TW202308688A

TW202308688A - 以gm-csf拮抗劑治療免疫療法相關毒性之方法

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Publication number: TW202308688A
Application number: TW111114798A
Authority: TW
Inventors: 卡麥隆達蘭特; 戴爾查普爾
Original assignee: 美商胡曼尼根公司
Priority date: 2021-04-19
Filing date: 2022-04-19
Publication date: 2023-03-01
Also published as: WO2022225821A1

Abstract

本發明提供用於中和及/或移除有需要之個體之人類GM-CSF的方法，包含向該個體投與具有GM-CSF基因剔除的CAR-T細胞(GM-CSF ^k/oCAR-T細胞)。亦提供用於使細胞中之 GM-CSF基因不活化或 GM-CSF基因剔除(KO)的方法，包含靶向基因體編輯或GM-CSF基因緘默。提供用於預防/治療免疫療法相關毒性的方法，包含向該個體投與具有 GM-CSF基因不活化或 GM-CSF基因剔除的CAR-T細胞(GM-CSF ^k/oCAR-T細胞)，其中使 GM-CSF基因不活化或剔除；及/或重組GM-CSF拮抗劑。提供使出現免疫療法相關毒性之個體中之除GM-CSF外之細胞介素或趨化因子含量降低的方法，包含向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑。亦提供用於治療或預防個體之免疫療法相關毒性的方法，包含向該個體投與表現嵌合抗原受體的T細胞(CAR-T細胞)，該等CAR-T細胞具有GM-CSF基因剔除(GM-CSF ^k/oCAR-T細胞)。亦提供用於預防或減少經免疫療法治療之個體之血腦障壁破壞的方法，該方法包含向該個體投與具有GM-CSF基因剔除的CAR-T細胞(GM-CSF ^k/oCAR-T細胞)。

Description

以GM-CSF拮抗劑治療免疫療法相關毒性之方法

本發明係關於中和及/或移除有需要之個體之人類GM-CSF的方法，該方法包含向該個體投與具有GM-CSF基因剔除的CAR-T細胞(GM-CSF ^k/oCAR-T細胞)。本發明亦關於使細胞中之 GM-CSF基因不活化或 GM-CSF基因剔除(KO)的方法，包含靶向基因體編輯或GM-CSF基因緘默。本發明另外關於用於預防/減少免疫療法相關毒性的方法，該方法包含向該個體投與具有 GM-CSF基因不活化或 GM-CSF基因剔除的CAR-T細胞(GM-CSF ^k/oCAR-T細胞)，其中藉由該方法不活化或剔除 GM-CSF基因。

本發明係關於減少經免疫療法治療之個體之血腦障壁破壞的方法，該方法包含向該個體投與重組GM-CSF拮抗劑。本發明亦關於保持經免疫療法治療之個體之血腦障壁完整性的方法，該方法包含向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑。本發明另外關於減少或預防CAR-T細胞療法誘導有需要之個體之神經炎症的方法，該方法包含向該個體投與重組GM-CSF拮抗劑。本發明係關於針對經免疫療法治療之個體在未發生免疫療法相關毒性的情況下降低其腫瘤復發之復發率或預防腫瘤復發出現的方法。本發明亦關於針對經免疫療法治療之個體在發生免疫療法相關毒性的情況下降低其腫瘤復發之復發率或預防腫瘤復發出現的方法。本發明另外關於降低除GM-CSF外之細胞介素或趨化因子在發生免疫療法相關毒性之個體中之含量的方法，該方法包含向該個體投與重組GM-CSF拮抗劑。本發明亦關於用於治療或預防個體之免疫療法相關毒性的方法，該方法包含向該個體投與表現嵌合抗原受體的T細胞(CAR-T細胞)及重組hGM-CSF拮抗劑，該等CAR-T細胞具有GM-CSF基因剔除(GM-CSF ^k/oCAR-T細胞)。本發明在本文中亦提供抑制或減少個體中之免疫療法相關毒性發生率及/或嚴重度的方法，該方法包含向該個體投與重組GM-CSF拮抗劑。

顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)為多種細胞類型(包括巨噬細胞、T細胞、肥大細胞、自然殺手細胞、內皮細胞及纖維母細胞)所分泌的細胞介素。GM-CSF刺激顆粒球及單核球的分化。單核球繼而遷移至組織中且成熟而變成巨噬細胞及樹突狀細胞。因此，GM-CSF的分泌引起巨噬細胞數目快速增加。GM-CSF亦參與中樞神經系統(CNS)的發炎反應，促使血源單核球及巨噬細胞流入以及星形膠質細胞及微神經膠質細胞活化。免疫相關毒性包含潛在地危及生命的免疫反應，該等免疫反應因不同免疫療法引起的高度免疫活化而發生。免疫相關毒性當前為免疫療法施用於癌症患者時的嚴重併發症。嵌合抗原受體T (CAR-T)細胞療法已作為治療癌症的一種新穎且潛在革命性療法顯現。基於B細胞惡性疾病發生的前所未有之反應，FDA在2017年批准兩種靶向CD19的CAR-T (CART19)細胞產品。然而，獨特且潛在致死的毒性出現限制了CAR-T細胞療法的更寬應用。此等毒性包括細胞介素釋放症候群(CRS)及神經毒性(NT)的顯現。據報導，經CART19細胞治療之患者中高達50%出現3級或更高等級的CRS或NT及若干死亡。此等毒性與延長的住院期、加護病房(ICU)留持有關，且NT的長期影響未知。因此，控制此等CART19細胞相關毒性為減少與CAR-T細胞療法有關之罹病率、死亡率、住院持續時間、ICU入住、所需支持性照護及顯著間接成本必不可少的。顯然，對預防及治療免疫相關毒性的方法存在關鍵的需求。理想的方法是例如允許免疫治療化合物更安全地給與及/或T細胞擴增而將此等危及生命之併發症的風險降至最低，同時不影響免疫療法的功效且甚至可潛在地改良功效。

在一個態樣中，本發明提供治療患有癌症之個體的方法，該方法包含：(a)向該個體投與治療有效量之重組hGM-CSF拮抗劑，其中該重組hGM-CSF拮抗劑為抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗(lenzilumab)；及(b)在投與抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗之後，向該個體投與抗CD19 CAR-T細胞。

在另一態樣中，本發明提供降低或消除已經歷癌症治療之個體之免疫療法相關毒性之發生率或嚴重度的方法，該方法包含：(a)向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑，其中該重組hGM-CSF拮抗劑為抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗；及(b)在投與抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗之後，向該個體投與抗CD19 CAR-T細胞。

在另一態樣中，本發明提供用抗CD19 CAR-T細胞療法延遲或預防已經歷癌症治療之個體之免疫療法相關不良神經事件的方法，該方法包含：(a)向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑，其中該重組hGM-CSF拮抗劑為抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗；及(b)在投與抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗之後，向該個體投與抗CD19 CAR-T細胞。

在一個態樣中，本發明提供用於中和及/或移除有需要之個體之人類GM-CSF的方法，該方法包含向該個體投與具有GM-CSF基因剔除的CAR-T細胞(GM-CSF ^k/oCAR-T細胞)。

在另一態樣中，本發明提供使細胞中之 GM-CSF基因不活化或 GM-CSF基因剔除(KO)的方法，包含靶向基因體編輯或GM-CSF基因緘默。

在另一態樣中，本發明提供用於預防/減少免疫療法相關毒性的方法，該方法包含向該個體投與具有 GM-CSF基因不活化或 GM-CSF基因剔除的CAR-T細胞(GM-CSF ^k/oCAR-T細胞)，其中藉由本文所述的方法不活化或剔除 GM-CSF基因。

在一個態樣中，本發明提供用於減少經免疫療法治療之個體之血腦障壁破壞的方法，該方法包含向該個體投與重組GM-CSF拮抗劑。

在另一態樣中，本發明提供用於保持經免疫療法治療之個體之血腦障壁完整性的方法，該方法包含向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑。

在另一態樣中，本發明提供減少或預防CAR-T細胞療法誘導有需要之個體發生神經炎症的方法，該方法包含向該個體投與重組GM-CSF拮抗劑。

在另一態樣中，本發明提供用於預防或減少經免疫療法治療之個體之血腦障壁破壞的方法，該方法包含向該個體投與具有GM-CSF基因剔除的CAR-T細胞(GM-CSF ^k/oCAR-T細胞)。

在一個態樣中，本發明提供針對經免疫療法治療之個體在未發生免疫療法相關毒性的情況下降低其腫瘤復發之復發率或預防或延遲腫瘤復發出現的方法，該方法包含向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑。在一相關態樣中，本發明提供針對經免疫療法治療之個體在發生免疫療法相關毒性的情況下降低其腫瘤復發之復發率或預防腫瘤復發出現的方法，該方法包含向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑。

在另一態樣中，本發明提供一種用於降低除GM-CSF外之細胞介素或趨化因子在發生免疫療法相關毒性之個體中之含量的方法，該方法包含向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑，其中該細胞介素或趨化因子之含量相較於其在個體發生免疫療法相關毒性期間的含量降低。

在另一態樣中，本發明提供一種用於預防或減少個體之免疫療法相關毒性的方法，該方法包含向該個體投與表現嵌合抗原受體的T細胞(CAR-T細胞)及重組hGM-CSF拮抗劑，該等CAR-T細胞具有GM-CSF基因『剔除』(GM-CSF ^k/oCAR-T細胞)。GM-CSF ^k/oCAR-T細胞可與hGM-CSF拮抗劑(重組hGM-CSF拮抗劑)組合投與。

在一個態樣中，本文揭示一種抑制或降低個體之免疫療法相關毒性發生率或嚴重度的方法，該方法包含向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑的步驟。

在一相關態樣中，該免疫療法包含授受性細胞轉移、投與單株抗體、投與細胞介素或趨化因子、投與癌症疫苗、T細胞接合療法或其任何組合。

在另一態樣中，授受性細胞轉移包含投與表現嵌合抗原受體的T細胞(CAR T細胞)、經T細胞受體(TCR)修飾的T細胞、腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)、經嵌合抗原受體(CAR)修飾的自然殺手細胞，或樹突狀細胞，或其任何組合。在一相關態樣中，單株抗體係選自包含以下之群：抗CD3、抗CD52、抗PD1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗CD20、抗BCMA抗體、雙特異性抗體或雙特異性T細胞接合子(BiTE)抗體或其任何組合。在一相關態樣中，細胞介素係選自包含以下之群：IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-21、IL-11、IL-12、IL-18、GM-CSF、TNFα，或其任何組合。

在另一態樣中，抑制或減少免疫療法相關毒性之發生率或嚴重度包含減少個體之血清、組織液或CSF中之至少一種發炎相關因子的濃度。在一相關態樣中，發炎相關因子係選自包含以下之群：C反應蛋白、GM-CSF、IL-1、IL-2、sIL2Rα、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IP10、IL-15、MCP-1 (AKA CCL2)、MIG、MIP1β、IFNγ、CX3CR1或TNFα，或其任何組合。在另一態樣中，重組GM-CSF拮抗劑的投與不會減少該免疫療法的功效。在另一態樣中，重組GM-CSF拮抗劑的投與增強該免疫療法的功效。在另一態樣中，重組GM-CSF拮抗劑的投與發生於免疫療法之前、同時或之後。在一相關態樣中，重組GM-CSF拮抗劑與以下各者共投與：皮質類固醇、抗IL-6抗體、托西利單抗(tocilizumab)、抗IL-1抗體、環孢靈(cyclosporine)、抗癲癇劑、苯并二氮呯、乙醯偶氮胺(acetazolamide)、過度換氣療法或高滲壓療法或其任何組合。

在另一態樣中，免疫療法相關毒性包含腦疾病、損傷或功能障礙。在一相關態樣中，腦疾病、損傷或功能障礙包含CAR-T細胞相關NT或CAR-T細胞相關腦病變症候群(CRES)。在一相關態樣中，抑制或減少腦疾病、損傷或功能障礙的發生率包含減少個體的頭痛、譫妄、焦慮、震顫、癲癇活動、意識模糊、清醒狀態的變化、幻覺、語言障礙、共濟失調、精神性運動不能、面神經麻痹、運動無力、癲癇發作、非痙攣性EEG癲癇發作、意識程度變化、昏迷、內皮細胞活化、血管滲漏、血管內凝血或其任何組合。在另一態樣中，免疫療法相關毒性包含CAR-T誘導的細胞介素釋放症候群(CRS)。在一相關態樣中，抑制或減少CRS發生率包含(不限於)減少或抑制高熱、肌痛、噁心、低血壓、低氧症或休克或其組合。在一相關態樣中，免疫療法相關毒性危及生命。

在另一態樣中，個體之ANG2或VWF的血清濃度或血清ANG2:ANG1比率減小。在一相關態樣中，在該等CAR-T細胞輸注之後的最初36小時期間，個體的體溫高於38℃，IL-6血清濃度＞16 pg/ml，或MCP-1血清濃度高於1,300 pg/ml。在一相關態樣中，個體易患該腦疾病、損傷或功能障礙。在一相關態樣中，在該等CAR-T細胞輸注之前，個體血清中的ANG2:ANG1比率高於1。

在另一態樣中，免疫療法相關毒性包含噬血細胞性淋巴組織細胞增生症(HLH)或巨噬細胞活化症候群(MAS)。在一相關態樣中，抑制或減少HLH或MAS發生率包含延長存活時間及/或復發時間、減少巨噬細胞活化、減少T細胞活化、降低周邊循環中之IFNγ濃度，或降低周邊循環中之GM-CSF濃度，或其任何組合。

在另一態樣中，個體出現發熱、脾腫大、涉及兩種或更多種株系的血球減少症、高三酸甘油酯血症、低纖維蛋白原血症、紅血球吞噬症、低或缺乏NK細胞活性、鐵蛋白血清濃度高於500 U/ml，或可溶性CD25血清濃度高於2400 U/ml，或其任何組合。在一相關態樣中，個體易患HLH或MAS。在一相關態樣中，個體的選自以下之基因攜帶突變：PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2或RAB27A，或個體中的穿孔素表現減少，或其任何組合。

在一個實施例中，GM-CSF拮抗劑為抗hGM-CSF抗體。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體阻斷hGM-CSF對hGM-CSF受體α亞單元的結合。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體為多株抗體。在另一實施例中，抗hGM-CSF抗體為單株抗體。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體為抗體片段，亦即，Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或dAB。在一些實施例中，雞中可產生單株抗hGM-CSF抗體、單鏈Fv及Fab；雞IgY為哺乳動物抗體抗體的禽類等效物。(Park等人, Biotechnology Letters (2005) 27:289-295; Finley等人, Appl. Environ. Microbiol., 2006年5月, 第3343-3349頁)。雞IgY抗體具有以下優點：較高親合力，亦即，抗體與抗原之間的總結合力；較高特異性(與除免疫原外之哺乳動物蛋白質的交叉反應性低)；蛋黃中的產量高；及較低背景(IgY與IgG之Fc區的結構差異使得假陽性染色低)。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體可為駱駝科抗體，例如來源於美洲駝之缺乏輕鏈之重鏈抗體上的單可變域(亦稱為sdAb、VHH及Nanobodies ^®)；VHH域(約15 kDa)為存在於哺乳動物中的已知最小抗原識別位點，其具有完全的結合能力及親和力(等效於習知抗體)。(Garaicoechea等人, (2015) PLoS ONE 10(8): e0133665; Arbabi-Ghahroudi M (2017) Front. Immunol. 8:1589; Wu等人, Translational Oncology (2018) 11, 366-373)。在另一個實施例中，抗體片段與聚乙二醇偶聯。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體的親和力在約5 pM至約50 pM範圍內。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體為中和抗體。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體為重組或嵌合抗體。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體為人類抗體。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體包含人類可變區。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體包含經工程改造之人類可變區。在另一個實施例中抗hGM-CSF抗體包含人類化可變區。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體包含經工程改造之人類可變區。在另一個實施例中抗hGM-CSF抗體包含人類化可變區。

在一個實施例中，抗hGM-CSF抗體包含人類輕鏈恆定區。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體包含人類重鏈恆定區。在另一個實施例中，人類重鏈恆定區為γ鏈。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體與嵌合19/2抗體結合至相同的抗原決定基。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體包含嵌合19/2抗體的VH區CDR3及VL區CDR3。在另一個實施例中，抗GM-CSF抗體包含嵌合19/2抗體的VH區及VL區CDR1、CDR2及CDR3。

在一個實施例中，抗hGM-CSF抗體所包含的重鏈可變區包含CDR3結合特異性決定子RQRFPY (SEQ ID NO: 12)或RDRFPY (SEQ ID NO: 13)、J段及V段，其中該J段與人類JH4 (YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:14))至少95%一致且該V段與人類生殖系VH1 1-02或VH1 1-03序列至少90%一致；或所包含的重鏈可變區包含含有RQRFPY (SEQ ID NO: 12)的CDR3結合特異性決定子。在另一個實施例中，J段包含YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:14)。在另一個實施例中，CDR3包含RQRFPYYFDY (SEQ ID NO: 15)或RDRFPYYFDY (SEQ ID NO: 16)。在另一個實施例中，重鏈可變區CDR1或CDR2可為人類生殖系VH1序列；或CDR1與CDR2均可為人類生殖系VH1。在另一個實施例中，抗體包含重鏈可變區CDR1或CDR2，或CDR1與CDR2，如圖1所示之V _H區中所示。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體具有V段，該V段具有圖1中所示之V _HV段序列。在另一個實施例中，V _H具有圖1中所示之VH#1、VH#2、VH#3、VH#4或VH#5序列。

在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體，例如具有如以上段落中所述之重鏈可變區的抗hGM-CSF抗體，包含含有CDR3結合特異性決定子的輕鏈可變區，該決定子包含胺基酸序列FNK或FNR。

在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體所包含的VL區包含含有胺基酸序列FNK或FNR的CDR3。在一個實施例中，抗GM-CSF抗體包含人類生殖系JK4區域。在另一個實施例中，抗體VL區CDR3包含QQFN(K/R)SPLT (SEQ ID NO: 17)。在另一個實施例中，抗GM-CSF抗體所包含的VL區域包含含有QQFNKSPLT (SEQ ID NO: 18)的CDR3。在另一個實施例中，VL區域包含圖1中所示之V _L區域的CDR1或CDR2，或CDR1與CDR2。在另一個實施例中，V _L區域包含與如圖1中所示之VKIIIA27 V段序列至少95%一致的V段。在另一個實施例中，V _L區域具有圖1中所示之VK#1、VK#2、VK#3或VK#4序列。

在一個實施例中，抗hGM-CSF抗體具有VH區CDR3結合特異性決定子RQRFPY (SEQ ID NO: 12)或RDRFPY (SEQ ID NO: 13)及含有CDR3的VL區，該CDR3包含QQFNKSPLT (SEQ ID NO: 18)。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體具有圖1中所示之VH區序列及圖1中所示之VL區序列。在另一個實施例中，VH區或VL區，或VH與VL區胺基酸序列均包含位於N端的甲硫胺酸。在另一個實施例中，GM-CSF拮抗劑選自包含以下之群：抗hGM-CSF受體抗體或受體亞單元或可溶性GM-CSF受體、細胞色素b562抗體模擬物、hGM-CSF肽類似物、阿德尼汀(adnectin)、脂質運載蛋白支架抗體模擬物、杯芳烴抗體模擬物及抗體樣結合肽模擬物。

在一個實施例中，本文揭示一種增強CAR-T免疫療法在個體中之功效的方法，該方法包含向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑的步驟，其中該投藥增強CAR-T免疫療法在該個體中的功效。在另一個實施例中，該投與重組hGM-CSF拮抗劑發生於該CAR-T免疫療法之前、同時或之後。在另一個實施例中，該增強的功效包含CAR-T細胞擴增增強、抑制T細胞功能之骨髓源抑制細胞(MDSC)數目減少、與檢查點抑制劑協同作用，或其任何組合。在另一個實施例中，相較於對照組，該增強的CAR-T細胞擴增包含至少50%增幅。在另一個實施例中，相較於對照組，該增強的CAR-T細胞擴增包含至少四分之一的對數擴增。在另一個實施例中，相較於對照組，該增強的細胞擴增包含至少二分之一的對數擴增。在另一個實施例中，相較於對照組，該增強的細胞擴增包含至少一個對數擴增。在另一個實施例中，相較於對照組，該增強的細胞擴增包含大於一個對數擴增。在另一個實施例中，重組hGM-CSF拮抗劑的投與減少或延遲抗CD19 CAR-T細胞的分化，藉此阻止CAR-T細胞耗竭及CAR-T細胞活化誘導的細胞死亡。

在一個實施例中，hGM-CSF拮抗劑包含中和抗體。在另一實施例中，中和抗體為單株抗體。

在一個實施例中，本文揭示一種抑制或減少個體中之CAR-T相關毒性發生率或嚴重度的方法，該方法包含向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑的步驟，其中該投與抑制或減少該個體中的CAR-T相關毒性發生率或嚴重度。在一個實施例中，該CAR-T相關毒性包含NT、CRS或其組合。在一個實施例中，本文提供的治療方法預防及治療有需要之個體的CRS及NT。在一些實施例中，相較於經CAR-T細胞及對照抗體治療之個體中的NT降幅，CAR-T細胞相關的NT減小約50%。在各種實施例中，重組hGM-CSF拮抗劑為根據本文所述之實施例的hGM-CSF中和抗體。

在另一個實施例中，該抑制或減少CRS發生率包含延長存活時間及/或復發時間、減少巨噬細胞活化、減少T細胞活化，或降低循環之hGM-CSF的濃度，或其任何組合。在另一個實施例中，該個體出現發熱(伴有或不伴有僵直、不適、疲勞、厭食症、肌痛、關節痛、噁心、嘔吐、頭痛、皮疹、腹瀉、呼吸急促、低血氧症、低氧症、休克、心血管性心搏過速、增寬的脈搏壓、低血壓、毛細血管滲漏、增加的早期心輸出量、減弱的後期心輸出量、升高的D-二聚體、低纖維素原血症伴有或不伴有出血、氮質血症、轉胺酶升高、高膽紅素血症、精神狀態變化、意識模糊、譫妄、弗蘭克失語症(frank aphasia)、幻覺、震顫、辨距障礙、步態變化、癲癇發作、器官衰竭，或其任何組合。

在另一個實施例中，抑制或減少CAR-T相關毒性發生率或嚴重度包含預防CAR-T相關毒性發生。

在另一個實施例中，本文揭示一種阻斷或減少細胞中之GM-CSF表現的方法，包含剔除或緘默細胞中的GM-CSF基因表現。在一個實施例中，阻斷或減少GM-CSF表現包含短干擾型RNS (siRNA)、CRISPR、RNAi、DNA引導的RNA干擾(ddRNAi)(其為利用DNA構築體活化動物細胞內源RNA干擾(RNAi)路徑的一種基因緘默技術)，或使用經工程改造之轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN)(亦即，由可定製的序列特異性DNA結合域與核酸酶融合而構成的人工蛋白質，該核酸酶以非序列特異性方式使DNA裂解)進行的靶向基因體編輯。(Joung及Sander, Nat Rev Mol Cell Biol. 2013年1月; 14(1): 49-55)，該文獻以全文引用的方式併入本文中。在一個實施例中，細胞為CAR-T細胞。

在一個實施例中，個體為人類。

在一個實施例中，本文揭示一種hGM-CSF拮抗劑，其用於抑制或減少個體之免疫療法相關毒性發生率或嚴重度的方法中，該方法包含向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑的步驟。在一個實施例中，本文揭示一種包含抗hGM-CSF拮抗劑的醫藥組合物。

相關申請案的交互參照

本申請案為美國申請案第17/274,167號的部分接續申請案，美國申請案第17/274,167號為2019年9月10日申請之PCT申請案第PCT/US2019/050494號的美國國家階段申請案，PCT申請案第PCT/US2019/050494號為2019年2月22日申請之美國申請案第16/283,694號的部分接續申請案，美國申請案第16/283,694號為2019年1月15日申請之美國申請案第16/248,762號的部分接續申請案，美國申請案第16/248,762號為2018年11月29日申請之美國申請案第16/204,220號的部分接續申請案，美國申請案第16/204,220號為2018年10月2日申請之美國申請案第16/149,346號的部分接續申請案，美國申請案第16/149,346號主張美國臨時申請案第62/567,187號(2017年10月2日申請)及第62/729,043號(2018年9月10日申請)的優先權，且本申請案主張2018年10月2日申請之PCT申請案第PCT/US2018/053933號的優先權，該等申請案均以引用的方式併入本文中。

參考形成本發明之一部分的以下詳細描述，可更容易地理解本發明之主題。應瞭解，本發明不限於本文所述及/或所示的特定產物、方法、條件或參數，且本文所用之術語僅用於舉例描述特定實施例的目的，而不希望限制所主張之本發明。 免疫療法相關毒性

熟習此項技術者應瞭解，術語「免疫療法相關毒性」係指由高度免疫活化引起的一系列發炎症狀。不同類型的毒性與不同的免疫治療方案相關。在一些實施例中，免疫療法相關毒性包含毛細血管滲漏症候群、心臟疾病、呼吸疾病、CAR-T細胞相關腦病變症候群(CRES)、神經毒性、大腸炎、痙攣、細胞介素釋放症候群(CRS)、細胞介素風暴、降低的左心室射出分率、腹瀉、播散性血管內凝血、水腫、腦病變、紅斑、胃腸出血、胃腸穿孔、噬血細胞性淋巴組織細胞增生症(HLH)、肝機能障礙、高血壓、垂體炎、免疫相關的不良事件、免疫性肝炎、免疫缺乏症、局部缺血、肝毒性、巨噬細胞活化症候群(MAS)、胸膜積液、心包積液、肺炎、多發性關節炎、腦後部可逆腦病變症候群(PRES)、肺高血壓、血栓栓塞及轉胺酶升高。

儘管不同類型的毒性不同之處在於其病理生理學及臨床表現，但其通常與發炎相關因子之增加相關，諸如C反應蛋白、GM-CSF、IL-1、IL-2、sIL-2Rα、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IP10、IL-15、MCP-1 (AKA CCL2)、MIG、MIP-1β、IFNγ、CX3CR1或TNFα。熟習此項技術者應瞭解，在一些實施例中，術語「發炎相關因子」包含在發炎期間受影響的分子、小分子、肽、基因轉錄本、寡核苷酸、蛋白質、激素及生物標記物。熟習此項技術者應瞭解，在發炎期間受影響的系統包含上調、下調、活化、去活化或任何種類的分子修飾。發炎相關因子(諸如細胞介素)的血清濃度可用作免疫療法相關毒性的指標，且可用細胞介素含量或濃度的增加倍數、增加百分比(%)、淨增加或變化率表示。除血清外之體液中的發炎相關因子濃度亦可用作免疫療法相關毒性的指標。在一些實施例中，絕對細胞介素含量或濃度高於某個含量或濃度可指示個體經歷或將經歷免疫療法相關毒性。在另一個實施例中，絕對細胞介素含量或濃度處於某個程度，例如對照個體中通常發現的含量或濃度，可為用於抑制或減少個體之免疫療法相關毒性發生率之方法的指示。熟習此項技術者應瞭解，術語「細胞介素含量」可包含濃度的量度、變化倍數的量度、變化百分比(%)的量度，或變化率的量度。另外，用於量測血液、腦脊髓液(CSF)、唾液、血清、尿液及血漿中之細胞介素的方法在此項技術中已熟知。

已詳述對神經毒性類型進行分類及對其進行相應管控的多種方法。此等分類係基於臨床及生物學症狀，如發熱、低血壓、低氧症、器官毒性、心臟功能異常、呼吸功能異常、腸胃功能異常、肝功能異常、腎功能異常、凝血病、存在癲癇、顱內壓、肌張力、運動表現、鐵蛋白含量及紅血球吞噬症。類似地，各類型的神經毒性可根據其嚴重度分級。表 1A(獲自Cellular Therapy Implementation: the MDACC Approach, P. Kebriaei, 2017年2月24日)揭示一種根據嚴重度將神經毒性分級成1級、2級、3級及4級的方法。然而，一些前述症狀典型地與神經毒性不相關。(Lee等人, Blood 2014; 124:188-195，該文獻以全文引用的方式併入本文中)。

表 1A：神經毒性分級方法 - 關於不良事件的準則(CTCAE)

症狀或徵象	1 級	2 級	3 級	4 級
意識程度	輕度嗜眠/嗜睡	中度的嗜睡、工具性ADL受限	反應遲鈍或木僵	危及生命，需要緊急介入或機械換氣
方位/意識模糊	輕度迷失方向/意識模糊	中度的迷失方向、工具性ADL受限	重度的迷失方向，自我照護ADL受限	危及生命，需要緊急介入或機械換氣
ADL/腦病變	輕度的ADL受限	工具性ADL受限	自我照護ADL受限	危及生命，需要緊急介入或機械換氣
語言	不損害溝通能力的語言障礙	語言障礙，自發溝通能力中度障礙	重度的接納或表達語言障礙，損害讀、寫或清晰溝通的能力	-
癲癇	短暫局部癲癇；未喪失意識	短暫的全身性癲癇	儘管醫學介入，但存在多次癲癇發作	危及生命；反覆性的癲癇發作延長
失禁或運動無力			腸道/膀胱失禁；無力；自我照護ADL受限，失能
*MD Anderson* 癌症中心(MDACC) 10點神經毒性等級	輕度(7-9)	中度(3-6)	重度(1-2)，1級及2級視神經乳頭水腫，CSF開放壓力(op)＜20 mm Hg	臨限(反應遲鈍；痙攣性持續性癲癇；運動無力，3、4及5級視神經乳頭水腫，CSF op≥20 mm Hg，腦水腫)

免疫療法輸注後的最初36小時內，體溫高於38.9℃、IL-6血清濃度高於16 pg/ml或MCP-1 (AKA CCL2)血清濃度高於1,343.5 pg/ml的患者出現重度神經毒性的機率較高(Gust等人, Cancer Discov.2017年10月12日)。

由於細胞介素調控異常且因此引起重度炎症，因此CRS為一種嚴重病狀及危及生命的副作用。症狀可以包括(不限於)發熱、心跳及呼吸紊亂、噁心、嘔吐及癲癇發作。CRS可藉由評估症狀及其嚴重度來分級，諸如：1級CRS：發熱、組成型症狀；2級CRS：低血壓-回應於體液或一次低劑量升壓劑，低氧症-回應於＜40% O ₂，器官毒性；2級；3級CRS：低血壓-需要多劑量升壓劑或高劑量升壓劑，低氧症-需要≥40% O ₂，器官毒性-3級、4級轉胺酶升高；4級CRS：機械換氣，器官毒性-4級，不包括轉胺酶升高。(Lee等人, Blood 2014; 124:188-195，該文獻以全文引用的方式併入本文中)。

CRES可如下分級：例如將神經學評估與其他參數組合，諸如視神經乳頭水腫、CSF開放壓力、成像評估，及癲癇發作的存在及運動無力。CRES分級方法描述於Neelapu等人, Nat Rev Clin Oncol.15(1):47-62 (2018)(2017年9月19日電子出版)中，該文獻以全文引用的方式併入本文中。表 1B(獲自Neelapu等人, Nat Rev Clin Oncol.15(1): 47-62 (2018))揭示一種根據嚴重度將CRES分級成1級、2級、3級及4級的方法。

表 1B：CRES分級方法。在CARTOX-10中，對正確執行以下任務中之每一者賦予一分：對年、月、城市、醫院的方位識別及居住國總統/首相的識別(各1分)；命名三種物件(各1分)；書寫一個標準語句；自100向後以數十計數。

症狀或徵象	1 級	2 級	3 級	4 級
神經學評估分數(根據CARTOX-10)	7-9 (輕度障礙)	3-6 (中度障礙)	0-2 (重度障礙)	處於臨限狀況及/或反應遲鈍及無法執行評估任務的患者
顱內壓升高	NA	NA	1至2期的視神經乳頭水腫，或CSF開放壓力＜20 mmHg	3至5期的視神經乳頭水腫，或CSF開放壓力≥20 mmHg，或大腦水腫
癲癇發作或運動無力	NA	NA	局部癲癇發作，或非痙攣性EEG癲癇發作，對苯并二氮呯有反應	全身性癲癇發作，或痙攣性或非痙攣性持續性癲癇，或新運動無力

NT、CRS及CRES表現可以包括腦病變、頭痛、譫妄、焦慮、震顫、癲癇活動、意識模糊、清醒狀態的變化、意識程度降低、幻覺、語言障礙、失語症、共濟失調、精神性運動不能、面神經麻痹、運動無力、癲癇發作、非痙攣性EEG癲癇發作、腦水腫及昏迷。CRES與循環細胞介素的濃度升高相關，細胞介素如C反應蛋白、GM-CSF、IL-1、IL-2、sIL2Rα、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IP10、IL-15、MCP-1、MIG、MIP1β、IFNγ、CX3CR1及TNFα。

在正常條件下所觀測之介於血清與CSF之間的細胞介素濃度梯度在CRES期間減小或消失。另外，在患者的CSF中觀測到CAR T細胞及高蛋白質濃度且此與病狀的嚴重度相關。此皆表明免疫療法之後，血腦障壁功能異常。出現神經毒性之患者中的ANG2濃度提高及ANG2:ANG1比率增大可部分地解釋增強的血管通透性。雖然ANG1誘導內皮細胞休眠，但ANG2引起內皮細胞活化及微血管通透性。據報導，內皮細胞活化在免疫療法之前增強的患者罹患神經毒性的機率較高(Gust等人, Cancer Discov.2017年10月12日)。

噬血細胞性淋巴組織細胞增生症(HLH)包含由高量分泌發炎細胞介素之良性淋巴球及巨噬細胞的不可控增殖引起的重度高炎症。在一些實施例中，HLH可歸類為細胞介素風暴症候群之一。在一些實施例中，HLH發生於強免疫活化之後，諸如全身感染、免疫缺乏症、惡性疾病，或發生於免疫療法之後。在一些實施例中，術語「HLH」與術語「噬血細胞性淋巴組織細胞增生症」、「紅血球吞噬症候群」或「紅細胞吞噬症候群」可互換使用，其皆具有相同性質及含義。

原發HLH包含異質常染色體隱性遺傳病。若干種基因之一中具有同型接合突變的患者展現參與溶胞顆粒胞外分泌之蛋白質的功能喪失。在一些實施例中，HLH可存在於嬰兒期而觸發最少或不觸發。繼發性HLH或獲得性HLH發生於強免疫活化之後，諸如發生全身感染、免疫缺乏症、潛在惡性疾病，或發生於免疫療法之後。兩種HLH形式的特徵在於正常T淋巴球及巨噬細胞的活化勢不可擋，在缺乏治療的情況下，其總是引起臨床及血液學變化及死亡。

在一些實施例中，病毒感染、EBV、CMV、細小病毒、HSV、VZV、HHV8、HIV、流感病毒、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、細菌感染、革蘭氏陰性(gram-negative)桿菌、黴漿菌種及結核分支桿菌、寄生蟲感染、瘧原蟲物種、利什曼原蟲物種(Leishmania species)、弓形蟲物種、真菌感染、隱球菌種、念珠菌種及肺囊蟲物種尤其可引起HLH。

巨噬細胞活化症候群(MAS)包含巨噬細胞及T淋巴球活化及增殖不可控的病狀，其中循環細胞介素含量(諸如IFNγ及GM-CSF)明顯增加。MAS與繼發性HLH密切相關。MAS表現包括高熱、肝脾腫大、淋巴腺病、全血細胞減少症、肝功能異常、播散性血管內凝血、紅血球吞噬症、低纖維素原血症、高鐵蛋白血症及高三酸甘油酯血症。

CRS包含與重度感染中所發現類似的非抗原特異性免疫反應。CRS的特徵在於以下症狀中的任一者或全部：發熱伴有或不伴有僵直、不適、疲勞、厭食症、肌痛、關節疼痛、噁心、嘔吐、頭痛、皮疹、腹瀉、呼吸急促、低血氧症、低氧症、休克、心血管性心搏過速、脈搏壓增寬、低血壓、毛細血管滲漏、心輸出量增加(早期)、心輸出量潛在減弱(後期)、D-二聚體升高、低纖維素原血症伴有或不伴有出血、氮質血症、轉胺酶升高、高膽紅素血症、頭痛、精神狀態變化、意識模糊、譫妄、找詞困難或弗蘭克失語症、幻覺、震顫、辨距障礙、步態變化、癲癇發作、器官衰竭、多器官衰竭。亦已報導死亡。據報導，接受CAR-T19之患者中高達60%已發生重度CRS。

細胞介素風暴包含由細胞介素與白血細胞之間的正反饋迴路組成的免疫反應，其中不同細胞介素的含量大幅升高。術語「細胞介素風暴」與術語「細胞介素級聯」及「高細胞介素血症」可互換使用，其皆具有相同性質及含義。在一些實施例中，細胞介素風暴以IL-2釋放及淋巴細胞增殖為特徵。細胞介素風暴引起潛在危及生命的併發症，包括心臟功能異常、成人呼吸窘迫症候群、神經毒性、腎衰竭及/或肝衰竭，及播散性血管內凝血。

如所提及，CAR-T細胞療法當前受到危及生命的神經毒性及CRS之風險限制。儘管主動管控，但所有CAR-T反應者經歷了某種程度的CRS。經CD19 CAR-T治療的患者中高達50%出現至少3級CRS或神經毒性。GM-CSF含量及T細胞擴增為與3級或更高級CRS及神經毒性最相關的因素。

減少或消除免疫療法(諸如CAR-T細胞療法)引起的CRS及神經毒性具有很大價值且關鍵是確定何者正驅動或加劇標誌CAR-T發炎反應。儘管多種細胞介素、信號傳導分子及細胞類型參與此路徑，但GM-CSF為似乎處於路徑中心的一種細胞介素。其在人類血清中通常偵測不到，卻為將炎症驅動至細胞介素風暴及內皮細胞活化之極值的環狀正反饋迴路的中心。神經毒性及細胞介素風暴並非細胞介素同時釋放的結果，而是GM-CSF起始的發炎級聯，其導致骨髓細胞遷移且募集至腫瘤部位。在CRS及神經毒性中觀測到此等骨髓細胞產生細胞介素，使發炎級聯反應永生化。 顆粒球巨噬細胞 - 群落刺激因子 (GM-CSF)

如本文所用，「顆粒球巨噬細胞-群落刺激因子」(GM-CSF)係指具有約23 kDa分子量、具有內部二硫鍵的天然存在之小醣蛋白。在一些實施例中，GM-CSF係指人類GM-CSF。在一些實施例中，GM-CSF係指非人類GM-CSF。在人類中，其由位於人類染色體5之細胞介素叢集內的基因編碼。人類基因及蛋白質的序列已知。蛋白質具有N端信號序列及C端受體結合域(Rasko及Gough，於：The Cytokine Handbook, A. Thomson等人, Academic Press, New York (1994)第349-369頁)。其三維結構類似於介白素之三維結構，但胺基酸序列不相似。作為對多種發炎介體的反應，造血環境中及周邊發炎部位處存在的間葉細胞產生GM-CSF。GM-CSF能夠刺激骨髓細胞產生嗜中性顆粒球、巨噬細胞及混合型顆粒球-巨噬細胞群落且可刺激胎兒肝臟祖細胞形成嗜酸血球群落。GM-CSF亦可刺激成熟顆粒球及巨噬細胞的一些功能活性。GM-CSF，一種存在於骨髓微環境中的細胞介素，募集發炎單核球衍生的樹突狀細胞，刺激IL-6及CCL2/MCP-1高量分泌且產生反饋迴路，從而將更多單核球、發炎樹突狀細胞募集至發炎部位。

如所提及，CRS涉及若干種細胞介素及趨化因子的增加，包括IFN-γ、IL-6、IL-8、CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP1α)及GM-CSF。(Teachey, D.等人(2016年6月), Cancer Discovery, CD-16-0040; Morgan R.等人, (2010年4月), Molecular Therapy.)。IL-6，關鍵的發炎細胞介素之一，並非由CAR-T細胞產生。(Barrett, D.等人(2016), Blood)。實際上，其由骨髓細胞產生，從而被募集至腫瘤部位。GM-CSF介導此募集，其誘導趨化因子產生，從而活化骨髓細胞且促使其遷移至腫瘤部位。升高的GM-CSF含量充當CRS的預測生物標記與其嚴重度的指標。GM-CSF超過發炎級聯中的關鍵組分，為負責CRS與NT的關鍵起始因子。如本文所述，使用鼠類模型的活體內研究表明，GM-CSF基因緘默阻止細胞介素風暴，同時仍維持CAR-T功效。GM-CSF基因剔除小鼠在活體內具有正常的INF-γ、IL-6、IL-10、CCL2 (MCP1)、CCL3/4 (MIG-1)含量且未出現CRS。(Sentman, M.-L.等人, (2016), The Journal of Immunology, 197(12), 4674-4685.)。GM-CSF基因剔除CAR-T模型募集至腫瘤部位的NK細胞、CD8細胞、骨髓細胞及嗜中性白血球比GM-CSF + CAR-T少。

術語「可溶性顆粒球巨噬細胞-群落刺激因子受體」(sGM-CSFR)係指一種非膜結合受體，其結合GM-CSF，但當結合至配位體時不轉導信號。

如本文所用，「肽GM-CSF拮抗劑」係指一種肽，其與GM-CSF或其受體相互作用以減少或阻斷(部分地或完全地)信號轉導，否則，GM-CSF結合至細胞上所表現之其同源受體會引起信號轉導。GM-CSF拮抗劑可藉由減少可用於結合受體之GM-CSF配位體之量來發揮作用(例如抗體在結合至GM-CSF後使GM-CSF清除率增加)，或藉由結合至GM-CSF或受體來阻止配位體結合至其受體(例如中和抗體)。GM-CSF拮抗劑亦可包括其他肽抑制劑，可包括多肽，其結合GM-CSF或其受體以部分地或完全地抑制信號傳導。肽GM-CSF拮抗劑可為例如抗體；拮抗GM-CSF的天然或合成GM-CSF受體配位體，或其他多肽。偵測GM-CSF拮抗劑活性的例示性分析提供於實例1中。典型地，肽GM-CSF拮抗劑(諸如中和抗體)具有10 nM或更小的EC50。

如本文所用，「純化」的GM-CSF拮抗劑係指一種GM-CSF拮抗劑，其實質上或基本上不含正常情況下伴隨其的組分，如在其原生狀態下所發現。舉例而言，自血液或血漿純化的GM-CSF拮抗劑(諸如抗GM-CSF抗體)實質上不含其他血液或血漿組分，諸如其他免疫球蛋白分子。純度及均質性典型地使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析之分析化學技術來測定。作為主導物種存在於製劑中的蛋白質得以實質上純化。典型地，「純化」意謂相對於與蛋白質一起天然存在的組分，蛋白質為至少85%純、更佳至少95%純且最佳至少99%純。抗體

如本文所用，「抗體」係指在功能上定義為結合蛋白且在結構上定義為包含胺基酸序列的蛋白質，熟習此項技術者認識到，該胺基酸序列來源於產生抗體之動物之免疫球蛋白編碼基因的構架區。抗體可由一或多種多肽組成，該一或多種多肽實質上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼。已認知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε及μ恆定區基因以及多種免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，其又限定免疫球蛋白類別，分別為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。

典型的免疫球蛋白(抗體)結構單元已知包含四聚體。各種四聚體由兩對相同多肽鏈構成，各對具有一條「輕」鏈(約25 kD)及一條「重」鏈(約50-70 kD)。各鏈之N端界定約100至110個或更多個胺基酸之可變區，該可變區主要負責抗原識別。術語可變輕鏈(V _L)及可變重鏈(V _H)分別指此等輕鏈及重鏈。

術語「抗體」包括保留結合特異性的抗體片段。舉例而言，存在已充分表徵的多種抗體片段。因此，舉例而言，胃蛋白酶在鉸鏈區之二硫鍵C端將抗體消化而產生F(ab')2，一種Fab二聚體，其本身為藉由二硫鍵與VH-CH1接合的輕鏈。F(ab)'2可在溫和條件下還原以破壞鉸鏈區中之二硫鍵，藉此將(Fab')2二聚體轉化成Fab'單體。Fab'單體基本上為具有鉸鏈區之一部分的Fab (關於其他抗體片段的較詳細描述，參見Fundamental Immunology, W. E. Paul編, Raven Press, N.Y. (1993))。儘管各種抗體片段係根據完整抗體的消化來定義，但熟習此項技術者應瞭解，可以化學方式或使用重組DNA方法來從頭合成片段。因此，如本文所用，術語抗體亦包括藉由修飾全抗體而產生或使用重組DNA方法合成的抗體片段。

抗體包括二聚體，諸如V _H-V _L二聚體、V _H二聚體或V _L二聚體，包括單鏈抗體(以單一多肽鏈形式存在的抗體)，諸如單鏈Fv抗體(sFv或scFv)，其中重鏈可變區與輕鏈可變區接合在一起(直接地或經由肽連接子)而形成連續多肽。單鏈Fv抗體為一種共價連接的V _H-V _L雜二聚體，其可由核酸表現，該核酸包括直接接合或藉由編碼肽之連接子接合的編碼V _H之序列及編碼V _L之序列(例如Huston等人, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)。儘管V _H及V _L各自作為單一多肽鏈連接，但V _H與V _L域非共價締合。或者，抗體可為另一片段，諸如二硫鍵穩定化Fv (dsFv)。亦可產生其他片段，包括使用重組技術。熟習此項技術者已知scFv抗體及多種其他結構，該等結構將來自抗體V區的天然聚集、但化學分離之輕鏈及重鏈多肽鏈轉化成一種分子，該分子摺疊成與抗原結合位點的結構實質上相似的三維結構(參見例如美國專利第5,091,513號、第5,132,405號及第4,956,778號)。在一些實施例中，抗體包括已呈現於噬菌體上或藉由重組技術、使用載體(其中各鏈以可溶性蛋白質形式分泌，例如scFv、Fv、Fab、(Fab')2)產生或藉由重組技術、使用載體(其中各鏈以可溶性蛋白質形式分泌)產生的彼等抗體。本發明使用的抗體亦可包括雙功能抗體及小型抗體。

本發明抗體亦包括重鏈二聚體，諸如駱駝科抗體。由於駱駝科之重鏈二聚體IgG的V _H區不必與輕鏈發生疏水相互作用，因此與輕鏈正常接觸之重鏈區域變成駱駝科中之親水性胺基酸殘基。重鏈二聚體IgG之V _H域稱為VHH域。本發明使用的抗體包括單域抗體(dAb)及奈米抗體(參見例如Cortez-Retamozo等人, Cancer Res.64:2853-2857, 2004)。

如本文所用，「V區」係指抗體可變區結構域，其包含構架1、CDR1、構架2、CDR2及構架3之區段，包括CDR3及構架4，該等區段作為重鏈與輕鏈V區基因在B細胞分化期間重排的結果而添加至V段中。如本文所用，「V段」係指由V基因編碼之V區(重鏈或輕鏈)區域。重鏈可變區的V段編碼FR1-CDR1-FR2-CDR2及FR3。出於本發明的目的，輕鏈可變區的V段定義為延伸通過FR3直至CDR3。

如本文所用，術語「J段」係指所編碼之可變區子序列，其包含CDR3之C端部分及FR4。內源J段由免疫球蛋白J基因編碼。

如本文所用，「互補決定區(CDR)」係指各鏈中的三個高變區，該等高變區被由輕鏈及重鏈可變區建立的四個「構架」區中斷。CDR主要負責對抗原之抗原決定基的結合。各鏈之CDR典型地稱為CDR1、CDR2及CDR3 (自N端開始依序編號)，且亦典型地根據特定CDR所位於之鏈鑑別。因此，舉例而言，V _HCDR3位於其中發現其之抗體重鏈可變域中，而V _LCDR1為來自其中發現其之抗體輕鏈可變域的CDR1。

不同輕鏈或重鏈之構架區的序列在一個物種內相對保守。抗體構架區，亦即，組成性輕鏈及重鏈之組合構架區，用於CDR在三維空間中的定位及對準。

CDR及構架區的胺基酸序列可使用此項技術中的各種熟知定義測定，例如Kabat、Chothia、國際免疫遺傳學資料庫(international ImMunoGeneTics database，IMGT)及AbM (參見例如Johnson等人 ,同上; Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol.196, 901-917; Chothia C.等人, 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883; Chothia C.等人, 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol. 227, 799-817; Al-Lazikani等人 , J.Mol.Biol1997, 273(4))。抗原組合位點之定義亦描述於以下文獻中：Ruiz等人, IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000); 及Lefranc, M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res.Jan 1;29(1):207-9 (2001); MacCallum等人, Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol., 262 (5), 732-745 (1996); 及Martin等人, Proc. Natl Acad. Sci.USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin等人, Methods Enzymol., 203, 121-153, (1991); Pedersen等人, Immunomethods, 1, 126, (1992); 及Rees等人, 於Sternberg M.J.E. (編), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996)。

「抗原決定基」或「抗原決定子」係指抗體所結合之抗原上的位點。抗原決定基可由鄰接胺基酸或非鄰接胺基酸形成，此等胺基酸因蛋白質之三級摺疊而毗鄰。由鄰接胺基酸形成的抗原決定基在暴露於變性溶劑後典型地保留，而藉由三級摺疊形成的抗原決定基在變性溶劑處理後典型地消失。抗原決定基典型地包括呈獨特空間構形之至少3個且更通常至少5個或8至10個胺基酸。測定抗原決定基之空間構形的方法包括例如x射線結晶學及2維核磁共振。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, 第66卷, Glenn E. Morris編(1996)。

如在本發明之上下文中所用，術語「結合特異性決定子」或「BSD」係指CDR區內的最小鄰接或非鄰接胺基酸序列，其為測定抗體之結合特異性所必需的。在本發明中，最小結合特異性決定子存在於抗體重鏈及輕鏈之一部分或全長CDR3序列內。

如本文所用，「抗GM-CSF抗體」或「GM-CSF抗體」可互換使用且係指結合至GM-CSF且抑制GM-CSF受體結合及活化的抗體。此類抗體可使用此項技術中公認的評估GM-CSF結合及/或功能之任何數目個分析加以鑑別。舉例而言，可使用量測對GM-CSF結合至α受體亞單元之抑制作用的結合分析，諸如ELISA分析。對於GM-CSF受體信號傳導，亦宜使用基於細胞之分析，諸如測定GM-CSF依賴性細胞株作為對有限量之GM-CSF之反應而增殖之速率的分析，以及量測作為對GM-CSF暴露之反應而產生細胞介素(例如產生IL-8)之量的分析。

如本文所用，「中和抗體」係指結合至GM-CSF且抑制GM-CSF受體傳導信號或阻止GM-CSF結合至其受體的抗體。

如本文所用，「人類顆粒球巨噬細胞-群落刺激因子」(hGM-CSF)係指具有約23 kDa分子量、具有內部二硫鍵的天然存在之小醣蛋白；GM-CSF的來源及標靶為人類；因而，如本文實施例中所述的抗hGM-CSF抗體僅結合人類及靈長類動物GM-CSF，而不結合小鼠、大鼠及其他哺乳動物GM-CSF。如本文實施例中所述的hGM-CSF抗體中和人類GM-CSF。在一些實施例中，人類中的hGM-CSF係由位於人類染色體5上之細胞介素叢集內的基因編碼。人類基因及蛋白質的序列已知。蛋白質具有N端信號序列及C端受體結合域(Rasko及Gough，於: The Cytokine Handbook, A. Thomson等人, Academic Press, New York (1994) 第349-369頁)。其三維結構類似於介白素之三維結構，但胺基酸序列不相似。作為對存在於造血環境中及周邊發炎部位處之多種發炎介體的反應，產生GM-CSF。GM-CSF能夠刺激骨髓細胞產生嗜中性顆粒球、巨噬細胞及混合型顆粒球-巨噬細胞群落且可刺激胎兒肝臟祖細胞形成嗜酸血球群落。GM-CSF亦可刺激成熟顆粒球及巨噬細胞的一些功能活性且抑制顆粒球及巨噬細胞發生細胞凋亡。

術語「平衡解離常數」或「親和力」縮寫(K _D)係指解離速率常數(k _d，時間 ^-1)除以締合速率常數(k _a，時間 ^-1M ^-1)。可使用此項技術中的任何已知方法量測平衡解離常數。本發明之抗體為高親和力抗體。此類抗體的單價親和力優於(低於)約10 nM，且通常優於約500 pM或優於約50 pM，如在37℃下執行表面電漿子共振分析所測定。因此，在一些實施例中，本發明抗體具有小於50 pM、典型地小於約25 pM或甚至小於10 pM的親和力(如利用表面電漿子共振所量測)。

在一些實施例中，本發明之抗GM-CSF抗體具有緩慢的解離速率，如在37℃下藉由表面電漿子共振分析針對與GM-CSF之單價相互作用所測定，其解離速率常數(kd)小於約10 ^-4s ^-1，較佳小於5×10 ^-5s ^-1且最佳小於10 ^-5s ^-1。

如本文所用，「嵌合抗體」係指一種免疫球蛋白分子，其中(a)恆定區或其一部分被改變、置換或交換，使得抗原結合位點(可變區)連接至類別、效應功能及/或物種不同或變化的恆定區，或向嵌合抗體賦予新特性的完全不同分子，例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等；或(b)可變區或其一部分被改變、置換或交換為具有不同或改變之抗原特異性的可變區或其一部分；或改變、置換或交換為來自另一物種或來自另一抗體類別或亞類的相應序列。

如本文所用，「人類化抗體」係指來自供者抗體之CDR移植至人類構架序列上的免疫球蛋白分子。人類化抗體亦可在構架序列中包含供者來源的殘基。人類化抗體亦可包含人類免疫球蛋白恆定區的至少一部分。人類化抗體亦可包含既未在接受者抗體中發現、亦未在所輸入之CDR或構架序列中發現的殘基。可使用此項技術中已知之方法執行人類化(例如Jones等人, Nature321:522-525; 1986；Riechmann等人, Nature332:323-327, 1988；Verhoeyen等人, Science239:1534-1536, 1988)；Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596, 1992；美國專利第4,816,567號)，包括以下技術：諸如「超級人類化」抗體(Tan等人, J. Immunol.169: 1119, 2002)及「表面重塑」(例如Staelens等人, Mol. Immunol.43:1243, 2006；及Roguska等人, Proc. Natl. Acad. Sci USA91: 969, 1994)。

在本發明之上下文中，「HUMANEERED®」抗體係指經工程改造之人類抗體，其具有參考抗體的結合特異性。本發明中使用的經工程改造之人類抗體具有含有來源於供者免疫球蛋白之最小序列的免疫球蛋白分子。在一些實施例中，經工程改造之人類抗體可僅保留來自參考抗體之CDR3區的最小必需結合特異性決定子。典型地，經工程改造之人類抗體如下經工程改造：將編碼來自參考抗體重鏈CDR3區之結合特異性決定子(BSD)的DNA序列與人類V _H段序列接合及將來自參考抗體的輕鏈CDR3 BSD與人類V _L段序列接合。「BSD」係指介導結合特異性的CDR3-FR4區域或此區域的一部分。因此，結合特異性決定子可為CDR3-FR4、CDR3、CDR3的最小必需結合特異性決定子(其係指當存在於抗體V區中時賦予結合特異性的小於CDR3之任何區域)、D段(就重鏈區域而言)，或CDR3-FR4中之賦予參考抗體結合特異性的其他區域。人類抗體工程改造方法提供於美國專利申請公開案第20050255552號及美國專利申請公開案第20060134098號中。

如本文所用，術語「人類抗體」係指實質上為人類抗體的抗體，亦即具有來自人類免疫系統的FR區且通常具有來自人類免疫系統的CDR區。相應地，該術語包括人類化抗體及人類人類工程化抗體，以及自人類免疫系統重構之小鼠中分離出的抗體及自呈現文庫中分離出的抗體。

術語「異源」當結合核酸之一部分使用時，表示該核酸包含自然界中通常找不到彼此關係相同的兩種或更多種子序列。舉例而言，核酸典型地以重組方式產生，具有兩種或更多種序列，例如來自經排列以產生新功能核酸的無關基因。類似地，異源蛋白質通常係指在自然界中找不到彼此關係相同的兩種或更多種子序列。

術語「重組」當結合例如細胞或核酸、蛋白質或載體使用時，表示該細胞、核酸、蛋白質或載體已藉由引入異源核酸或蛋白質或改變原生核酸或蛋白質而經修飾，或表示該細胞來源於經如此修飾的細胞。因此，例如重組細胞表現細胞原生(非重組)形式內未發現的基因，或表現在其他方面受到異常表現(表現不足或完全不表現)的原生基因。在本文中，術語「重組核酸」意謂最初在活體外形成的核酸，通常藉由操控核酸(例如使用聚合酶及核酸內切酶)而形成，其形式在自然界中通常找不到。以此方式達成不同序列的可操作鍵聯。因此，出於本發明的目的，呈線性形式的經分離核酸或在活體外藉由將通常不接合之DNA分子連接而形成的表現載體均視為重組的。應瞭解，重組核酸製成且再引入宿主細胞或生物體之後，其將以非重組形式複製，亦即利用活體內的宿主細胞之細胞機器，而非活體外操控；然而，此類核酸一旦重組產生，儘管隨後非重組複製，但出於本發明之目的，仍視為重組的。類似地，「重組蛋白」為利用重組技術(亦即，經由重組核酸的表現)製成的蛋白質。

片語「特異性(或選擇性)結合」至抗體或「與之具有特異性(或選擇性)免疫反應性」係指其中抗體結合至所關注之抗原的結合反應。在本發明之上下文中，抗體典型地以500 nM或更小的親和力結合至抗原，例如GM-CSF，且對其他抗原具有5000 nM或更大的親和力。

在兩種或更多種多肽(或核酸)序列的上下文中，術語「一致」或「一致性」百分比係指兩種或更多種序列或子序列相同或具有指定百分比的相同胺基酸殘基(或核苷酸)(亦即，當在比較窗或指定區域上根據最大一致性比較及對齊時，在指定區域上約60%一致性，較佳70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性)，如使用具有下述預設參數的BLAST或BLAST 2.0序列比較算法或藉由人工比對及目視檢查(參見例如NCBI網站)所量測。於是稱此類序列「實質上一致」。「實質上一致」的序列亦包括具有缺失及/或添加的序列，以及具有取代的序列，以及天然存在的序列，例如多形性或對偶基因變異體，及人造變異體。如下所述，較佳算法可考慮空位及其類似者。蛋白質序列一致性較佳存在於長度至少約25個胺基酸的區域上或更佳存在於長度50至100個胺基酸的區域上，或存在於蛋白質長度上。

如本文所用，「比較窗」包括提及選自由以下組成之群之鄰接位置數之一的區段：典型地20至600，通常約50至約200，更通常約100至約150，其中可將一種序列與鄰接位置數相同的參考序列比較(在將該兩種序列最佳對齊之後)。用於比較之序列比對方法在此項技術中已熟知。用於比較之最佳序列比對可藉由以下方式執行：例如Smith及Waterman, Adv. Appl. Math.2:482 (1981)之局部同源算法；Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol.48:443 (1970)之同源比對算法；Pearson及Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA85:2444 (1988)之相似性搜尋方法；此等算法之電腦化實施方案(Wisconsin Genetics套裝軟體中的GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)；或人工比對及目視檢查(參見例如Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人編, 1995年增刊)。

兩種多肽實質上一致的指示為，第一多肽與針對第二多肽產生的抗體具有免疫交叉反應性。因此，一種多肽典型地與第二多肽實質上一致，例如在兩種肽不同之處僅為保守取代的情況下。

適於測定序列一致性及序列相似性百分比之算法的較佳實例包括BLAST及BLAST 2.0算法，其描述於Altschul等人, Nuc. Acids Res.25:3389-3402 (1977)及Altschul等人, J. Mol. Biol.215:403-410 (1990)中。使用BLAST及BLAST 2.0及本文所述之參數測定本發明之核酸及蛋白質的序列一致性百分比。BLASTN程式(用於核苷酸序列)係使用字長(W) 11、期望值(E) 10、M=5、N=-4及雙股比較作為預設參數。就胺基酸序列而言，BLASTP程式使用以下作為預設參數：字長為3及期望值(E)為10，以及BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff及Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:10915 (1989))比對(B)為50，期望值(E)為10，M=5，N=-4，及雙股比較。

術語「分離」、「純化」或「生物學純的」係指材料實質上或基本上不含如在原生狀態下所發現的通常伴隨其之組分。純度及均質性典型地使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析之分析化學技術來測定。作為主導物種存在於製劑中的蛋白質得以實質上純化。在一些實施例中，術語「純化」表示蛋白質在電泳凝膠中基本上產生一條色帶。較佳地，其意謂蛋白質至少85%純、更佳至少95%純且最佳至少99%純。

術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用且係指胺基酸殘基之聚合物。該術語應用於其中一或多個胺基酸殘基為天然存在之相應胺基酸之人工化學模擬物的胺基酸聚合物，以及天然存在之胺基酸聚合物、含有經修飾之殘基的彼等聚合物，及非天然存在之胺基酸聚合物。

術語「胺基酸」係指天然存在的胺基酸及合成胺基酸，以及功能類似於天然存在之胺基酸的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸為由遺傳密碼編碼之胺基酸，以及後來經修飾之彼等胺基酸，例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷酸化絲胺酸。胺基酸類似物係指基本化學結構與天然存在之胺基酸相同(亦即，α碳與氫、羧基、胺基及R基團結合)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此等類似物可具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽主鏈，但保留與天然存在之胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物係指結構不同於胺基酸之一般化學結構、但功能類似於天然存在之胺基酸的化合物。

胺基酸在本文中可由其通常已知之三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名法委員會推薦之單字母符號來提及。核苷酸同樣可用其通常接受之單字母代碼來提及。

「保守修飾之變異體」適用於胺基酸與核酸序列。就特定核酸序列而言，經保守修飾之變異體係指編碼相同或基本上相同胺基酸序列的彼等核酸，或其中該核酸不編碼胺基酸序列；基本上相同或相關(例如天然鄰接)的序列。由於遺傳密碼之簡併，因此許多在功能上相同之核酸編碼大部分蛋白質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU皆編碼胺基酸丙胺酸。因此，在丙胺酸藉由密碼子說明的每個位置上，密碼子可改變成另一個所述相應密碼子而不會改變所編碼之多肽。此類核酸變異為「緘默變異」，其為一種保守修飾型變異。本文中編碼多肽之每個核酸序列亦描述核酸之緘默變異。熟習此項技術者將認識到，在某些情況下，核酸中之各密碼子(除AUG (通常為甲硫胺酸之唯一密碼子)及TGG (通常為色胺酸之唯一密碼子)之外)可經修飾以產生功能上相同之分子。因此，就表現產物而言，而非就實際探針序列而言，編碼多肽之核酸的緘默變異通常隱含於所述序列中。

關於胺基酸序列，熟習此項技術者應認識到，發生個別取代、缺失添加之核酸、肽、多肽或蛋白質序列(從而使所編碼序列中之單個胺基酸或小百分比之胺基酸改變、添加或缺失)為「經保守修飾之變異體」，其中變化引起胺基酸被化學上相似的胺基酸取代。提供功能相似胺基酸之保守取代表及取代矩陣(諸如BLOSUM)在此項技術中已熟知。此類經保守修飾之變異體另外為且不排除本發明之多形性變異體、種間同源物及對偶基因。用於彼此的典型保守取代包括：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見例如Creighton, Proteins (1984))。 用於預防或治療免疫療法相關毒性的方法

在一些實施例中，本文揭示抑制個體之免疫療法相關毒性的方法。在一些實施例中，本文中為減少個體之免疫療法相關毒性發生率的方法。在一些實施例中，本文揭示hGM-CSF中和方法。在一些實施例中，方法包含將重組hGM-CSF拮抗劑投與個體的步驟。在一些實施例中，方法包含hGM-CSF基因緘默。在一些實施例中，方法包含hGM-CSF基因敲除。基因緘默及基因剔除之方法已為一般熟習此項技術者熟知，且可包括(不限於) RNA干擾(RNAi)、CRISPR、短干擾RNS (siRNA)、DNA引導的RNA干擾(ddRNAi)、使用經工程改造之轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN)的靶向基因體編輯，或其他適合技術。

剔除 GM-CSF 的 基因編輯技術 ： GM-CSF ^k/o

在一些實施例中，基因編輯技術用於剔除GM-CSF表現。藉由將切割DNA的核酸內切酶(包括不限於Fok1或Cas9)遞送至遺傳密碼之位點特異性區段來完成基因體編輯。核酸內切酶切割DNA，觸發內源DNA修復機制。

熟習此項技術者將認識到，達成位點特異性染色體DNA裂解、接著觸發內源DNA修復的任何方法將產生相同的靶向基因體修飾。不論位點特異性是由RNA嚮導、DNA嚮導決定，抑或由DNA結合蛋白決定，或使用哪一種核酸內切酶達成DNA切割，靶向基因體修飾沒有差異。RNA導引位點特異性的實例包括(不限於) CRISPR/Cas9。DNA導引位點特異性之實例包括(不限於) flap核酸內切酶1 (FEN-1)。用於達成位點特異性之DNA結合蛋白的實例包括(不限於)鋅指蛋白(ZFN)、轉錄活化因子樣效應子(TALENS)、歸巢核酸內切酶，包括ARCUS、巨核酸酶等。

可用於基因緘默的其他方法已為一般熟習此項技術者所熟知，且可包括(不限於) RNA干擾(RNAi)、短干擾RNS (siRNA)、DNA引導的RNA干擾(ddRNAi)。

在一個態樣中，本發明提供一種使細胞中之 GM-CSF基因不活化或 GM-CSF基因剔除(KO)的方法，包含靶向基因體編輯或GM-CSF基因緘默。在所提供方法之一個實施例中，靶向基因體編輯包含核酸內切酶，其中該核酸內切酶為Fok1限制酶或flap核酸內切酶1 (FEN-1)。在另一個實施例中，核酸內切酶為 Cas9CRISPR相關蛋白9 (Cas9)。在一些實施例中，靶向且編輯外顯子1、外顯子2、外顯子3或外顯子4處之 GM-CSF的CRISPR/Cas9使 GM-CSF基因不活化。在另一實施例中，GM-CSF基因不活化包含CRISPR/Cas9靶向且編輯外顯子3處的 GM-CSF。在一個實施例中， GM-CSF基因不活化包含CRISPR/Cas9靶向且編輯外顯子1處的 GM-CSF。在一個實施例中， GM-CSF基因不活化包含多種CRISPR/Cas9酶，其中各種Cas9酶靶向且編輯外顯子1、外顯子2、外顯子3或外顯子4處之 GM-CSF的不同序列。在特定實施例中， GM-CSF基因不活化包含雙對偶基因CRISPR/Cas9靶向及剔除/不活化 GM-CSF基因。在所提供之 GM-CSF基因不活化或 GM-CSF基因剔除(KO)方法的另一個態樣中，方法進一步包含用丙戊酸處理原代T細胞以增強雙對偶基因剔除/不活化。在所提供之 GM-CSF基因不活化/基因剔除方法的一個態樣中，靶向基因體編輯包含鋅指(ZnF)蛋白。在另一態樣中，靶向基因體編輯包含轉錄活化因子樣效應子(TALENS)。在一個實施例中，靶向基因體編輯包含歸巢核酸內切酶，其中歸巢核酸內切酶為ARC核酸酶(ARCUS)或巨核酸酶。在本文所提供方法的特定實施例中，細胞為CAR T細胞。在另一個實施例中，CAR T細胞為CD19 CAR-T細胞。在一個實施例中，GM-CSF基因緘默選自由以下組成之群：RNA干擾(RNAi)、短干擾RNS (siRNA)及DNA引導的RNA干擾(ddRNAi)。

用於預防或治療免疫療法相關毒性的方法

在一些實施例中，方法包含投與CAR-T細胞，該等CAR-T細胞已經修飾以經由GM-CSF基因緘默或GM-CSF基因剔除來以較低量表現GM-CSF。基因緘默及基因剔除方法已為一般熟習此項技術者所熟知，且可包括(不限於) RNAi、CRISPR、siRNA、ddRNAi、TALEN、鋅指、歸巢核酸內切酶及巨核酸酶或其他適合技術。

在一些實施例中，投與GM-CSF基因緘默或基因剔除的CAR-T細胞阻止或顯著減少CRS及NT發生率及/或嚴重度。在一些實施例中，投與GM-CSF基因緘默或基因剔除的CAR-T細胞阻止或顯著減少BBB破壞。在一些實施例中，投與GM-CSF基因緘默或基因剔除的CAR-T細胞阻止或顯著減少CD14+骨髓細胞活化及遷移至CNS。在一些實施例中，投與GM-CSF基因緘默或基因剔除的CAR-T細胞使得全身細胞介素IL-3、IL-5、IP10、KC、MCP-1、MIP-1a、MIP-1b、M-CSF、MIP-2、MIG、VEGF、IL-1ra、IL-1b、IL-6、IL-12p40、IL12p70、IL-RA、M-CSF及G-CSF的含量比野生型CAR-T細胞投與時所觀測到的含量更低。

在一些實施例中，GM-CSF基因緘默或基因剔除之CAR-T細胞聯合重組GM-CSF拮抗劑投與，從而進一步減少CRS、NT發生率或嚴重度且進一步阻止或減少BBB破壞，且進一步阻止或減少CD14+骨髓細胞活化及遷移至CNS，且與野生型CAR-T細胞投與時所觀測相比，進一步阻止或降低全身細胞介素IL-3、IL-5、IP10、KC、MCP-1、MIP-1a、MIP-1b、M-CSF、MIP-2、MIG、VEGF、IL-1ra、IL-1b、IL-6、IL-12p40、IL12p70、IL1-RA、M-CSF及G-CSF含量。

用於改善授受細胞療法功效的方法

在一些實施例中，方法包含投與CAR-T細胞，該等CAR-T細胞已經修飾以經由GM-CSF基因緘默或GM-CSF基因剔除來以較低量表現GM-CSF。在一些實施例中，相對於野生型CAR-T細胞，GM-CSF基因緘默或基因剔除之CAR-T細胞在擴增之後，分化減弱，且在擴增之後，包括更高百分比的初始幹細胞記憶特徵及中樞記憶特徵。在一些實施例中，GM-CSF基因緘默或基因剔除的CAR-T細胞不表現FAS或FAS表現量低於野生型CAR-T細胞。在一些實施例中，相較於野生型CAR-T細胞，GM-CSF基因緘默或基因剔除的CAR-T細胞對活化誘導的細胞死亡(AICD)具有更大抗性、對衰老具有更大抗性且對惰能具有更大抗性。在一些實施例中，相較於野生型CAR-T細胞，GM-CSF基因緘默或基因剔除的CAR-T細胞使得MDSC形成的程度更低且使得CAR-T細胞擴增及持久性更好。在一些實施例中，投與GM-CSF基因緘默或基因剔除的CAR-T細胞顯示擴增及持久性比野生型CAR-T細胞更大。在一些實施例中，GM-CSF基因緘默或基因剔除的CAR-T細胞展現客觀反應(完全反應及部分反應)的程度高於野生型CAR-T細胞。在一些實施例中，GM-CSF基因緘默或基因剔除的CAR-T細胞在6個月、12個月及24個月展現的復發水準低於野生型CAR-T細胞。在一些實施例中，相較於野生型CAR-T細胞，GM-CSF基因緘默或基因剔除的CAR-T細胞展現無惡化存活率及/或總存活率的水準改良。

在一些實施例中，GM-CSF基因緘默或基因剔除的CAR-T細胞聯合重組GM-CSF拮抗劑投與，進一步改善擴增、持久性、抗衰老及抗惰能。在其他實施例中，GM-CSF基因緘默或基因剔除的CAR-T細胞聯合重組GM-CSF拮抗劑投與進一步減少了MDSC形成。在其他實施例中，GM-CSF基因緘默或基因剔除的CAR-T細胞聯合重組GM-CSF拮抗劑投與進一步改善客觀反應(完全反應及部分反應)；降低6個月、12個月及24個月時的復發水準；且展現無惡化存活率及/或總存活率的水準改善。

在一些實施例中，CAR-T細胞為CD19 CAR-T細胞；在其他實施例中，CAR-T細胞為BMCA CAR-T細胞；在其他實施例中，CAR-T細胞為雙重CD19/CD22 CAR-T細胞。在其他實施例中，CAR-T細胞為雙重CD19/CD20 CAR-T細胞。

在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少免疫活化。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含緩解毛細血管滲漏症候群。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含緩解心臟功能異常。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含緩解腦病變。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含緩解大腸炎。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含抑制痙攣。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含緩解CRS。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含緩解神經毒性。在各種實施例中，相較於經CAR-T細胞及對照抗體治療之個體的神經毒性減少，個體的CAR-T細胞相關神經毒性減少約90%。在某些實施例中，重組GM-CSF拮抗劑為抗體，特定言之，根據本文所述實施例之GM-CSF中和抗體，包括實例15。

在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少細胞介素風暴症狀。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含提高減弱的左心室射出分率。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含緩解腹瀉。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含緩解播散性血管內凝血。

在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少水腫。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含緩解紅斑。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少胃腸出血。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含治療胃腸穿孔。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含治療噬血細胞性淋巴組織細胞增生症(HLH)。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含治療肝機能障礙。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少低血壓。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少垂體炎。

在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含抑制免疫相關不良事件。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少免疫性肝炎。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少免疫缺乏症。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含治療局部缺血。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少肝毒性。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含治療巨噬細胞活化症候群(MAS)。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少神經毒性症狀。

在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少胸膜積液。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少心包積液。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少肺炎。

在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少多發性關節炎。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含治療腦後部可逆腦病變症候群(PRES)。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少肺高血壓。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含治療血栓栓塞。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減少轉胺酶升高。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含降低患者的CRES、神經毒性(NT)及/或細胞介素釋放症候群(CRS)級別。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含改善患者的CARTOX-10分數。

在另一態樣中，本發明提供降低或消除已經歷癌症治療之個體之免疫療法相關毒性發生率或嚴重度的方法，該方法包含：(a)向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑，其中該重組hGM-CSF拮抗劑為抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗；及(b)在投與抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗之後，向該個體投與抗CD19 CAR-T細胞。在本文所提供之方法的一個實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗分別以1小時或2小時靜脈內輸注600 mg至1800 mg的劑量投與。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以每8個小時600 mg之劑量投與，24小時總共三次劑量，歷時一天。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以每12小時800 mg之劑量投與，24小時總共兩次劑量，歷時一天。在一個實施例中，GM-CSF拮抗劑以1800 mg之劑量作為靜脈內輸注兩小時的單次劑量投與。在本文所提供之方法的一些實施例中，上述治療達成至少80%之客觀反應率。在一個實施例中，客觀反應率為完全反應或部分反應。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗投與之後的第2至24小時，投與抗CD19 CAR-T細胞。在一個特定實施例中，相較於基線腫瘤負荷，治療之後四週時的腫瘤負荷為腫瘤未被偵測到的完全反應。在一個實施例中，相較於基線腫瘤負荷，治療之後四週時的腫瘤負荷為SPD減少≥50%的部分反應。在一些實施例中，免疫療法相關毒性包含細胞介素釋放症候群(CRS)及/或神經毒性(NT)且個體在治療之後未出現3級或高於3級的CRS或NT，其中抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以600 mg之劑量投與。在一個實施例中，本文所提供之方法進一步包含投與治療有效量的抗IL-6受體單株抗體及/或類固醇。在某些實施例中，個體在治療之後未出現高於2級的細胞介素釋放症候群(CRS)或未出現1級或高於1級的NT，其中抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以1800 mg之劑量投與。在某些實施例中，個體在治療之後出現低於2級的細胞介素釋放症候群(CRS)及神經毒性且出現完全反應，其中完全反應為無毒性完全反應且抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以1800 mg之劑量投與。在一些實施例中，相較於接受CAR-T而未接受抗hGM-CSF抗體的患者，無毒性完全反應率改良超過50%。在一些實施例中，本文所提供之方法進一步包含投與治療有效量的抗IL-6受體單株抗體及/或類固醇。在一個實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗的投與以劑量依賴性方式減少CAR-T投與之後發生的全身炎症。在一些實施例中，全身炎症的減少包含CRS、鐵蛋白及SAA的含量。在某些實施例中，CRS減少包含骨髓細胞介素的含量降低，其中骨髓細胞介素為IL-6、IL-8、MCP-1及/或IP-10 (CXCL-10)；及/或IL-2的釋放減少。在一個實施例中，CRS減少包含急性T細胞細胞介素的含量降低，其中急性T細胞細胞介素為TNF-α、IL-12p40、INF-γ及/或穿孔素。在本文所提供之方法的一些實施例中，方法進一步包含在抗CD19 CAR-T細胞投與之後的第4天或第5天投與第二次劑量的抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗。在一個實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗的投與減少或延遲抗CD19 CAR-T細胞的分化，藉此阻止CAR-T細胞耗竭及CAR-T細胞活化誘導的細胞死亡。

在另一態樣中，本發明提供用抗CD19 CAR-T細胞療法延遲或預防已經歷癌症治療之個體之免疫療法相關不良神經事件的方法，該方法包含：(a)向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑，其中該重組hGM-CSF拮抗劑為抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗；及(b)在投與抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗之後，向該個體投與抗CD19 CAR-T細胞。在一個實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗分別以1小時或2小時靜脈內輸注600 mg至1800 mg的劑量投與。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以每8個小時600 mg之劑量投與，24小時總共三次劑量，歷時一天。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以每12小時800 mg之劑量投與，24小時總共兩次劑量，歷時一天。在一些實施例中，GM-CSF拮抗劑以1800 mg之劑量作為靜脈內輸注兩小時的單次劑量投與。在某些實施例中，上述治療達成至少80%的客觀反應率。在一個實施例中，客觀反應率為完全反應或部分反應。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗投與之後的第2至24小時，投與抗CD19 CAR-T細胞。在某些實施例中，相較於基線腫瘤負荷，治療之後四週時的腫瘤負荷為腫瘤未被偵測到的完全反應。在一些實施例中，相較於基線腫瘤負荷，治療之後四週時的腫瘤負荷為SPD減少≥50%的部分反應。在某些實施例中，個體在治療之後未出現3級或高於3級的細胞介素釋放症候群(CRS)，其中抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以600 mg之劑量投與。在某些實施例中，個體在治療之後出現低於2級的細胞介素釋放症候群(CRS)及神經毒性且出現完全反應，其中完全反應為無毒性完全反應且抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以1800 mg之劑量投與。在一些實施例中，相較於接受CAR-T而未接受抗hGM-CSF抗體的患者，無毒性完全反應率改良超過50%。在一些實施例中，本文所提供之方法進一步包含投與治療有效量的抗IL-6受體單株抗體及/或類固醇。在某些實施例中，個體在治療之後未出現2級或高於2級的細胞介素釋放症候群(CRS)或未出現1級或高於1級的神經毒性，其中抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以1800 mg之劑量投與。在某些實施例中，個體在治療之後出現低於2級的細胞介素釋放症候群(CRS)及神經毒性且出現完全反應，其中完全反應為無毒性完全反應且抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以1800 mg之劑量投與。在一些實施例中，相較於接受CAR-T而未接受抗hGM-CSF抗體的患者，無毒性完全反應率改良超過50%。在一些實施例中，本文所提供之方法進一步包含投與治療有效量的抗IL-6受體單株抗體及/或類固醇。在一個實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗的投與以劑量依賴性方式減少CAR-T投與之後發生的全身炎症。在一些實施例中，全身炎症的減少包含CRS、鐵蛋白及SAA的含量降低。在一個實施例中，CRS減少包含骨髓細胞介素的含量降低，其中骨髓細胞介素為IL-6、IL-8、MCP-1及/或IP-10 (CXCL-10)；及/或IL-2的釋放減少。在一些實施例中，CRS減少包含急性T細胞細胞介素的含量降低，其中急性T細胞細胞介素為TNF-α、IL-12p40、INF-γ及/或穿孔素。在某些實施例中，本文所提供之方法進一步包含在抗CD19 CAR-T細胞投與之後的第4天或第5天，投與第二次劑量的抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗。在各種實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗的投與減少或延遲抗CD19 CAR-T細胞的分化，藉此阻止CAR-T細胞耗竭及CAR-T細胞活化誘導的細胞死亡。在一個實施例中，免疫療法相關的不良神經事件為意識模糊狀態、震顫及/或腦病變。

在一個態樣中，本發明另外提供一種用於治療或預防個體之免疫療法相關毒性的方法，該方法包含向該個體投與表現嵌合抗原受體的T細胞(CAR-T細胞)及重組hGM-CSF拮抗劑，該等CAR-T細胞具有GM-CSF基因剔除(GM-CSF ^k/oCAR-T細胞)，如實例6及20至21中所展現。在一些實施例中，相較於野生型CAR-T細胞中的GM-CSF表現量，GM-CSF ^k/oCAR-T細胞中的GM-CSF表現量降低。在某些實施例中，GM-CSF ^k/CAR-T細胞中之一或多種細胞介素及/或趨化因子的表現量低於或等效於野生型CAR-T細胞中之一或多種細胞介素及/或趨化因子的表現量。在特定實施例中，一或多種細胞介素為選自由以下組成之群的人類細胞介素：IFN-γ、GRO、MDC、IL-2、IL-3、IL-5、IL-7、IP-10、CD107a、TNF-α及VEGF。在一些實施例中，一或多種細胞介素選自由以下組成之群：IFN-γ、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL7、IL-9、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、ILF、IL-13、LIX、IL-15、IP-10、KC、MCP-1、MIP-1a、MIP-1b、M-CSF MIP-2、MIG、RANTES及TNF-α、伊紅趨素、G-CSF及其組合。在各種實施例中，重組GM-CSF拮抗劑為hGM-CSF拮抗劑。在一些實施例中，重組GM-CSF拮抗劑為抗GM-CSF抗體。在特定實施例中，抗GM-CSF抗體結合人類GM-CSF。在其他實施例中，抗GM-CSF抗體結合靈長類動物GM-CSF。在各種實施例中，抗GM-CSF抗體結合哺乳動物GM-CSF。在一些實施例中，抗GM-CSF抗體為抗hGM-CSF抗體。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體為單株抗體。在各種實施例中，抗hGM-CSF抗體為抗體片段，亦即，Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或dAB。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體為人類GM-CSF中和抗體。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體為重組或嵌合抗體。在各種實施例中，抗hGM-CSF抗體為人類抗體。在一些實施例中，CAR-T細胞為CD19 CAR-T細胞。在特定實施例中，GM-CSF ^k/oCAR-T細胞增強重組hGM-CSF拮抗劑的抗腫瘤活性。在特定實施例中，相較於藉由投與野生型CAR-T細胞而治療之個體的存活期，GM-CSF ^k/oCAR-T細胞改善個體的總存活期。在特定實施例中，向該個體投與具有GM-CSF基因剔除的CAR-T細胞(GM-CSF ^k/oCAR-T細胞)及重組hGM-CSF拮抗劑為預防或治療免疫療法相關毒性(諸如CRS、神經毒性及神經炎症)的持久療法。在一些實施例中，個體患有癌症。在各種實施例中，癌症為急性淋巴母細胞白血病。

自個體中移除人類 GM-CSF 的方法

在此方法的一個實施例中，該方法進一步包含向個體投與重組hGM-CSF拮抗劑。在特定實施例中，重組GM-CSF拮抗劑為hGM-CSF拮抗劑。在一些實施例中，重組GM-CSF拮抗劑為抗GM-CSF抗體。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體為抗體片段，亦即，Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或dAB。在一個實施例中，抗hGM-CSF抗體具有圖1中所示之VH區序列及圖1中所示之VL區序列。在另一個實施例中，VH區或VL區，或VH與VL區胺基酸序列均包含位於N端的甲硫胺酸。在另一實施例中，hGM-CSF拮抗劑選自包含以下之群：抗hGM-CSF受體抗體或可溶性hGM-CSF受體或受體亞單元、細胞色素b562抗體模擬物、hGM-CSF肽類似物、阿德尼汀、脂質運載蛋白支架抗體模擬物、杯芳烴抗體模擬物，及抗體樣結合肽模擬物。在另一個實施例中，可溶性hGM-CSF受體包含可溶性hGM-CSF受體-Fc融合蛋白。在另一個實施例中，GM-CSF為CAR T衍生的GM-CSF或非CAR T衍生的GM-CSF。在一些實施例中，個體發生免疫療法相關毒性。

用於減少血腦障壁破壞及用於保持 / 維持 BBB 完整性的方法

在一個態樣中，本發明提供用於減少經免疫療法治療之個體之血腦障壁破壞的方法，該方法包含向該個體投與重組GM-CSF拮抗劑。在一些實施例中，個體發生免疫療法相關毒性。

在某些實施例中，免疫療法包含授受性細胞轉移、投與單株抗體、投與細胞介素、投與癌症疫苗、T細胞接合療法，或其任何組合。在各種實施例中，授受性細胞轉移包含投與表現嵌合抗原受體的T細胞(CAR T細胞)、經T細胞受體(TCR)修飾的T細胞、腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)、經嵌合抗原受體(CAR)修飾的自然殺手細胞，或樹突狀細胞，或其任何組合。在特定實施例中，CAR T細胞為CD19 CAR-T細胞。

在其他實施例中，重組GM-CSF拮抗劑為hGM-CSF拮抗劑。在一些實施例中，重組GM-CSF拮抗劑為抗GM-CSF抗體。在各種實施例中，抗GM-CSF抗體結合哺乳動物GM-CSF。在某些實施例中，抗GM-CSF抗體結合靈長類動物GM-CSF。在一些實施例中，靈長類動物為猴、狒狒、獼猴、黑猩猩、大猩猩、狐猴、懶猴、眼鏡猴、嬰猴、樹熊猴、冕狐猴、大狐猴、狐猿、猿或人類。

在特定實施例中，抗GM-CSF抗體為抗hGM-CSF抗體。在各種實施例中，抗hGM-CSF抗體結合人類GM-CSF。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體為單株抗體。在各種實施例中，抗hGM-CSF抗體為抗體片段，亦即，Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或dAB。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體為人類GM-CSF中和抗體。在其他實施例中，抗hGM-CSF抗體為重組或嵌合抗體。在其他實施例中，抗hGM-CSF抗體為人類抗體。在特定實施例中，抗hGM-CSF抗體與嵌合19/2抗體結合至相同的抗原決定基。在更多特定實施例中，抗hGM-CSF抗體包含嵌合19/2抗體的VH區CDR3及VL區CDR3。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體在免疫療法之前、同時、之後投與，或其組合。

在各種實施例中，抗hGM-CSF抗體包含嵌合19/2抗體的VH區及VL區CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體包含：含有CDR3結合特異性決定子RQRFPY (SEQ ID NO: 12)或RDRFPY、J段及V段的VH區，其中該J段與人類JH4 (YFD YWGQGTL VTVSS)至少95%一致且該V段與人類生殖系VH1 1-02或VH1 1-03序列至少90%一致；或含有CDR3結合特異性決定子RQRFPY (SEQ ID NO: 12)的VH區。在一些實施例中，J段包含YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:14)。在某些實施例中，CDR3包含RQRFPYYFDY或RDRFPYYFDY。在其他實施例中VH區CDR1為人類生殖系VH1 CDR1；VH區CDR2為人類生殖系VH1 CDR2；或CDR1與CDR2均來自人類生殖系VH1序列。在另外其他實施例中，抗hGM-CSF抗體包含VH CDR1或VH CDR2，或VH CDR1與VH CDR2，如圖1中所示之VH區中所示。在一些實施例中，V段序列具有圖1中所示之VH V段序列。在各種實施例中，VH具有圖1中所示之VH#1、VH#2、VH#3、VH#4或VH#5序列。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體包含VL區，該VL區包含含有胺基酸序列FNK或FNR的CDR3。

在其他實施例中，抗hGM-CSF抗體包含人類生殖系JK4區。在特定實施例中，VL區CDR3包含QQFN(K/R)SPLT (SEQ ID NO: 17)。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體包含VL區，該VL區包含含有QQFNKSPLT (SEQ ID NO: 18)的CDR3。在特定實施例中，VL區包含圖1中所示之VL區的CDR1或CDR2，或CDR1與CDR2。在某些實施例中，VL區包含V段，該V段與如圖1中所示的VKIII A27 V段序列至少95%一致。在各種實施例中，VL區具有圖1中所示之VK#1、VK#2、VK#3或VK#4序列。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體具有VH區CDR3結合特異性決定子RQRFPY (SEQ ID NO: 12)或RDRFPY (SEQ ID NO: 13)及VL區，該VL區具有包含QQFNKSPLT (SEQ ID NO: 18)的CDR3。在其他實施例中，抗hGM-CSF抗體具有圖1中所示之VH區序列及圖1中所示之VL區序列。在另外其他實施例中，VH區或VL區，或VH與VL區胺基酸序列均包含位於N端的甲硫胺酸。

在各種實施例中，hGM-CSF拮抗劑選自包含以下之群：抗hGM-CSF受體抗體或可溶性hGM-CSF受體、細胞色素b562抗體模擬物、hGM-CSF肽類似物、阿德尼汀、脂質運載蛋白支架抗體模擬物、杯芳烴抗體模擬物，及抗體樣結合肽模擬物。在特定實施例中，免疫療法相關毒性為CAR-T相關毒性。在更多特定實施例中，CAR-T相關毒性為細胞介素釋放症候群、神經毒性、神經炎症或其組合。

在所提供之方法的一個實施例中，重組hGM-CSF拮抗劑為抗GM-CSF抗體。在另一個實施例中，抗GM-CSF抗體結合哺乳動物GM-CSF。在又另一個實施例中，抗GM-CSF抗體結合靈長類動物GM-CSF。在另一實施例中，靈長類動物為猴、狒狒、獼猴、黑猩猩、大猩猩、狐猴、懶猴、眼鏡猴、嬰猴、樹熊猴、冕狐猴、大狐猴、狐猿、猿或人類。

在所提供之方法的一個特定實施例中，抗GM-CSF抗體為抗hGM-CSF抗體。在另一特定實施例中，抗hGM-CSF抗體結合人類GM-CSF。在另一實施例中，抗hGM-CSF抗體為單株抗體。在一個特定實施例中，抗hGM-CSF抗體為抗體片段，亦即，Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或dAB。在一個實施例中，抗hGM-CSF抗體為人類GM-CSF中和抗體。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體為重組或嵌合抗體。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體為人類抗體。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體與嵌合19/2抗體結合至相同的抗原決定基。在各種實施例中，抗hGM-CSF抗體包含嵌合19/2抗體的VH區CDR3及VL區CDR3。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體在免疫療法之前、同時、之後投與，或其組合。

在所提供之方法的一個實施例中，抗hGM-CSF抗體包含嵌合19/2抗體的VH區及VL區CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體包含：含有CDR3結合特異性決定子RQRFPY (SEQ ID NO: 12)或RDRFPY、J段及V段的VH區，其中該J段與人類JH4 (YFD YWGQGTL VTVSS)至少95%一致且該V段與人類生殖系VH1 1-02或VH1 1-03序列至少90%一致；或含有CDR3結合特異性決定子RQRFPY (SEQ ID NO: 12)的VH區。在某些實施例中，J段包含YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:14)。在特定實施例中，CDR3包含RQRFPYYFDY或RDRFPYYFDY。在一些實施例中，VH區CDR1為人類生殖系VH1 CDR1；VH區CDR2為人類生殖系VH1 CDR2；或CDR1與CDR2均來自人類生殖系VH1序列。在一個特定實施例中，抗hGM-CSF抗體包含VH CDR1或VH CDR2，或VH CDR1與VH CDR2，如圖1中所示之VH區所示。在一個實施例中，V段序列具有圖1中所示之VH V段序列。在一些實施例中，VH具有圖1中所示之VH#1、VH#2、VH#3、VH#4或VH#5序列。在各種實施例中，抗hGM-CSF抗體包含VL區，該VL區包含含有胺基酸序列FNK或FNR的CDR3。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體包含人類生殖系JK4區。在一個實施例中，VL區CDR3包含QQFN(K/R)SPLT (SEQ ID NO: 17)。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體包含VL區，該VL區包含含有QQFNKSPLT (SEQ ID NO: 18)的CDR3。在一些實施例中，VL區包含圖1中所示之VL區的CDR1或CDR2，或CDR1與CDR2。在各種實施例中，VL區包含V段，該V段與如圖1中所示的VKIII A27 V段序列至少95%一致。在特定實施例中VL區具有圖中所示之VK#1、VK#2、VK#3或VK#4序列。在特定實施例中，抗hGM-CSF抗體具有VH區CDR3結合特異性決定子RQRFPY (SEQ ID NO: 12)或RDRFPY (SEQ ID NO: 13)及VL區，該VL區具有包含QQFNKSPLT (SEQ ID NO: 18)的CDR3。在其他實施例中，抗hGM-CSF抗體具有圖1中所示之VH區序列及圖1中所示之VL區序列。在一些實施例中，VH區或VL區，或VH與VL區胺基酸序列均包含位於N端的甲硫胺酸。在某些實施例中，hGM-CSF拮抗劑選自包含以下之群：抗hGM-CSF受體抗體或可溶性hGM-CSF受體、細胞色素b562抗體模擬物、hGM-CSF肽類似物、阿德尼汀、脂質運載蛋白支架抗體模擬物、杯芳烴抗體模擬物，及抗體樣結合肽模擬物。在所提供之方法的一個特定實施例中，個體出現免疫療法相關毒性。在另一實施例中，免疫療法相關毒性為CAR-T相關毒性。在其他實施例中，CAR-T相關毒性為細胞介素釋放症候群、神經毒性、神經炎症或其組合。

在另一態樣中，本發明提供一種用於減少或預防CAR-T細胞療法誘導有需要之個體發生神經炎症的方法，該方法包含向該個體投與重組GM-CSF拮抗劑。

在一些實施例中，投與重組GM-CSF拮抗劑減少血腦障壁的破壞，藉此維持其完整性。在特定實施例中，減少血腦障壁的破壞減弱或阻止促炎性細胞介素流入中樞神經系統。在各種實施例中，促炎性細胞介素係選自由以下組成之群：IP-10、IL-2、IL-3、IL-5、IL-1Ra、VEGF、TNF-α、FGF-2、IFN-γ、IL-12p40、IL-12p70、sCD40L、MDC、MCP-1、MIP-1a、MIP-1b或其組合。在某些實施例中，促炎性細胞介素係選自由以下組成之群：IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-9、IL-10、IP-10、KC、MCP-1、MIP或其組合。在特定實施例中，相較於經CAR-T細胞療法及對照抗體治療的個體，個體的神經炎症減少75%至95%。在各種實施例中，神經炎症的75%至95%降幅類似於未治療對照個體的神經炎症。在一些實施例中，向個體投與表現嵌合抗原受體的T細胞(CAR T細胞)。在某些實施例中，向個體投與經T細胞受體(TCR)修飾之T細胞、腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)、經嵌合抗原受體(CAR)修飾之自然殺手細胞，或樹突狀細胞，或其任何組合。在特定實施例中，CAR T細胞為CD19 CAR-T細胞。在各種實施例中，重組GM-CSF拮抗劑為hGM-CSF拮抗劑。在某些實施例中，重組GM-CSF拮抗劑為抗GM-CSF抗體。在一些實施例中，抗GM-CSF抗體結合哺乳動物GM-CSF。在其他實施例中，抗GM-CSF抗體結合靈長類動物GM-CSF。在一些實施例中，靈長類動物為猴、狒狒、獼猴、黑猩猩、大猩猩、狐猴、懶猴、眼鏡猴、嬰猴、樹熊猴、冕狐猴、大狐猴、狐猿、猿或人類。在一個實施例中，抗GM-CSF抗體為抗hGM-CSF抗體。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體結合人類GM-CSF。在另一實施例中，抗hGM-CSF抗體為單株抗體。在另一實施例中，抗hGM-CSF抗體為抗體片段，亦即，Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或dAB。在特定實施例中，抗hGM-CSF抗體為人類GM-CSF中和抗體。

在各種實施例中，抗hGM-CSF抗體為重組或嵌合抗體。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體為人類抗體。在特定實施例中，抗hGM-CSF抗體與嵌合19/2抗體結合至相同的抗原決定基。在其他實施例中，抗hGM-CSF抗體包含嵌合19/2抗體的VH區CDR3及VL區CDR3。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體在免疫療法之前、同時、之後投與，或其組合。

在另外其他實施例中，抗hGM-CSF抗體包含嵌合19/2抗體的VH區及VL區CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體包含：含有CDR3結合特異性決定子RQRFPY (SEQ ID NO: 12)或RDRFPY、J段及V段的VH區，其中該J段與人類JH4 (YFD YWGQGTL VTVSS)至少95%一致且該V段與人類生殖系VH1 1-02或VH1 1-03序列至少90%一致；或含有CDR3結合特異性決定子RQRFPY (SEQ ID NO: 12)的VH區。在各種實施例中，J段包含YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:14)。

在特定實施例中，CDR3包含RQRFPYYFDY或RDRFPYYFDY。在一些實施例中，VH區CDR1為人類生殖系VH1 CDR1；VH區CDR2為人類生殖系VH1 CDR2；或CDR1與CDR2均來自人類生殖系VH1序列。在各種實施例中，抗hGM-CSF抗體包含VH CDR1或VH CDR2，或VH CDR1與VH CDR2，如圖1中所示之VH區所示。在某些實施例中，V段序列具有圖1中所示之VH V段序列。在特定實施例中，VH具有圖1中所示之VH#1、VH#2、VH#3、VH#4或VH#5序列。在其他實施例中，抗hGM-CSF抗體所包含的VL區包含含有胺基酸序列FNK或FNR的CDR3。在另外其他實施例中，抗hGM-CSF抗體包含人類生殖系JK4區。在一些實施例中，VL區CDR3包含QQFN(K/R)SPLT (SEQ ID NO: 17)。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體包含VL區，該VL區包含含有QQFNKSPLT (SEQ ID NO: 18)的CDR3。在各種實施例中，VL區包含圖1中所示之VL區的CDR1或CDR2，或CDR1與CDR2。在其他實施例中，VL區包含V段，該V段與如圖1中所示之VKIII A27 V段序列至少95%一致。在另外其他實施例中，VL區具有圖1中所示之VK#1、VK#2、VK#3或VK#4序列。

在一個實施例中，抗hGM-CSF抗體具有VH區CDR3結合特異性決定子RQRFPY (SEQ ID NO: 12)或RDRFPY (SEQ ID NO: 13)及VL區，該VL區具有包含QQFNKSPLT (SEQ ID NO: 18)的CDR3。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體具有圖1中所示之VH區序列及圖1中所示之VL區序列。在各種實施例中，VH區或VL區，或VH與VL區胺基酸序列均包含位於N端的甲硫胺酸。

在其他實施例中，hGM-CSF拮抗劑選自包含以下之群：抗hGM-CSF受體抗體或可溶性hGM-CSF受體、細胞色素b562抗體模擬物、hGM-CSF肽類似物、阿德尼汀、脂質運載蛋白支架抗體模擬物、杯芳烴抗體模擬物，及抗體樣結合肽模擬物。在一些實施例中，個體另外出現選自細胞介素釋放症候群、神經毒性或其組合的CAR-T相關毒性。 用於降低腫瘤復發之復發率或預防腫瘤復發發生的方法

在一個態樣中，本發明提供一種針對經免疫療法治療之個體降低腫瘤復發之復發率或預防腫瘤復發發生的方法，該方法包含向該個體投與重組GM-CSF拮抗劑。在一些實施例中，降低個體之腫瘤復發之復發率或預防腫瘤復發的發生係在免疫療法相關毒性未發生的情況下進行。在某些實施例中，降低個體之腫瘤復發的復發率或預防腫瘤復發的發生係在免疫療法相關毒性發生的情況下進行。在一些實施例中，重組GM-CSF拮抗劑為hGM-CSF拮抗劑。在各種實施例中，重組GM-CSF拮抗劑為抗GM-CSF抗體。在一些實施例中，抗GM-CSF抗體結合人類GM-CSF。在某些實施例中，抗GM-CSF抗體結合靈長類動物GM-CSF。在各種實施例中，靈長類動物選自猴、狒狒、獼猴、黑猩猩、大猩猩、狐猴、懶猴、眼鏡猴、嬰猴、樹熊猴、冕狐猴、大狐猴、狐猿或猿。在一些實施例中，抗GM-CSF抗體結合哺乳動物GM-CSF。

在特定實施例中，抗GM-CSF抗體為抗hGM-CSF抗體。如上文所述，抗GM-CSF抗體為單株抗體。在另一個實施例中，抗hGM-CSF抗體為抗體片段，亦即，Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或dAB。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體為人類GM-CSF中和抗體。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體為重組或嵌合抗體。在各種實施例中，抗hGM-CSF抗體為人類抗體。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體與嵌合19/2抗體結合至相同抗原決定基。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體包含嵌合19/2抗體的VH區CDR3及VL區CDR3。在各種實施例中，抗hGM-CSF抗體包含嵌合19/2抗體的VH區及VL區CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體包含：含有CDR3結合特異性決定子RQRFPY (SEQ ID NO: 12)或RDRFPY、J段及V段的VH區，其中該J段與人類JH4 (YFD YWGQGTL VTVSS)至少95%一致且該V段與人類生殖系VH1 1-02或VH1 1-03序列至少90%一致；或含有CDR3結合特異性決定子RQRFPY (SEQ ID NO: 12)的VH區。在特定實施例中，J段包含YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:14)。在其他實施例中，CDR3包含RQRFPYYFDY或RDRFPYYFDY。在一些實施例中，VH區CDR1為人類生殖系VH1 CDR1；VH區CDR2為人類生殖系VH1 CDR2；或CDR1與CDR2來自人類生殖系VH1序列。

在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體包含VH CDR1或VH CDR2，或VH CDR1與VH CDR2，如圖1中所示之VH區所示。在各種實施例中，V段序列具有圖1中所示之VH V段序列。在某些實施例中，VH具有圖1中所示之VH#1、VH#2、VH#3、VH#4或VH#5序列。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體所包含的VL區包含含有胺基酸序列FNK或FNR的CDR3。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體包含人類生殖系JK4區。在某些實施例中，VL區CDR3包含QQFN(K/R)SPLT (SEQ ID NO: 17)。在各種實施例中，抗hGM-CSF抗體包含VL區，該VL區包含含有QQFNKSPLT (SEQ ID NO: 18)的CDR3。在一些實施例中，VL區包含圖1中所示之VL區的CDR1或CDR2，或CDR1與CDR2。在特定實施例中，VL區包含與如圖1中所示之VKIII A27 V段序列至少95%一致的V段。在一些實施例中，VL區具有圖1中所示之VK#1、VK#2、VK#3或VK#4序列。在一個實施例中，抗hGM-CSF抗體具有VH區CDR3結合特異性決定子RQRFPY (SEQ ID NO: 12)或RDRFPY (SEQ ID NO: 13)及VL區，該VL區具有包含QQFNKSPLT (SEQ ID NO: 18)的CDR3。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體具有圖1中所示之VH區序列及圖1中所示之VL區序列。在其他實施例中，VH區或VL區，或VH與VL區胺基酸序列均包含位於N端的甲硫胺酸。

在一些實施例中，hGM-CSF拮抗劑選自包含以下之群：抗hGM-CSF受體抗體或可溶性hGM-CSF受體、細胞色素b562抗體模擬物、hGM-CSF肽類似物、阿德尼汀、脂質運載蛋白支架抗體模擬物、杯芳烴抗體模擬物，及抗體樣結合肽模擬物。在某些實施例中，CAR-T細胞為CD19 CAR-T細胞。在特定實施例中，免疫療法相關毒性為CAR-T相關毒性。在一些實施例中，CAR-T相關毒性為CRS、NT或神經炎症。

在特定實施例中，相較於經免疫療法治療且未投與重組GM-CSF拮抗劑之個體之腫瘤復發的發生，在重組GM-CSF拮抗劑投與之後的最初四分之一年內，腫瘤復發的發生減少50%至100%。在某些實施例中，重組GM-CSF拮抗劑投與之後的最初半年，腫瘤復發的發生減少50%至95%。在各種實施例中，重組GM-CSF拮抗劑投與之後的第一年，腫瘤復發的發生減少50%至90%。在一些實施例中，腫瘤復發的發生得到長期的預防。如本文所用，術語「長期」意謂自重組hGM-CSF拮抗劑最後一次治療日期算起至少一年(亦即，12個月)的延長時段期間。在一些實施例中，重組hGM-CSF拮抗劑為hGM-CSF中和抗體。在各種實施例中，重組hGM-CSF拮抗劑為抗hGM-CSF抗體，例如冷自魯單抗。在某些實施例中，腫瘤復發的發生得以預防12-36個月。在一些實施例中，腫瘤復發的發生得到「完全」(100%)預防，如本文所用，此意謂自重組hGM-CSF拮抗劑最後一次治療算起，至少12個月不會出現腫瘤復發。在某些實施例中，個體患有急性淋巴母細胞白血病。

在本文所提供之用於降低經免疫療法治療之個體之腫瘤復發之復發率或預防腫瘤復發之發生之方法的各種實施例中，該個體患有「難治性癌症」，如本文所用，難治性癌症為(a)手術不起作用的惡性疾病(本文中亦稱為「癌症」或「腫瘤」)；及為(b)初始對療法無反應或具有抗性，其中療法為化學療法、放射或其組合；或為(b)對前述療法變得或已變得無反應的惡性疾病。在一些實施例中，個體患有「復發」的癌症，如本文所用，該癌症為僅對療法有反應、但已恢復的癌症。在特定實施例中，難治性癌症或復發癌症為非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在各種實施例中，難治性癌症或復發癌症為非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在某些實施例中，難治性癌症為難治性侵襲性B細胞非霍奇金淋巴瘤。在一些實施例中，難治性癌症或復發癌症為化療難治性B細胞淋巴瘤。在各種實施例中，難治性癌症或復發癌症為激素難治性前列腺癌。在某些實施例中，難治性癌症或復發癌症為兒科癌症。在一些實施例中，難治性兒科癌症或復發的兒科癌症為神經母細胞瘤。在特定實施例中，難治性兒科癌症或復發的兒科癌症為選自由以下組成之群的兒科白血病：急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)或不常見的兒科白血病幼年型骨髓單核細胞性白血病或慢性骨髓性白血病。在某些實施例中，難治性癌症或復發癌症為兒科骨癌。在一些實施例中，難治性癌症或復發癌症為腎上腺癌。在各種實施例中，難治性癌症或復發癌症為乳癌。在某些實施例中，難治性癌症或復發癌症為大腸癌、直腸癌或大腸直腸癌。在特定實施例中，難治性癌症或復發癌症為T細胞淋巴瘤。在一些實施例中，難治性癌症或復發癌症為頭頸癌。在一些實施例中，難治性癌症或復發癌症為腦癌及/或脊髓癌，包括(但不限於)神經膠質瘤及神經膠母細胞瘤。在其他實施例中，難治性癌症或復發癌症為骨骼或軟組織腫瘤，包括(但不限於)軟骨肉瘤。在各種實施例中，難治性癌症或復發癌症為骨癌。在一些實施例中，難治性癌症或復發癌症為食道癌。在某些實施例中，難治性癌症或復發癌症為膽囊癌。在一些實施例中，難治性癌症或復發癌症為腎臟癌。在各種實施例中，難治性癌症或復發癌症為黑色素瘤。在一些實施例中，難治性癌症或復發癌症為卵巢癌。在某些實施例中，難治性癌症或復發癌症為胰臟癌。在一些實施例中，難治性癌症或復發癌症為選自基底細胞癌、鱗狀細胞癌或黑色素瘤的皮膚癌。在各種實施例中，難治性癌症或復發癌症為肺癌。在一些實施例中，難治性癌症或復發癌症為唾液腺癌。在其他實施例中難治性癌症或復發癌症為子宮平滑肌癌。在一些實施例中，難治性癌症或復發癌症為睪丸癌。在各種實施例中，難治性癌症或復發癌症為胃癌或胃腸癌。在某些實施例中，難治性癌症或復發癌症為膀胱癌。在其他實施例中，難治性癌症或復發癌症為脂肪組織贅瘤。在一些實施例中，難治性兒科癌症或復發兒科癌症為腺癌。在某些實施例中，難治性癌症或復發癌症為胸腺瘤。在各種實施例中，難治性癌症或復發癌症為血管肉瘤，亦即，血管內層癌症，其可發生於身體之任何部分，包括(但不限於)皮膚、乳房、肝臟、脾臟及深度組織，亦即，深部腫瘤。在一些實施例中，難治性癌症或復發癌症為前述難治性癌症或復發癌症中之任一者的轉移。

在一個態樣中，本發明提供治療患有癌症之個體的方法，該方法包含：(a)向該個體投與治療有效量之重組hGM-CSF拮抗劑，其中該重組hGM-CSF拮抗劑為抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗；及(b)在投與抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗之後，向該個體投與抗CD19 CAR-T細胞。在所提供之方法的一些實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗分別以1小時或2小時靜脈內輸注600 mg至1800 mg的劑量投與。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以每8小時600 mg之劑量投與，24小時總共三次劑量，歷時一天。在一個實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以每12小時800 mg之劑量投與，24小時總共兩次劑量，歷時一天。在另一個實施例中，GM-CSF拮抗劑以1800 mg之劑量作為靜脈內輸注兩小時的單次劑量投與。在一些實施例中，上述治療達成至少80%的客觀反應率。在一個實施例中，客觀反應率為完全反應或部分反應。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗投與之後的第2至24小時，投與抗CD19 CAR-T細胞。在各種實施例中，相較於基線腫瘤負荷，治療之後四週時的腫瘤負荷為腫瘤未被偵測到的完全反應。在一些實施例中，相較於基線腫瘤負荷，治療之後四週時的腫瘤負荷為SPD減少≥50%的部分反應。在一個實施例中，個體在治療之後未出現3級或高於3級的細胞介素釋放症候群(CRS)，其中抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以600 mg之劑量投與。在一個實施例中，本文所提供之方法進一步包含投與治療有效量的抗IL-6受體單株抗體及/或類固醇。在特定實施例中，個體在治療之後未出現2級或高於2級的細胞介素釋放症候群(CRS)或未出現1級或高於1級的神經毒性，其中抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以1800 mg之劑量投與。在一些實施例中，本文所提供之方法進一步包含投與治療有效量的抗IL-6受體單株抗體及/或類固醇。在一個實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗的投與以劑量依賴性方式減少CAR-T投與之後發生的全身炎症。在一些實施例中，全身炎症的減少包含CRS、鐵蛋白及SAA的含量。在特定實施例中，CRS減少包含骨髓細胞介素的含量降低，其中骨髓細胞介素為IL-6、IL-8、MCP-1及/或IP-10 (CXCL-10)；及/或IL-2的釋放減少。在一個實施例中，CRS減少包含急性T細胞細胞介素的含量降低，其中急性T細胞細胞介素為TNF-α、IL-12p40、INF-γ及/或穿孔素。在一些實施例中，本文中所提供之方法進一步包含抗CD19 CAR-T細胞投與之後的第4天或第5天投與第二次劑量的抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗。在一個實施例中，抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗的投與減少或延遲抗CD19 CAR-T細胞的分化，藉此阻止CAR-T細胞耗竭及CAR-T細胞活化誘導的細胞死亡。在一個實施例中，抗hGM-CSF抗體的投與引起無毒性完全反應，其中無毒性定義為CRS及NT＜2級。

在一些實施例中，免疫療法為活化免疫療法。在一些實施例中，免疫療法作為癌症療法提供。在一些實施例中，免疫療法包含授受性細胞轉移。

在一些實施例中，授受性細胞轉移包含投與表現嵌合抗原受體的T細胞(CAR T細胞)。熟習此項技術者應瞭解，CAR為一種靶向抗原之受體類型，其由細胞內T細胞信號傳導域與細胞外腫瘤結合部分(最通常為來自單株抗體的單鏈可變片段(scFv))融合而構成。CAR不依賴於MHC介導之呈遞而直接識別細胞表面抗原，從而允許使用對所有患者中的任何指定抗原具有特異性的單一受體構築體。初始CAR使抗原識別域與T細胞受體(TCR)複合物之CD3ζ活化鏈融合。儘管此等第一代CAR在活體外誘導T細胞效應功能，但其在很大程度上受到活體內不良抗腫瘤功效的限制。後續CAR迭代包括與CD3ζ串聯的二級共刺激信號，包括來自CD28的胞內域或多種TNF受體家族分子，諸如4-1BB (CD137)及OX40 (CD134)。另外，第三代受體包括除CD3ζ之外的兩種共刺激信號，最通常來自CD28及4-1BB。第二代及第三代CAR顯著改善抗腫瘤功效，在一些情況下，誘導晚期癌症患者完全緩解。在一個實施例中，CAR T細胞為經修飾以表現CAR的免疫反應性細胞，當CAR結合至其抗原時，該細胞被活化。

在一個實施例中，CAR T細胞為包含抗原受體的免疫反應性細胞，當其受體結合至其抗原時，該細胞被活化。在一個實施例中，如本文所揭示之組合物及方法中使用的CAR T細胞為第一代CAR T細胞。在另一個實施例中，如本文所揭示之組合物及方法中使用的CAR T細胞為第二代CAR T細胞。在另一個實施例中，如本文所揭示之組合物及方法中使用的CAR T細胞為第三代CAR T細胞。在另一個實施例中，如本文所揭示之組合物及方法中使用的CAR T細胞為第四代CAR T細胞。

在一些實施例中，授受性細胞轉移包含投與經T細胞受體(TCR)修飾之T細胞。熟習此項技術者應瞭解，經TCR修飾之T細胞係藉由自腫瘤組織中分離出T細胞且分離出其TCRα及TCRβ鏈而製得。隨後將此等TCRα及TCRβ選殖且轉染至自周邊血液分離的T細胞中，該等T細胞接著表現來自識別腫瘤之T細胞的TCRα及TCRβ。

在一些實施例中，授受性細胞轉移包含投與腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。在一些實施例中，授受性細胞轉移包含投與經嵌合抗原受體(CAR)修飾之NK細胞。熟習此項技術者應瞭解，經CAR修飾之NK細胞包含自患者分離的NK細胞或市售NK，該等NK經工程改造以表現識別腫瘤特異性蛋白質的CAR。

在一些實施例中，授受性細胞轉移包含投與樹突狀細胞。

在一些實施例中，免疫療法包含投與單株抗體。在一些實施例中，單株抗體連接至癌細胞上的特定蛋白質，從而標記該等細胞以便免疫系統發現且摧毀該等細胞。在一些實施例中，單株抗體藉由抑制免疫檢查點、從而阻礙癌細胞抑制免疫系統來發揮作用。在一些實施例中，單株抗體改善CAR-T與檢查點抑制劑協同作用的效用。

在一些實施例中，抗體靶向選自包含以下之群的蛋白質：5AC、5T4、活化素受體樣激酶1、AGS-22M6、α-胎蛋白、血管生成素2、血管生成素3、B7-H3、BAFF、BCMA、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶9、CCR4、CD125、CD152、CD184、CD19、CD2、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23、CD25、CD27、CD274、CD276、CD28、CD3、CD30、CD33、CD37、CD38、CD4、CD40、CD41、CD44 v6、CD49b、CD5、CD51、CD52、CD54、CD56、CD6、CD70、CD74、CD79B、CD80、CEA、CFD、CGRP、ch4D5、CLDN18.2、凝集因子A、CSF1R、CSF2、CTGF、CTLA-4、DLL3、DLL4、DPP4、DR5、EGFL7、EGFR、內皮因子、EpCAM、蝶素受體A3、上皮唾蛋白(episialin)、ERBB3 (HER3)、FAP、FGF 23、纖維蛋白II、β鏈、纖維結合蛋白外域-B、葉酸水解酶、葉酸受體、Frizzled受體、GCGR、GD2神經節苷脂、GD3神經節苷脂、GDF-8、磷脂肌醇蛋白聚醣3、GM-CSF、GM-CSF受體α-鏈、GPNMB、GUCY2C、HER1、HER2/neu、HGF、HHGFR、組蛋白複合物、人類分散因子受體激酶、人類TNF、ICOSL、IFN-α、IGF1、IGF2、IGHE、IL-17A、IL-13、IL1A、IL-2、IL-6、IL-6受體、IL-8、IL-9、ILGF2、整合素α4、整合素α5β1、整合素α7 β7、整合素αvβ3、IP10、KIR2D、KLRC1、Lewis-Y抗原、MAGE-A、MCP-1、間皮素、MIF、MIG、MIP1β、MS4A1、MSLN、MUC1、黏蛋白CanAg、N-羥乙醯基神經胺酸、NOGO-A、Notch 1、Notch受體、NRP1、OX-40、PD-1、PDCD1、PDGF-R α、磷酸鈉共轉運體、磷脂醯絲胺酸、血小板源生長因子受體β、前列腺癌細胞、RHD、RON、RTN4、SDC1、sIL2Rα、SLAMF7、SOST、神經鞘胺醇-1-磷酸酯、金黃色葡萄球菌、STEAP1、TAG-72、T細胞受體、TEM1、肌腱蛋白C、TFPI、TGFβ1、TGFβ2、TGF-β、TNFR超家族成員4、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRP-1、TRP-2、TSLP、腫瘤抗原CTAA16.88、腫瘤特異性MUC1糖基化、腫瘤相關鈣信號轉導子2、TWEAK受體、TYRP1 (醣蛋白75)、VEGFA、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白及VWF。

在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，抗體為雙特異性T細胞接合子(BiTE)抗體。在一些實施例中，抗體選自包含以下之群：伊匹單抗(ipilimumab)、尼沃單抗(nivolumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、利妥昔單抗(rituximab)、TGN1412、阿侖單抗(alemtuzumab)、OKT3或其任何組合。

在一些實施例中，免疫療法包含投與細胞介素。熟習此項技術者應瞭解，可投與細胞介素以便增強免疫系統對腫瘤的攻擊，其係藉由增強免疫細胞毒性細胞的識別及殺滅來達成。在一些實施例中，細胞介素選自包含以下之群：IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-15、IL-21、IL-11、IL-12、IL-18、GM-CSF、TNFα或其任何組合。

在一些實施例中，免疫療法包含投與免疫檢查點抑制劑。熟習此項技術者應瞭解，免疫檢查點為膜性蛋白質，其阻止T細胞攻擊表現其之細胞。免疫檢查點通常由癌細胞表現，從而防止T細胞攻擊癌細胞。在一些實施例中，檢查點蛋白質包含PD-1/PD-L1及CTLA-4/B7-1/B7-2。阻斷檢查點蛋白質表明可使T細胞擺脫抑制而攻擊及殺滅癌細胞。在一些實施例中，檢查點抑制劑選自包含阻斷CTLA-4、PD-1或PD-L1之分子之群。在一些實施例中，檢查點抑制劑為抗體或其一部分。

在一些實施例中，免疫療法包含投與多醣。熟習此項技術者應瞭解，在蘑菇中發現的某些多醣增強免疫系統及其抗癌特性。在一些實施例中，多醣為β-葡聚糖或磨菇多糖。

在一些實施例中，免疫療法包含投與癌症疫苗。熟習此項技術者應瞭解，癌症疫苗使免疫系統暴露於癌症特異性抗原及佐劑。在一些實施例中，癌症疫苗選自包含以下之群：西普魯塞-T (sipuleucel-T)、GVAX、ADXS11-001、ADXS31-001、ADXS31-164、ALVAC-CEA疫苗、AC疫苗、塔力拉赫(talimogene laherparepvec)、BiovaxID、普羅瓦克(Prostvac)、CDX110、CDX1307、CDX1401、CimaVax-EGF、CV9104、DNDN、NeuVax、Ae-37、GRNVAC、塔莫淨(tarmogens)、GI-4000、GI-6207、GI-6301、ImPACT療法、IMA901、赫普考朋-L (hepcortespenlisimut-L)、斯替木瓦(Stimuvax)、DCVax-L、DCVax-直接、前列腺DCVax、CBLI、Cvac、RGSH4K、SCIB1、NCT01758328及PVX-410。

用於降低除 GM-CSF 外之細胞介素或趨化因子含量的方法

在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減小體液中之至少一種發炎相關因子的濃度。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減小血清中之至少一種發炎相關因子的濃度。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減小腦脊髓液(CSF)中之至少一種發炎相關因子的濃度。在一些實施例中，本文揭示用於減小血清中之至少一種發炎相關因子濃度的方法。在一些實施例中，本文揭示用於減小組織液中之至少一種發炎相關因子濃度的方法。在一些實施例中，本文揭示用於減小CSF中之至少一種發炎相關因子濃度的方法。在一些實施例中，血清中的至少一種發炎相關因子濃度減小。在一些實施例中，組織液中的至少一種發炎相關因子濃度減小。在一些實施例中，CSF中的至少一種發炎相關因子濃度減小。熟習此項技術者應瞭解，減小發炎相關因子濃度包含減少或抑制個體中的該發炎相關因子產生，或抑制或降低個體的免疫療法相關毒性發生率或嚴重度。在另一個實施例中，減少或抑制發炎相關因子產生包含治療免疫療法相關毒性。在另一個實施例中，減少或抑制發炎相關因子產生包含預防免疫療法相關毒性。在另一個實施例中，減少或抑制發炎相關因子含量產生包含緩解免疫療法相關毒性。在另一個實施例中，減少或抑制發炎相關因子產生包含緩解免疫療法相關毒性。

在一些實施例中，發炎相關因子為細胞介素。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減小血清中之至少一種細胞介素的濃度。在一些實施例中，抑制或降低免疫療法相關毒性的發生率或嚴重度包含減小CSF中之至少一種細胞介素的濃度。

在一些實施例中，細胞介素為hGM-CSF。在一些實施例中，細胞介素為介白素(IL) -1β。在一些實施例中，細胞介素為IL-2。在一些實施例中，細胞介素為sIL2Rα。在一些實施例中，細胞介素為IL-5。在一些實施例中，細胞介素為IL-6。在一些實施例中，細胞介素為IL-8。在一些實施例中，細胞介素為IL-10。在一些實施例中，細胞介素為IP10。在一些實施例中，細胞介素為IL-13。在一些實施例中，細胞介素為IL-15。在一些實施例中，細胞介素為腫瘤壞死因子α (TNFα)。在一些實施例中，細胞介素為干擾素γ (IFNγ)。在一些實施例中，細胞介素為γ干擾素誘導的單核球激素(MIG)。在一些實施例中，細胞介素為巨噬細胞發炎蛋白(MIP) 1β。在一些實施例中，細胞介素為C反應蛋白。在一些實施例中，降低或抑制細胞介素產生水準包含減少或抑制一種細胞介素的產生。在一些實施例中，降低或抑制細胞介素產生水準包含減少或抑制至少一種細胞介素的產生。在一些實施例中，降低或抑制細胞介素產生水準包含減少或抑制多種細胞介素的產生。

在一個態樣中，本發明提供一種用於降低除GM-CSF外之細胞介素或趨化因子在發生免疫療法相關毒性之個體中之含量的方法，該方法包含向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑，其中該細胞介素或趨化因子之含量相較於其在同型對照抗體投與之個體發生免疫療法相關毒性期間的含量降低。在一些實施例中，免疫療法包含授受性細胞轉移、投與單株抗體、投與癌症疫苗、T細胞接合療法或其任何組合。在某些實施例中，授受性細胞轉移包含投與表現嵌合抗原受體的T細胞(CAR T細胞)、經T細胞受體(TCR)修飾之T細胞、腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)、經嵌合抗原受體(CAR)修飾之自然殺手細胞，或樹突狀細胞，或其任何組合。在一些實施例中，CAR-T細胞為CD19 CAR-T細胞。在某些實施例中，重組GM-CSF拮抗劑為hGM-CSF拮抗劑。在各種實施例中，重組GM-CSF拮抗劑為抗GM-CSF抗體。在特定實施例中，抗GM-CSF抗體結合人類GM-CSF。在其他實施例中，抗GM-CSF抗體結合靈長類動物GM-CSF，如上文所述。在一些實施例中，抗GM-CSF抗體結合哺乳動物GM-CSF。在某些實施例中，抗GM-CSF抗體為抗hGM-CSF抗體。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體為單株抗體。在各種實施例中，抗hGM-CSF抗體為抗體片段，亦即，Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或dAB。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體為人類GM-CSF中和抗體。在某些實施例中，抗hGM-CSF抗體為重組或嵌合抗體。在一些實施例中，抗hGM-CSF抗體為人類抗體。在特定實施例中，細胞介素或趨化因子為選自由以下組成之群的人類細胞介素或趨化因子：IP-10、IL-2、IL-3、IL-5、IL-1Ra、VEGF、TNF-α、FGF-2、IFN-γ、IL-12p40、IL-12p70、sCD40L、MDC、MCP-1、MIP-1a、MIP-1b或其組合，如實例22中所展現。在一些實施例中，細胞介素或趨化因子選自由以下組成之群：IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-9、IL-10、IP-10、KC、MCP-1、MIP或其組合(參見實例22)。在某些實施例中，個體患有急性淋巴母細胞白血病。

在一個實施例中，本文所揭示之方法不影響免疫療法的功效。在另一個實施例中，本文所揭示之方法使免疫療法的功效降低小於約5%。在另一個實施例中，本文所揭示之方法使免疫療法的功效降低小於約10%。在另一個實施例中，本文所揭示之方法使免疫療法的功效降低小於約15%。在另一個實施例中，本文所揭示之方法使免疫療法的功效降低小於約20%。在另一個實施例中，本文所揭示之方法使免疫療法的功效降低小於約50%。

在一個實施例中，本文所述的方法增強免疫療法的功效。在一個實施例中，增強功效允許改善免疫療法的臨床管理、患者結果及治療指數。在另一個實施例中，功效增強能夠使免疫療法以更高劑量投與。在另一個實施例中，功效增強使住院滯留及額外的治療及監測減少。在一個實施例中，免疫療法包含CAR-T。

任何適當的細胞毒性定量方法可用於測定免疫療法功效是否實質上保持不變。舉例而言，細胞毒性可利用基於細胞培養物之分析加以定量，諸如實例中所述的細胞毒性分析。細胞毒性分析可利用將死細胞之DNA優先染色的染料。在其他情況下，可使用量測細胞群中之活細胞及死細胞之相對數的螢光及發光分析。就此類分析而言，蛋白酶活性充當細胞存活率及細胞毒性的標記，且經標記的細胞可滲透肽產生與樣品中之活細胞數成比例的螢光信號。在另一個實施例中，細胞毒性的量測可為定性的。在另一個實施例中，細胞毒性的量測可為定量的。

在一個實施例中，該增強的功效包含增強的CAR-T細胞擴增、抑制T細胞功能之骨髓源抑制細胞(MDSC)的數目及/或活性減少、與檢查點抑制劑的協同作用，或其任何組合。在另一個實施例中，相較於對照組，該增強的CAR-T細胞擴增包含至少50%增幅。在另一個實施例中，相較於對照組，該增強的CAR-T細胞擴增包含至少四分之一的對數擴增。在另一個實施例中，相較於對照組，該增強的細胞擴增包含至少二分之一的對數擴增。在另一個實施例中，相較於對照組，該增強的細胞擴增包含至少一個對數擴增。在另一個實施例中，相較於對照組，該增強的細胞擴增包含大於一個對數擴增。

在一個實施例中，免疫療法相關毒性出現於免疫療法投與之後的第2天至第4週之間。在一個實施例中，免疫療法相關毒性出現於免疫療法投與之後的第0天至第2天之間。在一些實施例中，hGM-CSF拮抗劑作為預防，與免疫療法同時投與個體。在另一個實施例中，免疫療法投與之後的第0至2天，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之後的第2至3天，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之後的第7天，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之後的第10天，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之後的第14天，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之後的第2至24天，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。

在另一個實施例中，免疫療法投與之後的第2至3小時，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之後的第7小時，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之後的第10小時，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一實施例中，免疫療法投與之後的第14小時，向個體投與GM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之後的第2至24小時，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。

在一替代性實施例中，hGM-CSF拮抗劑作為預防，在免疫療法之前投與個體。在另一個實施例中，免疫療法投與之前的第1天，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之前的第2至3天，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之前的第7天，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之前的第10天，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之前的第14天，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之前的第2至24天，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。

在另一個實施例中，免疫療法投與之前的第2至3小時，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之前的第7小時，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之前的第10小時，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之前的第14小時，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。在另一個實施例中，免疫療法投與之前的第2至24小時，向個體投與hGM-CSF拮抗劑。

在另一個實施例中，免疫療法相關毒性已發生後，可在治療上投與hGM-CSF拮抗劑。在一個實施例中，偵測到病理生理學過程引起或證實免疫療法相關毒性開始後，可投與hGM-CSF拮抗劑。在一個實施例中，hGM-CSF拮抗劑可終止病理生理學過程且避免其後遺症。在一些實施例中，病理生理學過程包含以下中之至少一者：血清中的細胞介素濃度增加、CSF中的細胞介素濃度增加、血清中的C反應蛋白(CRP)增加、血清中的鐵蛋白增加、血清中的IL-6增加、內皮細胞活化、播散性血管內凝血(DIC)、ANG2血清濃度增加、血清中的ANG2:ANG1比率增加、CSF中存在CAR T細胞、血清馮威里氏因子(Von Willebrand factor，VWF)濃度增加、血腦障壁(BBB)滲漏，或其任何組合。

在另一個實施例中，hGM-CSF拮抗劑可在多個時間點治療性投與。在另一個實施例中，hGM-CSF拮抗劑至少在兩個時間點投與。在另一個實施例中，hGM-CSF拮抗劑至少在三個時間點投與。

在一個實施例中，hGM-CSF拮抗劑投與一次。在另一個實施例中，hGM-CSF拮抗劑投與兩次。在另一個實施例中，hGM-CSF拮抗劑投與三次。在另一個實施例中，hGM-CSF拮抗劑投與四次。在另一個實施例中，hGM-CSF拮抗劑投與至少四次。在另一個實施例中，hGM-CSF拮抗劑投與超過四次。

熟習此項技術者應瞭解，藉由不同療法管控免疫療法相關毒性。在一些實施例中，hGM-CSF拮抗劑與其他療法共投與。在一些實施例中，其他療法選自包含以下之群：針對細胞介素的療法、抗IL-6療法、皮質類固醇、托西利單抗(tocilizumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、低劑量血管升壓劑、心肌收縮劑、補充氧、利尿、胸腔穿刺術、抗癲癇劑、苯并二氮呯(benzodiazepines)、左乙拉西坦(levetiracetam)、苯巴比妥(phenobarbital)、過度換氣、高滲壓療法，及特定器官毒性的標準療法。

在一些實施例中，免疫療法相關毒性包含腦疾病、損傷或功能障礙。在一些實施例中，免疫療法相關毒性包含CAR T細胞相關NT。在一些實施例中，免疫療法相關毒性包含CAR T細胞相關的腦病變症候群(CRES)。在一些實施例中，本文提供用於抑制或降低腦疾病、損傷或功能障礙之發生率的方法。

在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含緩解頭痛。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含緩解譫妄。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少焦慮。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少震顫。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少癲癇活動。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少意識模糊。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少清醒狀態的變化。

在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少幻覺。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少語言障礙。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少共濟失調。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少精神性運動不能。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含緩解面神經麻痹。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少運動無力。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少癲癇發作。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少非痙攣性EEG癲癇發作。在一些實施例中，抑制或降低CRES之發生率或嚴重度包含改善昏迷恢復。

在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率或嚴重度包含減少內皮細胞活化。熟習此項技術者應瞭解，內皮細胞活化為內皮細胞的發炎及促凝狀態，其特徵為與白血球的相互作用增強。

在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少血管滲漏。術語「血管滲漏」與術語「血管滲漏症候群」及「毛細血管滲漏症候群」可互換使用，其皆具有相同特性及含義。熟習此項技術者應瞭解，血管滲漏與內皮細胞的間隔相關，該間隔使血漿滲漏且讓發炎細胞跨內皮遷移至身體組織中，導致組織及器官損傷。另外，嗜中性白血球可導致微循環閉塞，引起組織灌流減少。在一些實施例中，降低CRES發生率包含減少血管內凝血。

在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少至少一種循環細胞介素的濃度。在一些實施例中，細胞介素選自包含以下之群：hGM-CSF、IFNγ、IL-1、IL-15、IL-6、IL-8、IL-10及IL-2。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少血清ANG2濃度。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少血清中的ANG2:ANG1比率。

在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含降低CRES級別。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含改善CARTOX-10分數。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少顱內壓升高。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少癲癇發作。在一些實施例中，抑制或降低CRES發生率包含減少運動無力。

在一些實施例中，免疫療法相關毒性包含CAR T細胞相關CRS。在一些實施例中，本文提供用於抑制或降低CRS及/或NT發生率或嚴重度的方法。

在一些實施例中，抑制或降低CRS或NT發生率包含(不限於)緩解發熱(伴有或不伴有僵直、不適、疲勞、厭食症、肌痛、關節痛、噁心、嘔吐、頭痛、皮疹、腹瀉、呼吸急促、低血氧症、低氧症、休克、心血管心搏過速、脈搏壓增寬、低血壓、毛細血管滲漏、早期心輸出量增加、後期心輸出量減弱、D-二聚體升高、低纖維素原血症伴有或不伴有出血、氮質血症、轉胺酶升高、高膽紅素血症、精神狀態變化、意識模糊、譫妄、弗蘭克失語症、幻覺、震顫、辨距障礙、步態變化、癲癇發作、器官衰竭，或其任何組合，或此項技術中已知與CRS相關的任何其他症狀或特徵。

在一些實施例中，抑制或降低CRS發生率包含減少至少一種循環細胞介素的濃度。在一些實施例中，細胞介素選自包含以下之群：GM-CSF、IFNγ、IL-1、IL-15、IL-6、IL-8、IL-10及IL-2。

在一些實施例中，抑制或降低CRS發生率包含降低CRS級別。在一些實施例中，抑制或降低NT發生率包含降低NT級別。在一些實施例中，抑制或降低CRS發生率包含改善CARTOX-10分數。在一些實施例中，抑制或降低NT發生率包含改善CARTOX-10分數。在一些實施例中，抑制或降低CRS發生率包含減少顱內壓升高。在一些實施例中，抑制或降低CRS發生率包含減少癲癇發作。在一些實施例中，抑制或降低CRS發生率包含減少運動無力。在一些實施例中，抑制或降低NT或CRS發生率包含將發生率抑制或減少至小於60%。在一些實施例中，抑制或降低NT或CRS發生率包含將發生率抑制或降低至小於50%。在一些實施例中，抑制或降低NT或CRS發生率包含將發生率抑制或降低至小於40%。在一些實施例中，抑制或降低NT或CRS發生率包含將發生率抑制或降低至小於30%。在一些實施例中，抑制或降低NT或CRS發生率包含將患者的發生率抑制或降低至小於20%。在一些實施例中，抑制或降低NT或CRS發生率包含消除NT或CRS。

在一些實施例中，個體出現1級CRS及/或NT。在一些實施例中，個體出現2級CRS及/或NT。在一些實施例中，個體出現3級CRS及/或NT。在一些實施例中，個體出現4級CRS及/或NT。在一些實施例中，個體存在上述者的任何組合。

在一些實施例中，抑制或降低NT或CRS發生率包含降低CRS級、NT級或兩者。在一些實施例中，95%患者的級別降低至≤3 NT及/或CRS。

在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後出現高於37℃的體溫。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後出現高於38℃的體溫。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後出現高於39℃的體溫。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後出現高於40℃的體溫。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後出現高於41℃的體溫。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後出現高於42℃的體溫。

在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清IL-6濃度高於10 pg/mL。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清IL-6濃度高於12 pg/mL。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清IL-6濃度高於14 pg/mL。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清IL-6濃度高於16 pg/mL。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清IL-6濃度高於18 pg/mL。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清IL-6濃度高於20 pg/mL。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清IL-6濃度高於22 pg/mL。

在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清MCP-1濃度高於200 pg/ml。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清MCP-1濃度高於400 pg/ml。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清MCP-1濃度高於600 pg/ml。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清MCP-1濃度高於800 pg/ml。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清MCP-1濃度高於1000 pg/ml。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清MCP-1濃度高於1200 pg/ml。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清MCP-1濃度高於1400 pg/ml。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清MCP-1濃度高於1600 pg/ml。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清MCP-1濃度高於1800 pg/ml。在一些實施例中，個體在免疫療法投與之後的血清MCP-1濃度高於2000 pg/ml。

在一些實施例中，個體患有1級CRES。在一些實施例中，個體患有2級CRES。在一些實施例中，個體患有3級CRES。在一些實施例中，個體患有4級CRES。

在一些實施例中，個體在免疫療法之前，易患腦疾病、損傷或功能障礙。在一些實施例中，易患病的體質為遺傳的。在一些實施例中，易患病的體質為後天的。在一些實施例中，易患病的體質與現有的醫學病狀有關。在一些實施例中，在免疫療法之前，診斷出易患病的體質。在一些實施例中，未診斷出易患病的體質。在一些實施例中，個體經歷醫學評價以便在免疫療法之前確定是否易患免疫療法相關的腦疾病、損傷或功能障礙。

在一些實施例中，醫學評價包含測定體液中的ANG1濃度。在一些實施例中，醫學評價包含測定血清中的ANG1濃度。在一些實施例中，醫學評價包含測定體液中的ANG2濃度。在一些實施例中，醫學評價包含測定血清中的ANG2濃度。在一些實施例中，醫學評價包含計算血清中的ANG2:ANG1比率。在一些實施例中，血清ANG2:ANG1比率在免疫療法之前高於0.5的個體易患CRES。在一些實施例中，血清ANG2:ANG1比率在免疫療法之前高於0.7的個體易患CRES。在一些實施例中，血清ANG2:ANG1比率在免疫療法之前高於0.9的個體易患CRES。在一些實施例中，血清ANG2:ANG1比率在免疫療法之前高於1的個體易患CRES。在一些實施例中，血清ANG2:ANG1比率在免疫療法之前高於1.1的個體易患CRES。在一些實施例中，血清ANG2:ANG1比率在免疫療法之前高於1.3的個體易患CRES。在一些實施例中，血清ANG2:ANG1比率在免疫療法之前高於1.5的個體易患CRES。

在一些實施例中，免疫療法相關毒性包含噬血細胞性淋巴組織細胞增生症(HLH)。在一些實施例中，免疫療法相關毒性包含巨噬細胞活化症候群(MAS)。在一些實施例中，本文提供用於抑制或降低HLH發生率的方法。在一些實施例中，本文提供用於抑制或降低MAS發生率的方法。

在一些實施例中，抑制或降低HLH發生率包含延長個體存活期。在一些實施例中，抑制、降低HLH發生率包含延長復發時間。在一些實施例中，抑制或降低MAS發生率包含延長個體存活期。在一些實施例中，抑制、降低MAS發生率包含延長復發時間。

在一些實施例中，抑制或降低HLH或MAS發生率包含抑制巨噬細胞活化及/或增殖。在一些實施例中，抑制或降低HLH或MAS發生率包含抑制T淋巴球活化及/或增殖。在一些實施例中，抑制或降低HLH或MAS發生率包含減小循環IFNγ濃度。在一些實施例中，抑制或降低HLH或MAS發生率包含減小循環GM-CSF濃度。

在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現發熱。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現脾腫大。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現細胞減少症。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現兩種或更多種細胞株的細胞減少症。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現高三酸甘油酯血症。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現低纖維素原血症。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現紅血球吞噬症。在一些實施例中，觀測到骨髓出現紅血球吞噬症。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現低NK細胞活性。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現NK活性缺乏。

在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現高於100 U/ml的鐵蛋白血清濃度。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現高於300 U/ml的鐵蛋白血清濃度。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現高於500 U/ml的鐵蛋白血清濃度。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現高於700 U/ml的鐵蛋白血清濃度。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現高於900 U/ml的鐵蛋白血清濃度。

在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現高於1200 U/ml的可溶性CD25血清濃度。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現高於1500 U/ml的可溶性CD25血清濃度。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現高於1800 U/ml的可溶性CD25血清濃度。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現高於2000 U/ml的可溶性CD25血清濃度。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現高於2200 U/ml的可溶性CD25血清濃度。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現高於2400 U/ml的可溶性CD25血清濃度。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現高於2700 U/ml的可溶性CD25血清濃度。在一些實施例中，個體在免疫療法之後出現高於3000 U/ml的可溶性CD25血清濃度。

在一些實施例中，個體易患HLH。在一些實施例中，易患病的體質為遺傳的。在一些實施例中，易患病的體質與現有的醫學病狀有關。熟習此項技術者應瞭解，偶發性HLH已與多種基因突變相關。在一些實施例中，個體之選自PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2或RAB27A或其任何組合的基因中攜帶突變。在一些實施例中，個體中的穿孔素表現減少或缺乏。 hGM-CSF 拮抗劑

hGM-CSF拮抗劑藉由促使hGM-CSF對受體的結合減少而適用於選擇性地干擾對hGM-CSF受體信號傳導的誘導。此類拮抗劑可包括結合hGM-CSF受體的抗體、結合至hGM-CSF、GM-CSF類似物(諸如E21R)的抗體，及與hGM-CSF競爭結合至其受體或抑制通常由配位體結合至受體而引起之信號傳導的其他蛋白質或小分子。

在多個實施例中，本發明使用的hGM-CSF拮抗劑為與hGM-CSF競爭結合至受體、但無活性的多肽，例如抗hGM-CSF抗體、抗hGM-CSF受體抗體、可溶性hGM-CSF受體，或經修飾之GM-CSF多肽。此類蛋白質通常利用重組表現技術產生。此類方法在此項技術中已廣為人知。通用分子生物學方法，包括表現方法，可發現於例如說明手冊中，諸如Sambrook及Russell (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Current Protocols in Molecular Biology (2006) John Wiley and Sons ISBN: 0-471-50338-X。

多種基於原核及/或真核之蛋白質表現系統可用以產生hGM-CSF拮抗劑蛋白質。諸多此類系統廣泛獲自商業供應商。 hGM-CSF 抗體

本發明的hGM-CSF抗體為以高親和力結合至hGM-CSF的抗體且為hGM-CSF拮抗劑。抗體包含與人類生殖系V _H及V _L序列高度一致的可變區。在較佳實施例中，本發明抗體之CDRH3中的BSD序列包含胺基酸序列RQRFPY (SEQ ID NO: 12)或RDRFPY。CDRL3中的BSD包含FNK或FNR。

產生完整V區域，其中BSD形成CDR3的一部分且使用其他序列完成CDR3且添加FR4序列。典型地，CDR3之不包括BSD的部分及完整FR4包含人類生殖系序列。在一些實施例中，在各條鏈上，不包括BSD之CDR3-FR4序列與人類生殖系序列相差不超過2個胺基酸。在一些實施例中，J段包含人類生殖系J段。人類生殖系序列可經由例如公開可用的國際ImMunoGeneTics資料庫(IMGT)及V-base (全球資訊網vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)測定。

人類生殖系V段譜系係由51個重鏈V區、40 K輕鏈V段及31個λ輕鏈V段組成，從而產生總共3,621個生殖系V區對，另外，此等V段中大部分存在穩定的對偶基因變異體，但此等變異體對生殖系譜系之結構多樣性的貢獻有限。所有人類生殖系V段基因的序列已知且可在英國劍橋MRC蛋白質工程技術中心(MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, United Kingdom)提供的V-base資料庫中存取(亦參見Chothia等人, 1992, J Mol Biol227:776-798; Tomlinson等人, 1995, EMBO J14:4628-4638；及Williams等人, 1996, J Mol Biol264:220-232)。

如本文所述的抗體或抗體片段可表現於原核或真核微生物系統或高等真核細胞中，諸如哺乳動物細胞。

本發明使用的抗體可呈任何形式。舉例而言，在一些實施例中，抗體可為包括恆定區(例如人類恆定區)的完整抗體，或可為完整抗體的片段或衍生物，例如Fd、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、Fv片段或單域抗體，諸如奈米抗體或駱駝抗體。此類抗體可另外藉由熟習此項技術者熟知的方法、以重組方式加以工程改造。如上文所提及，此類抗體可利用已知技術產生。

在一些實施例中，hGM-CSF拮抗劑為結合至hGM-CSF的抗體或結合至hGM-CSF受體α或β亞單元的抗體。抗體可針對hGM-CSF (或hGM-CSF受體)蛋白質或片段產生，或以重組方式產生。本發明使用的GM-CSF抗體可為中和抗體或可為非中和抗體，其結合GM-CSF且提高hGM-CSF的活體內清除速率，使得循環中的hGM-CSF含量降低。hGM-CSF抗體通常為中和抗體。

多株抗體製備方法已為熟習此項技術者所知(例如Harlow及Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); Methods in Immunology)。可藉由在哺乳動物中一或多次注射免疫藥劑及必要時的佐劑來產生多株抗體。免疫藥劑包括GM-CSF或GM-CSF受體蛋白，例如人類GM-CSF或GM-CSF受體蛋白或其片段。

在一些實施例中，本發明使用的GM-CSF抗體係自人類血漿中純化。在此類實施例中，GM-CSF抗體典型地為與存在於人類血漿中之其他抗體分離的多株抗體。此類分離程序可利用例如已知技術(諸如親和層析)執行。

在一些實施例中，GM-CSF拮抗劑為單株抗體。單株抗體可使用融合瘤方法製備，諸如Kohler及Milstein, Nature 256:495 (1975)所述的彼等方法。在融合瘤方法中，小鼠、倉鼠或其他適當宿主動物典型地用免疫藥劑(諸如人類GM-CSF)免疫以誘使淋巴球產生或能夠產生將特異性結合至該免疫藥劑的抗體。或者，淋巴球可在活體外免疫接種。免疫藥劑較佳包括人類GM-CSF蛋白質、其片段或其融合蛋白。

人類單株抗體可利用此項技術中已知的各種技術產生，包括噬菌體呈現文庫(Hoogenboom及Winter, J. MoI. Biol. 227:381 (1991)；Marks等人, J. MoI. Biol. 222:581 (1991))。Cole等人及Boerner等人的技術亦可用於製備人類單株抗體(Cole等人, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 第77頁(1985)及Boerner等人, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991))。類似地，可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入轉殖基因動物(例如其中內源免疫球蛋白基因已部分或完全不活化的小鼠)來製備人類抗體。攻毒之後，觀測人類抗體產生，其在所有方面與人類中所見緊密類似，包括基因重排、組裝及抗體譜系。此方法描述於例如美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號；及以下科學出版物中：Marks等人, Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg等人, Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild等人, Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg及Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)。

在一些實施例中，抗GM-CSF抗體為嵌合或人類化單株抗體。如上文所指出，抗體的人類化形式為嵌合免疫球蛋白，其中來自人類抗體之互補決定區(CDR)的殘基置換為來自具有所需特異性、親和力及能力之非人類物種(諸如小鼠、大鼠或兔)之CDR的殘基。

在本發明之一些實施例中，抗體另外經工程改造以減少免疫原性，例如使得抗體適於重複投與。用於產生免疫原性減少之抗體的方法包括人類化/人類工程化程序及修飾技術，諸如去免疫，其中抗體進一步經工程改造，例如在一或多個構架區中經工程改造，以移除T細胞抗原決定基。

在一些實施例中，抗體為人類工程化抗體。人類工程化抗體為如下獲得的具有參考抗體之結合特異性的經工程改造之人類抗體：將編碼來自參考抗體重鏈CDR3區之結合特異性決定子(BSD)的DNA序列與人類VH段序列接合且將來自參考抗體的輕鏈CDR3 BSD與人類VL段序列接合。人類工程化方法提供於美國專利申請公開案第20050255552號及美國專利申請公開案第20060134098號中。大腸桿菌無信號分泌抗體片段的方法描述於美國專利申請案20070020685中。

抗體可進一步去免疫化，以自抗體的V區移除一或多個預測的T細胞抗原決定基。此類程序描述於例如WO 00/34317中。

重鏈恆定區通常為γ鏈恆定區，例如γ-1、γ-2、γ-3或γ-4恆定區。在一些實施例中，例如在抗體為片段的情況下，可使抗體與另一種分子偶聯，例如以提供延長的活體內半衰期，諸如聚乙二醇(聚乙二醇化)或血清白蛋白。抗體片段聚乙二醇化之實例提供於Knight等人(2004) Platelets 15: 409 (對於阿昔單抗(abciximab)); Pedley等人(1994) Br. J. Cancer 70: 1126 (對於抗CEA抗體); Chapman等人(1999) Nature Biotech. 17 : 780。

本發明使用的抗體結合至hGM-CSF或hGM-CSF受體。可利用任何數目種技術測定抗體結合特異性。關於可用於測定抗體之特異性免疫反應性之免疫分析形式及條件的描述，參見例如Harlow及Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)。

適用於本發明的例示性抗體為cl9/2 (小鼠/人類嵌合抗hGM-CSF抗體)。在一些實施例中，使用與cl9/2競爭結合至相同抗原決定基或與cl9/2結合相同抗原決定基的單株抗體。特定抗體與另一種抗體識別相同抗原決定基的能力典型地依據第一抗體競爭性地抑制第二抗體結合至抗原的能力測定。可使用多種競爭性結合分析中的任一者量測兩種抗體之間針對相同抗原的競爭。舉例而言，夾心ELISA分析可用於此目的。此係藉由使用捕捉抗體塗佈孔表面來進行。接著將亞飽和濃度的經標記抗原添加至捕捉表面。此蛋白質將經由特異性抗體-抗原決定基相互作用結合至抗體。洗滌之後，將已與可偵測部分(例如HRP，其中經標記的抗體定義為偵測抗體)共價連接的第二抗體添加至ELISA中。若此抗體與捕捉抗體識別相同抗原決定基，則其不能結合至靶蛋白，原因在於該特定抗原決定基將不再可供結合利用。然而，若此第二抗體識別靶蛋白上的不同抗原決定基，則其能夠結合且可使用相關受質、藉由定量活性程度(及因此定量所結合的抗體)來偵測此結合。藉由使用單一抗體作為捕捉抗體與偵測抗體來定義背景，而最大信號可藉由用抗原特異性抗體捕捉及用針對抗原上之標籤的抗體偵測來建立。藉由使用背景及最大信號作為參考，可以逐對方式評估抗體以測定抗原決定基特異性。

使用上述任一種分析，若第二抗體在第一抗體存在下對抗原的結合被減少至少30%，通常至少約40%、50%、60%或75%，且通常至少約90%，則第一抗體被視為競爭性地抑制第二抗體的結合。

在本發明之一些實施例中，採用與已知抗體(例如cl9/2)競爭結合或結合至相同抗原決定基的抗體。抗原決定基定位方法在此項技術中已熟知。舉例而言，一種對人類顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(hGM-CSF)之功能活性區進行定位的方法為對中和抗hGM-CSF單株抗體所識別的抗原決定基進行定位。舉例而言，已使用藉由酶消化細菌合成之hGM-CSF所得的蛋白水解片段定義cl9/2 (中和抗體LMM 102具有相同可變區)所結合的抗原決定基(Dempsey等人, Hybridoma 9:545-558, 1990)。對胰蛋白酶消化物進行的RP-HPLC部分分離能夠鑑別含有66種胺基酸的免疫反應性「胰蛋白酶核心」肽(蛋白質的52%)。利用金黃色葡萄球菌V8蛋白酶對此「胰蛋白酶核心」進一步消化，產生獨特的免疫反應性hGM-CSF產物，其包含兩種肽：藉由殘基88與121之間的二硫鍵連接的殘基86-93及112-127。抗體不識別個別肽。

在一些實施例中，適用於本發明的抗體對人類GM-CSF或hGM-CSF受體呈現高親和力結合。若抗體的解離常數(KD)＜約10 nM，典型地＜1 nM且較佳＜100 pM，則抗體與抗原之間存在高親和力結合。在一些實施例中，抗體具有約10 ^-4/秒或更好的解離速率。

如熟習此項技術者已熟知，可使用多種方法測定抗體對其靶抗原之結合親和力，諸如表面電漿子共振分析、飽和分析或諸如ELISA或RIA之免疫分析。用於測定結合親和力之例示性方法為在使用CM5感測晶片之BIAcore™ 2000儀器(Biacore AB, Freiburg, Germany)上進行表面電漿子共振分析，如Krinner等人, (2007) Mol. Immunol. 2月; 44(5):916-25 (2006年5月電子出版H)所述。

在一些實施例中，hGM-CSF拮抗劑為hGM-CSF中和抗體、其受體或其受體亞單元，其以干擾hGM-CSF結合至其受體或受體亞單元的方式結合。在一些實施例中，用於本發明的抗hGM-CSF抗體抑制對hGM-CSF受體α亞單元的結合。此類抗體可例如在其中hGM-CSF結合至受體且從而抑制結合之區域結合至hGM-CSF。在另一實施例中，抗hGM-CSF抗體抑制hGM-CSF發揮作用而不阻斷其結合至hGM-CSF受體α亞單元。 II. 重鏈

本發明抗hGM-CSF抗體的重鏈包含含有以下元件的重鏈V區： 1) 包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的人類重鏈V段序列 2) 包含胺基酸序列R(Q/D)RFPY的CDRH3區域 3) 人類生殖系J-基因段貢獻的FR4。

支持結合至hGM-CSF之V段序列與上述CDR3-FR4段以及互補V _L區組合的實例顯示於圖1中。V段可例如來自人類VH1亞類。在一些實施例中，V段為人類V _H1亞類段，其與生殖系段VH1 1-02 (SEQ ID NO: 19)或VH1 1-03 (SEQ ID NO: 20)具有高度的胺基酸序列一致性，例如至少80%、85%或90%或更大一致性。在一些實施例中，V段與VH1 1-02或VH1 1-03相差不超過15個殘基且較佳不超過7個殘基。

本發明抗體的FR4序列係由人類JH1、JH3、JH4、JH5或JH6基因生殖系段或與人類生殖系JH段具有高度胺基酸序列一致性的序列提供。在一些實施例中，J段為人類生殖系JH4序列。

CDRH3亦包含來源於人類J段的序列。典型地，不包括BSD之CDRH3-FR4序列與人類生殖系J段相差不超過2個胺基酸。在典型實施例中，CDRH3中的J段序列來自用於FR4序列的相同J段。因此，在一些實施例中，CDRH3-FR4區域包含BSD及完整的人類JH4生殖系基因段。CDRH3與FR4序列的例示性組合顯示於下文中，其中BSD為粗體且人類生殖系J段JH4殘基加有下劃線：

在一些實施例中，本發明抗體包含與生殖系段VH 1-02或VH1-03或與圖1中所示之V _H區中的一個V段(諸如VH#1、VH#2、VH#3、VH#4或VH#5的V段部分)至少90%一致或至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的V段。

在一些實施例中，V _H區中的V段具有如圖1中所示的CDR1及/或CDR2。舉例而言，本發明抗體可含有具有序列GYYMH (SEQ ID NO: 24)或NYYIH (SEQ ID NO:25)的CDR1；或具有序列WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 26)或WINAGNGNTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 27)的CDR2。

在特定實施例中，抗體具有均來自圖1中所示之V _H區V段之一的CDR1與CDR2，及包含R(Q/D)RFPY (SEQ ID NO: 22)、例如RDRFPYYFDY (SEQ ID NO: 16)或RQRFPYYFDY (SEQ ID NO: 15)的CDR3。因此，在一些實施例中，本發明之抗GM-CSF抗體可例如含有具有序列R(Q/D)RFPYYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 23)的CDR3-FR4及如圖1中所示的CDR1及/或CDR2。

在一些實施例中，本發明抗體的V _H區含有具有結合特異性決定子R(Q/D)RFPY的CDR3、來自人類生殖系VH1段的CDR2或來自人類生殖系VH1的CDR1。在一些實施例中，CDR1與CDR2來自人類生殖系VH1段。 III. 輕鏈

本發明抗hGM-CSF抗體的輕鏈包含含有以下元件的輕鏈V區： 1) 包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3的人類輕鏈V段序列 2) 包含序列FNK或FNR (例如QQFNRSPLT (SEQ ID NO:28)或QQFNKSPLT (SEQ ID NO: 18))的CDRL3區 3) 人類生殖系J-基因段貢獻的FR4。

V _L區包含Vλ或Vκ V段。支持結合之Vκ序列與互補V _H區組合的實例提供於圖1中。

V _L區CDR3序列包含J段衍生的序列。在典型實施例中，CDRL3中的J段序列來自用於FR4的相同J段。因此，在一些實施例中，該序列與來自人類κ生殖系V段及J段序列相差可不超過2個胺基酸。在一些實施例中，CDRL3-FR4區包含BSD及完整的人類JK4生殖系基因段。下文顯示κ鏈的例示性CDRL3-FR4組合，其最小必需結合特異性決定子以粗體顯示且JK4序列加有下劃線：

Vκ段為VKIII亞類特有的。在一些實施例中，該等區段與人類生殖系VKIII亞類具有至少80%序列一致性，例如與人類生殖系VKIIIA27 (SEQ ID NO: 21)序列具有至少80%一致性。在一些實施例中，Vκ段與VKIIIA27 (SEQ ID NO: 21)相差可不超過18個殘基。在其他實施例中，本發明抗體的V _L區V段與圖1中所示之人類κ V _L區V段序列具有至少85%一致性或至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性，例如VK#1 (SEQ ID NO: 6)、VK#2 (SEQ ID NO: 7)、VK#3 (SEQ ID NO: 8)或VK#4 (SEQ ID NO: 9)的V段序列。

在一些實施例中，可變區包含人類V-基因序列。舉例而言，可變區序列與人類生殖系V-基因序列可具有至少80%一致性或至少85%一致性、至少90%一致性、至少95%一致性、至少96%一致性、至少97%一致性、至少98%一致性或至少99%一致性或更大一致性。

在一些實施例中，V _L區中的V段具有如圖1中所示的CDR1及/或CDR2。舉例而言，本發明抗體可具有CDR1序列RASQSVGTNVA (SEQ ID NO:31)或RASQSIGSNLA (SEQ ID NO:32)、RASQS(V/I)G(T/S)N(V/L)A (SEQ ID NO: 39)；或CDR2序列STSSRAT (SEQ ID NO: 33)。

在特定實施例中，本發明之抗GM-CSF抗體可具有CDR1與CDR2的組合，如圖1中所示之V _L區的一個V段所示；以及包含FNK或FNR的CDR3序列，例如CDR3可為QQFNKSPLT (SEQ ID NO: 18)或QQFNRSPLT (SEQ ID NO: 28)。在一些實施例中，此類GM-CSF抗體可包含FR4區FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 34)。因此，本發明之抗GM-CSF抗體可包含例如均來自圖1中所示之V _L區之一的CDR1與CDR2；及CDR3-FR4區FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 34)。 IV. hGM-CSF 抗體製備

本發明抗體可包含如圖1中所示之V _H區VH#1、VH#2、VH#3、VH#4或VH#5中的任一者。在一些實施例中，本發明抗體可包含如圖1中所示之V _L區VK#1、VK#2、VK#3或VK#4中的任一者。在一些實施例中，抗體具有如圖1中所示的V _H區VH#1、VH#2、VH#3、VH#4或VH#5；及如圖1中所示的V _L區VK#1、VK#2、VK#3或VK#4，如例如美國專利第8,168,183號及第9,017, 674號所述，該等專利各自以全文引用的方式併入本文中。

可測試抗體以證實抗體保持拮抗hGM-CSF活性的活性。可利用任何數目個終點測定拮抗劑活性，包括增殖分析。可使用評估hGM-CSF功能的任何數目種分析鑑別或評價中和抗體及其他hGM-CSF拮抗劑。舉例而言，對於hGM-CSF受體信號傳導，宜使用基於細胞之分析，諸如測定hGM-CSF依賴性細胞株作為有限量之hGM-CSF的反應而增殖之速率的分析。人類TF-1細胞株適用於此類分析中。參見Krinner等人 ,(2007) Mol. Immunol 。在一些實施例中，當使用刺激90%最大TF-I細胞增殖的hGM-CSF濃度時，本發明之中和抗體將hGM-CSF刺激的TF-I細胞增殖抑制至少50%。因此，典型地，本發明使用的中和抗體或其他hGM-CSF拮抗劑具有小於10 nM的EC50 (例如表 2)。適用於鑑別適用於本發明之中和抗體的其他分析為熟習此項技術者所熟知。在其他實施例中，中和抗體對hGM-CSF刺激之增殖的抑制為嵌合c19/2抗體(例如WO03/068920)之拮抗劑活性的至少約75%、80%、90%、95%或100%，該嵌合抗體具有小鼠單株抗體LMM102的可變區及CDR。

適用作hGM-CSF拮抗劑的例示性嵌合抗體為cl9/2。c19/2抗體以約l0 pM的單價結合親和力結合hGM-CSF，如藉由表面電漿子共振分析所測定。cl9/2抗體的重鏈及輕鏈可變區序列已知(例如WO03/068920)。如根據Kabat所定義的CDR為：

CDR亦可利用此項技術中的其他熟知定義加以測定，例如Chothia、國際ImMunoGeneTics資料庫(IMGT)及AbM。

在一些實施例中，本發明所用的抗體與cl9/2競爭結合至，或結合至相同抗原決定基。cl9/2所識別的GM-CSF抗原決定基經鑑別為具有兩種肽的產物：殘基86-93及殘基112-127，殘基88與121之間藉由二硫鍵連接。當用0.5 ng/ml GM-CSF刺激細胞時，cl9/2抗體以30 pM的EC50抑制人類TF-I白血病細胞株的GM-CSF依賴性增殖。在一些實施例中，本發明所用的抗體與cl9/2結合至相同抗原決定基。

投與的抗體(諸如cl9/2)可另外進行人類工程化。舉例而言，cl9/2抗體可進一步經工程改造以含有人類V基因段。

可利用測定結合活性及親和力的熟知分析來鑑別高親和力抗體。此類技術包括ELISA分析以及利用表面電漿子共振或干涉量測術的結合測定。舉例而言，可藉由生物層干涉測量法、使用ForteBio (Mountain View, CA) Octet生物感測器測定親和力。本發明抗體典型地以類似親和力結合至hGM-CSF的糖基化形式與非糖基化形式。

本發明抗體與c19/2抗體競爭結合至hGM-CSF。本文所述之抗體阻斷或與c19/2抗體競爭結合至hGM-CSF的能力表明該抗體結合至相同抗原決定基c19/2抗體或結合至與c19/2抗體所結合的抗原決定基接近(例如重疊)的抗原決定基。在其他實施例中，本文所述之抗體，例如包含如圖1所提供之表中所示之V _H與V _L區組合的抗體，可作為參考抗體用於評估另一種抗體是否競爭結合至hGM-CSF。若在測試抗體存在下，參考抗體對抗原的結合被減少至少30%，通常至少約40%、50%、60%或75%，且通常被減少至少約90%，則認為該測試抗體競爭性地抑制參考抗體的結合。可利用多種分析評估結合，包括ELISA，以及其他分析，諸如免疫墨點。在一些實施例中，本發明抗體的解離速率比在相同條件下所分析之參考嵌合c19/2單株抗體慢至少2至3倍，但中和hGM-CSF活性的效能在量測hGM-CSF活性之基於細胞的分析中比參考抗體大至少6至10倍。

先前已描述分離V區序列接近於人類生殖系序列之抗體的方法(美國專利申請公開案第20050255552號及第20060134098號)。抗體文庫可表現於適合的宿主細胞中，包括哺乳動物細胞、酵母細胞或原核細胞。為了在一些細胞系統中表現，可將信號肽引入N端以將分泌引向細胞外培養基中。抗體可在信號肽存在或不存在下自細菌細胞(諸如大腸桿菌)分泌。大腸桿菌無信號分泌抗體片段的方法描述於美國專利申請案20070020685中。

在一些實施例中，產生本發明的結合hGM-CSF之抗體，其中具有來自圖1中所示之本發明之VH區之一之CDR的抗體與具有圖1中所示之V _L區之一之CDR的抗體組合且以多種形式中的任一者在適合的表現系統中表現。因此，抗體可以scFv、Fab、Fab' (含有免疫球蛋白鉸鏈序列)、F(ab') ₂(藉由兩個Fab'分子之鉸鏈序列之間形成雙硫鍵而形成)、全免疫球蛋白或截斷的免疫球蛋白形式或以融合蛋白形式表現於原核或真核宿主細胞中，此發生於宿主細胞內部或藉由分泌發生。甲硫胺酸殘基可視情況存在於N端，例如無信號表現系統中所產生之多肽的N端。本文所述之各V _H區可與各V _L區成對以產生抗hGM-CSF抗體。在一個實施例中，融合蛋白包含本發明之抗hGM-CSF結合抗體或其片段(在非限制性實例中，抗hGM-CSF抗體片段為Fab、Fab'、F(ab')2、scFv或dAB)及人類運鐵蛋白，其中人類運鐵蛋白與抗體、在鉸鏈之後或在C _H3之後、在重鏈恆定區1 (C _H1)的末端融合，如Shin, S-U.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第92卷, 第2820-2824頁, 1995中所述，所述文獻以全文引用的方式併入本文中。

重鏈與輕鏈的例示性組合顯示於圖 1所提供的表中。在一些實施例中，抗體VL區(例如圖1的VK#1、VK#2、VK#3或VK#4)與人類κ恆定區組合以形成完整的輕鏈。另外，在一些實施例中，VH區與人類γ-1恆定區組合。可選擇任何適合的γ-1異型，諸如f-異型。因此，在一些實施例中，抗體為IgG，例如具有f-異型的IgG，其具有選自VH#1、VH#2、VH#3、VH#4或VH#5的VH (圖1)及選自VK#1、VK#2、VK#3或VK#4的VL ( 圖 1)。

本發明抗體抑制hGM-CSF受體活化，例如藉由抑制hGM-CSF結合至受體來抑制hGM-CSF受體活化，且對hGM-CSF展現高親和力結合，例如500 pM。在一些實施例中，抗體具有約10 ^-4/秒或更小的解離常數。不受理論束縛，具有較慢解離常數之抗體提供改善的治療益處。舉例而言，解離速率比c19/2抗體慢三倍的本發明抗體產生的hGM-CSF中和活性強10倍以上，例如在基於細胞的分析(諸如IL-8產生)中(參見例如實例2)。

可使用任何數目個表現系統(包括原核表現系統與真核表現系統)來產生抗體。在一些實施例中，表現系統為哺乳動物細胞表現系統，諸如CHO細胞表現系統。諸多此類系統廣泛獲自商業供應商。在其中抗體包含V _H與V _L區的實施例中，可使用單一載體表現V _H及V _L區，例如在雙順反子表現單元中，或在不同啟動子的控制下。在其他實施例中，可使用各別載體表現V _H及V _L區。如本文所述之V _H或V _L區可視情況包含位於N端之甲硫胺酸。

本發明抗體可以任何數目種形式產生，包括Fab、Fab'、F(ab') ₂、scFv或dAB。本發明抗體亦可包括人類恆定區。輕鏈恆定區可為人類κ或λ恆定區。重鏈恆定區通常為γ鏈恆定區，例如γ-1、γ-2、γ-3或γ-4恆定區。在其他實施例中，抗體可為IgA。

在本發明的一些實施例中，抗體VL區(例如圖1的VK#1、VK#2、VK#3或VK#4)與人類κ恆定區(例如SEQ ID NO: 10)組合以形成完整的輕鏈。

在本發明的一些實施例中，V _H區與人類γ-1恆定區組合。可選擇任何適合的γ-1 f異型，諸如f-異型。因此，在一些實施例中，抗體為具有f-異型恆定區(例如SEQ ID NO: 11)的IgG，其具有選自VH#1、VH#2、VH#3、VH#4或VH#5的V _H(圖1)。在一些實施例中，抗體具有選自VK#1、VK#2、VK#3或VK#4的V _L(圖1)。在特定實施例中，抗體具有如SEQ ID NO: 10所示之κ恆定區，及如SEQ ID NO: 11所示之重鏈恆定區，其中重鏈及輕鏈可變區包含來自圖1中所示之序列的以下組合之一：a) VH#2、VK#3；b) VH#1、VK#3；c) VH#3、VK#1；d) VH#3、VL#3；e) VH#4、VK#4；f) VH#4、VK#2；g) VH#5、VK#1；h) VH#5、VK#2；i) VH#3、VK#4；或j) VH#3、VL#3)。

在一些實施例中，例如在抗體為片段的情況下，可使抗體與另一種分子偶聯，例如聚乙二醇(聚乙二醇化)或血清白蛋白，以提供延長的活體內半衰期。抗體片段聚乙二醇化之實例提供於Knight等人, Platelets15:409, 2004 (阿昔單抗(abciximab)); Pedley等人,, Br. J. Cancer70:1126, 1994 (抗CEA抗體); Chapman等人, Nature Biotech. 17:780, 1999; 及Humphreys等人 , Protein Eng. Des. 20: 227, 2007)。

在一些實施例中，本發明抗體呈Fab'片段形式。藉由將V _L區與人類κ或λ恆定區融合來產生全長輕鏈。任一恆定區可用於任何輕鏈；然而，在典型實施例中，κ恆定區與Vκ可變區組合使用且λ恆定區聯合Vλ可變區使用。

Fab'重鏈為本發明之V _H區與人類重鏈恆定區序列、第一恆定(CH1)域及鉸鏈區融合而產生的Fd'片段。重鏈恆定區序列可來自免疫球蛋白類別中之任一者，但通常來自IgG，且可來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。本發明的Fab'抗體亦可為雜交序列，例如鉸鏈序列可來自一種免疫球蛋白亞類且CH1域可來自不同亞類。 V. 投與抗 hGM-CSF 抗體用於治療其中 GM-CSF 為標靶的疾病 .

本發明亦提供治療患有涉及hGM-CSF之疾病的患者，其中需要抑制hGM-CSF活性，亦即其中hGM-CSF為治療標靶。在一些實施例中，此類患者患有慢性發炎疾病，例如關節炎，例如類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎、幼年特發性關節炎、全身發作型斯蒂爾病疾病(Still's disease)及關節的其他發炎疾病；發炎性腸病，例如潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、巴雷特症候群(Barrett's syndrome)、回腸炎、腸炎、嗜伊紅血球食道炎及麩質敏感性腸病；呼吸系統發炎性病症，諸如哮喘、嗜伊紅血球哮喘、成人呼吸窘迫症候群、過敏性鼻炎、矽肺病、慢性阻塞性肺病、過敏性肺病、間質性肺病、瀰漫性實質性肺病、支氣管擴張症；皮膚發炎疾病，包括牛皮癬、硬皮病及發炎皮膚病，諸如濕疹、異位性皮炎、蕁麻疹及搔癢症；涉及中樞及周邊神經系統發炎的病症，包括多發性硬化症、特發性脫髓鞘多發性神經病變、格-巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病變、神經纖維瘤及神經退化性疾病，諸如阿茲海默症(Alzheimer's disease)。多種其他發炎疾病可使用本發明之方法治療。此等疾病包括全身性紅斑狼瘡、免疫介導性腎病(例如腎絲球腎炎)及脊椎關節病；以及具有不良慢性發炎組分的疾病，諸如全身性硬化症、特發性發炎肌病、休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、血管炎、類肉瘤病、甲狀腺炎、痛風、耳炎、結膜炎、鼻竇炎、類肉瘤病、白塞氏症候群(Behcet's syndrome)、自體免疫淋巴增生症候群(或ALPS，亦稱為加勒-史密斯症候群(Canale-Smith syndrome))、Ras相關自體免疫淋巴增生病症(或RALD)、努南症候群(Noonan syndrome)、肝膽疾病(諸如肝炎)、原發性膽汁性肝硬化、肉芽腫性肝炎及硬化性膽管炎。在一些實施例中，患者在心血管系統損傷之後發炎。多種其他發炎疾病包括川崎氏疾病(Kawasaki's disease)、多中心卡斯爾曼疾病(Castleman's Disease)、肺結核及慢性膽囊炎。其他慢性發炎疾病描述於例如Harrison's Principles of Internal Medicine, 第12版, Wilson等人編, McGraw-Hill, Inc.)。在一些實施例中，經抗體治療的患者患有其中GM-CSF造成腫瘤或癌症細胞生長的癌症，包括(但不限於)例如急性骨髓性白血病、葉狀神經纖維瘤、自體免疫淋巴增生症候群(或ALPS，亦稱為加勒-史密斯症候群(Canale-Smith syndrome))、Ras相關自體免疫淋巴增生病症(或RALD)、努南症候群、慢性骨髓單核球性白血病、幼年型骨髓單核細胞性白血病及急性骨髓性白血病。在一些實施例中，經本發明抗體治療的患者患有心臟衰竭或處於心臟衰竭的風險下，例如由於心血管系統的局部缺血損傷，諸如缺血性心臟病、中風及動脈粥樣硬化。在一些實施例中，經本發明抗體治療的患者患有哮喘。在一些實施例中，經本發明抗體治療非患者患有阿茲海默氏病。在一些實施例中，經本發明抗體治療的患者出現骨質減少，例如骨質疏鬆症。在一些實施例中，經本發明抗體治療的患者患有血小板減少型紫癜。在一些實施例中，患者患有I型或II型糖尿病。在一些實施例中，患者可患有超過一種疾病，其中GM-CSF為治療標靶，例如患者可患有類風濕性關節炎及心臟衰竭，或骨質疏鬆症及類風濕性關節炎等。

中和抗GM-CSF抗體的兩個其他實例為Li等人, (2006) PNAS 103(10):3557-3562中所述的人類ElO抗體及人類G9抗體。ElO及G9為IgG類抗體。ElO對GM-CSF具有870 pM結合親和力且G9對GM-CSF具有14 pM親和力。兩種抗體均特異性結合至人類GM-CSF且顯示強中和活性，如TFl細胞增殖分析所評估。

另一種例示性中和抗GM-CSF抗體為Krinner等人(MoI Immunol. 44:916-25,2007；2006年5月電子出版112006)所述的MT203抗體。MT203為以皮莫耳濃度的親和力結合GM-CSF的IgGl類抗體。抗體顯示強抑制活性，如TF-I細胞增殖分析所評估，及其阻斷U937細胞產生IL-8的能力。

適用於本發明的其他抗體為熟習此項技術者所知。

作為抗hGM-CSF受體抗體的hGM-CSF拮抗劑亦可聯合本發明之方法使用。此類hGM-CSF拮抗劑包括hGM-CSF受體α鏈或β鏈之抗體。本發明所用之抗hGM-CSF受體抗體可呈如上所解釋之任何抗體形式，例如完整、嵌合、單株、多株、抗體片段或衍生物、單鏈、人類化、人類工程化及其類似形式。適用於本發明之抗hGM-CSF受體抗體(例如中和性高親和力抗體)實例已知(參見例如美國專利5,747,032及Nicola等人, Blood 82:1724, 1993)。 非抗體 GM-CSF 拮抗劑

可干擾hGM-CSF與其受體之生產型相互作用的其他蛋白質包括突變型hGM-CSF蛋白質及分泌性蛋白質，其包含結合至hGM-CSF且競爭結合至細胞表面受體之hGM-CSF受體鏈中之一或兩者之胞外部分的至少一部分。舉例而言，可溶性hGM-CSF受體拮抗劑可藉由將sGM-CSFRα之編碼區與鼠類IgG2a之CH2-CH3區融合來製備。例示性可溶性hGM-CSF受體描述於Raines等人(1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 8203中。GM-CSFR α-Fc融合蛋白之實例提供於例如Brown等人(1995) Blood 85: 1488中。在一些實施例中，此類融合體中的Fc組分可經工程改造以調節對Fc受體的結合，例如增強對Fc受體的結合。

其他hGM-CSF拮抗劑包括hGM-CSF突變體。舉例而言，Hercus等人, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:5838, 1994所述的hGM-CSF中之胺基酸殘基21突變成精胺酸或離胺酸(E21R或E21K)的hGM-CSF已顯示在阻止hGM-CSF依賴性白血病細胞在小鼠異種移植模型中播散的活體內活性(Iversen等人, Blood 90:4910, 1997)。如熟習此項技術者所瞭解，此類拮抗劑可包括保守性修飾之hGM-CSF變異體，該等變異體具有取代，諸如在胺基酸殘基21處所提及的取代，或具有例如延長半衰期之胺基酸類似物的hGM-CSF變異體。

在一些實施例中，hGM-CSF拮抗劑可為肽。舉例而言，hGM-CSF肽拮抗劑可為在結構上模擬人類GM-CSF之B及C螺旋上之特定殘基位置所設計的肽，該等特定殘基牽涉到受體結合及生物活性(例如Monfardini等人, J. Biol. Chem 271:2966-2971, 1996)。

在其他實施例中，hGM-CSF拮抗劑為以與抗體類似之方式靶向且結合至抗原的「抗體模擬物」。某些此等「抗體模擬物」利用非免疫球蛋白支架作為抗體可變區的替代蛋白質構架。舉例而言，Ku等人(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(14):6552-6556 (1995))揭示基於細胞色素b562之抗體的替代物，其中針對牛血清白蛋白隨機選擇細胞色素b562的兩個環用於結合。發現個別突變體類似於抗BSA抗體選擇性地結合BSA。美國專利第6,818,418號及第7,115,396號揭示一種抗體模擬物，其具有纖維結合蛋白或纖維結合蛋白樣蛋白質支架及至少一個可變環。稱為阿德尼汀的此等基於纖維結合蛋白之抗體模擬物展現與天然或經工程改造之抗體相同的許多特徵，包括對任何標靶配位體的高親和力及特異性。此等基於纖維結合蛋白之抗體模擬物的結構類似於IgG重鏈可變區的結構。因此，此等模擬物在性質及親和力上呈現與原生抗體類似的抗原結合特性。另外，此等基於纖維結合蛋白之抗體模擬物展現優於抗體及抗體片段的某些益處。舉例而言，此等抗體模擬物不依賴於二硫鍵來達成原生摺疊穩定性，且因此，在通常會裂解抗體的條件下穩定。另外，由於此等基於纖維結合蛋白之抗體模擬物的結構類似於IgG重鏈的結構，因此可在活體外使用環隨機改組方法，該方法類似於活體內抗體親和力成熟方法。

Beste等人(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96(5):1898-1903 (1999))揭示基於脂質運載蛋白支架的抗體模擬物(Anticalin®)。脂質運載蛋白係由蛋白質末端具有四個高變環的β-圓筒構成。對環進行隨機突變誘發且加以選擇以便與例如螢光素結合。三種變異體對螢光素展現特異性結合，其中一種變異體顯示的結合類似於抗螢光素抗體的結合。進一步的分析揭露，所有隨機化位置為可變的，表明抗運載蛋白適用作抗體替代物。因此，抗運載蛋白為單鏈小肽，其典型地具有160至180個殘基，具有優於抗體的若干優點，包括生產成本降低、儲存穩定性增加及免疫反應減少。

美國專利第5,770,380號揭示一種合成抗體模擬物，其使用杯芳烴的非肽有機剛性支架，該支架與用作結合位點的多個可變肽環連接。在幾何形狀上，肽環就彼此而言皆自杯芳烴的同一側突出。由於此幾何形狀已得到證實，因此所有環皆可用於結合，從而增強對配位體的結合親和力。然而，相較於其他抗體模擬物，基於杯芳烴的抗體模擬物並非完全由肽組成，且因此，其不大容易被蛋白酶攻擊。支架皆不完全由肽、DNA或RNA組成，意謂此抗體模擬物在極端的環境條件下相對穩定且具有較長壽命。另外，由於基於杯芳烴的抗體模擬物相對較小，因此不大可能產生免疫原性反應。

Murali等人(Cell MoI Biol 49(2):209-216 (2003))描述一種使抗體還原成較小肽模擬物的方法，術語「抗體樣結合肽模擬物」(ABiP)亦可適用作抗體的替代物。

除非免疫球蛋白構架之外，亦已利用包含RNA分子及非天然寡聚物(例如蛋白酶抑制劑、苯并二氮呯、嘌呤衍生物及β回旋模擬物)的化合物模擬抗體特性。因此，非抗體GM-CSF拮抗劑亦可包括此類化合物。 治療性投與

在一些實施例中，本發明之方法包含將hGM-CSF拮抗劑(例如抗hGM-CSF抗體)以醫藥組合物形式投與出現CRS或細胞介素風暴的個體。在一些實施例中，利用適於治療疾病的給藥方案，以治療有效量投與hGM-CSF拮抗劑。

在一些實施例中，治療有效量為至少部分地遏制病狀或其症狀的量。舉例而言，治療有效量可遏制免疫活化，可降低循環細胞介素含量，可減少T細胞活化或可改善發熱、不適、疲勞、厭食症、肌痛、關節疼痛、噁心、嘔吐、頭痛、皮疹、噁心、嘔吐、腹瀉、呼吸急促、低血氧症、心血管性心搏過速、增寬的脈搏壓、低血壓、增加的心輸出量(早期)、潛在減弱的心輸出量(後期)、升高的D-二聚體、低纖維素原血症伴有或不伴有出血、氮質血症、轉胺酶升高、高膽紅素血症、頭痛、精神狀態變化、意識模糊、譫妄、找詞困難或弗蘭克失語症、幻覺、震顫、辨距障礙、步態變化或癲癇發作。

本發明之方法包含利用適於治療疾病的給藥方案、以治療有效量將抗hGM-CSF抗體作為醫藥組合物投與患者。組合物可經調配以用於多種藥物遞送系統。為了正確調配，組合物中亦可包括一或多種生理學上可接受之賦形劑或載劑。適用於本發明之調配物見於 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins, 2005。欲簡單回顧藥物遞送方法，參見Langer, Science 249: 1527-1533 (1990)。

用於本發明方法中的抗hGM-CSF抗體於適於注射至患者之溶液中提供，諸如無菌注射等張水溶液。抗體以適合濃度溶解或懸浮於可接受之載劑中。在一些實施例中，載劑為水溶液，例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水及其類似物。組合物可以含有為接近於生理條件而必需的輔助醫藥物質，諸如pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑及其類似物。

本發明之醫藥組合物以足以治癒或至少部分地遏制疾病或該疾病之症狀及其併發症的量投與患者，例如患有以下疾病之患者：骨質減少、類風濕性關節炎、幼年特發性關節炎、全身發作型斯蒂爾病、哮喘、嗜伊紅血球哮喘、嗜伊紅血球食道炎、多發性硬化症、牛皮癬、異位性皮炎、葉狀神經纖維瘤、自體免疫淋巴增生症候群(或ALPS，亦稱為加勒-史密斯症候群)、Ras相關自體免疫淋巴增生病症(或RALD)、努南症候群、慢性骨髓單核球性白血病、幼年型骨髓單核細胞性白血病、急性骨髓性白血病、多中心卡斯爾曼疾病、慢性阻塞性肺病、間質性肺病、瀰漫性實質性肺病、特發性血小板減少紫癜、阿茲海默氏病、心臟衰竭、川崎氏疾病、歸因於缺血事件的心臟損傷，或糖尿病。足以實現此之量定義為「治療有效劑量」。藉由監測患者對治療的反應來確定治療有效劑量。指示治療有效劑量的典型基準包括患者之疾病症狀的改善。有效用於此用途的量將視疾病嚴重度及患者健康的一般狀態而定，包括其他因素，諸如年齡、體重、性別、投藥途徑等。抗體的單次或多次投與可視患者所需且耐受之劑量及頻率而定來投與。在任何情況下，方法提供足量的抗hGM-CSF抗體以有效治療患者。

抗體可單獨投與，或與治療所關注之疾病的其他療法組合投與。

抗體可藉由注射或輸注、經由任何適合的途徑投與，包括(但不限於)靜脈內、皮下、肌肉內或腹膜內途徑。在一些實施例中，抗體可藉由吹入投與。在一個例示性實施例中，抗體可在4℃下以10 mg/ml儲存於無菌等張性注射生理鹽水溶液中且在投與患者之前，在100 ml或200 ml 0.9%氯化鈉中稀釋以便注射。抗體以0.2與10 mg/Kg之間的劑量藉由歷時1小時的靜脈內輸注投與。在其他實施例中，抗體例如藉由靜脈內輸注15分鐘至2小時之時段來投與。在另其他實施例中，投藥程序係經由皮下或肌肉內注射。

在一些實施例中，hGM-CSF拮抗劑(例如抗hGM-CSF抗體)係藉由脊椎周圍途徑投與。脊椎周圍投藥涉及解剖學上的定域遞送，其為了在初始投藥時將治療性分子直接定位於脊椎附近而執行。脊椎周圍投藥描述於例如美國專利第7,214,658號及Tobinick及Gross, J. Neuroinflammation 5:2, 2008中。

為了向已診斷患有CRS或細胞介素風暴的個體提供有效療法，選擇hGM-CSF拮抗劑的劑量。劑量典型地在每位患者每公斤體重約0.1 mg至約50 mg範圍內或在約1 mg至約2 g範圍內。劑量通常在每位患者約1至約20 mg/Kg或大致在約50 mg至約2000 mg範圍內。可以適當頻率重複給藥，視拮抗劑的藥物動力學(例如抗體在循環系統中的半衰期)及藥效學反應(例如抗體治療作用的持續時間)而定，劑量可在每天一次至每三個月一次的範圍內。在一些實施例中，在拮抗劑為抗體或經修飾之抗體片段、活體內半衰期為約7天至約25天的情況下，抗體重複給與，每週一次至每3個月一次。在其他實施例中，抗體大致每個月投與一次。

本發明之V _H區及/或V _L區亦可用於診斷目的。舉例而言，V _H及/或V _L區可用於臨床分析，諸如偵測患者中的GM-CSF含量。本發明之V _H或V _L區亦可用於例如產生抗Id抗體。

除非本文中另外定義，否則結合本申請案使用的科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所瞭解的含義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。

在一些實施例中，「治療」包含治療性治療且「預防」包含防治性或預防性措施，其中目的為預防或減輕如上文所述之目標病理性病狀或病症。因此，在一個實施例中，治療可包括直接影響或治癒、遏制、抑制、預防疾病、病症或病狀，降低其嚴重度，延遲其發作，減少與疾病、病症或病狀相關之症狀，或其組合。因此，在一個實施例中，「治療」、「緩解」及「減輕」尤其係指延遲惡化、加速緩和、誘導緩和、增強緩和、加速恢復、增強替代治療劑之功效或減少對替代治療劑的抗藥性，或其組合。在一個實施例中，「預防」尤其係指延遲症狀發作、預防疾病復發、減少復發事件的次數或頻率、增加症狀性事件之間的潛伏期，或其組合。在一個實施例中，術語「遏制」或「抑制」尤其係指減輕症狀嚴重度、減輕急性事件嚴重度、減少症狀數目、降低疾病相關症狀之發生率、減少症狀潛伏期、緩解症狀、減少繼發症狀、減少繼發感染、延長患者存活期，或其組合。

在本發明中，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個提及物，且提及特定數值至少包括彼特定值。如本文所用，術語「複數個」意謂超過一個。當表示值範圍時，另一實例包括自一個特定值及/或至另一個特定值。

類似地，當使用前行詞「約」近似表示值時，應瞭解特定值形成另一個實施例。所有範圍均為包括性的及可組合的。在一些實施例中，術語「約」係指與指定的數字或數字範圍存在0.0001%-5%之偏差。在一些實施例中，術語「約」係指與指定的數字或數字範圍存在1至10%的偏差。在一些實施例中，術語「約」係指與指定的數字或數字範圍存在至多25%的偏差。術語「包含」意欲涵蓋列舉的所有元素，而且亦可包括其他未提及的元素，且其可與術語「涵蓋」、「包括」或「含有」互換使用，該等術語皆具有相同的特性及含義。術語「由……組成」意謂由所述元素或步驟構成，且其可與術語「由……構成」互換使用，該等術語皆具有相同特性及含義。實例實例 1 - 例示性人類工程化 GM-CSF 抗體

如美國專利申請公開案第20060134098號及第20050255552號中所述，由聚焦於抗原決定基的人類V段文庫產生對cl9/2具有特異性的一組工程化Fab'分子。聚焦於抗原決定基的文庫係由與CDR3-FR4區域連接的人類V段文庫序列以及人類生殖系J段序列構築而成，該區域的CDRH3及CDRL3中含有BSD序列。對於重鏈而言，使用人類生殖系JH4序列，且對於輕鏈而言，使用人類生殖系JK4序列。

選擇支持與重組人類GM-CSF結合的來自Vh1限制性文庫之人類工程化全長V區。如美國專利申請公開案第20060134098號中所述，使用「全長」V-κ文庫作為構築「卡匣」文庫的基礎，其中初始用人類序列文庫置換鼠類c19/2抗體V段的僅一部分。構築兩種類型的卡匣。使用構架2區域內重疊的共同序列、藉由橋式PCR製備用於V-κ鏈的卡匣。以此方式構築「前端」及「中部」人類卡匣文庫用於人類V-κIII同型。藉由群落轉移結合分析來鑑別支持與GM-CSF結合的人類V-κIII卡匣且在ELISA中根據親和力加以評級。藉由橋式PCR將V-κ人類「前端」與「中部」卡匣融合在一起，以重新構築支持GM-CSF結合活性的完全人類V-κ區域。人類工程化Fab因此由支持與人類GM-CSF結合的人類工程化V-重鏈及V-κ區組成。

藉由表面電漿子共振(spr)分析來測定結合活性。生物素化GM-CSF被捕捉於鏈黴抗生物素蛋白塗佈的CM5生物感測晶片上。由大腸桿菌表現的人類工程化Fab片段在10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.1 mg/ml BSA及0.005% P20 (pH 7.4)中稀釋至30 nM的初始濃度。利用3倍連續稀釋將各種Fab稀釋4次，且在37℃下測試各種濃度兩次，以測定對不同密度抗原表面的結合動力學。對來自所有三種表面的資料進行全域擬合以提取解離常數。

藉由Biacore 3000表面電漿子共振(SPR)分析結合動力學。將重組人類GM-CSF抗原經生物素標記且固著於鏈黴抗生物素蛋白CM5感測器晶片上。Fab樣品稀釋至3 nM的初始濃度且進行3倍連續稀釋。在10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.1 mg/mL BSA及0.005% p20 (pH 7.4)中且在37℃下進行分析。各種濃度測試兩次。對兩種抗原密度表面進行Fab'結合分析，從而提供雙重複資料集。使用1:1朗格繆爾結合模型計算的6種不同人類工程化抗GM-CSF Fab純系中之每一者的平均親和力(KD)顯示於表 2中。

利用TF-I細胞增殖分析測試Fab的GM-CSF中和。與0.5 ng/ml GM-CSF一起培育4天之後，利用MTS分析(Cell titer 96, Promega)量測人類TF-I細胞的GM-CSF依賴性增殖，以測定活細胞。在此分析中，所有Fab抑制的細胞增殖表明此等抗體為中和抗體。在基於細胞的分析中，抗GM-CSF Fab之相對親和力與EC50之間存在良好的相關性。單價親和力在18 pM-104 pM範圍內的抗GM-CSF抗體在基於細胞的分析中對GM-CSF展現有效的中和。

例示性工程化抗GM-CSF V區序列顯示於圖 1中。

表 2：相較於GM-CSF依賴性TF-I細胞增殖分析中的活性(EC50)，藉由表面電漿子共振分析所測定之抗GM-CSF Fab的親和力

Fab	藉由SPR測定的單價結合親和力(pM)	TF-1細胞增殖分析中的EC ₅₀(pM)
94	18	165
104	19	239
77	29	404
92	58	539
42	104	3200
44	81	7000

實例 2 - 人類工程化 GM-CSF 抗體的評價

此實例評價相較於具有來自小鼠抗體LMM102之可變區的嵌合IgG1k抗體(Ab2)(Nice等人, Growth Factors3:159, 1990)，人類工程化抗GM-CSF抗體在基於細胞之分析中的結合活性及生物學效能。Ab1為針對具有與Ab2相同之恆定區之GM-CSF的人類工程化IgG1k抗體。 表面電漿子共振對人類 GM-CSF 與 Ab1 及 Ab2 之結合的分析

利用表面電漿子共振分析，使用Biacore 3000儀器，根據Ab1及Ab2與糖基化人類GM-CSF的相互作用比較結合動力學及單價親和力。Ab1或Ab2被捕捉於使用多株抗人類F(ab')2的Biacore晶片表面上。使用由人類293細胞表現的重組人類糖基化GM-CSF作為分析物。在2次獨立實驗中測定動力學常數(參見圖 2A- 圖 2B及表 3)。結果顯示，在此實驗中，GM-CSF結合至Ab2與Ab1的單價親和力類似。然而，Ab1的「締合速率」比Ab2慢兩倍，而且「解離速率」慢大致三倍。

表 3：在圖2A至圖2B中由表面電漿子共振分析在37℃下測定的動力學常數；顯示締合常數(k _a)、解離常數(k _d)及親和力計算值(KD)。

	k _a(M ^-1s ^-1)	k _d(s ^-1)	KD (pM)
Ab2	7.20 x 10 ⁵	2.2 x 10 ^-5	30.5
Ab1	2.86 x 10 ⁵	7.20 x 10 ^-6	25.1

GM-CSF天然地在N連接與O連接的糖基化位點發生糖基化，但生物活性不需要糖基化。為了測定GM-CSF糖基化是否影響Ab1或Ab2的結合，在ELISA中使用來自兩種不同來源的重組GM-CSF對抗體進行比較；大腸桿菌表現的GM-CSF(非糖基化)及人類293細胞表現的GM-CSF(糖基化)。圖3A-圖3B及表 4中的結果顯示，兩種抗體均以等效活性結合糖基化GM-CSF與非糖基化GM-CSF。兩種抗體在此分析中亦展現類似的EC ₅₀值。

表 4.藉由ELISA測定Ab2及Ab1對來自兩種不同來源之人類GM-CSF之結合的EC ₅₀概述。利用兩次獨立實驗測定對人類293細胞(糖基化)或來自大腸桿菌(非糖基化)之重組GM-CSF的結合。實驗1顯示於圖3A至圖3B中。

	非糖基化(實驗1)	非糖基化(實驗2)	糖基化(實驗1)
Ab2	400 pM	433 pM	387pM
Ab1	373 pM	440 pM	413pM

Ab1為來源於存在於Ab2中之小鼠可變區的人類工程化抗體。藉由競爭ELISA測試Ab1對重疊抗原決定基的特異性(Ab2)。

使用已知技術製備生物素化Ab2。如ELISA所測定，生物素化不影響Ab2對GM-CSF的結合。在分析中，Ab2或Ab1以不同濃度與固定量的生物素化Ab2一起添加。生物素化Ab2的偵測係在未標記Ab或Ab1競爭物存在下加以分析(圖4A至圖4B)。Ab1與Ab2均與生物素化Ab2競爭結合至GM-CSF，從而表明與相同的抗原決定基結合。Ab1比Ab2更有效地競爭結合至GM-CSF，此符合藉由表面電漿子共振分析得知的Ab1解離動力學慢於Ab2。 Ab1 及 Ab2 對 GM-CSF 活性的中和

對中和GM-CSF活性進行的基於細胞之分析用於評價生物學效能。該分析量測GM-CSF誘導U937細胞分泌的IL-8。大腸桿菌來源的0.5 ng/ml GM-CSF誘導16小時之後，藉由ELISA測定分泌於培養上清液中的IL-8。

Ab1與Ab2中和活性在此分析中的比較顯示於圖 5的代表性分析中。在三次獨立實驗中，當比較IC50時，Ab1比Ab2更有效地抑制GM-CSF活性( 表 5)。

表 5. 關於抑制GM-CSF誘導IL-8表現之IC50的比較。圖5中所示之三次獨立實驗的資料及平均IC ₅₀用ng/ml及nM表示。

實驗	Ab2 (ng/ml)	Ab2 (nM)	Ab1 (ng/ml)	Ab1 (nM)
A	363	2.4	31.3	0.21
B	514	3.4	92.5	0.62
C	343	2.2	20.7	0.14
平均值	407	2.7	48.2	0.32

概述

人類工程化Ab1以25 pM的平衡結合常數計算值(KD)結合至GM-CSF。Ab2以30.5 pM的KD結合至GM-CSF。Ab2對GM-CSF顯示的締合常數(k _a)比Ab1高兩倍，而Ab1顯示的解離動力學(k _d)比Ab2慢三倍。Ab2及Ab1在抗原結合ELISA中對糖基化GM-CSF及非糖基化GM-CSF顯示的結合活性相似。競爭型ELISA證實，兩種抗體競爭相同抗原決定基；Ab1顯示的競爭性結合活性高於Ab2。另外，Ab1在GM-CSF誘導的IL-8誘導分析中顯示高於Ab2的GM-CSF中和活性。實例 3 - 在小鼠免疫療法相關毒性模型中投與中和性抗 GM-CSF 抗體

小鼠免疫療法相關毒性模型可用於顯示抗GM-CSF抗體預防及治療免疫療法相關毒性的功效。在免疫療法相關毒性的一種模型中，以引起毒性的劑量向小鼠注射CAR T細胞。舉例而言，van der Stegen等人(J. Immunol 191:4589-4598 (2013))(以引用的方式併入本文中)描述一種CRS模型，其藉由腹膜內注射單次劑量的30x10 ⁶個細胞(稱為T4 ⁺T細胞)誘導而成。T4 ⁺T細胞為表現嵌合Ag受體(CAR) T1E28z的工程化T細胞。經工程改造以表現T1E28z的T細胞藉由表現基於ErbB1及基於ErbB4之二聚體及ErbB2/3雜二聚體的細胞活化。

為了評價抗GM-CSF抗體預防及治療CRS的功效，將小鼠分組(n=10)，各組接受：a)單次腹膜內鹽水注射；b)腹膜內注射30x10 ⁶個T4 ⁺T細胞；c)腹膜內注射30x10 ⁶個T4 ⁺T細胞及與T4 ⁺T細胞共投與的0.25 mg靜脈內(i.v.)抗GM-CSF單株抗體22E9 (重組的大鼠抗小鼠GM-CSF抗體)；d)腹膜內注射30x10 ⁶個T4 ⁺T細胞及與T4 ⁺T細胞共投與的0.25 mg鼻內(i.n.)抗GM-CSF抗體22E9；e)腹膜內注射30x10 ⁶個T4 ⁺T細胞及在T4 ⁺T細胞投與之前的6小時靜脈內投與的0.25 mg抗GM-CSF抗體22E9；f)腹膜內注射30x10 ⁶個T4 ⁺T細胞及在T4 ⁺T細胞投與之前的6小時鼻內投與的0.25 mg抗GM-CSF抗體22E9；g)腹膜內注射30x10 ⁶個T4 ⁺T細胞及在T4 ⁺T細胞投與之後的2小時靜脈內投與的0.25 mg抗GM-CSF抗體22E9；或h)腹膜內注射30x10 ⁶個T4 ⁺T細胞及在T4 ⁺T細胞投與之後的2小時鼻內投與的0.25 mg抗GM-CSF抗體22E9。將評價其他劑量、投藥時間及投藥途徑。

為了評估抗GM-CSF抗體22E9作用，自小鼠收集器官，用福馬林固定且進行組織病理學分析。收集血液且藉由文獻中充分描述的方法(諸如ELISA分析)評估人類IFNγ、人類IL-2及小鼠IL-6、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFNγ及TNFα的濃度。將觀測小鼠體重、行為及臨床表現。實例 4 - 抗 GM-CSF 抗體對免疫療法的影響

小鼠模型可用於顯示GM-CSF拮抗劑對癌症免疫療法的功效不產生不利的影響。SCID米色小鼠可接種癌細胞株且用已知可誘導CRS的免疫治療劑(如T4 ⁺T細胞)聯合或不聯合抗GM-CSF抗體加以治療。

為了評價抗GM-CSF抗體是否影響免疫療法的功效，將小鼠分組(n=10)，各組接受：a)皮下(s.c.)注射30x10 ⁶個SKOV3細胞；b)皮下注射30x10 ⁶個SKOV3細胞及腹膜內注射30x10 ⁶個T4 ⁺T細胞；或c)皮下植入30x10 ⁶個SKOV3細胞、腹膜內注射30x10 ⁶個T4 ⁺T細胞及靜脈內注射0.25 mg抗GM-CSF抗體22E9。

為了評估抗GM-CSF抗體22E9對T4 ⁺T細胞功效的影響，藉由卡尺每四天量測腫瘤尺寸，且根據下式計算腫瘤體積：0.5×(較大直徑)×(較小直徑) ²。將觀測小鼠體重、行為及臨床表現。在實驗結束時，將動物處死，且收集腫瘤組織且稱重。實例 5 - 人類 CRS 的 小鼠模型

開發CRS的小鼠模型，用於研究人類化抗GM-CSF單株抗體治療或預防CRS的作用。(圖17a至圖17b)。

方法：所用模型為原發AML模型。將來源於CD123陽性AML患者的AML母細胞植入另外轉殖有人類SCF、IL-3及GM-CSF基因的免疫功能不全NSG-S小鼠。2至4週之後，對其抽血以證實移植及高疾病負荷的達成。接著用1x10 ⁶個細胞的高劑量CAR-T123治療小鼠，該等高劑量比先前研究的劑量高10倍。

結果：觀測到在CAR-T細胞注射之後的1至2週內，此等小鼠出現以無力、消瘦、身體拱起、回縮及不良運動反應為特徵的疾病。小鼠在7至10天內最終死於其疾病。症狀與小鼠中的大量T細胞擴增及多種人類細胞介素(諸如IL-6、MIP 1α、IFN-γ、TNFα、GM-CSF、MIP1β及IL-2)升高相關，此模式類似於人類CRS在CAR-T細胞療法之後所見的模式。GM-CSF變化倍數顯著大於其他細胞介素。(圖17a至圖17b)。實例 6 - GM-CSF 基因剔除 CAR-T 的產生

產生GM-CSF CRISPR基因剔除T細胞且其顯示GM-CSF表現減少，但其他細胞介素的含量及去顆粒程度相似，且顯示免疫細胞功能。(參見圖15a至圖15g)。實例 7 - 抗 GM-CSF 中和抗體不抑制 CAR-T 介導的殺滅、增殖或細胞介素產生 ， 但中和 GM-CSF

抗GM-CSF中和抗體不抑制CAR-T介導的殺滅、增殖或細胞介素產生，但成功地中和GM-CSF。(參見圖16a至圖16i)。實例 8 - 抗 GM-CSF 中和抗體在活體內不抑制 CAR-T 功效

人類化抗GM-CSF單株抗體(hGM-CSF中和抗體)在活體內不抑制CAR-T功效(圖18a至圖18c)。CAR-T與根據本文所述實施例之抗GM-CSF中和抗體的組合在異種移植模型中的功效。如圖18a中所示，向NSG小鼠注射NALM-6-GFP/螢光素酶細胞(人類周邊血液白血病前B細胞)且執行生物發光成像(BLI0)以證實腫瘤生長。小鼠用以下治療：(1)抗GM-CSF抗體(每日10 mg/Kg，歷時十天)及(a) CART19或(b)未轉導之人類T細胞(UTD) 1x10 ⁶個細胞；或(2) IgG對照抗體(每日10 mg/Kg，歷時十天)及(a) CART19或(b)未轉導之人類T細胞(UTD) 1x10 ⁶個細胞。圖18b及圖18c展現抗GM-CSF中和抗體在活體內不抑制CAR-T功效。實例 9 - 抗 GM-CSF 中和抗體不消弱 CAR-T 對 存活期的影響

活體外及活體內臨床前資料顯示，抗GM-CSF中和抗體(人類化抗GM-CSF單株抗體)不減弱CAR-T對小鼠模型之存活期的影響。(圖19)。

抗GM-CSF中和抗體在活體內、在PBMC不存在的情況下不阻礙CAR-T細胞功能。對於CAR-T + 對照物與CAR-T + 抗GM-CSF中和抗體而言，所示存活期相似。實例 10 - 抗 GM-CSF 中和抗體可增強 CAR-T 擴增

活體外及活體內臨床前資料顯示，抗GM-CSF中和抗體(人類化抗GM-CSF單株抗體)可增強CAR-T擴增(圖20)。抗GM-CSF中和抗體可增強活體外CAR-T癌細胞殺滅。抗體增強CAR-T細胞增殖且可改善功效。在PBMC存在下，GM-CSF中和抗體使CAR-T增殖增強。(在PBMC不存在下，其不受影響)。該抗體不抑制去顆粒、細胞內GM-CSF產生或IL-2產生。實例 11 - CAR-T 擴增與改良的總反應率相關

CAR-T擴增與改良的總反應率相關。(圖21)。CAR AUC (曲線下面積)定義為CAR-T投與後的最初28天期間內，每微升血液之CAR+細胞數累積含量。藉由威爾卡森秩和檢驗(Wilcoxon rank sum test)計算P值。(Neelapu等人, ICML 2017摘要8)。實例 12 - 根據本文所述實施例之抗 GM-CSF 中和抗體的研究方案

根據本文所述實施例之抗GM-CSF中和抗體(人類工程化抗GM-CSF單株抗體)的研究方案。(參見圖22)。在住院時及臨床問診時，在最初30天內每日評估CRS及NT。合格個體在CAR-T治療的第-1天、第+1天及第+3天接受GM-CSF中和抗體。在基線及在第1、3、6、9、12、18及24個月執行腫瘤評估。第-5、-1、0、1、3、5、7、9、11、13、21、28、90、180、270及360天獲取血液樣品(PBMC及血清)。實例 13 - GM-CSF 耗竭使 CAR-T 細胞 擴增增強

GM-CSF耗竭使CAR-T細胞擴增增強。(圖23A至圖23B) 圖23A顯示相較於對照CAR-T細胞，GM-CSF ^k/oCAR-T細胞的離體擴增增強。圖23b展現活體內用根據本文所述實施例之抗GM-CSF中和抗體(人類工程化抗GM-CSF單株抗體)治療之後的增殖更穩健。實例 14 - 抗 GM-CSF 中和 Ab 在 ＞100 位 人類患者中的安全概況 * I 期：健康成年自願者的單次劑量、劑量遞增。目標為分析安全/耐受性、PK及免疫原性。招募/劑量： (n=12) 3 / 1 mg/kg 3 / 3 mg/kg 3 / 10 mg/kg 3 / 安慰劑安全結果：清晰的安全概況：藥物無關的嚴重副作用(SAE) 非免疫原性 II 期： 1)類風濕性關節炎患者在第0週、第2週、第4週、第8週、第12週的劑量。目標為分析功效、安全/耐受性、PK及免疫原性。招募/劑量： (n=9) 7 / 600 mg 2 / 安慰劑安全結果：清晰的安全概況：藥物無關的嚴重副作用(SAE) 非免疫原性 2)重度哮喘患者在第0週、第2週、第4週、第8週、第12週、第16週、第20週的劑量。目標為分析功效、安全/耐受性、PK及免疫原性。招募/劑量： (n=160) 78 / 400 mg 82 / 安慰劑安全結果：清晰的安全概況：藥物無關的嚴重副作用(SAE) 非免疫原性 * 上文所描繪的研究中有94位患者，加上正在進行的CMML I期試驗中有12位患者，其中藥物具有良好耐受性；另外76位患者接受GM-CSF中和Ab的嵌合版(KB002)且顯示類似的安全概況。

所有研究均為隨機分組，雙盲安慰劑對照，靜脈內投藥。(參見圖24)。實例 15 - 抗 GM-CSF 抗體對 CART 活性及毒性的影響

研究將探究抗GM-CSF抗體阻斷GMCSF對嵌合抗原受體T細胞(CART)活性及毒性的影響。此可經由此兩種目標完成：目標#1：探究抗GM-CSF抗體阻斷GMCSF對CART細胞效應功能的影響目標#2：在CART細胞療法研究策略之後，研究抗GM-CSF抗體阻斷GMCSF對減少細胞介素釋放症候群的作用。提出以下實驗：

在骨髓細胞存在或不存在下，使用模型：針對ALL的CART19，對四種不同劑量之GMCSF阻斷型抗GM-CSF抗體與CART細胞之組合的活體外研究(產生細胞介素(30 plex Lumiex，包括GM-CSF、IL-2、INFg、IL-6、IL-8、MCP-1)、抗原特異性殺滅、去顆粒、增殖及耗竭)。

使用兩種模型，對不同劑量之GMCSF阻斷型抗GM-CSF抗體(具有及不具有鼠類GMCSF阻斷作用)與CART細胞之組合的活體內研究： CD19陽性細胞株(NALM6)植入的異種移植物，用CART19聯合或不聯合抗GM-CSF抗體治療；以及原發ALL患者來源的異種移植物，且接著用CART19聯合或不聯合抗GM-CSF抗體治療。

小鼠在即將植入CART細胞之前，腹膜內給與10 mg/kg抗GM-CSF抗體，並且以每天10 mg/kg給與10天。追蹤小鼠的腫瘤反應及存活期。CART細胞療法之後的一週開始且隨後每週完成眼眶後放血。將分析疾病負荷、T細胞擴增動力學、耗竭標記物表現及細胞介素含量(30 Plex)。實驗完成時，收集脾臟及骨髓，且分析腫瘤特徵及CAR-T細胞數目。

在PBMC存在下，使用以下模型，對GMCSF阻斷型抗GM-CSF抗體(具有或不具有鼠類GMCSF阻斷作用)與CART細胞之組合在CRS模型(在此模型中，使用高劑量的CART細胞誘發CRS)中的活體內研究：

原發ALL患者來源的異種移植物，接著用CART19聯合或不聯合抗GM-CSF抗體治療。

小鼠在即將植入CART細胞之前，腹膜內給與10 mg/kg抗GM-CSF抗體，並且以每天10 mg/kg給與10天。追蹤小鼠的腫瘤反應、CRS毒性症狀及存活期。在基線、CART細胞療法2天後、一週後及隨後每週完成眼眶後放血。將分析疾病負荷、T細胞擴增動力學、耗竭標記物表現及細胞介素含量(30 Plex)。實驗完成時，收集脾臟及骨髓，且分析腫瘤特徵及CAR-T細胞數目 活體內神經毒性分析

使用上文#3中論述的模型，小鼠用MRI成像，同時繼續評估CART細胞療法之後，神經毒性的出現。在接受CART細胞及抗GM-CSF抗體的小鼠與接受對照抗體的小鼠之間，對影像進行比較。執行重複實驗。在此等重複實驗中，CART細胞之後的第14天，將小鼠安樂死。利用多工分析法來分析腦組織中的細胞介素，藉由IHC、流式及顯微法來分析單核球、人類T細胞的存在及血腦障壁的完整性。實例 16 抗 hGM-CSF 中和抗體減少 CAR-T 細胞 相關神經毒性 (NT) 的 神經炎症

廣泛的科學理論依據表明GM-CSF為CAR-T細胞療法起始之後所見之細胞介素釋放症候群(CRS)、神經毒性(NT)及發炎級聯反應起始所必需的。所研究的假說為，中和抗體(冷自魯單抗)阻斷可溶性GM-CSF將消除或預防在使用CAR-T細胞療法的情況下所觀測到之CRS與NT的發作及嚴重度。重要的是，CAR-T細胞活性應得到保持或改良(若可能)。實驗設計係利用MRI成像及容積分析定量在使用CAR-T細胞療法的情況下所見的神經炎症來測試GM-CSF阻斷型抗GM-CSF抗體(冷自魯單抗)對CAR-T細胞效應功能、CAR-T在腫瘤異種移植模型中之功效、CRS在CRS異種移植模型中之出現及NT之出現的影響。在人類PBMC存在及不存在下，使用CAR-T +/-冷自魯單抗研究活體外及活體內實驗。(參見實例9及10、圖 19及圖 20a 至圖 20b)。方法

在人類PBMC存在或不存在下，執行活體外研究，以針對抗原特異性殺滅、去顆粒、增殖及耗竭來評價GM-CSF中和抗體冷自魯單抗與人類CD19+ CAR-T細胞之組合。

為了評估抗GM-CSF抗體(冷自魯單抗)對CAR-T細胞增殖及功效的影響，隨後利用以下模型(存在及不存在鼠類GM-CSF阻斷)執行活體內研究： 效應子 / 標靶對照實驗 ：CD19陽性細胞株(NALM6)植入的異種移植物，在人類PBMC不存在的情況下用CART19聯合或不聯合抗GM-CSF抗體(冷自魯單抗)治療。

NSG小鼠在即將植入CAR-T細胞之前，腹膜內給與10 mg/kg抗GM-CSF抗體(冷自魯單抗)，且隨後每天給與相同劑量，歷時10天，且追蹤以評估腫瘤反應及存活期。CAR-T細胞療法之後的一週開始且隨後每週完成眼眶後放血。亦分析疾病負荷、T細胞擴增動力學、耗竭標記物表現及細胞介素含量(30 Plex)。實驗完成時，收集脾臟及骨髓，且分析腫瘤特徵及CAR-T細胞數目。 CRS/NT 實驗：原發 ALL 患者來源的異種移植物 ， 隨後在人類 PBMC 存在下用 CART19 聯合或不聯合 冷自魯單抗治療 ：

為了評估冷自魯單抗對消除或預防CAR-T誘導CRS及NT發作及嚴重度的影響，使用經CART19聯合及不聯合冷自魯單抗治療的原發ALL患者來源之異種移植物，使用人類CAR-T細胞(具有及不具有鼠類GM-CSF阻斷)，在PBMC存在下，在CRS模型(其中使用高劑量的CAR-T細胞誘發CRS)中執行活體內研究。NSG小鼠在即將植入CAR-T細胞之前腹膜內給與10 mg/kg冷自魯單抗且隨後10天每天給與。追蹤小鼠的腫瘤反應、存活期、CRS及NT症狀。在基線、在CAR-T細胞療法期間及CAR-T細胞療法結束時，進行腦MRI掃描，且執行容積分析以評估及定量所有治療組的神經炎症及MRI T1高強度信號。在基線、CAR-T細胞療法後2天、CAR-T細胞療法後一週及隨後每週獲得體重且完成眼眶後放血。分析疾病負荷、T細胞擴增動力學、耗竭標記物表現及細胞介素含量(30 Plex)。實驗完成時，收集脾臟及骨髓，且分析腫瘤特徵及CAR-T細胞數目。結果 活體外模型

在此實驗中，探究GM-CSF中和與冷自魯單抗對CAR-T細胞效應功能的影響。已證明，CAR-T細胞分泌GM-CSF的量極高(逾1,500 pg/ml)且冷自魯單抗的使用完全地中和GM-CSF，但不抑制CAR-T去顆粒、細胞內GM-CSF產生或IL2產生。此外，冷自魯單抗不抑制CAR-T抗原特異性增殖或CAR-T殺滅。CAR-T + 冷自魯單抗相對於CAR-T + 對照抗體的效應子與標靶比率(E:T)相似， p=ns( 圖 16a 至圖 16d及圖 16j)。 活體內模型 ： 效應子 / 標靶對照實驗 ：

為了研究冷自魯單抗在活體內對CART19細胞功能的影響，吾等將CD19+ ALL細胞株NALM6在缺乏人類PBMC的情況下植入免疫功能不全的NOD-SCID-g-/-。儘管此等小鼠中之GM-CSF含量被完全中和，但類似於CART19聯合對照抗體，CART19與冷自魯單抗組合療法產生強抗腫瘤活性及改善的總存活期，表明GM-CSF在活體內在缺乏PBMC的情況下不減弱CAR-T細胞活性( 圖 16f及圖 16g)。 CRS 及 NT 實驗：

使用人類ALL母細胞、人類CD19 CAR-T及人類PBMC，發現冷自魯單抗與CAR-T細胞療法組合相較於單獨CAR-T可將神經炎症減少約90%，如根據定量MRI T1高強度信號所評估。此為標誌性研究結果且首次活體內證明，可有效地消除由CAR-T細胞療法引起的神經炎症。冷自魯單抗 + CAR-T細胞療法之後的MRI影像類似於治療前的基線掃描，此與對照抗體 + CAR-T細胞療法之後顯示炎症明顯增加的MRI影像形成鮮明對比。此外，相較於經CAR-T及對照抗體治療的小鼠，在經冷自魯單抗 + CAR-T治療之小鼠的腦中見到骨髓細胞減少。此研究結果與使用CD19 CAR-T細胞療法之臨床試驗中所報告的資料一致，其中在重度神經毒性級別＞3的患者CSF中觀測到骨髓細胞增加。另外，發現冷自魯單抗與CAR-T細胞療法組合相較於CAR-T + 對照抗體可減少CRS的發作及嚴重度。此研究結果得到以下支持：經CAR-T + 對照物治療之小鼠中所見之體重出現統計學顯著降低、大部分目標標記物及活體內所見之CRS標誌症狀。相較於CAR-T + 對照，冷自魯單抗 + CAR-T治療之小鼠的體重維持在基線水準( p＜0.05)。此外，經CAR-T + 對照抗體治療的小鼠呈現與CRS一致的身體症狀，包括拱起姿勢、回縮及無力，而經CAR-T + 冷自魯單抗治療的小鼠顯得健康。重要的是，在包括PBMC的此等CRS/NT實驗中，相較於CAR-T + 對照物，冷自魯單抗 + CAR-T使得CAR-T細胞的增殖亦展現5倍的顯著增加。先前已在使用各種CD19 CAR-T細胞療法的臨床試驗中顯示，改善的CAR-T增殖或擴增與改善的功效(包括ORR、CR)相關，表明冷自魯單抗可潛在地改善抗腫瘤反應。已知由GM-CSF促進的MDSC擴增及遷移之減少可部分地解釋此研究結果。最後，相較於CAR-T與對照抗體，冷自魯單抗 + CAR-T的組合使得白血病得到顯著更好的控制，如流式細胞術所定量。相較於未治療之小鼠(其具有500,000至1.5M個白血病細胞)及CAR-T + 對照抗體治療之小鼠(其具有15,000至100,000個白血病細胞)，CAR-T + 冷自魯單抗療法使得白血病細胞數目顯著減少(減少至500至5,000個細胞)，總體疾病控製得到改善(參見圖 25A 至圖 25D)。

圖 25A中的MRI影像顯示CAR-T細胞與根據本文所述實施例之抗GM-CSF中和抗體所投與之小鼠之腦的神經毒性(NT)(神經炎症)出現明顯的改善。相比之下，CAR-T細胞及對照抗體所投與之小鼠之腦的MRI影像顯示神經毒性徵象。圖 25B以圖形說明第1組小鼠的NT相較於第2組小鼠增加的NT減少90%。CAR-T細胞與根據本文所述實施例之抗GM-CSF中和抗體投與之後發生定量改善的程度(NT減少90%)為出乎意外的研究結果。結論

在使用人類ALL母細胞、人類CD19 CAR-T及人類PBMC的情況下，抗GM-CSF抗體(冷自魯單抗)當與CAR-T細胞療法組合時展現預防CRS及NT發作及嚴重度的潛力，同時改善活體內CAR-T擴增/增殖及總體白血病控制。此為首次證明可活體內消除CAR-T誘導的神經毒性。對冷自魯單抗與CAR-T細胞療法組合的關鍵臨床試驗已按照計劃驗證安全及功效改善的此等研究結果。實例 17 嵌合抗原受體 T 細胞 療法期間的 GM-CSF 阻斷使細胞介素釋放症候群及神經毒性減少且可增強其效應功能

嵌合抗原受體T細胞療法(CART)儘管其有功效，但受限於細胞介素釋放症候群(CRS)及神經毒性(NT)的出現。儘管CRS與細胞介素的急劇升高及大量的T細胞擴增有關，但NT的確切機制尚未得到闡明。初步研究表明，NT可能由穿越血腦障壁之骨髓細胞介導。得自CART19關鍵試驗的相關分析支持此結論，其中出現重度NT之患者之腦脊髓液中的CD14+細胞數目增加(Locke等人, ASH 2017)。因此，此研究旨在探究GM-CSF中和在預防經由單核球控制進行CART細胞療法後出現之CRS及NT的作用。

首先，探究GM-CSF阻斷對CART細胞效應功能的影響。在此，使用II期臨床試驗中已顯示安全的人類GM-CSF中和抗體(冷自魯單抗，Humanigen, Burlingame, California)。當用CD19+螢光素酶+急性淋巴母細胞白血病(ALL)細胞株NALM6刺激CART19細胞時，冷自魯單抗(10 μg/kg)中和GM-CSF，但不減弱活體外CART細胞功能。發現惡性疾病相關的巨噬細胞減少CART增殖。在單核球存在下，GM-CSF中和聯合冷自魯單抗使得CART細胞抗原特異性增殖增強。為了活體內證實此結論，將高疾病負荷的NALM6植入NOD-SCID-g-/-小鼠且用低劑量的CART19或對照T細胞(誘導腫瘤復發)與冷自魯單抗或同型對照抗體的組合加以治療。類似於經CART19與同型對照抗體組合治療的小鼠，CART19與冷自魯單抗的組合相較於對照T細胞產生顯著的抗腫瘤活性及總存活期益處( 圖 26A)，表明GM-CSF中和不能減弱活體內CART細胞活性。此抗腫瘤活性在ALL患者來源的異種移植模型中得到驗證。

接著，探究GM-CSF中和在患者來源的新異種移植模型中對CART細胞相關毒性的影響。在此，將來源於復發風險高之ALL患者的白血病母細胞(1至3x10 ⁶個細胞)植入NOD-SCID-g-/-小鼠。接著用高劑量的CART19細胞(2至5x10 ⁶個，靜脈內)治療小鼠。CART19治療之後的第五天，小鼠開始出現與循環中之人類細胞介素含量大幅升高相關的漸進性運動無力、身體拱起及體重減輕。在此症候群期間的腦磁共振成像(MRI)顯示擴散增強及水腫，此與中樞神經系統(CNS)被CART細胞及鼠類活化骨髓細胞浸潤相關。此與重度NT患者之CART19臨床試驗中所報告的類似。CART19、冷自魯單抗(中和人類GM-CS)及鼠類GM-CSF阻斷抗體(中和小鼠GM-CSF)的組合能夠防止體重減輕( 圖 26B)、減少臨限骨髓細胞介素( 圖 26C 至圖 26D)、減輕腦水腫( 圖 26E)、增強腦的白血病疾病控制( 圖 26F)及減少腦巨噬細胞( 圖 26G)。

最後，假設在CART細胞製造過程中經由CRISPR/Cas9基因編輯來破壞GM-CSF將產生GM-CSF分泌減少的功能CART細胞。設計靶向GM-CSF基因之外顯子3的嚮導RNA且產生GM-CSF ^k/oCART19細胞。初步資料表明，此等CART在活體外、在活化後產生的GM-CSF顯著減少，但繼續類似地產生其他細胞介素且展現正常效應功能( 圖 26H)。使用如上文所述的NALM6高腫瘤負荷復發型異種移植模型，GM-CSF ^k/oCART19細胞相較於CART19細胞使得疾病控制稍微得到增強( 圖 26I)。

因此，經由GM-CSF阻斷來調節骨髓細胞行為可有助於控制CART介導的毒性且可減少其免疫抑制特徵以改善白血病控制。此等研究闡明一種經由GM-CSF中和來消除NT及CRS的新穎方法，該新穎方法亦潛在地增強CART細胞功能。基於此等結果，已設計出II期臨床試驗，其使用冷自魯單抗作為預防彌漫性大B細胞淋巴瘤患者之CART相關毒性的模式。實例 18 在單核球存在下 ， GM-CSF 中和在活體外增強 CAR-T 細胞 增殖且不減弱 CAR-T 細胞 效應功能 細胞株及原代細胞

NALM6細胞株係購自ATCC, Manassas, VA, USA，且MOLM13細胞株為得自Mayo Clinic之Jelinek實驗室的禮物(購自DSMZ, Braunschweig, Germany)。此等細胞株用螢光素酶-ZsGreen慢病毒(Addgene, Cambridge, MA, USA)轉導且分選至100%純度。細胞株在R10 (用RPMI 1640 (Gibco, Gaithersburg, MD, US)、10%胎牛血清(FBS, Millipore Sigma, Ontaria, Canada)及1%青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸(Gibco, Gaithersburg, MD, US)製成)中培養。依據Mayo Clinic機構審查委員會(IRB)批准的方案，自Mayo Clinic生物資料庫獲得急性白血病患者的原代細胞。在實驗室中使用重組DNA係由Mayo Clinic機構生物安全委員會(IBC)批准。 原代細胞及 CAR-T 細胞

使用SepMate管(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)，自依據Mayo Clinic IRB批准之方案獲得的去標識化正常供者血液血球分離錐中分離出周邊血液單核細胞(PBMC)。使用EasySep ^TM人類T細胞分離套組(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)，利用負向選擇磁性珠粒分離出T細胞。使用來自Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany的人類單核球分離套組分離單核球，從而分離出CD14+單核球。原代細胞在T細胞培養基中培養，該培養基係用補充有10%人類血清白蛋白(Corning, NY, USA)及1%青黴素-鏈黴素-麩醯胺酸(Gibco, Gaithersburg, MD, USA)的X-Vivo 15 (Lonza, Walkersville, MD, USA)製成。如下文所述，經由慢病毒轉導正常供者T細胞來產生CART19細胞。從頭合成(IDT)第二代CART19構築體且在EF-1α啟動子的控制下選殖入第三代慢病毒中。指向CD19的單鏈可變區片段來源於純系FMC63。合成第二代4-1BB共刺激(FMC63-41BBz) CAR構築體且用於此等實驗。經由將質體在脂染胺3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、VSV-G及封裝質體(Addgene, Cambridge, MA, USA)存在下短暫轉染至產生293T病毒之細胞(來自Ikeda lab, Mayo Clinic的禮物)中來產生慢病毒粒子。自正常供者分離之T細胞使用細胞療法系統戴諾磁珠(Cell Therapy Systems Dynabeads) CD3/CD28 (Life Technologies, Oslo, Norway)以1:3比率刺激，且接著在以3.0之感染倍率(MOI)刺激之後的第24小時，用慢病毒粒子轉導。為了測定效價且隨後測定MOI，在濃縮慢病毒粒子之後，藉由用50 μL慢病毒轉導存在於100 μL T細胞培養基中的1x10 ⁵個原代T細胞來測定效價。首先，T細胞用CD3/CD28珠粒刺激且接著在24小時後用慢病毒粒子轉導。轉導在連續稀釋下重複執行三次。一天後，添加新鮮的T細胞培養基。兩天後，收集細胞，用PBS洗滌兩次且藉由流式細胞術測定T細胞上的CAR表現。效價係基於CAR陽性細胞的百分比測定(CAR+細胞的百分比×轉導時的T細胞計數×特定稀釋度/體積)且用每毫升的轉導單位來表示(TU/mL)。第6天執行磁珠移除且收集CAR-T細胞且在第8天低溫保存用於將來的實驗。將CAR-T細胞解凍且在其用於實驗之前，在T細胞培養基中靜置12小時。 GM-CSF 中和抗體 及同型對照

冷自魯單抗(Humanigen, Burlingame, CA)，一種根據本文所述實施例且如美國專利第8,168,183號及第9,017,674號(其各自以全文引用的方式併入本文中)中所述的hGM-CSF中和抗體，為中和人類GM-CSF的新穎首創Humaneered®單株抗體。活體外實驗使用10 μg/mL冷自魯單抗或 InVivoMAb人類IgG1同型對照物(BioXCell, West Lebanon, NH, USA)。對於活體內實驗，CART19注射當天開始每日腹膜內注射10 mg/kg冷自魯單抗或同型對照物，歷時10天。在一些實驗中，如實驗方案所指示，亦使用抗小鼠GM-CSF中和抗體( InVivoMAb抗小鼠GM-CSF, BioXCel, West Lebanon, NH, USA)或相應的同型對照物( InVivoMAb大鼠IgG2a同型對照物BioXCel, West Lebanon, NH, USA)。 T 細胞 功能實驗

如所指示，在CAR-T細胞與其標靶以1:1比率共培養之後的第24小時或第72小時，執行細胞介素分析。如所指示，對此等實驗收集的上清液或血清使用人類高靈敏度T細胞磁珠套件(Millipore Sigma, Ontario, Canada)、Milliplex人類細胞介素/趨化因子磁珠預混合38 Plex套組(Millipore Sigma, Ontario, Canada)或Milliplex小鼠細胞介素/趨化因子磁珠預混合32 Plex套組(Millipore Sigma, Ontario, Canada)。使用Luminex (Millipore Sigma, Ontario, Canada)進行分析。在CAR-T細胞與標靶以1:5比率在莫能菌素(BioLegend, San Diego, CA, USA)、hCD49d (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)及hCD28 (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)存在下培育4小時之後，執行細胞內細胞介素分析及T細胞去顆粒分析。4小時之後，收集細胞且在表面染色之後執行細胞內染色，隨後使用固定培養基A及B (Life Technologies, Oslo, Norway)進行固定及滲透。在增殖分析中，將CFSE (Life Technologies, Oslo, Norway)標記的效應細胞(CART19)與經輻照的靶細胞以1:1比率共培養。在一些實驗中，如所指示，以1:1:1比率將CD14+單核球添加至共培養物中。如特定實驗中所指示，將細胞共培養3至5天，且接著收集細胞且使用抗hCD3 (eBioscience, San Diego, CA, USA)及LIVE/DEAD™可固定淺綠色死細胞染劑套組(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)執行表面染色。如特定實驗所指示，使用不同濃度的PMA/離子黴素(Millipore Sigma, Ontario, Canada)作為T細胞的陽性非特異性刺激劑。在殺滅分析中，將CD19 ⁺螢光素酶 ⁺ALL細胞株NALM6或CD19 ^-螢光素酶 ⁺對照MOLM13細胞與效應T細胞以指定的比率培育24、48或72小時，如特定實驗中所列。根據Xenogen IVIS-200光譜相機(PerkinElmer, Hopkinton, MA, USA)的生物發光成像計算出殺滅率作為殘餘活細胞的量度。成像之前，用每100 μL樣品體積1 μl D-螢光素(30 μg/mL)(Gold Biotechnology, St. Louis, MO, USA)處理樣品10分鐘。 多參數流式細胞術

抗人類抗體及抗小鼠抗體係購自Biolegend、eBioscience或BD Biosciences (San Diego, CA, USA)。自活體外培養物或自動物周邊血液中分離出細胞。BD FACS溶解(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)之後，將其用補充有2% FBS (Millipore Sigma, Ontario, Canada)及1%疊氮化鈉(Ricca Chemical, Arlington, TX, USA)的磷酸鹽緩衝鹽水洗滌兩次且在4℃下染色。為了定量細胞數目，根據製造商說明書(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)使用Countbright珠粒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。在所有分析中，所關注之群體係基於正向相對於側向散射特徵來設門，隨後按照單態設門，且在用LIVE/DEAD™可固定淺綠色死細胞染色套組(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)染色之後，對活細胞設門。藉由用山羊抗小鼠F(ab')2抗體(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)染色來偵測CAR的表面表現。在三維雷射細胞儀Canto II (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)及CytoFLEX (Beckman Coulter, Chaska, MN, USA)上進行流式細胞術。使用FlowJo X10.0.7r2軟體(Ashland, OR, USA)及Kaluza 2.0軟體(Beckman Coulter, Chaska, MN, USA)進行分析。結果

在CAR-T細胞療法之後，若利用GM-CSF中和作為預防CRS及神經毒性的策略，則其不得抑制CAR-T細胞功效。因此，初始實驗旨在探究GM-CSF中和對CAR-T細胞效應功能的影響。在冷自魯單抗(hGM-CSF中和抗體)或同型對照物(IgG)存在下，將CART19細胞與CD19 ⁺ALL細胞株NALM6共培養或不共培養。已確定冷自魯單抗而非IgG對照抗體實際上能夠完全中和hGM-CSF ( 圖 27A)，但不能抑制CAR-T細胞抗原特異性增殖( 圖 27B)。ART19細胞與CD19 ⁺細胞株NALM6在單核球存在下共培養時，相較於CART19 + 同型對照IgG，冷自魯單抗與CART19的組合使抗原特異性CART19增殖出現指數級增加(P＜0.0001，圖 27C)。為了探究CAR-T特異性細胞毒性，將CART19或對照UTD T細胞與螢光素酶+CD19 ⁺NALM6細胞株一起培養且用同型對照抗體或GM-CSF中和抗體加以處理( 圖 27D)。GM-CSF中和抗體處理不抑制CAR-T細胞殺滅NALM6靶細胞的能力( 圖 27D)。總體而言，此等結果指示冷自魯單抗在活體外不抑制CAR-T細胞功能且在單核球存在下增強CART19細胞增殖，表明GM-CSF中和可改善CAR-T細胞介導的功效。實例 19 GM-CSF 中和在活體內、在異種移植模型中增強 CAR-T 細胞 抗腫瘤活性 小鼠異種移植模型

在Mayo Clinic的比較醫學部(Department of Comparative Medicine)內，依據Mayo Clinic實驗動物照護及使用委員會(IACUC)批准的培育方案培育雄性及雌性8至12週齡NOD-SCID-IL2rγ ^−/−(NSG)小鼠且照護。將小鼠在IBC批准的動物障壁空間中維持用於BSL2+含量的實驗。 NALM6 細胞株異種移植

依據IACUC批准的方案，使用CD19 ⁺螢光素酶 ⁺ALL NALM6細胞株建立ALL異種移植物。在此，經由尾靜脈注射，靜脈內(IV)注射1x10 ⁶個細胞。注射後的第4天至第6天，使用Xenogen IVIS-200光譜相機(PerkinElmer, Hopkinton, MA, USA)對小鼠進行生物發光成像，以證實移植。腹膜內(IP)注射10 μl/g D-螢光素(15 mg/mL，Gold Biotechnology, St. Louis, MO, USA)之後，執行成像10分鐘。接著基於小鼠生物發光成像將小鼠隨機分組以接受如特定實驗中所概述的不同療法。典型地，每隻小鼠靜脈內注射1至1.5x10 ⁶個CAR-T細胞(及T細胞總數相等的未轉導(UTD) T細胞)。CAR-T細胞轉導效率典型地為約50%。舉例而言，CAR-T細胞的轉導效率為50%時，接受1.5x10 ⁶個CAR-T細胞的小鼠接受總共3百萬個T細胞，且相應的UTD小鼠接受3x10 ⁶個UTD。每週執行成像以評估且追蹤疾病負荷。使用Xenogen IVIS-200光譜相機(PerkinElmer, Hopkinton, MA, USA)獲取生物發光影像且使用Living Image 4.4版(Caliper LifeSciences, PerkinElmer)加以分析。CAR-T細胞注射之後的第7天至第8天進行尾靜脈放血以評估T細胞擴增且隨後視需要評估細胞介素及趨化因子。使用BD FACS Lyse (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)對小鼠周邊血液進行紅血細胞溶解且接著用於流式細胞術研究。在CART細胞療法的同一天，抗體治療的小鼠開始每日腹膜內接受抗體療法(10 mg/kg冷自魯單抗或同型對照物)，歷時總共10天。 對小鼠腦組織進行 RNA-seq

使用miRNeasy Micro套組(Qiagen, Gaithersburg, MD, USA)分離RNA且用不含核糖核酸酶的去氧核糖核酸酶套件(Qiagen, Gaithersburg, MD, USA)加以處理。在Mayo Clinic，在Illumina HTSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, USA)上藉由基因體分析核心(Genome Analysis Core)進行RNA-seq。使用Illumina bcl2fastq軟體將二進制基址調用資料轉化為fastq。使用Trimmomatic，如Bolger, AM等人, Bioinformatics. 2014;30(15):2114-2120. 10.1093/bioinformatics/btu170 (該文獻以全文引用的方式併入本文中)所述移除接附子序列，且使用FastQC，如Leggett RM等人, Front Genet. 2013;4:288 (2014/01/02作為DOI 10.3389/fgene.2013.00288預出版，該文獻以全文引用的方式併入本文中)所述檢查品質。自NCBI下載最新的人類(GRCh38)及小鼠(GRCm38)參考基因體。使用STAR，如Dobin A等人, Bioinformatics. 2013;29(1):15-21. 10.1093/bioinformatics/bts635 (該文獻以全文引用的方式併入本文中)所述產生基因體索引檔案，且根據各種條件將成對的末端讀段相對於基因體定位。使用HTSeq，如Anders S等人, Bioinformatics. 2015;31(2):166-169 (2014/09/28作為DOI 10.1093/bioinformatics/btu638出版，該文獻以全文引用的方式併入本文中)所述產生各基因的表現計數，並且使用DeSeq2 ³⁸，如Love MI等人, Genome Biol. 2014;15(12):550 (2014/12/18作為DOI 10.1186/s13059-014-0550-8預出版，該文獻以全文引用的方式併入本文中)所述計算差異性表現。使用Enrichr，如Kuleshov MV等人, Nucleic Acids Research2016;44(W1):W90-W97. 10.1093/nar/gkw377 (該文獻以全文引用的方式併入本文中)所述來評估基因本體論。圖 35概述以上詳述之步驟。RNA定序資料可根據寄存編號GSE121591，在Gene Expression Omnibus獲得。

統計學

使用Prism Graph Pad (La Jolla, CA, USA)及Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA)分析資料。經由Prism將熱圖中的高細胞介素濃度相對於「1」標準化且將低濃度相對於「0」標準化。統計檢驗描述於圖例中。結果

為了證實GM-CSF耗竭不抑制CART19效應功能，探究GM-CSF中和聯合冷自魯單抗在異種移植模型中對CART19抗腫瘤活性的作用。首先，復發模型旨在有力地探究使用GM-CSF中和是否影響CART19細胞的抗腫瘤活性。向NOD/SCID/介白素-2受體γ剔除式(NSG)小鼠注射1x10 ⁶個螢光素酶 ⁺NALM6細胞且接著在6天後成像，從而允許有足夠的時間讓小鼠達成極高的腫瘤負荷。將小鼠隨機分組以接受CART19或UTD細胞的單次注射以及接受10天的同型對照抗體或冷自魯單抗( 圖 28A)。對CART19注射之後第8天收集的血清進行的GM-CSF分析揭露，在CART19療法的背景下，冷自魯單抗成功地中和GM-CSF ( 圖 28B)。CART19注射後第一週的生物發光成像顯示，CART19與冷自魯單抗的組合在此高腫瘤負荷復發模型中有效地控制白血病且比對照UTD細胞顯著更好( 圖 28C 至圖 28D)。類似於CART19聯合對照抗體，儘管GM-CSF含量被中和，但CART19與冷自魯單抗的組合療法產生強抗腫瘤活性及改善的總存活期，表明GM-CSF在活體內不減弱CAR-T細胞活性( 圖 36)。其次，在人類PBMC存在下，在原發ALL患者來源的異種移植模型中進行此等實驗，原因在於此模型代表著相關性更高的異源模型。使用白消安(busulfan)進行調節化學療法之後，向小鼠注射來源於ALL復發患者的母細胞。經由連續的尾靜脈放血來監測小鼠的植入數週，且當血液中的CD19 ⁺母細胞為約1/μL時，將小鼠隨機分組以接受CART19療法與PBMC的組合，其中在CART 19注射當天開始接受冷自魯單抗 + 抗小鼠GM-CSF中和抗體或同型對照IgG抗體，歷時10天( 圖 28E)。在此原發ALL異種移植模型中，相較於CART19 + 同型對照物，GM-CSF中和與CART19療法的組合使得白血病疾病控制得到顯著改善，此改善在CART19投與後持續至少35天的時間( 圖 28F)。此表明在CART19細胞療法之後，GM-CSF中和可發揮減少復發及增強持久完全反應的作用。實例 20 GM-CSF ^k/oCART19 的產生

經由篩選先前據報導對人類GM-CSF具有高效率之gRNA來選擇靶向人類GM-CSF之外顯子3的嚮導RNA (gRNA)，如以下文獻中所述：Sanjana NE等人, Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 2014;11(8):783-784. 2014/07/31作為DOI 10.1038/nmeth.3047預出版，所述文獻以全文引用的方式併入本文中。此gRNA在CAS9第三代慢病毒構築體(lentiCRISPRv2)中為有序的，處於U6啟動子(GenScript, Township, NJ, USA)的控制下。如上文所述產生編碼此構築體的慢病毒粒子。T細胞在CD3/CD28珠粒刺激之後的第24小時，用CAR19及GM-CSFgRNA-lentiCRISPRv2慢病毒雙重轉導。接著如上文所述繼續進行CAR-T細胞擴增。為了分析靶向GM-CSF的效率，使用PureLink基因體DNA小型套組(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)自GM-CSF ^k/oCART19細胞提取基因體DNA。使用Choice Taq Blue Mastermix (Thomas Scientific, Minneapolis, MN, USA)對所關注之DNA進行PCR擴增且使用QIAquick凝膠提取套組(Qiagen, Germantown, MD, USA)萃取凝膠以測定編輯。將PCR擴增子送交Eurofins定序(Louisville, KY, USA)且使用TIDE (藉由分解來追蹤插入缺失)計算對偶基因修飾頻率，TIDE為僅需兩個平行PCR反應、隨後進行一對標準毛細管定序分析的方法；接著使用專門設計的軟體分析兩個所得定序軌跡，該軟體作為簡單的網路工具及可在tide.nki.nl獲得的R代碼提供，如以下文獻所述：Brinkman EK等人, Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research.2014;42(22):e168. 2014/10/11作為DOI 10.1093/nar/gku936預出版，所述文獻以全文引用的方式併入本文中。圖 34B描述gRNA序列及引子序列，且圖 34A(i) 至圖 34A(iv)描繪GM-CSF ^k/oCART19方案的產生流程。實例 21 GM-CSF CRISPR 基因剔除的 CAR-T 細胞 展現減少的 GM-CSF 表現、含量類似的關鍵細胞介素及趨化因子 ， 以及增強的抗腫瘤活性

為了確信地排除GM-CSF在CAR-T細胞功能中關鍵的任何作用，在CAR-T細胞製造期間使用gRNA破壞GM-CSF基因，已報導該gRNA可達成高效率的基因剔除且選殖入CRISPR慢病毒主鏈中，如以下文獻所述：Sanjana NE等人, Nature Methods.2014;11(8):783-784. 2014/07/31作為DOI 10.1038/nmeth.3047預出版，該文獻以全文引用的方式併入本文中。吾等使用此gRNA使CART19細胞中達成約60%基因剔除效率( 圖 37)。當用CD19 ⁺細胞株NALM6刺激CAR-T細胞時，GM-CSF ^k/oCAR-T細胞產生的GM-CSF在統計學上顯著低於具有野生型GM-CSF基因座的CART19 (「野生型CART19細胞」)。CAR-T細胞的GM-CSF基因剔除不減弱T細胞之其他關鍵細胞介素的產生，包括IFN-γ、IL-2或CAR-T細胞抗原特異性去顆粒(CD107a)( 圖 29A)，但展現減少的GM-CSF表現( 圖 29B)。為了證實GM-CSF ^k/oCAR-T細胞繼續展現正常功能，測試其在活體內、在高腫瘤負荷ALL復發性異種移植模型中的功效(如圖 28A中所述)。在此異種移植模型中，在CART19治療之後的第7天，利用GM-CSF ^k/oCART19代替野生型CART19使人類GM-CSF的血清含量明顯降低( 圖 29B)。生物發光成像資料顯示，GM-CSF ^k/oCART19細胞在此模型中對白血病的控制相較於CART19增強( 圖 38)。重要的是，相較於野生型CART19細胞，GM-CSF ^k/oCART19細胞使總存活期展現顯著的改善( 圖 29C)。根據t檢驗，相較於野生型CART19，GM-CSF ^k/oCART19細胞使人類GM-CSF在統計學上出現顯著的減少( 圖 29D)。小鼠GM-CSF目測似乎增加，但根據t檢驗，此增加在統計學上不顯著(P=0.472367) ( 圖 29E)。小鼠GM-CSF減少的此缺乏不一定令人驚訝，原因在於GM-CSF ^k/oCART19細胞(其為人類細胞)為僅存在於發生該基因剔除之小鼠內的細胞，因此小鼠GMCSF不大可能受到直接影響。根據目視檢查，小鼠IP-10 (一種趨化因子，其吸引多種細胞類型，包括T細胞及單核球)使GM-CSF ^k/oCART19相較於CART19出現異常的增加，但此在統計學上亦不顯著，根據t檢驗為P=0.4877 ( 圖 29E)。根據目視檢查，小鼠MIP1α (一種發炎性細胞介素，其在吸引嗜中性白血球方面具有重要作用)及小鼠M-CSF (一種細胞介素，其在巨噬細胞分化方面具有關鍵作用)似乎減少，但其在統計學上不顯著，P=0.2437及P=0.3619 ( 圖 29E)。小鼠IL-1b (一種由巨噬細胞產生的關鍵發炎性細胞介素)及小鼠IL-15 (一種由巨噬細胞產生的細胞介素，其有助於NK細胞增殖)似乎使GMCSF ^k/oCART19相較於CART19減少( 圖 29E)，P值分別為P=0.0741及P=0.0900 ( 圖 29E)。GM-CSF ^k/o不抑制人類T細胞的關鍵細胞介素( 圖 29D)。應強調的是，此等異種移植物係經由高負荷的NALM6細胞株產生，且吾等CRS/NI模型( 圖 30A至圖 30D、圖 31、圖 32A 至圖 32D ，及圖 33A至圖 33D)需要利用原發ALL細胞才可產生。因此，在兩種模型之間，細胞介素概況的不同不令人驚訝，原因為NALM6異種移植物( 圖 29A至圖 29E)未出現CRS或NI。總之，在NALM6高腫瘤負荷模型未出現CRS的背景下，圖 29A 至圖 29E的結果證實了圖 27A至圖 27D及圖 28A至圖 28F，表明GM-CSF耗竭未減弱對於CAR-T功效功能而言關鍵的正常細胞介素或趨化因子。另外，圖 29A至圖 29E的結果表明，GM-CSF ^k/oCART可代表一種治療選項，其在CAR-T細胞製造期間達成「嵌入式」GM-CSF控制作為一種變型。實例 22 神經炎症 (NI) 及細胞介素釋放症候群的患者源異種移植模型 / 在 CART19 療法之後 ， GM-CSF 中和在活體內使異種移植模型的細胞介素釋放症候群及神經炎症改善 患者源原發 ALL 異種移植物

為了建立原發ALL異種移植物，NSG小鼠首先腹膜內接受30 mg/kg白消安(Selleckchem, Houston, TX, USA)。次日，向小鼠注射2.5x10 ⁶個原代母細胞，該等母細胞來源於復發性或難治性ALL患者的周邊血液。監測小鼠的移植約10週至13週。當觀測到血液中始終存在CD19 ⁺細胞(約1個細胞/μL)時，將其隨機分組以接受不同療法：CART19 (2.5x10 ⁶個細胞，靜脈內)及來源於同一供者之PBMC (1x10 ⁵個細胞，靜脈內)聯合或不聯合抗體療法(10 mg/kg冷自魯單抗或同型對照物，腹膜內，其接受CAR-T細胞療法的當天開始總共10天)。經由尾靜脈放血來定期監測小鼠的白血病負荷。用於 CRS/NI 的 患者源原發 ALL 異種移植物

類似於上述實驗，向小鼠腹膜內注射30 mg kg白消安(Selleckchem, Houston, TX, USA)。次日，小鼠接受1至3x10 ⁶個原代母細胞，該等母細胞來源於ALL復發患者的周邊血液。經由尾靜脈放血來監測小鼠的植入約10至13週。當血清CD19+細胞每微升≥10個細胞時，小鼠接受CART19 (2至5x10 ⁶個細胞，靜脈內)且開始抗體療法總共10天，如所指示。小鼠每日稱重作為其健康的量度。CART19注射後的第5至6天，執行小鼠腦MRI，且在CART19注射後的第4至11天執行尾靜脈放血用於細胞介素/趨化因子及T細胞分析。 MRI 擷取

使用Bruker Avance II 7 Tesla豎直鑽孔式小動物MRI系統(Bruker Biospin)擷取影像以評價中樞神經系統(CNS)血管通透性。經由3至4%異氟醚誘導且維持吸入性麻醉。在擷取階段期間，使用MRI相容性生命徵象監視系統(型號1030；SA Instruments, Stony Brook, NY)監測呼吸率。使用100 mg/kg之基於體重的劑量，向小鼠腹膜內注射釓，且在15分鐘的標準延遲之後，使用容積擷取T1加權式自旋回波序列(重複時間 = 150 ms，回波時間 = 8 ms，視野：32 mm×19.2 mm×19.2，矩陣：160×96×96；平均次數 = 1)獲取T1加權影像。釓增強型MRI變化指示血腦障壁破壞。 ²⁴使用Mayo Clinic的Biomedical Imaging Resource開發的分析套裝軟體來執行容積分析。結果

在此模型中，將原發ALL母細胞植入適應的NSG小鼠且監測移植數週，直至其出現高疾病負荷( 圖 30A)。當周邊血液中的CD19 ⁺母細胞含量＞10/μL時，如所指示，將小鼠隨機分組以接受不同療法( 圖 30A)。CART19療法(聯合對照IgG抗體或GM-CSF中和抗體)成功地根除疾病( 圖 30B)。在CART19治療之後的第4天至第6天內，小鼠開始出現運動無力、身體拱起及漸進性體重減輕；症狀與CRS及NI一致。與CAR-T細胞療法後之人類CRS中所見類似，此與CART19注射後第4天至第11天的關鍵血清細胞介素及趨化因子(包括人類GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-13、IL-2、IL-3、IP-10、MDC、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β及小鼠IL-6、GM-CSF、IL-4、IL-9、IP-10、MCP-1及MIG)升高相關。如揭露異常T1增強(表示血腦障壁破壞及可能的腦水腫)之腦MRI分析( 圖 30C)以及揭露人類CART19細胞浸潤之對所收集腦的流式細胞分析( 圖 30D)所指示，經CART19治療的此等小鼠亦出現NI。另外，自出現NI之此等徵象之小鼠收集之腦切片的RNA-seq分析顯示，調控T細胞受體、細胞介素受體、T細胞免疫活化、T細胞遷移以及T細胞及骨髓細胞分化的基因顯著上調( 圖 31，表 6)。

表6 ： 以表形式列舉的在CART19 細胞治療之後 ， 來自患者源異種移植物之腦中改變之典型路徑的表.

典型路徑	經調整的 P 值	基因
調控免疫反應 (GO:0050776)	9.45E-14	IFITM1, ITGB2, TRAC, ICAM3, CD3G, PTPN22, CD3E, ITGAL, SAMHD1, SLA2, CD3D, ITGB7, SLAMF6, B2M, NPDC1, CD96, BTN3A1, ITGA4, SH2D1A, HLA-B, HLA-C, BTN3A2, HLA-A, CD8B, SELL, CD8A, CD226, CD247, CLEC2D, HCST, BIRC3
細胞介素介導的信號傳導路徑 (GO:0019221)	1.36E-12	IFITM1, SP100, TRADD, ITGB2, IL2RG, SAMHD1, IL27RA, OASL, CNN2, IL18RAP, RIPK1, CCR5, IL12RB1, B2M, GBP1, IL6R, JAK3, CCR2, IL32, ANXA1, IL4R, TGFB1, IL10RB, IL10RA, STAT2, PRKCD, HLA-B, HLA-C, IL16, HLA-A, TNFRSF1B, CD4, IRF3, OAS2, IL2RB, FAS, TNFRSF25, LCP1, P4HB, IL7R, MAP3K14, CD44, IL18R1, IRF9, MYD88, BIRC3
T 細胞受體複合物 (GO:0042101)	1.30E-11	ZAP70, CD4, CD6, CD8B, CD8A, CD3G, CD247, CD3E, CD3D, CARD11
T 細胞活化 (GO:0042110)	2.07E-11	ITK, RHOH, CD3G, NLRC3, PTPN22, CD3E, SLA2, CD3D, CD2, ZAP70, CD4, PTPRC, CD8B, CD8A, LCK, CD28, LCP1, LAT
調控 T 細胞活化 (GO:0050863)	2.46E-10	PTPN22, LAX1, CCDC88B, CD2, CD4, LCK, SIT1, TBX21, TIGIT, JAK3, LAT, PAG1, CCR2
T 細胞受體信號傳導路徑 (GO:0050852)	4.35E-08	ITK, BTN3A1, TRAC, WAS, CD3G, PTPN22, BTN3A2, CD3E, CD3D, ZAP70, CD4, PTPRC, LCK, GRAP2, LCP2, CD247, CARD11, LAT, PAG1
正調控細胞介素產生 (GO:0001819)	1.57502E-07	GBP5, ANXA1, TGFB1, CYBA, PTPN22, PARK7, TMEM173, CCDC88B, MAVS, CD6, IRF3, CD28, RIPK1, SLAMF6, CD46, IL12RB1, TIGIT, IL6R, CARD11, MYD88, CCR2
T 細胞分化 (GO:0030217)	2.36E-07	ZAP70, CD4, ANXA1, PTPRC, CD8A, LCK, CD28, RHOH, PTPN22, CD3D
細胞介素受體活性 (GO:0004896)	2.43E-07	IL4R, IL10RB, IL10RA, IL2RG, CD4, CXCR3, IL2RB, CCR5, IL12RB1, IL7R, IL6R, CD44, CCR2
I 型干擾素信號傳導路徑 (GO:0060337)	3.27E-07	IFITM1, SP100, IRF3, OAS2, STAT2, HLA-B, HLA-C, HLA-A, SAMHD1, IRF9, MYD88, OASL
對細胞介素的反應 (GO:0034097)	0.0004679	SIGIRR, IFITM1, SP100, HCLS1, RIPK1, PTPN7, IKBKE, IL6R, JAK3, IL18R1, MYD88, AES
調控先天免疫反應 (GO:0045088)	0.001452	GBP5, GFI1, STAT2, ADAM8, NLRC3, PTPN22, SAMHD1, BIRC3
調控腫瘤壞死因子產生 (GO:0032680)	0.003843	CD2, MAVS, CYBA, NLRC3, PTPN22, RIPK1, SLAMF1
T 細胞受體結合 (GO:0042608)	0.0102397	LCK, CD3G, CD3E
調控腫瘤壞死因子介導的信號傳導路徑 (GO:0010803)	0.0124059	SHARPIN, TRADD, CASP4, RIPK1, TRAF1, BIRC3
正調控骨髓白血球分化 (GO:0002763)	0.0376647	CD4, HCLS1, RIPK1, EVI2B

使用圖 30A中所示之NI及CRS的患者源異種移植模型，探究GM-CSF中和對CART19毒性的影響。為了排除小鼠GM-CSF的混淆效應，小鼠接受CART19細胞與10天GM-CSF抗體療法(10 mg/kg冷自魯單抗及10 mg/kg抗小鼠GM-CSF中和抗體)或同型對照抗體的組合。CART19療法之後，GM-CSF中和抗體療法在統計學上顯著減少CRS誘導的體重減輕( 圖 32A)。CART19細胞療法之後第11天的細胞介素及趨化因子分析顯示，人類GM-CSF被抗體中和( 圖 32B)。另外，GM-CSF中和引起若干人類細胞介素及趨化因子(IP-10、IL-3、IL-2、IL-1Ra、IL-12p40、VEGF、GM-CSF)(圖32C)及小鼠細胞介素及趨化因子(MIG、MCP-1、KC、IP-10)( 圖 32D)顯著減少。干擾素γ誘導的蛋白質(IP-10、CXCL10)係由其他細胞類型中的單核球產生且充當多種細胞類型(包括單核球、巨噬細胞及T細胞)的趨化因子。IL-3在骨髓祖細胞分化方面發揮作用。IL-2為T細胞關鍵的細胞介素。介白素-1受體拮抗劑(IL-1Ra)抑制IL-1。(IL-1係由巨噬細胞產生且屬於關鍵發炎性細胞介素家族)。IL-12p40為IL-12亞單元，其由其他細胞類型中的巨噬細胞產生且可促進Th1分化。血管內皮生長因子(VEGF)促進血管形成。γ干擾素誘導的單核球激素(MIG，CXCL9)為T細胞趨化因子。單核球趨化蛋白1 (MCP-1、CCL2)吸引單核球、T細胞及樹突狀細胞。KC (CXCL1)係由其他細胞類型中的巨噬細胞產生且吸引骨髓細胞，諸如嗜中性白血球。GM-CSF中和之後，人類及小鼠的其他若干細胞介素及趨化因子亦出現統計學上非顯著的減少。此表明GMCSF在若干細胞介素及趨化因子的下游活性方面發揮作用，該等細胞介素及趨化因子在引起CRS及NI的級聯中起重要作用。

相較於CART19 + 對照抗體，CAR19治療後第5天的腦MRI顯示，GM-CSF中和減少了T1增強，T1增強為腦炎、血腦障壁破壞及可能水腫的量度。GM-CSF中和(聯合冷自魯單抗及抗小鼠GM-CSF抗體)之後的MRI影像類似於治療前的基線掃描，表明GM-CSF中和有效地幫助消除與CART19療法相關的NI ( 圖 33A及圖 33B)。藉由在此患者源異種移植模型中使用人類ALL母細胞及人類CART19，CART19之後的GM-CSF中和使神經炎症相較於CART19 + 同型對照物減少75% ( 圖 33B)。此為重要的研究結果且首次活體內證明，可有效地消除由CART19引起的NI。CART19療法之後，人類CD3 T細胞存在於腦中，如流式細胞術所分析，且在利用GM-CSF中和的情況下，腦CD3 T細胞減少的原始平均值存在差異，但此差異不滿足統計顯著性( 圖 33C、圖 30D及圖 39)。最後，觀測到接受GM-CSF中和之小鼠在CAR-T細胞療法期間，其腦中之CD11b+亮巨噬細胞減少的原始平均值相較於CAR-T療法期間的同型對照組( 圖 33D)存在差異(但此差異未達到統計顯著性)，可能暗示著GM-CSF中和有助於減少腦內的巨噬細胞。

實例18至19及22的結果證明，GM-CSF中和消除了CAR-T細胞療法之後的毒性且可增強其治療活性。特定言之，已顯示GM-CSF中和與CART19療法的組合預防CRS的出現且在使用人類ALL母細胞及人類CART19的異種移植模型中顯著降低NI嚴重度。GM-CSF中和引起與骨髓遷移相關的趨化因子(諸如IP-10、MCP-1、KC)及其他發炎性細胞介素及趨化因子減少，且與腦中之T細胞浸潤及骨髓細胞活化的原始平均值降低(但在統計學上不顯著)相關。令人感興趣的是，本文中的實驗亦表明GM-CSF抑制使活體內的CART19增殖、抗腫瘤活性及總存活率增強。基於此等結果，GM-CSF中和可被視為達成常規CAR-T細胞免疫療法的潛在下一代策略。

在本文所述之研究中，GM-CSF中和聯合冷自魯單抗不減弱活體外的任何CART19效應功能。在兩種不同的異種移植模型(NALM6異種移植物及患者來源的異種移植物)中，CART19與冷自魯單抗的組合有效地根除腫瘤，但GM-CSF中和在治療後的第35天顯著改善白血病疾病控制，而CART19 + 同型對照物在35天之後無法維持疾病控制。最後，在實例21至22中，GM-CSF ^k/oCART19細胞在活體外展現強效應功能，且相較於CART19，在活體內展現顯著改善的總存活率。

本文中所述之CRS及NI模型為一種獨特且相關的ALL患者源異種移植模型，其用於開發針對人類CAR-T細胞療法後之毒性的療法。在本文所述之模型中，CAR-T細胞輸注直至症狀發作、腦MRI變化、細胞介素及趨化因子升高以及效應細胞浸潤至CNS之間的時間間隔皆類似於CART19療法之後出現毒性之患者所報告的時間間隔。小鼠出現CRS及NI症狀(體重減輕、運動機能衰退及身體拱起)。CART19細胞輸注之後的第4天至第6天，偵測到腦MRI發生變化。在重度神經毒性的情況下，腦MRI T1攝入暗示著血腦障壁破壞及可能的腦水腫且類似於對人腦MRI所注意到的變化，如以下文獻所述：Gust等人, 2017 Cancer Discovery. 2017;7(12):1404-1419, 2017/10/14作為DOI 10.1158/2159-8290.CD-17-0698預出版，該文獻以全文引用的方式併入本文中。

有趣的是，Gust等人(2017)進一步描述了血腦障壁通透性阻礙了避免全身細胞介素所致的CSF，全身細胞介素誘導血管周細胞應激及內皮活化細胞介素的分泌，且患者顯示內皮細胞活化的證據。在本文所述之CRS/NI模型中，相較於CART19與同型對照抗體，發現GM-CSF在接受CART19療法聯合GM-CSF中和抗體之小鼠的血清中被中和。因此，小鼠腦自身內的T細胞可提供GM-CSF產生，且在其他細胞介素及趨化因子中，血清GM-CSF能夠達成CSF。另外，內皮細胞能夠產生GM-CSF，其可導致惡性循環。類似於CAR-T誘導神經毒性之患者以及非人類靈長類動物模型中的CSF變化，NI與CNS中的T細胞浸潤及骨髓細胞活化相關。本文中所述之模型類似於先前報導的患者源異種移植模型，其中在CAR-T細胞療法之後，出現CRS。近期報導表明，阻斷IL-1係經由骨髓細胞的耗竭來預防NI。然而，在該模型中，NI的出現延遲且腦膜變厚有關，此與本文所述之模型中及接受CART19療法之患者中所觀測到的不同。因此，本文所述之模型作為一種探究新穎介入的方式提供，以便預防及治療CART19細胞療法之後出現的CRS及神經毒性。本文所述之結果顯示，GM-CSF中和引起關鍵的骨髓及若干發炎性細胞介素及趨化因子減少，表明GM-CSF在若干細胞介素及趨化因子的下游活化方面為關鍵細胞介素；阻斷作用造成腦/CNS中之骨髓細胞及T細胞浸潤的原始平均值降低(但未達到統計顯著性)；且阻斷作用有助於減少明顯神經毒性的神經炎症。

有趣的是，在GM-CSF阻斷的情況下，觀測到CART19細胞增殖出現指數級增加，抗腫瘤活性增強且總存活率改善。舉例而言，GM-CSF中和之後，CART19抗原特異性增殖在單核球存在下、在活體外增強。此外，在ALL患者源異種移植物中，CART19細胞當與冷自魯單抗組合時使得疾病控制更持久。另外，發現GM-CSF ^k/oCAR-T細胞在控制NALM6異種移植物的白血病方面更有效且展現改善的總存活率。儘管當前不清楚GM-CSF耗竭之後的CART效應功能增強機制，但本文提供的結果與先前報導一致，表明單核球減弱T細胞的離體擴增且M2極化的巨噬細胞抑制CART19抗原特異性增殖。此為重要的研究結果，因為在所有CAR-T臨床試驗中，CAR-T細胞增殖的改善始終與功效及反應(亦即，總體反應率及完全反應率)的改善相關。

已知活化T細胞產生GM-CSF。T細胞不具有GM-CSF受體的所有亞單元，因此在普通環境中，GM-CSF對T細胞通常無直接反饋，但在有些環境中，其可處於極高的含量。實際上，此GM-CSF影響多種其他細胞類型的行為，包括巨噬細胞及樹突狀細胞。此等細胞的隨後活化產生了作用，從而起到刺激T細胞的作用，諸如細胞介素產生及抗原呈遞。T細胞刺激可進一步驅動GM-CSF及其他細胞介素的產生，此又作用於其他細胞類型樣的巨噬細胞及樹突狀細胞，從而驅動循環。在CAR-T細胞療法中，在極短時間線產生的大量活化T細胞有可能將此循環推動至極端的情形。本文所述之結果表明阻斷GM-CSF有助於防止此免疫過度刺激而不損害T細胞功能，實際上增強了T細胞功能。GM-CSF阻斷之後的CAR-T細胞效應功能增強之確切機制不清楚。

最後，本文提供的結果另外表明，GM-CSF ^k/oCART19細胞的開發可代表著一種部分地控制GM-CSF產生的新穎方式，該方式可併入當前的CAR-T細胞製造中。此等結果表明，此等細胞正常發揮功能且可代表一種獨立的治療方案以在CAR-T細胞療法之後增強治療窗。抗GM-CSF抗體，諸如冷自魯單抗，為中和GM-CSF、消除明顯神經毒性所致之CRS與神經炎症且潛在地改善CAR-T細胞功能的臨床階段治療方案。

本文所述之研究在瞭解及預防CAR-T細胞療法之後出現的毒性方面代表著重大的進展。此等結果強有力地表明，經由GM-CSF阻斷來調節骨髓細胞行為有助於控制CAR-T細胞介導的毒性且減少其免疫抑制特徵以改善白血病控制。此等研究闡明一種經由GM-CSF中和來消除明顯神經毒性及CRS之神經炎症的新穎方案，該GM-CSF中和亦潛在地增強CAR-T細胞功能。實例 23 抗 GM-CSF 單株抗體 ( 冷自魯單抗 ) 投與異種移植模型顯著減少由 CAR-T 療法引起的神經炎症且維持血腦障壁的完整性

此臨床前研究設計成密切地複製CAR-T臨床試驗中所觀測到的研究結果且使用人類急性淋巴母細胞白血病(ALL)、靶向人類CD19的CAR-T (CART19)及人類周邊血液單核細胞(PBMC)且在小鼠中執行。 患者源原發 ALL 異種移植物

基本上如實例 22中所述，在小鼠中建立ALL異種移植物。 MRI 擷取

BBB完整性可藉由磁共振成像(MRI)非侵入性地監測。為了偵測及定量BBB滲漏，將含有釓的習知MR造影劑(CA)聯合MRI使用。在正常環境下，CA不穿越完整BBB。然而，即使BBB部分地受損，CA亦因其尺寸小而自血液滲入腦組織中。

基本上如實例 22中所述獲取MRI。如Ku, MC等人, Methods Mol Biol.2018;1718:395-408. doi: 10.1007/978-1-4939-7531-0_23所述(該文獻以全文引用的方式併入本文中)的基於CA注射之前及之後所攝之T ₁加權影像的釓增強型MRI方法與本發明對冷自魯單抗及CART19進行臨床前研究所用的MRI方法一致。此釓增強型MRI方法適用於探究活體內小鼠模型的BBB通透性且可容易應用於多種實驗性疾病病狀，包括神經炎症，或用於評估(非)所需的藥物作用。 共焦顯微鏡法

利用共焦顯微鏡法評估血腦障壁(本文中亦稱為BBB)的缺損/破壞。此顯微技術係利用空間濾光來消除比焦點平面更厚之試樣中的離焦光或光斑；因而，共焦顯微鏡法具備優於習知光學顯微法的若干優點，包括場深可控、消除影像劣化性離焦資訊，及能夠自厚試樣收集連續光學切面。結果 CAR-T 及冷自魯單抗療法之後 ， BBB 完整性得以保持且神經炎症顯著減少

在本發明的研究中，第5天所攝取的MRI影像定性地揭露CAR-T療法引起彌散性神經炎症，而冷自魯單抗 + CAR-T組合療法之後所攝取的MRI影像顯示神經炎症顯著減少，類似於未治療對照組(參見圖33A)。經由釓增強型T1高強度信號定量MRI顯示，相較於CAR-T + 對照抗體，冷自魯單抗 + CAR-T使神經炎症顯著減少75% ( 圖 33A)。此外，共焦顯微鏡法的高解析度影像清楚地顯示，在CAR-T療法之後，BBB顯著受損( 圖 40A)，此與定性地顯示CAR-T療法引起彌散性神經炎症的MRI影像一致(參見圖33A)。相比之下，共焦顯微鏡法顯示冷自魯單抗與CAR-T的組合使BBB完整性得以維持( 圖 40A)，此與冷自魯單抗 + CAR-T組合療法之後所攝取的顯示神經炎症相較於CAR-T + 同型對照物顯著減少的定性及定量MRI影像一致。圖 40A顯示共焦顯微鏡法BBB資料。圖 33A為使用釓增強型T1高強度信號的證明性定量MRI，其顯示三個治療組：未治療組對CART19 + 冷自魯單抗對CART19 + 同型對照物。共焦顯微鏡法結果具有決定作用，原因在於其有助於解釋CAR-T誘導神經炎症的病理學。此資料表明在CAR-T投與之後，BBB受損，從而使促炎性細胞介素能夠大量流入CNS，咸信此引起神經炎症擴散。此資料與CAR-T臨床試驗中所報導的資料一致。在其中經嵌合抗原受體(CAR)轉導之自體T細胞(伊斯卡他(Yescarta))以2×10 ⁶個抗CD19 CAR T細胞/kg之目標劑量靜脈內投與的ZUMA-1研究中，發現出現3+級神經毒性之患者的CNS中存在顯著增加的促炎性細胞介素。本發明的共焦顯微鏡法資料有助於解釋冷自魯單抗的添加為何且如何顯著減少CAR-T誘導的神經炎症。

MRI影像定性地顯示在CAR-T療法(CART19)投與後的第5天，出現彌散性神經炎症及BBB缺損。當冷自魯單抗與CAR-T共投與時，BBB完整性得以保持/維持且在冷自魯單抗 + CAR-T之組合療法之後的第5天所攝取的MRI影像顯示神經炎症顯著減弱，類似於未治療對照組(參見圖33A)。此外，共焦顯微鏡法揭露此結果與MRI成像資料完全一致，表明在冷自魯單抗及CAR-T之後，神經炎症及BBB缺損相較於CAR-T及對照抗體減少75% (此分析中的Y軸為 釓增強型 T1 高強度信號)。

CART 與 冷自魯單抗療法之後 ， CART19 細胞增殖呈指數級增加且白血病疾病控制顯著改善

相較於CART19 + 對照物，CART19療法之後投與冷自魯單抗亦使得CART19細胞增殖呈指數級增加且使白血病疾病控制得到顯著改善，持續時間為CART19輸注後至少35天，如實例 22中所述。此等結果表明CART19療法之後，GM-CSF中和聯合抗GM-CSF單株抗體(冷自魯單抗)可起到減少復發及增強持久完全反應的作用。鑒於超過50%成年淋巴瘤患者初始對CART19療法有反應、隨後在隨訪第一年內復發，因此此為有價值的研究結果。

圖 40B(由以下文獻改編：Santomasso, BD等人, 2018年6月7日首次線上出版; DOI: 10.1158/2159-8290.CD-17-1319，該文獻以全文引用的方式併入本文中)顯示CSF中的高蛋白質含量(如Santomasso的資料所示)指示BBB破壞及蛋白質滲入CNS中(由於神經毒性期間的血液-腦脊髓液(CSF)障壁通透性增加)。此顯示BBB破壞為NI病理生理學的核心且使本文所提供的異種移植模型研究結果與Santomasso的臨床研究結果關聯。在本文所提供之方法的實施例中，方法進一步包含執行腰椎穿刺(由臨床醫師執行)及量測CSF蛋白質/白蛋白含量，此可預測後續臨床對NT級別的預期及預防措施。

儘管前文已藉助於說明及實例較詳細地描述本發明出於清楚理解之目的，但顯而易見的是，一般熟習此項技術者根據本發明之教示，可以在不背離隨附申請專利範圍之精神或範疇之情況下對其進行某些變更及潤飾。實例 24 剔除 T 細胞中之 GM-CSF 基因的基因編輯技術

各組正推行若干策略以併入基因編輯，從而開發出用於治療各種癌症的下一代嵌合抗原受體(CAR) T細胞。重度毒性(細胞介素釋放症候群及神經毒性)與CAR T細胞療法相關且可產生不良的患者結果。中毒過程中的關鍵引發因素似乎為CART細胞源GM-CSF。

基因編輯(例如使用工程化核酸酶)可用於剔除T細胞中的GM-CSF基因及/或可用於剔除編碼對於GM-CSF基因表現而言必需之蛋白質的基因。適用於此類基因體編輯的核酸酶包括(但不限於) CRISPR相關(Cas)核酸酶、鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應子(TALE)核酸酶，及歸巢核酸內切酶(HE)，亦稱為巨核酸酶。

鋅指核酸酶用於 GM-CSF 的用途

可使用 鋅指核酸酶 (ZFN) 技術使CART細胞中的GM-CSF基因不活化。DNA序列特異性核酸酶使GM-CSF基因裂解且DNA雙股斷裂修復引起基因不活化。藉由將序列特異性DNA結合域(鋅指)與Fok1核酸內切酶域組合來產生序列特異性核酸酶。靶向性核酸酶充當二聚體且利用兩個不同的DNA識別域達成位點特異性裂解。對Fok 1核酸內切酶進行工程改造確保雜二聚體而非均二聚體形成。因此，必要的雜二聚體Fok1-EL變異體達成高度的特異性。

迄今為止利用ZFN技術達成基因剔除方案的臨床經驗有限。然而，在利用ZFN技術剔除CCR5受體且將T細胞再引入HIV患者的小型安全研究中，當停止抗逆轉錄病毒藥物療法時，經修飾之T細胞相對於未修飾之T細胞存在顯著的存活率優勢。

當達成雙對偶基因破壞時，觀測到最佳效應。此表明達成基因破壞最大百分比的KO技術有可能是最有效的(Singh 2017, Tebas 2014)。在一些人類細胞類型中，藉由RAD51過度表現及丙戊酸處理來增加雙對偶基因靶向效率(Takayama 2017)。

在所選標靶區域內形成對的ZFN可靶向人類GM-CSF基因中的外顯子1至4。以DNA序列內之轉譯起始密碼子附近為標靶的潛在優點在於，其確保基因剔除不產生蛋白質的大片段，蛋白質的大片段仍然合成。此類蛋白質片段可具有非所需的生物活性。

多種工具可用於鑑別特定靶序列中的潛在鋅指核酸酶(ZFN)位點。此類工具的實例可見於：http://bindr.gdcb.iastate.edu/ZiFiT/。在表現GM-CSF的人類細胞中測試用於表現以此方式鑑別之ZFN對(用於GM-CSF基因剔除)的載體且根據細胞池內之GM-CSF產生的變化來量測每一對達成基因破壞的有效性。展現GM-CSF含量出現最高降幅的ZFN對選用於在人類CART細胞中進行測試。

舉例而言，可用編碼GM-CSF特異性ZFN對的複製缺乏型重組Ad5病毒載體離體轉導自體T細胞，從而修飾GM-CSF基因。載體僅支持由載體編碼之基因的短暫表現。兩個ZFN結合至複合bp序列，該序列特異性地在選用於誘發GM-CSF基因突變(外顯子1、2、3或4內)的區域中發現。GM-CSF特異性ZFN的表現誘導細胞DNA的雙股斷裂，該雙股斷裂被細胞機器修復，從而在經轉導的細胞中產生隨機序列插入或缺失。此等插入及缺失使GM-CSF編碼序列破壞，導致讀框轉移突變及蛋白質表現終止。

T 細胞製造 / 患者特異性樣品

研究個體經歷10公升白血球清除術，收集＞10 ⁹個白血細胞。藉由逆流離心溶離耗竭單核球及藉由磁力耗竭CD8+ T細胞(兩種方式均利用單次使用的封閉系統拋棄式套件)來富集白血球清除產物中的CD4+細胞。所得經富集的CD4+ T細胞用抗CD3/抗CD28 mAb塗佈的順磁珠粒活化且用編碼CAR T的載體及編碼ZFN的載體轉導。接著擴增細胞且在封閉系統中培養。轉移至WAVE生物反應器之後，繼續進行T細胞擴增，以便在灌流條件下進行額外的擴增。在培養期結束時，耗竭含有磁性珠粒的細胞，洗滌，濃縮且低溫保存。

原代T細胞亦可用其他藥劑處理，例如丙戊酸，以便增強ZFN的雙對偶基因靶向效率。

推定的靶向序列外顯子1 ATG TGG CTG CAG AGC CTG CTG CTC TCG GGC(SEQ ID NO: 40) TAC ACC GAC GTC TCG GACGAC GAG AGC CCG (SEQ ID NO: 41) CTC GCC CAG CCC CAG CAC GCA GCC(續接SEQ ID NO: 40) GAG CGG GTC GGG GTCGTG CGT CGG (續接SEQ ID NO: 41) 外顯子2 AAT GAA ACA GTA GAA GTC ATC TCA GAA ATG(SEQ ID NO: 42) TTA CTT TGT CAT CTT CAGTAG AGT CTT TAC (SEQ ID NO: 43 )GAA GTC ATC TCA GAA ATG TTT GAC(續接SEQ ID NO: 42) CTT CAG TAG AGT CTTTAC AAA CTG (續接SEQ ID NO: 43) 設計外顯子3 GAG CCG A CC TGC CTA CAG ACC CGC CTG GAG(SEQ ID NO: 44) CTC GGC TGG ACG GAT GTCTGG GCG GAC CTC (SEQ ID NO: 45) GCC TAC AGA CCCGCCT GGA GCT GTA(續接SEQ ID NO: 44) CGG ATG TCT GGGCGGACCT CGA CAT (續接SEQ ID NO: 45) 外顯子4 GAA ACT TCC TGT GCA ACC CAG ATT ATC ACC(SEQ ID NO: 46) CTT TGA AGG ACA CGT TGGGTC TAA TAG TGG (SEQ ID NO: 47) TGC AAC CCA GAT TATC ACC TTT GAA(續接SEQ ID NO: 46) ACG TTG GGT CTA ATAGTGG AAA CTT (續接SEQ ID NO: 47)

TALENS亦可使用活化因子樣效應子核酸酶(TALENS)使T細胞中的GM-CSF基因不活化。TALEN與ZFN類似之處在於，其包含與序列特異性DNA結合域融合的Fok1核酸酶域。靶向性核酸酶接著製造DNA的雙股斷裂且易錯修復形成突變的靶基因。使用簡單的蛋白質-DNA代碼可容易設計TALENS，該代碼將DNA結合TALE (轉錄活化因子樣效應子)重複域用於結合位點中的個別鹼基。TALEN的穩健性意謂基因體編輯為一種可靠且便捷的方法(Reyon D.等人, 2012 Nat Biotechnol. 2012 May;30(5):460-5. doi: 10.1038/nbt.2170，該文獻以全文引用的方式併入本文中)。

舉例而言，人類GM-CSF基因之外顯子1內的一些TALE靶序列為：

人類GM-CSF基因之外顯子4中之TALE靶序列的實例：

CRISPR Cas-9 介導原代 T 細胞中的 GM-CSF 基因剔除 .

CRISPR (成簇規律間隔短回文重複序列) Cas-9系統係由以下構成：Cas9、RNA導引的核酸酶及促進位點特異性DNA斷裂產生的短嚮導RNA (gRNA)，位點特異性DNA斷裂係藉由細胞內源機制修復。Cas9/gRNA RNP遞送至人類原代T細胞引起高效的靶基因修飾。CRISPR/Cas9介導剔除GM-CSF基因的方法描述於詳細的方案中，參見Oh, S. A., Seki, A., 及Rutz, S. (2018) Current Protocols in Immunology, 124, e69. doi: 10.1002/cpim.69, 以及Seki及Rutz, J Exp. Med. 2018, 第215卷, 第3期 985-997，該等文獻各以全文引用的方式併入本文中。

已報導，基因剔除引起的GM-CSF不活化使細胞介素釋放症候群及神經毒性減少且改善經CAR T治療之帶有腫瘤異種移植物之小鼠的抗腫瘤活性(如以下文獻所述：Sterner RM等人, 2018 Blood 2018:blood-2018-10-881722; doi: https://doi.org/10.1182/blood-2018-10-881722)，該文獻以全文引用的方式併入本文中。

藉由靶向外顯子 1 或 2 或 3 或 4 的 CRISPR 方案使 GM-CSF 基因不活化 .

為了確保所有樣品中的基因不活化高效發生，可使用多種Cas9構築體，例如靶向GM-CSF基因內之3種不同序列的3種Cas9構築體。(相較於其他基因編輯方法，使用CRISPR容易達成此目的)。

據報導，使用Cas9達成雙對偶基因剔除的頻率高(如以下文獻所述：Zhang, Y.等人, Methods. 2014 September; 69(2): 171-178. doi:10.1016/j.ymeth.2014.05.003，該文獻以全文引用的方式併入本文中)。此高頻率的雙對偶基因剔除提供了可能的優勢。

用於剔除 CAR T 細胞中之 GM-CSF 基因的 其他基因緘默技術

可用於基因緘默的其他方法已為一般熟習此項技術者熟知且可包括(不限於)歸巢核酸內切酶(HE)(亦稱為巨核酸酶)、RNA干擾(RNAi)、短干擾RNS (siRNA)、指向DNA的RNA干擾(ddRNAi)。

CAR T 細胞中之 GM-CSF 基因剔除與中和抗體的組合 ， 用於非 CAR T 來源的 GM-CSF.

移除/中和患者中的所有GM-CSF需要將抗GM-CSF抗體或抗受體抗體或可溶性受體-Fc融合體與CART細胞中之GM-CSF基因剔除組合使用(需要主張此等組合)。實例 25 冷自魯單抗與伊斯卡他的循序療法 (ZUMA-19) 在推薦的 2 期 劑量下 ，在抗 CD19 CAR-T 細胞療法 之前投與 1,800 mg 冷自魯單抗達成 100% 客觀反應率及 66% 完全反應率

在此3+3 1b期研究中，三位患者在第零天、在抗CD19 CAR-T細胞(西卡思羅(Axicabtagene ciloleucel)或「Axi-cel」)投與之前的4小時用600 mg冷自魯單抗治療(「第1組」或「c1」)，且三位患者在第零天、在Axi-cel投與之前的4小時用1,800 mg冷自魯單抗治療(「第2組」或「c2」)。結果

將冷自魯單抗及Axi-cel投與6位患者展現83%客觀反應率及66%完全反應率。未出現治療意外不良事件(TEAE)，此歸因於600 mg (第1組)或1800 mg (第2組)劑量的冷自魯單抗。第1組患者未出現等於或高於3級的CRS，出現1例3級NT持續兩天的個案( 表 21-23)。第2組未出現等於或高於3級的CRS或NT。

抗CD19 CAR-T投與之後，冷自魯單抗以劑量依賴性方式減少全身炎症(CRS/NT)，包括CRS、鐵蛋白及SAA的含量降低。冷自魯單抗以劑量依賴性方式減少循環中的骨髓細胞介素含量，包括IL-6、IL-8、MCP-1及IP-10 (CXCL-10)的含量。冷自魯單抗以劑量依賴性方式減少循環中的急性T細胞細胞介素，包括TNF-α、IL-12p40、INF-γ及穿孔素的含量。冷自魯單抗投與延遲了IL-2在循環系統中的出現。冷自魯單抗似乎減少或延遲CAR-T細胞分化。在第2組中，CAR-T投與之後，循環中的鐵蛋白含量最低直至不增加。

在推薦的2期劑量下，第2組(亦即，投與1,800 mg冷自魯單抗的患者)的一些關鍵研究結果為100%反應率及66%完全反應率。經1,800 mg冷自魯單抗治療的患者未經歷重度CRS或重度NT。 ( 表 7-8 、 10 、 12-13 、 15 、 17-18 ，及圖 41) 。NT最大級別為1級。CRS最大級別為2級。

表 7. 第 2 組患者 119-005-002 在冷自魯單抗及 Ax-cel 治療之前的特徵、第 4 週時的總體疾病評估、治療之後的最大 CRS 及神經事件

119-005-002	研究地點 - V
年齡/性別/人種/ ECOG PMH	年齡(歲)	性別	人種	ECOG PS	PMH：FL Gr3a (dx 2003)、CAD、甲狀腺功能低下、肝脂肪變性、DMII、甲狀腺功能低下、膽石症、BPH、膀胱過動症、手震顫(2017)、關節炎、結腸憩室病、睡眠呼吸中止、鱗狀細胞癌、肌痛、左肩痛
61	男性	白人	1
原發性疾病初始診斷及分期	初始診斷日期	DLBCL類型	初始診斷時的細胞來源	初始診斷時的雙重/三重命中狀態	篩選時的疾病分期	篩選時的IPI總分
2020年7月16日	由濾泡性淋巴瘤引起的DLBCL	GCB	無	III	2
先前治療線及移植	療法名稱	最佳治療反應	治療期間或之後惡化?	惡化日期
BRX5	漸進性疾病	Y	2021年12月
針對FL的R-CHOP、ICE、ASCT
Axi-cel及冷自魯單抗輸注日期	白血球清除術日期	淋巴球耗竭化學療法	冷自魯單抗輸注	西卡思羅	無過渡性療法醫院d/c第7天
2020年12月23日	2021年1月14日至2021年1月16日	2021年1月19日	2021年1月19日

表7 (續)

目標病變基線、第4週PET及放射性CT評估	訪診	病變ID	身體部位	最長直徑(mm)	最短軸(mm)	直徑的交叉乘積(PPD)(mm2)	腫瘤負荷 (SPD)(mm2)	FDG攝入脾臟中	FDG攝入骨髓中	PET/CT反應 - 5點量表	代謝反應評估
篩選	T01	主動脈LN	43	26	1118	2830	攝入可能與淋巴瘤無關	攝入可能與淋巴瘤無關	5 - 攝入明顯高於肝臟及/或新病變
	T02	眶周右LN	37	21	777
	T03	右耳前腫塊	11	7	77
	T04	左鎖骨上LN	21	18	378
	T05	右鎖骨上LN	32	15	480
第4週	T01	主動脈淋巴結	30	12	360	512	無	無	3 - 攝入＞縱隔，但＜=肝臟	完全代謝反應(CMR)
	T02	眶周右LN	0	0	0
	T03	右耳前腫塊	2	9	18
	T04	左鎖骨上LN	9	6	54
	T05	右鎖骨上LN	16	5	80
盧加諾(Lugano)總體疾病評估(Cheson 2014)	• 第 4週：完全反應
最大CRS 最大神經事件	• 無 • 無

表 8. 第 2 組患者 119-005-002 TEAE ≥ 3

分期/群組	個體ID	優先項	CTCAE級別	AE開始日期(研究日) ^a	AE結束日期(研究日) ^a	AE持續時間(天數) ^b	因果關係 ^c	嚴重
Ph1/Coh2	119-005-002	嗜中性白血球計數減少	3級	2021年1月25日(6)	2021年1月26日(7)	2	Axi-Cel, LC	否
		嗜中性白血球計數減少	3級	2021年1月29日(10)	2021年1月31日(12)	3	Axi-Cel, LC	否
		淋巴球計數減少	3級	2021年2月2日(14)		43	無	否

2021年1月25日、2021年1月30日及2021年1月31日給與Zarxio，Zarxio為顆粒球群落刺激因子(GCSF)的一種人造形式

表 9. 第 2 組患者 119-005-002 ：所有 TEA

分期/群組	個體ID	優先項	CTCAE級別	AE開始日期 (研究日) ^a	AE結束日期 (研究日) ^a	AE持續時間 (天數) ^b	因果關係 ^c	嚴重
Ph 1/Coh2	119-005-002	淋巴腺病	1級	2021年1月19日(0)	2021年2月15日(27)	28	無	否
		周邊水腫	1級	2021年1月19日(0)		57	無	否
		竇性心博過速	1級	2021年1月20日(1)	2021年1月21日(2)	2	無	否
		頭痛	1級	2021年1月21日(2)	2021年1月22日(3)	2	無	否
		背痛	1級	2021年1月25日(6)	2021年1月26日(7)	2	無	否
		嗜中性白血球計數減少	3級	2021年1月25日6)	2021年1月26日(7)	2	Axi-Cel, LC	否
		嗜中性白血球計數減少	2級	2021年1月28日(9)	2021年1月28日(9)	1	Axi-Cel, LC	否
		嗜中性白血球計數減少	3級	2021年1月29日(10)	2021年1月31日(12)	3	Axi-Cel, LC	否
		疼痛	1級	2021年1月30日(11)	2021年2月1日(13)	3	無	否
		淋巴球計數減少	3級	2021年2月2日(14)		43	無	否
		紅斑皮疹	1級	2021年2月2日(14)	2021年2月18日(30)	17	無	否
		便秘	2級	2021年2月7日(19)	2021年2月10日(22)	4	無	否
		疲勞	1級	2021年2月18日(30)		27	Axi-Cel	否
		不適	1級	2021年2月18日(30)		27	Axi-Cel	否

患者 119-005-002 ： CRS = 無患者 119-005-002 ：神經事件 = 無

表 10. 第 2 組患者 119-005-003 在冷自魯單抗及 Ax-cel 治療之前的特徵、第 4 週時的總體疾病評估、治療之後的最大 CRS 及神經事件

119-005-003	研究地點 -V
年齡/性別/人種/ECOG PMH	年齡(歲)	性別	人種	ECOG PS	PMH：貧血(Gr1)、疲勞、體重減輕/厭食症(Gr1)、關節炎、聽覺障礙、震顫(2018)、s/p脾切除術(bx +DLBCL)、h/o暈厥/記憶障礙/認知紊亂(2020年12月)、GERD、尿頻、腹部靜脈曲張、腎囊腫、h/o低血壓
76	男性	白人	1
原發性疾病初始診斷及分期	初始診斷日期	DLBCL類型	初始診斷時的細胞來源	初始診斷時的雙重/三重命中狀態	篩選時的疾病分期	篩選時的IPI總分
2017年8月7日	DLBCL	GCB	皆無	1	1
先前治療線及移植	療法名稱	最佳治療反應	治療期間或之後惡化?
R-CHOP X 6	漸進性疾病	Y
R-DHAP X 6	漸進性疾病	Y
雷利米得 + 利妥昔單抗(Revlimid + Rituximab)	完全反應	Y
維納妥拉/塞利尼索(Venetoclax/Selinexor)	穩定疾病	N
先前ASCT及XRT

表10 (續)

Axi-cel及冷自魯單抗輸注日期

白血球清除術日期

淋巴球耗竭化學療法

冷自魯單抗輸注

西卡思羅

*無過渡性療法 *第10天醫院d/c

13 JAN 2021年1月13日

2021年2月5日至2021年2月7日

2021年2月10日

目標病變基線、第4週及第3個月的PET及放射性CT評估

訪診

病變 ID

身體部位

最長直徑 (mm)

最短軸 (mm)

直徑的交叉乘積(PPD) (mm2)

腫瘤負荷(SPD) (mm2)

FDG攝入脾臟中

FDG攝入骨髓中

PET/CT反應 - 5點量表

代謝反應評估

篩選

T01

胃肝淋巴結

41

22

902

N/A

無

5 - 攝入明顯高於肝臟及/或新病變

第4週

T01

胃肝淋巴結

37

20

740

N/A

無

4 - 攝入適度高於肝

部分代謝反應

盧加諾總體疾病評估(Cheson 2014)

• 第4週：部分反應

最大CRS 最大神經事件

• 2級：第4天至第5天(發熱/心搏過速為Gr1)；第6天(對IVF有低血壓反應為Gr2)；第7天至第8天(發熱、竇性心搏過速為Gr1) - 托西利單抗/地塞米松 • 1級：第7天至第8天(意識模糊)；第20天至第22天(腦病變及意識模糊) - 地塞米松

患者119-005-003：TEAE ≥ 3級 = 無

表 11. 第 2 組患者 119-005-003 ：所有 TEA

分期/群組	個體ID	優先項	CTCAE級別	AE開始日期(研究日) ^a	AE結束日期(研究日) ^a	AE持續時間(天數) ^b	因果關係 ^c	嚴重
Ph1/Coh2	119-005-003	噁心	2級	2021年2月10日(0)	2021年2月12日(2)	3	LC	否
		肺不張	1級	2021年2月14日(4)	2021年3月2日(20)	17	無	否
		發熱	1級	2021年2月14日(4)	2021年2月16日(5)	2	Axi-Cel	否
		發熱	2級	2021年2月16日(e)	2021年2月18日(7)	2	Axi-Cel	是
		頭痛	1級	2021年2月16日(6)	2021年2月17日(7)	2	無	否
		低血壓	2級	2021年2月16日(6)	2021年2月16日(6)	1	Axi-Cel	否
		竇性心搏過速	1級	2021年2月16日(6)	2021年2月17日(7)	2	Axi-Cel	否
		意識模糊狀態	1級	2021年2月17日(7)	2021年2月18日(8)	2	Axi-Cel	否
		低血壓	2級	2021年2月19日(9)	2021年2月20日(10)	2	無	否
		間歇低血壓	2級	2021年2月21日(11)		24	無	否
		血液肌酐增加	2級	2021年2月21日(11)	2021年2月22日(12)	24	無	否
		夜尿症	2級	2021年2月22日(12)		23	無	否
		震顫	2級	2021年2月23日(13)	2021年3月2日(20)	8	無	否
		肌肉痙攣	1級	2021年2月24日(14)		21	無	否
		腦病變	1級	2021年3月2日(20)	2021年3月4日(22)	3	Axi-Cel	是
		意識模糊狀態	1級	2021年3月2日(20)	2021年3月3日(21)	2	Axi-Cel	否

表 12. 第 2 組患者 119-005-003 ： CRS

分期/群組	個體ID	優先項/字詞	AE數目	AE開始日期(研究日) ^a	AE結束日期(研究日) ^a	持續時間 (天數) ^b	因果關係 ^c	嚴重/嚴重度 ^d
Ph 1/Coh 2	119-006-003	細胞介素釋放症候群	19	2021年2月14日(4)	2021年2月15日(5)	2	Axi-Cel	否/1
		發熱	19	2021年2月14日(4)	2021年2月15日(5)	2	Axi-Cel	否/1
		細胞介素釋放症候群	4,22	2021年2月16日(6)	2021年2月16日(6)	1	Axi-Cel	是/2
		低血壓	22	2021年2月16日(6)	2021年2月16日(6)	1	Axi-Cel	否/2
		發熱	4	2021年2月16日(6)	2021年2月18日(8)	2	Axi-Cel	是/2
		細胞介素釋放症候群	4,29	2021年2月17日(7)	2021年2月18日(8)	2	Axi-Cel	否/1
		竇性心搏過速	29	2021年2月16日(6)	2021年2月17日(7)	2	Axi-Cel	否/1
		發熱	4	2021年2月16日(6)	2021年2月18日(8)	2	Axi-Cel	是/2
* 第6天(16FEB2021) • 妥西珠單抗 • 10 mg地塞米松 • IVF彈丸注射X1

表 13. 第 2 組患者 119-005-003 ：神經事件

分期/群組	個體ID	優先項	CTCAE 級別	AE開始日期(研究日) ^a	AE結束日期(研究日) ^a	AE持續時間 (Day) ^c	因果關係 ^c	嚴重
Ph 1/Coh 2	119-005-003	意識模糊狀態	1級	17FEB2021(7)	18FEB2021(8)	2	Axi-Cel	否
		震顫	Grade 2	23FEB2021(13)	02MAR 2021(20)	8	無	否
		腦病變	1級	02 MAR 2021(20)	04 MAR 2021(22)	3	Axi-Cel	是
		意識模糊狀態	1級	02 MAR 2021(20)	03MAR 2021(21)	2	Axi-Cel	否
• 第8天，10 mg地塞米松(18FEB2021) • 第20天及第21天(2021年3月2日及2021年3月3日)，10 mg地塞米松

表 14. 第 2 組患者 119-005-003 ： DLT 時段期間的嚴重不良事件 (SAE) 概述

SAE #1：醫學上顯著	• 2021年2月14日：Gr1 CRS - 發熱用乙醯胺苯酚(acetaminophen)管控。以經驗性頭孢吡肟(cefepime)開始。 • 2021年2月16日：Gr2 CRS - 發熱伴低血壓用乙醯胺苯酚、IVF、托西利單抗及地塞米松10 mg管控。此等介入之後，患者無發熱且血壓正常 • 2021年2月17日：Gr1 NT - 健忘及迷向。投與10 mg地塞米松 • 2021年2月18日：無其他神經事件。 • 2021年2月19日：與低血容量症有關的孤立型低血壓，無發熱，原因為患者在用1I LR管控當天期間對3.3I無效。感染性處理呈陰性且停服經驗性靜脈內頭孢吡肟	• 歸因於Axi-cel • 與LD化療或冷自魯單抗無關
SAE #2：必需住院	• 2021年3月2日：因Gr1意識模糊及腦病變而住院 • 患者記錄到在與兒子共進早餐期間，意識模糊且將其早餐散落。患者茫然凝視且無反應2-3分鐘。兒子詢問其幾個問題，但其回答不恰當。向患者出示範德堡ER (Vanderbilt ER)。 • 在ED中，遵循簡單指令，但分不清方向且意識模糊。其顯得激躁且對一些內部刺激有反應。兩個上肢均震顫，Stat CT頭部呈陰性。Labs及VS不明顯。給與10 mg IV x 1地塞米松。 • EEG：監測無急性事件。B12含量正常。 • 因患者保持A&O x3，因此取消MRI • 2021年3月3日：給與10 mg IV x 1地塞米松。意識模糊消退。 • 2021年3月4日：腦病變消退。	• 歸因於Axi-cel • 與LD化療或冷自魯單抗無關

表 15. 第 2 組患者 119-005-004 在冷自魯單抗及 Ax-cel 治療之前的特徵、第 4 週時的總體疾病評估、治療之後的最大 CRS 及神經事件

119-005-004	研究地點 -V
年齡/性別/人種/ECOG PMH	年齡(歲)	性別	人種	ECOG PS	PMH：高膽固醇、高血壓、高三酸甘油酯血症、CKD
57	男性	白人	0
原發性疾病初始診斷及分期	初始診斷日期	DLBCL類型	初始診斷時的細胞來源	初始診斷時的雙重/三重命中狀態	篩選時的疾病分期	篩選時的IPl總分
2018年3月19日	由濾泡性淋巴瘤引起的DLBCL	GCB	雙重命中	1	1
先前治療線及移植	療法名稱	最佳治療反應	治療期間或之後惡化?
R-CHOP X6	完全反應	Y
GDP X4	部分反應	Y
Axi-cel 及冷自魯單抗輸注日期	白血球清除術日期	淋巴球耗竭化學療法	冷自魯單抗輸注	西卡思羅	過渡性療法： 40 mg Dex X 3d (2021年1月23日至2021年1月26日) *第10天醫院d/c
2021年1月21日	2021年2月11日至2021年2月13日	2021年2月16日	2021年2月16日

表15 (續)

目標病變基線、第4週PET及放射性CT評估

訪診

評估日期

病變ID

身體部位

最長直徑 (mm)

最短軸 (mm)

直徑的交叉乘積(PPD) (mm2)

腫瘤負荷(SPD) (mm2)

FDG攝入脾臟中

FDG攝入骨髓中

PET/CT反應 - 5點量表

代謝反應評估

過渡性療法後的基線

2021年2月9日

T01

頭皮腫塊

65

23

1495

否

5 - 攝入明顯高於肝臟及/或新病變

第4週

2021年3月16日

T01

頭皮腫塊

40

9

360

否

3 - 攝入＞縱隔，但＜=肝臟

完全代謝反應

盧加諾總體疾病評估(Cheson 2014)

• 第4週：完全反應

最大CRS 最大神經事件

• 1級：第4天至第6天(發熱) - 托西利單抗/地塞米松 • 1級：第6天至第8天(腦病變、注意力障礙、找詞困難、激躁) - 地塞米松

患者119-005-004：TEAE ≥ 3級 = 無

表 16. 第 2 組患者 119-005-004 ：所有 TEAE

分期/群組	個體ID	優先項	CTCAE級別	AE開始日期(研究日) ^a	AE結束日期(研究日) ^a	AE持續時間 (天數) ^b	因果關係 ^c	嚴重
Ph 1 /Coh 2	119-005-004	便秘	2級	2021年2月16日(0)		29	LC	否
		失眠	2級	2021年2月16日(0)		29	無	否
		發熱	1級	2021年2月20日(4)	2021年2月23日(7)	4	Axi-Cel	否
		呼吸困難	1級	2021年2月21日(5)		24	無	否
		注意力干擾	1級	2021年2月22日(6)	2021年2月24日(8)	3	Axi-Cel	是
		失語症	1級	2021年2月22日(6)	2021年2月24日(8)	3	Axi-Cel	是
		激躁	1級	2021年2月22日(6)	2021年2月24日(8)	3	Axi-Cel	是
		腦病變	1級	2021年2月23日(7)	2021年2月24日(8)	2	Axi-Cel	是
		肌無力	2級	2021年2月24日(8)	2021年3月1日(13)	6	LC, Axi-Cel	否
		震顫	1級	2021年2月27日(11)	2021年3月25日	18	無	否
		淋巴腺病	1級	2021年3月3日(15)		14	無	否

表 17. 第 2 組患者 119-005-004 ： CRS

分期/群組	個體ID	優先項/字詞	AE數目	AE開始日期(研究日) ^a	AE結束日期 (研究日) ^a	持續時間 (天數) ^b	因果關係 ^c	嚴重/嚴重度 ^d
Ph 1/Coh 2	119-005-004	細胞介素釋放症候群發熱/發燒	12	2021年2月20日(4)	2021年2月23日(7)	4	Axi-Cel	否/1
		12	2021年2月20日(4)	2021年2月23日(7)	4	Axi-Cel	否/1
• 第6天投與托西利單抗(2021年2月22日) • 第6天投與10 mg地塞米松(2021年2月22日)

表 18. 第 2 組患者 119-005-004 ：神經事件

分期/群組	個體ID	優先項	CTCAE級別	AE開始日期(研究日) ^a	AE結束日期(研究日) ^a	AE持續時間 (天數) ^c	因果關係 ^c	嚴重
Ph 1/Coh 2	119-005-004	注意力干擾	1級	2021年2月22日(6)	2021年2月24日(8)	3	Axi-Cel	是
		失語症	1級	2021年2月22日(6)	2021年2月24日(8)	3	Axi-Cel	是
		激躁	1級	2021年2月22日(6)	2021年2月24日(8)	3	Axi-Cel	是
		腦病變	1級	2021年2月23日(7)	2021年2月24日(8)	2	Axi-Cel	是
		震顫	1級	2021年2月27日(11)	2021年3月25日	27	無	否
• 第6天及第7天投與地塞米松10 mg (2021年2月22日及2021年2月23日)

表 19. 第 2 組患者 119-005-004 ： DLT 時段期間的嚴重不良事件 (SAE) 概述

SAE #1：醫學上顯著

• 2021年2月22日：Gr1 NT及並行Gr1 CRS (發熱)。投與10 mg地塞米松及托西利單抗。 • 2021年2月23日：針對找詞困難給與地塞米松。Gr 1 CRS消退。 • 2021年2月24日：神經事件消退。

• 歸因於Axi-cel • 與LD化療或冷自魯單抗無關

表 20. DLT 安全及發生率概述

未出現歸因於Axi-cel的4級或5級TEAE

未出現歸因於冷自魯單抗的TEAE

在第2組個體(患者)1至3中的任一個體中均未觀測到DLT (如實例25中所定義)

表 21. 第 1 組患者 119-003-001 在冷自魯單抗及 Ax-cel 治療之前的特徵、第 4 週時的總體疾病評估、治療之後的最大 CRS 及神經事件

119-003-001	研究地點 - M
• 年齡/謝別/人種/ECOG • PMH/PSH	年齡(歲)	性別	人種	ECOG PS	PMH：GERD、失眠症、背痛及腹痛、間歇便秘、季節性過敏 PSH：淺表傷口修復、輸精管切除逆轉術
55	男性	白人	0
•原發性疾病初始診斷及分期	初始診斷日期	DLBCL類型	初始診斷時的細胞來源	初始診斷時的雙重/三重命中狀態	篩選時的疾病分期	篩選時的IPI總分
08 NOV 2019	非特指型DLBCL	GCB	皆無	II	1
•先前治療線及移植	治療線	療法名稱	最佳治療反應	治療期間或之後惡化?	惡化日期	無先前ASCT
1	CHOP RX 4	漸進性疾病	Y	2020年3月3日
2	R ICE X 1	漸進性疾病	Y	2020年4月21日
3	DHAP RX 1	穩定疾病	N
• Axi-cel及冷自魯單抗輸注日期	白血球清除術日期	淋巴球耗竭化學療法	冷自魯單抗輸注	西卡思羅
2020年6月4日	2020年6月24日/2020年6月26日	2020年6月29日/09:25	2020年6月29日/16:34

表21 (續)

• 目標病變基線、第4週及第3個月的PET及放射性CT評估

訪診

評估日期

病變ID

身體部位

最長直徑 (mm)

最短軸 (mm)

直徑的交叉乘積(PPD) (mm2)

腫瘤負荷(SPD) (mm2)

FDG攝入脾臟中

FDG攝入骨髓中

PET/CT反應 - 5點量表

代謝反應評估

篩選

23 JUN 2020

T01

腹部

90

80

7200

7846

否

4 - 攝入適度高於肝臟

T02

淋巴結

22

16

352

T03

淋巴結

21

14

294

第4週

24JUL 2020

T01

腹部

90

84

7560

否

4 - 攝入適度高於肝臟

部分代謝反應 (PMR)

T02

淋巴結

0

T03

淋巴結

0

第3個月

30 SEP 2020

T01

腹部

70

60

4200

否

攝入可能與淋巴瘤無關

3 - 攝入＞縱隔，但＜=肝臟

完全代謝反應 (CMR)

T02

淋巴結

0

T03

淋巴結

0

總體疾病評估(Cheson 2014)

• 穩定疾病(第4週) • 完全反應(第3個月)

最大CRS 最大神經事件

• 2級(第1天開始，第4天結束) • 3級(第4天開始，第8天結束)

表 22. 第 1 組患者 119-003-002 在冷自魯單抗及 Ax-cel 治療之前的特徵、第 4 週時的總體疾病評估、治療之後的最大 CRS 及神經事件

119-003-002	研究地點 - M
• 年齡/性別/人種/ ECOG •PMH/PSH	年齡(歲)	性別	人種	ECOG PS	PMH：HTN、便秘、前列腺癌(自2006年起，無病)
80	男性	白人	1
• 原發性疾病初始診斷及分期	初始診斷日期	DLBCL類型	初始診斷時的細胞來源	初始診斷時的雙重/三重命中狀態	篩選時的疾病分期	篩選時的IPI總分
20 NOV 2019	非特指型DLBCL	非生髮中心樣表型	雙重命中	II	1
•先前治療線及移植	治療線	療法名稱	最佳治療反應	療法期間或之後發生惡化嗎?	惡化日期	無先前ASCT
1	CHOP RX 6	漸進性疾病	Y	16 APR 2020年4月16日
2	GEM OX RITUXAN X 2	漸進性疾病	Y	01 JUN 2020年6月1日
• Axi-cel及冷自魯單抗輸注日期	白血球清除術日期	淋巴球耗竭化學療法	冷自魯單抗輸注	西卡思羅
2020年6月7時	2020年7月29日 / 2020年8月1日	2020年8月4日 / 09:10	2020年8月4日/ 16:53

表22 (續)

• 目標病變基線、第4週及第3個月的PET及放射性CT評估

訪診

評估日期

病變ID

身體部位

最長直徑 (mm)

最短軸 (mm)

直徑的交叉乘積(PPD) (mm2)

腫瘤負荷(SPD) (mm2)

FDG攝入脾臟中

FDG攝入骨髓中

PET/CT反應 - 5點量表

代謝反應評估

篩選

2020年7月27日

T01

胃腸道

66

39

2574

5502

否

攝入可能與淋巴瘤無關

5 - 攝入適度高於肝臟及/或新病變

T02

腹部

61

48

2928

第4週

2020年8月30日

T01

胃腸道

58

36

2088

5188

否

5 - 攝入適度高於肝臟及/或新病變

漸進性代謝疾病(PMD) 新左動脈旁LN

T02

腹部

62

50

3100

總體疾病評估(Cheson 2014)

• 漸進性疾病(第4週)

最大CRS 最大神經事件

• 2級(第4天發生，第8天結束) • 1級(第8天發生，第10天結束)

表23 (續)

Axi-cel及冷自魯單抗輸注日期

白血球清除術日期

淋巴球耗竭化學療法

冷自魯單抗輸注

西卡思羅

2020年9月25日

2020年10月15日/2020年10月17日

2020年10月20日/08:46

2020年10月20日/16:50

• 目標病變基線、第4週及第3個月的PET及放射性CT評估

訪診

評估日期

病變ID

身體部位

最長直徑 (mm)

最短軸 (mm)

直徑的交叉乘積(PPD) (mm2)

腫瘤負荷(SPD) (mm2)

FDG攝入脾臟中

FDG攝入骨髓中

PET/CT反應 - 5點量表

代謝反應評估

篩選

2020年9月1日

T01

右腋動脈

25

16

400

893

否

5 - 攝入適度高於肝臟及/或新病變

T02

左內髂靜脈

29

17

493

第4週

2020年11月18日

T01

右腋動脈

20

15

300

500

否

2 - 攝入小於或等於縱隔

完全代謝反應 (CMR)

T02

左內髂靜脈

20

10

200

總體疾病評估(Cheson 2014)

• 第4週：完全反應

最大CRS 最大神經事件

• 無CRS • 最大級別1級(第29天發生，第36天結束)

如本文所用，「劑量限制性毒性」(或「DLT」)定義為以下循序療法相關的事件：在循序療法輸注之後的最初28天內發生：4級嗜中性球減少症，自細胞轉移當天起，持續長於21天；4級血小板減少症，自細胞轉移當天起，持續長於28天；需要插管的任何循序療法相關不良事件(「AE」)，包括4級；需要插管以便保護呼吸道的腦病變；以及循序療法相關的任何5級事件。如本文所用，「不良事件」定義為不良事件，亦稱為不良經歷，可為在關於與藥物存在因果關係或存在關係的任何判斷不存在的情況下，暫時與使用藥物相關的任何不利及非預期徵象(例如異常的實驗室研究結果)、症狀或疾病。包括冷自魯單抗與抗CD19 CAR-T細胞(西卡思羅或「Axi-cel」)投與之間發生的不良事件。

所有其他臨床上較大(循序療法相關)的3級毒性持續超過3天及所有4級毒性，但其中以下病狀不視為DLT：在2週內消退至最嚴重1級且在4週內消退至基線的腦病變；3級發熱；骨髓抑制(包括血小板計數＜50x10 ⁹/L背景下的出血及嗜中性球減少症背景下的細菌感染記載)，其定義為淋巴球減少症、血紅素減少、嗜中性球減少症及血小板減少症，除非嗜中性球減少症及血小板減少症滿足所述DLT定義；細胞或冷自魯單抗輸注2小時內發生的即刻過敏反應，該等過敏反應在標準療法投與24小時內可逆地變成2級或更小；需要透析≤7天的腎中毒；腫瘤溶解症候群，包括可歸因於腫瘤溶解症候群的相關臨床表現(例如電解質異常、腎功能、高尿酸血症)；3級轉胺酶、鹼性磷酸酶、膽紅素或其他肝功能測試升高，限制條件為在14天內消退至≤2級；4級短暫血清肝酶異常，限制條件為在＜72小時內消退至≤3級；3級或4級低γ球蛋白血症；以及3級噁心或厭食症。歸因於CRS的AE按照總體CRS惡化評估定位以便確定DLT，但若3級或4級CRS (根據Lee 2014)歸因於上述例外狀況之一，則事件不被視為DLT。 藥物動力學 (PK) 及產物 (PD)

個體及產物特徵(有限資料集)顯得與歷史Z1參考值一致。然而，Z19C2 (Zuma-19第2組)個體出現相對較低的腫瘤負荷。冷自魯單抗PK概況與輸注的劑量一致。Z19第1組及第2組的血清冷自魯單抗濃度分別高於目標含量(50 μg/ml)約24-36小時及約5天。資料強有力地表明冷自魯單抗以劑量依賴性方式中和/隔離血清GM-CSF。

第7天或第14天觀測Zuma-19的Axi-cel PK峰值擴增值(個體特異性)，與歷史參考值一致。冷自魯單抗可以劑量依賴性方式減少或延遲Axi-cel擴增，然而，觀測到Z19第2組出現有前景的反應率(2位出現完全反應(CR)且1位出現部分反應(PR))。為了進一步探究冷自魯單抗與Axi-Cel的組合所提供的潛在治療益處，需要來自高腫瘤負荷個體的資料(例如＞4000 SPD)。

相較於歷史參考值，觀測到ZUMA-19存在神經事件(NE)延遲的傾向。Axi-cel輸注之後，冷自魯單抗以劑量依賴性方式減少全身炎症。治療後至少4天(或更長)，冷自魯單抗以劑量依賴性方式減少骨髓相關細胞介素及趨化因子(包括IL-6、IL-8、MCP-1及CXCL-10)在循環中的出現。鑒於個體/樣品的數目(n)低，因此CSF資料集(細胞介素、趨化因子及CSF細胞浸潤)無說服力/提供的洞察力有限(本文中未顯示)。

總之，在抗CD19 CAR-T細胞療法之前經1,800 mg冷自魯單抗治療之患者(第2組)中百分之六十六達成無毒性完全反應(CRS及NT＜2級的CR。此等結果證明，冷自魯單抗中斷功效/毒性聯繫且可預防與CAR-T細胞療法相關的細胞介素風暴，同時潛在地改善反應耐久性。

本說明書中所列舉之所有公開案、寄存編號、專利及專利申請案皆以引用的方式併入本文中，其併入程度如同每一者特定地且個別地指示以引用的方式併入一般。 本發明抗 GM-CSF 抗體的例示性 V _H 區序列 ： SEQ ID NO:1 (VH#1 ，圖 1)

SEQ ID NO:2 (VH#2 ，圖 1)

SEQ ID NO:3 (VH#3 ，圖 1)

SEQ ID NO:4 (VH#4 ，圖 1)

SEQ ID NO:5 (VH#5 ，圖 1)

本發明抗 GM-CSF 抗體的例示性 V _L 區序列 SEQ ID NO:6 (VK#1 ，圖 1)

SEQ ID NO:7 (VK#2 ，圖 1)

SEQ ID NO:8 (VK#3 ，圖 1)

SEQ ID NO:9 (VK#4 ，圖 1)

SEQ ID NO: 10 例示性 κ 恆定區

SEQ ID NO: 11 例示性重鏈恆定區 ， f- 異型：

圖 1提供抗GM-CSF抗體之例示性V _H及V _L序列。

圖 2A 至圖 2B說明GM-CSF對Ab1 ( 圖 2A)或Ab2 ( 圖 2B)的結合，如在37℃下藉由表面電漿子共振分析(Biacore 3000)所測定。Ab1及Ab2被捕獲於Biacore晶片上所固著的抗Fab多株抗體上。將不同濃度的GM-CSF注射於所示表面上。使用Scrubber2軟體執行全域擬合分析(假定1:1相互作用)。

圖 3A 至圖 3B說明Ab1及Ab2對糖基化GM-CSF( 圖 3A)及非糖基化GM-CSF ( 圖 3B)的結合。藉由ELISA測定對人類293細胞所表現之糖基化GM-CSF或大腸桿菌所表現之非糖基化GM-CSF的結合。所示為單次實驗的代表性結果(實驗1)。將Ab1及Ab2的兩倍稀釋液(始於1500 ng/ml)施加於經GM-CSF塗佈之孔中。各點表示三次重複測定之平均值±標準誤差。使用Prism 5.0軟體(Graphpad)執行S形曲線擬合。

圖 4A 至圖 4B說明競爭型ELISA，其展現Ab1及Ab2對共有抗原決定基的結合。將塗有每孔50 ng重組GM-CSF的ELISA盤與不同濃度的抗體(Ab2、Ab1或同型對照抗體)及50 nM生物素化Ab2一起培育。使用中性鏈親和素-HRP偶聯物分析生物素化抗體結合。競爭結合至GM-CSF維持1小時(圖4A)或18小時(圖4B)。各點表示三次重複測定之平均值±標準誤差。使用Prism 5.0軟體(Graphpad)執行S形曲線擬合。

圖 5說明抑制GM-CSF誘導的IL-8表現。將不同量的各種抗體與0.5 ng/ml GM-CSF一起培育且與U937細胞一起培育16小時。藉由ELISA測定分泌於培養上清液中的IL-8。

圖 6說明抗GM-CSF抗體以劑量依賴性方式抑制GM-CSF刺激人類顆粒球上的CD11b。

圖 7說明抗GM-CSF抗體以劑量依賴性方式抑制GM-CSF誘導CD14+人類原代單核球/巨噬細胞上的HLA-DR。

圖 8說明GM-CSF (骨髓發炎因子)作為關鍵細胞介素在CAR-T相關活性及刺激白血細胞增殖方面的作用，白血細胞增殖為某些白血病(例如急性骨髓性白血病(AML))的典型特徵。

圖 9說明藉由用抗GM-CSF抗體中和人類GM-CSF來抑制GM-CSF依賴性人類TF-1細胞增殖(人類紅白血病)。KB003為重組單株抗體，其被設計成靶向且中和人類GM-CSF。KB002為靶向且中和hGM-CSF的小鼠/人類嵌合單株抗體。

圖 10描繪了嵌合抗原受體。

圖 11說明CAR-T19療法使得難治性復發ALL達成高反應率。資料顯示R/R ALL的歷史結果及R/R ALL在CAR-T19療法之後的結果。(Maude等人, NEJM 2014)。

圖 12說明的證據顯示GM-CSF與NT顯著相關。GM-CSF含量與CAR-T細胞療法之後的嚴重副作用相關。GM-CSF含量領先於且調節除IL-15之外的其他細胞介素。升高的GM-CSF與≥3級NT明確相關。IL-2為具有此相關性的唯一其他細胞介素。

圖 13說明CRS及NT在CD19 CAR-T細胞療法之後的估算時程。症狀發作時序及CRS嚴重度取決於誘導劑、癌症類型、患者年齡及免疫細胞活化量級。CAR-T相關的CRS症狀發作典型地發生於T細胞輸注之後的數天至偶爾數週，與最大的T細胞擴增同時發生。類似於與mAb療法相關的CRS，與授受性T細胞療法相關的CRS始終伴隨著升高的IFNγ、IL-6、TNFα、IL-1、IL-2、IL-6、GM-CSF、IL-10、IL-8及IL-5。CAR-T細胞針對CRS的劑量-反應關係不明，但極高的T細胞劑量可能導致症狀更早發作。

圖 14說明GM-CSF為CAR-T副作用的關鍵起始因子。該圖描繪GM-CSF在CRS及NT中的主要作用。穿孔素允許顆粒酶穿透腫瘤細胞膜。CAR-T產生的GM-CSF將CCR2+骨髓細胞募集至腫瘤部位，該等骨髓細胞產生CCL2 (MCP1)。CCL2藉由CCR2+骨髓細胞募集而正向地加強其自身產生。來自骨髓細胞的IL-1及IL-6藉由誘導GM-CSF產生而與CAR-T形成另一正反饋迴路。作為穿孔素及顆粒酶摧毀細胞膜的結果，磷脂醯基絲胺酸被暴露。磷脂醯基絲胺酸刺激骨髓細胞產生CCL2、IL-1、IL-6及其他發炎效應子。此自強化反饋迴路的最終結果引起內皮細胞活化、血管通透性，最終導致CRS及NT。此外，動物模型證據表明，GM-CSF基因剔除小鼠不顯示CRS徵象，但IL-6基因剔除小鼠仍會出現CRS。來自CCR2+骨髓細胞的GM-CSF受體k/o消除了神經發炎模型中的級聯。(Sentman等人, J. Immunol.; Coxford等人, Immunity2015 (43)510-514; Ishii等人, Blood2016 128:3358; Teachey等人, Cancer Discov. 2016年6月6日(6): 664-679; Lee等人, Blood2016 124:2:188; Barrett等人, Blood2016: 128-654，各文獻以全文引用的方式併入本文中)。

圖 15A 至圖 15G說明GM-CSF CRISPR基因剔除T細胞展現減少的GM-CSF表現，但其他細胞介素的含量及去顆粒程度相似。a. GM-CSF基因剔除CAR-T的產生。(參見實例6)。

圖 16A 至圖 16J說明根據本文所述實施例的GM-CSF中和抗體不抑制CAR-T介導的殺滅、增殖或細胞介素產生，但成功地中和GM-CSF (參見實例7)。

圖 17A 至圖 17B說明人類CRS之小鼠模型的方案及結果。(實例5)。

圖 18A 至圖 18C說明CAR-T與根據本文所述實施例之GM-CSF中和抗體的組合在異種移植模型中的功效。GM-CSF中和抗體在活體內顯示不抑制CAR-T功效。(參見實例8)。

圖 19說明活體外及活體內臨床前資料，其顯示根據本文所述實施例之GM-CSF中和抗體不減弱CAR-T對存活期的影響。GM-CSF中和抗體在活體內、在PBMC不存在的情況下不阻礙CAR-T細胞功能。對於CAR-T + 對照物與CAR-T + GM-CSF中和抗體而言，存活期相似。(參見實例9)。

圖 20A 至圖 20B說明活體外及活體內臨床前資料，其表明根據本文所述實施例之GM-CSF中和抗體增強CAR-T擴增。GM-CSF中和抗體增強活體外CAR-T癌細胞殺滅。在PBMC存在下，抗體中和GM-CSF使CAR-T細胞增殖增強。在PBMC存在下，GM-CSF中和抗體使CAR-T增殖增強。(在PBMC不存在下，其不受影響)。抗GM-CSF抗體不抑制CAR-T去顆粒、細胞內GM-CSF產生或IL-2產生。(參見實例10)。

圖 21說明CAR-T擴增與改善的總反應率相關。CAR AUC (曲線下面積)定義為CAR-T投與後的最初28天期間內，每微升血液之CAR+細胞數累積含量。藉由威爾卡森秩和檢驗(Wilcoxon rank sum test)計算P值。(Neelapu等人, ICML 2017摘要8)。(參見實例11)。

圖 22說明根據本文所述實施例之GM-CSF中和抗體的研究方案。(參見實例12)。在住院時及臨床問診時，在最初30天內每日評估CRS及NT。合格個體在CAR-T治療的第-1天、第+1天及第+3天接受GM-CSF中和抗體。可考慮額外的給藥，直至至少第7天。在基線及在第1、3、6、9、12、18及24個月執行腫瘤評估。第-5、-1、0、1、3、5、7、9、11、13、21、28、90、180、270及360天獲取血液樣品(PBMC及血清)。(參見實例12)。

圖 23A 至圖 23B說明GM-CSF耗竭使CAR-T細胞擴增增強。圖 23A說明相較於對照CAR-T細胞，GM-CSF ^k/oCAR-T細胞的離體擴增增強。圖 23B說明在根據本文所述實施例之GM-CSF中和抗體治療之後，CAR-T細胞增殖更穩健。(參見實例13)。

圖 24說明根據本文所述實施例之GM-CSF中和抗體的安全概況。(參見實例14)。

圖 25A 至圖 25D說明GM-CSF中和抗體當添加至CAR-T細胞療法中時，使小鼠臨床前模型的神經炎症減少90%。圖 25A說明MRI資料(T1高強度信號指示BBB破壞及神經炎症)，其中在投與CAR-T細胞及根據本文所述實施例之GM-CSF中和抗體之後，小鼠腦得到保護而未出現神經炎症，相比之下，在投與CAR-T細胞及對照抗體(頂列)之後以及與未治療(基線)之小鼠腦(底列)相比，小鼠腦顯示神經毒性徵象。圖 25B定量地說明T1高強度信號相對於基線的增幅百分比：CAR-T及根據本文所述實施例之GM-CSF中和抗體已投與之小鼠之腦T1高強度信號相對於基線的增幅百分比為約10%，相比之下，在CAR-T細胞及對照抗體已投與之小鼠中，增幅稍逾100%。如對比圖中所示，CAR-T及GM-CSF中和抗體已投與之小鼠之腦T1高強度信號相對於基線增加約10%，則神經炎症相較於已接受CAR-T細胞及對照抗體之小鼠存在的神經炎症數量減少90%，如根據相對於基線的腦T1高強度信號所量測。圖 25C 至圖 25D表明，相較於未治療的小鼠(其具有500,000至1.5M個白血病細胞)及經CAR-T + 對照抗體治療的小鼠(其具有15,000至100,000個白血病細胞)，用CAR-T + 根據本文所述實施例之GM-CSF中和抗體治療使得白血病細胞數目顯著減少(減少至500至5,000個細胞)，總體疾病控制改善(參見實例15)。

圖 26A 至圖 26I表明GM-CSF阻斷有助於控制CART19毒性且改善功效。圖 26A表明在高腫瘤負荷NALM6復發模型中，經CART19及冷自魯單抗處理之CART19的存活率結果與UTD (未轉導之T細胞)同樣有效(7至8隻小鼠/組，n=2)。圖 26B 至圖 26D表明，冷自魯單抗及抗小鼠GM-CSF抗體控制的CRS誘導體重減輕，中和血清人類GM-CSF且減少原發ALL異種移植CART19 CRS/NT模型中的血清小鼠MCP-1 (單核球趨化蛋白-1)表現(3隻小鼠/組，* p＜0.05)。圖 26E表明冷自魯單抗及抗小鼠GM-CSF抗體減少原發ALL異種移植CART19 CRS/NT模型中的腦炎(3隻小鼠/組，* p＜0.05，** p＜0.01)，如MRI所示。圖 26F 至圖 26G表明CART19 + 冷自魯單抗(亦即，CART19 + 抗hGM-CSF抗體)治療小鼠的功效相較於抗小鼠GM-CSF抗體治療小鼠的功效改善，顯示在原發ALL異種移植CART19 CRS/NT模型(3隻小鼠/組)中，CD19+腦白血病負荷減小且腦巨噬細胞百分比降低。圖 26H表明根據細胞內染色，用CRISPR Cas9剔除GM-CSF來減少其在經NALM6刺激之CART19及UTD中的表現。(代表性實驗，n=2)。圖 26I表明CART19及GM-CSF K/O CART19對腫瘤負荷的控制比UTD更好，且在高腫瘤負荷NALM6復發模型(6隻小鼠/組，* p＜0.05，**** p＜0.0001)中，GM/CSF K/O CART19細胞控制腫瘤負荷的改善功效稍微優於CART19。誤差條指示SEM。

圖 27A 至圖 27D表明在單核球存在下，GM-CSF中和在活體外增強CAR-T細胞增殖且不消弱CAR-T細胞效應功能。圖 27A以圖形描繪相較於同型對照物處理，冷自魯單抗(hGM-CSF中和抗體)在活體外中和CAR-T細胞所產生的hGM-CSF，如CART19單獨在培養基中培養或CART19與NALM6共培養3天之後藉由多工分析所分析，n=2次實驗，每次實驗2個複本，所描繪為代表性實驗；在冷自魯單抗與同型對照處理之間，*** p＜0.001；t檢驗，平均值±SEM。圖 27B以圖形表明hGM-CSF中和抗體處理不抑制CAR-T細胞增殖的能力，如藉由CSFE流式細胞術增殖分析對活CD3細胞所分析，n=3個供者，每個供者2個複本，所描繪為在第3天時間點進行的代表性實驗；在冷自魯單抗與同型對照處理之間，ns p＞0.05；t檢驗，平均值±SEM。單獨：單獨存在於培養基中的CART19，MOLM13：CART19+MOLM13，PMA/ION：CART19 + 5 ng/mL PMA及0.1 μg/mL ION，NALM6：CART19+NALM6。圖 27C以圖形描繪相較於與人類單核球共培養之CART19處理的同型對照組，冷自魯單抗藉由中和hGM-CSF來增強CART19增殖，n=3個供者，在第3天時間點，每個供者2個複本，**** p＜0.0001，平均值±SEM。圖 27D以圖形表明，當與NALM6一起培養時，冷自魯單抗處理不抑制CART19或未轉導之T細胞(UTD)的細胞毒性，n=3個供者，每個供者2個複本，所描繪之代表性實驗在第48小時時間點進行；在冷自魯單抗與同型對照處理之間，ns p＞0.05；t檢驗，平均值±SEM。

圖 28A 至圖 28F證明GM-CSF中和在活體內增強CAR-T細胞在異種移植模型中的抗腫瘤活性(亦即，腫瘤細胞殺滅)。圖 28A說明實驗方案：向NSG小鼠注射CD19+螢光素酶+細胞株NALM6 (每隻小鼠1x10 ⁶個細胞，I.V)。4至6天後，將小鼠成像，隨機分組且接受1至1.5x10 ⁶個CAR-T19或總細胞數相等的對照UTD細胞，次日接受冷自魯單抗或對照IgG (10 mg/Kg，CAR-T注射當天開始每日腹膜內給與，歷時10天)。經由連續生物發光成像來追蹤小鼠以便在CAR-T細胞注射後的第7天開始評估疾病負荷，且追蹤其總存活期。CAR-T細胞注射之後的第7天至第8天，進行尾靜脈放血。圖 28B描繪相較於同型對照處理，冷自魯單抗在活體內中和CAR-T所產生的血清hGMCSF，如藉由hGM-CSF單工分析所分析，n=2次實驗，7至8隻小鼠/組，代表性實驗，CAR-T細胞/UTD注射後第8天的血清；在冷自魯單抗與同型對照處理之間，*** p＜0.001；t檢驗，平均值±SEM。圖 28C以圖形描繪在高腫瘤負荷ALL復發異種移植模型中，冷自魯單抗處理之CAR-T在活體內對腫瘤負荷的控制與同型對照物處理之CAR-T同樣有效，CAR-T注射後的第7天，n=2次實驗，7至8隻小鼠/組，所描繪為代表性實驗，*** p＜0.001，* p＜0.05，ns p＞0.05，t檢驗，平均值±SEM。圖 28D描繪圖 28C的小鼠影像。圖 28E說明實驗方案：向NSG小鼠注射來源於ALL患者的母細胞(每隻小鼠1x10 ⁶個細胞，I.V)。將小鼠連續放血且當CD19+細胞＞1/μL時，將小鼠隨機分組以接受2.5x10 ⁶個CART19與冷自魯單抗或對照IgG (10 mg/Kg，CAR-T注射當天開始每日腹膜內給與，歷時10天)。經由連續尾靜脈放血來追蹤小鼠以便在CAR-T細胞注射後的第14天開始評估疾病負荷，且追蹤其總存活期。圖 28F以圖形描繪相較於同型對照物療法聯合CAR-T療法，冷自魯單抗療法聯合CAR-T療法使得原發急性淋巴母細胞白血病(ALL)異種移植模型中之腫瘤負荷隨時間得到更持久的控制，6隻小鼠/組，** p＜0.01，* p＜0.05，ns p＞0.05，t檢驗，平均值±SEM。

圖 29A 至圖 29E證明GM-CSF CRISPR基因剔除CAR-T細胞中的GM-CSF表現減少，關鍵細胞介素及趨化因子的含量相似且抗腫瘤活性增強。圖 29A說明相較於野生型CART19，CRISPR Cas9 GM-CSF ^k/oCART19產生的GM-CSF減少，但GM-CSF基因破壞不抑制其他細胞介素產生及去顆粒程度，CART19及GM-CSF ^k/oCART19經NALM6刺激，n=3個實驗，每次實驗2個複本，*** p＜0.001，* p＜0.05，ns p＞0.05 (GM-CSF ^k/oCART19與CAR19對比)，t檢驗，平均值±SEM。圖 29B說明GM-CSF ^k/oCAR-T在活體內的血清人類GM-CSF相較於CAR-T療法減少，如藉由多工分析所分析，5-6隻小鼠/組(在CAR-T細胞注射後的第8天放血時為4-6隻)，**** p＜0.0001，*** p＜0.001 (在GM-CSFk/o CART19與野生型CART19之間)，t檢驗，平均值±SEM。圖 29C說明在使用NALM6細胞株的高腫瘤負荷ALL復發異種移植模型中，相較於野生型CART19，GM-CSF ^k/oCART19在活體內的總存活率增強，5-6隻小鼠/組，** p＜0.01，對數秩。圖 29D 至圖 29E顯示得自血清之多工分析的人類( 圖 29D)及小鼠( 圖 29E)細胞介素及趨化因子(除hGM-CSF之外)，表明GM-CSF ^k/oCART19與野生型CART19之間無統計差異，進一步表明藉由減少GM-CSF表現不會使關鍵的T細胞細胞介素及趨化因子發生不利的耗竭，5-6隻小鼠/組(在放血時為4-6隻)，**** p＜0.0001，t檢驗。

圖 30A 至圖 30D說明來源於患者的神經炎症及細胞介素釋放症候群異種移植模型。圖 30A顯示實驗方案：小鼠接受1-3x10 ⁶個來源於原發ALL患者之周邊血液的原代母細胞。經由尾靜脈放血來監測小鼠的植入約10至13週。當血清CD19+細胞每微升≥10個細胞時，小鼠接受CART19 (2-5x10 ⁶個細胞)且開始抗體療法總共10天，如所指示。小鼠每日稱重作為其健康的量度。CART19注射後的第5至6天，執行小鼠腦MRI，且在CART19注射後的第4-11天執行尾靜脈放血用於細胞介素/趨化因子及T細胞分析，2次獨立實驗。圖 30B說明GM-CSF中和與CART19的組合在控制CD19+ ALL細胞負荷方面，與同型對照抗體與CART19的組合同樣有效，代表性實驗，3隻小鼠/組，CART19注射後的第11天，* p＜0.05 (GM-CSF中和+ CART19與同型對照物 + CART19之間)，t檢驗，平均值±SEM。圖 30C說明腦MRI資料，其顯示CART19療法展現T1增強，表示腦血腦障壁破壞及可能的水腫。3隻小鼠/組，CART19注射後的第5至6天，代表性影像。圖 30D說明相較於未治療之PDX對照組，經CART19治療的高腫瘤負荷原發ALL異種移植物顯示腦被人類CD3細胞浸潤。3隻小鼠/組，代表性影像。

圖 31顯示來源於患者之異種移植物在用CART19細胞治療之後，在腦中的非典型路徑發生變化。紅色框指示CART19 + 同型對照物治療之小鼠中的基因相較於來源於患者之未治療之異種移植物上調。

圖 32A 至圖 32D證明CART19療法之後，GM-CSF中和在活體內改善異種移植模型中的CRS。圖 32A表明相較於經CART19及同型對照抗體治療的小鼠，冷自魯單抗及抗小鼠GM-CSF抗體預防CRS誘導的體重減輕，3隻小鼠/組，雙因子變異數分析，平均值±SEM。圖 32B表明在經冷自魯單抗及小鼠GM-CSF中和抗體治療之來源於患者的異種移植物中，人類GM-CSF被中和，3隻小鼠/組，*** p＜0.001，* p＜0.05，t檢驗，平均值±SEM。圖 32C顯示，人類細胞介素/趨化因子熱圖(CART19注射之後的第11天收集血清)展現在CART19治療之後，CRS特有的細胞介素及趨化因子增加。相較於經CART19及同型對照抗體治療的小鼠，GMCSF中和引起若干種細胞介素及趨化因子(包括若干種骨髓相關細胞介素及趨化因子)顯著減少，如圖所指示，3隻小鼠/組，CART19注射後第11天的血清，*** p＜0.001，** p＜0.01，* p＜0.05，GM-CSF中和抗體治療的小鼠與接受CAR-T細胞療法之同型對照物治療小鼠對比，CAR-T細胞療法，t檢驗。圖 32D顯示，人類細胞介素/趨化因子熱圖(CART19注射之後的第11天收集血清)展現在CART19治療之後，CRS特有的小鼠細胞介素及趨化因子增加。相較於CART19聯合對照抗體治療，GM-CSF中和引起若干種細胞介素及趨化因子(包括若干種骨髓分化細胞介素及趨化因子)顯著減少，如圖所指示，3隻小鼠/組，CART19注射後第11天的血清，* p＜0.05，GM-CSF中和抗體治療的小鼠與接受CAR-T細胞療法的同型對照治療小鼠對比，t檢驗。

圖 33A 至圖 33D證明CART19療法之後，GM-CSF中和在活體內改善異種移植模型中的神經炎症。圖 33A 至圖 33B描繪釓增強型T1高強度信號(mm ³) MRI，其表明相較於同型對照，GM-CSF中和有助於減少腦炎、血腦障壁破壞及可能的水腫，(A)代表性影像，(33B) 3隻小鼠/組，** p＜0.01，* p＜0.05，單因子變異數分析，平均值+SD。圖 33C顯示用CART19療法治療之後，腦中存在人類CD3 T細胞。GM-CSF中和引起腦中之CD3浸潤減少的傾向，如對腦半球執行流式細胞術所分析，3隻小鼠/組，平均值±SEM。圖 33D描繪相較於CAR-T療法期間的同型對照，接受GM-CSF中和之小鼠之腦中的CD11b+亮巨噬細胞在CAR-T療法期間減少，如藉由對腦半球執行流式細胞術所分析，3隻小鼠/組，平均值±SEM。

圖 34A(i) 至圖 34B說明GM-CSF ^k/oCART19細胞的產生。圖 34A(i) 至 34A(iv)顯示實驗方案；圖34B顯示用於產生GM-CSF ^k/oCART19的gRNA序列及引子序列。為了產生GM-CSF ^k/oCART19細胞，在U6啟動子的控制下將gRNA選殖入Cas9慢病毒載體中且用於產生慢病毒。來源於正常供者的T細胞用CD3/CD28珠粒刺激且24小時之後，用CAR19病毒及CRISPR/Cas9病毒雙重轉導。第+6天移除CD3/CD28磁珠，且在第8天低溫保存GM-CSF ^k/oCART19細胞或對照CART19細胞。

圖 35顯示用於RNA定序之程序的流程圖。使用Illumina bcl2fastq軟體將二進制基址調用資料轉化為fastq。使用Trimmomatic移除接附子序列，且使用FastQC檢查品質。自NCBI下載最新的人類(GRCh38)及小鼠(GRCm38)參考基因體。使用STAR產生基因體索引檔案，且根據各種條件將成對端讀段相對於基因體定位。使用HTSeq產生各基因的表現計數，且使用DeSeq2計算差異性表現。使用Enrichr評估基因本體論。

圖 36顯示對於高腫瘤負荷ALL復發異種移植模型而言，冷自魯單抗 + CAR-T細胞治療之小鼠的存活期類似於經同型對照抗體 + CAR-T細胞治療的小鼠。n=2次實驗，7至8隻小鼠/組，所描繪為代表性實驗，**** p＜0.0001，*** p＜0.001，* p＜0.05，對數秩。

圖 37顯示代表性TIDE序列，以驗證GM-CSF CRISPR Cas9基因剔除CAR-T細胞中的基因體變化。n=2次實驗，所描繪為代表性實驗。

圖 38表明在高腫瘤負荷復發ALL異種移植模型中，GM-CSF基因剔除CAR-T細胞在活體內對腫瘤負荷的控制相較於野生型CAR-T細胞稍微增強。CAR-T細胞注射後的天數列舉於x軸上，5-6隻小鼠/組(第13天，UTD組中剩留2隻)，所描繪為代表性實驗，**** p＜0.0001，* p＜0.05，雙因子變異數分析，平均值±SEM。

圖 39展現來源於患者之神經炎症及CRS異種移植模型，其使用CART19+抗hGM-CSF抗體療法。相較於未治療之PDX對照組( 圖 30D)，經CART19+抗hGM-CSF抗體療法治療的高腫瘤負荷原發ALL異種移植物顯示腦被人類CD3細胞浸潤( 圖 39)。3隻小鼠/組，代表性影像。

圖 40A 至圖 40B表明CAR-T及冷自魯單抗療法之後，BBB完整性得以保持且神經炎症顯著減少。圖 40A顯示共焦顯微鏡法，其清楚地以高解析度影像顯示在CAR-T療法之後，BBB顯著受損，且顯示CAR-T及冷自魯單抗療法使BBB完整性得以維持。圖 40B係由Santomasso, BD等人, 2018年6月7日首次線上公開; DOI: 10.1158/2159-8290.CD-17-1319 (該文獻以全文引用的方式併入本文中)調適，其表明CSF中之高蛋白質含量(如Santomasso的資料所示)指示BBB破壞及蛋白質滲入CNS中。

圖 41顯示投與兩個患者組之抗CD19 CART T細胞(Axi-Cel) 10 ⁶個細胞/kg及600 mg或1800 mg冷自魯單抗投與之後長達6.5個月的疾病反應評估。

圖 42A 至圖 42G顯示患者基線( 圖 42A 至圖 42D)及產物特徵( 圖 42E 至圖 42G(代表性))。個體(患者)特徵類似於歷史參考特徵。然而，Z19C2個體出現的腫瘤負荷/SPD相對較低。產物特徵與歷史參考特徵(可供使用的資料集有限)一致。

圖 43顯示基線至第4週的Axi-cel及冷自魯單抗PK概況。冷自魯單抗PK概況與輸注的劑量一致。第1組cMAX介於約70與90之間。第2組cMAX介於約250與300 μg/mL之間。達到cMax的時間在輸注後的1至3小時內(如所預期)。在第1組及第2組中，冷自魯單抗血清濃度高於目標劑量(50 μg/ml)的時間分別為24至36小時及5天。Zuma-19的Axi-cel PK峰擴增值發生於第7天及第14天，與歷史參考值一致。冷自魯單抗可能以劑量依賴性方式稍微減少且/或延遲Axi-cel峰擴增(為了研究此可能性，第2組中將需要更多的個體)。

圖 44A 至 44B顯示各組的Axi-cel峰擴增及Axi-cel峰/腫瘤負荷比率。圖 44A顯示第2組Zuma-19 (「Z19」) Axi-cel峰擴增低於歷史參考值的中值。圖 44B顯示Z19 Axi-cel峰擴增與腫瘤負荷(SPD)之間的比率與歷史參考值一致。

圖 45A 至圖 45B顯示使用V-Plex分析(「V」經驗證)「歷史」充分驗證分析(所有先前ZUMA研究所用)得到的血清GM-CSF含量(PD)。圖 45A顯示實例 25之研究中之六位患者隨時間變化的血清GM-CSF含量(pg/mL)。圖 45B顯示發生0至1級神經事件 (NE)的V-Plex GM-CSF Z1個體相對於Z19所有個體( 實例 25之第1組及第2組)。Z19 GM-CSF值皆低於LLOQ。在Z1C4中，31位個體中有17位(每2位個體中至少有1位；＞50%)未出現NE或1級NE，且根據V-plex分析，在治療最初7天內的至少1個時間點，出現可偵測的GM-CSF含量(＞定量下限(LLOQ))。類似地，在Z1C1及2中，61位個體中有32位如此(約50%)。因此，資料強烈表明冷自魯單抗至少部分地阻斷/隔離血清GM-CSF。

圖46顯示Ultra Sensitive (US) GM-CSF偵測。S-Plex (「S」= 靈敏)分析未經驗證。此為其首次使用；其不作為驗證型分析提供且未曾合格(QC'ed)。游離GM-CSF*的組別相關性減少，與冷自魯單抗劑量(600相對於1800 mg)一致：在第1組(600 mg冷自魯單抗)中，在第1天開始，GM-CSF*含量大幅度升高，其在第4天與第5天之間達到峰值且接著至第7天至第14天恢復至相對較低含量。Axi-cel輸注之後直至第5天，1800 g冷自魯單抗(第2組)使GM-CSF含量/偵測值大幅度降低(相較於第1組的含量)。在第2組中，3位個體中有2位在第6天及第7天仍出現GM-CSF的高含量/峰值，第14天似乎恢復至相對較低含量(第14天量測兩位個體中之一者)。S-Plex與V-Plex分析所測得的絕對GM-CSF值不完全類似。S-plex分析顯示，Z19的值高於參考Z1C4 (本文中未顯示)。此可能歸因於至少兩種原因：1)在不評估分析物隨時間及在冷凍/解凍循環期間之穩定性的情況下，S-Plex值在Z19與Z1C4 (參考)之間的比較不一定提供有用資訊。Z1C4樣品比Z19樣品老舊得多且可能亦已經歷多次冷凍/解凍循環；2) S-Plex分析對GM-CSF可能不具有完全的特異性且亦可能偵測到作為GM-CSF軸抑制之補償機制(未知機制/推測)而釋放的其他某物。理論上，為了在Axi-cel輸注後的最初7至14天期間保證GM-CSF軸受到持續的抑制及防止所有NE，約第4天至第5天可能需要重複給與冷自魯單抗。

圖 47A 至圖 47B顯示相較於歷史參考文獻，在ZUMA-19中觀測到的NE延遲(一種傾向)。圖 47A 及圖 47B顯示最嚴重級NE的發生(最初30天內)。最嚴重級NE發生的中值對於Z1C1及2及Z1C4而言為第5天，而對於Z-19 (所有組)而言為第7天。在Z-19中觀測到的最早發生時間為第4天，而Z1C4為第0天且Z1C1及2為第1天。

圖 48A 至圖 48D顯示急性期發炎標記物及IL-15 (血清PD)。圖48A至圖48C分別顯示實例 25之研究中之六位患者的CRP、鐵蛋白、SAA含量。Zuma19 CRP概況類似於歷史參考文獻中的彼等概況(Zuma1)。相較於Zuma19第1組及Zuma1參考文獻，Zuma19第2組的鐵蛋白含量在Axi-cel輸注後(及冷自魯單抗輸注後)降低。值得注意的是，Zuma 19第2組中的鐵蛋白含量在Axi-cel輸注之後出現最低的增加直至不增加。相較於歷史參考文獻，ZUMA-19的SAA含量亦可能降低，其中第2組的3位個體中有2位顯示接近基線含量。在Zuma-19第2組中，Axi-Cel輸注後的IL-15含量相較於歷史參考文獻出現降低，至少在治療後的最初3天如此。以上所述皆表明，Axi-Cel輸注之後，冷自魯單抗可能減少全身炎症。

圖 49A 至圖 49D顯示冷自魯單抗使細胞介素及趨化因子(血清PD)發生預期的減少(基於非臨床文獻)。藍色向下箭頭 = 當相較於歷史參考文獻觀測到一貫的冷自魯單抗劑量依賴性減少時的最後一天。如圖 49A 至圖 49D中所示，實例 25之研究中的六位患者在治療後的至少4天(或更長時間)，冷自魯單抗以劑量依賴性方式使IL-6、IL-8、MCP-1及CXCL-10的釋放減少。患者119-003-002的極高IL-6峰值可能歸因於托西利單抗(Tocilizumab)治療。患者119-005-003的CXCL-10含量在基線時極高且在治療後未觀測到增加。預期Z19第2組的Axi-Cel峰值擴增相對較低引起促炎性細胞介素及趨化因子的釋放減少。

圖 50A 至圖 50F顯示急性期T細胞反應蛋白質(血清PD)。冷自魯單抗可能以劑量依賴性方式減少TNF-α、IL-12p40、INF-γ及穿孔素。顆粒酶B含量與歷史參考含量一致。冷自魯單抗可能延遲IL-2釋放。相對較低的Axi-cel擴增可能造就此等傾向。推測上述內容可能指示在Axi-cel輸注之後，CAR-T細胞的分化減少或延遲。

圖 51A 至圖 51F顯示所選Z-19發炎標記物與Z1C4低/類似SPD (腫瘤負荷)個體之值的比較。此為尚未QC'ed的初步資料。在Zuma19第2組中，相較於Z1C4低/類似腫瘤負荷個體的值，在治療後偵測到若干種骨髓相關發炎標記物(鐵蛋白、IL-6、MCP-1、IL-8及CXCL-10)處於相對較低的峰值含量。參見實例 25。


          <![CDATA[<110>  美商胡曼尼根公司(HUMANIGEN, INC.)]]>
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              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Lys Ser Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的抗顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)抗體κ輕鏈可變區(VL) VK#3]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Thr Asp Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Arg Ser Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成抗顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)抗體κ輕鏈可變區(VL) VK#4 ]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Thr Asp Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Lys Ser Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成κ恆定區]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  330]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的f-異型重鏈恆定區]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的重鏈可變區(VH)互補決定區3 (CDR3)結合特異性決定子(BSD)]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Arg Gln Arg Phe Pro Tyr 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的重鏈可變區(VH)互補決定區3 (CDR3)結合特異性決定子(BSD)]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Arg Asp Arg Phe Pro Tyr 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的重鏈可變區(VH)人類J段JH4]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的重鏈可變區(VH)互補決定區3 (CDR3)]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Arg Gln Arg Phe Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的重鏈可變區(VH)互補決定區3 (CDR3) ]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Arg Asp Arg Phe Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的輕鏈可變區(VL)互補決定區3 (CDR3) ]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  VARIANT]]>
          <![CDATA[<222>  (5)..(5)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa = Lys或Arg]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Gln Gln Phe Asn Xaa Ser Pro Leu Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的輕鏈可變區(VL)互補決定區3 (CDR3) ]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Gln Gln Phe Asn Lys Ser Pro Leu Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  98]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<223>  生殖系重鏈可變區VH1 1-02]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg 
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  98]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<223>  生殖系重鏈可變區VH1 1-03]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Pro 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg 
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  96]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<223>  生殖系κ輕鏈可變區VKIII A27]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 
                          85                  90                  95      
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的重鏈可變區(VH)互補決定區3 (CDR3) ]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  VARIANT]]>
          <![CDATA[<222>  (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  X]]>aa = Gln 或 Asp
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Arg Xaa Arg Phe Pro Tyr 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈可變區(VH)互補決定區3 (CDR3)結合特異性決定子(BSD)與]]>
                      人類生殖系J段JH4的合成型組合(CDRH3與FR4) 
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  VARIANT]]>
          <![CDATA[<222>  (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa = Gln或Asp]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Arg Xaa Arg Phe Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 
          1               5                   10                  15      
          Val Thr Val Ser Ser 
                      20      
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的重鏈可變區(VH)互補決定區1 (CDR1)]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Gly Tyr Tyr Met His 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的重鏈可變區(VH)互補決定區1 (CDR1)]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Asn Tyr Tyr Ile His 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的重鏈可變區(VH)互補決定區2 (CDR2) ]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的重鏈可變區(VH)互補決定區2 (CDR2) ]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的輕鏈可變區(VL)互補決定區3 (CDR3)]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Gln Gln Phe Asn Arg Ser Pro Leu Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<22]]>3>  輕鏈可變區(VL)互補決定區3 (CDR3)結合特異性決定子(BSD)與]]&gt;
          <br/><![CDATA[            人類生殖系J段JK4的合成型組合(CDRL3與FR4)
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Gln Gln Phe Asn Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 
          1               5                   10                  15      
          Glu Ile Lys 
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變區(VL)互補決定區3 (CDR3)結合特異性決定子(BSD)與]]>
                      人類生殖系J段JK4的合成型組合(CDRL3與FR4)
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Gln Gln Phe Asn Lys Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 
          1               5                   10                  15      
          Glu Ile Lys 
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的輕鏈可變區(VL)互補決定區1 (CDR1)]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Thr Asn Val Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的輕鏈可變區(VL)互補決定區1 (CDR1) ]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn Leu Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的輕鏈可變區(VL)互補決定區2 (CDR2)]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Ser Thr Ser Ser Arg Ala Thr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的輕鏈可變區(VL) FR4區]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的重鏈可變區(VH)互補決定區1 (CDRH1)]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          Asp Tyr Asn Ile His 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的重鏈可變區(VH)互補決定區2 (CDRH2)]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          Tyr Ile Ala Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Glu Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asn 
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的輕鏈可變區(VL)互補決定區1 (CDRL1)]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ser Asn Val Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的輕鏈可變區(VL)互補決定區2 (CDRL2) ]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Gly 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  P]]>RT
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成的輕鏈可變區(VL)互補決定區1 (CDR1) ]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  VARIANT]]>
          <![CDATA[<222>  (6)..(6)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa = Val或Ile]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  VARIANT]]>
          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
          <![CDATA[<223>  Thr或Ser]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  VARIANT]]>
          <![CDATA[<222>  (10)..(10)]]>
          <![CDATA[<223>  Val或Le]]>u
          <![CDATA[<400>  39]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Xaa Gly Xaa Asn Xaa Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  54]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<223>  GM-CSF外顯子1的推定ZNF靶向序列]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          atgtggctgc agagcctgct gctctcgggc ctcgcccagc cccagcacgc agcc             54
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  54]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<223>  GM-CSF外顯子1的推定ZNF靶向序列互補股]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          tacaccgacg tctcggacga cgagagcccg gagcgggtcg gggtcgtgcg tcgg             54
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  54]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<223>  GM-CSF外顯子2的推定ZNF靶向序列]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          aatgaaacag tagaagtcat ctcagaaatg gaagtcatct cagaaatgtt tgac             54
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  54]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
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          ttatcacctt tgaaagtttc aaagagaacc tgaaggactt tctgcttgtc a                51

Claims

一種用於治療患有癌症之個體的方法，該方法包含： a) 向該個體投與治療有效量的重組hGM-CSF拮抗劑，其中該重組hGM-CSF拮抗劑為抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗(lenzilumab)；及 b) 向該個體投與抗CD19 CAR-T細胞。
如請求項1之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗係以600 mg至1800 mg的劑量投與，其中經由1小時靜脈內輸注來投與600 mg劑量且經由2小時靜脈內輸注來投與1800 mg劑量。
如請求項1之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗係以每8小時600 mg的劑量投與，24小時總共三次劑量，歷時一天。
如請求項1之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗係以每12小時800 mg的劑量投與，24小時總共兩次劑量，歷時一天。
如請求項1之方法，其中該GM-CSF拮抗劑係以1800 mg的劑量作為單次劑量、經由兩小時靜脈內輸注來投與。
如請求項1之方法，其中治療達成至少80%的客觀反應率。
如請求項6之方法，其中該客觀反應率為完全反應或部分反應。
如請求項1之方法，其中該重組hGM-CSF拮抗劑冷自魯單抗係在該抗CD19 CAR-T細胞投與之前投與，或該抗CD19 CAR-T細胞係在該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗投與之前投與。
如請求項8之方法，其中該抗CD19 CAR-T細胞係在該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗投與之後的2至24小時投與。
如請求項8之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗係在該抗CD19 CAR-T細胞投與之後的2至24小時投與。
如請求項1之方法，其中相較於基線腫瘤負荷，治療之後四週時的腫瘤負荷為腫瘤未被偵測到的完全反應。
如請求項1之方法，其中相較於基線腫瘤負荷，治療之後四週時的腫瘤負荷為SPD減少≥50%的部分反應。
如請求項2之方法，其中該個體在治療之後未出現3級或高於3級的細胞介素釋放症候群(CRS)，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以600 mg的劑量投與。
如請求項2之方法，其中該個體在治療之後未出現2級或高於2級的細胞介素釋放症候群(CRS)或未出現1級或高於1級的神經毒性，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以1800 mg的劑量投與。
如請求項2之方法，其中該個體在治療之後出現低於2級的細胞介素釋放症候群(CRS)及神經毒性且出現完全反應，其中該完全反應為無毒性完全反應且該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以1800 mg之劑量投與。
如請求項15之方法，其中相較於投與CAR-T細胞而未投與該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗的患者，無毒性完全反應率改善超過50%。
如請求項1之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗的投與以劑量依賴性方式減少CAR-T細胞投與之後所發生的全身炎症。
如請求項17之方法，其中該全身炎症減少包含CRS、鐵蛋白及SAA含量降低。
如請求項18之方法，其中該CRS降低包含骨髓細胞介素的含量降低，其中該等骨髓細胞介素為IL-6、IL-8、MCP-1及/或IP-10 (CXCL-10)；及/或IL-2的釋放減少。
如請求項18之方法，其中該CRS降低包含急性T細胞細胞介素的含量降低，其中該等急性T細胞細胞介素為TNF-α、IL-12p40、INF-γ及/或穿孔素。
如請求項1之方法，其進一步包含在該抗CD19 CAR-T細胞投與之後的第4天或第5天，投與第二次劑量的該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗。
如請求項1之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗的投與減少或延遲抗CD19 CAR-T細胞的分化，其阻止CAR-T細胞耗竭及CAR-T細胞活化誘導的細胞死亡。
一種用於降低或消除經歷癌症治療之個體之免疫療法相關毒性之發生率或嚴重度的方法，該方法包含： a) 向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑，其中該重組hGM-CSF拮抗劑為抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗；及 b) 在投與該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗之後，向該個體投與抗CD19 CAR-T細胞。
如請求項23之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗係以600 mg至1800 mg的劑量投與，其中經由1小時靜脈內輸注來投與600 mg劑量且經由2小時靜脈內輸注來投與1800 mg劑量。
如請求項23之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗係以每8小時600 mg的劑量投與，24小時總共三次劑量，歷時一天。
如請求項23之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗係以每12小時800 mg的劑量投與，24小時總共兩次劑量，歷時一天。
如請求項23之方法，其中該GM-CSF拮抗劑係以1800 mg的劑量作為單次劑量、經由兩小時靜脈內輸注來投與。
如請求項23之方法，其中治療達成至少80%的客觀反應率。
如請求項28之方法，其中該客觀反應率為完全反應或部分反應。
如請求項23之方法，其中該抗CD19 CAR-T細胞係在該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗投與之後的2至24小時投與，或該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗係在該抗CD19 CAR-T細胞投與之後的2至24小時投與。
如請求項23之方法，其中相較於基線腫瘤負荷，治療之後四週時的腫瘤負荷為腫瘤未被偵測到的完全反應。
如請求項23之方法，其中相較於基線腫瘤負荷，治療之後四週時的腫瘤負荷為SPD減少≥50%的部分反應。
如請求項24之方法，其中該免疫療法相關毒性包含細胞介素釋放症候群(CRS)及/或神經毒性(NT)且該個體在治療之後未出現3級或高於3級的CRS或NT，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以600 mg之劑量投與。
如請求項24之方法，其中該個體在治療之後未出現高於2級的細胞介素釋放症候群(CRS)或未出現1級或高於1級的NT，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以1800 mg的劑量投與。
如請求項24之方法，其中該個體在治療之後出現低於2級的細胞介素釋放症候群(CRS)及神經毒性且出現完全反應(無毒性完全反應)，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以1800 mg之劑量投與。
如請求項35之方法，其中相較於接受CAR-T而未接受該抗hGM-CSF抗體的患者，無毒性完全反應率改善超過50%。
如請求項23之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗的投與以劑量依賴性方式減少CAR-T投與之後所發生的全身炎症。
如請求項37之方法，其中該全身炎症減少包含CRS、鐵蛋白及SAA含量降低。
如請求項38之方法，其中該CRS降低包含骨髓細胞介素的含量降低，其中該等骨髓細胞介素為IL-6、IL-8、MCP-1及/或IP-10 (CXCL-10)；及/或IL-2的釋放減少。
如請求項38之方法，其中該CRS降低包含急性T細胞細胞介素的含量降低，其中該等急性T細胞細胞介素為TNF-α、IL-12p40、INF-γ及/或穿孔素。
如請求項23之方法，其進一步包含在該抗CD19 CAR-T細胞投與之後的第4天或第5天，投與第二次劑量的該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗。
如請求項23之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗的投與減少或延遲抗CD19 CAR-T細胞的分化，其阻止CAR-T細胞耗竭及CAR-T細胞活化誘導的細胞死亡。
一種用於延遲或預防經抗CD19 CAR-T細胞療法治療癌症之個體之免疫療法相關不良神經事件的方法，該方法包含： a) 向該個體投與重組hGM-CSF拮抗劑，其中該重組hGM-CSF拮抗劑為抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗；及 b) 在投與該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗之後，向該個體投與抗CD19 CAR-T細胞。
如請求項43之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗係以600 mg至1800 mg的劑量投與，其中經由1小時靜脈內輸注來投與600 mg劑量且經由2小時靜脈內輸注來投與1800 mg劑量。
如請求項43之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗係以每8小時600 mg的劑量投與，24小時總共三次劑量，歷時一天。
如請求項43之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗係以每12小時800 mg的劑量投與，24小時總共兩次劑量，歷時一天。
如請求項43之方法，其中該GM-CSF拮抗劑係以1800 mg的劑量作為單次劑量、經由兩小時靜脈內輸注來投與。
如請求項43之方法，其中治療達成至少80%的客觀反應率。
如請求項48之方法，其中該客觀反應率為完全反應或部分反應。
如請求項43之方法，其中該抗CD19 CAR-T細胞係在該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗投與之後的2至24小時投與，或該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗係在該抗CD19 CAR-T細胞投與之後的2至24小時投與。
如請求項43之方法，其中相較於基線腫瘤負荷，治療之後四週時的腫瘤負荷為腫瘤未被偵測到的完全反應。
如請求項43之方法，其中相較於基線腫瘤負荷，治療之後四週時的腫瘤負荷為SPD減少≥50%的部分反應。
如請求項52之方法，其中該個體在治療之後未出現3級或高於3級的細胞介素釋放症候群(CRS)，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以600 mg的劑量投與。
如請求項52之方法，其中該個體在治療之後未出現2級或高於2級的細胞介素釋放症候群(CRS)或未出現1級或高於1級的神經毒性，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以1800 mg的劑量投與。
如請求項52之方法，其中該個體在治療之後出現低於2級的細胞介素釋放症候群(CRS)及神經毒性且出現完全反應(無毒性完全反應)，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗以1800 mg之劑量投與。
如請求項55之方法，其中相較於接受CAR-T而未接受該抗hGM-CSF抗體的患者，無毒性完全反應率改善超過50%。
如請求項43之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗的投與以劑量依賴性方式減少CAR-T投與之後所發生的全身炎症。
如請求項57之方法，其中該全身炎症減少包含CRS、鐵蛋白及SAA含量降低。
如請求項58之方法，其中該CRS降低包含骨髓細胞介素的含量降低，其中該等骨髓細胞介素為IL-6、IL-8、MCP-1及/或IP-10 (CXCL-10)；及/或IL-2的釋放減少。
如請求項58之方法，其中該CRS降低包含急性T細胞細胞介素的含量降低，其中該等急性T細胞細胞介素為TNF-α、IL-12p40、INF-γ及/或穿孔素。
如請求項43之方法，其進一步包含在該抗CD19 CAR-T細胞投與之後的第4天或第5天，投與第二次劑量的該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗。
如請求項43之方法，其中該抗hGM-CSF抗體冷自魯單抗的投與減少或延遲抗CD19 CAR-T細胞的分化，其阻止CAR-T細胞耗竭及CAR-T細胞活化誘導的細胞死亡。
如請求項43之方法，其中免疫療法相關的該等不良神經事件為意識模糊狀態、震顫及/或腦病變。
如請求項13之方法，其進一步包含投與治療有效量的抗IL-6受體單株抗體及/或類固醇。
如請求項14之方法，其進一步包含投與治療有效量的抗IL-6受體單株抗體及/或類固醇。
如請求項15之方法，其進一步包含投與治療有效量的抗IL-6受體單株抗體及/或類固醇。
如請求項33之方法，其進一步包含投與治療有效量的抗IL-6受體單株抗體及/或類固醇。
如請求項34之方法，其進一步包含投與治療有效量的抗IL-6受體單株抗體及/或類固醇。
如請求項35之方法，其進一步包含投與治療有效量的抗IL-6受體單株抗體及/或類固醇。
如請求項53之方法，其進一步包含投與治療有效量的抗IL-6受體單株抗體及/或類固醇。
如請求項54之方法，其進一步包含投與治療有效量的抗IL-6受體單株抗體及/或類固醇。
如請求項55之方法，其進一步包含投與治療有效量的抗IL-6受體單株抗體及/或類固醇。