CN116419971A - 抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
属于病毒检测诊断领域,提供抗SARS‑CoV‑2刺突蛋白膜外区的单克隆杭体、其重链可变区和轻链可变区的氛基酸序列。提供的抗SARS‑CoV‑2刺突蛋白膜外区的单克隆杭体能够特异性地与S1或S2蛋白膜外区结合,可以用于SARS‑CoV‑2病毒杭原的检测,为SARS‑CoV‑2病毒的检测提供了可能和便利。
Description
本发明属于病毒检测诊断领域,涉及一种抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体。本发明还涉及该抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体的应用。
严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)属于冠状病毒的β属,直径60nm~140nm,有囊膜,颗粒呈圆形或椭圆形,常为多形性,其基因特征与SARSr-CoV和MERSrCoV有明显区别。SARS-CoV-2是目前发现的第7种可以感染人的冠状病毒。由该病毒引起的疾病称为新型冠状病毒疾病2019(coronavirus disease 2019,COVID-19),据Worldometer报道,截止2020年8月13日,已向世卫组织报告了超过2052万例COVID-19病例和近74万例死亡。
与SARS-CoV相似,SARS-CoV-2也是利用其高度糖基化的刺突蛋白(Spike protein,S protein,S蛋白),以三聚体形式完成宿主细胞受体结合和病毒侵染。ECD(extra cellular domain)是S蛋白的膜外区,S蛋白有两个亚基——S1和S2。S1亚基的RBD(receptor-binding domain)区可以识别并结合宿主细胞的血管紧张素转化酶2(human angiotensin-converting enzyme 2,hACE2),S2亚基介导病毒与宿主细胞的膜融合。早期筛查、早诊断能够及时有效的筛选出感染患者,对感染患者进行有效的隔离和治疗,可以遏制病毒传染进一步扩展。但是,目前仅美国FDA和日本批准了少量可用于SARS-CoV-2病毒抗原检测的试剂,FDA认为,抗原检测将在对抗COVID-19的过程中发挥关键作用。目前国内临床还未批准针对SARS-CoV-2病毒抗原检测的试剂。
基于PCR方法的病毒核酸检测是目前进行COVID-19诊断的金标准,也是无症状感染人群的必要筛查手段。但是,核酸检测对咽喉或鼻咽拭子采样要求比较高,样本采集手法、保存条件、PCR操作不当等均可能造成假阴性和假阳性的结果,导致早期诊断和后续管理的显著延迟,为提供及时的生命支持治疗和预防性检疫提出了严峻挑战。因此,制备抗SARS-CoV-2刺突蛋白ECD的单克隆抗体、开发抗原检测方法进行辅助诊断,与核酸检测相互补充,可弥补核酸检测时出现的假阴性和假阳性,提高疑似病例检测的准确率。中华 人民共和国国家卫生健康委员会《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(第7版)》中增加了通过检测新冠病毒蛋白特异性抗体检测来辅助新冠肺炎的临床诊断。
发明内容
在一方面,本发明提供了一种抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体或其功能片段,所述抗体或其功能片段包含重链可变区和轻链可变区,其中
(a)所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,
所述HCDR1包含选自SEQ ID NO:34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118或124所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列具有至多三个(例如,一个、二个或三个)氨基酸突变的变体;所述HCDR2包含选自SEQ ID NO:35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119或125所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列具有至多三个氨基酸突变的变体;所述HCDR3包含选自SEQ ID NO:36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120或126所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列具有至多三个氨基酸突变的变体;以及
(b)所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3,
所述LCDR1序列包含选自SEQ ID NO:37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121或127所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列具有至多三个氨基酸突变的变体;所述LCDR2序列包含选自SEQ ID NO:38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122或128所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列具有至多三个氨基酸突变的变体;所述LCDR3序列包含选自SEQ ID NO:39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123或129所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列具有至多三个氨基酸突变的变体。
在一些实施方案中,所述HCDR1序列包含选自SEQ ID NO:34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118或124所示的氨基酸序列,所述HCDR2序列包含选自SEQ ID NO:35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119或125所示的氨基酸序列,所述HCDR3序列包含选自SEQ ID NO:36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120或126所示的氨基酸序列;以及所述LCDR1序列包含选自SEQ ID NO:37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121或127所示的氨基酸序列,所述LCDR2序列包含选自SEQ ID NO:38、44、 50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122或128所示的氨基酸序列,所述LCDR3序列包含选自SEQ ID NO:39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123或129所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自如下序列:
(a)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:34、35和36所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:37、38和39所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;
(b)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:40、41和42所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:43、44和45所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;
(c)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:46、47和48所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:49、50和51所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;
(d)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:52、53和54所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:55、56和57所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;
(e)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:58、59和60所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:61、62和63所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;
(f)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:64、65和66所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:67、68和69所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;
(g)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:70、71和72所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:73、74和75所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;
(h)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:76、77和78所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:79、80和81所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;
(i)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:82、83和84所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:85、86和87所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;
(j)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:88、89和90所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:91、92和93所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;
(k)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:94、95和96所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:97、98和99所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;
(l)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:100、101和102所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:103、104和105所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;
(m)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:106、107和108所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:109、110和111所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;
(n)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:112、113和114所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2 和LCDR3分别包含SEQ ID NO:115、116和117所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;
(o)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:118、119和120所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:121、122和123所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;或
(p)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:124、125和126所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:127、128和129所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体。
在一些实施方案中,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自如下序列:
(a)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:34、35和36所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:37、38和39所示的氨基酸序列;
(b)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:40、41和42所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:43、44和45所示的氨基酸序列;
(c)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:46、47和48所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:49、50和51所示的氨基酸序列;
(d)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:52、53和54所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:55、56和57所示的氨基酸序列;
(e)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:58、59和60所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:61、62和63所示的氨基酸序列;
(f)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:64、65和66所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:67、68和69所示的氨基酸序列;
(g)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:70、71和72所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:73、74和75所示的氨基酸序列:
(h)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:76、77和78所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:79、80和81所示的氨基酸序列;
(i)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:82、83和84所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:85、86和87所示的氨基酸序列;
(j)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:88、89和90所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:91、92和93所示的氨基酸序列;
(k)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:94、95和96所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:97、98和99所示的氨基酸序列;
(l)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:100、101和102所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:103、104和105所示的氨基酸序列;
(m)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:106、107和108所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:109、110和111所示的氨基酸序列;
(n)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:112、113和114所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:115、116和117所示的氨基酸序列;
(o)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:118、119和120所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:121、122和123所示的氨基酸序列;或
(p)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:124、125和126所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:127、128和129所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自如下序列:
(a)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:34、35和36所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:37、38和39所示;
(b)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:40、41和42所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:43、44和45所示;
(c)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:46、47和48所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:49、50和51所示;
(d)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:52、53和54所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:55、56和57所示;
(e)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:58、59和60所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:61、62和63所示;
(f)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:64、65和66所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:67、68和69所示;
(g)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:70、71和72所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:73、74和75所示;
(h)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:76、77和78所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:79、80和81所示;
(i)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:82、83和84所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:85、86和87所示;
(j)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:88、89和90所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:91、92和83所示;
(k)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:94、95和96所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:97、98和99所示;
(l)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:100、101和102所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:103、104和105所示;
(m)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:106、107和108所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:109、110和111所示;
(n)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:112、113和114所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:115、116和117所示;
(o)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:118、119和120所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:121、122和123所示;或
(p)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:124、125和126所示以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:127、128和129所示。
在一些实施方案中,所述重链可变区序列包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32所示氨基酸序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;以及所述轻链可变区序列包含与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33所示氨基酸序列具有至少80%一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述重链可变区序列包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32所示氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;所述轻链可变区序列包含与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33所示氨基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述重链可变区序列包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32所示氨基酸序列;所述轻链可变区序列包含SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33所示氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述重链可变区和轻链可变区选自如下序列:
(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:2所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:3所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;
(b)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:4所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:5所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;
(c)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:6所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:7所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;
(d)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:8所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:9所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;
(e)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:10所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:11所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;
(f)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:12所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:13所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;
(g)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:14所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:15所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;
(h)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:16所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:17所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;
(i)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:18所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:19所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;
(j)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:20所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:21所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;
(k)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:22所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:23所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;
(l)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:24所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:25所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;
(m)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:26所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:27所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;
(n)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:28所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:29所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;
(o)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:30所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:31所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列;或
(p)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:32所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:33所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述重链可变区和轻链可变区选自如下序列:
(a)所述重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列;
(b)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;
(c)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;
(d)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列;
(e)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列;
(f)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列;
(g)所述重链可变区包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列;
(h)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列;
(i)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列;
(j)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列;
(k)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列;
(l)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列;
(m)所述重链可变区包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列;
(n)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列;
(o)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列;或
(p)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中,所述重链可变区和轻链可变区选自如下序列:
(a)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示;
(b)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示;
(c)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示;
(d)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示;
(e)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示;
(f)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示;
(g)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示;
(h)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示;
(i)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示;
(j)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示;
(k)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示;
(l)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示;
(m)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示;
(n)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示;
(o)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示;或
(p)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示,所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示。
在另一方面,本发明提供了编码上述的抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体或其功能片段的分离的多核苷酸。
在一些实施方案中,所述多核苷酸包含编码上述抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体或其功能片段的重链可变区的核苷酸序列,和编码所述抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体或其功能片段的轻链可变区的核苷酸序列。
在另一方面,本发明提供了包含所述多核苷酸的表达载体。
在另一方面,本发明提供了包含所述表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统。
在另一方面,本发明提供了一种药物组合物,所述药物组合物包含所述的抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体或其功能片段和药学上可接受的载体。
在另一方面,本发明提供了所述的抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体或其功能片段在制备治疗冠状病毒药物中的应用。
在另一方面,本发明提供了一种检测冠状病毒的试剂盒,所述试剂盒中包含所述的单克隆抗体或其功能片段。
在一些实施方案中,所述冠状病毒选自SARS-CoV、MERS-Cov或SARS-Cov-2,优选为SARS-Cov-2。在另一些实施方案中,所述冠状病毒为SARS-Cov-2。
在另一方面,本发明提供了一种制备抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体或其功能片段的方法,包括
1)以SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区免疫动物,在所述动物中产生针对SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的免疫反应;
2)分离所述动物的外周血单核细胞(PBMC,Peripheral Blood Mononuclear Cell),富集抗原阳性B细胞,并进行筛选,得到特异性识别SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的阳性克隆:
3)对所述阳性克隆进行基因测序,获得抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区抗体的重链和轻链的可变区编码序列;
4)用所述可变区编码序列进行重组抗体生产,获得功能性抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体。
在一些实施方案中,所述的单克隆抗体是兔源、嵌合的、人源化的或人的抗体。在一些优选实施方案中,所述的单克隆抗体是兔源的。在另一些优选实施方案中,所述的单克隆抗体是人源化的。
与PCR检测相比,血清学检测具有检测周期短、通量高和工作量少的优势。本发明开发的抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体能够特异性地与S蛋白膜外区结合,并且能够特异性的识别S1或者S2。提供的单克隆抗体可以识别抗原的11种表位,抗体的多样性为检测试剂盒的开发提供了便利。
图1为免疫之后的兔血清效价检测结果图;
图2为部分单克隆抗体纯化后SDS-PAGE鉴定结果图;
图3为单克隆抗体与S-ECD重组蛋白亲和力检测结果图;
图4为单克隆抗体3C4与抗体39G6对重组蛋白S-ECD配对检测图;
图5为单克隆抗体2F8与抗体39G6对重组蛋白S-ECD配对检测图。
本发明涉及一种具有功能性的病毒SARS-CoV-2 S蛋白膜外区的单克隆抗体,下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。除非另有说明,本发明所用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义相同。
术语“新型冠状病毒”(SARS-CoV-2),亦称为2019-nCoV,是指2019年开始出现并蔓延的新型病毒感染,其属于β属冠状病毒,有包膜,颗粒呈圆形或椭圆形,常为多形性,直径60-140nm。其基因特征与SARSr-Cov和MERSr-CoV有明显区别。研究显示,其与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85%以上。体外分离培养时,2019-nCov 96个小时左右即可在人呼吸道上皮细胞内发现,而在Vero E6和Huh-7细胞系中分离培养需约6天。
术语″抗体″意在指由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子(其中两条重链(H)和两条轻链(L)通过二硫键相互连接(即″完整的抗体分子″)),以及其多聚体(例如IgM)或其抗原结合片段。每条重链由重链可变区(“HCVR”或“VH”)和重链恒定区(由结构域CH1、CH2和CH3组成)组成。每条轻链由轻链可变区(“LCVR或“VL”)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区,其间插有更保守的区称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成,以下列顺序从氨基末端至羟基末端排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的一些实施方案中,抗体(或其抗原结合片段)的FR可与人种系序列相同或可经天然或人工修饰。
术语“单克隆抗体”指均一的仅针对某一特定抗原表位的抗体。与典型的包括针对不同抗原决定簇(表位)的不同抗体的普通多克隆抗体制剂相比,每种单克隆抗体针对抗原上的单个抗原决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的均一特征,不解释为需要通过任何特定方法产生的抗体。本发明的单克隆抗体优选通过重组DNA方法产生,或通过本发明其他地方描述的筛选方法获得。
术语“突变”是指单克隆抗体或其功能片段包含一个或多个(数个)位置的一个或多个(数个)氨基酸残基的变更,即取代、插入和/或缺失的多肽。取代是指用不同的氨基酸替代占据某位置的氨基酸;缺失是指除去占据某位置的氨基酸;而插入是指在占据某位置的氨基酸邻接处且在之后添加1-3个氨基酸。
术语“分离的多核苷酸”指非自然界中天然存在状态的多核苷酸,包括通过生物学技术从自然界(包括生物体内)分离出的多核苷酸,也包括人工合成的多核苷酸。分离的多核苷酸可以是基因组DNA、cDNA、mRNA或合成的其他RNA,或者它们的组合。需要指出的是,本领域技术人员可以根据本文所提供的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列,基于密码子简并性,设计出提供的核苷酸序列不完全相同的核苷酸序列,但都编码相同的氨基酸序列。这些经改动的核苷酸序列也包括在本发明的范围内。
当涉及多核苷酸时,术语“载体”指用于将核苷酸编码信息转移到宿主细胞内的任一种分子(例如核酸、质粒或病毒等)。术语“表达载体”或“表达盒”指适于在宿主细胞内表达目的基因(待表达核苷酸序列)的载体,通常包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。
术语“宿主细胞”指已经或者能够用核酸序列转化并从而表达所选的目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的后代,无论该后代与原来的亲本细胞在形态或基因组成上是否相同,只要后代存在所选目的基因即可。常用的宿主细胞包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
术语“抗体功能片段”意即抗体的抗原结合片段及抗体类似物,其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。例如,能够结合冠状病刺突(S)蛋白或其部分的抗体片段,包括但不限于sdAb(单域抗体)、Fab(例如,抗体经木瓜蛋白酶消化而得到)、F(ab’)2(例如,通过胃蛋白酶消化得到)、Fv或scFv(例如通过分子生物学技术得到)。
术语“药学上可接受的载体”包括与药物给药相容的任何和所有溶剂,分散剂,包被物,抗细菌和抗真菌药剂,等渗和缓释剂,及其类似物。合适的载体在Remington’s Pharmaceutical Sciences最新版中的标准参考文件中有所叙述,其通过在此引述而全部合并于本文。合适的载体或稀释液例子包括,但不局限于,水,盐溶液,ringer’s液,葡萄糖溶液,和5%人血清白蛋白。也可以使用脂质体和疏-水介质如不挥发油。药物活性物质的介质和药剂的使用在本领域中是熟知的。除了那些对于活性成分不相容的常规介质或试剂以外,其在成分中的使用都可以达到预期效果。
术语“氨基酸替换”,指在预先确定的(初始)氨基酸序列中,用不同的氨基酸残基代替现有的氨基酸残基。一般而言,本领域技术人员公认在多肽非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等,Molecular Biology ofthe Gene(基因的分子生物学),The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页(第四版,1987))。这样的例示性取代优选依照以下所示的取代来进行:
示例性保守氨基酸取代
原残基 | 保守取代 |
Ala(A) | Gly;Ser |
Arg(R) | Lys;His |
Asn(N) | Gln;His |
Asp(D) | Glu;Asn |
Cys(C) | Ser;Ala |
Gln(Q) | Asn |
Glu(E) | Asp;Gln |
Gly(G) | Ala |
His(H) | Asn;Gln |
Ile(I) | Leu;Val |
Leu(L) | Ile;Val |
Lys(K) | Arg;His |
Met(M) | Leu;Ile;Tyr |
Phe(F) | Tyr;Met;Leu |
关于肽或多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列一致性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后,且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分,候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行序列对比以测定百分比氨基酸序列同一性,例如使用公众可得到的计算机软件,诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数,包括对所比较的序列全长获得最大对比所需的任何算法。
当用“给予”和“治疗”提及动物、人、实验对象、细胞、组织、器官或生物液时,是指将外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受治疗者、细胞、组织、器官或生物液接触。“给予”和“治疗”可指例如治疗方法、药动学方法、诊断方法、研究方法和实验方法。治疗细胞包括让试剂与细胞接触以及让试剂与流液接触,其中所述流液与细胞接触。“给予”和“治疗”还意味着例如通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过其他细胞对细胞进行体外和离体治疗。
如本文使用的术语“受试者”指需要缓解、预防和/或治疗疾病或病症如病毒感染的动物,优选哺乳动物,更优选人。术语包括具有冠状病毒如SARS-CoV-2感染或处于具有冠状病毒如SARS-CoV-2感染风险的人受试者。
提及药物组合物时,本文所使用的术语“有效量的”指可对人和/或动物产生功能或活性且可被人和/或动物所接受的量。“药学上可接受的载体”指用于给药的载体,包括各种赋形剂、稀释剂和缓冲剂等,这些物质适合于人和/或动物给药而无过度的不良副反应,同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。
除非另外特别说明,否则单数的使用包括复数。除非另外特别说明,否则词语“一个(a)”或“一个(an)”意指“至少一个”。除非另外说明,否则“或”的使用意指“和/或”。短语“至少一个”的含义等同于短语“一个或多个”的含义。此外,术语“包括(including)”以及其他形式诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。此外,除非另外特别说明,否则术语诸如“要素”或“组分”包括包含一个单元的元素或组分以及包含多于一个单元的元素和组分。
除非另有说明,下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解,下文描述的方法和材料,仅是示例性的,而不应视为限定本发明的范围。
实施例1:SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区(S-ECD)蛋白动物免疫
动物免疫抗原采用重组蛋白S-ECD-His(序列如SEQ ID NO:1所示)。用含200μg S-ECD融合蛋白皮下免疫新西兰白兔。随后,每隔一周重复免疫,从而对实验兔进行加强免疫,共3次。2只兔血清效价在3次免疫之后均达到10
5以上(图1)。选择编号为7967的实验兔在最后一次免疫后7天采集无菌血进行后续抗体发现工作。
S-ECD-His氨基酸序列(SEQ ID NO:1,NCBI登录号:QLB39105.1):
实施例2:B细胞的获得以及单克隆抗体的筛选
1)抗原阳性B细胞的获得
采集兔无菌血15ml进行PBMC分离,然后采用抗原对抗原阳性细胞进行富集。富集后的细胞按照10个细胞每孔的密度铺到提前铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中。将板在37℃下在5%CO
2中孵育。6天的孵育之后,更换新鲜的培养基,第7天收集培养过夜的上清,开始使用下文所述的ELISA结合来测试针对S蛋白膜外区的抗体的存在情况。
2)ELISA结合检测方法
间接ELISA用于评估上清液中抗体对于S-ECD蛋白的结合能力。将ELISA板用100μl/孔的PBS中1μg/ml的重组S-ECD蛋白在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05%吐温)洗涤板,并将其用150μl/孔的含1%BSA的PBST在37℃封闭14、时。随后弃去封闭液,向每个板加入100μlB细胞培养上清液,然后在37℃孵育1小时。将板用PBST洗涤三次,并用100μl/孔的缀合辣根过氧化物酶的山羊抗兔IgG(Fc-特异性)二抗(GenScript,A01856)37℃孵育0.5小时。将板用PBST洗涤五次,然后加入TMB显色液并在室温下在黑暗中孵育13分钟。通过加入50μl的1M HCl终止液(国药,10011018)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。选择OD值大于1.0的阳性孔进行后续实验。
实施例3:单克隆抗体的可变区测序
使用TRIzol(Life Technology,15596-026)提取OD值大于1.0的孔内总细胞的RNA,并利用通用引物(Prime Script
TM 1
st Strand cDNA Synthesis Kit,Takara)将其逆转录为cDNA。随后通过抗体信号肽和恒定区特异性引物扩增兔免疫球蛋白重链和轻链V-区域片段,并将所得的PCR片段通过同源重组至pCDNA3.4载体中,使用载体特异性引物对插入片段进行测序。最终获取了16株兔IgG抗体,分别为3B4,2F6,5D10,3D5,3C4,2F8,2G4,5F7,5E4,5H7,2F12,3F4,5A10,3E5,5C9,2E12克隆的独特V-区域蛋白氨基酸序列及质粒。
3B4重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:2):
3B4轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:3):
2F6重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:4):
2F6轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:5):
5D10重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:6):
5D10轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:7):
3D5重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:8):
3D5轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:9):
3C4重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:10):
3C4轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:11):
2F8重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:12):
2F8轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:13):
2G4重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:14):
2G4轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:15):
5F7重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:16):
5F7轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:17):
5E4重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:18):
5E4轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:19):
5H7重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:20):
5H7轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:21):
2F12重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:22):
2F12轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:23):
3F4重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:24):
3F4轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:25):
5A10重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:26):
5A10轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:27):
3E5重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:28):
3E5轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:29):
5C9重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:30):
5C9轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:31):
2E12重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:32):
2E12轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:33):
兔IgG重链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO:133):
兔IgG轻链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO:134):
表1抗体的CDR区序列
实施例4:基于重组表达的单克隆抗体的生产
将分别包含抗体重链和轻链的质粒共转染至HEK293-6E(NRC,11565)细胞,于37℃摇瓶中培养6天后,收取上清用于抗体纯化。将蛋白A柱用含有0.05M Tris和1.5M NaCl(pH8.0)的缓冲液平衡。随后将收获的细胞培养物上清液,使用2×上述缓冲液1:1稀释并过滤除菌。将过滤的上清液和蛋白A柱室温孵育2小时,使用1×上述缓冲液洗涤柱后,使用无菌0.1M柠檬酸钠(pH3.5)洗脱IgG,收集洗脱液并用九分之一体积的无菌1M Tris-HCl(pH9.0)中和。在无菌条件下,将所述产品缓冲液交换为PBS(pH7.4)以除去残余的洗脱缓冲液,使用1.43的消光系数Ec(0.1%)通过OD280nm对抗体进行定量。
纯化的抗体通过BioRad电泳系统用10%预制胶(GenScript,M42012C)通过SDS-PAGE来分析。将所述凝胶用Estain2.0(GenScript,L00687R)染色并通过比较染色带与Protein Ladder(Takara,3452)来估计分子大小和纯度,如图2所示为3B4,3C4,5B10抗体检测结果图。
实施例5:单克隆抗体重组上清对病毒S-ECD蛋白、S-ECD三聚体蛋白、S-RBD蛋白、S1蛋白和S2蛋白的结合
间接ELISA用于评估重组后上清液中抗体对于S-ECD蛋白(Genscript,Z03481)、S-ECD三聚体蛋白(由Genscript生产)、S-RBD蛋白(Genscript,T80302)、S1蛋白(Genscript,Z03485)和S2蛋白(由Genscript生产)的结合能力。将ELISA板用100μl/孔的PBS中1μg/ml 的重组待检蛋白在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05%吐温)洗涤板,并将其用150μl/孔的含1%BSA的PBST在37℃封闭1小时。随后弃去封闭液,向每个板加入100μl重组表达上清液,然后在37℃孵育1小时。将板用PBST洗涤三次,并用100μl/孔的缀合辣根过氧化物酶的山羊抗兔IgG(Fc-特异性)二抗(GenScript,A01856)37℃孵育0.5小时。将板用PBST洗涤五次,然后加入TMB显色液并在室温下在黑暗中孵育13分钟。通过加入50μl的1M HCl终止液(国药,10011018)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。选择S-RBD蛋白结合阴性、S-ECD三聚体蛋白或者S1蛋白或者S2蛋白结合阳性的克隆进行后续实验。检测原蛋白氨基酸序列如下。
阴性判断标准为OD值小于阴性对照孔2.1倍,阳性判断标准为OD值大于1.0。检测结果如表2所示(“+”表示阳性;“-”表示阴性)。
表2抗体与S-ECD、S-RBD、S-ECD三聚体、S1及S2蛋白结合检测
抗体 | S-ECD结合 | S-RBD结合 | S-ECD三聚体结合 | S1结合 | S2结合 |
3B4 | + | - | + | - | + |
2F6 | + | - | + | - | + |
5D10 | + | - | + | - | + |
3D5 | + | - | + | + | - |
3C4 | + | - | + | - | + |
2F8 | + | - | + | + | - |
2G4 | + | - | + | - | + |
5F7 | + | - | + | - | + |
5E4 | + | - | + | + | - |
5H7 | + | - | + | - | + |
2F12 | + | - | + | - | + |
3F4 | + | - | + | - | + |
5A10 | + | - | + | + | - |
3E5 | + | - | + | + | - |
5C9 | + | - | + | - | + |
2E12 | + | - | + | - | - |
S-RBD(SEQ ID NO:130,NCBI登录号:QNA38155.1):
S1(SEQ ID NO:131,NCBI登录号:QKU53385.1):
S2(SEQ ID NO:132,NCBI登录号:QNA42621.1):
实施例6:单克隆抗体对病毒S-ECD蛋白结合的EC
50测试
间接ELISA用于评估纯化抗体对于S-ECD蛋白的结合能力。将ELISA板用100μl/孔的PBS中0.5μg/ml的重组S-ECD蛋白在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05%吐温)洗涤板,并将其用250μl/孔的含1%BSA的PBST在37℃封闭2小时。随后弃去封闭液,向首孔加入1μg/ml的纯化抗体100μl,并按照3倍梯度稀释,共计11个测试浓度梯度外加一个空白孔。然后在37℃下孵育1小时。将板用PBST洗涤三次,并用100μl/孔的缀合辣根过氧化物酶的山羊抗兔IgG(Fc-特异性)二抗(GenScript,A01856)37℃孵育0.5小时。ELISA板用PBST洗涤四次,然后加入TMB显色液(GenScript)并在25℃下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1M HCl终止液(国药,10011018)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板,各克隆的EC
50检测曲线如图3,EC
50值如表3所示:
表3抗体对S-ECD蛋白结合的EC
50值
抗体 | EC 50(ng/ml) | 抗体 | EC 50(ng/ml) |
3B4 | 1.145 | 5E4 | 6.144 |
2F6 | 1.354 | 5H7 | 6.727 |
5D10 | 2.198 | 2F12 | 7.182 |
3D5 | 2.402 | 3F4 | 7.723 |
3C4 | 2.796 | 5A10 | 8.130 |
2F8 | 3.029 | 3E5 | 8.327 |
2G4 | 4.523 | 5C9 | 11.873 |
5F7 | 4.630 | 2E12 | 12.253 |
实施例7:单克隆抗体表位鉴定
竞争ELISA用于评估细胞培养上清的抗原表位。将ELISA板用100μl/孔的PBS中1μg/ml的重组S-ECD蛋白在37℃下包被2小时。用PBS-T(0.05%吐温)洗涤板,并将其用250μl/孔的含1%BSA的PBST在37℃封闭1小时。随后弃去封闭液,每孔分别加入每个预先与缀合辣根过氧化物酶的山羊抗兔IgG(Fc-特异性)(GenScript,A01856)二抗混合的细胞上清50μl和每个细胞上清原液50μl。然后在37℃下孵育1小时。将板用PBST洗涤4次,然后加入TMB显色液(GenScript)并在25℃下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1M HCl终止液(GenScript)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。16种抗体共检测到 11种表位,汇总如表4。我们经过第一轮表位归类得到初步的归类结果,在此基础上每个表位选择一个抗体加上剩余的其他未归类抗体进行第二轮归类,表位归类的判断逻辑是:A、B、C代表不同的克隆,假如上清A的自身竞争孔的OD为0.545,与空白孔的值相比,OD值的差值接近1.0,有明显的竞争效果。当上清B和上清A-HRP混合液的OD值的差值大约为0.9,有明显的竞争效果。所以可判定分析出上清A和上清B识别的是相同的抗原决定簇。上清C和上清A-HRP混合液的OD值的差值与0孔的值相比,没有明显差异,没有竞争效果。所以可判定分析出上清C与上清A识别的是抗原的不同抗原决定簇。
表4抗体表位归类结果
实施例8:单克隆抗体的配对检测
将ELISA板用100μl/孔的PBS中2.5μg/ml的未标记纯化抗体(如3C4或2F8)在4℃下包被过夜。用PBST(0.05%吐温)洗涤板,并将其用250μl/孔的含1%BSA的PBST在37℃封闭2小时。随后弃去封闭液,分别加入首孔为20ng/ml,2倍稀释浓度和0ng/ml重组S-ECD蛋白100μl,在37℃孵育1小时。将板用PBST洗涤4次,将生物素标记的抗体(如39G6-biotin)加入板孔中,每孔加入100μl,37℃孵育1小时。将板用PBST洗涤4次,并用100μl/孔的抗生物素蛋白链菌素HRP(SA-HRP,GenScript)37℃孵育15分钟。最后将板用PBST洗涤4次,然后加入TMB显色液(GenScript)并在25℃下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1M HCl终止液(GenScript)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板,具体OD值如表5所示。选择2.5ug/ml的抗体(3C4或2F8)包被板子,然后加入不同浓度的检测原进行反应,最后加入生物素标记的检测抗体(39G6-biotin),使用SA-HRP进行反应显色。选择抗原为0的孔值低于0.1,检测抗体的值随抗原梯度降低有很好的线性关系(R值大于0.99),配对结果如图4和图5所示。判定抗体3C4和39G6是一个比较好的配对抗体,其灵敏度可达0-40pg/ml,可以作为双抗体夹心检测抗原的ELISA试剂盒的开发。同时抗体2F8和39G6也是一个比较好的配对抗体,其灵敏度可达0-40pg/ml。其中,抗体39G6为来源于PCT专利(PCT/CN2021/095228)中特异性针对RBD的兔单克隆抗体,其抗体的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136所示。
39G6重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:135):
39G6轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:136):
表5配对抗体数据
Claims (18)
- 一种抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体或其功能片段,所述抗体或其功能片段包含重链可变区和轻链可变区,其中(a)所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述HCDR1包含选自SEQ ID NO:34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118或124所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列具有至多三个氨基酸突变的变体;所述HCDR2包含选自SEQ ID NO:35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119或125所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列具有至多三个氨基酸突变的变体;所述HCDR3包含选自SEQ ID NO:36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120或126所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列具有至多三个氨基酸突变的变体;以及(b)所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3,所述LCDR1序列包含选自SEQ ID NO:37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121或127所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列具有至多三个氨基酸突变的变体;所述LCDR2序列包含选自SEQ ID NO:38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122或128所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列具有至多三个氨基酸突变的变体;所述LCDR3序列包含选自SEQ ID NO:39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123或129所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列具有至多三个氨基酸突变的变体。
- 根据权利要求1所述的单克隆抗体或其功能片段,其中,所述HCDR1序列包含选自SEQ ID NO:34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118或124所示的氨基酸序列;所述HCDR2序列包含选自SEQ ID NO:35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119或125所示的氨基酸序列;所述HCDR3序列包含选自SEQ ID NO:36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120或126所示的氨基酸序列;以及所述LCDR1序列包含选自SEQ ID NO:37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121或127所示的氨基酸序列;所述LCDR2序列包含选自SEQ ID NO:38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122或128所示的氨基酸序列;所述LCDR3序列包含选自SEQ ID NO:39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123或129所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其功能片段,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自如下序列:(a)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:34、35和36所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:37、38和39所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;(b)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:40、41和42所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:43、44和45所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;(c)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:46、47和48所示氨基酸序列或与与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:49、50和51所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;(d)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:52、53和54所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:55、56和57所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;(e)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:58、59和60所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:61、62和63所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;(f)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:64、65和66所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:67、68和69所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;(g)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:70、71和72所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:73、74和75所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;(h)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:76、77和78所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:79、80和81所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;(i)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:82、83和84所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:85、86和87所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;(j)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:88、89和90所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:91、92和93所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;(k)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:94、95和96所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:97、98和99所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;(l)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:100、101和102所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:103、104和105所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;(m)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:106、107和108所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:109、110和111所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;(n)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:112、113和114所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:115、116和117所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;(o)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:118、119和120所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2 和LCDR3分别包含SEQ ID NO:121、122和123所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;或(p)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:124、125和126所示氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体;以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:127、128和129所示的氨基酸序列或与所示氨基酸序列分别具有至多三个氨基酸突变的变体。
- 根据权利要求3中所述的单克隆抗体或其功能片段,所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3选自如下序列:(a)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:34、35和36所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:37、38和39所示的氨基酸序列;(b)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:40、41和42所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:43、44和45所示的氨基酸序列;(c)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ IDNO:46、47和48所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:49、50和51所示的氨基酸序列;(d)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:52、53和54所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:55、56和57所示的氨基酸序列;(e)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:58、59和60所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:61、62和63所示的氨基酸序列;(f)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:64、65和66所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:67、68和69所示的氨基酸序列;(g)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:70、71和72所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:73、74和75所示的氨基酸序列;(h)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:76、77和78所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:79、80和81所示的氨基酸序列;(i)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ IDNO:82、83和84所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:85、86和87所示的氨基酸序列;(j)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:88、89和90所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:91、92和93所示的氨基酸序列;(k)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:94、95和96所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:97、98和99所示的氨基酸序列;(l)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:100、101和102所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:103、104和105所示的氨基酸序列;(m)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:106、107和108所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:109、110和111所示的氨基酸序列;(n)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:112、113和114所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:115、116和117所示的氨基酸序列;(o)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:118、119和120所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:121、122和123所示的氨基酸序列;或(p)所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:124、125和126所示氨基酸序列以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:127、128和129所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1~4中任一项所述的单克隆抗体或其功能片段,其中,所述重链可变区序列包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32所示氨基酸序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;以及所述轻链可变区序列包含与SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33所示氨基酸序列具有至少80%一致性的氨基酸序列。
- 根据权利要求5中所述的单克隆抗体或其功能片段,其中,所述重链可变区序列包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32所示的氨基酸序列;以及所述轻链可变区序列包含SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33所示的氨基酸序列。
- 根据权利要求1~6中任一项所述单克隆抗体或其功能片段,所述重链可变区和轻链可变区选自如下序列:(a)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:2所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:3所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;(b)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:4所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:5所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;(c)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:6所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:7所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;(d)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:8所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:9所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;(e)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:10所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:11所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;(f)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:12所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:13所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;(g)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:14所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:15所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;(h)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:16所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:17所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;(i)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:18所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:19所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;(j)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:20所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:21所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;(k)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:22所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:23所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;(l)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:24所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:25所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;(m)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:26所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:27所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;(n)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:28所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:29所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;(o)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:30所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:31所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列;或(p)所述重链可变区包含与SEQ ID NO:32所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列,所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:33所示序列具有至少80%一致性的氨基酸序列。
- 根据权利要求7所述单克隆抗体或其功能片段,所述重链可变区和轻链可变区选自如下序列:(a)所述重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列;(b)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;(c)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;(d)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列;(e)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列;(f)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列;(g)所述重链可变区包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列;(h)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列;(i)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列;(j)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列;(k)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列;(l)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列;(m)所述重链可变区包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列;(n)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列;(o)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列;或(p)所述重链可变区包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
- 编码权利要求1~8中任一项所述的抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体或其功能片段的分离的多核苷酸。
- 根据权利要求9所述的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸包含编码所述单克隆抗体或其功能片段的重链可变区的核苷酸序列,和编码所述单克隆抗体或其功能片段的轻链可变区的核苷酸序列。
- 包含根据权利要求9或10所述的多核苷酸的表达载体。
- 包含根据权利要求11所述表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统。
- 一种药物组合物,所述药物组合物包含权利要求1~8中任一项所述的单克隆抗体或其功能片段和药学上可接受的载体。
- 权利要求1~8中任一项所述单克隆抗体或其功能片段在制备治疗冠状病毒药物中的应用。
- 根据权利要求14所述的应用,所述冠状病毒选自SARS-CoV、MERS-Cov或SARS-Cov-2,优选为SARS-Cov-2。
- 一种检测冠状病毒的试剂盒,所述试剂盒中包含权利要求1~8中任一项所述的单克隆抗体或其功能片段。
- 根据权利要求16所述的试剂盒,所述冠状病毒选自SARS-CoV、MERS-Cov或SARS-Cov-2,优选为SARS-Cov-2。
- 根据权利要求1~8中任一项所述的单克隆抗体或其功能片段,其特征在于,所述抗体是兔源的、嵌合的、人源化的或者人的。
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