30 D8
3 로그 만큼 RSV 바이러스 역가를 감소시키는 30D8의 IgG형의 농도가 1 ㎍/㎖임을 측정하였다. RSV A2 바이러스 입자들(2 x 106)을 30D8의 IgG 형의 희석물과 함께 전 배양하였고, (상기 실시예 6에서 설명된 바와 같이) 이 혼합물을 사용하여 베로 세포 단일층들을 감염시켰다. 아직 세포독성 효과를 나타내는 가장 높은 항체 농도를 갖는 웰들을 선택의 추가라운드 동안 선택하였다. 선택 12 라운드 후에, 30D8 회피 돌연변이는 동정되지 않았고, 그 결과를 표 31에 나타내었다.
[표 31]
Figure 112012100085696-pct00037
B. 중화 분석들
모타비주맙, 58C5 및 30D8의 IgG형 및 Fabs 56E11, 17C9 및 69F6을 RSV A2 부모 바이러스 균주, 모타비주맙 MARM 및 58C5의 IgG 형 MARM을 중화시키는 그들의 능력에 관해 테스트 하였다. 중화 분석 절차(procedure)는 상기 실시예 6에서 설명된다. 데이터는 하기 표 32-35에 나타낸다. 표 32는 RSV A2 부모 바이러스에 대항한 중화에 대한 플라크 감소율을 열거한다. 표 33은 모타비주맙 MARM에 대항한 중화에 대한 플라크 감소율을 열거한다. 표 34은 58C5 MARM에 대항한 중화에 대한 플라크 감소율을 열거한다. 표 35는 중화 데이터(ED50 값(values))의 요약이다.
결과는 58C5와 30D8의 IgG형이 가장 강한 활성을 나타내면서, 모든 항체들 이 부모 RSV A2 균주를 중화시킬 수 있음을 나타낸다(표 32 및 35 참조). 모든 시험된 항체들은 부모 균주와 비교하여 차이 없이 모타비주맙 MARM을 강력하게 중화시킨다(표 33 및 35 참조). 예측된 바와 같이, 모타비주맙은 테스트된 어떤 농도에서도 모타비주맙 MARM을 중화시킬 수 없다. 모타비주맙, 30D8의 IgG형 및 Fab 17C9는 중화 효력에 차이 없이, 58C5 MARM을 강력하게 중화시킨다(표 34 및 35 참조). 예측된 바와 같이, 58C5의 IgG형은 테스트된 어떤 농도에서도 58C5 MARM을 중화시킬 수 없다. 결과는 58C5 및 30D8의 IgG 형 및 Fabs 56E11, 17C9 및 69F6가 모두 경쟁을 나타내지 않으면서 모타비주맙 MARM을 중화시킨다는 것을 보여준다. 그러므로, 58c5, 30D8, 56E11, 17C9 및 69F6의 에피토프는, 경쟁이 관찰되지 않았고 모든 항체는 모타비주맙 MARM을 중화시켰으므로(표 28 참조), 모타비주맙의 에피토프와 겹치지 않는다.
Fab 69F6는 RSV F 단백질에 대한 결합에 관하여 58c5와 경쟁하지만(표 28 참조), 그러나 58c5 MARM을, 부모 A2 균주의 중화의 ED50보다 약간 높은 ED50으로, 여전히 중화시켰다(353 pM 대 256 pM). 반대로 Fab 56E11는 RSV F 단백질에 대한 결합에서 58c5의 IgG 형과 경쟁하지만 (표 29 참조), 시험된 어느 농도에서도 50c5 MARM을 중화시키지 않았다. 그러므로, 두 항체간의 경쟁으로서 58c5와 56E11 에피토프의 오버랩이 관찰하였고, 56E11 Fab는 58C5 MARM을 중화시킬 수 없었다. 항체 69F6 및 17C9는 58c5 MAM을 중화시켰고 그들의 에피토프가 항체 58c5의 것과 오버랩되지 않는다는 것을 나타낸다. 그러나, 58c5와 69F6간의 경쟁이 관찰하였고 (표 28 참조), 그러나 69F6는 58c5 MARM을 중화시키기 때문에, 관찰된 경쟁은 좀더 입체 장애에 의한 것이다.
[표 32]
Figure 112012100085696-pct00038
[표 33]
Figure 112012100085696-pct00039
[표 34]
Figure 112012100085696-pct00040
[표 35]
Figure 112012100085696-pct00041
실시예 12
58 C5 및 30 D8 결합 에피토프의 매핑
이 실시예에서, 항체 58c5 및 30D8의 결합에 참여하는 RSV F 단백질의 잔기들을 항체 58C5 또는 30D8에의 결합에 대한 RSV F 단백질의 단일 돌연변이 라이브러리를 스크리닝하여 결정하였다.
RSV F 단백질 돌연변이 라이브러리를 Shotgun Mutagenesis Mapping Technology Integral Molecular (Philadelphia, PA)를 사용하여 생성하였다. 즉, 상기 기술은 진핵 세포 내의 돌연변이된 표적 단백질의 다량의 라이브러리의 발현 및 분석이 가능하다. 표적 단백질 중의 모든 잔기는 단일클론성 항체 (MAb) 결합 또는 기능에서의 변화를 분석하기 위해, 개별적으로 다수의 다른 아미노산으로 돌연변이된다. 단백질은 진핵 번역 또는 후-번역 과정을 요구하는 복잡한 단백질이 에피토프 맵화되는 경우에도 포유류 세포계 내에서 발현된다.
인간 RSV F A2 균주 (NCBI Ref # FJ614814)를 RSV F 단백질에 대한 부모 플라스미드로 사용하였다. C-터미날 V5 태그를 스크리닝을 위해 포함시켰다. F 단백질을 HEK 293 세포에서 발현시키고 결합을 면역발광을 사용하여 측정하였다. 무작위 돌연변이 전략을 사용하여, 1029 돌연변이 클론을 함유하는 RSV F 단백질 라이브러리를 생성하였다. F 단백질의 모든 549 아미노산이 돌연변이 하였고, 클론당 평균 1.34 돌연변이 및 아미노산 잔기 당 평균 2.46 돌연변이였다. 모든 아미노산이 최소한 한번 돌연변이 하였고(100%), 적어도 457 아미노산(83.2%)가 두 번 돌연변이 하였다. 모타비주맙 및 F 단백질과 결합하는 다클론성 혈청을 발현된 F 단백질이 적절히 포개지는가를 결정하기 위한 양성 대조로서 사용하였다. 모타비주맙은 RSV F 단백질의 전- 및 후-융합 형태(conformation) 둘 다와 결합한다고 알려졌다. 이에 더하여, 58C5 및 30D8 모두 형태 변화에 민감하고, 따라서 58C5는 또한 30D8 에 대한 대조로서 사용하였고 30D8는 58C5에 대한 대조로서 사용하였다. 상기 실시예 10에 나타난 바와 같이, 58C5 및 30D8는 RSV F 단백질의 2 개의 독립 부위에 결합하고, 이에 더하여 둘 다 형태 변화에 민감하다.
형질감염의 2 개의 독립적인 미니프레프(minipreps)로 스크리닝을 수회 수행하였다. 항체 결합에 기여하는 잔기의 평가를 위한 선택 기준은 다음과 같았다:
돌연변이 잔기는 58c5에 대한 결합 신호가 30D8에 결합하기 위한 신호보다 2배 약하다;
돌연변이 잔기는 30D8에 대한 결합 신호가 58c5에 대한 결합신호보다 2배 약하다;
양성 대조 (다클론성 혈청 또는 모타비주맙) > 20% 발광체; 및
바람직하기는 또는 동일한 부위에서 또 다른 치환물.
각각의 동정된 클론을 다클론성 항체를 사용하여 표면 발현에 관하여 검증하였다. 샘플을 적어도 3회 시험하였다.
1. 항체 58 C5 에 대한 결합
결과를 표 36-37에 나타내었고, 이것은 적어도 3개의 샘플 (S1, S2 및 S3)에 대하여 각각의 F 단백질 돌연변이에 대한 58c5 및 30D8의 결합에 관한 면역발광, 모타비주맙 및/또는 다클론성 항체에 대한 결합, 58C5 및 30D8에 대한 값의 평균, 30D8/58C5에 대한 결합비 및 F 단백질에서의 돌연변이를 기재한다. 표 36-37에 나타낸 바와 같이, F 단백질 중의 잔기 N63, E82, Y86, K168, V207, N371, S405 및/또는 E463의 돌연변이는 항체 58C5의 결합 감소를 가져왔다. 잔기 E82는 미니프레프 스크린 모두에서 동정하였다. 이 돌연변이는 또한 FACS 분석에 의해 확인하였다. 결합된 동정된 잔기들을 예비융합 RSV-F의 3D 모델로 나타내면, 이들은 스파이크의 최상부에서 회피 돌연변이와 동일한 영역에서 스파이크의 제한 영역 위에 무리를 이루고 Mab 58C5의 항체 풋프린트를 설명한다 (도 1 참조). 그러므로, 58C5는 형태 에피토프에 결합한다.
이들 잔기를 후-융합 RSV-F 단백질 삼량체 스파이크의 X-선 구조에 나타내면, 잔기들은 항체 풋프린트의 일부일 수 없는 단백질 표면의 대부분 영역에 분포된다(도 2, 및 Morton et al., (2003) Virology 311:275-288; McLellan et al., (2010) J Virology 84(23):12236-12244; 및 McLellan et al., (2011) J Mol Biol 409:853-866 참조). 58C5의 에피토프는 F 단백질이 전-융합에서 후-융합 상태로 이동할 때 그것의 가장 극적인 형태 변화를 겪는 영역에 놓인다. 오직 전-융합 스파이크 상의 뭉쳐진 영역만이 항체의 풋프린트와 일치한다. 그러므로, 에피토프의 위치는 58C5이 융합 형태에 특이적이라는 자료와 일치하고 이것은 또한 모타비주맙, F101 및 30D8과의 경쟁의 부족을 확인한다. 그러므로, 58C5는 모타비주맙 또는 30D8과 동일한 에피토프와 결합하지 않는다.
[표 36]
Figure 112012100085696-pct00042
[표 37]
Figure 112012100085696-pct00043
2. 항체 30 D8 에 대한 결합
결과를 하기 표 38-39에 나타내었고, 이것은 적어도 3가지 샘플(S1, S2 및 S3)에 대해 각각의 F 단백질 돌연변이에 대한 58c5 및 30D8의 결합에 대한 면역형광, 모타비주맙 및/또는 다클론성 혈청의 결합, 58C5 및 30D8의 평균값, 58C5/30D8에 대한 결합 비율 및 F 단백질에서의 돌연변이를 나타낸다. 표 38-39에 나타낸 바와 같이, F 단백질 중의 잔기 V278, R339, F351, P353, M370, N371, C382, D392, M396 및/또는 S403의 돌연변이는 항체 30D8의 결합 감소를 가져왔다. 잔기 R339는 둘 다의 미니프레프 스크린에서 동정하였다. M370 및 C382 둘 다의 2 가지 다른 돌연변이는 RSV F 단백질에 대한 항체 30D8의 결합감소를 가져왔다. 58C5에 대해 상기에 나타낸 바와 같이, 동정된 잔류물은 RSV F 단백질의 하나의 도메인으로 제한하였다. 모든 결합에 대해 동정된 잔류물을 결합하면, 이들은 모두 줄기/대 영역 바로 위의 롤리팝의 저부에서, D1 도메인에서 무리를 이룬다. 몇몇 잔기들은 3D 모델에 따르면 내부이고, 반면 노출되어 있는 나머지 잔류물들은 전융합 삼량체 모델에서 다양한 프로모터들의 D1 도메인 사이의 틈의 계면에서 무리를 이룬다 (도 3 참조). 잔류물들이 후-융합 삼량체로 보일 때, 모든 동정된 잔류물들은 내부이다. 비록 D1 영역의 형태 변형이 전 및 후-융합 변형 사이로 매우 제한적일 것으로 예측되지만, 프로모터 서브유니트는 전 및 후-융합 사이에 재배열되고, 그 결과 더 압축되고 덜 개방된 후-융합 구조를 가져온다. 30D8 Mab의 D1 영역으로의 매핑은 본 결과와 일치하고 이것은 RSV F 단백질 구조 형태에 의존한다. 더욱이, 58c5의 경우, 에피토프는 58c5, 모타비주맙 또는 항체 101F와 경쟁하지 않는다. 이것은 3D 모델상의 위치와 일치한다. 그러므로, 30D8는 모타비주맙 또는 58c5과 동일한 에피토프와 결합하지 않는다.
[표 38]
Figure 112012100085696-pct00044
[표 39]
Figure 112012100085696-pct00045
변형은 본 분야의 당업자들에게 이해될 수 있으므로, 본 발명은 첨부된 청구범위의 범위에 의해서만 제한될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Calmune Corporation Williamson, Robert Anthony Wadia, Jehangir Pascual, Gabriel Keogh, Elissa <120> ANTI-HUMAN RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS ANTIBODIES (RSV) AND METHODS OF USE <130> 33335.01161.WO11/1161PC <150> 61/399,310 <151> 2010-07-09 <150> 61/456,454 <151> 2010-11-05 <160> 487 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 58c5 Fab Heavy Chain <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ala Leu Thr Cys Asn Val Ser Gly Ala Ser Ile Asn Ser Asp 20 25 30 Asn Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Arg Pro Gly Gly Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly His Ile Ser Tyr Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Ser Met Ser Leu Glu Thr Ser Gln Ser Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Ser Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Ala Cys Gly Ala Tyr Val Leu Ile Ser Asn Cys Gly Trp Phe 100 105 110 Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 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200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 58c5 VL CDR1 <400> 6 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 58c5 VL CDR2 <400> 7 Gly Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 58c5 VL CDR3 <400> 8 Gln Gln Tyr Gln Tyr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 9 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sc5 Fab Heavy Chain <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Gly Ser 20 25 30 Asn Trp Trp Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr Tyr Arg Gly Thr Thr Asn Tyr Lys Ser Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Arg Ser Thr Phe Gly Pro Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Met 100 105 110 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13 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> sc5 Light Chain <400> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Lys Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Asn Gln Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr 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480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gctaa 645 <210> 19 <211> 687 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> sc5 Heavy Chain <400> 19 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60 acttgcactg tctctggtga ctccatcagc ggctctaact ggtggaattg ggtccgccag 120 cccccaggga aggggctgga gtggattggg gaaatctatt atcgtgggac taccaattat 180 aagtcgtccc tcaagggtcg agtcaccatg tcagttgaca cgtccaagaa ccagttctcc 240 ctgaagctga cctctgtgac cgccgcggac acggccgtat attattgtgc gagagggggg 300 aggtccacct ttggtccgga ctactactac tacatggacg tctggggcag agggaccacg 360 gtcaccgtct cctcagcgtc gaccaaaggt ccgtctgttt tcccgctggc tccgtcttct 420 aaatctacct ctggtggtac cgctgctctg ggttgcctgg ttaaagacta cttcccggaa 480 ccggttaccg tttcttggaa ctctggtgct ctgacctctg gtgttcacac cttcccggct 540 gttctgcagt cttctggtct gtactctctg tcttctgttg ttaccgttcc gtcttcttct 600 ctgggtaccc 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taaatctgga gccggtgagc 840 gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 900 ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 960 taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 1020 agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 1080 atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 1140 aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 1200 caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 1260 ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 1320 cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 1380 tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 1440 gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 1500 ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 1560 gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 1620 caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1680 ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 1740 tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 1800 ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 1860 agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 1920 aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat 1980 gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg 2040 tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt 2100 tgtgtggaat tgtgagcgga taacaattga attaaggagg atataattat gaaatacctg 2160 ctgccgaccg cagccgctgg tctgctgctg ctcgcggccc agccggccat ggccgccggt 2220 gaaattgtct tgacgcaaag cccggggacc cagtcgctgt ccccgggaga gcgcgcgacc 2280 ctgtcatgtc gtgcgagtca aagtgtcggt aacaataaac tggcttggta ccagcaacgt 2340 cctgggcagg caccgcgctt actcatttac ggagcctctt cacgtcccag cggggtagcg 2400 gatcgtttct ccggttctgg cagcggcact gatttcacct taacaatctc gcgtctggaa 2460 ccggaagatt ttgccgtcta ttactgtcag caatacggcc agtccttgtc tacatttggc 2520 cagggaacga aagtggaggt aaaacgtacc gttgctgccc ccagtgtttt catctttcca 2580 ccgtcagacg agcagctgaa gtctggtacc gcaagtgtgg tttgcctcct gaataacttt 2640 tatcctcgcg aagcgaaagt tcagtggaag gtggataatg ccctgcagtc gggtaatagc 2700 caggaaagcg tgaccgaaca agattcaaaa gactccacat attctctgag ttcgactctt 2760 acgttaagca aagctgacta tgaaaagcac aaagtttatg catgcgaggt gacgcatcag 2820 ggtctttcca gcccagtaac taaatcattc aaccgcggcg aatgttaatt aataaggagg 2880 atataattat gaaaaagaca gctatcgcga ttgcagtggc actggctggt ttcgctaccg 2940 tagcccaggc ggccgcacag gtgcaactgg tgcagagtgg ggccgaagtt aaacgcccag 3000 gttcgtccgt aaccgtctca tgcaaggcca gcggtggctc tttctctacg tacgcgctgt 3060 cctgggttcg tcaggccccg ggtcgtggac ttgaatggat gggcggcgta ataccgctgc 3120 tcaccatcac taattacgca ccgcgtttcc agggccgcat tacaatcacc gcggaccgtt 3180 cgacctcaac ggcatatctc gagttaaact cactgcgtcc tgaagatacc gcagtgtatt 3240 actgcgctcg tgaaggtacc actggctggg gctggttggg taaaccgatt ggtgcgttcg 3300 cacattgggg gcaaggcaca cttgttactg tcagctctgc ctctacgaaa ggaccgagcg 3360 tctttccctt ggctccaagt agcaaatcaa cgagcggagg gacagccgcg ttaggatgtc 3420 tggtgaagga ctattttccg gaaccagtta ccgtcagttg gaactcgggc gcgttaactt 3480 ccggtgttca cacatttccc gctgttctgc aaagtagcgg tctgtattcc ctgtcctcag 3540 tagtgacagt tccttcgagt tctctgggca ctcagaccta tatttgcaat gtgaaccata 3600 aacctagcaa tacgaaagtg gataagaaag tagagccgaa atcttgtctg cgatcgcggc 3660 caggccggcc gcaccatcac catcaccatg gcgcataccc gtacgacgtt ccggactacg 3720 cttctactag ttagaagggt ggtggctctg agggtggcgg ttctgagggt ggcggctctg 3780 agggaggcgg ttccggtggt ggctctggtt ccggtgattt tgattatgaa aagatggcaa 3840 acgctaataa gggggctatg accgaaaatg ccgatgaaaa cgcgctacag tctgacgcta 3900 aaggcaaact tgattctgtc gctactgatt acggtgctgc tatcgatggt ttcattggtg 3960 acgtttccgg ccttgctaat ggtaatggtg ctactggtga ttttgctggc tctaattccc 4020 aaatggctca agtcggtgac ggtgataatt cacctttaat gaataatttc cgtcaatatt 4080 taccttccct ccctcaatcg gttgaatgtc gcccttttgt ctttggcgct ggtaaaccat 4140 atgaattttc tattgattgt gacaaaataa acttattccg tggtgtcttt gcgtttcttt 4200 tatatgttgc cacctttatg tatgtatttt ctacgtttgc taacatactg cgtaataagg 4260 agtcttaagc tagctaacga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 4320 gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 4380 gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 4440 acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 4500 agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 4560 ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 4620 ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 4680 taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 4740 aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttag 4779 <210> 87 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' LVKappa1/2 Forward Primer <400> 87 atgaggstcc cygctcagct gctgg 25 <210> 88 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' LVKappa3 Forward Primer <400> 88 ctcttcctcc tgctactctg gctcccag 28 <210> 89 <211> 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tccgtcttct tctctgggta cccagaccta 240 catctgcaac gttaaccaca aaccgtctaa caccaaagtt gacaagaaag ttgaaccgaa 300 atcttgcctg cgatcgcggc caggccggcc gcaccatcac catcaccatg gcgcataccc 360 gtacgacgtt ccggactacg cttctactag t 391 <210> 102 <211> 5432 <212> DNA <213> pCALM <400> 102 atgcattagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 60 gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 120 cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 180 acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 240 tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 300 ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 360 tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc 420 acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 480 tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 540 gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatccgcta 600 gcgattacgc caagctcgaa attaaccctc actaaaggga acaaaagctg gagctccacc 660 gcggtggcgg ccgcccacca tggactggac ctggcggatc ctgttcctgg tggccgcggc 720 caccggggcc cacagcaaag ggaaagggaa aggggctagc accaagggcc ccagcgtgtt 780 ccccctggcc cccagcagca agagcaccag cggcggcacc gccgccctgg gctgcctggt 840 gaaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gagctggaac agcggcgccc tgaccagcgg 900 cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag cagcggcctg tacagcctga gcagcgtggt 960 gaccgtgccc agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga accacaagcc 1020 cagcaacacc aaggtggaca agaaggtgga gcccaagagc tgcgacaaaa ctcacacatg 1080 cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa 1140 acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt 1200 gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa 1260 tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgggtgg tcagcgtcct 1320 caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa 1380 agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc 1440 acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac 1500 ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 1560 gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct 1620 ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc 1680 cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg 1740 taaacgggcc aagcgggcac ccgtgaagca gaccctgaac ttcgacctgc tgaagctggc 1800 cggcgacgtg gagagcaacc ccggccccat gaggctccct gctcagctcc tggggctgct 1860 aatgctctgg gtccctggct cgagtgagaa agggaaaggg aaataaggta ccaggtaagt 1920 gtacccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacaattcac tcgatcgccc ttcccaacag 1980 ttgcgcagcc tgaatggcga atggagatcc aatttttaag tgtataatgt gttaaactac 2040 tgattctaat tgtttgtgta ttttagattc acagtcccaa ggctcatttc aggcccctca 2100 gtcctcacag tctgttcatg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg 2160 ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg 2220 ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt 2280 tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg 2340 tatcttaacg cgtaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt 2400 taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa 2460 gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag 2520 aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt 2580 gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac 2640 cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag 2700 gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg 2760 cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc aggtggcact 2820 tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 2880 tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagaat 2940 cctgaggcgg aaagaaccag ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag 3000 gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg 3060 gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag 3120 caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc 3180 attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg 3240 cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaag 3300 atcgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca 3360 ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc 3420 ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc 3480 aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg gctatcgtgg 3540 ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg 3600 gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct 3660 gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct 3720 acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa 3780 gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagaacatc aggggctcgc gccagccgaa 3840 ctgttcgcca ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc 3900 gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt 3960 ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt 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gaaggtaact ggcttcagca 4860 gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 4920 actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 4980 gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 5040 agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 5100 ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 5160 aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 5220 cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 5280 gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 5340 cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 5400 cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cc 5432 <210> 103 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synagis VH chain <400> 103 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 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fibrinogen beta chain <400> 297 Lys Gly Ser Trp Tyr Ser Met Arg Lys Met Ser Met Lys Ile Arg Pro 1 5 10 15 Phe Phe Pro Gln Gln 20 <210> 298 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human fibrinogen gamma chain precursor <400> 298 Lys Thr Arg Tyr Tyr Ser Met Lys Lys Thr Thr Met Lys Ile Ile Pro 1 5 10 15 Phe Asn Arg Leu 20 <210> 299 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human fibrinogen alpha chain <400> 299 Arg Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Arg Ala Val Arg Met Lys Ile Arg Pro 1 5 10 15 Leu Val Thr Gln 20 <210> 300 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human hCT (9-32) <400> 300 Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro 20 <210> 301 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HN-1 <400> 301 Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu 1 5 10 <210> 302 <211> 12 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <223> Influenza virus nucleoprotein (NLS) <400> 302 Asn Ser Ala Ala Phe Glu Asp 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NF-kB P50) <400> 308 Val Gln Arg Lys Arg Gln Lys Leu Met 1 5 <210> 309 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep-1 <400> 309 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 310 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep-7 <400> 310 Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr 1 5 10 15 <210> 311 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila antennapedia <220> <223> Fruit Fly Penetratin <400> 311 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 312 <211> 17 <212> PRT <213> Drosophila antennapedia <220> <223> Fruit Fly Penetratin variant <400> 312 Gly Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 Lys <210> 313 <211> 7 <212> PRT <213> Drosophila antennapedia <220> <223> Fruit Fly Short Penetratin <400> 313 Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 <210> 314 <211> 17 <212> PRT <213> Drosophila antennapedia <220> <223> Fruit Fly Penetratin 42-58 <400> 314 Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys 1 5 10 15 Lys <210> 315 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Poly Arginine R7 <400> 315 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 316 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Poly Arginine R9 <400> 316 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 317 <211> 16 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <223> Rat pISL <400> 317 Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 318 <211> 28 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Prion mouse PrPc1-28 <400> 318 Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp 1 5 10 15 Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro 20 25 <210> 319 <211> 18 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Mouse pVEC <400> 319 Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His 1 5 10 15 Ser Lys <210> 320 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Mouse pVEC variant <400> 320 Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg 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virus <220> <223> HIV type I Tat 47-57 <400> 327 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 328 <211> 10 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <223> HIV type I Tat 47-56 <400> 328 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5 10 <210> 329 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <220> <223> HIV type I Tat 48-56 <400> 329 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5 <210> 330 <211> 10 <212> PRT <213> Human immundeficiency virus <220> <223> HIV type I Tat 48-57 <400> 330 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 331 <211> 9 <212> PRT <213> Human immundeficiency virus <220> <223> HIV type I Tat 49-57 <400> 331 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 332 <211> 8 <212> PRT <213> Human immundeficiency virus <220> <223> HIV type I Tat 49-56 <400> 332 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5 <210> 333 <211> 13 <212> PRT <213> Human immundeficiency virus <220> <223> HIV type I Tat 48-60 <400> 333 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 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<213> Bos taurus <220> <223> Bovine Indolicidin <400> 353 Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg 1 5 10 <210> 354 <211> 27 <212> PRT <213> Simian immunodeficiency virus <220> <223> SIV MPS <400> 354 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 355 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pIs1 <400> 355 Pro Val Ile Arg Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys 1 5 10 15 Lys <210> 356 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> hIgG1 heavy chain constant <400> 356 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 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ctcggtcact 360 ctgttcccgc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420 agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480 gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540 tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 600 catgaaggga gcaccgtgga gaagacaatt gcccctgcag aatgctca 648 <210> 477 <211> 681 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 56E11 Heavy Chain <400> 477 gaggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcagtg tctctggtgt ctccatcaac agcaacaatt atttctgggc ctggatccgc 120 cagcccccag gcaaggggct ggagtggatt gggaatatct attatggtgg gagcacccac 180 tacaatgcgt ccctgcagag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gagccagttc 240 tccctgaagc tgaactctgt gacctccgcc gacacggctg tgtattactg tgcggcttcc 300 gagtctatct tttgggacta ctactacggc ctggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct ctgcctccac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420 agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 600 ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660 aaagttgagc ccaaatcttg t 681 <210> 478 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 17C9 Light Chain <400> 478 gaaattgtgt tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gaatattaat acctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatcctttt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa cttgcagcct 240 gaagattttg caacttactt ttgtcaacag gctaacagtt tccctcggac cttcggccag 300 gggaccaagg tggaagtcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc 642 <210> 479 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 17C9 Heavy Chain <400> 479 caggtacagc tgcagcagtg gggcgcagga ctggtgaggc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtga ctccttcaat gattacttct ggacgtggat ccgccagacc 120 ccaggaaagg ggctggagtg gattggggaa atcagtcata gtggaagcac caactacagc 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gttgacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aaactcagcg ctgtgaccgc cgcggacacg actgtgtatt tctgtgcgag aggtgtccgc 300 tcccgacccc ctccgagtta ccgtggctcg ggctcccccc cttactacca ttacggtatg 360 gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg 420 gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480 ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540 agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600 gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca aatcttgt 708 <210> 480 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 69F6 Light Chain <400> 480 gaaattgtgt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga cagagtcacc 60 atctcttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca acagaaacca 120 gggaaagccc ctaggctcct gatctacgat gcatcctatt tggacacagg ggtcccatca 180 aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctacagcct 240 gaagattttg caacatatta ctgtcaacaa tatgatgatc tccggggggg gttcactttc 300 ggccctggga ccaaagtgga cgtcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 360 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 540 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgc 648 <210> 481 <211> 663 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 69F6 Heavy Chain <400> 481 cagatgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgagaaagc cgggggagtc tctgaagatc 60 gcctgtaagg gttccggata cagttttacc agctactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggaatg gctggggatc atctttccta atgactctga tgccacatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatg tcagtcgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga acagcctgaa ggcctcggac accgccgtgt atttttgtgc gagacagtat 300 tatcttggct cgtttgaatc ctggggccaa ggaaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660 tgt 663 <210> 482 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 56E11 VH CDR1 <400> 482 Ser Asn Asn Tyr Phe Trp Ala 1 5 <210> 483 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 17C9 VH CDR1 <400> 483 Asp Tyr Phe Trp Thr 1 5 <210> 484 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 69F6 VH CDR1 <400> 484 Ser Tyr Trp Ile Ala 1 5 <210> 485 <211> 574 <212> PRT <213> Respiratory syncytial virus <220> <223> F Protein <400> 485 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Lys Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Ala Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Gln Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Ile Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 565 570 <210> 486 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motavizumab MARM F protein <400> 486 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Lys Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Ala Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Gln Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Glu 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Ile Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 565 570 <210> 487 <211> 574 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 58C5 MARM F protein <400> 487 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Lys Ile 50 55 60 Lys Lys Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Ala Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Gln Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Lys Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Gly Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Ile Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val 530 535 540 Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 565 570

Claims (99)

  1. 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로, 여기서:
    RSV가 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 존재하에 10회 이상의 바이러스 복제 후 상기 항체 또는 그것의 항원-결합 단편에 의한 중화를 회피하는 바이러스를 생산하지 않고,
    여기서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로, SEQ ID NO:405에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 함유하는 VH CDR1; SEQ ID NO:406에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 함유하는 VH CDR2; 및 SEQ ID NO:407에 기재된 아미노산 잔기의 서열을 함유하는 VH CDR3을 함유하는 가변 중사슬; 및
    SEQ ID NO:408에 기재된 아미노산의 서열을 함유하는 VL CDR1; SEQ ID NO:409에 기재된 아미노산의 서열을 함유하는 VL CDR2; 및 SEQ ID NO:410에 기재된 아미노산의 서열을 함유하는 VL CDR3을 함유하는 가변 경사슬을 포함하고; 그리고
    상기 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 호흡기세포융합 바이러스(RSV) 융합(F) 단백질에 면역특이적으로 결합하고 및 RSV를 중화시키는 것인, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편으로
    VH 도메인; 및
    VL 도메인을 포함하고,
    여기서, VH 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:396의 아미노산 1-121으로 기재되고; 그리고
    VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:395의 아미노산 1-110으로 기재되는 것인, 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 인 비트로 플라크 감소 분석에서 RSV의 중화를 위한 2 nM 보다 적은 EC50를 갖거나 또는 단리된 RSV F 단백질 또는 RSV 바이러스에 대해 최소한 108 M-1 의 친화성을 갖는 것인 항-RSV 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  10. 제1항에 따른 항체 또는 그것의 항원-결합 단편 또는 제1 다중화 도메인에 컨쥬게이트된 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 제1 항원-결합 부분; 및
    제2 다중화 도메인에 컨쥬게이트된 항바이러스 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 제2 항원-결합 부분을 포함하는 다가 항체로,
    여기서, 상기 제1 다중화 도메인과 제2 다중화 도메인은 상보적이거나 또는 동일하고, 그것에 의해 제1 항원-결합 부분과 제2 항원-결합 부분은 다가 항체를 형성하는 것인 다가 항체.
  11. 제1항에 따른 항체 또는 그것의 항원-결합 단편, 제10항에 따른 다가 항체; 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 RSV 감염의 하나 이상의 증상의 치료 또는 억제, 또는 RSV 감염을 예방하기 위한 약제학적 조성물.
  12. RSV 감염의 하나 이상의 증상의 치료 또는 억제, 또는 RSV 감염을 예방하기 위한 제1항에 따른 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  13. RSV 감염의 하나 이상의 증상의 치료 또는 억제 또는 RSV 감염의 예방을 위해 의약의 제제에 사용하기 위한, 제1항에 따른 항체 또는 그것의 항원-결합 단편.
  14. RSV 감염을 검출하는 방법으로,
    (a) 제1항에 따른 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 사용하여 유체, 세포 또는 조직 샘플에서 RSV 항원의 농도를 분석하고;
    (b) 분석된 RSV 항원의 농도를 대조 농도와 비교하는 것을 포함하고, 그것에 의해 RSV 항원의 대조 농도와 비교한 RSV 항원에서의 분석된 농도의 증가는 RSV 감염을 나타내는 것인 검출방법.
  15. 제1항에 따른 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산.
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