KR20240007173A - 범-특이적 코로나 바이러스 결합제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 두 개의 서로 다른 결합 부위들을 통해 코로나 바이러스의 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하고, 코로나바이러스, 특히 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2와 같은 사베코바이러스를 강력하게 중화시키는 조성물 및 결합제에 관한 것이다. 상기 조성물 또는 결합제는 사베코바이러스의 여러 계통군에 걸쳐 두 에피토프가 보존되어 있는 것을 특징으로 하는 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)의 에피토프에 특이적으로 결합하여, 광범위하게 중화시키는 범-특이적 항체 기반 조성물을 제공함으로써 바이러스 탈출을 감소시킨다. 이러한 결합제 및 조성물의 적용 및 용도도 본 발명의 또 다른 일부를 이룬다.

Description

범-특이적 코로나 바이러스 결합제
본 발명은 적어도 두 개의 서로 다른 결합 부위들을 통해 코로나 바이러스의 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하고, 코로나바이러스, 특히 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2와 같은 사베코바이러스를 강력하게 중화시키는 조성물 및 결합제에 관한 것이다. 상기 조성물 또는 결합제는 사베코바이러스의 여러 계통군(clade)에 걸쳐 두 에피토프가 보존되어 있는 것을 특징으로 하는 스파이크 단백질의 ACE2-수용체 결합 도메인(RBD)의 에피토프들에 특이적으로 결합하여 광범위하게 중화되는 범-특이적 항체 기반 조성물(pan-specific antibody-based composition)을 제공함으로써 바이러스 탈출(viral escape)을 감소시킨다. 이러한 결합제 및 조성물의 적용 및 용도도 본 발명의 또 다른 일부를 이룬다.
중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 전 세계적으로 빠르게 확산되어 치명적인 결과를 가져온 질병인 COVID-19의 원인 물질이다. SARS-CoV-2 감염은 무증상일 수 있으며 대부분 경미하거나 약간 중증의 증상들이 나타날 수 있다. 그러나 환자의 대략 10%에서, COVID-19는 호흡곤란과 저산소혈증을 특징으로 하는 보다 심각한 단계로 진행되며, 이는 종종 장기 집중 치료가 필요한 급성 호흡 곤란으로 더 진행되고, 일부 환자에게는 사망을 일으킬 수 있다. 또한, "롱(Long)-COVID"는 SARS-CoV-2 바이러스를 더 이상 감지할 수 없는 경우에도 COVID-19 감염이 장기적으로 영향을 미치는 것을 의미한다. 아마도, SARS-CoV-2 바이러스의 본능적(innate) 인식과 또한 가능하게는 비효율적인 면역 반응으로 인한 항체와의 면역 복합체에 의해 유발되는 지속적인 염증이 심각한 질병 진행에 기여할 가능성이 높다. 하부 기도에서 바이러스 복제를 억압(suppress)하거나 심지어 (추가로) 방지하는 치료 옵션은 COVID-19에 감염되었거나 재감염된 환자(노인 또는 기타 환자)를 구하는 데 중요한 위치를 차지할 가능성이 높다. 특정 유형의 치료적 접근법은 잠재적으로 중화 항체, 즉 수동 항체 요법/면역요법에 의존한다(하부 기도의 염증으로 인해 전신 순환계에서 기관지-폐포 공간으로의 면역글로불린 배출이 증가하며, 따라서 중화 항체의 전신 투여가 가능함). Rujas 등 2020(doi: https://doi.org/10.1101/2020.10.15.341636)은 PDB(Protein Data Bank) 또는 EMDB(Electron Microscopy Data Bank)에서 항목(entry)을 입수할 수 있는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질(S)에 결합하는 항체들에 대한 우수한 개요를 제공하는 것으로, 몇 가지 새로운 항체들을 제공하는데, 그 중 일부(항체 46 및 52)는 결합 부위가 수용체 결합 모티프에서 다소 멀어지고 잠재적으로 스파이크 단백질을 불안정하게 만든다.
SARS-CoV-1에 의해 발생하는 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(SARS)와 유사하게, SARS-CoV-2는 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)를 인간 세포에 진입하기 위한 수용체로 사용한다. SARS-CoV-2는 SARS-CoV-1보다 더 높은 친화도로 ACE2에 결합한다. SARS-CoV의 S-도메인에 대한 항체들의 SARS-CoV-2와의 교차 반응성은 Bates 등 2021(Cell Rep 34:108737)에 기재되어 있다.
인간 ACE2 수용체와 상호작용하는 코로나 바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합 모티프(RBM)는 중화 인간 항체를 개발하기 위한 면역원성 영역을 제공하지만, SARS-CoV-2 변이 돌연변이가 발생하는 핫스팟 중 하나이기도 하며, 이는 RBM 영역에 결합하는 일부 단클론 항체의 중화 효능을 감소시키고, 걱정스럽게는 인간 회복기 혈장의 중화 효능도 감소시킬 수 있는, 영국에서 출현한 B.1.1.7 변이체 및 남아프리카에서 발견된 501Y.V2 변이체와 같은 확산되고 있는 수많은 SARS-CoV-2 변이체에 의해 입증된다(Leung, et al. 2021, Euro Surveill. 26, 2002106). 　 단클론 항체인 카시리비맙(casirivimab)과 임데비맙(imdevimab)(Regeneron) 및 밤라니비맙(bamlanivimab)(Lilly)은 2020년 11월 9일에 미국 FDA로부터 긴급 사용 승인을 받았다. SARS-CoV-2 변이체 B.1.351(남아프리카; RBD K417N, E484K, N501Y의 변이체들 포함) 및 B.1.1.248(브라질; RBD K417T, E484K, 및 N501Y의 변이체들 포함)이 최근에 카시리비맙에 부분적으로 내성이 있고, 밤라니비맙에는 완전히 내성이 있는 것으로 보고되었으며(Hoffmann et al. 2021, doi: https://doi.org/10.1101/2021.02.11.430787), 이는 추가적인 치료 옵션이 필요하다는 것을 충분히 보여주었다. 그 결과 FDA는 2021년 4월 16일에 단독요법으로서 밤라니비맙의 긴급 사용 승인을 취소했다. 변이체의 출현은 인간 항체 반응에 의해 선택 압력(selection pressure)이 감소된 에피토프에 결합하는 중화 항체를 개발할 필요성을 촉구한다. 이를 위해서는 단일 도메인 항체들이 특히 적합하다. 일부 단일 도메인 항체들은, 크기가 작기 때문에, 기존 항체가 접근하기 어려운 스파이크 내의 부위들에 도달할 수 있다. Wrapp 등 2020(Cell 184:1004-1015)의 VHH72와 같은 SARS-CoV-1과 SARS-CoV-2 둘 다의 단일 도메인 항체/나노바디 형식 중화제가 보고되었다. 바이러스가 면역으로부터 탈출할 가능성을 줄이는 추가적인 방법은 서로 다른 VHH들을 2중 파라토프(biparatopic) 작제물로 병합하는 것이다(도 1, Saelens and Schepens, 2021, Science 371 (6530), 681-682에서 조정됨). 예를 들어, Koenig 등(2021, Science 371, eabe6230)은 겹치치 않는 에피토프들에 결합하는 두 개의 중화 VHH들의 직렬 반복이 시험관내에서 중화를 피하는 돌연변이 바이러스들이 선택될 가능성을 크기 줄인다는 것을 보여주었다. Wu 등 2021(BioRxiv doi: https://doi.org/10.1101/2021.02.08.429275)은 이중특이적 나노바디 형식이 비강내 투여 환경에서 효능을 증가시킨다고 주장하는 일련의 SARS-CoV-2 중화 나노바디들을 보고했다.
중화를 피해 돌연변이 코로나바이러스들이 출현할 가능성을 줄이려면, 바이러스 돌연변이가 덜 발생하는 결합 부위들의 혼합을 제공하는 여러 에피토프 영역들에 결합하는 범-특이적 항체들이 필요하다.
본 발명은 사베코바이러스들 간에 보존되어 있는 적어도 2개의 결합 부위들을 통해 사베코바이러스 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(SPRBD)에 결합할 수 있는 범-특이적 결합제에 관한 것이다.
제1 측면에서, 본 발명은 코로나 바이러스 스파이크 단백질 RBD에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합제를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상기 하나 이상의 결합제는 서열 번호: 1로 정의된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 잔기 Y369, F377, 및 K378에 결합하는 하나 이상의 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD), 및 서열 번호: 1로 정의된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 T393, N394, V395, 또는 Y396 중 적어도 하나 이상에 결합하는 하나 이상의 제2 ISVD를 포함한다. 실제로 상기 제1 ISVD 및 제2 ISVD의 상기 결합 부위들은 결합제 또는 결합 도메인이 VHH72(Wrap et al. 2020; Cell 184:1004-1015; PCT/EP2021/052885) 및 VHH3.117(본원에 나타낸 바와 같음, EP21166835.5 및 PCT/EP2022/052919)과 특이적으로 상호작용하는 데 필요한 최소 잔기들로 정의될 수도 있다. 상기 제1 ISVD 및 제2 ISVD의 상기 결합 부위들은 각각 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2 바이러스들의 중화를 개별적으로 허용하는 이중 결합 영역을 제공하고, 사베코바이러스들 간에 보존되어 있는 코로나 바이러스 스파이크 단백질의 RBD 도메인 상에 결합 영역을 제공하여 돌연변이가 발생해 중화를 피할 확률이 낮아진다.
본 발명은 또한 서열 번호: 1로 표시된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 잔기 Y369, F377, 및 K378에 결합하는 하나 이상의 제1 ISVD, 및 서열 번호: 1로 표시된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 잔기 T393, N394, V395, 또는 Y396 중 적어도 하나 이상에 결합하는 하나 이상의 제2 ISVD를 포함하는 결합제에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 결합제를 암호화하는 단리된 핵산 분자, 뿐만 아니라 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
또 다른 측면은 상기 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 조성물, 결합제, 단리된 핵산 및/또는 재조합 벡터를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 상기 약제학적 조성물은 선택적으로 희석제, 담체 또는 부형제를 포함한다.
본 발명은 또한 약제로 사용하기 위한, 상기 기재된 (약제학적) 조성물, 결합제, 단리된 핵산 및/또는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상체(subject)의 예방적 치료에 사용하기 위한, 상기 기재된 (약제학적) 조성물, 결합제, 단리된 핵산 및/또는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 코로나바이러스 감염, 보다 구체적으로는 사베코바이러스 감염, 보다 구체적으로는 SARS-CoV-1 또는 SARS-CoV-2 감염의 치료에 사용하기 위한, 상기 기재된 (약제학적) 조성물, 결합제, 단리된 핵산 및/또는 재조합 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상체의 수동 면역화에 사용하기 위한, 상기 기재된 (약제학적) 조성물, 결합제, 단리된 핵산 및/또는 재조합 벡터에 관한 것이다.
설명된 도면은 단지 개략적이며 제한적이지 않다. 도면에서 일부 요소들의 크기는 예시를 위해 과장되어 표시될 수 있으며, 실제 축척에 맞게 그려지지는 않을 수 있다.
도 1. SARS-CoV-2를 중화시키기 위해 스파이크 단백질을 표적으로 하는 이중특이적 항체 조성물. SARS-CoV-2의 스파이크 단백질에는 숙주 세포의 ACE2에 결합하여 세포 진입을 유도하는 RBD가 포함되어 있다. RBD-ACE2 결합은 단일 도메인 항체 또는 VHH에 의해 방지될 수 있다. RBD의 겹치지 않는 영역들에 결합하는 VHH1 및 VHH2를 사용한 병용 치료는 탈출 돌연변이가 발생할 때까지 감염을 방지한다. 이는 VHH들이 이중특이적 분자에 공유적으로 연결되는 경우 극복될 수 있다. (Saelens and Schepens, Science 371 (6530), 681-682에서 조정됨). ACE2, 안지오텐신 전환 효소 2; RBD, 수용체 결합 도메인; SARS-CoV-2, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2.
도 2. 다른 계열의 VHH들에 의한 SARS-CoV-2 RBD에 대한 VHH72 결합의 용량 의존적 억제. avi-태그된 비오티닐화된 SARS-CoV-2 RBD(최종 0.5nM) 및 Flag-태그된 VHH72 h1 S56A(0.6nM)를 사용한 경쟁 Alphascreen. 동일한 (초)계열에 속하는 VHH들은 네모 박스로 표시되어 있다.
도 3. 심층 돌연변이 스캐닝을 기반으로 한 VHH72, VHH3.38, VHH3.83 및 VHH3.55의 에피토프. (B) 심층 돌연변이 스캐닝(검정색 선)에 의해 결정된 VHH72_h1_S56A, VHH3.38, VHH3.55 및 VHH3.83의 결합에 관여하는 RBD 아미노산 위치들의 프로파일은 FastContact 및 모델링(주황색 막대)을 기반으로 VHH들 간에 겹치고, SARS-CoV-2 RBD 상의 VHH72 에피토프와 겹친다.
도 4. RBD에 결합하는 VHH3.117의 동역학. (A) 항-인간 IgG Fc 포획(AHC) 바이오센서(ForteBio)에 고정된 단량체성 인간 Fc-융합된 SARS-CoV-2_RBD-SD1에 대한, 단일 농도(200nM)에서 BLI에 의해 측정된 VHH3.117("VHH3_117"), VHH3.42("VHH3_042") 및 VHH72_h1_S56A("VHH72")의 오프 레이트(off rate) 비교. 각 그래프에는 중복된 측정값들 중 하나가 표시되어 있다. (B) 200nM 내지 3.13nM의 농도(2배 연속 희석)에서 반복실험된 항-인간 IgG Fc 포획(AHC) 바이오센서(ForteBio)에 고정된 단량체성 인간 Fc-융합된 SARS-CoV-2_RBDSD1에 대한 VHH3.117의 결합 동역학.
도 5. VHH3.42 및 VHH3.117은 RBD 결합에 대해 VHH72와 경쟁하지 않는다. (A) VHH3.42 및 VHH3.117은 VHH72-Fc에 의해 포획된 단량체성 SARS-CoV-2 RBD에 결합할 수 있다. 그래프는 코팅된 VHH72-Fc에 의해 포획된 RBD에 대한 0.5μg/ml의 VHH들 및 무관한 GFP 결합 VHH(GBP)의 평균(n =2 + 변동(variation)) 결합(450nm에서 OD)을 보여준다. 10μg/ml의 PBS 및 VHH72_h1_S56A("VHH72")가 참조(reference)로 포함되었다. (B) 이러한 BLI 경쟁 실험에서, VHH72-Fc를 항-인간 Fc 바이오센서 팁에 로딩한 다음, 포화될 때까지 마우스 IgG2a Fc-융합된 SARS-CoV-2-RBD-SD1(Sino Biological)을 포함하는 용액에 담갔다. 다음으로 상기 팁을 VHH72_h1_S56A("VHH72"), VHH3.42("VHH3_42"), VHH3.117 5("VHH3_117")를 포함하는 용액 또는 VHH를 포함하지 않는 용액("버퍼")에 담갔다. RBD의 결합에 대해 VHH72와 경쟁하는 VHH(예컨대 VHH72 자체)는 VHH72-Fc 코팅된 팁에서 포획된 RBD-muFc를 대체하므로 시간이 지남에 따라 BLI 신호가 낮아질 것이다. VHH3.42 및 VHH3.172는 VHH72-Fc 포획된 RBD에 결합하므로 BLI 신호가 증가한다. 그래프는 팁들을 지시된 VHH들을 포함하는 용액에 담근 순간부터 시작하여 시간 경과에 따른 BLI 신호를 보여준다.
도 6. VHH3.42, VHH3.92 및 VHH3.117은 재조합 ACE2에 대한 RBD의 결합을 방해하지 않는다. 그래프는 VHH3.42, VHH3.92 및 VHH3.117의 연속 희석액의 존재 하에 비오티닐화된 RBD가 재조합 ACE2에 결합할 때 검출되는 AlphaLISA 신호를 보여준다. 무관한 단백질을 표적으로 하는 대조군 VHH를 음성 대조군(ctrl VHH)으로 사용했다. RBD와 ACE2의 결합을 방지하는 VHH72_h1_S56A 30("VHH72") 및 관련 VHH3.115를 양성 대조군으로 사용했다.
도 7. VHH3.42, VHH3.92 및 VHH3.117은 RBD가 ACE-2에 결합하는 것을 방지하지 않는다. (A-C) VHH3.42, VHH3.92 및 VHH3.117은 RBD가 Vero E6 세포에 결합하는 것을 방지하지 않는다. (A) ACE2를 내인성으로 발현하는 E6 세포에 대한 RBD-Fc 결합; Vero E6 세포에 대한 VHH3.42 또는 VHH3.117(각각 1ug/ml)과 사전 인큐베이션된 RBD(0.4ug/ml)의 결합에 대한 유세포 분석. 대조군으로서 RBD로 처리되지 않은 Vero E6 세포(RBD 없음) 및 PBS 또는 무관한 대조군 GFP 표적화 VHH(ctrl VHH)와 사전 인큐베이션된 RBD-muFc로 염색된 Vero E6 세포를 사용하였다. VHH72_h1_S56A를 참조로 사용했다. 막대는 VHH당 하나의 단일 분석을 나타낸다. 대조군인, "PBS" 및 "RBD 없음"은 중복하여 테스트되었다. RBD-muFc의 결합은 AF647 접합된 항-마우스 IgG 항체에 의해 검출되었다. (B) Vero E6 세포에 대한 VHH3.92 또는 VHH3.117의 연속 희석액과 사전 인큐베이션된 RBD(0.4ug/ml)의 결합을 보여주는 유세포 분석. 대조군으로서 RBD로 처리되지 않은 Vero E6 세포(RBD 없음) 및 PBS 또는 무관한 대조군 GFP 표적화 VHH(ctrl VHH)와 사전 인큐베이션된 RBD-muFc로 염색된 Vero E6 세포를 사용하였다. VHH3.115(VHH72와 관련된 VHH)를 참조로 사용했다. RBD-muFc의 결합은 AF647 접합된 항-마우스 IgG 항체에 의해 검출되었다. 그래프는 % RBD-muFc 양성 Vero E6 세포(n = 1)를 보여준다. (C) VHH3.117은 SARS-CoV-2 RBD를 표면에서 발현하는 효모 세포에 대한 인간 Fc에 융합된 인간 ACE2의 결합을 방지하지 않는다. VHH72 또는 15 VHH3.117(10, 1, 0.1, 0.01 또는 0ug/ml)과 사전 인큐베이션된 ACE2-Fc의 결합을 보여주는 히스토그램. ACE2-Fc의 결합은 AF594 접합된 항-인간 IgG 항체를 사용하여 검출되었다.
도 8. VHH3.117은 다양한 범위의 계통군 1, 2 및 3 사베코바이러스들의 RBD를 인식한다. (A) 100μg/ml(X축의 각 데이터포인트에 대해 왼쪽 막대), 1μg/ml(X축의 각 데이터포인트에 대해 중간 막대) 및 0.01μg/ml(X축의 각 데이터포인트에 대해 오른쪽 막대)에서 표시된 RBD들에 대한 VHH3.117의 결합을 보여주는 유세포 분석. (B) PBS를 음성 대조군으로 사용하고, VHH72_h1_S56A("VHH72")를 참조로 사용했다. 그래프는 표시된 RBD 변이체들에 있어서, RBD를 발현하지 않는 세포(FITC 접합된 항-myc 태그 항체 음성)에 대한 RBD를 발현하는 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 세포(FITC 접합된 항-myc 태그 항체 양성)에 결합된 VHH를 검출하는 데 사용되는 AF647 접합된 항마우스 IgG 항체의 MFI의 비율을 보여준다.
도 9. 심층 돌연변이 스캐닝에 의해 식별된 VHH3.117 에피토프의 개략화. (A) 2개의 독립적인 라이브러리들을 사용한 심층 돌연변이 스캐닝에 의해 식별된 바와 같이, 변화가 VHH72_h1_S56A("VHH72 탈출") 및 VHH3.117("VHH3.117 탈출")의 결합에 유의미한 영향을 미칠 수 있는 RBD 아미노산 위치들의 표시. 위쪽 및 아래쪽 줄에는 SARS-CoV-2 RBD 아미노산 서열(서열 번호: 99, 서열 번호: 1 스파이크 단백질 SARS-CoV-2의 잔기 381-531에 해당함)이 표시되어 있다. 위쪽 줄에는 돌연변이로 인해 사카로마이세스 세레비시아에 세포 표면에 표시된 SARS-CoV-2의 RBD에 대한 VHH72_h1_S56A 결합이 감소된 아미노산 위치들에 밑줄이 그어져 있고 굵은 글씨로 표시되어 있다. 아래쪽 줄에는 돌연변이로 인해 사카로마이세스 세레비시아에 세포 표면에 표시된 SARS-CoV-2의 RBD에 대한 VHH3.117의 결합이 감소된 아미노산 위치들에 밑줄이 그어져 있고 굵은 글씨로 표시되어 있다. (B) 상단 왼쪽 패널: 심층 돌연변이 스캐닝에 의해 식별된 바와 같이, 변화가 짙은 회색으로 표시되어 있는 VHH3.117 결합 감소와 관련되어 있는 아미노산 위치들이 있는 SARS-CoV-2 RBD(밝은 회색)의 표면 묘사. 상단 오른쪽 패널: SARS-CoV-2 RBD(밝은 회색)의 카툰 묘사(cartoon representation). 특정 치환이 VHH3.117 결합 감소와 관련되어 있고 표면에 노출되는 아미노산 위치들은 암적색으로 표시되어 있으며, 카툰 묘사에서는 스틱으로 표시되어 있다. 하단 왼쪽 및 오른쪽 패널: 일부 치환이 VHH3.117 결합 감소와 관련되어 있지만 RBD 표면에 노출되지 않은 아미노산 위치들이 표시되어 있다. 하단 왼쪽 카툰은 C336-C361 및 C391-C525 이황화 결합을 보여준다. 하단 오른쪽 패널은 Y365 및 F392의 방향족 측쇄가 RBD 코어 안쪽으로 향하고 있음을 보여준다.
도 10. 식별된 VHH3.117 에피토프의 위치는 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV-1 바이러스를 교차 중화시키는 VHH3.117의 능력과 일치한다. (A) VHH3.117 결합 부위는 GISAID 데이터베이스의 SARS-CoV-2 RBD 서열들 간에 고도로 보존되어 있다. 보존 정도를 보여주는 SARS-CoV-2 RBD(흰색)의 표면 묘사. 흰색에서 검정색으로의 그라데이션은 가장 많이 보존된 위치에서 가장 적게 보존된 위치까지를 나타낸다. N439 뿐만 아니라 우려되는 신종 변이체(K417, L452, E484 및 N501) 또는 관심 있는 변이체(S477)에서 치환된 아미노산들은 화살표로 표시되어 있다. (B) SARS-CoV-2 RBD의 아미노산 서열(서열 번호: 100, 우한-Hu-1 분리주(isolate)의 스파이크 단백질 아미노산 위치 333-516)에는, 각 잔기 위에 표시되어 있는, 분석된 440,769개의 SARS-CoV-2 게놈(2021년 2월 12일 GISAID에서 입수가능)에서 최소 한 번 검출된 모든 미스센스 돌연변이들이 함께 표시되어 있다. 변이체들은 관찰된 사례의 수로 표시되는 빈도에 따라 각 위치에서 세로로 정렬된다. 우려되는 신종 변이체(K417, L452, E484 및 N501) 또는 관심 있는 변이체(S477)에서 치환된 아미노산들은 별표로 표시되어 있다. 자주 치환되는 N439 위치도 표시되어 있다. 심층 돌연변이 스캐닝에 의해 결정된 바와 같이 치환이 VHH3.117의 결합 감소와 관련되어 있는 아미노산들은 네모 박스로 표시되어 있다. VHH3.117 에피토프는 온전한 스파이크 단백질에 접근할 수 없다. VHH3.117 결합 부위는 하향 또는 상향 입체형태의 RBD에 접근할 수 없다. 1개의 RBD는 상향 입체형태이고 2개의 RBD는 하향 입체형태인 SARS-CoV-2 스파이크 삼합체(PDB: 6VSB, 흰색)를 보여준다. VHH3.117 결합 영역은 짙은 회색으로 표시되어 있으며, 상향 위치에 있는 RBD를 가리키는 하나의 화살표와 하향 위치에 있는 RBD 중 하나를 가리키는 다른 화살표로 표시되어 있다. 삽도: 상향 입체형태의 RBD 상에 있는 VHH3.117 결합 부위는 인접한 스파이크 프로토머(protomer)의 NTD에 의해 부분적으로 가려진다.
도 11. VHH3.117 및 VHH72는 협력적인 방식으로 SARS-CoV-2를 중화시킨다. (A) VHH72(검정색)와 복합체를 이루는 SARS-CoV-2 RBD(회색)의 표면 묘사. 심층 돌연변이 스캐닝으로부터 추론된 VHH3.117 에피토프는 왼쪽에 빨간색으로 표시되어 있다. (B) SARS-CoV-2 스파이크로 슈도타이핑된 VSV-ΔG 바이러스는 VHH72 및 VHH3.117을 개별적으로 이용한 것보다 VHH72_h1-S56A/VHH3.117 칵테일에 의해 더 효율적으로 중화된다. VHH72 또는 VHH3.117의 EC50(VSV-ΔG 스파이크 SARS-CoV-2 중화)을 32배로 연속 희석하거나 이 농도의 절반으로 두 VHH들을 1:1 혼합한 것을 VSV-ΔG 스파이크(SARS-CoV-2)와 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, Vero E6 세포에 첨가했다. 감염 16시간 후, 세포 용해물을 준비하고 GFP 형광을 테스트했다. 그래프는 3중 샘플의 평균 MFI를 보여준다(n=3 ± SD).
도 12. SARS-CoV-2 RBD 및 항-RBD VHH들의 표면 묘사. (A) VHH72(녹색 리본으로 묘사됨)와 복합체를 이루는 SARS-CoV-2 RBD(회색)의 표면 묘사. VHH3.117 에피토프는 왼쪽에 빨간색으로 표시되어 있고, VHH3.117에 의해 덮일 가능성이 있는 영역은 빨간색 페인(pane)으로 표시되어 있다. (B) VHH3.117의 접촉 영역은 뒷면의 반대쪽에 VHH72 결합이 있는 RBD의 표면 묘사에서 빨간색으로 표시되어 있다. (C) VHH72 결합 부위와 유사하게, VHH3.83 결합(주황색 페인으로 표시됨)은 VHH3.117 결합 영역(빨간색)과 다른 RBD 영역을 덮는다.
도 13. Fc 융합 단백질로서 RBD-결합 VHH의 이중특이적, 2가 및 4가 작제물. (A) 2가 또는 이중특이적 VHH 작제물은 적합한 링커와 융합하여 만들어지며, 여기서 A 및 B는 서로 다른 1가 VHH 빌딩 블록들이다. 또 다른 A, B 또는 C VHH 1가 빌딩 블록과의 추가 다가 연결도 예상된다. (B) 2가 또는 (C) 이중특이적 Fc 융합 작제물은 VHH 빌딩 블록(A 및/또는 B)을 인간 Fc 도메인에, 예를 들어 IgG, 바람직하게는 IgG1로부터의 인간 Fc 도메인에 융합시킴으로써 제조될 수 있으며, 여기서 상기 Fc 꼬리는 놉-인투-홀(knob-into-hole) 기술(C)을 통해 구성될 수 있다. (D) Fc-융합체로서 이중특이적 VHH를 사용하는 4가 작제물. (E) 제1 VHH가 링커 및 힌지를 통해 Fc의 N-말단에 융합되어 있고, 다른 에피토프를 인식하는 제2 VHH가 인간 Fc의 C-말단에 링커를 통해 융합되어 있는 4가 이중특이적 VHH_A-Fc-VHH_B 작제물.
도 14: 헤드-투-테일(head-to-tail) 융합 VHH의 2가 작제물은 SARS-CoV-2 스파이크로 슈도타이핑된 VSV-ΔG를 강력하게 중화시킨다. (A) 헤드-투-테일 융합 VHH72-h1-E1D-S56A 복제물을 다양한 길이의 G4S 링커와 함께 포함하는 단일특이적 작제물은 SARS-CoV-2 스파이크로 슈도타이핑된 VSV-delG를 중화시킨다. 그래프는 B001, B002, B003(pX-B1, pXB2 및 pX-B3에 의해 암호화됨, 각각 서열 번호: 73-75로 제공됨), VHH3.117 및 VHH3.83(각각 서열 번호: 22 및 서열 번호: 6으로 표시됨)의 연석 희석액(n=3 ± SEM)의 GFP 형광 강도를 보여주며, 상기 각 형광 강도는 각 연속 희석액의 최고 및 최저 GFP 신호로 정규화된 것이다. (B) 헤드-투-테일 융합 VHH3.117 및 VHH3.83 또는 VHH3.83-N85E 변이체(pX-B7, pX-B8, 및 pX-B11에 의해 암호화되고, B007, B008 및 B011로 표시되고, 각각 서열 번호: 79, 80, 83에 표시됨)를 포함하는 이중특이적 작제물은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질로 슈도타이핑된 VSV-delG를 중화시킨다. 그래프는 표시된 2가 및 1가 VHH들(n=3 ± SEM)의 연속 희석액의 GFP 형광 강도를 보여주며, 상기 각 형광 강도는 각 연속 희석액의 최고 및 최저 GFP 신호로 정규화된 것이다.
도 15a 및 15b. 헤드-투-테일 융합 VHH3.117 및 VHH3.82를 포함하는 이중특이적 VHH 작제물은 광범위한 사베코바이러스들의 RBD에 결합한다. 그래프는 표시된 사베코바이러스의 RBD를 표면에 발현하는 코팅된 효모 세포에 대한 VHH3.117, VHH3.92, VHH3.83 및 B007(GS-VHH3-117-hc_(G4S)6_VHH3-83-hc_His8)의 연속 희석액의 결합(450nm에서의 OD)을 보여준다. GFP 결합 VHH인 GBP를 음성 대조군으로 사용했다.
도 16: 헤드-투-테일 융합 VHH의 이중특이적 작제물은 SARS-CoV-2 스파이크로 슈도타이핑된 VSV-ΔG를 강력하게 중화시킨다. 헤드-투-테일 융합 VHH3.117 및 VHH3.83(pX-B7, pX-B9 및 pX-B10에 의해 암호화되고, 각각 서열 번호: 79, 81 및 82로 표시됨) 또는 길이가 다양한 G4S 링커와 함께 VHH72-h1-E1D-S56A(pX-B4 및 pX-B5에 의해 인코딩됨, 각각 서열 번호 76 내지 77로 표시됨)를 포함하는 이중특이적 작제물은 SARS-CoV-2 스파이크로 슈도타이핑된 VSV-delG를 중화시킨다. 그래프는 표시된 이중특이적 작제물, VHH3.117 및 VHH3.83-hc('M6'; 서열 번호: 7로 표시됨)의 연속 희석액(n=3 ± SEM)의 GFP 형광 강도를 보여주며, 각 형광 강도는 각 연속 희석액에 포함된 감염되지 않은 및 감염된 PBS 처리 샘플로 정규화된 것이다. 아래 표에는 μg/mL로 표현된 각 샘플의 EC50 값이 제공되어 있다.
도 17. VHH3.89는 SARS-CoV-2 RBD와의 결합에 대해 VHH72, S309 또는 CB6과 경쟁하지 않지만 VHH3.117과 경쟁한다. (A) 특성이 잘 규명된 항체에 의해 미리 결합된 RBD에 대한 VHH3.89의 결합. 그래프는 ELISA 플레이트에 직접 코팅되거나 코팅된 S309, CB6, D72-53 및 VHH3.117(HA-태그 없음)에 의해 포획된 1가 인간 Fc(RBD-SD1-monoFc)에 융합된 RBD-SD1에 대한 VHH3.117과 관련된 VHH3.92(왼쪽 패널) 또는 VHH3.89(오른쪽 패널)의 연속 희석액의 평균 결합(450nm에서의 OD) 및 변동(n=2)을 보여준다. RSV F 단백질에 대한 항체인 팔리비주맙(palivizumab)(Synagis)에 의해 포획된 RBD를 음성 대조군으로 사용하였다. HA-태그된 VHH3.92 및 VHH3.89의 결합은 항-HA 태그 항체에 의해 검출되었다. (B) 메쉬(mesh)로 나타낸 S309, CB6 및 VHH72에 의해 포획된 SARS-CoV-2 RBD의 표면 묘사. RBD 표면의 검정색과 흰색 부분은 각각 SARS-CoV-1과 SARS-CoV-2 사이에 상이하거나 동일한 아미노산들을 나타낸다. (C) VHH3.117은 RBD 측면의 오목한 부위에 결합한다. RBD 표면 묘사에서 검정색 부분은 RBD 돌연변이체의 효모 표면 디스플레이(yeast surface display)에 기초한 심층 돌연변이 스캐닝에 의해 결정된 바와 같은 치환이 VHH3.117의 결합 감소와 관련되어 있는 아미노산 위치들을 나타낸다.
도 18. VHH3.89는 RBD가 ACE-2에 결합하는 것을 방지하지 않는다. VHH3.89 또는 VHH3.117의 연속 희석액과 사전 인큐베이션된 RBD-muFc(0.4ug/ml)와 Vero E6 세포의 결합에 대한 유세포 분석. RBD로 처리되지 않은 Vero E6 세포(RBD 없음), 및 PBS 또는 무관한 대조군 GFP 표적화 VHH(ctrl VHH)와 사전 인큐베이션된 RBD-muFc로 염색된 Vero E6 세포를 대조군으로 사용하였다. VHH72와 관련되고 RBD와 ACE2의 결합을 차단하는 것으로 알려진 VHH인 VHH3.115를 대조군으로 사용했다. RBD-muFc의 결합은 AF647 접합된 항-마우스 IgG 항체에 의해 검출되었다. 그래프는 Vero E6 세포에 대한 RBD-muFc(AF647의 MFI)의 결합(n=1)을 보여준다.
도 19. VHH3.89는 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-1 스파이크로 슈도타이핑된 VSV-ΔG를 중화시킨다. (A) VHH3.89는 SARS-CoV-2 스파이크로 슈도타이핑된 VSV-delG를 중화시킨다. 정제된 VHH3.89, VHH3.117 및 VHH3.92 및 VHH3.83에 의한 SARS-CoV-2 슈도타이핑된 VSV(VSV-ΔG 스파이크 SARS-CoV-2)의 중화. 그래프는 4중 연속 희석액(n=4 ± SEM)의 GFP 형광 강도를 보여주며, 각 형광 강도는 각 연속 희석액에 포함된 감염되지 않은 및 감염된 PBS 처리 샘플로 정규화된 것이다. GFP 결합 VHH인, GBP는 음성 대조군으로 사용되었다. (B) VHH3.89는 SARS-CoV-1 스파이크 단백질로 슈도타이핑된 VSV-delG를 중화시킨다. VHH3.89, VHH3.117, VHH3.92 또는 VHH3.83을 포함하는 미정제(crude) 이. 콜라이 주변세포질 추출물에 의한 SARS-CoV-1 슈도타이핑된 VSV(VSV-ΔG 스파이크 SARS-CoV-2)의 중화. 그래프는 감염되지 않은 샘플과 감염된 PBS 처리 샘플에 대해 정규화된 GFP 형광 강도를 보여준다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질 결합 VHH(PE 대조군)를 포함하지 않은 주변세포질 추출물을 음성 대조군으로 사용했다.
도 20. VHH3.89는 다양한 범위의 사베코바이러스들의 RBD를 인식한다. (A) SARS-CoV-1 관련 사베코바이러스(계통군 1a), SARS-CoV-2 관련 사베코바이러스(계통군 1b) 및 계통군 2 및 계통군 3 박쥐 SARS 관련 사베코바이러스의 RBD를 기반으로 한 분기도(cladogram)(UPGMA 방법). 화살표는 결합 분석에 RBD가 포함된 바이러스를 나타낸다. (B) 테스트된 사베코바이러스들 간의 아미노산 보존 정도를 적색(가장 많이 보존됨)에서 청색(가장 적게 보존됨)의 색으로 표시하는 SARS-CoV-2 RBD의 표면 묘사. 보존 분석 및 시각화는 Scop3D(Vermeire et al, 2015 Proteomics, 15(8):1448-52) 및 PyMol(DeLano, 2002)에 의해 수행되었다. (C) 표시된 사베코바이러스들의 RBD를 표면에 표시하는 사카로마이세스 세레비시아에 세포에 대한 VHH3.117 및 VHH3.89 연속 희석액의 결합에 대한 유세포 분석. 그래프는 테스트된 RBD 변이체에 있어서, RBD를 발현하지 않는 세포(FITC 접합된 항-myc 태그 항체 음성)에 대한 RBD를 발현하는 세포(FITC 접합된 항-myc 태그 항체 양성)에 결합된 VHH를 검출하는 데 사용되는 AF647 접합된 항마우스 IgG 항체의 MFI의 비율을 보여준다. (D) VHH3.89는 효모 세포 ELISA에서 모든 계통군 1 및 2 사베코바이러스들의 RBD에 효율적으로 결합한다. 그래프는 표시된 사베코바이러스의 RBD를 표면에 발현하는 코팅된 효모 세포에 대한 VHH3.89 및 VHH3.117 연속 희석액의 결합(450nm에서의 OD)을 보여준다.
도 21. 효모 표면 디스플레이를 통한 RBD의 심층 돌연변이 스캐닝을 기반으로 한 탈출 분석. (A) 각각 에피토프 1 및 2를 표적으로 하는 헤드-투-테일 융합 VHH들에 의한 결합으로부터 RBD 변이체들의 탈출은 매우 제한적이다. 패널들은 각 RBD AA 위치에 대해 표시된 VHH 작제물/조성물에 대해 해당 위치에서 VHH 결합으로부터 탈출한 모든 AA 치환의 누적 비율(각 AA에 대해 0과 1 사이)을 보여준다. (B) 각각 에피토프 1 및 2를 표적으로 하는 헤드-투-테일 융합 VHH들로부터 탈출하는 제한된 옵션. 그래프는 VHH3.83, VHH3.117, 두 VHH들의 조성물, 및 헤드-투-테일 융합 VHH3.117 및 VHH3.83(B008)에 의한 결합으로부터 탈출할 수 있는 표시된 치환을 갖는 RBD 변이체를 발현하는 효모 세포의 위치별 정체성(identity) 및 비율(0-1)을 보여준다.
도 22. 에피토프 1 결합 VHH와 에피토프 2 결합 VHH들의 칵테일/조성물 또는 헤드-투-테일 융합체는 탈출이 발생할 수 있는 RBD 위치의 수를 강력하게 제한한다. (A) 위쪽 서열은 야생형 RBD 서열(서열 번호: 101, 서열 번호: 1 스파이크 단백질 SARS-CoV-2의 잔기 331-531에 상응함)을 나타낸다. 아래 표시된 아미노산은, 표시된 각 VHH/VHH 작제물/VHH 조성물에 있어서, 돌연변이가 VHH 결합으로부터 상당히 탈출한 아미노산을 나타낸다. (B) 돌연변이가 VHH3.117, VHH3.83, VHH3.117과 VHH3.83의 조성물, 및 헤드-투-테일 융합 VHH3.117 및 VHH3.83(B8)의 결합으로부터 상당히 탈출한 AA 위치가 검정색으로 표시된 RBD의 표면 묘사.
도 23. B008은 표시된 스파이크 변이체로 슈도타이핑된 VSV v 입자를 사용한 중화 검정으로 테스트한 바와 같이 1가 VHH들에 의한 중화로부터 탈출하는 SARS-CoV-2 변이체에 대해 중화 활성을 유지한다. 중화 검정은 WT(우한) SARS-CoV-2 스파이크 단백질 (A) 또는 K378N 치환 (B) 또는 Y396H 치환 (C)을 포함하는 스파이크 단백질로 슈도타이핑된 VSV 입자들을 사용하여 수행되었다. 그래프는 각 연속 희석액에 포함된 모의 감염된 대조군 및 감염된 미처리 대조군에 대해 각각 정규화된 중복 희석액(N=2 ± 변동)의 평균 GFP 형광 강도를 보여준다. (D) 그래프는 표시된 각 VHH 작제물에 대해 비선형 회귀 곡선 피팅(log(억제제) 대 정규화된 반응 - 가변 기울기)을 통해 중복 연속 희석액으로부터 계산된 IC50 값을 보여준다.
도 24. B008은 표시된 변이체의 스파이크로 슈도타이핑된 VSV 입자를 사용한 중화 검정으로 테스트한 바와 같이 우려되는 SARS-CoV-2 변이체인 알파, 베타, 감마 및 델타를 강력하게 중화시킨다. 중화 검정은 WT(우한) SARS-CoV-2 스파이크 단백질 (A) 또는 우려되는 i SARS-CoV-2 변이체인 알파 (B), 베타 (C), 감마 (E) 및 델타 (D)의 RBD 돌연변이가 도입된 스파이크 단백질로 슈도타이핑된 VSV 입자를 사용하여 수행되었다. 또한, 알파, 베타, 델타 및 감마 변이체의 돌연변이가 조합된 스파이크 단백질(N501Y, K478N, E484K, L452R 및 T478K)(F)로 슈도타이핑된 VSV 입자를 사용하여 중화 검정을 수행하였다. 그래프는 각 연속 희석액에 모의 감염된 대조군 및 감염된 미처리 대조군에 대해 각각 정규화된 희석액(D72-53 및 B008의 경우 N=2 ± 변동, VHH3.83-Fc 및 VHH3.117-Fc의 경우 N=3 ± SEM)의 평균 GFP 형광 강도를 보여준다.
도 25. VHH3.83 및 VHH3.117을 포함하는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물은 개별 1가 VHH들에 의한 중화에서 탈출하는 SARS-CoV-2 변이체를 강력하게 중화시킨다. 중화 검정은 WT(우한) SARS-CoV-2 스파이크 단백질 (A) 또는 치환 K378N (B), Y396Y (C) 또는 K378N + Y396H (D)가 도입된 스파이크 단백질로 슈도타이핑된 VSV 입자를 사용하여 수행되었다. 그래프는 각 연속 희석액에 포함된 모의 감염된 대조군 및 감염된 미처리 대조군에 대해 각각 정규화된 중복된 연속 희석액(N=2 ± 변동)의 평균 GFP 형광 강도를 보여준다. (E) 그래프는 각 VHH 작제물에 대해 비선형 회귀 곡선 피팅(log(억제제) 대 정규화된 반응 -- 가변 기울기)을 통해 중복 연속 희석액으로부터 계산된 IC50 값을 보여준다. (F) K378 및 Y396 AA가 화살표로 표시되고 검정색으로 채색되어 있는 RBD의 표면 묘사.
도 26. 에피토프 1 및 2를 표적으로 하는 VHH를 포함하는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물은 SARS-CoV-2 BA.2 오미크론 변이체를 강력하게 중화시킨다. 중화 검정은 WT(우한) SARS-CoV-2 스파이크 단백질 (A) 또는 SARS-CoV-2 오미크론 BA.2 스파이크 단백질 (B)로 슈도타이핑된 VSV 입자를 사용하여 수행되었다. 그래프는 각 연속 희석액에 포함된 모의 감염된 대조군 및 감염된 미처리 대조군에 대해 각각 정규화된 3중 연속 희석액(N=3 ± SEM)의 평균 GFP 형광 강도를 보여준다. (C) 그래프는 각 VHH 작제물에 대해 비선형 회귀 곡선 피팅(log(억제제) 대 정규화된 반응 - 가변 기울기)을 통해 연속 희석액으로부터 계산된 평균 IC50 값(N=3 ± SD)을 보여준다. (D) 오미크론 BA.2 돌연변이가 검정색으로 채색되어 있는 RBD의 표면 묘사.
도 27. 에피토프 1 및 2를 표적으로 하는 VHH를 포함하는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물은 친화성이 매우 유사한 계통군 1, 계통군 2 및 계통군 3 사베코바이러스들 의 RBD를 인식한다. 그래프는 계통군 1(SARS-Cov-2, GD-천산갑, RatG13, SARS-Cov-1, WIV1/6, LyRa), 계통군 2(Rp3, HKU1, Rf1, ZXC21) 및 계통군 3(BM48-1)의 표시된 사베코바이러스들의 RBD를 표면에 발현하는 코팅된 효모 세포에 대한 VHH3.83-Fc, VHH3.117-Fc, KiH19, S309, CB6 및 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus) 특이적 대조 항체인 팔리비주맙의 연속 희석액의 결합(450nm에서의 OD)을 보여준다. 어떠한 RBD도 발현하지 않는 효모 세포(빈 세포)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 28. 에피토프 1 및 2를 표적으로 하는 VHH를 포함하는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물은 실제(authentic) SARS-CoV-2 바이러스를 강력하게 중화시킨다. (A) 그래프는 표시된 항체들의 3중 연속 희석액에 대해 계산된 평균 플라크 수(N=3 ± SEM)를 보여준다. 플라크 수는 처리되지 않은 감염된 대조 샘플의 수로 정규화되었다. (B) 그래프는 각 VHH 작제물에 대해 각각 3중으로 수행된 2개의 독립적인 플라크 감소 검정의 평균 IC50 값을 보여준다. IC50은 비선형 회귀 곡선 피팅(log(억제제) 대 정규화된 반응 - 가변 기울기)을 통해 3중 연속 희석액으로부터 계산되었다.
도 29. 에피토프 1에 결합하는 VHH: VHH72-5mut 및 에피토프 2에 결합하는 VHH: VHH3.89를 포함하는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물들은 VHH72-5mut에 의한 중화에 내성이 있는 WT 및 SARS-CoV-2 변이체를 효율적으로 중화시킨다. 중화 검정은 WT(우한) SARS-CoV-2 스파이크 단백질 (A) 또는 Y508H (B) 또는 S375F (C) 치환을 포함하는 변이체 스파이크 단백질로 슈도타이핑된 VSV 입자를 사용하여 수행되었다. 그래프는 각 연속 희석액에 포함된 모의 감염된 대조군 및 감염된 미처리 대조군에 대해 각각 정규화된 중복된 연속 희석액(N=2 ± 변동)의 평균 GFP 형광 강도를 보여준다. (D) 그래프는 각 VHH 작제물에 대해 비선형 회귀 곡선 피팅(log(억제제) 대 정규화된 반응 -- 가변 기울기)을 통해 중복 연속 희석액으로부터 계산된 IC50 값을 보여준다. (E) Y508 및 S375 AA가 화살표로 표시되고 검정색으로 채색되어 있는 SARS-CoV-2 RBD의 표면 묘사.
도 30. 에피토프 1에 결합하는 VHH: VHH72-5mut 및 에피토프 2에 결합하는 VHH: VHH3.89를 포함하는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물은 테스트된 모든 계통군 1, 계통군 2 및 계통군 3 사베코바이러스들 의 RBD를 인식한다. 그래프는 계통군 1(GD-천산갑, RatG13, SARS-Cov-1, WIV1/6, LyRa), 계통군 2(Rp3, HKU1, Rf1, ZXC21) 및 계통군 3(BM48-1)의 표시된 사베코바이러스들의 RBD를 표면에 발현하는 코팅된 효모 세포에 대한 VHH72-5mut-Fc (A), VHH3.89-Fc (B) 및 KiH10 (C)의 연속 희석액의 결합(450nm에서의 OD)을 보여준다. 어떠한 RBD도 발현하지 않는 효모 세포(빈 세포)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 31. SARS-CoV-2 스파이크로 슈도타이핑된 VSV 입자의, VHH-VHH-Fc 작제물 및 포맷팅된(formatted) 힌지 및 Fc가 있는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물에 의한 중화. (A) 에피토프 1 및 2를 각각 인식하는 헤드-투-테일 융합 VHH의 Fc 융합체는 SARS-CoV-2 스파이크로 슈도타이핑된 VSV 입자를 강력하게 중화시킬 수 있다. 그래프는 각 연속 희석액에 포함된 모의 감염된 대조군 및 감염된 미처리 대조군에 대해 각각 정규화된 3중 연속 희석액(N=3 ± SEM)의 평균 GFP 형광 강도를 보여준다. (B) 힌지 및 Fc를 포맷팅하는 것은 에피토프 1 및 에피토프 2에 결합하는 VHH들을 포함하는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물의 중화 활성을 감소시키지 않는다. 그래프는 각 연속 희석액에 포함된 모의 감염된 대조군 및 감염된 미처리 대조군에 대해 각각 정규화된 3중 연속 희석액(N=3 ± SEM)의 평균 GFP 형광 강도를 보여준다. (C) 그래프는 각 VHH 작제물에 대해 비선형 회귀 곡선 피팅(log(억제제) 대 정규화된 반응 -- 가변 기울기)을 통해 중복 연속 희석액으로부터 계산된 IC50 값을 보여준다.
도 32. 에피토프 1 및 에피토프 2를 각각 인식하는 헤드-투-테일 융합 VHH들의 Fc 융합체들은 계통군 1, 계통군 2 및 계통군 3 사베코바이러스들 의 RBD를 인식한다. 그래프는 계통군 1(SARS-CoV-2, GD-천산갑, RatG13, SARS-Cov-1, WIV1/6, LyRa), 계통군 2(Rp3, HKU1, Rf1, ZXC21) 및 계통군 3(BM48-1)의 표시된 사베코바이러스들의 RBD를 표면에 발현하는 코팅된 효모 세포에 대한 117-72(S56A)-Fc (A) 및 팔리비주맙 (B)의 연속 희석액의 결합(450nm에서의 OD)을 보여준다. 어떠한 RBD도 발현하지 않는 효모 세포(빈 세포)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 33. 에피토프 1 및 에피토프 2에 결합하는 VHH들을 포함하는 다양한 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물들은 WT SARS-CoV-2 및 SARS-CoV-2 오미크론 BA.1 및 BA.2 변이체를 일관되게 중화시킨다. 중화 검정은 SARS-CoV-2 614G 스파이크 단백질 (A) 또는 오미크론 BA.1 (B) 또는 BA.2 (C) 변이체의 스파이크 단백질로 슈도타이핑된 VSV 입자를 사용하여 수행되었다. 그래프는 각 연속 희석액에 포함된 모의 감염된 대조군 및 감염된 미처리 대조군에 대해 각각 정규화된 단일 연속 희석액의 평균 GFP 형광 강도를 보여준다.
도 34. 에피토프 1 및 2를 각각 표적으로 하는 2개의 VHH들을 포함하는 이중특이적 VHHa-Fc-VHHb 융합체들은 SARS-CoV-2 WT 및 BA.1 오미크론 변이체를 강력하게 중화시킨다. 중화 검정은 614G 스파이크 단백질 (A) 또는 오미크론 변이체 BA.1의 스파이크 단백질 (B)로 슈도타이핑된 VSV 입자를 사용하여 수행되었다. 그래프는 각 연속 희석액에 포함된 모의 감염된 대조군 및 감염된 미처리 대조군에 대해 각각 정규화된 4중 연속 희석액(N=4 ± SEM)의 평균 GFP 형광 강도를 보여준다.
도 35. 에피토프 1 및 2를 각각 표적으로 하는 2개의 VHH들을 포함하는 이중특이적 VHHa-Fc-VHHb 융합체들은 SARS-CoV-2 WT 및 오미크론 BA.1 및 BA.2 변이체를 강력하게 중화시킨다. 중화 검정은 SARS-CoV-2 614G 스파이크 단백질 (A) 또는 오미크론 BA.1 (B) 또는 BA.2 (C) 변이체의 스파이크 단백질로 슈도타이핑된 VSV 입자를 사용하여 수행되었다. 그래프는 각 연속 희석액에 포함된 모의 감염된 대조군 및 감염된 미처리 대조군에 대해 각각 정규화된 단일 연속 희석액의 평균 GFP 형광 강도를 보여준다.
도 36. 심층 돌연변이 스캐닝에 의한, 돌연변이 시 VHH3.117 및 VHH3.89에 대한 결합을 상실할 수 있는 SARS-CoV-2 RBD 아미노산 위치의 결정. SARS-CoV-2 RBD의 전체 길이(아미노산 위치는 '부위' 축에 표시됨)에 걸쳐 플로팅된 VHH3.117 (A) 또는 VHH3.89 (B)로 얻은 심층 돌연변이 스캐닝 신호(탈출 %로 표시됨). (C-D) SARS-CoV-2 RBD의 아미노산 서열(우한-Hu-1 분리주의 스파이크 단백질 아미노산 위치 336-525)이 표시되어 있으며, 심층 돌연변이 스캐닝에 의해 결정된 바와 같이 치환이 VHH3.117 (C) 또는 VHH3.83 (D)의 결합 손실과 관련되어 있는 아미노산은 네모 박스로 표시되어 있다.
도 37. SARS-CoV-2(SC2) 스파이크 단백질의 RBD에 대한 VHH3.89 및 VHH3.117의 결합 모드. 왼쪽, 중간 및 오른쪽 열은 정면(상단 행), 및 오른쪽(중간 행) 또는 왼쪽(하단 행)으로 90도 회전된 보기로 표시된, SC2 RBD(왼쪽 열), 및 VHH3.89와의 복합체(중간 열) 또는 VHH3.117과의 복합체(오른쪽 열)를 보여준다. VHH와 복합체를 이루는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 복합체는 cryoEM에 의해 결정되었으며(도 38 참조), 여기서는 용매 접근 가능한 표면, 밝은 회색(SC2 RBD), 진한 회색(VHH3.89) 또는 중간 회색(VHH3.117)으로 표시되어 있다. SC2 RBD 표면에서, 심층 돌연변이 스캐닝(도 36)에 의해 식별된 바와 같은 VHH3.89 및/또는 VHH3.117 결합에 대한 탈출 돌연변이로 식별된 잔기는 스틱 표현으로 표시되고, 라벨링되며, 진한 회색으로 강조 표시되어 있고; VHH3.89 및 VHH3.117 계열 구성원 결합제의 결합을 위한 최소 공통 코어(또는 '에피토프 코어'; 잔기 R355, N394, Y396, Y464, S514 및 E516 포함)를 형성하는 것으로 cryo-EM 실험에 의해 제안된 잔기들은 스틱 표현으로 표시되며, 검은색으로 표시되고, 라벨링되며, 네모 박스로 강조 표시되어 있다. 에피토프 코어는 대략 300Å2을 포함하는 연속적인 표면적을 형성한다.
도 38. SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합된 VHH3.89 및 VHH3.117의 Cryo-EM 재구성. 측면(왼쪽) 및 상단(중간) 보기로 표시된, VHH3.117(상단, 3Å 분해능) 또는 VHH3.89(하단, 3.1Å 분해능)와 복합체를 이루는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(SC2)의 전자 전위 맵(electron potential map). 오른쪽에 표시된 것은 RBD1-3 및 NTD1-3으로 라벨링된 3개의 SC2 프로토머들의 수용체 결합 도메인 및 N-말단 도메인과 함께 표면 표현으로 표시된 SC2 - VHH 복합체의 미세조정된(refined) cryo-EM 구조이다. SC2 - VHH3.117 복합체에서 각 프로토머들의 RBD 도메인은 입체형태적으로 유사한 상향 위치로 존재하며, 각각 단일 VHH3.117에 의해 결합되어 있다. SC2 - VHH3.89 복합체에서 세 개의 RBD 도메인들은 모두 상향 위치로 존재하지만 SC2 코어에 대해 다른 각도로 존재한다. 2개의 VHH3.89 복제물이 결합되어 있는데, 하나는 SC2 프로토머 1의 RBD(RBD-1로 라벨링됨)에, 다른 하나는 SC2 프로토머 2의 RBD(RBD-2)에 결합되어 있다. RBD-3은 cryo-EM 맵에서 좋지 않게 정의되며, 이는 입체형태적 유연성이 크다는 것을 나타낸다. 이 실험에 기초하여, VHH3.117 및 VHH3.89는 잔기 R355, N394, Y396, Y464, S514 및 E516을 포함하고, apo SC2 단백질의 RBD 하향 입체형태에서 차폐되는 대체로 일반적인 에피토프에 결합하도록 제안된다.
도 39. VHH3.89 및 VHH3.117은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에서 크게 겹치는 에피토프를 표적으로 한다. 용매 접근가능 표면으로 표시되고, VHH3.89 및 VHH3.117 에피토프에 대한 정면도로 나타낸 SARS-CoV-2 RBD(잔기 330 - 530)의 구조. SC2 RBD 표면에서, 심층 돌연변이 스캐닝(도 36)에 의해 VHH3.89 및/또는 VHH3.117 결합에 대한 탈출 돌연변이로 식별된 잔기들은 스틱 표현으로 표시되고, 라벨링되며, 진한 회색으로 강조 표시되어 있고; VHH3.89 및 VHH3.117 계열 구성원 결합제의 결합을 위한 최소 공통 코어(또는 '에피토프 코어'; 잔기 R355, N394, Y396, Y464, S514 및 E516 포함)를 형성하는 것으로 cryo-EM 실험에 의해 여기에서 제안된 잔기들은 스틱 표현으로 표시되며, 검은색으로 표시되고, 라벨링되며, 네모 박스로 강조 표시되어 있다. 에피토프 코어는 대략 300Å2을 포함하는 연속적인 표면적을 형성한다. SC2 RBD의 에피토프 코어에 VHH3.89가 결합하면 -2.3kcal/mol의 계산된 깁스 자유 에너지로 대략 290Å2 표면이 묻히게 된다(PDBePISA에 의해 결정됨).
도 40. VHH3.117 및 VHH3.89-Fc는 스파이크 S1 서브유닛의 조기 쉐딩(shedding)을 유도한다. (A) VHH72-Fc 및 VHH3.117은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하는 세포에서 S1 쉐딩을 유도한다. (B) VHH3.89-Fc는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하는 세포에서 S1 쉐딩을 유도한다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하는 Raji 세포(Raji 스파이크) 또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하지 않는 Raji 세포(Raji)의 성장 배지 및 세포 용해물을 표시된 VHH 작제물들 또는 항체들과 함께 30분 동안 인큐베이션한 후의 항-S1 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 블롯 오른쪽에 있는 아래쪽과 위쪽의 삼각형은 각각 스파이크 단백질 및 세포의 절단되지 않은 스파이크 단백질의 푸린 매개된 절단 후에 생성된 S1 스파이크 서브유닛을 나타낸다.
본 발명은 특정 구현예에 관하여 그리고 특정 도면을 참조하여 설명될 것이나, 본 발명은 이에 제한되지 않고 청구범위에 의해서만 제한된다. 청구범위에 있는 임의의 참조 기호는 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 물론, 반드시 모든 측면들 또는 이점들이 본 발명의 임의의 특정 구현예에 따라 달성될 수 있는 것은 아님을 이해해야 한다. 따라서, 예를 들어, 당업자는 본 발명이 본원에 교시되거나 제안될 수 있는 다른 측면들 또는 이점들을 반드시 달성할 필요 없이 본원에 교시된 하나의 이점 또는 이점들의 그룹을 달성하거나 최적화하는 방식으로 구현되거나 수행될 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명은 이의 특징들 및 이점들과 함께, 첨부된 도면과 함께 판독될 때 하기의 상세한 설명을 참조하여 가장 잘 이해될 수 있다. 본 발명의 측면들 및 이점들은 아래에 기재되어 있는 구현예(들)로부터 명백해질 것이며 이를 참조하여 설명될 것이다. 본 명세서 전반에 걸쳐 "일 구현예(one embodiment)" 또는 "구현예(an embodiment)"라는 말은 구현예와 관련하여 설명된 상세한 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 구현예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 여러 위치에서 "일 구현예에서" 또는 "구현예에서"라는 문구가 나타나면 반드시 모두 동일한 구현예를 지칭하는 것은 아니지만, 동일한 구현예를 지칭할 수도 있다. 마찬가지로, 본 발명의 예시적인 구현예들의 설명에서, 본 발명의 여러 특징들은 때때로 본 개시내용을 간소화하고 하나 이상의 여러 발명적 측면들의 이해를 돕기 위해 이의 단일 구현예, 도면 또는 설명으로 함께 그룹화된다는 것을 이해해야 한다. 그러나, 이러한 개시 방법은 청구된 발명이 각 청구범위에 명시적으로 언급된 것보다 더 많은 특징들을 필요로 한다는 의도를 반영하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
정의
"a" 또는 "an", "the"와 같이 단수 명사를 언급할 때 부정관사 또는 정관사가 사용되는 경우, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 해당 명사의 복수형도 포함된다. "포함하는"이라는 용어가 본 설명 및 청구범위에서 사용되는 경우, 이는 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않는다. 또한, 설명 및 청구범위에서 제1, 제2, 제3 등의 용어는 유사한 요소들을 구별하기 위해 사용되며, 반드시 순차적 또는 시간적 순서를 설명하려는 것은 아니다. 사용되는 용어들은 적절한 상황에서 상호교환 가능하며, 본원에 기재된 본 발명의 구현예는 본원에 기재되거나 예시된 것과 다른 순서로 작동할 수 있음을 이해해야 한다. 하기 용어 또는 정의는 본 발명의 이해를 돕기 위해서만 제공된다. 본원에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가에게 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 실무자는 특히 해당 분야의 정의 및 용어에 대해 문헌(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2012); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 114), John Wiley & Sons, New York (2016))을 참조한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업계(예를 들어, 분자 생물학, 생화학, 구조 생물학 및/또는 컴퓨터 생물학 분야)의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 '뉴클레오티드 서열', "DNA 서열" 또는 "핵산 분자(들)"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드와 같은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 이 용어는 분자의 기본 구조만을 나타낸다. 따라서, 이 용어에는 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 및 RNA가 포함된다. 또한, 여기에는 알려진 유형의 변형, 예를 들어, 메틸화, 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 "캡스(caps)" 치환이 포함된다. "핵산 작제물"은 자연에서 함께 발견되지 않는 하나 이상의 기능적 단위를 포함하도록 작제된 핵산 서열을 의미한다. 예시로는 원형, 선형, 이중 가닥, 염색체외 DNA 분자(플라스미드), 코스미드(람다 파지로부터의 COS 서열을 포함하는 플라스미드), 비천연 핵산 서열을 포함하는 바이러스 게놈 등이 포함된다. "코딩 서열"은 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓일 때 mRNA로 전사되고/되거나 폴리펩티드로 번역되는 뉴클레오티드 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5'-말단에 있는 번역 시작 코돈과 3'-말단에 있는 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 mRNA, cDNA, 재조합 뉴클레오티드 서열 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않으며, 인트론은 특정 상황에서도 존재할 수 있다. "키메라 유전자" 또는 "키메라 작제물" 또는 "키메라 유전자 작제물"은 프로모터 또는 조절 핵산 서열이 mRNA를 코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되거나 이와 결합되어, 조절 핵산 서열이 결합된 핵산 코딩 서열의 전사 또는 발현을 조절할 수 있도록 하는 재조합 핵산 서열을 의미한다. 키메라 유전자의 조절 핵산 서열은 자연에서 발견되는 바와 같이 결합된 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되어 있지 않다. "발현 카세트"는 발현 카세트의 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 유전자/코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 포함한다. 발현 카세트는 일반적으로, 바람직하게는 (전사 방향으로 5'에서 3'로) 전사 개시 영역과 작동 가능하게 연결된 프로모터 영역, 폴리뉴클레오티드 서열, 이의 상동체(homologue), 변이체 또는 단편, 및 RNA 중합효소에 대한 종결 신호 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 종결 서열을 포함하는 DNA 작제물이다. 이들 영역 모두는 형질전환될 원핵 세포 또는 진핵 세포와 같은 생물학적 세포에서 작동할 수 있어야 하는 것으로 이해된다. 바람직하게는 RNA 폴리머라제 결합 부위를 포함하는 전사 개시 영역을 포함하는 프로모터 영역, 및 폴리아데닐화 신호는 형질전환될 생물학적 세포에 본래 존재하는 것일 수 있거나 대체 공급원으로부터 유래될 수 있으며, 이때 상기 영역은 생물학적 세포에서 기능적이다. 이러한 카세트는 "벡터"로 작제될 수 있다.
용어 "단백질", "폴리펩티드", 및 "펩티드"는 본원에서 아미노산 잔기의 중합체 및 이의 변이체 및 합성 유사체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. "펩티드"는 또한, 예를 들어 트립신 소화(tryptic digestion) 후 원래의 단백질에서 유래된 부분 아미노산 서열로 언급될 수 있다. 따라서, 이러한 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 합성되는 비자연 발생 아미노산인 아미노산 중합체, 예컨대 상응하는 자연 발생 아미노산의 화학적 유사체, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. 이 용어는 또한 글리코실화, 인산화 및 아세틸화와 같은 폴리펩티드의 번역후 변형을 포함한다. 아미노산 서열 및 변형에 기초하여, 폴리펩티드의 원자 또는 분자 질량 또는 중량은 (킬로)달톤(kDa)으로 표현된다. "단백질 도메인"은 단백질의 별개의 기능 및/또는 구조 단위이다. 일반적으로 단백질 도메인은 특정 기능이나 상호작용을 담당하여 단백질의 전반적인 역할에 기여한다. 도메인은 기능이 다른 단백질에서 유사한 도메인을 찾을 수 있는, 다양한 생물학적 상황에 존재할 수 있다.
"단리된" 또는 "정제된"은 네이티브 상태에서 일반적으로 수반되는 구성요소들이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 의미한다. 예를 들어, "단리된 폴리펩티드" 또는 "정제된 폴리펩티드"는 자연 발생 상태에서 측면에 있는 분자로부터 정제된 폴리펩티드, 예를 들어, 상기 폴리펩티드에 인접한, 생산 숙주와 같은 샘플 또는 혼합물에 존재하는 분자로부터 제거된 본원에서 식별되고 개시된 항체 또는 나노바디를 지칭한다. 단리된 단백질 또는 펩티드는 아미노산의 화학적 합성에 의해 생성될 수 있거나 재조합 생산에 의해 또는 복합 샘플로부터의 정제에 의해 생성될 수 있다. "단리된 핵산"은 자연 발생 상태에서 옆에 있는 분자들, 또는 혼합물 또는 복합 샘플에 존재하는 분자들로부터 정제된 핵산 분자를 지칭한다.
본원에서 "에 연결된(connected to)", "에 접합된(conjugated to)", "에 결찰된(ligated to)"과 상호교환적으로 사용되는, 본원에서 사용된 용어 "에 융합된(fused to)"은 특히, 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의한 "유전적 융합", 뿐만 아니라 안정적인 공유 결합을 초래하는 "화학적 및/또는 효소적 접합"을 지칭한다. "에 삽입된(inserted in)"이라는 용어에도 동일하게 적용되며, 이때 하나의 핵산 또는 단백질 서열 부분은 두 서열들을 유전적으로, 효소적으로 또는 화학적으로 융합함으로써 다른 서열에 삽입될 수 있다.
단백질의 "상동체", "상동체들"은 해당 변형되지 않은 단백질과 비교하여 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 이것이 유래된 변형되지 않은 단백질과 유사한 생물학적 및 기능적 활성을 갖는 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질 및 효소를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "아미노산 동일성"은 서열이 비교 윈도우(window of comparison)에 걸쳐 아미노산 대 아미노산 기준으로 동일한 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성 백분율"은 비교 윈도우에 걸쳐 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 두 서열에서 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met, 또한 본원에서 한 글자 코드로 표시됨)가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 산출하고, 일치하는 위치의 수를 비교 윈도우 내의 총 위치 수(즉, 윈도우 크기(window size))로 나눈 후 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 계산된다. 본원에 사용된 "치환", "돌연변이", 또는 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드가, 모 단백질 또는 이의 단편의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 비교하여 각각 상이한 아미노산 또는 뉴클레오티드로 대체된 결과이다. 단백질 또는 이의 단편은 단백질의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있는 것으로 이해된다.
"야생형"이라는 용어는 자연 발생 공급원으로부터 단리된 유전자 또는 유전자 산물을 지칭한다. 야생형 유전자는 개체군에서 가장 빈번하게 관찰되는 것으로, 따라서 유전자의 "정상" 또는 "야생형" 형태를 임의로 설계한 것이다. 이에 반해, 용어 "변형된", "돌연변이체", "조작된" 또는 "변이체"는 야생형 유전자 또는 유전자 산물과 비교할 때 서열 변형, 번역 후 변형 및/또는 기능적 특성 변경(즉, 변경된 특성)을 나타내는 유전자 또는 유전자 산물을 지칭한다. 자연 발생 돌연변이가 단리될 수 있으며; 이는 야생형 유전자 또는 유전자 산물과 비교할 때 변경된 특성을 갖는다는 사실에 의해 식별된다는 점에 유의한다.
"결합 포켓" 또는 "결합 부위"라는 용어는, 이의 모양과 전하로 인해, 다른 화학적 실체(chemical entity), 또는 결합 도메인, 예컨대 화합물, 단백질, 펩티드, 항체 또는 Nb 등과 유리하게 결합하는 분자 또는 분자 복합체의 영역을 지칭한다. 항체-관련 분자의 경우, 용어 "에피토프" 또는 "입체형태적 에피토프"는 또한 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "포켓"이라는 용어는 틈새(cleft), 채널 또는 부위를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 코로나 바이러스의 RBD 도메인은 나노바디 결합 부위를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 결합 포켓 또는 결합 부위를 포함한다. 용어 "결합 포켓/부위의 일부"는 결합 포켓, 결합 부위 또는 에피토프를 정의하는 모든 아미노산 잔기보다 적은 잔기를 지칭한다. 예를 들어, 결합 포켓의 일부를 구성하는 잔기의 원자 좌표는 결합 포켓의 화학적 환경을 정의하는 데 특이적일 수 있거나, 이러한 잔기와 상호작용할 수 있는 억제제의 단편을 설계하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 잔기의 일부는 리간드 결합에 역할을 하는 주요 잔기일 수 있거나, 공간적으로 관련되어 결합 포켓의 3차원 구획을 정의하는 잔기일 수 있다. 상기 잔기는 1차 서열에서 연속적이거나 비연속적일 수 있다.
"결합"은 직접적이든 간접적이든 모든 상호작용을 의미한다. 직접적인 상호작용은 결합 파트너들 간의 접촉을 의미한다. 간접적인 상호작용은 두 개 이상의 분자들의 복합체에서 상호작용 파트너들이 상호작용하는 모든 상호작용을 의미한다. 상호작용은 하나 이상의 가교 분자의 도움으로 완전히 간접적이거나, 또는 파트너들 사이에 여전히 직접적인 접촉이 있어 하나 이상의 분자의 추가 상호작용에 의해 안정화되는 부분적으로 간접적일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "특이적으로 결합하다(specifically binds)"는 특정 표적을 인식하지만, 샘플 내의 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 결합 도메인을 의미한다. 특이적 결합은 배타적 결합을 의미하지 않는다. 그러나, 특이적 결합은 단백질이 결합제들 중 하나 또는 몇 개에 대해 특정 증가된 친화도 또는 선호도를 갖는다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "친화도"는 일반적으로 리간드, 화학물질, 단백질 또는 펩티드가 다른 (표적) 단백질 또는 펩티드에 결합하여 단일 단백질 단량체들의 평형을 이들의 결합에 의해 형성된 복합체의 존재 쪽으로 이동시키는 정도를 의미한다. 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 "결합제(binding agent)" 또는 "제제(agent)"는 결합제 상에 위치한 결합 영역 또는 결합 도메인을 통해 다른 분자에 결합할 수 있는 분자에 관한 것으로, 상기 결합은 바람직하게는 특이적 결합, 정의된 결합 부위, 포켓 또는 에피토프를 인식이다. 결합제는 임의의 성질 또는 유형의 것일 수 있으며, 이의 기원에는 의존하지 않는다. 결합제는 화학적으로 합성되거나, 자연적으로 발생하거나, 재조합으로 생성(및 정제)될 수 있을 뿐만 아니라 설계되고 합성적으로 생성될 수 있다. 따라서, 상기 결합제는 소분자, 화학물질, 펩티드, 폴리펩티드, 항체 또는 이들의 임의의 유도체, 예컨대 펩티드모방체, 항체 모방체, 활성 단편, 화학적 유도체 등일 수 있다.
본원에 기재된 코로나 바이러스의 RBD 도메인은 나노바디 결합 부위를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 결합 포켓 또는 결합 부위를 포함한다. "결합 포켓/부위의 일부" 또는 "부분적으로 겹쳐진 에피토프"라는 용어는 결합 포켓, 결합 부위 또는 에피토프를 정의하는 모든 아미노산 잔기들보다 적은 잔기를 의미한다. 예를 들어, 결합 포켓의 일부를 구성하는 잔기의 원자 좌표는 결합 포켓의 화학적 환경을 정의하는 데 특이적일 수 있거나, 이러한 잔기와 상호작용할 수 있는 억제제의 단편을 설계하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 잔기의 일부는 수용체 결합에 역할을 하는 주요 잔기일 수 있거나, 공간적으로 관련되어 결합 포켓의 3차원 구획을 정의하거나 입체형태적 기능을 부여하는 잔기일 수 있다. 본원에 사용된 "에피토프"는 코로나 바이러스 RBD 도메인, 보다 구체적으로는 사베코바이러스 RBD 도메인, 보다 더 구체적으로는 2019-nCoV RBD 도메인과 같은 표적 분자 상의 결합 부위 또는 결합 포켓을 구성하는 폴리펩티드의 항원 결정인자(antigenic determinant)를 지칭한다. RBD 도메인 상의 상기 에피토프는 결합제와 결합하는 데 필수적인 적어도 하나의 아미노산을 포함할 수 있지만, 바람직하게는 에피토프에 고유한 공간적 입체형태에서 적어도 3개의 아미노산을 포함한다. 일반적으로, 에피토프는 적어도 4, 5, 6, 7개의 이러한 아미노산으로 이루어지며, 보다 일반적으로는, 적어도 8, 9, 10개의 이러한 아미노산으로 이루어진다. 아미노산의 공간적 입체형태를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, X선 결정학 및 다차원 핵 자기 공명, cryo-EM, 또는 기타 구조 분석을 포함한다. 본원에서 사용된 "입체형태적 에피토프"는 폴리펩티드의 접힌 3차원 입체형태에 고유한 공간적 입체형태에서 아미노산들을 포함하는 에피토프를 의미한다. 일반적으로, 입체형태적 에피토프는 선형 서열에서는 연속적이지 않지만 단백질의 접힌 구조에서는 함께 모이는 아미노산들로 이루어진다. 그러나, 입체형태적 에피토프는 또한 폴리펩티드의 접힌 3차원 입체형태에 고유한(그리고 변성된 상태로 존재하지 않는) 입체형태를 채택하는 아미노산의 선형 서열로 이루어질 수 있다. 단백질 복합체에서, 입체형태적 에피토프는 서로 다른 접힌 폴리펩티드들이 접히고 고유한 4차 구조로 결합할 때 함께 모이는 하나 이상의 폴리펩티드의 선형 서열에서 연속적이지 않은 아미노산들로 이루어진다. 유사하게, 입체형태적 에피토프는 여기서 또한, 함께 모여 4차 구조에 고유한 입체형태를 채택하는 하나 이상의 폴리펩티드의 아미노산의 선형 서열로 이루어질 수 있다. 단백질의 "입체형태" 또는 "입체형태적 상태"라는 용어는 일반적으로 단백질이 임의의 순간에 채택할 수 있는 구조의 범위를 의미한다. 당업자는 입체형태 또는 입체형태적 상태의 결정인자가 단백질의 아미노산 서열(변형된 아미노산 포함) 및 단백질을 둘러싼 환경에 반영된 단백질의 1차 구조를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 단백질의 입체형태 또는 입체형태적 상태는 또한 단백질 2차 구조(예를 들어, α-나선, β-시트 등), 3차 구조(예를 들어, 폴리펩티드 사슬의 3차원 접힘), 및 4차 구조(예를 들어, 다른 단백질 서브유닛과 폴리펩티드 사슬의 상호작용)와 같은 구조적 특징과 관련이 있다. 리간드 결합, 인산화, 황산화, 글리코실화, 또는 소수성 기의 부착 등과 같은 폴리펩티드 사슬에 대한 번역 후 변형 및 기타 변형이 단백질의 입체형태에 영향을 미칠 수 있다. 또한, pH, 염 농도, 이온 강도, 및 주변 용액의 삼투압몰농도(osmolality)와 같은 환경 요인과 다른 단백질 및 보조 인자와의 상호작용 등이 단백질 입체형태에 영향을 미칠 수 있다. 단백질의 입체형태적 상태는 활성에 대한 기능적 검정 또는 다른 분자에 대한 결합에 의해 또는 X선 결정학, NMR, 또는 스핀 라벨링 등과 같은 물리적 방법에 의해 결정될 수 있다. 단백질 입체형태 및 입체형태적 상태에 대한 일반적인 논의는 문헌(참조: Cantor and Schimmel, Biophysical Chemistry, Part I: The Conformation of Biological. Macromolecules, W.H. Freeman and Company, 1980, and Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman and Company, 1993)을 참조한다.
"항체"라는 용어는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린(Ig) 분자 또는 면역글로불린(Ig) 도메인을 포함하는 분자를 의미한다. '항체'는 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 온전한 면역글로불린일 수 있으며, 온전한 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. "활성 항체 단편"이라는 용어는 그 자체로 항원 결정인자 또는 에피토프에 대해 높은 친화도를 갖고, 이러한 특이성을 설명하는 하나 이상의 CDR을 포함하는 임의의 항체 또는 항체 유사 구조물의 일부를 의미한다. 비제한적 예에는 면역글로불린 도메인, Fab, F(ab)'2, scFv, 중쇄-경쇄 이합체, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 나노바디(또는 VHH 항체), 도메인 항체, 및 단일 사슬 구조물, 예컨대 완전한 경쇄 또는 완전한 중쇄가 포함된다.
본원에 사용된 "항체 단편" 및 "활성 항체 단편" 또는 "기능적 변이체"라는 용어는 코로나 바이러스 스파이크 단백질, 보다 구체적으로는 SARS-CoV-2 바이러스 스파이크 단백질에 존재하는 RBD에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 도메인 또는 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 항체는 일반적으로 면역글로불린 분자들의 사합체이다. 용어 "면역글로불린(Ig) 도메인", 또는 보다 구체적으로는 "면역글로불린 가변 도메인"("IVD"로 약칭됨)은 당업계 및 본원 아래에서 "프레임워크 영역 1" 또는 "FR1"; "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2"; "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3"; 및 "프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로 각각 지칭되는 4개의 "프레임워크 영역들"로 본질적으로 이루어진 면역글로불린 도메인을 의미하며; 상기 프레임워크 영역들은 당업계 및 본원 아래에서 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"으로 각각 지칭되는 3개의 "상보성 결정 영역들" 또는 "CDR들"에 의해 중단된다. 따라서, 면역글로불린 가변 도메인의 일반적인 구조 또는 서열은 다음과 같이 표시될 수 있다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. 항원 결합 부위를 보유함으로써 항원에 대한 항체에 특이성을 부여하는 것은 면역글로불린 가변 도메인(들)(IVD)이다. 일반적으로, 기존의 면역글로불린에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)은 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 이 경우, VH 및 VL 모두의 상보성 결정 영역(CDR)은 항원 결합 부위에 기여할 것이며, 즉 총 6개의 CDR이 항원 결합 부위 형성에 관여할 것이다. 상기 정의에 비추어 볼 때, 각 항원의 에피토프에 공동으로 결합하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인과 같은 한 쌍의 (결합된) 면역글로불린 도메인들, 즉 면역글로불린 도메인들의 VH-VL 쌍에 의해 항원의 각 에피토프에 결합하는, 기존 4쇄 항체(예컨대 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자; 당업계에 알려짐) 또는 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 예컨대 이황화 결합 Fv 또는 scFv 단편, 또는 이러한 기존 4쇄 항체로부터 유래된 디아바디의 항원 결합 도메인(모두 당업계에 알려짐). 본원에서 사용된 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)은 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 형식에 따라 4개의 프레임워크 영역들(FR) 및 3개의 상보적 결정 영역들(CDR)을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 지칭한다. 본 발명의 "면역글로불린 도메인"은 "단일 가변 도메인"이라는 용어와 동등한 "면역글로불린 단일 가변 도메인"("ISVD"로 약칭됨)을 의미하며, 항원 결합 부위가 단일 면역글로불린 도메인에 존재하고, 단일 면역글로불린 도메인에 의해 형성되는 분자들을 나타낸다. 이는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 "기존" 면역글로불린 또는 이의 단편과 구별되게 하며, 이때 2개의 면역글로불린 도메인들, 특히 2개의 가변 도메인들이 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 결합 부위는 단일 VH/VHH 또는 VL 도메인에 의해 형성된다. 따라서, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 항원 결합 부위는 3개 이하의 CDR들에 의해 형성된다. 따라서, 단일 가변 도메인은, 단일 항원 결합 단위(즉, 단일 항원 결합 도메인이 기능적 항원 결합 단위를 형성하기 위해 다른 가변 도메인과 상호작용할 필요가 없도록 단일 가변 도메인으로 본질적으로 이루어진 기능적 항원 결합 단위)를 형성할 수 있는 한, 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, VL-서열) 또는 이의 적합한 단편; 또는 중쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, VH-서열 또는 VHH 서열) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, VH-서열)이고; 보다 구체적으로는, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 기존의 4쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열, 또는 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 서열일 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 (단일) 도메인 항체(또는 (단일) 도메인 항체로 사용하기에 적합한 아미노산 서열), "dAb" 또는 dAb(또는 dAb로 사용하기에 적합한 아미노산 서열) 또는 나노바디(본원에 정의되고, VHH를 포함하지만 이에 제한되지 않음); 다른 단일 가변 도메인, 또는 이들 중 어느 하나의 임의의 적합한 단편일 수 있다. 특히, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 나노바디(본원에 정의된 것과 같음) 또는 이의 적합한 단편일 수 있다. 참고: Nanobody®, Nanobodies® 및 Nanoclone®이 Ablynx N.V.(Sanofi Company)의 등록 상표이다. 나노바디의 일반적인 설명에 대해서는, 하기 추가 설명뿐만 아니라 예를 들어 WO2008/020079에 설명된 것과 같은 본원에 인용된 선행 기술을 참조한다. VHH, VHH 도메인, VHH 항체 단편, 및 VHH 항체로도 알려진 "VHH 도메인"은 원래 "중쇄 항체"(즉, "경쇄가 없는 항체"; Hamers-Casterman et al (1993) Nature 363: 446-448)의 항원 결합 면역글로불린(Ig)(가변) 도메인으로 설명되었다. "VHH 도메인"이라는 용어는 이러한 가변 도메인들을, 기존의 4쇄 항체들에 존재하는 중쇄 가변 도메인들(본원에서는 "VH 도메인들"로 지칭됨) 및 기존의 4쇄 항체들에 존재하는 경쇄 가변 도메인들(본원에서는 "VL 도메인들"로 지칭됨)과 구별하기 위해 선택되었다. VHH 및 나노바디에 대한 추가 설명은 Muyldermans의 리뷰 논문(Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001), 및 일반 배경 기술로 언급된 다음과 같은 특허 출원을 참조한다: the Vrije Universiteit Brussel의 WO 94/04678, WO 95/04079 및 WO 96/34103; Unilever의 WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 및 WO 02/48193; the Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)의 WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 및 WO 03/055527; Algonomics N.V. and Ablynx N.V.의 WO 03/050531; 캐나다 국립 연구소(the National Research Council of Canada)의 WO 01/90190; 항체 연구소(the Institute of Antibodies)의 WO 03/025020(= EP 1433793); 뿐만 아니라 Ablynx N.V.의 WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 및 WO 06/122825, 및 Ablynx NV에 의해 추가로 공개된 특허 출원. 이들 참고문헌에 기재된 바와 같이, 나노바디(특히 VHH 서열 및 부분적으로 인간화된 나노바디)는 특히 하나 이상의 프레임워크 서열에서 하나 이상의 "홀마크(Hallmark) 잔기"의 존재를 특징으로 할 수 있다. IVD의 아미노산 잔기를 넘버링하기 위해 다른 넘버링 방식이 적용될 수 있다. 예를 들어, 넘버링은 낙타과 유래 VHH 도메인에 적용된 것처럼, Honegger, A. 및 Plueckthun, A.(J.Mol.Biol. 309, 2001)에 의해 제공된 모든 중쇄(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)에 대한 AHo 넘버링 방식에 따라 수행될 수 있다. VHH 도메인에도 유사한 방식으로 적용될 수 있는, VH 도메인의 아미노산 잔기를 넘버링하기 위한 대안적인 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, FR 및 CDR 서열의 묘사는 논문(참조: Riechmann, L. and Muyldermans, S., 231(1-2), J Immunol Methods. 1999)에서 낙타과 유래 VHH 도메인에 적용된 바와 같은 Kabat 넘버링 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 각각의 CDR들에 있는 아미노산 잔기들의 총 수는 가변적일 수 있으며, Kabat 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기들의 총 수와 일치하지 않을 수 있다는 점에 유의해야 한다(즉, Kabat 넘버링에 따른 하나 이상의 위치가 실제 서열에서 점유되지 않을 수 있거나, 실제 서열은 Kabat 넘버링에 의해 허용되는 수보다 더 많은 아미노산 잔기들을 포함할 수 있음). 이는, 일반적으로, Kabat에 따른 넘버링이 실제 서열에서 아미노산 잔기들의 실제 넘버링과 일치할 수도 있고 일치하지 않을 수도 있음을 의미한다. VH 도메인 및 VHH 도메인에서 아미노산 잔기들의 총 수는 일반적으로 110 내지 120, 종종 112 내지 115의 범위 내에 있을 것이다. 그러나, 더 짧고 더 긴 서열도 본원에 기재된 목적에 적합할 수 있다는 점에 유의해야 한다. CDR 영역들의 결정은 MacCallum 등(MacCallum et al., J. Mol. Biol. (1996) 262, 732-745)에 기재된 바와 같은 접촉 분석(contact analysis) 및 결합 부위 지형(binding site topography)에 기초한 지정(designation)과 같이 다양한 방법들에 따라 수행될 수도 있다. 또는 대안적으로 CDR의 주석은 AbM(AbM은 http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html에 설명된 바와 같은 Oxford Molecular Ltd.의 항체 모델링 패키지임), Chothia(Chothia and Lesk, 1987; Mol Biol. 196:901-17), Martin(Abhinandan, and Martin. Molecular Immunology 45 (2008) 3832-3839; http://bioinf.org.uk/abs/info.html에 나타낸 바와 같음), Kabat(Kabat et al., 1991; 5th edition, NIH publication 91-3242), IMGT(LeFranc, 2014; Frontiers in Immunology. 5(22): 1-22), 및/또는 aHo, Gelfand, 및 Honegger를 포함한 대안적 주석(예를 들어, 검토는 Dondelinger et al. 2018, Front Immunol 9:2278 참조)에 따라 수행될 수 있다. 이러한 주석은 면역글로불린 단백질 서열의 아미노산 넘버링을 위해 존재하지만, 본 출원에서는 표시된 바와 같이 Kabat 넘버링 또는 특정 SEQ ID 넘버링만 사용된다. 상기 주석은 면역글로불린 도메인 함유 단백질의 CDR 및 프레임워크 영역(FR)의 묘사를 추가로 포함하며, 과도한 부담 없이 임의의 면역글로불린 단백질 서열에 이러한 주석을 적용할 수 있는 당업자에게 공지된 방법 및 시스템이다. 이러한 주석은 약간씩 다르지만, 각각은 표적 결합과 관련된 루프 영역을 포함하는 데 목적이 있다.
VHH 또는 Nb는 B 세포 성숙 동안 동일한 전구 세포(progenitor)에서 유래된 클론 관련 서열을 클러스터링하기 위해 종종 다른 서열 계열 또는 심지어 초계열(superfamily)로 분류된다(Deschaght et al. 2017. Front Immunol. 10; 8 :420). 이러한 분류는 종종 Nb의 CDR 서열을 기반으로 하며, 예를 들어 각 Nb 계열은 CDR3 영역의 서열 동일성 임계값을 갖는 (클론) 관련 서열의 클러스터로 정의된다. 따라서, 본원에 정의된 단일 VHH 계열 내에서, CDR3 서열은 아미노산 조성에서 동일하거나 매우 유사하며, 바람직하게는 CDR3 서열에서 적어도 80%의 동일성, 또는 적어도 85%의 동일성, 또는 적어도 90%의 동일성을 나타내어, 동일한 계열의 Nb들이 동일한 결합 부위에 결합하고 동일한 효과 또는 기능적 영향을 갖는다.
도메인 항체 및 Nanobody®(VHH 도메인 포함)와 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인은 인간화를 거칠 수 있으며, 즉 가장 가까운 인간 생식계열 서열과 서열 동일성 정도를 증가시킬 수 있다. 특히, 인간화 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 Nanobody®(VHH 도메인 포함)는, 인간화 치환(본원에서 추가로 정의됨)이고/이거나 인간화 치환에 상응하는 적어도 하나의 아미노산 잔기(특히, 적어도 하나의 프레임워크 잔기)가 존재하는 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있다. 잠재적으로 유용한 인간화 치환들은 자연 발생 VHH 서열의 프레임워크 영역들의 서열을 하나 이상의 밀접하게 관련된 인간 VH 서열의 상응하는 프레임워크 서열들과 비교함으로써 확인할 수 있으며, 그 후에 이렇게 결정된 하나 이상의 잠재적으로 유용한 인간화 치환들(또는 이들의 조합들)을 상기 VHH 서열 내로 도입할 수 있고(본원에 추가로 기재된 바와 같이 그 자체로 알려진 임의의 방식으로), 생성된 인간화 VHH 서열을 표적에 대한 친화성, 안정성, 발현 용이성과 수준, 및/또는 기타 원하는 특성들에 대해 테스트할 수 있다. 이러한 방식으로, 제한된 정도의 시행착오를 통해, 다른 적합한 인간화 치환들(또는 이들의 적합한 조합들)이 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 또한, 앞서 설명된 내용에 기초하여, Nanobody®(VHH 도메인 포함)와 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인(의 프레임워크 영역)은 부분적으로 인간화되거나 완전히 인간화될 수 있다.
인간화 면역글로불린 단일 가변 도메인, 특히 Nanobody®는 상응하는 자연 발생 VHH 도메인과 비교하여 감소된 면역원성과 같은 여러 이점을 가질 수 있다. 인간화는 인간 환자에게 투여시 면역원성이 경미하거나 존재하지 않도록 돌연변이된 것을 의미한다. 인간화 치환은 생성된 인간화 아미노산 서열 및/또는 VHH가 여전히 항원 결합 능력과 같은 VHH의 유리한 특성을 유지하도록 선택되어야 한다. 본원에 제공된 설명에 기초하여, 숙련가는 한편으로는 인간화 치환에 의해 제공되는 유리한 특성과 다른 한편으로는 자연 발생 VHH 도메인의 유리한 특성 간의 원하는 또는 적합한 균형을 최적화하거나 달성하는 인간화 치환 또는 인간화 치환의 적합한 조합을 선택할 수 있을 것이다. 이러한 방법은 숙련가에게 알려져 있다. 인간 공통(consensus) 서열이 인간화를 위한 표적 서열로 사용될 수 있지만, 다른 수단도 당업계에 공지되어 있다. 하나의 대안은 숙련가가, 예를 들어, 비제한적으로 IGHV3 대립유전자의 정렬과 같이, 다수의 인간 생식계열 대립유전자를 정렬하여 표적 서열에서 인간화에 적합한 잔기의 식별을 위해 상기 정렬을 사용하는 방법을 포함한다. 또한, 적합한 인간화 잔기를 식별하기 위한 출발점으로서 표적 서열에 가장 상동성인 인간 생식계열 대립유전자의 서브셋(subset)이 정렬될 수 있다. 대안적으로, VHH를 분석하여 인간 대립유전자에서 가장 가까운 상동체를 식별하고, 인간화 작제물 설계에 사용한다. 낙타과(Camelidae) VHH에 적용된 인간화 기술은 또한 단독으로 또는 조합하여 특정 아미노산의 대체를 포함하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 대체는 문헌, 알려진 인간화 노력, 및 천연 VHH 서열과 비교한 인간 공통 서열, 또는 관심 VHH 서열과 가장 유사한 인간 대립유전자로부터 공지된 것에 기초하여 선택될 수 있다. WO 08/020079의 표 A-5-A-8에 제공된 VHH 엔트로피 및 VHH 가변성에 대한 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 프레임워크 영역들에 있는 일부 아미노산 잔기들은 인간과 카멜리다에 사이에서 다른 것들보다 더 보존되어 있다. 일반적으로, 본 발명은 가장 넓은 의미에서 이에 제한되지는 않지만, 임의의 치환, 결실 또는 삽입은 덜 보존된 위치에서 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 일반적으로, 아미노산 결실 또는 삽입보다 아미노산 치환이 선호된다. 예를 들어, 인간과 유사한 부류의 낙타과 단일 도메인 항체는 인간 기원의 통상적인 항체 또는 다른 종에서 유래하는 통상적인 항체에서 전형적으로 발견되는 소수성 FR2 잔기를 함유하지만, 이중 사슬 항체의 VH에 존재하는 보존된 트립토판 잔기를 치환하는 103번 위치의 다른 치환에 의해 이러한 친수성 손실을 보상한다. 이와 같이, 이들 두 부류에 속하는 펩티드는 인간 VH 프레임워크 영역에 대해 높은 아미노산 서열 상동성을 나타내며, 상기 펩티드는 이로 인한 원치 않는 면역 반응이 예상되지 않고, 추가 인간화의 부담 없이 인간에게 직접 투여될 수 있다. 실제로, 일부 낙타과 VHH 서열은 인간 VH 프레임워크 영역에 대해 높은 서열 상동성을 나타내므로, 상기 VHH는 이로 인한 면역 반응이 예상되지 않고, 인간화에 대한 추가 부담 없이 환자에게 직접 투여될 수 있다.
인간화 동안 적합한 돌연변이, 특히 치환이 도입되어, 예를 들어 다음 위치들 중 적어도 하나에서 기존 항체(예를 들어 WO 2012/175741 및 WO2015/173325 참조)대한 결합이 감소된 폴리펩티드를 생성할 수 있다: 11, 13, 14, 15, 40, 41, 42, 82, 82a, 82b, 83, 84, 85, 87, 88, 89, 103, 또는 108. 본 발명의 아미노산 서열 및/또는 VHH는 임의의 프레임워크 잔기(들), 예컨대 하나 이상의 홀마크 잔기들(하기 정의된 것과 같음) 또는 하나 이상의 다른 프레임워크 잔기들(즉, 비-홀마크 잔기들) 또는 이들의 임의의 적합한 조합에서 적합하게 인간화될 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열, VHH 또는 폴리펩티드를 발현하는 데 사용되는 숙주 유기체에 따라, 이러한 결실 및/또는 치환은 또한 번역 후 변형을 위한 하나 이상의 부위(예컨대 하나 이상의 글리코실화 부위)가 제거되는 방식으로 설계될 수 있으며, 이는 당업자의 능력 내에 있을 것이다. 대안적으로, 치환 또는 삽입은 예를 들어 부위 특이적 페길화를 허용하기 위해 작용기(본원에 기재된 것과 같음)의 부착을 위한 하나 이상의 부위를 도입하도록 설계될 수 있다.
일부 경우에, 위치 37, 44, 45 및/또는 47에서 친수성 특성을 갖는 전형적인 낙타과 홀마크 잔기 중 적어도 하나가 대체된다(WO2008/020079 표 A-03 참조). 인간화의 또 다른 예로는 위치 1, 5, 11, 14, 16, 및/또는 28과 같은 FR 1; 위치 73, 74, 75, 76, 78, 79, 82b, 83, 84, 93 및/또는 94와 같은 FR3; 및 위치 10 103, 104, 108 및/또는 111과 같은 FR4에 있는 잔기의 치환이 포함된다(WO2008/020079 표 A-05 - A08 참조; 모든 넘버링은 Kabat에 따름). 인간화는 일반적으로 CDR이 아닌 FR의 치환에만 관련되는데, 이는 표적에 대한 결합 친화도 및/또는 효능에 영향을 미칠 수 있기/미칠 것이기 때문이다.
본원에 기재된 결합 부위 1 및 2에 대한 결합제를 포함하는 본 발명의 조성물 또는 결합제(들)는 "다가" 또는 "다중특이적" 형태로 나타날 수 있으므로 화학적으로 또는 재조합 DNA 기술에 의해 2개 이상의 동일하거나 다른 결합제들을 결합시켜 형성될 수 있다. 상기 다가 형태는 빌딩 블록을 직접 또는 링커를 통해 연결하거나 Fc 도메인 암호화 서열과 융합시킴으로써 형성될 수 있다. 다가 작제물의 비제한적인 예로는 "2가" 작제물, "3가" 작제물, "4가" 작제물 등이 포함된다. 이러한 2가 작제물 또는 동종이가(homobivalent) 작제물의 예시는 특히 ISVD 빌딩 블록들에 대해 첨부된 실시예 섹션에 더 설명되어 있다. 다가 작제물 내에 포함된 면역글로불린 단일 가변 도메인들은 동일하거나 상이할 수 있으며, 바람직하게는 동일하거나 중첩되는 결합 부위에 결합할 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 결합제(들)는 "다중특이적" 형태이고, 2개 이상의 빌딩 블록들 또는 제제들을 함께 결합시켜 형성되되, 상기 빌딩 블록 또는 제제 중 적어도 하나는 본원에 정의된 바와 같이 결합 부위 1에 결합하고, 적어도 하나는 본 명세서에 정의된 바와 같이 결합 부위 2에 결합하여, 둘 다 두 에피토프 모두에 특이적으로 결합할 수 있는 결합제 또는 조성물을 형성하고, 따라서 서로 다른 특이성을 갖는 결합제를 포함한다. 다중특이적 작제물의 비제한적 예로는 "이중특이적" 작제물, "삼중특이적" 작제물, "사중특이적" 작제물 등이 포함된다. 이를 더 설명하기 위해, 본 발명의 임의의 다가 또는 다중특이적(본원에 정의됨) ISVD는 코로나 바이러스 항원의 동일한 RBD 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 대해 적합하게 유도될 수 있거나, 또는 2개 이상의 다른 항원에 대해, 예를 들어 코로나 RBD에 대한 것과 하나는 반감기 연장부(half-life extension)로서 혈청 알부민 또는 포도상구균 단백질 A(SpA)에 대해 유도될 수 있다. 본 발명의 다가 또는 다중특이적 ISVD는 또한 원하는 코로나 RBD 상호작용을 위해 및/또는 이러한 다가 또는 다중특이적 면역글로불린 단일 가변 도메인들을 사용하여 얻을 수 있는 임의의 다른 원하는 특성 또는 원하는 특성들의 조합을 위해 결합력을 높이고/높이거나 선택성을 개선시킬 수 있다(또는 이를 위해 조작 및/또는 선별될 수 있다). 코로나 RBD와 결합할 때, 상기 다중특이적 결합제 또는 다가 ISVD는 SARS-코로나 또는 2019-신종 코로나 바이러스와 같은 코로나 바이러스의 결합 및 중화에 부가적 또는 상승적 영향을 미칠 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인들 중 어느 것을 1가, 다가 또는 다중특이적 형태로 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 따라서, 1가, 다가 또는 다중특이적 나노바디를 포함하는 폴리펩티드가 비제한적인 예시로서 본원에 포함된다. 다가 또는 다중특이적 결합제 또는 빌딩 블록은 다중특이적 제제에 의해 적어도 2개의 상이한 결합 부위들이 동시에 도달되거나 결합될 수 있도록 직접 융합되거나 적합한 링커에 의해 융합될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 적어도 하나의 ISVD는 C-말단 또는 N-말단에서 Fc 도메인, 예를 들어 Ig의 Fc-테일에 융합되어 2가 형식의 코로나 바이러스 스파이크 단백질 결합제를 생성할 수 있으며, 상기 VHH-Ig Fc(또는 VHH-Fc) 중 2개, 또는 이의 인간화 형태는 Fc 부분의 힌지 영역에서 이황화 가교를 통해 중쇄 단독-항체 유형 분자를 형성한다. IgG 인간화 형태와 같은 인간화된 형태는 IgG 서열 내의 다른 치환들 중에서도, 라이신의 C-말단 결실, 힌지 영역에서의 변경 또는 절단, 기재된 바와 같은 LALA(L234A 및 L235A) 또는 LALAPG(L234A, L235A, 및 P329G) 돌연변이와 같은 당업계에 공지된 IgG 인간화 변이체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 대안적인 설정에서, Fc 융합체는 링커에 의해 융합된 이러한 2가 또는 이중특이적 결합제의 C-말단을 Fc 도메인에 연결함으로써 설계되며, 이후 숙주에서 발현 시 Fc 부분의 힌지 영역에 있는 이황화 가교를 통해 다가 또는 다중특이적 항체 유형 분자를 형성한다.
본원에서 사용된 "치료 활성제(therapeutically active agent)" 또는 "치료 활성 조성물"은 질병 치료(본원에 추가로 기재된 것과 같음)와 관련하여 치료 효과(즉, 치유 또는 예방 효과)를 갖거나 가질 수 있는 임의의 분자 또는 분자들의 조성물을 의미한다. 바람직하게는, 치료 활성제는 세포독성제, 예컨대 독소, 또는 세포독성 약물, 또는 전구약물을 세포독성 약물로 전환할 수 있는 효소, 또는 방사성 핵종, 또는 세포독성 세포일 수 있거나, 비세포독성제일 수 있는 질병 조절제(disease-modifying agent)이다. 보다 더 바람직하게는, 치료 활성제는 질병에 대한 치유 효과를 가지고 있다. 본 발명의 결합제, 조성물 또는 약제학적 조성물은, 코로나 바이러스 감염, 보다 구체적으로는 SARS 코로나 바이러스와 같은 사베코바이러스 감염에 감염된 환자, 또는 SARS-CoV-2 감염 또는 이의 임의의 돌연변이 변이체, 또는 더 구체적으로 COVID-19로 고통받는 환자를 치료하는 데 유익한 경우 치료 활성제로서 작용할 수 있다. 치료 활성제/결합제 또는 조성물은 본원에 정의된 VHH72-에피토프에 특이적으로 결합하는 ISVD, 및 본원에 정의된 VHH3.117-에피토프에 특이적으로 결합하는 ISVD를 포함하는 제제, 바람직하게는 RBD 상의 두 에피토프의 동일한 결합 영역에 결합하는 개선된 변이체, 보다 바람직하게는 이의 인간화된 변이체를 포함할 수 있으며, 대상체에게 투여될 때 유리한 추가 작용기를 함유하거나 이에 커플링될 수 있다. 이러한 작용기들 및 이들을 도입하기 위한 기술들의 예시는 숙련가에게 명백할 것이며, 일반적으로 당업계에 언급된 모든 작용기들 및 기술들뿐만 아니라 의약용 단백질(pharmaceutical protein)의 변형, 특히 항체들 또는 항체 단편들의 변형을 위해 그 자체로 알려진 작용기들 및 기술들을 포함할 수 있으며, 이에 대해서는, 예를 들어 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980))을 참조한다. 이러한 작용기는 예를 들어 ISVD 또는 활성 항체 단편에 직접(예를 들어 공유적으로) 연결되거나, 또는 선택적으로 적합한 링커 또는 스페이서를 통해 연결될 수 있으며, 이는 숙련가에게 다시 한 번 명백할 것이다. 의약용 단백질의 반감기를 증가시키고/시키거나 면역원성을 감소시키기 위해 가장 널리 사용되는 기술들 중 하나는 적합한 약리학적으로 허용되는 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 또는 이의 유도체(예컨대 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 mPEG)의 부착을 포함한다. 예를 들어, 이러한 목적을 위해, PEG가 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 자연적으로 발생하는 시스테인 잔기에 부착될 수 있거나, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 변형하여 PEG 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기가 적합하게 도입될 수 있거나, 또는 PEG 부착을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 서열이 본 발명의 ISVD 또는 활성 항체 단편의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합될 수 있으며, 모두 숙련가에게 그 자체로 알려진 단백질 공학 기술을 사용한다. 일반적으로 덜 선호되는 또 다른 변형은, 항체 또는 활성 항체 단편을 발현하는 데 사용되는 숙주 세포에 따라, 일반적으로 번역 동시(co-translational) 및/또는 번역 후 변형의 일부로서 N-연결 또는 O-연결 글리코실화를 포함한다. 결합 도메인의 반감기를 증가시키기 위한 또 다른 기술은 이작용성(bifunctional) 또는 이중특이적 도메인들(예를 들어, 하나는 코로나 바이러스의 표적 RBD에 대한 ISVD 또는 활성 항체 단편이고, 다른 하나는 알부민 또는 표면활성 단백질 A(Surfactant Protein A: SpA) - 이는 반감기를 연장하는 데 도움이 되는 폐에 풍부하게 존재하는 표면 단백질임 - 와 같은 혈청 단백질에 대한 것임) 또는 항체 단편들, 특히 면역글로불린 단일 가변 도메인들과 펩티드들(예를 들어, 알부민과 같은 혈청 단백질에 대한 펩티드)의 융합체로의 조작을 포함할 수 있다. 또 다른 예시에서, 본 발명의 (변이체) ISVD, 이중특이적 ISVD, 또는 다중특이적 ISVD는 면역글로불린 Fc 도메인, 예컨대 IgA Fc 도메인, 또는 예를 들어 IgG1, IgG2 또는 IgG4 Fc 도메인과 같은 IgG Fc 도메인에 융합될 수 있다. 예시들은 상세한 설명에 더 설명되어 있으며 실험 섹션에서 보여주고 서열 목록에도 표시되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "결정하는(determining)", "측정하는(measuring)", "평가하는(assessing)", "식별하는(identifying)", "스크리닝하는(screening)" 및 "검정하는(assaying)"은 상호교환적으로 사용되며, 정량적 및 정성적 결정을 모두 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "유사한(similar)"은 유사한(alike), 유사한(analogous), 비슷한(comparable), 상응하는(corresponding), 및 같은(-like) 또는 유사하게(alike)와 상호교환 가능하며, 동일하거나 공통된 특성을 갖고/가지며 비슷한 결과, 즉 편차가 최대 20%, 10%, 보다 바람직하게는 5%, 또는 훨씬 더 바람직하게는 1% 이하인 결과를 나타내도록 정량화 가능한 방식으로 유사함을 의미한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "대상체", "개인" 또는 "환자"는 진단, 치료 또는 예방이 필요한 모든 유기체, 예컨대 척추동물, 특히 인간 및 다른 포유동물을 둘 다 포함하는 모든 포유동물, 예를 들어, 설치류, 토끼, 소, 양, 말, 개, 고양이, 라마, 돼지, 또는 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이)와 같은 동물에 관한 것이다. 상기 설치류는 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 또는 친칠라(chinchilla)일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 대상체는 인간, 래트 또는 비인간 영장류이다. 바람직하게, 상기 대상체는 인간이다. 일 구현예에서, 대상체는 질병 또는 질환, 특히 본원에서 "환자"로도 지칭되는 본원에 개시된 질병 또는 질환을 앓거나 앓는 것으로 의심되는 대상체이다. 그러나, 앞서 언급된 용어들은 증상들이 존재함을 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다.
"치료" 또는 "치료하는" 또는 "치료하다"라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 징후, 증상, 질환, 상태의 진행 또는 중증도를 늦추거나, 중단시키거나, 정지시키거나, 제어하거나, 중지시키거나, 감소시키거나 또는 되돌리지만, 모든 질병 관련 징후, 증상, 상태 또는 질환의 완전한 제거를 반드시 수반하지는 않는 치료적 개입으로 정의된다. 따라서, 치료적 치료는 병(illness)을 예방하기보다는 병을 치료하거나 개인의 건강을 개선하도록 설계된다. 치료는 또한 질병의 발생을 예방하기 위해 설계 및 사용되는 약물 또는 치료와 관련된 예방적 치료를 의미할 수도 있다.
"조성물"은 하나 이상의 활성 분자의 조합에 관한 것으로, 당업자가 최적의 성능을 얻기 위한 적합성을 알고 있고 있는 완충 용액 및/또는 용질 예컨대 pH 완충 물질, 물, 식염수, 생리학적 염 용액, 글리세롤, 방부제 등을 더 포함할 수 있다. 본원에 사용된 적합한 조건은 또한, 예를 들어 Nb들이 RBD에 결합하는 것을 목표로 하는 경우 적합한 결합 조건을 의미할 수 있다.
본원에 제공된 바와 같은 하나 이상의 결합제 또는 핵산 분자, 또는 재조합 벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 선택적으로 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. "담체" 또는 "보조제(adjuvant)", 특히 "약제학적으로 허용되는 담체" 또는 "약제학적으로 허용되는 보조제"는 그 자체로는 조성물을 투여받는 개인에게 해로운 항체의 생산을 유도하지 않으며 보호를 유도하지도 않는 임의의 적합한 부형제, 희석제, 담체 및/또는 보조제이다. "약제학적으로 허용되는"은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 물질이 아닌 물질을 의미하며, 즉 상기 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 일으키지 않거나 그것이 함유된 약제학적 조성물의 임의의 다른 구성요소와 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 화합물과 함께 개인에게 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 바람직하게는 담체에서 기인할 수 있는 임의의 부작용이 활성 성분의 유익한 효과를 손상시키지 않도록 활성 성분의 유효 활성과 일치하는 농도에서 비교적 무독성이고 환자에게 무해한 담체이다. 바람직하게는, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 보조제는 항원에 의해 유발되는 면역 반응을 향상시킨다. 적합한 담체 또는 보조제는 일반적으로 하기의 완전하지 않은 목록에 포함된 하나 이상의 화합물을 포함한다: 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 고분자 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자와 같은 천천히 대사되는 큰 거대분자. 본원에 사용된 용어 "부형제"는 약제학적 조성물에 존재할 수 있고 활성 성분이 아닌 모든 물질, 예를 들어 염, 결합제(예를 들어, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스, 소르비톨, 만니톨), 윤활제, 증점제, 표면 활성제, 보존제, 유화제, 완충 물질, 안정화제, 향미제 또는 착색제를 포함하는 것으로 의도된다. "희석제", 특히 "약제학적으로 허용되는 비히클"은 물, 식염수, 생리학적 염 용액, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 비히클을 포함한다. 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질, 보존제와 같은 보조 물질이 이러한 비히클에 포함될 수 있다. 약제학적 유효량의 본 발명의 폴리펩티드 또는 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체는 바람직하게는 치료되는 특정 상태에 대해 결과를 가져오거나 영향을 미치는 양이다. 치료를 위해, 본 발명의 약제학적 조성물은 표준 기술에 따라 임의의 환자에게 투여될 수 있다. 투여는 경구, 비경구, 국소, 비강, 안과, 척추강내, 뇌실내, 설하, 직장, 질 등을 포함하는 임의의 적절한 방식에 의해 이루어질 수 있다. 나노기술 및 에어로졸 및 흡입제로서의 또 다른 제형화 기술도 본 발명의 범위 내에 있다. 투여량 및 투여 빈도는 환자의 연령, 성별 및 상태, 다른 약물의 동시 투여, 금기증(counter-indication) 및 임상의가 고려해야 할 기타 파라미터에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 저장을 위해 동결건조되고 사용 전에 적합한 담체에서 재구성될 수 있다. 동결건조 또는 액체로 제조되는 경우, 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 안정화제를 본 발명의 약제학적 조성물에 첨가해야 한다(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, Ed. Allen, Loyd V, Jr. (2012). 버퍼 예를 들어 인산염, 시트르산염, 및 기타 유기산; 항산화제 예를 들어 비타민 C, 작은 폴리펩티드, 단백질 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 고분자, 예를 들어 PVP, 아미노산 예를 들어 아미노 아세테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 아르기닌, 라이신; 글리코스(glycose), 이당류, 및 기타 탄수화물 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린, 킬레이트제, 예를 들어 EDTA, 당 알코올 예를 들어 만니톨, 소르비톨; Na+와 같은 반대이온, 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 PEG 등과 같은 계면활성제를 포함하는, 담체, 부형제 및 안정제의 투여량 및 농도는 대상체(인간, 마우스 및 기타 포유동물)에게 안전해야 한다. 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 제제는 주사 전에 멸균되어야 한다. 이 절차는 동결건조 및 재구성 전과 후에 멸균 여과막을 사용하여 수행될 수 있다. 약제학적 조성물은 일반적으로 코르크가 있는 i.v. 용액 병과 같은 멸균된 접근 포트가 있는 용기에 채워진다.
상세한 설명
본 발명은 SARS-CoV-1 코로나 바이러스 및 SARS-Cov-2 코로나 바이러스와 같은 사베코바이러스의 스파이크 단백질의 일부인 수용체 결합 도메인(RBD) 상의 적어도 2개의 서로 다른 비경쟁 에피토프들과 특이적으로 상호작용하는 결합 영역 또는 결합 도메인, 특히 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 조성물 또는 결합제에 관한 것이다. 상기 결합제(들) 또는 조성물의 결합 도메인(들), 특히 ISVD들과 스파이크 단백질 사이의 상호작용은 사베코바이러스의 감염 능력을 중화시키고, 여기서 상기 조성물의 하나 이상의 결합제에서 상기 적어도 2개의 비경쟁 결합 영역들, 특히 ISVD들의 조합은 가능한 가장 광범위한 방식으로, 즉 범-특이적 방식으로 교차 반응성 및 사베코바이러스에 의한 감염의 강력한 금지를 초래한다. 실제로, 본원에서 각각 '결합 부위 1' 및 '결합 부위 2', 또는 'VHH72-에피토프' 및 'VHH3.117-에피토프'로 정의된 에피토프와 상호작용하는 결합제, 특히 제1 및 제2 ISVD(둘 다 사베코바이러스들 간에 매우 보존된 RBD 영역임)를 선택함으로써, 범-특이적 사베코바이러스 조성물 또는 결합제가 생성될 수 있으며, 이는 돌연변이 유발을 피할 위험을 줄일 수 있다.
또한, 스파이크 단백질의 상기 2개의 에피토프 '결합 부위 1' 및 '결합 부위 2'에 특이적인 결합제들, 특히 제1 및 제2 ISVD를 제공함으로써, 이 중 VHH72-에피토프에 대한 결합제, 특히 제1 ISVD(들)는, RBD와의 상호작용 시 인간 수용체(SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 경우 ACE-2) 결합에 대해 경쟁하고, VHH3.117 에피토프에 대한 결합제, 특히 제2 ISVD(들)는 인간 수용체(SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 경우 ACE-2)와 RBD의 결합을 억제하지 않고 바이러스를 중화시키며, 생성된 이중특이적 또는 다중특이적 결합제 또는 조성물은 중화 시 적어도 두 가지 별개의 메커니즘을 통해 작용한다. 어떠한 이론에도 얽매이기를 바라지 않고, VHH3.117 에피토프에 대한 결합제, 특히 제2 ISVD(들)는 S1 쉐딩 및 결과적으로 조기 스파이크 트리거링을 유발할 수 있으며, 따라서 사베코바이러스가 숙주 세포에 감염 또는 진입하는 과정을 완료하지 못하게 할 수 있다.
본원에 기술된 범-특이적 결합제의 주요 이점은 에피토프가 여러 계통군의 사베코바이러스의 RBD 내에 매우 보존되어 있는 RBD 아미노산을 포함한다는 특성으로 인해 제공되며, 이는 에피토프가 안정적이고 빈번한 돌연변이 변화를 겪지 않는다는 것을 나타낸다. 이러한 사베코바이러스 중화제는 여러 신종 SARS-CoV-2 변이체들을 고려할 때 COVID-19 치료를 위한 치료법 개발에 매우 중요하며, 상기 변이체들 중 일부는 전염성이 더 강하고/강하거나 더 심각한 질병 증상(청년 포함)을 유발하고/하거나 일부 기존 백신 및/또는 진단 테스트를 벗어난다. 본원에서 확인된 조성물 및 결합제, 뿐만 아니라 이들의 적용은 아래에 더 자세히 설명되어 있다.
SARS-CoV-2는 구조 단백질로서 스파이크(S) 단백질, 외피(E) 단백질, 막(M) 단백질, 및 뉴클레오캡시드(N) 단백질을 포함한다. 또한, 16개의 비구조 단백질(nsp1-16)이 식별되었으며, 복제 및 숙주 방어 수정에 관여하고 있다. Nsp12 단백질은 RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRp)에 상응한다. 본 발명에서 특히 관심을 끄는 것은 바이러스 표면에서 튀어나와 바이러스에 왕관과 같은 모양을 부여하는 동종삼합체를 형성하는 막횡단 당단백질인 스파이크 또는 S 단백질이다. 스파이크 단백질에는 두 개의 서브유닛, 즉 S1 및 S2가 있다. S1 서브유닛은 N-말단 도메인(NTD), 수용체 결합 도메인(RBD) - 위에서 나타낸 바와 같이, RBD는 인간 ACE-2에 결합함 - 및 서브도메인(subdomain) 1 및 2(SD1, SD2)를 포함한다. S2 서브유닛은 바이러스와 숙주 세포의 막을 융합하는 데 관여하며, 다음과 같은 여러 도메인들을 포함한다: S2' 프로테아제 절단 부위(융합에 필요한 숙주 프로테아제에 의한 절단), 융합 펩티드(FP), 헵타드 반복 1(HR1) 도메인, 중심 나선(CH) 도메인, 연결자 도메인(connector domain; CD), 헵타드 반복 2(HR2) 도메인, 막횡단(TM) 도메인 및 세포질 꼬리(cytoplasmic tail; CT) 도메인(Wang et al. 2020, Front Cell Infect Microbiol 10:587269). 융합 전 입체형태에서, 생합성 동안 S1-S2 푸린 절단 부위에서 절단된 S1과 S2는 서로 비공유 결합 상태로 남아 있으며 - 이는 S1과 S2가 절단되지 않은 상태로 남아 있는 SARS-CoV와 다르다. 닫힌 상태의 S 단백질(PDB: 6VXX)에서 삼합체의 3개 RBD 도메인들은 삼합체에서 돌출되지 않는 반면, 개방된 상태(PDB:6VYB) 또는 "상향" 입체형태에서는 RBD 중 하나가 삼합체에서 돌출된다. 단면이 삼각형인 S-삼합체 엑토도메인(ectodomain)은 길이가 대략 160옹스트롬이며, 이때 S1 도메인은 V자형 형태를 취한다. 프로토머당 22개의 N-연결된 글리코실화 부위들 중 16개가 글리코실화된 것으로 보인다(Walls et al. 2020, Cell 180:281-292). RBD 도메인은 5개의 역평행 가닥들에 의해 형성된 코어 베타 시트 영역을 포함한다. 2개의 역평행 가닥들 사이에는 수용체 결합 모티프(RBM)가 삽입되어 ACE2에 결합하는 대부분의 잔기들을 포함하는 확장된 구조(2개의 짧은 베타 가닥, 2개의 알파 나선, 및 루프로 형성됨)를 형성한다(Lan et al. 2020, Nature 581:215-220).
Sars-Cov-2 스파이크 단백질 서열은 Genbank 등록(Accession): QHQ82464, 버전 QHQ82464.1에서 찾을 수 있고/이와 일치하거나 이에 상응하고; 또한 본원에서는 SARS-CoV-2 표면 당단백질, 및 서열 번호: 1로 정의된다. 본 명세서에서, SARS-CoV-2 스파이크 단백질 RBD 도메인 영역(스파이크 수용체 결합 도메인으로도 정의됨; pfam09408)은 서열 번호: 1의 아미노산 330-583과/에 상응하거나; 또는 대안적으로 서열 번호: 1의 아미노산 330-518과/에 상응하거나; 또는 대안적으로 서열 번호: 1의 아미노산 349-526에 상응한다.
따라서 RBD는 인간 수용체: "안지오텐신 전환 효소 2", "ACE2" 또는 "ACE-2"(본원에서 상호교환적으로 사용됨)와 상호작용 부위를 형성하고, 상기 안지오텐신 전환 효소 2는 디펩티딜 카복시디펩티다제 계열에 속하는 포유동물 단백질을 의미하는 것으로, 때때로 EC:3.4.17.23으로 분류되며, 본원에서는 적어도 인간 코로나바이러스인 SARS-CoV, SARS-CoV-2, 및 NL63/HCoV-NL63(New Haven 코로나바이러스로도 공지됨)의 수용체로 작용한다. 인간 ACE2 단백질의 UniProtKB 식별자: Q9BYF1. 이소형 1(식별자: Q9BYF1-1)이 표준i 서열(canonicali sequence)로 선택되었다. GenBank에서 인간 ACE2 유전자의 참조 DNA 서열: NC_000023.11. GenBank에서 인간 ACE2의 참조 mRNA 서열 NM_001371415.1 및 NM_021804.3.
본 발명의 제1 측면에서는, 하나 이상의 코로나 바이러스 스파이크 단백질 특이적 결합제를 포함하는 조성물이 기재되어 있다. 본원에 사용된 '조성물'은 결합제 활성, 특히 이 경우 RBD 결합 및 사베코바이러스 중화 활성을 유지하는 제형에 존재하는 하나 이상의 분자의 조합을 지칭하며, 따라서 기능성 조성물을 나타낸다. 따라서, 상기 조성물은, 상기 스파이크 단백질 결합제 분자(들)에 더하여, 예를 들어 비제한적으로, 버퍼 구성요소, 보조제, 또는 기능성 분자일 수 있는 추가 분자를 더 포함하는 가용성 또는 고체 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 RBD 영역과의 상호작용을 통해 사베코바이러스 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합제 또는 결합 도메인을 구성하는 하나 이상의 분자를 포함한다. 따라서, 보다 구체적으로, 상기 조성물은 적어도 2개의 결합제 또는 적어도 2개의 결합 도메인을 함유할 수 있으며, 이는 하나의 결합제 또는 결합 도메인이 하나의 결합 부위에서 RBD 영역에 특이적으로 결합하고, 제2 결합제 또는 결합 도메인은 제1 결합 부위와 다른 또 다른 에피토프 또는 결합 부위에서 RBD 영역에 특이적으로 결합하여, 가능하면 동시에 RBD에 비경쟁 방식으로 결합하는 적어도 2개의 결합제 또는 결합 도메인을 갖는 조성물을 생성한다는 것을 특징으로 한다. 상기 적어도 2개의 결합제 또는 결합 도메인은 상기 조성물에 하나 또는 여러 분자 실체로서 존재할 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 상기 결합제에 존재하는 2개의 서로 다른 결합 도메인들을 통해 상기 RBD의 2개의 비경쟁 결합 부위에 결합할 수 있는 결합제를 포함하며, 이때 상기 결합제는 2중 파라토프 또는 이중특이적 결합제 또는 다가 또는 다중특이적 결합제일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 스파이크 단백질 또는 다른 바이러스 단백질의 동일하거나 다른 에피토프 상의 추가 결합 영역에 선택적으로 결합하거나 완전히 관련 없는 표적 단백질을 표적으로 할 수도 있는 추가 결합제(들) 또는 분자를 여전히 함유할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 조성물은 하나 이상의 스파이크 단백질 특이적 결합제 또는 결합 도메인을 포함하며, 이때 상기 결합제 또는 결합 도메인은 분자의 항원 결합제이다. 보다 구체적으로, 항체형 분자, 즉 본원에 기재된 RBD 항원 결합 부위에 특이적인 항체 또는 면역글로불린 도메인 함유 분자로서 본원에서 정의된 분자. 상기 항체 조성물은 하나 또는 여러 분자로서 상기 조성물에 제공되는 하나 이상의 결합제 또는 결합 도메인을 제공하는 것으로 본원에서 예상되며, 이때 상기 분자(들) 중 적어도 하나는 본원에서 서열 번호: 1에 표시된 스파이크 단백질의 RBD에, 2개의 비경쟁 결합 부위 중 적어도 1개에서 상기 RBD와의 상호작용을 통해 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 성질을 갖는다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 하나 이상의 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD) 및 하나 이상의 제2 ISVD를 제공하며, 이때 상기 제1 및 제2 ISVD는 본원에서 서열 번호: 1로 표시된 스파이크 단백질의 RBD에, 2개의 비경쟁 결합 부위에서 상기 RBD와의 상호작용을 통해 특이적으로 결합한다. 상기 제1 및 제2 ISVD는 단일 분자 또는 2개의 다른 분자로 존재할 수 있다.
상기 조성물의 상기 하나 이상의 결합제 또는 결합 도메인의 상기 결합 부위는 본원에서 '결합 부위 1' 및 '결합 부위 2'로 정의되며, 따라서 이는 본원에 개시된 결합제에 의해 특이적으로 인식되는 상기 RBD의 2개의 서로 다른 비경쟁 영역과 관련된다. 본 명세서에서 '결합제'란 표적, 보다 구체적으로는 예를 들어 RBD 스파이크 단백질 표적, 보다 더 구체적으로는 에피토프 1 또는 '결합 부위 1' 또는 에피토프 2 또는 '결합 부위 2'에 있는 표적과 특이적으로 상호작용할 수 있는 영역을 갖는 임의의 분자를 의미한다. 상기 조성물이 본원에 정의된 바와 같이 결합 부위 1 및 결합 부위 2 모두에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 결합제를 함유하는 경우, 상기 단일 결합제는 다중특이적 결합제, 또는 보다 바람직하게는 이중 파라토프 또는 이중특이적 결합제로 정의된다. 특정 구현예에서, 이러한 다중특이적 결합제는 하나 이상의 제1 ISVD 및 하나 이상의 제2 ISVD를 포함하며, 이때 상기 제1 및 제2 ISVD는 본원에서 서열 번호: 1로 표시된 스파이크 단백질의 RBD에, 2개의 비경쟁 결합 부위에서 상기 RBD와의 상호작용을 통해 특이적으로 결합한다.
상기 결합제는 폴리펩티드, 보다 구체적으로 항원 결합 도메인, 면역글로불린 도메인, 항체 또는 항체 단편, 단일 도메인 항체 또는 ISVD, VHH, 또는 Nb일 수 있다. 대안적으로, 상기 결합제는 또한 소분자, 접합체, 화학물질, 펩티드, 펩티드모방체, 항체모방체 등일 수 있다.
탈출 돌연변이 바이러스 출현을 감소시키기 위해 사베코바이러스 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD) 상의 여러 보존 영역들과 상호작용하는 구성요소
따라서, 본 발명의 조성물의 결합제는 (1) 사베코바이러스를 중화, 억제, 차단 또는 억압할 수 있는 결합제, 특히 (2) 사베코바이러스 감염 또는 사베코바이러스의 감염 능력(infective capacity)을 중화, 억제, 차단 또는 억압할 수 있는 결합제 및/또는 (3) 사베코바이러스 복제를 중화, 억제, 차단 또는 억압할 수 있는 결합제를 제공한다. 예를 들어, 본원에서 식별된 결합제와 사베코바이러스 스파이크 단백질 사이의 상호작용(결합, 특이적 결합)은 예컨대 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 검정에서 결정된 바와 같은 사베코바이러스의 감염력 또는 감염 능력의 중화를 야기한다. 본원에 기재된 결합제의 또 다른 기능은 이러한 결합제가 (4) 사베코바이러스의 스파이크 단백질에 결합하거나 특이적으로 결합할 수 있다는 것이다. 특히, 이러한 결합제는 (5) 사베코바이러스 스파이크 단백질, 특히 여러 상이한 사베코바이러스들의 스파이크 단백질에 있는 RBD 도메인 또는 모티프, 또는 RBD 도메인 또는 모티프의 일부, 보다 구체적으로는 사베코바이러스 스파이크 단백질에 있는 RBD 도메인 또는 모티프, 또는 RBD 도메인 또는 모티프의 일부에 있는 고도로 보존된 에피토프에 결합하거나 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어 본원에 각각 정의된 '결합 부위 1' 및 '결합 부위 2'와의 결합 등 RBD에 결합하는 인간 수용체(ACE2 수용체)와의 경쟁을 통하든 아니든, 이들의 작용 메커니즘과 무관하게, 본 발명에 따른 결합제들은 사베코바이러스 감염을 효율적/효과적으로 중화시킨다. 예를 들어, 어떠한 이론에도 얽매이기를 바라지 않고, 결합제는 S1 쉐딩 및 결과적으로 조기 스파이크 트리거링을 유발할 수 있으며, 따라서 사베코바이러스가 감염 또는 숙주 세포로의 진입 과정을 완료하지 못하게 할 수 있다.
본원에 기재된 조성물은 본 명세서에서 '결합 부위 1'로 언급된 RBD에 위치한 결합 부위를 통해 서열 번호: 1에 정의된 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는, 적어도 하나의 '결합제' 또는 '결합 도메인', 또는 하나 이상의 제1 ISVD를 포함하며, 이는 결합 부위 1에 대한 상기 결합제 또는 결합 도메인 또는 상기 제1 ISVD가 Wrapp 등(Wrapp et al., 2020, Cell 184:1004-105) 및 PCT/EP2021/052885에 기재되고 본원에 더 기재되어 있는 'VHH72-에피토프'에 상응한다는 것을 특징으로 한다. 또한, 결합 부위 1에 특이적인 상기 결합제 또는 결합 도메인, 또는 상기 제1 ISVD는 '결합 부위 2'에 특이적으로 결합하는 결합제(이의 일부), 또는 제2 ISVD와 경쟁하지 않고, 보다 구체적으로는, 결합 부위 1에 대한 상기 결합제 또는 결합 도메인, 또는 상기 제1 ISVD는 VHH3.117 계열 구성원(VHH3.117, 3.42, 3.92, 3.94, 및 3.180)(실시예 및 Saelens et al. EP　21166835.5 및 PCT/EP2022/052919에 설명됨), 또는 VHH3.89(PCT/EP2021/052885에 설명됨) 및 이의 계열 구성원인 VHH3_183 및 VHH3C_80(본원의 실시예 9에 설명됨), 보다 구체적으로는 서열 번호: 22-27 또는 서열 번호: 85-87 중 어느 것의 CDR1, 2 및 3 영역을 포함하는 임의의 결합제와 경쟁하지 않으며, 이때 상기 CDR은 본원에 기재되고 제공된 임의의 주석에 따라 주석이 달린다. 본 명세서에서 '경쟁하지 않는'은 결합제가 RBD의 결합 부위 1에 결합되어 있거나 그 반대로 결합된 경우 상기 비경쟁 결합제들의 '결합을 허용하는' 것을 의미한다.
또한, 구조적 분석에서는 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제1 ISVD, 예를 들어 VHH72에 특이적으로 결합하는 본원에 정의된 상기 에피토프 1이 네이티브 바이러스에서 지배적인 입체형태인 닫힌 스파이크 입체형태에서 가려진다는 것을 추가로 입증한다. ACE2 수용체에 결합할 수 있는 '1-RBD-상향' 입체형태에서도, 에피토프는 인간 단클론 항체가 쉽게 도달할 수 없도록 위치한다. 아마도 이 때문에, 스파이크의 다른 영역에 대한 수백 개의 항체들 중에서 VHH72 에피토프와 실질적으로 겹치는 에피토프에 결합하는 인간 항체는 거의 없다. 또한, 에피토프는 삼합체 스파이크의 프로토머들 사이에 중요한 패킹 접촉을 형성하는 잔기들로 구성된다. 이 에피토프에 돌연변이가 있는 SARS-CoV-2 바이러스는 지금까지 극히 드물다. 일관되게, 새롭게 등장하고 빠르게 확산되는 바이러스 변이체의 RBD 돌연변이 중 어느 것도 VHH72 결합 부위에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명의 결합제의 경우와 같이, SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2 및 사베코바이러스 아속의 다른 바이러스를 교차 중화시키는 항체는 드물고, 따라서 상기 ISVD를 포함하는 본 발명의 결합제는 특별하다.
CR3022는 VHH72 에피토프와 부분적으로 겹치는 영역에서 정제된 재조합 2019-nCoV 또는 SARS-CoV-2 RBD(ter Meulen et al. 2006, PLoS Med 3:e237)와 결합할 수 있는 것으로 보고되었으나 CR3022는 SARS-CoV-2 RBD에 대한 ACE2의 결합에 대해 경쟁하지 않는 반면, 에피토프 1 또는 대안적으로 VHH72-에피토프에 결합하는 본 발명의 결합제는 SARS RBD와의 결합에 대해 ACE2와의 명확한 경쟁을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 VHH72-에피토프 또는 '결합 부위 1'은 서열 번호: 1에 나타낸 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질에 존재하는 적어도 K378, 또는 잔기 K378, Y369 및 F377 중 적어도 하나 이상과 밀접하게 접촉하는 SARS CoV의 RBD에서 잘 정의된 입체형태적 에피토프를 나타내는 것이다. 보다 구체적으로, 스파이크 단백질의 상기 결합 부위 1은 본 명세서에서 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 잔기 S371, S375, T376 또는 C379 중 적어도 하나 이상, 또는 보다 더 구체적으로, SARS-Cov-2 스파이크 단백질 서열인 서열 번호: 1에 제시된 L368, Y369, S371, S375, T376, F377, K378, C379 및 Y508 중 적어도 하나를 포함하는 에피토프로 정의된다. 특히, 결합 부위 1에 특이적인 상기 결합제, 또는 상기 제1 ISVD는 본 명세서에서 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(서열 번호: 1), 본원에 열거된 아미노산들 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 또는 전부, 서열 번호: 1에 표시된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 L368, Y369, S371, S375, T376, F377, K378, C379 및 Y508에 특이적으로 결합하는 것으로 지칭된다.
또 다른 구현예는 본원에 정의된 바와 같이 에피토프 1에 대해 경쟁하거나 RBD 에피토프에 결합하는 VHH72와 경쟁하는 결합제로 정의되는, 코로나 바이러스 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 제1 ISVD는 본원에 정의된 바와 같이 에피토프 1에 대해 경쟁하거나 RBD 에피토프에 결합하는 VHH72와 경쟁한다. '경쟁하는(competing)'은 서열 번호: 1로 표시된 스파이크 단백질에 대한 VHH72의 결합이 상기 경쟁 결합제 또는 제1 ISVD의 존재 하에 강도가 적어도 30%, 또는 적어도 50%, 또는 바람직하게는 적어도 80% 감소함을 의미한다. 보다 구체적으로, 상기 경쟁 결합제 또는 제1 ISVD는 중첩 에피토프를 제공하고, 보다 구체적으로는 이의 잔기 중 적어도 2개, 또는 이의 잔기 중 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 6개에 결합하도록 서열 번호: 1로 표시된 SARS-Cov-2의 스파이크 단백질의 잔기 L368, Y369, S371, S375, T376, F377, K378, C379, 및 Y508 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 또는 그 이상을 포함하는 스파이크 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 상기 경쟁 결합제 또는 제1 ISVD는 잔기 K378, Y369 및 F377에 특이적으로 결합한다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 경쟁 결합제 또는 상기 제1 ISVD는 서열 번호: 1에 표시된 잔기 K378, Y369 및 F377에 특이적으로 결합하고, 상기 경쟁 결합제 또는 상기 제1 ISVD는 스파이크 단백질 및/또는 RBD 도메인에 결합하는 ACE2 수용체와 경쟁한다. 구체적으로, 상기 경쟁 결합제 또는 제1 ISVD는 중첩 에피토프를 제공하고, 보다 구체적으로는 잔기의 적어도 30%, 또는 잔기의 적어도 50%, 또는 잔기의 적어도 80% 결합을 제공하도록 서열 번호: 1로 표시된 SARS-Cov-2의 스파이크 단백질의 잔기 L368, Y369, S371, S375, T376, F377, K378, C379 및 Y508의 적어도 일부를 포함하고/하거나 구체적으로는 잔기 K378 및/또는 F377을 포함하는 스파이크 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본원에 기재된 조성물은 본 명세서에서 '결합 부위 2'로 언급된 RBD에 위치한 결합 부위를 통해 서열 번호: 1에 정의된 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는, 적어도 하나의 결합제 또는 결합 도메인, 또는 하나 이상의 제2 ISVD를 포함하며, 이는 결합 부위 2에 대한 상기 결합제 또는 상기 제2 ISVD가 EP　21166835.5 및 PCT/EP2022/052919에 기재되고 본원에 더 기재되어 있는 'VHH3.117-에피토프'에 상응한다는 것을 특징으로 한다. 또한, 결합 부위 2에 특이적인 상기 결합제 또는 결합 도메인, 또는 상기 제2 ISVD는 본원에 정의된 바와 같은 결합 부위 1에 특이적으로 결합하는 결합제(이의 일부) 또는 제1 ISVD와 경쟁하지 않으며, 보다 구체적으로는 공지된 면역글로불린 VHH72와 경쟁하지 않고/않거나(Wrapp et al. 2020, Cell 184:1004-105), 또한 공지된 면역글로불린 CR3022와 경쟁하지 않고/않거나(ter Meulen et al. 2006, PLoS Med 3:e237; Tian et al. 2020, Emerging Microbes & Infections 9:382-385), 공지된 면역글로불린 CB6과 경쟁하지 않고/않거나(Shi et al. 2020, Nature 584:120-124)과 경쟁하지 않고/않으며 공지된 면역글로불린 S309와 경쟁하지 않으며(Pinto et al. 2020, Nature 583:290-295), 모든 경쟁은 사베코바이러스의 스파이크 단백질(또는 그 안의 RBD 도메인)에 결합하거나 특이적으로 결합하는 것에 대한 것이다.
본 명세서에서 '경쟁하지 않는'은 결합제가 RBD의 결합 부위 2에 결합되어 있거나 그 반대로 결합된 경우 상기 비경쟁 결합제들의 '결합을 허용하는' 것을 의미한다. 따라서, 본원에서 상호교환적으로 사용되는 RBD의 '에피토프 2' 또는 '결합 부위 2'에 특이적으로 결합하는 결합제, 또는 제2 ISVD는 결합 부위 1에 특이적으로 결합하는 결합제(이의 일부), 또는 제1 ISVD, 및/또는 면역글로불린 CR3022, VHH72, CB6 또는 S309 중 어느 것의 스파이크 단백질/RBD 결합 패턴과 비교하여 상이한 스파이크 단백질/RBD 결합 패턴을 특징으로 한다. 대안적으로, RBD의 결합 부위 2에 특이적인 이러한 결합제들 또는 이러한 제2 ISVD들은 이러한 결합제들 또는 제2 ISVD들이 그 자체로 사베코바이러스 RBD에 결합될 때 CR3022, VHH72, CB6 또는 S309가 사베코바이러스 RBD 또는 스파이크 단백질에 결합할 수 있도록 한다. 대안적으로, 상기 결합제 또는 상기 제2 ISVD 자체가 CR3022, VHH72, CB6 또는 S309가 결합된 사베코바이러스 RBD에 결합할 수 있다.
하나의 특정 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 RBD의 결합 부위 2와 특이적으로 상호작용하는 결합제 또는 결합제의 일부, 또는 제2 ISVD는, 상기 결합제 또는 제2 ISVD가 사베코바이러스 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(SPRBD)에 결합하고, 사베코바이러스 결합제 또는 제2 ISVD 자체가 SPRBD에 결합되는 경우에도 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)가 SPRBD에 결합하도록 하며, 적어도 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV-1을 중화시키고, 서열 번호: 1에 정의된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 Thr393(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser393), Asn394(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser394), Val395, 또는 Tyr396 중 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 것으로 정의되고/특성화될 수 있다.
이들 잔기 중 적어도 하나가 결합되어 있는 상기 결합 부위 2에 대한 상기 결합은, 이 결합 부위 2가, 면역글로불린 mAb52 또는 Fab52에 의해 결합된 에피토프(Rujas et al. 2020, Biorxiv 2020.10.15.341636v1); 및/또는 면역글로불린 nb34에 의해 결합된 에피토프(Xiang et al. 2020, Science 370:1479-1484); 및/또는 면역글로불린 nb95에 의해 결합된 에피토프(Xiang et al. 2020, Science 370:1479-1484); 및/또는 면역글로불린 n3088 및/또는 n3130에 의해 결합된 에피토프(Wu et al. 2020, Cell Host Microbe 27:891-898); 및/또는 면역글로불린 n3086 및/또는 n3113에 의해 결합된 에피토프(Wu et al. 2020, Cell Host Microbe 27:891-898);와는 다른 스파이크 단백질 또는 RBD의 에피토프라는 것을 추가로 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 상기 결합제, 또는 상기 제2 ISVD는 본 명세서에서 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(서열 번호: 1의 아미노산 서열에 상응함), 아미노산 Thr393(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser393), Asn394(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser394), Val395 또는 Tyr396 중 적어도 하나; 및/또는 특히 아미노산 Lys462(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Arg462), Phe464(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Tyr464), Glu465(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Gly465) 또는 Arg466 중 적어도 하나; 및/또는 특히 아미노산 Ser 514, Glu516, 또는 Leu518 중 적어도 하나; 및/또는 특히 아미노산 Arg357(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Lys357)에 특이적으로 결합하는 것으로 지칭된다. 특히, 결합 부위 2에 특이적인 상기 결합제, 또는 상기 제2 ISVD는 본 명세서에서 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(서열 번호: 1), 본원에 열거된 아미노산들 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 또는 전부, 서열 번호: 1에 표시된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 R357, T393, N394, V395, Y396, K462, F464, E465, R466, S514, E516, 및 L518에 특이적으로 결합하는 것으로 지칭된다.
선택적으로, 이러한 결합제들, 또는 제2 ISVD(들)는 Cys336(사베코바이러스 계통군들 사이에서 보존됨)이 분자내 이황화 가교를 형성하는 사베코바이러스 스파이크 단백질에 결합하거나 특이적으로 결합하고/하거나 Cys391(사베코바이러스 계통군들 사이에서 보존됨)이 분자내 이황화 가교를 형성하는 사베코바이러스 스파이크 단백질에 결합하거나 특이적으로 결합하고; 특히, Cys336은 Cys361(사베코바이러스 계통군들 사이에서 보존됨)과 분자내 이황화 가교를 형성할 수 있고/있거나 Cys391은 Cys525(사베코바이러스 계통군들 사이에 보존됨)와 분자내 이황화 가교를 형성할 수 있다. 선택적으로, 이러한 결합제들 또는 결합 도메인들, 또는 제2 ISVD(들)는 아미노산 365가 티로신(Tyr365; 사베코바이러스 계통군들 사이에서 보존됨)인 사베코바이러스 스파이크 단백질에 결합하거나 특이적으로 결합하고/하거나, 아미노산 392가 페닐알라닌(Phe392; 사베코바이러스 계통군들 사이에서 보존됨)인 사베코바이러스 스파이크 단백질에 결합하거나 특이적으로 결합하고/하거나 아미노산 393이 트레오닌(Thr393; 또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser393)인 사베코바이러스 스파이크 단백질에 결합하거나 특이적으로 결합하고/하거나, 아미노산 395가 발린(Val395; 또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser393)인 사베코바이러스 스파이크 단백질에 결합하거나 특이적으로 결합하고/하거나 아미노산 518이 류신(Leu518)인 사베코바이러스 스파이크 단백질에 결합하거나 특이적으로 결합한다.
특정 구현예에서, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 아미노산 Asn394(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser394) 또는 Tyr396 중 적어도 하나에 결합하거나 특이적으로 결합하고/하거나; 특히 이러한 결합제 또는 결합 도메인, 또는 이러한 제2 ISVD는 Phe464(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Tyr464)에 결합하거나 특이적으로 결합하고/하거나; 특히 이러한 결합제 또는 결합 도메인, 또는 이러한 제2 ISVD는 아미노산 Ser514 또는 Glu516 중 적어도 하나에 결합하거나 특이적으로 결합하고/하거나; 특히 이러한 결합제 또는 결합 도메인, 또는 이러한 제2 ISVD는 Arg355에 결합하거나 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 아미노산 Asn394(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser394), Tyr396, Phe464, Ser514, Glu516, 및 Arg355 중 적어도 하나에 결합하거나 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 아미노산 Asn394(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser394), Tyr396, Phe464, Ser514, Glu516, 및 Arg355 중 적어도 2개에 결합하거나 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 아미노산 Asn394(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser394), Tyr396, Phe464, Ser514, Glu516, 및 Arg355 중 적어도 3개에 결합하거나 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 아미노산 Asn394(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser394), Tyr396, Phe464, Ser514, Glu516, 및 Arg355 중 적어도 4개에 결합하거나 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 아미노산 Asn394(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser394), Tyr396, Phe464, Ser514, Glu516, 및 Arg355 중 적어도 5개에 결합하거나 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 6개의 아미노산 Asn394(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser394), Tyr396, Phe464, Ser514, Glu516, 및 Arg355 모두에 결합하거나 특이적으로 결합한다.
특정 구현예에서, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 상기 결합제, 도메인 또는 ISVD의 일부가 적어도 Tyr396, Ser514 및 Glu516의 4옹스트롬 내에 들어오도록 결합하거나 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 적어도 Tyr396, Ser514, 및 Glu516에 결합하거나 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 상기 결합제, 도메인 또는 ISVD의 일부가 적어도 Asn394(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser394), Tyr396, Ser514, 및 Glu516의 4옹스트롬 내에 들어오도록 결합하거나 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 적어도 Asn394(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser394), Tyr396, Ser514, 및 Glu516에 결합하거나 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 상기 결합제, 도메인 또는 ISVD의 일부가 적어도 Asn394(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser394), Tyr396, Phe464, Ser514, 및 Glu516의 4옹스트롬 내에 들어오도록 결합하거나 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 적어도 Asn394(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser394), Tyr396, Phe464, Ser514, 및 Glu516에 결합하거나 특이적으로 결합한다.
선택적으로, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 아미노산 Arg357(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Lys357) 및/또는 Lys462(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Arg462) 및/또는 Glu465(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Gly465) 및/또는 Arg466 및/또는 Leu518에 추가로 결합하거나 특이적으로 결합하고, 예컨대 아미노산 Arg357(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Lys357) 및/또는 Lys462(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Arg462) 및/또는 Glu465(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Gly465) 및/또는 Arg466 및/또는 Leu518 중 적어도 2개의 아미노산, 또는 선호도가 증가하는 순서로 적어도 3개의 아미노산 또는 4개의 아미노산 모두에 추가로 결합하거나 특이적으로 결합한다.
특히, 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 R355, N394, Y396, F464, S514 및 E516에 의해 원주형으로 정의된 RBD 표면적의 적어도 25%, 적어도 33%, 적어도 50% 또는 적어도 75%를 커버하는 결합 계면이 생성되도록(예를 들어, PDBePISA에 의해 결정됨) 결합하거나 특이적으로 결합할 수 있다. 접촉되는 RBD 표면적은 이들 잔기들 사이에 입체적으로 존재하는 개재 표면적을 선택적으로 포함하도록 계산될 수 있다.
스파이크 단백질 서열에 존재하는 것으로 위에서 언급된 아미노산 및 아미노산 넘버링은 서열 번호: 1에 정의된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 기준으로 하고/이에 상응하고; 다른 사베코바이러스의 스파이크 단백질 또는 RBD 도메인에서 상응하는 아미노산은 여러 아미노산 서열들을 정렬하여 쉽게 결정할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 RBD의 결합 부위 2와 특이적으로 상호작용하는 결합제 또는 결합제의 일부, 또는 제2 ISVD는 상기 결합제 또는 제2 ISVD가 S1 쉐딩을 유발하는 것으로 정의되고/특성화될 수 있다.
또 다른 구현예는 본원에 정의된 바와 같이 에피토프 2에 대해 경쟁하거나 RBD 에피토프에 결합하는 VHH3.117과 경쟁하는 결합제로 정의되는, 코로나 바이러스 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 결합제에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 제2 ISVD는 에피토프 2에 대해 경쟁하거나, RBD 에피토프에 결합하는 VHH3.117과 경쟁한다. '경쟁하는'은 서열 번호: 1로 표시된 스파이크 단백질에 대한 VHH3.117의 결합이 상기 경쟁 결합제 또는 상기 제2 ISVD의 존재 하에 강도가 적어도 30%, 또는 적어도 50%, 또는 바람직하게는 적어도 80% 감소함을 의미한다. 보다 구체적으로, 상기 경쟁 결합제 또는 제2 ISVD는 중첩 에피토프를 제공하고, 보다 구체적으로는 이의 잔기 중 적어도 2개, 또는 이의 잔기 중 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 6개에 결합하도록 서열 번호: 1로 표시된 SARS-Cov-2의 스파이크 단백질의 잔기 R357, T393, N394, V395, Y396, K462, F464, E465, R466, S514, E516, 및 L518 중 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개 또는 그 이상을 포함하는 스파이크 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서 경쟁 결합제 또는 제2 ISVD는 서열 번호: 1의 잔기 T393, N394, V395 또는 Y396에 특이적으로 결합한다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 경쟁 결합제 또는 제2 ISVD는 서열 번호: 1에 표시된 잔기 T393, N394, V395, 또는 Y396에 특이적으로 결합하고, 상기 경쟁 결합제 또는 상기 제1 ISVD는 스파이크 단백질 및/또는 RBD 도메인에 결합하는 ACE2 수용체와 경쟁하지 않는다. 구체적으로, 상기 경쟁 결합제 또는 제2 ISVD는 중첩 에피토프를 제공하고, 보다 구체적으로는 잔기의 적어도 30%, 또는 잔기의 적어도 50%, 또는 잔기의 적어도 80% 결합을 제공하도록 서열 번호: 1로 표시된 SARS-Cov-2의 스파이크 단백질의 잔기 R357, T393, N394, V395, Y396, K462, F464, E465, R466, S514, E516, 및 L518의 적어도 일부를 포함하고/하거나 구체적으로는 서열 번호: 1의 잔기 T393, N394, V395, Y396을 포함하는 스파이크 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에 언급된 바와 같이, '사베코바이러스 RBD 결합에 대해 인간 수용체, 보다 구체적으로는 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2에 대한 ACE2와 경쟁하지 않는'이란 결합제 또는 (제2) ISVD가 그 자체로 사베코바이러스 RBD에 결합될 때 수용체와 사베코바이러스 RBD의 결합을 허용함을 의미하고(대안적으로, 결합제 또는 (제2) ISVD 자체는 수용체가 결합된 사베코바이러스 RBD에 결합할 수 있음); 반대로 'RBD 결합에 대해 수용체와 경쟁하는'이란 결합제 또는 (제1) ISVD가 RBD에 결합될 때 RBD에 대한 인간 수용체의 결합이 발생하지 않음(또는 부분적으로 발생하거나 대조군에 비해 느리게 발생함)을 의미한다(대안적으로, 결합제 또는 (제1) ISVD 자체는 수용체가 결합된 사베코바이러스 RBD에 결합할 수 없음). 따라서, 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 결합제 또는 결합 도메인은 본원에 정의된 바와 같이 적어도 2개의 서로 다른 결합 부위, 즉 RBD 상의 결합 부위 1 및 결합 부위 2를 통해 결합하여 결합제가 결합 부위 1을 통해 RBD와 상호작용하도록 함으로써 ACE2를 능가하거나 차단할 수 있는, RBD에 결합된 결합제(들) 또는 도메인(들)에 의해 형성된 복합체를 생성함으로써, 또는 하나 이상의 제1 ISVD를 통해, 그리고 또한 본원에 정의된 바와 같이 결합 부위 2와의 결합을 통해 RBD에 대한 ACE2 결합을 차단하는 것과 다른 바이러스의 중화 방식을 촉발함으로써, 또는 하나 이상의 제2 ISVD를 통해 사베코바이러스, 구체적으로는 SARS-CoV 바이러스 감염을 중화시킬 수 있다. RBD 영역의 보존된 2개의 드문 돌연변이 부위에서 상호작용하는 사베코바이러스의 스파이크 단백질에 특이적인 이러한 결합제 또는 결합 조성물은 다른 곳에서는 기술된 바 없으며, 본 발명자들의 의견으로는 범-특이적 코라나 바이러스 제제의 발달에 대한 매우 유망한 경로이다.
본원에 기재된 바와 같은 RBD의 에피토프 1 및 에피토프 2에 결합하기 위한 상기 하나 이상의 결합제 또는 결합 도메인, 특히 하나 이상의 제1 ISVD 및 하나 이상의 제2 ISVD를 포함하는 하나 이상의 결합제를 포함하는 조성물의 추가 기능적 특징은, 많은 사베코바이러스의 스파이크 단백질 또는 RBD에 있는 2개 이상의 보존된 에피토프가 상기 조성물에 의해 특이적으로 결합될 수 있다는 것이다. 특히, 에피토프 또는 결합 부위 1 및 결합 부위 2는 사베코바이러스의 서로 다른 계통군들 사이에서 보존되어 있다. 본원에서 '보존된'이란 상기 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기들이 성질 또는 측쇄 조성에 있어서 동일하거나 매우 유사하여, 상기 결합제 또는 결합 도메인, 특히 상기 ISVD와 상기 보존된 에피토프의 상호작용이, 서열 번호: 1에 대해 본원에 개시된 아미노산 잔기와 비교하여 보존된 치환이 존재하는 경우에도 유지되며, 효험(efficacy) 및 효능(potency)에 미치는 영향이 유사하거나 동일한 정도라는 것을 의미한다. 특히, 결합 부위 1 에피토프는 Schepens 등(PCT/EP2021/052885)에 설명되어 있고, 박쥐 SARS 관련 사베코바이러스의 계통군 1a, 1b, 계통군 2 및/또는 3 간에(계통군 2 및 3의 RBD들 간에는 어느 정도) 보존되어 있으며, 결합 부위 2 에피토프는 Saelens 등(EP21166835.5 및 PCT/EP2022/052919)에 설명되어 있고, 계통군 1.A, 계통군 1.B, 계통군 2, 및 계통군 3 사베코바이러스들 간에 보존되어 있다.
본원에 기재된 상기 하나 이상의 결합제 또는 결합 도메인을 포함하는 조성물의 추가 기능적 특징은, 결합 부위 1 및/또는 결합 부위 2와 특이적으로 결합하는 이러한 작용제 또는 도메인, 또는 상기 제1 및 제2 ISVD가, 예를 들어 슈도타입 바이러스 중화 검정에서 보여주는 바와 같이, 및/또는 바람직하게는 살아있는 바이러스 검정에서 보여주는 바와 같이 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV-1을 중화시킨다는 것이다.
본 발명에 따른 조성물 및/또는 결합제의 기능적 특징은 일반적으로 예를 들어 본원에 기재된 실시예에 사용되거나, 또는 본 명세서 위에서 인용된 간행물 및 기타 간행물 중 일부, 또는 본원에 언급된 각각의 단일 결합 부위를 개시하는 특허 출원(PCT/EP2021/052885, 및 EP21166835.5 또는 PCT/EP2022/052919)에 기재된 바와 같은 방법론에 의해 결정될 수 있다. 사베코바이러스 스파이크 단백질 에피토프 또는 사베코바이러스 RBD 도메인 에피토프의 결정은, 예를 들어, 결합 경쟁 실험(예컨대 본 명세서의 실시예 또는 본 명세서 위에서 인용된 많은 간행물들에 개괄되어 있음), 또는 예를 들어, 돌연변이 분석(예컨대 본 명세서의 실시예에 개괄되어 있음), 또는 예를 들어 인실리코 모델링(in silico modeling), X선 결정학, Cryo-EM, NMR, 스핀 라벨링, 또는 수소 중수소 교환(HDX)-MS를 포함하여 3D 수준에서 상호작용을 결정하는 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다.
본원에 기재된 결합제와 사베코바이러스 스파이크 단백질 또는 그 안의 RBD 도메인의 상호작용은 구조적 모델로부터 추론될 수 있다. 특히, 본원에 정의된 RBD의 결합 부위 1 또는 결합 부위 2와 결합제의 상호작용은 결합제의 원자(예를 들어, 아미노산 또는 아미노산 측쇄 또는 아미노산 수소)와 사베코바이러스 스파이크 단백질 또는 그 안의 RBD 도메인의 원자(예를 들어, 아미노산 또는 아미노산 측쇄 또는 아미노산 수소) 사이의 분자간 거리로 설명될 수 있다. FastContact(Champ et al. 2007, Nucleic Acids Res 35:W556-W560)와 같이 복합체의 결합 자유 에너지를 추정하는 알고리즘이 존재한다. FastContact 알고리즘에서, 예를 들어, 6 옹스트롬(5와 7 옹스트롬 사이에서 전위가 0으로 내려가는 것) 또는 9 옹스트롬(8과 10 옹스트롬 사이에서 전위가 0으로 내려가는 것)과 같이 탈용매 상호작용의 범위를 조정할 수 있으며; 정전기 및 반 데르 발스 에너지도 FastContact 알고리즘에서 사용하는 다른 구성요소이다.
따라서, 사베코바이러스 스파이크 단백질 또는 그 안의 RBD 도메인에 대한 본원에 기재된 결합제의 상호작용은, 결합 파트너의 원자와 사베코바이러스 스파이크 단백질 또는 그 안의 RBD 도메인(본 명세서 위에서 설명된 것과 같음)의 원자 사이의 거리가 예를 들어 1 옹스트롬(Å) 내지 10Å, 1Å 내지 9Å, 1Å 내지 8Å, 1Å 내지 7Å, 1Å 내지 6Å, 1Å 내지 5Å, 1Å 내지 4Å, 1Å 내지 3Å, 1Å 내지 2Å인 경우 상기 두 원자들 간의 상호작용을 결합으로 정의하고, 구조가 분해되는 분해능에 따라, 하한을 정의함으로써 구조 모델로부터 추론될 수 있다. 대안적으로, 사베코바이러스 스파이크 단백질 또는 그 안의 RBD 도메인의 잔기는 결합제 또는 파트너의 잔기들과 '접촉'하고, 이러한 '접촉'은 본원에서 거리가 4Å 이하, 5Å 이하, 6Å 이하, 7Å 이하, 8Å 이하, 9Å 이하, 또는 10Å 이하인 잔기들 사이의 (분자간) 접촉으로 정의될 수 있다.
특정 구현예에서, VHH72-에피토프(또는 본원에서 상호교환적으로 사용되는 에피토프 1 또는 결합 부위 1) 및 VHH3.117-에피토프(또는 본원에서 상호교환적으로 사용되는 에피토프 2 또는 결합 부위 2)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합제 또는 결합 도메인을 포함하는 상기 조성물은, 상기 결합제 또는 결합 도메인 중 적어도 하나가 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 적어도 각각의 결합 부위 1 및 2에 대해 상기 결합제 또는 결합 도메인은 ISVD, 특히 하나 이상의 제1 ISVD 및 하나 이상의 제2 ISVD를 각각 포함하는 것을 특징으로 하고, 이때 상기 ISVD, 특히 상기 제1 및 제2 ISVD는 각각 에피토프 1 및 2와 상호작용할 수 있다.
특히, 결합제 또는 결합 도메인은 본원에 기재된 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)이거나 이를 포함하거나, 본원에 기재된 하나 이상의 ISVD를 포함하고, 본 명세서 위에서 상세히 기재된 바와 같은 사베코바이러스 스파이크 단백질 또는 RBD 도메인의 일부(RBD 상의 에피토프 1 또는 에피토프 2)에 결합한다.
특히, 결합제 또는 결합 도메인의 일부(예컨대 본원에 기재된 CDR 및/또는 ISVD의 아미노산(또는 이의 일부))는 본원에 기재된 VHH72- 또는 VHH3.117-에피토프의 아미노산 중 적어도 하나와, 1 옹스트롬(Å) 내지 10Å, 1Å 내지 9Å, 1Å 내지 8Å, 1Å 내지 7Å, 1Å 내지 6Å, 1Å 내지 5Å, 1Å 내지 4Å, 1Å 내지 3Å, 1Å 내지 2Å; 또는 4Å 이하, 5Å 이하, 6Å 이하, 7Å 이하, 8Å 이하, 9Å 이하, 또는 10Å 이하의 거리로 접촉하거나 상호작용한다. 보다 구체적으로, 결합 부위 2에 특이적인 상기 결합제, 또는 상기 제2 ISVD는 서열 번호: 1에 표시된 스파이크 단백질 상의 RBD의 Y369, F377, K378, L368, S371, S375, T376, C379, 및/또는 Y508 중 적어도 하나와 접촉하거나 상호작용한다.
보다 구체적으로, 결합 부위 2에 특이적인 상기 결합제, 또는 상기 제2 ISVD는 서열 번호: 1에 표시된 스파이크 단백질 상의 RBD의 Thr393(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser393), Asn394(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Ser394), Val395 또는 Tyr396 중 적어도 하나의 아미노산; 및/또는 아미노산 Lys462(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Arg462), Phe464(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Tyr464), Glu465(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Gly465) 또는 Arg466 중 적어도 하나의 아미노산; 및/또는 아미노산 Ser514, Glu516 또는 Leu518 중 적어도 하나의 아미노산; 및/또는 아미노산 Arg357(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Lys357)과 접촉하거나 상호작용한다. 언급된 바와 같이, 다른 사베코바이러스의 스파이크 단백질 또는 RBD 도메인의 상응하는 아미노산들은 여러 아미노산 서열들을 정렬하여 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 결합제 또는 결합 도메인은 또 다른 측면에서 폴리펩티드성 결합제(즉, 펩티드성(peptidic), 폴리펩티드성(polypeptidic) 또는 단백질성(proteic) 모이어티를 포함하는 결합제, 또는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질 도메인을 포함하는 결합제) 또는 폴리펩티드 결합제(즉, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질인 결합제)로 구조적으로 정의된다. 보다 상세하게는, 본 발명에 따른 결합제는 본 명세서 아래에 정의된 임의의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)에 포함된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 폴리펩티드성(polypeptidic) 또는 폴리펩티드(polypeptide) 결합제 또는 결합 도메인으로 구조적으로 정의될 수 있다. 보다 상세하게는, 본 발명에 따른 조성물의 결합제 또는 결합 도메인은 일 구현예에서 본 명세서 아래에 정의된 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)에 포함된 적어도 CDR3을 포함하는 폴리펩티드성 또는 폴리펩티드 결합제로 구조적으로 정의될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 결합제는 본 명세서 아래에 정의된 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)에 포함된 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 적어도 두 가지(예를 들어, CDR1 및 CDR3, CDR2 및 CDR3, CDR1 및 CDR2) 또는 CDR1, CDR2 및 CDR3 세 가지 모두를 포함하는 폴리펩티드성 또는 폴리펩티드 결합제로 구조적으로 정의될 수 있다.
본 명세서에 개괄되고 정의된 바와 같이(정의 참조), 이러한 단백질 서열의 CDR 및 프레임워크 영역(FR)의 묘사를 포함하여 면역글로불린 단백질 서열의 아미노산을 넘버링하기 위한 많은 시스템 또는 방법(Kabat, Martin, MacCallum, IMGT, AbM, aHo, Chothia, Gelfand, Honegger; 예를 들어, 검토는 Dondelinger et al. 2018, Front Immunol 9:2278 참조)이 존재한다. 이러한 시스템 또는 방법은 숙련가에게 공지되어 있으므로, 과도한 부담 없이 임의의 면역글로불린 단백질 서열에 이러한 시스템 또는 방법을 적용할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같이 결합 부위 1에 특이적으로 결합하는 조성물의 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제1 ISVD는, 예를 들어, 이것이 서열 번호: 2-21, 90 또는 서열 번호: 95-98 중 어느 것에 존재하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이때 CDR은 Kabat, Martin, MacCallum, IMGT, AbM, aHo, Chothia, Gelfand, 또는 Honegger에 따라 주석을 달았다.
보다 상세하게는, 예를 들어, 비제한적으로 Kabat 주석이 달린 이러한 CDR은 본원에 개시되어 있는 표 5에 나열된 VHH72-에피토프 결합 ISVD 중 어느 것에 포함되고, 보다 구체적으로는 부위 1에 특이적으로 결합하는 ISVD 또는 제1 ISVD를 포함하는 상기 결합제 또는 결합 도메인은 특정 구현예에서 하기로부터 선택된 다음 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다:
- 서열 번호: 28-37, 또는 141-143에 제공된 CDR1 서열
- 서열 번호: 38-50, 144 또는 145에 제공된 CDR2 서열
- 서열 번호: 51-61, 또는 146에 제공된 CDR3 서열.
본원에 정의된 '결합 부위 1'에 결합하거나 특이적으로 결합할 수 있는 특정 결합제는 서열 번호: 90에 존재하는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 ISVD를 포함하며, 또한 본 명세서에 개시되어 있고, 여기서 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3은 Kabat, MacCallum, IMGT, AbM, Martin 또는 Chothia 중 어느 하나에 따라 주석이 달린다. 따라서 본 명세서의 측면은 또한 이러한 결합제 자체를 개시한다. 특히, 상기 결합제는 서열 번호: 33에 정의/제시된 CDR1, 서열 번호: 144에 의해 정의/제시된 CDR2, 및 서열 번호: 54에 정의/제시된 CDR3을 포함할 수 있다. 상기 결합제는 서열 번호: 90에 존재하는 프레임워크 영역(FR)들 중 적어도 하나, 또는 2개, 3개 또는 전부의 특정 조합, 또는 상기 FR 또는 FR들의 임의의 변이체를 포함하는 것을 추가로 특징으로 할 수 있으며, 여기서 상기 FR 또는 FR들은 Kabat, MacCallum, IMGT, AbM, Martin 또는 Chothia 중 어느 하나에 따라 주석이 달리며, 상기 변이체 FR 또는 FR들은 각각 독립적으로 서열 번호: 90에 존재하는 FR 또는 FR들과 비교하여 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일하거나 최대 10개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환, 결실 또는 추가, 예컨대 바람직하게는 보존적 및/또는 인간화 치환을 가지며, 여기서 상기 FR 또는 FR들은 Kabat, MacCallum, IMGT, AbM, Martin 또는 Chothia 중 어느 하나에 따라 주석이 달린다. 특히, 상기 결합제는 서열 번호: 90에 정의/제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 또는 85%, 바람직하게는 90% 또는 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열(이를 포함하는 ISVD)을 포함할 수 있으며, 이때 비동일성(non-identity) 또는 가변성(variability)은 바람직하게는 FR 아미노산 잔기에 있다. 특히, 이러한 비동일성 또는 가변성은 서열 번호: 90에 의해 정의/제시된 ISVD의 인간화 변이체를 얻기 위해 도입될 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 결합제는 서열 번호: 90에 정의/제시된 ISVD를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
상기 결합제는 사베코바이러스 스파이크 단백질에 결합하거나 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 기능적으로 특성화될 수 있으며, 특히 상기 결합제는 사베코바이러스 스파이크 단백질의 RBD, 또는 이의 일부에 결합하거나 특이적으로 결합할 수 있다. 특히, 상기 결합제는 VHH72, 또는 서열 번호: 2-21 또는 95-98 중 어느 하나에 존재하는 CRD1, CDR2 및 CDR3(여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3은 Kabat, MacCallum, IMGT, AbM, Martin 또는 Chothia 중 어느 하나에 따라 주석이 달림)을 포함하는 결합제와 동일한 에피토프에 결합하거나 특이적으로 결합할 수 있고/있거나 사베코바이러스 스파이크 단백질, RBD 또는 이의 일부와의 결합에 대해, VHH72, 또는 서열 번호: 2-21 또는 95-98 중 어느 하나에 존재하는 CRD1, CDR2 및 CDR3(여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3은 Kabat, MacCallum, IMGT, AbM, Martin 또는 Chothia 중 어느 하나에 따라 주석이 달림)을 포함하는 결합제와 경쟁한다. 보다 구체적으로, 상기 결합제는 서열 번호: 1로 표시된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 잔기 Y369, F377, 및 K378 중 적어도 하나, 바람직하게는 2개 또는 전부에 결합할 수 있고, 선택적으로 서열 번호: 1로 표시된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 잔기 L368, S371, S375, T376, C379 및 Y508 중 하나 이상에 결합할 수 있다.
상기 결합제는 또한 사베코바이러스 스파이크 단백질 또는 RBD와의 결합에 대해 ACE2 수용체와 경쟁한다는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 결합제는 사베코바이러스를 중화할 수 있다는 것, 특히 적어도 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV-1을 중화할 수 있다는 것을 추가로 특징으로 할 수 있다.
이러한 결합제는 1가 형태 또는 다가 형태일 수 있다. 다가 형태에서는 2개 이상의 ISVD들이 직접 또는 링커를 통해 융합될 수 있거나, ISVD가 Fc 도메인에 융합될 수 있다.
또한 본 명세서에서는, 상기 결합제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 (단리된) 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 상기 핵산 분자 또는 상기 벡터를 포함하는 세포, 또는 상기 결합제를 발현하는 세포가 개시되어 있다.
또한 본 명세서에서는, 상기 결합제, 또는 상기 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물; 뿐만 아니라 상기 결합제를 포함하는 진단 키트와 같은 키트가 개시되어 있다.
또한 본 명세서에서는, 의학(medicine)에서 사용하기 위한, 특히 대상체의 수동 면역화에 사용되는 것과 같은 사베코바이러스 감염, 예컨대 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-1 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 결합제, 상기 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터, 또는 상기 기재된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 키트가 개시되어 있다.
따라서, 본원에 기재된 바와 같이 결합 부위 2에 특이적으로 결합하는 조성물의 결합제 또는 결합 도메인, 또는 제2 ISVD는 예를 들어, 이것이 서열 번호: 22-27에 존재하는 VHH3.117 계열 VHH들 중 어느 것 또는 서열 번호: 85-87에 존재하는 VHH3.89 계열 VHH들 중 어느 것에 존재하는 상보성 결정 영역(CDR)들을 포함한다는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이때 CDR은 Kabat, Martin, MacCallum, IMGT, AbM, aHo, Chothia, Gelfand, 또는 Honegger에 따라 주석이 달린다.
보다 상세하게는, 예를 들어, 비제한적으로 Kabat 주석이 달린 이러한 CDR은 본원에 개시된 표 6에 열거된 VHH3.117-에피토프 결합 ISVD들 중 어느 것에 포함되고, 보다 구체적으로는 결합 부위 2에 특이적으로 결합하는 ISVD 또는 제2 ISVD를 포함하는 상기 결합제 또는 결합 도메인은 특정 구현예에서 하기로부터 선택된 다음 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다:
- 서열 번호: 62-63, 또는 131-132에 제공된 CDR1 서열
- 서열 번호: 64-67, 또는 133-134에 제공된 CDR2 서열
- 서열 번호: 68-69, 또는 135-137에 제공된 CDR3 서열.
대안적으로, 결합 부위 2에 특이적으로 결합하는 상기 결합제 또는 결합 도메인은, 각각 서열 번호: 70, 71 및 72로 표시된 바와 같은 VHH3.117 계열의 (공통) CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 ISVD, 특히 제2 ISVD, 또는 이의 임의의 인간화 변이체, 특히 CDR3 서열이 서열 번호: 72와 비교하여 2개의 치환을 포함하고, 보다 구체적으로는 2개의 메티오닌 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 이의 인간화 변이체이거나 이를 포함한다.
VHH3.117 계열에 대한 상기 공통 CDR은 CDR1: IXDMGW로 보다 구체적으로 정의되며, 이때 2번 위치의 X(Xaa)는 S(Ser, 세린) 또는 N(Asn, 아스파라긴)(서열 번호: 70)이다. 보다 상세하게는:
CDR1은 ISDMGW(서열 번호: 62; VHH3.117, VHH3.92, VHH3.94 및 VHH3.180에 포함됨) 또는 INDMGW(서열 번호: 63; VHH3.42에 포함됨)로 정의될 수 있다;
CDR2: TITKXGXTNYAXSXXG, 이때 5번 위치의 X(Xaa)는 T(Thr, 트레오닌) 또는 S(Ser, 세린)이고, 7번 위치의 X(Xaa)는 S(Ser, 세린) 또는 N(Asn, 아스파라긴)이며, 12번 위치의 X(Xaa)는 D(Asp, 아스파르트산) 또는 N(Asn, 아스파라긴)이고, 14번 위치의 X(Xaa)는 A(Ala, 알라닌) 또는 V(Val, 발린)이고, 15번 위치의 X(Xaa)는 Q(Gln, 글루타민) 또는 K(Lys, 라이신)이다(서열 번호: 71). 보다 상세하게는, CDR2는 TITKTGSTNYADSAQG(서열 번호: 64; VHH3.117 및 VHH3.180에 포함됨), TITKTGNTNYADSAQG(서열 번호: 65, VHH3.92에 포함됨), TITKSGSTNYANSAQG(서열 번호: 66; VHH3.94에 포함됨), 또는 TITKTGSTNYADSVKG(서열 번호: 67; VHH3.42에 포함됨)로 정의될 수 있다;
CDR3: WLXYGMGPDYYGME, 이때 3번 위치의 X(Xaa)는 P(Pro, 프롤린) 또는 L(Leu, 류신)이다(서열 번호: 72). 보다 상세하게는, CDR3은 WLPYGMGPDYYGME(서열 번호: 68; VHH3.117, VHH3.92, VHH3.94 및 VHH3.42에 포함됨) 또는 WLLYGMGPDYYGME(서열 번호: 69; VHH3.180에 포함됨)로 정의될 수 있다.
결합 부위 2에 특이적으로 결합하는 상기 결합제 또는 결합 도메인은 또한, 각각 서열 번호: 138, 139 및 140으로 표시된 바와 같은 VHH3.89 계열의 (공통) CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 ISVD, 특히 제2 ISVD, 또는 이의 임의의 인간화 변이체이거나 이를 포함할 수 있다. VHH3.89 계열에 대한 상기 공통 CDR은 보다 구체적으로 다음과 같이 정의된다:
CDR1: XYXXG, 이때 1번 위치의 X(Xaa)는 D 또는 Y이고; 3번 위치의 X(Xaa)는 D 또는 A이며, 4번 위치의 X(Xaa)는 V 또는 I이다(서열 번호: 138). 보다 상세하게는, CDR1은 YYAIG(서열 번호: 131; VHH3.89 및 VHH3_183에 포함됨) 또는 DYDVG(서열 번호: 132; VHH3C_80에 포함됨)로 정의될 수 있다;
CDR2: RIXSSDGSTYYADSVKG, 이때 3번 위치의 X(Xaa)는 D 또는 E이다(서열 번호: 139). 보다 상세하게는, CDR2는 RIDSSDGSTYYADSVKG(서열 번호: 133; VHH3.89 및 VHH3C_80에 포함됨), RIESSDGSTYYADSVKG(서열 번호: 134; VHH3_183에 포함됨)로 정의될 수 있다;
CDR3: DPIIXGXXWYWT, 이때 5번 위치의 X(Xaa)는 R 또는 Q이고, 7번 위치의 X(Xaa)는 R, S 또는 H이며, 8번 위치의 X(Xaa)는 N 또는 S이다(서열 번호: 140). 보다 상세하게는, CDR3은 DPIIQGRNWYWT(서열 번호: 135; VHH3.89에 포함됨), 또는 DPIIQGSSWYWT(서열 번호: 136, VHH3_183에 포함됨), 또는 DPIIRGHNWYWT(서열 번호: 137, VHH3C_80에 포함됨)로 정의될 수 있다.
추가의 특정 구현예에서, 상기 열거된 CDR을 포함하는 ISVD에 의해 정의된 바와 같은 상기 결합제 또는 결합 도메인은 본원에 기재된 바와 같이 이의 기능적 변이체(상기 변이체는 여전히 동일하거나 매우 유사한 결합 및 중화 특성을 제공한다는 것을 특징으로 함) 및/또는 이의 인간화 변이체로 제공된다.
추가의 특정 구현예에서, 상기 결합제 또는 결합 도메인은 VHH72 계열의 VHH들, 또는 VHH72와 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 VHH72와 경쟁하는 본원에 기재된 추가 VHH 계열들로 표시되고, 서열 번호: 2-21, 90 또는 서열 번호: 95-98에 제시된 바와 같은 결합 부위 1에 특이적으로 결합하는 ISVD 또는 제1 ISVD, 또는 상기 서열 번호: 2-21, 90 또는 서열 번호: 95-98로 표시된 상기 원래 VHH 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 이의 인간화 변이체를 포함하고, 이때 CDR들은 동일하고 상기 90% 동일성은 예를 들어 서열 번호: 2-21, 90 또는 서열 번호: 95-98 중 어느 것에 표시된 원래 VHH 서열의 FR1 전체 길이와 90% 동일한 변이체의 FR1, 및 서열 번호: 2-21, 90 또는 서열 번호: 95-98 중 어느 것에 표시된 원래 VHH 서열의 FR2 전체 길이와 90% 동일한 변이체의 FR2, 및 서열 번호: 2-21, 90 또는 서열 번호: 95-98 중 어느 것에 표시된 원래 VHH 서열의 FR3 전체 길이와 90% 동일한 변이체의 FR3, 및 서열 번호: 2-21, 90 또는 서열 번호: 95-98 중 어느 것에 표시된 원래 VHH 서열의 FR4 전체 길이와 90% 동일한 변이체의 FR4에 대해 계산되고/되거나 대안적으로 CDR들은 동일하지만, 전체 길이 서열은 원래 VHH 서열과 적어도 90% 동일하다.
추가의 특정 구현예에서, 상기 결합제 또는 결합 도메인은 VHH3.117 계열의 VHH들, 또는 VHH3.117과 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 VHH3.117과 경쟁하는 본원에 기재된 추가 VHH 계열들로 표시되고, 특정 구현예에서 VH3.117 계열 구성원들에 대해 서열 번호: 22-27에 제시되고, VHH3.89 계열 구성원들에 대해 서열 번호: 85-87에 제시된 바와 같은 결합 부위 2에 특이적으로 결합하는 ISVD 또는 제2 ISVD, 또는 상기 서열 번호: 22-27 또는 서열 번호: 85-87로 표시된 상기 원래 VHH 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 이의 인간화 변이체를 포함하고, 이때 CDR들은 동일하고 상기 90% 동일성은 예를 들어 서열 번호: 22-27 또는 서열 번호: 85-87 중 어느 것에 표시된 원래 VHH 서열의 FR1 전체 길이와 90% 동일한 변이체의 FR1, 및 서열 번호: 22-27 또는 서열 번호: 85-87 중 어느 것에 표시된 원래 VHH 서열의 FR2 전체 길이와 90% 동일한 변이체의 FR2, 및 서열 번호: 22-27 또는 서열 번호: 85-87 중 어느 것에 표시된 원래 VHH 서열의 FR3 전체 길이와 90% 동일한 변이체의 FR3, 및 서열 번호: 22-27 또는 서열 번호: 85-87 중 어느 것에 표시된 원래 VHH 서열의 FR4 전체 길이와 90% 동일한 변이체의 FR4에 대해 계산되고/되거나 대안적으로 CDR들은 동일하지만, 전체 길이 서열은 원래 VHH 서열과 적어도 90% 동일하다.
추가 측면에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드성 또는 폴리펩티드 결합제는 상기 정의된 임의의 ISVD에 포함된 하나 이상의 프레임워크 영역(FR)을 포함할 수 있다.
추가 구현예에서, 상기 폴리펩티드성 또는 폴리펩티드 결합제는 서열 번호: 2-27, 90 또는 서열 번호: 95-98 또는 서열 번호: 85-87의 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖거나, 서열 번호: 2-27, 90 또는 서열 번호: 95-98 또는 서열 번호: 85-87의 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖거나, 서열 번호: 2-27, 90 또는 서열 번호: 95-98 또는 서열 번호: 85-87의 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 97% 동일성을 갖는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 이러한 비동일성 또는 가변성은 FR 아미노산 잔기 내의 비동일성 또는 가변성으로 한정된다. 특히, 이러한 비동일성 또는 가변성은 서열 번호: 2-27, 90 또는 서열 번호: 95-98 또는 서열 번호: 85-87의 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 중 어느 것에 정의되거나 제시된 ISVD의 인간화 변이체를 얻기 위해 도입될 수 있다. 특히, 이러한 인간화 변이체는 원래 ISVD의 기능적 오솔로그(orthologue)이며, 여기서 기능은 본원에 기재된 바와 같이 정의된다.
특정 구현예에서, 상기 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 RBD의 에피토프 1 및 에피토프 2에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 결합 도메인, 또는 하나 이상의 제1 ISVD 및 하나 이상의 제2 ISVD를 포함하는 결합제를 포함하며, 이때 상기 결합제 또는 결합 도메인은 단일 또는 하나의 분자 또는 제제를 구성한다. 실제로, 본원에 정의된 결합 부위 1 및 2에 결합할 수 있는 조성물의 상기 단일 결합제는 이중특이적 또는 2중 파라토프 분자이거나, 심지어 다중특이적 또는 다중 파라토프 분자 또는 제제일 수도 있다.
또 다른 구현예는 에피토프 1 및/또는 에피토프 2에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 ISVD(또는 본원에 기재된 바와 같은 이의 변이체 또는 인간화 형태), 특히 하나 이상의 제1 ISVD 및 하나 이상의 제2 ISVD를 포함하는 상기 폴리펩티드성 또는 폴리펩티드 결합제에 관한 것으로, 이때 적어도 하나 이상의 (제1 및 제2) ISVD(또는 본원에 기재된 이의 변이체 또는 인간화 형태)는 직접 연결에 의해 또는 스페이서 또는 링커, 예컨대 펩티드 링커를 통한 융합에 의해 이중특이적 또는 다중특이적 제제에 연결된다.
또 다른 구현예에서, 상기 폴리펩티드성 또는 폴리펩티드 결합제는 에피토프 1 및/또는 에피토프 2에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 ISVD(또는 본원에 기재된 바와 같은 이의 변이체 또는 인간화 형태), 특히 하나 이상의 제1 ISVD 및 하나 이상의 제2 ISVD를 포함하고, 적어도 하나 이상의(제1 및 제2) ISVD(또는 본원에 기재된 바와 같은 이의 변이체 또는 인간화 형태)는 항체의 단편 결정화 가능 영역(Fc 영역)으로 본원에서 정의되는 Fc 도메인에 결합되거나 융합되며, 이는 Fc 수용체라고 불리는 세포 표면 수용체 및 보체 시스템의 일부 단백질과 상호작용하는 것으로 알려진 꼬리 영역이다. 상기 Fc 도메인은 항체의 두 중쇄의 두 번째 및 세 번째 불변 도메인으로부터 유래된 2개의 동일한 단백질 단편들로 구성된다. 기존의 모든 항체들은 Fc 도메인을 포함하므로, Fc 도메인 융합체는 IgG, IgA 및 IgD 항체 Fc 영역, 보다 더 구체적으로는 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래되거나 이의 변이체로서 Fc 도메인을 포함할 수 있다. IgG2의 힌지 영역은 ISVD 융합 작제물을 생성하기 위해 인간 IgG1의 힌지로 대체될 수 있으며, 그 반대도 가능하다. ISVD를 IgG1 및 IgG2 Fc 도메인과 같은 Fc 도메인에 융합시키는 데 사용되는 추가 링커는 (G4S)2-3 링커 및 20GS 링커를 포함한다. 또한, M257Y/S259T/T261E(YTE로도 알려짐) 또는 LS 변이체(N434S와 결합된 M428L)와 같이 알려진 반감기 연장부(extension)를 갖는 Fc 변이체가 사용될 수도 있다. 이러한 돌연변이는 신생아 수용체(FcRn)에 대한 기존 항체의 Fc 도메인의 결합을 증가시킨다.
일부 구현예에서, Fc 영역은 세포에서 공발현될 때 서로 다른 2개의 Fc 함유 폴리펩티드 사슬들의 이종이량체 형성을 촉진하는 "놉" 및 "홀"을 생성하도록 조작된다(U.S. 7,695,963). Fc 영역은 세포에서 공발현될 때 서로 다른 2개의 Fc 함유 폴리펩티드의 동종이량체 형성을 억제하면서 이종이량체 형성을 촉진하기 위해 정전기 조정(electrostatic steering)을 사용하도록 변경될 수 있다(WO 09/089,004).
본원에 언급된 용어 "놉-인투-홀" 또는 "KiH" 기술은 일반적으로 두 폴리펩티드가 상호작용하는 계면에서 하나의 폴리펩티드에 돌기(놉)를 도입하고, 다른 폴리펩티드에 공동(홀)을 도입하여 시험관내 또는 생체내에서 두 폴리펩티드를 함께 짝짓는 기술을 지칭한다. "돌기" 또는 "놉"은 이종다량체를 안정화시켜 예를 들어 동종다량체 형성보다 이종다량체 형성을 선호하도록 첫 번째 폴리펩티드의 계면으로부터 돌출되어 인접한 계면(즉, 두 번째 폴리펩티드의 계면)의 보상 공동 또는 홀에 위치할 수 있는 적어도 하나의 아미노산 측쇄를 지칭할 수 있다. 다중특이적 항체를 생산하는 방법으로서 놉 인투 홀을 사용하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. Fc 도메인에 KiH를 갖는 다중특이적 항체는 각 Fc 도메인에 연결된 하나 이상의 서로 다른 ISVD를 추가로 포함할 수 있다.
특정한 추가 구현예에서, 하나 이상의 ISVD, 특히 하나 이상의 제1 ISVD 및 하나 이상의 제2 ISVD(또는 본원에 기재된 이의 변이체 또는 인간화된 형태)를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드성 또는 폴리펩티드 결합제는 "다가" 또는 "다중특이적" 형태이고, 화학적으로 또는 재조합 DNA 기술에 의해, 2개 이상의 동일하거나 상이한 1가 ISVD들(또는 본원에 기재된 이들의 변이체들 또는 인간화된 형태들)을 함께 결합시킴으로써 형성된다. 상기 다가 형태들은 빌딩 블록을 직접 또는 링커를 통해 연결하거나 빌딩 블록을 Fc 도메인 암호화 서열과 융합시킴으로써 형성될 수 있다. 다가 작제물의 비제한적인 예로는 "2가" 작제물, "3가" 작제물, "4가" 작제물 등이 포함된다. 다가 작제물 내에 포함된 ISVD들(또는 본원에 기재된 이들의 변이체들 또는 인간화된 형태들)은 동일하거나 상이할 수 있다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 ISVD들(또는 본원에 기재된 이들의 변이체들 또는 인간화된 형태들)은 "다중특이적" 형태, 형식 또는 작제물이고, 둘 이상의 ISVD들을 함께 결합시킴으로써 형성되되, ISVD들 중 적어도 하나는 상이한 특이성을 갖는다. 다중특이적 작제물의 비제한적 예로는 "이중특이적" 작제물, "삼중특이적" 작제물, "사중특이적" 작제물 등이 포함된다. 이를 더 설명하기 위해, 본 발명의 임의의 다가 또는 다중특이적(본원에 정의됨) ISVD는 스파이크 단백질과 같은 둘 이상의 동일한 항원에 대해 지시될 수 있지만, 본원에 정의된 결합 부위 1 및 2와 같은 결합 부위의 비경쟁 또는 상이한 에피토프에 결합하여 2중 파라토프 제제를 제공하거나, 대안적으로 다른 항원, 예를 들어 코로나 RBD에 대한 항원 및 혈청 알부민 또는 SpA에 대한 반감기 연장부로서의 항원에 대해 지시될 수 있다. 본 발명의 다가 또는 다중특이적 ISVD는 또한 원하는 코로나 RBD 상호작용 및/또는 이러한 다가 또는 다중특이적 면역글로불린 단일 가변 도메인들을 사용하여 얻을 수 있는 임의의 다른 원하는 특성 또는 원하는 특성들의 조합에 대해 증가된 결합력 및/또는 개선된 선택성을 나타낼 수 있다(또는 이를 위해 조작 및/또는 선별될 수 있다).
특정 구현예에서, 하나 이상의 제1 ISVD는 하나 이상의 제2 ISVD에 직접 또는 링커를 통해 연결(link), 융합 또는 연결(connect)되어 있고, 바람직하게는 상기 결합제는 하나의 제2 ISVD에 직접 또는 링커를 통해 연결, 융합 또는 연결되어 있는 하나의 제1 ISVD를 포함한다. ISVD들을 연결하기 위한 적합한 링커의 비제한적인 예에는 (G4S)n과 같은 펩티드 링커가 포함되며, 이때 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 본원에서 "헤드-투-테일 융합체"로도 지칭되는 이러한 다중특이적 결합제의 개략도가 도 13a에 도시되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이 2개의 보존된 결합 부위들에 결합할 수 있는 이러한 다중특이적 결합제, 특히 이중특이적 결합제의 보다 구체적인 예는 예를 들어, 표 3 및 서열 번호: 76-93, 또는 이의 임의의 기능적 변이체, 또는 이와 적어도 90% 동일성을 갖는 변이체, 또는 이의 인간화 변이체에 제공되지만, 이에 제한되지 않는다.
추가 구현예에서, 이러한 2가 또는 이중특이적 결합제의 C-말단은, 예를 들어, 링커에 의해 Fc 도메인에 융합될 수 있으며, 이 작제물은 숙주에서 발현 시 Fc 부분의 힌지 영역에 있는 이황화 가교를 통해 다가 또는 다중특이적 결합제, 특히 4가 이중특이적 결합제를 형성한다. 따라서, 특정 구현예에서, 하나 이상의 제1 ISVD는 하나 이상의 제2 ISVD에 직접 또는 링커를 통해 연결(link), 융합 또는 연결(connect)되어 다중특이적 결합제를 형성하고, 상기 다중특이적 결합제는 Fc 도메인에 융합된다. 바람직한 구현예에서, 상기 결합제는 Fc 도메인에 융합된 이중특이적 결합제를 포함하며, 이때 상기 이중특이적 결합제는 하나의 제2 ISVD에 직접 또는 링커를 통해 연결(link), 융합 또는 연결(connect)된 하나의 제1 ISVD를 포함한다. 본원에서 "VHH-VHH-Fc 융합체"로도 지칭되는 이러한 다중특이적 결합제의 개략도가 도 13d에 도시되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이 2개의 보존된 결합 부위들에 결합할 수 있는 이러한 다중특이적 결합제, 특히 이중특이적 결합제의 보다 구체적인 예는 예를 들어, 표 9 및 서열 번호: 118, 또는 이의 임의의 기능적 변이체, 또는 이와 적어도 90% 동일성을 갖는 변이체, 또는 이의 인간화 변이체에 제공되지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 특정 구현예에서, 하나 이상의 제1 ISVD는 Fc 도메인의 N-말단에 융합되어 있고, 하나 이상의 제2 ISVD는 Fc 도메인의 C-말단에 융합되어 있거나, 하나 이상의 제1 ISVD는 Fc 도메인의 C-말단에 융합되어 있고, 하나 이상의 제2 ISVD는 Fc 도메인의 N-말단에 융합되어 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 결합제는 Fc 도메인의 N-말단에 융합된 하나의 제1 ISVD 및 Fc 도메인의 C-말단에 융합된 하나의 제2 ISVD를 포함하거나, 하나의 제1 ISVD가 Fc 도메인의 C-말단에 융합되고, 하나의 제2 ISVD가 Fc 도메인의 N 말단에 융합되어 있다. 본원에서 "VHH-Fc-VHH 융합체" 또는 "문랜더(moonlander)"로도 지칭되는 이러한 다중특이적 결합제의 개략도가 도 13e에 도시되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이 2개의 보존된 결합 부위들에 결합할 수 있는 이러한 다중특이적 결합제, 특히 이중특이적 결합제의 보다 구체적인 예는 예를 들어, 표 10 및 서열 번호: 119-121, 또는 이의 임의의 기능적 변이체, 또는 이와 적어도 90% 동일성을 갖는 변이체, 또는 이의 인간화 변이체에 제공되지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 제1 ISVD는 놉을 포함하는 Fc 도메인에 융합되고, 하나 이상의 제2 ISVD는 홀을 포함하는 Fc 도메인에 융합되거나, 하나 이상의 제1 ISVD는 홀을 포함하는 Fc 도메인에 융합되고, 하나 이상의 제2 ISVD는 놉을 포함하는 Fc 도메인에 융합된다. 본원에서 "놉-인투-홀" 또는 "KiH" 또는 "놉-인투-홀 VHH-Fc 융합체"로도 지칭되는 이러한 다중특이적 결합제의 개략도가 도 13c에 도시되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이 2개의 보존된 결합 부위들에 결합할 수 있는 이러한 다중특이적 결합제, 특히 이중특이적 결합제의 보다 구체적인 예는 예를 들어, 표 8 및 놉-인-홀 서열 쌍 서열 번호: 107/108, 109/110, 111/112, 113/114, 115/116 및 113/117, 또는 이의 임의의 기능적 변이체, 또는 이와 적어도 90% 동일성을 갖는 변이체, 또는 이의 인간화 변이체에 제공되지만, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 각각 에피토프 1 및 2에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 폴리펩티드성 또는 폴리펩티드 결합제를 포함하거나, 두 부위, 즉 에피토프 1 및 2에 특이적으로 결합하는 단일 결합제를 포함하는 조성물을 제공하며, 이때 에피토프 1 및 2에 대한 파라토프는 1가, 다가 또는 다중특이적 형태의 본 발명에 따른 ISVD(또는 본원에 기재된 바와 같은 이의 변이체 또는 인간화 형태)의 아미노산으로 구성된다. 따라서, 본원에 기재된 ISVD(또는 본원에 기재된 이의 변이체 또는 인간화 형태) 또는 이의 일부를 포함하는 1가, 다가 또는 다중특이적 폴리펩티드성 또는 폴리펩티드 결합제가 비제한적 예로서 본원에 포함된다.
특히, 본원에 기재된 제1 ISVD 또는 제2 ISVD와 같은 본원에 기재된 단일 ISVD(또는 이의 변이체 또는 인간화 형태)는 이의 C-말단에서 IgG Fc 도메인에 융합되어 2가 형식의 사베코바이러스 결합제를 생성할 수 있으며, 이때 상기 ISVD들(또는 본원에 기재된 이의 변이체들 또는 인간화 형태들) 중 2개는 IgG Fc 부분의 힌지 영역에서 이황화 가교를 통해 중쇄 단독-항체-유형 분자를 형성한다. 상기 인간화 형태는 IgG 서열 내의 다른 치환들 중에서도, 라이신의 C-말단 결실, 힌지 영역에서의 변경 또는 절단, 본원에 기재된 바와 같은 LALA 또는 LALAPG 돌연변이(Schlothauer, et al. 2016, Protein Eng. Des. Sel. PEDS 29, 457-466)와 같은 당업계에 공지된 IgG 인간화 변이체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
따라서 추가의 특정 구현예는 임의의 상기 결합제, 보다 구체적으로는 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드성 이중특이적 또는 4가 이중특이적 결합제를 포함하는 상기 조성물에 관한 것으로, 이는 에피토프 1에 대한 적어도 하나의 결합제, 예를 들어 VHH72(또는 이의 변이체) 또는 VHH3.83(또는 이의 변이체)으로 표시된 ISVD와 같은 본원에 기재된 바와 같은 제1 ISVD, 및 에피토프 2에 대한 적어도 하나의 결합제, 예를 들어 VHH3.117(또는 이의 변이체) 또는 VHH3.89(또는 이의 변이체)로 표시된 ISVD와 같은 본원에 기재된 제2 ISVD로 구성된다. 상기 2개의 보존된 에피토프들에 특이적으로 결합하는 상기 다중특이적 결합제를 포함하는 이러한 조성물의 보다 구체적인 예는 예를 들어, 표 3 및 서열 번호: 76-84 및 91-93, 또는 이의 임의의 기능적 변이체, 또는 이와 적어도 90% 동일성을 갖는 변이체, 또는 이의 인간화 변이체에 제공되지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 식별된 폴리펩티드 결합제 또는 결합 도메인 또는 단일 결합제를 암호화하는 핵산 분자, 예컨대 단리된 핵산, (단리된) 키메라 유전자 작제물, 발현 카세트, 코딩 서열과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터(예컨대 발현 또는 클로닝 벡터)를 제공한다.
본 발명의 추가 한 측면은 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 결합제(들) 또는 결합 도메인 또는 이의 일부, 예컨대 ISVD 또는 이의 일부를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 따라서, 숙주 세포는 상기 폴리펩티드 결합제 또는 결합 도메인을 암호화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 숙주 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 숙주 세포는 또한 단리된 DNA 분자, 본 발명의 폴리펩티드 결합제를 암호화하는 핵산 분자를 함유하도록 유전적으로 변형된 세포를 포함하는 재조합 숙주 세포일 수 있다. 상기 ISVD를 생성하기 위해 사용될 수 있는 대표적인 숙주 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 식물 세포, 및 동물 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 결합제의 생산에 적합한 박테리아 숙주 세포는 에스케리키아 종(Escherichia spp.) 세포, 바실러스 종(Bacillus spp.) 세포, 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spp.) 세포, 에르위니아 종(Erwinia spp.) 세포, 클렙시엘라 종(Klebsiella spp.) 세포, 세라티아 종(Serratia spp.) 세포, 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.) 세포, 및 살모넬라 종(Salmonella spp.) 세포를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 효모 숙주 세포는사카로마이세스(Saccharomyces), 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피치아(예를 들어, 피치아 파스토리스), 한세눌라(Hansenula)(예를 들어, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)), 야로위아(Yarowia), 슈와니오마이세스(Schwaniomyces), 시조사카로마이세스, 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces) 등에 속하는 종을 포함한다. 사카로마이세스 세레비시아에, 에스, 칼스버겐시스(S. carlsbergensis) 및 케이. 락티스(K. lactis)가 가장 일반적으로 사용되는 효모 숙주이며, 편리한 진균 숙주이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 동물 숙주 세포는 곤충 세포 및 포유동물 세포(가장 특히 차이니즈 햄스터(예를 들어 CHO) 및 인간 세포주, 예컨대 HeLa에서 유래되는 세포)를 포함한다. 예시적인 곤충 세포주는 Sf9 세포, 배큘로바이러스-곤충 세포 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(예를 들어, Jarvis, Virology Volume 310, Issue 1, 25 May 2003, Pages 1-7 검토). 대안적으로, 숙주 세포는 또한 형질전환 동물 또는 식물일 수 있다.
본 발명의 추가 측면은 본원에 기재된 바와 같은 결합제(들) 및/또는 상기 결합제를 암호화하는 핵산, 및/또는 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 약제 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특히, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 조성물이고; 이러한 조성물은 특정 구현예에서 (약제학적으로) 적합하거나 허용되는 담체, 희석제, 안정화제 등을 추가로 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 의약(medicine) 또는 약제(medicament)로 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 스파이크 단백질의 에피토프 1 및 2에 특이적으로 결합하는 상기 하나 이상의 결합제 또는 결합 도메인을 포함하는 조성물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 결합제, 상기 결합제를 암호화하는 핵산, 및/또는 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
대안적으로, 의약 또는 약제의 제조에 있어서 본원에 기재된 바와 같은 상기 조성물, 결합제 또는 상기 결합제를 암호화하는 핵산의 용도, 또는 본원에 기재된 바와 같은 결합제, 상기 결합제를 암호화하는 핵산, 및/또는 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 약제학적 조성물의 용도도 고려된다. 특히, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 결합제 또는 상기 결합제를 암호화하는 핵산, 또는 본원에 기재된 바와 같은 결합제, 상기 결합제를 암호화하는 핵산, 및/또는 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 약제 또는 약제학적 조성물은 수동 면역화에 사용하거나, 사베코바이러스에 감염된 대상체를 치료하는 데 사용하거나, 사베코바이러스에 의한 대상체의 감염을 예방하는 데 사용하거나, 또는 사베코바이러스에 의한 감염으로부터 대상체를 보호하는 데 사용하기 위한 것이다. 수동 면역화에 사용하는 경우, 대상체는 사베코바이러스(치료적 수동 면역화)에 감염되었거나 사베코바이러스에 감염되지 않았을 수 있다(예방적 수동 면역화).
본 발명의 추가 측면은 사베코바이러스 감염으로 고통받는/사베코바이러스에 감염된/사베코바이러스 감염에 걸린 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 상기 결합제(들) 또는 상기 결합제를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하거나, 또는 본원에 기재된 바와 같은 결합제 또는 상기 결합제를 암호화하는 핵산을 포함하는 약제 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 사베코바이러스에 의한 감염으로부터 대상체를 보호하거나 사베코바이러스에 의한 대상체의 감염을 예방하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 감염 전에 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 결합제 또는 상기 결합제를 암호화하는 핵산을 투여하거나, 또는 감염 전에 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 결합제 또는 상기 결합제를 암호화하는 핵산을 포함하는 약제 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
특히, 위의 의학적 측면에서 사베코바이러스는 코로나바이러스, 보다 상세하게는 인수공통 코로나바이러스, 보다 더 상세하게는 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-1, 보다 더 상세하게는 SARS-CoV-2 변이체 예컨대 위치 N439, S477, E484, N501 또는 D614에서의 변이체(서열 번호: 1에 정의된 SARS-CoV-2 스파이크 아미노산 서열 기준)이다. 특히, 치료는 사베코바이러스 감염에 걸린 대상체의 수동 면역화를 지칭한다. 특히, 사베코바이러스에 의한 감염의 예방은, 심각한 질병 증상의 발병에 가장 취약한 것으로 알려진 대상체가 예컨대 감염을 전반적으로 예방하거나 심각한 질병 증상의 발병이나 발생을 예방하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 결합제 또는 상기 결합제를 암호화하는 핵산으로 예방적으로 치료(방지적 또는 예방적 면역화)될 수 있는, 예를 들어 유행병 또는 대유행 상태의 경우에 유용하다. 방지 또는 예방 효과를 달성하기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 결합제 또는 상기 결합제를 암호화하는 핵산은 1주 또는 2주 간격과 같이 대상체에게 여러 번 투여될 필요가 있을 수 있으며; 간격은 결합제 또는 핵산의 약동학적 거동 또는 특성(반감기)에 의해 결정된다. 더 상세하게는, 대상체는 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-1에 감염되기 쉬운 인간 대상체와 같은 사베코바이러스에 감염되기 쉬운 포유동물이다.
또한, 특히 위의 의학적 측면과 관련하여, 본원에 기재된 바와 같은 결합제를 암호화하는 핵산은 예를 들어 유전자 요법 설정 또는 RNA 백신접종 설정에서 사용될 수 있다.
추가의 특정 구현예는 본원에 기재된 바와 같은 (약제학적) 조성물 또는 결합제의 단일 용량이 투여되고, 단일 용량이 0.5mg/kg 내지 25mg/kg의 범위 내에 있는 예방적 치료에 관한 것이다. 대안적으로, (약제학적) 조성물 또는 결합제를 이용한 치료적 치료(therapeutic treatment)가 고려되며, 이때 0.5mg/kg 내지 25mg/kg의 범위 내에 있는 단일 용량이 고려된다. 예방적 및 치료적 설정 모두에서, 다수의 용량이 투여될 필요가 있을 수 있고, 2회 후속 용량 사이의 시간 간격은 대상체의 순환계에서 상기 조성물 또는 결합제의 반감기에 의해 결정된다.
또한 특히 위의 의학적 측면과 관련하여, 상기 조성물, 결합제, 핵산 또는 약제학적 조성물은 정맥내 주사, 피하 주사 또는 비강내로, 또는 대안적으로 흡입 또는 폐 전달을 통해 대상체에게 투여될 수 있다.
또한, 특히 위의 의학적 측면과 관련하여, 상기 조성물, 결합제, 핵산 또는 약제학적 조성물의 치료적 유효량이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되며; 이러한 치료적 유효량의 투여는 사베코바이러스에 의한 감염을 억제 또는 예방하고/하거나 사베코바이러스에 의한 감염을 치유한다.
본 발명의 추가 측면은 사베코바이러스 감염을 진단하는 데 사용하거나, 진단제로서 사용하거나, 또는 진단제 또는 진단 키트, 예컨대 시험관내 진단제 또는 진단 키트의 제조에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 결합제에 관한 것이다. 대안적으로, 진단제/시험관내 진단제의 제조에 있어서 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 결합제의 사용이 고려된다. 특히, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 결합제는 사베코바이러스 감염에 감염된 것으로 의심되는 대상체와 같은 대상체로부터 얻은 샘플과 같은 샘플에서 사베코바이러스의 존재(또는 부재)를 검출하는 데 사용하기 위한 것이다. 본원에 기재된 바와 같은 결합제 또는 범-특이적 결합제를 암호화하는 핵산, 또는 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터도 마찬가지로 진단제 또는 진단 키트, 예컨대 시험관내 진단제 또는 진단 키트의 제조에 사용될 수 있거나 또는 이의 제조에 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 추가 측면은 사베코바이러스 감염에 감염된 것으로 의심되는 대상체와 같은 대상체로부터 얻은 샘플과 같은 샘플에서 사베코바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 일반적으로 샘플을 얻는 단계, 상기 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 결합제와 접촉시키는 단계, 및 상기 결합제와 사베코바이러스의 결합을 검출, 결정, 평가, 검정, 식별 또는 측정하는 단계를 포함한다.
특히, 위의 진단 측면에서, 사베코바이러스는 코로나바이러스, 보다 상세하게는 인수공통 코로나바이러스, 보다 더 상세하게는 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-1이다. 더 상세하게는, 대상체는 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-1에 감염되기 쉬운 인간 대상체와 같은 사베코바이러스에 감염되기 쉬운 포유동물이다.
더 상세하게는, 위의 진단 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 결합제는 이에 융합되거나, 결합되거나, 커플링되거나, 연결되거나, 복합체화되거나, 킬레이트화되는 검출가능한 모이어티를 포함한다. "검출가능한 모이어티"는 일반적으로 신호를 방출하거나 적절한 자극시 신호를 방출할 수 있는 모이어티, 또는 추가 분자(예를 들어, 표지된 항체에 의해 특이적으로 인식되는 친화성 태그와 같은 태그)와의 결합 또는 상호작용을 통해 검출될 수 있거나, 임의의 수단(바람직하게는 검출이 생체내/인체 내부에서 발생하는 경우 비침습적 수단)에 의해 검출가능한 모이어티를 지칭한다. 또한, 검출가능한 모이어티는 컴퓨터화된 이미지 구성을 허용할 수 있으므로, 검출가능한 모이어티는 이미징제(imaging agent)로 불릴 수 있다. 검출가능한 모이어티는 형광 에미터(emitter), 인광 에미터, 양전자 에미터, 방사성 에미터(radioemitter) 등을 포함하지만, 이러한 모이어티는 효소(기질을 측정가능하게 전환시킬 수 있음) 및 분자 태그도 포함하므로 에미터로 제한되지 않는다. 방사성 에미터/방사성 라벨의 예로는 68Ga, 110mIn, 18F, 45Ti, 44Sc, 47Sc, 61Cu, 60Cu, 62Cu, 66Ga, 64Cu, 55Ca, 72As, 86Y, 90Y, 89Zr, 125I, 74Br, 75Br, 76Br, 77Br, 78Br, 111In, 114mIn, 114In, 99mTc, 11C, 32Cl, 33Cl, 34Cl, 123I, 124I, 131I, 186Re, 188Re, 177Lu, 99Tc, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 225Ac, 153Sm, 및 67Ga가 포함된다. 형광 에미터는 시아닌 염료(예를 들어, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5), FITC, TRITC, 쿠마린, 인돌레닌 기반 염료, 벤조인돌레닌 기반 염료, 페녹사진, BODIPY 염료, 로다민, Si-로다민, Alexa 염료, 및 이들 중 어느 것의 유도체를 포함한다. 친화성 태그, 예컨대 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 폴리(His)(예를 들어, 6x His 또는 His6), 비오틴 또는 스트렙타비딘, 예컨대 Strep-tag®, Strep-tag II® 및 Twin-Strep-tag®; 가용화 태그(solubilizing tag), 예컨대 티오레독신(TRX), 폴리(NANP) 및 SUMO; 크로마토그래피 태그, 예컨대 FLAG-태그; 에피토프 태그, 예컨대 V5-태그, myc-태그 및 HA-태그; 형광 표지 또는 태그(즉, 형광색소/형광단), 예컨대 형광 단백질(예를 들어, GFP, YFP, RFP 등); 발광성 표지 또는 태그, 예컨대 루시퍼라제, 생물발광성 또는 화학발광성 화합물(예컨대, 루미날, 이소루미놀, 테로마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄염, 옥살레이트 에스테르, 디옥세탄 또는 GFP 및 이의 유사체); 인광성 표지; 금속 킬레이트제; 및 (기타) 효소 표지(예를 들어, 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 우레아제 또는 글루코스 옥시다제).
검출가능한 모이어티를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 결합제는 예를 들어 시험관내, 생체내 또는 인시츄(in situ) 검정(ELISA, RIA, EIA 및 기타 "샌드위치 검정" 등과 같은 그 자체로 알려진 면역검정 포함)에 사용될 뿐만 아니라 특정 표지의 선택에 따라 생체내 이미징 목적으로도 사용될 수 있다. 특정 구현예는 바이러스 또는 상기 바이러스의 스파이크 단백질의 검출을 위한, 선택적으로 표지된 형태의 조성물 또는 결합제의 용도를 개시하고 있으며, 이때 상기 바이러스는 계통군 1a, 1b, 2 및/또는 계통군 3 박쥐 SARS 관련 사베코바이러스, 예를 들어 SARS-Cov-2, GD-천산갑, RaTG13, WIV1, LYRa11, RsSHC014, Rs7327, SARS-CoV-1, Rs4231, Rs4084, Rp3, HKU3-1, 또는 BM48-31 바이러스 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 대안적 측면에서, 선택적으로 표지가 있는 본원에 기재된 임의의 결합제, 또는 상기 결합제를 암호화하는 임의의 핵산 분자, 또는 본원에 기재된 임의의 조성물, 또는 벡터가 또한 본원에 기재된 바와 같이 코로나 바이러스의 진단제로서 또는 코로나 바이러스의 검출에 사용될 수 있다. 진단 방법은 숙련가에게 알려져 있으며, 대상체로부터 유래된 생물학적 샘플을 포함할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 결합제를 사용하여 바이러스 단백질 또는 입자들을 검출하기 위한 시험관내 방법이 범위 내에 있을 수 있다. 마지막으로, 선택적으로 표지된, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 결합제는 또한 생체내 이미징에 사용하기에 적합할 수 있다.
본 발명의 추가 측면은 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 결합제 또는 상기 결합제를 암호화하는 핵산을 포함하는 키트, 또는 본원에 기재된 바와 같은 결합제 또는 상기 결합제를 암호화하는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
이러한 키트는 본원에 기재된 바와 같은 결합제 또는 상기 결합제를 암호화하는 핵산의 소정량을 포함하는 용기 또는 바이알(약제학적으로 허용되는 용기 또는 바이알과 같은 임의의 적합한 용기 또는 바이알)을 포함하고, 예를 들어 의도된 적응증(사베코바이러스 감염의 예방적 또는 치료적 치료) 및 잠재적인 부작용에 대한 정보를 포함하는 의료 전단지(medical leaflet) 또는 패키지 전단지와 같은 키트 삽입물을 추가로 포함하는 제약 키트(pharmaceutical kit) 또는 약제 키트(medicament kit)를 포함한다. 제약 키트 또는 약제 키트는 예를 들어 본원에 기재된 결합제 또는 상기 결합제를 암호화하는 핵산을 대상체에게 투여하기 위한 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
이러한 키트는 소정량의 본원에 기재된 결합제, 예컨대 검출가능한 모이어티를 포함하는 결합제를 포함하는 용기 또는 바이알(약제학적으로 허용되는 용기 또는 바이알과 같은 임의의 적합한 용기 또는 바이알)을 포함하는 진단 키트를 포함한다. 이러한 진단 키트는 예를 들어 검출가능한 모이어티를 검출하기 위한 하나 이상의 시약 및/또는 예를 들어 샘플에서 사베코바이러스의 검출을 위해 상기 결합제를 사용하는 방법에 대한 지침을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 측면 및 구현예는 아래에 번호가 매겨진 설명에 기재되어 있다:
(1) 서열 번호: 1로 정의된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 잔기 Y369, F377 및 K378 중 적어도 하나를 포함하는 제1 결합 부위, 및 서열 번호: 1로 정의된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 T393, N394, V395 또는 Y396 중 적어도 하나 이상을 포함하는 제2 결합 부위에서 코로나 바이러스 스파이크 단백질 RBD에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합제 또는 결합 도메인을 함유하는 조성물. 실제로 상기 제1 결합 부위 및 제2 결합 부위는 결합제 또는 결합 도메인이 각각 VHH72(Wrap et al. 2020; Cell 184:1004-1015; PCT/EP2021/052885) 및 VHH3.117(본원에 나타낸 바와 같음, EP21166835.5 및 PCT/EP2022/052919)과 특이적으로 상호작용하는 데 필요한 최소 잔기로 정의될 수도 있다. 상기 제1 결합 부위 및 제2 결합 부위는 각각 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2 바이러스들의 중화를 개별적으로 허용하는 이중 결합 영역을 제공하고, 사베코바이러스들 간에 보존되어 있는 코로나 바이러스 스파이크 단백질의 RBD 도메인 상에 결합 영역을 제공하여 돌연변이가 발생해 중화를 피할 확률이 낮아진다.
(2) 서열 번호: 1로 표시된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 잔기 Y369, F377 및 K378을 포함하는 결합 부위 1, 및 잔기 T393, N394, V395 또는 Y396 중 적어도 하나 이상을 포함하는 결합 부위 2에 코로나 바이러스 스파이크 단백질과 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제제를 포함하는 조성물.
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 결합 부위 1이 서열 번호: 1로 표시된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 L368, S371, S375, T376, C379 및/또는 Y508의 아미노산 잔기 중 적어도 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 결합 부위 2가 서열 번호: 1로 표시된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 잔기 R357, K462, F464, E465, R466, S514, E516, 또는 L518 중 적어도 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 조성물. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 서열 번호: 1에 제공된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 잔기 Y369, F377, K378, L368, S371, S375, T376, C379 및/또는 Y508 중 적어도 하나 이상 또는 전부를 포함하는 제1 결합 부위에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합제 또는 결합 도메인, 및 서열 번호: 1로 표시된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 잔기 T393, N394, V395, Y396, R357, K462, F464, E465, R466, S514, E516, 또는 L518 중 적어도 하나 이상을 포함하는 제2 결합 부위에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합제 또는 결합 도메인을 포함한다. 결합 부위 1에 특이적인 상기 결합제 또는 결합 도메인은 RBD의 결합 부위 2에 특이적인 결합제 또는 결합 도메인과 동일한 분자의 일부일 수 있거나, 다른 분자의 일부일 수 있다.
추가의 특정 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 RBD의 결합 부위 1에 특이적으로 결합하는 조성물의 결합제는 RBD와의 결합에 대해 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)와 경쟁하고, 본원에 정의된 바와 같이 스파이크 단백질의 결합 부위 1에 결합될 때 적어도 SARS-CoV-2 및/또는 SARS-CoV-1을 중화시킬 수 있는 결합제를 제공한다. 추가의 특정 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 RBD의 결합 부위 2에 특이적으로 결합하는 조성물의 결합제는 ACE2가 RBD에 결합하도록 허용하고, 결합제가 본원에 정의된 바와 같이 RBD의 결합 부위 2에 결합될 때 적어도 SARS-CoV-2 및/또는 SARS-CoV-1을 중화시킬 수 있는 결합제를 제공한다. 추가의 특정 구현예에서, 상기 결합제는 각각 본원에 정의된 바와 같은 RBD의 결합 부위 1 및 결합 부위 2에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 결합 영역, 바람직하게는 ISVD를 포함하며, 따라서 RBD와의 결합에 대해(결합 부위 1에 대한 결합을 통해) 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)와 경쟁하고, 본원에 정의된 바와 같이 결합 부위 1 및/또는 2에 결합될 때 적어도 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV-1을 중화시킬 수 있는 결합제를 제공한다. 또한, 본원에 정의된 바와 같은 결합 부위 2에 특이적으로 결합하는 결합제는 SPRBD에 결합될 때 ACE2뿐만 아니라 항체 VHH72, S309 또는 CB6이 SPRBD에 결합하도록 할 수 있다.
(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 결합제가 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하고, 바람직하게는 상기 하나 이상의 ISVD(들)가 제1 및/또는 제2 결합 부위에 특이적으로 결합하는 것인, 조성물. 상기 조성물은 적어도 2개의 결합제 또는 결합 도메인을 포함할 수 있는데, 적어도 하나는 본원에 정의된 서열 번호: 1의 스파이크 단백질의 결합 부위 1에 특이적으로 결합하고, 적어도 하나는 본원에 정의된 서열 번호: 1의 스파이크 단백질의 결합 부위 2에 특이적으로 결합한다. 대안적으로, 상기 조성물은 본원에 정의된 바와 같이 제1 및 제2 결합 도메인을 통해 스파이크 단백질의 제1 및 제2 결합 부위 각각에 결합할 수 있는 단일 결합제를 포함할 수 있다. 본원에 정의된 RBD의 두 결합 부위 모두에 결합할 수 있는 결합제는 적어도 2개의 ISVD를 포함할 수 있으며, 그 중 하나는 본원에 정의된 RBD 상의 제1 결합 부위에 특이적으로 결합하고, 다른 하나는 본원에 정의된 RBD 상의 제2 결합 부위에 특이적으로 결합한다.
(6) (5)에 있어서, 상기 하나 이상의 결합제가 결합 부위 1에 특이적으로 결합하는 ISVD를 포함하고, 서열 번호: 2-21 및 서열 번호: 95-98 중 어느 것으로 표시된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며, 이때 CDR은 Kabat, MacCallum, IMGT, AbM, aHo, Chothia, Gelfand, 또는 Honegger에 따라 주석이 달리거나, CDR1은 서열 번호: 28-37 중 어느 것에 정의되고, CDR2는 서열 번호: 38-50 중 어느 것에 정의되며, CDR3은 서열번호: 51-61 중 어느 것에 정의되어 있는 것인, 조성물. 서열 번호: 2-21 또는 서열 번호: 95-98에 정의되는 VHH는 서열 번호: 1의 Y369, F377 및 K378 중 적어도 하나 이상의 잔기를 포함하는 제1 RBD 에피토프에 특이적으로 결합하거나, 보다 구체적으로는 서열 번호: 1의 L368, S371, S375, T376, C379 및/또는 Y508 중 하나 이상의 잔기에 추가로 결합한다.
(7) (5)에 있어서, 하나 이상의 결합제가 결합 부위 2에 특이적으로 결합하는 ISVD를 포함하고, 서열 번호: 22-27 중 어느 것에 존재하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며, 이때 CDR은 Kabat, MacCallum, IMGT, AbM, aHo, Chothia, Gelfand, 또는 Honegger에 따라 주석이 달리거나, CDR1은 서열 번호: 70 - 여기서 2번 위치의 X(Xaa)는 S(Ser, 세린) 또는 N(Asn, 아스파라긴)임 -에 정의되고, CDR2는 서열 번호: 71 - 여기서 5번 위치의 X(Xaa)는 T(Thr, 트레오닌) 또는 S(Ser, 세린)이고, 7번 위치의 X(Xaa)는 S(Ser, 세린) 또는 N(Asn, 아스파라긴)이며, 12번 위치의 X(Xaa)는 D(Asp, 아스파르트산) 또는 N(Asn, 아스파라긴)이고, 14번 위치의 X(Xaa)는 A(Ala, 알라닌) 또는 V(Val, 발린)이며, 15번 위치의 X(Xaa)는 Q(Gln, 글루타민) 또는 K(Lys, 라이신)임 -에 정의되며, CDR3은 서열 번호: 72 - 여기서 3번 위치의 X(Xaa)는 P(Pro, 프롤린) 또는 L(Leu, 류신)임 -에 정의되거나; CDR1은 서열 번호: 62 또는 63 중 어느 것에 정의되고, CDR2는 서열 번호: 64-67 중 어느 것에 정의되며, CDR3은 서열 번호: 68 또는 69 중 어느 것에 정의되는 것인, 조성물. 서열 번호: 22-27에 정의되는 VHH는 서열 번호: 1의 T393, N394, V395 또는 Y396 중 적어도 하나 이상의 잔기를 포함하는 제2 RBD 에피토프에 특이적으로 결합하거나, 보다 구체적으로는 서열 번호: 1의 R357, K462, F464, E465, R466, S514, E516, 또는 L518 중 하나 이상의 잔기에 추가로 결합한다.
(8) (5)에 있어서, 상기 하나 이상의 결합제가 결합 부위 2에 특이적으로 결합하는 ISVD를 포함하고, 서열 번호: 85-87 중 어느 것에 존재하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며, 이때 CDR은 Kabat, MacCallum, IMGT, AbM, aHo, Chothia, Gelfand, 또는 Honegger에 따라 주석이 달린다.
(9) (5) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 결합 부위 1에 특이적으로 결합하는 ISVD를 포함하는 하나 이상의 결합제가 서열 번호: 2-21 및 서열 번호: 95-98의 서열 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일성을 갖되, 동일하지 않은 아미노산은 하나 이상의 FR에 위치하는 이의 기능적 변이체, 또는 이의 인간화 변이체를 포함하는 것인, 조성물. 특정 구현예에서, 본 명세서에 정의된 바와 같이 결합 부위 1에 특이적으로 결합하는 ISVD를 포함하는 하나 이상의 결합제 또는 결합 도메인을 포함하는 상기 조성물은 VHH72 또는 이의 변이체로 식별되거나 본 명세서의 서열 번호: 2-5, 또는 서열 번호 90에 제공된 바와 같은 VHH들 중 어느 것, 또는 서열 번호 9-14에 제공된 바와 같은 VHH72 계열 구성원, 또는 이들 중 어느 하나의 인간화 변이체에 묘사된 바와 같은 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 결합 부위 1에 특이적으로 결합하는 ISVD를 포함하는 하나 이상의 결합제를 포함하는 상기 조성물은 VHH3.83 또는 이의 변이체로 식별되거나 본 명세서의 서열 번호: 6-8에 정의된 바와 같은 VHH들 중 어느 것, 또는 VHH4.1XAS51, VHH4.2XAS58, VHH4.2XAS31, 및 VHH4.2XAS43에 제공되고 각각 서열 번호: 95-98로 표시된 바와 같은 VHH3.83의 계열 구성원에 묘사되거나, VHH3.55, 또는 이의 변이체로 식별되거나 본 명세서의 서열 번호: 17에 정의된 바와 같은 VHH들 중 어느 것, 또는 VHH3.55 계열 구성원, 또는 서열 번호: 18로 표시된 VHH3.35에 정의된 바와 같은 VHH, 또는 이들 중 어느 하나의 인간화 변이체에 묘사된 바와 같은 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같이 사베코바이러스 RBD와의 결합에 대해 VHH72와 경쟁하는 ISVD를 포함하는 하나 이상의 결합제를 포함하는 상기 조성물은 VHH3.36, VHH3.47, VHH3.29 또는 VHH3.149, 또는 이의 변이체로 식별되거나 각각 서열 번호: 15, 16, 19 또는 21에 정의된 바와 같은 VHH들 중 어느 것, 또는 이들 중 어느 하나의 인간화 변이체에 묘사된 바와 같은 CDR을 포함한다.
(10) (5) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 결합 부위 2에 특이적으로 결합하는 ISVD를 포함하는 하나 이상의 결합제가 서열 번호 22-27 및 서열 번호: 85-87의 서열 그룹으로부터 선택된 서열 또는 이와 적어도 90% 동일성을 갖되, 동일하지 않은 아미노산은 하나 이상의 FR에 위치하는 이의 기능적 변이체, 또는 이의 인간화 변이체를 포함하는 것인, 조성물.
(11) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 RBD와의 결합에 대해 서열 번호: 2-21 및 서열 번호: 95-98의 그룹으로부터 선택된 임의의 결합제와 경쟁하는 적어도 하나의 결합제를 포함하고/하거나 RBD와의 결합에 대해 서열 번호: 22-27 및 서열 번호: 85-87의 그룹으로부터 선택된 임의의 결합제와 경쟁하는 적어도 하나의 결합제를 포함하는, 조성물.
(12) (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 스파이크 단백질의 결합 부위 1 및 결합 부위 2에 특이적으로 결합하는 단일 제제를 포함하는, 조성물. 구체적으로, 상기 조성물은 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 단일 결합제 또는 분자를 포함하며, 이때 상기 하나 이상의 ISVD는 제1 및/또는 제2 결합 부위에 특이적으로 결합한다. 본원에 정의된 바와 같이 결합 부위 1에 특이적으로 결합하는 ISVD를 포함하고/하거나 결합 부위 2에 특이적으로 결합하는 ISVD를 포함하는 상기 결합제는 상기 결합제의 융합에 의해 얻어지며, 이때 상기 융합은 결합 도메인을 연결함으로써 직접적으로 이루어질 수 있거나, 또는 상기 융합은 본원에 추가로 명시된 바와 같이 링커 또는 또 다른 모이어티를 통해 이루어진다. 상기 링커는 하나 이상의 아미노산 잔기의 펩티드 링커일 수 있거나, 중쇄 Fc-테일 또는 또 다른 모이어티와 같은 또 다른 단백질 또는 항체 부분일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 결합제는 상기 결합 부위 1 및/또는 결합 부위 2 결합제 중 적어도 하나에 융합된 Fc 꼬리를 포함하며, 이때 상기 Fc는 바람직하게는 IgG로부터 유래된다. 따라서, 결합 부위 1에 특이적인 상기 결합제 중 적어도 하나에 융합된 상기 Fc 꼬리, 및 결합 부위 2에 특이적인 상기 결합제 중 적어도 하나에 융합된 Fc 꼬리를 발현시킴으로써, 2가 또는 4가 결합제와 같은 다가 결합제를 만드는 Fc 힌지 영역에서의 이량체화를 통해 이중특이적 또는 이중 파라토프 항체가 형성된다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 본원에 정의된 바와 같은 코로나 바이러스 스파이크 단백질의 RBD의 에피토프 1 및 2에 특이적으로 결합하는 다가 또는 다중특이적 제제를 포함하며, 이는 서열 번호: 2-27, 서열 번호: 95-98, 서열 번호: 85-87의 서열들 중 어느 것, 또는 서열 번호: 76-84, 또는 서열 번호: 91-93의 그룹으로부터 선택된 서열들 중 어느 것에 제공된 ISVD, 또는 이와 적어도 90% 동일성을 갖는, 구체적으로는 원래의 FR 서열과 비교하여 각 프레임워크 영역에 대해 적어도 90% 동일성, 및 동일한 CDR을 갖는 이들 중 어느 하나의 기능적 변이체, 및/또는 이들 중 어느 하나의 인간화 변이체를 포함할 수 있다.
(13) (12)에 있어서, 상기 결합제가 결합 부위 1에 특이적으로 결합하는 ISVD를 포함하고, 결합 부위 2에 특이적으로 결합하는 ISVD를 포함하며, 상기 ISVD들이 직접 또는 링커를 통해 융합된 것인, 조성물.
(14) (13)에 있어서, 상기 링커는 짧은 펩티드 링커, Fc-테일 또는 또 다른 모이어티일 수 있는 것인, 조성물.
(15) (12) 또는 (13)에 있어서, 상기 결합제가 결합 부위 1 및 2에 특이적인 상기 ISVD들을 융합시켜 이중특이적 항체를 제공하는 IgG Fc를 포함하고, 이때 상기 이중특이적 항체는 2가 또는 4가일 수 있는 것인, 조성물.
(16) (11) 내지 (14)에 있어서, 상기 결합제가 서열 번호: 76-84 및 서열 번호: 91-93의 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일성을 갖는 기능적 변이체, 또는 이들 중 어느 하나의 인간화 변이체를 포함하는 것인, 조성물.
(17) (11) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재된 결합제를 암호화하는 단리된 핵산.
(18) (17)에 기재된 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
(19) (1) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재된 조성물, (17)에 기재된 단리된 핵산 및/또는 (18)에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
(20) 약제로 사용하기 위한 (1) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재된 조성물, (17)에 기재된 단리된 핵산, (18)에 기재된 재조합 벡터, 또는 (19)에 기재된 약제학적 조성물.
(21) 대상체의 수동 면역화에 사용하기 위한 (1) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재된 조성물, (17)에 기재된 단리된 핵산, (18)에 기재된 재조합 벡터, 또는 (19)에 기재된 약제학적 조성물.
(22) 코로나바이러스 감염, 보다 구체적으로는 사베코바이러스 감염의 치료에 사용하기 위한 (1) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재된 조성물, (17)에 기재된 단리된 핵산, (18)에 기재된 재조합 벡터, 또는 (19)에 기재된 약제학적 조성물.
(23) SARS-CoV-1 또는 SARS-CoV-2 감염의 치료에 사용하기 위한 (1) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재된 조성물, (17)에 기재된 단리된 핵산, (18)에 기재된 재조합 벡터, 또는 (19)에 기재된 약제학적 조성물.
본 개시에 따른 방법, 샘플 및 바이오마커 제품에 대한 특정 구현예, 특정 배열뿐만 아니라 재료 및/또는 분자가 본 명세서에서 논의되었지만, 형태 및 세부사항에서 다양한 변경 또는 수정이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 하기 실시예는 특정 구현예를 더 잘 설명하기 위해 제공되며, 본 출원을 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 본 출원은 청구범위에 의해서만 제한된다.
실시예
실시예 1. 스파이크 단백질에 결합하는 ACE2 수용체의 억제를 통해 RBD의 보존된 에피토프에 특이적으로 결합하여 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2를 강력하게 중화시키는 VHH.
VHH72 및 이의 Fc 융합체를 포함하는 파생된(돌연변이) 변이체의 식별은 이전에 보고되었다(Wrapp et al. 2020; Schepens et al. 2021 Biorxiv doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.08.433449). 또한, SARS-CoV-1 스파이크 단백질의 RBD에 있는 VHH72의 에피토프가 본 명세서에 개시되었다. 또한, 동일한 VHH72 Nb 계열에서 유래하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하고/하거나 VHH72와 경쟁하는 추가 SARS-CoV-2 중화 VHH가 스파이크 단백질과 상호작용하여 SARS-CoV-2를 강력하게 중화시키는 것으로 식별되었다. 이러한 2세대 및 3세대 VHH를 사전에 정제하고, AlphaLISA(증폭 발광 근접 균질 검정)로 평가된 SARS-CoV-2 RBD와의 결합에 대해 VHH72와 경쟁하는 능력에 대해 테스트하고/하거나 결합 부위가 VHH72 결합 부위와 동일한지 확인하기 위해 스파이크 단백질과의 복합체로 구조 분석하였다. 이러한 경쟁 및 구조 분석 데이터는 Schepens 등(PCT/EP2021/052885)에 보고되어 있었고, 본원에 기재된 바와 같이 이러한 VHH를 '결합 부위 1' 또는 '에피토프 1'(또는 'VHH72-에피토프')에 대한 결합제로 분류하기 위한 기초를 제공한다.
정제된 1가 단백질로서 추가로 특성화하기 위해 다양한 VHH 계열을 대표하는 선별된 클론을 피치아 파스토리스 또는 이. 콜라이에서 생산하기 위해 재클로닝했다. 1가 VHH에는 각각 C-말단 His6 태그, 또는 C-말단 HA-His6 태그가 포함되어 있었다. Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제를 수행하였다.
AlphaLISA에서 VHH를 테스트하기 위해, 항-SARS-CoV-2 VHH 및 무관한 대조군 VHH의 연속 희석액(최종 농도 범위 90nM 내지 0.04nM)을 검정 버퍼(0.5% BSA 및 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS)에서 제조했다. 이어서, VHH를 백색의 낮은 결합 384웰 미량역가판(F-바닥, Greiner Cat nr 781904)에서 VHH72-h1(S65A)-Flag3-His6(최종 농도 0.6nM) 및 Avi-태그 비오티닐화된 SARS-CoV-2 RBD 단백질(AcroBiosystems, Cat nr. SPD-C82E9)(최종 농도 0.5nM)과 혼합하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 공여체 및 수용체 비드들을 최종 부피 0.025mL로 각각 20μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 비오티닐화된 RBD를 스트렙타비딘 코팅된 알파 공여체 비드(Perkin Elmer, Cat nr. 6760002)에서 포획하고, VHH72_h1(S56A)-Flag3-His6을 항-Flag AlphaLISA 수용체 비드(Perkin Elmer, Cat nr. AL112C)에서 실온에서 1시간 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하여 포획했다. 비드에 포획된 VHH72와 RBD의 결합은 한 비드에서 다른 비드로의 에너지 전달을 유도하는데, 이는 Ensight 기기에서 680nm의 조명 및 615nm의 판독 후에 평가되었다. 결과는 도 2에 나와 있다. IC50 값에 의해 결정된 효능은 표 1에 나와 있다. 결과에 따르면, 초계열의 일부인 7개의 VHH들(계열 F-36/55/29/38/149)과 VHH3.83(계열 83)이 SARS-CoV-2 RBD 단백질에 대한 VHH72의 상호작용을 완전히 차단하는 것으로 나타났고, 이는 이들이 VHH72와 최소한 겹치거나 동일한 에피토프에 결합함을 나타낸다. SARS-CoV-2 RBD 단백질과 ACE-2 수용체의 상호작용에 대한 용량 의존적 억제는 재조합 인간 ACE-2-Fc(최종 농도 0.2nM)를 사용하여 경쟁 AlphaLISA에서 평가되었다. VHH72와 경쟁하는 모든 VHH들은 인간 ACE2와 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 상호작용도 차단한다(데이터는 표시되지 않음; PCT/EP2021/052885). 부분적 차단(75% 억제)을 나타낸 VHH3.83을 제외하고, 다른 모든 것들은 ACE-2 결합의 완전한 차단을 나타냈다.
결론적으로, 경쟁 검정에 따르면, 계열 F-83, 36, 55, 29, 38 및 149로부터 정제된 VHH들이 VHH72의 동일 및/또는 경쟁 에피토프에 결합하고, VHH72 계열 구성원들과 유사하게 ACE-2 결합과 경쟁하는 것으로 확인되었다. VHH72 계열에 속하지 않는 가장 강력한 경쟁자는 각각 VHH3.36과 VHH3.83이다(표 1).
VHH 계열들은 대표적인 VHH 계열 구성원들 중 하나를 고려하여 식별되고/번호가 부여된다.
실시예 2. 구조 분석을 통해 VHH3.38, VHH3.83 및 VHH3.55의 결합 부위가 VHH72 에피토프에 해당한다는 것이 확인된다.
관련 SARS-CoV-1 RBD와 복합체를 이루는 결정 구조가 이용 가능한 VHH72(VHH72_h1_S56A)의 에피토프와 RBD 아미노산 결합이 유사하다는 것을 확인하기 위해 VHH3.38, VHH3.83 및 VHH3.55를 사용하여 심층 돌연변이 스캐닝을 수행했다. 본 발명자들은 각각 고유한 바코드 및 myc-태그(Greaney et al., Cell Host and Microbe, 29-1, p 44-57; 2021)로 표지된 단일 RBD 변이체를 발현시키는, 2개의 독립적으로 생성된 사카로마이세스 세레비시아에 세포 라이브러리들로 이루어진, Starr 등(Cell. 182, 1295-1310.e20; 2020)에 의해 개발된 효모 디스플레이 플랫폼을 사용했다. 각 위치가 모든 다른 아미노산들로 치환된 포괄적인 RBD 변이체들의 컬렉션을 생성하기 위해 PCR 기반 돌연변이유발에 의해 2개의 RBD 변이체 라이브러리를 생성하였다. RBD 변이체는 평균 2.7개의 아미노산 치환을 포함한다. 기능적 RBD 변이체만을 보유하기 위해, 효모 RBD-디스플레이 라이브러리를 재조합 ACE2에 결합하는 능력에 기초하여 FACS에 의해 사전 분류하였다(데이터는 표시되지 않음; PCT/EP2021/052885의 예시 참조). 민감한 방식으로 테스트된 VHH에 대해 친화도가 감소된 RBD 변이체를 발현시키는 효모 세포를 식별하기 위해, 본 발명자들은 각 VHH에 대해 결합이 포화도 바로 아래에 있는 농도를 정의했다. 각각의 테스트된 VHH에 대해 이 농도는 먼저 야생형 SARS-CoV-2 RBD를 발현하는 효모 세포를 VHH의 연속 희석액으로 염색함으로써 결정되었다. 이 접근 방식을 사용하여, 본 발명자들은 VHH72_h1_S56A(VHH72)에 대해 400ng/ml를 선택하고, VHH3.38, VHH3.55 및 VHH3.83에 대해 10ng/ml를 선택했다. 테스트된 VHH에 대한 친화도가 감소된 RBD 변이체를 발현하는 효모 세포를 식별하기 위해, 사전 분류된 라이브러리를 VHH 및 항-myc-태그 항체로 염색했다. 낮은 VHH 염색을 나타낸 RBD 발현 세포를 분류하고, 성장시키고, 각각의 바코드 시퀀싱에 사용했다. VHH 결합에 유의하게 관여하는 RBD 아미노산을 식별하기 위해, 분류된 집단에서 풍부한 치환을 Greane 등(Cell Host and Microbe, 29-1, p 44-57; 2021)에 기재된 바와 같이 결정하였다.
도 3은 각각의 테스트된 VHH에 대해, 치환이 감소된 VHH 결합을 초래하는 RBD에서의 위치에 대한 전체 프로파일을 나타낸다. VHH3.38, VHH3.55 및 VHH3.83의 프로파일이 VHH72_h1_S56A의 프로파일과 크게 겹치는 것이 분명하다. 탈출 프로파일 분석을 통해, A363, Y365, S366 Y369, N370, S371, F374, S375, T379, K378, P384, 및 Y508이 VHH72_h1_S56A의 결합에 관여하는(두 라이브러리의 평균을 기준으로) 아미노산 위치로 식별되었다. 처음 3개의 위치를 제외하고는 모두 SARS-CoV-1 RBD와 복합체를 이루는 VHH72의 결정 구조를 기반으로 한 모델링에 의해 정의된 RBD 상의 VHH72의 발자국(footprint) 내에 속한다(Wrapp, et al. 2020 Cell 181, 1004-1015.e15; Wrapp, et al. 2020; Science, 367, 1260-1263). 위치 A363, Y365 및 S366은 VHH72 발자국의 바깥쪽에 위치한다. SARS-CoV-2 RBD 구조를 조사한 결과, 이들은 VHH72 에피토프에 인접하며, 각 아미노산의 측쇄가 RBD에서 주로 안쪽으로 배향되어 있는 것으로 나타났다. 따라서, 이 위치에서의 치환에 의한 VHH72 결합 감소는 알로스테릭 영향으로 인해 발생할 가능성이 높다.
RBD의 2개 아미노산 위치(K378 및 P384)만이 VHH3.83에 대한 스캔에서 식별되었다. 중요하게도, 이들 두 위치들은 VHH72_h1_S56A를 포함하여 테스트된 다른 VHH들에 대해서도 식별되었으며, VHH72 에피토프 내에 위치한다. VHH3.83의 결합을 위한 RBD K378 잔기의 중요성은 SARS-CoV-2 RBD K378N 돌연변이체를 발현시키는 포유동물 세포에 대한 이러한 VHH의 결합이 야생형 SARS-CoV-2 RBD에 대한 결합과 비교하여 상당히 손상된다는 관찰과 일치한다(데이터는 표시되지 않음; PCT/EP2021/052885의 예시 참조).
VHH3.83의 구조 분석에 더하여, 서열 번호: 95-98을 포함하여 본원의 다른 곳에서 정의된 바와 같은 동일한 VHH 계열의 추가적인 VHH들이 식별되었다. VHH3.83과 관련된 이러한 VHH는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(1회) 및 RBD 도메인(2회)을 사용한 추가적인 추가 면역화(booster immunization) 후에 단리되었다. 획득한 VHH 면역 라이브러리는 SARS-CoV-2 RBD-SD1을 사용하여 패닝(panning)되었다. 주변세포질 추출물(PE) ELISA에서 SARS-CoV-2 RBD-SD1에 결합할 수 있는 것으로 입증된 242개 클론 중 일부 VHH는 VHH3.83과 동일하거나 관련성이 높은 CDR3 및 CDR2 아미노산 서열을 가지고 있었다. 따라서 상기 VHH는, CDR3이 동일하고 이의 기능적 특징이 유사하기 때문에 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 따라서 이들은 또한 본원에 기재된 바와 같이 'VHH72 에피토프 결합제' 또는 결합 부위 1에 대한 결합제로 간주된다.
마지막으로, VHH3.38 결합 방식과 SARS-CoV2 스파이크 단백질(SC2) 상의 결합 에피토프에 대한 뷰(view)를 얻기 위해, 본 발명자들은 PCT/EP2021/052885에 나타낸 바와 같이 나노바디와 복합체를 이루는 SC2의 3D cryoEM 구조를 결정했으며, 4.2Å의 전자 전위 맵을 사용하여 3개의 SC2 프로토머 복제물에 대한 밀도를 밝혀냈으며, 이때 각 프로토머에 대해 수용체 결합 도메인(RBD(잔기 334 내지 527))은 PDB 6zgg에서 보고된 것과 같은 1-RBD 상향 입체형태에서 볼 수 있는 것과 유사한 입체형태로 직립 위치에서 발견되었다.
실시예 3. 추가 VHH 계열의 강력한 중화제는 VHH72와 비경쟁 방식으로 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV-1 스파이크 단백질에 특이적으로 결합한다.
추가 SARS-Cov-1 및 SARS-CoV-2 교차 반응성 VHH를 얻기 위해, 재조합 융합전(prefusion) 안정화 SARS-CoV-1 및 MERS 스파이크 단백질로 사전에 면역화된 라마를, 융합전 입체형태로 안정화된 재조합 SARS-CoV-2 스파이크 단백질로 3회 추가 면역화시켰다(Wrapp et al. 2020, Cell 181:1436-1441). 면역 VHH 표시 파지미드 라이브러리를 구축하였고, 다양한 패닝 전략을 사용하여 SARS-CoV-2 스파이크 특이적 VHH를 선별하여 5개의 VHH 계열 구성원(VHH3.117, 3.42, 3.92, 3.94, 3.180)을 포함하는 VHH 계열(여기서는 VHH3.117 계열이라고 함)을 얻었다(Saelens et al. EP 21166835.5 및 PCT/EP2022/052919에 기재된 바와 같음). SARS-CoV-2의 RBD에 대한 정제된 VHH3.42, VHH3.92 및 VHH3.117의 결합은 1가 SARS-CoV-2 RBD-인간 Fc가 30nM로 항-인간 Fc 바이오센서에 고정된 생물층 간섭계(BLI)에 의해 테스트되었다. 이는 VHH3.42 및 VHH3.117이 VHH72보다 상당히 느린 오프 레이트로 RBD에 결합했음을 보여주었다(도 4a, 각각 200nM의 VHH). VHH3.117의 200nM에서 3.13nM 2배 연속 희석액에 대해, 동일한 BLI 설정을 사용하여 결합 동역학을 결정하였다. 도 5b는 VHH3.117이 4.45Х10-10M 의 KD로 단량체성 RBD에 결합한다는 것을 보여준다.
VHH3.42 및 VHH3.117이 RBD 결합에 대해 VHH72와 경쟁하는지 테스트하기 위해, 단량체성 RBD(RBD-SD1-Avi(비오티닐화 Avi-태그))를 VHH72-S56A-Fc(D72-23 = humVHH_S56A/LALAPG-Fc; Schepens et al. 2021, BioRxiv doi.org/10.1101/2021.03.08.433449)로 코팅된 ELISA 플레이트에 포획하였는데; 상기 VHH72-S56A-Fc는 VHH72가 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2 RBD에 대한 친화성을 증가시키는 CDR2 내의 S56A 치환을 갖는 VHH72-인간 IgG1 Fc 융합체이다(도 5a). PE가 RBD와의 결합에 대해 VHH72와 경쟁을 나타낸 VHH72 및 몇몇 VHH들이 대조군으로 포함되었다. VHH72 및 대조군 VHH들(표시되지 않음)과 대조적으로, VHH3.42 및 VHH3.117은 VHH72-S56A-Fc에 의해 고정된 단량체성 RBD에 결합할 수 있었다(도 5a). BLI에 의해 유사한 경쟁 실험이 수행되었는데, 이때 VHH72-S56A-Fc를 항-인간 Fc 바이오센서(AHC, ForteBio)에 고정하고, RBD-muFc로 전처리하여 고정된 VHH72-S56A-Fc에 RBD-muFc가 결합되도록 하였다. 이후 이 바이오센서를 1μM의 VHH72-S56A-Fc, VHH3.42, VHH3.117 또는 버퍼만을 포함하는 용액에 적용했다. 예상대로 VHH72-huFc/RBD-muFc로 프로브된 바이오센서를 VHH72 함유 용액에 적용하면 BLI 반응 신호가 감소하는데, 이는 바이오센서에서 RBD-Fc가 방출되었음을 나타낸다. 이는 VHH72가 RBD 결합에 대해 VHH72-S56A-Fc와 경쟁(대체)할 수 있음을 확인시켜 준다. 이와는 극명하게 대조적으로, VHH72-huFc/RBD-muFc 프로브된 바이오센서를 VHH3.42 또는 VHH3.117을 포함하는 용액에 적용하면 BLI 반응 신호가 명확하게 향상되었다(도 5b). 이는 VHH3.117 및 VHH3.42가 VHH72 에피토프에서 멀리 떨어진 부위에서 RBD에 결합할 수 있음을 보여준다.
정제된 VHH3.42, VHH3.117 및 VHH3.92는 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-1의 스파이크 단백질을 포함하는 슈도타이핑된 VSV-delG를 사용한 중화 검정에서 테스트되었다. 표 2는 VHH3.42, VHH3.117 및 VHH3.92가 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질을 포함하는 슈도타이핑된 VSV-delG를 중화시킬 수 있었고, 이는 VHH72_h1_S56A보다 약 6배 더 효율적이라는 것을 보여준다. 또한, 본 발명자들은 VHH3.42 및 VHH3.117도 SARS-CoV-1을 중화시킬 수 있는지 테스트했다. 표 2는 VHH3.42와 VHH3.117 모두 SARS-CoV-1 스파이크로 슈도타이핑된 VSV-delG를 강력하게 중화시킬 수 있었음을 보여준다. SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2 둘 모두에 대해 VHH3.117의 중화 활성은 VHH3.42보다 다소 더 높았다.
실시예 4. VHH3.42, VHH3.117 및 VH3.92는 RBD가 이의 수용체인 ACE2에 결합하는 것을 막지 않는다.
대부분의 보고된 단클론 항체들 및 VHH들은 RBD가 이의 수용체인 ACE2에 결합하는 것을 방지함으로써 중화시킨다. VHH72는 수용체 결합 모티프(RBM) 외부에서 RBD에 결합하지만, 입체 장애로 인해 RBD가 ACE2에 결합하는 것을 막는다(Wrapp et al. 2020, Cell 181:1436-1441). 여기에서 식별된 중화 VHH들이 RBD와 ACE2의 결합을 억제할 수 있는지 조사하기 위해, 본 발명자들은 AlphaLISA에 의해 재조합 RBD와 재조합 ACE2 단백질의 상호작용에 미치는 이러한 VHH들의 영향을 조사했다. VHH의 연속 희석액(최종 농도 범위 90nM 내지 0.04nM)을 검정 버퍼(0.5% BSA 및 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS)에서 제조하고, 백색의 낮은 결합 384웰 미량역가판(F-바닥, Greiner Cat nr 781904)에서 Avi-태그(AcroBiosystems, Cat nr. SPD-C82E9)를 통해 비오티닐화된 SARS-CoV-2 RBD(최종 농도 1nM)와 혼합했다. 상기 혼합물에 재조합 인간 ACE-2-Fc(최종 농도 0.2nM)를 첨가했다. 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 공여체 및 수용체 비드를 0.025mL의 최종 부피에서 각각에 대해 20μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다. RBD를 스트렙타비딘 코팅된 알파 공여체 비드(Perkin Elmer, Cat nr. 6760002)에 포획하였다. 인간 ACE-2-mFc 단백질(Sino Biological Cat nr. 10108-H05H)을 항-마우스 IgG(Fc 특이적) 수용체 비드(Perkin Elmer, Cat nr. AL105C)에 포획했다. 혼합된 비드를 어두운 곳에서 실온에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션했다. 비드들 간의 상호작용을 Ensight 기기에서 680nm의 조명 및 615nm의 판독 후 평가하였다. VHH72 및 관련 VHH3.115와 대조적으로, 본원에서 식별된 VHH3.42, VHH3.117 및 VHH3.92 중 어느 것도 각각의 중화 IC50(54.8nM, 13.7nM 및 13.55nM)을 훨씬 초과하는 용량에서조차 RBD/ACE2 상호작용을 방해할 수 없었다(도 7).
여기에서 식별된 VHH들이 또한 세포 표면에서 발현된 ACE2에 대한 RBD의 결합을 억제할 수 없는지 조사하기 위해, 본 발명자들은 마우스 Fc에 융합된 2가 SARS-CoV-2 RBD가 Vero 세포에 결합하는 것을 확인했다(도 6). 도 7a 및 6b는 VHH3.42, VHH3.117 및 VHH3.92가 각각의 중화 IC50보다 훨씬 높은 농도에서도 2가 SARS-CoV-2 RBD와 VeroE6 세포의 상호작용을 방지할 수 없었음을 보여준다(표 2). 이는 이러한 VHH들이, 표적 세포들에 대한 RBD 매개 바이러스 부착 방지를 수반하지 않는 대안적인 메커니즘을 통해 SARS-CoV 감염을 중화시킨다는 것을 나타낸다.
다음으로, 본 발명자들은 VHH3.42 계열의 VHH들이 세포 표면 발현 RBD에 대한 재조합 ACE2의 결합을 또한 방해하지 못하는지 테스트했다. 따라서, 본 발명자들은 VHH72 또는 VHH3.117이 마우스 Fc에 융합된 재조합 ACE2가 효모 세포의 표면에서 발현되는 RBD에 결합하는 것을 방지할 수 있는지 조사했다(도 7c). 예상한 대로 VHH72(VHH72_h1_S56A)는 세포 표면에서 SARS-CoV-2 RBD를 발현하는 효모 세포에 대한 재조합 ACE2-Fc의 결합을 억제할 수 있었다. 이와 달리 VHH3.117은 상기 결합을 억제할 수 없었다.
종합하면, 이러한 데이터는 여기에서 식별된 VHH들이 ACE2, 즉 표적 세포들의 표면에서 발현된 표준 사베코바이러스(예컨대 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2) 수용체에 대한 RBD의 결합을 방지할 수 없음을 일관되게 입증한다. 이는 이러한 VHH들이 대안적인 메커니즘을 통해 사베코바이러스 감염을 중화시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 5. VHH3.117 계열 구성원은 VHH72와는 거리가 먼 사베코바이러스 RBD의 보존된 에피토프에 결합한다.
VHH3.117 계열이 RBD 결합에 대해 VHH72 또는 ACE2와 경쟁하지 않는다는 관찰은, 이들 VHH들이 VHH72 및 RBM(RBD에서 수용체 결합 모티프 (하위)도메인)에서 멀리 떨어진 에피토프에 결합한다는 것을 보여준다. VHH3.117 계열의 에피토프를 더 자세히 설명하고 다른 사베코바이러스 RBD들과 교차반응할 가능성을 정의하기 위해 본 발명자들은 다양한 사베코바이러스들의 RBD에 대한 결합을 조사했다. 이를 위해, 대표적인 계통군 1.A(WIV1), 계통군 1.B(GD-천산갑), 계통군 2(HKU3 및 ZCX21) 및 계통군 3(BM48-31) 사베코바이러스들의 RBD를 발현하는 효모 세포들에 대한 이러한 VHH들의 결합을 유세포 분석법으로 테스트했다. GBP(GFP 결합 단백질) 대조 VHH를 제외한 모든 테스트된 VHH들(10μg/ml)은 표면에서 계통군 1.A(WIV1) 및 계통군 1.B(GD-천산갑)의 RBD를 발현하는 효모 세포와 결합한다(데이터는 표시되지 않음; EP21166835.5 및 PCT/EP2022/052919). 또한, VHH3.117, VHH3.42 및 VHH3.92는 2개의 계통군 2 분기(branch)를 나타내는 HKU3 및 ZXC21의 RBD에 결합할 수 있다. 또한, VHH3.42, VHH3.92 및 그 정도는 덜하지만 VHH3.117도 계통군 3 BM48-31 사베코바이러스의 RBD에 결합할 수 있었다(데이터는 표시되지 않음; 여기서는 EP21166835.5 및 PCT/EP2022/052919의 예시 참조). 별도의 실험에서, 더 넓은 범위의 계통군 1, 2 및 3 사베코바이러스들에 대한 VHH3.117의 결합을 테스트했다. 도 8a는 VHH3.117이 테스트된 모든 RBD 변이체들에 결합할 수 있고, VHH72와 비교하여 더 많은 RBD 변이체들에 결합한다는 것을 보여준다(도 8b). 이러한 관찰은 VHH3.117이 테스트된 RBD 변이체들 간에 고도로 보존된 RBD 영역을 표적으로 한다는 가설과 일치한다.
RBD에서 VHH3.117 계열 결합제의 결합 부위를 확인하기 위해 본 발명자들은 심층 돌연변이 스캐닝을 수행했다. 관련 SARS-CoV-1 RBD와 복합체를 이루는 결정 구조물이 입수될 수 있는 VHH72(VHH72_h1_S56A)가 참조로 포함되었고(Wrapp et al. 2020, Cell 181:1436-1441; Schepens et al., doi.org/10.1101/2021.03.08.433449), 본 출원에서 실시예 2에서 기재된 바와 같이 수행되었다.
각각의 테스트된 VHH에 대해 이 농도는 먼저 야생형 SARS-CoV-2 RBD를 발현하는 효모 세포를 VHH의 연속 희석액으로 염색함으로써 결정되었다. 이러한 접근 방식을 사용하여, 본 발명자들은 VHH72_h1_S56A (VHH72)의 경우 400ng/ml를 선택했고, VHH3.117의 경우 100ng/ml를 선택하였다.
도 9a 및 10a는 2개의 테스트된 VHH에 대해, 치환 결과 VHH 결합이 감소된 RBD의 위치에 대한 전반적인 프로파일을 보여준다. VHH3.117 및 VHH72_h1_S56A는 매우 다른 RBD 결합 프로파일을 가지고 있음이 분명하다. Greaney 등 2021(상기)에 의해 확립된 탈출 프로파일 분석에서는 A363, Y365, S366, Y369, N370, S371, F374, S375, T376, K378, P384, 및 Y508이 VHH72_h1_S56A의 결합에 관여하는(두 라이브러리들의 평균을 기준으로) 아미노산 위치로 식별되었다. VHH3.117의 경우, 탈출 프로파일 분석에서 C336, R357, Y365, C391, F392, T393, N394, V395, Y396, K462, F464, E465, R466, S514, E516 및 L518이 RBD 결합에 중요한 것으로 식별되었다(도 9a 및 9b). C336, Y365, C391 및 F392를 제외한 모든 이러한 아미노산들은 상기 기재된 실험에 근거하여 VHH3.117 결합 부위로 추정되는 RBD 측면에 있는 틈새 주위에 모여 있다. 이 결합 부위는 VHH들이 돌출된 단백질 표면보다는 틈새에 결합하는 일반적인 선호도와도 일치한다. C336 및 C391은 RBD의 전체 안정성에 매우 중요할 수 있는 C361 및 C525와 각각 이황화 가교를 형성하며, 이는 이러한 잔기들이 심층 돌연변이 스캐닝에 의해 식별된 이유를 설명한다(도 9b). Y365 및 F392는 VHH3.117 결합 표면 근처에 위치하며, RBD 코어 내부를 향한다(도 9b). 따라서, 이러한 위치에서의 돌연변이는 VHH3.117의 결합에 알로스테릭 영향(allosteric impact)을 미칠 수 있다. 심층 돌연변이 스캐닝에서는 Y365가 VHH72 결합에도 중요하다는 것을 보여주었다. Y365는 VHH3.117 결합 영역의 반대쪽에 있는 부위에서 RBD 코어에 위치한다. 마찬가지로, Y365는 VHH72에 의해 인식되는 RBD 표면에 위치하지 않지만 VHH3.117과 VHH72 결합 영역 사이에 있는 내부 RBD 코어를 향한다. 이는 Y365가 RBD 코어의 전반적인 입체형태에 중요하다는 것을 나타낸다. 중요한 것은 식별된 VHH3.117 결합 부위가, RBD 결합에 대해 VHH3.117이 ACE2 및 VHH72와 경쟁하지 않는다는 본 발명자들의 발견과 일치하고, 계통군 1, 2, 및 3 사베코바이러스의 RBD에 결합할 수 있는 능력과 일치하며, SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2 교차 중화 활성과 일치한다는 것이다. RBD 표면의 게놈 서열이 GiSAID에 제출된 순환 SARS-CoV-2 바이러스들 간의 아미노산 변이들을 분석한 결과, RBD 표면에 이러한 변이들의 투영으로 보여주는 바와 같이 심층 돌연변이 스캐닝에 의해 식별된 VHH3.117 결합 영역이 고도로 보존되어 있음이 밝혀졌다(도 10a).
본원에서 식별된 VHH들과 RBD의 결합은 표적 세포들의 표면에서 RBD와 ACE2의 결합을 방해하지 않는다. 결과적으로, 이러한 VHH들은 대안적인 메커니즘을 통해, 예를 들어 S309 및 mNb6-tri에 대해 설명된 바와 같이 SARS-CoV-2 스파이크를 비활성 닫힌 입체형태로 잠금으로써 감염을 예방한다(Pinto et al. 2020, Nature 583:290-295; Schoof et al. 2020, Science 370: 1473-1479). VHH3.117 관련 VHH들이 SARS-CoV-1을 중화시킬 수 있는 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 본 발명자들은 상향 입체형태에서 1개의 RBD가 있는 스파이크 삼합체에 VHH3.117 결합 부위를 표시했다. 이는 VHH3.117 부위가 하향 입체형태에 있는 RBD들에서 거의 완전히 가려져 있음을 나타낸다. 또한, 상향 입체형태의 RBD에서 VHH3.117 결합 부위는 대체로 제2 스파이크 프로토머의 NTD에 의해 차폐된다(도 10b). 이는 VHH3.117 및 관련 VHH들이 RBD를 하향 입체형태로 잠그는 것을 수반하지 않는 메커니즘을 통한 것이 아니라 전체 스파이크 입체형태 및/또는 기능을 방해함으로써 중화시킴을 보여준다.
VHH3.117 에피토프는 SARS-CoV-2 RBD 아미노산 Arg357, Thr393, Asn394, Val395, Tyr396, Lys462, Phe464, Glu465, Arg466, Ser514, Glu516 및/또는 Leu518 중 하나 이상을 포함한다(Cys336, Tyr 365, Cys391, Phe392는 RBD를 VHH-117에 의해 인식되는 입체형태로 유지하는 데 중요함). 전반적으로, VHH3.117은 새로 등장한 SARS-CoV-2 변종에서 변이(남아프리카 및 브라질 변종: Lys417, Glu484, Asn501에서 변이; 캘리포니아 변종: Leu452에서 변이; 영국 변종: Glu484에서 변이)가 발생하기 쉬운 것으로 알려진 RBD 아미노산들에 결합하지 않는다.
실시예 6. VHH3.117 및 VHH72는 SARS-CoV-2 중화에 함께 작동한다.
VHH72 및 VHH3.117은 먼 결합 부위를 표적으로 하기 때문에 RBD 결합에 대해 경쟁하지 않는다는 이전 관찰로부터(도 11a), 본 발명자들은 이러한 VHH들이 이들의 상호 중화 활성을 방해하지 않을 가능성이 가장 높을 것으로 예상했다. 따라서, 본 발명자들은 VHH72_h1-S56A와 VHH3.117 칵테일의 중화 활성을 테스트했다. 이를 테스트하기 위해 본 발명자들은 VHH72와 VHH3.177의 EC50(VSV-DG 스파이크 SARS-CoV-2 중화에 대한 EC50) 농도의 x배의 연속 희석액과 해당 EC50 농도의 절반 농도에서 VHH72와 VHH3.117의 1:1 혼합물을 사용하여 VSV-DG 스파이크(SARS-CoV-2V) 중화 검정을 수행했다. 도 11b는 VHH72와 VHH3.117의 칵테일이 해당 개별 VHH들보다 더 높은 중화 활성을 나타낸다는 것을 보여준다.
실시예 7. RBD 특이적 VHH들을 기반으로 하는 다양한 이중특이적 항체 작제물의 설계 및 생성.
도 12는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 RBD에서 'VHH72-에피토프'(또는 본원에 정의된 '결합 부위 1') 결합제 및 'VHH3.117-에피토프'(또는 본원에 정의된 '결합 부위 2') 결합제의 결합 위치를 시각화한 모델을 보여주며, 이는 두 결합 부위를 표적으로 하는 항체가 예를 들어 적합한 링커에 의해 융합된 VHH 빌딩 블록을 구성하는 결합제들의 융합에 의해 또는 Fc 융합체와 같이 다른 융합 단백질의 융합에 의해 만들어져야 한다는 것을 나타낸다. 도 13은 하나의 항체 조성물로 VHH72-에피토프 및 VHH3.117-에피토프를 동시에 표적화하기 위한 이중특이적 항체 조성물의 설계를 위해 제안된 융합 작제물의 여러 비제한적 예시를 제공한다. VHH72-에피토프 결합제(또는 이의 인간화 변이체) 및 VHH3.117-에피토프 결합제(또는 이의 인간화 변이체)로부터 출발하여, 다양한 이중특이적 또는 4가 융합 작제물을 설계 및 생산하고, 예를 들어 동일한 빌딩 블록의 동종2가 또는 1가 작제물과 기능성을 비교한다. 예를 들어, '결합 부위 1' 빌딩 블록으로서 VHH72 자체, 또는 VHH72-계열 구성원, 또는 본원에서 VHH72-에피토프에 결합하는 것으로 식별된 또 다른 VHH 계열, 예컨대 VHH3.83, 또는 이의 계열 구성원, 또는 이의 돌연변이체 또는 인간화 변이체와, '결합 부위 2' 빌딩 블록으로서 VHH3.117 자체, 또는 VHH3.117 계열 구성원, 또는 본원에서 VHH3.117-에피토프 결합제로 식별된 또 다른 VHH 계열, 예컨대 VHH3.89, 또는 본원에서 식별된 이의 계열 구성원(실시예 9), 또는 이의 돌연변이체 또는 인간화 변이체의 조합으로부터 출발하여, 다양한 방식으로, 링커에 의해 (또는 직접) 결합된 이중특이적 형식으로서 또는 Fc 도메인에 대한 융합체로서, 또는 Fc 꼬리에 융합된 링커에 의해 융합된 이중특이적 형식으로서, 또는 다른 VHH 빌딩 블록과 같은 다른 기능적 모이어티에 의해 만들어진 융합체로서 여러 융합체들이 제안될 수 있다. 특정 융합체의 일부 비제한적인 예가 표 3에 제공되어 있다. 결합 부위 1 및 결합 부위 2 빌딩 블록에 대한 대안적 융합 유형 또는 대안이 또한 고려될 수 있으며, 이들의 임의의 조합도 고려될 수 있다.
항체 조성물은 피치아 파스토리스 및/또는 CHO 세포, 또는 임의의 대안적인 적합한 생산 숙주에서 발현된 후, 본원에 기재되고/되거나 숙련가에게 공지된 바와 같은 정제 및 생화학적 및 생물물리학적 특성화가 이어진다. 다른 RBD 결합제 및 RBD에 결합하는 인간 수용체, 예컨대 ACE2와 비교하여 프로파일링된 친화도, 경쟁과 같은 RBD 결합 특성뿐만 아니라 각각의 조성물 또는 결합제의 효능이 숙련가에게 공지된 바와 같이 분석된다.
라마 면역 라이브러리에서 최초로 식별된 VHH72의 이전에 개발된 'VHH72-h1-E1D-S56A' 변이체는 Schepens et al. 2021(Biorxiv doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.08.433449) 및 PCT/EP2021/052885에 기재되어 있었다.
VHH72의 추가 변이체가 'VHH72-h1-E1D-R27L-E31D-Y32I-S56G-L97A'에 의해 제공되며, 여기서 5개의 추가 치환은 VHH3.115(서열 번호 12)의 최초 서열을 기반으로 만들어졌다.
본원에 정의된 바와 같은 RBD의 '결합 부위 1'에 결합하는 것으로 알려진 VHH3.83 나노바디의 경우(실시예 2), N-글리코실화 부위는 최초 아미노산 서열의 85번 위치에 존재하므로, 이 빌딩 블록의 돌연변이 변이체 중 하나는 진핵 세포에서 발현될 때 글리코실화를 방지하기 위해 글루타메이트 잔기(N85E)로 치환된 글리코실화 부위이다.
이러한 비-글리코실화된 돌연변이체 VHH3.83-N85E의 피치아 발현은 VHH83-VHH117 이중특이적 형식으로 테스트되었으며, 발현 수준이 크게 감소하지 않는 것으로 나타났고 효능은 유지되었다(도 14: 및 표 4; 'b8' 작제물과 비교된 'b7'; 실시예 8).
인간화 변이체의 예로는 예를 들어 최초로 식별된 라마 VHH3.83과 비교하여 다음과 같은 치환을 갖는 'VHH3_83 hc' 서열이 포함된다: Q1D, K83R, Q108L.
마찬가지로 VHH3.117의 경우 표 3에 제공된 'VHH3-117-hc'라는 인간화 버전은 Q1D, Q5V, K83R 및 Q108L 치환이 있는 변이체로 구성된다.
본 명세서의 작제물 및 분석에 기초하여, 펩티드 링커, Fc 도메인, 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 변이체 이중특이적 작제물을 설계하는 것은 숙련가에게 분명하다.
실시예 8. SARS-CoV-2에 대한 이중특이적 VHH의 중화 가능성.
초기 2가/이중특이적 항체 작제물 세트를 생산하고, 이들의 중화 활성을 분석했다. VSV-DG 스파이크(SARS-CoV-2V) 중화 검정은 도 14에 표시된 작제물의 연속 희석액을 사용하여 수행되었는데: 'pX-B1', 'pX-B2' 및 'pX-B3' 작제물은 서로 다른 GS 링커를 갖는 동종2가 VHH72-h1-S56A 단백질을 암호화하는 것으로, 또한 VHH72 결합 부위 결합제인 VHH3.83과 'pX-B7', 'pX-B8' 및 'pX-B11'에 의해 암호화된 VHH3.117을 조합한 이중특이적 형식과 중화 가능성을 비교하기 위해 사용된다. 이들 데이터는 이중특이적 VHH가 동종2가 작제물과 적어도 동일한 규모의 중화 활성을 제공하고, 링커를 추가로 최적화하면, VHH 및 변이체 서열의 위치가 SARS-CoV-2 치료시 치료 용도에 적합한 후보를 드러낸다는 것을 입증한다. 또한, 감소된 돌연변이 탈출 가능성을 나타내는, 두 결합 부위의 보존된 특성을 고려할 때, 이러한 이중특이적 형식은 강력한 범-특이적 사베코바이러스 항체를 개발하기 위한 기초가 된다.
이전 유세포 분석법 분석에 따르면, VHH3.117은 비록 친화도가 감소했지만 계통군 1 및 계통군 2 사베코바이러스들의 RBD와 계통군 3 BM48-31 사베코바이러스의 RBD에 강력하게 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다(EP21166835.5 및 PCT/EP2022/052919 참조). 대조적으로, BM48-31은 VHH3.83에 의해 효율적으로 인식되었다. 또한, VHH3.83은 테스트된 모든 계통군 1 사베코바이러스(SARS-CoV-2, PD-천산갑, RaTG3, SARS-CoV-1, LYRa11)의 RBD 및 Rf1을 제외(데이터는 표시되지 않음)하고 테스트된 모든 계통군 2 사베코바이러스(HKU3-1, Rp3, ZXC21, ZC45)의 RBD에도 강력하게 결합할 수 있었다. Rf1의 RBD를 발현하는 효모 세포에 대한 VHH3.83의 명확한 결합은 100ug/ml에서 관찰될 수 있었지만 1ug/ml에서는 관찰되지 않았다(데이터는 표시되지 않음). VHH3.117 및 VHH3.83(예를 들어, B007)을 포함하는 2가 VHH가 테스트된 모든 계통군 1, 2 및 3 사베코바이러스의 RBD에 강력하게 결합할 수 있는지 테스트하기 위해, 본 발명자들은 효모 세포 ELISA를 통해 표면에 각각의 RBD를 발현시키는 효모 세포에 대한 VHH3.117, VHH3.83 및 B007(pX-B7에 의해 인코딩됨)의 결합을 조사했다. 도 15a 및 15b는 B007이, 각각의 1가 VHH(VHH3.117 및 VHH3.83)에 의해 제대로 인식되지 않는 RBD를 포함하여 테스트된 모든 RBD에 잠재적으로 결합할 수 있음을 보여준다.
또한, VHH3.83에 융합된 VHH3.117을 암호화하는 pX-B7, pX-B9 및 pX-B10, 또는 VHH3.117-VHH72 결합 이중특이적 형식을 암호화하는 pX-B4 및 pX-B5로부터 발현된 이중특이적 작제물을 사용하여 가성중화 검정을 수행하였다. 도 16에 도시된 바와 같이, 1가 VHH3.83이 VHH72-S56A보다 친화도가 높지만, VHH3.117-VHH72-S56A는 VHH3.117-VHH3.83보다 더 강력하다. 또 다른 관찰 결과, GS 링커 길이가 VHH3.117-VHH72의 효능에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 보였지만, 1xG4S가 짧을수록 가장 좋지 않은 EC50을 초래했다. 반면, VHH3.117-VHH3.83의 경우 더 짧은 1xG4S가 6xG4S 링커보다 3.5배 더 강력했다.
실시예 9. VHH3.117 에피토프에 대한 결합제로서 VHH3.89 계열의 식별.
VHH3.89(서열 번호: 85)는 이전에 보고된 바와 같이 식별되었고(PCT/EP2021/052885), VHH3_183 및 VHH3C_80(각각 서열 번호: 86-87로 표시됨)에 상응하는, 이 Nb의 여러 추가 계열 구성원들이 여기에서 밝혀졌다.
이전 분석에서는 VHH3.117 다음으로 VHH3.89도 SARS-CoV-2 RBD 결합에 대해 VHH72와 경쟁하지 않는 것으로 나타났다(도 2 참조). 이를 확인하고, VHH3.89의 결합 부위를 추가로 특성화하기 위해, ELISA 플레이트에 직접 코팅되거나 코팅된 단클론 항체 S309, CB6에 의해 또는 VHH3.117에 의해 또는 인간 IgG1 Fc에 융합된 VHH72-S56A(D72-53 = VHH72_h1_E1D_S56A-(G4S)2-hIgG1힌지_EPKSCdel-hIgG1_LALA_Kdel)에 의해 포획된 1가 RBD에 대한 이러한 VHH의 결합을 조사했다(Pinto et al., Nature, 2020; Shi et al., Nature 2020). 도 17a는 VHH3.92와 마찬가지로 VHH3.117 계열에 속하는 VHH인 VHH3.89가 S309, CB6 및 D72-53과 경쟁하지 않지만 VHH3.117과 경쟁한다는 것을 보여준다. 이는 VHH3.89의 결합 부위가 VHH3.117 및 VHH3.92의 결합 부위와 겹친다는 것을 입증한다(도 17).
RBD 상의 VHH3.117의 결합 부위는 ACE2 결합 영역으로부터 멀리 떨어져 있으므로, 결과적으로 VHH3.117 및 관련 VHH들은 RBD가 ACE2에 결합하는 것을 방지하지 못한다(이전에 EP21166835.5 및 PCT/EP2022/052919에 표시됨). 본 발명자들은 이전에 AlphaLISA를 사용하여 VHH3.89가 용액에서 재조합 ACE2에 대한 RBD의 결합을 방해하지 않는다는 것을 입증했다(PCT/EP2021/052885, 도 47). VHH3.89도 SARS-CoV-2 RBD가 표적 세포 표면의 인간 수용체와 결합하는 것을 방지할 수 없다는 것을 확인하기 위해, 본 발명자들은 VHH3.89와 함께 사전 인큐베이션된 RBD-muFc의 Vero E6 표적 세포에 대한 결합을 테스트했다. VHH72와 관련되고, RBD가 ACE2에 결합하는 것을 방지하는 것으로 알려진 VHH3.117 및 VHH3.115를 대조군으로 사용했다. 도 18은 VHH3.117과 마찬가지로, VHH3.89가 SARS-CoV-2 스파이크들로 슈도타이핑된 VSV-delG의 중화를 위한 EC50 이상의 농도에서 ACE2 발현 Vero E6 세포들에 RBD가 결합하는 것을 방지할 수 없음을 보여준다(하기 및 도 19 참조).
VHH3.117과 유사하게, VHH3.89가 RBD와 ACE2의 결합을 차단하지 않고 SARS-CoV-2를 중화시킬 수 있는지 테스트하기 위해, 본 발명자들은 VHH3.89가 SARS-CoV-2 스파이크 슈도타이핑된 VSV-delG를 중화시킬 수 있는지 조사했다. GFP 표적화 VHH(GBP)를 음성 대조군으로 사용했고, VHH3.117 및 VHH3.92를 참조로 사용했으며, VHH72 에피토프에 결합하고 ACE2에 대한 RBD 결합을 방해하는 VHH3.83을 양성 대조군으로 사용했다(PCT/ EP2021/052885). 도 19a는 VHH3.89가 VHH3.117 및 VHH3.92의 EC50과 유사한 EC50으로 SARS-CoV-2 스파이크들로 슈도타이핑된 VSV-del G를 중화시킨다는 것을 보여준다. 또한, VHH3.89, VHH3.83, VHH3.117 또는 VHH3.92를 포함하는 PE 추출물도 SARS-CoV-1 스파이크 슈도타이핑된 VSV-delG를 중화시킬 수 있었다. SARS-CoV-2와 SARS-CoV-1의 RBD들 간의 변이를 고려하면, 이 교차 중화 활성은 VHH3.117과 VHH3.92가 매우 유사한 에피토프에 결합한다는 것을 강조한다(도 17b 및 17c).
이전 분석에 따르면, VHH3.117은 비록 친화도가 감소했지만 계통군 1 및 계통군 2 사베코바이러스들의 RBD와 계통군 3 BM48-31 사베코바이러스의 RBD에 강력하게 결합할 수 있는 것으로 밝혀졌다(EP21166835.5 및 PCT/EP2022/052919 참조). VHH3.89가 VHH3.117의 결합 부위와 매우 유사한 부위에서 RBD와 결합하는 경우, 이는 계통군 1 및 2의 RBD에 결합할 수 있어야 하며, 계통군 3 사베코바이러스의 RBD에는 더 적은 정도로 결합할 수 있어야 한다. 이를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 SARS-CoV-2(계통군 1.B), SARS-CoV-1(계통군 1.A), HKU3(계통군 1), Rf1(계통군 3) 및 BM48-31(계통군 3)의 RBD를 발현하는 효모 세포에 대한 VHH3.89의 결합을 유세포 분석법 분석에 의해 조사했다(도 20a 내지 20c). VHH3.117 및 VHH3.89는 둘 다 계통군 1 및 2 사베코바이러스의 RBD에 강력하게 결합할 수 있었고, BM48-31 계통군 3 바이러스의 RBD에는 현저하게 낮은 정도로 결합할 수 있었다. 또한, 효모 세포 ELISA로 테스트했을 때 더 확장된 일련의 계통군 1 및 2 바이러스들에 대해서도 VHH3.117과 VHH3.89 둘 모두의 강력한 결합이 관찰되었다(도 20d). 계통군 1, 2 및 3 사베코바이러스들 사이에서 보존되는 RBD 상의 몇몇 부위들을 고려하면, 이러한 결과는 VHH3.89가 VHH3.117 결합 부위와 매우 유사한 에피토프를 인식한다는 것을 강력하게 주장한다.
실시예 10. VHH72-에피토프 및 VHH3.117-에피토프 결합제의 인간화.
RBD 스파이크 단백질의 VHH72- 및 VHH3.117-에피토프를 특이적으로 표적화하는 범-특이적 코로나 항체 조성물을 개발하는 관점에서, VHH를 포함하는 적어도 2개의 빌딩 블록들의 융합 단백질이 본원에 기술되었다. 상기 범-특이적 조성물은 이중특이적 작제물의 형태로 본원에서 제안되며, 여기서 2개의 빌딩 블록들은 펩티드 직접, 링커를 통해, 또는 또 다른 모이어티를 통해 연결된다. 예를 들어, VHH 빌딩 블록은 1가, 2가 또는 이중특이적 작제물로서 Fc 꼬리에 융합될 수 있으며, 이는 숙주에서 발현시 이합체 또는 2가 형식의 상기 Fc 융합체를 포함하는 항체 조성물을 제공할 것이다. 따라서 상기 융합 작제물은 본원에 기재된 바와 같이 스파이크 단백질의 상기 결합 부위 1 및 2에 결합할 수 있을 것이다. 이러한 VHH 함유 범-특이적 작제물의 개발은 VHH 빌딩 블록, 및/또는 링커의 추가 인간화 또는 Fc 꼬리와 같은 추가 모이어티를 필요로 할 수 있다. 숙련가는 당업계에 공지된 인간화를 위한 방법론 및 기술을 숙지하고 있으며, 수많은 인간화 치환들을 시험해 볼 수 있는 지식을 보유하고 있다. 낙타과 VHH 서열의 인간화를 위한 바람직한 위치 및 잔기는 본 명세서 위에 기재되어 있다. 특히, 본원에 제공된 예시적인 융합체의 경우, 본 발명자들은 본원에 기재된 결합제의 인간화 변이체를 만들기 위한 통찰력과 작제물을 추가로 제공한다.
수많은 VHH72 변이체들이 이전에 개시되었으며(Schepens et al. 2021 (Biorxiv doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.08.433449 및 PCT/EP2021/052885, 예를 들어 VHH72-S56A 또는 이의 인간화 변이체에 대해 본원에 기재된 바와 같이 2가 또는 다가 또는 이중특이적 또는 다중특이적 형식으로 사용될 수 있다.
또한, 추가의 VHH72 인간화 변이체가 피치아 파스토리스에서 생성 및 생산되었으며, 이는 서열 번호: 90과 관련이 있으며, 이때 VHH72_h1(E1D)(S56A) 서열(서열 번호: 4)은 5개의 위치에서 VHH3.115의 동일한 위치에 상응하는 아미노산 잔기로 각각 R27L, E31D, Y32I, A56G, L97A 위치(Kabat 넘버링에 따름)에서 치환되었다. 또한, 상기 변이체는 2가 또는 이중특이적 형식으로, 예를 들어, 서열 번호: 88-89에 제공된 것과 같은 방식으로 Fc 융합체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
또한, VHH72 외에, VHH2.50, VHH3.17, VH3.77, VHH3.115, VHH3.144 및 VHHBE4(본원에서 서열 번호: 9-14로 최초로 식별되고 표시됨)를 포함하고 본원에 기재된 동일한 계열로 식별된 다른 VHH도 VHH72와 유사한 방식으로 인간화될 수 있다. 구체적으로 프레임워크 잔기는 보다 '인간과 유사한' 것으로 알려진 잔기로 치환될 수 있지만, CDR 잔기는 유지되는 것이 바람직하다. 인간화 변이체는 바람직하게는 프레임워크 잔기, 바람직하게는 특정 VHH에 대해 본원에 나열된 FR 잔기 위치 중 하나 이상의 위치에서의 치환만이 다르며, 이때 인간화 FR1, 2, 3 또는 4는 최초 FR1, 2, 3 또는 4 서열과 비교하여 적어도 90%의 동일성을 갖는다. 예를 들어, 서열 번호: 94에 표시된 Fc 융합체의 일부로서 VHH3.115 인간화 변이체가 본원에 개시되어 있다.
스파이크 단백질의 VHH72-에피토프(또는 결합 부위 1)에 특이적으로 결합하는 추가 VHH 계열이 본원에 기재되어 있으며, 이에 대한 인간화 변이체도 본원에서 고려될 수 있다.
예를 들어, VHH3.83(서열 번호: 6)의 경우, 인간화 변이체의 일 예는 최초로 식별된 라마와 비교하여 Q1D, K83R, 및 Q108L 치환(Kabat 넘버링에 따름)을 포함하는 서열 번호: 7('VHH3_83 hc')로 개시되어 있다. 유사하게, 서열 번호: 95-98로 표시된 VHH3.83 계열 구성원은 동일하거나 대안적인 방식으로 인간화될 수 있다.
또한, VHH3.36, 3.47, 3.55, 3.35, 3.29, 3.38 및 3.149(서열 번호: 15-21에 제공됨)를 포함하는 VHH72-에피토프 결합제의 경우, 인간화 변이체를 제공하기 위해 본원에 나열된 인간화 치환도 적용될 수 있다. 구체적으로 프레임워크 잔기는 보다 '인간과 유사한' 것으로 알려진 잔기로 치환될 수 있지만, CDR 잔기는 유지되는 것이 바람직하다. 숙련가는 원하는 특성을 갖는 제품을 찾기 위해 최초 VHH와 비교하여 이러한 인간화 변이체의 친화도, 결합 및 효능 잠재력을 확인해야 할 수도 있다.
상기 VHH72-에피토프 결합제 인간화 변이체를 사용하는 다가 또는 다중특이적 형식도 본원에서 의도되며, 예를 들어 서열 번호: 73-84 및 서열 번호: 88, 89, 및 91-93, 또는 이의 추가 인간화 변이체로 설계될 수 있다.
유사하게, VHH3.117과 같은 VHH3.117-에피토프 결합제의 경우, 표 3에 제공된 'VHH3-117-hc'로 명명된 인간화 버전은 Q1D, Q5V, K83R 및 Q108L(Kabat 넘버링에 따름) 치환을 갖는 변이체를 구성한다.
대안적으로, VHH3.117의 특성화를 위해 수많은 인간화 변이체들이 고려되며, 다음 위치(Kabat 넘버링에 따름)에서 인간화 치환을 위한 가장 두드러진 5개의 후보 잔기들이 있으며: 피로글루타메이트를 피하기 위해 Q1을 D로 치환하지만, N-말단 치환은 이것이 에피토프 영역 근처에 가깝게 위치하므로 VHH3.117의 결합 특성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 결합 가능성을 확인하기 위해 이러한 변이체에 대한 추가 심층 분석이 필요할 수 있다. 추가로, Q5를 V로 대체, K84를 N으로 대체, K87을 R로 대체, Q108을 L로 대체하는 것이 본원에서 고려된다.
구체적으로 VHH3.117(서열 번호: 22)의 최초 라마 기반 서열의 경우, 적절한 인간화 변이체를 얻기 위해 CDR3 내의 두 메티오닌 잔기를 대체할 수 있는 개발가능성이 요구될 수 있다. 그러나 결합 능력이 느슨해지거나 영향을 받지 않도록 주의해야 하므로 순차적 치환 방법이 권장된다.
또한, 적절한 인간화 변이체를 얻기 위해 추가 잔기 치환이 필요할 수 있으며, 상기 치환에는 프레임워크 2의 39번 위치에 있는 프롤린을, 예를 들어, 알라닌으로 치환, 64-65번 위치에 있는 A-Q, 및 77-78번 위치에 있는 S-A의 치환, 뿐만 아니라 프레임워크 3에 있는 E82를 예를 들어 각각 VK, NT 또는 NA, 및 Q로 치환, 및 119번 위치에 있는 K를 Q로 치환하는 것이 포함된다(Kabat 넘버링에 따름).
VHH3.117의 인간화에 추가하여, VHH3.92, 3.94, 3.42 및 3.180(서열 번호: 2-5로 표시됨)을 포함하는 계열 구성원에서 유사한 치환이 고려될 수 있다.
구체적으로 프레임워크 잔기는 보다 '인간과 유사한' 것으로 알려진 잔기로 치환될 수 있지만, CDR 잔기는 유지되는 것이 바람직하다. 구체적으로, VHH3.117 계열 구성원의 인간화의 경우, CDR1에 대해 서열 번호: 70, CDR2에 대해 서열 번호: 71, 및 CDR3에 대해 서열 번호: 73으로 제공된 CDR 서열은 본원에 제공된 대로 유지되어야 하고, 인간화 변이체는 프레임워크 잔기, 바람직하게는 특정 VHH에 대해 본원에 나열된 FR 잔기 위치 중 하나 이상의 위치에서의 치환만이 다르며, 이때 인간화 FR1, 2, 3 또는 4는 최초 FR1, 2, 3 또는 4 서열과 비교하여 적어도 90%의 동일성을 갖는다.
상기 VHH3.117-에피토프 결합제 인간화 변이체를 사용하는 다가 또는 다중특이적 형식도 본원에서 의도되며, 예를 들어 서열 번호: 76-84 및 서열 번호: 91-93, 또는 이의 추가 인간화 변이체, 또는 본원에 제시된 것과 유사한 대체 융합 조합으로 설계될 수 있다.
대안적으로, 본원의 실시예 9에 기재된 바와 같은 VHH3.89 계열이 또한 당업계에서 통상적으로 고려되는 인간화 치환과 유사하게 인간화를 위해 고려될 수 있다. 바람직하게는, 인간 유사 서열에 가장 가까운 CDR 및 FR의 최초 서열을 조합하기 위해, VHH3.89 계열의 다른 계열 구성원에 기초한 '키메라' VHH를 구성하는 인간화 변이체가 고려될 수 있다. 예를 들어, VHH3.89의 CDR1을 VHH3.83의 FR과 조합하면 다른 계열 구성원과 비교하여 CDR1에 이중 결실이 있다.
상기 제안된 인간화 변이체의 발현 및 정제는 클로닝, 발현 및 생산에 대해 본원에 개시된 방법에 따라, 그리고 숙련가에게 공지된 바와 같이 수행될 수 있다. 가장 적합한 인간화 변이체들의 선택을 위한 분석에는 RBD와의 결합에 대해 최초 VHH와 비교하여 인간화 VHH의 특이적 결합 능력, 이의 친화도, 및 이의 중화 가능성에 대한 검증이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
실시예 11. 이중특이적 헤드-투-테일 융합 VHH는 바이러스 탈출에 대한 장벽을 높인다.
본 발명자들은 ACE2 경쟁 VHH가 ACE2 경쟁 없이 RBD에 결합하는 VHH에 융합된 이중특이적 작제물이 바이러스 탈출을 줄일 수 있는지 테스트했다. VHH3.117(부위 2에 결합하는 비ACE2 경쟁자) 및 VHH3.83_N85E(부위 1에 결합하는 ACE2 경쟁자)의 헤드-투-테일 융합체(서열 번호: 80)인 B008 및 이의 1가 부분에 대해 RBD 돌연변이체의 심층 돌연변이 스캐닝(DMS)을 수행했다(PCT/EP2022/052919 및 PCT/EP2021/052885). VHH3.83의 N85가 추정되는 N-글리코실화 부위이므로, B008에서 글루탐산으로 치환되었다. 본원에 기재된 B007(서열 번호: 79)은 B008과 동일한 N85E 돌연변이를 제외한다. 융합 작제물 옆에는 두 VHH의 등몰 칵테일/조성물도 포함되었다. 도 21a는 각 RBD AA 위치에 대해 해당 위치에서 테스트된 각 AA 치환에 대해 표시된 VHH/VVH 작제물/VHH 조성물에서 결합을 탈출하는 분율의 합을 보여준다. 개별 1가 VHH와 비교하여, 칵테일/조성물, 특히 B008 헤드-투-테일 융합체는 결합으로부터의 탈출을 강력하게 제한한다. 일관되게, 치환으로 인해 VHH 결합으로부터 상당히 탈출한 AA 위치의 수 및 탈출 분율은 헤드-투-테일 융합체 B008과 비교하여 개별 VHH에서 더 높았다(도 21b 및 22). VHH3.117 처리된 샘플의 경우 6개의 AA 위치(Y365, N394, Y396, S514, E516 및 V524)에서 상당한 탈출이 관찰되었다. 모든 돌연변이는 스파이크/VHH3.117 복합체의 cryo-EM 및 DMS에 의해 이전에 결정된 VHH3.117 결합 부위에 위치한다(PCT/EP2022/052919). VHH3.83 처리된 샘플의 경우 4개 AA 위치(S366, K378, Y308 및 P384)에서 상당한 탈출이 관찰되었다. S366을 제외하고, 이러한 위치는 DMS에 의해 이전에 결정된 바와 같이 VHH3.83의 결합 영역에 위치한다(PCT/EP2021/052885). 또한, 모두 다 VHH3.83 결합 영역과 상당히 겹치는 영역에 결합하는 VHH72, VHH3.38 및 VHH3.55의 에피토프 매핑을 위해 DMS에 의해 S366의 돌연변이를 선택했다(PCT/EP2021/052885). S366은 이러한 VHH의 결합 부위 근처에 위치하지만 RBD 표면의 반대 부위에 있다. 해당 위치의 돌연변이는 알로스테릭 메커니즘을 통한 결합에 영향을 미칠 수 있다(PCT/EP2021/052885). 비록 낮은 빈도이긴 하지만, VHH3.83 및 VHH3.117 개개에 대해서도 탈출이 관찰된 P384 및 S514를 포함하는 3개 위치에서 VHH3.117/VHH3.83 칵테일/조성물의 결합으로부터의 탈출이 관찰되었다(도 21b 및 22). 놀랍게도, 수용체 결합 모티브에 위치하고 두 개의 VHH 결합 부위에서 멀리 떨어진 위치 Q493(Q493N)에서도 탈출이 관찰되었다. REGN10933 및 REGN10987 칵테일에 대해서도 유사한 관찰이 이루어졌다: DMS 분석 결과, 칵테일로부터 E406W에 대한 강력한 탈출을 나타냈지만, 개별 항체에 대해서는 그렇지 않은 것으로 나타났다(Starr et al. 2021. Science 371:850-854). RBD의 이러한 AA 위치는 REGN10933 및 REGN10987의 결합 부위와 멀리 떨어져 있다. VHH3.117이 VHH3.83에 헤드-투-테일로 융합되어 있는 B008 작제물의 경우, 단 1개 위치(S514)에서만 상당한 탈출이 관찰되었으며 매우 드물게 관찰되었다. 1가 VHH3.117에 대해서도 해당 위치에서의 탈출이 관찰되었다. 이러한 데이터에서는, 단 하나의 VHH만이 ACE2와 경쟁할 수 있는 이중특이적 VHH 융합 작제물이, 상응하는 1가 VHH를 사용한 치료와 비교하여 바이러스 탈출에 대한 장벽을 강력하게 높인다는 것을 보여준다.
실시예 12. VHH3.83과 VHH3.117의 헤드-투-테일 융합체는 개별 VHH에 의한 중화에서 탈출하는 SARS-CoV-2 변이체를 강력하게 중화시킨다.
다음으로, 본 발명자들은 각각 결합 부위 1과 2를 표적으로 하는 2개의 VHH의 헤드-투-테일 융합체(즉, 실시예 11에 기재된 B008 작제물)가 2개의 융합된 VHH들 중 하나에 의한 중화에서 탈출하는 SARS-CoV-2 변이체의 탈출을 극복할 수 있는지 테스트했다. 따라서, 본 발명자들은 DMS 분석에서 각각 VHH3.83 및 VHH3.117에 의한 결합에서 탈출한 K378N 치환을 포함하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 Y396H 치환을 포함하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질로 슈도타이핑된 VSV 입자를 생성했다. 이러한 슈도타이핑된 바이러스 입자를 사용한 중화 검정 결과, K378N 및 Y396H 치환이 각각 VHH3.83 및 VHH3.117에 의한 중화에 유의한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이와는 극명하게 대조적으로, B008은 여전히 K378N 및 Y396H 변이체 슈도타이핑된 바이러스 입자를 모두 강력하게 중화시킬 수 있었다(도 23).
자연적으로 발생하는 SARS-CoV-2 알파, 베타, 델타 및 감마 변이체는 결합 부위 1과 2에서 멀리 떨어진 RBD 돌연변이를 가지고 있다. B008 헤드-투-테일 융합 작제물이 이러한 변이체를 강력하게 중화시킬 수 있는지 확인하기 위해, 각각의 SARS-CoV-2 변이체의 RBD 돌연변이를 포함하는 스파이크 단백질로 슈도타이핑된 VSV 입자를 사용하여 중화 검정을 수행했다. 또한, 본 발명자들은 SARS-CoV-2 변이체 바이러스에서 돌연변이된 모든 RBD 위치에서 돌연변이된 스파이크 단백질로 슈도타이핑된 VSV 바이러스 입자를 생성했다. 도 24는 B008이 기재된 모든 VSV 입자의 감염을 강력하게 방지할 수 있었음을 보여준다. 이는 B008이 이러한 SARS-CoV-2 변이체를 강력하게 중화시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 13. VHH3.83 및 VHH3.117을 포함하는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물은 개별 1가 VHH들에 의한 중화에서 탈출하는 SARS-CoV-2 변이체를 강력하게 중화시킨다.
헤드-투-테일 융합체 외에도 본원에 기재된 결합 부위 1 및 2를 표적으로 하는 VHH를 포함하는 다른 이중특이적 형식도 SARS-CoV-2를 강력하게 중화시키고 바이러스 탈출에 대한 높은 장벽을 제공할 수 있는지 알아보기 위해, VHH3.83 및 VHH3.117을 포함하는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물(KiH19, 서열 번호: 108 및 107)을 생성했다. B008과 유사하게, KiH19는 각각 1가 VHH3.83 및 1가 VHH3.117에 의한 중화에서 크게 탈출하는 K378N 및 Y396N 치환을 포함하는 바이러스를 강력하게 중화시킬 수 있었다(도 25). 이러한 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물이 두 VHH에 대한 탈출 돌연변이를 포함하는 바이러스를 여전히 중화시킬 수 있는지 테스트하기 위해, 본 발명자들은 K378N 및 Y396H 돌연변이를 모두 포함하는 스파이크로 슈도타이핑된 VSV 입자를 생성했다. 놀랍게도, KiH19는 이러한 이중 탈출 슈도바이러스 변이체를 모체 WT 대응물만큼 효율적으로 중화시킬 수 있었다(도 25). 이는 본원에 기재된 결합 부위 1을 표적으로 하는 VHH와 본원에 기재된 결합 부위 2를 표적으로 하는 VHH를 단일 분자로 조합하면 바이러스 탈출에 대한 장벽을 강력하게 높일 수 있음을 보여준다.
실시예 14. 에피토프 1 및 2를 표적으로 하는 VHH를 포함하는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물은 SARS-CoV-2 오미크론 BA.2 변이체를 강력하게 중화시킬 수 있다.
다른 SARS-CoV-2 변이체와 비교하여, 오미크론 변이체는 RBD를 포함한 스파이크 단백질에 훨씬 더 많은 수의 돌연변이를 보유하고 있다. 여러 연구에 따르면, 긴급 승인 하에 사용되거나 고급 임상 개발(advanced clinical development)에 사용되는 많은 단클론 항체의 중화 활성이 오미크론 BA.1 및 특히 오미크론 BA.2 변이체에 대해 완전히 또는 심각하게 손상되는 것으로 나타났다(Bruel et al. 2022. Nat Med. doi: 10.1038/s41591-022-01792-5.; Cameroni et al. 2022. Nature 602:664-670). 따라서, 본 발명자들은 오미크론 BA.2 변이체로 슈도타이핑된 바이러스 입자에 대해, 실시예 13에 기재된 KiH19와 KiH19가 포함하는 2개의 1가 VHH(즉, VHH3.83 및 VHH3.117)의 Fc 융합체의 중화 활성을 조사했다. 18개의 C-말단 아미노산이 결실된 오미크론 BA.2 스파이크 단백질의 코딩 서열(서열 번호: 130)을 합성 뉴클레오티드 서열로 주문하였고, 발현 벡터에 클로닝하여 오미크론 BA.2 스파이크 단백질로 슈도타이핑된 VSV 입자를 생성하였다. 도 26d는 오미크론 BA.2 변이체에서 돌연변이된 RBD 표면의 위치를 보여준다. 보고된 내용에 따르면, 각각 승인된 치료 항체인 소트로비맙과 에테세비맙의 모 항체 S309 및 CB6의 중화 활성은 BA.2 돌연변이에 의해 크게 감소되거나 폐지된다(Bruel et al. 2022). VHH3.83-Fc의 경우 중화 활성의 손실이 보다 완만하게 관찰된 반면, VHH3.117-Fc의 활성은 영향을 받지 않은 채 유지되었다(도 26). KiH19의 중화 활성은 약간의 영향(2.4배)만 받았다(도 26).
실시예 15. 에피토프 1 및 2를 표적으로 하는 VHH를 포함하는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물은 2개의 VHH로 이루어진 2가 Fc 융합체에 의해 잘 인식되지 않는 RBD를 포함하여 계통군 1, 2 및 3 SARS-CoV-2 변이체의 RBD에 효율적으로 결합한다.
실시예 5에서는 VHH3.117이 광범위한 사베코바이러스 패널의 RBD를 효율적으로 인식하지만 계통군 3 BM48-31의 RBD에는 결합하지 못하는 것으로 나타났다(도 8a). 마찬가지로, VHH3.83도 광범위한 사베코바이러스 패널의 RBD를 효율적으로 인식하지만 계통군 2 Rf1 바이러스의 RBD에는 결합하지 못한다(PCT/EP2021/052885). VHH3.83과 VHH3.117을 포함하는 헤드-투-테일 융합 작제물과 유사하게(도 15a 및 15b), 놉-인투-홀 VHH-Fc가 BM48-31 및 Rf1을 포함하는 계통군 1, 2 및 3 사베코바이러스의 RBD를 효율적으로 인식하는지 테스트하기 위해, 본 발명자들은 ELISA에 의해 사베코바이러스 RBD 패널을 발현시키는 효모 세포에 대한 KiH19 및 또한 VHH3.83-Fc, VHH3.117-Fc의 결합을 테스트했다. 도 27은 VHH3.83-Fc 및 VHH3.117-Fc가 각각 Rf1 및 BM48-31에 결합할 수 있지만, 이들 변이체에 대한 결합이 다른 RBD 변이체에 비해 분명히 덜 효율적이라는 것을 보여준다. 대조적으로, KiH19는 테스트된 모든 RBD 변이체에 매우 유사한 친화도로 결합할 수 있었다. 예상한 대로, 인간 단클론 항체 S309와 CB6에 의한 RBD 결합은 각각 계통군 1 및 SARS-CoV-2 관련 바이러스로 제한되었다.
실시예 16. 에피토프 1 및 2를 표적으로 하는 VHH를 포함하는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물은 실제 델타 변이체 SARS-CoV-2 바이러스를 효율적으로 중화시킨다.
에피토프 1 및 2를 표적으로 하는 VHH를 포함하는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물이 실제 SARS-CoV-2 바이러스를 중화시킬 수 있는지 테스트하기 위해, 본 발명자들은 KiH19, 및 VHH3.83과 VHH3.117의 단일특이적 Fc 융합체를 사용하여 플라크 감소 검정을 수행했다. 도 28은 KiH19가 실제 SARS-CoV-2 델타 변이체 바이러스를 효율적으로 중화시킬 수 있음을 보여준다. 또한, VHH3.117-Fc 및 VHH3.83-Fc는 실제 델타 변이체 SARS-CoV-2 바이러스를 중화시킬 수 있지만 효험이 다소 낮다.
실시예 17. 에피토프 1 결합 VHH: VHH72-5mut 및 에피토프 2 결합 VHH: VHH3.89를 포함하는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물은 WT 및 VHH72-5mut 내성 SARS-CoV-2 변이체를 효율적으로 중화시킨다.
VHH3.115는 VHH72와 관련성이 높지만 SARS-CoV-2 RBD에 대한 친화도가 더 높고 중화 활성도 더 높다(PCT/EP2021/052885). VHH3.115의 서열을 기반으로 하여, 5개의 치환: R27L, E31D, Y31D, S56G 및 L97A를 도입함으로써 VHH72-변이체: VHH72-5mut(서열 번호: 90)를 생성했다. VHH72-5mut를 부분적으로 인간화하고 가능한 N-말단 피로글루타메이트 형성과 연관된 전하 이질성을 피하기 위해, 네이티브 N-말단 아미노산 잔기를 XVR011과 유사하게 아스파르트산으로 대체했다(Schepens et al. 2021. Sci Trans. Med 13:eabi7826). 도 29a는 VHH72-5mut(서열 번호: 88)의 Fc 융합체가 VHH72-S56A(D72-53 = XVR011, 서열 번호: 105)의 Fc 융합체와 비교하여 SARS-CoV-2 스파이크로 슈도타이핑된 VSV 입자를 중화시키는데 약 2.5배 더 강력하다는 것을 입증한다. 또한, VHH72-5mut-Fc는 D72-53에 부분적으로 내성이 있는 SARS-CoV-2 Y508H 스파이크 돌연변이로 슈도타이핑된 VSV 입자를 중화시키는 데 약 5배 더 강력하다(도 29b 및 29e). D72-53 및 VHH72-5mut-Fc는 SARS-CoV-2 S375F 변이체 스파이크 단백질로 슈도타이핑된 VSV 입자를 중화할 수 없었다(도 29c 및 29e).
그러나, VHH72-5mut가 VHH3.117과 다른, 본원에 기재된 에피토프 2 결합제인 VHH3.89의 인간화 버전과 결합하여 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물(KiH10, 서열 번호: 109 및 110)을 생성하는 경우, 이는 SARS-CoV-2 S375F 변이체 스파이크 단백질로 슈도타이핑된 VSV 입자를 약 1.6μg/ml의 IC50으로 중화시킬 수 있었다(도 29d). 또한, WT 또는 S375F 변이체 스파이크로 슈도타이핑된 VSV 입자에 대한 KiH10의 중화 활성은 VHH3.89-Fc(서열 번호: 104) 또는 VHH72-5mut-Fc(서열 번호: 88)의 중화 활성과 동일한 범위에 있었다.
KiH10이 광범위한 사베코바이러스를 효율적으로 인식할 수 있는지 테스트하기 위해, 다양한 계통군 1, 2 및 3 사베코바이러스의 RBD를 표시하는 효모 세포를 사용하여 ELISA를 수행했다. VHH72-5mut-Fc는 모든 계통군 2 RBD에 결합할 수 없는 반면, KiH10은 결합할 수 있었다(도 30a 및 30c). 또한, 계통군 3 BM48-31 RBD에 대한 KiH10의 결합은 VHH3.89-Fc에 비해 어느 정도 개선되었다(도 30b 및 30c).
KiH10에서 VHH는 (G4S)2 링커를 통해 Fc 도메인에 연결되어 있으며, Fc 도메인은 이펙터 기능을 손상시키는 LALA 돌연변이를 포함한다. VHH와 Fc 도메인 사이에 (G4S)4 링커가 있다는 것을 제외하고, KiH10과 동일한 KiH15 작제물(서열 번호: 111 및 112)이 생성되었는데, 상기 Fc 도메인은 순환 반감기를 연장시키는 YTE 돌연변이를 가지며, 인간화 VHH3.89 대신 VHH3.89의 비인간화 버전을 포함한다. WT SARS-CoV-2 스파이크로 슈도타이핑된 VSV 입자를 사용한 중화 검정에서는, KiH15가 KiH10과 매우 유사한 중화 활성을 가짐을 입증했으며(도 31b 및 31c), 이는 링커 및 Fc 도메인을 변경해도 상기 놉-인투-홀 작제물의 중화 활성에 영향을 미치지 않았음을 보여준다.
종합적으로, 이러한 데이터에서는, VHH3.83 및 VHH3.117(KiH19에서 사용됨) 이외의 본원에 기재된 다른 에피토프 1 및 에피토프 2 표적화 VHH를 포함하는 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물이 광범위한 사베코바이러스를 효율적으로 인식할 수 있고, SARS-CoV-2를 강력하게 중화시킬 수 있으므로 바이러스 탈출 장벽을 높일 수 있음을 보여준다.
실시예 18. VHH를 표적으로 하는 에피토프 1 및 에피토프 2를 포함하는 VHH1-VHH2-Fc 작제물은 광범위한 사베코바이러스 를 인식하고 SARS-CoV-2를 효율적으로 중화시킬 수 있다.
Fc 도메인에 융합된, 헤드-투-테일 융합 VHH3.117 및 VHH72(S56A)를 포함하는 작제물(VHH3.117-VHH72(S56A)-Fc = 3.117-72(S56A)-Fc, 서열 번호 118)이 생성되었다. 도 31a는 VHH3.117-VHH72(S56A)-Fc가 상응하는 VHH의 단일특이적 VHH-Fc 형식만큼 효율적으로 SARS-CoV-2 스파이크 슈도타이핑된 VSV 입자를 중화시킬 수 있었음을 보여준다(도 31c).
표면에 다양한 계통군 1, 2 및 3 RBD를 표시하는 효모 세포를 사용하여 ELISA를 수행했다. 도 32는 VHH3.117-VHH72(S56A)-Fc가 계통군 1, 2 및 3 사베코바이러스의 RBD를 효율적으로 인식했음을 보여준다.
이러한 데이터는 또한 VHH를 표적으로 하는 에피토프 1 및 에피토프 2를 포함하는 VHH-VHH-Fc 이중특이적 작제물이 특이성을 넓히고 바이러스 탈출에 대한 장벽을 높일 수 있음을 보여준다.
실시예 19. 놉-인투-홀 VHH-Fc 작제물은 이중특이적 VHH를 위한 다용도 형식이다.
VHH.XAS.51은 SARS-CoV-2 스파이크-2P 단백질을 사용한 1회 면역화와 SARS-CoV-2 RBD-SD1을 사용한 2회 후속 추가 면역화를 포함한 추가 백신접종 시리즈 후 라마 윈터(llama Winter)에서 단리된 VHH3.83의 계열 구성원이다. VHH3.83과 대조적으로, VHH.XAS.51은 N-글리코실화 부위(서열 번호: 95)를 포함하지 않는다. VHH3.83-Fc와 유사하게, VHH.XAS.51hum-Fc는 SARS-CoV-2 614G 변이체를 강력하게 중화시켰지만, 오미크론 BA.2 변이체에 대해서는 중화 활성이 다소 감소했다(도 26 및 도 33a 및 33c).
VHH3.117을 Fc-홀-사슬(서열 번호: 115)에 융합시키고 Fc-놉-사슬(서열 번호: 116)에 융합된 인간화 VHH.XAS.51과 조합하여 KiH_VHH3.117/VHH.XAS.51hum(= KiH_117/XAS.51hum, 서열 번호: 115 및 116)을 생성했다. 또한, 역 형식(KiH_VHH.XAS.51hum/VHH3.117 = KiH_XAS.51hum/117, 서열 번호: 113 및 117)도 생성했다. 인간화 XAS.51(Fc-홀-사슬)도 인간화 VHH3.89와 결합되었다(KiH_VHH.XAS.5hum/VHH3.89hum = KiH_XAS.51hum/89hum; 서열 번호: 113 및 114).
이러한 KiH 작제물은 SARS-CoV-2 614G 변이체(도 33a), 오미크론 BA.1 변이체(도 33b) 또는 오미크론 BA.2 변이체(도 33c)의 스파이크 단백질로 슈도타이핑된 VSV 입자를 사용하는 중화 검정에서 테스트되었다. 도 33은 테스트된 세 가지 SARS-CoV-2 변이체 KiH_VHH3.117/VHH.XAS.51hum 및 KiH_VHH.XAS.51hum/VHH3.117 모두 매우 유사하고, 강력한 중화 활성을 나타냈음을 보여준다. 이는 중화 활성 및 특이성이 VHH-Fc 놉-인투-홀 작제물에서 VHH의 위치에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다.
KiH_VHH3.117/VHH.XAS.51hum 및 KiH_VHH.XAS.51hum/VHH3.117의 중화 활성은 VHH.XAS.51hum의 단일특이적 VHH-Fc 형식(즉, VHH. XAS.51hum-Fc(YTE))보다 오미크론 돌연변이에 의해 영향을 덜 받았다(도 33). 마찬가지로, KiH_VHH3.117/VHH.XAS.51hum 및 KiH_VHH.XAS.51hum/VHH3.117의 중화 활성도 단일-특이적 VHH-Fc 형식: VHH.XAS.51hum-Fc(YTE)보다 오미크론 돌연변이에 의해 영향을 덜 받았다. 이는 VHH-Fc 놉-인투-홀 형식에서 VHH 중 하나의 잠재적인 활성 손실이 영향을 받지 않은 다른 VHH의 활성에 의해 지속적으로 보상될 수 있음을 나타낸다(VHH3.89-Fc의 경우 도 33, VHH3.117-Fc의 경우 도 26). 614G 변이체와 비교하여 오미크론 BA.1 변이체에 대한 VHH3.89hum-Fc(YTE)의 향상된 중화 활성은 KiH_VHH.XAS.51hum/VHH3.89hum의 향상된 중화 활성과 병행하여 나타났다(도 33b).
실시예 20. 각각 에피토프 1과 2를 표적으로 하는 2개의 VHH를 포함하는 이중특이적 VHHa-Fc-VHHb 융합체는 에피토프 1 결합 VHH의 중화에 영향을 미치는 돌연변이와 관계없이 SARS-CoV-2를 강력하게 중화시킬 수 있다.
이중특이적 VHH-Fc 놉-인투-홀 형식은 각 에피토프에 대해 단일 VHH를 포함한다. 동일한 VHH의 2개 복제물을 포함하는 단일특이적 VHH-Fc 작제물은 상응하는 1가 VHH에서 탈출할 수 있는 SARS-CoV-2 변이체에 대한 강력한 중화 활성을 유지할 수 있다(도 23 및 도 25). 각 VHH에 대한 이중특이성과 2가성을 조합하기 위해, 본원에 기재된 에피토프 1 및 에피토프 2를 각각 인식하는 2개의 VHH가 Fc 도메인의 N-말단 및 C-말단에 각각 융합되는 4가 이중특이적 VHH1-Fc-VHH2 융합체가 생성되었다(도 13e): VHH3.89hum-Fc(YTE)-VHH3.83hum (89hum-FcYTE-83hum, 서열 번호: 120) 및 이의 역 대응물 VHH3.83hum-Fc(YTE)-VHH3.89hum(83hum-FcYTE-89hum, 서열 번호: 121), 및 VHH.XAS.51hum-FcYTE-VHH3.89hum(XAS.51hum-FcYTE-89hum, 서열 번호: 119).
VHH3.89hum-FcYTE-VHH3.83hum 및 이의 역 대응물인 VHH3.83hum-FcYTE-VHH3.89hum은 SARS-CoV-2 614G(도 34a) 및 오미크론 BA.1(도 34b) 변이체의 스파이크로 슈도타이핑된 VSV 입자를 사용하는 중화 검정에서 테스트되었다. 도 34는 VHH3.89hum-FcYTE-VHH3.83hum 및 이의 역 대응물인 VHH3.83hum-FcYTE-VHH3.89hum이 각각 VHH3.83 및 VHH3.89hum의 단일특이적 VHH-Fc 융합체보다 더 강력하게 두 바이러스 변이체를 중화시켰다는 것을 보여준다. 이는 4가 이중특이적 VHH-Fc-VHH 작제물이 사베코바이러스를 강력하게 중화시킬 수 있음을 입증한다.
이러한 이중특이적 VHH-Fc-VHH 형식이 탈출 장벽을 높일 수 있는지 테스트하기 위해, SARS-CoV-2 오미크론 BA.2 변이체에 대한 중화 활성을 테스트했다. 표시된 바와 같이, SARS-CoV-2 오미크론 BA.2 변이체에 대한 에피토프 1을 표적으로 하는 VHH(VHH3.83 및 VHH.XAS.51)의 단일특이적 VHH-Fc 융합체의 중화 활성이 감소했다(도 26 및 도 33). VHH3.83-Fc(도 26)와 유사하게, VHH.XAS51hum-Fc(YTE)(XAS.51hum-FcYTE)의 중화 활성은 오미크론 BA.2 돌연변이에 의해 부분적으로 영향을 받은 반면(도 33a 및 33c), VHH3.89hum-Fc(YTE)(89hum-FcYTE)의 중화 활성은 영향을 받지 않았다(도 33a 및 33c). 놀랍게도, 이러한 2개의 VHH를 포함하는 VHH.XAS.51hum-Fc(YTE)-VHH3.89hum(XAS.51hum-FcYTE-89hum)은 SARS-CoV-2 오미크론 BA.2 바이러스에 대한 완전한 중화 활성을 유지했다(도 35). 유사하게, VHH3.83-Fc(83-Fc)의 중화 활성이 오미크론 BA.2 돌연변이에 의해 영향을 받은 반면(약 6배 감소, 도 26), VHH3.89hum-FcYTE-VHH3.83hum(89hum-FcYTE)-83hum) 및 이의 역 대응물인 VHH3.83hum-FcYTE-VHH3.89hum(83hum-FcYTE-89hum)은 완전한 중화 활성을 유지했다(도 35a 및 35c). 또한, SARS-CoV-2 오미크론 BA.1 변이체의 경우 테스트된 VHH-Fc-VHH 작제물은 과거 SARS-CoV-2 614G 균주의 중화 활성과 유사한 중화 활성을 유지했다(도 35b). 이러한 데이터는, 에피토프 1 및 2를 표적으로 하는 이중특이적 VHH-Fc-VHH 융합체가 이러한 에피토프를 표적으로 하는 단일특이적 VHH-Fc 작제물과 비교하여 바이러스 탈출에 대한 장벽을 높이는 광범위하고 강력한 중화 활성을 가진다는 것을 입증한다.
실시예 21. 심층 돌연변이 스캐닝에 의한, 돌연변이 시 VHH3.117 및 VHH3.89에 대한 결합을 상실할 수 있는 SARS-CoV-2 RBD 아미노산 위치의 결정.
RBD의 전체 길이에 걸쳐 플롯팅된 심층 돌연변이 스캐닝 신호를 비교한 결과, VHH3.89 및 VHH3.117을 사용하여 얻은 프로파일이 매우 유사하다는 것을 보여주며(도 36a 및 36b), 이는 이러한 두 VHH 계열이 매우 유사한 SARS-CoV-2 RBD 아미노산 위치 세트의 돌연변이에 의해 이들의 결합에 기능적으로 영향을 받는다는 것을 입증한다.
RBD의 전체 접힘 무결성에 중요한 이황화 결합에 영향을 미치는 돌연변이 외에도, 식별된 아미노산 위치의 대부분은 이러한 VHH와 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 복합체의 상응하는 cryoEM 결정 구조물(도 37)을 조사한 결과 이러한 VHH와 RBD의 직접 결합 접촉 영역의 일부를 효과적으로 형성하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 VHH3.89 및 VHH3.117 둘 모두에 대한 핵심 결합 접점이 도 36c 및 36d에 박스로 표시된 위치를 포함한다는 것을 기술할 수 있다. 나머지 위치는 보다 주변부 접점이거나 핵심 접촉 영역의 국소 알로스테릭 조절인자인 것으로 보인다.
실시예 22. VHH3.89 및 VHH3.117과 복합체를 이루는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 삼합체의 Cryo-EM 재구성.
스파이크 단백질 - VHH 복합체의 구조 결정을 위해, VHH3.89 또는 VHH3.117을 우한 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 HexaPro 안정화 스파이크 단백질(스파이크-6P)에 1.3몰 과량으로 첨가했다. 0.72mg/ml SC2 - VHH 복합체 3ml를 R2.1 Quantifoil 그리드에 놓은 후 그리드를 액체 에탄에 담가 급속 동결시켰다. cryoEM 데이터를 Gatan K3 직접 전자 검출기가 장착된 JEOL cryoARM300 전자 현미경에서 수집했다. Relion3을 사용하여 단일 입자들을 처리한 결과, VHH3.117 및 VHH3.89 복합체에 대해 공칭 분해능이 3.1Å인 3D 전자 전위 맵이 생성되었다. cryoEM 쿨롱 전위 맵은 VHH 제제에 상응하는 명확한 볼륨을 보여주었다. SC2 - VHH3.117 복합체의 경우, SC2 삼합체의 3개 RBD 도메인은 모두 직립 입체형태로 발견되고, 각각 VHH3.117의 단일 복제물이 결합되어 있다(도 38). SC2 - VHH3.89 복합체의 경우, SC2 삼합체의 3개 RBD 도메인은 모두 직립 입체형태로 발견되지만, SC2 프로토머 3의 RBD에 대한 국부 맵 밀도가 좋지 않아 이 RBD에서 큰 입체형태 유연성을 나타낸다(도 38). SC2 프로토머 1과 2의 RBD에는 각각 VHH3.89의 복제물이 결합되어 있다.
실시예 23. VHH3.117 및 VHH3.89-Fc는 스파이크 S1 서브유닛의 조기 쉐딩을 유도한다.
RBD를 표적으로 하는 대부분의 중화 항체 또는 나노바디는 RBM(예를 들어, CB6)에 직접 결합하거나 입체 장애(예를 들어, VHH72)에 의해 RBD가 이의 수용체 ACE2에 결합하는 것을 방지함으로써 중화시킨다(Wrapp et al. (2020) Cell 181:1004-1015.e15). 또한, ACE2 결합을 차단하는 항체는 S1 쉐딩 및 이에 따른 조기 스파이크 트리거링을 유도할 수 있다(Wec et al. (2020) Science 369:731-736). VHH3.89 및 VHH3.117이 SARS-CoV-2를 중화시키지만(도 19), 이들은 RBD와 ACE2의 결합을 차단할 수는 없다. 중화 항체의 대안적인 메커니즘은 S1 쉐딩 및 결과적으로 조기 스파이크 트리거링을 유발할 수 있다. VHH3.117 및 VHH3.89-Fc가 S1 쉐딩을 유도할 수 있는지 조사하기 위해, 본 발명자들은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하는 세포를 이러한 항체와 함께 인큐베이션하고, 다클론 S1 특이적 항혈청을 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 성장 배지로의 S1 쉐딩을 검출했다. ACE2 차단 항체 CB6 및 VHH72-Fc는 양성 대조군으로 포함되었다(Schepens et al. (2021) Sci. Transl. Med. 13). ACE2 결합을 차단하지 않고 S1 쉐딩을 유도하지 않는 것으로 나타난 비-중화 항체 CR3022가 음성 대조군으로 포함되었다(Wec et al. (2020)). 또한, 본 발명자들은 ACE2 결합을 차단하지 않는 중화 항체 S309도 포함시켰다(Tortorici et al. (2021) Science 370:950-957). 예상한 대로 RBD에 대한 ACE2 결합을 차단할 수 있는 항체(CB6 및 VHH72-Fc)는 세포 표면에서 성장 배지로 S1의 쉐딩을 유도했으며, 이는 성장 배지(SN)에 S1 서브유닛이 축적되고, PBS 처리된 세포와 비교하여 세포 분획에 남아 있는 것이 감소하는 것으로 관찰되었다(도 40a). RBD에 대한 ACE2의 결합을 차단할 수 없는 2개의 기존 항체 S309 및 CR3022도 스파이크 발현 세포로부터 S1 쉐딩을 유도하지 않았다(도 40). S309 및 CR3022와 극명하게 대조적으로, 그리고 RBD에 대한 ACE2의 결합을 차단할 수 없음에도 불구하고, VHH3.117 및 VHH3.89-Fc는 S1 쉐딩을 유도했다(도 40). 어떠한 이론에도 얽매이기를 바라지 않고, 이들 VHH에 의해 유도된 S1 쉐딩에 대한 가능한 설명은 이러한 VHH의 공통 결합 영역이 스파이크 삼합체 내에서 크게 가려져 있다는 것이다. 따라서 이러한 VHH의 결합은 네이티브 스파이크 삽합체의 불안정화를 초래할 수 있으므로, 결과적으로 S1 쉐딩 및 조기 스파이크 트리거링을 촉진할 수 있다.
재료 및 방법
피치아 파스토리스 및 이. 콜라이 에 의한 VHH의 생산.
피치아 파스토리스에서 VHH의 소규모 생산은 문헌(Wrapp et al. 2020 Cell)에 기재되어 있다. 이. 콜라이에서 VHH의 생산을 위해, 관심 VHH를 함유하는 pMECS 벡터를 WK6 세포(비-억제 이. 콜라이 균주)로 형질전환시키고, 암피실린을 함유하는 LB 플레이트에서 평판배양하였다. 다음날 클론을 피킹(picking)하고, 200rpm으로 진탕하면서 37℃에서 100ug/ml 암피실린 및 1% 글루코스를 함유하는 LB 2mL에서 밤새 성장시켰다. 이러한 전배양액 1ml를 사용하여 100μg/ml 암피실린, 2mM MgCl2 및 0.1% 글루코스가 보충된 TB(terrific broth) 25ml에 접종하고, OD600이 0.6 내지 0.9에 도달할 때까지 진탕(200 내지 250rpm)하면서 37℃에서 인큐베이션했다. VHH 생산은 IPTG를 1mM의 최종 농도로 첨가함으로써 유도되었다. 이러한 유도된 배양액을 200rpm에서 진탕하면서 28℃에서 밤새 인큐베이션했다. 생산된 VHH를 주변세포질로부터 추출하고, Wrapp 등에 기재된 바와 같이 정제했다. 요컨대, VHH는 Ni 세파로스 비드(GE Healthcare)를 사용하여 용액으로부터 정제되었다. 500mM 이미다졸을 사용하여 용리한 후, VHH 함유 통과 분획을 Vivaspin 컬럼(5kDa 컷오프, GE Healthcare)을 사용하여 PBS로 버퍼 교환했다. 정제된 VHH를 SDS-PAGE와 쿠마시 염색, 및 온전한 질량 분석법으로 분석했다.
효소 결합 면역흡착 검정.
미량역가판(유형 II, F96 Maxisorp, Nuc)의 웰들을 100ng의 재조합 SARS-CoV S-2P 단백질(폴돈(foldon) 포함), SARS-CoV-1 S-2P 단백질(폴돈 포함), 마우스 Fc 태그된 SARS-CoV-2 RBD(Sinobiologicals), 또는 BSA로 4℃에서 밤새 코팅했다. 코팅된 플레이트를 PBS 중 5% 밀크 파우더(milk powder)로 차단했다. VHH의 연속 희석액을 상기 웰들에 첨가했다. 상기 플레이트를, HRP 접합된 양 항-마우스 IgG 항체(GE healthcare) 또는 HRP-접합된 토끼 항-낙타과 VHH 항체들(Genscript)과 결합된 마우스 항-HA(12CA5, Sigma)와 순차적으로 인큐베이션하여 결합을 검출했다. 세척 후 TMB 기질(테트라메틸벤지딘, BD OptETA) 50μL를 상기 플레이트에 첨가하고, 1M H2SO4 50μL를 첨가하여 반응을 중단시켰다. iMark 마이크로플레이트 흡광도 판독기(Bio Rad)를 사용하여 450nM에서의 흡광도를 측정하였다. 곡선 피팅은 비선형 회귀(Graphpad 8.0)를 사용하여 수행되었다.
VHH3.117, VHH72-Fc 또는 인간 단클론 항체 S309, CB6 또는 팔리비주맙에 의해 포획된 1가 RBD에 대한 VHH의 결합을 테스트하는 경쟁 검정을 위해, ELISA 플레이트(유형 II, F96 Maxisorp, Nuc)를 PBS 중의 1가 인간 Fc(RBD), VHH3.117, VHH72-Fc(D72-53) 또는 인간 단클론 항체에 융합된 RBD-SD1 100ng로 4℃에서 16시간 동안 코팅했다. PBS로 세척한 다음 0.1% tween-20을 포함하는 PBS로 세척한 후, 웰들을 실온에서 1시간 동안 5% 밀크 파우더를 포함하는 PBS를 사용하여 차단하고, 상기 웰들에 1가 인간 Fc에 융합된 단량체성 RBD-SD1 100ng을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 이후, HA-태그된 VHH의 연속 희석액을 웰들에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS로 2회, 2% 밀크 및 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS로 3회 세척한 후, 결합된 VHH를 마우스 항-HA-태그 항체(12CA5, Sigma) 및 HRP 접합된 양 항-마우스 IgG 항체(GE healthcare)를 사용하여 검출하였다. 세척 후 TMB 기질(테트라메틸벤지딘, BD OptETA) 50μL를 상기 플레이트에 첨가하고, 1M H2SO4 50μL를 첨가하여 반응을 중단시켰다. iMark 마이크로플레이트 흡광도 판독기(Bio Rad)를 사용하여 450nM에서의 흡광도를 측정하였다. 곡선 피팅은 비선형 회귀(Graphpad 8.0)를 사용하여 수행되었다.
생물층 간섭계
본원의 VHH의 SARS-CoV-2 RBD 결합 동역학은 Octet RED96 시스템(ForteBio)에서 생물층 간섭계를 통해 평가되었다. RBD에 대한 1가 VHH 변이체들의 친화도를 측정하기 위해, 15μg/ml의 단량체성 인간 Fc-융합된 SARS-CoV-2_RBD-SD1(Wrapp et al. 2020, 상기)을 항-인간 IgG Fc 포획(AHC) 바이오센서(ForteBio)에 0.35 내지 0.5nm의 신호로 고정시켰다. 동역학 버퍼에서 중복 200nM VHH들의 결합(120초) 및 해리(480초)를 측정했다. 분석 사이에 바이오센서를 재생 버퍼(10mM 글리신 pH 1.7)에 20초간 3회 노출시켜 재생시켰다. 데이터는 Octet Data Analysis 소프트웨어 v9.0(ForteBio)에서 이중 참조값이 공제되고, 서로 정렬되었다. 오프 레이트(kdis)를 1:1 모델에 피팅했다.
SARS-CoV-2 RBD 결합에 대한 VHH 변이체들 간의 경쟁은 Octet RED96 시스템(ForteBio)에서 생물층 간섭계를 통해 평가되었다. 2가 VHH72-hFc(50nM)를 항-인간 IgG Fc 포획(AHC) 바이오센서(ForteBio)에 고정시킨 다음, 항원 RBD-SD1_mFc(200nM)를 포화 상태까지 포획했다. 이어서, 1μM VHH 변이체(320 내지 400nm의 흡광도 스펙트럼에서 외삽된 혼탁도 프로파일을 공제한 후 Trinean DropSense 기기, Lunatic 칩에 의해 계산된 단백질 농도)와의 경쟁을 600초 동안 측정했다. 분석 사이에 바이오센서를 재생 버퍼(10mM 글리신 pH 1.7)에 20초간 3회 노출시켜 재생시켰다. 데이터는 Octet Data Analysis 소프트웨어 v9.0(ForteBio)에서 이중 참조값이 공제되고, 서로 정렬되었다.
사카로마이세스 세레비시아에 의 표면에 표시된 사베코바이러스 RBD에 대한 항체 결합의 유세포 분석법 분석.
SARS-CoV2 상동체 세트의 RBD를 암호화하는 pETcon 효모 표면 디스플레이 발현 벡터를 기반으로 하는 플라스미드 풀은 Jesse Bloom 박사가 아낌없이 제공해 주었다(Starr et al. 2020, Cell 182:1295-1310). 이 풀을 10ng 규모로 전기천공에 의해 이. 콜라이 TOP10 세포로 형질전환시키고, 카르베니실린(carbenicillin)이 보충된 저염 LB 한천 플레이트 상에 평판배양했다. 단일 클론들을 선별하고, 카르베니실린이 보충된 액체 저염 LB에서 성장시키고, 미니프렙(miniprep)했다. 선별된 플라스미드를 전체 RBD CDS를 커버하는 프라이머로 Sanger 시퀀싱하였으며, 모든 원하는 RBD 상동체가 서열 검증된 단일 클론으로 피킹될 때까지 이 과정을 반복했다. 또한, SARS-CoV2의 RBD의 CDS를 효모 코돈 최적화된 gBlock으로 주문하고, Gibson 어셈블리를 통해 pETcon 벡터에 클로닝했다. 플라스미드를 이. 콜라이로 형질전환시키고, 상기 기재된 바와 같이 프렙하고, 서열 검증하였다. 선별된 pETcon RBD 플라스미드의 DNA를 Gietz & Schiestl(Gietz et al. 2007, Nature Protocols 2:1-8 and 31-41)의 프로토콜에 따라 사카로마이세스 세레비시아에 균주 EBY100으로 형질전환시키고, 효모 드롭아웃 배지(yeast drop-out medium)(SD 한천-trp-ura)에 평판배양했다. 단일 클론을 선별하고, 정확한 삽입 길이에 대해 콜로니 PCR로 검증했다. 각 RBD 상동체의 단일 클론을 선별하고, 28℃에서 10ml 액체 억제 배지(SRaf-ura-trp)에서 밤새 성장시켰다. 이어서, 이들 전배양액을 1ml당 0.67의 OD600에서 액체 유도 배지(SRaf/Gal-ura-trp) 50ml로 역희석(back-dilute)하고, 수거 전에 16시간 동안 성장시켰다. PBS로 세척한 후, 세포를 1% PFA에 고정하고, PBS로 2회 세척하고, 1% BSA로 차단하고, 다른 농도의 VHH로 염색했다. 항체의 결합은 Alexa fluor 633 접합된 항-인간 IgG 항체(Invitrogen)를 사용하여 검출되었다. 표면에 표시된 myc 태그된 RBD의 발현은 FITC 접합된 닭 항-myc 항체(Immunology Consultants Laboratory, Inc.)를 사용하여 검출되었다. 0.5% BSA를 포함하는 PBS로 3회 세척한 후, 세포를 BD LSRII 유세포 분석기(BD Biosciences)를 사용하여 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 결합은 RBD-(FITC- 세포)의 AF647 MFI에 대한 RBD+(FITC+) 세포의 AF647 MFI 간의 비율로 계산되었다.
사카로마이세스 세레비시아에 의 표면에 표시된 사베코바이러스 RBD에 대한 항체 결합을 테스트하기 위한 효모 세포 ELISA.
다양한 계통군 1, 2 및 3 사베코바이러스의 RBD를 발현하는 고정된 효모 세포를 상기 기재된 바와 같이 준비하고, PBS에서 ELISA 플레이트(유형 II, F96 Maxisorp, Nuc)에 코팅하여 약 10 내지 20%의 컨플루언시(confluency)를 얻었다. PBS로 2회 세척한 후 세포를 실온에서 15분 동안 3% H2O2로 처리하여 효모 퍼옥시다제를 비활성화시켰다. 이후 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 0.1% Tween-20을 함유하는 PBS로 1회 세척했다. 1시간 동안 2% BSA로 차단한 후, 0.5% BSA 및 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS에서 HA-태그된 VHH의 연속 희석액을 제조하고, 세포에 첨가하고, 90분 동안 인큐베이션했다. PBS로 2회, 0.5% BSA 및 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS로 3회 세척한 후, 결합된 VHH를 마우스 항-HA-태그 항체(12CA5, Sigma) 및 HRP 접합된 양 항-마우스 IgG 항체(GE healthcare)를 사용하여 검출하였다. 세척 후 TMB 기질(테트라메틸벤지딘, BD OptETA) 50μL를 상기 플레이트에 첨가하고, 1M H2SO4 50μL를 첨가하여 반응을 중단시켰다. iMark 마이크로플레이트 흡광도 판독기(Bio Rad)를 사용하여 450nM에서의 흡광도를 측정하였다. 곡선 피팅은 비선형 회귀(Graphpad 8.0)를 사용하여 수행되었다.
Vero E6 세포에서의 RBD 경쟁 검정.
최종 농도 0.4μg/mL의 뮤린 IgG Fc(Sino Biological)에 융합된 SARS-CoV-2 RBD를 1가 VHH 1ug/ml와 함께 인큐베이션하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션한 후 얼음 위에서 추가로 10분간 인큐베이션했다. VHH가 없는 RBD(PBS) 및 RBD가 없는 PBS(RBD 없음)를 대조군으로 사용했다. 서브컨플루언시로 성장한 VeroE6 세포는 세포 해리 버퍼(Sigma) 및 트립신 처리에 의해 분리되었다. PBS로 1회 세척한 후, 세포를 얼음 위에서 PBS 중의 1% BSA로 차단했다. 나머지 모든 단계도 얼음 위에서 수행했다. RBD 및 VHH 또는 VHH-Fc 융합체를 포함하는 혼합물을 세포에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션했다. 이후, 세포를 0.5% BSA를 포함하는 PBS로 3회 세척하고, AF647 접합된 당나귀 항마우스 IgG 항체(Invitrogen)로 1시간 동안 염색했다. 0.5% BSA를 포함하는 PBS로 추가로 3회 세척한 후, 세포를 BD LSRII 유세포 분석기(BD Biosciences)를 사용하여 유세포 분석법에 의해 분석하였다.
CoV 슈도바이러스 중화 검정.
SARS-CoV-2 변이체의 RBD 돌연변이를 포함하는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 pCG1 발현 벡터는 제조업체의 지침(Aligent)에 따라 적절한 프라이머를 사용하여 QuickChange 돌연변이유발에 의해 특정 RBD 돌연변이를 순차적으로 도입함으로써 pCG1-SARS-2-Sdel18 벡터로부터 생성되었다(SARS-CoV-2 우한 WT(서열 번호: 122), D614 변이체(서열 번호: 123), 델타 변이체(서열 번호: 124), 알파 변이체(서열 번호: 125), 베타 변이체(서열 번호: 126), 감마 변이체(서열 번호: 127), 및 18-C 말단 아미노산이 결실된 전술한 변이체(서열 번호: 128)에서 돌연변이된 모든 RBD 위치의 돌연변이를 조합한 변이체의 스파이크 단백질에 대한 코딩 서열).
오미크론 BA.1 및 오미크론 BA.2 발현 벡터를 제작하기 위해, 18개의 C-말단 아미노산이 결실된 이들 스파이크 단백질의 코딩 서열(각각 서열 번호: 129 및 130)을 합성 뉴클레오티드 서열로 주문하고, 발현 벡터에 클로닝했다.
복제 결함 VSV 슈도타이핑된 바이러스를 생성하기 위해, SARS-CoV-1 S 또는 SARS-CoV-2 S로 형질감염된 HEK293T 세포에 eGFP 및 반딧불이 루시퍼라제 발현 카세트들을 포함하는 복제 결함 VSV 벡터를 접종하였다(Berger and Zimmer 2011, PloS One 6:e25858). 37℃에서 1시간 인큐베이션한 후, 접종물을 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고, 항-VSV G mAb(ATCC)가 보충된 배지에서 16시간 동안 인큐베이션했다. 이이서, 슈도타이핑된 입자를 수거하고, 원심분리에 의해 정화했다(Wrapp et al. 2020, Cell 181:1004-1015). VSV 슈도타입 중화 실험을 위해, 슈도바이러스를 GFP 결합 단백질(GBP: GFP에 특이적인 VHH) 또는 정제된 VHH의 다양한 희석액과 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 이후, 인큐베이션된 슈도바이러스를 VeroE6 세포의 하위 융합성(subconfluent) 단층에 첨가했다. 16시간 후 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 수동 용해 버퍼(Promega)를 사용하여 세포 용해물을 제조했다. Tecan infinite 200 pro 플레이트 판독기를 사용하여 세포 용해물의 GFP 형광을 측정함으로써 형질도입 효율을 정량화했다. 범례에 표시된 바와 같이, GFP 형광은 감염되지 않은 세포 및 PBS로 처리된 감염된 세포의 GFP 형광, 또는 각각의 연속 희석액의 최저 및 최고 GFP 형광 값을 사용하여 정규화되었다. 대안적으로, 감염은 promega 루시퍼라제 검정 시스템 및 GloMax 마이크로플레이트 루미노미터(Promega)를 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 정량화되었다. IC50은 비선형 회귀 곡선 피팅, log(억제제) 대 정규화된 반응 -- 가변 기울기에 의해 계산되었다.
ACE2/RBD 상호작용을 테스트하기 위한 AlphaLISA.
검정 버퍼(0.5% BSA 및 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS)에서 VHH들의 연속 희석액(최종 농도 범위 90nM 내지 0.04nM)을 제조하고, 백색의 낮은 결합 384웰 미량역가판(F-바닥, Greiner Cat nr 781904)에서 Avi-태그(AcroBiosystems, Cat nr. SPD-C82E9)를 통해 비오티닐화된 SARS-CoV-2 RBD(최종 농도 1nM)와 혼합했다. 상기 혼합물에 재조합 인간 ACE-2-Fc(최종 농도 0.2nM)를 첨가했다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 공여체 및 수용체 비드를 각각 20μg/mL의 최종 농도로 첨가하여 최종 부피가 0.025mL가 되도록 했다. RBD를 스트렙타비딘 코팅된 알파 공여체 비드(Perkin Elmer, Cat nr. 6760002)에 포획했다. 인간 ACE-2-mFc 단백질(Sino Biological Cat nr. 10108-H05H)을 실온에서 1시간 동안 어두운 곳에서 추가로 인큐베이션하여 항-마우스 IgG(Fc 특이적) 수용체 비드(Perkin Elmer, Cat nr. AL105C)에 포획했다. 비드들 간의 상호작용을 Ensight 기기에서 680nm의 조명 및 615nm의 판독 후 평가하였다. VHH72 및 관련 VHH3.115와 대조적으로, VHH3.42, VHH3.117 및 VHH3.92 중 어느 것도 각각의 중화 IC50(54.8nM, 13.7nM 및 13.55nM)을 훨씬 초과하는 용량에서조차 RBD/ACE2 상호작용을 방해할 수 없었다(도 10).
심층 돌연변이 스캐닝
심층 돌연변이 SARS-CoV2 RBD 라이브러리의 이. 콜라이로의 형질전환: pETcon 벡터에서 독립적으로 생성된 2개의 심층 돌연변이 SARS-CoV2 RBD 라이브러리의 플라스미드 프렙은 Jesse Bloom 박사가 아낌없이 제공해 주었다(Starr et al. 2020, Cell 182, 1295-1310.e20). 이러한 프렙 10ng을 전기천공을 통해 이. 콜라이 TOP10 균주로 형질전환시키고, 37℃에서 1시간 동안 SOC 배지에서 회수했다. 형질전환 혼합물을 나누고, 카르베니실린이 보충된 저염 LB 배지를 포함하는 24.5cm × 24.5cm 대형 생물검정 접시 10개에 플레이트당 100,000개 클론의 예상 밀도로 평판배양했다. 밤새 성장시킨 후, 모든 콜로니를 플레이트에서 긁어내고, 카르베니실린이 보충된 저염 LB 300ml에 재현탁시켰다. 펠렛화하기 전에 배양액을 2시간 반 동안 성장시켰다. 세포 펠렛을 멸균 MQ로 1회 세척하고, 제조업체의 지침에 따라 QIAfilter 플라스미드 Giga 프렙 키트(Qiagen)를 통해 플라스미드를 추출했다.
심층 돌연변이 SARS-CoV2 RBD 라이브러리의 에스. 세레비시아에로의 형질전환: 생성된 플라스미드 프렙 10μg을 Gietz & Schiestl(Gietz et al. 2007, Nature Protocols 2:1-8 and 31-41)의 대규모 프로토콜에 따라 사카로마이세스 세레비시아에 균주 EBY100으로 형질전환시켰다. 형질전환체는 16시간 동안 100ml 액체 효모 드롭아웃 배지(SD-trp-ura)에서 선별되었다. 이어서, 배양액을 추가 9시간 경과 동안 1 OD600에서 신선한 SD-trp-ura 100mL로 역희석했다. 그 후, 배양액을 15% 글리세롤 중의 1e8 세포 분취액으로 급속 동결하고 -80℃에서 보관했다.
SARS-CoV2의 WT RBD의 클로닝 및 형질전환: SARS-CoV2의 RBD의 CDS를 효모 코돈 최적화된 gBlock으로 주문하고, Gibson 어셈블리를 통해 pETcon 벡터에 클로닝했다. 클로닝 혼합물을 이. 콜라이 TOP10 세포에 유사하게 전기천공하고, 제조업체의 지침에 따라 미니프렙 키트(Promega)를 통해 플라스미드를 추출했다. 플라스미드를 전체 RBD CDS를 커버하는 프라이머로 Sanger 시퀀싱했다. 마지막으로, 플라스미드를 Gietz & Schiestl(Gietz et al. 2007, Nature Protocols 2:1-8 and 31-41)의 소규모 프로토콜에 따라 사카로마이세스 세레비시아에 균주 EBY100으로 형질전환시켰다. 형질전환체는 효모 콜로니 PCR을 통해 선별되었다.
ACE2에서 심층 돌연변이 SARS-CoV2 RBD 라이브러리의 사전 분류: 각 라이브러리의 분취액 하나를 해동하고 28℃에서 10 ml 액체 억제 배지(SRaf-ura-trp)에서 밤새 성장시켰다. 추가로, SARS-CoV2로부터 WT RBD를 발현시키는 pETcon 플라스미드를 포함하는 대조군 EBY100 균주를 10ml 액체 억제 배지에 접종하고, 28℃에서 밤새 성장시켰다. 이어서, 이들 전배양액을 1ml당 0.67의 OD600에서 액체 유도 배지(SRaf/Gal-ura-trp) 50ml로 역희석하고, 수거 전에 16시간 동안 성장시켰다.
세포 펠렛을 세척 버퍼(버퍼 50ml당 1× PBS + 1mM EDTA, pH 7.2 + 1개의 완전 억제제 EDTA-비함유 정제(Roche))로 3회 세척하고, 회전 휠(rotating wheel) 위에서 4℃에서 1시간 동안 염색 버퍼(세척 버퍼 + 0.5mg/ml의 소 혈청 알부민) 중의 9.09nM hACE2-muFc(Sino Biological)를 사용하여 1ml당 8의 OD600에서 염색했다. 세포를 염색 버퍼로 3회 세척하고, 회전 휠 위에서 4℃에서 1시간 동안 1:100 항-cmyc-FITC(Immunology Consultants Lab), 1:1000 항-마우스-IgG-AF568(Molecular Probes), 및 1:200 L/D eFluor506(Thermo Fischer Scientific)으로 염색했다. 세포를 염색 버퍼로 3회 세척하고, 35μm 세포 여과기(cell strainer)로 여과한 후 FACSMelody(BD Biosciences)에서 분류했다. 보상(compensation) 후, 미염색 및 단일 염색 대조군 세포의 최대 0.1%가 배경 위에 나타나도록 ACE2+ 세포를 포착하는 선별 게이트(selection gate)가 그려졌다. 라이브러리당 대략 250만 개의 ACE2+ 세포를, 각각 2× YPAD + 1% BSA로 코팅된 5ml 폴리프로필렌 튜브에 수집했다.
분류된 세포를 28℃에서 72시간 동안 100U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific)이 포함된 액체 SD-trp-ura 배지에서 회수하고, 15% 글리세롤 중의 9 OD600 단위 분취액으로 -80℃에서 급속 동결했다.
ACE2 분류된 심층 돌연변이 SARS-CoV2 RBD 라이브러리에서 나노바디 탈출 돌연변이 분류: 각 라이브러리의 ACE2 분류된 분취액 하나를 해동하고 28℃에서 10ml 액체 억제 배지(SRaf-ura-trp)에서 밤새 성장시켰다. 추가로, SARS-CoV2로부터 WT RBD를 발현시키는 pETcon 플라스미드를 포함하는 대조군 EBY100 균주를 10ml 액체 억제 배지에 접종하고, 28℃에서 밤새 성장시켰다. 이어서, 이들 전배양액을 1ml당 0.67의 OD600에서 액체 유도 배지(SRaf/Gal-ura-trp) 50ml로 역희석하고, 수거 전에 16시간 동안 성장시켰다.
세포 펠렛을 세척 버퍼(50ml 버퍼당 1× PBS + 1mM EDTA, pH 7.2 + 1개의 완전 억제제 EDTA-비함유 정제(Roche), 새로 제조되고 멸균 여과됨)로 3회 세척하고, 염색 버퍼(세척 버퍼 + 0.5mg/ml의 소 혈청 알부민)에서 염색된 나노바디당 특정 농도로 1ml당 8의 OD600으로 4℃에서 1시간 동안 회전 휠 위에서 염색했다. 구체적으로, 본 발명자들은 VHH3.117, VHH3.83 및 B008의 경우 1000ng/ml로 염색하고 VHH3.117 + VHH3.83의 칵테일의 경우 각 나노바디에 대해 500ng/ml로 염색했다. 세포를 염색 버퍼로 3회 세척하고, 회전 휠 위에서 4℃에서 1시간 30분 동안 1:2000 마우스 항-His(Biorad)로 염색했다. 세포를 염색 버퍼로 3회 세척하고, 회전 휠 위에서 4℃에서 1시간 동안 1:100 항-cmyc-FITC(Immunology Consultants Lab), 1:1000 항-마우스-IgG-AF568(Molecular Probes), 및 1:200 L/D eFluor506(Thermo Fischer Scientific)으로 염색했다. 세포를 염색 버퍼로 3회 세척하고, 35μm 세포 여과기로 여과한 후 FACSMelody(BD Biosciences)에서 분류했다. 게이팅은, 보상 후, 완전히 염색된 WT RBD 대조군 세포의 최대 0.1%가 선별 게이트에 나타나도록 선택되었다. 라이브러리당 150,000 내지 350,000개의 탈출 세포를, 각각 2× YPAD + 1% BSA로 코팅된 5ml 폴리프로필렌 튜브에 수집했다.
분류된 세포를 28℃에서 16시간 동안 100U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific)이 보충된 액체 SD-trp-ura 배지에서 회수했다.
나노바디 탈출 분류된 심층 돌연변이 SARS-CoV2 RBD 라이브러리의 DNA 추출 및 Illumina 시퀀싱: 제조업체의 지침에 따라 Zymoprep 효모 플라스미드 미니프렙 II 키트(Zymo Research)를 사용하여 분류된 세포로부터 플라스미드를 추출했는데, 단, 지몰리아제(Zymolyase) 효소와의 인큐베이션 시간이 더 늘어났고(2시간), 지몰리아제 인큐베이션 후 액체 질소에서의 동결-해동 사이클이 추가되었다.
샘플 인덱스와 나머지 Illumina 어댑터 서열을 추가하기 위해 KAPA HiFi HotStart ReadyMix를 사용하여 추출된 플라스미드에 대해 NEBNext UDI 프라이머를 사용하여 PCR을 수행했다(20 사이클). PCR 샘플은 CleanNGS 마그네틱 비드(CleanNA)를 사용하여 한 번, AMPure 마그네틱 비드(Beckman Coulter)를 사용하여 한 번 정제되었다. 0.1× TE 버퍼 15μl에서 단편을 용리시켰다. 크기 분포는 12개 모세관 단편 분석기(Advanced Analytical)에서 고감도 NGS 키트(DNF-474, Advanced Analytical)를 사용하여 평가되었다. VIB Nucleomics 코어(Leuven, 벨기에)에 의해 NovaSeq 6000에서 100bp 단일 말단 시퀀싱(single-end sequencing)을 수행했다.
시퀀싱 데이터 분석 및 돌연변이 탈출 프로파일을 사용한 에피토프 계산.
심층 시퀀싱 판독은 https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_Crowe_antibodies에서 이용가능한 코드를 사용하여 Greaney 등 2021(Cell Host Microbe 29:44-57)에 기재된 바와 같이 처리되었으며, 조정이 이루어졌다. 간단히 말하면, 뉴클레오티드 바코드 및 이의 상응하는 돌연변이는 dms_variants 패키지(0.8.6)를 사용하여 카운팅되었다. 각 바코드에 대한 탈출 분율은 농축(enrichment) 후 판독 비율을 탈출 변이체들의 농축 전 판독 비율로 나눈 값으로 정의되었다. 생성된 변이체를 필터링하여 신뢰할 수 없을 정도로 낮은 수를 제거하고, 충분한 RBD 발현 및 ACE2 결합을 갖는 변이체를 유지했다(공개된 데이터를 기반으로 함(Starr et al. 2020, Cell 182: 1295-1310)). 여러 돌연변이가 있는 변이체의 경우, 적어도 하나의 단일 돌연변이 변이체 및 2개의 전체 변이체에서 관찰되지 않은 돌연변이를 제외하고, 전체 상위성 모델(global epistasis model)을 사용하여 개별 돌연변이의 영향을 추정했다. 따라서, 중복 실험과 라이브러리 전체 평균 사이에 상관관계가 높은 얻어진 탈출 측정값을 추가 분석에 사용했다. 각 나노바디의 가장 두드러진 탈출 부위를 결정하기 위해, 총 부위 탈출이 모든 부위에서 중앙값의 10배를 초과하고, 또한 주어진 나노바디의 모든 위치에서 최대 총 부위 탈출의 적어도 10%인 RBD 위치가 식별되었다.
상당한 탈출을 나타낸 AA 위치는 PyMol(DeLano 2002. The PyMOL molecular graphics system. DeLano Scientific, San Carlos, CA.)을 사용하여 RBD 표면에서 시각화되었다.
실제 SARS-CoV-2 델타 변이체를 사용한 플라크 감소 검정.
PRNT 실험은 B.1.617.2(델타) 계통의 SARS-CoV-2 분리주를 사용하여 het KULeuven에서 수행되었다. 이 바이러스는 벨기에 환자로부터 채취한 구강인두 면봉에서 단리되었다(EPI_ISL_2425097; 2021-04-20). Vero E6 세포에 2회 계대배양하여 바이러스 스톡을 생성했다. 나노바디 작제물에 의한 중화는 나노바디 작제물의 연속 희석액을 2% FBS가 보충된 DMEM 중의 100 PFU SARS-CoV-2와 혼합하여 정량화되었다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 이를 12웰 플레이트 내 VeroE6 세포 단층에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 다음으로, 접종물을 2% FBS가 보충된 DMEM 중 0.8%(w/v) 메틸셀룰로오스로 대체했다. 37℃에서 3일 동안 인큐베이션한 후, 오버레이(overlay)를 제거하고 세포를 3.7% PFA로 고정했다. 이후, 세포를 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색했다. 반최대 중화 역가(PRNT50)는 50%의 플라크 감소를 초래하는 항체 농도로 정의되었다.
cryoEM에 의한 SC2 - VHH3.89 및 SC2 - VHH3.117 복합체의 구조 결정.
샘플 준비 및 데이터 수집: 스파이크 단백질 - VHH 복합체의 구조 결정을 위해, VHH3.89 또는 VHH3.117을 우한 SARS-CoV-2 바이러스의 재조합 HexaPro 안정화 스파이크 단백질(스파이크-6P)에 1.3배 몰 과량으로 첨가했다. Quantifoil R.2.1 Cu400 홀리 탄소 그리드(holey carbon grid)를 11mA 및 0.3mbar에서 1분 동안 ELMO 글로우 방전 시스템(Corduan Technologies)에서 글로우 방전(glow discharge)시켰다.
cryo-EM 샘플은 CP3 극저온플런저(cryoplunger)(Gatan)를 사용하여 준비했다. 0.72mg/ml의 스파이크-6P - VHH 복합체 2μl를 그리드에 적용하고, 95% 상대 주변 습도에서 와트만(Whatman) 2번 여과지를 사용하여 2초간 양쪽에서 블롯팅하고, -176℃의 액체 에탄에 플런지 동결(plunge-frozen)하고, 데이터 수집 전에 액체 질소에 보관했다.
Cryo-EM 이미지들을 카운팅 방식에서 작동하는 Gatan K3 직접 전자 검출기를 사용하여 60,000의 공칭 배율과 0.76Å의 상응하는 보정 픽셀 크기로 JEOL CryoARM 300 현미경에서 수집했다. 데이터 수집을 위해, 3.112초 노출을 프레임당 1.06e-Å-2의 전자 선량으로 60 프레임으로 선량 분할(dose-fractionated)했다. 디포커스(defocus)는 -0.9μm와 -2.2μm 사이에서 변화했다. 이러한 방식으로 스파이크-6P - VHH3.89 및 스파이크-6P - VHH3.117 복합체에 대해 각각 12915개 및 15663개의 무손실 현미경사진이 기록되었다.
EM 이미지 처리: 선량 분할 무비(dose-fractionated movie)를 RELION 4.0 베타에 가져와 RELION 자체(CPU 기반) UCSF motioncor2 프로그램 구현을 사용하여 동작을 보정했다. 대비 전달 함수(Contrast Transfer Function, CTF) 파라미터들은 CTFFIND-4.1.14를 사용하여 추정되었다. 자동피킹(autopicking)을 위한 참조는 LoG 기반 자동피킹에 이어 2D 분류를 사용하여 1000개의 현미경사진의 서브셋을 피킹함으로써 생성되었다. 이러한 참조는 전체 데이터세트의 템플릿 기반 피킹에 사용되었으며, 그 결과 스파이크-6P - VHH3.89 및 스파이크-6P - VHH3.117 복합체에 대해 각각 1894336 및 6777098개의 입자가 피킹되었고, 576픽셀의 상자 크기로 추출되고 144픽셀로 비닝(binning)되었다. 입자 스택을 청소하기 위해 3회 연속 라운드의 2D 분류를 수행하여 스파이크-6P - VHH3.89 및 스파이크-6P - VHH3.117 복합체에 대해 각각 398264 및 239918개의 입자들이 청소된 입자 스택에 남아 있게 되었다. 이러한 남아 있는 입자들을 재추출하고, 288픽셀로 비닝하고, 6개의 초기 3D 모델을 생성했다. 각 복합체에 대한 최상의 3D 클래스에 속하는 입자들을 비닝 없이 재추출하였고, 정렬 없이 연속 3D 자동 미세조정(auto-refinement), CTF 미세조정 및 분류의 세 사이클을 거쳤다. 스파이크-6P - VHH3.89 복합체의 경우, 최종 라운드의 분류 및 3D 자동 미세조정 후 222258개의 입자들이 남아 있었고, 이후 사후 처리 결과 0.143 FSC 기준에 따라 3.1Å 공칭 분해능의 맵이 생성되었다. 스파이크-6P - VHH3.117 복합체의 경우, 최종 라운드의 분류 및 3D 자동 미세조정 후 183857개의 입자들이 남아 있었고, 이후 사후 처리 결과 3.1Å 분해능의 맵이 생성되었다.
S1 쉐딩 검정
스파이크가 없거나 SARS-CoV-2 스파이크를 발현시키는 100만 개의 Raji 세포에 항체 또는 VHH를 최종 농도 10μg/ml로 첨가했다. 항체-세포 혼합물을 37℃ 및 5% CO2에서 30분 또는 1시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 세포들을 원심분리에 의해 펠렛화하고, 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, 세포 펠렛을 RIPA 용해 버퍼(50mM Tris-HCl pH 8.0, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.1% SDS, 1% NP-40)으로 용해시켰다. 상청액 및 용해물 샘플 20μl를 8% SDS-PAGE 겔에서 분리하고, 니트로셀룰로스 멤브레인에 전기블롯팅(electroblotting)했다. 멤브레인을 4% 밀크로 차단하고, 토끼 항-SARS-S1 항체(1/1000, Sino biologics, 40591-T62)로 염색한 다음, 항-토끼 IgG-HRP(1/2000, GE Healthcare, NA934V)로 염색하고, Pierce™ ECL 웨스턴 블롯팅 기질(Thermofisher Scientific)을 사용하여 발색(develop)했다.
서열 목록
>서열 번호:1: 스파이크 단백질 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (QHQ82464.1)
>서열 번호:2: VHH72 아미노산 서열
> 서열 번호: 3: VHH72-S56A 아미노산 서열
>서열 번호: 4: VHH72_h1(S56A) VHH72-S56A 아미노산 서열의 인간화 변이체 1
>서열 번호:5: VHH72_h1(E1D)(S56A) VHH72-S56A 아미노산 서열의 인간화 변이체 1(E1D)
>서열 번호:6: VHH3-83 아미노산 서열
>서열 번호: 7: VHH3.83 변이체 VHH3-83-hc 아미노산 서열
>서열 번호: 8: VHH3.83 변이체 VHH3-83-hc-N85E 아미노산 서열
>서열 번호:9: VHH2.50 아미노산 서열
>서열 번호:10: VHH3.17 아미노산 서열
>서열 번호:11: VHH3.77 아미노산 서열
>서열 번호:12: VHH3.115 아미노산 서열
>서열 번호:13: VHH3.144 아미노산 서열
>서열 번호:14: VHH3BE4 아미노산 서열
>서열 번호:15: VHH3.36 아미노산 서열
>서열 번호:16: VHH3.47 아미노산 서열
>서열 번호:17: VHH3.55 아미노산 서열
>서열 번호:18: VHH3.35 아미노산 서열
>서열 번호:19: VHH3.29 아미노산 서열
>서열 번호:20: VHH3.38 아미노산 서열
>서열 번호:21: VHH3.149 아미노산 서열
>서열 번호:22: VHH3.117 아미노산 서열
>서열 번호:23: VHH3_117-hc 아미노산 서열
>서열 번호:24: VHH3.92 아미노산 서열
>서열 번호:25: VHH3.94 아미노산 서열
>서열 번호:26: VHH3.42 아미노산 서열
>서열 번호:27: VHH3.180 아미노산 서열
>서열 번호:70 : VHH3.117 계열에 대한 CDR1의 아미노산 공통 서열, 이때 2번 위치의 X(Xaa)는 S 또는 N이다.
IXDMGW
>서열 번호:71 : VHH3.117 계열에 대한 CDR2의 아미노산 공통 서열, 이때 5번 위치의 X(Xaa)는 T 또는 S이고, 7번 위치의 X(Xaa)는 S 또는 N이며, 12번 위치의 X(Xaa)는 D 또는 N이고, 14번 위치의 X(Xaa)는 A 또는 V이며, 15번 위치의 X(Xaa)는 Q 또는 K이다.
TITKXGXTNYAXSXXG
>서열 번호:72 : VHH3.117 계열에 대한 CDR3의 아미노산 공통 서열, 이때 3번 위치의 X(Xaa)는 P 또는 L이다.
WLXYGMGPDYYGME
>서열 번호: 73: 작제물 pX-B001_GS-VHH72-h1-E1D-S56A_(G4S)6_VHH72-h1-E1D-S56A_His8에 의해 암호화된 동종이가 VHH 아미노산 서열
>서열 번호:74 : 작제물 pX-B002_GS-VHH72-h1-E1D-S56A_(G4S)_VHH72-h1-E1D-S56A_His8에 의해 암호화된 동종이가 VHH 아미노산 서열
>서열 번호:75 : 작제물 pX-B003_GS-VHH72-h1-E1D-S56A_(G4S)4_VHH72-h1-E1D-S56A_His8에 의해 암호화된 동종이가 VHH 아미노산 서열
>서열 번호:76 : 작제물 pX-B004_GS-VHH3-117-hc_(G4S)6_VHH72-h1-E1D-S56A _His8에 의해 암호화된 이중특이적 VHH 아미노산 서열
>서열 번호:77 : 작제물 pX-B005_GS-VHH3-117-hc_(G4S)_VHH72-h1-E1D-S56A _His8에 의해 암호화된 이중특이적 VHH 아미노산 서열
>서열 번호:78 : 작제물 pX-B006_GS-VHH3-117-hc_(G4S)4_VHH72-h1-E1D-S56A _His8에 의해 암호화된 이중특이적 VHH 아미노산 서열
>서열 번호: 79 : 작제물 pX-B007_GS-VHH3-117-hc_(G4S)6_VHH3-83-hc_His8에 의해 암호화된 이중특이적 VHH 아미노산 서열
>서열 번호: 80: 작제물 pX-B008_GS-VHH3-117-hc_(G4S)6_VHH3-83-hc-N85E_His8에 의해 암호화된 이중특이적 VHH 아미노산 서열
>서열 번호: 81: 작제물 pX-B009_GS-VHH3-117-hc_(G4S)_VHH3-83-hc_His8에 의해 암호화된 이중특이적 VHH 아미노산 서열
>서열 번호: 82: 작제물 pX-B010_GS-VHH3-117-hc_(G4S)4_VHH3-83-hc_His8에 의해 암호화된 이중특이적 VHH 아미노산 서열
>서열 번호: 83 : 작제물 pX-B011_GS-VHH3-117-hc_(G4S)_VHH3-83-hc-N85E_His8에 의해 암호화된 이중특이적 VHH 아미노산 서열
>서열 번호: 84: 작제물 pX-B012_GS-VHH3-117-hc_(G4S)4_VHH3-83-hc-N85E_His8에 의해 암호화된 이중특이적 VHH 아미노산 서열
>서열 번호:85: VHH3.89 아미노산 서열
>서열 번호:86: VHH3_183 아미노산 서열
>서열 번호:87: VHH3C_80 아미노산 서열
>서열 번호:88: 2가-Fc 작제물 VHH72_h1_E1D_R27L_E31D_Y32I_S56G_L97A-10xGS-hIgG1_EPKSCdel_LALA_K447del
>서열 번호:89: 2가-Fc 작제물 VHH72-h1-E1D-R27L-E31D-Y32I-S56G-L97A_(GGGGS)x2_hIgG힌지EPKSCdel_hIgGFc_N297A_Gsdel
>서열 번호:90: VHH72-h1-E1D-R27L-E31D-Y32I-S56G-L97A 아미노산 서열
>서열 번호:91: 작제물 pX-B014_GS-VHH3_117-hc_(G4S)6_VHH72-h1-E1D-R27L-E31D-Y32I-S56G-L97A_His8의 이중특이적 VHH 아미노산 서열
>서열 번호:92: 작제물 pX-B017_GS-VHH3_117-hc_(G4S)_VHH72-h1-E1D-R27L-E31D-Y32I-S56G-L97A_His8의 이중특이적 VHH 아미노산 서열
>서열 번호:93: 작제물 pX-B018_GS-VHH3_117-hc_(G4S)4_VHH72-h1-E1D-R27L-E31D-Y32I-S56G-L97A_His8의 이중특이적 VHH 아미노산 서열
>서열 번호: 94 : VHH3.115-h1-E1D_(GGGGS)x2_hIgGhingeEPKSCdel_hIgGFc_N297A_Gsdel의 2가 VHH-Fc 아미노산 서열
>서열 번호: 95 : VHH4.1XAS51 아미노산 서열
>서열 번호: 96 : VHH4.2XAS58 아미노산 서열
>서열 번호: 97 : VHH4.2XAS31 아미노산 서열
>서열 번호: 98 : VHH4.2XAS43 아미노산 서열
>서열 번호: 99 : SARS-CoV-2 RBD: 서열 번호:1의 AA 381-531
>서열 번호: 100 : SARS-CoV-2 RBD: 우한-Hu-1 분리주의 AA 333-516
>서열 번호: 101 : SARS-CoV-2 RBD: 서열 번호:1의 AA 331-531
>서열 번호: 122 : SARS-CoV-2 우한 WT 스파이크_del18: 18개의 C-말단 아미노산이 결실된 SARS-CoV-2 우한 WT 스파이크 단백질.
>서열 번호: 123 : SARS-CoV-2 D614G 스파이크_del18: 18개의 C-말단 아미노산이 결실된 SARS-CoV-2 D614G 스파이크 단백질.
>서열 번호: 124 : SARS-CoV-2 스파이크_del18_L452R/T478K: 18개의 C-말단 아미노산이 결실된 SARS-CoV-2 Delta 변이체 스파이크 단백질.
>서열 번호: 125 : SARS-CoV-2 스파이크_del18_N501Y: 18개의 C-말단 아미노산이 결실된 SARS-CoV-2 알파 변이체 스파이크 단백질.
>서열 번호: 126 : SARS-CoV-2 스파이크_del18_N501Y/K417N/E484K: 18개의 C-말단 아미노산이 결실된 SARS-CoV-2 베타 변이체 스파이크 단백질.
>서열 번호: 127 : SARS-CoV-2 스파이크_del18_N501Y/K417T/E484K: 18개의 C-말단 아미노산이 결실된 SARS-CoV-2 감마 변이체 스파이크 단백질.
>서열 번호: 128 : SARS-CoV-2 스파이크_del18 (N501Y/K417N/E484K/L452R/T478K): 18개의 C-말단 아미노산이 결실된 SARS-CoV-2 N501Y/K417N/E484K/L452R/T478K 스파이크 단백질.
>서열 번호: 129 : SARS-CoV-2 오미크론 BA.1 스파이크_del18 : 18개의 C-말단 아미노산이 결실된 SARS-CoV-2 오미크론 BA.1 변이체 스파이크 단백질.
>서열 번호: 130 : SARS-CoV-2 오미크론 BA.2 스파이크_del18: 18개의 C-말단 아미노산이 결실된 SARS-CoV-2 오미크론 BA.2 변이체 스파이크 단백질.
SEQUENCE LISTING <110> VIB VZW ExeVir Bio BV UNIVERSITEIT GENT <120> PAN-SPECIFIC CORONA VIRUS BINDERS <130> EXVI-005-PCT <150> EP21173680.6 <151> 2021-05-12 <160> 146 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1273 <212> PRT <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <400> 1 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser 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Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 5 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH72_h1(E1D)(S56A) humanized variant 1(E1D) of VHH72-S56A amino acid sequence <400> 5 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 6 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3-83 amino acid sequence <400> 6 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Leu Ser Gly Gly Val Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Phe Asn Ser Asp Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asn Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Gly Asn His Tyr Asn Pro Gln Tyr Tyr His Asp Tyr Asp 100 105 110 Lys Tyr Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 7 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.83 variant VHH3-83-hc amino acid sequence <400> 7 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Leu Ser Gly Gly Val Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Phe Asn Ser Asp Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Asn Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Gly Asn His Tyr Asn Pro Gln Tyr Tyr His Asp Tyr Asp 100 105 110 Lys Tyr Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 8 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.83 variant VHH3-83-hc-N85E amino acid sequence <400> 8 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Leu Ser Gly Gly Val Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu 35 40 45 Ala Ala Ile Thr Phe Asn Ser Asp Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys 85 90 95 Ala Ala Gly Gly Asn His Tyr Asn Pro Gln Tyr Tyr His Asp Tyr Asp 100 105 110 Lys Tyr Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 9 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH2.50 amino acid sequence <400> 9 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Ile 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 10 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.17 amino acid sequence <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Gly Asp Gly 20 25 30 Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Arg Pro Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Thr Val Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr Tyr Phe Ala Glu Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Leu Ala Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 11 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.77 amino acid sequence <400> 11 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ser Ser Gly Arg Ala Phe Gly Asn Gly 20 25 30 Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Arg Pro Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Thr Val Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr Tyr Phe Ala Glu Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Leu Ala Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr 100 105 110 Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 12 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.115 amino acid sequence <400> 12 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Ile 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu Pro Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 13 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.144 amino acid sequence <400> 13 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ala Phe Gly Asn Gly 20 25 30 Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Thr Val Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ala Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 14 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3BE4 amino acid sequence <400> 14 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ala Phe Gly Asn Gly 20 25 30 Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Thr Val Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ala Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 15 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.36 amino acid sequence <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Trp Gly Gly Ile Ser Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Pro Lys Gly Trp Ser Glu Trp Asp Met Glu Tyr Trp Gly 100 105 110 Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.47 amino acid sequence <400> 16 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly His Asn Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Thr Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Glu Asn Asp Val Met Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Pro Lys Gly Trp Ser Glu Trp Asp Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.55 amino acid sequence <400> 17 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Asn Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Ala Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Ser Ile Ser Arg Tyr Tyr Lys Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Met Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Pro Ala Gly Trp Ser Glu Phe Gly Met Glu Tyr Trp Gly 100 105 110 Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.35 amino acid sequence <400> 18 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Asn Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Ala Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Ser Ile Ser Arg Tyr Tyr Lys Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Met Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Pro Ala Gly Trp Ser Glu Phe Gly Met Glu Tyr Trp Gly 100 105 110 Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.29 amino acid sequence <400> 19 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Gly Trp Ala Gly Leu Ser Ser Tyr Tyr Leu Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Met Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Asp His Gly Trp Ser Ala Ala Gly Met Asp Tyr Leu Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.38 amino acid sequence <400> 20 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Met Phe Trp Ser Gly Leu Pro Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Ser Arg Gly Trp Ser Asp Val Gly Gly Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.149 amino acid sequence <400> 21 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Thr Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Trp Phe Gly Ala Pro Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Asp Ser Lys Gly Trp Asp Pro Gln Asp Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.117 amino acid sequence <400> 22 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Ala Val Ser Ile Ser 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Lys Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala Gln 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Ser Ala Val Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Lys Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Trp Leu Pro Tyr Gly Met Gly Pro Asp Tyr Tyr Gly Met Glu Leu 100 105 110 Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3_117-hc amino acid sequence <400> 23 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Ala Val Ser Ile Ser 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Lys Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala Gln 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Ser Ala Val Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Lys Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Trp Leu Pro Tyr Gly Met Gly Pro Asp Tyr Tyr Gly Met Glu Leu 100 105 110 Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.92 amino acid sequence <400> 24 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Ala Val Ser Ile Ser 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Lys Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala Gln 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ala Val Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Ala Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Trp Leu Pro Tyr Gly Met Gly Pro Asp Tyr Tyr Gly Met Glu Leu 100 105 110 Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.94 amino acid sequence <400> 25 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Ala Val Ser Ile Ser 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Lys Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asn Ser Ala Gln 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ala Val Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Trp Leu Pro Tyr Gly Met Gly Pro Asp Tyr Tyr Gly Met Glu Leu 100 105 110 Trp Gly Glu Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.42 amino acid sequence <400> 26 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ala Val Ser Ile Asn 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Lys Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Ala Trp Leu Pro Tyr Gly Met Gly Pro Asp Tyr Tyr Gly Met Glu Leu 100 105 110 Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH3.180 amino acid sequence <400> 27 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Asn Cys Ala Ala Ser Gly Lys Ala Val Ser Ile Ser 20 25 30 Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Lys Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala Gln 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ala Val Tyr 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Sequence <220> <223> binder <400> 35 Ser Gly Gly Met Gly 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> binder <400> 36 Asn Tyr Ala Met Ala 1 5 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> binder <400> 37 Ser Tyr Ala Leu Gly 1 5 <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> binder <400> 38 Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> binder <400> 39 Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> binder <400> 40 Ala Ile Thr Phe Asn Ser Asp Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> binder <400> 41 Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> binder <400> 42 Thr Val 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Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn 85 90 95 Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln 100 105 110 Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys 115 120 125 Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Asp Val Tyr Tyr His Lys 130 135 140 Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala 145 150 155 160 Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu 165 170 175 Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys 180 185 190 Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn 195 200 205 Leu Gly Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val 210 215 220 Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala 225 230 235 240 Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr 245 250 255 Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe 260 265 270 Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys 275 280 285 Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr 290 295 300 Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr 305 310 315 320 Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Asp 325 330 335 Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg 340 345 350 Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Phe 355 360 365 Ala Pro Phe Phe Ala Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu 370 375 380 Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg 385 390 395 400 Gly Asn Glu Val Ser Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala 405 410 415 Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala 420 425 430 Trp Asn Ser Asn Lys Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr 435 440 445 Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp 450 455 460 Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Asn Lys Pro Cys Asn Gly Val 465 470 475 480 Ala Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Arg Ser Tyr Gly Phe Arg Pro 485 490 495 Thr Tyr Gly Val Gly His Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe 500 505 510 Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr 515 520 525 Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr 530 535 540 Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln 545 550 555 560 Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro 565 570 575 Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val 580 585 590 Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu 595 600 605 Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp 610 615 620 Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe 625 630 635 640 Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu Tyr Val Asn Asn Ser 645 650 655 Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln 660 665 670 Thr Gln Thr Lys Ser His Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser 675 680 685 Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr 690 695 700 Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr 705 710 715 720 Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr 725 730 735 Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln 740 745 750 Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Lys Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala 755 760 765 Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln 770 775 780 Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser 785 790 795 800 Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu 805 810 815 Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys 820 825 830 Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys 835 840 845 Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp 850 855 860 Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr 865 870 875 880 Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala 885 890 895 Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val 900 905 910 Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile 915 920 925 Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys 930 935 940 Leu Gln Asp Val Val Asn His Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val 945 950 955 960 Lys Gln Leu Ser Ser Lys Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp 965 970 975 Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg 980 985 990 Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln 995 1000 1005 Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala 1010 1015 1020 Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp 1025 1030 1035 Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala 1040 1045 1050 Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln 1055 1060 1065 Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys 1070 1075 1080 Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His 1085 1090 1095 Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr 1100 1105 1110 Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly 1115 1120 1125 Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp 1130 1135 1140 Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser 1145 1150 1155 Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val 1160 1165 1170 Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys 1175 1180 1185 Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr 1190 1195 1200 Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile 1205 1210 1215 Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys 1220 1225 1230 Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly 1235 1240 1245 Ser Cys Cys Lys 1250 <210> 131 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of VHH3.89 and VHH3_183 according to Kabat annotation <400> 131 Tyr Tyr Ala Ile Gly 1 5 <210> 132 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of VHH3C_80 according to Kabat annotation <400> 132 Asp Tyr Asp Val Gly 1 5 <210> 133 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of VHH3.89 and VHH3C_80 according to Kabat annotation <400> 133 Arg Ile Asp Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 134 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of VHH3_183 according to Kabat annotation <400> 134 Arg Ile Glu Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 135 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of VHH3.89 according to Kabat annotation <400> 135 Asp Pro Ile Ile Gln Gly Arg Asn Trp Tyr Trp Thr 1 5 10 <210> 136 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of VHH3_183 according to Kabat annotation <400> 136 Asp Pro Ile Ile Gln Gly Ser Ser Trp Tyr Trp Thr 1 5 10 <210> 137 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of VHH3C_80 according to Kabat annotation <400> 137 Asp Pro Ile Ile Arg Gly His Asn Trp Tyr Trp Thr 1 5 10 <210> 138 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus CDR1 of VHH3.89 family <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is D (Asp, Aspartic Acid) or Y (Tyr, Tryosine) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is D (Asp, Aspartic Acid) or A (Ala, Alanine) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is V (Val, Valine) or I (Ile, Isoleucine) <400> 138 Xaa Tyr Xaa Xaa Gly 1 5 <210> 139 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus CDR2 of VHH3.89 family <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is D (Asp, Aspartic Acid) or E (Glu, Glutamic Acid) <400> 139 Arg Ile Xaa Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 140 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus CDR3 of VHH3.89 family <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is R (Arg, Arginine) or Q (Gln, Glutamine) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is R (Arg, Arginine), S (Ser, Serine) or H (His, Histidine) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is N (Asn, Asparagine) or S (Ser, Serine) <400> 140 Asp Pro Ile Ile Xaa Gly Xaa Xaa Trp Tyr Trp Thr 1 5 10 <210> 141 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 according to Kabat of VHH4.1XAS51 and VHH4.1XAS43 <400> 141 Asn Tyr Ala Met Gly 1 5 <210> 142 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 according to Kabat of VHH4.1XAS58 <400> 142 Ala Phe Ser Ile Gly 1 5 <210> 143 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 according to Kabat of VHH4.1XAS31 <400> 143 Ser Asp Tyr Ala Val Ala 1 5 <210> 144 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 according to Kabat of VHH72-5mut <400> 144 Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 145 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 according to Kabat of VHH4.1XAS51, VHH4.1XAS43, VHH4.1XAS58 and VHH4.1XAS31 <400> 145 Ala Ile Thr Phe Asn Ser Asp Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 146 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 according to Kabat of VHH4.1XAS51 <400> 146 Gly Gly Asn His Tyr Asn Pro Gln Tyr Tyr His Asp Tyr Asp Lys Tyr 1 5 10 15 Asp Tyr

Claims (25)

  1. 코로나 바이러스 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 제제를 포함하는 조성물로서, 상기 하나 이상의 제제는 서열 번호: 1로 표시된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 잔기 Y369, F377, 및 K378에 결합하는 하나 이상의 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD), 및 서열 번호: 1로 표시된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 잔기 T393, N394, V395, 또는 Y396 중 적어도 하나 이상에 결합하는 하나 이상의 제2 ISVD를 포함하는 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 제2 ISVD는, 상기 하나 이상의 제2 ISVD가 수용체 결합 도메인(RBD)에 결합될 때, 상기 스파이크 단백질의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)-수용체 결합 도메인(RBD)이 ACE2에 결합하는 것을 허용하는 것인, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 ISVD는 서열 번호: 1로 표시된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 L368, S371, S375, T376, C379 및/또는 Y508의 아미노산 잔기들 중 적어도 하나 이상의 아미노산 잔기에 추가로 결합하는 것인, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제2 ISVD는 아미노산 잔기 K462(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 R462), F464(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 Y464), E465(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 G465) 또는 R466 중 적어도 하나의 아미노산 잔기에 추가로 결합하는 것인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제2 ISVD는 적어도 서열 번호: 1로 표시된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 잔기 R357에 추가로 결합하는 것인, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제2 ISVD는 서열 번호: 1에 정의된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 아미노산 N394(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 S394), Y396, F464, S514, E516, 및 R355 중 적어도 하나, 또는 선호도가 증가하는 순서로 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 아미노산에 결합하고; 선택적으로 아미노산 R357(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 K357) 및/또는 K462(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 R462) 및/또는 E465(또는 일부 사베코바이러스에서는 대안적으로 G465) 및/또는 R466 및/또는 L518에 추가로 결합하는 것인, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제2 ISVD는 S1 쉐딩(shedding)을 유도하는 것인, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 ISVD는 서열 번호: 2-21, 90 및 서열 번호: 95-98 중 어느 것에 표시된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고, 이때 상기 CDR은 Kabat, Martin, MacCallum, IMGT, AbM, 또는 Chothia에 따라 주석이 달리거나, 또는 CDR1은 서열 번호: 28-37 또는 141-143 중 어느 것에 정의되고, CDR2는 서열 번호: 38-50, 144 또는 145 중 어느 것에 정의되며, CDR3은 서열 번호: 51-61 또는 146 중 어느 것에 정의되는 것인, 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제2 ISVD는 서열 번호: 22-27 또는 서열 번호: 85-87 중 어느 것에 존재하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하며, 이때 상기 CDR은 Kabat, Martin, MacCallum, IMGT, AbM, 또는 Chothia에 따라 주석이 달리거나; 또는 CDR1은 서열 번호: 70 또는 138에 의해 정의되고, CDR2는 서열 번호: 71 또는 139에 정의되며, CDR3은 서열 번호: 72 또는 140에 정의되거나; 또는 CDR1은 서열 번호: 62, 63, 131, 또는 132 중 어느 것에 정의되고, CDR2는 서열 번호: 64-67 또는 133-134 중 어느 것에 정의되며, CDR3은 서열 번호: 68, 69, 또는 135-137 중 어느 것에 정의되는 것인, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 ISVD는 서열 번호: 2-21, 90 및 서열 번호: 95-98의 서열 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 90%의 동일성을 갖되, 동일하지 않은 아미노산은 하나 이상의 FR에 위치하는 이의 기능적 변이체, 또는 이의 인간화 변이체를 포함하는 것인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제2 ISVD는 서열 번호: 22-27 및 서열 번호: 85-87의 서열 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 90%의 동일성을 갖되, 동일하지 않은 아미노산은 하나 이상의 FR에 위치하는 이의 기능적 변이체, 또는 이의 인간화 변이체를 포함하는 것인, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 RBD와의 결합에 대해 서열 번호: 2-21, 90 및 서열 번호: 95-98의 그룹으로부터 선택된 결합제 중 어느 것과 경쟁하는 적어도 하나의 제제를 포함하고/하거나 상기 RBD와의 결합에 대해 서열 번호: 22-27 및 서열 번호: 85-87의 그룹으로부터 선택된 결합제 중 어느 것과 경쟁하는 적어도 하나의 제제를 포함하는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 단일 제제를 포함하며, 이때 상기 제제는 상기 하나 이상의 제1 ISVD 및 상기 하나 이상의 제2 ISVD를 포함하는 것인, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 ISVD 및 상기 제2 ISVD는 직접 또는 링커를 통해 융합되는 것인, 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 링커는 짧은 펩티드 링커 또는 Fc-테일 또는 또 다른 모이어티인 것인, 조성물.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 제제는 상기 제1 ISVD 및 상기 제2 ISVD를 융합시켜 이중특이적 항체를 제공하는 IgG Fc를 포함하며, 이때 상기 이중특이적 항체는 놉-인투-홀(knob-into-hole) VHH-융합체, VHH-VHH-Fc 융합체 또는 VHH-Fc-VHH 융합체와 같이 2가 또는 4가일 수 있는 것인, 조성물.
  17. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 서열 번호: 76-84, 서열 번호: 91-93, 서열 번호: 118, 및 서열 번호: 119-121의 그룹으로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 90%의 동일성을 갖는 기능적 변이체, 또는 이들 중 어느 하나의 인간화 변이체를 포함하거나; 또는 상기 제제는 서열 번호: 107 및 108, 서열 번호: 109 및 110, 서열 번호: 111 및 112, 서열 번호: 113 및 114, 서열 번호: 115 및 116, 및 서열 번호: 113 및 117의 서열 쌍 그룹으로부터 선택된 서열 쌍, 또는 이와 적어도 90%의 동일성을 갖는 기능적 변이체, 또는 이들 중 어느 하나의 인간화 변이체를 포함하는 것인, 조성물.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 결합제.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 결합제를 암호화하는 단리된 핵산.
  20. 제19항에 기재된 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 조성물, 제18항에 기재된 결합제, 제19항에 기재된 단리된 핵산 및/또는 제20항에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
  22. 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 조성물, 제18항에 기재된 결합제, 제19항에 기재된 단리된 핵산, 제20항에 기재된 재조합 벡터, 또는 제21항에 기재된 약제학적 조성물.
  23. 대상체의 수동 면역화에 사용하기 위한, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 조성물, 제18항에 기재된 결합제, 제19항에 기재된 단리된 핵산, 제20항에 기재된 재조합 벡터, 또는 제21항에 기재된 약제학적 조성물.
  24. 코로나바이러스 감염, 보다 구체적으로는 사베코바이러스 감염의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 조성물, 제18항에 기재된 결합제, 제19항에 기재된 단리된 핵산, 제20항에 기재된 재조합 벡터, 또는 제21항에 기재된 약제학적 조성물.
  25. SARS-CoV-1 또는 SARS-CoV-2 감염 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 조성물, 제18항에 기재된 결합제, 제19항에 기재된 단리된 핵산, 제20항에 기재된 재조합 벡터, 또는 제21항에 기재된 약제학적 조성물.
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