KR20220007584A - 항-clec2d 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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KR20220007584A
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말로이 고쉬
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요겐드라 만주나스 방갈로르 무니라주
사트야발란 무루게산
상가미트라 바타차르지
비벡 할란
수브라 프라카쉬 차크라바르티
아쉬비니 쿠마르 두베이
아누락 티와리
키르타나 마이소르 바수데바라오 신드
팔라비 라히리
사하나 비마 라오
프라치 *
슈루티 스리바스타바
라오 슈리샤 라메쉬
바라트 라빈드라 세노이
니키타 마르칸다
바그야수리 디케이
바이라바발라쿠마르 나타라얀
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Abstract

요약서
본 명세서는 신규한 항-CLEC2D 항체들 (이때, CLEC2D는 렉틴 유사 전사체-1-LLT1-단백질에 대한 유전자이며, 이는 인간 NKR-P1A 수용체의 기능성 리간드임) 및 관련된 조성물, 그리고 이의 사용 방법에 관계한다. 이러한 항체는 다양한 암 및 기타 질병의 치료제 및 예후 및 진단 용도로 사용된다.

Description

항-CLEC2D 항체 및 이의 사용 방법
관련 출원
본 출원은 2019년 2월 11일 출원된 미국 가특허 출원 제 201941005395호를 우선권으로 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 명세서는 면역학, 특히 면역-종양학에 관련된다. 구체적으로, 본 본 명세서는 CLEC2D 항원에 대항하는 신규한 항체 분자에 관계한다. 본 명세서는 상기 개시된 항체 분자의 다중 포멧 및 아미노산 조성물, 상기 항체 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역, 그리고 CLEC2D 항원에 대항하는 CDR 조성물 및 길이 분포에 또한 관계한다. 본 명세서의 조성물은 단일요법으로 이용될 수 있거나, 또는 질환, 이를 테면 암의 치료 또는 예방에 관련된 다른 항체 분자 또는 임의의 다른 치료요법제와 조합하여 이용될 수 있다.
배경
항체-기반/지향된 치료요법적 접근법을 통한 면역 세포 체크포인트 수용체의 조절은 지난 10년에 걸쳐 지속적으로 관심을 끌어왔었다. 이들 수용체중 많은 것들이 T 세포 체크포인트 조절에 연루되어 있다. 그러나, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 및 골수 세포 체크포인트 조절이 주목을 받고 있다.
NK 세포들은 광범위의 표적 세포, 이를 테면 종양 세포들 또는 바이러스 감염된 세포들을 인지하고, 이에 대항하여 세포독성을 유도하는 선천 면역의 일부분이다. 또한, NK 세포들은 다양한 사이토킨들의 생산을 통하여 채택성 면역 반응의 개시 및 진행에 참여한다. 통상, 이들 반응은 표적 세포들과 면역 세포들의 표면 상에 있는 리간드들을 갖는 활성화 수용체 및 억제성 수용체들의 광범위한 정렬을의 상호작용에 의해 조절된다.
NK 세포 수용체는 두 가지 주요 구조적 클래스로 나뉜다: 면역글로불린 및 C-유형 렉틴-유사 (CTL) 수퍼패밀리. NKR-P1 수용체 (가령, CD161)는 중요한 면역-조절 유전자들이며, 비장 수지상 세포들, T 세포들의 하위집단 및 과립세포들을 비롯한 다양한 세포 유형에서 발현되는 C-유형 렉틴-유사 막경유 분자의 패밀리다. 렉틴-유사 전사체 1 (LLT1) 또는 C-유형 렉틴 도메인 패밀리 2 구성원 D (CLEC2D) 또는 파골세포 억제성 렉틴 (OCIL) 분자는 CD161 수용체의 리간드이며, 이러한 상호작용은 NK 세포 및 T 세포 기능을 차등적으로 조절한다. CLEC2D의 6가지 접합(splice) 변이체들이 있고, 아이소폼 1은 NK 세포들, T 세포들, 단핵구/대식세포, 활성화된 B 세포 및 수지상 세포들에서 발현되는 기본형(canonical) 서열로써, 인간 NK 세포 활성화 수용체로써 기능한다. CLEC2D의 폴리펩티드 쇄는 N-말단 세포질 부분, 막-경유 및 자루 영역 및 2개의 예측된 N-당화 부위를 갖는 C-말단 CTL 엑토도메인으로 나뉠 수 있다.
CLEC2D와 CD161 상호작용은 다양한 암을 비롯한 몇 가지 질환 시나리오에서 숙주 방법으로부터 이탈을 유도한다. 이러한 면역 이탈(escape)은 인간 교모세포종 및 다른 질환에서 보고되었다. 더욱이, B 세포 상에 CLEC2D 발현은 NK 세포들과 항원 제시 세포들 (APC) 사이에 누화(cross-talk)를 조절하는 것으로 본다. 따라서, CLEC2D-CD161 상호작용의 차단은 다양한 암 치료를 위한 새로운 치료요법적 옵션을 제공한다.
CLEC2D-CD161 상호작용의 하류 신호전달에 대해서 잘 알지 못한다. CLEC2D/CD161의 상호작용은 NK 세포 기능을 억제하고, T 세포 증식 및 사이토킨 분비를 자극한다. 이러한 이유로, CLEC2D/CD161 상호작용은 CLEC2D에 특이적으로 결합하고, CLEC2D와 이의 공지의 수용체 CD161 또는 다른 미지의 세포 기전 간의 상호작용을 파괴시키는 단일클론 항체를 이용함으로써 역전시킬 수 있다.
요약
본 명세서는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 이때 이 중쇄는 다음으로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함한다: (a) 서열 식별 번호: 46, 서열 식별 번호: 65, 서열 식별 번호: 59, 및 서열 식별 번호: 99에서 선택된 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (b) 서열 식별 번호: 57, 서열 식별 번호: 91, 서열 식별 번호: 98, 서열 식별 번호: 84, 서열 식별 번호: 58, 서열 식별 번호: 88, 서열 식별 번호: 96, 서열 식별 번호: 47, 서열 식별 번호: 17, 및 서열 식별 번호: 8에서 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (c) 서열 식별 번호: 93, 서열 식별 번호: 53, 서열 식별 번호: 95, 서열 식별 번호: 23, 서열 식별 번호: 103, 및 서열 식별 번호: 7에서 선택된 서열에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (d) 서열 식별 번호: 45, 서열 식별 번호: 15, 서열 식별 번호: 51, 서열 식별 번호: 44, 서열 식별 번호: 73, 서열 식별 번호: 36, 서열 식별 번호: 77, 서열 식별 번호: 50, 및 서열 식별 번호: 6에서 선택된 서열에 대해 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (e) 서열 식별 번호: 97, 서열 식별 번호: 16, 서열 식별 번호: 76, 서열 식별 번호: 9, 서열 식별 번호: 89, 서열 식별 번호: 107, 서열 식별 번호: 68, 서열 식별 번호: 29, 서열 식별 번호: 67, 서열 식별 번호: 74, 서열 식별 번호: 32, 서열 식별 번호: 81, 서열 식별 번호: 106, 서열 식별 번호: 31, 서열 식별 번호: 62, 서열 식별 번호: 48, 서열 식별 번호: 75, 서열 식별 번호: 12, 서열 식별 번호: 102, 서열 식별 번호: 54, 서열 식별 번호: 80, 서열 식별 번호: 26, 서열 식별 번호: 30, 서열 식별 번호: 92, 서열 식별 번호: 108, 및 서열 식별 번호: 79에서 선택된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 서열; (f) 서열 식별 번호: 105, 서열 식별 번호: 101, 서열 식별 번호: 4, 서열 식별 번호: 72, 서열 식별 번호: 28, 서열 식별 번호: 64, 서열 식별 번호: 25, 서열 식별 번호: 60, 서열 식별 번호: 55, 서열 식별 번호: 52, 서열 식별 번호: 27, 서열 식별 번호: 43, 서열 식별 번호: 70, 서열 식별 번호: 71, 서열 식별 번호: 14, 서열 식별 번호: 85, 서열 식별 번호: 13, 서열 식별 번호: 61, 서열 식별 번호: 42, 서열 식별 번호: 39, 서열 식별 번호: 10, 서열 식별 번호: 49, 서열 식별 번호: 24, 서열 식별 번호: 40, 서열 식별 번호: 63, 서열 식별 번호: 78, 서열 식별 번호: 2, 서열 식별 번호: 94, 및 서열 식별 번호: 5에서 선택된 서열에 대해 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 서열; (g) 서열 식별 번호: 11, 서열 식별 번호: 35, 서열 식별 번호: 86, 서열 식별 번호: 22, 서열 식별 번호: 69, 서열 식별 번호: 41, 서열 식별 번호: 3, 서열 식별 번호: 66, 서열 식별 번호: 37, 서열 식별 번호: 56, 서열 식별 번호: 21, 서열 식별 번호: 38, 서열 식별 번호: 90, 서열 식별 번호: 100, 서열 식별 번호: 18, 서열 식별 번호: 20, 서열 식별 번호: 83, 서열 식별 번호: 1, 및 서열 식별 번호: 19에서 선택된 서열에 대해 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 동일한 서열; 그리고 (h) 서열 식별 번호: 33, 서열 식별 번호: 34, 서열 식별 번호: 87, 서열 식별 번호: 82, 및 서열 식별 번호: 104에서 선택된 서열에 대해 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 서열, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편는 C-형 렉틴 도메인 패밀리 2 구성원 D (CLEC2D)에 결합한다.
본 명세서는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 제공하며, 이때 이 경쇄는 다음으로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함한다: (a) 서열 식별 번호: 218, 서열 식별 번호: 249, 서열 식별 번호: 230, 서열 식별 번호: 279, 서열 식별 번호: 316, 서열 식별 번호: 237, 서열 식별 번호: 322, 서열 식별 번호: 225, 서열 식별 번호: 318, 서열 식별 번호: 233, 서열 식별 번호: 305, 서열 식별 번호: 280, 서열 식별 번호: 283, 서열 식별 번호: 242, 서열 식별 번호: 286, 서열 식별 번호: 297, 서열 식별 번호: 309, 및 서열 식별 번호: 246에서 선택된 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (b) 서열 식별 번호: 222, 서열 식별 번호: 258, 서열 식별 번호: 219, 서열 식별 번호: 313, 서열 식별 번호: 294, 서열 식별 번호: 303, 서열 식별 번호: 317, 서열 식별 번호: 273, 서열 식별 번호: 266, 서열 식별 번호: 315, 서열 식별 번호: 257, 서열 식별 번호: 288, 서열 식별 번호: 301, 서열 식별 번호: 221, 서열 식별 번호: 240, 서열 식별 번호: 299, 서열 식별 번호: 247, 서열 식별 번호: 263, 및 서열 식별 번호: 274에서 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (c) 서열 식별 번호: 231, 서열 식별 번호: 250, 서열 식별 번호: 260, 서열 식별 번호: 226, 서열 식별 번호: 271, 서열 식별 번호: 256, 서열 식별 번호: 272, 서열 식별 번호: 278, 서열 식별 번호: 302, 서열 식별 번호: 320, 서열 식별 번호: 295, 서열 식별 번호: 292, 서열 식별 번호: 229, 서열 식별 번호: 264, 서열 식별 번호: 252, 서열 식별 번호: 267, 서열 식별 번호: 304, 서열 식별 번호: 300, 서열 식별 번호: 311, 및 서열 식별 번호: 324에서 선택된 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (d) 서열 식별 번호: 259, 서열 식별 번호: 239, 서열 식별 번호: 281, 서열 식별 번호: 228, 서열 식별 번호: 217, 서열 식별 번호: 227, 및 서열 식별 번호: 251에서 선택된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (e) 서열 식별 번호: 307, 서열 식별 번호: 262, 서열 식별 번호: 253, 서열 식별 번호: 276, 서열 식별 번호: 323, 서열 식별 번호: 234, 서열 식별 번호: 261, 서열 식별 번호: 312, 및 서열 식별 번호: 290에서 선택된 서열에 대해 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (f) 서열 식별 번호: 254, 서열 식별 번호: 289, 서열 식별 번호: 238, 서열 식별 번호: 268, 서열 식별 번호: 248, 서열 식별 번호: 284, 서열 식별 번호: 244, 서열 식별 번호: 310, 서열 식별 번호: 243, 서열 식별 번호: 285, 서열 식별 번호: 220, 서열 식별 번호: 255, 서열 식별 번호: 293, 서열 식별 번호: 298, 서열 식별 번호: 235, 서열 식별 번호: 319, 서열 식별 번호: 245, 서열 식별 번호: 224, 서열 식별 번호: 291, 서열 식별 번호: 277, 및 서열 식별 번호: 232에서 선택된 서열에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; 그리고 (g) 서열 식별 번호: 282, 서열 식별 번호: 308, 서열 식별 번호: 287, 서열 식별 번호: 321, 서열 식별 번호: 236, 서열 식별 번호: 265, 서열 식별 번호: 270, 서열 식별 번호: 275, 서열 식별 번호: 306, 서열 식별 번호: 296, 서열 식별 번호: 241, 서열 식별 번호: 314, 및 서열 식별 번호: 223에서 선택된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; 이때 이들 항체 또는 이의 항원-결합 단편들은 CLEC2D에 결합한다.
본 명세서는 다음을 포함하는 단리된 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 제공한다: (a) 다음에서 선택된 서열을 포함하는 중쇄: (i) 서열 식별 번호: 46, 서열 식별 번호: 65, 서열 식별 번호: 59, 및 서열 식별 번호: 99에서 선택된 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (ii) 서열 식별 번호: 57, 서열 식별 번호: 91, 서열 식별 번호: 98, 서열 식별 번호: 84, 서열 식별 번호: 58, 서열 식별 번호: 88, 서열 식별 번호: 96, 서열 식별 번호: 47, 서열 식별 번호: 17, 및 서열 식별 번호: 8에서 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (iii) 서열 식별 번호: 93, 서열 식별 번호: 53, 서열 식별 번호: 95, 서열 식별 번호: 23, 서열 식별 번호: 103, 및 서열 식별 번호: 7에서 선택된 서열에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (iv) 서열 식별 번호: 45, 서열 식별 번호: 15, 서열 식별 번호: 51, 서열 식별 번호: 44, 서열 식별 번호: 73, 서열 식별 번호: 36, 서열 식별 번호: 77, 서열 식별 번호: 50, 및 서열 식별 번호: 6에서 선택된 서열에 대해 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (v) 서열 식별 번호: 97, 서열 식별 번호: 16, 서열 식별 번호: 76, 서열 식별 번호: 9, 서열 식별 번호: 89, 서열 식별 번호: 107, 서열 식별 번호: 68, 서열 식별 번호: 29, 서열 식별 번호: 67, 서열 식별 번호: 74, 서열 식별 번호: 32, 서열 식별 번호: 81, 서열 식별 번호: 106, 서열 식별 번호: 31, 서열 식별 번호: 62, 서열 식별 번호: 48, 서열 식별 번호: 75, 서열 식별 번호: 12, 서열 식별 번호: 102, 서열 식별 번호: 54, 서열 식별 번호: 80, 서열 식별 번호: 26, 서열 식별 번호: 30, 서열 식별 번호: 92, 서열 식별 번호: 108, 및 서열 식별 번호: 79에서 선택된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (vi) 서열 식별 번호: 105, 서열 식별 번호: 101, 서열 식별 번호: 4, 서열 식별 번호: 72, 서열 식별 번호: 28, 서열 식별 번호: 64, 서열 식별 번호: 25, 서열 식별 번호: 60, 서열 식별 번호: 55, 서열 식별 번호: 52, 서열 식별 번호: 27, 서열 식별 번호: 43, 서열 식별 번호: 70, 서열 식별 번호: 71, 서열 식별 번호: 14, 서열 식별 번호: 85, 서열 식별 번호: 13, 서열 식별 번호: 61, 서열 식별 번호: 42, 서열 식별 번호: 39, 서열 식별 번호: 10, 서열 식별 번호: 49, 서열 식별 번호: 24, 서열 식별 번호: 40, 서열 식별 번호: 63, 서열 식별 번호: 78, 서열 식별 번호: 2, 서열 식별 번호: 94, 및 서열 식별 번호: 5에서 선택된 서열에 대해 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (vii) 서열 식별 번호: 11, 서열 식별 번호: 35, 서열 식별 번호: 86, 서열 식별 번호: 22, 서열 식별 번호: 69, 서열 식별 번호: 41, 서열 식별 번호: 3, 서열 식별 번호: 66, 서열 식별 번호: 37, 서열 식별 번호: 56, 서열 식별 번호: 21, 서열 식별 번호: 38, 서열 식별 번호: 90, 서열 식별 번호: 100, 서열 식별 번호: 18, 서열 식별 번호: 20, 서열 식별 번호: 83, 서열 식별 번호: 1, 및 서열 식별 번호: 19에서 선택된 서열에 대해 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; 그리고 (viii) 서열 식별 번호: 33, 서열 식별 번호: 34, 서열 식별 번호: 87, 서열 식별 번호: 82, 및 서열 식별 번호: 104에서 선택된 서열에 대해 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; 그리고 (b) 다음에서 선택된 서열을 포함하는 경쇄: (i) 서열 식별 번호: 218, 서열 식별 번호: 249, 서열 식별 번호: 230, 서열 식별 번호: 279, 서열 식별 번호: 316, 서열 식별 번호: 237, 서열 식별 번호: 322, 서열 식별 번호: 225, 서열 식별 번호: 318, 서열 식별 번호: 233, 서열 식별 번호: 305, 서열 식별 번호: 280, 서열 식별 번호: 283, 서열 식별 번호: 242, 서열 식별 번호: 286, 서열 식별 번호: 297, 서열 식별 번호: 309, 및 서열 식별 번호: 246에서 선택된 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (ii) 서열 식별 번호: 222, 서열 식별 번호: 258, 서열 식별 번호: 219, 서열 식별 번호: 313, 서열 식별 번호: 294, 서열 식별 번호: 303, 서열 식별 번호: 317, 서열 식별 번호: 273, 서열 식별 번호: 266, 서열 식별 번호: 315, 서열 식별 번호: 257, 서열 식별 번호: 288, 서열 식별 번호: 301, 서열 식별 번호: 221, 서열 식별 번호: 240, 서열 식별 번호: 299, 서열 식별 번호: 247, 서열 식별 번호: 263, 및 서열 식별 번호: 274에서 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (iii) 서열 식별 번호: 231, 서열 식별 번호: 250, 서열 식별 번호: 260, 서열 식별 번호: 226, 서열 식별 번호: 271, 서열 식별 번호: 256, 서열 식별 번호: 272, 서열 식별 번호: 278, 서열 식별 번호: 302, 서열 식별 번호: 320, 서열 식별 번호: 295, 서열 식별 번호: 292, 서열 식별 번호: 229, 서열 식별 번호: 264, 서열 식별 번호: 252, 서열 식별 번호: 267, 서열 식별 번호: 304, 서열 식별 번호: 300, 서열 식별 번호: 311, 및 서열 식별 번호: 324에서 선택된 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (iv) 서열 식별 번호: 259, 서열 식별 번호: 239, 서열 식별 번호: 281, 서열 식별 번호: 228, 서열 식별 번호: 217, 서열 식별 번호: 227, 및 서열 식별 번호: 251에서 선택된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (v) 서열 식별 번호: 307, 서열 식별 번호: 262, 서열 식별 번호: 253, 서열 식별 번호: 276, 서열 식별 번호: 323, 서열 식별 번호: 234, 서열 식별 번호: 261, 서열 식별 번호: 312, 및 서열 식별 번호: 290에서 선택된 서열에 대해 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; (vi.) 서열 식별 번호: 254, 서열 식별 번호: 289, 서열 식별 번호: 238, 서열 식별 번호: 268, 서열 식별 번호: 248, 서열 식별 번호: 284, 서열 식별 번호: 244, 서열 식별 번호: 310, 서열 식별 번호: 243, 서열 식별 번호: 285, 서열 식별 번호: 220, 서열 식별 번호: 255, 서열 식별 번호: 293, 서열 식별 번호: 298, 서열 식별 번호: 235, 서열 식별 번호: 319, 서열 식별 번호: 245, 서열 식별 번호: 224, 서열 식별 번호: 291, 서열 식별 번호: 277, 및 서열 식별 번호: 232에서 선택된 서열에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; 그리고 (vii) 서열 식별 번호: 282, 서열 식별 번호: 308, 서열 식별 번호: 287, 서열 식별 번호: 321, 서열 식별 번호: 236, 서열 식별 번호: 265, 서열 식별 번호: 270, 서열 식별 번호: 275, 서열 식별 번호: 306, 서열 식별 번호: 296, 서열 식별 번호: 241, 서열 식별 번호: 314, 및 서열 식별 번호: 223에서 선택된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; 이때 이들 항체 또는이의 항원-결합 단편은 CLEC2D에 결합한다.
본 명세서는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체들 또는 항원-결합 단편들을 제공하며, 이때 이 중쇄는 서열 식별 번호: 1-108중 임의의 하나에서 선택된 서열을 포함한다.
본 명세서는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체들 또는 항원-결합 단편들을 제공하며, 이때 이 경쇄는 서열 식별 번호: 217-324중 임의의 하나에서 선택된 서열을 포함한다.
본 명세서는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체들 또는 항원-결합 단편들을 제공하며, 이때 이 중쇄는 서열 식별 번호: 1-108중 임의의 하나에서 선택된 서열을 포함하고, 이 경쇄는 서열 식별 번호: 217-324중 임의의 하나에서 선택된 서열을 포함한다.
본 명세서는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 제공하며, 이때 상기 중쇄는 다음을 포함한다: (i) 서열 식별 번호: 433-485에서 선택된 서열을 포함하는 중쇄 (HC) CDR1; (ii) 서열 식별 번호: 486-546에서 선택된 서열을 포함하는 HC CDR2; 그리고 (iii) 서열 식별 번호: 547-653에서 선택된 서열을 포함하는 HC CDR3, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CLEC2D에 결합한다.
본 명세서는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 제공하며, 이때 상기 경쇄는 다음을 포함한다: (i) 서열 식별 번호: 654-726에서 선택된 서열을 포함하는 경쇄 (LC) CDR1; (ii) 서열 식별 번호: 727-783에서 선택된 서열을 포함하는 LC CDR2; 그리고 (iii) 서열 식별 번호: 784-885에서 선택된 서열을 포함하는 LC CDR3, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CLEC2D에 결합한다.
본 명세서는 다음을 포함하는 단리된 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 제공한다: 서열 식별 번호: 433-485에서 선택된 서열을 포함하는 HC CDR1, 서열 식별 번호: 486-546에서 선택된 서열을 포함하는 HC CDR2, 그리고 서열 식별 번호: 547-653에서 선택된 서열을 포함하는 HC CDR3을 포함하는 중쇄; 서열 식별 번호: 654-726에서 선택된 서열을 포함하는 LC CDR1, 서열 식별 번호: 727-783에서 선택된 서열을 포함하는 LC CDR2, 그리고 서열 식별 번호: 784-885에서 선택된 서열을 포함하는 LC CDR3; 또는 이의 조합.
본 명세서의 항체들 또는 이의 항원 결합 단편들의 일부 구체예들에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 식별 번호: 886-909에서 선택된 서열을 포함하는 인간 CLEC2D 폴리펩티드; 서열 식별 번호: 930-1003에서 선택된 서열을 포함하는 인간 CLEC2D 폴리펩티드; 서열 식별 번호: 918-920에서 선택된 서열을 포함하는 시노몰구스 CLEC2D 폴리펩티드; 서열 식별 번호: 911-915에서 선택된 서열을 포함하는 마우스 CLEC2D 폴리펩티드; 서열 식별 번호: 910에서 선택된 서열을 포함하는 렛(rat) CLEC2D 폴리펩티드; 및/또는 서열 식별 번호: 916-917에서 선택된 서열을 포함하는 개 CLEC2D 폴리펩티드에 결합한다.
본 명세서는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 이때 상기 중쇄는 다음 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2 (표 9A에서 기술된 바와 같이)으로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDRH) 1, CDRH2 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하며, 그리고, 이때 상기 경쇄는 다음 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2 (표 9A에서 기술된 바와 같이)으로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 경쇄 상보성 결정 영역 (CDRL)1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 이때 상기 중쇄는 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2 (표 9A에 기술된 바와 같이)로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 이때 상기 경쇄는 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2 (표 9A에 기술된 바와 같이)로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 이때 상기 중쇄는 본원에서 기술된 바와 같이, 표 9B의 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 생식계열 패밀리의 중쇄 프레임 워크 영역 서열을 포함하고, 그리고 이때 상기 경쇄는 본원에서 기술된 바와 같이, 표 9B의 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 경쇄 생식계열 패밀리의 프레임 워크 영역 서열을 포함한다.
본 명세서의 항체들 또는 항원 결합 단편들의 일부 구체예들에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일클론성 항체다.
본 명세서의 항체들 또는 항원 결합 단편들의 일부 구체예들에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CLEC2D가 수용체에 결합하는 것을 차단한다. 일부 구체예들에서, 상기 수용체는 CD161 수용체를 포함하고, 그리고 이 CD161 수용체는 서열 식별 번호: 921-929에서 선택된 서열을 포함한다.
본 명세서의 항체들 또는 항원 결합 단편들의 일부 구체예들에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간, 뮤린 또는 키메라 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 항원-결합 단편은 Fv, Fav, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, scFv-CH3, scFv-Fc, 및 디아바디 단편들로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 nM 미만의 친화력 (KD)으로 인간 CLEC2D에 결합한다.
본 명세서는 본 명세서에서 기술된 펩티드 (가령, 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들) 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서는 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서는 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 인코딩하는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 명세서의 약제학적 조성물의 일부 구체예들에서, 약제학적 조성물은 완충제, 약제학적으로 수용가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 및 보존제중 적어도 하나를 더 포함한다.
본 명세서는 서열 식별 번호: 109-216에서 선택된 아미노산 중쇄 서열을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 명세서는 서열 식별 번호: 325-432에서 선택된 아미노산 경쇄 서열을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 명세서는 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2 (표 9A에서 기술된 바와 같이)으로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 각 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 아미노산 서열에 따라 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 명세서는 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2 (표 9A에서 기술된 바와 같이)으로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 각 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열에 따라 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 명세서는 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2 (표 9A에서 기술된 바와 같이)으로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 가변 중쇄 아미노산 서열에 따라 중쇄 아미노산 서열을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 명세서는 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2 (표 9A에서 기술된 바와 같이)으로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 가변 경쇄 아미노산 서열에 따라 경쇄 아미노산 서열을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 명세서는 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2 (표 9B에서 기술된 바와 같이)으로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 중쇄 프레임워크 영역 아미노산 서열에 따라 프레임워크 영역 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 명세서는 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2 (표 9B에서 기술된 바와 같이)으로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 경쇄 프레임워크 영역 아미노산 서열에 따라 프레임워크 영역 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 명세서는 본 명세서의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 아미노산 서열을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 명세서는 본 명세서의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 아미노산 서열을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
본 명세서는 서열 식별 번호: 109-216에서 선택된 폴리펩티드를 인코드하는 제 1 핵산 및 서열 식별 번호: 325-432에서 선택된 폴리펩티드를 인코드하는 제 2 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 명세서는 본 명세서의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 명세서는 본 명세서의 핵산, 핵산 조성물 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 진핵 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 진핵 세포는 포유류 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 포유류 세포는 CHO 세포, 293 세포, NSO 세포, PER.C6 세포, 및 B 세포로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 포유류 세포는 293-6E 세포 또는 DG44 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 세포들은 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원 결합 단편들을 발현시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 생식계열 세포다.
본 명세서는 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 생산하는 세포들을 제공한다.
본 명세서는 질환 치료를 요하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 해당 대상체에게 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들의 치료요법적 효과량을 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서는 질환 치료를 요하는 대상체에서 질환 치료에 사용하는 용도의 조성물을 제공하며, 이 조성물은 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들 또는 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 인코딩하는 핵산의 치료요법적 효과량을 포함한다.
본 명세서는 질환 치료를 요하는 대상체에서 질환 치료 또는 예방을 위한 약물에 사용을 위한 조성물을 제공하며, 이 조성물은 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들 또는 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 인코딩하는 핵산의 치료요법적 효과량을 포함한다.
본 명세서의 용도를 위한 방법 또는 조성물의 일부 구체예들에서, 상기 질환은 류마티스 관절염이다. 일부 구체예들에서, 상기 대상체는 류마티스 관절염이 있는 결과로 골 손실을 보인다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료요법적 효과량을 투여하면 상기 대상체에서 골 손실을 지연 또는 역전시킨다.
본 명세서의 용도를 위한 방법 또는 조성물의 일부 구체예들에서, 상기 질환은 암이다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 유방암, 전립선암, 자궁내막암, 자궁암, 방광암, 신장암, 식도암, 편평세포암, 포도막흑색종, 신경교종, 교모세포종, 골수종, 갈색세포종, 부신경절종, 여포성 림프종, 신세포암종, 센드칼(cendcal) 암, 난소암, 자궁경부암, 폐암, 결장직장암, 뇌암, 췌장암, 위암, 장암, 고환암, 피부암, 갑상선암, 흉선종, 두경부암, 간암, 인두암, 부신피질암, 담관암, 중피종, 육종, 백혈병, 림프종, 호지킨 질환, 다발성 골수종, 흑색종, 성상세포종, 위암 및 폐선암종으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 암 세포는 해당 세포 표면에 CLEC2D를 발현시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들의 치료요법적 효과량을 투여하면 해당 대상체에서 항-종양 반응이 초래된다.
본 명세서의 용도를 위한 방법 또는 조성물의 일부 구체예들에서, 상기 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들은 단일요법으로 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들은 T 세포 표적화된 면역조절 제제, 제 2 면역조절 제제, 암 백신, 적응성 세포 요법, 종양용해성 바이러스, 제 2 항체 요법, 방사능요법, 항체 약물 콘쥬게이트, 작은 간섭 RNA, a 화학요법, 면역요법, 면역 체크포인트 억제제, 유사분열 억제제중 적어도 하나, 또는 이의 조합과 복합되어 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 적응성 세포 요법은 CAR-T 요법을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료요법적 효과량의 투여로 상기 질환의 징후 또는 증상이 완화된다.
본 명세서는 적어도 약 108개의 독특한 단일클론성 항체 클론을 포함하는 항체 라이브러리를 제공하며, 이때 상기 항체 클론의 적어도 약 80%는 CLEC2D 항원에 탐지가능하게 그리고 특이적으로 결합한다.
본 명세서의 항체 라이브러리의 일부 구체예들에서, CLEC2D 항원은 서열 식별 번호: 886-920 및 서열 식별 번호: 930-1003으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서의 항체 라이브러리의 일부 구체예들에서, CLEC2D 항원은 서열 식별 번호: 886-909 및 서열 식별 번호: 930-1003으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 CLEC2D 항원은 종양 세포 표면 상에 발현된 CLEC2D 항원, 해당 CLEC2D 항원의 변이체, 또는 해당 CLEC2D 항원의 동족체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 CLEC2D 항원의 변이체는 해당 CLEC2D 단백질의 단편을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 CLEC2D 항원의 동족체는 인간, 마우스, 개, 렛 또는 시노몰구스의 CLEC2D를 포함한다.
본 명세서는 면역성 조절이 필요한 대상체에서 면역성을 조절하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 대상체에게 본 명세서의 항체들 또는 항원-결합 단편들의 치료요법적 효과량 또는 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 인코딩하는 핵산의 치료요법적 효과량을 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서는 면역성 조절이 필요한 대상체에서 선천적 면역성을 조절하는(가령, 증가시키는) 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 대상체에게 본 명세서의 항체들 또는 항원-결합 단편들의 치료요법적 효과량 또는 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 인코딩하는 핵산의 치료요법적 효과량을 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서는 자연 킬러 세포의 세포독성을 증가시킬 필요가 있는 대상체에서 이를 증가시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 대상체에게 본 명세서의 항체들 또는 항원-결합 단편들의 치료요법적 효과량 또는 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 인코딩하는 핵산의 치료요법적 효과량을 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서는 면역성 조절이 필요한 대상체에서 적응성 면역성을 조절하는(가령, 증가시키는) 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 대상체에게 본 명세서의 항체들 또는 항원-결합 단편들의 치료요법적 효과량 또는 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 인코딩하는 핵산의 치료요법적 효과량을 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서는 CLEC2D 항원에 결합하는 항체에 대해 매우 다양한 항체 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 항체 유전자의 라이브러리를 파아지 단백질 유전자에 삽입하고, 다수의 파아지를 형질전환시켜 파아지 라이브러리를 만들고, 이때 파아지 라이브러리 안의 파아지들은 해당 파아지의 표면 상에 항체 유전자의 라이브러리를 나타내며; (b) CLEC2D 항원에 결합하는 개별 파아지에 대해 CLEC2D 항원에 대해 파아지 라이브러리를 패닝(panning)시키고, 그렇게 함으로써 CLEC2D 항원에 결합하는 항체들을 인코드하는 항체 유전자들로 풍부해진 풍부화된(enriched) 파아지 라이브러리를 만들고; (c) 단계 (b)를 적어도 한 차례 또는 적어도 두 차례 반복하고; (d) 상기 풍부화된 파아지 라이브러리로부터 항체 유전자를 효모 표면 디스플레이 라이브러리로 이전하고; (e) 상기 효모 표면 디스플레이 라이브러리로부터 CLEC2D 항원에 결합하는 개별 효모 세포들을 단리하고; (f) 상기 CLEC2D 항원에 결합하는 단리된 개별 효모 세포들을 배양하여 효모 표면 디스플레이 라이브러리 클론을 만들고; 그리고 (g) 상기 효모 표면 디스플레이 라이브러리 클론을 서열화시키고; 그렇게 함으로써 CLEC2D 항원에 결합하는 항체 유전자들이 단리된다.
본 명세서의 스크리닝 방법의 일부 구체예에서, 상기 패닝 단계 (b)는 상기 파아지 라이브러리에 CLEC2D 피복된 자성 비드를 패닝시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 이전 단계 (d)는 상기 항체 유전자를 효모 발현 벡터 안에 클로닝시키고, 효모 세포들을 형질전환시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 FLAG 테그, c-Myc 테그, 폴리히스티딘 테그 또는 V5 테그로 항체 유전자의 표면 발현을 분석하는 것을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 테스트 단계 (e)는 상기 CLEC2D 항원에 결합하는 항체 유전자를 발현시키는 효모 세포들을 유동 세포측정으로 단리시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 상기 유동 세포측정 단리를 적어도 1x, 적어도 2x, 적어도 3x, 적어도 4x 또는 적어도 5x 반복하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 상기 CLEC2D에 결합하는 항체 유전자를 포유류 발현 벡터에 클로닝시키는 것을 더 포함한다.
본 명세서는 항-CLEC2D 항체들 또는 이의 항원 결합 단편들을 포함하는 조성물을 만드는 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 프로모터를 인코딩하는 서열 및 항-CLEC2D 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 벡터로 포유류 세포들을 형질전환시키고, 이때 상기 프로모터 및 항-CLEC2D 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 서열은 작동가능하도록 연계되며 작동가능하도록 연계되며; (b) 상기 항-CLEC2D 항체 또는 항체 단편의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 포유류 세포들을 배양하고; (c) 상기 배양된 포유류 세포들을 원심분리시켜 상청액을 만들고; (d) 상기 상청액을 여과하고; 그리고 (e) 상기 여과된 상청액은 액체 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 것을 포함한다.
본 명세서의 방법의 일부 구체예들에서, 상기 여과 단계 (d)는 3 μm -30 μm 필터를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 여과 단계 (d)는 0.22 μm 필터를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 정제 단계 (e)는 단백질 A 컬럼을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 단백질 A 컬럼은 고-염 세척 완충제로 처리되어, 숙주 세포 단백질을 제거하였다. 일부 구체예들에서, 항-CLEC2D 항체 또는 이의 단편은 30 mM 인산염 완충제, pH.3.0-4.0를 이용하여 용리된다. 일부 구체예들에서, 상기 정제 단계 (e)는 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX) 단계를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 AEX 단계는 Q 세파로스 컬럼을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 Q 세파로스는 10-100 mM 히스티딘을 포함하는 사전-평형 완충제로 미리-평형화된다. 일부 구체예들에서, 상기 사전-평형 완충제는 구연산, 인산염 2-(N-몰포리노)에탄술폰산 (MES), 아세테이트 또는 이의 조합을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 사전-평형 완충제의 pH는 4.5-6.5을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체는 단계 (e)에서 200-1000 mM NaCl, KCl 또는 이의 조합을 포함하는 용리 완충제로 용리된다. 일부 구체예들에서, 상기 용출 완충제의 pH는 4.5-6.5를 포함한다.
한 측면에서, 본 명세서는 CLEC2D 항원에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론성 항체들의 단리에 관계한다. 상기 신규한 항체들은 CD161과 CLEC2D의 상호작용을 조절 (가령, 억제시켜), NK 세포/면역 세포 매개된 세포독성 및/또는 사이토킨 생산을 변형시킨다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 ADCC (항체 의존적 세포성 세포독성) 및/또는 CDC (보체 의존적 세포독성) 및/또는 ADCP (항체 의존적 세포성 식작용)을 통하여 종양 세포들을 사멸시킬 수 있는 이들 신규한 항체에 의해 특이적으로 인지되는, CLEC2D를 발현시키는 암 세포에 관계한다.
연관된 측면에서, 본 명세서는 항-CLEC2D 항체를 만드는 방법에 관계하며, 이 방법은 고도의 다양성 항체 유전자 라이브러리로부터 항-CLEC2D 항체를 선별하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 고도의 다양성 항체 유전자 라이브러는 파아지 및/또는 효모 표면 디스플레이를 통하여 디스플레이된다. 한 구체예에서, 상기 파아지-및/또는 효모-디스플레이된 고도의 다양성 항체 유전자 라이브러리는 표적으로 정제된 CLEC2D 항원을 이용하여 선별된다. 한 구체예에서, 선별된 항-CLEC2D 항체 유전자는 포유류 세포 (가령, 중국 헴스터 난소 (CHO) 세포)에서 발현된다. 한 구체예에서, 항-CLEC2D 항체를 발현시키는 단일 세포 클론은 세포주에서 확장되고, 항-CLEC2D 항체 발현에 대해 확인된다. 한 구체예에서, 선별된 항체 클론의 과다발현은 특정된 배양 배지, 보충물 및 본원에서 상류 공정 개발로 누적적으로 기술된 특정 생물반응기 공정을 통해 이루어진다. 한 구체예에서, 세포주로부터 발현된 항-CLEC2D 항체는 예를 들어, 다양한 여과 및 크로마토그래피를 통해 균질하게 정제되며, 이를 본원에서 하류 정제 공정으로 지칭된다.
본 명세서는 질환 치료를 요하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: 해당 대상체내 CLEC2D 단백질의 수준을 결정하고; 그리고 치료요법적 효과량의 항-CLEC2D 항체를 해당 대상체에게 투여한다.
본 명세서의 방법의 일부 구체예들에서, 상기 질환은 암이다. 일부 구체예들에서, 상기 암은 유방암, 전립선암, 자궁내막암, 자궁암, 방광암, 신장암, 식도암, 편평세포암, 포도막흑색종, 신경교종, 교모세포종, 골수종, 갈색세포종, 부신경절종, 여포성 림프종, 신세포암종, 센드칼(cendcal) 암, 난소암, 자궁경부암, 폐암, 결장직장암, 뇌암, 췌장암, 위암, 장암, 고환암, 피부암, 갑상선암, 흉선종, 두경부암, 간암, 인두암, 부신피질암, 담관암, 중피종, 육종, 백혈병, 림프종, 호지킨 질환, 다발성 골수종, 흑색종, 성상세포종, 위암, 폐선암종, 선암종, 세엽 세포 선암종, 부신피질 암종, 폐포 세포 암종, 역형성 암종, 기저양 암종, 기저 세포 암종, 세기관지 암종, 기관지 암종, 신장 아디놀 암종, 배아 암종, 아노메트로이드 암종, 섬유층 간 세포 암종, 여포 암종, 거대 세포 암종, 간세포 암종, 표피내 암종, 상피내 암종, 렙토마니지오(leptomanigio) 암종, 수질 암종, 흑색 암종, 수막(menigual) 암종, 중피세포 암종, 귀리 세포 암종, 편평 세포 암종, 땀샘 암종, 이행 세포 암종, 세뇨관 세포 암종, 범랑아세포 육종, 혈관결석 육종, 포도상(botryoid) 육종, 자궁내막 간질 육종, 유잉(ewing)육종, 섬유속(fascicular) 육종, 거대 세포 육종, 과립구 육종 육종, 면역모세포 육종, 주사코디얼(juxaccordial) 골원성 육종, 코피스(coppices) 육종, 백혈구육종 (백혈병), 림프육종 (림프 육종), 수질 육종, 골수 육종(과립구성 육종), 오스티오겐시(austiogenci) 육종, 골막성 육종, 세망 세포 육종 (조직구 림프종), 원형 세포 육종, 방추 세포 육종, 활막 육종, 모세혈관 확장성 청력 육종, 버킷 림프종, NPDL, NML, NH, 미만성 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, T-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 급성 골수성 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 외투 세포 림프종 및 여포성 림프종을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 대상체의 암 세포는 암을 가지고 있지 않은 정상 세포와 비교하였을 때, 상승된 수준의 CLEC2D 단백질을 갖는다. 일부 구체예들에서, 증가된 수준의 CLEC2D는 나쁜 예후 결과와 관련있다.
본 명세서의 방법의 일부 구체예들에서, 상기 질환은 자가면역 또는 염증성 장애다. 일부 구체예들에서, 상기 자가면역 또는 염증성 장애는 I형 당뇨병, 류마티스 관절염, 루푸스, 염증성 장 질환, 체강(celiac) 질환, 크론 질환, 궤양성 대장염, 건선 또는 다발성 경화증이다.
본 명세서의 방법의 일부 구체예들에서, 상기 질환은 자가면역 또는 염증성 장애다. 일부 구체예들에서, 상기 자가면역 장애는 I형 당뇨병, 류마티스 관절염, 루푸스, 염증성 장 질환, 체강 질환, 크론 질환, 궤양성 대장염, 건선 또는 다발성 경화증이다.
본 명세서의 방법의 일부 구체예들에서, 상기 질환은 감염성 질환이다. 일부 구체예들에서, 상기 질환은 HIV 감염, 인간 사이토메갈로바이러스 감염, B형 간염 감염, C형 간염 감염, 에볼라 바이러스 감염, 뎅기열, 황열병, 리스테리아증, 결핵, 콜레라, 말라리아, 리슈만편모충증 또는 트리파노소마 감염이다.
또다른 측면에서, 시험관 내 및 생체 내 다중 분석을 사용하여 CHO 세포주에서 생산된 새로운 항체를 특징화하는데, 다양한 생물물리학적 매개변수, 항원 인지, 종양 세포 표면 결합, 종양 세포 사멸, 사이토킨 생성, 작용 방식을 정의하기 위한 다운스트림 유전자 분석이 내포된다. 이러한 단일클론성 항체들은 암, 감염성 질환, 자가면역 및 만성 질환에서의 치료, 예후 및 진단 용도와 관련된 다양한 제형, 장기간 안정성에 대해 또한 테스트된다. 또다른 측면에서, 생체 내 종양 억제 분석은 단독 요법으로 또는 다른 치료제와 조합하여, 선택된 항체의 항-종양 활성을 확립하기 위해 수행된다.
한 측면에서, 본 명세서는 CLEC2D 항원에 특이적으로 결합하는 신규한 그리고 독특한 단일클론성 항체들의 단리에 더욱 관계한다. 일부 측면에서, 상기 신규한 항체들은 CD161과 CLEC2D의 상호작용에 영향을 주어, 면역 세포 (가령, NK 세포, B-세포, 또는 T-세포) 매개된 세포독성 및/또는 사이토킨 생산을 변형시킨다. 일부 측면에서, CLEC2D를 발현시키는 다양한 암 세포들이 이들 신규한 항체에 의해 인지되며, ADCC (항체 의존적 세포성 세포독성) 및/또는 CDC (보체 의존적 세포독성 및/또는 ADCP (항체 의존적 세포성 식작용)이 내포된 다양한 수단을 통하여 세포독성 효과가 드러났다. 한 측면에서, 본 명세서는 림프구와 면역 저항 간의 누화(cross-talk)에서 CLEC2D의 역할을 강조하고, 가정한다. 또다른 측면에서, 승인된 치료제의 영역에서, 또는 전임상 또는 임상 시험에서, 제공되는 신규 항체 분자 및 관련 조성물을 확인하는 방법은 제조 가능성/개발 가능성이 있는 약학적 속성들을 포함한다.
한 측면에서, 본 명세서는 질환 또는 장애의 치료를 요하는 대상체의 질환 또는 장애 치료 방법에 관계하며, 이 방법은 해당 대상체에게 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료요법적 효과량을 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 항체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체이다: 본원에서 기술된 바와 같이, 표 9A 및 B의 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2.
한 측면에서, 본 명세서는 면역성 조절이 필요한 대상체에서 면역성을 조절하는 방법에 관계하며, 이 방법은 해당 대상체에게 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 치료요법적 효과량을 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 항체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체이다: 본원에서 기술된 바와 같이, 표 9A 및 B의 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2.
한 측면에서, 본 명세서는 면역성 조절이 필요한 대상체에서 선천적 면역성을 조절하는(가령, 증가시키는) 방법에 관계하며, 이 방법은 해당 대상체에게 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 치료요법적 효과량을 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 항체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체이다: 본원에서 기술된 바와 같이, 표 9A 및 B의 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2.
한 측면에서, 본 명세서는 면역성 조절이 필요한 대상체에서 적응성 면역성을 조절하는(가령, 증가시키는) 방법에 관계하며, 이 방법은 해당 대상체에게 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 치료요법적 효과량을 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 항체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체이다: 본원에서 기술된 바와 같이, 표 9A 및 B의 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2.
한 측면에서, 본 명세서는 자연 킬러 세포의 세포독성을 증가시킬 필요가 있는 대상체에서 이를 증가시키는 방법에 관계하며, 이 방법은 해당 대상체에게 상기 항체 또는 항원-결합 단편의 치료요법적 효과량을 투여하는 것을 포함하고, 이때 상기 항체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체이다: 본원에서 기술된 바와 같이, 표 9A 및 B의 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2.
도면의 간단한 설명
본 개시내용의 특징은 첨부된 도면과 함께 취해진 다음의 설명으로부터 완전히 명백해질 것이다. 특허 또는 출원 파일에는 컬러로 실행된 도면이 적어도 하나 포함되어 있다. 컬러 도면이 있는 이 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청 및 필요한 요금 지불시, 특허청(Office)에서 제공한다. 도면은 본 개시에 따른 단지 몇몇 실시예를 도시하지만, 그 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다는 이해 하에, 본 개시는 첨부 도면의 사용을 통해 추가로 설명될 것이다.
도 1A-1C는 본 명세서를 도식적인 형태로 설명한다: 도 1A, 시나리오, 이때 CLEC2D와 CD161가 상호작용하여, 면역 세포들을 탈출하는 종양 세포; 도 1B, 시나리오 이때 CLEC2D와 CD161의 상호작용을 항-CLEC2D 항체를 이용하여 차단시킴으로써, 용해 신호에 이어, 종양 세포들이 사멸되고; 그리고 도 1C, 시나리오 이때 CLEC2D 항원에 항-CLEC2D 항체를 결찰시키면, NK 세포가 활성화되고, 사이토킨 발현이 상승되며, 이어서 직접 사멸 또는 다른 면역 세포들이 연루됨으로써 표적 세포 청소가 강화된다.
도 2 A-2F 포유류 세포에서 CLEC2D 항원의 발현 및 정제를 설명한다: 도 2A, CLEC2D 엑토-도메인을 가용성 항원으로 발현시키는 포유류 발현 플라스미드의 생성. 상기 구조체는 유전자 합성을 통하여 생성되었고, 제한효소 절단 및 Sanger 시퀀싱을 통하여 확인하였고; 도 2B, 가용성 CLEC2D (Q72-V191)의 정제를 도시하는 IMAC 크로마토그래피 프로파일, 그리고 CLEC2D 항원의 용출 프로파일을 보여주는 삽도; 도 2C, 로드, 세척 및 최종 용리된 CLEC2D 단백질의 SDS-PAGE 프로파일, 해당 정제된 CLEC2D 단백질이 균질하며, 순수하고, 추가 하류 실험에 적합함을 보여주고; 도 2D, CLEC2D 항원에 대항하는 시판되는 이용가능한 항체로 프로브된 정제된 CLEC2D 단백질의 웨스턴 블랏; 도 2E, 상이한 농도의 정제된 CLEC2D 항원에 대해 시판 항체의 결합 특이성을 보여주는 ELISA 분석; 그리고 도 2F, 3 시간 또는 6 시간 동안 환원 조건 하에 PNGase 효소와 함께 항온처리된 정제된 CLEC2D 항원의 SDS-PAGE 분석, CLEC2D 항원의 탈글리코실화를 보여준다.
도 3은 항체 라이브러리 스크리닝 전략의 개략도를 보여준다: 나이브(
Figure pct00001
) 항체 라이브러리는 파아지 및 효모 표면 디스플레이 시스템을 이용하여 표적 CLEC2D 항원에 대하여 스크리닝된다.
도 4A-4E는 자성 비드 상에 피복된 CLEC2D 항원으로 항체 라이브러리의 파아지 패닝을 보여준다. 도 4A, 유동 세포측정에 의한 자성 비드 콘쥬게이션 효능 추정; 도 4B, Fab 라이브러리의 패닝 후 독립 중쇄 클론의 제한효소 절단; 도 4C, Fab 라이브러리 패닝 후 독립 카파 경쇄 클론의 제한 효소 절단; 도 4D, ScFv 라이브러리 패닝 후 독립 중쇄 클론의 제한 효소 절단; 그리고 도 4E, ScFv 라이브러리 패닝 후 독립 카파 경쇄 클론의 제한 효소 절단.
도 5A-5H는 효모 표면 디스플레이를 이용하여 CLEC2D에 대항하는 항체의 스크리닝을 설명한다: 도 5A, 전기천공을 통하여 ScFv 항체 라이브러리의 생성을 위한 효모 콜로니를 묘사하는 플레이트 이미지; 도 5B, 반수체 중쇄 및 경쇄 항체 라이브러리 생성을 묘사하는 플레이트 이미지; 도 5C, 중쇄 또는 경쇄 항체 라이브러리를 함유하는 반수체 효모 균주의 메이팅(mating) 효능을 보여주는 플레이트 이미지, 이때 메이팅 효능은 ~29%로 예상되었다; 도 5D, 효모 세포 표면 상에 발현된 항체 분자와 CLEC2D 항원의 결합에 대한 대표적인 유동 세포측정 분석, 상기 ScFv 라이브러리를 여러차례 소팅하여 고-친화력 효모 클론이 풍부해지도록 하였다; 도 5E, 효모 세포 표면 상에 발현된 항체 분자가 CLEC2D 항원에 결합에 대한 대표적인 유동 세포분석, 상기 Fab 라이브러리를 여러차례 소팅하여 고-친화력 효모 클론이 풍부해지도록 하였다; 도 5F, 발현 및 항원 인지 모두에 대해 여러 차례 소팅 라운드 후, 효모 클론의 풍도에 대한 대표적인 데이터; 도 5G, 개별 효모 클론을 분리하였고, CLEC2D 항원으로 테스트하여 고-친화력 항체 클론을 발현시키는 효모 세포주를 식별하였다; 그리고 도 5H, 단일클론성 항체 클론의 가용성 CLEC2D 항원 결합 백분율을 보여주는 대표적인 유동 세포측정 데이터. 상기 클론의 적어도 약 80%는 CLEC2D 항원에 검출 가능하고 특이적으로 결합한다.
도 6A-6D 다음에서 효모 디스플레이 플랫폼을 통해 스크리닝된 클론의 대등(peer) 그룹 서열 분석을 설명한다: 도 6A, 선별된 분자들의 CDRH3 길이 분포를 보여주는 막대 그래프; 도 6B, 중쇄 CDRH3에 대한 상대적인 아미노산 분포 빈도를 나타내는 막대 그래프 (Kabat 명명법); 도 6C, 중쇄 콘센수스 패밀리 분포를 보여주는 파이 차트; 그리고 도 6D, 경쇄 콘센수스 패밀리 분포를 보여주는 파이 차트.
도 7A-7B 전장-길이의 단일클론성 항체를 생성하는데 이용된 포유류 발현 구조체를 도시한다: 도 7A, 파아지 및 효모 디스플레이 플렛폼을 통하여 스크리닝후, 선별된 항체 가변 중쇄 유전자를 클론시키기 위해 기획된 벡터; 그리고 도 7B, 파아지 및 효모 디스플레이 플렛폼을 통하여 스크리닝후, 선별된 항체 가변 경쇄 (카파) 유전자를 클론시키기 위해 기획된 벡터. 유전자 합성을 통해 구조체들을 만든 후, 제한효소 절단 및 Sanger 시퀀싱을 통해 확인했다.
도 8A-8C 나타낸 바와 같이, 세포 표면 상에 전장 길이의 CLEC2D를 발현시키기 위한 포유류 발현 시스템을 도시한다 : 도 8A, CLEC2D 유전자 발현 구조체는 유전자 합성을 통해 구조체들을 만든 후, 제한효소 절단 및 Sanger 시퀀싱을 통해 확인했고; 그리고 도 8B, 상업적으로 이용가능한 항-CLEC2D 항체 (4C7)를 이용한 유동 세포측정에서 형질감염된 CHO 세포 표면 (C4548) 상에 CLEC2D의 발현을 나타내며; 그리고 도 8C, 공초점 현미경 (60X)으로 고정 및 비-투과성 세포 상에서 항-CLEC2D(4C7) 항체로 모니터링한 CLEC2D의 표면 발현. C4548 세포에서는 항-CLEC2D 항체의 결합이 관찰되었지만, 반면 형질감염안된 CHO 세포들에서는 결합이 관찰되지 않았다. 핵은 DAPI(청색)로 대조착색되었다. 축적 막대는 10 μm이다.
도 9A-9C 일시적으로 형질감염된 CHO 세포로부터 정제된 항-CLEC2D 단일클론성 항체 클론을 설명한다. 항체는 나타낸 바와 같이, 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다: 도 9A, 대표적인 항-CLEC2D 항체들의 SDS -PAGE 프로파일. 정제된 항체는 비-환원 및 환원 조건 모두에서 SDS-PAGE 분석을 받았다. C3566으로부터 정제된 항-CLEC2D 항체 클론은 환원 및 비-환원 겔의 상단 패널, 라인 9에 표시되었다. 라인 4의 클론을 제외한, 하단 패널의 모든 클론은 환원 및 비-환원 겔에서 우수한 프로파일을 나타냈다. 분해된 산물을 나타내는 클론은 추가 연구에서 고려되지 않았다. 실시예 섹션에 설명된 대로 다른 클론에 대해서도 유사한 기준이 적용되었다; 도 9B, 유동 세포측정을 통하여 CHO 세포 상에서 발현된 CLEC2D 항원과 정제된 항-CLEC2D 항체의 상호작용; 형질감염안된 또는 전장-길이 CLEC2D 구조체로 형질감염된 CHO 세포주 상에서 CLEC2D 결합에 대해 C4577, C2907, C3566, C5582, C5397에 의해 구체화된 바와 같이, 대표적인 항체 클론을 평가하였다. MFI에서 우측으로의 이동은 표면 발현된 CLEC2D 항원에 대한 각 클론의 결합을 나타내고; 그리고 도 9C, PC3 종양 세포들 상에 발현된 CLEC2D 항원과 항-CLEC2D 항체들의 상호작용의 대표적 이미지. 표 22에 나타낸 것과 같이, 결합의 정량적 등급이 실시되었고, "+"는 낮은 결합을 나타내고, "+++"는 매우 높은 결합을 나타낸다. 구체화된 바와 같이, 항체 C4252에서는 표면 결합이 탐지되지 않았고, 한편 항체 C0610의 경우, 낮은 결합이 관찰되었으며, 따라서 (+)로 등급화되었으며, 한편 다른 클론들은 여전히 유의적인 차등적 표면 결합을 보였다. 핵은 DAPI(보라색)로 대조착색되었다. 축적 막대는 10 μm이다.
도 10A-10E 나타낸 바와 같이, 항-CLEC2D 항체를 발현시키는 안정적인 CHO 세포주의 개발: 도 10A, 항-CLEC2D 항체 발현 플라스미드로 형질감염된 CHO 미니-풀 샘플로부터 획득된 상청액을 이용하여 모니터링하였을 때(유동 세포측정을 이용하여), 면 발현된 CLEC2D로 결합 연구를 실행하였다. 막대그림은 다양한 클론에 대해 관찰하였을 때, C4548 세포 상에서 발현된 표면 CLEC2D 항원에 대한 결합 정도를 나타낸다. 개별 미니-풀 결합에 대해 MFI에서 배수 변화가 플롯되었다. 배수 변화가 높을 수록 항-CLEC2D 항체가 CLEC2D 항원에 더 많이 결합함을 나타낸다; 도 10B, 단일 세포 클론 스크리닝 -단일 세포 클론 계통으로부터 발현된 항-CLED2D 항체가 정제되었고, 유동 세포측정 실험에 이용되었다. 형광 신호에서 배수 변화가 더 높을 수록 항-CLEC2D 항체가 CLEC2D 항원에 더 강력하게 결합함을 나타낸다; 도 10C, 단일클론성 항체를 생산하는 안정적인 CHO 세포주의 유동 세포측정 분석 -단일 세포 클론 스크리닝 -단일 세포 클론 계통으로부터 발현된 항-CLED2D 항체가 정제되었고, 유동 세포측정 실험에 이용되었다. 항-CLEC2D 항체들을 발현시키는 다수의 단일클론성 세포주는 이를 테면, C4608, C5093, C5511, C6481, C6726, C7720, C9103, C5848 및 C3452이며, 이들은 유동 세포측정에 의해 CHO 세포 표면 발현된 CLEC2D 항원에 결합하는 것에 대해 테스트되었다. 정중 형광 강도에서 배수 증가가 추정되었고, 다수의 안정적인 클론의 경우 3-10 배 범위 안에 있는 것으로 관찰되었다; 도 10D, 클론 CHO 세포주로부터 생성된 항-CLED2D 단일클론성 항체들과 PC3 종양 세포주 상에서 발현된 CLEC2D 항원과의 상호작용의 대표적 이미지. 본원에서 나타낸 바와 같이, 다양한 항-CLEC2D 항체들은 PC3 세포 표면 상의 CLEC2D 항원에 여전히 유의적인 차등적 표면 결합을 보였다. 핵은 DAPI(보라색)로 대조착색되었다. 축적 막대는 10μm이며; 그리고 도 10E, 항체 중쇄 유전자와 경쇄 유전자의 안정적인 통합을 확인하기 위해 안정적인 세포 클론 C4608 및 C5511 상에서 실행된 항-CLEC2D 항체의 정량적 RT PCR. GAPDH 하우스-킵핑 유전자를 내부 표준화자(normalizer)로 이용하였다. 이 연구는 항-CLEC2D 항체들을 발현시키는 CHO 단일클론 계통의 60 세대에서 실행되었다.
도 11A-11F 나타낸 바와 같이, 단일클론성 항-CLEC2D 항체들의 기능적 특징을 도시한다: 도 11A, 전립선 암 세포주, PC3의 표면 발현된 CLEC2D에 대해 항-CLEC2D 항체들, C4608, C5511, C6481, C2438, C3452, C0949의 결합. MFI에서 우측으로의 변위는 PC3 세포주 상에 표면 발현된 CLEC2D 항원에 항체의 결합을 나타내고; 그리고 도 11B, 100ug/mL 고정 농도의 항-CLEC2D 항체에서 1:5의 비율로 작동체 세포를 이용한 PBMC를 이용하여 PC3 표적 세포 상에서 실행된 세포독성 분석의 대표적인 유동 세포측정 분석. 본원에서 기능성에 대해 평가된 클론은 공여자 1의 PBMC와 함께 C5511, C4608 및 C6481이었고, 한편 클론 C5392 및 C3452로부터 정제된 항체들은 공여자 2의 PBMC로 테스트되었다. PC3 살아있는 세포들의 백분율은 APC (eFluor 670) 양성 세포들에 의해 나타내며, 죽은 세포들은 시톡스(Sytox) 그린-양성 세포들을 나타낸다. 각 플롯에 대해 각각의 단일 세포 클론이 표시되었다; 도 11C, PBMC를 작동체 세포로 사용하여 PC3 표적 세포들 (1:5) 상에서 실행된 세포독성 분석의 대표적 유동 세포측정 분석, 항-CLEC2D 항체 (C5511)의 농도를 10 μg/mL에서 200 ug/mL로 증가시키면 투여량(dose) 의존적 종양 세포 세포독성이 증가되는 것으로 나타났다; 도 11D, 고정된 농도의 항-CLEC2D 항체 C5511에서 작동체 세포로 PBMC를 이용하여 PC3 표적 세포들 상에서 실행된 세포독성 분석의 대표적 유동 세포측정 분석. 종양 대비 작동체 세포 비율 (T:E)은 1:5에서 1:10으로 증가되었다. 상기 데이터에서 작동체 세포들의 비율이 증가되면 더 높은 수준의 종양 세포 세포독성이 유도되었음이 나타났고; 그리고 도 11E, 엔드 포인트(end point) 세포독성 분석에서 10 μg/mL에서 종양 세포의 유의적인 세포독성이 드러났다. 상기 분석은 표적 세포들을 사멸시키기 위한 항-CLEC2D 항체의 최적 농도를 또한 결정 (공촛점 현미경을 이용하여)한다. 상단 패널은 예상대로 세포독성이 관찰되지 않은 모든 대조군 처리를 나타내고, 하단 패널은 PBMC의 존재 하에 항-CLEC2D 항체 (C6726)의 농도를 증가시켜 처리할 때 향상된 PC3 종양 세포 사멸을 나타낸다 (T:E = 1:5). 최대 세포 사멸은 50ug/ml의 항-CLEC2D 항체 농도에서 관찰되었다. PC3 종양 세포들 -녹색; PBMC -적색; 사멸 세포들 -청색; 그리고 도. 11F, 표적 세포들을 사멸시키기 위하여 선별된 항-CLEC2D 항체를 이용한 엔드 포인트 세포독성 분석 (공촛점 현미경을 사용). PC3 종양 세포 단독, PBMC 단독, 이소형 인간 IgG1 항체가 있는 PBMC와 같은 대조군 처리에서는 세포독성이 관찰되지 않았다. 항-CLEC2D 항체 (C6726, C5848, C4608, C5511 및 C6481) 클론을 이용하였을 때, PC3 종양 세포 세포독성이 관찰되었다. 크기가 향상된 이미지는 PC3 종양 세포가 종양 세포 사멸을 유도하는 작동체 세포로 둘러싸여 있음을 보여주었다. PC3 종양 세포들 -녹색; PBMC -적색; 사멸 세포들 -청색.
도 12A-12D 항-CLEC2D 항체를 사용한 종양 세포의 NK 세포 매개된 세포독성을 예시한다: 도 12A, 정제된 NK 세포들과 항-CLEC2D 항체들 (C6481 & C5511), 100ug/ml로 처리하였을 때, PC3 종양 세포들의 세포독성. 이 데이터는 1:1의 T:E에서 PC3 종양 세포의 86% NK 세포 매개된 세포독성을 나타냈다. PC3 사멸 세포의 백분율은 시톡스 녹색 양성 세포를 나타내고; 도 12B, 아이소형 대조군 (인간 IgG1 항체) 또는 1:0.5에서 1:10으로 시작하여 T:E 비율을 증가시키는 NK 세포와 함께 배양할 때 표적 세포 사멸이 관찰되지 않았고; 축적 막대는 10μm이며, 도 12C, 항-CLEC2D 항체 단독으로는 PC3 종양 세포의 세포독성을 유도하지 못하였고; 축적 막대는 10μm이며, 도 12D 항-CLEC2D 항체 C5511 (50ug/mL)는 T:E 비율을 1:0.5에서 시작하여, 1:5 및 1:10 C5511로 증가시킬 때, PC3 종양 세포 사멸이 증가되는 것으로 드러났다. 축적 막대는 10 μm이다.
도 13은 단리된 T 세포와 항-CLEC2D 항체들 (C5511 & C6481), 100ug/ml로 처리된 PC3 종양 세포들의 세포독성을 도시한다. 죽은 PC3 종양 세포들의 백분율은 시톡스 녹색-양성 세포들에 의해 표시된다.
도 14A-14B 나타낸 바와 같이, PC3 종양 세포들의 항-CLEC2D 항체 의존적 세포독성과 살아있는 세포의 이미지를 도시한다. 도 14A, 살아있는 세포 이미징은 200μg/ml에서 인간 PBMC 세포 및 항-CLEC2D 항체와 함께 항온처리한 동안 PC3 종양 세포의 세포독성을 보여주었다. 상기 분석은 이미지 획득 동안 37℃ 및 5% CO2로 유지된 가습기에서 20시간 동안 수행되었다. 대조적으로, 대조군 인간 IgG1 항체 (200μg/ml)와 함께 항온처리하면 종양 세포 세포독성이 야기되지 않았다. 살아있는 PC3 종양 세포들 -녹색; PBMC -적색; 죽은 세포들 -청색; 축적 막대는 20μm이며, 그리고 도 14B, 살아있는 세포 이미징은 200μg/ml에서 인간 NK 세포 및 항-CLEC2D 항체와 함께 항온처리한 동안 PC3 종양 세포의 세포독성을 보여주었다. 상기 분석은 이미지 획득 동안 37℃ 및 5% CO2로 유지된 가습기에서 20시간 동안 수행되었다. 대조적으로, 대조군 인간 IgG1 항체 (200μg/ml)와 함께 항온처리하면 종양 세포 세포독성이 야기되지 않았다. 살아있는 PC3 종양 세포들 -녹색; NK 세포들 -적색; 죽은 세포들 -청색. 축적 막대는 20μm이다.
도 15A-15G 나타낸 바와 같이, 항-CLEC2D 항체들의 예측 모델을 도시한다: 도 15A, 복합체 PDB ID 5MGT의 에피토프 인식의 카툰 표현 (쇄 A -진한 파란색, 쇄 B -청록색) 및 CD161(쇄 C -주황색 빨간색, 쇄 D -자주색); 도 15B, 적색 셀렉션은 NKR-P1 사슬의 6Å 이내의 잔기를 나타낸다; 도 15C, 정제된 항-CLEC2D 항체 구조는 리본으로 표현; 특이적 항-CLEC2D 단일클론성 항체에 대한 각각의 클론은 적절하게 라벨되었다. 가변 경쇄는 어두운 음영으로 표시되고, 중쇄 가변 영역은 흰색으로 표시되며; 도 15D, CLEC2D에 대해 상호 작용하는 클러스터 중 하나에 기여한 C4608에 속하는 PIZSA 점수 및 형태 클러스터링 원리에 따라 선택된 형태를 나타낸다 (더 짙은 음영);도 15E, C4608의 G00001-G00004-G00007-G00010-G00015 클러스터 조합이 CLEC2D 항원에 대한 결합 부위를 포함하는 지를 결정하기 위해, 돌연변이용으로 선택된 잔기의 시각화; 도 15F, CLEC2D와 상호 작용하는 클러스터 중 하나에 기여한 C5511에 속하는 PIZSA 스코어링 및 구조 클러스터링 원칙에 따라 선택된 구조를 나타낸다 (더 짙은 음영); 그리고 도 15G, C5511의 G00001-G00005-G00011-G00019-G00020 클러스터 조합이 CLEC2D 항원에 대한 결합 부위를 포함하는 지를 결정하기 위해, 돌연변이용으로 선택된 잔기의 시각화.
도 16A-16G 항-CLEC2D 항체 클론 C4608 및 C5511에 대항하는 CLEC2D 항원에서 식별된 에피토프를 도시한다; 도 16A, CLEC2D 항원 상에 항-CLEC2D 항체 C4608 접촉 점의 표면 현시; 도 16B, CLEC2D 상에 CD161 결합 영역들과 중첩되는 CLEC2D 항원 상의 항-CLEC2D 항체 C4608 접촉 점; 도 16C, CLEC2D 항원 상의 항-CLEC2D 항체 C5511 접촉 점의 표면 현시; 도 16D, CLEC2D 상의 CD161 결합 영역과 중첩되는 CLEC2D 항원과의 항-CLEC2D 항체 C5511 접촉 점; 모든 도시에서 더 어두운 음영은 CLEC2D 항원에서 상호작용하는 잔기 위치를 나타낸다; 도 16E, CLEC2D와 CD161 상호작용의 항-CLEC2D 항체 매개된 파괴 -CLEC2D 항원 비드 접합 효율 점검 모니터링; 도 16F, CD161-FC의 CLEC2D 항원에 대한 결합은 농도 의존적 방식으로 자성 비드 상에서 관찰됨; 도 16G, 대조군과 비교하여, 항-CLEC2D 항체의 부재 및 존재 하에 CD161 결합의 유동세포 분석 모니터링, 검은색 실선 화살표로 표시된 대로 CD161 및 CLEC2D 결합의 파괴 측정.
도 17A-17B 나타낸 바와 같이, 항-CLEC2D 항체에 의한 NK 세포 활성화를 도시한다: 도 17A, 항-CLE2D 항체 C5511은 세포독성이 되는 쪽으로 NK 세포 활성화를 나타내는 CD69 발현을 유도한다. 각 플롯에 대해 각각의 실험 조건이 언급되었다. IL2 처리는 CD69 과다발현의 양성 대조군으로 수행되었다; 그리고 도 17B, 항-CLEC2D 항체 매개된 CD69 발현은 NK 세포에서 PC3 세포 프라이밍된 CD69 발현 수준에 비해 더 높다.
도 18A-18D 나타낸 바와 같이, 작동체 세포들에 의해 사이토킨 발현에서 항-CLEC2D 항체 C5511의 효과를 실증한다: 도 18A, IFNγ 발현 수준에서 상승을 모니터하기 위해 항-CLEC2D 항체 C5511는 10μg/mL 및 100μg/mL 농도로 이용되었다; 도 18B, 항-CLEC2D 항체 C5511은 PC3 세포들 (E:T = 10:1) 존재 또는 부재 하에서 100ug/mL 농도로 이용되었다. IFNγ 발현은 CD3+ve 게이트(gated) 집단에서 모니터링되었다; 도 18C, 항-CLEC2D 항체 C5511은 PC3 세포들 (E:T = 10:1) 존재 또는 부재 하에서 100ug/mL 농도로 이용되었다. IFNγ 발현은 CD3-ve 게이트(gated) 집단에서 모니터링되었다; 그리고 도 18D, 항-CLEC2D 항체 C5511은 단리된 NK 세포의 존재 또는 부재 하에서 100μg/mL 농도로 이용되었다. 항-CLEC2D 항체 C5511를 사용한 경우 IFNγ 과다발현이 관찰되었다.
도 19A-19G 전장-길이 단일클론성 항체를 생성하는데 이용된 포유류 발현 구조체를 도시한다. 나타낸 바와 같이, 유전자 합성을 통해 구조체들을 만든 후, 제한효소 절단 및 Sanger 시퀀싱을 통해 확인했다. 도 19A, IgG4 백본에서 선별된 항체 가변 중쇄 유전자를 클론하기 위해 기획된 벡터; 도 19B, IgG1 N에서 A 백본에 선별된 항체 가변 중쇄 유전자를 클론하기 위해 기획된 벡터; 도 19C, CHO 세포들의 표면 상에 발현된 CLEC2D 항원에 IgG4 아이소형 백본을 갖는항-CLEC2D 항체 (C3256 및 C3276)의 결합에 대한 유동 세포측정 분석. 우측으로 피크 변위로부터 측정하였을 때, 형질감염안된 CHO 세포들과의 결합을 비교하였고; 도 19D, 다양한 항체 아이소형을 이용한 항-CLEC2D 항체의 세포독성. IgG1 아이소형 (C3452 & C4608) 및 IgG4 아이소형 (C3256 & C3276) 항-CLEC2D 항체들은 새로 단리된 PBMC 및 PC3 종양 세포들과 항온처리할 때 유의적인 세포독성을 나타내었고, 도 19E, 아푸코실화된 단일클론성 항체들 C0613, C1301, C6268, C1699, C2437, C9832, C8900 및 C7749로 만들어진 항-CLEC2D 항체는 유동 세포측정에 의해 CHO 세포 표면 발현된 CLEC2D 항원에 대한 결합을 나타냈고; 도 19F, C5511보다 5X 더 적은 농도에서 이용된 아푸코실화된 항-CLEC2D 항체 (C7749, C8800, C9832)를 이용한 PC3 종양 세포들의 NK 세포-매개된 세포독성. 이 데이터에서 아푸코실화된 항-CLEC2D 항체가 5배 더 적은 농도에서 거의 동일한 세포 사멸을 달성했음이 드러났고, 이것은 아푸코실화된 항-CLEC2D 항체들이 더 세포독성이 큰 것을 나타내며; 그리고 도 19G, Ramos 및 PC3 종양 세포주를 이용한 항-CLEC2D 항체 C5511에 대한 CDC 매개된 세포독성을 측정하였다. 리투시맙은 양성 대조군으로 이용되었다.
도 20A-20K 암 이종이식(xenograft) 마우스 모델에서 항-종양 효과를 도시한다. HuNOG-EXL 마우스가 PC3 이종이식에 이용되었으며, 종양을 품고있는 동물들을 무작위화시키고, 나타낸 바와 같이 항-CLEC2D 항체 산물의 주사에 이들을 이용하였다: 도 20A, 항-CLEC2D 항체 단독 또는 항-PDL1 항체와 조합하여 관찰된 유의적인 항종양 효과를 나타내는 종양 부피 대비 시간 플롯; 도 20B, 종양 미세 환경에서 CD3+ T 세포의 착색을 통한 면역 세포 침윤을 보여주는 이미지; 도 20C, 96-시간에 걸쳐 종양에 주사된 Alexa 647 라벨된 항-CLEC2D 항체를 보여주는 이종이식된 마우스에서 이미지; 도 20D, 피하 PC-3 종양 이종이식편을 보유하는 인간화된(huNOG-EXL) 마우스에서 종양 부피에 대한 테스트 화합물의 효과 (최대 36일차까지). 각 처리 그룹은 5 마리의 동물로 구성되었으며, C5511 mAb 그룹, 비히클 대조군 IgG1 그룹 및 C6481 mAb 그룹으로 명명되었다. 값은 각 그룹에서 2~5마리의 동물의 평균으로 표시된다. 통계 분석은 이-원 ANOVA에 이어, Graph Pad Prism (버전 8.3.0)을 사용한 Bonferroni 사후-테스트로 수행되었다. C5511 mAb 그룹과 비히클 대조군 IgG1 그룹의 비교하였을 때 ** p<0.01 통계학적 유의성 (36일차); 도 20E, 피하 PC-3 종양 이종이식편을 품고 있는 인간화된(huNOG-EXL) 마우스에서 종양 용적에 있어서 테스트 화합물의 효과 (최대 24일차 까지). 각 처리 그룹은 5 마리의 동물로 구성되었으며, C5511 mAb 그룹, 비히클 대조군 IgG1 그룹 및 C6481 mAb 그룹으로 명명되었다. 값은 각 그룹에서 2-5마리의 동물의 평균으로 표시된다. 통계 분석은 이-원 ANOVA에 이어, Graph Pad Prism (버전 8.3.0)을 사용한 Bonferroni 사후-테스트로 수행되었다. 차례로 C5511 mAb 그룹과 C6481 mAb 그룹을 비히클 대조군 IgG1 그룹을 비교하였을 때 *** p<0.001 및 * p<0.05 통계학적 유의성 (24일차); 도 20F, 피하 PC-3 종양 이종이식편을 품고 있는 인간화된(huNOG-EXL) 마우스에서 델타 종양 용적에 있어서 테스트 화합물의 효과 (최대 36일차 까지). 각 처리 그룹은 5 마리의 동물로 구성되었으며, C5511 mAb 그룹, 비히클 대조군 IgG1 그룹 및 C6481 mAb 그룹으로 명명되었다. 값은 각 그룹에서 2-5마리의 동물의 평균으로 표시된다. 통계 분석은 이-원 ANOVA에 이어, Graph Pad Prism (버전 8.3.0)을 사용한 Bonferroni 사후-테스트로 수행되었다. C5511 mAb 그룹과 비히클 대조군 IgG1 그룹의 비교하였을 때 ** p<0.01 통계학적 유의성 (36일차); 도 20G, 피하 PC-3 종양 이종이식편을 품고 있는 인간화된(huNOG-EXL) 마우스에서 델타 종양 용적에 있어서 테스트 화합물의 효과 (최대 24일차 까지). 각 처리 그룹은 5 마리의 동물로 구성되었으며, C5511 mAb 그룹, 비히클 대조군 IgG1 그룹 및 C6481 mAb 그룹으로 명명되었다. 값은 각 그룹에서 2-5마리의 동물의 평균으로 표시된다. 통계 분석은 이-원 ANOVA에 이어, Graph Pad Prism (버전 8.3.0)을 사용한 Bonferroni 사후-테스트로 수행되었다. 차례로 C5511 mAb 그룹과 C6481 mAb 그룹을 비히클 대조군 IgG1 그룹을 비교하였을 때 *** p<0.001 및 * p<0.05 통계학적 유의성 (24일차); 도 20H, 피하 PC-3 종양 이종이식편을 품고 있는 인간화된(huNOG-EXL) 마우스에서 상대적 종양 용적에 있어서 테스트 화합물의 효과 (최대 36일차 까지). 각 처리 그룹은 5 마리의 동물로 구성되었으며, C5511 mAb 그룹, 비히클 대조군 IgG1 그룹 및 C6481 mAb 그룹으로 명명되었다. 값은 각 그룹에서 2-5마리의 동물의 평균으로 표시된다. 통계 분석은 이-원 ANOVA에 이어, Graph Pad Prism (버전 8.3.0)을 사용한 Bonferroni 사후-테스트로 수행되었다. C5511 mAb 그룹과 비히클 대조군 IgG1 그룹의 비교하였을 때 *p<0.05 통계학적 유의성 (36일차); 도 20I, 피하 PC-3 종양 이종이식편을 품고 있는 인간화된(huNOG-EXL) 마우스에서 상대적 종양 용적에 있어서 테스트 화합물의 효과 (최대 24일차 까지). 각 처리 그룹은 5 마리의 동물로 구성되었으며, C5511 mAb 그룹, 비히클 대조군 IgG1 그룹 및 C6481 mAb 그룹으로 명명되었다. 값은 각 그룹에서 2-5마리의 동물의 평균으로 표시된다. 통계 분석은 이-원 ANOVA에 이어, Graph Pad Prism (버전 8.3.0)을 사용한 Bonferroni 사후-테스트로 수행되었다. 차례로 C5511 mAb 그룹과 C6481 mAb 그룹을 비히클 대조군 IgG1 그룹을 비교하였을 때 *** p<0.001 및 * p<0.05 통계학적 유의성 (24일차); 도 20J, 피하 PC-3 종양 이종이식편을 품고 있는 인간화된(huNOG-EXL) 마우스에서 상대적 델타 종양 용적에 있어서 테스트 화합물의 효과 (최대 36일차 까지). 각 처리 그룹은 5 마리의 동물로 구성되었으며, C5511 mAb 그룹, 비히클 대조군 IgG1 그룹 및 C6481 mAb 그룹으로 명명되었다. 값은 각 그룹에서 2-5마리의 동물의 평균으로 표시된다. 통계 분석은 이-원 ANOVA에 이어, Graph Pad Prism (버전 8.3.0)을 사용한 Bonferroni 사후-테스트로 수행되었다. C5511 mAb 그룹과 비히클 대조군 IgG1 그룹의 비교하였을 때 *p<0.05; 그리고 통계학적 유의성 (36일차); 도 20K, 피하 PC-3 종양 이종이식편을 품고 있는 인간화된(huNOG-EXL) 마우스에서 상대적 종양 용적에 있어서 테스트 화합물의 효과 (최대 24일차 까지). 각 처리 그룹은 5 마리의 동물로 구성되었으며, C5511 mAb 그룹, 비히클 대조군 IgG1 그룹 및 C6481 mAb 그룹으로 명명되었다. 값은 각 그룹에서 2-5마리의 동물의 평균으로 표시된다. 통계 분석은 이-원 ANOVA에 이어, Graph Pad Prism (버전 8.3.0)을 사용한 Bonferroni 사후-테스트로 수행되었다. 차례로 C5511 mAb 그룹과 C6481 mAb 그룹을 비히클 대조군 IgG1 그룹을 비교하였을 때 *** p<0.001 및 * p<0.05 통계학적 유의성 (24일차).
도 21A-21I 나타낸 바와 같이, 정제된 항-CLEC2D 항체 산물의 특징을 도시한다: 도 21A, 비-환원 및 환원 조건에서 정제된 C5511 항체의 SDS-PAGE 분석; 도 21B, 항-CLEC2D 항체의 무손상 질량 분광분석법 분석으로부터 TIC 크로마토그램 (3회 복제); 도 21C, 항-CLEC2D 항체의 WCX 크로마토그램 분석; 도 21D, 항-CLEC2D 항체의 크기 압출 크로마토그램; 도 21E, CLEC2D 정제된 바이오티닐화된 항원에 대항한 항-CLEC2D 항체의 ELISA 분석 개발. 이 데이터는 항-CLEC2D 항체의 Kd를 계산하기 위해 하나의 부위 결합 모델에 적합했고; 도 21E 및 21F, 대표적인 항-CLEC2D 항체의 CLEC2D 항원 친화력 기반으로 한 결합 연구. 도 21G, 정제된 CLEC2D 항원 엑토-도메인을 BIACORE 연구에서 항원의 공급원으로 이용되었으며; 모니터된 반응을 시간에 대해 플롯팅하였고; 도 21H, pH 5.9에서 FcRn과 대표적인 항-CLEC2D 항체 분자들의 친화력 기반으로 한 결합 연구; 그리고 도 21I, pH 7.4에서 FcRn과 대표적인 항-CLEC2D 항체 분자들의 친화력 기반으로 한 결합 연구.
도 22A-22C 나타낸 것과 같이, 타당한 진단 및 예후 적용을 위한 항-CLEC2D 항체를 도시한다: 도 22A, 결합 특징을 기반으로 하여 항-CLEC2D 항체 (C0949)의 선별. PC3 표적 세포들 상에 CLEC2D 결합에 대해 4개 항-CLEC2D 항체 (C2779, C2438, C0949 및 C2543) 가 평가되었다. C0949는 우수한 결합 및 피크 중앙값 이동을 나타냄; 도 22B, 항-CLEC2D 항체 C0949는 다수의 전립선 암 세포주 상에서 CLEC2D 항원을 인지하고; 그리고 도 22C, 항-CLEC2D 항체 C0949는 다수의 종양 세포주 상에서 CLEC2D 항원을 인지한다. 평균 형광의 특이적 결합 및 배수 변화는 테스트와 대조군 사이의 평균 FITC 형광의 비율로 계산되었다.
도 23A-23D 나타낸 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 전립선 암 종양 세포들 상에서 CLEC2D 항원을 인지함을 도시한다: 도 23A, TCGA 데이터 분석 후, 전립선암 병기에서 CLEC2D 항원의 발현 수준; 도 23B, 전립선 암 세포주 PC3, DU145, 22RV1 및 LnCap에서 CLEC2D 항원의 발현 수준; 도 23C, LPS, Poly I:C, IFN-γ, PBMC 상청액, PBMC 세포들, NK 세포들 및 T 세포들을 이용한 유도와 함께, 전립선 암 세포주 PC3, LnCap, 22RV1, 및 DU145에서 CLEC2D 항원의 발현 수준. 항-CLEC2D 항체가 있는 상단 패널, 병합된 이미지를 나타내는 하단 패널; 그리고 도 23D, 악성 전립선 암 조직에서 종양 세포들의 착색을 보여주는, 항-CLEC2D 항체 C2685로 착색된 인간 조직 마이크로어레이 슬라이드.
도 24A-24D 나타낸 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 다양한 다른 종양 세포들 상에서 CLEC2D 항원을 인지함을 도시한다: 도 24A, 다양한 암에서 CLEC2D 항원 발현에 대한 TCGA 데이터 분석; 도 24B, 다양한 종양 세포주 HepG2 (간암), LN229 (교아세포종), SKOV3 (난소암), BT474 (유방암), NCI-H929 (골수종), 및 Ramos (림프종)에서 CLEC2D 항원의 발현 수준; 도 24C, LPS, Poly I:C, IFNγ으로 유도시, BT474 (유방암), SKOV3 (난소암), LN229 (교아세포종), Ramos (림프종), NCI-H929 (골수종) 및 HepG2 (간암)에서 CLEC2D 항원의 발현 수준; 그리고 도 24D, SKOV3 (난소암)에서 관찰된 100μg/ml의 항-CLEC2D 항체 C5511 매개된 세포독성; 그리고 HepG2 (간암) 세포주에서 관찰된 100μg/ml의 항-CLEC2D 항체 C5511 및 C6481의 매개된 세포독성. 죽은 종양 세포들의 백분율은 시톡스 녹색-양성 세포들에 의해 표시된다.
도 25A-25E 나타낸 바와 같이, 유동 세포측정 분석을 이용하여 항-CLEC2D 항체에 의한 림프구 증식 분석을 설명한다. 도 25A, 항체 습식-피복 프로토콜; 도 25B, 공기-건조된 항체 피복 프로토콜; 도 25C, 고-밀도 사전-배양 프로토콜; 도 25D, 연장된 기간 동안 PBMC를 항-CLEC2D 항체들 (C5511, C4608, C6481)과 함께 항온처리할 때, 작동체 세포들로부터 IFNγ 사이토킨 분비 측정. OKT3 항체를 이용한 처리는 양성 대조군으로 이용하였고; 그리고 도 25E, 연장된 기간 동안 PBMC를 항-CLEC2D 항체들 (C5511, C4608, C6481)과 함께 항온처리할 때, 작동체 세포들로부터 IL2 사이토킨 분비 측정. OKT3 항체를 이용한 처리는 양성 대조군으로 이용하였다. PBMCs 는 항-CD3 항체 OKT3 (1μg/ml), 항-CLEC2D 항체 C4608, C5511 및 C6481 (1μg/ml, 10μg/ml, 50μg/ml & 100μg/ml)로 처리하였고, 4일간 항온처리하였다. 유동세포 분석기를 사용하여 형광 증식 염료 상태를 모니터링했다. 처리안된 PBMC는 대조군으로 이용하였다.
도 26 유동 세포측정 분석을 이용하여 CHO 세포 표면 상에서 발현된 렛, 마우스 및 시노몰구스의 CLEC2D 항원 동족체에 대항하는 항-CLEC2D 항체 (C3566 및 C5511)의 결합을 보여주는 막대그림 오버레이를 도시한다.
상세한 설명
항체-기반/지향된 치료요법적 접근법을 통한 면역 세포 체크포인트 수용체의 조절은 지난 수년에 걸쳐 지속적으로 관심을 끌어왔었다. 가장 큰 노력은 T 셀 체크포인트 조정에 집중되었다. 그러나, B 세포, NK 세포, 및 골수성 세포 체크포인트 조정에 대한 관심이 증가하고 있다. 선천적 면역 시스템은 자연 킬러 (NK) 세포들이 내포되며, 광범위한 표적 세포들, 이를 테면, 종양 세포들 또는 바이러스 감염된 세포들을 인지하고, 세포독성을 유도하는 능력을 소유한다. NK 세포들은 임의의 사전 항원 감작화를 요구하지 않는다. 직접적인 세포독성 외에도, NK 세포는 사이토킨의 생산과 분비를 통해 적응 면역 반응의 시작과 진행에도 참여한다. 일반적으로, 이러한 반응은 표적 세포 표면의 리간드와 다양한 표면 활성화 및 표면 억제 수용체의 상호작용에 의해 유도된 신호의 적절한 균형에 의해 조절된다. 단일클론성 항체, 사이토킨과 같은 다양한 제제를 통한 NK 세포 수 및/또는 이의 관련 기능의 조절은 항종양 활성을 향상시킬 수 있다. 이러한 제제는 단독으로 또는 잠재적 치료제와 조합하여 제공될 수 있다. 따라서, NK 세포의 항-암 활성은 활성화 종류 및/또는 억제 종류의 표면 수용체를 활용하여 발현될 수 있다.
이러한 상호작용의 차단은 여러 암 치료를 위한 새로운 치료 옵션이 될 수 있다. 그러나, 발견, 이해 및 설계가 조정되어야 하고, 치료요법적 처리는 다양한 암의 표적으로서 특정 수용체에 대해 더욱 맞춤화될 필요가 있지만, 아직 해결되지 않고 있다.
본 명세서에 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서와 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어들은 해당 분야의 숙련된 기술자들이 통상적으로 이해하는 의미를 가져야 한다. 더욱이, 내용에서 달리 필요하지 않는 한, 문맥 및 응용에서 적절하다고 간주되면, 단수형 용어들은 복수형을 포함하며, 복수형 용어들은 단수형을 포함한다. 명료함을 위해, 다양한 단수/복수 순열이 여기에 명시적으로 제시될 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 생명공학, 면역학, 분자 및 세포 생물학, 재조합 DNA 기술과 관련하여 사용되는 명명법은 당업계에 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 여기에 인용된 특정 참고 문헌 및 기타 문서는 참조로 여기에 명시적으로 편입된다. 충돌이 있는 경우, 정의를 비롯하여 본 명세서의 내용이 우선한다. 재료, 방법, 그리고 실례는 단지 예시이고, 이에 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
또한, 개시된 항체 나이브 라이브러리의 방법, 제조 및 사용은 달리 명시되지 않는 한, 분자 생물학, 생화학, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 기술, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 관련 분야의 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술, 그 원리 및 요구 사항은 문헌에 설명되어 있으며, 당업자에게 알려져 있다.
항체 나이브 라이브러리를 생성하는 방법 및 항체 나이브 라이브러리를 인코딩하는 핵산 및 본 개시내용의 다른 구체예들이 개시되고 설명되기 앞서, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시예를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는, 단수형 "하나" 및 "그것"은 문맥에서 달리 명확히 언급이 없는 한 복수형을 포함함을 유념하여야 한다.
한 구체예에서, 용어 "라이브러리" 및 "라이브러리들"은 본 명세서내에서 호환되며, 본 명세서의 산물에 관계한다. 한 구체예에서, 이것은 핵산 서열의 수집 또는 모듬(pool)을 지칭한다. 한 구체예에서, 이것은 아미노산 서열의 수집 또는 모듬(pool)을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 이것은 아미노산 서열 또는 핵산 서열의 수집 또는 모듬을 포함하는 유지체의 수집 또는 모듬을 지칭한다. 일부 구체예들에서, 상기 유기체는 박테리오파아지 (파아지) 또는 효모 (가령, 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae))이다.
한 구체예에서, 본 개시내용의 맥락에서, 용어 '풀링(pooling)', '풀링된(pooled)', '풀(pool)' 및 '여러 풀(pools)'은 상기 방법을 사용하여 다수의 공여자, 즉, 한 명 이상의 공여자로부터 수득된 샘플/핵산 서열/핵산 단편/유전자 클론/증폭된 산물/항체를 조합하는 것을 의미한다.
한 구체예에서, 용어 "PBMC"는 림프구 (T 세포, B 세포, NK 세포) 및 단핵구, 적혈구, 혈소판 및 과립구(호중구, 호염기구 및 호산구)로 구성된 둥근 핵을 갖는 임의의 말초혈액 세포를 지칭한다.
항원
본원에서 사용될 때, 용어 "항원" 또는 "면역원"이란 신체에서 면역 반응을 유도하는 임의의 외래 물질을 지칭한다. 한 구체예에서, 항원은 세포성 단백질이다. 한 구체예에서, 항원은 세포 표면 단백질이다.
상기 항원은 임의의 종으로부터 단리될 수 있거나, 또는 유도될 수 있다. 대표적인 종에는 호모 사피엔스(Homo sapiens), 무스 머스큘러스(Mus musculus), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 카니스 루피스파알리스(Canis lupissimilaris) 및 시노몰구스 마카카 파시쿨라리스(Cynomolgus macaca fascicularis)가 내포되지만, 이에 국한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 항원은 호모 사피엔스(Homo sapiens), 무스 머스큘러스(Mus musculus), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 카니스 루피스파알리스(Canis lupissimilaris) 및 시노몰구스 마카카 파시쿨라리스(Cynomolgus macaca fascicularis)로부터 단리된, 또는 유도된 야생형 단백질의 단편이다. 일부 구체예들에서, 상기 항원은 호모 사피엔스(Homo sapiens), 무스 머스큘러스(Mus musculus), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 카니스 루피스파알리스(Canis lupissimilaris) 및 시노몰구스 마카카 파시쿨라리스(Cynomolgus macaca fascicularis)의 단백질의 돌연변이 변이체다. 일부 구체예들에서, 항원은 해당 항원의 용해도 및/또는 안정성이 증가되도록 돌연변이될 수 있다. 예를 들면, CLEC2D 항원에는 발현된 단백질의 안정성 및 균일성이 증가되도록, Cys163 아미노산으로 추가 이황화물 다리를 도입시키기 위해 H176C에 돌연변이가 내포될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 항원에는 해당 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 에피토프 테그를 내포한다. 예시적인 테그에는 폴리히스티딘 테그 및 FLAG 테그가 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 당업계에 공지된 임의의 에피토프 테그는 본 개시내용의 범위 내에서 고려된다.
C-형 렉틴 도메인 패밀리 2 구성원 D (CLEC2D) -CLAX로도 지칭됨-, 렉틴 유사 전사체-1 (LLT1) 및 OCIL은 자연 킬러 세포 수용체 C-형 렉틴 패밀리의 구성원이다. CLEC2D는 킬러 세포 렉틴 유사 수용체 B1 (KLRB1)에 결합한다. KLRB1은 또한 CD161, CLEC5B, NKR, NKR-P1, NKR-P1A, NKRP1A 및 hNKR-P1A로 알려져 있다. CLEC2D 및 CD161의 모든 오르소로그(orthologs) 및 아이소형은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
일부 구체예들에서, C-형 렉틴 도메인 패밀리 2 구성원 D (CLEC2D) 단백질 또는 이의 임의의 동맹체(aliases) 또는 동족체 (당분야에 공지된, 인간 또는 다른 종으로부터)는 본원에 기술된 방법에 의해 만들어진 항체의 표적 항원을 나타낸다.
일부 구체예들에서, 상기 항원은 호모 사피엔스(Homo sapiens), 무스 머스큘러스(Mus musculus), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 카니스 루피스파알리스(Canis lupissimilaris) 및 시노몰구스 마카카 파시쿨라리스(Cynomolgus macaca fascicularis)로부터 단리된 또는 유래된 CLEC2D 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는 CLEC2D 항원이다.
일부 구체예들에서, CD161 단백질 또는 이의 임의의 동맹체 또는 동족체 (당분야에 공지된, 인간 또는 다른 종으로부터)는 본원에 기술된 방법에 의해 만들어진 항체의 표적 항원을 나타낸다.
일부 구체예들에서, CD161 항원은 호모 사피엔스(Homo sapiens), 무스 머스큘러스(Mus musculus), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 카니스 루피스파알리스(Canis lupissimilaris) 및 시노몰구스 마카카 파시쿨라리스(Cynomolgus macaca fascicularis)로부터 단리된 또는 유래된 CD161 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일성을 갖는다.
예시적인 항원은 하기 표 1에 나타낸다.
표 1. 대표적인 CLEC2D 및 CD161 폴리펩티드 서열
Figure pct00002
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항체들
한 구체예에서, 용어 "항체"는 전체 또는 부분적으로 천연 공급원으로부터 유래되거나 또는 합성적으로 생성될 수 있는 면역글로불린을 지칭한다. 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 다른 언급이 없는 한, 명세서를 통하여 동의어로 이용된다.
한 구체예에서, 용어 "항체"에는 다중클론성 및 단일클론성 항체 조제물(preparations)이 모두 내포되며, 또한 다음의 것들이 내포된다: 키메라 항체 분자들, F(ab')2 및 F(ab) 단편들, Fv 분자들, 단일 쇄 Fv 분자들 (ScFv), 이량체 및 삼량체 항체 단편들, 이중특이적 항체, 미니바디, 인간화된 단일클론성 항체 분자들, 인간 항체들, 항체의 Fc 영역 및 이들 분자로부터 생성된 임의의 기능적 단편들을 포함하는 융합 단백질, 이때 유도체 분자들은 부모계 항체 분자의 면역학적 기능성을 유지한다. 본 명세서에 따른 항체는 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 또는 본 명세서에 따른 특징적 속성이 유지되는 한, 유전공학적으로 더 조작된 항체다.
"고유 항체들과 면역글로불린"은 통상 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질로써, 2개의 동일한 경쇄 (L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된다. 각 경쇄는 한 개 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연계되며,이황화 결합의 수는 상이한 면역글로불린 아이소형(isotypes)의 중쇄 간에 가변적이다. 각 중쇄와 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄내 이황화 결합 다리를 갖는다. 각 중쇄는 한 단부에 가변 도메인 (VH)과 이어서 몇 개의 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한 단부에 가변 도메인(VL)과 이의 다른 단부에 불변 도메인을 갖고; 상기 경쇄의 불변 도메인은 상기 중쇄의 제 1 불변 도메인과 나란히 있으며, 경쇄 가변 도메인은 해당 중쇄의 가변 도메인과 나란히 있다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성한다고 여겨진다 (Clothia et al., J. Mol. Biol. 186:651 (1985); Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:4592 (1985)).
"항원 결합 부위" 또는 "결합 부분"이라는 용어는 항원 결합에 관여하는 면역글로불린 분자의 부분을 의미한다. 상기 항원 결합 부위는 중쇄 ("H") 및 경쇄 ("L")의 N 말단 가변 영역 ("V")의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변 영역 (hypervariable regions)"이라 불리는 중쇄 및 경쇄의 V 부위 내의 3 개의 매우 다양한 스트레취는 "프레임워크 (framework) 영역" 또는 "FRs"로 알려진, 더 보존된 인접 스트레취 사이에 끼어있다. 따라서, "FR"이라는 용어는 면역글로불린의 초가변영역 사이, 그리고 이에 인접하게 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 의미한다. 항체 분자에서, 경쇄의 3 개의 초가변 영역 및 중쇄의 3 개의 초가변 영역은 3-차원 공간에서 서로에 대해 상대적으로 배치되어, 항원-결합 표면을 형성한다. 항원-결합 표면은 결합된 항원의 3-차원 표면에 상보적이며, 중쇄 및 경쇄의 각각의 3 개의 초가변 영역은 "상보성-결정 영역(complementarity-determining regions)" 또는 "CDRs"으로 지칭된다.
용어 "가변"이란 해당 가변 도메인의 특정 일부분이 항체들 간에 서열에서 상당히 상이하며, 이의 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성에 이용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성(variability)은 가변 도메인에 고르게 분포되지 않는다. 이것은 경쇄-및 중쇄-가변 도메인 모두에서 상보성-결정 영역 (CDRs) 또는 초가변 영역이라고 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 더욱 더 보존된 부분들은 프레임워크 (FR)라고 불린다. 고유의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 β-시트 형태를 채택한 4 개의 FR 영역, 이에 연결된 3 개의 CDR, 이때, 이들은 루프 연결되며, 그리고 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 쇄의 CDRs는 FR 영역에 의해 서로 근접하게 유지되고, 다른 쇄의 CDRs와 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991) 참고). 상기 불변 도메인은 항체가 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 다양한 작동체(effector) 기능, 이를 테면, 항체-의존적 세포 독성에서 항체에 참여와 같은 기능을 나타낸다.
"항체 단편들"은 전장-길이 항체의 일부분, 바람직하게는 이의 가변 도메인, 또는 이의 적어도 상기 항원 결합 부위를 포함한다. scFv 항체들은 가령, Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88에서 기술되어 있다. 한 구체예에서, "항체 단편"은 온전체 항체의 일부분으로, 항원 결합 활성을 나타내는 능력을 유지한다. 또한, 항체 단편들은 VH 도메인의 특징을 갖는, 즉, VL 도메인과 함께 어셈블리될 수 있는, 또는 각 항원에 결합하는 VL 도메인이 기능적 항원 결합 부위로 VH 도메인과 함께 어셈블리하는 능력을 갖고, 그렇게 함으로써 본 명세서에 따른 항체의 속성을 제공하는, 단일 쇄 폴리펩티드를 포함한다.
항체의 파파인 절단으로 2개의 동일한 항원-결합 단편들, 소위 "Fab" 단편들-각각은 단일 항원-결합 부위를 가짐-, 그리고 잔류 "Fc" 단편들을 만드는데, 이의 이름은 쉽게 결정화하는 능력을 반영한다. 펩신 처리로 2 개의 항원-복합 부위를 갖고, 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
"Fv"는 완벽한 항원-인지 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게, 비-공유적 연합된 하나의 중쇄-및 하나의 경쇄-가변 도메인으로 된 이량체로 구성된다. 이것은 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 특정하는 형상이다. 집합적으로, 6개의 CDR은 해당 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (항원에 대해 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다는 더 낮은 친화력을 갖지만, 여전히 항원을 인지하고, 결합하는 능력을 갖는다.
단일 쇄 Fv ("scFv") 폴리펩티드 분자는 펩티드-인코딩 링커에 의해 연결된 VH-및 VL-인코딩 유전자를 포함하는 융합 유전자로부터 발현될 수 있는 공유 결합된 VH:VL 이형이량체(heterodimer)다. 자연적으로 응집되었지만 화학적으로 분리된 경질 및 중질 폴리펩티드 쇄를 항체 V 영역으로부터 scFv 분자로 전환시키는 화학 구조를 식별하기 위한 다수의 방법이 기술되어 있으며, 이때 상기 구조는 항원-결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3-차원 구조로 폴딩될 수 있다. 가령, U.S. 특허 번호. 5,091,513; 5,132,405; 그리고 4,946,778 참고.
Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH1)을 또한 함유한다. Fab' 단편들은 이 항체 힌지 영역의 하나 또는 그 이상의 시스테인을 함유하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 몇개의 잔기를 추가함으로써 Fab 단편들과는 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리(free) 티올기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편들은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 알려져 있다.
상수임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (면역글로블린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (k) 및 람다 (l)라고 불리는 2 개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역학적 결합", 및 "면역학적 결합 성질"은 면역글로불린 분자와 면역글로불린의 특이적인 항원 사이에서 발생하는 비-공유적 상호 작용 유형을 의미한다. 면역학적 결합 상호작용의 강도 또는 친화력은 이 상호작용의 해리 상수 (Kd)로 표현될 수 있으며, 이때 더 작은 Kd는 더 큰 친화력을 나타낸다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 정량화될 수 있다. 그러한 방법 중 하나는 항원-결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리의 속도를 측정하는 것을 수반하고, 이때 이러한 속도는 복잡한 파트너의 농도, 상호작용의 친화력 그리고 양쪽 방향에서 이 비율에 동등하게 영향을 주는 기하학적 매개 변수에 따라 달라진다. 따라서, 온-속도 상수"(Kon) 및 "오프-속도 상수"(Koff)는 모두 농도 및 결합(association)과 해리(dissociation)의 실제 속도의 계산에 의해 결정될 수 있다. Koff/Kon의 비율은 친화력과 관련이 없는 모든 매개변수의 취소를 가능하게 하며, 이는 해리 상수 Kd와 같다. 일부 구체예들에서, 방사능리간드 결합 분석 또는 당분야의 숙련자들에게 공지된 유사한 분석에 의해 측정하였을 때, 본 명세서의 항체는 Kd ≤ 10 μM, 바람직하게는 ≤ 1 μM, 더욱 바람직하게는 ≤ 100 nM, 예를 들면, ≤ 90 nM, ≤ 80 nM, ≤ 70 nM, ≤ 60 nM, ≤ 50 nM, ≤ 40 nM, ≤ 30 nM, ≤ 20 nM, ≤ 10 nM, ≤ 5 nM, 또는 ≤ 1 nM에서 CLEC2D에 결합한다. 일부 구체예에서, 본 명세서의 항체의 결합 친화력은 10-5M ~ 10-12 M 범위 안에 있다. 예를 들면, 본 명세서의 항체의 결합 친화력은 10-6 M ~ 10-12 M, 10-7 M ~ 10-12 M, 10-8 M ~ 10-12 M, 10-9 M ~ 10-12 M, 10-5 M ~ 10-11 M, 10-6 M ~ 10-11 M, 10-7 M ~ 10-11 M, 10-8 M ~ 10-11 M, 10-9 M ~ 10-11 M, 10-10 M ~ 10-11 M, 10-5 M ~ 10-10 M, 10-6 M ~ 10-10, 10-7 M ~ 10-10 M, 10-8 M ~ 10-10, 10-9 M ~ 10-10 M, 10-5 M ~ 10-9 M, 10-6 M ~ 10-9 M, 10-7 M ~ 10-9 M, 10-8 M ~ 10-9 M, 10-5 M ~ 10-8 M, 10-6 M ~ 10-8 M, 10-7 M ~ 10-8 M, 10-5 M ~ 10-7 M, 10-6 M ~ 10-7 M 또는 10-5 M ~ 10-6 M이다.
본 명세서는 또한 본 명세서에 기재된 CLEC2D 항체의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 특정 동일성 또는 유사성 백분율을 갖는 항체를 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 항체들은 본 명세서에 기재된 CLEC2D 항체중 임의의 하나의 특정 영역 또는 전장과 비교하였을 때, 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 높은 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체들은 본 명세서에 기재된 CLEC2D 항체중 임의의 하나의 특정 영역 또는 전장과 비교하였을 때, 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 높은 동일성을 가질 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 항체들은 본 명세서에 기재된 CLEC2D 항체중 임의의 하나의 특정 영역 또는 전장과 비교하였을 때, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 높은 동일성을 가질 수 있다. 더 더욱 바람직하게는, 상기 항체들은 본 명세서에 기재된 CLEC2D 항체중 임의의 하나의 특정 영역 또는 전장과 비교하였을 때, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 높은 동일성을 가질 수 있다. 본 명세서의 핵산 및 단백질에 대한 서열 동일성 또는 유사성은 당분야에 공지된 방법에 의해 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 서열 비교 알고리즘 (즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬 또는 육안 검사를 이용하여, 본 명세서의 핵산 및 단백질에 대한 서열 동일성 (%) 또는 유사성을 결정할 수 있다.
아미노산 서열에 관해서, 당업자는 인코드된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변경, 추가, 결실 또는 치환하는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 부가는 본 명세서에서 집합적으로 "보존적으로 변형된 변이체(conservatively modified variant)"로 지칭된다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 변경으로 인해 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환된다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 이 기술 분야에 잘 알려져 있다.
이들 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, "면역글로블린"은 상이한 클래스(classes)로 할당될 수 있다. 면역글로불린에는 5 가지 주요 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들중 몇 가지는 하위클래스(아이소형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더 세분될 수 있다. 면역글로블린의 상이한 클래스에 대응하는 중쇄-불변 도메인은 차례로 α, ∂, ε, γ, 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 면역 글로불린의 하위단위 구조 및 3-차원 배열은 잘 알려져 있다.
한 구체예에서, 인간화된 항체는 본원에서 제공된 조성물 및 방법에 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 용어 "인간화된 항체" 또는 "항체의 인간화 버전"이라는 용어는 프레임워크 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)이 모체 면역글로불린의 것과 비교하여 상이한 특이성의 면역글로불린의 CDR을 포함하도록 변형된 항체를 지칭한다. 다른 구체예들에서, VH 및 VL의 CDRs을 해당 인간 항체의 프레임워크 영역에 접합시켜, "인간화된 항체"를 준비한다. 가령, Riechmann, L., et al, Nature 332 (1988) 323-327; 그리고 Neuberger, M.S., et al, Nature 314 (1985) 268-270 참고. 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역들은 동일한 또는 상이한 인간 항체 서열로부터 유래될 수 있다. 상기 인간 항체 서열은 자연 발생적 인간 항체들의 서열일 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역들은 가령, Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology (2000) -Appendix IP A.1P.1-A.1P.37에 열거되며, IMGT, the international ImMunoGeneTics information system® (http://imgt.cines.fr) 또는 http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk.를 통해 접근가능하다. 선택적으로, 상기 프레임워크 영역은 추가 돌연변이에 의해 변형될 수 있다. 특히 바람직한 CDRs는 키메라 항체에 대해 상기 언급된 항원을 인식하는 서열을 나타내는 것에 상응한다. 본원에서 사용될 때, 용어 "인간화된 항체"는 불변 영역에서 변형되어, 특히 C1q 결합 및/또는 FcR 결합과 관련하여, 예를 들어, "클래스 전환", 즉, Fc 부분의 변화 또는 돌연변이 (예를 들어, IgG1에서 IgG4로 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이)에 의해 변형된 이러한 항체들이 포괄된다. 본원에서 사용될 때, 용어 "인간 항체"는 인간 생식 계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체가 내포되도록 의도된다. 인간 항체들은 당분야에 잘 공지되어 있다 (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 인간 항체들은 면역화시, 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 선별 또는 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자삽입 동물 (가령, 마우스)을 생산하는 것도 가능하다. 이러한 생식-계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식-계열 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 공격 시 인간 항체의 생산을 초래할 것이다(가령, Jakobovits, A., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al, Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M.D., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40 참고). 인간 항체는 또한 파아지 디스플레이 라이브러리에서 생산될 수 있다 (Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al, J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Cole, A., et al. and Boerner, P., et al. 의 기술이 또한 인간 단일클론성 항체들을 준비하는데 이용될 수 있다(Cole, A., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Liss, A.L., p. 77 (1985); 그리고 Boerner, P., et al, J. Immunol. 147 (1991) 86-95). 본원에서 사용될 때, 용어 "인간 항체"란 명세서에 따라 인간화된 항체에서 이미 언급된 바와 같이, 본 명세서에 따른 속성을 만들기 위해 불변 영역에서 변형된 이러한 항체들이 포괄된다.
한 구체예에서, 용어 "단일클론성 항체"는 상동성 항체 집단을 갖는 항체 조성물을 지칭한다. 상기 항체는 항체의 종 또는 공급원 또는 그것이 만들어지는 방식에 의해 제한되지 않는다. 또다른 구체예에서, 상기 용어에는 온전체 면역글로불린 뿐만 아니라, 단편들 이를 테면, Fab, F(ab')2, Fv, 및 기타 단편들, 뿐만 아니라 부모계 단일클론성 항체 분자의 면역학적 결합 속성을 나타내는 키메라 및 인간화된 균질한 항체 집단이 포괄된다. 또다른 구체예에서, 용어 "단일클론성 항체" 또는 "단일클론성 항체 조성물"이란 본원에서 사용될 때, 단일 아미노산 조성물의 항체 분자들의 조제물을 지칭한다. 또다른 구체예에서, 용어 Fab 또는 ScFv는 특정 언급이 된 항체 단편들로 이용된다.
일부 구체예들에서, 키메라 항체는 본원에서 제공된 조성물 및 방법에 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 용어 "키메라 항체"란 가변 영역, 가령, 결합 영역, 한 가지 종 (가령, 마우스 또는 렛)에서 유래된 결합 영역, 그리고 상이한 공급원 또는 종 (가령, 인간)으로부터 유래된 불변 영역의 적어도 일부분을 포함하는 단일클론성 항체를 지칭하며, 이것은 통상적으로 재조합 DNA 기술에 의해 준비된다. 마우스 가변 영역과 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 특히 바람직하다. 이러한 키메라 항체들은 한 가지 종으로부터 유래된 면역글로불린 가변 영역을 인코드하는 DNA 세그먼트과 상이한 종의 면역글로불린 불변 영역을 인코드하는 DNA 세그먼트를 포함하는 면역글로불린 유전자의 발현 산물이다. 본 명세서에서 포괄되는 다른 형태의 "키메라 항체들"은 원래 항체의 것으로부터 변형 또는 변경된 클래스 또는 하위클래스를 갖는 것들이다. 이러한 "키메라" 항체들은 "클래스-전환된(class-switched)체들"이라고도 한다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당업계에 현재 잘 알려진 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기술이 관련된다. 가령, Morrison, S.L., et al, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 및 US 5,204,244 참고.
한 구체예에서, "항체 디스플레이 라이브러리"란 표적 항원에 대한 스크리닝 방법에 적합한 무-세포 또는 무-세포의 표면에서 항체를 발현하는 플랫폼(들)을 지칭한다. 여기에서, 파아지 디스플레이 라이브러리 및 효모 디스플레이 라이브러리는 달리 명시되지 않는 한, 정확한 상세와 함께 사용된다.
한 구체예에서, 용어 "나이브(
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) 라이브러리"란 비-면역화된 공급원으로부터 자연 발생적 VH 레퍼토리를 인코딩하는 핵산 서열의 집합을 지칭한다.
한 구체예에서, 용어 "VH"는 자연적으로 경쇄 또는 이의 일부가 결여된 포유동물에서 발견될 수 있는 유형의 항체의 단일 중쇄 가변 도메인을 지칭하고; 따라서 나이브 VH는 이에 따라 이해될 수 있을 것이다.
한 구체예에서, 용어 "VL"는 항체의 단일 경쇄 가변 도메인을 지칭하며; 해당 불변 도메인 서열을 기반으로 하여 두 가지 유형에서 발견된다. 따라서, Vk (카파 불변 영역) 및 Vl (람다 불변 영역)로 인지된다.
한 구체예에서, 용어 "CDR"란 항체 구조의 상보성 결정 영역을 지칭한다.
한 구체예에서, 용어 "레퍼토리(repertoire)"는 유전적 다양성을 나타내는 집합을 의미한다.
한 구체예에서, 용어 "프레임워크 영역(framework region)"은 분자의 구조적 요소를 코딩하는 항체 분자의 핵산 서열 영역을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
또다른 구체예에서, 용어 "벡터"는 특정 지정된 제한 부위에 항체 유전자를 수용하기 위한 클로닝 또는 발현 시스템과 관련된 DNA를 지칭한다. 이에 따라, 파아지미드 벡터 (파아지 디스플레이 시스템에 적용가능) 또는 효모 벡터 (효모 디스플레이 시스템에 적용가능), 또는 포유류 발현 벡터 (포유류 발현 시스템에 적용가능)가 이해될 것이다.
본 명세서는 본 명세서의 CLEC2D 항원에 결합하는 항체 및 항체 단편들을 제공한다.
본 명세서는 본 명세서에서 기술된 바와 같이, CLEC2D 항원 또는 CLEC2D의 에피토프에 결합하는 항체 및 항체 단편들의 VH 도메인과 VL 도메인을 제공한다.
본 명세서는 본 명세서에서 기술된 바와 같이, CLEC2D 항원 또는 CLEC2D의 에피토프에 결합하는 항체들의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인 서열, 그리고 VL 도메인의 CDR1, CDR2 및 CD3 서열을 제공한다.
본 명세서의 VH 서열과 VL 서열의 임의의 조합은 본 명세서 범위 내에 있는 것으로 간주된다. VH 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 또는 VL 도메인의 CDR1, CDR2 및 CD3 서열은 본 명세서 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
단일클론 항체가 CLEC2D 결합을 해당 단일클론 항체가 저해하는 지를 확인함으로써, 본 명세서의 단일클론 항체와 동일한 특이성을 갖는 지를 과도한 실험없이 결정하는 것이 가능하다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 만일, 테스트될 인간 단일클론 항체는 본 명세서의 인간 단일클론 항체와 경쟁한다면(본 발명의 인간 단일클론 항체에 의해 결합 감소로 나타날 때), 상기 두 단일클론 항체는 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 매우 관련된 에피토프에 결합할 것 같다.
단일클론 항체가 본 명세서의 단일클론 항체의 특이성을 갖는 지를 결정하는 또다른 방법은 본 명세서의 단일클론 항체를 정상적인 반응성을 갖는 CLEC2D 단백질과 사전-배양하고, 그 다음 시험중인 단일클론 항체를 첨가하여 시험중인 단일클론 항체가 CLEC2D에 결합하는 능력이 저해되는지 확인한다. 시험되는 인간 단일클론 항체가 억제된다면, 십중팔구는 이 항체는 본 발명의 단일클론 항체와 동일하거나, 또는 기능적으로 동등한 에피토프 특이성을 가질 것이다. 본 명세서의 단일클론 항체의 스크리닝은 CLEC2D를 이용하고, 상기 테스트 단일클론 항체가 CLEC2D를 중화시킬 수 있는지를 결정함으로써, 수행될 수 있다.
당 업계에 공지된 다양한 절차를 이용하여 본 명세서의 단백질, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 상동체(analogs homologs) 또는 오르소로그에 대항하여 지향된 폴리클론 또는 단일클론 항체의 제조할 수 있다 (예를 들면, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, 그리고 Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참고, 본 명세서의 참고자료에 편입됨).
항체는 주로 면역 혈청의 IgG 분획(fraction)을 제공하는 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하는 친화력 크로마토그래피와 같은 잘 알려진 기술에 의해 정제될 수 있다. 후속적으로, 또는 대안으로, 찾고 있는 면역글로불린의 표적인 특이적 항원, 또는 이의 에피토프는 면역친화력 크로마토 그래피에 의해 면역 특이적 항체를 정제하기 위하여, 컬럼 상에 고정화될 수 있다. 면역글로블린의 정제는 예를 들면, D. Wilkinson에 의해 논의된다 (The Scientist, The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000)에 의해 공개됨, pp. 25-28).
단일클론성 항체는 이를 테면, Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)에서와 같은 하이브리도마 방법을 이용하여 준비될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물은 전형적으로 면역화제로 면역화되어, 면역원(immunizing agent)에 특이 적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.
면역원은 전형적으로 단백질 항원, 이의 단편 또는 이의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 사람 기원 세포가 바람직하다면, 말초 혈액 림프구가 사용되고, 또는 사람이 아닌 포유류가 바람직한 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 그 다음, 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융합제를 사용하여 불멸화된 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). 불사화된 세포주는 일반적으로 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포로 형질 전환된다. 보통, 렛 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 이러한 하이브리도마 세포들은 융합안된, 부모 골수종 세포들의 성장 또는 생존을 저해시키는 하나 또는 그 이상의 물질이 함유된 적합한 배양 배지에 접종하고, 성장시킨다. 예를 들면, 만일 부모계 세포가 하이포산핀 구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT 또는 HPRT)가 부족한 경우, 하이브리도마의 배양 배지에는 전형적으로 HGPRT가 결핍된 세포의 성장을 막는 하이포산핀, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")이 포함될 것이다.
바람직한 불사화 세포주는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 발현을 뒷받침하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 세포주다. 더욱 바람직한 불사화된 세포주는 쥐의 골수종 세포주로서, 예를 들어, Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California 및 American Type Culture Collection, Manassas, Virginia로부터 수득할 수 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종(heteromyeloma) 세포주는 또한 인간 단일클론 항체의 생산을 위해 기술되어 왔다. (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63) 참고).
하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지는 항원에 대항하여 지향된 단일클론 항체의 존재에 대해 분석될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단일클론 항체의 결합 특이성은 시험관내 결합 분석, 예를 들면, 면역침강 법 또는 방사 면역 측정법 (RIA) 또는 효소-연계된 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 결정된다. 이러한 기술 및 분석은 당 업계에 공지되어 있다. 단일클론성 항체의 결합 친화력은 예를 들면, Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)에 의해 결정될 수 있다. 더욱이, 단일클론 항체의 치료요법적 용도에서, 표적 항원에 대해 고도의 특이성 및 높은 결합 친화력을 갖는 항체를 동정하는 것이 중요하다.
목적하는 하이브리도마 세포가 동정된 후, 클론을 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법으로 성장시킬 수 있다. (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103 참고). 이러한 목적을 위한 적절한 배양 배지는 예를 들어, Dulbecco의 Modified Eagle 's Medium 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안으로, 하이브리도마 세포는 포유 동물에서 복수(ascites)로써 생체 내에서 성장할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 단일클론성 항체는 통상적인 면역 글로불린 정제 절차, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 하이드록실 아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기 영동, 투석 또는 친화력 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리되거나 또는 정제될 수 있다.
단일클론성 항체는 이를 테면, U.S. 특허 번호 4,816,567에서 기술된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 또한 만들어질 수 있다. 본 명세서의 단일클론성 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (가령, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 용이하게 단리되고, 그리고 서열화될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로 작용한다. 일부 구체예들에서, 항체 유전자 서열은 본 명세서의 방법 (가령, 파아지 및 효모 라이브러리 디스플레이)을 이용하여 단리되고, 클론화되어, 그리고 이러한 DNA의 공급원으로 삼는다. 일단 단리된 DNA를 발현 벡터에 넣은 다음, 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예를 들면, 유인원(simian) COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체를 합성할 수 있다. 상기 DNA는 예를 들면, 상동성 뮤린 서열의 위치에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인의 코딩 서열을 대체하거나(U.S. 특허 번호. 4,816,567; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)) 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유적으로 결합시킴으로써 또한 변형될 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 키메라 이가 항체를 생성하기 위해 본 명세서의 항체의 불변 도메인을 대신하여 치환될 수 있거나, 또는 본 명세서의 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인을 대신하여 치환될 수 있다.
항체 또는 항체 단편의 발현 및 정제에 적합한 모든 세포주는 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포주는 포유류 세포주이다. 세포주는 인간, 마우스 및 햄스터를 비롯한 모든 공급원으로부터 분리되거나 또는 유래될 수 있다. 적합한 세포주에는 중국 헴스터 난소 (CHO) 세포들, HEK 293 세포들, HEK293T 세포들, BHK21 세포들, NSO 세포들, PER.C6 세포들, B 세포들, HEK 293-6E 세포들, Sp2/0-Ag14 세포들 및 DG44 세포들이 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 세포주는 하이브리도마 세포주이다.
상기 항체는 본원에서 기술된 단일 쇄 항체를 인코딩하는 DNA 절편을 함유하는 벡터로 발현될 수 있다.
벡터, 리포좀, 네이키드(naked) DNA, 어쥬번트(adjuvant)-연합된 DNA, 유전자 총, 카테테르(catheters) 등을 포함할 수 있다. 백터는 화학 콘쥬게이트(conjugates) 이를 테면, WO 93/64701에 기술된, 표적화 모이어티 (가령, 세포의 표면 수용체에 리간드를), 그리고 핵산 결합 모이어티(moiety) (가령, 폴리리신), 바이러스 벡터 (가령, DNA 또는 RNA 바이러스 벡터), 융합 단백질, 이를 테면, PCT/US 95/02140 (WO 95/22618)에 기술되어 있는 표적 모이어티 (가령, 표적 세포에 특이적인 항체) 및 핵산 결합 모이어티 (가령, 프로타민), 플라스미드, 파아지, 등을 함유하는 융합 단백질을 포함한다. 상기 벡터는 염색체, 비-염색체 또는 합성 벡터일 수 있다.
바람직한 벡터는 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학적 콘쥬게이트를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 몰로니(moloney) 뮤린 백혈병 바이러스를 포함한다. DNA 바이러스 벡터가 선호된다. 이들 벡터는 수두 벡터, 이를 테면, 오르소폭스(orthopox) 또는 아비폭스(avipox) 벡터, 헤르페스바이러스 벡터 이를 테면, 헤르페스 심플렉스(herpes simplex) I 바이러스 (HSV) 벡터 (Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990), 아데노바이러스 벡터(Adenovirus Vectors) (LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993) 참고); Davidson, et al., Nat. Genet 3:219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995) 및 아데노-연합된(Adeno-associated) 바이러스 벡터 (Kaplitt, M. G.. et al., Nat. Genet. 8:148 (1994) 참고)를 포함한다.
수두 바이러스 벡터는 세포질에 유전자를 도입한다. 아비폭스 바이러스 벡터는 핵산의 오직 단기 발현만을 초래한다. 아데노바이러스 벡터, 아데노-연합된 바이러스 벡터 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 벡터는 신경 세포 안으로 핵산을 도입시킬 때 바람직하다. 아데노바이러스 벡터는 아데노-연합된 바이러스 (약 4 개월)보다 짧은 기간 (약 2 개월)을 결과하여, 이는 HSV 벡터보다 더 짧다. 특정 벡터는 표적 세포 및 치료되는 상태에 따라 달라질 것이다. 도입은 표준 기술, 가령, 감염, 형질감염, 형질도입 또는 형질전환에 의해 이루어질 수 있다. 유전자 전달 방식의 예는 예를 들어, 네이키드 DNA, CaPO4 침전, DEAE 덱스트란, 전기천공, 원형질체 융합, 리포 펙션, 세포 미세주입 및 바이러스 벡터를 포함한다.
본 명세서의 CLEC2D 항체들의 예시적인 VH 아미노산 서열은 하기 표 2에 도시된다. 표 2에 열거된 서열에 대해 적어도 50% 동일성, 적어도 55% 동일성, 적어도 60% 동일성, 적어도 65% 동일성, 적어도 70% 동일성, 적어도 75% 동일성, 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성, 적어도 99% 동일성, 적어도 99.5% 동일성, 적어도 99.8% 동일성, 적어도 99.9% 동일성 또는 100 % 동일성을 갖는 VH 아미노산 서열은 본 명세서 범위 안에 있는 것으로 간주된다.
표 2. VH 아미노산 서열
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본 명세서의 VH 아미노산 서열은 하기 표 3에 도시된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드될 수 있다.
표 3. VH DNA 서열
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본 명세서의 CLEC2D 항체들의 예시적인 VL 아미노산 서열은 하기 표 4에 도시된다. 표 4에 열거된 서열에 대해 적어도 50% 동일성, 적어도 55% 동일성, 적어도 60% 동일성, 적어도 65% 동일성, 적어도 70% 동일성, 적어도 75% 동일성, 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성, 적어도 99% 동일성, 적어도 99.5% 동일성, 적어도 99.8% 동일성, 적어도 99.9% 동일성 또는 100 % 동일성을 갖는 VL 아미노산 서열은 본 명세서 범위 안에 있는 것으로 간주된다.
표 4. VL 아미노산 서열
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본 명세서의 VL 아미노산 서열은 하기 표 5에 도시된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드될 수 있다.
표 5. VL DNA 서열
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본 명세서의 CLEC2D 항체들의 예시적인 CDR 아미노산 서열은 하기 표 6에 도시된다.
표 6. CDR 아미노산 서열
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일부 구체예들에서, 본 명세서의 항체, 항체 단편, VH 도메인, VL 도메인 또는 CDR을 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 야생형 서열이다. 일부 구체예들에서, 포유류 세포들에서 발현을 위해 상기 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다. 일부 구체예들에서, 인간 세포들에서 발현을 위해 상기 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 CLEC2D에 결합할 수 있고, CLEC2D와 CD161 사이의 상호작용을 차단하는 항체에 관한 것이다 (도 1). 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-CLEC2D 항체는 단일클론성 항체다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-CLEC2D 항체는 다중클론성 항체다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 CLEC2D에 결합할 수 있고, CLEC2D와 CD161 간의 상호작용을 차단시켜, 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및/또는 by 보체-의존적 세포독성 (CDC)의 수단에 의해 CLEC2D-발현시키는 세포들을 제거할 수 있는 항체에 관련된다. 일부 구체예들에서, 본 발명은 CLEC2D에 결합할 수 있고, CLEC2D와 CD161 간의 상호작용을 차단시켜, 사이토킨 생산을 자극하고, NK 세포들에 의해 매개된 세포독성을 촉진시킬 수 있는 항체에 관련된다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-CLEC2D 항체는 인간화된 항체다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-CLEC2D 항체는 인간 IgG1, IgG1 N296A, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아이소형 항체다. 일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체는 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b 또는 IgG3 아이소형이다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 1-108로 구성된 군에서 선별된 아미노산 서열에 대해 적어도 50% 동일성, 적어도 55% 동일성, 적어도 60% 동일성, 적어도 65% 동일성, 적어도 70% 동일성, 적어도 75% 동일성, 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성, 적어도 99% 동일성, 적어도 99.5% 동일성, 적어도 99.8% 동일성, 적어도 99.9% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 217-324로 구성된 군에서 선별된 아미노산 서열에 대해 적어도 50% 동일성, 적어도 55% 동일성, 적어도 60% 동일성, 적어도 65% 동일성, 적어도 70% 동일성, 적어도 75% 동일성, 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성, 적어도 99% 동일성, 적어도 99.5% 동일성, 적어도 99.8% 동일성, 적어도 99.9% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 1-108로 구성된 군에서 선별된 아미노산 서열에 대해 적어도 50% 동일성, 적어도 55% 동일성, 적어도 60% 동일성, 적어도 65% 동일성, 적어도 70% 동일성, 적어도 75% 동일성, 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성, 적어도 99% 동일성, 적어도 99.5% 동일성, 적어도 99.8% 동일성, 적어도 99.9% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH); 그리고 서열 식별 번호: 217-324로 구성된 군에서 선별된 아미노산 서열에 대해 적어도 50% 동일성, 적어도 55% 동일성, 적어도 60% 동일성, 적어도 65% 동일성, 적어도 70% 동일성, 적어도 75% 동일성, 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 91% 동일성, 적어도 92% 동일성, 적어도 93% 동일성, 적어도 94% 동일성, 적어도 95% 동일성, 적어도 96% 동일성, 적어도 97% 동일성, 적어도 98% 동일성, 적어도 99% 동일성, 적어도 99.5% 동일성, 적어도 99.8% 동일성, 적어도 99.9% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 109-216으로 구성된 군에서 선택된 핵산에 의해 인코드된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 325-432로 구성된 군에서 선택된 핵산에 의해 인코드된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 109-216으로 구성된 군에서 선택된 핵산에 의해 인코드된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH); 그리고 서열 식별 번호: 325-432로 구성된 군에서 선택된 핵산에 의해 인코드된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 1-108로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 217-324로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 1-108로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH), 그리고 서열 식별 번호: 217-324로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄(VL)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 44에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH와 서열 식별 번호: 260에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 45에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH와 서열 식별 번호: 261에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 42에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH와 서열 식별 번호: 258에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH와 서열 식별 번호: 217에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 73에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH와 서열 식별 번호: 289에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 21에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH와 서열 식별 번호: 237에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 35에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH와 서열 식별 번호: 251에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 58에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH와 서열 식별 번호: 274에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 7에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH와 서열 식별 번호: 223에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 433-485로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 1 (CDR1)을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 486-546으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 2 (CDR2)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 547-653으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 654-726으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 1 (CDR1)을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 727-783으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 2 (CDR2)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 784-885로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 433-485로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 서열 식별 번호: 486-546으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 그리고 서열 식별 번호: 547-653으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 654-726으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 서열 식별 번호: 727-783으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 그리고 서열 식별 번호: 784-885로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 433-485로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 서열 식별 번호: 486-546으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 그리고 서열 식별 번호: 547-653으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 상보성 결정 영역 3 (CDR3); 그리고 서열 식별 번호: 654-726으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 서열 식별 번호: 727-783으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 상보성 결정 영역 2 (CDR2), 그리고 서열 식별 번호: 784-885로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 439에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 식별 번호:492에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 식별 번호: 589에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 그리고 서열 식별 번호: 687에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 식별 번호: 729에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 식별 번호: 827에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 439에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 식별 번호:492에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 식별 번호: 590에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 그리고 서열 식별 번호: 688에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 식별 번호: 755에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 식별 번호: 828에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 473에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 식별 번호:495에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 식별 번호: 587에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 그리고 서열 식별 번호: 655에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 식별 번호: 732에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 식별 번호: 825에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 433에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 식별 번호:486에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 식별 번호: 547에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 그리고 서열 식별 번호: 654에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 식별 번호: 727에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 식별 번호: 784에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 439에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 식별 번호:492에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 식별 번호: 618에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 그리고 서열 식별 번호: 678에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 식별 번호: 730에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 식별 번호: 852에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 446에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 식별 번호:501에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 식별 번호: 567에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 그리고 서열 식별 번호: 655에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 식별 번호: 735에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 식별 번호: 804에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 435에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 식별 번호:488에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 식별 번호: 581에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 그리고 서열 식별 번호: 680에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 식별 번호: 782에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 식별 번호: 818에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 466에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 식별 번호:521에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 식별 번호: 603에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 그리고 서열 식별 번호: 662에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 식별 번호: 732에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 식별 번호: 814에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 439에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 식별 번호:492에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 식별 번호: 553에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3; 그리고 서열 식별 번호: 660에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 식별 번호: 733에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 식별 번호: 790에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
본 명세서는 적어도 약 108개의 독특한 단일클론성 항체 클론을 포함하는 항체 라이브러리를 제공하며, 이때 상기 항체 클론의 적어도 약 80%는 CLEC2D 항원에 탐지가능하게 그리고 특이적으로 결합한다. 중쇄, 경쇄, 중쇄 CDRs1-3 (가령, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3) 그리고 경쇄 CDRs 1-3 (가령, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3)의 특이한 조합을 갖는 다양한 항-CLEC2D 항체들이 표 9A에 기술된다.
표 9A
Figure pct00079
Figure pct00080
표 9B. 표 9A의 선별된 항-CLEC2D 항체의 생식계열 정보
Figure pct00081
표 9C. IgG1, IgG4, IgG N2A 및 IgG2로 포멧된 항-CLEC2D 항체의 아미노산 서열 및 DNA 서열 정보.
Figure pct00082
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 A1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 A1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 A1은 생식계열 유전자 패밀리: IGHV4, IGHD3 및 IGHJ2의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 A1은 생식계열 유전자 패밀리: IGKV3 및 IGKJ4의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 B1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 B1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 B1은 생식계열 유전자 패밀리: IGHV4, IGHD3 및 IGHJ5의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 B1은 생식계열 유전자 패밀리: IGKV1 및 IGKJ1의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 C1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 C1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 D1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 D1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 E1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 E1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 E1은 생식계열 유전자 패밀리: IGHV3, IGHD5 및 IGHJ4의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 E1은 생식계열 유전자 패밀리: IGKV3 및 IGKJ5의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 F1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 F1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 G1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 G1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 H1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 H1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 I1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 I1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 J1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 J1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 K1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 K1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 L1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 L1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 M1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 M1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 N1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 N1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 O1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 O1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 P1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 P1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 P1은 생식계열 유전자 패밀리: IGHV1, IGHD6 및 IGHJ4의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 P1은 생식계열 유전자 패밀리: IGKV3 및 IGKJ5의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 Q1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 Q1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 R1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 R1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 S1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 S1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 T1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 T1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 U1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 U1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 U1은 생식계열 유전자 패밀리: IGHV4, IGHD1 및 IGHJ4의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 U1은 생식계열 유전자 패밀리: IGKV4 및 IGKJ4의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 V1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 V1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 W1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 W1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 X1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 X1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 Y1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 Y1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 Y1은 생식계열 유전자 패밀리: IGHV5, IGHD5 및 IGHJ4의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 Y1은 생식계열 유전자 패밀리: IGKV3 및 IGKJ4의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 Z1 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 Z1 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 A2 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 A2 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 B2 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 B2 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 C2 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 C2 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 D2 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 D2 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 E2 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 E2 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 E2는 생식계열 유전자 패밀리: IGHV1, IGHD5 및 IGHJ4의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 E2는 생식계열 유전자 패밀리: IGKV1 및 IGKJ1의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 F2 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 F2 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 G2 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 G2 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 H2 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 H2 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 I2 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 I2 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 I2는 생식계열 유전자 패밀리: IGHV6, IGHD1 및 IGHJ4의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 I2는 생식계열 유전자 패밀리: IGKV3 및 IGKJ1의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 J2 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 J2 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 K2 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 K2 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 L2 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 L2 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 L2는 생식계열 유전자 패밀리: IGHV4, IGHD3 및 IGHJ4의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9B에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체 번호 L2는 생식계열 유전자 패밀리: IGKV1 및 IGKJ3의 프레임워크 영역 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 M2 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 M2 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 N2 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열에 따라 중쇄 CDRs 1, 2 및 3, 그리고 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 (표 9A에 기술된 바와 같이) 항-CLEC2D 항체 번호 N2 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 하나 또는 전부 (가령, 표 9A 및 9B에 기술된 바와 같은 항체 번호 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2중 임의의 하나 또는 이들 전부)는 인간 IgG1 Fc 영역 또는 백본을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 하나 또는 전부 (가령, 표 9A 및 9B에 기술된 바와 같은 항체 번호 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2중 임의의 하나 또는 이들 전부)는 인간 IgG4 Fc 영역 또는 백본을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 하나 또는 전부 (가령, 표 9A 및 9B에 기술된 바와 같은 항체 번호 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2중 임의의 하나 또는 이들 전부)는 인간 IgG1 N ~ A Fc 영역 또는 백본을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 하나 또는 전부 (가령, 표 9A 및 9B에 기술된 바와 같은 항체 번호 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2중 임의의 하나 또는 이들 전부)는 인간 IgG2 Fc 영역 또는 백본을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 하나 또는 전부 (가령, 표 9A 및 9B에 기술된 바와 같은 항체 번호 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2중 임의의 하나 또는 이들 전부)는 아푸코실화된다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 하나 또는 전부 (가령, 표 9A 및 9B에 기술된 바와 같은 항체 번호 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2중 임의의 하나 또는 이들 전부)는 아푸코실화 항체 영역을 포함한다.
일부 구체예들에서, 표 9A 및 9B에 기술된 바와 같은 항체 번호 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 하나 또는 이들 전부는 인간 IgG1 Fc 영역 또는 백본을 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 하나 또는 이들 전부는 인간 IgG4 Fc 영역 또는 백본을 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9A 및 9B에 기술된 바와 같은 항체 번호 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 하나 또는 이들 전부는 인간 IgG1 N ~ A Fc 영역 또는 백본을 포함한다. 일부 구체예들에서, 표 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 하나 또는 이들 전부는 인간 IgG2 Fc 영역 또는 백본을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 A1로 포멧된 IgG1의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 B1로 포멧된 IgG1의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 E1로 포멧된 IgG1의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 P1로 포멧된 IgG1의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 U1로 포멧된 IgG1의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 Y1로 포멧된 IgG1의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 E2로 포멧된 IgG1의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 I2로 포멧된 IgG1의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 L2로 포멧된 IgG1의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄와 경쇄의 조합을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 A1로 포멧된 IgG4의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 B1로 포멧된 IgG4의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 E1로 포멧된 IgG4의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 P1로 포멧된 IgG4의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 U1로 포멧된 IgG4의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 Y1로 포멧된 IgG4의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 E2로 포멧된 IgG4의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 I2로 포멧된 IgG4의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 L2로 포멧된 IgG4의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 L2로 포멧된 IgG4의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 IgG N2A 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 A1로 포멧된 IgG2의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 B1로 포멧된 IgG2의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 E1로 포멧된 IgG2의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 P1로 포멧된 IgG2의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 U1로 포멧된 IgG2의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 Y1로 포멧된 IgG2의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 E2로 포멧된 IgG2의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 I2로 포멧된 IgG2의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 L2로 포멧된 IgG2의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 L2로 포멧된 IgG2의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 IgG N2A 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 A1로 포멧된 IgG N2A의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 B1로 포멧된 IgG N2A의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 E1로 포멧된 IgG N2A의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 P1로 포멧된 IgG N2A의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 U1로 포멧된 IgG N2A의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 Y1로 포멧된 IgG N2A의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 E2로 포멧된 IgG N2A의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 I2로 포멧된 IgG N2A의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 L2로 포멧된 IgG N2A의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 중쇄를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 표 9C에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 번호 L2로 포멧된 IgG N2A의 중쇄의 아미노산 서열에 따라 IgG N2A 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 하나 또는 이들 전부는 푸코실화된다. 일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 하나 또는 이들 전부는 아푸코실화된 항체 영역을 포함한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호: A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 886-920 및 서열 식별 번호: 930-1003중 적어도 하나에 따른 아미노산 서열의 인간 CLEC2D 단백질을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호: A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체는 서열 식별 번호: 886-909중 적어도 하나에 따른 아미노산 서열의 인간 CLEC2D 단백질을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항체 단편은 서열 식별 번호: 930-1003중 적어도 하나에 따른 아미노산 서열의 인간 CLEC2D 단백질을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호: A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함하고, CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기과 중첩되거나 및/또는 비-중첩되는 아미노산 위치를 포함한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호: A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원을 인지하는 또다른 항체를 억제하거나, 폐기시키거나 또는 이들과 경쟁하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함하고, CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기과 중첩되거나 및/또는 비-중첩되는 아미노산 위치를 포함한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호: A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체는 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95 또는 이의 조합의 임의의 아미노산 위치를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호: A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체는 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95 또는 이의 조합의 임의의 아미노산 위치를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합에 대해 억제하거나, 폐기시키거나 또는 이들과 경쟁하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함하고가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호: A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체는 CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기에 대한 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-920 및 930-1003의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호: A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체는 CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기에 대한 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-909 및 930-1003의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호: A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체는 CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기에 대한 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-890의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호: A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체는 CD161 수용체 비-상호작용 아미노산 잔기에 대한 알로스테릭(allosteric), 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-920 및 930-1003의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호: A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체는 CD161 수용체 비-상호작용 아미노산 잔기에 대한 알로스테릭, 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-909 및 930-1003의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호: A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체는 CD161 수용체 비-상호작용 아미노산 잔기에 대한 알로스테릭, 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-890의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호: A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체는 독립적으로 또는 조합에 의해 종양 사멸 또는 세포독성을 유도하기 위해, 서열 식별 번호: 886-920 및 930-1003으로부터 선별된 CLEC2D에 결합될 때, 다음 아미노산 위치중 적어도 하나의 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해당 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 처리된 세포 총 수의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%에서 세포독성을 유도한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호: A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체는 독립적으로 또는 조합에 의해 종양 사멸 또는 세포독성을 유도하기 위해, 서열 식별 번호: 886-909 및 930-1003으로부터 선별된 CLEC2D에 결합될 때, 다음 아미노산 위치중 적어도 하나의 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해당 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 처리된 세포 총 수의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%에서 세포독성을 유도한다.
일부 구체예들에서, 표 9A, 9B 및 9C에 기술된 바와 같은 항체 번호: A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체는 독립적으로 또는 조합에 의해 종양 사멸 또는 세포독성을 유도하기 위해, 서열 식별 번호: 886-890으로부터 선별된 CLEC2D에 결합될 때, 다음 아미노산 위치중 적어도 하나의 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해당 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 처리된 세포 총 수의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%에서 세포독성을 유도한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 탈글리코실화된다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 탈글리코실화된 항-CLEC2D 항체는 글리코실화된 형태의 동일한 항-CLEC2D 항체와 비교하였을 때, 숙주 세포를 지향하는 세포독성이 증가된다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 N-연계된 글리코실화를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 아푸코실화된다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 아푸코실화된 항-CLEC2D 항체는 푸코실화된 형태의 동일한 항-CLEC2D 항체와 비교하였을 때, 숙주 세포를 지향하는 세포독성이 증가된다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 시알화(sialylated)된다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 시알화된 항-CLEC2D 항체는 시알화안된 형태의 동일한 항-CLEC2D 항체와 비교하였을 때, 숙주 세포를 지향하는 세포독성이 증가된다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 과다-갈락토실화된다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 과다-갈락토실화된 항-CLEC2D 항체는 갈락토실화안된 또는 낮은 수준으로 갈락토실화된 형태의 동일한 항-CLEC2D 항체와 비교하였을 때, 숙주 세포를 지향하는 세포독성이 증가된다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 과다-만노실화된다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 과다-만노실화된 항-CLEC2D 항체는 만노실화안된 또는 낮은 수준으로 만노실화된 형태의 동일한 항-CLEC2D 항체와 비교하였을 때, 숙주 세포를 지향하는 세포독성이 증가된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 항체의 중쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 관계한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 항체의 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 관계한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 항체의 가변 중쇄의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 관계한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 항체의 경쇄의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 관계한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 표 9A에 기술된 바와 같은 항-CLEC2D 항체들중 임의의 항체의 가변 중쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 관계한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 표 9A에 기술된 바와 같은 항-CLEC2D 항체들중 임의의 항체의 가변 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 관계한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 표 9A에 기술된 바와 같은 항-CLEC2D 항체들중 임의의 항체의 가변 중쇄의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 관계한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 표 9A에 기술된 바와 같은 항-CLEC2D 항체들중 임의의 항체의 가변 경쇄의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 관계한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 표 9A에 기술된 바와 같은 항-CLEC2D 항체들중 임의의 항체의 가변 중쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 관계한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 표 9A에 기술된 바와 같은 항-CLEC2D 항체들중 임의의 항체의 가변 중쇄의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 관계한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 표 9A에 기술된 바와 같은 항-CLEC2D 항체들중 임의의 항체의 가변 경쇄 CDRs 1, 2 및 3의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 관계한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 표 9A에 기술된 바와 같은 항-CLEC2D 항체들중 임의의 항체의 가변 경쇄의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 관계한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 본원에 기술된 바와 같이 생식계열 패밀리의 프레임워크 영역 서열을 갖는, 표 9A에 기술된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 항체의 중쇄 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 관계한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 본원에 기술된 바와 같이 생식계열 패밀리의 프레임워크 영역 서열을 갖는, 표 9A에 기술된 항-CLEC2D 항체들중 임의의 항체의 경쇄 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 관계한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항체 단편은 인간, 뮤린, 설치류, 토끼목 포유동물, 말, 소, 조류, 염소, 돼지, 물고기자리(piscean), 갯과(canine) 또는 고양이 프레임워크 생식계열 패밀리로부터 유래된 프레임워크 영역 서열을 포함하거나, 또는 이들이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항체 단편은 인간 프레임워크 생식계열 패밀리로부터 유래된 또는 이들인 프레임워크 영역 서열을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 휴대하는 벡터에 관계한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 표 9A에 기술된 바와 같은 항-CLEC2D 항체의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열중 임의의 하나 또는 모두를 휴대하는 벡터에 관계한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 본원에서 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 휴대하는 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 관계한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 발명은 표 9A에 기술된 바와 같이 항-CLEC2D 항체의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 휴대하는 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 관계한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항체 단편은 작용제, 화학물 또는 소 분자에 콘쥬게이트될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 작용제는 치료요법적 작용제다. 일부 구체예들에서, 상기 치료요법적 작용제는 화학요법 약물이다. 일부 구체예들에서, 상기 치료요법적 작용제는 세포독성 작용제 또는 약물이다. 일부 구체예들에서, 상기 치료요법적 작용제는 방사성동위원소다. 일부 구체예들에서, 상기 작용제는 진단 작용제다. 일부 구체예들에서, 상기 진단 작용제에는 형광성, 화학발광성 또는 방사성 동위원소 염료 또는 제제를 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.
에피토프 인지
일반적으로, 용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 구역 또는 영역, 즉, 항체와 물리적으로 접촉하는 구역 또는 영역을 지칭한다. 단백질 에피토프는 항체에 대한 결합에 직접적으로 관여하는 항원 내의 아미노산 잔기(에피토프의 면역우성 성분이라고도 함) 및 결합에 직접적으로 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에서 용어 에피토프는 달리 언급되지 않는 한, 항-CLEC2D 항체, 또는 본 개시내용에 따른 또다른 CLEC2D-특이적 작용제에 특이적으로 결합하는 CLEC2D의 임의의 특정 영역의 결합 부위의 두 가지 유형이 모두 내포된다 (가령, 일부 문맥에서 본 명세서는 특정 아미노산 잔기에 직접적으로 결합하는 항체에 관계한다). 특이적 항-CLEC2D 항체의 보다 상세한 에피토프 맵핑은 알라닌 스캔 접근법을 통해 결정될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항체 단편은 서열 식별 번호: 886-920 및 930-1003중 적어도 하나에 따른 아미노산 서열의 인간 CLEC2D 단백질을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항체 단편은 서열 식별 번호: 886-909중 적어도 하나에 따른 아미노산 서열의 인간 CLEC2D 단백질을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항체 단편은 서열 식별 번호: 930 -1003중 적어도 하나에 따른 아미노산 서열의 인간 CLEC2D 단백질을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항체 단편은 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함하고, CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기과 중첩되거나 및/또는 비-중첩되는 아미노산 위치를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항체 단편은 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원을 인지하고, 이에 결합하는 또다른 항체를 억제, 폐기 또는 이와 경쟁하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함하고, CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기과 중첩되거나 및/또는 비-중첩되는 아미노산 위치를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95 또는 이의 조합의 임의의 아미노산 위치를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95 또는 이의 조합의 임의의 아미노산 위치를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 또다른 항체의 결합을 억제, 폐기 또는 이와 경쟁하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기에 대한 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-920 및 930-1003의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기에 대한 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-909 및 930-1003의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기에 대한 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-890의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD161 수용체 비-상호작용 아미노산 잔기에 대한 알로스테릭, 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-920 및 930-1003의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD161 수용체 비-상호작용 아미노산 잔기에 대한 알로스테릭, 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-909 및 930-1003의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD161 수용체 비-상호작용 아미노산 잔기에 대한 알로스테릭, 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-890의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 독립적으로 또는 조합에 의해 종양 사멸 또는 세포독성을 유도하기 위해, 서열 식별 번호: 886-920 및 930-1003으로부터 선별된 CLEC2D에 결합될 때, 다음 아미노산 위치중 적어도 하나의 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해당 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 처리된 세포 총 수의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%에서 세포독성을 유도한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 독립적으로 또는 조합에 의해 종양 사멸 또는 세포독성을 유도하기 위해, 서열 식별 번호: 886-909 및 930-1003으로부터 선별된 CLEC2D에 결합될 때, 다음 아미노산 위치중 적어도 하나의 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해당 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 처리된 세포 총 수의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%에서 세포독성을 유도한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 독립적으로 또는 조합에 의해 종양 사멸 또는 세포독성을 유도하기 위해, 서열 식별 번호: 886-890으로부터 선별된 CLEC2D에 결합될 때, 다음 아미노산 위치중 적어도 하나의 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해당 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 처리된 세포 총 수의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%에서 세포독성을 유도한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 인간 CLEC2D의 서열 식별 번호: 886, 889, 894, 899, 903, 905, 906 또는 907에 따른 아미노산 서열 내 아미노산 잔기: THR178; ASN95; ARG137; GLU179; TYR177; SER98; GLU162; GLN139; ARG101; ALA160; TRP96; CYS176; GLU138; ARG175; GLY140; SER136; ASP104; ASP92; THR97; LYS94; GLU150; THR149; GLY148; GLN141; PRO142; LYS144; THR152; TRP151; ASN147; ARG153; TRP143; ILE157; CYS163; SER129; THR93; LYS181; ASP91; ARG180; SER187; LYS194; TYR165; ALA174; LEU110; ASN167; ASP168; ILE146; SER172; GLY161; SER173; LEU135; ASP130; GLN100; PHE155; GLY159; PRO156; LEU158; GLN117; SER115; GLU114; GLN154; ASN120; PHE116; PHE102; GLN106; SER105; ASP107; LYS186; ASP109; GLN112; VAL191; TRP145; LYS169; GLY127; PRO128; GLN83; LYS85; GLU77; GLY170; LEU119; LEU123; TRP182; SER90; ALA108; TYR88; HIS190; ILE189; ALA73; ARG84; SER78; TRP79; PRO76; PHE82; ALA171; ASP188; CYS75를 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체는 인간 CLEC2D의 서열 식별 번호: 886, 889, 894, 899, 903, 905, 906 또는 907에 따른 아미노산 서열 내 아미노산 잔기: ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항체 단편은 서열 식별 번호: 886-909중 적어도 하나에 따른 아미노산 서열의 인간 CLEC2D 단백질을 인지하고, 이에 결합하는 서열 식별 번호: 42 & 서열 식별 번호: 258의 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항체 단편은 서열 식별 번호: 921-909중 적어도 하나에 따른 아미노산 서열의 인간 CLEC2D 단백질을 인지하고, 이에 결합하는 서열 식별 번호: 42 & 서열 식별 번호: 258의 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항체 단편은 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함하고, CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기과 중첩되거나 및/또는 비-중첩되는 아미노산 위치를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항체 단편은 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원을 인지하고, 이에 결합하는 또다른 항체를 억제, 폐기 또는 이와 경쟁하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함하고, CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기과 중첩되거나 및/또는 비-중첩되는 아미노산 위치를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95 또는 이의 조합의 임의의 아미노산 위치를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95 또는 이의 조합의 임의의 아미노산 위치를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 또다른 항체의 결합을 억제, 폐기 또는 이와 경쟁하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기에 대한 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-920 및 930-1003의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기에 대한 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-909 및 930-1003의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기에 대한 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-890의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD161 수용체 비-상호작용 아미노산 잔기에 대한 알로스테릭, 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-920 및 930-1003의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD161 수용체 비-상호작용 아미노산 잔기에 대한 알로스테릭, 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-909 및 930-1003의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD161 수용체 비-상호작용 아미노산 잔기에 대한 알로스테릭, 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-890의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 독립적으로 또는 조합에 의해 종양 사멸 또는 세포독성을 유도하기 위해, 서열 식별 번호: 886-920 및 930-1003으로부터 선별된 CLEC2D에 결합될 때, 다음 아미노산 위치중 적어도 하나의 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해당 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 처리된 세포 총 수의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%에서 세포독성을 유도한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 독립적으로 또는 조합에 의해 종양 사멸 또는 세포독성을 유도하기 위해, 서열 식별 번호: 886-909 및 930-1003으로부터 선별된 CLEC2D에 결합될 때, 다음 아미노산 위치중 적어도 하나의 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해당 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 처리된 세포 총 수의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%에서 세포독성을 유도한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 독립적으로 또는 조합에 의해 종양 사멸 또는 세포독성을 유도하기 위해, 서열 식별 번호: 886-890으로부터 선별된 CLEC2D에 결합될 때, 다음 아미노산 위치중 적어도 하나의 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 해당 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 처리된 세포 총 수의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%에서 세포독성을 유도한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체, 서열 식별 번호: 42 & 서열 식별 번호: 258은 아미노산 ARG175-XAA176-TYR177-XAA178-GLU179; ARG153; ARG84; HIS190을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체, 서열 식별 번호: 44 & 서열 식별 번호: 260은 아미노산 ARG101; GLU150-XAA151-THR152-ARG153-GLN154; ARG175-XAA176-TYR177-XAA178-GLU179를 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체, 서열 식별 번호: 45 & 서열 식별 번호: 261은 아미노산 GLN141; ARG101-XAA102-XAA-103-XAA104-SER105-XAA106-ASP107; HIS190을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체, 서열 식별 번호: 1 & 서열 식별 번호: 217은 아미노산 GLN141; ARG153; ASP92-THR93-LYS94; HIS190을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 서열 식별 번호: 58 & 서열 식별 번호: 274은 아미노산 GLU138-XAA139-XAA140-GLN141-XAA142-XAA143-LYS144; CYS176을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체, 서열 식별 번호: 35 & 서열 식별 번호: 251은 아미노산 GLU138-GLN139-XAA140-GLN141; ARG175-XAA176-TYR177-XAA178-XAA179-ARG180; SER187을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 서열 식별 번호: 21 & 서열 식별 번호: 237은 아미노산 ASP92; TYR177-XAA179-XAA180-LYS181; THR152-ARG153-GLN154을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체, 서열 식별 번호: 7 & 서열 식별 번호: 223은 아미노산 THR93-XAA94-ASN95; ARG101; GLN139; PHE116; ARG153을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체, 서열 식별 번호: 73 & 서열 식별 번호: 289는 아미노산 THR93-LYS94; ARG101; GLN141; TYR177-XAA178-GLU179를 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체, 서열 식별 번호: 73 & 서열 식별 번호: 289는 서열 식별 번호: 2560에 따른 아미노산을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체, 서열 식별 번호: 73 & 서열 식별 번호: 289는 서열 식별 번호: 2561에 따른 아미노산을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체, 서열 식별 번호: 73 & 서열 식별 번호: 289는 서열 식별 번호: 2562에 따른 아미노산을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체, 서열 식별 번호: 73 & 서열 식별 번호: 289는 서열 식별 번호: 2563에 따른 아미노산을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체, 서열 식별 번호: 73 & 서열 식별 번호: 289는 서열 식별 번호: 2564에 따른 아미노산을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체, 서열 식별 번호: 73 & 서열 식별 번호: 289는 서열 식별 번호: 2565에 따른 아미노산을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체, 서열 식별 번호: 73 & 서열 식별 번호: 289는 서열 식별 번호: 2566에 따른 아미노산을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체, 서열 식별 번호: 73 & 서열 식별 번호: 289는 서열 식별 번호: 2567에 따른 아미노산을 인지하고, 이에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함한다.
라이브러리 스크리닝
임의의 특정 기술에 의해 결합되기를 바라지 않고, 본 개시내용의 항원에 결합하는 항체는 하기 기재된 방법을 사용하여 확인 및 특성화될 수 있다.
암, 류마티스 관절염, 신경계 장애, 감염성 질환 및 대사 장애 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 질환의 치료를 위한 치료제의 공급원으로서 나이브 항체 라이브러리가 본원에 제공된다. 본 명세서의 방법들을 사용하여 식별된 항체들은 진단 도구, 예후 도구; 연구 목적용, 표적 발견용, 기능적 유전체학의 검증용 또는 항체 또는 항체 유도체들이 사용되는 모든 응용 분야에 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 용어 "패닝(panning)"이란 특이적 표적/항원에 대한 결합자(binders)를 선택하는 친화력 선별 기술을 지칭한다.
일부 구체예들에서, 상기 나이브 항체 유전자 발현 라이브러리를 스크리닝하는 방법에는 두 개의 개별 스캔 도구를 사용하여 유전자 클론 풀(pool)의 발현 프로필을 순차적으로 탐색하는 것이 내포된다: 1) 파아지 디스플레이 기술, 그리고 2) 효모 디스플레이 기술 (도 3). 항체 유전자 발현을 위한 효모 시스템의 사용은 진핵생물 단백질 해독, 처리 및 세포 표면 상의 항체 생성물의 적절한 폴딩 때문에 유리하다. 더욱이, 효모 발현은 높은 특이성을 가진 항원 표적과의 적절한 상호작용을 허용한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 방법은 다양한 항원 표적에 대항하는 독특한 분자를 식별할 수 있는 라이브러리의 다양성을 보존한다.
본 명세서의 방법의 일부 구체예들에서, 상기 방법에는 다음의 전략이 연루되는데, 이때 상기 다양성은 키메라 항체 분자들, Fv, Fav, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, scFv-CH3, scFv-Fc, ScFab, 이량체 및 삼량체 항체 단편들, 미니바디, 인간화된 단일클론성 항체 분자들, 인간 항체들, 이중특이적 항체들, 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 그리고 이들 분자들로부터 생성되는 임의의 기능적 단편 (이때 유도된 분자들은 부모계 항체 분자의 면역학적 기능성을 유지하며), 그리고 다른 모든 항체 포멧이 내포되나, 이에 국한되지 않은 다양하게 공작된 항체 포멧으로 두 플랫폼 간에 해독되고, 탐색된다.
일부 구체예들에서, 본 방법에 의해 얻어진 후보 항체 분자들은 항체-항원 상호작용의 구조-기능 연구에 의해 안내되는 합리적인 설계를 통해 더욱 최적화된다. 단일클론성 항체 약물의 성공적인 제조를 위한 전제 조건은 다양한 생물학적 및/또는 상관 관계에 따른 속성, 이를 테면, 용해도, 응집, 항원성, 안정성 및 기타 등등과 같은 것들에 따라 달라진다. 구체화된 바와 같이, 합리적이고, 증거-기반의, 더 신속한, 구조-기반 약물 설계는 그 중에서도 암 화학요법, 약물 내성 감염, 신경계 질환 분야에 상당한 기여를 했다. 이들 방법의 결과적인 결과는 본 명세서에서 항체 라이브러리 구축 및 선별된 분자의 제작가능성을 개선하는데 사용된다.
일부 구체예들에서, 용어 "단리된"이란 생물학적 막의 일부가 아닌, 2개의 단백질 쇄 또는 이의 단편들로 구성된 신규하고, 독특한 분자에 관한 것이다. 특히, 본 명세서에 따른 단리된 분자는 가용성이고, 공유 결합 또는 비공유 결합을 통한 링커 분자에 의해 직접 또는 간접적으로 연계된다. 이들 분자는 단일클론성 또는 다중클론성 항체들을 포함할 수 있으며, 이는 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 쉽게 얻을 수 있다.
일부 구체예들에서, 단리 또는 탐지 목적으로 본원에 기술된 항원 또는 항체에는 친화력 테그가 내포될 수 있다. 친화력 테그는 당업계에 잘 알려져 있고, 표적에 부착되고 친화력 테그에 결합하는 분자를 사용하여 표적의 검출 또는 분리에 사용된다. 원칙적으로, 항체 또는 기타 특이적 결합 작용제로 이용가능한 임의의 펩티드 또는 단백질은 친화력 테그로서 사용될 수 있다. 사용에 적합한 예시적인 친화력 테그에는 단핵구 어뎁터 단백질 (MONA) 결합 펩티드, T7 결합 펩티드, v5 테그, 스트렙트아비딘 결합 펩티드, 폴리히스티딘 트랙, 단백질 A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991)), 글루타티온 S 전이효소 (Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988)), Glu-Glu 친화력 테그 (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985)), 물질(substance) P, FLAG 펩티드 (Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988)), 또는 다른 항원성 에피토프 또는 결합 도메인이 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 전반적으로, Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991) 참고. 한 구체예에서, His6 테그가 본원에 기술된 방법에서 이용된다. 또다른 구체예에서, FLAG 테그가 본원에 기술된 방법에서 이용된다. 또다른 구체예에서, v5 테그가 본원에서 기술된 방법 및 조성물에서 이용된다. 친화력 테그를 인코딩하는 DNA 분자들은 상업적 공급자 (가령, Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.)의 것을 이용할 수 있다.
제반 사항을 고려하면, 본 명세서의 방법은 CLEC2D 항원성 표적에 대한 신규한 단일클론성 항체의 확인, 검증, 특성화 및 개발을 중심으로 집중되어 있다. 이들 신규한 단일클론성 항체들은 암을 비롯한 다양한 질환에 적용가능한 치료제, 진단제 및 예후제에 사용하기 위해 개발되었다.
일부 구체예들에서, 나이브 항체 라이브러리일 수 있는 항체 라이브러리는 특정 치료 표적, 가령, 항원, 이를 테면 본 명세서에 개시된 CLEC2D 단백질 또는 이의 임의의 단편과 같은 항원에 대해 원하는 기능적 속성을 갖는 고유한 항체 분자의 분리를 허용한다.
다양한 라이브러리와 적절한 호환가능한 디스플레이 플랫폼의 조합은 특정 항원 분자에 대해 더 높은 친화력 및 개선된 기능을 가진 치료 항체의 신속한 선별 및 생산을 가능하게 한다. 표적화된 치료용 항체 분자에 대한 전형적인 스크리닝은 더 작은 항체 단편들에 의한 디스플레이 플랫폼을 통해 표적 항원에 대항하여 다양한, 큰 항체 라이브러리로부터 분자를 선별하고, 이어서 포유동물 세포주에서 발현되는 전장 항체 분자를 구축하는 것을 포함한다. 일단 발현되면, 정제 과정과 이를 검증하기 위한 여러 기능 분석이 수행된다. 에피토프 식별, 제형, 안정성 연구 및 생체내 효능과 같은 매개변수의 최적화는 선택된 선도 항체의 개발을 더욱 강화시킨다.
본 명세서의 예시적인 구체예에서, CLEC2D 항원에 대항하는 인간 나이브 항체 라이브러리로부터 단일클론성 항체의 스크리닝, 분리 및 개발 방법은 다음 설명을 포함한다. 다양한 CLEC2D 항원 구조체, 즉, 야생형 및 돌연변이체의 가용성 엑토-도메인의 설계 및 생성; 포유동물 시스템에서 발현하도록 적절하게 최적화된/맞춤형 벡터 내 전체 길이의 CLEC2D 단백질은 친화성 크로마토그래피 방법을 통해 균질하게 정제시킨다.
일부 구체예들에서, 분자 라이브러리의 스크리닝은 CLEC2D 항원을 사용한 파아지 패닝을 약 1 내지 3회 수행한다. 각 라운드 동안 비-결합자를 제거함으로써, 라이브러리에서 특정 결합자들을 선별한다. 파아지 디스플레이 플랫폼에서 스크리닝된 분자들의 선별된 풀은 선택된 다양성의 무작위화 여부에 관계없이, 효모 표면 디스플레이 플랫폼으로 이동된다. 이것은 임의의 PCR 기반-방법 단계를 피함으로써, CLEC2D 항원에 대해 선별된 분자 풀을 보존한다. 상기 효모 디스플레이 플랫폼은 상이한 포멧의 다양한 항체 모이어티를 발현시키는 것을 포함한다. 디스플레이된 단편들을 특이적 항원 표적에 대항하여 스크리닝하고, 표적 항원에 대해 더 높은 친화력을 나타내는 특정 집단을 분리시킨다. 이들 선별된 풀은 항원 특이성에 대해 추가 테스트된다. 마지막으로, 개별 클론들을 분리시키고, 클론 집단은 개별 항체 클론의 시퀀싱에 사용된다.
항원에 대항하는 파아지 패닝 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 자성 비드가 이용될 수 있다. 자성 다이나비드(dynabeads) 상에 피복된 항원이 준비될 수 있고, 원하는 항체 클론을 발현하는 파아지 입자를 분리하기 위해 파아지 항체 라이러브러는 항원 피복된 비드에 대항하여 패닝되었다.
그런 다음, 정제된 DNA를 절단하고, 적절한 효모 발현 벡터에 결찰시켜, Fab 또는 ScFv와 같은 원하는 포멧의 항체를 생성시킬 수 있다. 효모 세포는 표준 방법으로 형질전환되고, 항체 발현을 확인할 수 있다. 항체의 표면 발현은 각각 중쇄 및 경쇄에 대한 FLAG, c-Myc 및 (His)6-테그 및 V5-테그 및 면역조직화학과 같은 다중 테그로 분석할 수 있다. 유동 세포측정은 특이적 항원 결합을 나타내는 항체 서열을 발현시키는 효모 세포들을 단리시키는데 이용될 수 있다. 효모 세포 집단의 유동 세포분석 소팅은 라벨된 항원을 지향하는 더 높은 친화도를 갖는 항체 클론을 풍부하게 하기 위해 적어도, 적어도 1x, 적어도 2x, 적어도 3x, 적어도 4x 또는 적어도 5x 반복될 수 있다.
개별 효모 클론은 당업계의 표준 방법을 사용하는 서열화시키고, 해당 항체 서열은 적합한 포유동물 유전자 발현 벡터에 추가로 클로닝된다.
본 명세서는 CLEC2D 항원에 결합하는 항체들의 고도의 다양성 항체 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 항체 유전자의 라이브러리를 벡터내 파아지 단백질 유전자로 삽입하고, 파아지를 형질전환시켜 상기 고도의 다양성 항체 유전자 라이브러리를 포함하는 파아지 라이브러리를 만드는 것을 포함한다. 상기 파아지 라이브러리 내 파아지는 해당 파아지 표면 상에 항체 유전자의 라이브러리를 디스플레이한다. 그 다음, 이 파아지 라이브러리는 CLEC2D 항원에 결합하는 개별 파아지에 대한 CLEC2D 항원으로 패닝되고, 그렇게 함으로써 CLEC2D 항원에 결합하는 항체들을 인코드하는 항체 유전자에 대해 풍부해진 풍부화된 파아지 라이브러리를 만든다. 이 패닝은 예를 들어, 비드 상의 항원에 결합하는 단리된 파아지에 사용될 수 있는 자성 비드에 항원을 콘쥬게이팅시킴으로써 달성될 수 있다. 상기 패닝 단계는 해당 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편들을 발현시키는 파아지가 풍부해지도록, 적어도 한 번, 또는 두 번, 또는 그 이상으로 반복될 수 있다.
그 다음, 상기 풍부화된 파아지 라이브러리의 항체 또는 항체 단편 유전자는 효모 표면 디스플레이 라이브러리로 이전된다. 일부 구체예들에서, 이것은 항체 또는 항체 단편 유전자를 적합한 효모 형질전환 벡터로 클로닝시키고, 당업계에서 표준인 방법으로 효모 세포를 형질전환함으로써 달성된다. 그 다음, CLEC2D 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편들을 발현시키는 효모 세포들이 단리된다. 일부 구체예들에서, 이러한 단리는 해당 효모 세포들을 소팅시키는 유동 세포측정을 이용하여 이루어진다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편들을 발현시키는 효모 세포들을 풍부하게 하기 위해, 유동 세포측정 단리를 적어도 1x, 적어도 2x, 적어도 3x, 적어도 4x 또는 적어도 5x 또는 그 이상으로 반복하는 것을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 FLAG 테그, c-Myc 테그, 폴리히스티딘 테그 또는 V5 테그로 항체 유전자의 표면 발현을 분석하는 것을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 상기 CLEC2D에 결합하는 항체 유전자를 포유류 발현 벡터에 클로닝시키는 것을 더 포함한다.
최적화 및 정제
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 방법은 전장의 단일클론성 항체의 발현, 안정적 세포-계통 생성 및 후속적 정제를 위해, 포유류 세포주 이를 테면, 중국 헴스터 난소 (CHO) 세포주로 선별된 항체 유전자 서열을 원활하게 전달하기 위한 벡터 구조체의 기획, 생성 및 최적화를 포함한다. 이를 통해 하류 프로세스에서 볼 수 있는 형태 및 해독-후 변형 측면에서 우수한 균질성을 가진 단일클론성 항체를 발현시키는 안정적인 세포주의 신속하고, 효율적인 확립이 가능하다.
항체 또는 항체 단편의 발현 및 정제에 적합한 모든 세포주는 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 일부 구체예들에서, 상기 세포주는 포유류 세포주이다. 세포주는 인간, 마우스 및 햄스터를 비롯한 모든 공급원으로부터 분리되거나 또는 유래될 수 있다. 적합한 세포주에는 중국 헴스터 난소 (CHO) 세포들, HEK 293 세포들, HEK293T 세포들, BHK21 세포들, NSO 세포들, PER.C6 세포들, B 세포들, HEK 293-6E 세포들, Sp2/0-Ag14 세포들 및 DG44 세포들이 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
일부 구체예들에서, 항체 클론의 CDR 길이와 아미노산 조성을 분석하여 이러한 클론의 신규성을 이해한다. 정제 전략, 안정성 그리고 항체내 있는 또는 존재하는 전하 변이체에 직접적인 영향을 미치는 물리-화학적 속성에 유해한 모티프를 갖는 클론을 제거하기 위해, 추가적인 신중한 분석이 수행된다.
일부 구체예들에서, 선두(lead) 항체 클론의 규모 확대는 당업계에 알려져 있고, 본원에 기술된 정의된 배양 배지, 보충물, 및 특정 생물반응기 공정을 통해 달성된다.
본 명세서 예시적인 정제 방법들은 항체 분자들에서 아미노산 조성물의 물리-화학적 성질을 조사하는 것을 이용하는 다단계 크로마토그래피 기술을 포함한다. 또한, 항체의 숙주 세포 단백질/불순물, 중합체 (또는 응집체)를 효과적으로 제거하고, 항체 회수율을 개선함으로써, 더 높은 순도를 얻을 수 있다. 항체 분자의 정제는 안정성을 더욱 향상시킬 적절한 제형으로 마무리된다.
치료요법적 조성물은 제조 및 보관 조건 하에서 무균 및 안정적인 조건을 포함한다.
항체 정제 프로세스는 당분야 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 임의의 특정 프로세스에 결부되지 않고, 예시적인 항체 정제 프로세스는 해당 항체 또는 항체 단편을 발현시키는 일차 세포를 정제하기 위한 원심분리, 이어서 필터 이를 테면, 3 μm -30 μm 필터를 이용한 추가 정제를 포함한다. 후속적으로, 수집된 여과액은 예를 들면, 0.22 μm 필터를 통하여 추가 여과될 수 있다. 이 샘플은 액체 크로마토그래피에 의한 추가 정제를 위해 컬럼에 로드될 수 있다. 예시적인 컬럼에는 XK 16/20 단백질 A 컬럼이 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 액체 크로마토그래피에는 느슨하게 결합된 숙주 세포 단백질 및 기타 불순물을 제거하기 위해 고염 세척 완충액으로 처리하는 것이 내포될 수 있다. 낮은 pH 세척 완충제로 소량의 불순물을 제거할 수 있다. 후속적으로, 결합된 단백질은 30 mM 인산염 완충제, pH.3.0-4.0를 이용하여 용리시킬 수 있다. 이 샘플을 희석하여 전도도를 낮춘 다음, 관통 모드 (가령, 음성 결합을 이용하여)에서 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 예시적인 AEX 컬럼에는 Q 세파로스 XK 16/20 컬럼이 내포되나, 이에 국한되지 않으며, 이때 컬럼은 10-100 mM 히스티딘 및/또는 구연산 및/또는 인산염 및/또는 MES 및/또는 아세테이트 완충제 (pH 4.5-6.5)로 사전-평형화시킬 수 있다. 약하게 상호작용하는 단백질은 세척액으로 용리 완충액을 사용하여 제거될 수 있고, 본 명세서의 항체 또는 항체 단편과 같은 결합된 단백질은 예를 들어, 단일 단계에서 1M NaCl 및/또는 KCl을 함유하는 용출 완충액을 사용하여 용리된다. AEX 크로마토그래피을 관통한 유동체는 10-100 mM 히스티딘 및/또는 구연산 및/또는 인산염 및/또는 2-(N-몰포리노)에탄술폰산 (MES) 및/또는 아세테이트 완충제 (pH 4.5-6.5)에서 사전-평형화된 apto SP ImpRes C10/20 컬럼 상에 로딩될 수 있다. 결합된 단백질 이를 테면, 본 명세서의 항체들 또는 항체 단편들은 용출 단계를 통하여 용출되고, 이어서 용출 완충제 (평형 완충제 -200-1000 mM NaCl 및/또는 KCl, pH 4.5-6.5 함유)를 이용하여 구배 용출될 수 있다. 그러나, 1 ~ 1.5 M NaCl, pH 4.5-6.5가 함유된 고-염 완충제는 강력하게 결합된 단백질 (존재한다면)을 제거할 수 있다.
이러한 사항을 모두 고려하면, 본 명세서의 항체들 및 항체 단편들은 다단계 크로마토그래피 기술에 의해 정제되어 높은 순도를 가지게 되며, 한편 숙주 세포 단백질/불순물, 항체의 중합체 (또는 응집체)를 제거하고, 해당 항체 회수율을 개선시키고; 예시적인 크로마토그래피 방법들에는 이온 교환기와 소수성 작용기를 모두 갖는 혼합 모드 수지의 사용이 내포된다. 아미노산이 첨가제로 이용될 수 있다.
치료 방법
본원에서 사용될 때, "치료하는" 또는 "치료하다"란 질환, 병태 또는 장애를 퇴치할 목적으로 환자를 관리 및 보살피는 것을 설명하고, 질환, 병태 또는 장애의 하나 또는 그 이상의 증상 또는 합병증을 완화하기 위해, 또는 질병, 병태 또는 장애를 제거하기 위해 본 명세서의 항체 또는 동일한 항체를 포함하는 약제학적 조성물의 투여를 포함한다. 용어 "치료하다"에는 시험관내 세포 또는 동물 모델의 치료가 또한 내포될 수 있다.
본 명세서의 항체, 또는 이의 약제학적 조성물은 질환, 병태 또는 장애를 예방하거나, 또는 이러한 목적을 위한 적합한 후보를 식별하는데 또한 이용될 수 있다. 본원에서 사용될 때, "예방하는" 또는 "예방하다"란 질병, 상태 또는 장애의 증상 또는 합병증의 발병을 감소 또는 제거하는 것을 설명한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "경감시키다"란 장애의 징후 또는 증상의 중증도가 감소되는 과정을 설명하는 것을 의미한다. 중요한 것은, 징후나 증상이 제거되지 않지만, 완화될 수 있다는 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 명세서의 약제학적 조성물을 투여하면, 징후 또는 증상의 제거로 이어지지만, 그러나 반드시 제거되어야 하는 것은 아니다. 효과적인 용량(dosages)으로 징후 또는 증상의 중증도를 감소시킬 것으로 예상된다. 예를 들어, 여러 위치에서 발생할 수 있는 암과 같은 장애의 징후 또는 증상은 여러 위치 중 적어도 하나의 위치에서 암의 중증도가 감소한다면, 완화된 것이다.
본원에서 사용될 때 용어 "증상"이란 질환, 병, 부상 또는 신체에 이상이 있는 징후로 정의된다. 증상을 경험한 개인은 증상을 느끼거나 또는 알아차리지만 다른 사람들은 쉽게 알아차리지 못할 수 있다. 여기에서 다른 사람이란 비-의료 전문가로 정의된다.
본원에서 사용될 때 용어 "징후"란 신체에 이상이 있음을 나타내는 표시로도 정의된다. 그러나, 징후는 의사, 간호사 또는 기타 의료 전문가가 볼 수 있는 것으로 정의된다.
본 명세서의 항체의 치료요법적 효과량이란 치료요법적 목적을 획득하는데 필요한 양으로 일반적으로 관계된다. 위에서 언급한 바와 같이, 이것은 특정 경우에 표적의 기능을 방해하는 항체와 표적 항원 사이의 결합 상호작용일 수 있다. 투여에 요구되는 양은 또한 항체의 특이적 항원에 대한 이 항체의 결합 친화력에 더욱 의존할 것이며, 그리고 이 항체가 투여되는 대상의 유리 체적(free volume)으로부터 투여된 항체가 고갈되는 속도에 의존 할 것이다. 본 명세서의 항체 또는 항체 단편의 치료학적으로 효과적인 투여를 위한 통상적인 범위는 비제한적 예로써, 약 0.1 mg/kg 체중 내지 약 50 mg/kg 체중일 수 있다. 일반적인 투약 빈도는 예를 들면, 일일 두 번 내지 일주일에 한 번의 범위일 수 있다.
항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 가장 작은 억제 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열에 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성 및/또는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. (가령, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993) 참고).
본 명세서의 비-제한적 구체예에서, 단리된 단일클론성 항체들은 다양한 유도 조건에 반응하여, 면역 세포 및 종양 세포를 비롯한 다양한 세포 표면 상에서 CLEC2D의 차등 발현을 나타낸다. 이것은 다수의 질병 징조에 대한 치료요법적 작용제로서 항-CLEC2D 항체의 용도를 나타낸다.
본 명세서는 본 명세서의 조성물, 상기 항체들 또는 이의 항원 결합 단편들, 및/또는 해당 항체들 또는 이의 항원 결합 단편들을 인코딩하는 핵산을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 CLEC2D와 이의 동계(cognate) 수용체 CD161간의 상호작용을 조정 또는 억제함으로써, 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 조성물, 상기 항체들 또는 이의 항원 결합 단편들, 및/또는 해당 항체들 또는 이의 항원 결합 단편들을 인코딩하는 핵산에 의해 치료되는 질환은 CLEC2D가 질환의 개시 및/또는 전개에 있어서 역할을 하는 (가령, CD161을 억제함으로써) 암, 자가면역 질환, 염증성 질환, 감염성 질환, 또는 다른 질환이다.
예시적인 질환 예시적인 질병은 이를 테면, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 라이터 증후군 및 염증성 장 질환과 관련된 척추관절병증과 같은 혈청음성 척추관절병증을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다.
예시적인 질환에는 인공 관절 이완을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.
예시적인 질환에는 결합 조직 질환 이를 테면, 소아 류마티스 관절염, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 및 루푸스 신염, 경피증, 쇼그렌(Sjogren) 증후군, 혼합 결합 조직 질환 및 다발성 근염, 피부근염이 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 질환에는 염증성 장 질환 이를 테면, 크론 질환 및 궤양성 대장염이 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 질환에는 육아종 회장염과 관련된 휘플(Whipples) 질환 및 관절염이 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 질환에는 염증성 피부 병태, 이를 테면, 자가면역 수포성 천포창, 자가면역 심상성 천포창, 습진 및 피부염이 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 질환에는 염증성 폐 질환 이를 테면, 폐포염, 폐 섬유증, 유육종증, 천식, 기관지염 및 폐쇄성 세기관지염이 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 질환에는 염증성 신장 질환 이를 테면, 사구체 신염, 신장 동종 이식 거부 및 신장 세뇨관 염증이 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 질환에는 죽상동맥경화증이 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 질환에는 전신 맥관념 이를 테면, 측두동맥염/거대세포동맥염, 타카야수(takayasu) 동맥염, 결절다발 동맥염, 가와사키(Kawasaki) 질환, 베게너(Wegener) 육아종증, 처그 슈트라우스(churg strauss) 증후군, 현미경적 다발혈관염, 괴사성 사구체신염, 헤녹 쇤라인(henoch schonlein) 질환, 본태성 한랭글로불린혈증성 혈관염, 기타 소혈관성 자반병 및 베체트 질환이 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 질환에는 대식세포 활성화 질환 이를 테면, 대식세포 활성화 증후군(MAS), 성인 발병 스틸(stills) 질환 및 혈구식작용 증후군이 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 질환에는 류마티스성 다발성 근육통, 원발성 담도 경화증, 경화성 담관염, 자가면역 간염, 제1형 당뇨병, 하시모토(Hashimoto) 갑상선염, 그레이브스(Graves) 질환, 다발성 경화증(MS), 길랭-바레(Guillain-Barre) 증후군, 애디슨(Addison) 질환 및/또는 레이노(Raynaud) 증후군 및 굿포스튜(Goodpasture) 증후군이 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
예시적인 질환에는 다음을 포함하는 암이 연계된 질환 및 암이 내포되나, 이에 국한되지 않는다: 유방암, 전립선암, 자궁내막암, 자궁암, 방광암, 신장암, 식도암, 편평세포암, 포도막흑색종, 신경교종, 교모세포종, 골수종, 갈색세포종, 부신경절종, 여포성 림프종, 신세포암종, 센드칼(cendcal) 암, 난소암, 자궁경부암, 폐암, 결장직장암, 뇌암, 췌장암, 위암, 장암, 고환암, 피부암, 갑상선암, 흉선종, 두경부암, 간암, 인두암, 부신피질암, 담관암, 중피종, 육종, 백혈병, 림프종, 호지킨 질환, 다발성 골수종, 흑색종, 성상세포종, 위암, 폐선암종, 선암종, 세엽 세포 선암종, 부신피질 암종, 폐포 세포 암종, 역형성 암종, 기저양 암종, 기저 세포 암종, 세기관지 암종, 기관지 암종, 신장 아디놀 암종, 배아 암종, 아노메트로이드 암종, 섬유층 간 세포 암종, 여포 암종, 거대 세포 암종, 간세포 암종, 표피내 암종, 상피내 암종, 렙토마니지오(leptomanigio) 암종, 수질 암종, 흑색 암종, 수막(menigual) 암종, 중피세포 암종, 귀리 세포 암종, 편평 세포 암종, 땀샘 암종, 이행 세포 암종, 세뇨관 세포 암종, 범랑아세포 육종, 혈관결석 육종, 포도상(botryoid) 육종, 자궁내막 간질 육종, 유잉(ewing)육종, 섬유속(fascicular) 육종, 거대 세포 육종, 과립구 육종, 면역모세포 육종, 주사코디얼(juxaccordial) 골원성 육종, 코피스(coppices) 육종, 백혈구육종 (백혈병), 림프육종 (림프 육종), 수질 육종, 골수 육종(과립구성 육종), 오스티오겐시(austiogenci) 육종, 골막성 육종, 세망 세포 육종 (조직구 림프종), 원형 세포 육종, 방추 세포 육종, 활막 육종, 모세혈관 확장성 청력 육종, 버킷 림프종, NPDL, NML, NH, 미만성 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 급성 골수성 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 외투 세포 림프종 및 여포성 림프종을 포함한다.
예시적인 질환에는 다음이 내포되나, 이에 국한되지 않는다: 부신피질 암종, 방광 요로상피 암종, 유방 침윤성 암종, 자궁경부 편평세포 암종 및 자궁경부 선암종, 담관암종, 결장 선암종, 림프성 신생물 미만성 거대 B-세포 림프종, 식도 암종, 다형 교모세포종, 두경부 편평 세포 암좀, 신장 염색공포증, 신장 신장의 투명세포 암종, 신장 신장의 유두세포 암종, 급성 골수성 백혈병, 뇌 저등급 신경교종, 간 간의 세포암종, 폐 선암종, 폐 편평세포 암종, 난소 장액성 낭선암종, 췌장 선암종, 갈색세포종 및 부신경절종, 전립선 선암종, 직장 선암종, 육종, 피부 피부의 흑색종, 위 선암종, 자궁암, 고환 생식 세포 종양, 갑상선 암종, 흉선종, 자궁 코퍼스 자궁내막암종, 자궁 암종 및 포도막 흑색종.
바람직한 구체예에 따르면, 본 명세서의 조성물 및 방법들은 뼈로 전이되는 전이 암 치료에 관계하며, 이때 전이성 암은 유방, 폐, 신장, 다발성 골수종, 갑상선, 전립선, 선암종, 백혈병 및 림프종을 포함한 혈액 세포 악성종양; 두경부암; 식도암, 위암, 결장암, 장암, 결장직장암, 직장암, 췌장암, 간암, 인두암, 담관암 또는 담낭암을 포함한 위장관암; 난소암, 자궁내막암, 질암, 자궁경부암을 포함한 여성 생식기의 악성종양; 방광 암; 신경모세포종을 포함한 뇌암; 육종, 골육종; 및 악성 흑색종 또는 편평 세포암을 포함하는 피부암이다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 바와 같이, 대상체에서 질환 또는 장애의 치료 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 세포의 활성화에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 바와 같이, 대상체에서 질환 또는 장애의 치료 방법은 면역 세포 (가령, NK 세포, B-세포, 또는 T-세포)의 활성화에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 바와 같이, 대상체에서 질환 또는 장애의 치료 방법은 포유류 대상체의 치료에 관계한다. 일부 구체예들에서, 본원에 개시된 바와 같이, 대상체에서 질환 또는 장애의 치료 방법은 인간 대상체의 치료에 관계한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애 치료용 치료요법적 작용제로 이용된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체 다양한 세포 표면 상에서 CLEC2D의 차등적 또는 기이한 발현과 연합된 질환 또는 장애 치료용 치료요법적 작용제로 이용된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체 다양한 세포 표면 상에서 CLEC2D의 차등적 또는 기이한 발현과 연합된 질환 또는 장애 치료용 치료요법적 작용제로 이용되며, 이때 상기 세포들은 면역 세포 또는 종양 세포들이다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체 다양한 세포 표면 상에서 CLEC2D의 차등적 또는 기이한 발현과 연합된 질환 또는 장애 치료용 치료요법적 작용제로 이용되며, 이때 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 CLEC2D와 이의 동계 수용체 CD161의 상호작용을 조정 또는 억제하는데 효과량으로 해당 대상체에게 투여된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체 다양한 세포 표면 상에서 CLEC2D의 차등적 또는 기이한 발현과 연합된 질환 또는 장애 치료용 치료요법적 작용제로 이용되며, 이때 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 NK 세포에 결합하여, 이를 활성화시키는데 효과량으로 해당 대상체에게 투여된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체 다양한 세포 표면 상에서 CLEC2D의 차등적 또는 기이한 발현과 연합된 질환 또는 장애 치료용 치료요법적 작용제로 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 이를 필요로 하는 대상체에서 CLEC2D의 차등적 또는 기이한 발현과 연합된 질환 또는 장애 치료 방법에 이용되는 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 CLEC2D와 이의 동계 수용체 CD161과의 상호작용을 조정 또는 억제시킨다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 혈청음성 척추관절병증 이를 테면, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 라이터 증후군 및 염증성 장 질환과 관련된 척추관절병증이 내포되나 이에 국한되지 않은 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 결합 조직 질환 이를 테면, 소아 류마티스 관절염, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창 (SLE) 및 루프스 신염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 혼합 결합 조직 질환 및 다발성근염, 피부근염이 내포되나, 이에 국한되지 않은 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 결합 조직 질환 이를 테면, 소아 류마티스 관절염, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창 (SLE) 및 루프스 신염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 혼합 결합 조직 질환 및 다발성근염, 피부근염이 내포되나, 이에 국한되지 않은 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 결합 조직 질환 이를 테면, 소아 류마티스 관절염, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창 (SLE) 및 루프스 신염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 혼합 결합 조직 질환 및 다발성근염, 피부근염이 내포되나, 이에 국한되지 않은 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 결합 조직 질환 이를 테면, 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환과 같은 결합 조직 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 결합 조직 질환 이를 테면, 육아종 회장염과 관련된 휘플 질환 및 관절염과 같은 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 염증성 피부 병태 이를 테면, 자가면역 수포성 천포창, 자가면역 심상성 천포창, 습진 및 피부염과 같은 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 염증성 폐 질환 이를 테면, 폐포염, 폐섬유증, 유육종증, 천식, 기관지염 및 폐쇄성 세기관지염과 같은 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 죽상 동맥 경화증 및 관상 동맥 질환을 포함하나, 이에 국한되지 않는 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 염증성 신장 질환 이를 테면, 사구체 신염, 신장 동종이식 거부 반응 및 신세뇨관 염증을 포함하나, 이에 국한되지 않는 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 전신 맥관념 이를 테면, 측두동맥염/거대세포동맥염, 타카야수(takayasu) 동맥염, 결절다발 동맥염, 가와사키(Kawasaki) 질환, 베게너(Wegener) 육아종증, 처그 슈트라우스(churg strauss) 증후군, 현미경적 다발혈관염, 괴사성 사구체신염, 헤녹 쇤라인(henoch schonlein) 질환, 본태성 한랭글로불린혈증성 혈관염, 기타 소혈관성 자반병 및 베체트 질환을 포함하나, 이에 국한되지 않는 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 전신 맥관념 이를 테면, 측두동맥염/거대세포동맥염, 타카야수(takayasu) 동맥염, 결절다발 동맥염, 가와사키(Kawasaki) 질환, 베게너(Wegener) 육아종증, 처그 슈트라우스(churg strauss) 증후군, 현미경적 다발혈관염, 괴사성 사구체신염, 헤녹 쇤라인(henoch schonlein) 질환, 본태성 한랭글로불린혈증성 혈관염, 기타 소혈관성 자반병 및 베체트 질환을 포함하나, 이에 국한되지 않는 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 대식세포 활성화 질환 이를 테면, 대식세포 활성화 증후군(MAS), 성인 발병 스틸(stills) 질환 및 혈구식작용 증후군이을 포함하나, 이에 국한되지 않는 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 류마티스성 다발성 근육통, 원발성 담도 경화증, 경화성 담관염, 자가면역 간염, 제1형 당뇨병, 하시모토(Hashimoto) 갑상선염, 그레이브스(Graves) 질환, 다발성 경화증(MS), 길랭-바레(Guillain-Barre) 증후군, 애디슨(Addison) 질환 및/또는 레이노(Raynaud) 증후군 및 굿포스튜(Goodpasture) 증후군을 포함하나, 이에 국한되지 않는 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 암과 연계된 질환 또는 암이 내포되나, 이에 국한되지 않는 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 다음을 포함하는 암이 연계된 질환 및 암이 내포되나, 이에 국한되지 않는 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다: 유방암, 전립선암, 자궁내막암, 자궁암, 방광암, 신장암, 식도암, 편평세포암, 포도막흑색종, 신경교종, 교모세포종, 골수종, 갈색세포종, 부신경절종, 여포성 림프종, 신세포암종, 센드칼(cendcal) 암, 난소암, 자궁경부암, 폐암, 결장직장암, 뇌암, 췌장암, 위암, 장암, 고환암, 피부암, 갑상선암, 흉선종, 두경부암, 간암, 인두암, 부신피질암, 담관암, 중피종, 육종, 백혈병, 림프종, 호지킨 질환, 다발성 골수종, 흑색종, 성상세포종, 위암, 폐선암종, 선암종, 세엽 세포 선암종, 부신피질 암종, 폐포 세포 암종, 역형성 암종, 기저양 암종, 기저 세포 암종, 세기관지 암종, 기관지 암종, 신장 아디놀 암종, 배아 암종, 아노메트로이드 암종, 섬유층 간 세포 암종, 여포 암종, 거대 세포 암종, 간세포 암종, 표피내 암종, 상피내 암종, 렙토마니지오(leptomanigio) 암종, 수질 암종, 흑색 암종, 수막(menigual) 암종, 중피세포 암종, 귀리 세포 암종, 편평 세포 암종, 땀샘 암종, 이행 세포 암종, 세뇨관 세포 암종, 범랑아세포 육종, 혈관결석 육종, 포도상(botryoid) 육종, 자궁내막 간질 육종, 유잉(ewing)육종, 섬유속(fascicular) 육종, 거대 세포 육종, 과립구 육종 육종, 면역모세포 육종, 주사코디얼(juxaccordial) 골원성 육종, 코피스(coppices) 육종, 백혈구육종 (백혈병), 림프육종 (림프 육종), 수질 육종, 골수 육종(과립구성 육종), 오스티오겐시(austiogenci) 육종, 골막성 육종, 세망 세포 육종 (조직구 림프종), 원형 세포 육종, 방추 세포 육종, 활막 육종, 모세혈관 확장성 청력 육종, 버킷 림프종, NPDL, NML, NH, 미만성 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 급성 골수성 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 외투 세포 림프종 및 여포성 림프종을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 전이성 암 또는 암과 연계된 질환이 내포되나, 이에 국한되지 않는 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 전이성 암 또는 암들과 연계된 질환이 내포되나, 이에 국한되지 않는 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 뼈로 전이되는 전이성 암 또는 암들과 연계된 질환이 내포되나, 이에 국한되지 않는 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 전이성 암 또는 암들과 연계된 질환이 내포되나, 이에 국한되지 않은 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되며, 이때 전이성 암은 유방, 폐, 신장, 다발성 골수종, 갑상선, 전립선, 선암종, 백혈병 및 림프종을 포함한 혈액 세포 악성종양; 두경부암; 식도암, 위암, 결장암, 장암, 결장직장암, 직장암, 췌장암, 간암, 인두암, 담관암 또는 담낭암을 포함한 위장관암; 난소암, 자궁내막암, 질암, 자궁경부암을 포함한 여성 생식기의 악성종양; 방광 암; 신경모세포종을 포함한 뇌암; 육종, 골육종; 및 악성 흑색종 또는 편평 세포암을 포함하는 피부암이며, 이때 상기 방법은 해당 대상체에서 해당 질환의 증후를 치료 또는 완화시키는데 효과량의 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체 및 조성물은 장기 이식편 또는 적응성 면역 세포 이식편을 이용하여 대상체의 치료 방법에 이용된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체 및 조성물은 CD161과 CLEC2D 상호작용을 차단시키고, 동종반응성(alloreactiv) NK 세포에 의한 수용체 수지상 세포의 사멸로 인해 이식편 대 숙주 거부 반응을 감소시킨다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체 및 조성물은 박테리아, 진균, 원생동물, 기생충 및 바이러스를 포함하지만 이에 국한되지 않는 미생물에 의한 대상체에서의 감염성 질환의 치료 방법에 이용된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체 및 조성물은 다음중 임의의 하나 또는 그 이상 (또는 이들의 임의의 조합)에 의해 야기되는 대상체에서의 박테리아 질환 치료 방법에 이용된다: 아씨네토박터 바우마니(Acinetobacter baumanii), 악티노바실러스 종, 악티노미세테스(Actinomycetes), 악티노미세스 종 (이를 테면, 악티노미세스 이스라엘리Actinomyces israelii) 및 악티노미세스 나에슬룬디(Actinomyces naeslundii), 아에로모나스 종.,(이를 테면, 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), 아에로모나스 베로니 바이오바르 소브리아(Aeromonas veronii biovar sobria) (아에로모나스 소브리아), 및 아에로모나스 카비아에(Aeromonas caviae)), 아나플라스마 파고사이토필럼(Anaplasma phagocytophilum), 아나플라스마 마르기나레 (Anaplasma marginale) 알칼리게네스 자일로시단스 (Alcaligenes xylosoxidans), 아씨네토박터 바우마니, 악티노바실러스 악티노미세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans), 바실러스 종.,(이를 테면, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 및 바실러스 스테아로터모필러스(Bacillus stearothermophilus)), 박테로이드 종.,(이를 테면, 박테로이드 프라길리스 (Bacteroides fragilis)), 바르토넬라 종.,(이를 테면, 바르토넬라 바시리포르미스(Bartonella bacilliformis) 및 바르토넬라 헨셀라에(Bartonella henselae)), 비리도박테리움 (Bifidobacterium) 종., 보르데테라 종.,(이를 테면, 보르데테라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 보르데테라 파라페르투시스(Bordetella parapertussis), 및 보르데테라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica)), 보렐리아 종.,(이를 테면, 보렐리아 레쿠렌티스(Borrelia recurrentis), 및 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)), 브루셀라 종.,(이를 테면, 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 브루셀라 멜린텐시스(Brucella melintensis) 및 브루셀라 수이스(Brucella suis)), 부르크홀데리아 종.,(이를 테면, 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei) 및 부르크홀데리아 쎄파시아(Burkholderia cepacia)), 캄필로박터 종.,(이를 테면, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari) 및 캄필로박터 페투스(Campylobacter fetus)), 캅노사이토파가 종, 카르디오박테리움 옴미니스(Cardiobacterium hominis), 클라미디아 트라초마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 뉴모니에(Chlamydophila pneumoniae), 클라모도필라 시타시(Chlamydophila psittaci), 시트로박터 종.,콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetii), 코리네박테리움(Corynebacterium) 종.,(이를 테면, 코리네박테리움 디프테리에(Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 제이툼(Corynebacterium jeikeum) 및 코리네박테리움), 클로스트리디움 (Clostridium) 종.,(이를 테면, 클로스트리디움 퍼프리겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 및 클로스트리디움 테타티(Clostridium tetani)), 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens), 엔테로박터 종.,(이를 테면, 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae) 및 대장균 (기회주의적 대장균, 이를 테면, 장독성 대장균, 장침습성 대장균, 장병원성 대장균, 장출혈성 대장균, 장집합성 대장균 및 요로병원성 대장균) 엔테로코커스 종.,(이를 테면, 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) 및 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 에릴키아 종.,(이를 테면, 에릴키아 차펜시아(Ehrlichia chafeensia) 및 에릴키아 카니스(Ehrlichia canis)), 에피데르모피톤 플로코숨(Epidermophyton floccosum), 에리시펠트릭스 루시오파티에(Erysipelothrix rhusiopathiae), 유박테리움 종(Eubacterium) 종, 프란시세라 투라렌시스(Francisella tularensis), 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 가르드네레라 바기날리스(Gardnerella vaginalis), 게메라 모르비로룸(Gemella morbillorum), 헤모필루스 종.,(이를 테면, 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 헤모필루스 두크레이(Haemophilus ducreyi), 헤모필루스 아에깁티우스(Haemophilus aegyptius), 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 헤모리티쿠스(Haemophilus haemolyticus) 및 헤모필루스 파라헤모리티쿠스(Haemophilus parahaemolyticus), 헬리코박터 종.,(이를 테면, 헬리코박터 피로리(Helicobacter pylori), 헬리코박터 씨나에디(Helicobacter cinaedi) 및 헬리코박터 페넬리아에(Helicobacter fennelliae), 킹겔라 킹기(Kingella kingii), 클렙시엘라 종.,(이를 테면, 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella 뉴모니에), 클렙시엘라 그래눌로마티스(Klebsiella granulomatis) 및 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 락토바실러스 종, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes, 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 엔테로간스(Leptospira interrogans), 펩토스트렙토코커스 (Pepto스트렙토코커스) 종., 만헤이미아 헤모리티카(Mannheimia hemolytica), 마이크로스포룸 카니스(Microsporum canis), 모락셀라 카라랄리스(Moraxella catarrhalis), 모르가넬라(Morganella) 종., 모비루쿠스(Mobiluncus) 종., 마이크로코쿠스(Micrococcus) 종., 미코박테리움 종.,(이를 테면, 미코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 파라투베르쿨로시스(Mycobacterium paratuberculosis), 미코박테리움 인트라셀루라레(Mycobacterium intracellulare), 미코박테리움 아비움(Mycobacterium avium), 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 그리고 미코박테리움 마리눔(Mycobacterium marinum), 미코플라즘 종.,(이를 테면, 미코플라즈마 뉴모니에(Mycoplasma pneumoniae), 미코플라즈마 오미니스(Mycoplasma hominis), 및 미코플라즈마 게니탈리룸(Mycoplasma 생식기ium), 노카르디아 종.,(이를 테면, 노카르디아 아스테로이데스(Nocardia asteroides), 노카르디아 크리아시게오르기카(Nocardia cyriacigeorgica) 및 노카르디아 브라스실렌시스(Nocardia brasiliensis), 나이세리아 종.,(이를 테면, 나이세리아 고노르오에(Neisseria gonorrhoeae) 및 나이세리아 메닝지티디스(Neisseria meningitidis), 파스누레라 물토시다(Pasteurella multocida), 피티로스포움 오르비쿨라레(Pityrosporum orbiculare) (말라세지아 푸르푸르(Malassezia furfur)), 플레시오모나스 쉬겔로이데스(Plesiomonas shigelloides). 프레보테라 (Prevotella) 종., 포르피로모나스(Porphyromonas) 종., 프레보테라 멜라니오게니카(Prevotella melaninogenica), 프로테우스 종.,(이를 테면, 프로테우스 불라리스(Proteus vulgaris) 및 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis)), 프로비덴시아 종.,(이를 테면, 프로비덴시아 알칼리파시엔스(Providencia alcalifaciens), 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri) 및 프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii)), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 프로피오닙 아세테리움 아시네스(Propionib acterium acnes), 로도코커스 에퀴(Rhodococcus equi), 리케차 종.,(이를 테면, 리케차 리케시(Rickettsia rickettsii), 리케차 아카리(Rickettsia akari) 및 리케차 프로와제키(Rickettsia prowazekii), 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi) (이전에는: 리케차 쯔쯔가무시(Rickettsia tsutsugamushi) 및 리케차 티피(Rickettsia typhi)), 로도코커스(Rhodococcus) 종., 쎄라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스테노트로포모나스 말토피라(Stenotrophomonas maltophilia), 살로넬라 종.,(이를 테면, 살로넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 살로넬라 티피(Salmonella typhi), 살로넬라 파라티피(Salmonella paratyphi), 살로멜라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살로넬라 콜레라수이스(Salmonella cholerasuis) 및 살로넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 종.,(이를 테면, 세라티아 마르세산스(Serratia marcesans) 및 세라티아 리퀴파시엔스(Serratia liquifaciens), 쉬겔라 종.,(이를 테면, 쉬겔라 디센테리에(Shigella dysenteriae), 쉬겔라 플렉세니레(Shigella flexneri), 쉬겔라 보이디(Shigella boydii) 및 쉬겔라 소나이(Shigella sonnei), 스타필로코커스 종.,(이를 테면, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 헤모리티쿠스(Staphylococcus hemolyticus), 스타필로코커스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토코커스 종.,(이를 테면, 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae) (예를 들면 클로람페니콜-저항성 혈청형 4 스트렙토코커스 뉴모니에, 스펙티노미신-저항성 혈청형 6B 스트렙토코커스 뉴모니에, 스트렙토미신-저항성 혈청형 9V 스트렙토코커스 뉴모니에, 에리트로미신-저항성 혈청형 14 스트렙토코커스 뉴모니에, 옵토친-저항성 혈청형 14 스트렙토코커스 뉴모니에, 리팜피신-저항성 혈청형 18C 스트렙토코커스 뉴모니에, 테트라사이클린-저항성 혈청형 19F 스트렙토코커스 뉴모니에, 페니실린-저항성 혈청형 19F 스트렙토코커스 뉴모니에, 및 트리메토프림-저항성 혈청형 23F 스트렙토코커스 뉴모니에, 클로람페니콜-저항성 혈청형 4 스트렙토코커스 뉴모니에, 스펙티노미신-저항성 혈청형 6B 스트렙토코커스 뉴모니에, 스트렙토미신-저항성 혈청형, 9V 스트렙토코커스 뉴모니에, 옵토친-저항성 혈청형 14 스트렙토코커스 뉴모니에, 리팜피신-저항성 혈청형 18C 스트렙토코커스 뉴모니에, 페니실린-저항성 혈청형 19F, 스트렙토코커스 뉴모니에, 또는 트리메토프림-저항성 혈청형 23F 스트렙토코커스 뉴모니에), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 무탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 그룹 A 스트렙토코카이, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 그룹 B 스트렙토코카이(Streptococci), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 그룹 C 스트렙토코카이, 스트렙토코커스 앙기노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 에퀴스밀리스(Streptococcus equismilis), 그룹 D 스트렙토코카이, 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 그룹 F 스트렙토코카이, 및 스트렙토코커스 앙기노수스(Streptococcus anginosus) 그룹 G 스트렙토코카이), 스피릴룸 미누스(Spirillum minus), 스트렙토바실러스 모니리포르미(Streptobacillus moniliformi), 트레포네마 종.,(이를 테면, 트레포네마 카라테움(Treponema carateum), 트레포네마 페테누에(Treponema petenue), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum) 및 트레포네마 엔데미쿰(Treponema endemicum), 트리초피톤 루바룸(Trichophyton rubrum), T. 멘타그로피테스(mentagrophytes), 트로페리마 위페리(Tropheryma whippelii), 우레아플라스마 우레랄리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 베리오넬라(Veillonella) 종, 비브리오 종.,(이를 테면, 비브리오 콜레아(Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤모리티쿠스(Vibrio parahemolyticus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 파라헤모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 불리피쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 알기노리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 미미쿠스(Vibrio mimicus), 비브리오 홀리세(Vibrio hollisae), 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 비브리오 메치니코비(Vibrio metchnikovii), 비브리오 담세라(Vibrio damsela) 및 비브리오 푸르니시(Vibrio furnisii), 에르시니아 종.,(이를 테면, 에르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 에르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 및 에르시니아 슈도투레르쿨로시스(Yersinia pseudo결핵) 그리고 산토모나스 말토피라(Xanthomonas maltophilia).
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체 및 조성물은 아스퍼길러스(Aspergillus), 블라스토미세스(Blastomyces), 칸디디아증(Candidiasis), 코시디오미코시스(Coccidiodomycosis), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티(Cryptococcus gatti), 종.,히스토플라스마 종(이를 테면, 히스토플라스마 캡술라툼(Histoplasma capsulatum), 뉴모시스티스 종.,(이를 테면, 뉴모시스티스 지로베치(Pneumocystis jirovecii), 스타치보트리 (이를 테면, 스타치보트리 카르타룸(Stachybotrys chartarum)), 무크로이무코시스(Mucroymcosis), 스포로트릭스(Sporothrix), 곰팡이 눈 감염 고리벌레(ringworm), 엑세로힐룸(Exserohilum), 클라도스포리움(Cladosporium)중 임의의 하나 또는 그 이상(또는 이의 임의의 조합)에 의해 야기되는 대상체내 곰팡이 질환의 치료 방법에 이용된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체 및 조성물은 유글레노조아(Euglenozoa), 헤테롤로보세아(Heterolobosea), 디플로모나디다(Diplomonadida), 아모에보조아(Amoebozoa), 블라스토시스틱(Blastocystic), 및 아피코플렉사(Apicomplexa) 중 임의의 하나 또는 그 이상(또는 이의 임의의 조합)에 의해 야기되는 대상체내 곰팡이 질환의 치료 방법에 이용된다. 예시적인 유글레노조아에는 트리파노조마 크루지(Trypanosoma cruzi) (샤가스(Chagas) 질환), T. 브루세이 감비엔세(brucei gambiense), T. 브루세이 로데시엔스(brucei rhodesiense), 레이쉬마니아 브라질렌시스(Leishmania braziliensis), L. 인판툼(infantum), L. 멕시카나(mexicana), L. 마요르(major), L. 트로피카(tropica), 및 L. 도노바니(donovani)가 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 예시적인 헤레롤로보세아에는 나에글레이라 파울레리(Naegleria fowleri)가 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 예시적인 디플로모나디다에는 기아르디아 인테스티날리스(Giardia intestinalis) (G.람블리아(lamblia), G. 듀오데날리스(duodenalis)가 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 예시적인 아모에보조아에는 아칸타모에바 카스텔라니(Acanthamoeba castellanii), 발라무티아 마드릴라리스(Balamuthia madrillaris), 엔타모에바 히스토리카(Entamoeba histolytica)가 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 예시적인 블라스토시스에는 블라스토시스틱 옴미니스(Blastocystic hominis)가 내포되나, 이에 국한되지 않는다. 예시적인 아피코플렉사에는 바베시아 미크로티(Babesia microti), 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum), 시클로스포라 카에타넨시스(Cyclospora cayetanensis), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), P. 비박스(vivax), P. 오발레(ovale), P. 말라리에(malariae), 및 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii)가 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체 및 조성물은 에볼라바이러스, 홍역 바이러스, SARS, 치쿤구니야(Chikungunya) 바이러스, 간염 바이러스, 마르부르크(Marburg) 바이러스, 황열 바이러스, MERS, 뎅기(Dengue) 바이러스, 랏사(Lassa) 열 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 라도바이러스 또는 HIV중 임의의 하나 또는 그 이상(또는 이의 임의의 조합)에 의해 야기되는 대상체내 바이러스 질환의 치료 방법에 이용된다. 간염 바이러스에는 간염 A, 간염 B, 또는 간염 C가 내포될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체 및 조성물은 다음중 하나 또는 그 이상(또는 이의 임의의 조합)에 의해 야기되는 대상체에서 바이러스 질환의 치료에 이용된다: 인간 호흡기 합포체 바이러스, 수단 에볼라 바이러스, 분디부교(Bundibugyo) 바이러스, 타이 숲 에볼라 바이러스, 레스턴(Reston) 에볼라 바이러스, 아키모타(Achimota), 숲모기(Aedes) 플라비바이러스, 아구아카떼(Aguacate) 바이러스, 아카반(Akabane) 바이러스, 알레티노피드(Alethinophid) 렙타레나바이러스, 알파우아요(Allpahuayo) 맘마레나바이러스, 아마파리(Amapari) 맘마레나바이러스, 안데스(Andes) 바이러스, 아포이(Apoi) 바이러스, 아라반(Aravan) 바이러스, 아로아(Aroa) 바이러스, 아룸워트(Arumwot) 바이러스, 아틀란타 연어 파라믹소바이러스, 호주 박쥐 리사바이러스, 조류 보르나바이러스, 조류 메타뉴모바이러스, 조류 파라믹소바이러스, 펭귄 또는 포크랜드 섬바이러스, BK 폴리오마바이러스, 바가자(Bagaza) 바이러스, 바나(Banna) 바이러스, 박쥐 헤르페스바이러스, 박쥐 사포바이러스, 곰 캐넌 맘마레나바이러스, 베이롱(Beilong) 바이러스, 베타코로나바이러스, 베타파밀로마바이러스 1-6, 반야(Bhanja) 바이러스, 보케로흐 박쥐 리사바이러스, 보르나 질환 바이러스, 보우르본(Bourbon) 바이러스, 소의 헤파씨i바이러스, 소의 파라인플루엔자 바이러스 3, 소의 호흡기 합포체 바이러스, 브라조란(Brazoran) 바이러스, 분얌웨라(Bunyamwera) 바이러스, 칼리씨비리데(Caliciviridae) 바이러스. 캘리포니아 뇌염 바이러스, 칸디루(Candiru) 바이러스, 갯과 디스템퍼 바이러스, 갯과 뉴모바이러스, 쎄다르(Cedar) 바이러스, 세포 융합 작용제 바이러스, 쎄타세안 모르빌리바이러스, 칸디푸라(Chandipura) 바이러스, 차오양(Chaoyang) 바이러스, 차라페(Chapare) 맘마레나바이러스,치쿤구니야(Chikungunya) 바이러스, 콜로부스 원숭이 파필로마바이러스, 콜로라도 틱 열 바이러스, 우두 바이러스, 크리메안-콩도 출혈성 열 바이러스, 쿠렉스(Culex) 플라비바이러스, 쿠픽시(Cupixi) 맘마레나바이러스, 뎅기 바이러스, 도브라바-벨그라데(Dobrava-Belgrade) 바이러스, 동강(Donggang) 바이러스, 두그베(Dugbe) 바이러스, 두벤하게(Duvenhage) 바이러스, 동부형 말 뇌염 바이러스, 엔테브(Entebbe) 박쥐 바이러스, 엔테로바이러스 A-D, 유럽 박쥐 리사바이러스 1-2, 에야치(Eyach) 바이러스, 고양잇과 모르빌리바이러스, 페르-데-란세(Fer-de-Lance) 파라믹소바이러스, 파투즈로이(Fitzroy) 강 바이러스, 플라비비리데(Flavi비리데) 바이러스, 플렉살(Flexal) 맘마레나바이러스, GB 바이러스 C, 가이로(Gairo) 바이러스, 게미시르쿠라르바이러스, 거위 파라믹소바이러스 SF02, 그레이트섬(GreatIsland) 바이러스, 구아나리토(Guanarito) 맘마레나바이러스, 한탄(Hantaan) 바이러스, 한타(Hanta)바이러스 Z10, 허트랜드(Heartland) 바이러스, 헨드라(Hendra) 바이러스, 간염 A/B/C/E, 간염 델타 바이러스, 인간 보카바이러스, 인간 코로나바이러스, 인간 내인성 레트로바이러스 K, 인간 장의 코로나바이러스, 인간 생식기-연합된 원형 DNA 바이러스-1, 인간 헤르페스바이러스 1-8, 인간 면역결핍 바이러스 1/2, 인간 마스타데노바이러스 AG, 인간 파필로마바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1-4, 인간 파레초바이러스, 인간 피코르나바이러스, 인간 스마코바이러스, 이코마 리사바이러스, 일레우스(Ilheus) 바이러스, 인플루엔자 A-C, 이피(Ippy) 맘마레나바이러스, 이르쿠트(Irkut) 바이러스, J-바이러스, JC 폴리오마바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 유닌(Junin) 맘마레나바이러스, KI 폴리오마바이러스, 카디피로(Kadipiro) 바이러스, 카미티(Kamiti) 강 바이러스, 케도우고우(Kedougou) 바이러스, 쿠얀드(Khujand) 바이러스, 코코베라(Kokobera) 바이러스, 캬사누르 (Kyasanur) 숲 질환 바이러스, 라고스 박쥐 바이러스, 랑가트(Langat) 바이러스, 라사(Lassa) 맘마레나바이러스, 라티노(Latino) 맘마레나바이러스, 레오파르드 언덕(Leopards Hill) 바이러스, 이라오 닝(Liao ning) 바이러스, 엘우간(Ljungan) 바이러스, 요비우(Lloviu) 바이러스, 로우핑(Louping) 병 바이러스, 루요(Lujo) 맘마레나바이러스, 루나(Luna) 맘마레나바이러스, 룬크(Lunk) 바이러스, 림프구성 맥락막수막염 맘마레나바이러스, 리사바이러스 오레르노(Ozernoe), MSSI2Y225 바이러스, 마추포(Machupo) 맘마레나바이러스, 마마스트로바이러스 1, 만자닐라(Manzanilla) 바이러스, 마푸에라(Mapuera) 바이러스, 마르부르크 바이러스, 마야로(Mayaro) 바이러스, 홍역 바이러스, 메난글레(Menangle) 바이러스, 메르카데오(Mercadeo) 바이러스, 메르켈(Merkel) 세포 폴리오마바이러스, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스, 모바라(Mobala) 맘마레나바이러스, 모독(Modoc) 바이러스, 모이양(Moijang) 바이러스, 모코로(Mokolo) 바이러스, 원숭이팍스 바이러스, 몬타나 윗수염박쥐 류코엔찰리티스(leukoenchalitis) 바이러스, 모페이아(Mopeia) 라사바이러스 재조합체 29, 모페이아 맘마레나바이러스, 모로고로(Morogoro) 바이러스, 모스만(Mossman) 바이러스, 볼거리 바이러스, 뮤린(Murine) 폐렴 바이러스, 무레이 계곡(Murray Valley) 뇌염 바이러스, 나리바(Nariva) 바이러스, 뉴캐슬(Newcastle) 질환 바이러스, 니파(Nipah) 바이러스, 노르워크(Norwalk) 바이러스, 노르웨이 렛(rat) 헤파시바이러스, 나타야(Ntaya) 바이러스, 오녕-영(O'nyong-nyong) 바이러스, 올리베로스(Oliveros) 맘마레나바이러스, 옴스크(Omsk) 출혈열 바이러스, 오로포치(Oropouche) 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 5, 파라나(Parana) 맘마레나바이러스, 파라마타(Parramatta) 강 바이러스, 페스트-데스-페티티츠-루미난트(Peste-des-petits-ruminants) 바이러스, 파칸데(Pichande) 맘마레나바이러스, 피코르나비리데 바이러스, 피리탈(Pirital) 맘마레나바이러스, 피쉬헤페바이러스(Piscihepevirus) A, 돼지 파라인플루엔자 바이러스 1, 돼지 루불라바이러스, 포와산(Powassan) 바이러스, 영장류 T-림프친화성 바이러스 1-2, 영장류 에리트로파르보바이러스 1, 푼타 토로(Punta Toro) 바이러스, 푸마라(Puumala) 바이러스, 쿠앙 빈(Quang Binh) 바이러스, 광견병 바이러스, 라즈단(Razdan) 바이러스, 파충류 보르나바이러스 1, 리노바이러스 A-B, 리프트 계곡(Rift Valley) 열 바이러스, 린데르페스트(Rinderpest) 바이러스, 리오 브라보(Rio Bravo) 바이러스, 설치류 토르크 테노(Torque Teno) 바이러스, 설치류 헤파치바이러스, 로스(Ross) 강 바이러스, 로타바이러스 A-I, 로얄 팜(Royal Farm) 바이러스, 루벨라(Rubella) 바이러스, 사비아(Sabia) 맘마레나바이러스, 살렘(Salem) 바이러스, 샌드플라이 열 네이플(Sandfly fever Naples) 바이러스, 샌드플라이 열 시칠리안(Sicilian) 바이러스, 사포로(Sapporo) 바이러스, 사투페리(Sathuperi) 바이러스, 표범 아넬로바이러스, 세밀리키(Semliki) 숲 바이러스, 센다이(Sendai) 바이러스, 서울(Seoul) 바이러스, 세픽(Sepik) 바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군-관련 코로나바이러스, 혈소판감소증 증후군 바이러스의 중증 열, 샤몬다(Shamonda) 바이러스, 쉬모니(Shimoni) 박쥐 바이러스, 수니(Shuni) 바이러스, 심부(Simbu) 바이러스, 원숭이 토르크 테노(torque teno) 바이러스, 원숭이 바이러스 40-41, 신 놈브레(Sin Nombre) 바이러스, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 작은 아넬로바이러스, 소수가(Sosuga) 바이러스, 스페인 염소 뇌염 바이러스, 스폰웨니(Spondweni) 바이러스, 세인트 루이스(St. Louis)뇌염 바이러스, 선샤인(Sunshine) 바이러스, TTV-유사 미니 바이러스, 타카리브(Tacaribe) 맘마레나바이러스, 타이라(Taila) 바이러스, 타마나(Tamana) 박쥐 바이러스, 타미아미(Tamiami) 맘마레나바이러스, 템부수(Tembusu) 바이러스, 토고토(Thogoto) 바이러스, 토타팔라얌(Thottapalayam) 바이러스, 틱-본(Tick-borne) 뇌염 바이러스, 티오만(Tioman) 바이러스, 토가비리데(Toga비리데) 바이러스, 토르크 테노 카니스(Torque teno canis) 바이러스, 토르크 테노 도우로쿨리(douroucouli) 바이러스, 토르크 테노 펠리스(felis) 바이러스, 토르크 테노 미디(midi) 바이러스, 토르크 테노 수스(sus) 바이러스, 토르크 테노 타마린(tamarin) 바이러스, 토르크 테노 바이러스, 토르크 테노 잘로푸스(zalophus) 바이러스, 투호코(Tuhoko) 바이러스, 투라(Tula) 바이러스, 투파이아(Tupaia) 파라믹소바이러스, 우수투(Usutu) 바이러스, 유쿠니에미(Uukuniemi) 바이러스, 백시니아(Vaccinia) 바이러스, 바리올라(Variola) 바이러스, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스, 수포성 구내염 인디아나(Indiana) 바이러스, WU 폴리오마바이러스, 웨셀스브론(Wesselsbron) 바이러스, 서양 백인(West Caucasian) 박쥐 바이러스, 서부 나일(West Nile) 바이러스, 서부형 말 뇌염 바이러스, 화이트워터 아로요(Whitewater Arroyo) 맘마레나바이러스, 황열 바이러스, 요코세(Yokose) 바이러스, 유그 보그다노박(Yug Bogdanovac) 바이러스, 자이레(Zaire) 에볼라바이러스, 지카(Zika) 바이러스, 또는 지고사카로미세스 바이리(Zygosaccharomyces bailii) 바이러스 Z 바이러스성 서열. RNA 바이러스가 원인이 되는 치료될 수 있는 질환의 예로는 코로나비리데 바이러스, 피코르나비리데 바이러스, 칼리치비리데 바이러스, 플라비비리데 바이러스, 토가비리데 바이러스, 보르나비리데, 피로비리데, 파라믹소비리데, 뉴모비리데, 라도비리데, 아레나비리데, 분야비리데, 오르토믹소비리데, 또는 델타바이러스중 하나 또는 그 이상(또는 이의 임의의 조합)이 내포된다. 특정 구체예들에서, 상기 바이러스는 코로나바이러스, SARS, 폴리오바이러스, 리노바이러스, 간염 A, 노르워크 바이러스, 황열 바이러스, 서부 나일 바이러스, 간염 C 바이러스, 뎅기열 바이러스, 지카 바이러스, 루벨라 바이러스, 로스 강 바이러스, 신드비스 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 보르나 질환 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 니파 바이러스, 핸드라 바이러스, 뉴캐슬 질환 바이러스, 인간 호흡기 합포체 바이러스, 광견병 바이러스, 라사 바이러스, 한타바이러스, 크리미안-콩고 출혈열 바이러스, 인플루엔자, 또는 간염 D 바이러스이다. 특정 구체예들에서, 상기 바이러스는 다음중 하나 또는 그 이상의 또는 이의 임의의 조합이 내포된 레트로바이러스이다: 게누스 알파레트로바이러스, 베타레트로바이러스, 감마레트로바이러스, 델타레트로바이러스, 입실론레트로바이러스, 렌티바이러스, 스푸마바이러스, 또는 패밀리 메타비리데, 슈도비리데, 및 레트로비리데 (HIV를 비롯한), 헤파드나비리데 (간염 B 바이러스를 비롯한), 그리고 콜리모비리데 (콜리플라워 모자이크 바이러스를 비롯한).
일부 구체예들에서, 상기 감염성 질환은 만성 바이러스 감염, 이를 테면, HIV를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 감염성 질환은 만성 박테리아 감염 이를 테면, 결핵 (TB)을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 감염성 질환은 만성 기생충 감염 이를 테면, 말라이아를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체의 다양한 세포의 표면 상에 CLEC2D의 발현 증가를 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용되는데, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 항-CLEC2D 항체들을 치료요법적 작용제로 하여 다음을 행하는데 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다: (i) 면역 세포의 표면 상에 있는 CD161에 다양한 세포 상에 있는 CLEC2D가 결합하는 것을 차단; (ii) 다양한 세포들 상에 CLEC2D 발현을 감소; (iii) 면역 세포 상에 CD161에 CLEC2D가 결합함으로써 면역 세포에서 유도되는 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 감소 (iv) 면역 세포의 표면 상에 있는 하나 또는 그 이상의 Fc 수용체에 결합 및/또는 활성화, (v) 면역 세포들의 표면 상에 CLEC2D에 결합하여, 해당 면역 세포를 활성화, 또는 이의 임의의 조합.
일부 구체예들에서, 본 발명은 암 또는 종양 또는 이 둘 모두를 앓고 있는 대상체에서 치료요법적 작용제의 효능을 평가하는 방법에 관계하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: a) 대상체의 샘플에서 살아있는 암 세포의 수 및/또는 증식하는 암 세포의 수를 탐지하고; b) 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 항-CLEC2D 항체들의 치료요법적 효과량을 상기 대상체에게 투여하고; c) 단계 a)를 한 번 또는 그 이상으로 반복하고; 그리고 d) 단계 a)에서 탐지된 것과 비교하여 단계 c)에서 탐지된 살아있는 암세포 및/또는 증식하는 암 세포의 수를 비교하고, 이때 상기 항-CLEC2D 항체들이 (i) 암 세포의 표면에 CLEC2D에 결합하고, 종양 세포들 상에 있는 CLEC2D와 면역 세포들의 표면 상에 CD161 간의 상호작용을 저해시키고; (ii) 암 세포들의 표면 상에 CLEC2D 및 면역 세포의 표면 상의 Fc 수용체에 결합하여 암 세포의 용해를 유도하고; (iii) 면역 세포포들의 표면 상에 CLEC2D에 결합하여 면역 세포들을 활성화시키거나; 또는 이의 조합을 행하고, 이때 단계 a)에서 탐지된 살아있는 암 세포 및/또는 증식하는 암 세포의 수와 비교하여, 단계 c)에서 탐지된 살아있는 또는 증식하는 암 세포의 수가 없거나, 또는 감소되었다면, 이것은 상기 작용제가 효과적임을 나타낸다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물은 점막 연합된 불변체 T (MAIT) 세포들, NK 세포들 또는 T 세포들의 기능을 강화시킬 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관계하며, 이때 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서의 항-CLEC2D 항체의 치료요법적 효과량과 적어도 제 2 치료요법적 작용제의 치료요법적 효과량의 조합을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 적어도 하나의 제 2 치료요법적 작용제는 종양 세포 또는 면역 세포의 표면 상에 발현된 단백질 또는 항원에 대항하는 치료요법적 항체를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 적어도 하나의 제 2 치료요법적 작용제는 종양 세포의 표면 상에 발현된 단백질 또는 항원에 대항하는 치료요법적 항체를 포함하고, 이는 해당 종양 세포의 자가사멸을 유도한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 적어도 하나의 제 2 치료요법적 작용제, 종양 세포의 표면 상에 발현된 단백질 또는 항원에 대항하는 치료요법적 항체를 포함하고, 이는 항체 지향된 세포성 세포독성 (ADCC) 또는 보체 지향된 세포독성 (CDC)을 통하여 면역 세포에 의한 사멸을 유도한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 적어도 하나의 제 2 치료요법적 작용제, 면역 세포의 표면 상에 발현된 단백질 또는 항원에 대항하는 치료요법적 항체를 포함하고, 이는 해당 면역 세포의 활성화를 유도한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 적어도 하나의 제 2 치료요법적 작용제, 면역 세포의 표면 상에 발현된 단백질 또는 항원에 대항하는 치료요법적 항체를 포함하고, 이는 해당 면역 세포에 의한 사이토킨 생산을 유도한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 적어도 하나의 제 2 치료요법적 작용제, 면역 세포의 표면 상에 발현된 단백질 또는 항원에 대항하는 치료요법적 항체를 포함하고, 이는 해당 면역 세포에 의한 케모킨 생산을 유도한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 적어도 하나의 제 2 치료요법적 작용제, 면역 세포의 표면 상에 발현된 단백질 또는 항원에 대항하는 치료요법적 항체를 포함하고, 이는 해당 면역 세포에 의한 염증성 사이토킨의 생산을 유도한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 적어도 하나의 제 2 치료요법적 작용제, 면역 세포의 표면 상에 발현된 단백질 또는 항원에 대항하는 치료요법적 항체를 포함하고, 이는 면역 세포들을 활성화시켜 암 세포를 인지하고, 세포독성을 유도한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 적어도 하나의 제 2 치료요법적 작용제, 면역 세포의 표면 상에 발현된 단백질 또는 항원에 대항하는 치료요법적 항체를 포함하고, 이는 면역 세포를 활성화시켜 병원균에 감염된 세포들을 인지하고, 세포독성을 유도하며, 이때 상기 병원균에는 바이러스 또는 박테리아가 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
일부 구체예들에서, 본원에 개시된 바와 같이, 대상체에서 질환 또는 장애의 치료 방법은 상기 항-CLEC2D 항체들 또는 항-CLEC2D 항체들을 포함하는 조성물과 적어도 제 2 치료요법적 작용제, 순차적으로 또는 동시에 투여하는 것을 포함한다.
염증성 질환의 치료
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항체들 및 동일한 것을 포함하는 약제학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 장애는 염증성 또는 자가면역 질환 또는 장애를 포함한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "염증성 장애"란 일반적으로 호중구 화학주성에 의해 유발되는 염증을 유발하는 병리학적 상태를 지칭한다.
본원에서 사용될 때, 자가면역 질환 또는 장애는 일반적으로 박테리아, 바이러스 및 기타 감염성 물질로부터 신체를 방어하는 신체의 면역계가 "자기" 조직, 세포 및 장기를 공격할 때 발생한다. 이러한 "자기" 표적에 대한 면역 체계의 동원을 자가면역이라고 한다. 모든 개체에게 어느 정도의 자가면역이 존재하지만, 엄격한 제어 시스템은 자가면역이 일반적으로 무증상인 정도로 면역계의 자가 인식 세포를 억제한다. 질환 상태는 제어 시스템이 중단되어, 자가면역 세포가 억제를 피하거나 또는 표적 조직에 어떤 변화가 있어 더 이상 자기의 것으로 인식되지 않을 때 발생한다. 자가면역 장애는 염증성 반응으로 특징화될 수 있다.
염증성 또는 자가면역 장애의 예시적인 그러나 비-제한적인 예로는 혈청음성 척추관절병증, 결합 조직 질환, 염증성 장 질환, 관절염, 염증성 피부 상태, 염증성 폐 질환, 염증성 신장 질환, 전신 맥관염, 대식세포 활성화 질환, 류마티스성 다발성 근육통, 원발성 담도 경화증, 경화성 담관염, 자가면역 간염, 제1형 당뇨병, 하시모토(Hashimoto) 갑상선염, 그레이브스(Graves) 질환, 다발성 경화증(MS), 길랭-바레(Guillain-Barre) 증후군, 애디슨(Addison) 질환, 레이노(Raynaud) 증후군 및 굿포스튜(Goodpasture) 증후군이 내포되나, 이에 국한되지 않는다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항체 또는 동일한 것을 포함하는 약제학적 조성물의 치료요법적 효과량은 염증성 또는 자가면역 장애의 징후 또는 증상을 완화하거나 또는 예방한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항체 또는 동일한 것을 포함하는 약제학적 조성물의 치료요법적 효과량은 해당 대상체의 하나 이상의 조직 또는 장기에서 염증의 양을 감소시킨다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항체 또는 동일한 것을 포함하는 약제학적 조성물의 치료요법적 효과량은 일시적으로 상기 질환의 하나 또는 그 이상의 측면 또는 면역 반응의 하나 이상의 측면을 감소 또는 억제시킨다. 질환 또는 면역계의 하나 또는 그 이상의 측면의 이러한 일시적인 억제 또는 감소는 몇 시간, 며칠, 몇 주 또는 몇 달 동안 지속될 수 있다. 바람직하게는, 상기 질환 또는 면역 반응의 하나 또는 그 이상의 측면에서 일시적인 억제 또는 감소는 몇 시간 (가령, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 14 시간, 16 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 또는 48 시간), 몇 일 (가령, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 또는 14 일), 또는 몇 주 (가령, 3 주, 4 주, 5 주 또는 6 주) 동안 지속된다.
본 명세서의 항체 또는 이 항체를 포함하는 약제학적 조성물의 예방적, 치료요법적 또는 면역조절 활성은 가령, 특정 단백질 이를 테면, 공동-자극 분자들 및 사이토킨의 발현에 대한 CTL 분석, 증식 분석, 및 면역분석 (가령, ELISAs)을 비롯한 당분야에 당업자에게 공지된 임의의 기술을 통하여 시험관 및/또는 생체에서 결정될 수 있다.
암의 치료
본원에서 사용될 때, 용어 "중증도"는 암이 전-암성 또는 양성 상태에서 악성 상태로 전환될 가능성을 설명하는 의미이다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 중증도는 예를 들어, TNM 시스템(International Union Against Cancer (UICC) 및 American Joint Committee on Cancer (AJCC)에서 승인된) 또는 기타 기술에 따라 암 단계를 설명하는 것을 의미한다. 암 병기는 원발성 종양의 위치, 종양 크기, 종양 수, 림프절 침범 (암이 림프절로 퍼짐)과 같은 요인에 따라, 암의 정도 또는 중증도를 나타낸다. 대안적으로 또는 추가로, 중증도는 업계에서 인정하는 방법으로 종양 등급을 설명하기 위한 것이다(National Cancer Institute, www.cancer.gov 참조). 종양 등급은 암세포가 현미경으로 얼마나 비정상적으로 보이는지, 종양이 얼마나 빨리 성장하고 퍼질 가능성이 있는 지에 따라, 암 세포를 분류하는 데 사용되는 시스템이다. 세포의 구조 및 성장 패턴을 비롯하여, 종양 등급을 결정할 때 많은 요인들이 고려된다. 종양 등급을 결정하는 데 사용되는 특정 요인은 각 암 유형에 따라 다르다. 중증도는 또한 분화라고도 하는 조직학적 등급을 설명하며, 이는 종양 세포가 동일한 조직 유형의 정상 세포와 얼마나 유사한지를 나타낸다(National Cancer Institute, www.cancer.gov 참고). 더욱이, 중증도는 종양 세포의 핵 크기와 모양, 분열 중인 종양 세포의 비율을 나타내는 핵 등급을 나타낸다 (National Cancer Institute, www.cancer.gov 참고).
본 명세서의 또다른 측면에서, 중증도는 종양이 성장 인자를 분비하고, 세포외 기질을 분해하고, 혈관을 형성하고, 병치된 조직에 대한 접착력을 상실하거나, 전이된 정도를 설명한다. 또한, 중증도는 원발성 종양이 전이된 위치의 수를 나타낸다. 마지막으로, 중증도에는 다양한 유형과 위치의 종양을 치료하는 어려움도 내포된다. 예를 들면, 수술할 수 없는 종양, 여러 신체 시스템에 더 많이 접근할 수 있는 암 (혈액학적 및 면역학적 종양), 전통적인 치료법에 가장 저항성이 강한 암이 가장 심각한 것으로 간주된다. 이러한 상황에서 대상체의 평균 수명 연장 및/또는 통증 감소, 암 세포의 비율 감소 또는 세포를 하나의 시스템으로 제한, 암 병기/종양 등급/조직학적 등급/핵 등급 개선은 암의 징후 또는 증상을 완화하는 것으로 간주된다.
암은 거의 모든 징후나 또는 증상을 유발할 수 있는 질환 군이다. 징후와 증상은 암의 위치, 암의 크기, 주변 장기나 구조에 미치는 영향에 따라 다르다. 만약 암이 퍼지면 (전이되면), 신체의 다른 부분에 증상이 나타날 수 있다.
암을 치료하면, 종양의 크기가 줄어들 수 있다. 종양 크기의 감소는 또한 "종양 퇴행"으로 지칭될 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 종양 크기는 치료 전 크기에 비해 5% 또는 그 이상 감소한다; 더욱 바람직하게는, 종양 크기는 10% 또는 그 이상 감소되며; 더욱 바람직하게는, 20% 또는 그 이상으로 감소되며; 더욱 바람직하게는, 30% 또는 그 이상으로 감소되며; 더욱 바람직하게는, 40% 또는 그 이상으로 감소되며; 더 더욱 바람직하게는, 50% 또는 그 이상으로 감소되며; 그리고 가장 바람직하게는, 75% 또는 그 이상으로 감소된다. 종양의 크기는 임의의 재현가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 종양의 크기는 종양의 직경으로 측정할 수 있다.
암을 치료하면, 종양 부피가 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 종양 부피는 치료 전 부피에 비해 5% 또는 그 이상 감소한다; 더욱 바람직하게는, 종양 크기는 10% 또는 그 이상 감소되며; 더욱 바람직하게는, 20% 또는 그 이상으로 감소되며; 더욱 바람직하게는, 30% 또는 그 이상으로 감소되며; 더욱 바람직하게는, 40% 또는 그 이상으로 감소되며; 더 더욱 바람직하게는, 50% 또는 그 이상으로 감소되며; 그리고 가장 바람직하게는, 75% 또는 그 이상으로 감소된다. 종양의 부피는 임의의 재현가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다.
암을 치료하면, 종양 수가 감소된다. 바람직하게는, 치료 후, 종양의 수는 치료 전 갯수에 비해 5% 또는 그 이상 감소한다; 더욱 바람직하게는, 종양 크기는 10% 또는 그 이상 감소되며; 더욱 바람직하게는, 20% 또는 그 이상으로 감소되며; 더욱 바람직하게는, 30% 또는 그 이상으로 감소되며; 더욱 바람직하게는, 40% 또는 그 이상으로 감소되며; 더 더욱 바람직하게는, 50% 또는 그 이상으로 감소되며; 그리고 가장 바람직하게는, 75% 이상으로 감소된다. 종양의 수는 임의의 재현가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 종양의 수는 육안으로 볼 수 있는 종양을 세어 측정하거나 또는 지정된 배율로 측정할 수 있다. 바람직하게는, 지정된 배율은 2x, 3x, 4x, 5x, 10x 또는 50x이다.
암을 치료하면, 원발성 종양 부위로부터 원위의 다른 조직이나 또는 장기의 전이성 병변 수가 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 전이성 병변의 수는 치료 전 갯수에 비해 5% 또는 그 이상 감소한다; 더욱 바람직하게는, 전이성 병변의 수는 10% 또는 그 이상 감소되며; 더욱 바람직하게는, 20% 또는 그 이상으로 감소되며; 더욱 바람직하게는, 30% 또는 그 이상으로 감소되며; 더욱 바람직하게는, 40% 또는 그 이상으로 감소되며; 더 더욱 바람직하게는, 50% 또는 그 이상으로 감소되며; 그리고 가장 바람직하게는, 75% 이상으로 감소된다. 전이성 병변의 수는 임의의 재현가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 전이성 병변의 수는 육안으로 보거나 또는 특정 배율에서 전이성 병변을 헤아려 측정할 수 있다. 바람직하게는, 지정된 배율은 2x, 3x, 4x, 5x, 10x 또는 50x이다.
암을 치료하면, 담체만을 제공받는 집단과 비교하여, 치료 대상 집단의 평균 생존 시간이 증가할 수 있다. 바람직하게는, 평균 생존 시간은 30 일 이상; 더욱 바람직하게는, 60 일 이상; 더욱 바람직하게는, 90 일 이상; 그리고 가장 바람직하게는, 120 일 이상 증가된다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 재현가능한 임의의 수단으로 측정할 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 예를 들어, 항체 또는 동일한 것을 포함하는 약제학 조성물로 치료를 시작한 후, 해당 집단에 대해 평균 생존 기간을 계산함으로써 측정될 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 예를 들어, 항체 또는 동일한 것을 포함하는 약제학 조성물로 제 1 라운드 치료를 완료한 후, 해당 집단에 대해 평균 생존 기간을 계산함으로써 또한 측정될 수 있다.
암을 치료하면, 치료를 받지 않은 대상체 집단과 비교하여, 치료 대상 집단의 평균 생존 시간이 증가할 수 있다. 바람직하게는, 평균 생존 시간은 30 일 이상; 더욱 바람직하게는, 60 일 이상; 더욱 바람직하게는, 90 일 이상; 그리고 가장 바람직하게는, 120 일 이상 증가된다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 재현가능한 임의의 수단으로 측정할 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 예를 들어, 항체 또는 동일한 것을 포함하는 약제학 조성물로 치료를 시작한 후, 해당 집단에 대해 평균 생존 기간을 계산함으로써 측정될 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 예를 들어, 항체 또는 본 명세서의 동일한 것을 포함하는 약제학 조성물로 제 1 라운드 치료를 완료한 후, 해당 집단에 대해 평균 생존 기간을 계산함으로써 또한 측정될 수 있다.
암을 치료하면, 본 명세서의 항체가 아닌 약물을 이용한 단일 요법을 제공받은 대상체 집단과 비교하여, 치료 대상 집단의 평균 생존 시간이 증가할 수 있다. 바람직하게는, 평균 생존 시간은 30 일 이상; 더욱 바람직하게는, 60 일 이상; 더욱 바람직하게는, 90 일 이상; 그리고 가장 바람직하게는, 120 일 이상 증가된다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 재현가능한 임의의 수단으로 측정할 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 예를 들어, 항체 또는 본 명세서의 동일한 것을 포함하는 약제학 조성물로 치료를 시작한 후, 해당 집단에 대해 평균 생존 기간을 계산함으로써 측정될 수 있다. 집단의 평균 생존 시간의 증가는 예를 들어, 항체 또는 본 명세서의 동일한 것을 포함하는 약제학 조성물로 제 1 라운드 치료를 완료한 후, 해당 집단에 대해 평균 생존 기간을 계산함으로써 또한 측정될 수 있다.
암을 치료하면, 담체만을 제공받는 집단과 비교하여, 치료 대상체 집단의 사망률이 감소할 수 있다. 암을 치료하면, 담체만을 제공받는 집단과 비교하여, 치료를 받지 않은 대상체 집단의 사망률이 감소할 수 있다. 암을 치료하면, 본 명세서의 항체가 아닌, 또는 동일한 것을 포함하는 약제학적 조성물이 아닌 약물을 이용한 단일 요법을 제공받은 대상체 집단과 비교하여, 치료 대상체 집단의 사망률이 감소할 수 있다. 바람직하게는, 사망률은 2% 이상; 더욱 바람직하게는, 5% 이상; 더욱 바람직하게는, 10% 이상; 그리고 가장 바람직하게는, 25% 이상 감소된다. 치료 대상 집단의 사망률 감소는 임의의 재현가능한 수단으로 측정할 수 있다. 집단의 사망률 감소는 예를 들어, 항체로 치료를 시작한 후 집단에 대해 단위 시간당 질병-관련 사망의 평균 수를 계산함으로써 측정될 수 있다. 집단의 사망률 감소는 예를 들어, 항체로 제 1 라운드 치료를 완료한 후, 집단에 대해 단위 시간당 질병-관련 사망의 평균 수를 계산함으로써 또한 측정될 수 있다.
암을 치료하면, 종양 성장률이 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 종양 성장률은 치료 전 숫자에 비교하여 적어도 5% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 종양 성장률은 적어도 10% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 20% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 30% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 40% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 50% 감소되며; 더 더욱 바람직하게는, 적어도 50% 감소되며; 그리고 가장 바람직하게는, 적어도 75% 감소된다. 종양 성장률은 임의의 재현가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 종양 성장률은 단위 시간당 종양 직경의 변화에 따라 측정할 수 있다.
암을 치료하면, 종양 재성장이 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 종양 재성장은 5% 미만이며; 더욱 바람직하게는, 종양 재성장은 10% 미만이며; 더욱 바람직하게는, 20% 미만이며; 더욱 바람직하게는, 30% 미만이며; 더욱 바람직하게는, 40% 미만이며; 더욱 바람직하게는, 50% 미만이며; 더 더욱 바람직하게는, 50% 미만이며; 그리고 가장 바람직하게는, 75% 미만이다. 종양 재성장은 임의의 재현가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 종양 재성장은, 예를 들어, 치료 후, 기존 종양의 수축 후 해당 종양 직경에 있어서 증가를 측정함으로써 측정된다. 종양 재성장의 감소는 치료를 중단한 후, 해당 종양이 재발하지 않았다는 것을 나타낸다.
암을 치료하면, 세포 증식 속도가 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 세포성 증식율은 적어도 5% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 10%; 더욱 바람직하게는, 적어도 20%; 더욱 바람직하게는, 적어도 30%; 더욱 바람직하게는, 적어도 40%; 더욱 바람직하게는, 적어도 50%; 더 더욱 바람직하게는, 적어도 50%; 그리고 가장 바람직하게는, 적어도 75% 감소된다. 세포성 증식율은 임의의 재현가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 세포성 증식율은 예를 들어, 단위 시간당 조직 샘플에서 분열하는 세포의 수를 측정함으로써 측정된다.
암을 치료하면, 증식하는 세포의 비율이 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 증식하는 세포의 비율이 적어도 5% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 10%; 더욱 바람직하게는, 적어도 20%; 더욱 바람직하게는, 적어도 30%; 더욱 바람직하게는, 적어도 40%; 더욱 바람직하게는, 적어도 50%; 더 더욱 바람직하게는, 적어도 50%; 그리고 가장 바람직하게는, 적어도 75% 감소된다. 증식하는 세포의 비율은 임의의 재현가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 바람직하게는, 증식하는 세포의 비율은 예를 들면, 조직 샘플에서 분열하지 않는 세포의 수에 대한 분열하는 세포의 수를 정량화함으로써 측정된다. 증식하는 세포의 비율은 유사분열 지수와 등가일 수 있다.
암을 치료하면, 세포 증식 구역 또는 영역의 크기가 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 세포성 증식의 구역 또는 영역의 크기는 치료전 이의 크기와 비교하여 적어도 5% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 10% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 20% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 30% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 40% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 50% 감소되며; 더 더욱 바람직하게는, 적어도 50% 감소되며; 그리고 가장 바람직하게는, 적어도 75% 감소된다. 세포성 증식의 구역 또는 영역은 임의의 재현가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 세포성 증식의 구역 또는 영역의 크기는 세포성 증식의 구역 또는 영역의 직경 또는 폭으로 측정될 수 있다. 암을 치료하면, 비정상적인 모양이나 형태를 가진 세포의 수 또는 비율이 감소할 수 있다. 바람직하게는, 치료 후, 비정상적인 모양을 가진 세포의 수는 치료 전 이의 크기와 비교하여 적어도 5% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 10% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 20% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 30% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 40% 감소되며; 더욱 바람직하게는, 적어도 50% 감소되며; 더 더욱 바람직하게는, 적어도 50% 감소되며; 그리고 가장 바람직하게는, 적어도 75% 감소된다. 비정상적인 세포성 모양이나 형태는 임의의 재현가능한 측정 수단으로 측정할 수 있다. 비정상적인 세포성 형태는 가령, 역위(inverted) 조직 배양 현미경을 사용하여 현미경으로 측정할 수 있다. 비정상적인 세포성 형태는 핵 다형성의 형태를 취할 수 있다.
암을 치료하면, 세포 사멸이 발생할 수 있으며, 바람직하게는 세포 사멸은 집단에서 세포 수가 적어도 10% 감소된다. 더욱 바람직하게는, 세포 사멸이란 적어도 20%의 감소를 의미하며; 더욱 바람직하게는, 적어도 30%의 감소; 더욱 바람직하게는, 적어도 40%의 감소; 더욱 바람직하게는, 적어도 50%의 감소; 가장 바람직하게는, 적어도 75%의 감소를 의미한다. 집단에서 세포 수는 재현가능한 임의의 수단으로 측정할 수 있다. 집단에서 세포 수는 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 면역형광 현미경 및 광학 현미경으로 측정할 수 있다. 세포 사멸을 측정하는 방법은 Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100(5): 2674-8, 2003에 나타낸 것과 같다. 한 측면에서, 세포 사멸은 자가사멸에 의해 일어난다.
단독요법
본 명세서의 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항체들 및 조성물은 질환 치료를 위해 단독요법으로 투여된다.
본원에서 사용될 때, "단일요법"이란 단일 활성 또는 치료요법적 화합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다. 바람직하게는, 단일요법은 치료요법적 효과량의 활성 화합물의 투여와 관련될 것이다. 예를 들면, 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서의 항체 또는 이의 약제학적 조성물 중 하나를 사용한 암 단일요법. 단일 요법은 다수의 활성 화합물의 조합이 투여될 때, 바람직하게는 각 성분이 치료요법적으로 유효량으로 존재하는 조합이 투여되는 병용 요법과 대조될 수 있다. 한 측면에서, 본 명세서의 항체 또는 약제학적 조성물을 이용한 단일 요법은 원하는 생물학적 효과를 유도하는 데 있어 병용 요법보다 더 효과적이다.
본 명세서에 따른 항체는 샘플에서 CLEC2D (또는 단백질 또는 이의 단백질 단편)의 존재를 검출하기 위한 작용제로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 검출가능한 라벨을 함유한다. 항체들은 다중클론, 또는 더욱 바람직하게는, 단일클론성일 수 있다. 고유 항체, 또는 이의 단편 (가령, Fab, scFv, 또는 F(ab)2)이 이용될 수 있다. 프로브 또는 항체와 관련하여 용어 "라벨된(labeled)"은 프로브 또는 항체에 검출가능한 물질을 커플링 (가령, 물리적으로 연계)함으로써, 이 프로브 또는 항체의 직접 라벨링하는 것 뿐만 아니라, 직접적으로 라벨된 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체를 간접적으로 라벨링하는 것을 포괄하는 의미다. 간접 라벨의 예는 형광-라벨된 2 차 항체를 사용한 일차 항체의 검출 및 형광-라벨된 스트렙타비딘으로 검출할 수 있는 바이오틴으로 DNA 프로브의 말단-라벨링을 포함한다. "생물학적 샘플"이라는 용어는 대상으로부터 분리된 조직, 세포 및 생물학적 유체 뿐만 아니라 이 대상 내에 존재하는 조직, 세포 및 체액을 포함하도록 의도된다. 따라서 "생물학적 샘플"이라는 용어의 사용에는 혈액 및 혈청, 혈장 또는 림프액을 포함한 혈액의 분획 또는 성분이 포함된다. 즉, 본 명세서의 검출 방법은 시험관내뿐만 아니라 생체내에서 생물학적 시료 중의 분석 대상 mRNA, 단백질, 또는 게놈 DNA를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 분석물 mRNA를 검출하기 위한 시험관내 기술은 노던(Northern) 하이브리드 화 및 원위치(in situ) 하이브리드화를 포함한다. 분석물 단백질의 검출을 위한 시험관내 기술은 효소 연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 웨스턴(Western) 블롯, 면역 침전 및 면역 형광을 포함한다. 분석물 게놈 DNA를 검출하기 위한 시험관내 기술은 서던(Southern) 하이브리드화를 포함한다. 면역분석을 시행하는 과정은 예를 들면, "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassays", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; 그리고 "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985에서 기술된다. 더욱이, 분석물 단백질의 검출을 위한 생체내 기술은 라벨된 항-분석물 단백질 항체를 대상에 도입하는 것을 포함한다. 예를 들면, 상기 항체는 표준 이미징 기술에 의해 대상에서 존재와 위치가 검출될 수 있는 방사성 마커로 라벨될 수 있다.
CLEC2D 단백질 (또는 이의 단편)에 지향된 항체는 CLEC2D 단백질의 국소화 및/또는 정량화와 관련된 당분야에 공지된 방법에 이용될 수 있는데 (가령, 적절한 생리학적 시료 안에 CLEC2D 단백질의 수준을 측정하는 용도, 진단 방법에 사용, 단백질의 이미지화에 사용, 그리고 이와 유사한 용도). 주어진 구체예에서, CLEC2D 단백질, 또는 항체 유래된 항원 결합 도메인을 함유하는이의 유도체, 단편, 유사체 또는 동사체에 특이적인 항체는 약리학적으로 활성인 화합물 (이하 "치료제(therapeutics)"라 함)로서 이용된다.
명세서의 CLEC2D 단백질에 특이적인 항체는 면역친화력, 크로마토그래피 또는 면역침전과 같은 표준 기술에 의해 CLEC2D 폴리펩티드를 단리하는데 사용될 수 있다. CLEC2D 단백질 (또는 이의 단편)에 대한 항체는 예를 들어, 주어진 치료법의 효능을 결정하기 위한 임상 시험 절차의 일부로써, 조직 내 단백질 수준을 모니터하기 위해 진단학적으로 사용될 수 있다. 항체를 검출가능한 물질에 커플링 (가령, 물리적으로 연계)시킴으로써 검출은 용이하게 실행될 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보철(prosthetic) 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적절한 효소의 예로는 양고추냉이 과산화효소, 알칼리 포스포타제, β갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하며; 적절한 보철 그룹의 예로는 스트렙타아비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하고; 적절한 형광 물질의 예로는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레신(fluorescein) 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트이아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 피코에리틴을 포함하며; 발광 물질의 예로는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린, 그리고 에쿠오린(aequorin)을 포함하고, 그리고 적절한 방사능 활성 물질의 예로는 125I, 131I, 35S, 또는 3H를 포함한다.
병용 요법(Combination therapy)
본 명세서의 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항체들 및 조성물은 질환 치료를 위해 병용 요법의 일부분으로 투여된다.
예를 들면, 항-CLEC2D 항체들은 이종이식 연구 단독 및 체크 포인트 단일클론성 항체 (항-PDL1)와 함께 테스트되었다. 항-CLEC2D 및 항-PDL1을 사용한 병용 치료는 상당한 종양 성장 감소를 나타냈다. 따라서, 항-CLEC2D 항체는 치료 목적으로 다른 치료법과 함께 사용할 수 있다.
이러한 요법에는 T 세포 표적화된 면역조절 기전, 기타 면역조절 기전, 암 백신, 적응성 세포 치료법, 종양용해성 바이러스, 항체 단편의 이중특이성 및 기타 조합을 포함한 추가 항체 치료법, 방사선 치료, 항체 약물 콘쥬게이트, 작은 간섭 RNAs, 화학요법, 면역요법, 면역 체크포인트 억제제, 유사분열 억제제 또는 이들의 조합이 내포되지만, 이에 국한되지는 않는다.
본 명세서의 항-CLEC2D 항체 또는 조성물과 조합하여 투여될 수 있는 화학요법, 소분자 및 생물학적 제제에는 다음이 내포되나, 이에 국한되지 않는다: 호르몬 요법, PARP 억제제, 안드로겐 수용체 억제제, 티로신 키나제 억제제, 아비라테론 아세테이트(Abiraterone acetate), 엔잘루타미드(Enzalutamide), 아팔루타미드(Apalutamide), 다루루타미드(Darolutamide), 포스포이노시티드 3 키나제 베타-선택적 억제제, 라듐 223 이염화물 및 기타 변이체, 안드로겐 수용체 길항제, CYP17A1 억제제, LHRH 길항제, LHRH 유사체, 시클로포스파미드, 카바지탁셀, 도세탁셀(Docetaxel), PULP 백신 유사 시푸루셀(Sipuleucel)-T, 프로스트박(Prostvac), 프로반게(Provange), PSCA, 온전체 세포 백신 및 기타, PULP 표면 항원에 대항하는 치료제, 시스플라틴(Cisplatin), 이중특이적 항체-CD3 및 ADAM17, pTVG-HP 플라스미드 DNA 백신 및 기타 유사한 백신, 티소투맙 베도틴(Tisotumab Vedotin), DCVAC/PCa, GX301, GVAX-PCa 및 데노수맙(Denosumab).
본 명세서의 항-CLEC2D 항체 또는 조성물과 조합하여 투여될 수 있는 화학요법 약물 및 항암제화학요법 약물에는 다음이 내포되나, 이에 국한되지 않는다: 알킬화 작용제, 항대사물질, 식물 알칼로이드, 빈카 알칼로이드, 유사분열 억제제, 항종양 항생제, 백금-계 항-신생물제, 토포이소머라제 억제제 및 단백질 키나제 억제제. 예시적인 알킬화 작용제는 부설판, 사이클로포스파미드 및 테모졸로미드를 포함한다. 예시적인 항대사물질은 5-플루오로우라실 (5-FU), 6-메르캅토퓨린 (6-MP), 카페시타빈(셀로다(Xeloda)) 및 젬시타빈(Gemcitabine)을 포함합니다. 예시적인 항-종양 항생제는 닥티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비친 및 독소루비친을 포함한다. 예시적인 백금-계 한 항-신생물제는 시스플라틴 및 카르보플라틴을 포함한다. 예시적인 토포이소머라제 억제제는 에토포시드(Etoposide), 이리노테칸(Irinotecan) 및 토포테칸(Topotecan)을 포함한다. 예시적인 유사분열 억제제는 탁산 (가령, 파클리탁셀, 도세탁셀), 빈카 알칼로이드(빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈) 및 콜히친을 포함한다. 추가 화학요법제는 메토트렉세이트를 포함한다.
본 명세서의 항-CLEC2D 항체 또는 이를 포함하는 조성물과 조합하여 투여될 수 있는 치료요법적 작용제에는 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: 오르테로넬(Orteronel), 겔다나마이신(Geldanamycin), 카보잔티닙(Cabozantinib), 알파라딘(Alpharadin), 177Lu-J591, 미톡산트론(Mitoxantrone), 비아멧(Viamet), CFG920, 갈레테론(Galeteron), 올라파립(Olaparib), ADXS-PSA, 탁소테레(Taxotere), 고낙스(Gonax), 데카펩틸(Decapeptyl), 루프론(Lupron), 반타스(Vantas), 카소덱스(Casodex), 졸라덱스(Zoladex), 에리가르드(Eligard), 류플린(Leuplin), 피르마곤(Firmagon), 미토산트론, 엠시트(Emcyt), 란레오티드, 잘트랩(Zaltrap), 쿠스티르센 나트륨 및 스프리셀(Sprycel).
본 명세서의 항-CLEC2D 항체는 다음의 표적을 억제하거나 또는 조절하는 단일클론 항체 또는 이의 단편, 치료 생물학적 제제, 소분자 또는 화학 제제와 조합하여 사용될 수 있다: 분화 클러스터 19 (CD19), 예정된 세포 사멸 단백질 1 (PD1), 예정된 사멸-리간드 1 (PDL1), 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (Her2), 전사의 신호 변환자 및 활성자 3 (STAT3), 분화 클러스터 152 (CTLA4), 뉴욕 식도의 편평 세포 암종 1 (NYESO1), B-세포 성숙화 항원 (BCMA), 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO), 네오 항원, 콜로니 자극 인자 1 수용체 (CSF1R), B-림프구 표면 항원 B1 (CD20), 윌름 종양 단백질 (WT1), 분화 클러스터 47 (CD47), 무친(Mucin) 1, 세포 표면 연합된 (MUC1), TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 9 (4-1BB), 디시알로강글리오사이드 GD2, 아데노신 A2a 수용체 (ADORA2A), 인터페론-알파/베타 수용체 알파 쇄 (IFNAR1), Toll-유사 수용체 7 (TLR7), 분화 클러스터 40 (CD40), 메소텔린, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), 히스톤 탈아세틸라제 1 (HDAC1), 인터루킨-2 수용체 (IL2R), 텔로메라제 역 전사효소 (TERT), Toll-유사 수용체 (TLR), Siglec-3 (CD33), 림프구-활성화 유전자 3 (LAG3), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 구성원 4 (OX40), C-X-C 케모킨 수용체 유형 4 (CXCR4), 히스톤 탈아세틸라제 6 (HDAC6), 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 (EBV), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 수용체 (GMCSFR), Toll-유사 수용체 9 (TLR9), 인터루킨-3 수용체 (CD123), 인터페론 유전자의 자극자 (STING), Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T-세포 면역 수용체 (TIGIT), T-세포 면역글로불린 및 무친-도메인 함유-3 (TIM3), Toll-유사 수용체 4 (TLR4), 인간 파필로마바이러스 유전자 E6 (HPV-E6), 5'-뉴클레오티다제 (CD73), 암배 항원 관련된 세포 흡착 분자 5 (CEACAM5), 설바이빈(Survivin), 분화의 클러스터 3 (CD3), 원형 ADP 리보스 가수분해효소 (CD38), 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련된 단백질 (GITR), 인간 파필로마바이러스 E7 온코단백질 (HPVE7), 인터루킨 21 수용체 (IL21R), CD137), 분화 클러스터-22 (CD22), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 구성원 8 (CD30), 글리피칸-3 (GPC3), 베타 카테닌, fms-유사 티로신 키나제 3 (FLT3), 야누스 키나제 2 (JAK2), 상피 세포 흡착 분자 (EPCAM), 흑색종-연합된 항원 3 (MAGE-A3), Toll-유사 수용체 3 (TLR3), 인간 파필로마바이러스 (HPV), K-ras (KRAS), 수용체 티로신 키나제 유사 고아(Orphan) 수용체 1 (ROR1), 유비퀴틴 특이적 펩티다제 7 (USP7), 영양막 당단백질 (5T4), 인터루킨-2 수용체 알파 쇄 (CD25), 사이토메갈로바이러스 (CMV), C-X-C 모티프 케모킨 리간드 12 (CXCL12), 과립구 콜로니-자극 인자 수용체 (GCSFR), 킬러 세포 렉틴 유사 수용체 K1 (NKG2D), 전-멜라닌소체 단백질 (PMEL), 흑색종에서 선호적으로 발현된 항원 (PRAME), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제자 (VISTA), C-C 모티프 케모킨 수용체 4 (CCR4), 분화 클러스터 46 (CD46), 마크로파아지 자극 단백질 수용체 (CDw136), 시클로옥시게나제-2 (COX2), SLAM 패밀리 구성원 7 (CS1), C-X-C 모티프 케모킨 수용체 1 (CXCR1), 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII), p96, 글루코코르티코이드 수용체 (GR), 유도성 T-세포 공동자극제 (ICOS), 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF1), 인터루킨-5 수용체 (IL5R), 야누스 키나제 1 (JAK1), 전립선 특이적 항원 (PSA), 전사의 신호 변환자 및 활성자 5 (STAT5), 형질변환 성장 인자 베타 수용체 2 (TGFBR2), 맥관 내피 성장 인자 (VEGF), 역형성(Anaplastic) 림프종 키나제 (ALK), 알파-갈락토시다제 A (알파-gal), 분화 클러스터 276 (B7-H3), C-C 모티프 케모킨 수용체 1 (CCR1), C-C 케모킨 수용체 유형 2 (CCR2), CD27 분자 (CD27), 엑토뉴클레오시드 트리포스파te 디포스포하이드롤라제 1 (CD39), 암배 항원 (CEA), 겔락틴-3, 인터루킨 13 수용체 하위단위 알파 2 (IL13RA2), 인터루킨 6 (IL6), 인터루킨 6 수용체 (IL6R), 인터루킨 1 수용체 연합된 키나제 4 (IRAK4), MER 프로토-온코유전자, 티로신 키나제 (MERTK), 대식세포 이동 억제성 인자 (MIF), 단백질 멜란-A (MLANA), 프로스타글란딘 E 수용체 4 (PTGER4), 원위-없는 호메오박스(distal-less homeobox) 3 (TDO), 형질변환 성장 인자 베타 1 (TGFB, TGFB1), 톨(toll) 유사 수용체 2 (TLR2), 종양 괴사 인자 (TNF), ADORA2B, 알파 태아단백질 (AFP), 앙지오포에틴 1 (ANG1), BTLA, 프로미닌 1 (CD133), 신경 세포 흡착 분자 1 (CD56), CD70 분자 (CD70), 암배 항원 관련된 세포 흡착 분자 6 (CEACAM6), C-형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A), C-X-C 모티프 케모킨 수용체 2 (CXCR2), 섬유아세포 활성화 단백질 알파 (FAP), 히스톤 탈아세틸라제 (HDAC), 인터페론 알파 및 베타 수용체 하위단위 1 (IFNAR), 인터페론 감마 수용체 1 (IFNGR1), 인터루킨 17 수용체 A (IL17R), 야누스 키나제 (JAK), 무친 16, 세포 표면 연합된 (MUC16), 미토겐 활성화된 단백질 키나제 (P38), 종양 단백질 p53 (p53), DExD/H-box 헬리카제 68 (RIG1), RAR 관련된 고아 수용체 C (RORC), 신호 조절 단백질 알파 (SIRPA), 형질변환 성장 인자 베타 수용체 1 (TGFBR1), 도파크롬 타우토메라제 (TRP2), 아데노신 A3 수용체 (ADORA3), 브라츄리(Brachyury), C-C 모티프 케모킨 수용체 7 (CCR7), 신데칸(syndecan) 1 (CD138), L1 세포 흡착 분자 (CD171), 푸코실전이효소 3 (루이스 혈액 그룹) (CD174), IgG 수용체 IIa의 Fc 단편 (CD32), C-X3-C 모티프 케모킨 수용체 1 (CX3CR1), FPHA2, 엽산 수용체 1 (FOLR1), 베타-1,3-N-아세틸갈로토사아미닐전이효소 1 (글로보시드 혈액 그룹) (GloboH), 이소시아네이트 데하이드로게나제 (NADP(+)) 1, 시토졸 (IDH1), 인터루킨 2 수용체 하위단위 베타 (IL2rB), 야누스 키나제 3 (JAK3), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), RAS, 형질변환 성장 인자 베타 2 (TGFB2), 톨 유사 수용체 8 (TLR8), 산 포스파타제, 전립선 (ACPP), 디펩티딜 펩티다제 4 (ADABP), ADAM 메탈로펩티다제 도메인 17 (ADAM17), 안드로겐 수용체 (AR), ATRT, AXL 수용체 티로신 키나제 (AXL), V-세트 도메인 함유 T 세포 활성화 억제제 1 (B7-H4), CA19-9, 인테그린 하위단위 알파 M (CD11b), IgG 수용체 IIIa의 Fc 단편 (CD16), CD16a, CD200 분자 (CD200), CD28 분자 (CD28), CD52 분자 (CD52), CD7 분자 (CD7), CD80 분자 (CD80), 보체 C5a 수용체 1 (CD88), 카드헤린 3 (CDH3), CECAM1, 사이토크롬 c 산화효소 하위단위 II (COX2), CCCTC-결합 인자 유사 (CTCFL), C-X-C 모티프 케모킨 수용체 5 (CXCR5), 비전형 케모킨 수용체 3 (CXCR7), E1a, 가스트린, 그레이브(Graves) 질환, 민감성, X-연계된 (GD3), 겔락틴(Gelactin)-1, 콜로니 자극 인자 2 (GMCSF), HBV, HLA-A2, HLA-DR, 인간 파필로마바이러스 (HPV) E6/7, HPV L2, 인터페론 알파 및 베타 수용체 하위단위 2 (IFNAR2), 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체 (IGF1R), 인터루킨 12 (IL12), 인터루킨 1 베타 (IL1B), 인터루킨 7 수용체 (IL7R), C-X-C 모티프 케모킨 리간드 8 (IL8), 킬러 세포 면역글로불린 유사 수용체, 두 개 Ig 도메인과 긴 세포질 꼬리 1 (KIR2DL1), 킬러 세포 면역글로불린 유사 수용체, 두 개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 3 (KIR2DL3), LXR, CD244 분자 (2B4), 마게(Mage) 패밀리 구성원 A (MAGE-A), MAGE 패밀리 구성원 A1 (MAGE-A1), MAGE 패밀리 구성원 A4 (MAGE-A4), 자가사멸의 X-연계된 억제제 (MiHA), 킬러 세포 렉틴 유사 수용체 C1 (NKG2A), 천연 세포독성 촉발 수용체 1 (NKp46), 핵 수용체 하위패밀리 2 그룹 F 구성원 6 (NR2F6), PTTG1 상호작용 단백질 (PBF), 정자 흡착 분자 1 (SPAM1), 전사의 신호 변환자 및 활성자 1 (STAT1), 톨 유사 수용체 5 (TLR5), 페록시레독신 2 (TSA), 티로신 키나제 2 (TYK2), 키나제 삽입 도메인 수용체 (VEGFR2), 5' 뉴클레오티다제, ATP 결합 카세트 하위패밀리 B 구성원 5 (ABCB5), ADAM 메타로펩티다제 도메인 9 (ADAM9), 아데노신, ADP, 메타드헤린 (AEG1), 흑색종에 없는 2 (AIM2), 알파-락트알부민, 항-물레리안 호르몬 수용체 유형 2 (AMHR2), 앙지오포에틴 2 (ANG2), 혈관신생, 아스파르테이트 베타-히드록실라제 (ASPH), 자연 킬러 세포 세포독성 수용체 3 리간드 1 (B7-H6), TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 13C (BAFF-R), 폴리(ADP-리보스) 중합효소 패밀리 구성원 9 (Bal1), BRCA1 연합된 RING 도메인 1 (BARD1), BCL2 자가사멸 조절자 (BCL2), POU 클라스 2 연합 인자 1 (BOB-1), BTE6-lX-8b, BTE6-X-15-7, KIT 프로토-온코유전자, 수용체 티로신 키나제 (cKIT), 카르보닉 안하이드라제 9 (CA9), 탄수화물 항원, 카나비노이드 수용체 2 (CB2), Cbl 프로토-온코유전자 B (CBLB), C-C 모티프 케모킨 리간드 20 (CCL20), C-C 모티프 케모킨 리간드 3 (CCL3), 사이클린 B1 (CCNB1), C-C 모티프 케모킨 수용체 9 (CCR9), 알라닐 아미노펩티다제, 막 (CD13), 인터루킨 6 신호 변환자 (CD130), 바시긴 (Ok 혈액 그룹) (CD147), 폴리오바이러스 수용체 (CD155), CD160 분자 (CD160), 셀렉틴 P 리간드 (CD162), CD200 수용체 1 (CD200R1), 보체 C3d 수용체 2 (CD21), TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 13B (CD267), 인테그린 하위단위 베타 1 (CD29), CD3e 분자 (CD3E), CD4 분자 (CD4), CD44 분자 (인디언 혈액 그룹) (CD44), 인테그린 하위단위 알파 V (CD51), 세포간흡착 분자 1 (CD54), CD8a 분자 (CD8), CGEN-XXXX, 클라우딘 18, 클라우딘 6, MET 프로토-온코유전자, 수용체 티로신 키나제 (cMet), 코프로포피리노겐 산화효소 (COX), 프로스타글란딘-엔도퍼옥시드 합성효소 1 (COX-1), 사이토크롬 c 산화효소 하위단위 I (COX-1), CPEG4, 세레블론 (CRBN), 사이토킨 수용체 유사 인자 2 (CRLF2), 콜로니 자극 인자 1 (CSF1), 인산염 시티딜일전이효소 1, 콜린, 알파 (CTA), C-X-C 모티프 케모킨 리간드 1 (CXCL1), C-X-C 모티프 케모킨 수용체 3 (CXCR3), 데옥시시티딘 키나제 (DCK), dickkopf WNT 신호생성 경로 억제제 1 (DKK1), 델타 유사 정법 Notch 리간드 3 (DLL3), TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 10b (DR5), EBNA3C, 상피 성장 인자 (EGF), C-형 렉틴 도메인 함유 14A (EGFR5), 진핵세포성 해독 개시 인자 2 알파 키나제 3 (EIF2AK3), ELVAL4, EPH 수용체 A3 (EPHA3), 상피 성장 인자 수용체 경로 기질 8 (EPS8), ERG, IgM 수용체의 Fc 단편 (FAIM-3), 섬유아세포 성장 인자 2 (FGF2), fms 관련된 티로신 키나제 3 (FLT3), 피브로넥틴 1 (FN1), 엽산 수용체 1 (FOLR), 포크머리 상자 M1 (FOXM1), 낭포 자극 호르몬 수용체 (FSHR), Ga렉틴 3, N-아세틸갈락토사미닐전이효소 (GalNAc), 류신 풍부 반복체 함유 32 (GARP), GC 비타민 D 결합 단백질 (GC), 겔락틴(Gelactin) 9, 겔락틴1/3/9, GM2, 고나도트로틴 방출 호르몬 수용체 (GNRHR), 글루타밀 아미노펩티다제 (GP160), 골지 막 단백질 1 (GP73), 당단백질 A33 (gpA33), H3.3K27M, DEAD-상자 헬리카제 43 (HAGE), 히스톤 탈아세틸라제 2 (HDAC2), 히스톤 탈아세틸라제 8 (HDAC8), 헤마글루티딘, erb-b2 수용체 티로신 키나제 3 (HER3), 저산소증 유도성 지질 방울 연합된 (HILPDA), 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 4 (HMWMAA), HP59, HPV16, HPV11, 열 쇼크 단백질 패밀리 H (Hsp110) 구성원 1 (HSP105), 열 쇼크 단백질 패밀리 D (Hsp60) 구성원 1 (HSP65), 열 쇼크 단백질 패밀리 A (Hsp70) 구성원 4 (HSP70), TNF 수용체 수퍼패밀리 구성원 14 (HVEM), 히알루로난, 인돌아민 2,3-디옥시게나제 1(IDO1), 인터페론 감마 (IFNG), 인터페론 감마 수용체 1 (IFNGR), 인터페론 감마 수용체 2 (IFNGR2), 인슐린 유사 성장 인자 2 (IGF2), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 2(IGFBP2), IGK2, 인터루킨 10 (IL10), 인터루킨 10 수용체 하위단위 알파 (IL10RA), 인터루킨 12 수용체 하위단위 베타 1 (IL12RB1), 인터루킨 (IL13), 인터루킨 13 수용체 하위단위 알파 2 (IL13R), 인터루킨 13 수용체 하위단위 알파 1 (IL13RA1), 인터루킨 15 (IL15), 인터루킨 15 수용체 하위단위 알파 (IL15RA), 인터루킨 17A (IL17 IL17A), 인터루킨17B (IL17B), 인터루킨 1 수용체 유형 1 (IL1R1), 인터루킨 1 수용체 악세서리 단백질 (IL1R3), 인터루킨 21 수용체 (IL21R), 인터루킨 27 수용체 하위단위 알파 (IL27R), 인터루킨 2 수용체 하위단위 알파 (IL2RA), IL35, 인터루킨 9 수용체 (IL9R), 인테그린 베타 7, 인터루킨 1 수용체 연합된 키나제 1 (IRAK1), 인테그린 하위단위 베타 5 (ITGB5), 카파 골수종 항원, 키네신 패밀리 구성원 20A (KIF20A), 킬러 세포 면역글로불린 유사 수용체, 두개의 Ig 도메인 및 긴 세포질 꼬리 2 (KIR2DL2), 키뉴레닌(Kynurenine), 람다 골수종 항원, 리소좀 연합된 막 단백질 3 (LAMP), LLO, 핵 수용체 하위패밀리 1 그룹 H 구성원 3 (LXRA), 핵 수용체 하위패밀리 1 그룹 H 구성원 2 (LXRB), MAGEA10 MAGE 패밀리 구성원 A10 (MAGE-A10), MAGEA6 MAGE 패밀리 구성원 A6 (MAGE-A6), MAGEC2 MAGE 패밀리 구성원 C2 (MAGE-C2), 맘마글로빈 A, 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK), Mas 수용체, 헬리카제 C 도메인으로 유도된 인터페론 1 (MDA5), MG7, 주요 조직적합성 복합체 II (MHCII), MIC, MHC 클래스 I 폴리펩티드-관련된 서열 A (MICA), MHC 클래스 I 폴리펩티드-관련된 서열 (MICB), 매트릭스 메탈로펩티다제 11 (MMP-11), 운동섬모 정자 도메인 함유 2 (MOSPD2), 다중약물 저항성-연합된 단백질-1 (MRP1), MRP3765, muGNTP01, 주요 볼트(vault) 단백질 (MVP), MYB 프로토-온코유전자, 전사 인자 (MYB), MYB 프로토-온코유전자 유사 2 (MYBL2), 미엘로블라스틴, MYCN 프로토-온코유전자, bHLH 전사 인자 (N-myc), 활성화된 T 세포들의 핵 인자 (NFAT), NLR 패밀리 피린(pyrin) 도메인 함유 3 (NLRP3), 온코페탈 항원, 퓨린성 수용체 P2X 5 (P2RX5), p38 map 키나제, 포스포이노시티드-3-키나제 조절 하위단위 3 (P55), PAM4, 재생 패밀리 구성원 3 알파 (PAP), PAS 도메인 함유 억제자 1 (PASD1), 프로토카드헤린 18 (PCDH18), 예정된 세포 사멸 1 리간드 2 (PDL2), POTE 안키린 도메인 패밀리 구성원 D (POTE), 단백질 포스파타제 5 촉매성 하위단위 (PPT), 프로스타글란딘 E 수용체 2 (PTGER2), PVR 관련된 면역글로불린 도메인 함유 (PVRIG), RBL001, ras 동족체 패밀리 구성원 C (RhoC), 수용체 티로신 키나제 유사 고아 수용체 2 (ROR2), SEREX, SIM bHLH 전사 인자 2 (SIM2), 소마토스태틴 수용체 2 (SSTR2), SSX 패밀리 구성원 2 (SSX2), 스테롤 O-아실전이효소 1 (STAT), 진핵세포성 해독 연장 인자 1 알파 2 (STn), mRNA 캡 구아닌-N7 메틸l전이효소 (TAG72), TAMA, TASTD2, TD02, 전사 인자 Dp 패밀리 구성원 3 (TFDP3), 티미딜레이트 합성효소, DNA 토포이소메라제 I (TOP1), T 세포 수용체 베타 불변 1 (TRBC1), T 세포 수용체 베타 불변 2 (TRBC2), 트립토판, 흉선 자극 호르몬 수용체 (TSHR), TNF 수퍼패밀리 구성원 12 (TWEAK), 티로신, 림프구 항원 6 패밀리 구성원 K (URLC10), 레트로요소 침묵 인자 1 (UTA2-1), fms 관련된 티로신 키나제 1 (VEGFR1), V-세트 및 면역글로불린 도메인 함유 4 (VSIG-4), X 항원 패밀리, 구성원 1 (XAGE1), 조나 펠루시다(zona pellucida) 당단백질 3 (ZP3), STEAP 패밀리 구성원 1 (STEAP1), 또는 TNF 수퍼패밀리 구성원 11 (RANKL).
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는 면역 체크포인트 억제제와 복합하여 투여된다: CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, ICOS (CD278), PDL1, KIR, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244 (2B4), TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, VISTA, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, MT1, MT2, CD40, OX40, CD137, GITR, CD27, SHP-1, TIM-3, CEACAM-1, CEACAM-3, 또는 CEACAM-5. 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는 면역 체크포인트 억제제와 복합하여 투여된다. 예시적인 면역 체크포인트 유전자 및 치료요법적 표적에는 예정된 세포 사멸 1 (PD1), PD-L1, CLTA-4, T 세포 면역글로불린 및 무친 3 (TIM-3) 그리고 림프구 활성화 3 (LAG-3)이 내포된다. 일부 구체예들에서, 상기 면역 체크포인트 억제제는 PD1, PD-L1 (예정된 사멸-리간드 1), CLTA-4 또는 TIM3에 결합하고, 이를 억제시키는 치료요법적 항체다. 예시적인 PD1 억제제는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab) 및 세미플리맙(Cemiplimab)을 포함한다. 예시적인 PD-L1 억제제는 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab), 및 두르발루맙(Durvalumab)을 포함한다. 예시적인 CLTA-4 억제제는 이필리무맙(Ipilimumab)을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 키나제 억제제와 함께 투여되며, 이때 상기 키나제 억제제는 BCR-Abl, B-raf, BTK, CDK 패밀리, c-Met, EGFR 패밀리, JAK 패밀리, MEK ½, PDGFR 알파/베타, RET, Src 패밀리, 또는 VEGFR 패밀리 키나제를 억제한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 키나제 억제제는 작은 키나제 분자 억제제다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 키나제 억제제는 치료요법적 항체 또는 길항성 항체다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 키나제 억제제는 크리조티닙(Crizotinib), 세리티닙(Ceritinib), 알렉티닙(Alectinib), 브리가티닙(Brigatinib), 보수티닙(Bosutinib), 다사티닙(Dasatinib), 이마티닙(Imatinib), 니로티닙(Nilotinib), 포나티닙(Ponatinib), 베무라페닙(Vemurafenib), 다브라페닙(Dabrafenib), 이부루티닙(Ibrutinib), 팔보씨클립(Palbociclib), 소라페닙(Sorafenib), 리보씨클립(Ribociclib), 크리조티닙(Crizotinib), 카보잔티닙(Cabozantinib), 게피티닙(Gefitinib), 에르로티닙(Erlotinib), 라파티닙(Lapatinib), 반데타닙(Vandetanib), 아파티닙(Afatinib), 오시메르티닙(Osimertinib), 룩스올리티닙(Ruxolitinib), 토파씨티닙(Tofacitinib), 트라메티닙(Trametinib), 아시티닙(Axitinib), 게피티닙(Gefitinib), 이마티닙(Imatinib), 렌바티닙(Lenvatinib), 닌데다닙(Nintedanib), 파조파닙(Pazopanib), 레고라페닙(Regorafenib), 소라페닙(Sorafenib), 수니티닙(Sunitinib), 반데타닙(Vandetanib), 보수티닙(Bosutinib), 다사티닙(Dasatinib), 포나티닙(Ponatinib), 반데타닙(Vandetanib), 악시티닙(Axitinib), 렌바티닙(Lenvatinib), 닌테다닙(Nintedanib), 레고라페닙(Regorafenib), 파조파닙(Pazopanib), 소라페닙(Sorafenib), 수니티닙(Sunitinib), 또는 이의 조합이다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 항-CD20 항체와 복합하여 투여된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 가령, 류마티스 관절염 치료를 위해 항-CD20 항체, TNF-수용체 길항제, 항-TNF-α, 또는 이의 조합과 복합하여 투여된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 가령, 건선 치료를 위해 항-CD11a와 복합하여 투여된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 가령, 다발성 경화증 치료를 위해 IFN-γ와 복합하여 투여된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 궤양성 결장염 치료를 위해 TNF-α와 복합하여 투여된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 가령, 크론 질환 치료를 위해, 인플릭시맙(Infliximab) 또는 나탈리주맙(Natalizumab)과 복합하여 투여된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 면역 체크 포인트 유전자 산물 및/또는 암과 관련된 표적 항원의 임의의 조합에 대항하여 지향된 다중특이적 항체와 복합하여 투여된다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 면역 체크 포인트 유전자 산물 및/또는 암과 관련된 표적 항원의 임의의 조합에 대항하여 지향된 이중특이적 항체와 복합하여 투여된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 예정된 세포 사멸 1 (PD1), PD-L1, CLTA-4, T 세포 면역글로불린 및 무친 3 (TIM-3) 그리고 림프구 활성화 3 (LAG-3)으로 구성된 군에서 선택된 면역 체크 포인트 단백질에 대항하여 지향된 이중특이적 항체와 복합하여 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 면역 체크포인트 억제제는 PD1, PD-L1 (예정된 사멸-리간드 1), CLTA-4 또는 TIM3에 결합하고, 이를 억제시키는 치료요법적 항체다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 다음으로 구성된 군에서 선택된 종양 항원에 대항하여 지향된 이중특이적 항체와 복합하여 투여된다: B 세포 성숙화 항원 (BCMA); PSA (전립선-특이적 항원); 전립선특이적 막 항원 (PSMA); PSCA (전립선 줄기 세포 항원); 티로신-단백질 키나제 막경유 수용체 ROR1; 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP); 종양-연합된 당단백질 72 (TAG72); 암배 항원 (CEA); 상피 세포 흡착 분자 (EPCAM); 메소텔린; 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (ERBB2 (Her2/neu)); 프로스타제; 전립선 산 포스파타제 (PAP); 연장 인자 2 돌연변이체 (ELF2M); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-1R); gplOO; BCR-ABL (브레이크포인트 클러스터 영역-아벨손(Abelson)); 티소시나제; 뉴욕 식도의 편평 세포 암종 1 (NY-ESO-1); k-경쇄, LAGE (L 항원); MAGE (흑색종 항원); 흑색종-연합된 항원 1 (MAGE-A1); MAGE A3; MAGE A6; 레구마인; 인간 파필로마바이러스 (HPV) E6; HPVE7; 프로스테인; 설바이빈; PCTA1 (갈렉틴 8); 멜란-A/MART-1; Ras 돌연변이체; TRP-1 (티소시나제 관련된 단백질 1, 또는 gp75); 티소시나제-관련된 단백질 2 (TRP2); TRP-2/INT2 (TRP-2/인트론 2); RAGE (신장 항원); 진행된 당화반응 최종 산물의 수용체 1 (RAGEl); 신장 유비퀴토스 1, 2 (RU1, RU2); 장내 카르복실 아스테라제 (iCE); 열 쇼크 단백질 70-2 (HSP70-2) 돌연변이체; 흉선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); CD123; CD171; CD19; CD20; CD22; CD26; CD30; CD33; CD44v7/8 (분화 클러스터 44, 엑손 7/8); CD53; CD92; CD100; CD148; CD150; CD200; CD261; CD262; CD362; CS-1 (CD2 하위세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24); C-형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1); 강글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(ll)Cer); Tn 항원 (Tn Ag); Fms-유사 티로신 키나제 3 (FLT3); CD38; CD138; CD44v6; B7H3 (CD276); KIT (CD1 17); 인터루킨-13 수용체 하위단위 알파-2 (IL-13Ra2); 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-l lRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 2 1 (PRSS21); 맥관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래된 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); 무친 1, 세포 표면 연합된 (MUCl); 무친 16 (MUCl 6); 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII); 신경 세포 흡착 분자 (NCAM); 카르보닌 안하이드라제 IX (CAIX); 프로테아좀 (프로좀, 마그로페인) 하위단위, 베타 유형, 9 (LMP2); 에피린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 에피린(Ephrin) B2; 푸코실 GM1; 시알일 루이스 흡착 분자 (sLe); 강글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TGS5; 고-분자량-흑색종-연합된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드 (OAcGD2); 엽산 수용체 알파; 엽산 수용체 베타; 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련된 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); G 단백질 결합된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 6 1 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리 시알산; 태반 특이적1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 헥사사카라이드 부분(GloboH); 유선(mammary gland) 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); 간염 A 바이러스 세포성 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 판넥신 3 (PANX3); G 단백질-결합된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌(locus) K 9 (LY6K); 올팩토리 수용체 51E2 (OR51E2);TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름 종양 단백질 (WT1); 염색체 12p에 위치한ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A (XAGE1); 앙지오포에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); CT (암/고환 (항원)); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; p53; p53 돌연변이체; 인간 텔로메라제 역 전사효소 (hTERT); 육종 전좌 브레이크포인트; 자가사멸의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막경유 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N아세틸 글루코사미닐-전이효소 V (NA17); 쌍을 이룬 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; 사이클린 Dl; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 종양유전자 신경아세포종 유래된 동족체 (MYCN); Ras 동족체 패밀리 구성원 C (RhoC); 사이토크롬 P450 1B1 (CYP1B1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS); T 세포-1 또는 3에 의해 인지되는 편평 세포 암종 항원 (SARTl, SART3); 쌍을 이룬 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TES1); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 앵커 단백질 4 (AKAP-4); 윤활막 육종, X 브레이크포인트-1, -2, -3 또는 -4 (SSX1, SSX2, SSX3, SSX4); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-연합된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 하위패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C-형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 뼈 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈 함유 무친-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 마우스 이중 마이누트(double minute) 2 동족체 (MDM2); 리빈(livin); 알파페토단백질 (AFP); 막경유 활성자 및 CAML 상호작용자 (TACI); B-세포 활성화 인자 수용체 (BAFF-R); V-Ki-ras2 키르스텐 렛 육종 바이러스 종양유전자 동족체 (KRAS); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLL1); 707-AP (707 알라닌 프롤린); ART-4 (T4 세포들에 의해 인지되는 선암종 항원); BAGE (B 항원; b-카테닌/m, b카테닌/돌연변이된); CAMEL (흑색종 상에 CTL-인지된 항원); CAPl (암배 항원 펩티드 1); CASP-8 (카스파제-8); CDC27m (세포-분할 주기 27 돌연변이됨); CDK4/m (사이클린-의존적 키나제 4 돌연변이됨); Cyp-B (사이클로필린 B); DAM (분화 항원 흑색종); EGP-2 (상피 당단백질 2); EGP-40 (상피 당단백질 40); Erbb 2, 3, 4 (적혈모구 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체-2, -3, 4); FBP (엽산 결합 단백질);, fAchR (태아 아세틸콜린 수용체); G250 (당단백질 250); GAGE (G 항원); GnT-V (N아세틸글루코사미닐전이효소 V); HAGE (헬리코스 항원); ULA-A (인간 백혈구 항원-A); HST2 (인간 시그넷(signet) 종양 2); KIAA0205; KDR (키나제 삽입체 도메인 수용체); LDLR/FUT (저 밀도 지질 수용체/GDP L-푸코스: b-D-갈락토시다제 2-a-L 푸코실전이효소); LICAM (LI 세포 흡착 분자); MC1R (멜라노코르틴 1 수용체); 미오신/m (돌연변이된 미오신); MUM-1, -2, -3 (흑색종 산재된 돌연변이된1, 2, 3); NA88-A (환자의 NA cDNA 클론 M88); KG2D (자연 킬러 그룹 2, 구성원 D) 리간드; 온코페타 항원 (h5T4); pi 90 소수 bcr-abl (단백질 190KD bcr-abl); Pml/RARa (전-골수성 백혈병/레티논산 수용체 a); PRAME (흑색종의 선호적으로 발현된 항원); SAGE (육종 항원); TEL/AMLl (전좌 Ets-패밀리 백혈병/급성 골수성 백혈병 1); TPI/m (돌연변이된 트리오스포스페이트 이소메라제 인산염); CD70; 그리고 이들의 임의의 조합.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 다음이 내포된, 그러나 이에 국한되지 않는 약물 또는 치료요법적 작용제와 복합하여 투여된다: 미코페놀레이트, 아자티오프린(Azathioprine), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 피르페니돈(Pirfenidone), 닌데다닙(Nintedanib), 란소프라졸(Lansoprazole) (프레바시드 24HR), 오메프라졸(Omeprazole) (프릴로섹 OTC) 및 판토프라졸(Pantoprazole) (프로토닉스), 또는 이의 조합.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 다음이 내포된, 그러나 이에 국한되지 않 사이토킨 또는 케모킨과 복합하여 투여된다: 인터페론-γ (IFN-γ), 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), IL-8, 맥관 내피 성장 인자 (VEGF), 기질 세포-유래된 인자-1, 및 인터페론 감마-유도성 단백질-10 (IP-10), 케모킨 (CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, 및 CXCL8) 또는 이의 조합.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 조성물은 적응성 세포 요법과 복합하여 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 적응성 세포 요법은 자가유래요법이다 일부 구체예들에서, 상기 적응성 세포 요법은 동종(allogenic) 요법이다. 일부 구체예들에서, 상기 적응성 세포 요법은 면역 세포 이를 테면, T 세포 또는 NK 세포를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 적응성 세포 요법은 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR-T) 또는 CAR-NK 요법을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 CLEC2D 항체들 또는 조성물은 고형 종양과 연합된 표적 항원에 대항하여 지향된 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR-T)를 포함하는 적응성 세포 요법과 복합하여 투여된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 CLEC2D 항체들 또는 조성물은 다음의 암이 내포되나, 이에 국한되지 않은 암 연합된 표적 항원에 대항하여 지향된 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR-T)를 포함하는 적응성 세포 요법과 복합하여 투여된다:급성 림프모구성 백혈병, 미만성 거대 b세포 림프종, 여포성 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종 및 기타.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 CLEC2D 항체들 또는 조성물은 다음으로 구성된 군에서 선별된 종양 항원인 제 2 항원에 대항하여 지향된 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR-T)를 포함하는 적응성 세포 요법과 복합하여 투여된다: B 세포 성숙화 항원 (BCMA); PSA (전립선-특이적 항원); 전립선특이적 막 항원 (PSMA); PSCA (전립선 줄기 세포 항원); 티로신-단백질 키나제 막경유 수용체 ROR1; 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP); 종양-연합된 당단백질 72 (TAG72); 암배 항원 (CEA); 상피 세포 흡착 분자 (EPCAM); 메소텔린; 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (ERBB2 (Her2/neu)); 프로스타제; 전립선 산 포스파타제 (PAP); 연장 인자 2 돌연변이체 (ELF2M); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-1R); gplOO; BCR-ABL (브레이크포인트 클러스터 영역-아벨손(Abelson)); 티소시나제; 뉴욕 식도의 편평 세포 암종 1 (NY-ESO-1); k-경쇄, LAGE (L 항원); MAGE (흑색종 항원); 흑색종-연합된 항원 1 (MAGE-A1); MAGE A3; MAGE A6; 레구마인; 인간 파필로마바이러스 (HPV) E6; HPVE7; 프로스테인; 설바이빈; PCTA1 (갈렉틴 8); 멜란-A/MART-1; Ras 돌연변이체; TRP-1 (티소시나제 관련된 단백질 1, 또는 gp75); 티소시나제-관련된 단백질 2 (TRP2); TRP-2/INT2 (TRP-2/인트론 2); RAGE (신장 항원); 진행된 당화반응 최종 산물의 수용체 1 (RAGEl); 신장 유비퀴토스 1, 2 (RU1, RU2); 장내 카르복실 아스테라제 (iCE); 열 쇼크 단백질 70-2 (HSP70-2) 돌연변이체; 흉선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); CD123; CD171; CD19; CD20; CD22; CD26; CD30; CD33; CD44v7/8 (분화 클러스터 44, 엑손 7/8); CD53; CD92; CD100; CD148; CD150; CD200; CD261; CD262; CD362; CS-1 (CD2 하위세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24); C-형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1); 강글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(ll)Cer); Tn 항원 (Tn Ag); Fms-유사 티로신 키나제 3 (FLT3); CD38; CD138; CD44v6; B7H3 (CD276); KIT (CD1 17); 인터루킨-13 수용체 하위단위 알파-2 (IL-13Ra2); 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-l lRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 2 1 (PRSS21); 맥관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래된 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); 무친 1, 세포 표면 연합된 (MUCl); 무친 16 (MUCl 6); 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII); 신경 세포 흡착 분자 (NCAM); 카르보닌 안하이드라제 IX (CAIX); 프로테아좀 (프로좀, 마그로페인) 하위단위, 베타 유형, 9 (LMP2); 에피린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 에피린(Ephrin) B2; 푸코실 GM1; 시알일 루이스 흡착 분자 (sLe); 강글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TGS5; 고-분자량-흑색종-연합된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드 (OAcGD2); 엽산 수용체 알파; 엽산 수용체 베타; 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련된 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); G 단백질 결합된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 6 1 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리 시알산; 태반 특이적1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 헥사사카라이드 부분(GloboH); 유선(mammary gland) 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); 간염 A 바이러스 세포성 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 판넥신 3 (PANX3); G 단백질-결합된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌(locus) K 9 (LY6K); 올팩토리 수용체 51E2 (OR51E2);TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름 종양 단백질 (WT1); 염색체 12p에 위치한ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A (XAGE1); 앙지오포에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); CT (암/고환 (항원)); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; p53; p53 돌연변이체; 인간 텔로메라제 역 전사효소 (hTERT); 육종 전좌 브레이크포인트; 자가사멸의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막경유 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N아세틸 글루코사미닐-전이효소 V (NA17); 쌍을 이룬 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; 사이클린 Dl; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 종양유전자 신경아세포종 유래된 동족체 (MYCN); Ras 동족체 패밀리 구성원 C (RhoC); 사이토크롬 P450 1B1 (CYP1B1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS); T 세포-1 또는 3에 의해 인지되는 편평 세포 암종 항원 (SARTl, SART3); 쌍을 이룬 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TES1); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 앵커 단백질 4 (AKAP-4); 윤활막 육종, X 브레이크포인트-1, -2, -3 또는 -4 (SSX1, SSX2, SSX3, SSX4); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-연합된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 하위패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C-형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 뼈 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈 함유 무친-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 마우스 이중 마이누트(double minute) 2 동족체 (MDM2); 리빈(livin); 알파페토단백질 (AFP); 막경유 활성자 및 CAML 상호작용자 (TACI); B-세포 활성화 인자 수용체 (BAFF-R); V-Ki-ras2 키르스텐 렛 육종 바이러스 종양유전자 동족체 (KRAS); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLL1); 707-AP (707 알라닌 프롤린); ART-4 (T4 세포들에 의해 인지되는 선암종 항원); BAGE (B 항원; b-카테닌/m, b카테닌/돌연변이된); CAMEL (흑색종 상에 CTL-인지된 항원); CAPl (암배 항원 펩티드 1); CASP-8 (카스파제-8); CDC27m (세포-분할 주기 27 돌연변이됨); CDK4/m (사이클린-의존적 키나제 4 돌연변이됨); Cyp-B (사이클로필린 B); DAM (분화 항원 흑색종); EGP-2 (상피 당단백질 2); EGP-40 (상피 당단백질 40); Erbb 2, 3, 4 (적혈모구 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체-2, -3, 4); FBP (엽산 결합 단백질);, fAchR (태아 아세틸콜린 수용체); G250 (당단백질 250); GAGE (G 항원); GnT-V (N아세틸글루코사미닐전이효소 V); HAGE (헬리코스 항원); ULA-A (인간 백혈구 항원-A); HST2 (인간 시그넷(signet) 종양 2); KIAA0205; KDR (키나제 삽입체 도메인 수용체); LDLR/FUT (저 밀도 지질 수용체/GDP L-푸코스: b-D-갈락토시다제 2-a-L 푸코실전이효소); LICAM (LI 세포 흡착 분자); MC1R (멜라노코르틴 1 수용체); 미오신/m (돌연변이된 미오신); MUM-1, -2, -3 (흑색종 산재된 돌연변이된1, 2, 3); NA88-A (환자의 NA cDNA 클론 M88); KG2D (자연 킬러 그룹 2, 구성원 D) 리간드; 온코페타 항원 (h5T4); pi 90 소수 bcr-abl (단백질 190KD bcr-abl); Pml/RARa (전-골수성 백혈병/레티논산 수용체 a); PRAME (흑색종의 선호적으로 발현된 항원); SAGE (육종 항원); TEL/AMLl (전좌 Ets-패밀리 백혈병/급성 골수성 백혈병 1); TPI/m (돌연변이된 트리오스포스페이트 이소메라제 인산염); CD70; 그리고 이들의 임의의 조합.
본 명세서의 항-CLEC2D 항체를 이용하여 이중특이적 항체를 만들 수 있는데, 이때 상기 이중특이적 항체는 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 다음이 내포되나, 이에 국한되지 않은 면역 체크포인트 억제제다: CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, ICOS (CD278), PDL1, KIR, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244 (2B4), TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, VISTA, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, MT1, MT2, CD40, OX40, CD137, GITR, CD27, SHP-1, TIM-3, CEACAM-1, CEACAM-3, 또는 CEACAM-5. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며, 이때 상기 이중특이적 항체는 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 다음이 내포되나, 이에 국한되지 않은 면역 체크포인트 유전자 및 치료요법적 표적이다: 예정된 세포 사멸 1 (PD1), PD-L1, CLTA-4, T 세포 면역글로불린 및 무친 3 (TIM-3) 그리고 림프구 활성화 3 (LAG-3). 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며, 이때 상기 이중특이적 항체 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 다음이 내포되나, 이에 국한되지 않은 사이토킨 또는 케모킨과 연합된다: 인터페론-γ (IFN-γ), 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), IL-8, 맥관 내피 성장 인자 (VEGF), 기질 세포-유래된 인자-1, 그리고 인터페론 감마-유도성 단백질-10 (IP-10), 케모킨 (CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, 및 CXCL8) 또는 이의 조합.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며, 이때 상기 이중특이적 항체는 숙주 세포 표면 상에서 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며, 이때 상기 이중특이적 항체는 CLEC2D에 특이적으로 결합하는 가변 경쇄와 가변 중쇄의 제 1 쌍과 숙주 세포 표면 상에 있는 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 가변 경쇄와 가변 중쇄의 제 2 쌍을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며, 이때 상기 이중특이적 항체는 숙주 세포의 표면 상에 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 암 또는 종양 세포와 연합된 항원이다.
본원에 기술된 이중특이적 항체는 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 특이적 아이소형 가령, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 또는 이의 변이체를 제시하는 불변 영역을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 이중특이적 항체는 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 특이적 아이소형 가령, 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b 또는 IgG3 또는 이의 변이체를 제시하는 불변 영역을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 이중특이적 항체는 IgG1, IgG1N297A 및 IgG4의 아이소형 백본을 가질 수 있다. 본원에 기술된 이중특이적 항체는 삼-기능성 항체를 사용하는 이중특이성 항체 형식일 수 있으며, 화학적으로 연계된 Fab, scFv 또는 이황화 결합 Fvs에는 직렬 scFv(종종 이중특이성 T 세포 인게이저 또는 'BiTE'로 사용됨), 4가 IgG-scFv, 디아바디 및 기타 여러 포멧이 내포된다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 이중특이적 항체는 상이한 두개의 scFvs를 인코드하는 서열을 하나의 구조체에 복합시켜 만들어진 디아바디로 생성될 수 있는데, 이때 중쇄는 단일 폴리펩티드로 발현되고, 그 다음 대응하는 경쇄와 연결된다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며,이때 상기 이중특이적 항체는 숙주 세포의 표면 상에서 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 다음이 내포되나, 이에 국한되지 않은 암과 연합된 항원이다: 유방암, 전립선암, 자궁내막암, 방광암, 신장암, 식도암, 편평세포암, 포도막흑색종, 여포성 림프종, 신세포암종, 센드칼(cendcal) 암, 난소암, 폐암, 결장직장암, 뇌암, 췌장암, 두경부암, 간암, 백혈병, 림프종, 호지킨 질환, 다발성 골수종, 흑색종, 성상세포종, 위암, 폐선암종, 선암종, 세엽 세포 선암종, 부신피질 암종, 폐포 세포 암종, 역형성(anaplastic) 암종, 기저양 암종, 기저 세포 암종, 세기관지 암종, 기관지 암종, 신장 아디놀 암종, 배아 암종, 아노메트로이드 암종, 섬유층 간 세포 암종, 여포 암종, 거대 세포 암종, 간세포 암종, 표피내 암종, 상피내 암종, 렙토마니지오(leptomanigio) 암종, 수질 암종, 흑색 암종, 수막(menigual) 암종, 중피세포 암종, 귀리 세포 암종, 편평 세포 암종, 땀샘 암종, 이행 세포 암종, 세뇨관 세포 암종, 범랑아세포 육종, 혈관결석 육종, 포도상(botryoid) 육종, 자궁내막 간질 육종, 유잉(ewing)육종, 섬유속(fascicular) 육종, 거대 세포 육종, 과립구 육종, 면역모세포 육종, 주사코디얼(juxaccordial) 골원성 육종, 코피스(coppices) 육종, 백혈구육종 (백혈병), 림프육종 (림프 육종), 수질 육종, 골수 육종(과립구성 육종), 오스티오겐시(austiogenci) 육종, 골막성 육종, 세망 세포 육종 (조직구 림프종), 원형 세포 육종, 방추 세포 육종, 활막 육종, 모세혈관 확장성 청력 육종, 버킷 림프종, NPDL, NML, NH, 및 미만성 림프종.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며,이때 상기 이중특이적 항체는 숙주 세포 표면 상에서 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 다음으로 구성된 군에서 선택된 암 또는 종양 세포와 연합된 항원이다: 유방암, 전립선 암, 자궁내막 암, 방광 암, 신장 암, 식도의 암, 편평 세포 암종, 포도막 흑색종, 여포성 림프종, 신장 세포 암종, 센드칼(cendcal) 암, 난소 암, 폐 암, 직장결장 암, 뇌 암, 췌장 암, 두경부 암, 간암, 백혈병, 림프종, 호지킨 질환, 다수의 골수종, 흑색종, 성상세포종, 위암, 및 폐 선암종. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며,이때 상기 이중특이적 항체는 숙주 세포 표면 상에서 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 다음으로 구성된 군에서 선택된 종양 항원이다: B 세포 성숙화 항원 (BCMA); PSA (전립선-특이적 항원); 전립선특이적 막 항원 (PSMA); PSCA (전립선 줄기 세포 항원); 티로신-단백질 키나제 막경유 수용체 ROR1; 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP); 종양-연합된 당단백질 72 (TAG72); 암배 항원 (CEA); 상피 세포 흡착 분자 (EPCAM); 메소텔린; 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (ERBB2 (Her2/neu)); 프로스타제; 전립선 산 포스파타제 (PAP); 연장 인자 2 돌연변이체 (ELF2M); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-1R); gplOO; BCR-ABL (브레이크포인트 클러스터 영역-아벨손(Abelson)); 티소시나제; 뉴욕 식도의 편평 세포 암종 1 (NY-ESO-1); k-경쇄, LAGE (L 항원); MAGE (흑색종 항원); 흑색종-연합된 항원 1 (MAGE-A1); MAGE A3; MAGE A6; 레구마인; 인간 파필로마바이러스 (HPV) E6; HPVE7; 프로스테인; 설바이빈; PCTA1 (갈렉틴 8); 멜란-A/MART-1; Ras 돌연변이체; TRP-1 (티소시나제 관련된 단백질 1, 또는 gp75); 티소시나제-관련된 단백질 2 (TRP2); TRP-2/INT2 (TRP-2/인트론 2); RAGE (신장 항원); 진행된 당화반응 최종 산물의 수용체 1 (RAGEl); 신장 유비퀴토스 1, 2 (RU1, RU2); 장내 카르복실 아스테라제 (iCE); 열 쇼크 단백질 70-2 (HSP70-2) 돌연변이체; 흉선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); CD123; CD171; CD19; CD20; CD22; CD26; CD30; CD33; CD44v7/8 (분화 클러스터 44, 엑손 7/8); CD53; CD92; CD100; CD148; CD150; CD200; CD261; CD262; CD362; CS-1 (CD2 하위세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24); C-형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1); 강글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(ll)Cer); Tn 항원 (Tn Ag); Fms-유사 티로신 키나제 3 (FLT3); CD38; CD138; CD44v6; B7H3 (CD276); KIT (CD1 17); 인터루킨-13 수용체 하위단위 알파-2 (IL-13Ra2); 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-l lRa); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 2 1 (PRSS21); 맥관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판 유래된 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); 무친 1, 세포 표면 연합된 (MUCl); 무친 16 (MUCl 6); 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII); 신경 세포 흡착 분자 (NCAM); 카르보닌 안하이드라제 IX (CAIX); 프로테아좀 (프로좀, 마그로페인) 하위단위, 베타 유형, 9 (LMP2); 에피린 유형-A 수용체 2 (EphA2); 에피린(Ephrin) B2; 푸코실 GM1; 시알일 루이스 흡착 분자 (sLe); 강글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer); TGS5; 고-분자량-흑색종-연합된 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드 (OAcGD2); 엽산 수용체 알파; 엽산 수용체 베타; 종양 내피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 내피 마커 7-관련된 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); G 단백질 결합된 수용체 클래스 C 그룹 5, 구성원 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 6 1 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리 시알산; 태반 특이적1 (PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 헥사사카라이드 부분(GloboH); 유선(mammary gland) 분화 항원 (NY-BR-1); 유로플라킨 2 (UPK2); 간염 A 바이러스 세포성 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 판넥신 3 (PANX3); G 단백질-결합된 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 좌(locus) K 9 (LY6K); 올팩토리 수용체 51E2 (OR51E2);TCR 감마 대체 리딩 프레임 단백질 (TARP); 윌름 종양 단백질 (WT1); 염색체 12p에 위치한ETS 전좌-변이체 유전자 6 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 구성원 1A (XAGE1); 앙지오포에틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); CT (암/고환 (항원)); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련된 항원 1; p53; p53 돌연변이체; 인간 텔로메라제 역 전사효소 (hTERT); 육종 전좌 브레이크포인트; 자가사멸의 흑색종 억제제 (ML-IAP); ERG (막경유 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N아세틸 글루코사미닐-전이효소 V (NA17); 쌍을 이룬 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 Bl; 사이클린 Dl; v-myc 조류 골수세포증 바이러스 종양유전자 신경아세포종 유래된 동족체 (MYCN); Ras 동족체 패밀리 구성원 C (RhoC); 사이토크롬 P450 1B1 (CYP1B1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS); T 세포-1 또는 3에 의해 인지되는 편평 세포 암종 항원 (SARTl, SART3); 쌍을 이룬 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TES1); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 앵커 단백질 4 (AKAP-4); 윤활막 육종, X 브레이크포인트-1, -2, -3 또는 -4 (SSX1, SSX2, SSX3, SSX4); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-연합된 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 하위패밀리 A 구성원 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 구성원 f (CD300LF); C-형 렉틴 도메인 패밀리 12 구성원 A (CLEC12A); 뼈 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈 함유 무친-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 마우스 이중 마이누트(double minute) 2 동족체 (MDM2); 리빈(livin); 알파페토단백질 (AFP); 막경유 활성자 및 CAML 상호작용자 (TACI); B-세포 활성화 인자 수용체 (BAFF-R); V-Ki-ras2 키르스텐 렛 육종 바이러스 종양유전자 동족체 (KRAS); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLL1); 707-AP (707 알라닌 프롤린); ART-4 (T4 세포들에 의해 인지되는 선암종 항원); BAGE (B 항원; b-카테닌/m, b카테닌/돌연변이된); CAMEL (흑색종 상에 CTL-인지된 항원); CAPl (암배 항원 펩티드 1); CASP-8 (카스파제-8); CDC27m (세포-분할 주기 27 돌연변이됨); CDK4/m (사이클린-의존적 키나제 4 돌연변이됨); Cyp-B (사이클로필린 B); DAM (분화 항원 흑색종); EGP-2 (상피 당단백질 2); EGP-40 (상피 당단백질 40); Erbb 2, 3, 4 (적혈모구 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체-2, -3, 4); FBP (엽산 결합 단백질);, fAchR (태아 아세틸콜린 수용체); G250 (당단백질 250); GAGE (G 항원); GnT-V (N아세틸글루코사미닐전이효소 V); HAGE (헬리코스 항원); ULA-A (인간 백혈구 항원-A); HST2 (인간 시그넷(signet) 종양 2); KIAA0205; KDR (키나제 삽입체 도메인 수용체); LDLR/FUT (저 밀도 지질 수용체/GDP L-푸코스: b-D-갈락토시다제 2-a-L 푸코실전이효소); LICAM (LI 세포 흡착 분자); MC1R (멜라노코르틴 1 수용체); 미오신/m (돌연변이된 미오신); MUM-1, -2, -3 (흑색종 산재된 돌연변이된1, 2, 3); NA88-A (환자의 NA cDNA 클론 M88); KG2D (자연 킬러 그룹 2, 구성원 D) 리간드; 온코페타 항원 (h5T4); pi 90 소수 bcr-abl (단백질 190KD bcr-abl); Pml/RARa (전-골수성 백혈병/레티논산 수용체 a); PRAME (흑색종의 선호적으로 발현된 항원); SAGE (육종 항원); TEL/AMLl (전좌 Ets-패밀리 백혈병/급성 골수성 백혈병 1); TPI/m (돌연변이된 트리오스포스페이트 이소메라제 인산염); CD70; 또는 이의 조합.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며, 이때 상기 이중특이적 항체 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 감염성 작용제 또는 병원체와 연합된 항원이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며, 이때 상기 이중특이적 항체 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 미생물과 연합된 항원이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며, 이때 상기 이중특이적 항체 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 박테리아, 곰팡이, 원생동물, 기생충 및 바이러스가 내포되나, 이에 국한되지 않은 미생물과 연합된 항원이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며, 이때 상기 이중특이적 항체 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 병원성 박테리아, 곰팡이, 원생동물, 기생충 및 바이러스가 내포되나, 이에 국한되지 않은 미생물과 연합된 항원이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며, 이때 상기 이중특이적 항체 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 세포내 박테리아가 내포되나, 이에 국한되지 않은 미생물과 연합된 항원이다. 일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며, 이때 상기 이중특이적 항체 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 병원성 박테리아, 곰팡이, 원생동물, 기생충 및 바이러스가 내포되나, 이에 국한되지 않은 미생물에 감염된 숙주 세포에서 특이적으로 발현되는 항원이다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며, 이때 상기 이중특이적 항체 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 혈청음성 척추관절병증, 결합 조직 질환, 염증성 장 질환, 관절염, 염증성 피부 상태, 염증성 폐 질환, 염증성 신장 질환, 전신 맥관염, 대식세포 활성화 질환, 류마티스성 다발성 근육통, 원발성 담도 경화증, 경화성 담관염, 자가면역 간염, 제1형 당뇨병, 하시모토(Hashimoto) 갑상선염, 그레이브스(Graves) 질환, 다발성 경화증(MS), 길랭-바레(Guillain-Barre) 증후군, 애디슨(Addison) 질환, 레이노(Raynaud) 증후군 및 굿포스튜(Goodpasture) 증후군이 내포되나, 이에 국한되지 않는 염증성 또는 자가면역 장애와 연합된 항원이다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며, 이때 상기 이중특이적 항체 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 결합 조직 질환 이를 테면, 소아 류마티스 관절염, 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스(SLE) 및 루푸스 신염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 혼합 결합 조직 질환 및 다발성 근염, 피부근염과 연합된 항원이다.
일부 구체예들에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들은 이중특이적 항체이며, 이때 상기 이중특이적 항체 CLEC2D 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하며, 이때 상기 제 2 항원은 휘플스 질환과 관련된 항원, 육아종성 회장염과 관련된 관절염, 염증성 피부 상태 이를 테면, 자가면역 수포성 천포창, 자가면역 심상성 천포창, 습진 및 피부염, 폐포염과 같은 염증성 폐질환, 폐섬유증, 유육종증, 천식, 폐쇄성 기관지염 및 폐쇄성 세기관지염, 사구체 신염과 같은 염증성 신장 질환, 신장 동종 이식 거부 및 신장 세뇨관 염증, 죽상동맥경화증, 측두동맥염/거대세포동맥염 등의 전신혈관염, 다카야수(takayasu) 동맥염, 결절다발동맥염, 가와사키(Kawasaki) 질환, 베게너(Wegener) 육아종증, 처그 슈트라우스(churg strauss) 증후군, 현미경적 다발혈관염, 괴사성 사구체신염, 헤녹 쇤라인(henoch schonlein) 자반병, 본태성 한랭글로불린혈증성 혈관염, 기타 소혈관성 혈관염 및 베체트(Behcets) 질환, 대식세포 활성화 질환 이를 테면, 대식세포 활성화 증후군 (MAS), 성인 발병 스틸(stills) 질환, 혈구탐식 증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 원발성 담도 경화증, 경화성 담관염, 자가면역 간염, 제1형 당뇨병, 하시모토(Hashimoto) 갑상선염, 그레이브스(Graves) 질환, 다발성 경화증(MS), 길랭-바레(Guillain-Barre) 증후군, 애디슨(Addison) 질환, 레이노(Raynaud) 증후군 및 굿포스튜(Goodpasture) 증후군과 연합된 항원이다.
본 발명 이중특이적 항체들은 당분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 만들고, 이를 테면, 비-제한적 예로써, 가교된 단편들, 쿼드로마(quadromas), 및/또는 임의의 다양한 재조합 포멧 이를 테면, 비-제한적 예로써, 연계된 항체 단편들, 강압된 이종이량체, 및 단일 도메인 기반의 재조합 포멧을 이용하여 만든다. 이중특이적 포멧의 예시에는 다음이 내포되나, 이에 국한되지 않는다: Fab 부문(arm) 교환을 기반으로 한 이중특이적 IgG (Gramer et al., 2013 MAbs. 5(6)); CrossMab 포멧 (Klein C et al., 2012 MAbs 4(6)); 강제된 이종이량체화 방법 이를 테면, SEED 기술 (Davis JH et al., 2010 Protein Eng Des Sel. 23(4):195-202), 정전기적 스티어링(electrostatic steering) (Gunasekaran K et al., J Biol Chem. 2010 285(25):19637-46.) 또는 노브-인투-홀(knob-into-hole) (Ridgway JB et al., Protein Eng. 1996 9(7):617-21.)를 기반으로 하는 다수의 포멧 또는 동종이량체 형성을 방해하는 다른 돌연변이 세트 (Von Kreudenstein TS et al., 2013 MAbs. 5(5):646-54.); 단편 기반으로 한 이중특이적 포멧 이를 테면, 탠덤 scFv (이를 테면,BiTEs) (Wolf E et al., 2005 Drug Discov. Today 10(18):1237-44.); 이중특이적 사가(tetravalent) 항체들 (
Figure pct00083
LM et al., 2012 Cancer Immunol Immunother. 61(10):1869-75.); 듀얼 친화력 재표적화 분자들 (Moore PA et al., 2011 Blood.117(17):4542-51), 디아바디 (Kontermann RE et al., Nat Biotechnol. 1997 15(7):629-31).
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들과 조성물 그리고 추가 치료요법적 작용제(들)은 질환의 징후 또는 증상을 치료하기 위해 부가적으로 작용한다.
일부 구체예들에서, 상기 항-CLEC2D 항체들과 조성물 그리고 추가 치료요법적 작용제(들)은 질환의 징후 또는 증상을 치료하기 위해 공조적으로 작용한다.
일부 구체예들에서, 추가 치료요법적 작용제와 항-CLEC2D 항체 및 조성물의 조합은 질환 또는 장애의 하나 또는 그 이상의 증상 감소의 증가, 해당 치료에서 하나 또는 그 이상의 부작용의 감소, 또는 항-CLEC2D 항체 또는 조성물 또는 추가 치료요법적 작용제의 치료요법적 유효한 투여량의 감소를 비롯한 질병 또는 장애의 치료에서 우수한 효능을 유도한다.
상기 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들이 콘쥬게이트되어 또다른 치료요법적 양태(modality)가 될 수 있다. 상기 콘쥬게이션으로 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 표적, 이를 테면, 표적 세포에 근접하도록 하여, 표적 특이성을 개선시키고, 해당 표적에 콘쥬게이트의 전반적인 결합 친화력을 증가시키고, 및/또는 해당 표적을 향한 NK 세포의 세포독성을 강화시켜, 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들의 치료요법적 효능 및/또는 특이성을 증가시킨다. 또 다른 치료 양태는 본원에 기재된 임의의 추가 치료요법적 작용제일 수 있다. 항체 콘쥬게이트를 만드는 방법은 당분야에 공지되어 있는데, 예를 들면, 단백질-커플링 작용제 이를 테면, N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이가기능성 유도체(이를 테면, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (이를 테면, 디숙시니미딜 수베레이트), 알데히드(이를 테면, 글루타알데히드), 비스-아지도 화합물(이를 테면, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조니움 유도체 (이를 테면, 비스-(p-디아조니움벤조일)에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (이를 테면, 토일렌 2,6-디이소시아네이트), 그리고 비스-활성 플로린 화합물 (이를 테면, 1,5-디플루오르-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 만든다. 커플링은 항체와 다른 부분이 각각의 활성을 유지하는 한, 두 분자를 결합하는 임의의 화학 반응에 의해 달성될 수 있다. 이 연계(linkage)는 예로써, 공유 결합, 친화력 결합, 개재(intercalation), 좌표 결합 및 복합화와 같은 많은 화학적 기전을 포함할 수 있다. 그러나, 바람직한 결합은 공유 결합이다. 공유 결합은 기존 측쇄의 직접 응축에 의해, 또는 외부 가교 결합 분자에 의해 달성될 수 있다. 많은 이가(bivalent) 또는 다가(polyvalent) 연계 물질은 본 발명의 항체와 같은 단백질 분자를 다른 분자에 커플링시키는데 유용하다. 예를 들면, 대표적인 커플링제는 티오에스테르, 카보디이미드, 숙시니미드 에스테르, 디이소시아네이트, 글루타르알데히드, 디아조 벤젠 및 헥사메틸렌 디아민과 같은 유기 화합물을 포함할 수 있다. 이 목록은 당업계에 공지된 다양한 종류의 커플링제를 하나도 빠짐없이 기록한 것이 아니라, 보다 일반적인 커플링제의 예시다. (Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); 그리고 Vitetta et al., Science 238:1098 (1987) 참조).
본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들은 이중-특이적 항체를 만드는데 또한 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서의 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 본원에서 기술하는 추가 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들과 복합시켜 이중-특이적 항체를 만들 수 있다. 이중특이적 항체들을 만드는 방법은 당업계에 알려져 있다.
최적의 원하는 반응 (예를 들어, 치료요법적 반응) 또는 최소 부작용을 제공하기 위해 투여량 섭생을 조정된다. 예를 들면, 항-CLEC2D 항체 투여를 위해, 용량은 약 0.0001 내지 약 1000 mg/kg 범위일 수 있다. 예를 들면, 용량은 체중 당 적어도 0.1, 적어도 0.3, 적어도 1, 적어도 3, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20 또는 적어도 25 mg/kg이다. 투여 일정은 일반적으로 항체의 전형적인 약동학적 특성을 기반으로 수용체 점유를 지속시키는 노출을 달성하도록 설계된다. 예시적인 치료 체계는 주당 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 월 1회, 3개월마다 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다. 용량과 일정은 치료 과정에서 변경될 수 있다. 예를 들면, 투여 일정은 상기 항체를 투여하는 것을 포함할 수 있다: (i) 6-주 주기로 매 2주마다; (ii) 6회 용량의 경우 매 4주마다, 그 다음에는 매 3개월 마다; (iii) 매 3주 마다; (iv) 초기에 고용량을 투여한 후, 주기적으로 더 낮은 유지 투여량을 투여. 단일 용량 사이의 간격은 예를 들어, 매주, 2주마다, 3주마다, 매월, 3개월마다 또는 매년 간격일 수 있다. 간격은 또한 환자의 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정하여 나타나는 것에 따라 불규칙할 수 있다. 일부 방법에서, 용량은 항체의 원하는 혈장 농도를 달성하도록 조정된다.
일부 구체예들에서, Ab는 지속 방출 제형으로 투여될 수 있으며, 이 경우 빈도가 줄어든 투여가 요구된다. 용량 및 빈도는 환자에서 항체 반감기에 따라 가변적이다. 일반적으로, 인간 항체는 반감기가 가장 길며, 그 다음 인간화 항체, 키메라 항체, 비-인간항체 순이다. 용량 및 투여 빈도는 치료가 예방적 또는 치료적인 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서, 비교적 낮은 용량은 일반적으로 장기간에 걸쳐 비교적 덜 빈번한 간격으로 투여된다. 일부 환자는 평생 동안 계속 치료를 받는다. 치료요법적 적용에서, 질병의 진행이 감소되거나 또는 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질병의 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 보일 때까지 비교적 짧은 간격으로 비교적 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 해당 환자는 예방 요법을 투여받을 수 있다.
본 명세서의 약제학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서도, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 양의 활성 성분을 얻도록 변화시킬 수 있다. 선택된 용량 수준은 이용되는 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용된 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적인 건강 및 이전의 병력, 및 의학 분야에서 잘 알려진 인자들이 포함된, 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 조성물은 당업계에 잘 알려진 다양한 방법 중 하나 또는 그 이상을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다.
진단 및 예후
본 명세서는 질환 치료를 요하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: 해당 대상체내 CLEC2D 단백질의 수준을 결정하고; 그리고 치료요법적 효과량의 CLEC2D 항체를 해당 대상체에게 투여한다. 한 구체예에서, CLEC2D 단백질의 수준은 대상체의 세포에서 CLEC2D 발현 수준을 측정함으로써 결정된다. 한 구체예에서, 상기 세포는 암 세포 (가령, 본원에서 기술된 암에서 유래된 세포)이다.
본 명세서는 질환 치료를 요하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: 상기 대상체로부터 샘플을 획득하고; 해당 샘플 안에 CLEC2D 단백질의 수준을 결정하고; 만약 샘플 안에 있는 CLEC2D 단백질 수준이 대조군 샘플 안에 있는 CLEC2D 단백질 수준보다 더 높다면, 치료요법적 효과량의 CLEC2D 항체를 해당 대상체에게 투여한다. 한 구체예에서, 상기 샘플은 상기 대상체로부터 얻은 세포다. 한 구체예에서, 상기 세포는 병이 있는 조직 또는 장기로부터 얻는다. 한 구체예에서, 상기 세포는 암 세포 (가령, 본원에서 기술된 암에서 유래된 세포)이다. 한 구체예에서, 상기 대조군 샘플은 해당 대상체의 질환이 없는 조직 또는 장기로부터 얻는다. 한 구체예에서, 상기 대조군 샘플은 해당 질환이 없는 대상체로부터 얻는다.
본 명세서는 질환 치료를 요하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: 상기 대상체로부터 제 1 샘플을 얻고; 제 1 샘플 안에CLEC2D 단백질의 제 1 수준을 결정하고; 치료요법적 효과량의 CLEC2D 항체를 해당 대상체에게 투여하고; 해당 대상체로부터 제 2 샘플을 얻고; 상기 제 2 샘플 안에 CLEC2D 단백질의 제 2 수준을 결정하고; 상기 제 2 수준과 제 1 수준을 비교하여; 만일 제 1 수준이 제 2 수준 보다 더 높다면, 치료요법적 효과량의 CLEC2D 항체를 해당 대상체에게 투여를 지속한다. 한 구체예에서, 상기 샘플은 상기 대상체로부터 얻은 세포다. 한 구체예에서, 상기 세포는 병이 있는 조직 또는 장기로부터 얻는다. 한 구체예에서, 상기 세포는 암 세포 (가령, 본원에서 기술된 암에서 유래된 세포)이다. 한 구체예에서, 상기 대조군 샘플은 해당 대상체의 질환이 없는 조직 또는 장기로부터 얻는다. 한 구체예에서, 상기 대조군 샘플은 해당 질환이 없는 대상체로부터 얻는다.
본 명세서는 질환 치료를 요하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: 상기 대상체로부터 제 1 샘플을 얻고; 제 1 샘플 안에CLEC2D 단백질의 제 1 수준을 결정하고; 치료요법적 제 1 효과량의 CLEC2D 항체를 해당 대상체에게 투여하고; 해당 대상체로부터 제 2 샘플을 얻고; 상기 제 2 샘플 안에 CLEC2D 단백질의 제 2 수준을 결정하고; 상기 제 2 수준과 제 1 수준을 비교하여; 만일 제 1 수준이 제 2 수준 보다 더 낮다면, 치료요법적 제 2 효과량의 CLEC2D 항체를 해당 대상체에게 투여하고. 이때 상기 제 2 치료요법적 효과량은 제 1 치료요법적 효과량보다 더 크다. 한 구체예에서, 상기 샘플은 상기 대상체로부터 얻은 세포다. 한 구체예에서, 상기 세포는 병이 있는 조직 또는 장기로부터 얻는다. 한 구체예에서, 상기 세포는 암 세포 (가령, 본원에서 기술된 암에서 유래된 세포)이다. 한 구체예에서, 상기 대조군 샘플은 해당 대상체의 질환이 없는 조직 또는 장기로부터 얻는다. 한 구체예에서, 상기 대조군 샘플은 해당 질환이 없는 대상체로부터 얻는다.
본 명세서는 질환 치료를 요하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: 상기 대상체로부터 제 1 샘플을 얻고; 제 1 샘플 안에CLEC2D 단백질의 제 1 수준을 결정하고; 치료요법적 효과량의 CLEC2D 항체를 해당 대상체에게 투여하고; 해당 대상체로부터 제 2 샘플을 얻고; 상기 제 2 샘플 안에 CLEC2D 단백질의 제 2 수준을 결정하고; 상기 제 2 수준과 제 1 수준을 비교하여; 만일 제 1 수준이 제 2 수준 보다 더 낮다면, 해당 대상체에게 CLEC2D 항체 투여를 중단한다. 한 구체예에서, 상기 샘플은 상기 대상체로부터 얻은 세포다. 한 구체예에서, 상기 세포는 병이 있는 조직 또는 장기로부터 얻는다. 한 구체예에서, 상기 세포는 암 세포 (가령, 본원에서 기술된 암에서 유래된 세포)이다. 한 구체예에서, 상기 대조군 샘플은 해당 대상체의 질환이 없는 조직 또는 장기로부터 얻는다. 한 구체예에서, 상기 대조군 샘플은 해당 질환이 없는 대상체로부터 얻는다.
단리된, 신규한 항체 클론은 질환의 단계와 공격성을 결정하고, 해당 질환의 적절한 치료에 사용할 수 있다.
본 명세서는 질환 및 장애의 진단 및 예후에 사용을 위해 항-CLEC2D 항체들과 이의 항체 단편들, 상기 항체들 또는 이의 항원 결합 단편들을 인코딩하는 핵산, 또는 동일한 것을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구체예들에서, 단리된 단일클론성 항체들은 다양한 종양 세포 표면에서 CLEC2D의 차등적 발현을 나타내고, 이것은 CLEC2D가 다양한 질병 상태의 진단을 위한 새로운 바이오마커임을 나타낸다. 더욱이 CLEC2D 항원은 다양한 종양에서 상당히 과다발현되어, 이것은 질환 진단을 위한 새로운 분자 마커로서 이 표적 분자의 유용성을 나타낸다. 더욱이, CLEC2D의 발현 수준은 다양한 유도 작용제의 영향 하에 유의적으로 증가한다. 유도된 종양 세포에서 CLEC2D 항원의 차등 발현은 질환, 질환 진행, 전이 등의 다양한 단계와 상관관계가 있다. 따라서 CLEC2D는 예후 바이오마커의 엄청난 잠재력을 가지고 있다. 일부 구체예들에서, 예를 들어, 대상체의 암 세포에서 CLEC2D 단백질 발현의 증가는 CLEC2D 단백질 발현이 증가하지 않은 경우보다 불량한 예후 결과와 관련이 있다.
본원에 상세히 기재된 바와 같이, 단리된 단일클론성 항체는 종양 세포주 상에서 CLEC2D 표면 발현을 모니터링하기 위해 사용된다.
항-CLEC2D 항체를 사용하여 다음 질환들이 내포되나, 이에 국한되지 않는 질환을 진단하고 예측할 수 있다: 유방암, 전립선암, 자궁내막암, 방광암, 신장암, 식도암, 편평세포암, 포도막흑색종, 여포성 림프종, 신세포암종, 센드칼(cendcal) 암, 난소암, 폐암, 결장직장암, 뇌암, 췌장암, 두경부암, 간암, 백혈병, 림프종, 호지킨 질환, 다발성 골수종, 흑색종, 성상세포종, 위암, 폐선암종, 선암종, 세엽 세포 선암종, 부신피질 암종, 폐포 세포 암종, 역형성(anaplastic) 암종, 기저양 암종, 기저 세포 암종, 세기관지 암종, 기관지 암종, 신장 아디놀 암종, 배아 암종, 아노메트로이드 암종, 섬유층 간 세포 암종, 여포 암종, 거대 세포 암종, 간세포 암종, 표피내 암종, 상피내 암종, 렙토마니지오(leptomanigio) 암종, 수질 암종, 흑색 암종, 수막(menigual) 암종, 중피세포 암종, 귀리 세포 암종, 편평 세포 암종, 땀샘 암종, 이행 세포 암종, 세뇨관 세포 암종, 범랑아세포 육종, 혈관결석 육종, 포도상(botryoid) 육종, 자궁내막 간질 육종, 유잉(ewing)육종, 섬유속(fascicular) 육종, 거대 세포 육종, 과립구 육종, 면역모세포 육종, 주사코디얼(juxaccordial) 골원성 육종, 코피스(coppices) 육종, 백혈구육종 (백혈병), 림프육종 (림프 육종), 수질 육종, 골수 육종(과립구성 육종), 오스티오겐시(austiogenci) 육종, 골막성 육종, 세망 세포 육종 (조직구 림프종), 원형 세포 육종, 방추 세포 육종, 활막 육종, 모세혈관 확장성 청력 육종, 버킷 림프종, NPDL, NML, NH, 및 미만성 림프종.
현재 이용 가능한 다양한 치료 옵션에도 불구하고, 이를 테면, 유방암, 전립선 암, 자궁내막 암, 방광 암, 신장 암, 식도의 암, 편평 세포 암종, 포도막 흑색종, 여포성 림프종, 신장 세포 암종, 센드칼(cendcal) 암, 난소 암, 폐 암, 직장결장 암, 뇌 암, 췌장 암, 두경부 암, 간암, 백혈병, 림프종, 호지킨 질환, 다수의 골수종, 흑색종, 성상세포종, 위암, 및 폐 선암종과 같은 다수의 암은 여전히 전 세계 사람들의 주요 사망 원인으로 남아 있으며, 독특한 치료 전망이 부족하다. 이러한 질환들을 조기에 진단하는 것은 생존을 결정하는 가장 중요한 요소 중 하나이다. 본 명세서는 심오한 치료적 의미를 갖는 이들 질환 및 기타 질환에 대한 바이오마커 표적으로서 CLEC2D의 확인을 기재한다. 본 명세서에 기재된 CLEC2D에 대한 전체 항체 식별 방법의 급속한 발전으로 인해, 위에서 언급한 다양한 질환 징후에 대한 신규 바이오마커로서 CLEC2D를 검증할 수 있게 되었다.
본 명세서는 특정 치료에 대해 더 나은 반응을 보일 가능성이 있는 환자를 계층화하기 위한 예측 바이오마커로서 CLEC2D 발현의 확인에 사용하기 위한 항-CLEC2D 항체 및 이의 단편, 및 동일한 것을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 명세서는 CLEC2D 발현을 예측 바이오마커로 식별하는 데 사용하고, 전이성 암 환자에서 NK 세포 세포용해 활성을 향상시키는 것을 목표로 하는 치료법을 탐색하는 길을 열기 위해, 항-CLEC2D 항체들 및 이의 단편들, 상기 항체들 또는 이의 항원 결합 단편들을 인코딩하는 핵산, 또는 동일한 것을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예들에서, 종양 미세 환경에서 면역 세포에 대한 이러한 CLEC2D 수용체의 발현은 좋은 예후와 관련이 있다. 특이적 면역 세포들, 이를 테면, NK 세포 및 T 세포 상에서 특이적 분자들의 발현은 특정 면역 기능의 유지와 관련된다. 본 명세서는 전립선암을 포함하는 NK 수용체 리간드로서의 CLEC2D 발현의 예후적 역할, 및 CLEC2D 발현과 상이한 전립선암 질환 단계, 분자 하위유형 및 임상-병리학적 특징과의 연관성을 기재한다. 항-CLEC2D 항체를 이용하여 종양 세포에서 CLEC2D 발현을 차단하는 것은 NK 세포 매개된 세포독성 면역 맥락에서 신호를 전달하고, 침윤 T 세포의 긍정적인 예후 가치를 활용한다. 본 명세서의 인간 항-CLEC2D 단일클론성 항체들은 단독으로 또는 다른 리간드, 사이토킨 또는 기타 세포 인자와 함께 다양한 암 유형에서 오로지 치료제로써, 또한, 예후 및 진단제로서 이들 항체의 기회/범위로 확장된다.
약제학적 제형
본 명세서는 본 명세서의 항-CLEC2D 항체들 또는 이의 항체 단편들의 임의의 약제학적 조성물을 제공한다. 본 명세서의 각 항-CLEC2D 항체들은 대상체에게 투여하는데 적합한 조성물로 제형화될 수 있다. 예시적인 측면들에서, 각 항-CLEC2D 항체들은 가령, 예를 들어, 특정 온도, 예를 들어 실온에서 해당 항-CLEC2D 항체를 안정화함으로써 항-CLEC2D 항체의 화학-물리적 특징을 향상시키고, 저장 수명을 증가시키고, 분해를 감소시키고, 예를 들어, 산화 프로테아제 매개된 분해를 감소시키고, 항-CLEC2D 항체의 반감기 증가시키는 등의 하나 또는 그 이상의 작용제들과 함께 제형화될 수 있다. 본 명세서의 예시적인 측면들에서, 상기 항-CLEC2D 항체는 약제학적으로 수용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가로 포함하는 조성물로 제형화될 수 있다.
"약제학적 조성물"과 "약제학적 제형"은 문맥이 명백하게 달리 암시하지 않는 한, 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
상기 약제학적 조성물은 고체, 반고체 또는 액체일 수 있다. 일반적으로, 상기 약제학적 조성물은 특정 투여 경로에 맞게 조정된다. 예를 들면, 상기 약제학적 조성물은 경구 투여, 직장 투여, 협측 투여, 국소 투여 등에 적합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 약제학적 조성물은 정맥내 투여에 적합하다. 일부 구체예들에서 본 명세서의 항체들 또는 항체 단편들을 포함하는 약제학적 조성물은 정맥 주사 또는 주입에 적합하다. 일부 구체예들에서, 안정적인 수성 단일클론성 항체 제형은 바람직하게는 근육내 주사, 피하 주사, i.v. 주사를 통하여, 또는 가장 바람직하게는 i.v. 주입을 통하여 비경구 경로로 투여될 것이다.
본원에서 사용될 때, "약제학적으로 허용되는 담체"에는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 및 생리학적으로 적합한 유사한 것들이 내포된다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입)에 적합하다. 본 명세서의 약제학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 염, 항-산화제, 수성 및 비수성 담체, 및/또는 어쥬번트 이를 테면, 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 수용가능한 담체에는 표준 약제학적 운반체, 이를 테면, 인산염 완충된 염 용액, 물, 에멸젼 이를 테면, 유중수(oil/water) 또는 수중유(water/oil) 에멸젼, 그리고 각종 형태의 가습 제제가 내포된다. 이 용어는 또한 미국 연방 정부의 규제 기관이 승인하거나 인간을 포함한 동물에 사용하기 위해 US Pharmacopeia에 등재된 제제들을 포괄한다.
상기 약제학적 조성물는 예를 들어 다음을 포함하는 임의의 약제학적으로 수용가능한 성분들을 포함할 수 있다: 산성화제, 첨가제, 흡착제, 에어로졸 추진제, 공기 치환제, 알칼리화제, 고결방지제, 항응고제, 항균성 보존제, 산화방지제, 방부제, 염기, 결합제, 완충제, 킬레이트제, 코팅제, 착색제, 건조제, 세제, 희석제, 소독제, 붕해제, 분산제, 용해 증진제, 염료, 연화제, 유화제, 유화 안정제, 충전제, 필름 형성제, 향미 증진제, 향미제, 흐름 증진제, 겔화제, 과립제, 습윤제, 윤활제, 점막접착제, 연고 베이스, 연고, 유성 비히클, 유기 베이스, 사탕형 베이스, 안료, 가소제, 광택제, 방부제, 격리제, 피부 침투제, 가용화제, 용제, 안정화제, 좌제, 계면활성제, 계면활성제, 현탁제, 감미제, 치료제, 증점제, 등장화제, 독성제, 점도 증가제, 수분 흡수제, 수혼화성 공용매, 연수제 또는 습윤제. 당업계에 알려진 기타 약제학적으로 수용가능한 부형제 에는 희석제, 담체, 충전제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 활택제, 착색제, 안료, 맛 차폐제, 감미료, 가소제 그리고 임의의 허용되는 보조 물질, 이를 테면, 흡수 증진제, 침투 증진제, 계면활성제, 보조-계면 활성제, 보존제, 산화 방지제 및 특수 오일이 내포된다. 생-약제학적 단백질 분야에 특이적인 것은 단백질을 안정화하기 위한 부형제와 동결 건조 동안 보호를 제공하는 동결-방지제다. 적절한 부형제(들)은 부분적으로 투여 형태, 의도된 투여 방식, 의도된 방출 속도 및 제조 신뢰성에 기초하여 선택된다. 일반적으로 사용되는 부형제의 비제한적인 예로는 중합체, 왁스, 인산칼슘, 당 (예: 트레할로스, 수크로스 또는 만니톨), 완충제(가령, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 히스티딘 또는 글리신 기반 완충제(pH 5~7.5)), 염 (가령, NaCl 또는 NaEDTA), 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 인간 알부민, 덱스트란 및 벤질 알코올이 내포된다.가령, Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000) 참고(본원에 이의 전문이 참고자료로 편입된다). Remington 's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E.W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)이 본원에 이의 전문이 참고자료로 편입된다.
예시적인 측면들에서, 상기 약제학적 조성물은 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성인 제형화 물질을 포함한다. 특이적 구체예들에서, 활성 작용제 및 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 염; 폴리올; 계면활성제; 삼투 균형제; 강장제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 증량제; 동결 보호제; 소포제; 킬레이트제; 방부제; 착색제; 진통제; 또는 추가 약제를 포함하는 약제학적 조성물.
예시적인 측면들에서, 상기 약제학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 폴리올 및/또는 하나 이상의 계면활성제를 포함하고, 임의선택적으로, 약제학적으로 허용되는 염; 삼투 균형제(긴장성제); 항산화제; 항생제; 항진균제; 증량제; 동결 보호제; 소포제; 킬레이트제; 방부제; 착색제; 및 진통제가 내포되나, 이에 국한되지 않은 하나 또는 그 이상의 부형제를 또한 포함한다.
특정 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물은 예를 들어 pH, 삼투압 농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 무균, 안정성, 조성물의 용해 또는 방출 속도, 흡착 또는 침투를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형화 물질을 함유할 수 있다. 이러한 구체예들에서, 적합한 제형화 물질에는 다음의 것들이 내포되나, 이에 국한되지 않는다: 아미노산 (이를 테면, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신); 항미생물제; 항산화제 (이를 테면, 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 완충제 (이를 테면, 붕산염, 중탄산염, Tris-HCl, 구연산, 인산염 또는 기타 유기산); 증량제 (이를 테면, 만니톨 또는 글리신); 킬레이트제(이를 테면, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화제 (이를 테면, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린); 충전제; 단당류; 이당류; 및 기타 탄수화물 (이를 테면, 포도당, 만노스 또는 덱스트린); 단백질 (이를 테면, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제, 향미제 및 희석제; 유화제; 친수성 중합체 (이를 테면, 폴리비닐피롤리돈); 저 분자량 폴리펩티드; 염 형성 반대이온(이를 테면, 나트륨); 방부제(이를 테면, 염화 벤잘코니움, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매 (이를 테면, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알코올 (이를 테면, 만니톨 또는 소르비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 습윤제 (이를 테면, 플루로닉스, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트 (이를 테면, 폴리소르베이트 20, 폴리소르바트, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔)); 안정성 향상제(예: 자당 또는 소르비톨); 긴장성 향상제 (이를 테면, 알칼리 금속 할로겐화물, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 소르비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 약제학적 어쥬번트. REMINGTON'S PHARMACEUTICAL CAR-TSCIENCES, 18" Edition, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company 참고.
상기 약제학적 조성물은 생리학적으로 적합한 pH를 달성하도록 제형화될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물의 pH는 예를 들면 약 4 또는 약 5 내지 약 8.0, 약 4.5 내지 약 7.5, 또는 약 5.0 내지 약 7.5일 수 있다. 예시적인 구체예들에서, 상기 약제학적 조성물의 pH는 5.5 내지 7.5이다.
비-구 투여를 통해 항-CLEC2D 항체를 투여하기 위한 약제학적 조성물은 일반적으로 액체이다. 물은 일반적으로 주요 부형제로 사용되지만, 에탄올, 글리세롤, 올레산 에틸, 미글리올, 올레산 벤질, 피마자유, MCT, 벤질 알코올 이소프로필 미리스테이트와 같은 기타 약학적으로 허용되는 액체를 단독으로 또는 물과 함께, 또는 서로 조합하여 사용할 수 있다. 다른 부형제를 함유하지 않는 수성 조성물도 고려되며, 동결건조, 무정형 또는 결정질 화합물로부터 제조될 수 있다. 종종 피하, IM 또는 IV 주사용일 수 있는 주사 가능한 조성물은 등장화제를 함유한다. 주사 가능한 용액 또는 현탁액은 일반적으로 모든 액체 제약 투여 형태와 마찬가지로 멸균 상태다.
국소 투여를 통해 항-CLEC2D 항체를 투여하기 위한 약제학적 조성물은 분말, 크림, 연고, 겔, 로션, 용액 및 현탁액(구강 세척제 포함)이 내포된다. 부형제 담체는 종종 수성, 오일 또는 중합체 기반이며, 각각은 선택적으로 에멀젼 또는 마이크로에멀젼의 형태이다. 용어 "국소 투여"는 예를 들어, 광학적 투여(예를 들어, 크림/연고를 통해) 및 피부에 투여(예를 들어, 염증이 있는 관절에서)를 포함한다.
경구 투여를 통해 항-CLEC2D 항체를 투여하기 위한 약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 이의 장용 코팅된 형태, 로젠지 및 필름과 같은 고체 경구 투여 형태, 뿐만 아니라 용액, 현탁액, 액체 충전 캡슐 및 구강 세척제를 포함하는 액체 투여 형태를 포함한다. 정제는 가용성 정제, 분산성 정제, 발포성 정제, 씹을 수 있는 정제, 동결건조 정제, 코팅 정제(가령, 당-코팅 또는 장용-코팅), 및 방출 조절 정제일 수 있다. 캡슐에는 분말, 펠렛, 과립, 작은 정제 또는 미니 정제, 용액 또는 에멀젼 또는 조합으로 채워질 수 있고, 장용 또는 변형 방출용으로 코팅될 수 있는 경질 젤라틴 캡슐이 내포된다. 연질 캡슐이 또한 고려되고, 더 전형적으로 액체, 겔 또는 분산액으로 채워지지만, 이에 국한되지는 않는다. 과립은 발포성 과립, 코팅된 과립(가령, 당-코팅 또는 장용-코팅) 및 방출 변형된 과립일 수 있다. 본 명세서의 항-CLEC2D 항체는 경구 투여할 수 있지만, 이러한 투여는 GI 관에 대한 국소 투여로 간주될 수 있음을 이해해야 한다. 마찬가지로, 좌약 또는 직장 주사를 내장에 국소적으로 사용할 수도 있다. 본 명세서의 항-CLEC2D 항체를 사용하여 위장 질환(들)을 치료하기 위한 경구 투여 형태의 사용은 본 명세서의 한 측면이다.
투여 형태에 대한 개요는 Ansel's Pharmaceutical Dosage forms and Drug Delivery Systems. 9th ed. L.V. Allan, N.G. Popovitch, H.C. Ansel, 2010 Lippincott, ISBN: 978-0781779340; Formularium der Nederlandse Apothekers. 2004 WINAp ISBN 90-70605-75-9; Recepteerkunde, G. K. Bolhuis, Y. Bouwman-Boer, F. Kadir en J. Zuiderma, 2005 WINAp ISBN 90-70605-65-1; 그리고 Apothekenrezeptur und -defektur. Deutscher Apotheker Verlag Stuttgart 1986 ISBN 3-7692-1092-1에서 찾을 수 있다. 건선과 같은 피부 염증성 질환을 치료하기 위해 IL-8 항체를 전달하기 위한 국소 제제에 대한 설명은 또한 US 7,147,854를 참조한다.
상기 약제학적 조성물은 사용되는 투여 형태에 일부 의존적으로, 일반적으로 투여당 약 0.01 내지 1000 mg의 항체를 함유한다. 투여량은 예를 들어, 고정되거나 또는 가변적일 수 있다(예를 들어, 체중을 기준으로 함).
안정한 제형의 개발은 본 명세서의 항체 및 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물의 성공적인 임상 제조에 필수적이다.
일부 구체예들에서, 안정한 제형은 첨가제의 도움으로 다양한 pH에서 다양한 완충제, 안정제를 스크리닝하여 제조되며, 최종 안정적 제형은 보관 시 물리적, 화학적 안정성 및 생물학적 활성을 함유해야 한다. 안정한 제형에서 부형제의 역할은 허용가능한 저장 수명을 제공하기 위해 분해 속도를 방지 및/또는 감소시키는 것이다.
본 명세서는 일부 구체예에서 항-CLEC2D 단일클론성 항체의 안정한 액체 및/또는 동결건조 제제를 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에서 사용에 고려되는 제형화 완충제는 4.0 내지 8.0 범위의 pH를 가지며; 바람직하게는 4.5 내지 7.5의 pH 범위; 가장 바람직하게는 5.0 내지 6.5의 pH 범위를 갖는다.
일부 구체예들에서, 본 명세서는 하기 기술된 것들 및 이들의 조합 중 임의의 것일 수 있는 완충제를 포함한다: 구연산나트륨, 구연산; 일염기성 인산나트륨, 이염기성 인산나트륨; 일염기성 인산칼륨, 이염기성 인산칼륨; 아세트산, 아세트산나트륨; 히스티딘, 히스티딘 HCl; 숙신산, 숙신산나트륨; 타르타르산, 타르타르산나트륨; 말레산, 말레산염; 숙시네이트 2-(N-모르폴리노) 에탄 설폰산(MES) 및 염산 및 수산화나트륨을 사용하고, pH를 원하는 범위로 조정한다.
일부 구체예들에서, 상기 조성물은 다른 완충제 이를 테면, Tris 완충제, (3-(N-몰포리노)프로판술폰산) (MOPS), N-사이클로헥실-2-하이드록실-3-아미노프로판설폰산(CAPSO), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)(PIPES)MOPS-SDS (MEPS) 등을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제형은 당 알코올인 폴리올을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제형에서 안정화제는 α-트레할로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨 중 임의의 하나를 단독으로, 또는 조합하여 포함한다. 다른 구체예들에서, 상기 제형은 메티오닌, 라이신, 아르기닌, 글리신, 글루타메이트 등 중 임의의 하나를 제 2 안정화제로 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 항체 제형은 소수성 염, 즉 나트륨 장뇌 황산염, 트리메틸 암모늄 요오다이드를 포함한다. 또다른 구체예에서, 본 명세서의 항-CLEC2D 단일클론성 항체 제형은 계면 활성제를 또한 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 제형에는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 188에 의해 예시된 바와 같이, 다음 계면활성제 중 임의의 하나가 내포된다. 일부 구체예들에서, 항-CLEC2D 단일클론성 항체를 포함하는 조성물은 항-산화제, 예를 들어, 메티오닌 및/또는 글루타티온을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 조성물은 제형 완충제의 pH를 조정하기 위해 염산 및 수산화나트륨을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 명세서는 에데트산이나트륨(Na(2)EDTA) 및 디에틸렌 트리아민펜타아세트산(DTPA)과 같은 다른 안정화제 및 착화제를 포함한다. 일부 구체예들에서, 안정한 제형의 모든 부형제는 주사용 물(WFI)에 용해된다.
한 구체예에서, 최종 안정적 수성 제형은 미립자 물질을 제거하기 위해 적절하게 여과된다. 일부 구체예들에서, 여과는 폴리에테르설폰(PES) 필터, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 필터 또는 재생 셀룰로스(RC) 필터를 통해 수행되며, 필터 크기는 적절하게는 0.22 및/또는 0.45 마이크론 기공 크기다.
일부 구체예들에서, 약물 전달 장치는 항체 제형의 두 번째 중요한 측면이다. 다른 구체예들에서, 상기 약물 전달 장치는 무균이다. 다른 구체예들에서, 상기 약물 전달 장치는 바이알, 앰플, 주사기, 주사 펜 또는 정맥 주사(i.v) 백이다.
본 명세서의 비-제한적 구체예에서, 기능적 특성화는 당업계에 잘 알려진 다른 기술 중에서 ELISA, BIAcore, 유동 세포 분석, 웨스턴-블랏, 및 이미징이 내포되나, 이에 국한되지 않는 기술을 사용하여, 항-CLEC2D 항체의 결합의 동역학 및 역학을 이해하기 위한 실험을 수행하는 것을 포함한다. 추가로, CLEC2D-CD161 상호작용 부위를 매핑한 다음, 유동 세포 분석 기반 결합 실험을 통해 모니터링하고, 검증한다.
본 명세서의 비-제한적 구체예에서, 단일클론성 항체는 면역계의 선천성 또는 적응성 부문(arm)을 프라이밍하는 궁극적인 효과로 종양 세포를 파괴하는 다양한 기전을 통해 기능한다. 상기 작동체 기능에는 보체-의존적 세포독성 (CDC), 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 및 항체-의존적 세포성 식작용 (ADCP)이 내포된다. 본원에 기술된 방법에 이용된 한 가지 비-제한적 접근법은 면역글로불린 불변 영역을 변형시켜, 치료요법적 항체의 효능을 강화시키는 것이다. 이러한 항체의 예는 본원에서 기술된 바와 같이, 가변 영역(신규한 중쇄 및 경쇄 영역)으로 구성되고, 특정 아이소형, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG4 또는 이의 변이체를 나타내는 불변 영역으로 구성될 수 있는 항-CLEC2D 항체가 내포된다. 유사하게, 독특한 가변 영역 서열은 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 이중특이성 항체, ScFv 분자 또는 임의의 다른 항체 형식을 개발하고, 뿐만 아니라 향상된 ADCC 기능 또는 변형된 열 안정성을 갖는 항체 분자 개발에 사용될 수 있다.
본 명세서의 비-제한적 구체예에서, 구절 "사이토킨"에는 케모킨, 인터페론, 인터루킨, 림포카인 및 종양 괴사 인자가 내포될 수 있으며, 이는 언급된 질환 및/또는 이들의 조합과 관련된 임의의 세포주에 대항하여 사용되는 단리된 항체의 치료 효과로서 생성될 수 있다.
본 명세서의 비-제한적 구체예에서, 구절 "유도자"는 유전자 발현을 제어하는 분자다.
본 명세서의 구체예는 선택된 항체 분자의 작용 방식과 관련하여 NK-세포 시그니처, IFN-γ 생산 등과 같은 경로와 관련된 유전자의 상호작용을 이해하기 위한 방법 및 도구를 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 웨스턴 블롯, 유동 세포 분석, 공초점 현미경을 통한 영상화 및 RT PCR과 같은 기술을 함께 사용하여 선택된 항-CLEC2D 항체 분자의 기계적 영향을 해독하며, 이때 주요 신호 전달 경로에 대한 다양한 억제제의 효과는 다중 암에서 평가된다. 한 구체예에서, IFN-γ 방출 분석, CD107a+ 발현, 및/또는 세포독성 분석을 이용하여 항-CLEC2D 항체의 효과를 평가한다.
본 명세서의 비-제한적 구체예에서, 항-종양 활성은 피하 PC3 종양 이종이식을 보유하고 있는 huNOG-EXL 마우스에서 평가되며, 이때 선별된 항-CLEC2D 항체는 단독으로 또는 체크포인트 표적에 대항하는 단일클론성 항체과 조합하여 모니터링된다. 또다른 구체예에서, 항체 용량 요법은 최적의 원하는 항-종양 반응을 얻도록 조정된다. 일부 구체예들에서, 본원에 사용된 "비경구 투여"라는 문구 또는 관련 용어는 일반적으로 주사에 의한 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 근육내, 정맥내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내(intradermal), 복강내, 피하, 표피하, 척수내, 경막외, 흉골내 주사 및 주입 투여 수단을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 바람직한 구체예들을 보다 충분히 설명하기 위해 하기 실시예를 제시한다. 그러나 그것들은 본 개시의 넓은 범위를 제한하는 것으로 결코 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 가용성 CLEC2D 항원의 발현
야생형 또는 돌연변이된 CLEC2D의 엑토-도메인을 포함하는 항원 구조체를 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주에서 발현시키고, 가용성 항원으로서 정제하였다. CLEC2D 엑토도메인은 2개의 추정 이황화 결합이 있는 5개의 시스테인을 함유한다. 발현된 단백질의 안정성 및 균일성이 증가되도록, Cys163 아미노산으로 추가 이황화물 다리를 도입시키기 위해 H176C에 돌연변이가 실행되었다. 상기 구조체는 항원 정제 프로세스를 실행하기 위해 C-말단 히스티딘 테그를 갖도록 개발되었다.
CLEC2D(Q72-V191, H176C) 항원의 세포외 도메인은 인간 및 CHO 발현 시스템 모두에 대해 코돈 최적화되었고, 구조체들이 합성되었다. CHO 발현된 항원의 분비를 위해 특정 신호 서열을 사용하였다. CLEC2D 유전자 서열 및 적절한 신호 서열을 pCDNA3.1 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하였다(도 2A).
90% 이상의 생존율에서 CHO 현탁 세포를 CLEC2D 유전자를 인코딩하는 발현 플라스미드의 형질감염에 사용하였다. 세포를 4-5분 동안 1000-1400 rpm에서 원심분리하였다. 소모된 배지를 따라내고, 세포를 OptiMEM I 배지 250ml에 재현탁시켰다. CLEC2D 발현 플라스미드는 PlusTM 시약과 함께 리포펙타민 LTX를 사용하여 형질감염되었다. 500 μg의 DNA를 1:3의 DNA 대비 형질감염 시약 비율로 사용하고, 500 μl PlusTM 시약을 사용했다. DNA 및 리포펙타민 LTX 복합체를 250ml OptiMEM I에서 제조하고, 복합체 형성을 위해 20-25℃에서 20분 동안 항온처리했다. 형질감염 혼합물을 세포 현탁액에 천천히 첨가하였다. 세포를 100-120 RPM에서 5% CO2 진탕기 인큐베이터에서 37℃에서 5시간 동안 항온처리하였다. 500ml의 Power CHO2 CD 성장 배지를 세포에 첨가했다. 세포를 100-120 RPM에서 5% CO2 진탕기 인큐베이터에서 37℃에서 3일 동안 항온처리하였다. 형질감염 후 3일 차에 2mM 글루타맥스를 함유하는 Power CHO2 CD 성장 배지 200ml를 첨가하였다. 세포를 100-120 RPM에서 5% CO2 진탕기 인큐베이터에서 37℃에서 항온처리하였다. 형질감염 후 6일 차에, 세포 배양 상청액을 10-15분 동안 1400-2000rpm에서 원심분리에 의해 수확하였다.
세포 수확물을 원심분리하고, 여과하여 세포 파편을 제거했다. 투명한 상청액을 미리 평형화된 Ni 세파로스 FF C10 컬럼에 로딩했다. 후속적으로, 컬럼을 50mM 및 100mM 이미다졸 용액으로 순차적으로 세척한 후, 500mM 이미다졸로 His-태그된 CLEC2D 단백질을 단일-단계 용리했다. 다중 분획을 수집하고, 완충액을 1X 인산 완충 식염수(PBS) pH 7.4로 교환했다.
정제된 CLEC2D 항원은 SDS-PAGE를 통하여 분석하였다. 인간 CLEC2D 서열은 두 개의 추정 N-글리코실화 부위 N95 및 N147을 갖는다. SDS-PAGE의 비정상적인 이동성은 차등적인 N-글리코실화 패턴으로 인한 것으로 추측된다. 정제된 CLEC2D 항원은 PNGase 효소를 사용하여 탈당화되었으며, SDS-PAGE 분석으로 판단하였을 때, 예상 분자량에서 단일 밴드로 나타났다 (도 2B-2F). 후속적으로 정제된 CLEC2D 항원은 상업적으로 이용가능한 항-CLEC2D 항체를 이용한 웨스턴 블랏 실험으로 분석하였다. 상기 정제된 CLEC2D 항원은 상업적으로 이용가능한 항-CLEC2D 항체를 이용한 ELISA를 통하여 또한 확인되었다. 단백질의 올리고머 상태는 크기 배제 크로마토그래피 실험을 사용하여 이량체인 것으로 밝혀졌다. 마지막으로 N-말단 시퀀싱을 Edman 분해법으로 수행하여 항원 서열을 확인하였다.
실시예 2: 파아지 및 효모 디스플레이 플렛폼을 이용한 항체 유전자 라이브러리의 스크리닝
항체 유전자 라이브러리의 스크리닝은 항체 라이브러리의 파아지 디스플레이와 효모 디스플레이를 결합하여 수행되었다. 인간 항체 레퍼토리를 발현시키는 파아지 및 효모 디스플레이 플랫폼을 순차적으로 사용하여, CLEC2D 항원에 대해 더 높은 친화력 및 특이성을 갖는 신규 항체 클론을 식별했다 (도 3). 항원에 대항하는 파아지 패닝 실험을 위해, 자성 비드 기반 접근법이 채택되었다. 자성 다이나비드(dynabeads)에 코팅된 항원이 준비되었으며, 콘쥬게이션 효율은 >90%였다. 파아지 항체 라이브러리를 항원 코팅된 비드에 대해 패닝하여, 항-CLEC2D 항체 클론을 발현하는 파아지 입자를 분리하였다. 선택된 파아지 입자를 사용하여, 중쇄 및 경쇄 레퍼토리를 포함하는 복제 형태를 생성했다. 정제된 DNA를 절단하고, 두 개의 상이한 플라스미드 구조체에서 효모 발현 벡터에 결찰시켜 Fab 형식 및 ScFv 포멧 항체를 생성하였다.
정제된 CLEC2D 항원과 자성 비드 콘쥬게이션을 위해, 먼저 다이나(dyna) 비드를 ~0.5-1.0 X 108 비드에 해당하는 0.5 mg에서 1.5 mg 범위의 양으로 칭량하고, 0.1 M 인산나트륨 완충액, pH 7.4에 용해시켰다. 이 현탁액을 30-60초 동안 와동시킨 후, 연속 회전시키면서 실온에서 10-15분 동안 항온처리하였다. 현탁액을 0.1M 인산나트륨 완충액으로 2회 세척하고, 0.1M 인산나트륨 완충액 100μL에 다시 현탁시켰다. 5-10 μg의 정제된 가용성 CLEC2D 항원 용액(75-150 μL)을 비드 현탁액에 첨가했다. 더욱이, 상기 현탁액은 100μL의 3M 황산암모늄 용액을 첨가하기 전, 잘 혼합되었다. 상기 혼합물을 천천히 기울이고 연속 회전시키면서, 30-37℃에서 15-20시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 자성 분리를 위해 튜브를 자석 홀더에 1분 동안 두었다. 자석 홀더(튜브가 제자리에 둠)를 조심스럽게 두 번 아래-위로 뒤집어 캡에 구슬이 남아 있지 않도록 했다. 상청액을 제거하고, 비드를 BSA(0.05%)가 포함된 1X PBS 1mL로 4회 세척한다. 마지막으로, 상기 비드는 BSA(0.05%)가 포함된 1X PBS 100μL에 재현탁되고, 패닝에 사용된다.
1μL(~106개 비드)의 비드 단독 및 CLEC2D 항원으로 코팅된 비드를 0.1μg의 양으로 시판 P4500/항-CLEC2D 항체와 혼합한 다음, 0.5% BSA를 함유하는 1X PBS를 이용하여 부피를 100μL로 만든다. 상기 혼합물을 얼음 위에서 2시간 동안 항온처리한 후, 0.5% BSA를 함유하는 1X PBS로 세척하였다. 1:400 희석으로 FITC와 접합된 항-염소 IgG를 0.5% BSA를 포함하는 1X PBS 용액에서 재현탁된 비드에 100μL 부피로 첨가한 후 판독했다. 모든 유동 세포 분석 실험은 Accuri C6 유동 세포 분석기를 사용하여 수행되었으며, 분석은 BD Accuri C6 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 첫째, 정방향 및 측면 산란 데이터는 게이트를 고정한 다음, FLH1 필터를 통해 형광 판독을 수행하는 것으로 나타났다. 각 샘플에 대해 최소 5,000-10,000개의 데이터 포인트가 수집된다 (도 4A).
파아지 패닝 실험은 새로 스트리킹된 TG1 박테리아 플레이트의 단일 콜로니를 3 ml LB 배지에 접종한 다음, OD600
Figure pct00084
0.9가 될 때까지 37℃에서 항온처리한 다음, 나중에 파아지 감염에 사용했다. 파아지 나이브 항체 라이브러리를 해동하고, 파아지 입자를 250μl (파지 현탁액 부피의 ~1/4) PEG/NaCl 용액(20% PEG 8000 및 2.5M NaCl)으로 침전시켰고, 얼음 위에서 30분 동안 항온처리한 후, 침전된 파아지를 10,000xg에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고, 파아지 펠렛을 200μl PBS 용액에 재현탁시켰다. 파아지 현탁액(200μl)을 BSA가 콘쥬게이트된 비드에 첨가하고, 회전자 상에서 실온에서 2시간 동안 항온처리하였고, 이어서 CLEC2D 항원과 콘쥬게이트된 비드에 상층액을 첨가하고, 10μL의 상청액을 나중에 플라크 분석을 위해 따로 보관했다. 항원과 콘쥬게이트된 비드가 있는 파아지 현탁액을 2시간 동안 실온에서 회전자 상에서 항온처리하였다. 상기 비드를 1 ml 0.05% PBST(PBS 중 0.05% Tween-20)로 2회 세척하였다. 마지막으로, 파아지 입자와 결합된 자성 비드를 100 μl PBS에 재현탁한다. 10 μL의 비드 현탁액을 나중에 플라크 분석을 위해 따로 보관했다. 나머지 90μl의 현탁액을 앞서 제조한 성장된 TG1 세포 2ml에 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 이를 25μg/ml의 최종 농도로 암피실린을 함유하는 10ml LB 배지로 희석하였다. 37℃에서 2시간 동안 250rpm에서 일정하게 교반시키면서 항온처리한 후, 암피실린의 농도를 최종 농도 100μg/ml로 증가시켰다. 헬퍼 파아지인 M13KO7을 감염 다중도(MOI)가 10인 증폭된 TG1 세포에 혼합하고, 37℃에서 추가로 30분 동안 항온처리하였다. 헬퍼 파아지 감염 박테리아를 회전시켜 가라앉히고, 펠렛을 100μg/ml암피실린 및 25μg/ml 카나마이신이 보충된 10ml의 LB 배지에 재현탁시킨 후, 파아지 증폭을 위해 30℃에서 30분 내지 100분 동안 항온처리하였다. 박테리아 배양물을 10,000g에서 10분 동안 원심분리에 의해 펠렛 다운시켰다. 상기 펠렛을 버리고, 상청액에 PEG/NaCL 용액을 첨가하여 증폭된 파아지 분자의 침전을 위해 상청액(상청액의 ~1/4 부피)을 사용했다 상기 혼합물을 얼음 위에서 30분 동안 항온처리한 후, 침전된 파아지를 10,000g에서 10분 동안 회전시켰다. 상층액을 버리고, 펠렛을 PBS 1ml에 재-현탁시켰다. 플라크 분석은 증폭된 파아지 수를 추정하기 위해, 10μL의 증폭된 파아지 현탁액에서 수행되었으며, 나머지 침전된 파지는 장기간 보관을 위해 -80oC 냉동고에서 50% 글리세롤과 함께 보관되었다.
플라크 분석은 파아지 입자의 수를 확인하기 위해 모든 단계에서 수행되었다. TG1 박테리아 플레이트의 단일 콜로니를 3 ml LB 배지의 박테리아에 접종하고, OD600
Figure pct00085
0.9가 될 때까지 37℃에서 성장시켰다. 0.7%의 아가로스를 정제수에서 제조하고, 15ml의 팔콘 튜브에 각각 3ml씩 나누어 50℃에서 보관하였다. 파아지 상청액 및 펠렛을 10-1 에서 10-5로 각 단계에서 희석하였다. 100 μl의 희석된 파지 및 100μl의 TG1 세포를 각각의 아가로스 분취량에 첨가 혼합한 다음, 즉시 LB 한천 플레이트 상에 도말하였다. 상기 플레이트를 인큐베이터에서 37oC에서 밤새 항온처리했니다. 플라크 형성을 관찰하고, 다음날 계수하였다. 패닝된 분자의 수는 관찰된 플라크의 수를 기반으로 계산되었다 (표 10).
표 10: CLEC2D 항원에 대한 패닝 과정의 모든 단계에서 파아지 입자 수를 추정.
Figure pct00086
TG1 박테리아 플레이트의 단일 콜로니를 OD600이 ~ 0.9에 도달할 때까지 37℃에서 20ml LB 배지에 접종했다. 침전된 패닝된 파지 현탁액 200μl를 2ml의 TG1 세포에 접종하였고 (10개의 다른 튜브에 들어 있으며, 각 튜브에는 2-5ml의 TG1 세포가 들어 있다), 그 다음 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 진탕하면서 항온처리하였다. 각 튜브의 부피를 25μg/ml 암피실린을 함유하는 10ml LB 배지로 희석하였다. 220rpm에서 진탕하면서 37℃에서 추가 2시간 항온처리 후, 암피실린 농도를 100μg/ml의 최종 농도로 증가시키고, 30분 내지 100분 동안 추가로 항온처리하였다. 박테리아 배양물을 10,000g에서 10분 동안 회전시키고, 추가 사용을 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen midi prep을 통한 DNA 분리를 이 펠렛을 사용하여 수행했다.
Fab 포멧의 효모 셔틀 벡터로 중쇄 및 경쇄 라이브러리 구축:
경쇄 통합을 위해 지정된 사내(in-house) 효모 발현 벡터 pZB003(MTCC 25127)과 함께 패닝된 분자의 분리된 DNA의 복제 형태는 HindIII 및 AscI로 절단하고, 이어서 결찰시켜, 개별적으로 고도의 컴피턴트(competent) 세포인 TG1로의 형질전환시켰다. 유사하게, 중쇄 풀(분리된 복제 형태에서 공급됨) 및 각각의 벡터 pZB002(MTCC 25126)는 NcoI 및 NotI로 분해된 후, 이어서 결찰시켜, 고도의 컴피턴트 세포인 TG1로의 형질전환시켰다. 중쇄 및 경쇄 패닝된 라이브러리 모두에 대해 얻은 변환 효율은 >107 cfu이다. 중쇄 라이브러리 및 경쇄 라이브러리 모두에 대해 얻은 형질전환된 콜로니는 글리세롤 스톡 준비를 위해 긁어내기 전, 중쇄에 대해 NcoI/NotI를 사용하고 (도 4B), 경쇄에 대해 HindIII/AscI(도 4C)를 사용하여, 삽입물 방출에 대해 점검하였다. 두 가지 쇄 모두에 대한 삽입물 방출은 패닝된 가변 중쇄 및 경쇄-카파 분자의 존재로 확인되었다. 글리세롤 스톡은 향후 사용을 위해 -80oC에 보관된다. 표 10, 표 11 및 표 12는 효모 벡터에서 라이브러리 구성에 있어서 적용가능한 구성 요소를 제공한다.
표 11 표 12
Figure pct00087
Figure pct00088
표 13
Figure pct00089
ScFv 포멧의 효모 셔틀 벡터로 중쇄 및 경쇄 라이브러리 구축:
ScFv 포멧은 경쇄 (CLEC2D 항원에 대한 패닝된 파아지에서 유래된 카파 레퍼토리)를 pZB004.4 벡터의 NdeI 및 AscI 제한 부위 사이로 이동시킨 후, 경쇄 ScFv 라이브러리 풀을 생성하는 것으로 구성된다. 후속적으로, 상기 라이브러리를 제한 절단 확인으로 확인 후, ScFv-경쇄 라이브러리에서 NcoI 및 NotI 제한 효소 사이로 패닝된 중쇄 풀의 이동으로 되었다. 이 최종 라이브러리는 효모 발현 시스템에서 추가로 형질전환되고, 소팅되고 및 스크리닝될 패닝된 분자의 ScFv 라이브러리로 사용될 것이다. 경쇄 통합을 위해 지정된 사내 ScFv 효모 발현 벡터와 함께 패닝된 분자의 분리된 DNA의 복제 형태는 NdeI 및 AscI로 절단하고, 이어서 결찰시켜, 개별적으로 고도의 컴피턴트 세포인 TG1로의 형질전환시켰다.
경쇄 라이브러리에 대해 얻은 형질전환된 콜로니는 글리세롤 스톡 준비를 위해 긁어내기 전, NdeI/AscI를 사용하여, 삽입물 방출에 대해 점검하였다. 삽입물 방출은 패닝된 분자의 존재로 확인되었다. 글리세롤 스톡은 향후 사용을 위해 -80oC에 보관된다. 패닝에서 얻은 중쇄 레퍼토리 통합에 사용할 Qiagen midi prep 키트를 사용하여, 플라스미드를 분리했다.
유사하게, 중쇄 풀(단리된 복제 형태로부터) 및 ScFv 함유 경쇄 라이브러리는 NcoI 및 NotI로 분해된 후(도 4D), 이어서 결찰시켜, 고도의 컴피턴트 세포인 TG1로의 형질전환시켰다. 중쇄 및 경쇄 패닝된 라이브러리 모두에 대해 얻은 변환 효율은 >107 cfu이다. NcoI/NotI가 있는 중쇄 및 NdeI/AscI가 있는 경쇄 모두에 대한 삽입물 방출로 콜로니가 확인되었다 (도 4E).
표 13, 표 14 및 표 15는 효모 발현 벡터에서 라이브러리 구성에 있어서 적용가능한 구성 요소를 제공한다.
표 14 표 15
Figure pct00090
Figure pct00091
표 16
Figure pct00092
대규모로 분리된 DNA는 효모 형질전환을 위해 이전되기 전에 제한 효소 절단에 대해 확인되었다. 각 포멧에 대해 가변 중쇄 및 경쇄 카파 쇄를 함유하는 적어도 10개의 독립적인 클론에서 제한 효소 절단을 통한 사후 확인으로 위해 시퀀싱 반응을 위해 보냈다. 시퀀싱 결과는 하기 표 17에 만들어진 중쇄 및 경쇄 카파로 요약하였다.
표 17: 독립적인 클론에서 수행된 시퀀싱 반응에서 추정된 가변 중쇄 및 경쇄-카파 쇄에 대한 생산성 백분율을 요약한다.
Figure pct00093
상술한 바와 같이, 파아지 항체 라이브러리는 비-특이적 결합제를 제거하기 위해, CLEC2D 항원 피복된 비드에 대해 패닝되었다. 선택된 파아지 입자를 사용하여, 중쇄 및 경쇄 레퍼토리를 포함하는 복제 형태를 생성했다. 이 방법은 패닝된 분자 풀(pool)을 향한 원치 않는 편향을 도입할 수 있는 접근 방식을 기반으로 하는 임의의 PCR이 없었다. 정제된 복제 형태의 DNA를 절단시키고, 2개의 상이한 플라스미드 구조체 안에서 효모 발현 벡터에 결찰시켜 Fab 형식 및 ScFv 형식의 항체를 만들었고, 이때 클로닝 효율은 >95%로 추정되었고, TG1 세포 형질전환 효율은 107 cfu 이상이었다. 이러한 매개변수는 패닝된 다양성의 완전한 캡처를 보장하하는데 필수적이었다.
후속적으로, 두 가지 포멧, 즉 ScFv 및 Fab의 효모 DNA 라이브러리를 효모 세포로 형질전환시켰다. 중쇄, 경쇄 및 Fab 분자 발현에 대해 형질전환된 효모 세포를 확인하였다. 항체 유전자들의 표면 발현은 각각 중쇄 및 경쇄에 대한 FLAG, c-Myc 및 (His)6-테그 및 V5-테그와 같은 다중 테그로 분석하였다. 유동 세포측정 기반으로 한 소팅을 실행하여 특이적 항원 결합을 보이는 항체 서열을 발현시키는 효소 세포를 단리하였다 ()). 효모 세포 집단의 유동 소팅을 2-3회 반복하여, 라벨된 CLEC2D 항원에 대해 더 높은 친화력을 갖는 항체 클론을 풍부하게 하였다.
효모 ScFv 라이브러리의 생성
EBY100 균주(S. 세르비시에 세포)를 220rpm 및 30℃에서 플랫폼 진탕기에서 5ml YPD 배지에서 밤새 성장시켰다. 다음날 아침, 밤새 배양물의 분취량을 ~0.3의 OD600에서 100ml YPD 배지에 접종했다. 접종된 세포는 OD600이 ~1.6에 도달할 때까지(통상적으로 5 시간 -6 시간 후), 플랫폼 진탕기에서 30℃ 및 220rpm에서 계속 성장시켰다. 효모 세포들을 3000rpm에서 3분 동안 원심분리하여 수집하고, 배지를 제거했다. 세포 펠렛을 50ml의 얼음 냉수로 두 번 세척하고, 50ml의 얼음처럼 차가운 전기천공 완충액(1 M 솔비톨/1 mM CaCl2).으로 한 번 세척했다. 효모 세포를 세포 펠릿을 20ml(0.1M LiAc/10mM DTT)에 재현탁하고, 배양 플라스크에서 30분 동안 30℃에서 진탕함으로써 조건화되었다. 이러한 조건화된 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 50 ml의 얼음처럼 차가운 전기천공 완충액으로 1회 세척하였고, 최종 부피가 1 ml에 도달하도록 100 μl 안의 세포 펠릿을 200 μl 전기천공 완충액에 재현탁시켰다.
이는 약 1.6 × 109 세포/ml에 상응하며, 각각 400 μl의 2개의 전기천공 반응에 충분하다. 상기 세포들은 전기천공까지 얼음 위에 두었다. 400μl 전기-적합능 세포를 필요한 양의 플라스미드 DNA와 부드럽게 혼합하고, 미리 냉각된 Bio-Rad GenePulser 큐벳(0.2 cm 전극 갭)으로 옮기고, 전기천공까지 5분 동안 얼음 위에 두었다. 세포를 2.5kV 및 25μF에서 전기천공하였다. 전기천공된 세포를 각 큐벳에서 1M 소르비톨:YPD 배지의 1:1 혼합물 8mL로 옮겼고, 플랫폼 진탕기에서 220rpm 및 30℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 세포를 원심분리에 의해 수집하고, SDCAA 배지에 재현탁시켰다. 세포 현탁액으로부터 10-배 연속 희석된 세포를 준비하였고, 100 μl의 10-3 및 10-4 희석된 세포를 선택 플레이트(SDCAA 플레이트)에 플레이팅하고, 30℃ 인큐베이터에서 3-4일 동안 항온처리했다. 라이브러리 크기는 3-4일 후 콜로니 수에서 결정되었다 (도 5A). 3-4일 후, SDCAA 플레이트에서 콜로니를 관찰하였다. 마지막으로, 효모 ScFv 항체 라이브러리의 20% 글리세롤 스톡은 효모 세포를 긁어서 준비하였고, -80℃에서 보관했다.
Fab 항체 라이브러리 개발을 위한 효모 반수체 항체 라이브러리 생성
약간의 수정을 가하여 제조업체(Zymo Research) 프로토콜에 따라 형질변환을 수행했다. 간단히 말해서, EBY100ura3Δ4.03 균주(S. 세르비시에 세포) 및 YVH10을 220rpm 및 30℃에서 플랫폼 진탕기에서 5ml YPD 배지에서 밤새 성장시켰다. 하룻밤 배양물의 OD600 값을 확인했고, 하룻밤 배양물은 OD600 ~0.4에서 시작하여 이의 OD600이 ~1.0-1.2에 도달할 때까지, 50ml YPD 배지에 220rpm의 인큐베이터 진탕기에서 30℃에서 재-접종했다. 효모 세포를 3000rpm에서 3분 동안 원심분리하여 수집하고 배지를 제거했다. 세포 펠렛을 10 ml EZ1 용액으로 세척한 후 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 그런 다음, 세포 펠렛을 600 μl의 EZ2 용액에 재현탁했고, RT에서 5분 동안 추가 항온처리하였다. 컴피턴트(competent) 효모 세포를 포함하는 EZ2 용액 200μl를 플라스미드 DNA의 적당량 및 EZ3 용액 500μl와 혼합하였다. 위의 컴피턴트 효모 세포와 DNA 혼합물을 30℃에서 1시간 30분 동안 항온처리했다. 효모 세포를 5분 동안 2400rpm에서 원심분리하였다. 200 μl의 상청액을 버리고 세포 펠렛을 남은 상청액에 재-현탁시켰다.
세포 현탁액으로부터 10배 연속 희석된 세포를 준비하고, 100μl의 10-3 희석된 세포를 선택 플레이트에 플레이팅하고, 30℃ 인큐베이터에서 3-4일 동안 항온처리했다. 트립토판-배제(drop out) 글루코스 배지에서 중쇄 항체 라이브러리로 형질전환된 EBY100ura3Δ4.03을 선별하였다. 그러나, 경쇄 항체 라이브러리가 있는 YVH10 균주는 우라실-배제 드롭아웃 배지에서 선별되었다. 라이브러리 크기는 3일 후 콜로니 수에서 결정되었고, ~105로 추정되었다. (도 5A) 반수체 효모 항체 라이브러리의 20% 글리세롤 스톡을 준비하고 -80℃에서 보관했다.
효모 교배(mating)를 통한 이배체 효모 Fab 라이브러리 생성
상이한 교배 유형을 갖는 중쇄 및 경쇄 라이브러리를 갖는 2개의 반수체 효모 균주를 아미노산-배제 글루코스 배지로 긁어냈다. 두 반수체 세포 배양물의 OD600을 확인했다. 각 배양물의 약 1 OD600을 1.5ml 마이크로퓨지 튜브에 넣고, 3-5분 동안 13000rpm에서 회전시켰다. 상청액을 버리고, 각 펠릿에 정제수 100 μL을 추가하고 함께 섞었다. 혼합 효모 배양물을 YPD 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 5-6시간 동안 항온처리했다. 5-6시간 후 YPD 플레이트로부터의 효모 세포를 긁어내고, 긁어낸 효모 세포의 OD600을 모니터링했다. 긁어낸 배양물을 시작 OD600이 0.1인 ura-trp-이중-배제된 포도당 배지에 접종하였고, 30℃, 220rpm(두배수체 농축을 위해)에서 적어도 24시간 동안 항온처리했다.
풍부화된 이배수체 배양물의 OD600을 모니터링하고, 약 500개 및 1000개 세포를 포함하는 농축 배양물로부터 희석액을 준비했다. 희석액을 단일 및 이중-아미노산-배제 글루코스 한천 플레이트에 플레이팅하고, 30℃에서 2-3일 동안 항온처리했다. 이배수체 라이브러리는 ura-trp-이중 배제 글루코스 플레이트에서 선별되었다. 남은 풍부화된 이배수체 배양액의 20% 글리세롤 스톡을 준비하고, -80℃에서 보관했다. 교배 효율 백분율은 이중-배제 배지 플레이트에서 성장한 이배수체 콜로니 수를 단일-배제 플레이트에서 성장한 총 콜로니 수로 나누어 산출했다. 효모 교배를 통해 효모 fab 항체 라이브러리 생성 (도 5C).
효모 Fab 및 ScFv 라이브러리의 유동 소팅
효모 샘플을 3ml의 SDCAA 배지에 접종하고, 30℃, 220rpm에서 하룻밤 효모 세포를 항온처리했다. 다음날, 접종된 배양물의 OD600 값을 1:10으로 희석하여 모니터링했다. 효모 샘플의 0.3 OD600 세포를 20 ml 2x SGCAA 배지에 접종했고, 인큐베이터 진탕기에서 20℃, 220rpm에서 48시간 동안 항온처리했다. 유도된 배양물의 OD600은 48시간 후에 1:10으로 희석하여 모니터링하였다. 약 0.1의 OD600 세포를 성장된 효모 배양물로부터 1.5ml 튜브로 취하고, 2분 동안 13,000rpm에서 회전시켰다. 상층액을 버리고, 100 μl의 1× PBS를 추가하고, 13,000 rpm에서 2분간 242회전시켜 펠렛을 세척하였다. 상층액을 다시 버렸다. 적절한 농도의 200 μl의 일차 항체 또는 바이오틴화된 항원을 효모 세포 펠렛에 첨가하고, RT에서 회전하면서 45분 동안 항온처리했다. 항온처리 후, 세포를 13,000 rpm에서 2분 동안 회전시키고 상청액을 버렸다. 0.1% BSA를 포함하는 PBS 200μl 를 첨가하여 세포 펠렛을 2회 세척하고, 13,000rpm에서 2분간 회전시킨 후 상층액을 버렸다. 적절한 농도의 200 μl의 2차 항체를 효모 세포 펠렛에 첨가하고, 얼음 상에서 30분 동안 항온처리했다. 항온처리 후, 세포를 13,000 rpm에서 2분 동안 회전시키고 상청액을 버렸다. 0.1% BSA를 포함하는 1XPBS 200μl 를 첨가하고, 13,000rpm에서 2분간 회전시킨 후 세포 펠렛을 두 차례 세척하였다. 300 μL 의 1X PBS를 효모 세포 펠렛에 첨가하고, 샘플을 유동 소팅기를 통해 분석했다 (도 5D 및 5E). 일차, 2차 항체 및 바이오틴화된 항원에 대한 농도는 표 18에 제시되어 있다.
표 18
Figure pct00094
소팅된/재-소팅된 ScFv 또는 소팅된/재-소팅된 Fab 풀에서 개별 클론 스크리닝
개별 클론 스크리닝을 위한 유동 소팅 중에 논의된 바와 같이 유사한 유동 착색 프로토콜(flow staining protocol)이 사용되었다. 약 1000개의 콜로니를 유동 세포 분석을 통해 발현 및 항원 결합에 대해 스크리닝했다 (도 5F, 5G, 및 5H). 이들 클론은 각각 Fab 및 ScFv 클론의 경우, 결합 및 발현 모두에 대해 >2% 및 >5% 양성을 기준으로 선별되었다.
또한, 가용성 CLEC2D 항원에 대한 소팅에서 얻은 선별된 항체 유전자 풀을 차세대 시퀀싱에 적용했다. 이 실행은 항체 유전자 풀의 ScFv 및 Fab 형식 모두에 대해 수행되었다. 구체화된 바와 같이, 서열 식별 번호: 서열 식별 번호: 44; 서열 식별 번호: 45; 서열 식별 번호: 42; 서열 식별 번호: 1; 서열 식별 번호: 73; 서열 식별 번호: 21; 서열 식별 번호: 35; 서열 식별 번호: 58; 서열 식별 번호: 7; 서열 식별 번호: 260; 서열 식별 번호: 261; 서열 식별 번호: 258; 서열 식별 번호: 217; 서열 식별 번호: 289; 서열 식별 번호: 237; 서열 식별 번호: 251; 서열 식별 번호: 274; 서열 식별 번호: 223은 Fab 포멧으로 스크리닝된 클론에 적용 가능한 최종 소팅 라운드에서 2.5배에서 7배 범위로 농축되었으며, ScFv 포멧으로 스크리닝된 클론은 2배에서 106배까지의 범위에서 근사치로 농축되었다. 모든 소팅 라운드에서 관찰된 유전자 카피의 수를 통해 농축 배수를 추정했다. 이것은 CLEC2D 항원에 대한 항체가 나이브 항체 라이브러리 스크리닝된 파지 및 효모 디스플레이 기술로 구성된 강력한 플랫폼을 통해 스크리닝되며, 단리되고 및 식별되었다는 사실을 추가로 뒷받침한다.
마지막으로, 개별 효모 클론은 유동세포 분석을 사용하여 확인되었다. 후속적으로, 대등 그룹 항체 유전자 시퀀싱을 수행하고, 포유류 유전자 발현 벡터에 대한 추가 클로닝을 위해 신규 항체 서열을 취하였다. 효모 플라스미드 DNA는 Zymoprep 효모 플라스미드 miniprep 키트를 이용하여 Fab 또는 ScFv 포쳇 모두에 존재하는 선별된 효모 클론으로부터 단리되었다. Fab 포멧의 선별된 효모 클론의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 벡터 특이적 프라이머를 이용하여 증폭시키고, 이어서 서열화하였다. ScFv 포멧의 클론의 경우, 효모 콜로니에서 분리된 플라스미드를 더 많은 생산을 위해 NEB-알파 세포로 후속적으로 형질전환시켰다. NEB-알파 세포에서 단리된 플라스미드를 시퀀싱 확인을 위해 보냈다. 도 5H는 유동 세포 분석에 의해 결정된 CLEC2D 항원과 단일클론성 항체 클론의 결합 백분율을 요약한다. 이 데이터는 단일클론성 항체 클론의 적어도 약 80%가 CLEC2D 항원에 특이적으로 그리고 검출가능하게 결합하는 것으로 나타났음을 시사한다.
모든 서열 식별자 및 관련 서열 동일성 분석은 표 19에 설명되어 있고, 이 표에서는 가변 중쇄에 대한 항체 클론을 열거하고 있으며, 표 20에서는 가변 카파 경쇄에 대한 항체 클론을 열거하고 있다.
표 19. 항-CLEC2D의 VH 서열의 서열 식별 번호
Figure pct00095
Figure pct00096
표 20. 항-CLEC2D의 VL 서열의 서열 식별 번호
Figure pct00097
Figure pct00098
실시예 3: 신규한 항체 클론을 확인하기 위한 항체 서열 분석
CLEC2D 항원에 특이적으로 결합하는 중쇄 및 경쇄 모두에 대한 단리된 항체의 가변 영역은 6개의 초가변 영역을 포함한다: 경쇄로부터 3개 초가변 영역 (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3) 그리고 중쇄로부터 3개 초가변 영역 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3). 초가변 영역의 길이는 CDRH3에 대해 나타낸 바와 같이 상당히 다양할 수 있는데, 이들의 길이는 풀(pool)에서 유의적으로 현시되며, 그 범위는 4-23개 아미노산 범위다. CLEC2D에 대한 선택된 항체 유전자의 서열 가변성을 이해하기 위해, 모든 중쇄 CDRH3 길이에서 아미노산 조성을 측정하였다 (도 6A, 6B, 6C, 및 6D). 특이성을 결정하기 위해 상기 항체 서열을 분석하였다. 다중 서열 정렬 도구를 사용하여 IMGT, IgBLAST 등과 같은 데이터베이스에 기재된 항체 서열과 항체 유전자 서열을 비교했다.
선별된 서열 식별된 항체 유전자의 추가 분석에서 탈-아미드화 모티프, 이성질체화 모티프, 단백질 분해 모티프, N-연계된 글리코실화 부위, 가소적(plastic) 결합 모티프, 스트렙트아비딘 결합 모티프, 인간 Fc 결합 모티프, 마우스 IgM 결합 모티프, 소의 IgG 모티프, 프롤린 풍부 모티프 및 시스테인 풍부 모티프, 등등을 갖는 항체 유전자를 확인했다. 이러한 항체 유전자는 치료적 단일클론 항체 개발에 적합하지 않은 것으로 간주되어, 추가 평가를 위해 고려되지 않았다. 개별 효모 콜로니 스크리닝 수준에서 가용성 CLEC2D 항원에 대한 항체 유전자에 대해 관찰된 결합의 규모에 기초하여, 상위 40개 결합자 (이에 국한되지 않음)는 후속 개발에 있어서 추가 관심의 대상이 되었다. 일단 확인된 항체 유전자 서열만 추가 클로닝, 발현 및 특성화를 위해 취했다.
실시예 4: 신규한 항체 유전자의 클로닝
오류가 없는 항체 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역은 후속적으로 인간, 마우스 및 시노몰구스 원숭이 종으로부터 유래된 다양한 아이소타입 백본 (야생형 또는 돌연변이)을 갖는 포유동물 발현 벡터로 클로닝되었다. 하기 표 21은 식별된 항-CLEC2D 항체 유전자의 클로닝을 위해 개발되고, Microbial Type Culture Collection and Gene Bank (MTCC), India에 기탁된 관련 벡터들이 요약되어 있다.
표 21
Figure pct00099
구체화된 바와 같이, 포유류 발현 벡터 pZB007 (MTCC 25358) & pZB008 (MTCC 25359) 은 각각 가변 중쇄 및 경쇄 유전자 클로닝을 위해 지정, 사용되었다(도 7A 및 7B).이들 벡터는 적합한 프로모터 서열의 제어 하에 항체 유전자의 발현을 위해 맞춤 설계되고, 합성되었다. 상기 플라스미드는 강력한 프로모터에 의해 구동되는 카나마이신R/퓨로마이신R 카세트 및 증식을 위한 높은-복제-수의 ColE1/pMB1/pBR322/pUC 복제 원점을 운반한다(도 7A 및 7B).
인간 나이브 항체 라이브러리를 사용하여, 가용성 CLEC2D 항원에 대해 파아지 및 효모 디스플레이 플랫폼을 통해 스크리닝된 서열-확인된 선택된 플라스미드를 후속 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용했다. 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 갖는 선별된 클론을 증폭하기 위해, 서열 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 Eppendorf™ Mastercycler™ pro PCR 시스템에서 0.2μM의 각 프라이머(Eurofins, India), 200단위(units)의 Phusion 중합효소(NEB)로 구성된 50μL 혼합물 부피로 수행되었다. 94 ℃, 3분 동안 초기 변성 후, 94 ℃에서 30초간 변성, 60 ℃에서 50초간 어닐링, 72 ℃에서 10초간 프라이머 연장, 72 ℃에서 10분간 최종 연장으로 구성된 주기를 30회 실행되었다. PCR 증폭 산물은 QIAquick 겔 추출 키트를 사용하여 추출되었다. 플라스미드 벡터 pZB007은 AscI 및 XbaI에 의한 제한효소 절단을 통하여 선형화되었고, pZB008의 경우에는 EcoRI 및 AscI에 의한 제한효소 절단을 통하여 선형화되었고 삽입 단편 및 선형화된 벡터는 QIAGEN 키트(20021)를 사용하여 겔 추출되었다. 이들 정제된 벡터 및 삽입체는 Infusion HD 클로닝 키트(Takara, USA)를 사용하여 재조합에 사용하였다. 주입 반응 혼합물의 박테리아 세포로의 형질전환을 수행하였다. -80℃ 냉동고에서 컴피턴트 대장균(E.coli) 세포(Stellar)의 100 μL 분취량을 취하여 얼음에서 5분 동안 해동시켰다. 재조합 샘플의 50%를 컴피턴트 세포에 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 얼음 위에서 20분 동안 항온처리하였다. 건식 조에서 42˚C에서 50초간 열 쇼크를 가하였다. 바이알을 2분 동안 얼음 위에서 빠르게 냉각시켰다. 37℃로 사전-예열된 LB 브로스 0.950mL를 첨가하고, 셰이커 인큐베이터에서 37℃, 220rpm에서 1시간 동안 항온처리하였다. 생성된 배양액 100 μL를 카나마이신이 포함된 LB 한천 배지에 플레이팅하고, 37 ℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다.
특이적 DNA 플라스미드를 함유하는 형질전환체를 카나마이신이 함유된 LB 브로스 5mL에 접종하고, 37℃에서 하룻밤 동안 220rpm에서 항온처리하였다. 플라스미드 DNA는 QIAGEN 키트를 사용하여 하룻밤 동안 항온처리된 배양물에서 분리되었다. 단리된 클론을 SpeI 및 XhoI 효소를 이용한 제한효소 분석을 통해 스크리닝하고, 시퀀싱을 통해 확인하였으며, 오류가 없는 것으로 확인되었다. 확인된 클론에서 서열-확인된 플라스미드 DNA를 QIAprep Spin Midiprep 키트(Qiagen)를 사용하여 대규모로 정제하고, 후속 형질감염 실험에 사용했다.
실시예 5: 항-CLEC2D 항체의 준비 및 CHO 발현된 신규한 단일클론성 항체들의 선별
신규한 단일클론성 항체 클론을 선별하기 위한 전략
치료용 항체의 디자인과 특성으로 인해 향후 개발을 위해 특정 단일 클론 항체를 선별하는 데 합리적이어야 한다. 더욱이, 약동학, 용해도, 발현, 점도 및 장기-안정성과 같은 분자 속성을 예측하기 어렵고, 매개변수들간의 관계에 대한 이해가 다소 제한되어 있기 때문, 항체의 생성, 제조 및 저장은 지속적으로 도전을 받고 있다. 또한, 항체 디스플레이 플랫폼을 통해 유입된 선별된/식별된 다양한 항체 유전자를 고려하여 순위 프로토콜을 통해 정렬해야 할 필요가 있었다. 기존 시퀀싱 데이터, 예를 들어, 그 중에서도 고유성, 클론의 추가 선택/개발에 도움이 되지 않을 수 있는 특정 모티프의 존재; 가용성 형태 또는 막 결합 형태의 CLEC2D 항원에 대한 친화력 및 기능성; 역가, 수율, 회수율, 분석 프로파일이 독립적 또는 조합적으로 구체화된 기존 시퀀싱 데이터를 기반으로 포괄적인 등급화 기능/방법을 사용/개발했다.
클론은 최종 클론 선별에 효과적으로 사용될 역동적 선별 시스템을 갖는 개발 과정에서 핵심적 매개변수에 대해 여러 차례의 검사를 거치게 된다.
세포 표면 발현을 위한 전장의 CLEC2D 유전자를 사용한 CHO 세포 형질감염.
세포 표면에 발현된 CLEC2D 단백질에 대해 식별된 신규 항체 유전자의 결합 속성을 평가하기 위해, 전장 CLEC2D 구조체를 합성하였다. 고유한 신호 서열은 CHO 세포에서 효율적인 표면 발현을 위해 사용되었다. 전장의 CLEC2D 유전자 서열을 pCDNA3.1 포유류 발현 벡터로 클로닝하였다 (도 8A). 후속적으로, 상기 구조체를 neb-알파로 형질전환하고 Qiagen midi prep 키트를 사용하여 대량으로 단리했다. >90% 생존율을 갖는 CHO 현탁 세포를 전장 CLEC2D 유전자 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 구체화된 바와 같이, 10ml 부피의 형질감염에 대해 1.25X106 세포/ml가 취해졌고, 여기서 CHO 세포는 4-5분 동안 1000-1400 rpm에서 원심분리되었다. 소모된 배지를 따라내고, 세포를 2.5 ml의 OptiMEM I 배지에 재-현탁시켰다. PlusTM 시약과 함께 리포펙타민 LTX를 사용하여 DNA 구조체를 형질감염시켰다. 5-10 μg의 DNA를 1:3~1:6의 DNA 대비 형질감염 시약 비율로 사용하고, 5-10 μg PlusTM 시약을 사용했다. DNA 및 리포펙타민 LTX 복합체를 2.5ml OptiMEM I에서 제조하고, 복합체 형성을 위해 20-25℃에서 5분 동안 항온처리했다. 형질감염 혼합물을 세포 현탁액에 천천히 첨가하였다. 세포를 100-120 RPM에서 5% CO2 진탕기 인큐베이터에서 37℃에서 4-6시간 동안 항온처리하였다. 5ml의 Power CHO2 CD 성장 배지를 세포에 첨가했다. 세포를 100-120 RPM에서 5% CO2 진탕기 인큐베이터에서 37℃에서 항온처리하였다. 형질감염 2-4일 후, 2 ml Power CHO2 CD 성장 배지를 첨가하고, 200 mM 스톡으로부터 Glutamax를 첨가하여 2 mM의 최종 농도를 달성하였다. 세포를 100-120 RPM에서 5% CO2 진탕기 인큐베이터에서 37℃에서 항온처리하였다. 형질감염 후 3일, 4일 및 5일차에 유동 세포 분석을 통해 세포의 표면 항원 결합을 분석했다. 다른 곳에서 달리 언급하지 않는 한, 전장 구조체로 형질감염된 CHO 세포는 본원에서 향후 C4548로 불려질 것이다.
전장 막 고정된 CLEC2D 항원을 일시적으로 발현시키는 C4548 세포는 상업용 항-CLEC2D 항체를 사용하여 유동 세포 측정법 및 공초점 현미경 모두를 통해 검증되었다. 대략적으로, 50,000-100,000개의 세포를 96-웰 U자형 바닥 플레이트에서 취하였다. 100 μl 분석 완충액에 1-5 μg의 시판용 항-CLEC2D 항체(4C7)(Cat # H00029121-M01; Novus Biologicals)를 형질감염안된 CHO 및 전장 CLEC2D 표면 항원 구조체로 형질감염된 C4548에 첨가했고, 1-2% BSA가 있는 DPBS에서 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. 1시간 항온처리 후, 플레이트를 3-5분 동안 1000-1400rpm에서 원심분리하였다. 상기 세포를 0.1% BSA 용액 200 μl로 두 차례 더 세척하였다. 이차 항체, 즉 항-마우스 Alexa 488(Thermo Fisher Scientific)를 희석액 100에 1을 첨가했다. 후속적으로, 플레이트를 암실에서 30분 동안 실온에서 항온처리했다. 상기 웰을 0.1% BSA 용액으로 두 차례 세척하고, 유동 세포 분석으로 분석하였다. 단일클론성 항체의 세포 표면 결합은 CLEC2D 발현 CHO 세포와 형질감염되지 않은 CHO 세포 사이의 형광 신호 증가를 비교함으로써 평가되었다. CLEC2D 항원의 표면 발현은 C4548 형질감염된 CHO 세포에서 4일에서 5일 사이에 최적이었다 (도 8B).
공초점 현미경 실험을 위해, 웰당 250μl의 12μg/ml 폴리 D 라이신을 첨가하고, 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리했다. 챔버를 500μl의 DPBS로 두 번 세척하고, 2℃ ~ 8℃에 보관했다. 형질감염되지 않은 CLEC2D 항원을 발현하는 CHO 세포, C4548이 사용되었고, 이때 세포 계수 및 생존력 데이터는 vi-cell Beckman 코울터(coulter)를 사용하여 수집되었다. 50,000개의 세포를 웰당 10% FBS와 함께 500μl 성장 배지(4mM 글루타민 + 1% Penstrep가 포함된 Power CHO2)에 씨딩했다. 상기 모든 세포는 실험 전에 2일 동안 37℃에서 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 항온처리했다. 더욱이, 세포를 1X PBS로 세척한 다음, PBS에서 2% 포름알데히드에 실온(RT)에서 5분 동안 고정시켰다. 그런 다음, 세포를 1X PBS로 두 번 헹구고, 실온에서 1시간 동안 5% BSA로 차단했다. 희석된 일차 항체, 즉 항-CLEC2D 항체 (4C7) (2μg)와 1시간 동안 RT에서 항온처리한 후, PBS에서 적어도 3회 세척한 다음, 항-마우스 Alexa 488(Thermo Fisher Scientific), 2차 항체(2μg)와 함께 RT에서 1시간 동안 항온처리했다. 세포 핵을 DAPI (RT에서 5분 동안 1:1000)를 사용하여 착색했다. 그런 다음, 세포를 1X PBS에서 두 번 헹구고, 영상화될 때까지 PBS에 잠긴 상태로 유지시켰다. 면역형광 현미경 검사는 1.35-NA 대물렌즈로 60X 배율로 Olympus FV3000-4 레이저 주사(scanning) 공초점 현미경에서 수행되었다. 세포는 적절한 파장을 사용하여 처리 후 16시간에 이미지화되었다(DAPI의 경우, λex 405nm 및 λem 430-470nm; Alexa 488의 경우, λex 488nm 및 λem 510-530 nm. Fiji ImageJ 소프트웨어로 이미지를 분석했다.
현미경 이미지로 확인된 바와 같이, C4548 세포에서 CLEC2D의 표면 발현은 세포 표면에 분포된 것으로 관찰되었으며, 반면 형질감염되지 않은 CHO 세포는 현미경 하에서 항-CLEC2D 항체 의존적 신호를 제공하지 못했다 (도 8C).
신규한 항-CLEC2D 단일클론성 항체 클론을 발현시키기 위한 CHO 세포 형질감염
항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 올바르게 폴딩된 단일클론성 항체를 배양 배지로 분비하기 위한 적절한 신호 서열을 갖는 포유류 유전자 발현 벡터를 사용하여 발현시켰다. 90% 이상의 생존율에서 CHO 현탁 세포를 항체 유전자 발현을 위해 형질감염시켰다. CHO 세포를 1.25×106 세포/ml에서 4-5분 동안 1000-1400 rpm에서 원심분리했다. 소모된 배지를 따라내었다. 세포를 25 ml의 OptiMEM I 배지에 재-현탁시켰다. 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현시키는 플라스미드는 다양한 화학량론 (이를 테면, 1:2, 1:3, 1:4, 2:3, 3:1, 4:1 등등)에서 리포펙타민 LTX과 PlusTM 시약을 이용하여 공동-형질감염시켰다. 50-100 μg의 DNA를 1:3~1:6의 DNA 대비 형질감염 시약 비율로 사용하고, 50-100 μg PlusTM 시약을 사용했다. DNA 및 리포펙타민 LTX 복합체를 25ml OptiMEM I에서 제조하고, 복합체 형성을 위해 20-25℃에서 5분 동안 항온처리했다. 형질감염 혼합물을 세포 현탁액에 천천히 첨가하였다. 세포를 100-120 RPM에서 5% CO2 진탕기 인큐베이터에서 37℃에서 4-6시간 동안 항온처리하였다. 50ml의 Power CHO2 CD 성장 배지를 세포에 첨가했다. 세포를 100-120 RPM에서 5% CO2 진탕기 인큐베이터에서 37℃에서 항온처리하였다. 형질감염 2-4일 후, 20 ml Power CHO2 CD 성장 배지를 첨가하고, 200 mM 스톡으로부터 Glutamax를 첨가하여 2 mM의 최종 농도를 달성하였다. 세포를 100-120 RPM에서 5% CO2 진탕기 인큐베이터에서 37℃에서 항온처리하였다. 형질감염 후 6일 차에, 세포 배양 상청액 (50 mL)을 10-15분 동안 1400-2000rpm에서 원심분리에 의해 수확하였다.
세포 표면 결합을 이용한 CHO 발현된 단일클론성 항체들의 스크리닝: 일시적
후속적으로, 분비된 신규한 항-CLEC2D 항체 클론을 함유하는 50mL의 수확된 배양 상청액을 Mabselect SuRe 수지(GE Healthcare)를 함유하는 셀그래비티(cellgravity) 컬럼을 사용하여 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이 방법은 0.5M 수산화나트륨(NaOH) 용액의 3 컬럼 부피(CV)를 실온에서 5분 동안 통과시킨 다음, 8 컬럼 부피의 정제수를 통과시키는 단백질 A 컬럼 위생화(sanitization) 단계로 시작한다. 후속적으로, 단백질 A 컬럼은 30mM 인산나트륨, 120mM NaCl pH 7.0±0.2를 포함하는 단백질 A 평형 완충액의 3 CV로 평형화되었다. 50mL 배양물 상청액을 평형화된 단백질 A 컬럼에 로딩하는 동안 통과액을 다시-로딩했다. 이 과정을 두 차례 반복하였다. 3 CV의 단백질 A 평형 완충액 세척을 수행한 후, 3 CV의 단백질 A 고-염 완충액(30mM 인산나트륨, 1M NaCl pH 7.0±0.2) 세척을 수행했다.
추가로, 3 CV의 단백질 A 평형 완충액을 컬럼에 통과시킨 후 4 CV의 단백질 A 낮은-pH 완충액(30mM 인산나트륨, 50mM NaCl pH 6.0±0.2)으로 세척하였다. 그 다음, 5 CV의 단백질 A 용출 완충액(30mM 인산나트륨, 50mM NaCl pH 3.0±0.1)을 사용하여 결합된 단일클론성 항-CLEC2D 항체를 용출시켰다. 더욱이, 항체를 포함하는 단백질-A 용리액은 적절한 양의 1M Tris 용액을 첨가하여 pH ~7.0으로 중화되었다.
중화 후, 단백질-A 용리액을 농축하고, Amicon 30kDa 컷-오프 농축기를 사용하여 완충액을 1X PBS로 교환했다. 농축기로부터 단백질 샘플을 회수하고, Nanodrop Biophotometer를 사용하여 A280으로 농도를 측정하였다. 단백질은 환원 조건 및 비-환원 조건 하에서 도 9A에 도시된 바와 같이, SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 후속적으로, 이 단백질 샘플은 추가 실험에 사용되었다.
정량화로 판단한 바와 같이, 환원 조건 및 비-환원 조건에서 산물 품질을 확인하기 위해, 생성물 수율이 100μg 이상인 클론을 SDS-PAGE 분석의 최종 후보 목록에 올렸다. 연속적으로, SDS-PAGE 겔에서 두드러진 밴드가 있는 클론은 설명된 바와 같이 비-환원 조건에서 ~150kDa, 환원 조건에서 ~50kDa(중쇄를 나타냄) 및 ~25kDa(경쇄를 나타냄)가 추가 분석을 위해 최종 후보 목록에 추가되었다 (도 9A). 또한, 순도는 표적 단백질과 함께 나타나는 밴드 수를 통해 판단하고, 클론을 선별/명단에 등재하는 기준으로도 고려되었다. 비-환원 조건에서 3개 이상의 밴드를 갖는 단백질과 마찬가지로 환원 조건에서 중쇄 또는 경쇄에 대해 1개 이상의 밴드를 갖는 단백질은 고려하지 않았다.
세포 표면 결합 분석: 유동 세포측정 및 공촛점 현미경을 통한
전장의 막 고정된 CLEC2D 항원을 일시적으로 발현시키는 CHO 현탁액 세포들을 이용하여 항체 샘플 (세포 배양 상청액 및/또는 정제된 단백질)을 스크리닝하였다. 50,000-100,000개의 세포를 96-웰 U자형 바닥 플레이트에서 취하였다. 100 μl의 세포 배양 상청액 또는 100 μl 분석 완충액내 0.03-3 μg의 정제된 항체를 CLEC2D 발현 세포에 첨가하였고, 1-2% BSA가 포함된 DPBS에서 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 1시간 항온처리 후, 플레이트를 3-5분 동안 1000-1400rpm에서 원심분리하였다. 상기 세포를 0.1% BSA 용액 200 μl로 두 차례 더 세척하였다. 1/100 희석액의 2차 항체 -염소 항-인간 IgG FITC를 첨가했다. 후속적으로, 플레이트를 암실에서 30분 동안 실온에서 항온처리했다. 상기 웰을 0.1% BSA 용액으로 두 차례 세척하고, 유동 세포 분석으로 분석하였다. 상업적으로 이용가능한 항-CLEC2D 단일클론성 Ab (Novus Biologicals)를 양성 대조군으로 이용하였고, 항-마우스 Alexa 488 (Thermo Fisher Scientific)를 2차 항체로 이용하였다. 단일클론성 항체의 세포 표면 결합은 CLEC2D 발현 CHO 세포와 형질감염되지 않은 CHO 세포 사이의 형광 신호 증가를 비교함으로써 평가되었다.
확인된 신규한 항-CLEC2D 단일클론 항체를 스크리닝하기 위해, 검증된 C4548 세포 및 PC3 세포를 유동 세포 분석 및 공초점 현미경 모두를 통해 CLEC2D 항원 결합 모니터링에 적용하였다. 실험에 앞서, Vi-cell XR 자동 세포 계수기로 세포 수를 측정했다. 유동 세포 분석을 위한 샘플 준비 방법은 위에서 설명한 바와 같이, ~1-5 μg의 정제된 항-CLEC2D 항체 클론 및 참조 양성 대조군을 각각 사용하여 형질감염되지 않은 CHO 세포 및 C4548 세포에 대한 막 결합 CLEC2D 결합을 평가했다. 세포를 4-5분 동안 1400-1500 rpm에서 원심분리하였다. 펠렛을 1ml DPBS에 재현탁시켰다. 50,000개의 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 분취했다. 테스트 샘플과 참조 대조군 모두를 각 웰에 첨가하고, 실온(25℃)에서 30-60분 동안 항온처리했다. 플레이트를 4-5분 동안 1400-1500 rpm에서 원심분리하고, 상청액을 흡출시키고, 세포를 DPBS내 0.1% BSA로 세척하였다. 2.5 ml의 2% BSA를 DPBS로 50 ml로 희석하였다. 염소 항-인간 IgG FITC 콘쥬게이트를 2차 항체로 이용하였다. 이차 항체의 1:100 희석액을 DPBS에 준비하였고, 100μl를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 30 분 동안 실온(25℃) 암 상태에서 항온처리했다. 세포를 0.1% BSA로 세척하고, 100μl의 1% BSA에 재현탁시켰다. 샘플을 유동-세포 분석으로 분석했다 (도 9B).
형질감염되지 않은 CHO 세포에 대한 테스트 샘플 상청액의 결합을 평가하고, 하기 공식을 사용하여 C4548 세포 표면에 대한 특이적 결합 계산에 사용하였다:
Figure pct00100
공초점 현미경 실험을 위해, PC3 세포들을 씨딩하였고, 이때 웰당 250μl의 12μg/ml 폴리 D 라이신을 첨가하고, 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리했다. 챔버를 500 μl의 DPBS로 두 번 세척하고, 2℃ ~ 8℃에 보관했다. PC3와 같은 부착 세포주는 0.05% 트립신을 사용하여 트립신 처리되었다. 트리판 블루 착색을 사용하여, 혈구계로 세포 수 및 생존력 데이터를 수집했다. 세포를 웰당 500μl 성장 배지와 함께, 20000개 세포/웰의 밀도로 씨딩하고, 실험 전에 2일 동안 37℃에서 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 항온처리했다. 더욱이, PC3 세포를 1X PBS로 세척한 다음, PBS에서 2% 포름알데히드에 RT에서 5분 동안 고정시켰다. 그런 다음, 세포를 1X PBS로 두 번 헹구고, 실온에서 1시간 동안 5% BSA로 차단했다.
희석된 테스트 항체 샘플, 즉 신규한 독특한 항-CLEC2D 항체(2μg) 및 참조 대조군으로 시판 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 1시간 항온처리 후, PBS에서 적어도 3회 세척한 다음, Alexa Fluor 488 염소 항-인간 IgG 및 항-마우스 Alexa 488 (Thermo Fisher Scientific)를 이용가능한 2차 항체(2μg)와 함께 RT에서 1시간 동안 항온처리했다. 세포 핵을 DAPI (RT에서 5분 동안 1:1000)를 사용하여 착색했다. 그런 다음, 세포를 1X PBS에서 두 번 헹구고, 영상화될 때까지 PBS에 잠긴 상태로 유지시켰다. 면역형광 현미경 검사는 1.35-NA 대물렌즈로 60X 배율로 Olympus FV3000-4 레이저 주사 공초점 현미경에서 수행되었다. 세포는 적절한 파장을 사용하여 처리 후 16시간에 이미지화되었다(DAPI의 경우, λex 405nm 및 λem 430-470nm; Alexa 488의 경우, λex 488nm 및 λem 510-530 nm. Fiji ImageJ 소프트웨어로 이미지를 분석했다. 테스트된 mAb의 CLEC2D 항원 결합에 대한 변이 및 결합 데이터는 + (낮은 결합)에서 +++ (높은 결합)의 등급으로 제공된다 (표 19, 및 도 9C). 표면 결합에 대한 변이가 관찰되었고, 결합 데이터는 표 22에서 +(낮은 결합) 내지 +++(높은 결합)의 등급으로 제공된다. 구체화된 바와 같이, 항체 mAbC4252에서는 표면 결합이 탐지되지 않았고, 한편 항체C0610의 경우, 낮은 결합이 관찰되었으며, 따라서 (+)로 등급화되었으며, 한편 다른 클론들은 여전히 유의적인 차등적 표면 결합을 보였다.
표 22
Figure pct00101
Figure pct00102
위에서 언급한 모든 기준과 단리된 항-CLEC2D 항체의 생물물리학적 및 기능적 속성을 포함하는 각각의 관찰된 결과를 기반으로 하여, 9개의 독특한 항-CLEC2D 항체 서열, C5397, C5852, C3566, C2901, C4577, C2685, C0694, C0997, C0800이 안정적인 세포주 개발을 위해 선별되었지만, 이에 국한되지는 않는다.
안정적인 세포주의 생성
단일클론성 항체 (mAb) 산물의 임상적 효과는 상업적 성공을 주도했다.
다른 사람들에게 알려진 바와 같이, 포유류 세포는 생산된 mAb가 인간 형태와 생화학적으로 유사하기 때문에, 현재 대규모 생산에 선호되는 시스템이다. 안정적인 세포주 생성 과정은 높은 생산성, 안정적인 장기적 발현 및 우수한 제품 품질을 가진 클론이 드물기 때문에 지루하고, 시간이 많이 걸리는 작업이다. 포유류 세포에서 mAb 생산은 일시적 또는 안정적인 형질감염으로 수행될 수 있다. 이전 섹션에서 볼 수 있듯이, 일시적인 형질감염을 통해 약물 발견의 초기 단계에서 사용할 소량의 제품을 비교적 빠르게 만들 수 있다. 그러나, 안정적으로 형질감염된 세포주는 대규모 산업 생산에 더 널리 사용된다. 더 중요한 것은, 제조에 사용되는 안정적인 세포주는 많은 양의 일관된 제품을 얻기 위해, 단일 세포 클론에서 유래한다는 것이다.
항생제 선별:
90% 세포 생존율에서 형질감염 후 항생제 선별을 시작하였다. 세포 현탁액을 4분 동안 1400 RPM에서 원심분리하였다. 펠렛은 완전한 Power CHO2 성장 배지에 재현탁되었고, 퓨로마이신 디하이드로클로라이드의 농도는 2μg/1X10^6 세포로 조정되었다. 항생제 선별은 매 2일 또는 3일마다 수행되었다. 세포 계수 및 생존율 데이터는 표 5를 참조한다.
표 23
Figure pct00103
안정적인 풀(pool)의 반복 형질감염
세포 수는 Vi-cell XR을 사용하여 측정되었다 (표 10 참조). 형질감염 전, 세포를 계대배양하였다. 앞서 언급한 바와 같이, 2차례 추가 순차적 형질감염을 수행하였다. 3 라운드의 형질감염 완료 시, 풀을 R3 안정 풀로 지정했다. 표 24 참고.
표 24
Figure pct00104
미니풀 플레이팅(Minipool plating)
미니풀은 연속 희석 방법으로 생성되었다. 연속적으로 성장하는 세포주의 배양물은 플레이팅 2일 전, 2mM 글루타맥스가 포함된 30ml 완전 PowerCHO 2 성장 배지에서 0.5백만개 세포/ml로 계대배양되었다. 세포 수 및 생존력 데이터는 Vi-cell XR을 사용하여 수집되었다 (표 25 참고).
표 25
Figure pct00105
세포 현탁액의 연속 희석은 완전한 Power CHO2 성장 배지에서 1:10 비율로 수행되었다 (표 26 참고). 희석액 D에서 0.52ml 세포 현탁액을 취하고, 25ml의 클로닝 배지에 첨가하였다. 세포를 웰당 200μl 부피로 96웰 플레이트에 웰당 10개 세포 밀도로 씨시딩하였다. 이들 미니-풀은 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃ 온도로 유지되었다.
표 26
Figure pct00106
미니-풀 스크리닝 및 증폭:
총 117개의 미니-풀을 유동 세포 분석에 의해 스크리닝하고, CHO 세포 표면 발현 항원에 대한 결합을 평가했다. 미니풀은 유동 세포 분석을 위한 샘플 준비 방법이 위에서 설명한 것과 같이 세포 표면 결합을 기반으로 순위가 매겨졌고, 한편 항-CLEC2D 항체 단백질 및 참조 양성 대조군을 각각 발현시키는 세포 배양물 상청액 ~200 μl를 사용하여 형질감염되지 않은 CHO 세포 및 C4548 세포에 대한 막 결합 CLEC2D 결합을 평가했다 (도 10A). 정중 형광 강도에서 관찰된 배수 변화로부터 유도된 결합 크기를 통해 선별되고, 유동 세포 분석 스크리닝에서 확인된 미니풀을 96-웰 플레이트에서 24-웰 플레이트로 증폭시켰고, 5% CO2 인큐베이터에서 37 ℃, 가습 조건으로 유지되시켰다. 이들은 24-웰 플레이트에서 6-웰 플레이트 중 하나의 웰로 추가로 증폭되었다. 세포가 합류된 후, 미니-풀은 6-웰 플레이트의 1개 웰에서 25ml 성장 배지가 있는 생물반응기 튜브로 증폭되었고, 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터, 200rpm에서 가습 조건에서 유지시켰다.
단일 세포 클로닝
단일 세포들은 연속 희석 방법으로 생성되었다. 미니-풀의 연속적으로 성장하는 배양물은 클로닝 1일 전, 2mM 글루타맥스가 포함된 30ml 완전 Power CHO 2 성장 배지에서 1백만개 세포/ml로 계대배양되었다. 세포 수 및 생존력 데이터는 Vi-cell XR을 사용하여 수집되었다. 세포 현탁액의 연속 희석은 완전한 Power CHO2 성장 배지에서 1:10 비율로 수행되었다 (표 26 참고). 세포를 96-웰 플레이트에 0.5개 세포/웰의 밀도로 씨딩하고 가습된 5% CO2 정적(static) 인큐베이터에서 37℃ 온도로 유지시켰다. 세포를 희석액 D로부터 흡출시키고, 96-웰 플레이트에서 웰당 0.5개 세포/200μl 클로닝 배지의 밀도로 씨딩하였다. 플레이트를 37˚C, 상대 습도 75%의 5% CO2 인큐베이터에서 항온처리했다. 0일차부터 10일차까지 단클론성 보고서 생성을 위해 CloneSelect Imager(Molecular Devices)를 사용하여 플레이트를 스캔했다. 개별 웰 이미지는 0일차, 1일차, 2일차, 3일차, 6일차, 8일차 및 10일차에 수집하였다. 클론 집단군은 전체 웰의 0일차 이미지와 CloneSelect Imager에 의해 생성된 단클론성 보고서에서 확인되었다. 계대 번호는 P(x+0)였다. 단일 세포 클론은 세포가 합류된 후 24-웰 플레이트로 증폭되었다. 계대 번호는 P(x+1)이었다.
단일 세포 클론의 스크리닝 및 클론 증폭:
세포 배양 상청액에서 항체를 평가하고, 클론의 등급을 매기기 위해 세포 표면 결합 분석을 수행하였다. CHO 세포 표면 발현 항원에 대해 더 높은 결합을 나타내는 단일 세포 클론은 2일 후에 24-웰에서 6-웰로 증폭되었다. 계대 번호는 (x+2)이었다. 이어서 6-웰 플레이트의 3개 웰에서 증폭시켰다. 계대 번호는 (x+3)이었다. 클론은 20ml 부피의 튜브 생물반응기로 추가로 증폭되었으며, 계대 번호는 (x+4)이었다. 증폭 후, 계대 번호(x+5)의 클론에 대해 RCB 바이알을 준비했다.
유동 세포 분석을 통해 C4548 세포에서 CLEC2D 표면 단백질과의 결합에 대해 안정한 세포 배양 상청액을 평가했고, 이때 유동 세포 분석을 위한 샘플 준비 방법이 위에서 설명한 것과 같고, 한편 항-CLEC2D 항체 단백질 및 참조 양성 대조군을 각각 발현시키는 세포 배양물 상청액 ~200 μl를 사용하여 형질감염되지 않은 CHO 세포 및 C4548 세포에 대한 막 결합 CLEC2D 결합을 평가했다 (도 10B).
표 27
Figure pct00107
안정적인 세포주로부터 발현 및 정제된 단일클론성 항체 클론의 선별
단백질 정제를 위한 배양물 수거:
세포를 30ml 완전 파워 CHO2 성장 배지에 약 0.3X106 세포/ml의 밀도로 씨딩하고, 120 RPM 회전과 함께 5% CO2 인큐베이터에서 37℃, 가습 조건에서 6일 동안 항온처리했다. 4일차에 완전 파워 CHO2 성장 배지와 함께 20ml 배지 보충(top-up)이 제공되었다. 전체 세포 현탁액을 2000RPM에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확하였다. 상층액을 수집하고, 추가 정제를 위해 -20℃에 보관했다. 여기에서 앞으로, 새롭고 고유한 항-CLEC2D 항체 유전자를 포함하는 모든 각각의 안정한 세포 클론은 Cxxxx로 지칭하며, 여기서 xxxx는 4자리 숫자를 나타낸다. (표 19). 각 코드는 달리 다른 곳에서 언급되지 않은 한, 특정 항체 유전자를 함유하는 특정 안정 세포주를 나타낸다.
후속적으로, ~221개의 고유하고, 확인된 안정한 세포 클론의 배양 상청액을 단백질 A를 통해 정제한 후, 순도, 역가로 예시된, 그러나, 이에 국한되지 않은 매개변수에 대한 합리적인 판단을 거쳤다. 또한, 열 변위 분석(TSA)을 통한 열 안정성 평가는 선별/스크리닝에 대한 추가 매개변수로 통합되었다.
용융 온도가 높을수록 더 안정적인 단백질의 특성으로 간주되고, 용융 온도가 65℃ 미만인 단백질은 추가 개발을 위해 포함되지 않기로 결정했다. TSA 실험은 1x PBS에서 단백질 샘플을 0.5mg/ml 농도로 적절하게 희석하여 시작하고, 이때 SYPRO-ORANGE 형광 염료 (5000X)를 표적 단백질에 최종 농도가 5X가 되도록 첨가하였다. 추가로, 혼합물을 2분 동안 500RPM에서 원심분리하였고, CFX96 실시간 시스템으로 분석했다. 열 변성은 분당 0.5℃의 속도로 온도를 25℃에서 95℃로 증가시켜 수행하였다. 형광 강도를 0.5℃ 간격으로 수집하고, CFX Maestro 소프트웨어로 분석하고, 용융 곡선에서 Tm 값을 계산했다.
유동 및/이미징:
또한, 각각의 정제된 항-CLEC2D 단백질을 또한 유동-세포 분석 및 공초점 현미경에 의한 세포 표면 결합 분석에 대해 평가하였다. 유동 세포 분석 및 공초점 현미경 연구를 포함하는 근거는 조합 순위 매트릭스를 통해 항-CLEC2D 클론의 포괄적인 목록을 얻기 위한 것이었다.
유동 세포 측정 분석을 위한 샘플 준비 방법을 포함한 실험은 위에서 설명한 바와 같고, 한편 ~ 1-5 μg의 정제된 항-CLEC2D 항체 단백질 및 참조 양성 대조군을 각각 형질감염안된 CHO 세포들 및 C4548 세포들 상에 막 발현된 CLEC2D의 결합을 평가하는데 이용하였다 (도 10C).
공초점 현미경을 통한 이미징 획득을 위한 샘플 준비 방법을 포함한 실험은 전술한 바와 같고, 한편 ~2μg의 정제된 항-CLEC2D 항체 단백질, 이를 테면, C5848, C8408, C7832, C8800, C5595, C0694 (이에 국한되지 않음) 그리고 참조 양성 대조군을 이용하여 PC3 세포들 상에서 막 결합된 CLEC2D 항원 결합을 모니터하였다. 안정적인 세포 클론 C5848, C8408, C8800, C5595, C7832 (이에 국한되지 않음)으로부터 정제된 항-CLEC2D에 대한 이미지 연구를 통하여 관찰된 바와 같이, PC3 세포의 표면 상에 균질하지만, 차별적인 CLEC2D 항원 결합이 나타났다(도 10D).
안정적인 세포 클론에서 항-CLEC2D 항체 유전자의 안정성을 평가/이해하기 위해, 안정적으로 통합된 항-CLEC2D 항체 유전자의 CHO 세포 게놈으로의 증폭을 모니터링하고, 평가할 수 있는 RT PCR을 통한 정량적 측정이 채택되었다. CHO 세포 펠릿은 첫 번째 계대로서 P01에 해당하는 60세대 동안 각 클론의 연속 계대 배양의 일부로 모든 계대에서 얻었고, P18은 최종 60세대를 나타낸다. 여기에서 DNeasy® Blood & Tissue 키트 (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)를 사용하여 제조사의 프로토콜(프로티나제 K 처리 배양 세포용 프로토콜)에 따라 세포 펠릿에서 게놈 DNA(gDNA)를 분리했다. gDNA 준비물의 농도 및 순도는 Eppendorf BioPhotometer® D30(Eppendorf AG, Germany)을 사용하여 분광광도계로 분석되었다. 단리된 gDNA를 100ng/μL의 농도로 희석하고, qPCR을 위해 BD Ultra-Fine™ 바늘 인슐린 주사기(Becton, Dickinson and Company, NJ, USA)를 통과시켰다. Ct 값을 정량화하기 위해, 96-웰, 얇은 벽 Hard-Shell PCR 플레이트 및 Microseal® 'B' 밀봉 필름 실러(모두 Bio-Rad, Hercules, CA, USA)가 있는 CFX96™ Real-Time 시스템에서 qPCR을 수행했다. 각 qPCR 실행은 각 샘플에 대해 3중으로 수행되었다. GAPDH는 상대 대조군으로 사용되었으며, 주형 대조군(NTC)은 각 qPCR 실행에 포함되지 않았다. 각 반응 믹스에는 12.5μL의 SYBR™ Green PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific의 Appliedbiosystems, Life Technologies, Woolston Warrington, UK), 10pmol의 각 프라이머(Eurofins, Bangalore, India에서 합성) 및 물, HPLC(HiMedia Laboratories, Mumbai, India)를 최종 부피 25μL로 조정된 100ng의 용해된 gDNA가 함유되어 있다. qPCR 실행은 95℃에서 10분 동안 초기 변성 단계를 수행한 후, 95℃에서 15초 동안 변성 및 60℃에서 60초 동안 어닐링을 40회 반복하는 2-단계 프로토콜로 수행되었다. 미가공 데이터는 Cq(주기 정량화) 값을 얻기 위해, 설정 기준 차감을 사용하여 Bio-Rad CFX Manager™ 소프트웨어 응용 프로그램 버전 3.1.1517.0823(BioRad)으로 처리되었다.
설명된 정량적 접근 방식은 C5511, C4608에 대해 예시된 바와 같이 모든 클론에 사용되었다. 연구로부터 얻은 데이터는 도 10E에 도시되어 있는데, 모든 계대 수에 걸쳐 각각의 항체 쇄에 대한 Ct 값에서 <5%의 비-유의적 변이를 나타내며, 이것은 항-CLEC2D 항체 유전자의 CHO 세포 게놈으로의 안정적인 통합을 확인하고, 적어도 60세대 동안 지속됨을 확인시킨다.
조합 매트릭스를 고려하여, C4608, C7720, C5093, C3452, C9136, C3641, C5372, C6481, C5511, C6726, C5392에 의해 구체화된 바와 같이, 안정적인 세포주의 수는 11개 클론에서 선별되었다. 지금부터, 항-CLEC2D 항체 유도 세포독성과 같은 대규모 생산 측면 및 기능적 특징에 대한 이해가 추가 개발을 위한 최종 클론 선택에 통합되었다.
클론 선택 과정에서 강력하고 반복 가능하며, 일관된 품질의 단백질을 생산하는 방법이 필수적이었다. 따라서, 클론 스크리닝이 시작되기 전, 효율적인 클론 스크리닝을 보장하기 위해 플랫폼 프로세스가 개발되었다. 기저 배지로 ActiPro를 사용하고, 공급으로 세포 부스트 7a 및 세포 부스트 7b를 사용하여 유가식(fed batch) 공정을 개발했다. 피딩 주기와 양을 실험적으로 최적화하고, 최적화된 과정을 반복하여 견고함을 확립했다. 공급 프로세스는 최고 성능의 클론을 분리하기 위해 클론 스크리닝으로 추가 확장되었다. 최고 성능의 클론을 분리한 후 최적화된 유가식 공정을 사용하여 10L 생물 반응기에서 세포를 배양하여 클론을 확인했다. 이 단계는 더 큰 규모로 옮길 때 선택된 클론의 제조 가능성을 보장하기 위해 수행되었다.
ActiPro 배지는 다른 기반 배지와 비교한 이력 데이터를 기반으로 플랫폼 프로세스 개발을 위한 기반 배지로 선택되었다. ActiPro는 세포의 대사 요구 사항이 충족되도록, 4mM 글루타민이 보충되었다.
더 나은 수행자를 이해하고, 순위를 매기고, 선택하기 위해, 여러 단클론성 세포주를 평가했다. 생존가능 세포 밀도, 생존력, 역가에서 얻은 결과를 기반으로, C5511, C4608, C3452, C5392, C6481은 모든 성능 매개변수에서 가장 우수한 성능을 보이는 것으로 평가되었다.
다양한 전립선 암 세포주:PC3 상의 표면 항원 발현
CLEC2D 항원을 발현하는 종양 세포를 트립신 처리에 의해 수거하였다. Vi-cell XR 자동 세포 계수기로 세포 수를 측정했다. 세포를 4-5분 동안 1400-1500 rpm에서 원심분리하였다. 펠렛을 1ml DPBS에 재현탁시켰다. 50,000개의 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 분취했습니다. 1μg의 테스트 샘플 (C5511로 구체화된), 대조군을 각 웰에 첨가하고, 실온 (25℃)에서 30-60분 동안 항온처리했다. 플레이트를 4-5분 동안 1400-1500 rpm에서 원심분리하고, 상청액을 흡출시키고, 세포를 DPBS내 0.1% BSA로 세척하였다. 2.5 ml의 2% BSA를 DPBS로 50ml로 희석하였다. 염소 항-인간 IgG FITC 콘쥬게이트를 2차 항체로 이용하였다. 이차 항체의 1:100 희석액을 DPBS에 준비하였고, 100μl를 각 웰에 첨가하였다. 염소 항-인간 IgG FITC 접합체를 1:100의 희석에서 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 30 분 동안 실온 (25℃), 암 상태에서 항온처리했다. 세포를 0.1% BSA로 세척하고, 100μl의 1% BSA에 재현탁시켰다. 샘플을 유동-세포 분석으로 분석했다.
다음 공식을 사용하여 종양 세포 표면에 대한 특이적 결합 계산을 위해 테스트 샘플의 결합을 평가하고, 사용했다:
Figure pct00108
C5511, C4608, C6481, C2438, C3452, C0949 항체로 구체화된(이에 국한되지 않지만) 바와 같이, 유동 세포 분석 실험에서 관찰될 때, PC3 표면 결합의 MFI의 배수 변화는 대조군과 비교하여 2배 이상 증가된 것으로 밝혀졌다 (도 11A).
더욱이, 실시예 4, 섹션: 세포 표면 결합 분석: 유동세포 분석 및 공초점 현미경을 통해 기술된 바와 같이, 공초점 현미경을 통한 PC3 세포의 표면 상의 항체 결합에 있어서, PC3 표면 상에서 다양한 독특한 항-CLEC2D 항체 안정 클론에 의해 표면 결합이 이루어졌다. 도 11A에 도시된 바와 같이, PC3 표면 상에서 정제된 신규한 항-CLEC2D의 결합은 PC3 세포들 상에 있는 신규한 항체를 통한 CLEC2D 항원의 균일한 분포와 함께 관찰되었다.
세포독성 분석: 유동 세포측정 및 이미징 방법들을 통하여 (살아있는 + 엔드 포인트+)
항-CLEC2D의 기능적 활성을 평가하기 위해, 단리된 PBMC와 함께, 표적 세포 및 항-CLEC2D와 함께 항온처리하여, 유동 세포 분석법 및 공초점 현미경법을 모두 사용하여 세포독성 분석을 수행하였다. 이에 앞서, mAb 농도 및 이상적인 T:E 비율에 대한 최적화가 수행되었다.
건강한 기증자의 PBMCs, 작동체 세포들은 이전 프로토콜(Jewett A, J Immunol 1996)에 따라 분리되었다. 간략하게 설명하자면, Histopaque-1077(Sigma) 원심분리 후, 말초 혈액 림프구를 얻었다. 1:2 희석된 혈액을 15mL Histopaque에 적층하였다. 모든 시약은 실온에서 유지되었다. histopaque와 혈액이 들어 있는 튜브를 가속 및 제동이 0인 실온에서 400g에서 30분 동안 원심분리시켰다. 원심분리 후, 단핵 세포를 포함하는 불투명한 계면의 0.5 cm 이내로 상층을 조심스럽게 흡출시키고, 상층은 폐기하였다. 불투명한 경계면을 조심스럽게 원심분리 튜브로 옮겼다. 세포를 10분 동안 250g의 1XPBS 10-15mL를 첨가하여 두 차례 세척하였다. 펠렛을 PBS 2mL에 재현탁하고, PBMCs를 계수했다. 10mL의 혈액에서 총 1천만 개의 PBMC를 얻었다. PBMC의 품질 검사는 CD45+ 모집단이 99%인 유동 세포 분석을 기반으로 수행되었다. NK 단리 키트(Stem cells technologies, Vancouver, BC, Canada)를 사용하여, 음성 선별을 통해 NK 세포를 단리했다. NK 세포의 순도는 유동 세포 분석 CD56+ 집단에 기초하여 >90%인 것으로 밝혀졌다.
표적 전립선 암 세포주, PC3 세포들은 제조업체의 프로토콜에 따라 Efluor로 라벨되었고, 24-웰 플레이트의 20% DMEM에서 0.04x106 밀도로 씨딩되었다. 24 시간, 새로 단리된 PBMCs는 T:E 1:5로 추가되었다. 신규한 단일클론성 항-CLEC2D 항체들 C5511, C6481, C5392, C3452 및 C4608 (이에 국한되지 않음)은 0.5ml의 분석 반응에 ~200 μg/ml로 추가되었고, 14 시간 동안 항온처리되었다. 24-웰 플레이트에서 상청액을 수집하고, 부착 세포를 트립신 처리하고, 1.5ml 튜브에 수집했다. 반응 혼합물을 시톡스 그린(시톡스 green)(15nM)과 함께 20분 동안 항온처리하고, 유동 세포 분석기에서 형광을 검출했다. 특이적 세포 사멸 퍼센트는 테스트 샘플에서 대조군의 세포 사멸 퍼센트을 차감시켜 결정하였다.
세포독성은 유동 세포분석에 의한 듀얼 표적 세포 염색에 의해 분석되었다. 도 11B에서는 3가지 신규한 항-CLEC2D 단일클론성 항체들, C5511(~41%), C4608(~32%) 및 C6481(~37%)의 세포독성을 대조군의 것과 비교한 것을 나타내며, 이때 세포 사멸 퍼센트는 공여자 1, 및 표적 세포로부터 단리된 PBMC를, 처리 없이 1:5 비율로 함께 항온처리하여 측정하였다. 유사한 조건에 따라, C5392 및 C3452 클론을 공여자 2에 대해 시험하였고, 여기서 세포독성은 각각 ~14% 및 ~28%인 것으로 밝혀졌다 (도 11B). 항-CLEC2D 농도를 50μg/ml에서 200μg/ml로 증가시켰을 때 표적 세포의 80% 이상의 세포독성이 관찰되었고 (도 11C), T:E 비율이 1:5에서 1:10으로 증가될 때 종양 세포 사멸의 상당한 증가가 또한 모니터링되었다 (도 11D).
공초점 현미경 실험을 위해, PC3 세포를 완전 배지(20% FBS + DMEM-F12+ 1x Pen/Strep + 1mM 피루브산 나트륨)에서 8-웰 슬라이드(eppendorf)에서 70-80% 합류까지 성장시켰다. 새로 단리된 PBMC 세포들을 휴지 PBMC 세포로서 세포독성에 사용하기 전에 배양 배지(10% FBS를 포함하는 RPMI1640)에서 하룻밤 방치하였다. PC3 세포는 세포 추적기 염료(100 nM)로 착색되었고, PBMC 세포는 세포 증식 염료 EF670(10 μM)으로 별도로 착색되었다. 60X 배율, 1.35-NA 대물렌즈로 Olympus FV3000-4 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하여, 6-7 시간 동안 배양된 착색된 PC3 및 PBMC 세포와 함께 다양한 농도의 신규 항체를 이미지를 획득했다. 사멸 염료 시톡스 블루(시톡스 blue) (5 μM)의 경우 이용된 레이져 광, λex 405nm 및 λem 450-500nm; 세포 추적 그린의 경우 이용된 레이져 광, λex 488nm 및 λem 510-530 nm; 세포 증식 염료 EF670의 경우 이용된 레이져 광 λex 630nm 및 λem 650-750 nm. Fiji ImageJ 소프트웨어로 이미지를 분석했다.
세포독성 분석을 위한 새로운 mAb의 최적 농도를 확인하기 위해, 표적 대비 작동체 세포 비율 (1:5)과 신규한 항-CLEC2D 항체 (C6726)의 3가지 상이한 농도 (가령, 10 μg/ml, 20 μg/ml 및 50 μg/ml)를 이용하였고, 완전 배지에서 6-7 시간 동안 항온처리하였다. 세포 사멸은 PC3 세포에서 녹색 형광의 소멸 및 보라색 형광의 출현에 의해 모니터링되었다. 최대 세포독성은 50 μg/ml에서 관찰되었다 (도 11E). 다른 항체 클론(C6726, C4608, C5848, C5511, C6481-이에 국한되지 않음-, 테스트된 클론)에 대해 동일한 항온처리 타이밍에 대해 50 μg/ml의 농도를 사용하여 추가 엔드 포인트 세포 사멸 분석을 계속했고 (도 11F), 표적 세포 사멸은 신규 항체의 존재 하에서 관찰되는 반면, 표적 세포가 신규 항체로 처리되지 않은 경우 세포 사멸은 모니터링되지 않았음을 나타낸다.
위에서 설명한 대로 사용가능한 데이터를 기반으로, C4608, C5511, C6481, C5392 및 C3452 클론이 최종 생체 내 마우스 효능 실험을 위해 선별되었다.
치료요법적 단일클론성 항체들 (mAbs)의 개발 동안, 부적절한 노출, 독성 또는 효능 부족과 관련된 비용이 많이 드는 후기 단계 실패를 피하기 위해, 임상에서 성공 가능성이 가장 큰 후보 항체를 조기에 식별하기 위한 전략이 필요하다. mAbs의 조기 스크리닝 및 최적화는 선두 구조체의 선택을 위한 특징, 이를 테면, 친화력, 효능 및 안정성에 중점을 두고, 개발 후반부와 소수의 리드 mAb 구성에 대해 특성화지만, 한편으로 생체 내 효능에 대한 확인이 일반적으로 필요하다. 여기서, 확인된 항-CLEC2D 클론 C4608, C5511, C6481, C5392 및 C3452를 대상으로 전립선암 이종이식편에 대한 생체내 효능 평가를 수행하였다.
실시예 6: 신규한 항-CLEC2D 항체 분자의 작용 기전 판독
면역 체크포인트는 자가 내성을 유지하고, 면역 반응을 돕는 억제 및 자극 경로로 구성된다. 암에서, 면역 체크포인트 경로는 초기 항-종양 면역 반응을 억제하기 위해 대개 활성화된다. 면역 체크포인트 요법은 이러한 경로를 차단하거나 또는 자극함으로써 작용하고, 종양에 대항한 신체의 면역 활성을 향상시킨다. 정상적인 상황에서, 면역 체크포인트는 면역 체계가 감염 및 악성 종양에 대항하여 반응하도록 하는 동시에, 이러한 작용으로 인해 발생할 수 있는 모든 피해로부터 조직을 보호한다. 그러나, 악성 세포에 의한 이러한 면역-체크포인트 단백질 중 일부의 발현으로 항종양 면역이 조절되지 못하고, 암세포의 성장과 확장을 촉진시킨다. 면역 요법, 특히 단일클론 항체 기반 요법의 작용 기전의 이해를 통하여, 여러 접근법이 단독으로 또는 조합하여, 종양 세포 사멸에 유리하게 작용하는 특정 방식에 더욱 활력을 줄 것이다.
본 명세서에서, 항-CLEC2D 항체의 기전은 분자 상호작용 수준에서 발생되는 사건들, 이를 테면, CLEC2D 표적 의존성, CLEC2D/CD161 간의 상호작용, 세포성 네트워크 수준에서 발생되는 사건들, 이를 테면, 항-CLEC2D 항체의 존재 또는 부재 하에서 종양 세포의 사멸에 있어서 다양한 작동체 세포들, 가령, 자연 킬러 (NK) 세포, T 세포들의 연루, 또는 항-CLEC2D 항체의 아이소형 이를 테면, ADCC, CDC, ADCP에 의해 구동되는 특정 기전 및/또는 조합적으로 사이토킨/케모킨 수준의 상승 또는 다양한 활성화/억제성 수용체의 발현의 조합에 의해 유도된 종양 세포 사멸로 구성된 시험관 실험, 그리고 생체내 실험으로부터 이해될 수 있고, 이때, 종양 퇴행은 림프구 침윤을 통하여 발생된다.
또한, 항체의 기능과 표적 분자가 다양해짐에 따라, 표적 분자가 생물학적으로 어떻게 기능하는지, 그리고 항체에 의해 유도된 변형된 기능에 대한 생물학적 반응이 무엇인지 이해하는 것이 점점 더 필요해지고 있다. 이를 언급했지만, 작용 기전에 대한 이해는 전립선암 치료, 특히 거세 저항성 전립선암 치료에 대한 엄청난 강조점이 될 것이며, 새로운 면역요법 전략으로 다양한 질병 징후의 전체 스펙트럼을 위한 길을 열 것이다. 이을 언급했지만, 합리적인 접근/계층화의 철저한 사용은 암 치료에 더 잘 이해된 면역학의 일관된 통합을 보장하고, 전반적인 치료 환경의 발전에 극적인 영향을 미칠 것이다.
세포 독성에 연루된 특정 세포 유형은 유동 세포 계측법 및 공초점 현미경을 통해 조사되었으며, 여기서 엔드 포인트 분석 및 살아있는 세포 이미징 방법을 모두 갖는 현미경 기반 접근 방식이다.
NK 세포 매개된 세포독성
PC3 세포들은 제조업체의 프로토콜에 따라 Efluor로 라벨되었고, 24-웰 플레이트의 20% DMEM에서 0.04x106 밀도로 씨딩되었다. 24 시간, 새로 단리된 NK 세포는 T:E 1:1로 추가되었다. 신규한 단일클론성 항-CLEC2D 항체 C5511 및 C6481은 0.5ml의 분석 반응에서 100μg/ml로 추가되었고, 14 시간 동안 항온처리되었다. 24-웰 플레이트에서 상청액을 수집하고, 부착 세포를 트립신 처리하고, 1.5ml 튜브에 수집했다. 반응 혼합물을 시톡스 그린 (15nM)과 함께 20분 동안 항온처리하고, 유동 세포 분석기에서 형광을 검출했다. 특이적 세포 사멸 퍼센트는 테스트 샘플에서 대조군의 세포 사멸 퍼센트을 차감시켜 결정하였다. NK 세포-매개된 세포독성 (NKCC)는 사전라벨된 표적 종양 세포주와 항-CLEC2D와 함께 14 시간 동안 공동-항온처리된 새로 단리된 NK 세포들을 이용하여 결정되었다. 분석 샘플을 죽은 세포 염료 시톡스 그린과 함께 항온처리하였고, 형광을 유동 세포측정 분석에 의해 측정했다. 예측된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 세포독성 분석에서 80% 이상의 세포 사멸을 나타내었다 (도 12A).
고정된 세포 이미지화와 살아있는 세포 이미지화를 통해, NK 세포 매개된 세포독성의 영향을 이해하기 위해, 공초점 현미경 기반 접근 방식을 추가로 사용했다.
PC3 세포를 완전 배지(20% FBS + DMEM-F12+ 1x Pen/Strep + 1mM 피루브산 나트륨)에서 8-웰 슬라이드(eppendorf)에서 70-80% 합류까지 성장시켰다. NK 세포들은 상기에서 기술된 바와 같이 단리되었다. 새로 단리된 NK 세포들을 휴지 NK 세포로서 세포독성에 사용하기 전, 10% RPMI에서 하룻밤 방치하였다. PC3 세포는 세포 추적기 염료로 착색되었고, NK 세포는 세포 증식 염료 EF670으로 별도로 착색되었다. NK:표적 세포들의 상이한 비율 (1:0.5, 1:5, 1:10)과 50μg/ml의 C5511, C4608, C6481의 신규한 항체들(이에 국한되지 않음)과 함께 이용되었고, Olympus FV3000-4 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하여, 60X 배율, 1.35-NA 대물렌즈를 사용하여 이미지를 획득하기 전 6-7시간 동안 항온처리하였다. 사멸 염료 시톡스 블루의 경우 이용된 레이져 광, λex 405nm 및 λem 450-500nm; 세포 추적 그린의 경우 이용된 레이져 광, λex 488nm 및 λem 510-530 nm; 세포 증식 염료 EF670의 경우 이용된 레이져 광 λex 640nm 및 λem 650-750 nm. Fiji ImageJ 소프트웨어로 이미지를 분석했다.
세포독성에 대한 NK 세포의 역할을 탐구하기 위해, 6~7시간 동안 고정 농도의 신규 항체와 함께, 상이한 비율의 NK 세포를 PC3와 함께 항온처리하였다. 우리는 테스트된 모든 항체(C5511, C4608, C6481)에 있어서 E:T 비율이 증가함에 따라 세포 사멸의 증가를 관찰했으며, 이때 도 12B, 12C 및 12D에 표시된 바와 같이, 1:10의 T:E 비율은 가장 높은 세포 사멸을 나타냈다).
T 세포 매개된 세포독성
PC3 세포들은 제조업체의 프로토콜에 따라 Efluor로 라벨되었고, 24-웰 플레이트의 20% DMEM에서 0.04x106 밀도로 씨딩되었다. 새로 단리된 T 세포는 1:3의 T:E로 이용되었고, 100ug/ml의 항체 농도에서 세포독성 분석에 사용되었다. 신규한 단일클론성 항-CLEC2D 항체 C5511 및 C6481은 0.5ml의 분석 반응에서 100ug/ml로 추가되었고, 14시간 동안 항온처리되었다. 24-웰 플레이트에서 상청액을 수집하고, 부착 세포를 트립신 처리하고, 1.5ml 튜브에 수집했다. 반응 혼합물을 시톡스 그린 (15nM)과 함께 20분 동안 항온처리하고, 유동 세포 분석기에서 형광을 검출했다. 특이적 세포 사멸 퍼센트는 테스트 샘플에서 대조군의 세포 사멸 퍼센트을 차감시켜 결정하였다.
도 13은 PC3 세포에 대항하여 관찰된 T 세포 매개 사멸을 도시하며, 이때 클론 C5511 & C6481은 6% 죽은 세포의 기저 수준을 갖는 대조군과 비교할 때, 종양 세포 세포독성을 유발하는 100μg/ml의 농도에서 항온처리되었다. 1:3의 T:E를 사용한 실험 조건에서 최대 55%의 T 세포 매개된 세포독성이 관찰되었다 (도 13).
세포독성의 과정을 추가로 정의하기 위해, PBMC 및 NK 세포 모두에 대해 작동체 세포를 통한 표적 세포 사멸을 추적하기 위해 살아있는-세포 현미경 실험을 수행했다. 살아있는 세포 이미징 실험을 위해, PC3 세포를 완전 배지(20% FBS + DMEM-F12+ 1x Pen/Strep + 1mM 피루브산 나트륨)에서 8-웰 슬라이드(eppendorf)에서 70-80% 합류까지 성장시켰다. PC3 세포는 세포 추적기 염료로 착색되었고, PBMC/NK 세포는 세포 증식 염료 EF670으로 별도로 착색되었다. 착색된 PC3 및 PBMC/NK 세포와 함께 200μg/ml의 신규 항체. PBMC 및 NK 세포 모두에 대한 표적 대 작동체 비율은 각각 1:5 및 1:1이었다. 세포는 이미징 동안 37℃ 및 5% CO2로 유지되는 가습기에 보관되었다. 살아있는 세포 이미징은 63 X 배율, 1.4-NA 대물렌즈를 사용하여 Zeiss LSM800 공초점 현미경에서 수행했고, 적절한 파장을 이용하여 최대 20시간 까지 8분 간격으로 이미지를 캡쳐했다(시톡스 블루의 경우 λex 405nm 및 λem 450-500nm; 세포 추적 그린의 경우 λex 488nm 및 λem 510-530 nm; 세포 증식 염료 EF670의 경우 λex 640nm 및 λem 650-750 nm. Zen lite Imaging 소프트웨어로 이미지를 분석했다.
세포독성의 과정을 추가로 정의하기 위해, PBMC 또는 NK 세포 작동체 세포를 통한 표적 세포 사멸을 추적하기 위해 살아있는-세포 현미경을 수행했다.
살아있는 세포 이미지화의 목적은 제어된 실험 조건 하에서 시간 의존적 방식으로 PBMC 또는 NK 세포와 같은 작동체 세포의 존재 하에서, 항-CLEC2D 매개된 종양 세포 사멸 과정을 이해하고 추적하는 것이었다. 살아있는 세포 이미징에서 얻은 결과는 아이소형 대조군의 존재 하에서 PBMC 또는 NK 세포가 PC3 표적 세포와 직접적으로 덜 접촉하여, 적은 백분율의 표적 세포 사멸을 초래한다는 사실이다. 반대로, PBMC 또는 NK 세포 및 표적 세포 상에 항-CLEC2D(C5511) 항체를 추가하면, PBMC 또는 NK 세포와 PC3 표적 세포 모두 간의 직접 접촉의 정도가 증가하여, 상당한 표적 세포 사멸을 초래한다. 흥미롭게도, NK 세포의 존재 하에 항-CLEC2D(C5511) 항체에 의해 매개된 PC3 표적 세포 사멸은 종양 세포의 보다 효율적인 제거를 유도하였고, 이때 대부분의 종양 세포 용해가 항온처리 10시간 이내에 발생하며, 한편 PBMC의 존재 하에서 관찰된 종양 세포 사멸은 상기 시점 내에서 상당히 더 낮은 것으로 밝혀졌다. 이것은 항-CLEC2D 항체를 통한 PC3 종양 세포의 효과적인 제거는 주로 NK 세포 매개임을 나타낸다.
항-CLEC2D 항체와 CLEC2D 항원 간의 분자 상호작용: 에피토프 맵핑을 통하여
가상환경에서 연구
다음 프로토콜은 CLEC2D-항체 복합체에 의해 형성된 결합 부위를 식별하기 위해 개발되었다. 간략하게 설명하자면, 이 방법은 CLEC2D-항체 입체구조를 생성하기 위해, 모양-상보성 기반 도킹에서 항체와 CLEC2D 모두의 단백질 구조의 사용과 관련되며, 결합 부위를 확인하기 위해 후보 목록 돌연변이에 대한 구조 분석이 이어진다. (Germain et al, 2011, Rozbesky et al, 2015).
이 프로토콜의 중심 가정 중 하나는 잠재적인 결합 부위, 즉 홈 또는 채널이 결합 파트너를 더 잘 수용해야 한다는 것인데, 여기에서 적절한 결합 파트너가 효소 및 기질의 잠금-과-열쇠 모델에 의해 어느 정도 설명되 듯이 잘 정책할 수 있어야 하며, 특정 자물쇠(또는 결합 부위)는 구조적 호환성에 따라 특정 열쇠(또는 결합 파트너)를 수용할 것이다. 이 개념은 모양-기반 도킹에 따라, 결합 부위를 식별하로 확장되었으며, 생성된 입체형태의 가장 큰 농도가 가능한 결합 부위로 간주되었다.
그런 다음, 해당 입체구조는 상호 작용하는 잔기들의 상호작용 쌍을 기반으로 함께 클러스터링되었으며, 클러스터에 통합될 수 없는 입체구조는 폐기되고, 나머지 입체구조들은 에너지 최소화되며, 생존 가능성에 대해 스크리닝되었다. 생존 가능한 것으로 밝혀진 입체구조의 경우, 상호 작용하는 잔기 쌍을 더 면밀히 조사하고 연관성을 테스트하기 위해 돌연변이를 제안했다.
킬러 세포 렉틴-유사 수용체 하위패밀리 B 구성원 1 (NKR-P1)은 NK 세포-매개된 세포독성을 조절하는 억제성 수용체다. C-형 렉틴 도메인 패밀리 2 구성원 D (CLEC2D)는 NKR-P1의 리간드이며, CLEC2D/CD161 상호작용은 NK 세포-매개된 세포독성을 억제시키고, CLEC2D-NKR-P1 복합체의 차단으로 일차 NK 세포 활성을 강화시킬 수 있다.
신규한 라이브러리로부터 유래된 모든 독특한 항-CLEC2D 항체들은 CLEC2D와 결합에 의해 CLEC2D-NKR-P1 연합을 방지하는 것으로 밝혀졌지만, 그러나 이러한 억제의 정확한 위치와 속성은 알려지지 않고 있다. 다음 프로토콜은 모델링, 도킹 및 부위-지정 돌연변이 유발을 통해 결합 부위의 가능성을 식별하기 위해 고안되었다.
이 과정은 CLEC2D 상에서 주요 상호작용 잔기를 식별하는 것으로 시작되며, 이때, CLEC2D-항체 복합체 상호작용은 CLEC2D-NKR-P1(CD161) 복합체를 자세히 살펴봄으로써 이해할 수 있고, 5MGT로 PDB에 증착된 복합체의 결정 구조를 연구하여 수행되었습다 (도 15A).
5MGT 결정 구조는 CLEC2D와 NKR-P1 복합체 사이의 연관성을 설명한다. 이러한 연합에 연루된 잔기들이 관심대상이다. 항체-CLEC2D 복합체의 억제 모드가 입체적 다양성인 경우, 두 상호작용에 연루된 잔기와 이들의 바로 이웃 잔기들이 겹칠 가능성이 있다. 키메라의 5MGT 구조를 조사하여, CLEC2D 쇄에 연루된 잔기들(이후로는 항원 상호작용 잔기라고 지칭함)을 확인했다 (도 15B) (Pettersen et al, 2004). 기본적으로, CLEC2D와 NKR-P1(CD161) 쇄들 간의 접촉 거리(최대 6Å) 내의 모든 잔기가 확인되었다 (표 28 참고).
표. 28
Figure pct00109
이러한 항원-상호 작용 잔기는 NKR-P1(CD161)-CLEC2D 복합체에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으므로 다음 구조 분석에서 '중요한' 잔기로 간주된다.
경쟁 항체 구조
14개 항체의 모델은 상동성 모델링 프로그램 MODELLER를 사용하여 생성되었다. 생성된 모델은 주요 관심 영역인 항체의 가변 영역으로 제한되었다. PDB는 항체의 완전한 가변 영역의 구조에 대해 분석되었다. 독특한 항체 가변 영역 서열 각각 사용 가능한 구조의 서열에 대해 정렬되었으며, 각 항체 서열에 가장 잘 일치하는 것이 항체 모델을 구축하는 주형으로 사용되었다. 각 서열에 대해 여러 모델을 생성하고, 가장 에너지 효율적인 구조를 항체의 주요 모델로 선택했다 (도 15C).
항체는 이들의 초가변 상보성 결정 영역(CDR) 루프 외부에서 매우 잘 보존되어 있으며, 항체의 두 쇄에 있는 6개 CDR중 중쇄 및 경쇄 각각에 3개, 중쇄 상에 있는 CDR3 루프는 상호작용 확립에 있어서 최대의 그리고 가장 큰 영향을 주는 것으로 알려져 있고, CDR 루프와 관련하여 가장 에너지 효율적인 구조를 생성하기 위해 MODELLER의 Loop Refinemen을 여러 번 실행했다. 다시 한 번, 주요 모델의 여러 변형이 생성되었으며, 가장 에너지 효율적인 것이 정제된 항체 모델로 채택되었다.
CLEC2D 상에 항체의 도킹
CLEC2D 모델은 CLEC2D 체인의 이량체인 4QKI로 기탁된 PDB에서 획득했다. 상호작용의 정확한 위치가 알려져 있지 않기 때문에, 가능한 상호작용 모드를 탐색하기 위해 복합체 구조 생성에 Molecular Docking이 사용되었다. 사용된 프로그램은 구조적 타당성을 기반으로 가능한 모든 상호 작용 모드를 순열하는 모양 상보성 도킹 프로그램인 PatchDock이었다. (Schneidman-Duhovny et al, 2005)
4 Å (기존 입체형태의 4 Å 이내의 형태가 생성되는 것을 방지함)의 클러스터 거리에서 PatchDock의 High Accuracy Mode를 사용하여, 정제된 항체 가변 영역 구조와 항원 CLEC2D(PDB: 4QKI) 사이에 도킹을 수행했다. 제약 조건은 항원 구조에 대해서만 제공되었으며, 여기서 경쇄 및 중쇄의 CDR3 루프가 모두 지정되었다.
PatchDock은 제공된 항체 각각에 대해 여러 도킹 입체형태를 생성했다. (표 29 참고).
표 29
Figure pct00110
입체구조 분석
도킹된 입체구조가 생성된 후, 상호 작용하는 잔기들이 분석되었다.
내부 스크립트를 사용하여, 복합 구조를 쿼리하고, 서로 최대 4Å의 거리에서 서로 다른 쇄로부터 참가자와 연루된 모든 잔기 쌍을 식별했다. 이러한 잔기 쌍은 목록으로 편집되었으며, 표 30 및 표 31은 이러한 목록에서 몇 줄을 보여주고, 이를 사용하여 입체구조를 클러스터링했다.
Figure pct00111
Figure pct00112
입체구조 클러스터링 및 실행가능성 평가
입체구조는 중첩된는 접촉을 기반으로 클러스터링되었으며, 잔기 쌍의 적어도 75%가 공통인 경우, 입체구조가 함께 클러스터링되었다. 클러스터에 통합되지 않은 입체구조는 폐기되었다.
나머지 구조 중 단백질 상호작용 Z 등급 평가(Protein Interaction Z Score Assessment (PIZSA)) 도구를 사용하여 비-결합자 입체구조를 필터링하는 다음 여과 단계 전에 모든 복합체에 대해 에너지 최소화를 수행했다. PIZSA는 단백질 복합체를 취하고, 잔기들의 원자에 적용된 거리 임계값을 기반으로 가능한 모든 잔기 상호작용을 식별했다. 식별 후 모든 접촉 쌍을 평가하고, 구성요소 연합을 점수화하여, 식별한 연합이 안정적인 연합으로 이어질지, 복합체가 실행가능한 지의 여부에 궁극적으로 사용되는 누적 점수를 구축했다. (Roy et al, 2019) (이 실행가능성은 식별된 접촉 쌍의 구성 및 조합을 기반으로 한다.) 실행가능한 것으로 확인된 입체구조만 유지되었다. (표 32 참고).
표 32
Figure pct00113
이러한 감소된 클러스터는 CLEC2D 쇄와 중첩되는 연합을 형성하는 여러 밀접하게 그룹화된 구조로 구성되었다.
이러한 클러스터 형성은 가능한 결합 사이트 위치로 간주되었으며, 각 부위를 검증했다 (도 15D, 15E, 15F, 및 15G).
돌연변이 분석
탐색할 더 적은 수의 실행가능한 구조의 등재-목록에 따라 돌연변이 분석이 수행되었다. PIZSA는 또한 확인된 접촉 쌍을 취하고, 각 참가 잔기를 다른 19개의 천연 아미노산으로 대체하고, 해당 치환에 대한 구조의 전체 점수에 대한 영향을 결정하는 특성을 또한 보유하였다. 영향 값은 특정 잔류물이 다른 잔류물로 교체되는 경우 복합물이 겪을 안정성 손실을 나타낸다. 강한 연합을 형성하는 복합체에 중요한 잔기들은 높은 영향력 값을 가질 것이며, 이러한 위치를 변연변경하면 복합체가 약화되거나 불안정해질 수 있기 때문이다. 이 정보는 어떤 잔기 쌍 돌연변이가 전체 복합체를 가장 불안정하게 만들 것인지 식별하는 데 사용되었다. 입체구조가 이미 클러스터링되었기 때문에, 돌연변이에 대해 클러스터의 모든 구성원에서 널리 퍼져 있는 3-4개의 높은 영향을 미치는 잔기-쌍을 식별하여 전체 클러스터를 평가할 수 있다. 여기에서 다음 매개변수를 기반으로 상당한 고려가 이루어졌다: 이를 테면, 동일한 클러스터 카운트(Same Cluster Count)는 동일한 항체 상에 있는 동일 클러스터 내 상호작용에서 특정 잔기가 관찰된 총 횟수를 나타내고; 동일_클러스터_비율(Same_Cluster_Proportionate)은 동일한 항체의 동일한 클러스터 내 상호작용에서 특정 잔기가 관찰된 비례 횟수를 나타내고; 다른 클러스터의 동일한 항체 발생 카운트는 동일한 클러스터에서 여러 번 볼 수 있는 동일한 항체의 모든 클러스터 간의 상호 작용에서 특정 잔기가 관찰된 총 횟수를 의미하고; 동일 항체 다른 클러스터 카운트(Same antibody Other Cluster count)는 동일한 항체의 모든 클러스터중 동일 클러스터에서 여러 사례를 캡처하지만, 그러나 한 번만 계산되는 상호 작용에서 특정 잔기가 관찰된 구조의 총 수를 나타내고; 다른 항체 다른 클러스터 발생 카운트(Other antibody Other Cluster occuraece count)는 다른 항체들 상에 모든 클러스터의 상호작용에서 특정 잔기들이 관찰되는 총 횟수를 나타내고; 다른 항체 다른 클러스터 카운트(Other antibody other Cluster count)는 다른 항체들 상에 모든 클러스트의 상호작용에서 특정 잔기들이 관찰되는 구조의 총 수를 나타낸다 (동일 클러스터 내 다수의 사례, 그러나 한번만 계산됨). 종합하면, 이 접근법은 차례로 각각의 항-CLEC2D 항체에 대한 CLEC2D 항원에 대한 에피토프 패치를 제공했다. 유사한 방법이 모든 항-CLEC2D 항체에 대해서도 정당하게 채택되었다.
표 33. C4608 항-CLEC2D 항체와 접촉하는 CLEC2D 항원의 중요한 잔기에 대한 요약이다.
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
어떤 클러스터가 진정한 결합 부위를 설명하는지 확인하기 위해, 일련의 돌연변이가 주요 잔기에 제안될 것이다. 클러스터의 수가 많기 때문에, 여러 클러스터를 동시에 테스트할 수 있는 돌연변이를 식별하는 것이 유리했다.
이를 달성하기 위해, 단일 항체의 모든 클러스터에 대해 확인된 모든 잔기를 분석했다. 이 생각은 여러 클러스터가 조합으로 배치되고, 많은 형태를 동시에 테스트하기 위해 모든 잠재적 결합 모드에서 중요한 역할을 하는 잔기를 돌연변이로 제안된다는 것이었다. 이러한 조합은 중복되는 유의미하게 관련된 잔기들(각 클러스터의 상위 3개 비율에서 발생하는 것들)을 검사하여 식별되었다. 클러스터가 여러차례 유의적으로 관련된 잔기를 공유하는 경우, 가능한 조합으로 간주되었다. 본원에서 구체화된 바와 같이, C4608 및 C5511에 대해 돌연변이가 제시되었다. 이들 항체는 각각 21개 및 7개의 클러스터를 갖고, 이들을 클러스터링하기 위해 이러한 모든 클러스터로부터 대표 잔기를 분석하였다. C4608의 경우 유의미하게 발생하는 잔기들의 대표적인 중복을 검사하여 제안된 가능한 조합은 G00001-G00004-G00007-G00010-G00015, G00012-G00014-G00016-G00017-G00018-G00021-G00026, G00005-G00008-G00020-G00022-G00031 및 G00011-G00012-G00014-G00018이며, C5511의 경우 가능한 조합은 G00015 및 G00017과 함께G00001-G00005-G00011-G00019-G00020이다. 위에서 설명한 전략은 모든 항-CLEC2D 항체에 적용되었다.
클러스터 조합에서 어떤 잔기가 역할을 했는지 확인하기 위해, 2에서 13개 클러스터(사용 가능한 초기 클러스터의 총 수에 따라 다름)길이의 다양한 가능한 모든 조합이 생성되었다. 모든 조합에 대해, 영향 값과 함께 관련된 모든 잔기들이 확인되었다. 조합 구성원의 전체 또는 대다수 (최대 2개의 구성원에서 누락됨)에 연루된 잔기들은 유지되었고, 한편 조합의 일부 클러스터에서만 역할을 하는 잔기들은 고려 대상에서 제거되어, 발생 빈도가 높은 잔기들의 목록만 남았다.
잔기의 중첩을 기반으로 바람직한 조합들이 일단 확인되면, 해당 조합에 대해 많이 발생하는 잔기를 면밀히 조사하고, 높은 영향 값을 갖는 것으로 관찰된 잔기를 돌연변이 옵션으로 제시했다 (도 16E 및 16G).
이러한 모든 고려 사항 후에 만들어진 선택은 다음 속성을 모두 보유한다: (a) 전하를 띠거나 또는 극성인 잔기 (이러한 잔기들 관찰되지 않은 경우, 상호 작용에 미치는 영향에 따라 다른 잔기들이 선택됨), (b) 조합의 클러스터 전체 또는 대부분에 존재, (c) 잠재적인 결합 모드에 대해 유의성을 갖고, 그리고 (d) 항원-상호작용 잔기에 연루됨.
상기 기술된 전략이 채택되었던 C4608에 의해 예시된 바와 같이, 다음의 잔기 조합이 CLEC2D 항원과의 상호작용에 관여하는 것으로 여겨진다. 유사한 방법이 모든 항-CLEC2D 항체에 대해서도 정당하게 채택되었다.
표 34. 항체 클론 C4608에 대해 확인된 조합의 최종 선택 세트
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가용성 CLEC2D 변이체로써 구조체 생성
조합되거나 독립적으로 존재하는 아미노산이 CD161 상호작용 지점과 겹치거나 겹치지 않으면, 새로운 항-CLEC2D 항체 클론에 대한 에피토프를 매핑하기 위해 CLEC2D 항원 변이체로 생성되었다. 이 구조체들은 부위-지향된 돌연변이유발 또는 유전자 합성에 의해 생성되었다. 모든 구조체는 추가 정제를 용이하게 하기 위해, 스크리닝에 사용된 가용성 CLEC2D 항원과 유사한 C-말단 히스티딘 테그를 갖는다. 관찰된 가상환경에서의 돌연변이 영향이 알라닌 아미노산에 대해 최대인 것으로 나타났기 때문에, 모든 가능한 위치는 전술한 아미노산으로 변경되었다. 표 35 돌연변이가 도입된 CLEC2D 가용성 항원의 위치를 설명한다.
표 35
Figure pct00118
Figure pct00119
본원에 구체화 바와 같이, 부위-지향 돌연변이유발은 Eurofins에서 합성된 비-변형 뉴클레오타이드 서열의 측면에 원하는 돌연변이를 함유하는 2개의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 PCR을 이용하여 Agilent의 QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit를 사용하여 수행되었다. PCR은 Eppendorf™ Mastercycler™ pro PCR 시스템에서 0.2 μM의 각 프라이머 (Eurofins, India), 1.5 μL의 Quick 용액, 1 μL Quickchange XL dNTP 믹그, 10X 퀵 변화 라이트닝 완충제 2.5 μL로 구성된 25-μL 부피에서 수행되었다. 주형 DNA 15 ng이 또한 내포되어 있다. 95 ℃, 2분에서 초기 변성 후, 95 ℃에서 20초간 변성, 60 ℃에서 60초간 어닐링, 68 ℃에서 3분간 프라이머 연장, 68 ℃에서 5분간 최종 연장으로 구성된 주기를 18회 실행되었다. PCR후, 메틸화된 그리고 헤미-메틸화된 DNA에 특이적인 2 μL의 Dpn I 엔도뉴클레아제가 추가되었고, 부모 DNA 템플릿을 분해하고, 돌연변이를 포함하는 합성된 DNA를 선택하는데 이용하였다 (거의 모든 대장균 균주에서 분리된 DNA는 dam 메틸화되어 있으므로, 따라서 Dpn I 절단에 취약하다.) 원하는 돌연변이를 포함하는 닉(nicked) 벡터 DNA를 XL10-Gold 울트라컴피턴트(ultracompetent) 세포로 형질전환시키고, 암피실린-함유 LB 한천 플레이트에 플레이팅하였다. 형질전환된 콜로니의 플라스미드 DNA를 QIAprep Spin Miniprep 키트(Qiagen)로 정제하고 Eurofins에서 시퀀싱했다.
특이 돌연변이를 갖는 벡터 및 SDM 구조체는 HindIII 및 XhoI 효소에 대한 제한 엔도뉴클레아제 활성이었고, 산물은 QIAquick Gel Extraction 키트를 사용하여 추출하고, T4 DNA 리게이즈(NEB)를 사용하여 결찰하고, 혼합물의 50%를 NEB5α 컴피턴트 세포 대장균(E.coli)으로 형질전환했다. 후속적으로, 제한효소 절단을 거쳐 최종적으로 시퀀싱 반응을 통해 클론 스크리닝을 수행하였다. 시퀀싱 프로세스를 통해 클론이 원하는 돌연변이를 포함하는 것으로 확인되었다.
CLEC2D 및 CD161 상호작용의 항-CLEC2D 항체 매개된 차단.에피토프 매핑 연구에서 관찰된 사항에 대한 추가 조사는 CLEC2D 항원 상의 항-CLEC2D 항체 결합 부위가 CLEC2D 항원에 설정된 독특한/배타적 접촉점과 CLEC2D-CD161 복합체 사이에 설정된 접촉점과 중첩되는 결합 부위를 모두 갖는 접촉점으로 구성된다는 사실로 결론내려졌다. 본원에 구체화된 바와 같이, C4608 (도 16A 및 도 16B) 및 C5511(도 16C 및 도 16D)에 대한 CLEC2D 항원 상의 에피토프 패치(이에 국한되지 않음)가 표시되었으며, 이때 CLEC2D와 상호작용하는 C4608 및 C5511 항-CLEC2D 항체 둘 모두에 대한 결합 부위는 항원은 CLEC2D 항원과 CD161 사이의 접촉점과 상당히 중첩된다. 본 명세서는 CLEC2D와 CD161 단백질 사이의 상호작용에 대한 확인된 항-CLEC2D 항체의 영향을 탐구한다. 종양 세포가 CLEC2D와 CD161 사이의 상기 상호작용을 통해 면역 체계를 회피하고, 따라서, CLEC2D 결합자, 즉 상호작용을 방해하는 항-CLEC2D 항체의 실험적 검증은 아래에서 추가로 입증되었다. 실험 세부 사항은 CLEC2D 및 CD161 상호 작용의 확인으로 시작하여, 항-CLEC2D 항체를 사용하여 동일한 상호 작용을 폐기한다.
본원에서 구체화된 바와 같이, CLEC2D 항원은 자성 비드 상에 콘쥬게이트되었고, 이때, 1 ml의 0.1 M 인산염 완충제 염수를 0.5 mg 다이나비드에 추가하고, 30초간 와동시키고, RT에서 10분 동안 회전시키면서 항온처리하였다. 항온처리 후, 비드를 Dynamag 2의 도움으로 1 ml의 0.1 M 포스페이트 완충제 염수로 두 차례 세척한 다음, 세척된 비드를 100μl의 0.1 M PBS에 재현탁시켰다. 자성 비드에 항원을 콘쥬게이트시키기 위해, 세척된 비드 100μl와 CLEC2D 항원 1μg을 함유하는 PBS 100μl를 3M 황산암모늄 100μl의 존재 하에 철저히 혼합한 다음, 37℃에서 하룻밤 항온처리하였다. 하룻밤 항온처리된 혼합물을 PBS로 두 차례 세척하고, 0.5% BSA를 함유하는 PBS 100μl로 2시간 동안 차단한 후, Dynamag 2와 함께 자성 비드를 분리했다.
끝으로, 콘쥬게이트된 항원 비드는 100 μl PBS에서 재현탁시켰다. 항원의 정체를 확인하기 위해, 상기 접합된 항원 비드 1μl를 99μl의 1X PBS에 재현탁하고, 0.1M PBS로 한 번 세척하고, 100μl의 1X PBS에 다시 재현탁시켰다. Novus Biologicals에서 상업적으로 이용가능한 0.5μg의 항-CLEC2D 단일클론성 항체를 100μl의 세척된 콘쥬게이트된 항원 비드에 첨가한 다음, 얼음 위에서 2시간 동안 지속적으로 두드리며 항온처리했다. 항온처리 후, 콘쥬게이트된 항원 비드는 0.25% BSA를 함유하는 100 μl 1X PBS로 두 차례 세척하고, 그 다음 100 μl의 5 μg/ml Alexa Fluor 488 염소 항-마우스 IgG (H+L)를 콘쥬게이트된 항원 비드에 추가하였고, 얼음 위에서 30분 동안 추가 항온처리했다. 항온처리 후, 콘쥬게이트된 항원 비드는 0.25% BSA를 함유하는 100 μl 1X PBS로 두 차례 세척하고, 200 μl의 1X PBS에 재현탁시켰다. 대조군을 비롯한 모든 샘플의 형광은 CytoFLEX를 통해 판독되었다. 비드 콘쥬게이션 효율은 도 16E에 나타낸 것과 같이, 유동 세포측정 분석에 의해 판단할 때, >95%인 것으로 밝혀졌다.
CD161-Fc와 CLEC2D 항원의 결합을 확인하려면, 2 μl의 상기 콘쥬게이트된 CLEC2D 항원 비드를 취하고, 상이한 농도의 CD161-FC (Biolegend에서 구입)를 첨가하고, 비드의 침전을 방지하기 위해 일정한 탭핑과 함께 얼음 위에서 2시간 동안 항온처리했다. 항온처리 후, 비드를 1% BSA가 포함된 PBS 100μl 로 두 차례 세척하였다. 100 μl의 5μg/ml의 alexa 플루오르 염소 항-인간 IgG를 첨가하고, 회전시키면서 20분 동안 얼음 위에서 항온처리했다. 비드를 1% BSA가 포함된 PBS 100μl로 한 차례 세척하고, 1X PBS 100μl로 재현탁시켰다. 대조군을 비롯한 모든 샘플의 형광은 CytoFLEX를 통해 판독되었다. 도 16F에서 볼 수 있는 바와 같이, 자성 비드에 콘쥬게이트된 CLEC2D 항원은 CD161 단백질과 용량 의존적 방식으로 상호작용한다.
0.5 μg의 바이오티닐화된 CD161-FC를 2μl의 CLEC2D 콘쥬게이트된 비드에 첨가하고, 얼음 위에서 2시간 동안 항온처리했다. 항온처리 후, 비드를 1% BSA 및 200ng의 스트렙타비딘을 함유하는 PBS 100μl로 두 차례 세척하고, Alexa Fluor™ 633 콘쥬게이트를 추가하였고, 얼음 위에서 20분 동안 더 항온처리했다. 항온처리 후, 비드를 1% BSA를 함유하는 PBS 100μl로 두 차례 세척하고, 2 μg의 C5511 항체를 얼음 위에서 2시간 동안 추가하였다. 2 시간 항온처리 후, 5 μg/ml의 알렉사 플루오르 염소 항-인간 IgG를 추가하였고, 회전시키면서 20분 동안 얼음 위에서 추가 항온처리했다. 끝으로, 대조군을 비롯한 모든 샘플의 형광은 CytoFLEX를 통해 판독되었다. 도 16G에서 볼 수 있는 바와 같이, 항-CLEC2D 항체의 최적 농도에서 CLEC2D-CD161 상호작용 신호가 상실되었고, 이는 항-CLEC2D 항체가 CLEC2D-CD61 접촉 부위와 경쟁하여, 상호작용을 방해할 수 있음을 나타낸다.
면역 세포 활성화: 항-CLEC2D 항체의 결합으로 인한
NK 세포 활성화에 대한 일반적인 견해는 활성화 수용체와 억제 수용체의 신호 간의 균형을 통해 건강한 세포를 민감한 표적 세포와 구별하는 능력이다. 주요 양성 및 음성 신호전달 사건의 순 출력은 표적 세포를 죽이는 NK 세포의 능력을 결정하기 위해 관찰된다. 그러나, 억제 신호가 활성화 경로를 중단시키는 정확한 분자 체크포인트는 잘 정의되어 있지 않았다.
그러나, NK 세포 활성화에 대한 개별 수용체의 기여를 기술하려는 시도에서, CD 69 표면 수용체는 활성화 직후 NK 세포에서 빠르게 유도되는 조기 활성화 면역 세포 마커로 간주되었다. CD69 프로모터는 NF-κB, 적혈구 형질전환-특이적 관련 유전자-1 (ERG-1) 및 AP-1에 대한 결합 부위를 함유한다. 이의 발현은 대부분의 백혈구에서 활성화될 때 상향조절되며, 활성화된 림프구 및 NK 세포의 마커로 사용된다. 또한, CD69는 면역 반응의 중요한 조절자이기도 하다. CD69는 Syk-Src 의존적 방식을 통해 NK 세포 활성화에 관여한다. T 세포에서 CD69는 TCR/CD3 결합 후에 유도되어 TGF-B 신호전달을 통해 TH1/TH17 반응을 음성적으로 조절하고, 생체 내 염증을 조절한다. 그러나, NK 세포에서 CD69 교차-연결은 활성화된 NK 세포의 세포독성 활성 및 사이토카인 생성을 유도하는 것으로 나타났다. 그렇게 함으로써, CD69는 활성화된 NK 세포에서 표적 세포에 대한 추정 수용체로 나타낼 수 있다. 이 연구에 사용된 작동체 세포, (해당되는 경우) PBMC 및 NK 세포는 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 분리되었다.
NK 세포 상태에 대한 항-CLEC2D 항체의 영향을 이해하기 위해, 항-CLEC2D 항체의 존재 및 부재 하에 NK 세포 상의 CD69 마커 발현 수준을 모니터링하였다. 각 반응에 대해 0.1X106개의 단리된 NK 세포를 취했다. IL-2는 양성 대조군으로 이용되었다. 200U의 IL-2(Acro biosystems) 및 항-CLEC2D 100μg/mL 및 200μg/mL를 각 웰에 첨가하고, 하룻밤 동안 항온처리했다. PC3 프라이밍을 통한 CD69 발현의 변화를 이해하기 위해, PC3 세포를 항-CLEC2D 항체 C5511이 있거나 없는 NK 세포에 1:1 (T:E) 비율로 추가했다. 임의의 처리 없이 또는 표적이 없는 NK 세포를 대조군으로 유지하였다. 항온처리 12-16시간 후, 항-인간 CD3-FITC 및 항-인간 CD69-APC750(Biolegend)에 대한 CD 마커(이에 국한되지 않음) 착색를 수행하여, 0.1X106 세포에 대해 0.5 uL의 각각의 항체를 사용하였다. 세포를 1XPBS 0.2%BSA로 한 번 세척하고, CytoFLEX(Beckman Coulter)를 사용하여 판독했다. 데이터는 기본 게인 설정을 사용하여 수집되었으며 샘플당 5000-10000개의 이벤트가 기록되었다.
이들 결과에서 처리하지 않은 NK 대조군과 비교할 때, C5511 항체 (100μg/mL 및/또는 200μg/mL) 존재 하에서 NK 세포에서 관찰된 바와 같이, CD69 발현의 40-50% 상향조절을 보여주었고, 이때 기선 발현은 1-2%로 기록되었다 (도 17A). IL-2는 양성 대조군으로 사용되었고, 30-40% 상향조절을 나타냈다 (도 17A). 종양(PC3)의 경우, 프라이밍된 NK 세포는 CD69의 70-75% 발현에 가까운 높은 발현을 나타낸 한편, CD69 발현은 PC3 세포 및 항체 100 μg/mL 모두 존재 하에서 ~85%까지 상형조절되었다 (도 17B).
사이토킨/케모킨의 분비/세포-내 발현
종양 세포들/감염된 세포들의 NK 세포 인지는 세포독성과 사이토킨 분비를 유도한다. 사이토카인 생성을 조절하는 신호전달 경로와 과정에 대한 표적 세포 인식 시, NK 세포 활성화 수용체의 기여는 잘 모르고 있다. 또한, 표적 세포에서 특정 리간드의 결합에 대한 사이토카인 분비의 조건/조건도 잘 모른다. 이로 인하여, NK 세포 프로필/사이토카인 및 케모카인 스크리닝에 의한 표적 세포 인지 시, 면역 반응의 1차 개시를 이해하는 것이 중요하다. 여기에서, 새로운 항체 C5511의 존재 하에서 사이토카인 분비를 검출하는 연구가 기획되었다. NK 세포에 의해 만들어지는 가장 두드러진 사이토킨 중 두 가지는 IFN-γ 및 TNF-α이며, 다양한 면역 세포들의 세포독성 및 증식 모두에 연루되었다. 이로 인하여, 본 연구에서 유동 기반으로 한 분석에서 잘 정립된 세포 내 IFN-γ착색 기술에 의해 PBMC 또는 분리된 NK 세포에서 IFN-γ 분비를 검출하기 위한 실험이 수행되었다.
세포 자극 및 IFN-γ 착색 프로토콜:
PBMCs 세포와 NK 세포들을 37℃에서 하룻밤 방치한 후, 활성화 시약과 분비 억제제 (브레펠딘(Brefeldin) A(10μg/mL)/모넨신(Monensin)(6μg/mL))를 웰에 첨가했다. PBMCs 세포 및 NK 세포들 은 처리안된 상태로 두거나, 또는 신규한 항체 C5511, 100μg/mL로 처리하였다. IFN-γ 분비를 유도하는 것으로 알려진 항-인간 OKT-3 (1-2 μg/mL)을 양성 대조군으로 사용하여 세포를 자극하였다. 작동체 대 표적 비율 10:1에서 필요할 때 표적 세포를 이용하였다. 배지 단독은 음성 대조군으로 이용하였다. 세포는 37℃에서 CO2 인큐베이터에서 4 시간 동안 항온처리하였다.
항온처리 후, 2mM의 최종 농도가 되도록 EDTA를 첨가하고 실온에서 15분 동안 항온처리하였다. 실온에서 1600rpm, 8분 간 PBS로 세포를 세척한다. PBS 세척을 1600rpm, 8분 동안 실온에서 반복하고, 500 μl PBS에 재현탁시켰다. 항-CD3 (Biolegend) 칵테일을 각 샘플에 추가하였다 (최종 20 μl). 보상(compensation) 조절을 위해 적절한 양의 단일 항체로 보상을 수행하였다. 암실에서 30분 동안 실온에서 세포를 항온처리였다. 2ml의 FACS 완충제를 각 웰 튜브에 추가하였다. 세포를 FACS 완충제로 1600rpm, 8분 간, 실온에서 두 차례 세척하였다. 그런 다음, 세포를 100μl의 유동 완충액(DPBS 중 0.1% BSA) 또는 250μl/튜브의 BD 사이토픽스/사이토펌(cytofix/cytoperm)과 함께 재현탁하고, RT에서 15분 동안 항온처리였다. 그런 다음, 세포를 4℃에서 2000rpm으로 8분간 원심분리하고, 상층액을 버렸다.
세척 완충제에서 세포를 두 차례 세척하였다. 상층액을 버리고, 제조업체의 프로토콜에 따라 IFN-γ PE (Invitrogen) 세포내 착색을 수행했다. 암실에서 30분-60분 동안 세포를 항온처리였다. 항온처리 후, 1ml의 FACS 완충제로 세포를 두 차례 세척하였다. 상청액을 버리고, Flow용 150μl FACS 완충액의 최종 부피에 재현탁했다.
도 18A에서 볼 수 있는 바와 같이, 항-CLEC2D 항체인 C5511로 100 μg/mL 농도에서 유도될 때, PBMCs에서 IFN-γ 방출은 유도안된 대조군과 비교하여 ~2.97%이었다. FITC에 콘쥬게이트된 항-CD3 항체인 항-OKT-3 항체를 양성 대조군으로 이용하였을 때, 유도안된 PBMC와 비교하여 3-6 % IFN-γ 방출을 보여주었다 (도 18A). 후속적으로 PBMC 세포들은 CD3 +ive 및 -ive 집단을 기반으로 하여 게이팅되었고, 이때 전체 PBMC의 CD3+ 세포들은 항-CLEC2D 항체 단독으로, 또는 표적 세포와 함께 (T:E 비율은 1:10임) 처리하였을 때, IFN-γ 방출이 비-유의적으로 증가함을 보여주었다 (도 18B). 반대로, CD3-ive 집단은 항-CLEC2D 항체 치료 시, IFN-γ 방출의 유의한 증가를 보였다 (도 18C). 여기에서, 온전체 PBMC 또는 CD3+ 세포 또는 CD3-세포와 함께, PC3 프라이밍된 작동체 세포에서 IFN-γ 생성의 증가가 없거나 또는 증가가 낮았다는 점에 주목해야 한다. 단리된 NK 세포로 관찰을 확장하여, IFN-γ 방출 실험이 수행되었으며, 여기서 항-CLEC2D 항체의 존재 하에 IFN-γ 방출의 대략적인 1-2%가 모니터링되었다도 18D). 종합하면, IFN-γ과 같은 사이토킨의 방출은 본 개시내용에 기재된 바와 같이, 항-CLEC2D 항체의 치료 시 상승하였다. 항-CLEC2D 항체를 통해 매개된 전술한 관찰은 CD3-/NK 세포에 제한되지 않는 작동체 세포에서 발현되는 CLEC2D 항원에 결합하여 다른 면역 세포의 활성화 및 표적 세포의 본질적인 효과적인 제거를 지향하는 독립적인 경로임을 암시한다.
세포독성 기전:
세포독성 기전에서 항-CLEC2D 항체의 기능적 역할을 이해하기 위해, 항-CLEC2D 아이소형 변이체들을 구축하였고, 세포독성 분석에서 평가하였다.
관련 아이소형 구조체의 생성
구체화된 바와 같이, IgG1, N-> A 돌연변이를 갖는 포유류 발현 벡터 pZB013 (기탁 # MTCC 25364) 및 IgG4를 갖는 pZB014 (기탁 # MTCC 25365) 벡터를 만들었고, 이때 선별된 항-CLEC2D 가변 중쇄 영역이 클론될 수 있다. 후속적으로, 가변 중쇄를 갖는 전술한 구조체들과 가변 경쇄를 갖는 pZB008 (기탁 # MTCC 25359)은 후속 실험을 위해 형질감염되고, 발현되고, 그리고 정제될 것이다. IgG1, N-> A 돌연변이를 갖는 포유류 구조체 pZB013 및 IgG4를 갖는 포유류 구조체 pZB014는 모두 맞춤 기획 및 합성되었다 (도 19A 및 19B). 상기 플라스미드는 강력한 프로모터에 의해 구동되는 카나마이신R/퓨로마이신R 카세트 및 증식을 위한 높은-복제-수의 ColE1/pMB1/pBR322/pUC 복제 원점을 운반한다. 이 가변 중쇄는 제한절단 효소 AscI 및 XbaI를 이용하여 대체시킬 수 있다. 이 가변 경쇄는 제한절단 효소EcoRI 및 AscI를 이용하여 대체시킬 수 있다.
본원에서 구체화된 바와 같이, Eurofins에서 합성된 서열 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 실행하고, pZB014 및 pZB008 벡터는 각 효소에 대해 제한절단 엔도뉴클레아제 활성이며, PCR 증폭 산물은 QIAquick 겔 추출 키트를 이용하여 추출되었고, 클로닝 주입은 Infusion HD Cloning Plus CE를 이용하여 실행되며, 혼합물의 50%는 Stellar 컴피턴트 세포 대장균(E.coli)으로 형질전환시키고, 카나마이신-함유 LB 한천 플레이트에 도말하였다. 형질전환된 콜로니의 플라스미드 DNA를 QIAprep Spin Miniprep 키트(Qiagen)로 정제하고 Eurofins에서 시퀀싱했고, 큰 규모의 플라스미드를 단리시키고, 형질감염에 이용하였다. 여기에서 열 쇼크(Heat shock) 방법에 의한 플라스미드 DNA를 박테리아 세포로의 형질전환 및 QIAGEN 키트와 클론 스크리닝을 이용하여 박테리아 세포로부터의 플라스미드 DNA 분리는 상기 섹션에서 설명한 것과 유사하였다. 모든 클론은 순차적으로 서열 검증되었고, 오류가 없는 것으로 밝혀졌다. IgG4 및/또는 IgG1 돌연변이 포멧 모두에서 각각의 항-CLEC2D 클론은 포유동물 발현 시스템인 CHO 세포로의 형질감염을 위해 대규모로 단리되었다.
신규한 항-CLEC2D 단일클론성 항체 IgG4 변이체를 발현시키기 위한 CHO 세포의 형질감염:
구체화된 바와 같이, 형질감염을 위해, Vi-cell XR 자동 세포 계수기, Beckman coulter를 사용하여 세포 수 및 생존력 데이터를 수집했다. 제조업체의 프로토콜에 따라, Lipofectamine® LTX 및 PLUS 시약을 사용하여 형질감염을 수행했다. 필요한 부피의 세포 현탁액을 4-5분 동안 1400-1500 RPM에서 원심분리하고, 125ml 진탕 플라스크에서 표 36에 따라 지정된 부피의 OPTIMEM I에 재현탁했다. 형질감염 믹스는 표 3에서과 같이 준비되었다. DNA 세부 사항은 표 A를 참조한다. 형질감염 2-3일 후, 10 ml Power CHO2 CD 성장 배지를 첨가하고, 200 mM 스톡으로부터 Glutamax를 첨가하여 2 mM의 최종 농도를 달성하였다. 형질감염 후 6일 차에, 세포 배양 상청액을 10-15분 동안 1400-2000rpm에서 원심분리에 의해 수확하였다. IgG4 항체 변이체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다.
표 36. IgG4 구조체로 형질감염시키는 실시예
Figure pct00120
구체화된 바와 같이, C4701, C3276, C3256 클론 (이에 국한되지 않은)은 추가 정제 및 세포독성 분석을 위해 형질감염되었다.
표 37부터 삽입
항체 매개된 세포독성
정제 후, 항-CLEC2D 항체 클론을 유동 세포측정 분석을 사용하여, C4548 세포 상의 세포 표면 결합에 대해 평가하였다. 도 19C에서 알 수 있는 바와 같이, IgG4 아이소타입을 갖는 두 클론은 대조군 비-형질감염 CHO 세포와 비교할 때, ~4-8배 더 높은 MFI로 표면 발현된 CLEC2D 항원에 대한 결합을 나타내었다.
아이소형 변이체들의 기능성을 평가하기 위해, PC3 세포들은 제조업체의 프로토콜에 따라 Efluor로 라벨되었고, 24-웰 플레이트의 20% DMEM에서 0.04x106 밀도로 씨딩되었다. 24 시간 후, 새로 단리된 PBMCs를 T:E 1:5로 추가하고, 신규한 단일클론성 항-CLEC2D 항체 C3276, C3256, C3452, 및 C4608은 0.5ml의 분석 반응에서 100μg/ml로 추가되었고, 14 시간 동안 항온처리되었다. 24-웰 플레이트에서 상청액을 수집하고, 부착 세포를 트립신 처리하고, 1.5ml 튜브에 수집했다. 반응 혼합물을 시톡스 그린 (15nM)과 함께 20분 동안 항온처리하고, 유동 세포 분석기에서 형광을 검출했다. 특이적 세포 사멸 퍼센트는 테스트 샘플에서 대조군의 세포 사멸 퍼센트을 차감시켜 결정하였다.
도 19D에서 알 수 있는 바와 같이, C3276, IgG4 변이체 및 C4608 IgG1 변이체는 PC3 세포를 지향하는 유사한 백분율의 세포독성을 나타내었다. 종합하면, IgG1 및 IGG4 변이체 (100 μg/ml에서 처리됨)는 CD16 의존성 표적 세포 사멸의 작업을 보여주고, CLEC2D와 CD161 상호작용 차단을 통한 표적 세포 사멸시키는 PC3 세포를 지향한 항-종양 활성을 보여주었으며, 이는 종양 세포를 신속하게 죽이기 위해, ADCC 메커니즘과 독립적으로 기능하는 다중 경로의 연루를 암시한다. 또한, 전술한 항체의 상이한 아이소형 포멧은 잠재적으로 전립선암에 국한되지 않는 특정 질환에 대한 새로운 치료법을 개척할 수 있다.
세포독성에 있어서 변형된 글리코실화를 갖는 항-CLEC2D 항체의 영향
단일클론 항체 기반 바이오치료제는 면역 복합체 형성의 결과로서, 항체 작동체 기능, 뿐만 아니라, 표적 세포의 항원 에피토프의 효과적인 인식을 통해 기능한다. 최근에, 항체 작동체 기능은 전술한 부류의 생물치료제의 효능을 개선하기 위해 상당한 관심을 얻었다. 항체 의존적 세포 세포독성 (ADCC)은 치료요법적 항체의 임상 효능을 향상시키며, 환자의 백혈구 수용체 (FcγR)의 대립형질 다형성과 관련된 연구에서 구체화된 바와 같이, 항암 항체의 경우 그 효과가 더욱 두드러진다. 최근에, 화학 효소적 방법을 통해 개발된 균질한 IgG 글리코폼(glycoforms)에 대한 명쾌한 연구에서 항체 시알화가 코어 푸코실화에서는 ADCC에 부정적인 영향을 미치지만, 그러나 푸코실화되지 않은 항체의 경우에는 그렇지 않다는 것이 밝혀졌다. 다수의 연구에 따르면, 완전히 푸코실화안된 단일클론 항체는 FcγRIII에 대한 Fc 친화도를 유의하게 증가시키고, 이로 인하여 시험관내 및 생체내에서 항체 ADCC 기능을 몇 배로 향상시켰다.
타고난 면역 체계가 종양 미세 환경에 동원되는 면역 종양 표적에 대항한 차세대 단일 클론 항체 약물의 출현으로, NK 세포 작동체 기능을 참여시키는 것이 매우 중요해졌다. 종양 세포 상의 에피토프를 인지하는 개선된 ADCC 기능을 갖는 이러한 항체는 종양 세포 생존 및 이에 따른 종양 진행에 대해 더 많은 억제 효과를 발휘할 가능성이 있다. 이러한 맥락에서, 단일클론 항체 치료제의 ADCC 기능을 조절하는 것은 해한 사이토카인 방출에 대해 최적의 작동체 기능의 균형을 맞추는 데 도움이 된다.
아푸코실화된 항-CLEC2D 항체 발현:
Talen Fut8 유전자 녹아웃 세포주가 GS 음성 CHO 세포주에서 개발되었다. 이 세포주는 FUT8 유전자 녹아웃에 대해 서열 검증되었으며, C2899로 코딩되었다. C0694 (HC 벡터 및 LC 벡터)와 C2685 (HC 벡터 및 LC 벡터)는 이 세포주에 형질감염되었다. 항생제 선별이 수행되었고, 아푸코실화된 항-CLEC2D 항체를 발현시키는 이들 세포주로부터 미니풀 및 단일 세포 클론이 개발되었다. 유동-세포측정 분석에 의한 C4548 세포 상의 세포 표면 항원 결합 및 공초점 영상화에 의한 표적 세포 상의 세포 표면 항원 결합에 대해 아푸코실화된 항체들을 테스트하였다.
신규한 항-CLEC2D 단일클론성 항체 클론을 발현시키기 위한 C2899 세포 형질감염 형질감염:
C2899 세포들은 C0694 및 C2685 중쇄 벡터와 경쇄 벡터로 형질감염되었다. 세포 수 및 생존력 데이터는 Vi-cell XR 자동 세포 계수기, Beckman coulter를 사용하여 수집되었다. 제조업체의 프로토콜에 따라, Lipofectamine® LTX 및 PLUS 시약을 사용하여 형질감염을 수행했다. 필요한 부피의 세포 현탁액을 4분 동안 1400 RPM에서 원심분리하고, 125ml 진탕 플라스크에서 지정된 부피의 OPTIMEM I에 재현탁했다. 형질감염 믹스는 이전에 설명한 대로 준비되었다. C0694 HC 벡터 및 LC 벡터로 형질감염된 C2899 세포는 C3234로 공지되며, 한편으로 C2685 HC 벡터 및 LC 벡터로 형질감염된 C2899 세포는 C4335로 공지되었다.
아푸코실화된 항-CLEC2D 항체를 발현시키는 안정적 세포주의 생성:
항생제 선별:
>80% 세포 생존율에서 형질감염 후 항생제 선별을 시작하였다. 세포 현탁액을 4-5분 동안 1400 RPM에서 원심분리하였다. 펠렛은 완전한 Power CHO2 성장 배지에 재현탁되었고, 퓨로마이신 디하이드로클로라이드의 농도는 2μg/1X10^6 세포로 조정되었다. 항생제 선별은 매 2일 또는 3일마다 수행되었다.
안정적인 풀의 형질 감염 반복:
세포 수는 Vi-cell XR을 사용하여 측정되었다. 형질감염 전, 세포를 계대배양하였다. 앞서 언급한 바와 같이, 2차례 추가 순차적 형질감염을 수행하였다. 3 라운드의 형질감염 완료 시, 풀을 R3 안정 풀로 지정했다.
미니풀 플레이팅:
미니풀은 연속 희석 방법으로 생성되었다. 연속적으로 성장하는 세포주의 배양물은 플레이팅 1-2일 전, 2mM 글루타맥스가 포함된 30ml 완전 PowerCHO 2 성장 배지에서 0.5백만개 세포/ml로 계대배양되었다. 세포 수 및 생존력 데이터는 Vi-cell XR을 사용하여 수집되었다. 세포 현탁액의 연속 희석은 완전한 PowerCHO2 성장 배지에서 1:10 비율로 수행되었다. 세포를 클로닝 배지에서 웰당 200μl 부피로 96웰 플레이트에 웰당 10개 세포 밀도로 씨시딩하였다. 이들 미니-풀은 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃ 온도로 유지되었다.
미니-풀 스크리닝 및 증폭:
유동 세포측정에 의해 미니-풀이 스크리닝되었고, 이때 C4548 세포에 대한 결합이 평가되었다. 미니풀은 세포 표면 결합을 기반으로 등급화되었다. 유동 세포측정 스크리닝으로부터 선별된 미니풀을 96웰 플레이트에서 24-웰 플레이트로 증폭하고, 5% CO2 인큐베이터에서 37 ℃, 가습 조건으로 유지했다. 이들은 24-웰 플레이트에서 6-웰 플레이트 중 하나의 웰로 추가로 증폭되었다. 세포들이 합류된 후, 미니-풀은 6-웰 플레이트의 1개 웰에서 25-30ml의 성장 배지를 갖는 50ml 생물반응기 튜브 또는 125ml Erlenmeyer 교반 플라스크로 증폭되었고, 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터, 120-200RPM에서 가습 조건에서 유지시켰다.
단일 세포 클로닝
단일 세포들은 연속 희석 방법으로 생성되었다. 연속적으로 성장하는 선택된 미니-풀의 배양물은 플레이팅 클로닝 1-2일 전, 2mM 글루타맥스가 포함된 30ml 완전 PowerCHO 2 성장 배지에서 1백만개 세포/ml로 계대배양되었다. 세포 수 및 생존력 데이터는 Vi-cell XR을 사용하여 수집되었다. 세포 현탁액의 연속 희석은 완전한 PowerCHO2 성장 배지에서 1:10 비율로 수행되었다. 세포를 96-웰 플레이트에 0.5개 세포/웰의 밀도로 씨딩하고 가습된 5% CO2 정적(static) 인큐베이터에서 37OC 온도로 유지시켰다. 0일차부터 10일차까지 단클론성 보고서 생성을 위해 CloneSelect Imager(Molecular Devices)를 사용하여 플레이트를 스캔했다. 클론 집단군은 전체 웰의 0일차 이미지와 CloneSelect Imager에 의해 생성된 단클론성 보고서에서 확인되었다. 계대 번호는 P(x+0)이었다. 단일 세포 클론은 4자리 무작위수로 코딩되었다. 단일 세포 클론은 세포가 합류된 후 24-웰 플레이트로 증폭되었다. 계대 번호는 P(x+1)이었다.
단일 세포 클론의 스크리닝 및 클론 증폭:
세포 배양 상청액에서 항체를 평가하고, 클론의 등급을 매기기 위해 세포 표면 결합 분석을 수행하였다. C4548 세포 표면 발현된 CLEC2D 항원에 대해 더 높은 결합을 나타내는 단일 세포 클론은 2일 후에 24-웰에서 6-웰로 증폭되었다. 계대 번호는 (x+2)이었다. 이어서 6-웰 플레이트의 3개 웰에서 증폭시켰다. 계대 번호는 (x+3)이었다. 클론은 생물반응기 튜브 또는 Erlenmeyer 플라스크로 추가로 증폭되었다. 클론용 RCB 바이알을 준비했다.
단백질 정제를 위한 배양물 수거:
세포를 30-100ml 완전 파워 CHO2 성장 배지에 약 0.3X10^6 세포/ml의 밀도로 씨딩하고, 120 RPM 회전과 함께 5% CO2 인큐베이터에서 37℃, 가습 조건에서 6일 동안 항온처리했다. 3일차 또는 4일차에 완전 파워 CHO2 성장 배지와 함께 20%v/v 배지 보충(top-up)이 제공되었다. 상청액을 1400-2000RPM에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확하였다. 상층액을 수집하고, 단백질-A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.
유동-세포측정에 의한 세포 표면 결합 분석:
CHO 세포들은 CLEC2D 표면 발현 벡터로 일시적으로 형질감염되었다. 표면 발현은 형질감염된 세포들에서 4일차 내지 5일차에 최적이었다. 이들 세포는 C4548로 코드되었다. Vi-cell XR 자동 세포 계수기로 세포 수를 측정했다. CHO 세포 및 C4548 세포는 4-5분 동안 1000-1400 rpm에서 원심분리하였다. 펠렛을 1ml DPBS에 재현탁시켰다. 50,000개의 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 분취했다. 1-5μg의 정제된 항체 샘플 및 참조 대조군을 각 웰에 첨가하고, 실온(25℃)에서 40-60분 동안 항온처리했다. 플레이트를 4-5분 동안 1000-1400 rpm에서 원심분리하고, 상청액을 흡출시키고, 세포를 DPBS내 0.1% BSA로 세척하였다. 2.5 ml의 2% BSA를 DPBS로 50ml로 희석하였다. 염소 항-인간 IgG FITC 콘쥬게이트를 2차 항체로 이용하였다. 이차 항체의 1:100 희석액을 DPBS에 준비하였고, 100μl를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 30 분 동안 실온 (25℃), 암 상태에서 항온처리했다. 세포를 0.1% BSA로 세척하고, 100μl의 2% BSA에 재현탁시켰다. 샘플을 유동-세포 분석으로 분석했다.
형질감염되지 않은 CHO 세포에 대한 테스트 샘플 상청액의 결합을 평가하고, 하기 공식을 사용하여 C4548 세포 표면에 대한 특이적 결합 계산에 사용하였다:
Figure pct00121
안정한 세포 클론에서 정제된 항-CLEC2D 항체는 먼저 유동 세포측정 분석을 통해 C4548 세포에 대한 세포 표면 결합에 대해 평가되었으며, 유동 세포측정 분석 기반 결합 연구에 대한 실험은 섹션에 설명된 것과 유사하게 유지된다. 도 19E에서 볼 수 있는 바와 같이, C0613, C1301, C6268, C1699, C2437, C9832, C8900 및 C7749에 의해 구체화된 바와 같이, 모든 클론은 형질감염되지 않은 CHO 세포인 대조군과 비교할 때, ~2-10배 더 높은 MFI로 표면 발현된 CLEC2D 항원에 대한 차등 결합을 나타냈다.
아푸코실화된 항-CLEC2D 항체에 의한 세포독성
확인된 아푸코실화된 항-CLEC2D 단일클론 항체들은 이후에 세포독성 실험에 사용되었으며, 글리코실화 효과는 푸코실화된 항-CLEC2D 항체와 비교되었다.
여기에서, PC3 세포들은 제조업체의 프로토콜에 따라 Efluor로 라벨되었고, 24-웰 플레이트의 20% DMEM에서 0.04x106 밀도로 씨딩되었다. 24 시간, 새로 단리된 NK 세포는 T:E 1:1로 추가되었다. 신규한 단일클론성 항-CLEC2D 항체 C5511 (100 μg/ml) 및 아푸코실화된 mabs C7749, C8800와 C9832는 0.5ml의 분석 반응에서 20 μg/ml로 추가되었고, 14 시간 동안 항온처리되었다. 상청액은 후속적으로 24-웰 플레이트에서 수집된 후 부착 세포의 트립신 처리가 뒤따랐다. 반응 혼합물을 시톡스 그린 (15nM)과 함께 20분 동안 항온처리하고, 유동 세포측정 분석기에서 형광을 검출했다. 특이적 세포 사멸 퍼센트는 테스트 샘플에서 대조군의 세포 사멸 퍼센트을 차감시켜 결정하였다.
도 19F는 PC3 세포의 사멸을 통해 평가하였을 때, 항-CLEC2D 항체 매개된 세포독성에 대한 푸실화의 영향을 도시한다. 전에 언급된 바와 같이, 아푸코실화된 항-CLEC2D 항체들은 푸코실화된 항체 가령, C5511보다 5배 더 낮은 농도로 이용되었다. 관찰된 세포독성은 푸코실화된 항-CLEC2D 항체가 푸코실화된 항-CLEC2D 항체와 비교할 때, 적어도 5배 더 효과적임을 시사한다. 이로 인하여, 전술한 및 설명된 버전, 즉, 아푸코실화된 항-CLEC2D 항체는 증가된 임상 효능을 달성하기 위한 효율적인 대체 치료/치료 옵션으로 사용될 수 있다.
종합하면, 항-CLEC2D 단일클론성 항체의 기능적 효율성은 IgG4 아이소타입 포멧의 전술한 항체에 대한 기능성에서 볼 수 있는 바와 같이, ADCC 독립적일 수 있으며, 항-CLEC2D 항체의 아푸코실화 버전은 효율적인 ADCC 매개 표적 사멸을 유도하고, 이는 치료 공간에서 기능 및 적용 관련 다용성을 정교화/확장시킨다.
보체 의존적 세포독성
보체-의존적 세포독성, 또는 CDC는 항체가 보체-관련 반응의 캐스케이드를 활성화하여 원치 않는 표적을 용해시키는, 잘 알려진 기전이다. 일반적으로, IgG1 및 IgG3은 이의 Fc 영역을 경유하여 혈청 보체 성분, 특히 C1q에 결합함으로써 CDC 사멸 효과를 유도한다. 20개 이상의 고도로 조절된 요소들이 연루된, 복잡한 효소 활성화 및 절단 사건 이후, 이것은 궁극적으로 막 공격 복합체(MAC)의 형성으로 이어지고 이로 인하여 표적 세포를 파괴한다.
특이적 실시예에서 실험을 상세하게 설명하는데, 이때 5 × 104 개 세포들(PC3 및 Ramos)을 함유하는 50 μL의 표적 세포 현탁액을 96-웰 분석 플레이트의 각 웰에 추가하였다. 50 μL의 상이한 농도의 C5511 항체 (200, 40, 0.4, 0.04 μg/mL) 희석액을 해당 플레이트에 추가하여 반응을 시작한다. 플레이트를 30초 동안 교반시켰다. 그런 다음, 아기 토끼 보체를 세포 배지에 희석(1:20)하고, 50μL를 적절한 웰에 첨가했다. 30초 동안 교반시킨 후, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 120분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 제거하고 15분 동안 실온(RT)으로 냉각되도록 하고, 그런 다음 따뜻한 Risazurin 용액 25 μL를 추가하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 하룻밤 (16-20시간) 동안 항온처리하였다. 그런 다음, 플레이트를 37℃ 인큐베이터에서 빼내고, 15분 동안 실온(RT)으로 냉각시킨 다음, Synergy HT BIOTEK 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 형광 모드(여기 530 및 방출 590)에서 플레이트를 판독했다.
Ramos 세포주 및 PC3 세포주 둘 모두로부터 수득된 데이터는 도 19G에 나타낸 바와 같이, 항-CLEC2D 항체는 CDC 경로를 통한 이의 세포 사멸 기전을 나타내지 않음을 시사한다.
실시예 7: 항-CLEC2D 단일클론성 항체를 이용한 생체내 마우스 효능 연구
생체내 마우스 효능 연구
치료요법적 단일클론성 항체들 (mAbs)의 개발 동안, 부적절한 노출, 독성 또는 효능 부족과 관련된 비용이 많이 드는 후기 단계 실패를 피하기 위해, 임상에서 성공 가능성이 가장 큰 후보 mAbs를 조기에 식별하기 위한 전략이 필요하다. mAbs의 조기 스크리닝 및 최적화는 선두 구조체의 선택을 위한 특징, 이를 테면, 친화력, 효능 및 안정성에 중점을 두고, 한편으로 생체 내 효능에 대한 확인이 일반적으로 필요하다.
항-CLEC2D 단일클론성 항체의 항암 활성은 피하 PC3 종양 이종이식편을 품고 있는 huNOG-EXL 마우스에서 평가되었다 (도 20A 및 20B). 이 절차는 인간 조혈 줄기 세포와 접목 시, 인간과-유사한 면역 시스템 (인간 기원의 림프구 및 골수 계통)을 초래하는 슈퍼 면역-결핍 hGM-CSF/hIL3 형질전환-NOG 마우스에 의존한다. 이 모델로 면역-요법 작용제의 기능과 관련된 주요 선천적 기전의 효능 연구가 가능하였다. 이 연구는 종양 부피와 체중을 정기적으로 관찰하면서, 4-5주의 기간 동안 수행되었다. 이 연구는 Institutional Animal Ethics Committee (IAEC)에 따라 수행되었다.
모든 동물은 실험 시작 전, 약 5-7일 동안 적응을 위해 유지되었다. 동물을 IVCs에 그룹별로 수용하고 (케이지당 5마리) 오토클레이브 옥수수 속대를 깔개 재료로 사용했다. 동물은 22±3℃ 온도, 50±20% 습도, 각각 12시간의 명암 주기 및 시간당 15-20회의 신선한 공기 교체로 통제된 환경에서 유지되었다. 동물에게 인증된 방사선 조사 실험실 설치류 식이(Irradiated Laboratory Rodent Diet)를 임의로 먹였다.
Figure pct00122
모든 절차는 멸균 기술에 따라 층류 후드에서 수행되었다. 연구를 위해 >90 %의 생존력를 갖는 PC-3 (인간 전립선 선암종) 세포를 선택했다. 약 5 x 106 세포를 얼음에 보관된 마트리겔 50%를 함유하는 무혈청 배지 200μl 에 재현탁시켰다. 개별 환기 케이지(IVCs)에 수용된 수컷 huNOG-EXL 마우스를 연구에 사용했다. PC-3 세포주는 동물의 오른쪽 옆구리 부위에 세포를 피하 주사하여, 동물 내로 증식시켰다. 종양의 성장에 대해 이식된 영역을 모니터링하였다. 해당 종양이 만져질 수 있는 단계에 도달하고, 필요한 부피가 되면 (평균 종양 부피 115 mm3), 동물을 무작위화하고, 항-CLEC2D 모노클로날 항체, IgG1 대조군 모노클로날 항체 및 체크포인트 모노클로날 항체로 투여를 개시하였다. 항체들을 복강내 투여하였다. 각 개별 동물의 투여량은 체중을 기준으로 조정되었다.
이 연구의 주요 목적은 항-CLEC2D 단일클론 항체의 항종양 활성을 평가하는 것이었다. 항CLEC2D 항체 클론 단독의 효능에 더하여, PDL1 항원에 대항한 체크포인트 단일클론 항체와의 병용 치료에 대한 실험을 수행하였다. PC-3 종양 이종이식편을 품고있는 huNOG-EXL 마우스에서 동물 체중, 임상 징후 및 종양 부피를 실험 기간 동안 매 3일마다 기록하였다. 이 연구는 표 42에 기술된 바와 같이 다음과 같이 구성되었다:
표 42
Figure pct00123
"부문 1"의 동물은 연구 기간 동안 점진적인 종양 성장을 나타냈다. 다른 모든 실험부문에서 성장 억제가 관찰되었다. 연구 기간 동안 3일에 한 번씩 개체의 체중을 측정하였다. 개별 마우스의 체중 변화 백분율을 계산하고 기록했다. 연구 기간 동안 매일 동물에서 눈에 띄는 임상 징후에 대해 관찰하였다. 종양 부피는 (가령, 체중을 측정한 날과 동일한 날) 무작위로 해당 당일(0일차) 디지털 Vernier 캘리퍼스로 2-차원으로 측정한 다음, 매 3일에 한 번 측정했다. Vernier 캘리퍼스를 사용하여, 종양의 길이(L)와 폭(W)을 측정하였다. 종양 부피(TV)는 다음 공식을 사용하여 계산되었다:
TV = (L x W x W)/2; 이때 L = 길이 (mm); W = 폭 (mm).
개별 군에 대해 평균, 표준 편차(SD) 또는 평균의 표준 오차(SEM)를 계산했다. 항종양 활성은 대조군 IgG1 암(부문 1)에 대한 최대 종양 부피 억제로 평가되었다 . 데이터 평가는 통계 소프트웨어 Graph Pad Prism V 5.0을 사용하여 수행되었다. 종양 성장 억제(TGI)는 다음 공식을 사용하여 계산되었다:
Figure pct00124
여기에서, T = (X일차에 테스트 부문의 평균 종양 부피 (TV) - 0일차 테스트 부문의 평균 TV; C = (X일차의 대조군 인간 IgG (부문 1)의 평균 TV - 0일차 대조군 인간 IgG (부문 1)의 평균 TV.
상대 종양 부피(RTV) 및 종양 성장 억제를 계산했다. RTV 데이터에 대해 평균 ± SEM을 계산하고, 종양 성장 억제를 백분율로 표시했다. 이원 ANOVA는 통계적 분석을 위해 활용되었으며, 부문 간의 p 값 <0.05는 유의한 것으로 간주되었다. 결과는 항-CLEC2D 항체 단독 요법과 PDL1에 대한 체크 포인트 단일클론 항체 조합 모두에서 상당한 종양 성장 감소를 보여준다.
대조군 인간 IgG1을 나타내는 부문 1과 비교하여 부문 2, 부문 3, 부문 4 및 부문 5에서 상당한 종양 성장 억제가 관찰되었습다. 전체 연구 기간에 걸쳐 상당한 종양 성장 억제가 항-CLEC2D 단일클론성 항체 클론 및 항-PDL1 항체로 처리된 동물에서 관찰되었다는 것은 예상치 못한 일이었다. 더 흥미롭게도, 항-CLEC2D 단일클론 항체 클론과 항-PDL1 단일클론 항체의 조합으로 처리된 동물에서 종양 크기가 절반으로 감소된 것은 완전히 새로운 발견이었다. 이러한 관찰은 항-CLEC2D 항체 및 항-PDL1 항체와의 조합 치료가 5 mg/kg의 감소된 투여량에서 이러한 높은 수준의 종양 성장 억제를 달성했기 때문에 매우 중요하다. 이 데이터는 항-CLEC2D 항체를 단독으로 사용한 경우, 그리고 항-PDL1 항체와 조합하여 사용한 경우, 상당한 항종양 활성을 나타내며, CLEC2D 항원에 대한 항체 클론은 다양한 질환 적응증에 대한 큰 치료 잠재력을 가지고 있다.
연구 기간 동안, 단일클론성 항체 용량은 가벼운 체중 감소가 있지만, 잘 용인되었다. 케이지 쪽 관찰에 따르면, 실험 기간 동안 모든 그룹에서 비정상적인 행동의 가시적 징후 또는 불리한 임상 증상이 없었다. 종양 부위에 대한 T 세포 침윤은 절제된 종양의 면역조직화학 (IHC)을 사용하여 분석되었다. 수거된 종양 세포는 침윤을 이해하기 위해, 다양한 유형의 T 세포 마커에 적용되었다. FFPE 조직 (포르말린-고정된 파라핀-매립된 (FFPE) 조직 검체)에 대한 면역조직화학을 위한 조직학적 분석을 수행했다. 동물을 안락사시키고, 종양을 수확하고, 24시간 동안 10% 중성 완충제 포르말린에서 고정시켰다. 이 조직을 조직 프로세싱하였다. 파라핀 매립된 조직 블록은 조직 프로세싱이 완료된 후, 준비되었다. 후속적으로, 절단 블레이드 홀더 각도는 마이크로톰의 조직 블록 표면에 맞게 조정되었다. 거친 트리밍을 수행하고, 5마이크론 두께의 미세 섹션을 취하여 조직 수조로 옮겼다. F포르말린-고정된 파라핀-매립된 (FFPE) 조직 검체들은 표준 시약을 이용한IHC 착색을 위해 프로세싱되었다.
샘플을 세척 완충액(PBST-0.3% 트리톤X-100)에서 10분 동안 세척했다. 샘플을 가습 환경에서 30-60분 동안 차단 용액(PBS 중 10% 정상 염소 혈청 및 3% BSA)과 함께 항온처리했다. 항체 희석액 완충제 (3% BSA/PBS)에 일차 항체들을 희석하였다. 조직을 1:100 희석으로 CD3 항원에 대항한 일차 항체와 함께 항온처리하고, 4℃에서 하룻밤 항온처리했다. 후속적으로 슬라이드를 세척 완충액에서 세척당 10-30분동안 세차례 세척하였다. 그 다음, 실온에서 2차 항체 염소 항-토끼 IgG H&L(HRP)과 함께 항온처리했다. 슬라이드는 세척 완충액에서 각 세척당 15-30분동안 세차례 세척하였다. DAB Chromogen은 조직 착색의 적절한 강도를 개발하기 위해 적용되었다. 대조착색은 헤마톡실린으로 수행되었다.
종양 샘플을 항-CD3 항체로 면역조직화학적으로 착색하였다. CD3 세포 (범 T 세포 마커) 침윤은 인간 IgG 대조군(부문 1)에서 종양 조직의 주변에서 관찰되었다. 그러나, 항-CLEC2D 항체, 체크 포인트 항체 단독, 또는 항-CLEC2D 항체와 체크 포인트 항체의 조합으로 처리된 동물에서, CD3 세포 침윤은 주변부 및 또한 종양 세포 주변에서 이질적으로 관찰되었다. 막성 면역조직화학적 마커인 CD3은 항-CLEC2D 항체, 체크 포인트 항체, 그리고 항-CLEC2D 항체와 체크 포인트 항체의 조합으로 처리된 동물로부터 수거된 종양 샘플을 경도 내지 중도의 착색을 시키는 것으로 나타났다. 데이터는 종양 매개 면역 억제의 메커니즘에 대한 명확한 통찰력을 제공한다.
라벨된 항-CLEC2D 항체의 국소화
별도의 영상 실험에서, Alexa 647로 라벨된 항-CLEC2D 항체를 10mg/kg의 단일 용량으로 정맥내 투여했다. 형광 라벨된 항체를 피하 PC-3 종양을 품고 있는 huNOG-EXL 마우스에 투여했다(평균 종양 부피 ~213mm3). 생체내 영상화는 Alexa 647 라벨된 항체의 투여 후, 0분, 5분, 15분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 수행되었 (도 20C). 항-CLEC2D 항체에 대항하는 단일클론성 항체는 PC-3 종양을 품고 있는 huNOG-EXL 마우스에서 관심대상의 표적 항원에 대해 친화력 (종양 신호 강도로부터 명백함)를 나타내었다.
종양의 신호 강도는 항체 주입 후 5분 만 조기에 나타났고, 시간이 지남에 따라 점차적으로 증가했다. 피크 신호 강도는 3시간에 관찰되었으며, 종양으로부터의 신호 강도는 96시간까지 지속되었다.
생체내 선별된 단일클론성 항체 샨물의 마우스에서 효능
별도의 후속 이종이식 마우스 연구에서 단일클론 항체 약물 산물을 테스트하여 단일클론 항체 치료 시 종양 성장 감소를 평가했다.
동물의 기원: 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포(HSCs)가 이식된 hGM-CSF/hIL3 NOG 마우스는 빠르면 주사-후 6-8주에 광범위한 세포 계통을 안정적으로 발달시킨다. 골수 및 림프 계통 세포는 모두 말초 혈액, 골수, 흉선 그리고 비장, 폐 및 간을 포함한 비-림프 조직에 존재한다. 현재 연구를 위해, 말초 혈액에서 hCD45+가 25% 이상인 huNOG-EXL 마우스를 사용했다.
이론적근거: 이 절차는 인간 조혈 줄기 세포와 접목 시, 인간과-유사한 면역 시스템 (인간 기원의 림프구 및 골수 계통)을 초래하는 슈퍼 면역결핍 hGM-CSF/hIL3 형질전환-NOG 마우스에 의존한다. 이 모델은 면역-요법 관련 약제의 효능과 관련된 선천적 메커니즘을 연구하고, 인간 이종이식편의 확립을 위한 적합한 모델을 제공할 수 있다.
세포주 huNOG-EXL
성별 수컷
출처 Taconic (USA)
실험 시작 연령 13-14 주
동물의 체중 18-22 g
동물 관리
동물 복지
Control and Supervision of Experiments on Animals (CPCSEA), 인도 정부 및 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(AAALAC) 지침의 규정에 따라 동물을 관리했다.
수용시설 및 영양공급
동물은 22 + 3℃ 온도, 50 + 20% 습도, 12시간 명암 주기 및 시간당 15-20회의 신선한 공기 교체로 제어된 환경에서 유지되는 개별적으로 환기되는 우리에 수용되었다. 동물을 그룹-별로 수용하고, 오토클레이브 옥수수 속대(Sparconn Life Sciences, Bangalore, India)를 깔개 재료로 사용했다. 동물에게 인증된 방사선 조사 실험실 설치류 식이를 임의로 연구 기간 동안 먹였다(NIH-31).
음용수
RO를 통해 여과된 신선한 음용수는 노즐이 장착된 병을 통해 모든 동물에게 고압증기멸균 후 임의로 제공되었다.
동물의 준비
동물을 10일 동안 실험실에서 순응시켰다. 동물을 선별하기 전, 철저한 관찰을 수행했으며, 겉보기에 건강한 동물만 연구에 사용했다.
동물 식별확인
동물에게 개별 번호를 부여하였고, 실험, 연구 번호, 무작위화 날짜, 마우스 계통, 성별 및 마우스 개별 번호를 표시한 케이지 카드가 해당 케이지에 표시되었다. 무작위 그룹 식별 후, 치료 코드, 용량, 일정 및 투여 경로가 케이지 카드에 포함되었다.
실험 과정
종양 세포들의 준비
모든 절차는 멸균 기술에 따라 층류 후드에서 수행되었다. 연구를 위해 >90 %의 생존력를 갖는 PC-3 (인간 전립선 선암종) 세포를 선택했다. 약 5 x 106 세포를 얼음에 보관된 마트리겔 50%를 함유하는 무혈청 배지 200μl 에 재현탁시켰다.
세포의 피하 주사
개별 환기 케이지(IVCs)에 수용된 수컷 huNOG-EXL 마우스를 연구에 사용했다. PC-3 세포주는 동물의 오른쪽 옆구리 부위에 세포를 피하 주사하여, 동물 내로 증식시켰다. 종양의 성장에 대해 이식된 영역을 모니터링하였다. 세포 주사 4일 후, 동물을 종양 부피(평균 종양 부피
Figure pct00125
37mm3)를 기준으로 무작위화하고 투여를 시작했다.
테스트 물질의 투여 경로 및 방식:
필요한 양의 테스트 항체를 준비하고 2-80C에서 보관했다. 항체들을 복강내 투여하였다. 각 개별 동물의 투여량은 동물의 체중을 기준으로 조정되었다. 각 항체에 대해, 사용하지 않은 새 주사기와 바늘을 사용했다.
실험 기획
· 단일클론 항체 산물은 10mg/kg 투여량으로 사용되었다.
a. C5511 mAb 그룹;
b. C6481 mAb 그룹.
· 비히클 대조군 IgG1 그룹 -대조군 IgG1은 10mg/kg 용량으로 이용되었다.
· 처리 군당 5마리 동물.
· 항체 약물 산물은 처음 2주 동안은 매 3일마다, 나머지 연구 기간 동안에는 매주 1회 주사하였다.
· 전체 연구 기간 36 일.
·종양 종양 부피 측정 및 동물 체중 측정은 3일마다 수행하였다.
투여량 및 투여 경로
필요한 양의 테스트 화합물(즉석 사용 가능한 제형)을 사용하고 -200C에서 보관했다. 테스트 화합물을 각각의 그룹에 복강내 투여하였다. 각 개별 동물의 투여량은 투여 직전에 결정된 체중을 기준으로 조정되었고, 투여량 부피는 10mL/kg 체중으로 유지되었다. 각 테스트 화합물의 경우 멸균된 새 주사기와 바늘을 사용했다. 상기 테스트 화합물은 약물 투여 당일 바로 해동되었다.
관찰
체중 -연구 기간 동안 3일에 한 번씩 개체의 체중을 측정하였다. 개별 마우스의 체중 변화 %을 계산하고 기록했다.
임상 신호 -동물의 눈에 보이는 임상 징후에 대해 관찰되었고, 치료 기간 동안 매 3일마다 1회 기록하였다.
종양 부피 측정 -종양 부피는 무작위화 당일(1일차) 디지털 Vernier 캘리퍼스로 2-차원으로 측정되었다. 2차 종양 부피 측정은 3일째에(즉, 체중을 측정한 동일한 날짜에) 추가로 3일마다 실험이 끝날 때까지 종양 부피 측정되었다. Vernier 캘리퍼스를 사용하여, 종양의 길이(L)와 폭(W)을 측정하였다. 종양 부피(TV)는 다음 공식을 사용하여 계산되었다:
Figure pct00126
여기에서, L = 길이 (mm); W = 폭 (mm).
개별 군에 대해 평균, 표준 편차(SD) 또는 평균의 표준 오차(SEM)를 계산했다.
항종양 활성
항종양 활성은 비히클 대조군에 대한 최대 종양 부피 억제로 평가되었다. 데이터 평가는 통계 소프트웨어 Graph Pad Prism V 5.0을 사용하여 수행되었다.
· 종양 성장 억제 (TGI)
TGI는 다음의 식을 이용하여 산출되었다:
TGI = (1 -T/C) x 100
여기에서, T = (X 일차에 테스트 그룹에서 평균 TV - 1일차 테스트 그룹에서 평균 TV)
C = (X 일차에 대조군에서 평균 TV - 1일차 대조군 그룹에서 평균 TV)
· 상대적 종양 부피 (RTV)
상대적 종양 부피 (RTV)는 다음 공식을 사용하여 계산되었다:
Figure pct00127
통계 분석
종양 억제의 통계적 유의성을 평가하기 위해, Graph Pad Prism V 8.3.0을 사용하여 이원 ANOVA에 이어서 Bonferroni 사후 테스트를 수행했다. p 값 <0.05는 그룹 간의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.
부검
종양 부하(TV>1500mm3) 및 종양 괴사/궤양은 진행성 종양 성장으로 인해 관찰되었다. 따라서, 종양 종점 및 윤리적 이유(36일째)에 기초하여, 모든 실험 그룹의 모든 동물을 인도적으로 안락사시키고, 병리학적 육안 관찰을 기록하였다. 안락사 전, 혈액 샘플링을 수행하고, 혈청을 분리하여 -80℃에 보관했다. 모든 살아있는 동물 및 절제된 종양 조직은 눈금척도와 함께 사진을 찍고, 전체 종양 조직은 포르말린-고정했다.
생체내 연구로부터 얻은 결과
항종양 활성
이 연구에서 PC-3 종양을 품고 있는 huNOG-EXL 마우스는 10 mg/kg의 용량으로 복강 내 시험 화합물로 처리되었다(1, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 & 33일차). 현재 실험 조건에서, 비히클 대조군 IgG1 그룹은 실험 기간 동안 점진적인 종양 성장을 보였다. 따라서 다른 치료군과 이 군을 비교하여, 항암 효능 평가를 하였다. 테스트된 용량 및 요법 중에서, 두 개의 테스트 부분은 24일째에 비히클 대조군 IgG1과 비교할 때, C5511 mAb 그룹 및 C6481 mAb 그룹이 각각 p<0.001 및 p<0.05로 유의한 종양 성장 억제를 나타냄을 보여주었다. 반면, 36일차에 C5511 mAb 그룹만이 비히클 대조군 IgG1 그룹과 비교할 때, p<0.05로 유의적인 종양 성장 억제를 나타내었다. 데이터는 표 43에 제시된다.
표 43. 피하 PC-3 종양 이종이식편을 품고 있는 인간화된 (huNOG-EXL) 마우스에서 테스트 화합물의 효과
Figure pct00128
24일차 및 36일차에 종양 부피 (TV) & 델타 종양 부피 (ΔTV)
24일차, C5511 mAb 그룹, 비히클 대조군 IgG1 그룹, & C6481 mAb 그룹의 평균 종양 부피 (mm3)는 차례로 241 ± 31, 474 ± 38, 및 355 ± 68이었다. 더욱이, C5511 mAb 그룹, 비히클 대조군 IgG1 그룹, & C6481 mAb 그룹의 24일차 평균 델타 종양 부피 (ΔTV)는 차례로 204 ± 32, 437 ± 38, 및 318 ± 68 mm3이었다. 처리 그룹, C5511 mAb 그룹 및 C6481 mAb 그룹은 24일차 비히클 대조군 IgG1 그룹과 비교하여 종양 부피 및 델타 종양 부피에서 유의적인 감소를 보였다(p < 0.001 & p < 0.05). 36일차 C5511 mAb 그룹, 비히클 대조군 IgG1 그룹, 및 C6481 mAb 그룹의 평균 종양 부피는 차례로 690 ± 186, 1062 ± 157, 및 977 ± 230 mm3이었다. 36일차 C5511 mAb 그룹, 비히클 대조군 IgG1 그룹, 및 C6481 mAb 그룹의 평균 델타 종양 부피 (ΔTV)는 차례로 654 ± 187, 1025 ± 159, 및 940 ± 231 mm3이었다. 처리 그룹, C5511 mAb 그룹은 비히클 대조군 IgG1 그룹과 비교하여 종양 부피 및 델타 종양 부피에서 유의적인 감소를 보였다(p < 0.05). 모든 처리 그룹에서 종양 부피 (TV) & 델타 종양 부피 (ΔTV)는 표 44와 표 45, 그리고 도 20D, 20E, 20F 및 20G에 요약된다.
표 44. 피하 PC-3 종양 이종이식편을 품고 있는 (huNOG-EXL) 마우스의 평균 종양 부피에 있어서 테스트 화합물의 효과
Figure pct00129
표 45. 피하 PC-3 종양 이종이식편을 품고 있는 (huNOG-EXL) 마우스의 Δ (델타) 평균 종양 부피에 있어서 테스트 화합물의 효과
Figure pct00130
24일차 및 36일차에 종양 성장 억제 백분율 (TGI%)
C5511 mAb 그룹의 종양 성장 억제 (TGI%)는 24일차에 49%의 최대값을 보였고, 그 다음으로 C6481 mAb 그룹의 TGI% 값은 25%이었다. 반면, C5511 mAb 그룹 및 C6481 mAb 그룹에 대한 36일차의 TGI% 값은 비히클 대조군 IgG1 그룹에 대해 36일째에 각각 35% 및 8%였다. 개별 동물 종양 성장 억제는 표 46에 요약되어 있다.
표 46. PC-3 종양 이종이식편을 품고 있는 (huNOG-EXL) 마우스에 대항한 테스트 화합물의 종양 성장 억제 (TGI%)
Figure pct00131
24일차 및 36일차에 대적 종양 부피 (RTV) & 델타 상대적 종양 부피 (ΔRTV)
24일차, C5511 mAb 그룹 비히클 대조군 IgG1 그룹 및 C6481 mAb 그룹의 평균 상대적 종양 부피는 차례로 7 ± 1, 13 ± 1, 및 10 ± 2이었다. C5511 mAb 그룹, 비히클 대조군 IgG1 그룹, 및 C6481 mAb 그룹의 델타 상대적 종양 부피 (ΔRTV)는 표 5에 나타낸 것과 같이 차례로 6 ± 1, 12 ± 1, 및 9 ± 2이었다. 처리 그룹, C5511 mAb 그룹은 비히클 대조군 IgG1 그룹과 비교하였을 때, 상대적 종양 부피 및 델타 상대적 종양 부피 에서 유의적인 감소를 보였다(p < 0.001), 도 20H 및 20I. 36일차의 평균 상대적 종양 부피는 C5511 mAb 그룹의 경우 20 ± 6, 비히클 대조군 IgG1 그룹에서 29 ± 5, 그리고 C6481 mAb 그룹에서 27 ± 7이었다. 한편, 36일차, C5511 mAb 그룹, 비히클 대조군 IgG1 그룹 및 C6481 mAb 그룹의 평균 델타 종양 부피 (ΔRTV)는 차례로 19 ± 6, 28 ± 5, 및 26 ± 7이었다(표 47과 도 20J 및 20K에 나타냄).
표 47. PC-3 종양 이종이식편을 품고 있는 (hu NOG-EXL) 마우스에 대항한 테스트 화합물의 상대적 종양 부피 (RTV)
Figure pct00132
표 48. PC-3 종양 이종이식편을 품고 있는 (hu NOG-EXL) 마우스에 대항한 테스트 화합물의 델타 상대적 종양 부피 (ΔRTV)
Figure pct00133
이 연구는 테스트 조건에서 C5511 mAb 그룹, 비히클 대조군 IgG1 그룹 및 C6481 mAb 그룹에서 10 mg/kg의 투여량으로 복강내 (1, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 및 33일차)에 사용된 화합물은 huNOG-EXL 마우스에서 PC-3 종양 이종이식편에 대한 항암 효능을 평가하기 위해 테스트하였다. 효능 평가는 비히클 대조군 IgG1 그룹에 대비하여 산출되었다. 테스트된 화합물들에서, C5511 mAb 그룹 및 C6481 mAb 그룹은 비히클 대조군 IgG1 그룹과 비교하였을 때, 유의적인 항-암 효능을 나타내었다. 종양 부피, 종양 성장 억제, 상대적 종양 부피의 통계학적 분석을 기반으로 C5511 mAb 그룹으로 처리는 C6481 mAb 그룹에서 이용된 테스트 화합물과 비교하였을 때 우위의 항종양 효능을 보여주었다. 모든 치료 그룹에서 중간 정도의 체중 감소가 관찰되었다.
이러한 맥락에서, 현재 HuNOG 연구에서 테스트된 단일클론성 항체 산물은 준-최적 분석 조건에서 활용되었다는 점을 주지해야 한다. 이 연구에 사용된 단일클론 항체 산물은 최적의 기능을 위해 인간 NK 세포가 필요하며, 현재까지 인간 NK 세포가 생체 내 조건을 모방할 수 있는 동물 모델은 없다. 이러한 제약을 고려하여, HuNOG 모델이 합리적으로 사용되었으며, 여기서 인간 면역 세포(인간 NK 세포 포함)가 마우스에 확립되었다. 그러나, NK 세포의 풍도는 유의적으로 낮다. 따라서 HuNOG 마우스 모델은 이러한 새로운 항-CLEC2D 단일클론 항체 산물을 테스트하기에 적합한 실험 조건을 타탕성있게 제공한다. 또한, 연구의 진행과 함께 동물이 나이가 들어감에 따라 인간 면역 세포의 전체 수가 감소하기 시작하는 것이 관찰되었다. HuNOG PC3 이종이식편 모델에서 이러한 수준의 종양 성장 감소는 놀랍고, 이는 본 명세서의 신규한 항-CLEC2D 단일클론성 항체의 매우 우수한 효능을 나타낸다.
실시예 8: 항-CLEC2D 단일클론성 항체의 특징
정제된 항-CLEC2D 항체 는 특히 질량, 입체구조, 해독-후 변형과 같은 항체의 여러 고유 특성을 나타내는 다양한 생물물리학 및 생화학적 특성화를 거쳤다.
단리된 단편의 확인을 위해, SDS PAGE를 비-환원 조건에서 수행하였으며,
Figure pct00134
모든 샘플에 대해 분자량(MW) 150kDa에 해당하는 단일 주요 밴드가 관찰되었고, 이것은 무손상 항-CLEC2D 항체를 나타낸다. 환원 조건하에 있는 동안, 25kDa 및 50kDa에서 항-CLEC2D 항체의 경쇄와 중쇄가 연합된 2개의 밴드가 명백하였다. SDS PAGE 데이터는 도 21A)에 나타내었다.
무손상 질량 실험은 ELISA, 유동 세포측정, 웨스턴 블랏팅, BIACORE, Waters UPLC H-클래스 Bio+ Xevo G2 XS QTOF UNIFI를 기반으로 하는 방법을 이용하여 실시되었다. Xevo G2 XS QTOF는 포지티브 감도 MS 전용 모드에서 실행되었다. 사전 처리 없이, 1 μg 샘플은 위에서 설명한 대로 동일한 크로마토그래피 조건(하위 단위 질량 분석과 상이한 구배만) 및 질량 분석 조건을 사용하여 위에서 설명한 하위 단위 질량 분석으로 분석되었다..
가장 풍부한 질량은 도 21B) 및 표 49에 나타난 바와 같이, 제네릭 글리코실화 IgG1 단일클론항체에 가깝고, 따라서 항-CLEC2D 단일클론항체의 분자량을 확인시켜준다.
산성, 염기성 및 주요 피크는 분석되었고, 주요 피크와 함께 각 변이체의 백분율은 항-CLEC2D 항체 분자에서 WCX-LC 방법에 의해 결정된 전하 분포를 아래에 표로 나타낸다. 산성 아이소형의 상대적 풍부함은 일반적으로 항체 내 산화, 탈아미드화 및 당화 과정에 기인한다. 다른 한편으로, C-말단 리신의 존재 및 아미드화는 주로 항체에서 염기성 아이소형을 형성하는 원인이 된다. WCX 크로마토그램은 도 21C)에 나타낸다.
산성 종: 10%
주요 종: 83%
염기성 종: 7%
단백질 응집은 면역원성을 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다; 소량의 응집체가 예상되지만, 항체가 제조, 정제, 제제화 및 저장 수명 동안 겪을 수 있는 스트레스 조건으로 인해 이 양이 증가할 가능성이 있다. 응집은 항-약물 항체(ADAs)의 생산을 또한 유도할 수 있는데, 이것은 활성 손실을 초래하거나 또는 투여 시 부작용을 일으킬 수 있다. 항-CLEC2D 항체 샘플을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석하고, 전형적인 크로마토그램을 하기에 나타내었다. 도 21D)의 첨부된 크로마토그램에서 관찰된 바와 같이, 100% 단량체가 관찰되어 샘플에 어떠한 응집체 및/또는 분해물도 없음을 확인하였다.
치료요법적 단일클론성 항체들의 중요한 품질 속성 중 하나는 글리코실화 프로파일이다. 항-CLEC2D 항체의 글리칸 분포를 확인하기 위해, 샘플을 HILIC N-글리칸 프로파일링 방법으로 분석했다. 주요 글리칸, 이를 테면, G0F, G1F, G1F' 및 G2F가 확인되었으며, 갈락토실화된 글리칸의 총 백분율은 약 46.44%인 것으로 나타났다.
가용성 CLEC2D 항원에 대항하는 결합 연구:
결합 연구는 정제된 가용성 CLEC2D 항원에 대한 항-CLEC2D 항체를 사용하여 수행되었으며, 측정은 ELISA 및 SPR 기반 방법을 통해 이루어졌다.
게다가, SPR은 신생아 Fc 수용체(FcRn)와의 결합 상호작용이 재조합 인간 단일클론 항체 치료제의 약동학적 특성의 결정 요인 중 하나이고, 결정화가능한 단편에서 보존된 결합 모티프는 FcRn과 상호작용하기 때문에, 항-CLEC2D 항체와 FcRn 사이의 상호작용 이해에 또한 사용되었다.
ELISA;
가용성 CLEC2D 항원을 생성하고, CHO 세포 배양 시스템을 사용하여 정제하고, 항-CLEC2D 항체 C5511을 ELISA 분석에 사용하였다. 상기 방법은 직접 ELISA, 간접 ELISA 및 샌드위치 ELISA로 예시되는 다양한 ELISA 형식을 사용하여 최적화되었다. 마지막으로, 최적화된 ELISA 분석은 항원이 바이오틴 모이어티로 라벨된 단백질 A 피복된 플레이트를 기반으로 하였다. 0.01μg/mL ~ 62.5μg/mL 범위의 항-CLEC2D 항체 희석액을 희석 완충액 0.5% BSA(0.05% 트윈20이 포함된 DPBS)에서 만들었다.
상기 단백질 A 피복된 웰은 200μL의 세척 완충제 (DPBS+ 0.1% Tween20)으로 두 차례 세척되었다. 100μL의 각 항체 희석액을 웰에 첨가하고, 플레이트를 오비탈 쉐이커 상에서 실온에서 90분 동안 항온처리하였다. 각 웰을 200μL의 세척 완충액으로 4회 헹구었다. 100μL의 상이한 농도의 바이오틴화된 항원, 라벨링은 앞서 기술한 바와 같이 수행되었고, 각 웰에 첨가되었고, 플레이트는 오비탈 쉐이커 상에서 실온에서 60분 동안 항온처리하였다. 각 웰을 200μL의 세척 완충액으로 4회 헹구었다. 100μL의 1:5000 희석된 HRP-라벨된 스트렙타비딘을 첨가하고, 플레이트를 오비탈 쉐이커에서 실온에서 60분 동안 항온처리하였다. 각 웰을 200μL의 세척 완충액으로 5회 헹구었다. 100μl 1X TMB를 첨가하고, 플레이트를 암실에서 RT에서 30분 동안 항온처리하였다. 30분 후, 100μl의 중단 용액을 첨가하고, 플레이트를 450nm에서 판독했다.
블랭크의 적절한 차감에 추가로, Graphpad PRISM 6.0을 사용하여 흡광도 값을 플롯하고, S자 결합을 기반으로 하는 바인딩 모델에 피팅했다. 피팅에서 구한 KD 값은 정제된 CLEC2D 항원에 대항하는 항-CLEC2D 항체의 경우 10-17 nM인 것으로 밝혀졌다 (도 21F). 실험은 통계적 신뢰도를 달성하기 위해, 독립적으로 3회 이상 독립적으로 반복되었으며, 변동은 5% 미만인 것으로 밝혀졌으며, 신뢰 구간은 95% 이내였다.
가용성 CLEC2D 항원에 대한 항-CLEC2D 항체를 사용한 BIAcore 결합 연구
BIACORE를 사용한 표면 플라즈몬 공명을 통해, 특정 단일클론 항체와의 CLEC2D 항원 상호 작용을 모니터링했다. 항-CLEC2D 항체와 CLEC2D 항원의 상호작용에 대한 운동 매개변수를 평가하였다. 이 방법은 CLEC2D 항원에 대한 잠재적인 고-친화력 단일클론 항체를 스크리닝하는 데 사용되었다.
상이한 단일클론성 항체들은 CLEC2D 항원을 지향하여 상이한 친화성을 나타냈다. 이 실험에서 100 nM 미만 (가령, ≤ 90 nM, ≤ 80 nM, ≤ 70 nM, ≤ 60 nM, ≤ 50 nM, ≤ 40 nM, ≤ 30 nM, ≤ 20 nM, ≤ 10 nM, ≤ 5 nM, 또는 ≤ 1 nM)의 친화력 상수가 나타났다.
CLEC2D 항원 결합 동역학 및 CLEC2D 항원과 항-CLEC2D 항체 결합 연구 사이의 친화력 연구는 BIACORE 3000 기기에서 항-His 항체 결합 포획 화학을 사용하여 수행되었다. His Capture Kit (GE healthcare)는 RU ~1800에서 CM5 칩 표면 상에 고정되었다. CLEC2D 항원은 항-His(~200 μg/mL의 농도)와 결합된 CM5 칩, 표면 상에 캡처되었고, 이때 항원의 희석은 HBS-EP+ 완충제를 포함하는 런닝 완충제 (GE Healthcare)를 통해 이루어졌다. 후속적으로 항-CLEC2D 항체 C5511은 각각 3분 및 25분의 결합 및 해리 시간에서 1 내지 100μg/mL 범위의 농도로 통과되었다. 항체 희석액은 HBS-EP+ 완충제 (GE healthcare)에서 만들었다. 수득된 반응 곡선(도 21G)을 각각 기준 유동 세포 신호 및 블랭크로부터 적절하게 차감하고, 1:1:1 Langmuir 결합에 피팅하면 추정 KD는 ~109M-1이었다.
FcRn 결합
표면 플라즈몬 공명(SPR) 바이오센서 분석은 FcRn과 항체 치료제 간의 상호작용 특성화에 종종 사용된다. 연구에 따르면, FcRn은 pH 의존적 방식으로 CH2-CH3 도메인 경계면에서 IgG의 결정화 가능한 단편(Fc)에 있는 결합 모티프와 상호작용하는 것으로 나타났다 6,8. 이 상호작용의 pH 의존성은 IgG 분자의 긴-혈청 반감기 유지에 필수적이다. 구체적으로, 내피세포의 엔도솜(~pH 6.0)에서 포음작용(pinocytosis)을 통해 내재화된 IgG는 FcRn에 결합하여 IgG-FcRn 복합체를 형성하고; 그런 다음, IgG-FcRn 복합체는 세포 표면으로 이동되어 IgG가 생리적 pH (~7.4)에서 순환계로 다시 방출된다. 이것은 IgG의 리소좀 분해를 막는다. 재조합 인간 단일클론성 항체 (rhumAb) 치료제의 경우, FcRn-rhumAb 결합 상호작용은 약동학(PK) 특성의 중요한 결정인자이며, FcRn 결합 모티프의 표적화된 조작은 환자에서 항체 치료제를 덜 빈번하게 투여할 수 있다. 여러 연구에서 FcRn 결합 친화력과 항체 반감기 사이에 상관관계가 있음을 시사했지만, 그러한 상관관계가 없다는 보고도 또한 있다.
인간 FcRn/FCGRT & B2M 이종이량체 단백질과 항-CLEC2D 항체 결합 연구 사이의 결합 동역학 및 친화력 연구를 BIACORE 3000 기기를 사용하여 수행했다. 인간 FcRn/FCGRT 및 B2M 이종이량체 단백질(Acro Biosystems)을 ~300의 RU에서 CM5 칩 표면에 고정화했다. 인간 FcRn/FCGRT & B2M 이종이량체 단백질은 아민 커플링을 통해 CM5 칩 표면에 ~1 μg/mL 농도로 포획되었고, 이때 단백질의 희석은 HBS-EP+ 완충제 (GE healthcare)를 포함하는 런닝 완충제를 통해 이루어졌다 후속적으로, 항-CLEC2D 항체 C5511은 pH 5.9와 pH 7.4 모두에서 0.0315~0.5μM 범위의 농도로 통과되었다. 항체 희석액은 HBS-EP+ 완충제 (GE healthcare)에서 만들었다. 반응 곡선에서 알 수 있는 바와 같이, pH 7.4 (도 21H)에서는 결합이 관찰되지 않은 반면, pH 5.9 (도 21I)에서는 반응이 모니터링되었다. 수득된 반응 곡선을 각각 기준 유동 세포 신호 및 블랭크로부터 적절하게 차감하고, 1:1:1 Langmuir 결합에 피팅하면 추정 KD는 1.88X 106 M-1이었다. 중성 pH에서 결합이 없으면, 항-CLEC2D 항체가 혈류로 다시 방출될 가능성을 증가시킬 수 있다고 결론지을 수 있다.
실시예 9: 진단 도구/여러 질병 적응증에 대한 예후 마커로서의 항-CLEC2D 모노클로날 항체
모든 상위 결합 항-CLEC2D 항체를 스크리닝하여, 진단 항체로서 상부 결합자를 선별하였다. 4개의 높은-결합 항-CLEC2D 항체 중 하나는 PC3 종양 세포주에 대한 항원 결합 분석을 통해 선별되었다.
CLEC2D 항원을 발현하는 종양 세포를 트립신 처리에 의해 수거하였다. Vi-cell XR 자동 세포 계수기로 세포 수를 측정했다. 세포를 4-5분 동안 1400-1500 rpm에서 원심분리하였다. 펠렛을 1ml DPBS에 재현탁시켰다. 50,000개의 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 분취했습니다. 1μg의 C2779, C2438, C0949, C2543을 각 웰에 첨가하고, 실온 (25℃)에서 30-60분 동안 항온처리했다. 플레이트를 4-5분 동안 1400-1500 rpm에서 원심분리하고, 상청액을 흡출시키고, 세포를 DPBS내 0.1% BSA로 세척하였다. 2.5 ml의 2% BSA를 DPBS로 50ml로 희석하였다. 염소 항-인간 IgG FITC 콘쥬게이트를 2차 항체로 이용하였다. 이차 항체의 1:100 희석액을 DPBS에 준비하였고, 100μl를 각 웰에 첨가하였다. 이차 항체, 염소 항-인간 IgG FITC 콘쥬게이트는 모든 관련 실험에서 1:100의 희석에서 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 30 분 동안 실온 (25℃), 암 상태에서 항온처리했다. 세포를 0.1% BSA로 세척하고, 100μl의 1% BSA에 재현탁시켰다. 샘플을 유동-세포 분석으로 분석했다.
C0949는 다른 항-CLEC2D 클론(도 22A)과 비교할 때, PC3에서 표면 발현된 CLEC2D에 대해 관찰된 결합의 최대 백분율로 인해 진단 항체 시약으로 선별되었으며, 다양한 종양 세포주에서 CLEC2D 항원을 검출하기 위한 추가 목적이 있다.
전립선암 세포주 중에서 22RV는 이차 항체 대조군에 비교하여, 5배 증가된 가장 높은 항원 발현을 보였다 (도 22B). 더욱이, 진단 항-CLEC2D 항체 (C0949에 국한되지 않는)를 도 22C에 나타낸 여러 질병 징후의 다중 종양 세포주에 대한 항원 결합 분석에 사용하였다.
다양한 항-CLEC2D 항체 클론을 사용하여, 전립선암 세포주를 포함한 여러 암세포주에서 관찰되는 효율적이고 민감한 결합은 진단/예후 시약으로서 상기 분자의 후보성을 강력하게 뒷받침한다.
항-CLEC2D 단일클론성 항체의 임상적 전망
질환 관련성: 전립선 암
TCGA 분석
암 게놈 아틀라스(TCGA) 데이터는 전립선암 환자에서 CLEC2D의 발현 수준과 함께 질병 진행에 관여하는 유전자에 대한 현재 이해를 향상시키기 위해 전이성 전립선암을 분석하였다.
PRAD 프로젝트는 TCGA의 전립선암 프로젝트로 500건의 암 사례에 대한 데이터를 담고 있다. 분석된 관련 데이터 소스는 HTSeq 카운트 데이터, miRNA 발현 정량화 및 아이소형 발현 정량화를 포함하는 유전자 발현 정량화로 제한되었다. 표 50은 관심 있는 데이터 범주에서 다운로드할 수 있는 데이터에서 위에 지정된 파일의 발생에 대한 사례별 분석을 보여준다.
Figure pct00135
TCGA 데이터 -전사체 프로파일링
전사체 프로파일링 데이터 데이터 범주에는 유전자, miRNA 및 동형 발현 수가 함유된다. TCGA에 기탁된 500건 중 498건은 원발성 종양 조직과 관련된 데이터를 가지고 있고, 52건은 정상 조직과 관련된 발현 데이터를 갖고 있다. 파일은 Ensembl ID와 각 사례 내 이의 카운트로 표시되는 60483개의 유전자 및 변이체 목록이다.
TCGA 데이터 -전이 사례 확인
500개의 TCGA PRAD 프로젝트 사례를 분석하여, 전이성 전립선암 사례로 식별될 수 있는 특성을 나타내는 사례를 확인했다. 총 289건의 사례가 전이성으로 확인되었으며, 이 확인은 다른 매개변수 Gleason 점수 및 처방된 약물을 나열하는 다른 TCGA 문서의 주요 매개변수를 기반으로 이루어졌다. 289개 중 오직 18개만이 관련 정상 조직 데이터를 가지고 있었는데, 이 분석은 질병 전후에 대한 발현 수준의 변화에 관한 것이므로 다른 유전자에 대해서도 기준 값인 정상 데이터를 설정할 필요가 있었다. 이는 52개의 모든 정상 조직 데이터를 살펴보고, 각 유전자에 대한 각 사례의 52개 값을 모두 고려하고, 영외값을 제거하고, 유전자에 대한 '정상 기선' 값을 계산하여 기준선 파일을 만드는 데 사용되었다. 정상 조직 수가 부족한 경우, 기선 파일을 비교 분석에 사용했다.
TCGA 데이터 -전이 사례 하위-집단화
전이성 사례 식별의 기초가 된 동일한 주요 매개변수는 데이터를 암의 단계 및 현재 치료 요법과 같은 다른 하위 그룹으로 분리하는 데에도 사용되었다 -이 데이터는 하위 그룹 간의 CLEC2D 발현 수준 분석에 사용되었다.
후속적으로, CLEC2D 유전자의 발현을 모니터링하여 프로젝트의 모든 관련 FPKM 파일을 다운로드하고, CLEC2D 발현에 대해 구체적으로 문의했다. FPKM 파일은 종양 발현 파일과 경우에 따라 정상 조직 발현 파일로 구성되었다. 두 세트 모두 정상 및 조직 사례 중 각 암에 대한 CLEC2DCLEC2D 발현 범위 계산에 별도로 사용되었다. 또한, 발현 값의 정규 분포를 가정하고, 그 평균에서 2 표준 편차 이상의 값을 삭제함으로써, 이 데이터에서 영외값을 생략했다.
암에서 CLEC2D의 역할을 더 잘 이해하기 위해, 정상 조직 샘플과 종양 조직 샘플에서 유전자의 상대적인 발현 수준을 분석했다. 이는 특정 암/상태에 대한 모든 사례 데이터를 수집하고, 값 세트를 분석하기 전, 각 파일에서 CLEC2D 발현 값을 검색하여 수행되었다. 각 하위 집합에 대해, CLEC2D 발현 프로필의 '스프레드'은 최소값, 최대값 및 사분위수 값을 보고 그렸다. 도 23A에서 알 수 있는 바와 같이, CLEC2D는 그중에서도 특히 전이, 종양 병기 및 치료와 같은 상이한 서브세트 상태에서 관찰되는 발현 수준의 관점에서 현저한 존재를 따르는 것으로 보인다.
유도에 의해 구동된 발현 증가
상이한 종양 세포주의 표면 상에 CLEC2D의 발현 수준을 결정하기 위해, CLEC2D 형질감염된 HDCHO, C4548의 표면 상에서 CLEC2D의 표면 발현을 우선 관찰하고, 상업적으로 이용가능한 항-CLEC2D (4C7) 항체를 이용하여 형질감염된 세포 상에 이의 분포를 관찰하였다. CLEC2D의 해독이 다양한 종류의 유도에 따라 크게 조절될 수 있다고 가정하고, 다수의 유도자들, 이를 테면, 작동체 세포들 (온전체 PBMC 또는 PBMC의 상청액) 또는 전립선 종양 세포주 (PC3)에서 NK 세포의 활성자(가령, LPS)로 다양한 전립선 암 세포 유형을 유도하여, CLEC2D의 발현 수준에 있어서 영향을 모니터하였다. 다양한 유도자로 처리했을 때, 처리되지 않은 표적 세포와 비교하여 증가된 CLEC2D 발현 수준이 관찰되었다.
유도 없는 상태에서 전립선 종양 세포주중에서, 거세-저항성 전립선 암 (CRPC) 세포주, 가령 PC3 및 DU145는 비-CRPC 세포주 가령 LNCap 및 22RV1과 비교하여, 높은 CLEC2D 표면 발현을 가지고, 이때 CLEC2D는 C2685 클론으로 구체화되었지만, 이에 국한되지 않은 신규한 항-CLEC2D 항체를 이용하여 프로브되었다 (도 23B). 유도되지 않은 조건에서 얻은 관찰을 확장하여, 치료용 항-CLEC2D 항체, C2685(이에 국한되지 않음)를 사용하여 유도자의 존재 또는 부재 하에 발현 수준의 변화를 이해하였다. 그 다음, 다양한 처리 시 모든 전립선 종양 세포주 상에 CLEC2D의 발현 수준의 변화를 보기 위해, 전립선 종양 세포들을 작동체 세포들 (온전체 PBMC 또는 PBMC의 상청액 또는 단리된 NK 세포들 또는 단리된 T 세포들) 또는 NK 세포들의 활성화제/유도자 (LPS 또는 Poly I:C 또는 IFN 감마)와 함께 항온처리하였고, 그리고 C2685 항-CLEC2D 항체를 이용하여 CLEC2D의 발현 수준을 검사하였다. 처리 할 경우, 처리안된 표적 세포들와 비교하여, CLEC2D의 발현 수준의 증가가 관찰되었다 (도 23C). 전립선 종양 세포주중에서, 거세-저항성 전립선 암 (CRPC) 세포주 가령, PC3 및 비-CRPC 세포주 가령, LNCap는 전술한 유도자로 처리된 DU145 및 22RV1과 비교하였을 때, 처리할 경우 CLEC2D 표면 발현이 더 강화됨을 보여주었다(도 23C).
이들 모두를 고려하고, 전립선 암의 특이적 촛점을 보면, 세포주 이를 테면, 거세-저항성 전립선 암 (CRPC) 세포주 (이를 테면, PC3 및 DU145), 그리고 비-CRPC 세포주 (이를 테면, LNCap 및 22RV1)는 종양 세포 표면 상에 CLEC2D 항원의 상당한 수준의 발현을 나타내고, 이 발현 수준은 다수의 TLR 처리를 비롯한 다양한 처리에 의해 더 증가되었다. 세포주의 선택은 전략적이었는데, 그 이유는 사용된 모든 전립선암 세포주는 전립선암 질환의 특정 단계 또는 상태를 나타내고, CLEC2D 발현 수준과 관련될 수 있기 때문이다. 본 명세서에서 설명되고 도시된 바와 같이, 전립선 암 세포주, LNCaP, DU145, 22RV1 및 PC3는 낮은, 중등도 및 높은 전이 가능성을 가지며, 이때 세포 표면 CLEC2D의 높은 발현을 갖는 PC3은 식별된 항-CLEC2D 항체를 이용하여 CLEC2D-CD161 축을 통해 억제 신호를 차단시킬 때 NK 세포에 의해 효과적으로 사멸될 수 있고, 그로 인하여 CLEC2D는 전립선 암에 대한 임상적으로 관련된 표적임이 확립된다.
실시예 10: 암 조직에서 CLEC2D 항원 발현
CLEC2D는 다-기능 단백질로 기술되었으며, 수용체인 CD161과의 상호작용의 기능적 결과를 완전히 설명하려면 CLEC2D 분포의 포괄적인 특성화가 필요하다. CLEC2D는 다양한 종양 세포주에서 활성화되고, 인간의 다양한 면역 세포에 존재하는 것으로 관찰되었다. CLEC2D는 여러 건강한 인간 조직에서 검출될 수 있으며, 면역-특권이 있는 부위에서 현저하게 만연할 수 있다. 이 정보는 림프구와 면역 관용 사이의 누화에서 CLEC2D의 역할을 강조하고 가정하는 데 사용된다.
조직 마이크로어레이 (TMA)는 면역조직화학 및 형광 제-자리 혼성화(FISH)를 비롯한 조직학-기반 실험실 테스트의 평가를 위한 고-처리량 기술을 나타낸다. 면역 형광 착색의 경우, 항-CLEC2D 단일클론 항체가 일차 항체로 사용되며, 직접 라벨링 또는 라벨링된 2차 Ab가 있는 간접 라벨링이 검출에 사용된다. 따라서, CLEC2D의 역할은 다양한 암과 다양한 암 단계의 맥락에서 결정된다.
또한, 3D 세포 배양 방법론은 CLEC2D 항원과 종양 세포에서 발현하는 상호작용 파트너(CD161 포함) 간, 그리고 면역 세포 유형 이를 테면, B 세포, T 세포, 단핵구 및 NK 세포 간의 누화를 결정하기 위해, 조직 발현된 CLEC2D 항원과 인간 면역 시스템의 상호 작용을 이해하는 데 사용된다.
첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명은 정확한 실시예로 한정되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해, 첨부된 청구범위에 특정된 바와 같이, 본 명세서의 범위 또는 사상을 범위를 벗어나지 않고, 다양한 변경 및 수정이 가능함을 이해하여야 한다.
인간 조직 마이크로어레이, US Biomax (카탈로그 번호 TP242d), 암의 상위 4 유형 (결장암, 유방암, 폐암 및 전립선암), TNM 및 병리 등급을 포함하는 정상 조직을 이용한 조직 어레이, 24가지 사례/24가지 핵심을 이용하여 항-CLEC2D 항체 클론 C0694 및 C2685의 반응성을 분석하였다. 전립선 암 샘플은 다음과 같다.
표 51
Figure pct00136
IHC 염색은 1:10 희석에서 1:30 희석까지 다양한 농도의 항체에서 CC1 및 CC2 프로토콜을 모두 따랐다. 이 데이터는 C2685가 강한 반응성과 부정적인 영역의 간섭이 적은 것으로 나타났음을 시사한다. 결과는 도 23D에 도시된다.
TCGA 데이터 -모든 암 CLEC2D 발현
모든 TCGA 암 프로젝트를 연구하여 팬-암(pan-cancer)석을 수행했다. 프로젝트의 모든 관련 FPKM 파일을 다운로드하고, CLEC2D 발현에 대해 구체적으로 문의했다. FPKM 파일은 종양 발현 파일과 경우에 따라 정상 조직 발현 파일로 구성되었다. 두 세트 모두 정상 및 조직 사례 중 각 암에 대한 CLEC2D 발현 범위 계산에 별도로 사용되었다. 또한, 발현 값의 정규 분포를 가정하고, 그 평균에서 2 표준 편차 이상의 값을 삭제함으로써, 이 데이터에서 영외값을 생략했다.
Figure pct00137
Figure pct00138
각 하위 집합에 대해, CLEC2D 발현 프로필의 '스프레드'은 최소값, 최대값 및 사분위수 값을 보고 그렸다. 도 24A에서 알 수 있는 바와 같이, CLEC2D는 무엇보다도 상기 표에 열거된 바와 같이, 상이한 암 상태에서 관찰되는 발현 수준의 면에서 현저한 존재를 따르는 것으로 보인다.
결합 연구: 유동 세포측정 및 이미징
전립선암 세포주에서 관찰된 바와 같이, 특히 C2685, C5511에 의해 예시된 바와 같이 확인된 항-CLEC2D 항체 클론을 사용한 관찰을 다른 종양 세포주로 확장시켰다. 결합은 또한 유동 세포측정 분석 및 공초점 현미경 모두를 통해 모니터링되었으며, 여기서 각각의 실험 조건은 위의 설명과 유사하다.
항-CLEC2D 항체 C5511을 사용하여, 유동 세포측정 분석 관찰을 하기 표 53에 요약하였다.
표 53. 이중특이적 항체
Figure pct00139
이해할 수 있는 바와 같이, 다양한 암 세포주에서 CLEC2D의 발현 수준은 낮거나 또는 중간 내지 높은 것으로 밝혀졌다.
유사하게, 새로운 항체에 대한 질병 관련성을 결정하기 위해, 우리는 간암, 신경교종, 난소 선암암, 폐암, 골수종, 림프종 및 유방암과 같은 다양한 종양 세포주의 표면에서 공촛점 현미경을 통하여 CLEC2D의 발현 수준을 확인했다. 항-CLEC2D 항체 클론 C2685를 사용하여 테스트한 암 세포주에서 관찰된 다양한 CLEC2D 발현 수준이 있었다(도 24B). CLEC2D의 우세한 발현은 간세포 암종 (HepG2), 유방암 (BT474), 및 신경교종 (LN229)에서 관찰된 반면, 난소 선암종 (SkoV3), 골수종 (NCI-H929) 및 림프종 (Ramos)에서는 발현이 매우 낮거나 관찰되지 않았다 (도 24B).
이들 세포주에서 CLEC2D의 해독에 있어서 조절을 점검하기 위해, 다양한 유도자들 이를 테면, 작동체 세포들 (온전체 PBMC 또는 PBMC의 스프) 또는 NK 세포들의 활성자 (가령, LPS), IFN-γ, poly I:C를 이용하여 모든 종양 세포주(HepG2, BT474, LN229, SkoV3, NCI-H929 및 Ramos)를 전립선 종양 세포주와 유사하게 유도하였으며, CLEC2D의 발현 수준을 모니터하였다. 처리할 경우, 처리안된 표적 세포들와 비교하여, CLEC2D의 발현 수준의 증가가 관찰되었다(도 24C). 흥미로운 것은, SkoV3, NCI-H929 및 Ramos 세포들은 처리할 경우 CLEC2D 발현이 증가됨을 관찰하였지만, 한편 처리안된 세포들은 발현이 없거나/적었다 (도 24C). 이러한 발견은 CLEC2D가 이들 세포에 대한 특정 TLR 자극에 따라 유도되고, 항-CLEC2D 항체를 사용하여 표적화될 수 있는 이러한 암 상태에 대한 잠재적 표적이 될 수 있음을 나타낸다.
세포독성
SKOV3 (난소 암 세포주), HepG2 (간세포 암종) 세포들에 의해 구체화된 바와 같이, 종양 세포주는 제조업체의 프로토콜에 따라 Efluor로 라벨되었고, 24-웰 플레이트의 20% DMEM에서 0.04x106 밀도로 씨딩되었다. 24 시간, 새로 단리된 PBMCs는 T:E 1:5로 추가되었다. 신규한 단일클론성 항-CLEC2D 항체들 C5511은 0.5ml의 분석 반응에서 200μg/ml로 추가되었고, 14 시간 동안 항온처리되었다. 24-웰 플레이트에서 상청액을 수집하고, 부착 세포를 트립신 처리하고, 1.5ml 튜브에 수집했다. 반응 혼합물을 시톡스 그린 (15nM)과 함께 20분 동안 항온처리하고, 유동 세포 분석기에서 형광을 검출했다. 특이적 세포 사멸 퍼센트는 테스트 샘플에서 대조군의 세포 사멸 퍼센트을 차감시켜 결정하였고, 난소 (SKOv3) 및 간 (HepG2) 암 세포주에서 유의적인 세포독성을 보여주었고 (도 24D), 이는 다수의 질환에 대항하여 항-CLEC2D 항체의 항종양 활성을 나타낸다.
이해할 수 있는 바와 같이, 유방암(BT474), 림프종(ramos), 간암(HepG2), 전립선암(PC3, DU145, LNCAP 및 22RV1), 신경교종 (LN229) 난소 선암종 (SkoV3), 골수종 (NCI-H929)과 같은 질병과 관련된 여러 세포주에서 CLEC2D 표면 발현 모니터링에 사용된 단리된 항-CLEC2D 항체는 이 분야에서는 이분야에서 혁신적이다. 더욱이, 상기 항-CLEC2D 항체에 의해 유발되는 세포독성은 이들 항-CLEC2D 항체가 잠재적으로 각각의 질병에 대한 치료 수단으로서 사용될 수 있다는 사실을 반영한다. 종합하면, 이것은 또한 CLEC2D 항원 발현이 다수의 암 세포주와 연결되어 있고, 본 명세서에서 추측되는 바와 같이 암 생물학에서 중요한 역할을 할 수 있음을 의미한다.
항-CLEC2D 단일클론성 항체를 이용하여 실행된 위험 완화 연구
단백질 기반 바이오치료제에 대한 면역원성은 의약품 및 환자의 품질과 같은 중요한 특성을 포함하여 제품에 특정한 수많은 요인이 포함되는 복잡한 과정이다. 이러한 중요한 품질 속성에는 다음이 내포될 수 있다: 1차 서열의 변형, 숙주-세포 특이적 해독-후 변형, 숙주 세포 단백질의 존재, 제형 변경, 응집, 화학적 변형(산화, 탈아미드화 또는 당화), 단백질 구조의 변화. 항체 의약품의 몇 가지 중요한 품질 속성은 특정 유형의 속성에 대한 정확한 기여는 알려져 있지 않지만, 서열 기반 면역원성 위험을 향상시켜 환자 안전에 영향을 미치는 것으로 제안되었다. T-세포 의존적 의존적 반응은 임상에서 생물학적 제제에 대한 장기적인 친화력 성숙 면역 반응의 주요 동인이다. 여기에는 다음을 이용한 분석 시스템이 내포된다: 전혈, 말초 혈액 단핵 세포들 (PBMC), CD8+-고갈된 PBMC, 불사화된 세포주, 수지상 세포들/단핵구/자가 CD4+ T세포와 함께 배양된 대식세포, 및 인공 림프절 시스템, 및 그외 몇 가지. 다양한 생물학적 결과는 시험관 내 분석에서 사이토킨 분비, 활성화의 세포 표면 마커의 발현, HLA-DR 결합 펩티드의 식별, 신호 전달 이벤트, 항원 제시 세포(APC) 및 증식에 의한 식균 작용 등이 내포된 면역 세포 활성화의 여러 단계에서 측정할 수 있다. 생물의약품 개발에 지정된 분석법의 적용은 초기 개발 단계의 후보 선택에서 면역원성 위험에 영향을 미칠 수 있는 특정 속성의 후기 단계 평가에 이르기까지 다양하다. 본 명세서는 면역원성 또는 관련 속성에 대한 항-CLEC2D 항체 관련 위험을 평가하려는 시도에 대해 상세히 설명한다.
림프구 증식 연구
림프구의 증식은 항체의 습식 코팅, 항체의 공기-건조 코팅 및 고밀도 PBMC 사전-배양 후 테스트 항체의 유도와 같은 3가지 독립적인 실험 프로토콜에 의해 테스트되는데, 다음과 같이 자세히 설명된다:
항체들의 습식 코팅
C5511에 국한되지 않는 테스트 항체들의 다양한 농도1μg/ml ~ 100 μg/ml 및 1μg/ml의 양성 대조군: 항-CD3 항체, 항-OKT3 항체를 96-웰 평평한 바닥 플레이트의 웰에 첨가하고, 37℃ 인큐베이터에서 2-3시간 동안 항온처리하였다. 그 후, 웰을 200μl의 DPBS로 3회 세척하였다. PBMCs는 제조업체의 프로토콜에 따라, Efluor 670 생존가능산 세포 염료로 라벨되었다. 30000개의 PBMC 세포를 총 200μl 성장 배지(10% FBS가 있는 RPMI-1640)의 각 웰에 씨딩했다. 0일차에 샘플을 수집하고, 유동 세포측정 분석에 의해 분석했다. 세포는 5 % CO2 인큐베이터에서 4 일 동안 37℃에서 항온처리되었다. 4일차에 샘플을 수집하고, 항-CD4 항체-FITC 콘쥬게이트로 염색하고 유동 세포측정 분석으로 분석했다.
항체들의 대기 건조 코팅
테스트 항체들의 다양한 농도 1μg/ml ~ 100 μg/ml 및 1μg/ml의 양성 대조군: 항-CD3 항체, 항-OKT3 항체를 96-웰 평평한 바닥 플레이트의 웰에 첨가하고, 생물 안전 캐비닛에서 공기 건조시켰다. 최적의 공기 건조를 위해, 항체의 부피는 50μl 미만으로 제한시켰다. PBMCs는 제조업체의 프로토콜에 따라, Efluor 670 생존가능산 세포 염료로 라벨되었다. 웰이 건조되면, 30000개의 PBMC 세포를 총 200μl 성장 배지(10% FBS가 있는 RPMI-1640)의 각 웰에 씨딩했다. 0일차에 샘플을 수집하고, 유동 세포측정 분석에 의해 분석했다. 세포는 5 % CO2 인큐베이터에서 4 일 동안 37℃에서 항온처리되었다. 4일차에 샘플을 수집하고, 항-CD4 항체-FITC 콘쥬게이트로 염색하고 유동 세포측정 분석으로 분석했다.
TCR 프라이밍을 위한 PBMC의 고밀도 사전-배양 후, 용액 내 항체 유도
PBMC 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃, 성장 배지에서 48시간 동안 1X10^6 세포/ml 및 10X10^6 세포/ml 밀도로 사전-배양하였다. 48 시간 후, PBMCs는 제조업체의 프로토콜에 따라, Efluor 670 생존가능산 세포 염료로 라벨되었다. 1X10^6 PBMC 세포들/ml를 총 200μl 성장 배지(10% FBS가 있는 RPMI-1640)의 각 웰에 씨딩했다. 다양한 농도 1μg/ml ~ 100 μg/ml의 테스트 항체들 및 1μg/ml의 양성 대조군: 항-CD3 항체, 항-OKT3 항체를 PBMCs를 함유하는 웰에 추가하였다. 0일차에 샘플을 수집하고, 유동 세포측정 분석에 의해 분석했다. 세포는 5 % CO2 인큐베이터에서 4 일 동안 37℃에서 항온처리되었다. 4일차에 샘플을 수집하고, 항-CD4 항체-FITC 콘쥬게이트로 염색하고 유동 세포측정 분석으로 분석했다.
유동-세포측정 분석을 위한 샘플 처리
PBMC 샘플을 200rpm에서 5분 동안 원심분리했다. 상청액을 버리고, 세포를 항-CD4 항체-FITC 콘쥬게이트(최종 반응에서 1:100 희석)와 함께 0.5% BSA가 포함된 100μl의 DPBS에 재현탁시켰다. 세포는 30분 동안 암상태로 항온처리되었다. 그 후, 세포를 200rpm에서 5분간 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 0.5% BSA가 포함된 DPBS 100μl에 재-현탁했다.
항-CLEC2D 항체 처리가 양성대조군으로 이용된 도 25A, 25B 및 25C에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 항-OKT3 항체로 처리된 PBMC는 Efluor 생존 염료를 다중 후손 집단으로 분할함으로써 관찰된 바와 같이, 림프구 증식을 나타냈다(막대그림에서 화살표로 표시됨). 배양 4일 후, 단일 집단의 출현은 처리되지 않은 PBMC 대조군 및 1μg/ml 내지 100μg/ml 항-CLEC2D 항체 처리된 테스트 샘플에서 관찰되었으며, 이는 항-CLEC2D 항체가 림프구 증식을 유도하지 않았음을 보여준다. 이러한 관찰은 항체의 습식 코팅(도 25A), 항체의 공기 건조 코팅(도 25B) 및 고밀도 PBMC 사전-배양(도 25C)에 이은 시험 항체로 유도하는3개의 독립적인 테스트 프로토콜과 일치하였다. 여러 건강한 공여자의 PBMC를 테스트했으며, 얻은 결과는 일관되었다.
분비된 사이토킨: IFN-γ 및 IL2의 측정
현재 부분의 앞부분에서 설명한 것처럼 림프구 증식 분석을 이해하는 것과 별개로, 항-CLEC2D 항체가 IFN-γ, IL2와 같은 사이토킨을 유도하는지 여부를 확인하는 것이 필수적이다. 분비된 사이토킨 이를 테면, IFN-γ, IL2 (이에 국한되지 않음)의 측정은 ELISA 기반으로 한 탐지 방법을 통하여 수행되며, 이때 상술한 바와 같은 다양한 실험 설정/조건, 예를 들어 고밀도, 습식 코팅으로부터 수집된 상청액을 후속 정량을 위해 24시간 간격으로 사용하였다. 모든 실험에서 사용된 각 항체의 농도는 항 OKT3 항체(1ug/ml) 및 100ug/ml의 C5511 C6481 C4608과 같은 항-CLEC2D 항체 클론이다. 후속적으로, 항-OKT3 항체 처리 샘플에서 얻은 상등액을 1:4 비율로 희석하고, 이때 50 ul의 상청액은 150ul의 10%RPMI 1640을 추가하여 희석시킨 반면, 항-CLEC2D 항체 처리된 샘플은 임의의 상청액의 추가 없이 그대로 사용하였다. 동시에, 습식 코팅법으로 사이토킨 IL2를 측정하기 위한 샘플을 준비하였다. 여기에서 항-OKT3 항체 처리 샘플은 1:10 비율로 희석하고 25 ul는 225 ul의 10% RPMI 1640을 첨가하여 희석하였으며, 항-CLEC2D 항체 처리 샘플에서 채취한 상청액을 바로 사용하였다. IFN-γ 또는 IL2에 대한 각 실험에서 대조군으로는 처리안된 PBMC로부터 획득된 상청액이 이용되었다.
도 25D에서 볼 수 있는 바와 같이, 이때 항-OKT3 항체로 처리된 PBMC는 상청액에 1155 pg/mL 농도에서 IFN 감마 분비 수준이 최고였고, 테스트된 항-CLEC2D 항체들은 임의의 항-CLEC2D 항체 클론과 관련하여 30 pg/mL 미만으로 IFN 감마 생산을 증가시키지 못하였다 (도 25D). 유사하게, IL2 측정의 경우 항-OKT3 항체 유도된 분비 상승은 121.50 pg/mL인 반면, 항-CLEC2D 항체는 4.7 pg/mL 이상 IL2 분비를 일으키지 않았다 (도 25E). 종합하면, 확인된 치료용 항-CLEC2D 항체는 항-CLEC2D 항체로 치료할 때 관찰되는 T 림프구 딸 집단의 결핍 및 IFN-γ 및 IL2 모두에서 관찰된 바와 같이, 극히 낮은 양의 사이토카인 분비로 판단되는 바와 같이, 면역원성 반응에 대한 가능성이 낮다.
렛/비-인간 영장류에서 항-CLEC2D 단일클론성 항체로 실행된 안정성 연구
치료적 단일클론항체를 이용한 독성 연구는 약리학적으로 적절한 종에서 수행되어야 하는데, 이는 단일클론 항체가 인식하는 표적 항원을 발현하고 항체 결합 후 인간에서 예상되는 것과 유사한 유사한 약리학적 반응을 유발하는 것을 의미한다. 특히 IgG1과 같이 상대적으로 강력한 작동체 기능을 가진 항체의 경우, 인간으로 확장될 수 있는 동물에서 단일클론 항체의 유사한 작동체 기능을 입증해야 한다. 그런 이유로, 인간의 안전을 예측할 수 있는 가장 민감한 동물 모델을 활용한다. 그러나, 교차 반응성, 또는 교차 반응성의 부족은 인간 항원 단백질 또는 표적 에피토프와 독성 연구에 사용되는 통상적인 종의 동등한 단백질 사이의 구조적 이해 및 서열에 대한 상세한 가상환경에서의(in silico) 분석을 통해 예측할 수 있다. 가능한 경우, 두 가지 관련 종 (설치류 및 비-설치류)에서 독성 평가를 수행하는 것을 권하며, 설치류 한 마리와 설치류가 아닌 한 마리가 있으며, 사이노몰구스 원숭이와 같은 비-인간 영장류(NHP)는 영장류 사용을 최소화하는 전략과 사용을 윤리적으로 정당화하는 데 가장 적합한 종으로 알려져 있다.
인간, 렛, 마우스 및 사이노몰구스 원숭이의 CLEC2D 항원 상동체의 비교 서열 분석에 대한가상환경에서 이해는 인간 CLEC2D 항원은 사이노몰구스 원숭이 CLEC2D 동족체와 가장 높은(>90%) 서열 상동성을 공유하지만, 한편 렛과 마우스 동족체에 대한 서열 상동성은 ~70% 미만임을 나타낸다. 그러나, 항체 파라토프 서열과 접촉하는 중요한 잔기의 존재를 확인하기 위해 서열을 상세히 조사하였다. 전술한 조사에서 모든 종들이 항-CLEC2D 항체와 상호작용에 이용할 가능성이 있는 보존된 상호작용 아미노산 잔기 및 접촉 점의 적어도 70%를 함유하는 것으로 나타났다. 따라서, 항-CLEC2D 단일클론성 항체의 결합을 이해하기 위한 노력은 렛, 마우스 및 사이노몰구스 원숭이 종으로부터 표면 발현된 CLEC2D 항원 동족체를 생성함으로써 시도되었다. 유동 세포측정 기반으로 한 방법은 항체와 CLEC2D 항원 동족체들 간의 결합 평가에 이용되었다.
서열 식별 번호: 886, 910, 911, 918로 연계될 수 있는 바와 같이, 각 종으로부터 전장의 CLEC2D 동족체 서열을 함성하고, pCDNA3.1, 포유류 발현 벡터에 클론되었으며, 이는 유동 세포측정을 통한 결합 연구를 위해 CHO 세포에 형질감염되었다.
상동성 연구를 위한 CLEC2D 항원 변이체 구조체를 이용한 형질감염
90% 이상 생존율의 CHO 현탁 세포를 CLEC2D 항원 변이체의 발현에 사용하였다. 형질감염 100ml 부피의 경우 1.25 X10^8 세포를 취하였다. 세포를 4-5분 동안 1000-1400rpm에서 원심분리하고, 사용한 배지를 따라내고, 25ml의 OptiMEM I 배지에 재-현탁시켰다. PlusTM 시약과 함께 리포펙타민 LTX를 사용하여 DNA 구조체를 형질감염시켰다. 50-100 μg의 각 pCDNA 3.1, 구조체를 1:3 ~ 1:6 DNA 대비 형질감염 시약 비율로 사용하였고, 50-100 μl PlusTM 시약을 이용하였다. DNA 및 리포펙타민 LTX 복합체를 25ml OptiMEM I에서 제조하고, 복합체 형성을 위해 20-25℃에서 5분 동안 항온처리했다. 형질감염 혼합물을 세포 현탁액에 천천히 첨가하였다. 세포를 100-120 RPM에서 5% CO2 진탕기 인큐베이터에서 37℃에서 4-6시간 동안 항온처리하였다. 50ml의 Power CHO2 CD 성장 배지를 세포에 첨가했다. 세포를 100-120 RPM에서 5% CO2 진탕기 인큐베이터에서 37℃에서 항온처리하였다. 형질감염 2-3일 후, 200 ml Power CHO2 CD 성장 배지를 첨가하고, 200 mM 스톡으로부터 Glutamax를 첨가하여 2 mM의 최종 농도를 달성하였다. 세포를 100-120 RPM에서 5% CO2 진탕기 인큐베이터에서 37℃에서 항온처리하였다. 형질감염 후 3일~6일차에 유동 세포측정 분석을 통해 세포의 표면 항원 결합을 분석했다.
도 26에서 알 수 있는 바와 같이, 항-CLEC2D 항체 클론 C5511, C4608(이에 한정되지 않음)은 인간 CLEC2D 항원에 대해 발달하였고, MFI의 2-4배 범위의 유사한 결합을 나타내었다. 이것은 설치류 및 비-인간 영장류 종 모두에서 CLEC2D 동족체에 대한 항-CLEC2D 항체의 광범위한 특이성을 나타낸다.
표 54. 항-CLEC2D 항체에 의해 인지되는 아미노산 서열
Figure pct00140

Claims (99)

  1. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 있어서, 이때 상기 중쇄 다음으로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함한다:
    a. 서열 식별 번호: 46, 서열 식별 번호: 65, 서열 식별 번호: 59, 및 서열 식별 번호: 99로부터 선별된 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    b. 서열 식별 번호: 57, 서열 식별 번호: 91, 서열 식별 번호: 98, 서열 식별 번호: 84, 서열 식별 번호: 58, 서열 식별 번호: 88, 서열 식별 번호: 96, 서열 식별 번호: 47, 서열 식별 번호: 17, 및 서열 식별 번호: 8로부터 선별된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    c. 서열 식별 번호: 93, 서열 식별 번호: 53, 서열 식별 번호: 95, 서열 식별 번호: 23, 서열 식별 번호: 103, 및 서열 식별 번호: 7로부터 선별된 서열에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    d. 서열 식별 번호: 45, 서열 식별 번호: 15, 서열 식별 번호: 51, 서열 식별 번호: 44, 서열 식별 번호: 73, 서열 식별 번호: 36, 서열 식별 번호: 77, 서열 식별 번호: 50, 및 서열 식별 번호: 6으로부터 선별된 서열에 대해 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    e. 서열 식별 번호: 97, 서열 식별 번호: 16, 서열 식별 번호: 76, 서열 식별 번호: 9, 서열 식별 번호: 89, 서열 식별 번호: 107, 서열 식별 번호: 68, 서열 식별 번호: 29, 서열 식별 번호: 67, 서열 식별 번호: 74, 서열 식별 번호: 32, 서열 식별 번호: 81, 서열 식별 번호: 106, 서열 식별 번호: 31, 서열 식별 번호: 62, 서열 식별 번호: 48, 서열 식별 번호: 75, 서열 식별 번호: 12, 서열 식별 번호: 102, 서열 식별 번호: 54, 서열 식별 번호: 80, 서열 식별 번호: 26, 서열 식별 번호: 30, 서열 식별 번호: 92, 서열 식별 번호: 108, 및 서열 식별 번호: 79로부터 선별된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 서열;
    f. 서열 식별 번호: 105, 서열 식별 번호: 101, 서열 식별 번호: 4, 서열 식별 번호: 72, 서열 식별 번호: 28, 서열 식별 번호: 64, 서열 식별 번호: 25, 서열 식별 번호: 60, 서열 식별 번호: 55, 서열 식별 번호: 52, 서열 식별 번호: 27, 서열 식별 번호: 43, 서열 식별 번호: 70, 서열 식별 번호: 71, 서열 식별 번호: 14, 서열 식별 번호: 85, 서열 식별 번호: 13, 서열 식별 번호: 61, 서열 식별 번호: 42, 서열 식별 번호: 39, 서열 식별 번호: 10, 서열 식별 번호: 49, 서열 식별 번호: 24, 서열 식별 번호: 40, 서열 식별 번호: 63, 서열 식별 번호: 78, 서열 식별 번호: 2, 서열 식별 번호: 94, 및 서열 식별 번호: 5로부터 선별된 서열에 대해 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 서열;
    g. 서열 식별 번호: 11, 서열 식별 번호: 35, 서열 식별 번호: 86, 서열 식별 번호: 22, 서열 식별 번호: 69, 서열 식별 번호: 41, 서열 식별 번호: 3, 서열 식별 번호: 66, 서열 식별 번호: 37, 서열 식별 번호: 56, 서열 식별 번호: 21, 서열 식별 번호: 38, 서열 식별 번호: 90, 서열 식별 번호: 100, 서열 식별 번호: 18, 서열 식별 번호: 20, 서열 식별 번호: 83, 서열 식별 번호: 1, 및 서열 식별 번호: 19로부터 선별된 서열에 대해 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 서열; 그리고
    h. 서열 식별 번호: 33, 서열 식별 번호: 34, 서열 식별 번호: 87, 서열 식별 번호: 82, 및 서열 식별 번호: 104로부터 선별된 서열에 대해 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 동일한 또는 100% 동일한 서열,
    이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 C-형 렉틴 도메인 패밀리 2 구성원 D (CLEC2D)에 결합한다.
  2. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 있어서, 이때 상기 경쇄 다음으로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함한다:
    a. 서열 식별 번호: 218, 서열 식별 번호: 249, 서열 식별 번호: 230, 서열 식별 번호: 279, 서열 식별 번호: 316, 서열 식별 번호: 237, 서열 식별 번호: 322, 서열 식별 번호: 225, 서열 식별 번호: 318, 서열 식별 번호: 233, 서열 식별 번호: 305, 서열 식별 번호: 280, 서열 식별 번호: 283, 서열 식별 번호: 242, 서열 식별 번호: 286, 서열 식별 번호: 297, 서열 식별 번호: 309, 및 서열 식별 번호: 246에서 선별된 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    b. 서열 식별 번호: 222, 서열 식별 번호: 258, 서열 식별 번호: 219, 서열 식별 번호: 313, 서열 식별 번호: 294, 서열 식별 번호: 303, 서열 식별 번호: 317, 서열 식별 번호: 273, 서열 식별 번호: 266, 서열 식별 번호: 315, 서열 식별 번호: 257, 서열 식별 번호: 288, 서열 식별 번호: 301, 서열 식별 번호: 221, 서열 식별 번호: 240, 서열 식별 번호: 299, 서열 식별 번호: 247, 서열 식별 번호: 263, 및 서열 식별 번호: 274에서 선별된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    c. 서열 식별 번호: 231, 서열 식별 번호: 250, 서열 식별 번호: 260, 서열 식별 번호: 226, 서열 식별 번호: 271, 서열 식별 번호: 256, 서열 식별 번호: 272, 서열 식별 번호: 278, 서열 식별 번호: 302, 서열 식별 번호: 320, 서열 식별 번호: 295, 서열 식별 번호: 292, 서열 식별 번호: 229, 서열 식별 번호: 264, 서열 식별 번호: 252, 서열 식별 번호: 267, 서열 식별 번호: 304, 서열 식별 번호: 300, 서열 식별 번호: 311, 및 서열 식별 번호: 324에서 선별된 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열
    d. 서열 식별 번호: 259, 서열 식별 번호: 239, 서열 식별 번호: 281, 서열 식별 번호: 228, 서열 식별 번호: 217, 서열 식별 번호: 227, 및 서열 식별 번호: 251에서 선별된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    e. 서열 식별 번호: 307, 서열 식별 번호: 262, 서열 식별 번호: 253, 서열 식별 번호: 276, 서열 식별 번호: 323, 서열 식별 번호: 234, 서열 식별 번호: 261, 서열 식별 번호: 312, 및 서열 식별 번호: 290에서 선별된 서열에 대해 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100%동일한 서열;
    f. 서열 식별 번호: 254, 서열 식별 번호: 289, 서열 식별 번호: 238, 서열 식별 번호: 268, 서열 식별 번호: 248, 서열 식별 번호: 284, 서열 식별 번호: 244, 서열 식별 번호: 310, 서열 식별 번호: 243, 서열 식별 번호: 285, 서열 식별 번호: 220, 서열 식별 번호: 255, 서열 식별 번호: 293, 서열 식별 번호: 298, 서열 식별 번호: 235, 서열 식별 번호: 319, 서열 식별 번호: 245, 서열 식별 번호: 224, 서열 식별 번호: 291, 서열 식별 번호: 277, 및 서열 식별 번호: 232에서 선별된 서열에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; 그리고
    g. 서열 식별 번호: 282, 서열 식별 번호: 308, 서열 식별 번호: 287, 서열 식별 번호: 321, 서열 식별 번호: 236, 서열 식별 번호: 265, 서열 식별 번호: 270, 서열 식별 번호: 275, 서열 식별 번호: 306, 서열 식별 번호: 296, 서열 식별 번호: 241, 서열 식별 번호: 314, 및 서열 식별 번호: 223에서 선별된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CLEC2D에 결합한다.
  3. 다음을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. 다음에서 선별된 서열을 포함하는 중쇄:
    i. 서열 식별 번호: 46, 서열 식별 번호: 65, 서열 식별 번호: 59, 및 서열 식별 번호: 99로부터 선별된 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    ii. 서열 식별 번호: 57, 서열 식별 번호: 91, 서열 식별 번호: 98, 서열 식별 번호: 84, 서열 식별 번호: 58, 서열 식별 번호: 88, 서열 식별 번호: 96, 서열 식별 번호: 47, 서열 식별 번호: 17, 및 서열 식별 번호: 8에서 선별된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    iii. 서열 식별 번호: 93, 서열 식별 번호: 53, 서열 식별 번호: 95, 서열 식별 번호: 23, 서열 식별 번호: 103, 및 서열 식별 번호: 7로부터 선별된 서열에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    iv. 서열 식별 번호: 45, 서열 식별 번호: 15, 서열 식별 번호: 51, 서열 식별 번호: 44, 서열 식별 번호: 73, 서열 식별 번호: 36, 서열 식별 번호: 77, 서열 식별 번호: 50, 및 서열 식별 번호: 6으로부터 선별된 서열에 대해 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    v. 서열 식별 번호: 97, 서열 식별 번호: 16, 서열 식별 번호: 76, 서열 식별 번호: 9, 서열 식별 번호: 89, 서열 식별 번호: 107, 서열 식별 번호: 68, 서열 식별 번호: 29, 서열 식별 번호: 67, 서열 식별 번호: 74, 서열 식별 번호: 32, 서열 식별 번호: 81, 서열 식별 번호: 106, 서열 식별 번호: 31, 서열 식별 번호: 62, 서열 식별 번호: 48, 서열 식별 번호: 75, 서열 식별 번호: 12, 서열 식별 번호: 102, 서열 식별 번호: 54, 서열 식별 번호: 80, 서열 식별 번호: 26, 서열 식별 번호: 30, 서열 식별 번호: 92, 서열 식별 번호: 108, 및 서열 식별 번호: 79에서 선별된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    vi. 서열 식별 번호: 105, 서열 식별 번호: 101, 서열 식별 번호: 4, 서열 식별 번호: 72, 서열 식별 번호: 28, 서열 식별 번호: 64, 서열 식별 번호: 25, 서열 식별 번호: 60, 서열 식별 번호: 55, 서열 식별 번호: 52, 서열 식별 번호: 27, 서열 식별 번호: 43, 서열 식별 번호: 70, 서열 식별 번호: 71, 서열 식별 번호: 14, 서열 식별 번호: 85, 서열 식별 번호: 13, 서열 식별 번호: 61, 서열 식별 번호: 42, 서열 식별 번호: 39, 서열 식별 번호: 10, 서열 식별 번호: 49, 서열 식별 번호: 24, 서열 식별 번호: 40, 서열 식별 번호: 63, 서열 식별 번호: 78, 서열 식별 번호: 2, 서열 식별 번호: 94, 및 서열 식별 번호: 5로부터 선별된 서열에 대해 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    vii. 서열 식별 번호: 11, 서열 식별 번호: 35, 서열 식별 번호: 86, 서열 식별 번호: 22, 서열 식별 번호: 69, 서열 식별 번호: 41, 서열 식별 번호: 3, 서열 식별 번호: 66, 서열 식별 번호: 37, 서열 식별 번호: 56, 서열 식별 번호: 21, 서열 식별 번호: 38, 서열 식별 번호: 90, 서열 식별 번호: 100, 서열 식별 번호: 18, 서열 식별 번호: 20, 서열 식별 번호: 83, 서열 식별 번호: 1, 및 서열 식별 번호: 19로부터 선별된 서열에 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; 그리고
    viii. 서열 식별 번호: 33, 서열 식별 번호: 34, 서열 식별 번호: 87, 서열 식별 번호: 82, 및 서열 식별 번호: 104로부터 선별된 서열에 대해 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; 그리고
    b. 다음에서 선별된 서열을 포함하는 경쇄:
    i. 서열 식별 번호: 218, 서열 식별 번호: 249, 서열 식별 번호: 230, 서열 식별 번호: 279, 서열 식별 번호: 316, 서열 식별 번호: 237, 서열 식별 번호: 322, 서열 식별 번호: 225, 서열 식별 번호: 318, 서열 식별 번호: 233, 서열 식별 번호: 305, 서열 식별 번호: 280, 서열 식별 번호: 283, 서열 식별 번호: 242, 서열 식별 번호: 286, 서열 식별 번호: 297, 서열 식별 번호: 309, 및 서열 식별 번호: 246에서 선별된 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    ii. 서열 식별 번호: 222, 서열 식별 번호: 258, 서열 식별 번호: 219, 서열 식별 번호: 313, 서열 식별 번호: 294, 서열 식별 번호: 303, 서열 식별 번호: 317, 서열 식별 번호: 273, 서열 식별 번호: 266, 서열 식별 번호: 315, 서열 식별 번호: 257, 서열 식별 번호: 288, 서열 식별 번호: 301, 서열 식별 번호: 221, 서열 식별 번호: 240, 서열 식별 번호: 299, 서열 식별 번호: 247, 서열 식별 번호: 263, 및 서열 식별 번호: 274에서 선별된 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    iii. 서열 식별 번호: 231, 서열 식별 번호: 250, 서열 식별 번호: 260, 서열 식별 번호: 226, 서열 식별 번호: 271, 서열 식별 번호: 256, 서열 식별 번호: 272, 서열 식별 번호: 278, 서열 식별 번호: 302, 서열 식별 번호: 320, 서열 식별 번호: 295, 서열 식별 번호: 292, 서열 식별 번호: 229, 서열 식별 번호: 264, 서열 식별 번호: 252, 서열 식별 번호: 267, 서열 식별 번호: 304, 서열 식별 번호: 300, 서열 식별 번호: 311, 및 서열 식별 번호: 324에서 선별된 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열
    iv. 서열 식별 번호: 259, 서열 식별 번호: 239, 서열 식별 번호: 281, 서열 식별 번호: 228, 서열 식별 번호: 217, 서열 식별 번호: 227, 및 서열 식별 번호: 251에서 선별된 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    v. 서열 식별 번호: 307, 서열 식별 번호: 262, 서열 식별 번호: 253, 서열 식별 번호: 276, 서열 식별 번호: 323, 서열 식별 번호: 234, 서열 식별 번호: 261, 서열 식별 번호: 312, 및 서열 식별 번호: 290로부터 선별된 서열에 대해 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    vi. 서열 식별 번호: 254, 서열 식별 번호: 289, 서열 식별 번호: 238, 서열 식별 번호: 268, 서열 식별 번호: 248, 서열 식별 번호: 284, 서열 식별 번호: 244, 서열 식별 번호: 310, 서열 식별 번호: 243, 서열 식별 번호: 285, 서열 식별 번호: 220, 서열 식별 번호: 255, 서열 식별 번호: 293, 서열 식별 번호: 298, 서열 식별 번호: 235, 서열 식별 번호: 319, 서열 식별 번호: 245, 서열 식별 번호: 224, 서열 식별 번호: 291, 서열 식별 번호: 277, 및 서열 식별 번호: 232에서 선별된 서열에 대해 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열; 그리고
    vii. 서열 식별 번호: 282, 서열 식별 번호: 308, 서열 식별 번호: 287, 서열 식별 번호: 321, 서열 식별 번호: 236, 서열 식별 번호: 265, 서열 식별 번호: 270, 서열 식별 번호: 275, 서열 식별 번호: 306, 서열 식별 번호: 296, 서열 식별 번호: 241, 서열 식별 번호: 314, 및 서열 식별 번호: 223에서 선별된 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일한 서열;
    이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CLEC2D에 결합한다.
  4. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 있어서, 이때 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 1-108중 임의의 하나로부터 선별된 서열을 포함하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CLEC2D에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 있어서, 이때 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 217-324중 임의의 하나로부터 선별된 서열을 포함하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CLEC2D에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 있어서, 이때 상기 중쇄는 서열 식별 번호: 1-108중 임의의 하나로부터 선별된 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 서열 식별 번호: 217-324중 임의의 하나로부터 선별된 서열을 포함하고, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CLEC2D에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 있어서, 이때 상기 중쇄는 다음을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (i) 서열 식별 번호: 433-485로부터 선별된 서열을 포함하는 중쇄 (HC) CDR1;
    (ii) 서열 식별 번호: 486-546으로부터 선별된 서열을 포함하는 HC CDR2; 그리고
    (iii) 서열 식별 번호: 547-653으로부터 선별된 서열을 포함하는 HC CDR3,
    이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CLEC2D에 결합한다.
  8. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 있어서, 이때 상기 경쇄는 다음을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (i) 서열 식별 번호: 654-726으로부터 선별된 서열을 포함하는 경쇄 (LC) CDR1;
    (ii) 서열 식별 번호: 727-783으로부터 선별된 서열을 포함하는 LC CDR2; 그리고
    (iii) 서열 식별 번호: 784-885로부터 선별된 서열을 포함하는 LC CDR3;
    이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CLEC2D에 결합한다.
  9. 다음을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. 서열 식별 번호: 433-485로부터 선별된 HC CDR1 서열, 서열 식별 번호: 486-546으로부터 선별된 HC CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 547-653로부터 선별된 HC CDR3 서열을 포함하는 중쇄;
    b. 서열 식별 번호: 654-726으로부터 선별된 LC CDR1 서열, 서열 식별 번호: 727-783로부터 선별된 LC CDR2 서열, 그리고 서열 식별 번호: 784-885로부터 선별된 LC CDR3 서열을 포함하는 경쇄; 또는
    c. 이의 조합,
    이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CLEC2D에 결합한다.
  10. 청구항 1-9중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    a. 서열 식별 번호: 886-909 및 930-1003으로부터 선별된 서열을 포함하는 인간 CLEC2D 폴리펩티드;
    b. 서열 식별 번호: 918-920으로부터 선별된 서열을 포함하는 시노몰구스 CLEC2D 폴리펩티드;
    c. 서열 식별 번호: 911-915로부터 선별된 서열을 포함하는 마우스 CLEC2D 폴리펩티드;
    d. 서열 식별 번호: 910으로부터 선별된 서열을 포함하는 렛 CLEC2D 폴리펩티드; 및/또는
    e. 서열 식별 번호: 916-917로부터 선별된 서열을 포함하는 개 CLEC2D 폴리펩티드.
  11. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 있어서, 이때 상기 중쇄는 표 9A의 항-CLEC2D 항체 번호 A1-N2중 임의의 하나의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDRH) 1, CDRH2 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고, 이때 상기 경쇄는 표 9A의 항-CLEC2D 항체 번호 A1-N2중 임의의 하나의 경쇄 상보성 결정 영역 (CDRL)1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 있어서, 이때 상기 중쇄는 표 9A의 항-CLEC2D 항체 번호 A1-N2중 임의의 하나의 중쇄 아미노산 서열을 포함하고, 이때 상기 경쇄는 표 9A의 항-CLEC2D 항체 번호 A1-N2중 임의의 하나의 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 있어서, 이때 상기 중쇄는 표 9A에서 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDRH) 1, CDRH2 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하며, 그리고, 이때 상기 경쇄는 표 9A에서 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 경쇄 상보성 결정 영역 (CDRL)1, CDRL2 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 있어서, 이때 상기 중쇄는 표 9A에서 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 이때 상기 경쇄는 표 9A에서 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2 로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 있어서, 이때 상기 중쇄는 본원에서 기술된 바와 같이, 표 9B의 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 생식계열 패밀리의 중쇄 프레임 워크 영역 서열을 포함하고, 그리고 이때 상기 경쇄는 본원에서 기술된 바와 같이, 표 9B의 A1, B1, E1, P1, U1, Y1, E2, I2 및 L2로 구성된 군에서 선택된 항-CLEC2D 항체의 경쇄 생식계열 패밀리의 프레임 워크 영역 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 청구항 62 내지 64중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-CLEC2D 항체는 표 9A 및 표 9B에서 항-CLEC2D 항체 번호 A1인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 청구항 62 내지 64중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-CLEC2D 항체는 표 9A 및 표 9B에서 항-CLEC2D 항체 번호 B1인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 청구항 62 내지 64중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-CLEC2D 항체는 표 9A 및 표 9B에서 항-CLEC2D 항체 번호 E1인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 청구항 62 내지 64중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-CLEC2D 항체는 표 9A 및 표 9B에서 항-CLEC2D 항체 번호 P1인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 청구항 62 내지 64중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-CLEC2D 항체는 표 9A 및 표 9B에서 항-CLEC2D 항체 번호 U1인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  21. 청구항 62 내지 64중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-CLEC2D 항체는 표 9A 및 표 9B에서 항-CLEC2D 항체 번호 Y1인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  22. 청구항 62 내지 64중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-CLEC2D 항체는 표 9A 및 표 9B에서 항-CLEC2D 항체 번호 E2인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  23. 청구항 62 내지 64중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-CLEC2D 항체는 표 9A 및 표 9B에서 항-CLEC2D 항체 번호 I2인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  24. 청구항 62 내지 64중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항-CLEC2D 항체는 표 9A 및 표 9B에서 항-CLEC2D 항체 번호 L2인, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  25. 청구항 1-24중 임의의 한 항에 있어서, 이때 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일클론성 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  26. 청구항 1-24중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CLEC2D가 수용체에 결합하는 것을 조절 또는 차단시키는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  27. 청구항 26에 있어서, 이때 상기 수용체는 CD161 수용체를 포함하고, 그리고 이 CD161 수용체는 서열 식별 번호: 921-929에서 선택된 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편
  28. 청구항 1-27중 임의의 한 항에 있어서, 이때 해당 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간, 뮤린 또는 키메라인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  29. 청구항 1-28중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항원-결합 단편은 Fv, Fav, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, scFv-CH3, scFv-Fc, 및 디아바디 단편들로 구성된 군에서 선별된, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  30. 청구항 1-29중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체는 아푸코실화된, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  31. 청구항 1-30중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아푸코실화된, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  32. 청구항 1-31중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 해당 항체 영역에서 아푸코실화된, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  33. 청구항 1-32중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1 Fc 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  34. 청구항 1-32중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG4 Fc 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  35. 청구항 1-32중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1 N에서 A Fc 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  36. 청구항 1-32중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG2 Fc 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  37. 청구항 1-35중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 100 nM 미만의 친화력 (KD)으로 인간 CLEC2D에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  38. 청구항 1-37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기와 중첩되는 및/또는 비-중첩되는 아미노산 위치들로 구성된 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원을 인지하고, 이에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  39. 청구항 1-37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기와 중첩되는 및/또는 비-중첩되는 아미노산 위치들로 구성된 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원을 인지하고, 이에 결합하는 또다른 항체를 억제, 폐기 또는 이와 경쟁하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  40. 청구항 1-37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95 또는 이의 조합중 임의의 것을 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  41. 청구항 1-37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95 또는 이의 조합중 임의의 것을 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 대한 또다른 항체의 결합을 억제, 폐기 또는 이와 경쟁하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  42. 청구항 1-37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CD161 수용체 상호작용 아미노산 잔기에 대한 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-920 및 930-1003의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  43. 청구항 1-37중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CD161 수용체 비-상호작용 아미노산 잔기에 대한 알로스테릭, 비-선형 스캐폴드를 구성하고, 그렇게 함으로써 CLEC2D와 CD161 수용체 간의 상호작용을 차단시키는, 서열 식별 번호: 886-920 및 930-1003의 적어도 하나의 아미노산 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95를 포함하는 CLEC2D의 형태학적 에피토프 항원에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  44. 청구항 1-43중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 독립적으로 또는 조합에 의해 종양 사멸 또는 세포독성을 유도하기 위해, 서열 식별 번호: 886-920 및 930-1003으로부터 선별된 CLEC2D에 결합될 때, 다음 아미노산 위치중 적어도 하나의 위치 ARG175; TYR177; GLU179; ARG153; ARG84; HIS190; ARG101; GLU150; GLN154; THR152; GLN141; SER105; ASP107; ASP92; THR93; LYS94; LYS144; GLU138; CYS176; GLN139; ARG180; SER187; LYS181; PHE116; ASN95에 결합하는 가변 중쇄 서열과 가변 경쇄 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  45. 청구항 44에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 해당 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 처리된 세포 총 수의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%에서 세포독성을 유도하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  46. 청구항 1-45중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물.
  47. 청구항 46에 있어서, 완충제, 약제학적으로 수용가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 및 보존제중 적어도 하나를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  48. 서열 식별 번호: 109-216으로부터 선벽된 아미노산 중쇄 서열을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  49. 서열 식별 번호: 325-432로부터 선벽된 아미노산 경쇄 서열을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  50. 청구항 1, 3, 4, 6, 7, 및 9-37중 임의의 한 항에 따른 중쇄 아미노산 서열을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  51. 청구항 2, 3, 5, 6, 8, 및 9-37중 임의의 한 항에 따른 경쇄 아미노산 서열을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  52. 서열 식별 번호: 109-216에서 선택된 폴리펩티드를 인코드하는 제 1 핵산과 서열 식별 번호: 325-432에서 선택된 폴리펩티드를 인코드하는 제 2 핵산을 포함하는 조성물.
  53. 청구항 48-51중 임의의 한 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  54. 청구항 48-51중 임의의 한 항의 핵산, 청구항 52의 조성물, 또는 청구항 53의 벡터를 포함하는 세포에 있어서, 이때 상기 세포는 진핵 세포인, 세포.
  55. 청구항 54에 있어서, 이때 상기 진핵 세포는 포유류 세포인, 세포.
  56. 청구항 55에 있어서, 이때 상기 포유류 세포는 CHO 세포, 293 세포, NSO 세포, PER.C6 세포, 및 B 세포로 구성된 군에서 선택되는, 세포.
  57. 청구항 56에 있어서, 이때 상기 포유류 세포는 293-6E 세포 또는 DG44 세포인, 세포.
  58. 청구항 1-45중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 세포.
  59. 질환 치료를 요하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 1-45중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료요법적 효과량을 해당 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  60. 청구항 59에 있어서, 이때 상기 질환 또는 장애는 이러한 치료를 필요로 하는 대상체의 다양한 세포 표면 상에서 CLEC2D의 차등적 또는 기이한 발현과 연합된, 방법.
  61. 청구항 59에 있어서, 이때 상기 질환 또는 장애는 이러한 치료를 필요로 하는 대상체의 다양한 세포 표면 상에서 CLEC2D의 증가된 발현과 연합된 방법.
  62. 청구항 60-61중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 세포는 면역 세포인, 방법.
  63. 청구항 62에 있어서, 이때 상기 면역 세포는 NK 세포인, 방법.
  64. 청구항 60-61중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 세포는 암 세포인, 방법.
  65. 청구항 60-61중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 세포는 미생물에 감염된 세포인, 방법.
  66. 청구항 65에 있어서, 이때 상기 미생물은 박테리아, 바이러스, 진균, 기생 미생물 또는 원생동물인, 방법.
  67. 청구항 66에 있어서, 이때 상기 미생물은 세포내 박테리아인, 방법.
  68. 청구항 59-67중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 질환은 류마티스 관절염인, 방법.
  69. 청구항 68에 있어서, 이때 상기 대상체는 류마티스 관절염이 있는 결과로 골 손실을 나타내는, 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료요법적 효과량을 투여하면 상기 대상체에서 골 손실을 지연 또는 역전시키는, 방법.
  71. 청구항 59-67중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 질환은 암인, 방법.
  72. 청구항 71에 있어서, 이때 암은 유방암, 전립선암, 자궁내막암, 방광암, 신장암, 식도암, 편평 세포 암종, 포도막 흑색종, 여포성 림프종, 신장 세포 암종, 센드칼(cendcal) 암, 난소암, 폐암, 결장직장암, 뇌암, 췌장암, 두경부암, 간암, 백혈병, 림프종, 호지킨 질환, 다발성 골수종, 흑색종, 성상세포종, 위암 및 폐선암종인, 방법.
  73. 청구항 71에 있어서, 이때 암은 부신피질 암종, 방광 요로상피 암종, 유방 침윤성 암종, 자궁경부 편평세포 암종 및 자궁경부 선암종, 담관암종, 결장 선암종, 림프성 신생물 미만성 거대 B-세포 림프종, 식도 암종, 다형 교모세포종, 두경부 편평 세포 암좀, 신장 염색공포증, 신장 신장의 투명세포 암종, 신장 신장의 유두세포 암종, 급성 골수성 백혈병, 뇌 저등급 신경교종, 간 간의 세포암종, 폐 선암종, 폐 편평세포 암종, 난소 장액성 낭선암종, 췌장 선암종, 갈색세포종 및 부신경절종, 전립선 선암종, 직장 선암종, 육종, 피부 피부의 흑색종, 위 선암종, 자궁암, 고환 생식 세포 종양, 갑상선 암종, 흉선종, 자궁 코퍼스 자궁내막암종, 자궁 암종 및 포도막 흑색종으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  74. 청구항 71-73중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들의 치료요법적 효과량을 투여하면 해당 대상체에서 항-종양 반응이 초래되는, 방법.
  75. 청구항 59-74중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료요법적 효과량의 투여로 상기 질환의 징후 또는 증상이 완화되는, 방법.
  76. 청구항 59-75중 임의의 한 항에 있어서, 이때 청구항 1-45중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료요법적 효과량은 CLEC2D와 이의 동계 수용체 CD161의 상호작용을 조절 또는 억제시키는, 방법.
  77. 미생물에 의해 야기되는 질환, 장애 또는 감염에 반응하여 대상체에서 면역 반응의 활성화 조정을 필요로 하는 대상체에서 이의 활성화를 조정하는 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 1-45중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료요법적 효과량을 해당 대상체에게 투여하고, 이때 면역 반응은 선천적 면역 반응 또는 적응성 면역 반응 또는 이의 조합이 되는, 방법.
  78. 자연 킬러 세포의 세포독성 증가를 필요로 하는 대상체에서 이를 증가시키는 방법에 있어서, 이 방법은 청구항 1-45중 임의의 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 치료요법적 효과량을 해당 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  79. 적어도 약 108개의 독특한 단일클론성 항체 클론을 포함하는 항체 라이브러리에 있어서, 이때 상기 항체 클론의 적어도 약 80%는 CLEC2D 항원에 탐지가능하게 그리고 특이적으로 결합하는, 항체 라이브러리.
  80. 청구항 79에 있어서, 이때 상기 CLEC2D 항원은 서열 식별 번호: 886-920 및 서열 식별 번호: 930-1003으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 항체 라이브러리.
  81. 청구항 79 또는 80에 있어서, 이때 상기 CLEC2D 항원은 종양 세포 표면 상에 발현된 CLEC2D 항원, 해당 CLEC2D 항원의 변이체, 또는 해당 CLEC2D 항원의 동족체를 포함하는, 항체 라이브러리.
  82. 청구항 81에 있어서, 이때 해당 CLEC2D 항원의 변이체는 CLEC2D 단백질의 단편을 포함하는, 항체 라이브러리.
  83. 청구항 82에 있어서, 이때 해당 CLEC2D 항원의 동족체는 인간, 마우스, 개, 렛 또는 시노몰구스의 CLEC2D를 포함하는, 항체 라이브러리.
  84. CLEC2D 항원에 결합하는 항체들의 고도의 다양성 항체 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 방법에 있어서, 이 방법은 다음을 포함하는, 방법:
    a) 항체 유전자의 라이브러리를 파아지 단백질 유전자로 삽입시키고, 다수의 파아지를 형질전환시켜 파아지 라이브러리를 만들고, 이때 상기 파아지 라이브러리의 파아지는 해당 파아지의 표면 상에 항체 유전자의 라이브러리를 디스플레이시키고;
    b) 이 파아지 라이브러리는 CLEC2D 항원에 결합하는 개별 파아지에 대한 CLEC2D 항원으로 패닝되고, 그렇게 함으로써 CLEC2D 항원에 결합하는 항체들을 인코드하는 항체 유전자에 대해 풍부해진 풍부화된 파아지 라이브러리를 만들고;
    c) 단계 (b)를 적어도 한 차례 또는 적어도 두 차례 반복하고;
    d) 상기 풍부화된 파아지 라이브러리로부터 상기 항체 유전자를 효모 표면 디스플레이 라이브러리로 이전시키고;
    e) 상기 효모 표면 디스플레이 라이브러리로부터 CLEC2D 항원에 결합하는 개별 효모 세포들을 단리시키고;
    f) 상기 CLEC2D 항원에 결합하는 단리된 개별 효모 세포들을 배양하여 효모 표면 디스플레이 라이브러리 클론를 만들고; 그리고
    g) 상기 효모 표면 디스플레이 라이브러리 클론을 스크리닝하고;
    그렇게 함으로써 CLEC2D 항원에 결합하는 항체 유전자를 단리시킨다.
  85. 청구항 84에 있어서, 이때 상기 패닝 단계 (b)는 해당 파아지 라이브러리를 CLEC2D 피복된 자성 비드로 패닝시키는 것을 포함하는, 방법.
  86. 청구항 84에 있어서, 이때 이전 단계 (d)는 상기 항체 유전자를 효모 발현 벡터에 클로닝시키는 것을 포함하는, 방법.
  87. 청구항 86에 있어서, FLAG 테그, c-Myc 테그, 폴리히스티딘 테그 또는 V5 테그로 항체 유전자의 표면 발현을 분석하는 것을 더 포함하는, 방법.
  88. 청구항 84에 있어서, 이때 상기 테스트 단계 (e)는 상기 CLEC2D 항원에 결합하는 항체 유전자를 발현시키는 효모 세포들을 유동 세포측정으로 단리시키는 것을 포함하는, 방법.
  89. 청구항 88에 있어서, 상기 유동 세포측정 단리를 적어도 1x, 적어도 2x, 적어도 3x, 적어도 4x 또는 적어도 5x 반복하는 것을 더 포함하는, 방법.
  90. 청구항 84-89중 임의의 한 항에 있어서, 상기 CLEC2D 항원에 결합하는 항체 유전자를 포유류 발현 벡터에 클로닝시키는 것을 더 포함하는, 방법.
  91. 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 만드는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
    a) 프로모터를 인코딩하는 서열과 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 서열을 포함하는 벡터로 포유류 세포를 형질변환시키고, 이때 상기 프로모터와 상기 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 서열은 작동가능하도록 연계되며;
    b) 상기 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현에 적합한 조건 하에서 상기 포유류 세포를 배양하고; 그리고
    c) 상기 배양된 포유류 세포들로부터 항-CLEC2D 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 얻어 상청액이 만들어진다.
  92. 청구항 91에 있어서, 이때 단계 (c)는 상기 배양된 포유류 세포들의 상청액을 수집하는 것을 포함하는, 방법.
  93. 청구항 91 또는 92에 있어서, 단계 (c) 이후 상청액을 여과하는 단계 (d)를 더 포함하는, 방법.
  94. 청구항 91-93중 임의의 한 항에 있어서, 상기 여과된 상청액을 정제시키는 단계 (e)를 더 포함하는, 방법.
  95. 질환 치료를 요하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법에 있어서, 이 방법은 다음을 포함하는 방법:
    a. 상기 대상체에서 CLEC2D 단백질의 수준을 결정하고; 그리고
    b. 치료요법적 효과량의 CLEC2D 항체를 상기 대상체에게 투여한다.
  96. 청구항 95에 있어서, 이때 상기 질환은 암인, 방법.
  97. 청구항 96에 있어서, 이때 상기 대상체의 암 세포는 암을 가지고 있지 않은 정상 세포와 비교하였을 때, 상승된 수준의 CLEC2D 단백질을 갖는, 방법.
  98. 청구항 95에 있어서, 이때 증가된 수준의 CLEC2D는 나쁜 예후 결과와 관련되는, 방법.
  99. 청구항 95에 있어서, 이때 상기 질환은 자가면역 또는 염증성 장애인, 방법.
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