CN102171334B - 纯化流感病毒抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供可以通过简便的方法从流感病毒培养液中高效率除去宿主蛋白等杂质，分离并纯化流感病毒抗原的方法。本发明的纯化流感病毒抗原的制备方法包含以下步骤：将含有流感病毒的试样用表面活性剂处理的步骤；在上述表面活性剂的共存下将上述处理后的试样与羟磷灰石接触的步骤；以及回收羟磷灰石非吸附组分的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及纯化流感病毒抗原的制备方法。
背景技术
流感病毒是属于正粘病毒科的RNA病毒，已知有A型、B型和C型。
流感病毒具有具脂质双层膜结构的包膜蛋白(Envelope)。包膜蛋白的内层主要由基质蛋白以及RNA和蛋白质的复合体RNP构成。外层是所谓的表面蛋白即流感NA蛋白(神经氨酸酶)和流感HA蛋白(血细胞凝集素)(以下，分别简称为“NA蛋白”“HA蛋白”)以突起物的形式存在。
即使是同型的病毒由于HA蛋白和NA蛋白的抗原性的不同，也可分别分类为多个的亚型和株。作为流感疫苗，在含有NA蛋白和HA蛋白的原液中添加佐剂或防腐剂等的疫苗得到广泛利用。
流感疫苗中所使用的流感病毒主要使用通过含胚胎的鸡胚培养的病毒。近年来在动物细胞培养系中也建立了培养流感病毒的方法。
通常通过这些方法得到的流感病毒并不是单独存在，而是与培养细胞、杂质蛋白等一起存在，因此必须从培养液等中分离流感病毒。流感病毒的分离、纯化通过超离心法、超滤法、密度梯度离心法等进行。
但是，即使是通过这些方法分离、纯化的流感病毒中也常常确认到来自宿主的杂质蛋白。接种存在这些杂质蛋白的流感疫苗时，可能显示过敏性休克或格林-巴利综合征等的副作用，因此需要进一步纯化。
另外，作为流感抗原的制备方法，已知有在动物细胞或昆虫细胞中插入(組み込む)制备流感病毒中所含的蛋白质抗原的基因的方法。
作为纯化流感病毒的方法，已经已知有例如使用羟磷灰石来纯化流感病毒或流感病毒抗原的方法(专利文献1)。专利文献1的方法包含以下步骤：使病毒或病毒抗原吸附在羟磷灰石上的步骤、以及通过洗脱液洗脱的步骤。但是，流感病毒中存在多种的株，各种的株中HA蛋白或NA蛋白的序列不同，因此，在洗脱条件一定时，依据流感病毒的株洗脱位置发生变化，每种株的纯化度可能不同。因此，必须对每种流感病毒株来严格规定吸附的蛋白质的洗脱条件，在制备上非常烦杂。
专利文献2中公开了利用HA蛋白特异性吸附在特定的糖链上的性质，使用固定了保有唾液酸糖链的化合物的载体的重组HA蛋白的纯化方法。但是，该方法中，固定了保有唾液酸糖链的化合物的载体的制作需要花费很多功夫，并且在流感病毒株中，在HA蛋白发生较大突变时，存在的问题是有难以纯化的可能性等。
非专利文献1中记载了通过基因重组法，将具有生成流感病毒的HA蛋白的信息的基因插入到动物细胞(昆虫细胞)中，制备基因重组细胞，培养该细胞，制备HA蛋白的方法。该方法必须彻底除去来自基因重组细胞的杂质蛋白。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2000-262280号公报
专利文献2：日本特许第3476242号
非专利文献
非专利文献1：Vaccine 24(2006)2176-2185 Expression and purificationof an influenza hemagglutinin-one step closer to a recombinant protein-based influenza vaccine
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供：可以通过简便的方法，从含有流感病毒抗原的流感病毒培养液、或插入了生成流感抗原的基因的基因重组细胞的培养液中高效率除去宿主蛋白等杂质，分离并纯化流感病毒抗原的方法。
解决课题的方法
本发明人等深入研究的结果，发现：将通过鸡胚培养系或动物细胞培养系培养的流感病毒培养液等的含有流感抗原的试样进行粗纯化，然后用表面活性剂处理，进行适当的离心或滤器分离等，然后在表面活性剂的共存下与羟磷灰石接触，则培养液中的杂质被羟磷灰石吸附，HA蛋白等流感病毒抗原可以以高纯度在非吸附组分中获得，从而完成了本发明。
即，本发明提供纯化流感病毒抗原的制备方法，该方法包含以下步骤：将含有流感病毒抗原的试样用表面活性剂处理的步骤；在上述表面活性剂的共存下使上述处理后的试样与羟磷灰石接触的步骤；以及回收羟磷灰石非吸附组分的步骤。本发明还提供流感疫苗的制备方法，该方法包含通过上述本发明的方法来制备纯化流感病毒抗原。本发明进一步提供通过上述本发明的方法制备的含有纯化流感病毒抗原的流感疫苗、以及将流感疫苗填充在可接种的容器中的预装试剂盒(プレフイルドキツト)。本发明进一步提供通过上述本发明的方法制备的含有纯化流感病毒抗原的流感诊断试剂。本发明还进一步提供通过上述本发明的方法制备的含有纯化流感病毒抗原的流感诊断试剂盒。
需要说明的是，如无特别说明，本说明书中，试样中各成分的浓度和pH值是指试样与羟磷灰石接触之前的浓度。如无特别说明，浓度单位的％为％w/v。
发明效果
根据本发明，可以通过简单的操作，从含有含各种杂质的流感病毒抗原的试样中，将HA蛋白等抗原蛋白制成高纯度的纯化流感病毒抗原，并且可以以高回收率获得它们。根据本发明的方法，可以低成本获得显示过敏性休克等的严重副作用的可能性小、可用作疫苗的、安全性和有效性高的纯化流感病毒抗原。
附图简述
图1是表示实施例1中羟磷灰石柱层析结果以及各组分的SDS-PAGE(非还原银染色)结果的图。
图2是表示实施例1中经羟磷灰石纯化前后的试样SDS-PAGE(非还原银染色)结果的图。
图3是表示实施例2中羟磷灰石柱层析结果以及各组分的SDS-PAGE(非还原银染色)结果的图。
图4是表示实施例3中羟磷灰石柱层析结果以及各组分的SDS-PAGE(非还原银染色)结果的图。
图5是表示实施例3中各纯化步骤样品的SDS-PAGE(非还原，CBB染色)结果的图。
图6是表示对实施例4中所得各组分进行SDS-PAGE(非还原，CBB染色)的结果的图。
图7是表示对实施例5中所得各上清和各沉淀组分进行SDS-PAGE(非还原，CBB染色)的结果的图。
图8是表示对实施例6中所得各组分进行SDS-PAGE(非还原银染色)的结果的图。
图9是表示实施例7中羟磷灰石柱层析结果以及各组分的SDS-PAGE(非还原银染色)结果的图。
图10是表示参考例中CHAPS非添加试样的羟磷灰石柱层析结果以及各组分的SDS-PAGE(非还原，CBB染色)结果的图。
图11是表示参考例中CHAPS添加试样的羟磷灰石柱层析结果以及各组分的SDS-PAGE(非还原，CBB染色)结果的图。
图12是表示实施例8中羟磷灰石柱层析结果以及各组分的SDS-PAGE(非还原银染色)结果的图。
图13是表示实施例8中经羟磷灰石纯化前后的试样的SDS-PAGE(非还原银染色)结果的图。
图14是表示对实施例9中所得各组分进行SDS-PAGE(非还原，CBB染色)结果的图。
具体实施方式
流感病毒抗原可以是流感病毒的一部分或其同等物。流感病毒抗原例如可以使用HA蛋白、NA蛋白、M2蛋白等的存在于病毒表面的蛋白，或M1蛋白、NP蛋白等的存在于病毒内部的蛋白的任何一种，优选使用HA蛋白。HA蛋白的制备可以是以流感病毒的培养液作为原料，也可以是以插入了HA蛋白合成基因的基因重组细胞的培养液作为原料。
本发明的纯化流感病毒抗原的制备方法包含以下步骤：将含有流感病毒抗原的试样用表面活性剂处理的步骤；在上述表面活性剂的共存下使上述处理后的试样与羟磷灰石接触的步骤；以及回收羟磷灰石非吸附组分的步骤。本发明的方法中，羟磷灰石是用于吸附试样中的杂质并除去，流感病毒抗原在非吸附组分中获得。
供给本发明的方法的含有流感病毒抗原的试样可举出：通过使用动物细胞作为宿主的动物细胞培养系或使用鸡胚作为宿主的鸡胚培养系来使流感病毒增殖的培养液；或者插入HA蛋白合成基因等的制备流感病毒抗原的基因的基因重组细胞培养系的培养液等。
通过鸡胚培养系或动物细胞培养系使流感病毒增殖的培养液中大量含有来自宿主的蛋白质等的杂质。根据本发明的方法，可以通过简便的操作高效率除去上述杂质，可获得纯度高的流感病毒抗原。
动物细胞培养系和鸡胚培养系在该领域是公知的，可以使用上述公知的培养系的任意一种。动物细胞培养系中，例如可以使用由牛、马、猪、羊、犬、猴等哺乳类，鸡、鹅、鸭等鸟类，以及小鼠等分离的组织或培养细胞，优选使用CHO细胞、Vero细胞、MDCK细胞、Per.C6细胞、EB66细胞等。
在培养液中增殖的流感病毒通常通过常规使用的纯化步骤、例如超滤法、密度梯度离心法等从培养液中分离，以粗纯化流感病毒液的形式制备。本发明的方法中，可以将上述粗纯化流感病毒液优选作为含有流感病毒抗原的试样使用。
供给本发明的方法的含有流感病毒抗原的试样并不限定为流感病毒培养液。也可以通过基因重组法向昆虫细胞或动物细胞导入生成流感病毒抗原的基因，对于生成的流感病毒抗原也可以利用本发明的方法进行纯化。
插入HA蛋白基因的动物细胞或昆虫细胞没有特别限定，昆虫细胞可举出：夜盗蛾、蚕，动物细胞可举出犬、猫、猴、猪、牛、小鼠等哺乳类，或者鸡、鹅、鸭等鸟类。宿主细胞优选增殖效率高的昆虫细胞或变态反应发生源少的哺乳类，动物细胞优选使用CHO细胞、COS细胞、HEK293细胞、Vero细胞、MDCK细胞等，昆虫细胞优选使用SF-9细胞、SF-21细胞等。另外，流感病毒抗原基因的核苷酸序列是周知的，例如记载于GenBank Accession No.EU103824等中。根据该核苷酸序列，可以通过基因重组法制备流感病毒抗原(例如参照非专利文献1)。另外，通过基因重组法制备的流感病毒抗原在市场上有出售，因此也可以将上述市售品应用于本发明的方法中。
对含流感病毒抗原的试样进行处理的表面活性剂可以使用选自非离子性表面活性剂、两性表面活性剂和阴离子性表面活性剂的一种以上。
非离子性表面活性剂可举出：聚氧乙烯烷基醚(例如，商品名エマルゲン220、エマルゲン104P、エマルゲン108、エマルゲン408等(花王公司制备))、聚氧乙烯烷基苯基醚(例如，商品名エマルゲン903、エマルゲン909、エマルゲン913等(花王公司制备))、聚氧乙烯/聚氧丙烯缩合物(例如，商品名プルロニツクF88(旭电化公司制备))、酰基聚氧乙烯失水山梨醇酯(例如商品名Tween 21、Tween 81、Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80、Tween 85、Emasol4130等)、烷基聚氧乙烯醚(例如，商品名AtlasG2127、Brij36T、Brij 56等)、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、蔗糖单月桂酸酯、聚氧乙烯月桂基醚(商品名エマルゲン120等(花王公司制备))、聚氧乙烯亚烷基苯基醚(商品名エマルゲンA60等)、聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚(商品名エマルゲンB66等)、聚氧乙烯乙二醇对叔辛基苯基醚聚氧乙烯乙二醇(商品名TritonX-100)、聚氧乙烯高级醇醚(商品名エマルゲン705、エマルゲン709等(花王公司制备))、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺、甘油脂肪酸酯、正辛基-β-D-葡糖苷、聚氧乙烯乙二醇单十二烷基醚、正辛基-β-D-硫代葡糖苷、聚氧乙烯单月桂酸酯等。特别优选聚氧乙烯乙二醇对叔辛基苯基醚。
作为两性表面活性剂，可举出：甜菜碱衍生物、烷基甜菜碱衍生物、咪唑甜菜碱衍生物、磺基甜菜碱衍生物、氨基羧酸衍生物、咪唑啉衍生物、アミンオキサノイド衍生物、胆汁酸衍生物等，特别优选DDA[(2-(N-十二烷基-N，N-二甲基氨基)乙酸盐]、DDSA[十二烷基二甲基(3-硫丙基)氢氧化铵]、CHAPS[3-(3-氯酰氨丙基)二甲基氨基-1-丙磺酸盐]。
作为阴离子性表面活性剂，可举出：月桂基硫酸、十二烷基磺酸、月桂酰肌氨酸、十二烷基苯磺酸、酪蛋白酸、月桂酰-β-丙氨酸、胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、脂肪酸盐等。阴离子性表面活性剂可以是这些化合物的钠盐、钾盐等碱金属盐。优选使用脱氧胆酸钠(DOC)。
这些表面活性剂可以单独使用，也可以将多种组合使用。将多种组合时，可以将非离子系表面活性剂与两性表面活性剂组合使用，也可以将非离子系表面活性剂与阴离子性表面活性剂组合使用，还可以将两性表面活性剂与阴离子性表面活性剂组合使用，也可以将三者组合使用。还可以将非离子性表面活性剂之间或两性表面活性剂之间或阴离子性表面活性剂之间组合使用。
表面活性剂的处理例如可以在含有流感病毒抗原的试样中添加表面活性剂，在0℃～室温左右搅拌30分钟～2小时左右来进行。表面活性剂的处理浓度(与羟磷灰石接触之前的浓度)通常是表面活性剂的有效成分相对于含有流感病毒抗原的试样全体的浓度，优选0.05％～20％，进一步优选0.1％～20％，更进一步优选0.1％～5％。不过，适合处理的表面活性剂浓度根据表面活性剂的种类而不同，未必限定于该范围。例如CHAPS优选0.5％～20％，进一步优选1％～15％。聚氧乙烯乙二醇对叔辛基苯基醚优选0.05％～3％，进一步优选0.1％～2％。脱氧胆酸或脱氧胆酸盐优选1％～20％，进一步优选1.5％～15％。
还可以根据需要从表面活性剂处理后的试样中除去试样溶液中的不溶物。作为除去不溶物的方法，可举出：离心、超离心、滤器过滤等。通过该不溶物除去步骤，可以除去杂质的大部分，因此通过将其与羟磷灰石吸附除去杂质相组合，可以非常高效率地进行纯化。
接着，使表面活性剂处理后的试样溶液与羟磷灰石接触。本发明中，在表面活性剂共存下，使羟磷灰石与含流感病毒抗原的试样溶液接触，这是很重要的。如果在不存在表面活性剂的状态下使羟磷灰石与流感病毒抗原接触，则可确认到流感病毒抗原吸附在羟磷灰石上(参照下述参考例)。本发明中，表面活性剂处理后的试样溶液中已经存在表面活性剂，因此可以将处理后的溶液直接与羟磷灰石接触。不过，也可以进一步在处理后的溶液中追加表面活性剂。
优选表面活性剂处理后的试样在pH6～10、更优选在pH6～9、进一步优选在pH6.5～9的条件下与羟磷灰石接触。若pH值低于该范围，则难以在非吸附组分中获得流感病毒抗原。另外，若pH值高于该范围，则杂质的吸附除去效率降低(参照下述实施例)。
对本发明中使用的羟磷灰石的种类没有特别限定，可以使用可商业获得的任何羟磷灰石。例如，可以使用作为柱的填充剂在市场上出售的羟磷灰石。优选的例子可举出具有约20～50μm粒径和约800埃孔径的陶瓷羟磷灰石。上述可商业获得的羟磷灰石可举出例如由Bio-Rad销售的“陶瓷·羟磷灰石I型”或“陶瓷·羟磷灰石II型”。
对表面活性剂处理后的试样与羟磷灰石接触的具体操作没有限定，可根据样品的浓度或量、所使用的羟磷灰石的形态等适当选择。例如可举出以下方法：向试样中加入羟磷灰石的间歇式、或向填充有羟磷灰石的柱内添加试样的方法等。
间歇法中，例如通过过滤、离心等从表面活性剂处理后的试样中除去不溶物后，向试样中加入羟磷灰石。此时，试样可以预先使用适当的缓冲液等调节至pH6～10左右，优选pH6～9左右，更优选pH6.5～9。可以进一步向试样中追加表面活性剂，不过处理后的溶液中已经存在表面活性剂，因此无需追加表面活性剂，直接加入羟磷灰石，这较为简便。加入羟磷灰石后，在0℃～室温左右下、在适当搅拌下接触15分钟～1小时左右，使试样中的杂质吸附。纯化流感病毒抗原可在非吸附组分中获得，因此可以通过过滤等除去羟磷灰石，获得上清。
将羟磷灰石填充在柱中使用的方法中，例如利用磷酸缓冲液等的缓冲液来平衡柱，然后向柱中添加表面活性剂处理后的试样，利用平衡中使用的缓冲液等展开。流感病毒抗原不吸附在羟磷灰石上，直接通过，因此分取非吸附组分，可获得纯化流感病毒抗原。该洗脱的组分主要含有HA蛋白，这种状态下就已经被纯化至很高程度，可以再次通过同样的层析进一步纯化，也可以根据需要通过超滤、离子交换色谱、凝胶过滤等方法进一步纯化。缓冲液的pH值优选6～10，更优选pH6～9，进一步优选pH6.5～9。
可使用的缓冲液除磷酸缓冲液之外，例如有：MES[2-(N-吗啉代)乙烷磺酸]、BIS-TRIS[双-(2-羟基乙基)-氨基]三-(羟基甲基)甲烷]、ADA[N-2-乙酰胺亚氨基二乙酸一钠盐]、ACES[N-2-乙酰胺-2-氨基乙烷磺酸]、PIPES[哌嗪-N，N’-双(2-乙烷-磺酸)]、MOPSO[(3-N-吗啉代)-2-羟基丙烷磺酸]、BIS-TRIS PROPANE[1，3-双[三(羟基甲基)甲基氨基]丙烷]、BES[N，N-双-(2-羟基乙基)-2-氨基-乙烷磺酸]、TES[N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸和2-2([2-羟基-1，1-双(羟基甲基)乙基]氨基)乙烷磺酸]、HEPES[N-2-羟基乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸]、DIPSO[3-(N，N-双(2-羟基乙基)氨基)-2-羟基-丙烷磺酸]、TAPSO[3-N-三(羟基甲基)甲基氨基]-2-羟基-丙烷磺酸]、TRIS[三-(羟基甲基)-氨基甲烷]、HEPPSO[N-(2-羟基乙基)-哌嗪-N’-[2-羟基-丙烷磺酸]]、POPSO[(哌嗪-N，N’-双[2-(羟基丙烷磺酸)]、EPPS[N-[2-羟基乙基]-哌嗪-N’-[3-丙烷磺酸和HEPPS]、TEA[三乙醇胺]、TRICINE[N[三-(羟基甲基)甲基]甘氨酸]、BICINE[N，N-双-(2-羟基乙基)]-甘氨酸]、TAPS[3-{[三-(羟基甲基)甲基]氨基}-丙烷磺酸]、咪唑、HEPPS[N-2-羟基乙基哌嗪-N’-3-丙烷磺酸]、甘氨酰胺盐酸盐、甘氨酰替甘氨酸、柠檬酸盐、乙酸盐、硼酸盐、以及琥珀酸盐缓冲液。
这些缓冲液中可以含有盐类和/或表面活性剂。作为可以使用的盐类，可以举出：例如钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钙盐、氯化物、溴化物、乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐。具体来说，可以举出：氯化钠、氯化钾、氯化铵、氯化镁、氯化钙、溴化钠、溴化钾、溴化铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵、乙酸钠、乙酸钾、乙酸钙、乙酸镁、磷酸钠、磷酸钾、磷酸铵等。对于表面活性剂，可以使用之前例举的表面活性剂，但并不限于这些。
关于缓冲液的适当组成，本领域技术人员可以以本技术领域已知的知识为指导，进行适当选择。
与羟磷灰石接触后的非吸附组分中所含的表面活性剂可以适当通过超滤等除去。
如上纯化的流感病毒抗原其纯化度高，几乎不含有表面活性剂、来自鸡胚或动物细胞或基因重组细胞的DNA等的杂质。流感病毒抗原中添加佐剂或防腐剂等，可以作为流感疫苗使用。流感疫苗可以填充在注射器或可用于接种操作的药筒(Cartridge)等中，制成预装注射器等可接种的预装试剂盒。
作为非吸附组分获得的纯化流感病毒抗原液可以以原液的形式直接或者是作为诊断用组合物等、作为流感诊断试剂盒的一部分使用。还可以按照周知的方法使用纯化流感病毒抗原作为免疫原，制备抗流感抗体，将含有该抗体的试剂作为流感诊断试剂的一部分、或者作为流感诊断试剂盒的一部分使用。
实施例
以下，基于实施例更具体地说明本发明。但本发明并不受下述实施例限定。
实施例1
在培养的马-达二氏犬肾(MDCK)细胞中接种流感病毒(H1N1株)，使其增殖。通过过滤、超滤、蔗糖密度梯度离心法粗纯化所得培养上清，通过β-丙内酯进行流感病毒的灭活。对灭活的流感病毒液进行超滤，将溶剂置换为6.7mM磷酸缓冲生理盐水，得到粗纯化流感病毒液。
在10mL粗纯化流感病毒液中加入10mL含有10％CHAPS的6.7mM磷酸缓冲生理盐水，在室温下搅拌1小时，然后在200,000×g、30分钟、15℃的条件下超离心。超离心后回收上清，作为柱层析的试样。
在内径0.5cm、高度16cm的柱中填充1.8mL羟磷灰石树脂(Macro-Prep陶瓷羟磷灰石I型40μm，Bio-Rad公司制备)，用5mM磷酸缓冲液(pH7.0)、以流速0.5mL/分钟进行平衡，然后添加20mL试样，用5mM磷酸缓冲液(pH7.0)展开。分取直接流过的组分(非吸附组分)，作为纯化流感病毒抗原液。吸附的组分利用5mM～400mM的磷酸缓冲液的线性梯度来洗脱。纯化流感病毒抗原液进一步通过使用VIVAFLOW50(ザルトリウス公司制备)的超滤来除去CHAPS，将溶剂置换为6.7mM磷酸缓冲生理盐水，然后使用0.22μm滤器(ミリポア公司制备，SLLG025SS)进行滤器过滤，得到15mL的纯化流感病毒抗原液。
羟磷灰石柱层析和各组分的SDS-PAGE(非还原银染色)的结果如图1所示。需要说明的是，梯度是将A液(5mM磷酸缓冲液)和B液(400mM磷酸缓冲液)混合来制备，图中的ConcB(％)表示B液的混合比例(例如，ConcB 0％溶液：100％A液+0％B液，ConcB 50％溶液：50％A液+50％B液，ConcB 100％溶液：0％A液+100％B液)。纯化前后的SDS-PAGE(非还原银染色)的结果如图2所示，对于纯化的流感抗原进行DNA分析、CHAPS分析、总蛋白质量分析，结果如表1所示。表1中的HA蛋白含量是：在SDS-PAGE后进行CBB染色，通过图像分析计算HA蛋白含量率，将该值乘以总蛋白质量所得的值。
由HA含量计算的HA蛋白的回收率为72％。另外，来自宿主的DNA、或在纯化步骤中添加的CHAPS等杂质在一系列的纯化步骤中被除去至非常低的水平。
[表1]
实施例2
与实施例1同样，由通过MDCK细胞增殖的流感病毒(H1N1株)培养液中制备粗纯化流感病毒液。向1mL该粗纯化液中加入1mL含有1％TritonX-100的6.7mM磷酸缓冲生理盐水，在室温下搅拌1小时，然后在200,000×g、30分钟、15℃的条件下超离心。超离心后回收上清，作为柱层析的试样。
在内径0.5cm、高度9cm的柱中填充1mL羟磷灰石树脂(Macro-Prep陶瓷羟磷灰石I型40μm，Bio-Rad公司制备)，利用5mM磷酸缓冲液(pH7.0)、以流速0.5mL/分钟进行平衡，然后添加2mL试样，利用400mM磷酸缓冲液(pH7.0)展开。分取直接流过的组分(非吸附组分)，得到纯化流感病毒抗原液。吸附的组分利用5mM～400mM的磷酸缓冲液的线性梯度来洗脱。
羟磷灰石柱层析以及各组分的SDS-PAGE(非还原银染色)的结果如图3所示。需要说明的是，图中的Conc B(％)的含义与实施例1同样。
即使在使用TritonX-100作为表面活性剂时，通过使用羟磷灰石，也显示出可以高效率制备纯化流感病毒抗原。
实施例3
将流感病毒(H1N1株)接种于孵化鸡胚中使其增殖，通过超滤、钡处理、蔗糖密度梯度离心法粗纯化尿囊腔液中游出的流感病毒培养液，通过β-丙内酯进行流感病毒的灭活。对于灭活的流感病毒液进行超滤，将溶剂置换为6.7mM磷酸缓冲生理盐水，得到粗纯化流感病毒液。
在5mL粗纯化流感病毒液中加入5mL含有10％CHAPS的6.7mM磷酸缓冲生理盐水，在室温下搅拌1小时，然后通过孔径0.22μm的膜滤器过滤，将滤液作为柱层析的试样。
在内径0.5cm、高度16cm的柱中填充1.8mL羟磷灰石树脂(Macro-Prep陶瓷羟磷灰石I型40μm，Bio-Rad公司制备)，利用5mM磷酸缓冲液(pH7.0)、以流速0.5mL/分钟进行平衡，然后添加6mL试样，利用5mM磷酸缓冲液(pH7.0)展开。分取直接流过的组分(非吸附组分)，作为纯化流感病毒抗原液。纯化流感病毒抗原液进一步通过使用VIVAFLOW50(ザルトリウス公司制备)的超滤来除去CHAPS，将溶剂置换为6.7mM磷酸缓冲生理盐水，然后使用0.22μm滤器(ミリポア公司制备，SLLG025SS)进行滤器过滤(无菌过滤)，得到15mL的纯化流感病毒抗原液。吸附的组分是利用400mM磷酸缓冲液(pH7.0)、接着利用0M～1M NaOH的线性梯度来洗脱，得到洗脱组分。
羟磷灰石柱层析和各组分的SDS-PAGE(非还原银染色)的结果如图4所示。需要说明的是，梯度是将A液(400mM磷酸缓冲液)和B液(1M NaOH)混合来制作，图中的Conc B(％)表示B液的混合比例。各纯化步骤样品的SDS-PAGE(非还原，CBB染色)的结果如图5所示。对于纯化的流感病毒抗原进行总蛋白质量、CHAPS分析，结果如表2所示。表2中的HA蛋白含量是：在SDS-PAGE后进行CBB染色，通过图像分析计算HA蛋白含有率，将其值乘以总蛋白质量所得的值。
由HA蛋白含量计算的HA蛋白的回收率为42％。另外，在纯化步骤中添加的CHAPS在一系列的纯化步骤中被除去至非常低的水平。
[表2]
实施例4
与实施例1同样，由通过MDCK细胞增殖的流感病毒(H1N1株)制备粗纯化流感病毒液。向1mL该粗纯化液中加入1mL含有1％TritonX-100的6.7mM磷酸缓冲生理盐水，在室温下搅拌1小时，然后在200,000×g、30分钟、15℃的条件下通过超离心法分离，回收上清。向0.2mL上清中添加0.2mL羟磷灰石树脂(Macro-Prep陶瓷羟磷灰石I型40μm，Bio-Rad公司制备)，搅拌30分钟，然后转移至离心过滤滤器(Ultrafree-MC，ミリポア公司制备)，以15,000×g离心30秒，采取透过液作为非吸附组分。残留在上部的羟磷灰石树脂是加入0.25mL的6.7mM磷酸缓冲生理盐水并搅拌，然后同样地离心、洗涤，将该操作反复3次，采取透过液作为洗涤组分。接着加入250mM磷酸缓冲液进行搅拌，同样地离心，进行洗脱，采取透过液作为洗脱组分(磷酸)。进一步加入0.25mL的0.1M NaOH溶液，同样地离心，进行洗脱，采取透过液作为洗脱组分(NaOH)。对于所得透过液进行SDS-PAGE(非还原，CBB染色)。结果如图6所示。
实施例5
与实施例1同样，由通过MDCK细胞增殖的流感病毒(H1N1株)制备粗纯化流感病毒液。向0.15mL该粗纯化液中加入0.15mL添加了表3所示浓度的各种表面活性剂的6.7mM磷酸缓冲生理盐水。即，表面活性剂处理系内的表面活性剂浓度为表3所述浓度的二分之一。在室温下搅拌1小时，然后在550,000×g、15℃、30分钟的条件下进行超离心。超离心后分别回收上清和沉淀组分，进行SDS-PAGE(非还原，CBB染色)，结果如图7所示。由图7可知，添加CHAPS进行超离心得到的上清中，HA蛋白以外的杂质蛋白少。使用CHAPS时，显示由表面活性剂处理的阶段即可高度纯化流感病毒抗原。需要说明的是，表中的“DOC”表示脱氧胆酸钠。
[表3]
| 表面活性剂 | 浓度(％) |
| TritonX-100 | 1 |
| Tween 80/CTAB | 0.06/0.15 |
| CHAPS | 10 |
| DOC | 10 |
实施例6
与实施例1同样，由通过MDCK细胞增殖的流感病毒(H1N1株)制备粗纯化流感病毒液。向1mL该粗纯化液中加入10mL含有1％TritonX-100的6.7mM磷酸缓冲液，在室温下搅拌1小时，然后在200,000×g、30分钟、15℃的条件下进行超离心。超离心后回收上清，作为柱层析的试样。
在内径0.5cm、高度9cm的柱中填充1mL羟磷灰石树脂(Macro-Prep陶瓷羟磷灰石I型40μm，Bio-Rad公司制备)，使用各种pH值的5mM磷酸缓冲液、以流速0.5mL/分钟进行平衡，然后添加1mL试样，利用各种pH值的5mM磷酸缓冲液展开，分取直接流过的组分(非吸附组分)。吸附的组分用0M～0.1M的NaOH的分级梯度(A液：5mM磷酸缓冲液，B液：0.1M的NaOH溶液)洗脱，得到吸附组分1、2。对于这些组分进行SDS-PAGE(非还原银染色)，结果如图8所示。在pH5.8时，直接流过的组分中几乎未见蛋白质，也包括流感病毒抗原，大部分的蛋白质吸附在羟磷灰石树脂上。pH6.2以上时，直接流过的组分中可以确认到以HA蛋白为主的蛋白质的存在。
实施例7
与实施例3同样，由接种于孵化鸡胚并增殖的流感病毒(H1N1株)制备粗纯化流感病毒液。向1mL该粗纯化液中加入1mL含有5％脱氧胆酸钠(DOC)的6.7mM磷酸缓冲液，在室温下搅拌1小时，然后通过孔径0.22μm的膜滤器过滤，将滤液作为柱层析的试样。
在内径0.5cm、高度9cm的柱中填充0.9mL羟磷灰石树脂(Macro-Prep陶瓷羟磷灰石I型40μm，Bio-Rad公司制备)，利用含有60mM NaCl的5mM磷酸缓冲液(pH7.0)、以流速0.5mL/分钟进行平衡，然后添加1mL试样，利用含有60mM NaCl的5mM磷酸缓冲液(pH7.0)展开。分取直接流过的组分，得到纯化流感病毒抗原液。吸附的组分与实施例3同样，利用400mM磷酸缓冲液来洗脱，接着利用0M～1M NaOH的线性梯度来洗脱。
羟磷灰石柱层析以及各组分的SDS-PAGE(非还原银染色)的结果如图9所示。需要说明的是，图中的Conc B(％)的含义与实施例3同样。
即使是使用DOC作为表面活性剂时，通过使用羟磷灰石，也显示出可以高效率进行流感病毒抗原的纯化。
参考例
在按照与实施例1同样的方法、使用羟磷灰石树脂纯化、除去了CHAPS的0.5mL纯化流感病毒抗原中，将添加了0.5mL的6.7mM磷酸缓冲液的所得物作为CHAPS非添加试样，将添加了0.5mL含有10％CHAPS的6.7mM磷酸缓冲液的所得物作为CHAPS添加试样。
在内径0.5cm、高度9cm的柱中填充0.9mL羟磷灰石树脂(Macro-Prep陶瓷羟磷灰石I型40μm，Bio-Rad公司制备)，使用5mM磷酸缓冲液(pH7.0)、以流速0.5mL/分钟进行平衡，然后添加0.5mL试样，利用5mM磷酸缓冲液(pH7.0)展开。各分取1mL直接流过的组分(非吸附组分)。吸附的组分利用与实施例1同样的5mM～400mM磷酸缓冲液(pH7.0)的线性梯度来洗脱，分别分取1mL。
CHAPS非添加试样的羟磷灰石柱层析以及各组分的SDS-PAGE(非还原，CBB染色)的结果如图10所示，CHAPS添加试样的结果如图11所示。需要说明的是，图中的Conc B(％)的含义与实施例1同样。
在CHAPS非添加试样中，几乎所有HA蛋白被吸附，即使用400mM磷酸缓冲液洗脱，也只有微量被洗脱的程度，但在CHAPS添加试样中，HA蛋白被洗脱在直接流过的组分中。
实施例8
在培养的马-达二氏犬肾(MDCK)细胞中接种流感病毒(H5N1株)并使其增殖。通过过滤、超滤、蔗糖密度梯度离心法粗纯化所得培养上清，通过β-丙内酯进行流感病毒的灭活。对于灭活的流感病毒液进行超滤，将溶剂置换为6.7mM磷酸缓冲生理盐水，得到粗纯化流感病毒液。
在75mL粗纯化流感病毒液中加入75mL含有1％TritonX-100的6.7mM磷酸缓冲液，在室温下搅拌90分钟，然后使用0.22μm的滤器(ミリポア公司制备，ステリカツプ-GV)进行滤器过滤，作为柱层析的试样。
在内径2.6cm、高度20cm的柱中填充56mL羟磷灰石树脂(Macro-Prep陶瓷羟磷灰石I型40μm，Bio-Rad公司制备)，利用含有60mM NaCl和0.5％TritonX-100的5mM磷酸缓冲液(pH7.0)、以流速0.5mL/分钟进行平衡，然后添加150mL试样，利用平衡中使用的缓冲液展开。分取直接流过的组分(非吸附组分)，作为纯化流感病毒抗原液。吸附的组分利用400mM磷酸缓冲液(pH7.0)、接着利用0mM～1M NaOH的线性梯度来洗脱，得到洗脱组分。纯化流感病毒抗原液进一步通过离子交换色谱除去TritonX-100，通过使用VIVAFLOW50(ザルトリウス公司制备)的超滤，将溶剂置换为6.7mM磷酸缓冲生理盐水，然后使用0.22μm的滤器(ミリポア公司制备，MILLEX-GV)进行滤器过滤，得到20mL的纯化流感病毒抗原液。
羟磷灰石柱层析以及各组分的SDS-PAGE(非还原银染色)的结果如图12所示。需要说明的是，图中的Conc B(％)的含义与实施例3同样。纯化前后的SDS-PAGE(非还原银染色)的结果如图13所示。
即使是来自H5N1型流感病毒的流感病毒抗原也显示出可以与来自H1N1型流感病毒的流感病毒抗原同样地进行纯化。
实施例9
在作为流感病毒抗原的、由插入了生成HA蛋白的基因的昆虫细胞制备的0.009mL H1型HA蛋白(アブカム公司制备，Cat.No.ab69741，1.67mg/mL，市售品)中加入0.072mL含有1％TritonX-100的20mM磷酸缓冲生理盐水，进行搅拌，作为试样。在离心过滤滤器(Ultrafree-MC，ミリポア公司制备)的膜上载上0.05mL羟磷灰石树脂(Macro-Prep陶瓷羟磷灰石I型40μm，Bio-Rad公司制备)，添加0.05mL试样，以15,000×g离心30秒。采取透过液作为非吸附组分。在上部残留的羟磷灰石树脂中加入0.05mL的20mM磷酸缓冲生理盐水，进行搅拌，然后同样地离心并洗涤，将该操作反复3次，采取透过液作为洗涤组分。接着加入0.05mL的250mM磷酸缓冲液，进行搅拌，然后同样地离心进行洗脱，采取透过液作为洗脱组分(磷酸)。进一步加入0.05mL的0.1M NaOH溶液，同样地离心，进行洗脱，采取透过液作为洗脱组分(NaOH)。对于所得透过液进行SDS-PAGE(非还原，CBB染色)，结果如图14所示。
作为流感病毒抗原的、由插入了生成HA蛋白的基因的昆虫细胞生成的HA蛋白虽然可见一部分吸附在树脂上，但仍然可以将HA蛋白作为非吸附组分、洗涤组分回收。这显示出，使用基因重组的昆虫细胞制备的H1型HA蛋白也与利用鸡胚或动物细胞培养的HA蛋白同样，可通过作为非吸附组分和洗涤组分回收来进行纯化。
产业实用性
如上所示，根据本发明的方法，可以通过简单的操作，由含有培养的各种杂质的、含流感病毒抗原的培养液等的试样中高纯化度且高回收率地获得HA蛋白等的流感病毒抗原。另外，根据本发明的制备方法，可以低成本地获得安全性和有效性高的纯化流感病毒抗原。
Claims (4)
1.纯化流感病毒抗原的制备方法，该方法包含以下步骤：将含有流感病毒抗原的试样用表面活性剂在0℃～室温搅拌30分钟～2小时的步骤；在上述表面活性剂的共存下使上述处理后的试样与羟磷灰石在pH6～10的条件下接触的步骤；以及回收羟磷灰石非吸附组分的步骤，其中上述流感病毒抗原是HA蛋白，
其中，上述含有流感病毒抗原的试样是利用动物细胞培养或鸡胚培养而增殖的流感病毒，或者
上述含有流感病毒抗原的试样是在动物细胞中插入生成流感病毒抗原的基因的基因重组细胞的培养液，
其中，以0.05%～20%的表面活性剂浓度进行上述表面活性剂处理，
其中，上述表面活性剂是选自两性表面活性剂、非离子性表面活性剂和阴离子性表面活性剂的至少一种，
其中该方法是从表面活性剂处理后的试样中除去不溶物，然后与羟磷灰石接触，
其中，在与表面活性剂和羟磷灰石接触的上述步骤中，在预先使用磷酸缓冲液调节至pH6～10的上述处理后的试样中间歇式添加羟磷灰石，回收上清，作为羟磷灰石非吸附组分，
或者，在与上述羟磷灰石接触的步骤中，向用磷酸缓冲液平衡的填充了羟磷灰石的柱中添加上述处理后的试样，用磷酸缓冲液展开，回收由柱洗脱的非吸附组分。
2.权利要求1的方法，其中
上述两性表面活性剂为CHAPS，以0.05%～20%的表面活性剂浓度进行上述表面活性剂处理，
上述非离子性表面活性剂是聚乙二醇对叔辛基苯基醚，以0.05%～3%的表面活性剂浓度进行上述表面活性剂处理，
上述阴离子性表面活性剂是脱氧胆酸或其盐，以1%～20%的表面活性剂浓度进行上述表面活性剂处理。
3.权利要求1或2的方法，其中所述动物细胞为昆虫细胞。
4.流感疫苗的制备方法，该方法包含通过权利要求1－3中任一项所述的方法制备纯化流感病毒抗原。
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