TWI797091B - 利用嵌合抗原受體之癌症治療 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用以治療與CD20或CD22表現相關之疾病之組合物及方法。本發明亦關於對CD20或CD22具有特異性之嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor；CAR)、編碼其等之載體，及包含該CD20 CAR或CD22 CAR之重組T或天然殺手(natural killer；NK)細胞。本發明亦包括投與可表現包含CD20或CD22結合域之CAR之遺傳性地修飾T細胞或NK細胞之方法。

Description

利用嵌合抗原受體之癌症治療
本發明概言之係關於經改造以表現嵌合抗原受體(Cherimeric Antigen Receptor；CAR)之T細胞或天然殺手(NK)細胞於治療與分化簇20蛋白(Cluster of Differentiation 20 protein；CD20)或分化簇22蛋白(Cluster of Differentiation 22 protein；CD22)之表現相關之疾病的用途。
許多B細胞惡性病患者無法利用標準療法治癒。另外，傳統治療選項通常具有嚴重副作用。在癌症免疫療法中已進行了多種嘗試，然而，若干障礙致使此成為達成臨床有效性之極難目標。儘管業內已鑑別出數百種所謂的腫瘤抗原，但該等抗原通常源自自身且因此具有較差免疫原性。此外，腫瘤會利用若干機制使其自身抵抗免疫攻擊之引發及蔓延。 利用嵌合抗原受體(CAR)修飾之自體T細胞(CART)療法之最新研發依賴於將T細胞重定向至癌細胞(例如B細胞惡性病)上之適宜細胞表面分子，其在利用免疫系統之活力治療B細胞惡性病及其他癌症方面展示出有希望的結果(參見例如Sadelain等人，Cancer Discovery 3:388-398 (2013))。鼠類源性CART19 (即，「CTL019」)之臨床結果已展示有希望在患有CLL之患者以及兒童期ALL中建立完全緩解(參見例如Kalos等人，Sci Transl Med 3:95ra73 (2011)；Porter等人，NEJM 365:725-733 (2011)；Grupp等人，NEJM 368:1509-1518 (2013))。除經遺傳性地修飾之T細胞上之嵌合抗原受體識別及破壞靶細胞之能力外，成功的治療性T細胞療法需要具有隨時間增殖及存留之能力，以勘測白血病復發。由於無應變效能、阻抑作用或耗竭之T細胞之可變品質會對CAR轉形T細胞之性能產生影響，此時熟習此項技術者對其具有有限控制。為了有效性，CAR轉形之患者T細胞需要存留且維持因應同源抗原增殖之能力。已展示ALL患者T細胞可利用包含鼠類scFv之CART19達成此能力(參見例如Grupp等人，NEJM 368:1509-1518 (2013))。 因此，業內需要其他CAR療法。
本發明之特徵至少部分在於針對CD20及CD22之新穎抗原結合域及嵌合抗原受體(CAR)分子以及例如作為單一療法或組合療法之使用方法。在一些實施例中，本文所揭示之組合物及方法可包含結合CD20之CAR分子併與B細胞抑制劑(例如CD19或CD22之抑制劑或其組合)之組合。亦揭示編碼組合物之核酸、宿主細胞、載體以及製備及使用方法。編碼 CD20 結合域及 CD20 CAR 之核酸 在第一態樣中，本發明之特徵在於編碼嵌合抗原受體(CAR)之經分離核酸分子，其中CAR包含包括CD20結合域(例如，鼠類、人類或人類化CD20結合域)、跨膜域及細胞內信號傳導域(例如，包含共刺激域及/或初級信號傳導域之細胞內信號傳導域)之抗體或抗體片段。在一個實施例中，CAR包含包括本文所述之CD20結合域(例如，本文所述之鼠類、人類或人類化CD20結合域)、本文所述之跨膜域及本文所述之細胞內信號傳導域(例如，包含共刺激域及/或初級信號傳導域之細胞內信號傳導域)的抗體或抗體片段。 在一個實施例中，經編碼CD20結合域包含本文所述CD20結合域之一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個或所有三個)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、輕鏈互補決定區2 (LCDR2)及輕鏈互補決定區3 (LCDR3)，及/或本文所述CD20結合域之一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個或所有三個)重鏈互補決定區1 (HCDR1)、重鏈互補決定區2 (HCDR2)及重鏈互補決定區3 (HCDR3)，例如包含一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個或所有三個) LCDR及一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個或所有三個) HCDR之CD20結合域。在實施例中，經編碼CD20結合域包含例如表1及表2中所匯總之本文所述重鏈CDR (例如，HCDR1、HCDR2及/或HCDR3)。在實施例中，經編碼CD20結合域包含例如表1中及表3中所匯總之本文所述輕鏈CDR (例如，LCDR1、LCDR2及/或LCDR3)。 在一些實施例中，經編碼CD20結合域包含以下胺基酸序列中之一者、兩者、三者、四者、五者或六者： HCDR1包含胺基酸序列(N/S)YN(L/M)H或由其組成； HCDR2包含胺基酸序列AIYPGN(Y/G)DTSYN(Q/P)KFKG或由其組成； HCDR3包含胺基酸共有序列(V/S)(D/Y)F(G/Y)(H/G)S(R/S)(Y/S)WYFDV或由其組成； LCDR1包含胺基酸序列RA(T/S)SSVSSM(N/H)或由其組成； LCDR2包含胺基酸序列ATSNLAS或由其組成；及/或 LCDR3包含胺基酸序列QQW(T/I)FNPPT或由其組成。 在一個實施例中，經編碼CD20結合域(例如，鼠類、人類或人類化CD20結合域)包含本文所述之輕鏈可變區(例如，表1中及表5中所匯總)及/或本文所述之重鏈可變區(例如，表1中及表4中所匯總)。在一個實施例中，經編碼CD20結合域係包含如表1中所示之輕鏈及重鏈之scFv。在實施例中，經編碼CD20結合域(例如，scFv)包含表1中之胺基酸序列或由其組成。在實施例中，CD20結合域(例如，scFv)包含：輕鏈可變區，其包含具有表5中所提供之輕鏈可變區胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列、或與表5之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包含胺基酸序列具有表4中所提供之重鏈可變區胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列、或與表4之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。 在一個實施例中，經編碼CD20結合域包括(Gly4-Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6，較佳3或4 (SEQ ID NO: 23)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可呈例如以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接體-重鏈可變區或重鏈可變區-連接體-輕鏈可變區。 在一個實施例中，經編碼CD20結合域包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429，或與其具有95%-99%一致性之序列。 在一個實施例中，編碼CD20結合域之核酸序列包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 268、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 322、SEQ ID NO: 349、SEQ ID NO: 376、SEQ ID NO: 403及SEQ ID NO: 430，或與其具有95%-99%一致性之序列。在實施例中，編碼CD20結合域之核酸序列包含如表1中所示之序列。 在一個實施例中，經編碼CAR包括跨膜域，其包含例如選自由以下組成之群之蛋白質(例如本文所述蛋白質)之跨膜域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中，經編碼跨膜域包含SEQ ID NO: 801之序列。在一個實施例中，經編碼跨膜域包含包括SEQ ID NO: 801之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾但不超過20個、10個或5個修飾的胺基酸序列、或與SEQ ID NO: 801之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，編碼跨膜域之核酸序列包含SEQ ID NO: 802之序列或與其具有95%-99%一致性之序列。 在一個實施例中，經編碼CD20結合域藉由鉸鏈區(例如，本文所述之鉸鏈區)連接至跨膜域。在一個實施例中，經編碼鉸鏈區包含SEQ ID NO: 799或SEQ ID NO: 814或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，編碼鉸鏈區之核酸序列包含SEQ ID NO: 800或SEQ ID NO: 815之序列或與其具有95%-99%一致性之序列。 在一個實施例中，經分離核酸分子進一步包含編碼共刺激域(例如，本文所述之共刺激域)之序列。 在實施例中，細胞內信號傳導域包含共刺激域。在實施例中，細胞內信號傳導域包含初級信號傳導域。在實施例中，細胞內信號傳導域包含共刺激域及初級信號傳導域。 在一個實施例中，共刺激域係自例如本文所述、例如選自由以下組成之群之蛋白質獲得的功能性信號傳導域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)及4-1BB (CD137)。在一個實施例中，共刺激域選自由以下組成之群：4-1BB、CD27或CD28。在一個實施例中，共刺激域包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO: 803、SEQ ID NO: 818或SEQ ID NO: 809。在一個實施例中，共刺激域包含SEQ ID NO: 803之序列。在一個實施例中，共刺激域包含具有SEQ ID NO: 803之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾但不超過20個、10個或5個修飾的胺基酸序列、或與SEQ ID NO: 803之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，編碼共刺激域之核酸序列包含SEQ ID NO: 804之序列或與其具有95%-99%一致性之序列。 在實施例中，初級信號傳導域包含CD3ζ之功能性信號傳導域。在實施例中，CD3ζ之功能性信號傳導域包含SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807。 在一個實施例中，經編碼細胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及/或CD3ζ之功能性信號傳導域。在一個實施例中，經編碼細胞內信號傳導域包含SEQ ID NO: 803之序列及/或SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807之序列。在一個實施例中，細胞內信號傳導域包含具有SEQ ID NO: 803之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807之序列之至少1個、2個或3個修飾但不超過20個、10個或5個修飾的胺基酸序列、或與SEQ ID NO: 803之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807之序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，經編碼細胞內信號傳導域包含SEQ ID NO: 803之序列及SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807之序列，其中包含細胞內信號傳導域之序列係在同一框架中且以單一多肽鏈表現。在一個實施例中，編碼細胞內信號傳導域之核酸序列包含SEQ ID NO: 804之序列或與其具有95%-99%一致性之序列、及/或SEQ ID NO: 806或SEQ ID NO: 808之序列或與其具有95%-99%一致性之序列。 在另一態樣中，本發明係關於編碼CAR構築體之經分離核酸分子，其包含前導序列(例如本文所述之前導序列，例如SEQ ID NO: 797之前導序列)、本文所述之CD20結合域(例如包含本文所述之LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2及HCDR3之CD20結合域，例如表1中所述之鼠類、人類或人類化CD20結合域或與其具有95%-99%一致性之序列)、本文所述之鉸鏈區(例如SEQ ID NO: 799之鉸鏈區)、本文所述之跨膜域(例如具有SEQ ID NO: 801之序列)及細胞內信號傳導域(例如本文所述之細胞內信號傳導域)。在一個實施例中，經編碼細胞內信號傳導域包含共刺激域(例如本文所述之共刺激域，例如具有SEQ ID NO: 803之序列之4-1BB共刺激域)及/或初級信號傳導域(例如本文所述之初級信號傳導域，例如具有SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 806之序列之CD3ζ刺激域)。在一個實施例中，編碼CAR構築體之經分離核酸分子包括由SEQ ID NO: 798之核酸序列編碼之前導序列或與其具有95%-99%一致性之序列。 在一些實施例中，經分離核酸分子包含編碼表1中所述之CAR胺基酸序列之核酸(例如，由其組成)。 在一個實施例中，經分離核酸分子包含編碼SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 242、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 296、SEQ ID NO: 323、SEQ ID NO: 350、SEQ ID NO: 377、SEQ ID NO: 404及SEQ ID NO: 431之CAR胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 242、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 296、SEQ ID NO: 323、SEQ ID NO: 350、SEQ ID NO: 377、SEQ ID NO: 404及SEQ ID NO: 431之胺基酸序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列之核酸(例如，由其組成)。 在一些實施例中，經分離核酸分子包含表1中所述之核酸序列(例如，由其組成)。 在一個實施例中，經分離核酸分子包含SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 189、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 270、SEQ ID NO: 297、SEQ ID NO: 324、SEQ ID NO: 351、SEQ ID NO: 378、SEQ ID NO: 405及SEQ ID NO: 432之核酸序列，或與SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 135、、SEQ ID NO: 189、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 270、SEQ ID NO: 297、SEQ ID NO: 324、SEQ ID NO: 351、SEQ ID NO: 378、SEQ ID NO: 405及SEQ ID NO: 432之核酸序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的核酸序列(例如，由其組成)。 在一個態樣中，本發明係關於編碼CD20結合域之經分離核酸分子，其中CD20結合域包含本文所述CD20結合域之一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個或所有三個)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、輕鏈互補決定區2 (LCDR2)及輕鏈互補決定區3 (LCDR3)、及本文所述CD20結合域之一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個或所有三個)重鏈互補決定區1 (HCDR1)、重鏈互補決定區2 (HCDR2)及重鏈互補決定區3 (HCDR3)，例如包含一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個或所有三個) LCDR及一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個或所有三個) HCDR之鼠類、人類或人類化CD20結合域。 在一些實施例中，重鏈CDR (例如，HCDR1、HCDR2及/或HCDR3)包含表2中所述或表1中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈CDR (例如，LCDR1、LCDR2及/或LCDR3)包含表3中所述或表1中所示之胺基酸序列。 在實施例中，HCDR1、HCDR2及HCDR3之胺基酸序列分別選自以下中之a)-p)： (a) SEQ ID NO: 136、137及138； (b) SEQ ID NO: 217、218及219； (c) SEQ ID NO: 55、56及57； (d) SEQ ID NO: 82、83及84； (e) SEQ ID NO: 109、110及111； (f) SEQ ID NO: 1、2及3； (g) SEQ ID NO: 163、164及165； (h) SEQ ID NO: 190、191及192； (i) SEQ ID NO: 28、29及30； (j) SEQ ID NO: 244、245及246； (k) SEQ ID NO: 271、272及273； (l) SEQ ID NO: 298、299及300； (m) SEQ ID NO: 325、326及327； (n) SEQ ID NO: 352、353及354； (o) SEQ ID NO: 379、380及381；及 (p) SEQ ID NO: 406、407及408。 在實施例中，LCDR1、LCDR2及LCDR3之胺基酸序列分別選自以下中之a)-p)： (a) SEQ ID NO: 147、148及149； (b) SEQ ID NO: 228、229及230； (c) SEQ ID NO: 66、67及68； (d) SEQ ID NO: 93、94及95； (e) SEQ ID NO: 120、121及122； (f) SEQ ID NO: 12、13及14； (g) SEQ ID NO: 174、175及176； (h) SEQ ID NO: 201、202及203； (i) SEQ ID NO: 39、40及41； (j) SEQ ID NO: 255、256及257； (k) SEQ ID NO: 282、283及284； (l) SEQ ID NO: 309、310及311； (m) SEQ ID NO: 336、337及338； (n) SEQ ID NO: 363、364及365； (o) SEQ ID NO: 390、391及392；及 (p) SEQ ID NO: 417、418及419。 在一個實施例中，LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2及HCDR3之胺基酸序列分別選自以下中之a)-p)： (a) SEQ ID NO: 147、148、149、136、137及138； (b) SEQ ID NO: 228、229、230、217、218及219； (c) SEQ ID NO: 66、67、68、55、56及57； (d) SEQ ID NO: 93、94、95、82、83及84； (e) SEQ ID NO: 120、121、122、109、110及111； (f) SEQ ID NO: 12、13、14、1、2及3； (g) SEQ ID NO: 174、175、176、163、164及165； (h) SEQ ID NO: 201、202、203、190、191及192； (i) SEQ ID NO: 39、40、41、28、29及30； (j) SEQ ID NO: 255、256、257、244、245及246； (k) SEQ ID NO: 282、283、284、271、272及273； (l) SEQ ID NO: 309、310、311、298、299及300； (m) SEQ ID NO: 336、337、338、325、326及327； (n) SEQ ID NO: 363、364、365、352、353及354； (o) SEQ ID NO: 390、391、392、379、380及381；及 (p) SEQ ID NO: 417、418、419、406、407及408。 在實施例中，經編碼CD20結合域(例如，scFv)包含表1中所述之胺基酸序列。 在一個實施例中，經編碼CD20結合域包含本文所述之輕鏈可變區(例如表5)及/或本文所述之重鏈可變區(例如表4)。在一個實施例中，經編碼CD20結合域係包含選自表1之胺基酸序列之輕鏈及重鏈之scFv。 在實施例中，輕鏈可變區及重鏈可變區之胺基酸序列分別選自以下中之a)至p)： (a) SEQ ID NO: 156及145； (b) SEQ ID NO: 237及226； (c) SEQ ID NO: 21及10 (d) SEQ ID NO: 75及64； (e) SEQ ID NO: 102及91； (f) SEQ ID NO: 129及118； (g) SEQ ID NO: 183及172； (h) SEQ ID NO: 210及199； (i) SEQ ID NO: 48及37； (j) SEQ ID NO: 264及253； (k) SEQ ID NO: 291及280； (l) SEQ ID NO: 318及307； (m) SEQ ID NO: 345及334； (n) SEQ ID NO: 372及361； (o) SEQ ID NO: 399及388；及 (p) SEQ ID NO: 426及415。 在實施例中，CD20結合域(例如，scFv)包含：輕鏈可變區，其包含具有表5中所提供之輕鏈可變區胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列、或與表5之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包含具有表4中所提供之重鏈可變區胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列、或與表4中之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。 在一個實施例中，CD20結合域包含選自由表2、表3、表4或表5中所顯示之序列組成之群之序列或與其具有95%-99%一致性之序列。 在一個實施例中，經編碼CD20結合域係scFv，且包含本文所述胺基酸序列之輕鏈可變區(例如在表1中)經由連接體(例如，本文所述之連接體)附接至包含本文所述胺基酸序列的重鏈可變區(例如在表1中)。在一個實施例中，經編碼CD20結合域包括(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6，較佳係4 (SEQ ID NO: 23)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可呈例如以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接體-重鏈可變區或重鏈可變區-連接體-輕鏈可變區。包含 CD20 結合域及 CD20 CAR 之多肽 在另一態樣中，本發明係關於由核酸分子編碼之經分離多肽分子。在一個實施例中，經分離多肽分子包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429，或與其具有95%-99%一致性之序列。 在另一態樣中，本發明係關於經分離嵌合抗原受體(CAR)分子，其包含CD20結合域(例如，特異性結合至CD20之鼠類、人類或人類化抗體或抗體片段)、跨膜域及細胞內信號傳導域(例如，包含共刺激域及/或初級信號傳導域之細胞內信號傳導域)。在一個實施例中，CAR包含包括本文所述之CD20結合域(例如，特異性結合至CD20之鼠類、人類或人類化抗體或抗體片段，如本文所述)、本文所述之跨膜域及本文所述之細胞內信號傳導域(例如，包含本文所述之共刺激域及/或初級信號傳導域之細胞內信號傳導域)的抗體或抗體片段。 在實施例中，本文提供包含CD20結合域、跨膜域及細胞內信號傳導域之經分離CAR分子，其中CD20結合域包含表1中所列示之任一CD20結合域之一或多個輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、輕鏈互補決定區2 (LCDR2)及輕鏈互補決定區3 (LCDR3)、及表1中所列示之任一CD20結合域之一或多個重鏈互補決定區1 (HCDR1)、重鏈互補決定區2 (HCDR2)及重鏈互補決定區3 (HCDR3)。 在一個實施例中，CD20結合域包含本文所述CD20結合域之一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個或所有三個)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、輕鏈互補決定區2 (LCDR2)及輕鏈互補決定區3 (LCDR3)、及本文所述CD20結合域之一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個或所有三個)重鏈互補決定區1 (HCDR1)、重鏈互補決定區2 (HCDR2)及重鏈互補決定區3 (HCDR3)，例如包含一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個或所有三個) LCDR及一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個或所有三個) HCDR之CD20結合域。在一些實施例中，重鏈CDR (例如，HCDR1、HCDR2及/或HCDR3)包含表2中所述或表1中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，輕鏈CDR (例如，LCDR1、LCDR2及/或LCDR3)包含表3中所述或表1中所示之胺基酸序列。 在一個實施例中，CD20結合域包含本文所述之輕鏈可變區(例如，在表5中)及/或本文所述之重鏈可變區(例如，在表4中)。在一個實施例中，CD20結合域係包含表4或表5中所列示之胺基酸序列之輕鏈及重鏈之scFv。在實施例中，CD20結合域(例如，scFv)包含：輕鏈可變區，其包含具有表5中所提供之輕鏈可變區胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列、或與表5中所提供之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包含具有表4中所提供之重鏈可變區胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列、或與表4中所提供之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，CD20結合域包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429，或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，CD20結合域係scFv，且包含本文所述胺基酸序列之輕鏈可變區(例如在表5中)經由連接體(例如，本文所述之連接體)附接至包含本文所述胺基酸序列的重鏈可變區(例如在表4中)。在一個實施例中，CD20結合域包括(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6，較佳係4 (SEQ ID NO: 23)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可呈例如以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接體-重鏈可變區或重鏈可變區-連接體-輕鏈可變區。 在一個實施例中，經分離CAR分子包含例如選自由以下組成之群之蛋白質(例如本文所述蛋白質)之跨膜域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO: 801之序列。在一個實施例中，跨膜域包含具有SEQ ID NO: 801之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過20個、10個或5個修飾(例如，取代)的胺基酸序列、或與SEQ ID NO: 801之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。 在一個實施例中，CD20結合域藉由鉸鏈區(例如，本文所述之鉸鏈區)連接至跨膜域。在一個實施例中，經編碼鉸鏈區包含SEQ ID NO: 799或與其具有95%-99%一致性之序列。 在一個實施例中，經分離CAR分子進一步包含編碼共刺激域(例如，本文所述之共刺激域)之序列。 在實施例中，經分離CAR分子之細胞內信號傳導域包含共刺激域。在實施例中，經分離CAR分子之細胞內信號傳導域包含初級信號傳導域。在實施例中，經分離CAR分子之細胞內信號傳導域包含共刺激域及初級信號傳導域。 在一個實施例中，共刺激域包含選自由以下組成之群之蛋白質之功能性信號傳導域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)及4-1BB (CD137)。在一個實施例中，共刺激域包含SEQ ID NO: 803之序列。在一個實施例中，共刺激域包含具有SEQ ID NO: 803之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過20個、10個或5個修飾(例如，取代)的胺基酸序列、或與SEQ ID NO: 803之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。 在實施例中，初級信號傳導域包含CD3ζ之功能性信號傳導域。在實施例中，CD3ζ之功能性信號傳導域包含SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807。 在一個實施例中，細胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及/或CD3ζ之功能性信號傳導域。在一個實施例中，細胞內信號傳導域包含SEQ ID NO: 803之序列及/或SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807之序列。在一個實施例中，細胞內信號傳導域包含具有SEQ ID NO: 803之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807之序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過20個、10個或5個修飾(例如，取代)的胺基酸序列、或與SEQ ID NO: 803之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807之序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，細胞內信號傳導域包含SEQ ID NO: 803之序列及/或SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807之序列，其中包含細胞內信號傳導域之序列係在同一框架中且以單一多肽鏈表現。 在一個實施例中，經分離CAR分子進一步包含前導序列，例如本文所述之前導序列。在一個實施例中，前導序列包含SEQ ID NO: 797之胺基酸序列或與SEQ ID NO:797之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。 在另一態樣中，本發明係關於經分離CAR分子，其包含前導序列(例如本文所述之前導序列，例如SEQ ID NO: 797或與其具有95%-99%一致性之前導序列)、本文所述之CD20結合域(例如包含本文所述LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2及HCDR3之CD20結合域，例如表1中所述之CD20結合域或與其具有95%-99%一致性之序列)、鉸鏈區(例如本文所述之鉸鏈區，例如SEQ ID NO: 799或與其具有95%-99%一致性之鉸鏈區)、跨膜域(例如本文所述之跨膜域，例如具有SEQ ID NO: 801之序列或與其具有95%-99%一致性之序列之跨膜域)、細胞內信號傳導域(例如本文所述之細胞內信號傳導域(例如，包含共刺激域及/或初級信號傳導域之細胞內信號傳導域))。在一個實施例中，細胞內信號傳導域包含共刺激域(例如本文所述之共刺激域，例如具有SEQ ID NO: 803之序列或與其具有95%-99%一致性之序列之4-1BB共刺激域)及/或初級信號傳導域(例如本文所述之初級信號傳導域，例如具有SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807之序列或與其具有95%-99%一致性之序列之CD3ζ刺激域)。在一個實施例中，細胞內信號傳導域包含共刺激域(例如本文所述之共刺激域，例如具有SEQ ID NO: 803之序列之4-1BB共刺激域)及/或初級信號傳導域(例如本文所述之初級信號傳導域，例如具有SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807之序列之CD3ζ刺激域)。 在一個實施例中，經分離CAR分子包含SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429之胺基酸序列、或具有SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429之胺基酸序列之至少1個、2個、3個、4個、5個、10個、15個、20個或30個修飾(例如，取代)但不超過60個、50個或40個修飾(例如，取代)的胺基酸序列、或與SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429之胺基酸序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸序列(例如，由其組成)。 在一個態樣中，本發明係關於CD20結合域，其包含本文所述CD20結合域之一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個或所有三個)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、輕鏈互補決定區2 (LCDR2)及輕鏈互補決定區3 (LCDR3)、及本文所述CD20結合域之一或多個(例如，一或多個、兩個或更多個或所有三個)重鏈互補決定區1 (HCDR1)、重鏈互補決定區2 (HCDR2)及重鏈互補決定區3 (HCDR3)，例如包含一或多個、例如所有三個LCDR及一或多個、例如所有三個HCDR之CD20結合域。 在一個實施例中，CD20結合域包含本文所述之輕鏈可變區(例如表5)及/或本文所述之重鏈可變區(例如表4)。在一個實施例中，CD20結合域係包含表5之輕鏈胺基酸序列及表4之胺基酸序列之重鏈的scFv。在實施例中，CD20結合域(例如，scFv)包含：輕鏈可變區，其包含具有表5中所提供之輕鏈可變區胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列、或與表5中之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包含具有表4中所提供之重鏈可變區胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列、或與表4中之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，CD20結合域包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429，或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，CD20結合域係scFv，且包含本文所述胺基酸序列之輕鏈可變區(例如在表5中)經由連接體(例如，本文所述之連接體)附接至包含本文所述胺基酸序列的重鏈可變區(例如在表4中)。在一個實施例中，CD20結合域包括(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6，較佳係4 (SEQ ID NO: 23)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可呈例如以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接體-重鏈可變區或重鏈可變區-連接體-輕鏈可變區。 本文亦提供CD20結合域或多肽，例如包含本文所述之CD20結合scFv，且例如進一步包含本文所述之前導序列。舉例而言，前導序列包含SEQ ID NO: 797或由其組成。在一些實施例中，CD20結合域包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429。在一些實施例中，CD20結合域包含表1中所列示之可溶性scFv胺基酸序列。在實施例中，CD20結合域係由表1中所列示之可溶性scFv核酸序列編碼。CD22 結合域及 CD22 CAR 在另一態樣中，本發明係關於CD22結合域或CAR分子，其包含CD22-65sKD之重鏈可變域(VH)之胺基酸序列，例如包含SEQ ID NO: 839之胺基酸序列；及/或CD22-65sKD之輕鏈可變域(VL)之胺基酸序列，例如包含SEQ ID NO: 840之胺基酸序列。在實施例中，VH及VL序列係例如不使用連接體直接連接。在實施例中，VH及VL序列係經由連接體連接。在一些實施例中，連接體係(Gly4-Ser)n連接體，其中n係0、1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，在CD22-65sKD之VH區與CD22-65KD之VL區之間不存在連接體，例如n係0。在一個實施例中，連接體係(Gly4-Ser)n連接體，其中n係1。在一些實施例中，CD22結合域包含CD22-65sKD scFv之胺基酸序列，例如包含SEQ ID NO: 837之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明係關於CD22結合域或CAR分子，其包含CD22-65s ((Gly4-Ser)n連接體，其中n係1)或CD22-65ss (無連接體)之scFv之胺基酸序列。在一些實施例中，CD22結合域包含SEQ ID NO: 835之scFv。在一些實施例中，CD22結合域包含SEQ ID NO: 836之scFv。 本發明亦係關於包含前述態樣或實施例中之任一者之核酸分子、載體、細胞及用途。用於抗原結合域之連接體 令人驚奇地發現，在抗原結合域之可變域(例如，VH與VL)之間包含短或無連接體之CAR分子展示等於或大於較長連接體形式之活性。舉例而言，在一些實施例中，CD22-65s (具有(Gly4-Ser)n連接體，其中n係1)在腫瘤模型中展示與CD22-65 (具有(Gly4-Ser)n連接體，其中n係3)相比相當或較大之活性及/或效能，參見例如實例9及12。因此，本文所述抗原結合域或CAR分子中之任一者可具有不同長度之連接抗原結合域之可變域之連接體，包括例如約3至6個胺基酸、4至5個胺基酸或約5個胺基酸之短連接體。在一些實施例中，可使用較長連接體，例如約6至35個胺基酸，例如8至32個胺基酸、10至30個胺基酸、10至20個胺基酸。舉例而言，可使用(Gly4-Ser)n連接體，其中n係0、1、2、3、4、5或6。在一個實施例中，可變域未經由連接體(例如(Gly4-Ser)n連接體，n=0)連接。在一些實施例中，可變域係經由短連接體(例如(Gly4-Ser)n連接體，n=1)連接。在一些實施例中，可變域係經由(Gly4-Ser)n連接體(n=2)連接。在一些實施例中，可變域係經由(Gly4-Ser)n連接體(n=3)連接。在一些實施例中，可變域係經由(Gly4-Ser)n連接體(n=4)連接。在一些實施例中，可變域係經由(Gly4-Ser)n連接體(n=5)連接。在一些實施例中，可變域係經由(Gly4-Ser)n連接體(n=6)連接。可變域之順序(例如VL及VH域在抗原結合域(例如scFv)中出現之順序)可發生變化(即，VL-VH或VH-VL定向)。在一個實施例中，抗原結合域結合至CD20，例如如本文所述之CD20抗原結合域。在另一實施例中，抗原結合域結合至CD22，例如如本文所述之CD22抗原結合域。在另一實施例中，抗原結合域結合至CD19，例如如本文所述之CD19抗原結合域。 本發明亦係關於包含前述態樣或實施例中之任一者之核酸分子、載體、細胞及用途。多特異性抗體分子及 CAR 在一些實施例中，抗體分子係多特異性(例如雙特異性)抗體分子，其具有針對第一抗原(例如B細胞表位)之第一結合特異性及針對相同或不同抗原(例如B細胞表位)之第二結合特異性。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係抗體分子，例如抗體結合域(例如，scFv)。在雙特異性抗體分子之每一抗體分子(例如，scFv)內，VH可在VL之上游或下游。 在一些實施例中，上游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VL2 -VH2 。 在一些實施例中，上游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VH2 -VL2 。 在一些實施例中，上游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VL2 -VH2 。 在一些實施例中，上游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VH2 -VL2 。 在上述構形中之任一者中，視情況，連接體置於兩個抗體或抗體片段(例如，scFv)之間，例如若構築體排列為VH1 -VL1 -VL2 -VH2 則連接體置於VL1 與VL2 之間；若構築體排列為VL1 -VH1 -VH2 -VL2 則連接體置於VH1 與VH2 之間；若構築體排列為VL1 -VH1 -VL2 -VH2 則連接體置於VH1 與VL2 之間；或若構築體排列為VH1 -VL1 -VH2 -VL2 則連接體置於VL1 與VH2 之間。一般而言，兩個scFv之間之連接體應足夠長以避免兩個scFv之域之間錯配。連接體可為如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK (例如由其組成)。 在上述構形中之任一者中，視情況，連接體置於第一scFv之VL與VH之間。視情況，連接體置於第二scFv之VL與VH之間。在具有多個連接體之構築體中，任兩個或更多個連接體可相同或不同。因此，在一些實施例中，雙特異性CAR包含VL、VH及視情況一或多個呈如本文所述排列之連接體。 在一些實施例中，每一抗體分子、例如每一抗原結合域(例如，每一scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在某些實施例中，抗體分子係雙特異性抗體分子，其具有針對第一B細胞表位之第一結合特異性及針對相同或不同B細胞抗原之第二結合特異性。例如，在一些實施例中，雙特異性抗體分子，其具有針對CD20之第一結合特異性及針對CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中之一或多者之第二結合特異性。在一些實施例中，雙特異性抗體分子具有針對CD19之第一結合特異性及針對CD20之第二結合特異性。在一些實施例中，雙特異性抗體分子具有針對CD19之第一結合特異性及針對CD22之第二結合特異性。 在一個實施例中，抗體分子係具有結合特異性(例如針對CD19之第一及/或第二結合特異性)之雙特異性抗體分子。在一個實施例中，結合特異性經構形其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VL2 -VH2 。在一個實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如CTL019 scFv (SEQ ID NO: 765)。在一些實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如人類化CD19 scFv，例如人類化CAR2。在一些實施例中，針對CD19之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD19之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD19之第一及/或第二結合特異性)經構形其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VH2 -VL2 。在一個實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如CTL019 scFv (SEQ ID NO: 765)。在一些實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如人類化CD19 scFv，例如人類化CAR2。在一些實施例中，針對CD19之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD19之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD19之第一及/或第二結合特異性)經構形其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VL2 -VH2 。在一個實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如CTL019 scFv (SEQ ID NO: 765)。在一些實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如人類化CD19 scFv，例如人類化CAR2。在一些實施例中，針對CD19之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD19之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD19之第一及/或第二結合特異性)經構形其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VH2 -VL2 。在一個實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如CTL019 scFv (SEQ ID NO: 765)。在一些實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如人類化CD19 scFv，例如人類化CAR2。在一些實施例中，針對CD19之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD19之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，抗體分子係具有結合特異性(例如針對CD20之第一及/或第二結合特異性)之雙特異性抗體分子。在一個實施例中，結合特異性經構形其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VL2 -VH2 。在一個實施例中，CD20結合特異性包含如表1中所繪示之VH及VL，例如C3H2 scFv或C5H1 scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD20之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD20之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD20之第一及/或第二結合特異性)經構形其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VH2 -VL2 。在一個實施例中，CD20結合特異性包含如表1中所繪示之VH及VL，例如C3H2 scFv或C5H1 scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD20之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD20之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD20之第一及/或第二結合特異性)經構形其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VL2 -VH2 。在一個實施例中，CD22結合特異性包含如表1中所繪示之VH及VL，例如C3H2 scFv或C5H1 scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD20之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD20之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD20之第一及/或第二結合特異性)經構形其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VH2 -VL2 。在一個實施例中，CD22結合特異性包含如表1中所繪示之VH及VL，例如C3H2 scFv或C5H1 scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD20之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD20之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，抗體分子係具有結合特異性(例如針對CD22之第一及/或第二結合特異性)之雙特異性抗體分子。在一個實施例中，結合特異性經構形其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VL2 -VH2 。在一個實施例中，CD22結合特異性包含如表6中所繪示之VH及VL，例如CD22-65或CD22-65KD scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD22之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD22之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser，例如如在CD22-65s scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3，例如如在CD22-65 scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接，例如如在CD22-65ss scFv中。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD22之第一及/或第二結合特異性)經構形其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VH2 -VL2 。在一個實施例中，CD22結合特異性包含如表6中所繪示之VH及VL，例如CD22-65或CD22-65KD scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD22之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD22之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser，例如如在CD22-65s scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3，例如如在CD22-65 scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接，例如如在CD22-65ss scFv中。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD22之第一及/或第二結合特異性)經構形其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VL2 -VH2 。在一個實施例中，CD22結合特異性包含如表6中所繪示之VH及VL，例如CD22-65或CD22-65KD scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD22之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD22之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser，例如如在CD22-65s scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3，例如如在CD22-65 scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接，例如如在CD22-65ss scFv中。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD22之第一及/或第二結合特異性)經構形其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VH2 -VL2 。在一個實施例中，CD22結合特異性包含如表6中所繪示之VH及VL，例如CD22-65或CD22-65KD scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD22之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD22之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser，例如如在CD22-65s scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3，例如如在CD22-65 scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接，例如如在CD22-65ss scFv中。 在一些實施例中，雙特異性抗體分子包含針對CD19之第一結合特異性(例如本文所述針對CD19之結合特異性中之任一者)及針對CD22之第二結合特異性(例如本文所述針對CD22之結合特異性中之任一者)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK。 在一個實施例中，雙特異性抗體分子包含針對CD19之第一結合特異性(例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性)及針對CD22之第二結合特異性(例如針對CD22之VL2-VH2或VH2-VL1結合特異性)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK。 在一個實施例中，雙特異性抗體分子包含針對CD22之第一結合特異性(例如針對CD22之VL2-VH2或VH2-VL1結合特異性)及針對CD19之第二結合特異性(例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK。 兩個或更多個抗體分子(例如如本文所述)可連接提供多特異性抗體分子，例如雙特異性、三特異性或更多特異性抗體分子。 在一些實施例中，上述多特異性(例如雙特異性)抗體分子中之任一者存在於如本文所述之CAR分子中。在實施例中，CAR分子包含包括第一及第二結合特異性、例如如本文所述(例如兩個抗體分子，例如兩個如本文所述之scFv)之雙特異性CAR。在一些實施例中，雙特異性CAR包含兩個抗體分子，其中第一結合特異性、例如第一抗體分子(例如第一抗原結合域，例如第一scFv)靠近跨膜域，在本文中亦稱為近端抗體分子(例如，近端抗原結合域)，且第二結合特異性、例如第二抗體分子(例如第二抗原結合域，例如第二scFv)遠離膜，在本文中亦稱為遠端抗體分子(例如，遠端抗原結合域)。因此，自N末端至C末端，CAR分子包含遠端結合特異性、例如遠端抗體分子(例如遠端抗原結合域，例如遠端scFv或scFv2)，視情況連接體，其後為近端結合特異性、例如近端抗體分子(例如近端抗原結合域，例如近端scFv或scFv1)，視情況經由連接體，至跨膜域及細胞內域，例如如本文所述。雙特異性CAR構形之示意圖繪示於圖27中。 在一些實施例中，CAR分子包含包括第一及第二結合特異性之雙特異性CAR。在一些實施例中，雙特異性CAR包含針對B細胞表位之第一結合特異性及針對相同或不同B細胞抗原之第二結合特異性。例如，在一些實施例中，雙特異性CAR分子具有針對CD19之第一結合特異性及針對CD19、CD22、CD10、CD20、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中之一或多者之第二結合特異性。在一些實施例中，雙特異性CAR分子具有針對CD19之第一結合特異性及針對CD20之第二結合特異性。在一些實施例中，雙特異性CAR分子具有針對CD19之第一結合特異性及針對CD22之第二結合特異性。 在一些實施例中，CAR分子包含針對CD20之近端或遠端結合特異性，例如如本文所述之CD20結合特異性。 在一些實施例中，CAR分子包含針對CD22之近端或遠端結合特異性，例如如本文所述之CD22結合特異性。 在一個實施例中，CAR分子包含針對CD19之膜遠端結合特異性(例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性)及針對CD22之膜近端結合特異性(例如針對CD22之VL2-VH2或VH2-VL1結合特異性)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK。在一個實施例中，CAR分子包含針對CD19之膜遠端結合特異性，例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性，視情況Gly4 -Ser連接體或LAEAAAK連接體。在實施例中，CD22結合特異性包含CD22 VH及VL，其中VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser，例如如在CD22-65s scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3，例如如在CD22-65 scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接，例如如在CD22-65ss scFv中。 在一個實施例中，CAR分子包含針對CD19之膜近端結合特異性(例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性)及針對CD22之膜遠端結合特異性(例如針對CD22之VL2-VH2或VH2-VL1結合特異性)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK。在一個實施例中，CAR分子包含針對CD19之膜近端結合特異性，例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性，視情況Gly4 -Ser連接體或LAEAAAK連接體。在實施例中，CD22結合特異性包含CD22 VH及VL，其中VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser，例如如在CD22-65s scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3，例如如在CD22-65 scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接，例如如在CD22-65ss scFv中。 在一些實施例中，CAR分子包含針對CD20之近端或遠端結合特異性，例如如本文所述之CD20結合特異性。 在一個實施例中，CAR分子包含針對CD19之膜遠端結合特異性(例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性)及針對CD20之膜近端結合特異性(例如針對CD20之VL2-VH2或VH2-VL1結合特異性)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK。 在一些實施例中，CAR分子包含針對CD20之近端或遠端結合特異性，例如如本文所述之CD20結合特異性。在一個實施例中，CAR分子包含針對CD19之膜近端結合特異性(例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性)及針對CD20之膜遠端結合特異性(例如針對CD20之VL2-VH2或VH2-VL1結合特異性)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK。在一些實施例中，連接體係由胺基酸序列：LAEAAAK組成。 在一些實施例中，CAR分子進一步包含人類前導序列，例如N末端之人類CD8α序列。 在一些實施例中，多特異性抗體分子包含SEQ ID NO: 845、847、849、851、853、855、857、858、860、862、864、866、868、870、872或874中任一者之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，與其至少85%、90%、95%、98%、99%或更大一致)之序列。 在一些實施例中，多特異性抗體分子係由SEQ ID NO: 845、847、849、851、853、855、857、858、860、862、864、866、868、870、872或874中任一者之胺基酸序列或與其實質上一致(例如，與其至少85%、90%、95%、98%、99%或更大一致)之序列組成。 本發明亦係關於包含前述態樣或實施例中之任一者之核酸分子、載體、細胞及用途。載體 在另一態樣中，本發明係關於包含本文所述之任一核酸分子(例如編碼本文所述CAR之核酸分子)之載體。在一個實施例中，載體選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體或逆轉錄病毒載體。 在一個實施例中，載體係慢病毒載體。在一個實施例中，載體進一步包含啟動子。在一個實施例中，啟動子係EF-1α啟動子。在一個實施例中，EF-1α啟動子包含SEQ ID NO: 833之序列。 在一個實施例中，載體係活體外轉錄之載體，例如轉錄本文所述核酸分子之RNA之載體。在一個實施例中，載體中之核酸序列進一步包含聚(A)尾，例如本文所述之聚A尾，例如包含約150個腺苷鹼基。在一個實施例中，載體中之核酸序列進一步包含3’UTR，例如本文所述之3’ UTR，例如包含源自人類β-球蛋白之3’UTR之至少一個重複。在一個實施例中，載體中之核酸序列進一步包含啟動子，例如T2A啟動子。CAR 組合 在另一態樣中，本發明之特徵在於編碼以下各項之核酸：(i) CD20 CAR分子(例如如本文所述)，及(ii) 結合B細胞抗原(例如CD19、CD22、CD10、CD34、CD123、FLT-3、ROR-1、CD79b、CD79a或CD179b)之CAR分子。 在另一態樣中，本發明之特徵在於編碼以下各項之核酸：(i) 編碼CD20 CAR分子(例如如本文所述)之第一核酸，及(ii) 編碼結合B細胞抗原(例如CD19、CD22、CD10、CD34、CD123、FLT-3、ROR-1、CD79b、CD79a或CD179b)之CAR分子之第二核酸。 在一些實施例中，CAR分子結合B細胞抗原，該抗原係CD19或CD22。 在一些實施例中，CAR結合至CD19且包含編碼表11之CD19 CAR (例如CTL-019或人類化CAR2)之核苷酸序列。 在一些實施例中，CAR結合至CD22且包含編碼表6之CD22 CAR (例如CD22-65 CAR、CD22-65KD CAR、CD22-65s CAR或CD22-65ss CAR)之核苷酸序列。 在一些實施例中，編碼可裂解肽之核苷酸序列(例如P2A或F2A序列)置於編碼CD20 CAR之核酸分子與編碼結合B細胞抗原之CAR之核酸分子之間。 在一些實施例中，CD20 CAR及結合B細胞抗原之CAR係由單一啟動子例如以雙順反子轉錄產物形式編碼。 在一些實施例中，單一啟動子係EF-1α啟動子，視情況其中EF-1α啟動子包含SEQ ID NO: 833之序列。 在一些實施例中，CD20 CAR係由第一啟動子編碼且結合B細胞抗原之CAR係由第二啟動子編碼。 在一些實施例中，核酸包含RNA或DNA。 在另一態樣中，本發明係關於由如本文所述之任一核酸分子編碼或包含其之多肽分子。細胞 在另一態樣中，本發明係關於包含本文所述之核酸、經分離多肽或載體之細胞，例如免疫效應細胞群體。在一個實施例中，細胞係本文所述之細胞，例如人類T細胞或人類NK細胞，例如本文所述之人類T細胞。在一個實施例中，人類T細胞係CD8+ T細胞。 在另一態樣中，本發明係關於細胞、例如免疫效應細胞群體(例如，第一及/或第二免疫效應細胞群體)，包括：(i) 包含本文所述之核酸、經分離多肽分子或載體之第一細胞群體。 在一些實施例中，結合B細胞抗原之CAR係CD19或CD22。 在一個實施例中，CAR結合至CD19且包含編碼表11之CD19 CAR (例如CTL-019或人類化CAR2)之核苷酸序列。 在一個實施例中，CAR結合至CD22且包含編碼表6之CD22 CAR (例如CD22-65 CAR、CD22-65KD CAR、CD22-65s CAR或CD22-65ss CAR)之核苷酸序列。 在另一實施例中，本文所述之CAR表現細胞可進一步表現另一藥劑，例如增強CAR表現細胞之活性之藥劑。舉例而言，在一個實施例中，藥劑可為抑制抑制性分子之藥劑。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFβ。在一個實施例中，抑制抑制性分子之藥劑包含第一多肽(例如抑制性分子)與向細胞提供正信號之第二多肽(例如，本文所述之細胞內信號傳導域)締合。在一個實施例中，藥劑包含例如抑制性分子(例如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFβ)或該等分子中任一者之片段(例如，該等分子中任一者之細胞外域之至少一部分)的第一多肽，及為本文所述之細胞內信號傳導域(例如，包含共刺激域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文所述)及/或初級信號傳導域(例如，本文所述之CD3ζ信號傳導域)的第二多肽。在一個實施例中，藥劑包含PD1或其片段(例如，PD1之細胞外域之至少一部分)之第一多肽，及本文所述之細胞內信號傳導域(例如，本文所述之CD28信號傳導域及/或本文所述之CD3ζ信號傳導域)之第二多肽。製備方法及用途 在另一態樣中，本發明係關於製備細胞之方法，其包含用包含編碼CAR (例如本文所述之CAR)之核酸之載體轉導本文所述之細胞，例如本文所述之T細胞或NK細胞。 本發明亦提供產生瞬時表現外源RNA之RNA改造細胞(例如本文所述之細胞，例如T細胞或NK細胞)群體的方法。該方法包含將活體外轉錄之RNA或合成RNA引入細胞中，其中RNA包含編碼本文所述CAR分子之核酸。 在另一態樣中，本發明係關於提供哺乳動物中之抗腫瘤免疫性之方法，其包含向哺乳動物投與有效量之表現CAR分子之細胞，例如表現本文所述之CAR分子(例如CD20 CAR分子)之細胞。在一個實施例中，細胞係自體T細胞或NK細胞。在一個實施例中，細胞係同種異體T細胞或NK細胞。在一個實施例中，哺乳動物係人類。 在另一態樣中，本發明係關於包括(例如表現)如本文所述之CAR分子(例如CD20 CAR分子)之細胞(例如免疫效應細胞群體)，其用於提供哺乳動物中之抗腫瘤免疫性之方法中，其中該方法包括向哺乳動物投與有效量之細胞。 在另一態樣中，本發明係關於治療患有與如本文所述之B細胞抗原(例如CD20、CD19或CD22，例如野生型或突變體CD20、CD19或CD22)之表現相關之癌症或疾病(例如，增生性疾病、癌前病況及與CD20、CD19或CD22之表現相關之非癌症相關適應症)之哺乳動物的方法，其包含向哺乳動物投與有效量之表現CAR分子(例如本文所述之CAR分子，例如CD20 CAR分子)之細胞。在一些實施例中，經改造以表現CD20 CAR之CD20 CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞)例如係併與一或多種B細胞抑制劑組合投與來治療與CD20之表現相關之疾病。舉例而言，CD20 CAR表現細胞係併與一或多種其他B細胞抑制劑組合投與。在一些實施例中，B細胞抑制劑係第二CD20抑制劑。在一些實施例中，B細胞抑制劑係CD19、CD22、CD20、CD10、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中一或多者之抑制劑。 在另一態樣中，本發明係關於表現如本文所述之CAR分子(例如CD20 CAR分子)之細胞(例如免疫效應細胞群體)，其用於治療患有與CD20、CD19或CD22之表現相關之癌症或疾病的哺乳動物之方法中，其中該方法包括向哺乳動物投與有效量之細胞。在一些實施例中，經改造以表現CD20 CAR之CD20細胞(例如T細胞或NK細胞)例如係併與一或多種B細胞抑制劑組合投與來治療與CD20之表現相關之疾病。舉例而言，CD20 CAR表現細胞係併與一或多種其他B細胞抑制劑組合投與。在一些實施例中，B細胞抑制劑係第二CD20抑制劑。在一些實施例中，B細胞抑制劑係CD19、CD22、CD20、CD10、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中一或多者之抑制劑。 在一個實施例中，與CD20、CD19或CD22表現相關之疾病選自增生性疾病(例如癌症或惡性病)或癌前病況(例如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期)，或係與CD20、CD19或CD22之表現相關之非癌症相關適應症。 在一個實施例中，與CD20、CD19或CD22相關之癌症或疾病係血液癌症。舉例而言，血液癌症係白血病或淋巴瘤。在另一實例中，血液癌症選自一或多種急性白血病，包括(但不限於) B細胞急性淋巴球性白血病(BALL)、T細胞急性淋巴球性白血病(TALL)、小淋巴球性白血病(SLL)、急性淋巴球性白血病(ALL)；一或多種慢性白血病，包括(但不限於)慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)；其他血液癌症或血液病況，包括(但不限於)外套細胞淋巴瘤(MCL)、B細胞前淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤、柏基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴球增生性病況、MALT淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞贅瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症。在一些實施例中，疾病係「白血病前期」，其係因骨髓性血球之無效產生(或發育不良)而集合在一起之血液病況的不同集合。 在一些實施例中，與CD20、CD19或CD22表現相關之癌症或疾病包括(但不限於)表現CD20、CD19或CD22之非典型及/或非古典癌症、惡性病、癌前病況或增生性疾病；及其任何組合。 在一些實施例中，癌症或CD20、CD19或CD22相關疾病係B細胞惡性病，例如非霍奇金氏淋巴瘤，例如DLBCL、濾泡性淋巴瘤或CLL。 在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之細胞係併與增加表現CAR分子之細胞之效能的藥劑(例如，本文所述之藥劑)組合投與。在實施例中，藥劑係mTOR抑制劑，例如如本文所述之mTOR抑制劑。 在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之細胞係併與改善一或多種與投與表現CAR分子之細胞相關的副作用之藥劑(例如，本文所述之藥劑)組合投與。 在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之細胞係併與治療與CD20相關之疾病之藥劑(例如，本文所述之藥劑)組合投與。 在另一態樣中，本發明係關於編碼本發明CAR之經分離核酸分子、本發明CAR之經分離多肽分子、包含本發明CAR之載體、包含本發明CAR之細胞(或細胞群體)，其用作藥劑，例如如本文所述。 在另一態樣中，本發明係關於編碼本發明CAR之經分離核酸分子、本發明CAR之經分離多肽分子、包含本發明CAR之載體、包含本發明CAR之細胞(或細胞群體)，其用於治療表現CD20、CD19或CD22之疾病，例如如本文所述表現CD20、CD19或CD22之疾病。 在另一態樣中，本發明係關於經改造以表現CD20 CAR之細胞(例如T細胞或NK細胞)例如併與一或多種B細胞抑制劑組合治療與CD20之表現相關之疾病的方法或用途。舉例而言，CD20 CAR表現細胞係併與一或多種其他B細胞抑制劑組合投與。在一些實施例中，B細胞抑制劑係第二CD20抑制劑。在一些實施例中，B細胞抑制劑係CD19、CD22、CD20、CD10、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中一或多者之抑制劑。 在一些實施例中，B細胞抑制劑係小分子抑制劑；結合至B細胞抗原(例如，CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中之一或多者)之多肽，例如可溶性配體、抗體或其抗原結合片段；或抑制性核酸(例如，雙鏈RNA (dsRNA)、小干擾RNA (siRNA)或短髮夾RNA (shRNA))。在一些實施例中，B細胞抑制劑係表現結合至B細胞抗原(例如，CD19、CD22、CD20、CD10、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)之CAR之細胞(例如，CAR表現免疫效應細胞)。 在一些實施例中，B細胞抑制劑係在包括CD20 CAR分子之細胞(例如免疫效應細胞群體)之前投與。 在一些實施例中，B細胞抑制劑係與包括CD20 CAR分子之細胞(例如免疫效應細胞群體)同步投與。 在一些實施例中，B細胞抑制劑係在包括CD20 CAR分子之細胞(例如免疫效應細胞群體)之後投與。 在一些實施例中，CD20 CAR表現細胞係與第二CD20抑制劑一起投與。第二CD20抑制劑可為例如小分子、抗體或其片段(例如，單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至CD20之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現CD20 CAR之細胞，例如CD20 CAR表現T細胞或NK細胞。在一個實施例中，第二CD20抑制劑係第二抗CD20 CAR表現細胞，例如CD20 CART或CD20 CAR表現NK細胞。實例性CD20抑制劑更詳細闡述於下文中。 在實施例中，本發明提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現一種以上CD20 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括表現第一CD20 CAR之第一細胞及表現不同第二CD20 CAR之第二細胞。 在某些實施例中，CD20 CAR表現細胞係與CD22抑制劑一起投與。CD22抑制劑可為例如小分子、抗體或其片段(例如，單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至CD22之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現CD22 CAR之細胞，例如CD22 CAR表現T細胞或NK細胞。在一個實施例中，CD22抑制劑係抗CD22 CAR表現細胞，例如CD22 CART或CD22 CAR表現NK細胞。實例性CD22抑制劑更詳細闡述於下文中，例如表6中。 在實施例中，本發明提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及CD22 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD22 CAR之第二細胞。 在一些實施例中，CD20 CAR表現細胞係與CD19抑制劑一起投與。CD19抑制劑可為例如小分子、抗體或其片段(例如，單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至CD19之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現CD19 CAR之細胞，例如CD19 CAR表現T細胞或NK細胞。在一個實施例中，CD19抑制劑係抗CD19 CAR表現細胞，例如CD19 CART或CD19 CAR表現NK細胞。實例性CD19抑制劑更詳細闡述於下文中，例如表11中。 在一個實施例中，本發明提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及CD19 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD19 CAR之第二細胞。 在某些實施例中，CD20 CAR表現細胞係與ROR1抑制劑一起投與。ROR1抑制劑可為例如小分子、抗體或其片段(例如，單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至ROR1之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現ROR1 CAR之細胞，例如ROR1 CAR表現T細胞或NK細胞。在一個實施例中，ROR1抑制劑係抗ROR1表現細胞，例如ROR1 CART或ROR1表現NK細胞。實例性ROR1抑制劑更詳細闡述於下文中。 在一個實施例中，本發明提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及ROR1 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現ROR1 CAR之第二細胞。 在一些實施例中，CD20 CAR表現細胞係與CD123抑制劑一起投與。CD123抑制劑可為例如小分子、抗體或其片段(例如，單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至CD123之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現CD123 CAR之細胞，例如CD123 CAR表現T細胞或NK細胞。在一個實施例中，CD123抑制劑係抗CD123 CAR表現細胞，例如CD123 CART或CD123 CAR表現NK細胞。實例性CD123抑制劑更詳細闡述於下文中。 在一個實施例中，本發明提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及CD123 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD123 CAR之第二細胞。 在某些實施例中，CD20 CAR表現細胞係與CD10抑制劑一起投與。CD10抑制劑可為例如小分子、抗體或其片段(例如，單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至CD10之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現CD10 CAR之細胞，例如CD10 CAR表現T細胞或NK細胞。在一個實施例中，CD10抑制劑係抗CD10 CAR表現細胞，例如CD10 CART或CD10 CAR表現NK細胞。實例性CD10抑制劑更詳細闡述於下文中。 在一個實施例中，本發明提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及CD10 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD10 CAR之第二細胞。 在某些實施例中，CD20 CAR表現細胞係與CD34抑制劑一起投與。CD34抑制劑可為例如小分子、抗體或其片段(例如，單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至CD34之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現CD34 CAR之細胞，例如CD34 CAR表現T細胞或NK細胞。在一個實施例中，CD34抑制劑係抗CD34 CAR表現細胞，例如CD34 CART或CD34 CAR表現NK細胞。實例性CD34抑制劑更詳細闡述於下文中。 在一個實施例中，本發明提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及CD34 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD34 CAR之第二細胞。 在某些實施例中，CD20 CAR表現細胞係與FLT-3抑制劑一起投與。FLT-3抑制劑可為例如小分子、抗體或其片段(例如，單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至FLT-3之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現FLT-3 CAR之細胞，例如FLT-3 CAR表現T細胞或NK細胞。在一個實施例中，FLT-3抑制劑係抗FLT-3 CAR表現細胞，例如FLT-3 CART或FLT-3 CAR表現NK細胞。實例性FLT-3抑制劑更詳細闡述於下文中。 在一個實施例中，本發明提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及FLT-3 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現FLT-3 CAR之第二細胞。 在某些實施例中，CD20 CAR表現細胞係與CD79b抑制劑一起投與。CD79b抑制劑可為例如小分子、抗體或其片段(例如，單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至CD79b之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現CD79b CAR之細胞，例如CD79b CAR表現T細胞或NK細胞。在一個實施例中，CD79b抑制劑係抗CD79b CAR表現細胞，例如CD79b CART或CD79b CAR表現NK細胞。實例性CD79b抑制劑更詳細闡述於下文中。 在實施例中，本發明提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及CD79b CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD79b CAR之第二細胞。 在某些實施例中，CD20 CAR表現細胞係與CD179b抑制劑一起投與。CD179b抑制劑可為例如小分子、抗體或其片段(例如，單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至CD179b之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現CD179b CAR之細胞，例如CD179b CAR表現T細胞或NK細胞。在一個實施例中，CD79b抑制劑係抗CD179b CAR表現細胞，例如CD179b CART或CD179b CAR表現NK細胞。實例性CD179b抑制劑更詳細闡述於下文中。 在實施例中，本發明提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及CD179b CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD179b CAR之第二細胞。 在某些實施例中，CD20 CAR表現細胞係與CD79a抑制劑一起投與。CD79a抑制劑可為例如小分子、抗體或其片段(例如，單特異性或雙特異性抗體或其片段)；結合至CD79a之重組蛋白，例如融合蛋白；抑制性核酸；或表現CD79a CAR之細胞，例如CD79a CAR表現T細胞或NK細胞。在一個實施例中，CD79a抑制劑係抗CD79a CAR表現細胞，例如CD79a CART或CD79a CAR表現NK細胞。實例性CD79a抑制劑更詳細闡述於下文中。 在實施例中，本發明提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及CD79a CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD79a CAR之第二細胞。 在一個態樣中，CAR (例如，CD19 CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR、FLT-3 CAR、CD79b CAR、CD179b CAR或CD79a CAR)包含可選前導序列(例如，本文所述之可選前導序列)、細胞外抗原結合域、鉸鏈(例如，本文所述之鉸鏈)、跨膜域(例如，本文所述之跨膜域)及細胞內刺激域(例如，本文所述之細胞內刺激域)。在一個態樣中，實例性CAR構築體包含可選前導序列(例如，本文所述之前導序列)、細胞外抗原結合域、鉸鏈、跨膜域、細胞內共刺激域(例如，細胞內本文所述之共刺激域)及細胞內刺激域。 在實施例中，本文提供治療為CD19抑制劑(例如CD19 CAR療法)之不反應者、部分反應者或復發者之患者的方法，其包含向患者投與CD20之抑制劑。 在一些實施例中，本文提供CD20之抑制劑用於治療為CD19抑制劑(例如CD19 CAR療法)之不反應者、部分反應者或復發者之患者的方法中，該方法包括向患者投與CD20之抑制劑。 在實施例中，患者包含CD19陰性癌細胞及CD20陽性癌細胞。在實施例中，該方法進一步包含確定患者是否包含CD19陰性癌細胞之步驟。在一些實施例中，該方法進一步包含確定患者是否包含CD20陽性癌細胞之步驟。 除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所理解之含義相同的含義。儘管本發明之實踐或測試中可使用類似或等效於本文所述之方法及材料之方法及材料，但下文闡述適宜方法及材料。本文所提及之所有出版物、專利申請案、專利及其他參考文獻係全文以引用方式併入本文中。另外，材料、方法及實例僅為說明性且不欲具有限制性。標題、子標題或經編號或有字母之元件(例如，(a)、(b)、(i)等)僅為便於閱讀而呈現。在此文件中使用標題或經編號或有字母之元件無需以字母順序實施步驟或元件或該等步驟或元件不必彼此離散。根據本描述及圖式以及申請專利範圍，將明瞭本發明之其他特徵、目標及優點。
相關申請案 本申請案主張於2016年10月7日提出申請之美國臨時申請案第62/405,520號之優先權，該申請案之全部內容以引用方式併入本文中。序列表 本案含有序列表，其已以ASCII格式電子提交，且其全文以引用方式併入本文中。該ASCII拷貝創建於2017年10月4日，命名為N2067-7121WO_SL.txt且大小為1,118,768個位元組。 定義 除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所理解之含義相同的含義。 術語「一(a及an)」係指一個或一個以上(即，至少一個)的冠詞之文法受詞。舉例而言，「一個元件」意指一個元件或一個以上之元件。 術語「約」在提及諸如量、時間長度及諸如此類等可量測值時意欲涵蓋自指定值±20%、或在一些情況下±10%、或在一些情況下±5%、或在一些情況下±1%、或在一些情況下±0.1%的變化，只要該等變化適於實施所揭示之方法即可。 如本文所用之術語「醫藥上可接受之鹽」係指在合理醫學判斷範圍內適於與個體之組織接觸使用而無過度毒性、刺激、過敏反應及諸如此類、且與合理益處/風險比相稱之彼等鹽。醫藥上可接受之鹽為業內所熟知。舉例而言，Berge等人在J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19中詳細闡述醫藥上可接受之鹽。 術語「抑制」或「抑制劑」包括給定分子(例如CD20、CD10、CD19、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)之某一參數(例如活性)減小。舉例而言，此術語包括使活性(例如CD20、CD10、CD19、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a之活性)抑制至少5%、10%、20%、30%、40%或更大。因此，抑制無需為100%。抑制劑之活性可如本文所述或藉由業內已知之分析來測定。 術語「嵌合抗原受體」或或者「CAR」係指多肽之集合，在最簡單實施例中通常為兩種多肽之集合，其在免疫效應細胞中時向該細胞提供針對靶細胞(通常為癌細胞)之特異性及細胞內信號產生。在一些實施例中，CAR包含至少細胞外抗原結合域、跨膜域及包括源自如下文所定義之刺激分子及/或共刺激分子之功能性信號傳導域之細胞質信號傳導域(在本文中亦稱為「細胞內信號傳導域」)。在一些態樣中，多肽之集合彼此鄰接，例如在同一多肽鏈中，例如包含嵌合融合蛋白。在一些實施例中，多肽之集合並不彼此鄰接，例如在不同多肽鏈中。在一些實施例中，多肽之集合包括在二聚化分子存在時可使多肽彼此偶合(例如，可使抗原結合域偶合至細胞內信號傳導域)之二聚化開關。在一個態樣中，刺激分子係與T細胞受體複合物締合之ζ鏈。在一個態樣中，細胞質信號傳導域進一步包含一或多個源自至少一個如下文所定義之共刺激分子之功能性信號傳導域。在一個態樣中，共刺激分子選自本文所述之共刺激分子，例如4-1BB (即，CD137)、CD27及/或CD28 (圖10A及表14)。在一個態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含細胞外抗原結合域、跨膜域及包括源自刺激分子之功能性信號傳導域之細胞內信號傳導域。在一個態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含細胞外抗原結合域、跨膜域及包括源自共刺激分子之功能性信號傳導域及源自刺激分子之功能性信號傳導域之細胞內信號傳導域。在一個態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含細胞外抗原結合域、跨膜域及包括兩個源自一或多個共刺激分子之功能性信號傳導域及源自刺激分子之功能性信號傳導域的細胞內信號傳導域。在一個態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含細胞外抗原結合域、跨膜域及包括至少兩個源自一或多個共刺激分子之功能性信號傳導域及源自刺激分子之功能性信號傳導域的細胞內信號傳導域。在一個態樣中，CAR包含處於CAR融合蛋白之胺基末端(N-ter)之可選前導序列(圖10B及表14)。在一個態樣中，CAR進一步包含處於細胞外抗原結合域之N末端之前導序列，其中前導序列在細胞處理及CAR針對細胞膜定位期間視情況自抗原結合域(例如，scFv)裂解。 術語「信號傳導域」係指蛋白質之藉由在細胞內傳送資訊經由所定義信號傳導途徑藉由產生第二信使或藉由因應該等信使發揮效應物作用來起調控細胞活性作用的功能部分。 如本文所用之術語「CD20」係指已知可在B細胞上檢測到之抗原決定子。人類CD20亦稱為跨膜4域子家族A成員1 (MS4A1)。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如基因庫、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類CD20之胺基酸序列可參見登錄號NP_690605.1及NP_068769.2，且編碼人類CD20之轉錄本變體1及3之核酸序列可分別參見登錄號NM_152866.2及NM_021950.3。在一個態樣中，CAR之抗原結合部分識別並結合CD20蛋白之細胞外域內之抗原。在一個態樣中，CD20蛋白在癌細胞上表現。如本文所用之「CD20」包括包含全長野生型CD20之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變體之蛋白質。 如本文所用之術語「ROR1」係指已知可在白血病前體細胞上檢測到之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如基因庫、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類ROR1之同種型1及2前體之胺基酸序列可分別參見登錄號NP_005003.2及NP_001077061.1，且編碼其之mRNA序列可分別參見登錄號NM_005012.3及NM_001083592.1。在一個態樣中，CAR之抗原結合部分識別並結合ROR1蛋白之細胞外域內之抗原。在一個態樣中，ROR1蛋白在癌細胞上表現。如本文所用之「ROR1」包括包含全長野生型ROR1之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變體之蛋白質。 如本文所用之術語「CD19」係指分化簇19蛋白，其係可在白血病前體細胞上檢測到之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如基因庫、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類CD19之胺基酸序列可參見UniProt/Swiss-Prot登錄號P15391，且人類CD19之核酸序列編碼可參見登錄號NM_001178098。CD19在大多數B譜系癌症上表現，包括例如急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴球白血病及非霍奇金氏淋巴瘤。表現CD19之其他細胞提供於下文「與CD19之表現相關之疾病」之定義中。其亦係B細胞祖細胞之早期標記物。參見例如Nicholson等人，Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)。在一個態樣中，CART之抗原結合部分識別並結合CD19蛋白之細胞外域內之抗原。在一個態樣中，CD19蛋白在癌細胞上表現。如本文所用之「CD19」包括包含全長野生型CD19之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變體之蛋白質。 如本文所用之術語「CD22」係指已知可在白血病前體細胞上檢測到之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如基因庫、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類CD22之異型1-5之胺基酸序列可分別參見登錄號NP 001762.2、NP 001172028.1、NP 001172029.1、NP 001172030.1及NP 001265346.1，且編碼人類CD22之變體1-5之核酸序列可分別參見登錄號NM 001771.3、NM 001185099.1、NM 001185100.1、NM 001185101.1及NM 001278417.1。在一個態樣中，CAR之抗原結合部分識別並結合CD22蛋白之細胞外域內之抗原。在一個態樣中，CD22蛋白在癌細胞上表現。如本文所用之「CD22」包括包含全長野生型CD22之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變體之蛋白質。 如本文所用之術語「CD123」係指已知可在一些惡性血液癌症細胞(例如白血病細胞)上檢測到之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如基因庫、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類CD123之胺基酸序列可參見登錄號NP_002174.1 (同種型1前體)；NP_001254642.1 (同種型2前體)，且編碼其之mRNA序列可參見登錄號NM_002183.3 (變體1)；NM_001267713.1 (變體2)。在一個態樣中，CAR之抗原結合部分識別並結合CD123蛋白之細胞外域內之抗原。在一個態樣中，CD123蛋白在癌細胞上表現。如本文所用之「CD123」包括包含全長野生型CD123之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變體之蛋白質。 如本文所用之術語「CD10」係指已知可在白血病細胞上檢測到之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如基因庫、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類CD10之胺基酸序列可參見登錄號NP_009218.2；NP_000893.2；NP_009219.2；NP_009220.2，且編碼其之mRNA序列可參見登錄號NM_007287.2 (變體1bis)；NM_000902.3 (變體1)；NM_007288.2 (變體2a)；NM_007289.2 (變體2b)。在一個態樣中，CAR之抗原結合部分識別並結合CD10蛋白之細胞外域內之抗原。在一個態樣中，CD10蛋白在癌細胞上表現。如本文所用之「CD10」包括包含全長野生型CD10之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變體之蛋白質。 如本文所用之術語「CD34」係指已知可在造血幹細胞及一些癌細胞上檢測到之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如基因庫、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類CD34之胺基酸序列可參見登錄號NP_001020280.1 (同種型a前體)；NP_001764.1 (同種型b前體)，且編碼其之mRNA序列可參見登錄號NM_001025109.1 (變體1)；NM_001773.2 (變體2)。在一個態樣中，CAR之抗原結合部分識別並結合CD34蛋白之細胞外域內之抗原。在一個態樣中，CD34蛋白在癌細胞上表現。如本文所用之「CD34」包括包含全長野生型CD34之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變體之蛋白質。 如本文所用之術語「FLT-3」係指已知可在造血祖細胞及一些癌細胞(例如白血病細胞)上檢測到之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如基因庫、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類FLT-3之胺基酸序列可參見登錄號NP_004110.2，且編碼其之mRNA序列可參見登錄號NM_004119.2。在一個態樣中，CAR之抗原結合部分識別並結合FLT-3蛋白之細胞外域內之抗原。在一個態樣中，FLT-3蛋白在癌細胞上表現。如本文所用之「FLT-3」包括包含全長野生型FLT-3之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變體之蛋白質。 如本文所用之術語「CD79b」係指已知可在一些惡性血液癌症細胞(例如白血病細胞)上檢測到之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如基因庫、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類CD79b之胺基酸序列可參見登錄號NP_000617.1 (同種型1前體)、NP_067613.1 (同種型2前體)或NP_001035022.1 (同種型3前體)，且編碼其之mRNA序列可參見登錄號NM_000626.2 (轉錄本變體1)、NM_021602.2 (轉錄本變體2)或NM_001039933.1 (轉錄本變體3)。在一個態樣中，CAR之抗原結合部分識別並結合CD79b蛋白之細胞外域內之抗原。在一個態樣中，CD79b蛋白在癌細胞上表現。如本文所用之「CD79b」包括包含全長野生型CD79b之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變體之蛋白質。 如本文所用之術語「CD79a」係指已知可在一些惡性血液癌症細胞(例如白血病細胞)上檢測到之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如基因庫、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類CD79a之胺基酸序列可參見登錄號NP_001774.1 (同種型1前體)或NP_067612.1 (同種型2前體)，且編碼其之mRNA序列可參見登錄號NM_001783.3 (轉錄本變體1)或NM_021601.3 (轉錄本變體2)。在一個態樣中，CAR之抗原結合部分識別並結合CD79a蛋白之細胞外域內之抗原。在一個態樣中，CD79a蛋白在癌細胞上表現。如本文所用之「CD79a」包括包含全長野生型CD79a之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變體之蛋白質。 如本文所用之術語「CD179b」係指已知可在一些惡性血液癌症細胞(例如白血病細胞)上檢測到之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如基因庫、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類CD179b之胺基酸序列可參見登錄號NP_064455.1 (同種型a前體)或NP_690594.1 (同種型b前體)，且編碼其之mRNA序列可參見登錄號NM_020070.3 (轉錄本變體1)或NM_152855.2 (轉錄本變體2)。在一個態樣中，CAR之抗原結合部分識別並結合CD179b蛋白之細胞外域內之抗原。在一個態樣中，CD179b蛋白在癌細胞上表現。如本文所用之「CD179b」包括包含全長野生型CD179b之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變體之蛋白質。 如本文所用之術語「結合域」 (例如，「CD20結合域」)係指蛋白質，例如包含至少一個免疫球蛋白可變域序列之免疫球蛋白鏈或其片段。術語「結合域」 (在本文中亦稱為「抗體分子」)涵蓋抗體及抗體片段。在實施例中，抗體分子係多特異性抗體分子，例如其包含複數個免疫球蛋白可變域序列，其中該複數個中第一免疫球蛋白可變域序列具有針對第一表位之結合特異性，且該複數個中第二免疫球蛋白可變域序列具有針對第二表位之結合特異性。在實施例中，多特異性抗體分子係雙特異性抗體分子。雙特異性抗體具有針對不超過兩種抗原之特異性。雙特異性抗體分子之特徵在於具有針對第一表位之結合特異性的第一免疫球蛋白可變域序列及具有針對第二表位之結合特異性的第二免疫球蛋白可變域序列。 術語「抗體片段」係指抗體之保留與(例如，藉由結合、位阻、穩定/去穩定、空間分佈)抗原之表位特異性相互作用能力之至少一部分。抗體片段之實例包括(但不限於) Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv片段、scFv抗體片段、二硫鍵連接之Fv (sdFv)、由VH及CH1域組成之Fd片段、直鏈抗體、單一域抗體(例如sdAb (VL或VH))、駱駝科動物VHH域、自抗體片段(例如包含在鉸鏈區由二硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段)形成之多特異性抗體及經分離CDR或抗體之其他表位結合片段。亦可將抗原結合片段納入單一域抗體、巨型抗體、微型抗體、奈米抗體、胞內抗體、二價抗體、三價抗體、四價抗體、v-NAR及雙-scFv中(參見例如Hollinger及Hudson，Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005)。亦可基於多肽(例如III型纖連蛋白(Fn3))將抗原結合片段移植至支架中(參見美國專利第6,703,199號，其闡述纖連蛋白多肽微型抗體)。術語「scFv」係指包含至少一個包含輕鏈可變區之抗體片段及至少一個包含重鏈可變區之抗體片段的融合蛋白，其中輕鏈及重鏈可變區例如經由合成連接體(例如，短撓性多肽連接體)以鄰接方式連接，且能夠表現為單鏈多肽，且其中scFv保留衍生出其之完整抗體之特異性。除非說明，否則如本文所用之scFv可具有例如相對於多肽之N末端及C末端呈任一順序之VL及VH可變區，scFv可包含VL-連接體-VH或可包含VH-連接體-VL。 如本文所用之術語「互補決定區」或「CDR」係指抗體可變區內賦予抗原特異性及結合親和力之胺基酸序列。給定CDR之精確胺基酸序列邊界可使用多個熟知方案中之任一者來確定，該等方案包括以下文獻中所述之彼等：Kabat等人(1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版，Public Health Service, 國立衛生研究院, Bethesda, MD (「Kabat」編號方案)；Al-Lazikani等人(1997) JMB 273, 927-948 (「Chothia」編號方案)；及ImMunoGenTics (IMGT)編號(Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)；Lefranc, M.-P.等人，Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) (「IMGT」編號方案)。舉例而言，對於古典格式，在Kabat下，重鏈可變域(VH)中之CDR胺基酸殘基編號為31-35 (HCDR1)、50-65 (HCDR2)及95-102 (HCDR3)；且輕鏈可變域(VL)中之CDR胺基酸殘基編號為24-34 (LCDR1)、50-56 (LCDR2)及89-97 (LCDR3)。在Chothia下，VH中之CDR胺基酸編號為26-32 (HCDR1)、52-56 (HCDR2)及95-102 (HCDR3)；且VL中之胺基酸殘基編號為26-32 (LCDR1)、50-52 (LCDR2)及91-96 (LCDR3)。藉由組合Kabat及Chothia二者之CDR定義，CDR係由人類VH中之胺基酸殘基26-35 (HCDR1)、50-65 (HCDR2)及95-102 (HCDR3)以及人類VL中之胺基酸殘基24-34 (LCDR1)、50-56 (LCDR2)及89-97 (LCDR3)組成。在IMGT下，VH中之CDR胺基酸殘基編號約為26-35 (CDR1)、51-57 (CDR2)及93-102 (CDR3)，且VL中之CDR胺基酸殘基編號約為27-32 (CDR1)、50-52 (CDR2)及89-97 (CDR3) (根據「IMGT」編號)。在IMGT下，抗體之CDR區域可利用程式IMGT/DomainGap Align來確定。 包含抗體或其抗體片段之本發明CAR部分可以多種形式存在，其中抗原結合域表現為連續多肽鏈之一部分，包括例如單一域抗體片段(sdAb)、單鏈抗體(scFv)、人類化抗體或雙特異性抗體(Harlow等人，1999，Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY；Harlow等人，1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York；Houston等人，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Bird等人，1988, Science 242:423-426)。在一個態樣中，本發明CAR組合物之抗原結合域包含抗體片段。在另一態樣中，CAR包含包括scFv之抗體片段。 術語「抗體重鏈」係指以其天然構象存在於抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較大者，且該抗體重鏈通常決定抗體所屬之類別。 術語「抗體輕鏈」係指以其天然構象存在於抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較小者。卡帕(κ)及蘭姆達(λ)輕鏈係指兩種主要的抗體輕鏈同型。 術語「重組抗體」係指利用重組DNA技術產生之抗體，例如由噬菌體或酵母表現系統表現之抗體。該術語亦應理解為意指已藉由合成編碼抗體之DNA分子產生且該DNA分子表現抗體蛋白或指定該抗體之胺基酸序列的抗體，其中DNA或胺基酸序列已利用業內可用且熟知之重組DNA或胺基酸序列技術獲得。 術語「抗原」或「Ag」係指引起免疫反應之分子。此免疫反應可涉及抗體產生或特異性免疫勝任細胞之活化或二者皆有。熟習此項技術者將理解，包括幾乎所有蛋白質或肽在內之任何大分子皆可用作抗原。此外，抗原可源自重組或基因體DNA。熟習此項技術者將理解，包含編碼引發免疫反應之蛋白質之核酸序列或部分核酸序列之任何DNA由此編碼「抗原」(在該術語用於本文中時)。此外，熟習此項技術者將理解，抗原無需僅由基因之全長核酸序列編碼。容易地明瞭，本發明包括(但不限於)一個以上基因之部分核酸序列之用途及該等核酸序列係以多種組合排列以編碼引發期望免疫反應之多肽。此外，熟習此項技術者將理解抗原完全不必由「基因」編碼。容易地明瞭，抗原可產生、合成或可源自生物樣品，或可為除多肽外之大分子。此一生物樣品可包括(但不限於)組織樣品、腫瘤樣品、細胞或含有其他生物組分之流體。 術語「抗癌效應」係指可以多種方式表現之生物效應，該等方式包括(但不限於)例如腫瘤體積減小、癌細胞數減少、轉移數減少、預期壽命增加、癌細胞增殖減少、癌細胞存活期縮短或與癌性病況相關之各種生理症狀之改善。「抗癌效應」亦可表現為本發明之肽、多核苷酸、細胞及抗體在第一時間預防癌症發生之能力。術語「抗腫瘤效應」係指可以多種方式表現之生物效應，該等方式包括(但不限於)例如腫瘤體積減小、腫瘤細胞數減少、腫瘤細胞增殖減少或腫瘤細胞存活期縮短。術語「自體」係指源自同一個體且後來再引入該個體中之任何材料。 術語「同種異體」係指源自與材料欲引入之個體同一物種之不同動物之任何材料。當一或多個基因座處之基因不同時，認為兩個或更多個個體互為同種異體。在一些態樣中，來自同一物種之個體之同種異體材料可在遺傳學上足夠不同以在抗原上相互作用。 術語「異種」係指源自不同物種之動物之移植物。 術語「組合」係指呈一種劑量單位形式之固定組合，或其中本發明化合物及組合伴侶(例如如下文所解釋之另一藥物，亦稱為「治療劑」或「助劑」)可在相同時間獨立投與或在時間間隔內單獨投與之組合投與，尤其其中該等時間間隔容許組合伴侶展示協作(例如協同)效應之組合投與。單一組分可包裝於套組中或單獨。一或兩種組分(例如，粉末或液體)在投與之前可經重構或稀釋至期望劑量。如本文所用之術語「共投與」或「組合投與」或諸如此類意欲涵蓋向有需要之單一個體(例如患者)投與所選組合物伴侶，且意欲包括其中不必藉由相同投與途徑或同時投與藥劑之治療方案。如本文所用之術語「醫藥組合」意指自混合或組合一種以上之治療劑產生且包括治療劑之固定及不固定組合二者之產品。術語「固定組合」意指將治療劑(例如，本發明化合物)及組合伴侶二者以單一實體或劑量形式同時投與患者。術語「不固定組合」意指將治療劑(例如本發明化合物)及組合伴侶二者作為各別實體同時、同步或依序且無具體時間限制地投與患者，其中此投與在患者體內提供兩種化合物之治療有效量。後者亦適用於混合物療法，例如投與3種或更多種治療劑。 術語「癌症」係指特徵在於異常細胞之快速且不受控生長之疾病。癌細胞可在局部擴散或通過血流及淋巴系統擴散至身體其他部分。多種癌症之實例闡述於本文中，且包括(但不限於)乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌及諸如此類。術語「腫瘤」及「癌症」在本文中可互換使用，例如兩個術語涵蓋實體及液體腫瘤。如本文所用之術語「癌症」或「腫瘤」包括癌前以及惡性癌症及腫瘤。 如本文所用之片語「與CD20之表現相關之疾病」包括(但不限於)與CD20 (例如，野生型或突變體CD20)之表現相關之疾病或與表現或在任何時間表現CD20 (例如，野生型或突變體CD20)之細胞相關之病況，包括例如增生性疾病(例如癌症或惡性病)或癌前病況(例如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期)；或與表現CD20 (例如，野生型或突變體CD20)之細胞相關之非癌症相關適應症。為免生疑問，與CD20之表現相關之疾病可包括與當前不表現CD20之細胞相關之病況，例如，此乃因CD20表現例如因使用靶向CD20 (例如本文所述之CD20抑制劑)、但不同時表現CD20之分子治療而下調。在一個態樣中，與CD20之表現相關之癌症係血液癌症。在一個態樣中，血液癌症包括(但不限於) AML、骨髓發育不良症候群、ALL、毛細胞白血病、前淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤及諸如此類。另外，與CD20之表現相關之疾病包括(但不限於)例如與CD20之表現相關之非典型及/或非古典癌症、惡性病、癌前病況或增生性疾病。亦可包括與CD20之表現相關之非癌症相關適應症。 片語「與CD19之表現相關之疾病」包括(但不限於)與CD19 (例如野生型或突變體CD19)之表現相關之疾病或與表現或在任何時間表現CD19 (例如野生型或突變體CD19)之細胞相關之病況，包括例如增生性疾病(例如癌症或惡性病)或癌前病況(例如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期)；或與表現CD19之細胞相關之非癌症相關適應症。為免生疑問，與CD19之表現相關之疾病可包括與當前不表現CD19之細胞相關之病況，例如，此乃因CD19表現例如因使用靶向CD19 (例如，CD19 CAR)、但不同時表現CD19之分子治療而下調。在一個態樣中，與CD19之表現相關之癌症係血液癌症。在一個態樣中，血液癌症係白血病或淋巴瘤。在一個態樣中，與CD19之表現相關之癌症包括癌症及惡性病，包括(但不限於)例如一或多種急性白血病，包括(但不限於)例如B細胞急性淋巴球性白血病(BALL)、T細胞急性淋巴球性白血病(TALL)、急性淋巴球性白血病(ALL)；一或多種慢性白血病，包括(但不限於)例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)。與CD19之表現相關之其他癌症或血液病況包含(但不限於)例如B細胞前淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤、柏基特氏淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、多毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴球增生性病況、MALT淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞贅瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症及「白血病前期」(其係因骨髓性血球之無效產生(或發育不良)而集合在一起之血液病況之不同集合)及諸如此類。另外，與CD19之表現相關之疾病包括(但不限於)例如與CD19之表現相關之非典型及/或非古典癌症、惡性病、癌前病況或增生性疾病。與CD19之表現相關之非癌症相關適應症包括(但不限於)例如自體免疫疾病(例如，狼瘡)、發炎性病症(過敏及氣喘)及移植。在一些實施例中，CD19表現細胞表現或在任何時間表現CD19 mRNA。在實施例中，CD19表現細胞產生CD19蛋白(例如，野生型或突變體)，且CD19蛋白可以正常含量或降低的含量存在。在實施例中，CD19表現細胞在一點處產生可檢測含量之CD19蛋白，且隨後產生實質上無法檢測之CD19蛋白。 術語「保守序列修飾」係指不顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體或抗體片段之結合特徵的胺基酸修飾。該等保守修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。可藉由業內已知之標準技術(例如定點誘變及PCR介導之誘變)將修飾引入本發明之抗體或抗體片段中。保守胺基酸取代係其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基替代者。業內已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β分枝側鏈之胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，本發明CAR內之一或多個胺基酸殘基可經來自同一側鏈家族之其他胺基酸殘基替代，且可利用本文所述之功能分析來測試經改變CAR。 術語「刺激」係指藉由刺激分子(例如，TCR/CD3複合物或CAR)與其同源配體(或在CAR情形下為腫瘤抗原)結合、由此調介信號轉導事件(例如但不限於經由TCR/CD3複合物之信號轉導或經由適宜NK受體或CAR之信號傳導域之信號轉導)引起的初級反應。刺激可調介某些分子之經改變表現。 術語「刺激分子」係指由提供細胞質信號傳導序列之免疫細胞(例如，T細胞、NK細胞或B細胞)表現之分子，該(等)細胞質信號傳導序列以刺激免疫細胞信號傳導路徑之至少一些態樣之方式來調控免疫細胞的活化。在一個態樣中，信號係藉由例如TCR/CD3複合物與負載有肽之MHC分子結合起始之初級信號，且此可調介T細胞反應，包括(但不限於)增殖、活化、分化及諸如此類。以刺激方式起作用之初級細胞質信號傳導序列(亦稱為「初級信號傳導域」)可含有信號傳導基序，其稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM。尤其用於本發明中之含有ITAM之細胞質信號傳導序列之實例包括(但不限於)源自以下各項之彼等：CD3ζ、共有FcRγ (FCER1G)、Fcγ RIIa、FcRβ (FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10及DAP12。在本發明之特定CAR中，本發明之任一或多個CARS中之細胞內信號傳導域包含細胞內信號傳導序列，例如CD3-ζ之初級信號傳導序列。在本發明之特定CAR中，CD3-ζ之初級信號傳導序列係以SEQ ID NO: 805提供之序列或來自非人類物種(例如，小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基。在本發明之特定CAR中，CD3-ζ之初級信號傳導序列係如SEQ ID NO: 807中所提供之序列或來自非人類物種(例如，小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基。 術語「抗原呈遞細胞」或「APC」係指在其表面上顯示與主要組織相容性複合物(MHC)複合之外源抗原之免疫系統細胞(例如輔助細胞，例如B細胞、樹突細胞及諸如此類)。T細胞可利用其T細胞受體(TCR)識別該等複合物。APC處理抗原且將其呈遞至T細胞。 在「免疫效應細胞」用於本文中時該術語係指參與免疫反應(例如，促進免疫效應物反應)之細胞。免疫效應細胞之實例包括T細胞(例如α/β T細胞及γ/δ T細胞)、B細胞、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T (NK-T)細胞、肥大細胞及骨髓源性吞噬細胞。 當「免疫效應物功能或免疫效應物反應」用於本文中時該術語係指例如免疫效應細胞之增強或促進靶細胞之免疫攻擊之功能或反應。例如，免疫效應物功能或反應係指T細胞或NK細胞之促進靶細胞之殺死或抑制其生長或增殖之性質。在T細胞之情形下，主要刺激及共刺激係免疫效應物功能或反應之實例。 在「細胞內信號傳導域」用於本文中時該術語係指分子之細胞內部分。細胞內信號傳導域產生促進含有CAR之細胞(例如，CART細胞或CAR表現NK細胞)之免疫效應物功能之信號。例如CART細胞或CAR表現NK細胞中免疫效應物功能之實例包括細胞溶解活性及輔助活性，包括分泌細胞介素。 在實施例中，細胞內信號傳導域可包含初級細胞內信號傳導域。實例性初級細胞內信號傳導域包括源自負責主要刺激或抗原依賴性刺激之分子之彼等。在實施例中，細胞內信號傳導域可包含共刺激細胞內域。實例性共刺激細胞內信號傳導域包括源自負責共刺激信號或非抗原依賴性刺激之分子之彼等。舉例而言，在CART之情形下，初級細胞內信號傳導域可包含T細胞受體之細胞質序列，且共刺激細胞內信號傳導域可包含來自共受體或共刺激分子之細胞質序列。 初級細胞內信號傳導域可包含信號傳導基序，稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM。含有ITAM之初級細胞質信號傳導序列之實例包括(但不限於)源自以下各項之彼等：CD3ζ、共有FcRγ (FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ (FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10及DAP12。 術語「ζ」或或者「ζ鏈」、「CD3-ζ」或「TCR-ζ」定義為以GenBan登錄號BAG36664.1提供之蛋白質或來自非人類物種(例如，小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基，且「ζ刺激域」或或者「CD3-ζ刺激域」或「TCR-ζ刺激域」定義為來自ζ鏈之細胞質域或其功能衍生物之足以發揮傳送T細胞活化所需之初始信號功能的胺基酸殘基。在一個態樣中，ζ之細胞質域包含基因庫登錄號BAG36664.1之殘基52至164或來自非人類物種(例如，小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之為其功能直向同源物之等效殘基。在一個態樣中，「ζ刺激域」或「CD3-ζ刺激域」係以SEQ ID NO: 805提供之序列。在一個態樣中，「ζ刺激域」或「CD3-ζ刺激域」係以SEQ ID NO: 807提供之序列。 術語「共刺激分子」係指在T細胞上與共刺激配體特異性結合、由此調介T細胞之共刺激反應(例如但不限於增殖)之同源結合伴侶。共刺激分子係有助於有效免疫反應之除抗原受體或其配體外之細胞表面分子。共刺激分子包括(但不限於) I類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、鐸配體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB (CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS5 (CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM (LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配體。 共刺激細胞內信號傳導域可係共刺激分子之細胞內部分。共刺激分子可表示於以下蛋白家族中：TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴球活化分子(SLAM蛋白)及活化NK細胞受體。該等分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CSD、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3及與CD83特異性結合之配體及諸如此類。 細胞內信號傳導域可包含衍生出其之分子之整個細胞內部分或整個天然細胞內信號傳導域或其功能片段或衍生物。 術語「4-1BB」係指具有以基因庫登錄號AAA62478.2提供之胺基酸序列或來自非人類物種(例如小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基的TNFR超家族之成員；且「4-1BB共刺激域」定義為基因庫登錄號AAA62478.2之胺基酸殘基214-255或來自非人類物種(例如小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基。在一個態樣中，「4-1BB共刺激域」係以SEQ ID NO: 803提供之序列或來自非人類物種(例如，小鼠、齧齒類動物、猴、人猿及諸如此類)之等效殘基。 術語「編碼」係指多核苷酸中核苷酸之特異性序列(例如基因、cDNA或mRNA)用作合成生物過程中具有所定義核苷酸序列(例如rRNA、tRNA及mRNA)或所定義胺基酸序列之其他聚合物及大分子的模板之固有性質及源自其之生物性質。因此，若對應於基因之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則該基因、cDNA或RNA編碼該蛋白質。編碼鏈(與mRNA序列一致且通常提供於序列列表中之核酸序列)及非編碼鏈(用作基因或cDNA轉錄之模板)二者皆可稱為編碼該基因或cDNA之蛋白質或其他產物。 除非另有說明，否則「編碼胺基酸序列之核酸序列」包括為彼此之簡併形式且編碼相同胺基酸序列之所有核酸序列。就編碼蛋白質之核酸序列可在某一形式中含有內含子而言，編碼蛋白質或RNA之片語核酸序列亦可包括內含子。 術語「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換使用，且係指如本文所述可有效地達成特定生物結果之化合物、調配物、材料或組合物之量。 術語「內源」係指來自生物體、細胞、組織或系統或在其內部產生之任何材料。 術語「外源」係指自生物體、細胞、組織或系統引入或在其外部產生之任何材料。 術語「表現」係指由啟動子驅動之特定核酸序列之轉錄及/或轉譯。 術語「轉移載體」係指包含經分離核酸且可用於將經分離核酸遞送至細胞內部之物質之組合物。多種載體為業內已知，包括(但不限於)直鏈多核苷酸、與離子型或兩親性化合物締合之多核苷酸、質體及病毒。因此，術語「轉移載體」包括自主複製之質體或病毒。該術語亦應理解為進一步包括幫助核酸轉移至細胞中之非質體及非病毒化合物，例如聚離胺酸化合物、脂質體及諸如此類。病毒轉移載體之實例包括(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體及諸如此類。 術語「表現載體」係指包含包括可操作地連接至欲表現核酸序列之表現控制序列之重組多核苷酸的載體。表現載體包含用於表現之足夠順式作用元件；用於表現之其他元件可由宿主細胞或在活體外表現系統中供應。表現載體包括所有業內已知納入重組多核苷酸之彼等，包括黏粒、質體(例如，裸露或含於脂質體中)及病毒(例如，慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。 術語「慢病毒」係指逆轉錄病毒科(Retroviridae)之屬。慢病毒在逆轉錄病毒中之獨特之處在於，能夠感染未分裂細胞；其可將大量遺傳資訊遞送至宿主細胞之DNA中，因此其係基因遞送載體之最有效方法之一。HIV、SIV及FIV皆為慢病毒屬(lentivirus)之實例。 術語「慢病毒載體」係指源自慢病毒基因體之至少一部分之載體，尤其包括如Milone等人，Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)中所提供之自失活慢病毒載體。可用於臨床中之慢病毒載體之其他實例包括(但不限於)例如來自Oxford BioMedica之LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen之LENTIMAX™載體系統及諸如此類。慢病毒載體之非臨床類型亦可用且將為熟習此項技術者已知。 術語「同源」或「一致性」係指兩個聚合分子之間、例如兩個核酸分子(例如兩個DNA分子或兩個RNA分子)之間或兩個多肽分子之間的亞單位序列一致性。當兩個分子二者中之亞單位位置經相同單體亞單位佔據時；例如若在兩個DNA分子中每一者中之位置經腺嘌呤佔據，則其在該位置處同源或一致。兩個序列之間之同源性係匹配或同源位置數之直接函數；例如若兩個序列中之一半(例如聚合物10個亞單位長度上之5個位置)位置同源，則該兩個序列為50%同源；若90%之位置(例如10個中之9個)匹配或同源，則該兩個序列為90%同源。 非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式係嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)，其含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列。在極大程度上，人類化抗體及其抗體片段係人類免疫球蛋白(接受者抗體或抗體片段)，其中來自接受者之互補決定區(CDR)的殘基經來自諸如小鼠、大鼠或兔等非人類物種(供體抗體)之CDR且具有期望特異性、親和力及能力的殘基替代。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv框架區(FR)殘基經相應非人類殘基替代。此外，人類化抗體/抗體片段可包含在接受者抗體與導入之CDR或框架序列中皆未發現之殘基。該等修飾可進一步完善且最佳化抗體或抗體片段性能。一般而言，人類化抗體或其抗體片段將包含實質上所有的至少一個、且通常兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDR區，且FR區之全部或重要部分為人類免疫球蛋白序列之FR區。人類化抗體或抗體片段亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc) (通常為人類免疫球蛋白恆定區)之至少一部分。關於其他細節參見Jones等人，Nature, 321: 522-525, 1986；Reichmann等人，Nature, 332: 323-329, 1988；Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992。 「全人類」係指免疫球蛋白，例如抗體或抗體片段，其中整個分子為人類來源或由與抗體或免疫球蛋白之人類形式一致之胺基酸序列組成。 「鼠類」係指小鼠或大鼠。舉例而言，鼠類抗體或其片段含有自鼠類動物(例如小鼠或大鼠)分離之抗體或其片段之序列。 術語「經分離」意指自天然狀態改變或移除。舉例而言，天然存在於活動物中之核酸或肽未「經分離」，但部分或完全自其天然狀態之共存材料分離之相同核酸或肽為「經分離」。經分離核酸或蛋白質可以實質上經純化之形式存在，或可存在於非天然環境(例如宿主細胞)中。 在本發明上下文中使用普遍存在核酸鹼基之以下縮寫。「A」係指腺苷，「C」係指胞嘧啶，「G」係指鳥苷，「T」係指胸苷，且「U」係指尿苷。 術語「可操作地連接」或「轉錄控制」係指調控序列與異源核酸序列之間之功能鏈接，以使後者表現。舉例而言，當第一核酸序列與第二核酸序列位於功能關係中時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。可操作地連接之DNA序列可彼此鄰接，且例如在需要連接兩個蛋白質編碼區時處在同一閱讀框中。 術語免疫原性組合物之「非經腸」投與包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌內(i.m.)或胸骨內注射、腫瘤內或輸注技術。 術語「核酸」或「多核苷酸」係指呈單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非明確限制，否則該術語涵蓋含有具有與參考核酸相似之結合性質且以類似於天然核苷酸之方式代謝之天然核苷酸已知類似物的核酸。除非另有指示，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾變體(例如，簡併密碼子取代)、對偶基因、直向同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。特定而言，簡併密碼子取代可藉由產生其中一或多個所選(或全部)密碼子之第三位經混合鹼基及/或去氧次黃嘌呤核苷殘基取代的序列來達成(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；及Rossolini等人，Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。 術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且係指包含藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基之化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，且對可包含蛋白質或肽序列之胺基酸之最大數量無限制。多肽包括包含藉由肽鍵彼此連接之兩個或更多個胺基酸之任何肽或蛋白質。如本文所用之該術語係指例如兩條短鏈(業內亦通常稱為肽、寡肽及寡聚物)及較長鏈(業內通常稱為蛋白質，其具有許多類型)。「多肽」尤其包括例如生物活性片段、實質上同源之多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽之變體、經修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重組肽或其組合。 術語「啟動子」係指由細胞之合成機構或所引入合成機構識別之起始多核酸序列之特定轉錄所需之DNA序列。 術語「啟動子/調控序列」係指為表現可操作地連接至啟動子/調控序列之基因產物所需之核酸序列。在一些情況下，此序列可為核心啟動子序列，且在其他情況下此序列亦可包括增強子序列及為表現基因產物所需之其他調控元件。啟動子/調控序列可為例如以組織特異性方式表現基因產物之序列。 術語「組成型」啟動子係指當與編碼或指定基因產物之多核苷酸可操作地連接時，在細胞中在細胞之大多數或所有生理學條件下產生該基因產物之核酸序列。 術語「誘導型」啟動子係指當與編碼或指定基因產物之多核苷酸可操作地連接時，在細胞中實質上僅在對應於啟動子之誘導劑存在於細胞中時產生該基因產物之核酸序列。 術語「組織特異性」啟動子係指當與編碼或指定基因產物之多核苷酸可操作地連接時，在細胞中實質上僅在細胞係對應於啟動子之組織類型之細胞時產生該基因產物的核酸序列。 如在scFv情況下使用之術語「撓性多肽連接體」或「連接體」係指將可變重鏈與可變輕鏈區連接在一起之由單獨或以組合使用之諸如甘胺酸及/或絲胺酸等胺基酸殘基組成之肽連接體。在一個實施例中，撓性多肽連接體係Gly/Ser連接體且包含胺基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser) (SEQ ID NO: 834)，重複n次，其中n係等於或大於1之正整數。舉例而言，n=1、n=2、n=3. n=4、n=5及n=6、n=7、n=8、n=9及n=10。在一個實施例中，撓性多肽連接體包括(但不限於) (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO: 23)或(Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 541)。在另一實施例中，連接體包括(Gly2 Ser)及(GlySer)之多個重複。在另一實施例中，多肽不包括連接體，例如(n=0)。WO2012/138475中所述之連接體亦包括在本發明範圍內，該專利以引用方式併入本文中。 如本文所用之5'帽(亦稱為RNA帽、RNA 7-甲基鳥苷帽或RNA m7 G帽)係在轉錄起始後不久即添加至真核信使RNA之「前面」或5'端之經修飾鳥嘌呤核苷酸。5'帽係由連接至第一個轉錄核苷酸之端基組成。其存在對於核糖體之識別及針對RNA酶之保護至關重要。帽添加與轉錄偶合且以共轉錄方式發生，以使其相互影響。轉錄起始後不久，所合成mRNA之5'端藉由與RNA聚合酶締合之帽合成複合物結合。此酶促複合物催化為mRNA加帽所需之化學反應。合成以多步驟生物化學反應進行。加帽部分可經修飾以調節mRNA之功能，例如其穩定性或轉譯效率。 如本文所用之「活體外轉錄RNA」係指已在活體外合成之RNA，較佳mRNA。通常，活體外轉錄RNA係自活體外轉錄載體產生。活體外轉錄載體包含用於產生活體外轉錄RNA之模板。 如本文所用之「聚(A)」係藉由多聚腺苷酸化附接至mRNA之一系列腺苷。在用於瞬時表現之構築體之較佳實施例中，聚A介於50與5000之間，較佳大於64，更佳大於100，最佳大於300或400。聚(A)序列可經化學或酶促修飾以調節諸如定位、穩定性或轉譯效率等mRNA功能。 如本文所用之「多聚腺苷酸化」係指將多腺苷醯基部分或其經修飾變體共價連接至信使RNA分子。在真核生物體中，大部分信使RNA (mRNA)分子在3'端經多腺苷酸化。3'聚(A)尾係經由酶(多腺苷酸化聚合酶)之作用添加至mRNA前體之長腺嘌呤核苷酸序列(通常數百個)。在高等真核生物中，聚(A)尾添加至含有特異性序列(多腺苷酸化信號)之轉錄本上。聚(A)尾及其結合之蛋白質幫助保護mRNA免於外切酶降解。多腺苷酸化對於轉錄終止、mRNA自核之輸出及轉譯亦至關重要。多腺苷酸化在核中DNA轉錄成RNA後立即發生，但此外亦可後來在細胞質中發生。在轉錄終止後，mRNA鏈經由與RNA聚合酶締合之核酸內切酶複合物之作用裂解。裂解位點之特徵通常在於在裂解位點附近存在鹼基序列AAUAAA。在mRNA裂解後，腺苷殘基添加至裂解位點處之游離3'端。 如本文所用之「瞬時」係指非整合轉基因經數小時、數天或數週時段之表現，其中該表現時間段小於基因在宿主細胞中整合至基因體中或含於穩定質體複製子內時表現之時間段。 如本文所用之術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」及「治療(treating)」係指自投與一或多種療法(例如一或多種治療劑，例如本發明CAR)引起之減輕或改善增生性病症之進展、嚴重程度及/或持續時間，或改善增生性病症之一或多種症狀(較佳地一或多種可感受到之症狀)。在具體實施例中，術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」及「治療(treating)」係指改善增生性病症之至少一個未必可由患者感受到之可量測物理參數，例如腫瘤生長。在一些實施例中，術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」及「治療(treating)」係指抑制增生性病症之進展，在物理上例如穩定可感受到之症狀，在生理上例如穩定物理參數，或二者皆有。在一些實施例中，術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」及「治療(treating)」係指減輕或穩定腫瘤大小或癌細胞計數。 術語「信號轉導路徑」係指在信號自細胞之一部分傳送至細胞之另一部分中起作用之多種信號轉導分子之間的生物化學關係。片語「細胞表面受體」包括能夠接收信號且穿過細胞膜傳送信號之分子及分子複合物。 術語「個體」意欲包括其中可引發免疫反應之活生物體(例如，哺乳動物、人類)。 術語「實質上經純化」之細胞係指基本上不含其他細胞類型之細胞。實質上經純化之細胞亦指已與在其天然狀態下與其天然締合之其他細胞類型分離之細胞。在一些情況下，實質上經純化之細胞群體係指細胞之同源群體。在其他情況下，此術語僅指已與在其天然狀態下與其天然締合之細胞分離之細胞。在一些態樣中，細胞係在活體外培養。在其他態樣中，細胞並非在活體外培養。 如本文所用之術語「治療(therapeutic)」意指治療(treatment)。治療效應係藉由減輕、阻抑、緩解或根除疾病狀態來獲得。 如本文所用之術語「防護」意指疾病或疾病狀態之預防或保護性治療。 在本發明上下文中，「腫瘤抗原」或「過度增生性病症抗原」或「與過度增生性病症相關之抗原」係指為特定過度增生性病症所共有之抗原。在某些態樣中，本發明之過度增生性病症抗原源自癌症，包括(但不限於)原發性或轉移性黑色素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌及腺癌，例如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌及諸如此類。 術語「轉染」或「轉形」或「轉導」係指將外源核酸轉移或引入宿主細胞中之過程。「轉染」或「轉形」或「轉導」之細胞係經外源核酸轉染、轉形或轉導之細胞。該細胞包括原代個體細胞及其後代。 術語「特異性結合」係指識別並與存在於樣品中之結合伴侶(例如，刺激性腫瘤抗原)蛋白結合之抗體或配體，但該抗體或配體實質上並不識別或結合樣品中之其他分子。 如本文所用之「難治性」係指對治療無反應之疾病，例如癌症。在實施例中，難治性癌症可在治療前或治療開始時對治療有抗性。在一些實施例中，難治性癌症可在治療期間變得有抗性。難治性癌症亦稱為抗性癌症。 若個體中癌症之參數(例如血液癌症，例如癌細胞生長、增殖及/或存活)減緩或減小可檢測量(例如約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更大)，如藉由任一適宜量測、例如藉由質量、細胞計數或體積所測定，則個體對治療「有反應」。在一實例中，若個體經歷預期壽命比不投與治療時所預測之預期壽命延長約5%、10%、20%、30%、40%、50%或更大，則個體對治療有反應。在另一實例中，若個體具有增加的無疾病存活期、總存活期或延長的進展時間，則個體對治療有反應。可使用若干方法來確定患者是否對治療有反應，該等方法包括例如由NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology (NCCN Guidelines®)提供之準則。舉例而言，在B-ALL情況下，完全反應或完全反應者可涉及以下中之一或多者：＜ 5% BM母細胞、＞1000個嗜中性球/ANC (/µL)、＞100,000個血小板(/μL)且無循環母細胞或髓外疾病(無淋巴結病、脾腫大、皮膚/齒齦浸潤/睪丸腫塊/CNS涉及)、三譜系造血及4週無復發。部分反應者可涉及BM母細胞之＞50%減少、＞1000個嗜中性球/ANC (/μL)、＞100,000個血小板(/μL)中之一或多者。不反應者可展示疾病進展，例如＞ 25%之BM母細胞。在實施例中，完全反應者定義為在CD8+群體中具有7%或更多CD27+ CD45RO-細胞。在實施例中，收穫前水準之CAR+細胞%區分反應者(例如，完全反應者及部分反應者)與不反應者(NR)。 如本文所用之術語「復發」係指在初始反應(例如，完全反應或部分反應)時段後癌症之再現。初始反應時段可涉及降至某一臨限值以下(例如20%、1%、10%、5%、4%、3%、2%或1%以下)之癌細胞含量。再現可涉及升高至某一臨限值以上(例如20%、1%、10%、5%、4%、3%、2%或1%以上)之癌細胞含量。舉例而言，例如在B-ALL情況下，再現可涉及例如在完全反應後血液、骨髓(＞ 5%)或任一髓外位點中母細胞之再現。在此情況下，完全反應可涉及＜ 5% BM母細胞。更通常而言，在實施例中，反應(例如，完全反應或部分反應)可涉及不存在可檢測到之MRD (微量殘存疾病)。在實施例中，初始反應時段持續至少1天、2天、3天、4天、5天或6天；至少1週、2週、3週或4週；至少1個月、2個月、3個月、4個月、6個月、8個月、10個月或12個月；或至少1年、2年、3年、4年或5年。 當「可調控嵌合抗原受體(RCAR)」用於本文中時該術語係指多肽之集合，在最簡單實施例中通常為兩種多肽之集合，其在RCARX細胞中時向RCARX細胞提供針對靶細胞(通常為癌細胞)之特異性及可調控細胞內信號產生或增殖，此可最佳化RCARX細胞之免疫效應物性質。RCARX細胞至少部分依賴抗原結合域來提供針對包含由抗原結合域結合之抗原之靶細胞的特異性。在實施例中，RCAR包括在二聚化分子存在時可使細胞內信號傳導域偶合至抗原結合域之二聚化開關。 當「膜錨定」或「膜系鏈域」用於本文中時該術語係指足以使細胞外或細胞內域錨定至漿膜之多肽或部分，例如肉豆蔻醯基。 當「開關域」用於本文中時，該術語例如在提及RCAR時係指在二聚化分子存在下與另一開關域締合之實體，通常為基於多肽之實體。締合產生連接至(例如，融合至)第一開關域之第一實體與連接至(例如，融合至)第二開關域之第二實體之功能偶合。第一及第二開關域統稱為二聚化開關。在實施例中，第一及第二開關域彼此相同，例如，其係具有相同的主要胺基酸序列之多肽，且統稱為同二聚化開關。在實施例中，第一及第二開關域彼此不同，例如，其係具有不同的主要胺基酸序列之多肽，且統稱為異二聚化開關。在實施例中，開關在細胞內。在實施例中，開關在細胞外。在實施例中，開關域係基於多肽之實體，例如基於FKBP或FRB，且二聚化分子為小分子，例如雷帕黴素類似物(rapalogue)。在實施例中，開關域係基於多肽之實體，例如結合myc肽之scFv，且二聚化分子為多肽、其片段或多肽之多聚體，例如myc配體或myc配體之結合至一或多個myc scFv之多聚體。在實施例中，開關域係基於多肽之實體，例如myc受體，且二聚化分子為抗體或其片段，例如myc抗體。 當「二聚化分子」用於本文中時，該術語例如在提及RCAR時係指促進第一開關域與第二開關域締合之分子。在實施例中，二聚化分子並非天然存在於個體中，或並不以將產生顯著二聚化之濃度存在。在實施例中，二聚化分子為小分子，例如雷帕黴素(rapamycin)或雷帕黴素類似物，例如RAD001。 術語「生物等效」係指產生與由參考化合物(例如，RAD001)之參考劑量或參考量產生之效應等效的效應所需之除參考化合物(例如，RAD001)外之藥劑之量。在實施例中，效應係mTOR抑制之程度，例如如藉由P70 S6激酶抑制所量測，例如如在活體內或活體外分析中所評估，例如如藉由本文所述之分析(例如，Boulay分析)或藉由西方墨點(western blot)之磷酸化S6含量量測值所量測。在實施例中，效應係改變PD-1陽性/PD-1陰性T細胞之比率，如藉由細胞分選所量測。在實施例中，mTOR抑制劑之生物等效量或劑量係達成與參考化合物之參考劑量或參考量相同之P70 S6激酶抑制程度之量或劑量。在實施例中，mTOR抑制劑之生物等效量或劑量係達成與參考化合物之參考劑量或參考量相同之PD-1陽性/PD-1陰性T細胞之比率變化程度之量或劑量。 術語「低免疫增強劑量」在與mTOR抑制劑(例如別位mTOR抑制劑，例如RAD001或雷帕黴素，或催化mTOR抑制劑)結合使用時係指mTOR抑制劑之部分、但非完全抑制mTOR活性之劑量，例如如藉由P70 S6激酶活性之抑制所量測。例如藉由抑制P70 S6激酶評估mTOR活性之方法論述於本文中。該劑量不足以產生完全免疫阻抑，但足以增強免疫反應。在實施例中，mTOR抑制劑之低免疫增強劑量會使PD-1陽性T細胞數減少及/或使PD-1陰性T細胞數增加或使PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞之比率增加。在實施例中，mTOR抑制劑之低免疫增強劑量會使幼稚T細胞數增加。在實施例中，mTOR抑制劑之低免疫增強劑量會產生以下中之一或多者： 增加以下標記物中之一或多者在例如記憶T細胞(例如，記憶T細胞前體)上之表現：CD62L高 、CD127高 、CD27+ 及BCL2； 減少KLRG1例如在記憶T細胞(例如，記憶T細胞前體)上之表現；及 增加記憶T細胞前體(例如，具有以下特徵中之任一者或該等特徵之組合之細胞)數：增加的CD62L高 、增加的CD127高 、增加的CD27+ 、減少的KLRG1及增加的BCL2； 其中例如與未經治療之個體相比，例如至少瞬時出現上述任一變化。 範圍：在本發明通篇中，本發明之多個態樣可以範圍格式呈現。應理解，呈範圍格式之描述僅出於方便及簡潔之目的，且不應理解為對本發明範圍之硬性限制。因此，範圍之描述應視為特定揭示所有可能的子範圍以及該範圍內之個別數值。舉例而言，諸如1至6等範圍之描述應視為特定揭示諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子範圍，以及該範圍內之個別數值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。作為另一實例，諸如95%-99%一致性等範圍包括具有95%、96%、97%、98%或99%一致性之範圍，且包括諸如96%-99%、96%-98%、96%-97%、97%-99%、97%-98%及98%-99%一致性等子範圍。此無論範圍之寬度如何皆適用。 詳細描述 本文提供利用CD20及/或嵌合抗原受體(CAR)治療或預防疾病(例如癌症)之物質組合物及使用方法。 在一個態樣中，本發明提供多種嵌合抗原受體(CAR)，其包含經改造以特異性結合至CD20蛋白或CD22蛋白或其片段之抗體或抗體片段。在一個態樣中，本發明提供經改造以表現CAR之細胞(例如，T細胞或NK細胞)，其中該細胞(例如「CART」)展現抗腫瘤性質。在一個態樣中，使用CAR轉形細胞且使CAR之至少一部分在細胞表面上表現。在一些實施例中，使用編碼CAR之病毒載體轉導細胞(例如，T細胞或NK細胞)。在一些實施例中，病毒載體係逆轉錄病毒載體。在一些實施例中，病毒載體係慢病毒載體。在一些該等實施例中，細胞可穩定表現CAR。在另一實施例中，用編碼CAR之核酸(例如mRNA、cDNA、DNA)轉染細胞(例如，T細胞或NK細胞)。在一些該等實施例中，細胞可瞬時表現CAR。 在一個態樣中，CAR之CD20或CD22結合域(例如鼠類、人類或人類化CD20結合域)係scFv抗體片段。在一個態樣中，該等抗體片段之功能在於其保留等效結合親和力，例如其以與具有相同重鏈及輕鏈可變區之IgG抗體相當之效率結合相同抗原。在一個態樣中，該等抗體片段之功能在於其提供生物反應，該生物反應可包括(但不限於)活化免疫反應、抑制源自其靶抗原之信號轉導、抑制激酶活性及諸如此類，如熟習此項技術者將理解。 在一些態樣中，將本發明抗體納入嵌合抗原受體(CAR)中。在一個態樣中，CAR包含本文以表1提供之多肽序列。 在一個態樣中，CD20或CD22結合域(例如，鼠類、人類化或人類CD20或CD22結合域，本發明CAR之一部分)係由序列已經密碼子最佳化用於在哺乳動物細胞中表現之轉基因編碼。在一個態樣中，本發明之整個CAR構築體係由整個序列已經密碼子最佳化用於在哺乳動物細胞中表現之轉基因編碼。密碼子最佳化係指以下發現：同義密碼子(即編碼相同胺基酸之密碼子)在編碼DNA中之出現頻率在不同物種中有所不同。該密碼子簡併性容許相同多肽經多條核酸序列編碼。多種密碼子最佳化方法為業內已知，且包括例如至少美國專利第5,786,464號及第6,114,148號中所揭示之方法。 在一個態樣中，CAR之抗原結合域包含鼠類(例如，大鼠或小鼠)抗體或抗體片段。在一個態樣中，CAR之抗原結合域包含人類CD20或CD22抗體或抗體片段。在一個態樣中，CAR之抗原結合域包含人類化CD20或CD22抗體或抗體片段。在一個態樣中，CAR之抗原結合域包含包括scFv之鼠類CD20或CD22抗體片段。在一個態樣中，CAR之抗原結合域包含包括scFv之人類CD20或CD22抗體片段。在一個態樣中，CAR之抗原結合域係人類CD20或CD22 scFv。在一個態樣中，CAR之抗原結合域包含包括scFv之人類化CD20抗體片段。在一個態樣中，CAR之抗原結合域係人類化CD20或CD22 scFv。 在一個態樣中，CAR20結合域包含SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429中所提供之scFv部分。 在一個態樣中，CAR22結合域包含如表6中所示之scFv蛋白。 此外，本發明提供CD20 CAR或CD22 CAR組合物及其於藥劑或方法中之用途，其用於治療尤其涉及表現CD20或CD22之細胞或組織之疾病、癌症或任何惡性病或自體免疫疾病。 在一個態樣中，本發明CAR可用於根除表現CD20或表現CD22之正常細胞，由此適於用作細胞移植前之細胞調理療法。在一個態樣中，表現CD20或表現CD22之正常細胞係表現CD20或表現CD22之骨髓性祖細胞且細胞移植係幹細胞移植。 在一個態樣中，本發明提供經改造以表現本發明嵌合抗原受體(例如，CART)之細胞(例如，T細胞或NK細胞)，其中細胞(例如，「CART」)展現抗腫瘤性質。因此，本發明提供包含CD20結合域之CD20-CAR及/或包含CD22結合域且改造至T細胞或NK細胞中之CD22-CAR及其用於授受性療法之方法。 在一個態樣中，CD20-CAR或CD22-CAR包含至少一個例如本文所述、例如選自以下之群之細胞內域：CD137 (4-1BB)信號傳導域、CD28信號傳導域、CD3ζ信號域及其任一組合。在一個態樣中，CD20-CAR或CD22-CAR包含至少一個來自一或多種除CD137 (4-1BB)或CD28外之共刺激分子之細胞內信號傳導域。 嵌合抗原受體(CAR) 本發明涵蓋包含編碼CAR之序列之重組DNA構築體，其中CAR包含特異性結合至CD20及/或CD22或其片段(例如人類CD20或CD22)之抗原結合域(例如，抗體、抗體片段)，其中CD20或CD22結合域(例如，抗體或抗體片段)之序列例如與編碼細胞內信號傳導域之核酸序列鄰接且與其處於同一閱讀框中。細胞內信號傳導域可包含共刺激信號傳導域及/或初級信號傳導域，例如ζ鏈。共刺激信號傳導域係指包含共刺激分子之細胞內域之至少一部分的CAR部分。 在具體態樣中，本發明之CAR構築體包含選自由以下組成之群之scFv域：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429，其中scFv前面可為例如SEQ ID NO: 797中所提供之可選前導序列且其後為例如SEQ ID NO: 799或SEQ ID NO: 814或SEQ ID NO: 815中所提供之可選鉸鏈序列、例如SEQ ID NO: 801中所提供之跨膜區、包括SEQ ID NO: 803或SEQ ID NO: 804之細胞內信號傳導域及包括SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807之CD3ζ序列，例如，其中該等域鄰接且處於同一閱讀框中以形成單一融合蛋白。本發明亦包括編碼選自由以下組成之群之scFv片段中的每一者之多肽之核酸序列：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429。 在一個實施例中，編碼CD20結合域之核酸序列包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 268、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 322、SEQ ID NO: 349、SEQ ID NO: 376、SEQ ID NO: 403及SEQ ID NO: 430。在實施例中，編碼CD20結合域之核酸序列包含如表1中所示之序列。 在一個實施例中，編碼CD22結合域之核酸序列包含如表6中所示之序列。 其他實施例包括編碼表1及/或表6之多肽之核酸序列。其他實施例包括編碼表1及/或表6中任一者之多肽及SEQ ID NO: 797、799、801、803、805及視情況818之域中之每一者的核酸序列。 在一個態樣中，實例性CD20CAR構築體包含可選前導序列、細胞外抗原結合域、鉸鏈、跨膜域及細胞內刺激域。在一個態樣中，實例性CD20CAR或CD22CAR構築體包含可選前導序列、細胞外抗原結合域、鉸鏈、跨膜域、細胞內共刺激域及細胞內刺激域。 在一些實施例中，全長CD20 CAR序列亦以表1提供於本文中。 在一些實施例中，全長CD22 CAR序列亦以表6提供於本文中。 實例性前導序列係以SEQ ID NO: 797提供。實例性鉸鏈/間隔體序列係以SEQ ID NO: 799或SEQ ID NO: 814或SEQ ID NO: 816提供。實例性跨膜域序列係以SEQ ID NO: 801提供。4-1BB蛋白之實例性細胞內信號傳導域序列係以SEQ ID NO: 803提供。CD27之實例性細胞內信號傳導域序列係以SEQ ID NO: 818提供。實例性CD3ζ域序列係以SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807提供。 在一個態樣中，本發明涵蓋包含編碼CAR之核酸分子之重組核酸構築體，其中核酸分子包含例如與編碼細胞內信號傳導域之核酸序列鄰接且處於同一閱讀框中之編碼CD20結合域(例如本文所述)之核酸序列。在一個態樣中，CD20結合域選自SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429。在一個態樣中，本發明涵蓋包含編碼CAR之核酸分子之重組核酸構築體，其中核酸分子包含編碼CD20結合域之核酸序列，例如，其中該序列與編碼細胞內信號傳導域之核酸序列鄰接且處於同一閱讀框中。可用於CAR中之實例性細胞內信號傳導域包括(但不限於)例如CD3-ζ、CD28、4-1BB及諸如此類之一或多個細胞內信號傳導域。在一些情況下，CAR可包含CD3-ζ、CD28、4-1BB及諸如此類之任一組合。 在一個態樣中，本發明CAR構築體之核酸序列選自以下中之一或多者：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 268、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 322、SEQ ID NO: 349、SEQ ID NO: 376、SEQ ID NO: 403及SEQ ID NO: 430。編碼期望分子之核酸序列可利用業內已知之重組方法來獲得，例如利用標準技術藉由自表現該基因之細胞篩選文庫、自已知包括該基因之載體衍生出基因或自含有該基因之細胞及組織直接分離來獲得。或者，所關注核酸可以合成方式而非選殖來產生。 本發明包括可直接轉導至細胞中之表現CAR之逆轉錄病毒及慢病毒載體構築體。 本發明亦包括可直接轉染至細胞中之RNA構築體。產生用於轉染之mRNA之方法涉及使用特殊設計之引子在活體外轉錄(IVT)模板，然後添加聚A，以產生長度通常為50-2000個鹼基之含有以下各項之構築體：3’及5’非轉譯序列(「UTR」)、5’帽及/或內部核糖體進入位點(IRES)、欲表現之核酸及聚A尾。由此產生之RNA可有效地轉染不同種類之細胞。在一個實施例中，模板包括針對CAR之序列。在實施例中，RNA CAR載體係藉由電穿孔轉導至T細胞或NK細胞中。 抗原結合域 在一個態樣中，本發明CAR包含靶特異性結合元件，亦稱為抗原結合域。部分之選擇端視界定靶細胞表面之配體之類型及數量而定。舉例而言，抗原結合域可經選擇以識別用作靶細胞上與特定疾病狀態相關之細胞表面標記物之配體。 在一個態樣中，可藉助將特異性結合期望抗原之抗原結合域改造至CAR中使CAR介導之T細胞反應針對所關注抗原。 在一個態樣中，包含抗原結合域之CAR部分包含靶向CD20或其片段之抗原結合域。在一個態樣中，抗原結合域靶向人類CD20或其片段。 在一個態樣中，包含抗原結合域之CAR部分包含靶向CD22或其片段之抗原結合域。在一個態樣中，抗原結合域靶向人類CD22或其片段。 抗原結合域可為結合至抗原之任何域，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、重組抗體、鼠類抗體、人類抗體、人類化抗體及其功能片段，包括(但不限於)單一域抗體，例如重鏈可變域(VH)、輕鏈可變域(VL)及駱駝科動物源性奈米抗體之可變域(VHH)，及業內已知用作抗原結合域之替代性支架，例如重組纖連蛋白域及諸如此類。在一些情況下，使抗原結合域衍生自其中最終將使用CAR之同一物種有益。舉例而言，對於人類中之使用，CAR之抗原結合域包含抗體或抗體片段之抗原結合域之人類或人類化殘基可能有益。 在一些情況下，使抗原結合域衍生自其中最終將使用CAR之同一物種有益。舉例而言，對於人類中之使用，CAR之抗原結合域包含抗體或抗體片段之抗原結合域之人類或人類化殘基可能有益。因此，在一個態樣中，抗原結合域包含人類抗體或抗體片段。 在其他情況下，抗原結合域衍生自與其中最終將使用CAR之物種(例如，人類)不同之物種(例如，鼠類)。 在一個實施例中，CD20結合域包含本文所述CD20結合域之一或多個(例如，所有三個)輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、輕鏈互補決定區2 (LCDR2)及輕鏈互補決定區3 (LCDR3)、及/或本文所述CD20結合域之一或多個(例如，所有三個)重鏈互補決定區1 (HCDR1)、重鏈互補決定區2 (HCDR2)及重鏈互補決定區3 (HCDR3)，例如包含一或多個、例如所有三個LCDR及一或多個、例如所有三個HCDR之CD20結合域。在一個實施例中，CD20結合域包含本文所述CD20結合域之一或多個(例如，所有三個)重鏈互補決定區1 (HCDR1)、重鏈互補決定區2 (HCDR2)及重鏈互補決定區3 (HCDR3)，例如CD20結合域具有兩個重鏈可變區，其各自包含本文所述之HCDR1、HCDR2及HCDR3。 在一個實施例中，LCDR1、LCDR2及/或LCDR3包含表3中所列示之胺基酸序列(或由其組成)。在一個實施例中，HCDR1、HCDR2及/或HCDR3包含表2中所列示之胺基酸序列(或由其組成)。 在一個實施例中，CD20結合域包含本文所述之輕鏈可變區(例如，在表5中)及/或本文所述之重鏈可變區(例如，在表4中)。在一個實施例中，CD20結合域包含本文所述之重鏈可變區(例如，在表4中)，例如至少兩個本文所述之重鏈可變區(例如，在表4中)。在一個實施例中，CD20結合域係包含表1之胺基酸序列之輕鏈及重鏈之scFv。在實施例中，CD20結合域(例如，scFv)包含：輕鏈可變區，其包含具有表5中所提供之輕鏈可變區胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列、或與表5之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包含具有表4中所提供之重鏈可變區胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾(例如，取代)但不超過30個、20個或10個修飾(例如，取代)的胺基酸序列、或與表4之胺基酸序列具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，CD20結合域包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429，或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，CD20結合域係scFv，且包含本文所述胺基酸序列之輕鏈可變區(例如在表5中)經由連接體(例如，本文所述之連接體)附接至包含本文所述胺基酸序列的重鏈可變區(例如在表4中)。在一個實施例中，CD20結合域包括(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6，較佳3或4 (SEQ ID NO: 23)。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可呈例如以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接體-重鏈可變區或重鏈可變區-連接體-輕鏈可變區。 人類化抗體可使用業內已知之多種技術產生，該等技術包括(但不限於) CDR移植(參見例如歐洲專利第EP 239,400號；國際公開案第WO 91/09967號；及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號，其各自係全文以引用方式併入本文中)、鑲飾或表面重修(參見例如歐洲專利第EP 592,106號及第EP 519,596號；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498；Studnicka等人，1994, Protein Engineering, 7(6):805-814；及Roguska等人，1994, PNAS, 91:969-973，其各自係全文以引用方式併入本文中)、鏈改組(參見例如美國專利第5,565,332號，其全文皆以引用方式併入本文中)及例如以下各項中所揭示之技術：美國專利申請公開案第US2005/0042664號、美國專利申請公開案第US2005/0048617號、美國專利第6,407,213號、美國專利第5,766,886號、國際公開案第WO 9317105號；Tan等人，J. Immunol., 169:1119-25 (2002)；Caldas等人，Protein Eng., 13(5):353-60 (2000)；Morea等人，Methods, 20(3):267-79 (2000)；Baca等人，J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997)；Roguska等人，Protein Eng., 9(10):895-904 (1996)；Couto等人，Cancer Res., 55 (23增刊):5973s-5977s (1995)；Couto等人，Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995)；Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)；及Pedersen等人，J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)，其各自係全文以引用方式併入本文中。通常，框架區中之框架殘基經CDR供體抗體之相應殘基取代以改變(例如改良)抗原結合。該等框架取代係藉由業內熟知之方法來鑑別，例如藉由對CDR與框架殘基之相互作用建模以鑑別對抗原結合重要之框架殘基，及序列比較以鑑別特定位置處之不尋常框架殘基。(參見例如Queen等人，美國專利第5,585,089號；及Riechmann等人，1988, Nature, 332:323，其全文皆以引用方式併入本文中。) 人類化抗體或抗體片段中保留一或多個來自非人類來源之胺基酸殘基。該等非人類胺基酸殘基通常稱為「導入」殘基，其通常取自「導入」可變域。如本文所提供，人類化抗體或抗體片段包含一或多個來自非人類免疫球蛋白分子之CDR及其中包含框架之胺基酸殘基完全或幾乎源自人類種系之框架區。用於人類化抗體或抗體片段之多種技術為業內所熟知，且基本上可遵循Winter及同事之方法(Jones等人，Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等人，Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等人，Science, 239:1534-1536 (1988))，藉由用齧齒類動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列，即CDR移植(EP 239,400；PCT公開案第WO 91/09967號；及美國專利第4,816,567號；第6,331,415號；第5,225,539號；第5,530,101號；第5,585,089號；第6,548,640號，該等專利之內容係全文以引用方式併入本文中)來實施。在該等人類化抗體及抗體片段中，實質上少於完整的人類可變域已經非人類物種之相應序列取代。人類化抗體通常為人類抗體，其中一些CDR殘基及可能一些框架(FR)殘基經來自齧齒類動物抗體中類似位點的殘基取代。抗體及抗體片段之人類化亦可藉由以下方式來達成：鑲飾或表面重修(EP 592,106；EP 519,596；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498；Studnicka等人，Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994)；及Roguska等人，PNAS, 91:969-973 (1994))或鏈改組(美國專利第5,565,332號)，該等文獻之內容係全文以引用方式併入本文中。 用於製備人類化抗體之人類可變域(輕鏈及重鏈二者)之選擇係用於降低抗原性。根據所謂的「最佳擬合」方法，針對已知人類可變域序列之整個文庫來篩選齧齒類動物抗體之可變域之序列。然後將最接近齧齒類動物之人類序列視為用於人類化抗體之人類框架(FR) (Sims等人，J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等人，J. Mol. Biol., 196:901 (1987)，該等文獻之內容係全文以引用方式併入本文中)。另一方法使用衍生自輕鏈或重鏈之特定子組之所有人類抗體之共有序列的特定框架。可將相同框架用於若干不同的人類化抗體(參見例如Nicholson等人，Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)；Carter等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等人，J. Immunol., 151:2623 (1993)，該等文獻之內容係全文以引用方式併入本文中).在一個實施例中，框架區可包含一個、兩個、三個、四個或五個例如來自相應鼠類序列之胺基酸之修飾，例如取代。 在一些態樣中，包含抗體片段之本發明CAR組合物部分經人類化以保留針對靶抗原之高親和力及其他有利生物性質。根據本發明之一態樣，人類化抗體及抗體片段係利用親代及人類化序列之三維模型藉由分析親代序列及各種概念型人類化產物之製程來製備。三維免疫球蛋白模型通常可購得且為熟習此項技術者所熟悉。可使用電腦程式，該等電腦程式說明並顯示所選候選免疫球蛋白序列之可能的三維構象結構。藉由檢查該等顯示內容可分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能發揮中之可能作用，例如分析影響候選免疫球蛋白結合靶抗原之能力的殘基。以此方式，可自接受者序列及導入序列選擇並組合FR殘基，以使得達成期望抗體或抗體片段特徵，例如增加的靶抗原親和力。一般而言，CDR殘基直接且最為實質性地參與影響抗原結合。 人類化抗體或抗體片段可保留與原始抗體相似之抗原特異性，例如在本發明中結合人類CD20或其片段之能力。在一些實施例中，人類化抗體或抗體片段可具有經改良之與人類CD20或其片段結合之親和力及/或特異性。 在一個態樣中，抗原結合域部分包含一或多個選自以下之序列：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429。在一個態樣中，CD20結合域之特徵在於抗體或抗體片段之特定功能特徵或性質。舉例而言，在一個態樣中，包含抗原結合域之本發明CAR組合物部分特異性結合人類CD20或其片段。在一個態樣中，本發明係關於包含抗體或抗體片段之抗原結合域，其中抗體結合域特異性結合至CD20蛋白或其片段，其中抗體或抗體片段包含包括選自表1之胺基酸序列中之可變輕鏈及/或可變重鏈。在一個態樣中，抗原結合域包含選自以下之scFv之胺基酸序列：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429。在某些態樣中，scFv與前導序列鄰接且處於同一閱讀框中。在一個態樣中，前導序列係以SEQ ID NO: 797提供之多肽序列。 在一個態樣中，CD20結合域係片段，例如單鏈可變片段(scFv)。在一個態樣中，CD20結合域係Fv、Fab、(Fab')2或雙功能(例如雙特異性)雜交抗體(例如，Lanzavecchia等人，Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987))。在一個態樣中，本發明之抗體及其片段以野生型或增強的親和力結合CD20蛋白或其片段。 在一些情況下，人類scFv可衍生自展示文庫。展示文庫係實體之集合；每一實體包括可及多肽組分及編碼或鑑別多肽組分之可回收組分。多肽組分有所變化以使得代表不同胺基酸序列。多肽組分可具有任一長度，例如三個胺基酸至300個以上胺基酸。展示文庫實體可包括一種以上之多肽組分，例如Fab之兩個多肽鏈。在一個實例性實施例中，展示文庫可用於鑑別人類CD20結合域。在選擇中，用CD20或其片段探測文庫每一成員之多肽組分，且若多肽組分結合至CD20，則通常藉由支撐物上之保留鑑別出展示文庫成員。 自支撐物回收保留的展示文庫成員且分析。分析可包括在相似或不相似條件下擴增及後續選擇。舉例而言，可交替進行正向及負向選擇。分析亦可包括確定多肽組分(即抗CD20結合域)之胺基酸序列及純化多肽組分以供詳細表徵。 可將多個格式用於展示文庫。實例包括噬菌體展示。在噬菌體展示中，蛋白質組分通常共價連接至噬菌體外殼蛋白。鏈接源自編碼融合至外殼蛋白之蛋白質組分之核酸的轉譯。鏈接可包括撓性肽連接體、蛋白酶位點或因抑制終止密碼子而納入之胺基酸。噬菌體展示闡述於例如以下文獻中：U.S. 5,223,409；Smith (1985)Science 228:1315-1317；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；WO 90/02809；de Haard等人(1999)J. Biol. Chem 274:18218-30；Hoogenboom等人(1998)Immunotechnology 4:1-20；Hoogenboom等人(2000)Immunol Today 2:371-8；及Hoet等人(2005)Nat Biotechnol . 23(3)344-8。展示蛋白質組分之噬細菌體可利用標準噬菌體製備方法(例如自生長培養基PEG沈澱)生長及收穫。選擇個別展示噬菌體後，可在擴增後自感染所選噬菌體之細胞或自噬菌體自身分離編碼所選蛋白質組分之核酸。可挑選個別群落或噬菌斑，分離核酸並測序。 其他展示格式包括基於細胞之展示(參見例如WO 03/029456)、蛋白質-核酸融合(參見例如US 6,207,446)、核糖體展示(參見例如Mattheakis等人(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022及Hanes等人(2000)Nat Biotechnol. 18:1287-92；Hanes等人(2000)Methods Enzymol. 328:404-30；及Schaffitzel等人(1999)J Immunol Methods. 231(1-2):119-35)及大腸桿菌(E. coli )周質展示(2005年11月22日;PMID: 16337958)。 在一些情況下，scFv可根據業內已知之方法製備(參見例如Bird等人(1988) Science 242:423-426及Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。scFv分子可藉由利用撓性多肽連接體將VH區及VL區連接在一起來產生。scFv分子包含具有最佳化長度及/或胺基酸組成之連接體(例如，Ser-Gly連接體)。連接體長度可極大地影響scFv之可變區摺疊及相互作用之方式。事實上，若採用短多肽連接體(例如，介於5-10個胺基酸之間)，則會防止鏈內摺疊。亦需要鏈間摺疊使兩個可變區一起形成功能表位結合位點。關於連接體定向及大小之實例參見例如Hollinger等人，1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448；美國專利申請公開案第號2005/0100543號、第2005/0175606號、第2007/0014794號以及PCT公開案第WO2006/020258號及第WO2007/024715號，該等文獻皆以引用方式併入本文中。 scFv可包含在其VL區與VH區之間具有至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個或更多個胺基酸殘基之連接體。連接體序列可包含任何天然胺基酸。在一些實施例中，連接體序列包含胺基酸甘胺酸及絲胺酸。在另一實施例中，連接體序列包含甘胺酸及絲胺酸重複之集合，例如(Gly4 Ser)n，其中n係等於或大於1之正整數。在一個實施例中，連接體可為(Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO: 23)或(Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 541)。連接體長度之變化可保留或增強活性，從而在活性研究中產生優異效能。 穩定性及突變 CD20結合域(例如scFv分子，例如可溶性scFv)之穩定性可參考習用對照scFv分子或全長抗體之生物物理性質(例如熱穩定性)來評估。在一個實施例中，人類scFv在所述分析中具有比對照結合分子(例如習用scFv分子)大約0.1℃、約0.25℃、約0.5℃、約0.75℃、約1℃、約1.25℃、約1.5℃、約1.75℃、約2℃、約2.5℃、約3℃、約3.5℃、約4℃、約4.5℃、約5℃、約5.5℃、約6℃、約6.5℃、約7℃、約7.5℃、約8℃、約8.5℃、約9℃、約9.5℃、約10℃、約11℃、約12℃、約13℃、約14℃或約15℃之熱穩定性。 隨後將CD20結合域(例如scFv)經改良之熱穩定性賦予整個CART20構築體，從而改良CART20構築體之治療性質。CD20結合域(例如scFv)之熱穩定性與習用抗體相比可改良至少約2℃或3℃。在一個實施例中，CD20結合域(例如scFv)具有與習用抗體相比改良1℃之熱穩定性。在另一實施例中，CD20結合域(例如scFv)具有與習用抗體相比改良2℃之熱穩定性。在另一實施例中，scFv具有與習用抗體相比改良4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃之熱穩定性。可比較例如本文所揭示之scFv分子與全長抗體。熱穩定性可利用業內已知之方法來量測。舉例而言，在一個實施例中，可量測Tm。用於量測Tm之方法及測定蛋白質穩定性之其他方法更詳細闡述於下文中。 scFv中之突變改變scFv之穩定性且改良scFv及CART20構築體之整體穩定性。鼠類、人類化或人類scFv之穩定性係利用諸如Tm、溫度變性及溫度聚集等量度來測定。 在一個實施例中，CD20結合域(例如scFv)包含至少一個突變，使得突變scFv賦予CART20構築體經改良之穩定性。在另一實施例中，CD20結合域(例如scFv)包含至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個源自人類化過程之突變，使得突變scFv賦予CART20構築體經改良之穩定性。 評估蛋白質穩定性之方法 抗原結合域之穩定性可利用例如下文所述之方法來評價。該等方法可測定多個熱解摺疊轉變，其中最不穩定域首先解摺疊或限制協同解摺疊之多域單元(例如展現單一解摺疊轉變之多域蛋白)之整體穩定性臨限值。最不穩定域可以多種其他方式鑑別。可實施誘變以探測限制整體穩定性之域。另外，可在其中已知最不穩定域固有地解摺疊之條件下經由DSC或其他光譜方法實施多域蛋白質之蛋白酶抗性(Fontana等人(1997) Fold. Des., 2: R17-26；Dimasi等人(2009) J. Mol. Biol. 393: 672-692)。一旦鑑別出最不穩定域，即可採用編碼此域(或其部分)之序列作為該等方法中之測試序列。a) 熱穩定性 組合物之熱穩定性可利用多種業內已知之非限制性生物物理或生物化學技術來分析。在某些實施例中，熱穩定性係藉由分析型光譜來評估。 實例性分析型光譜方法為差示掃描量熱法(DSC)。DSC採用對伴隨大多數蛋白質或蛋白質域之解摺疊之吸熱度敏感之量熱計(參見例如Sanchez-Ruiz等人，Biochemistry, 27: 1648-52, 1988)。為測定蛋白質之熱穩定性，將蛋白質樣品插入量熱計中且升高溫度直至Fab或scFv解摺疊。蛋白質解摺疊時之溫度指示蛋白質整體穩定性。 另一實例性分析型光譜方法係圓二色性(CD)光譜。CD光譜量測組合物隨溫度增加變化之光學活性。圓二色性(CD)光譜量測因結構不對稱產生之左旋偏振光對右旋偏振光吸收之差。無序或解摺疊結構使得CD光譜與有序或摺疊結構之CD光譜非常不同。CD光譜反映蛋白質對溫度增加之變性效應之敏感性，且因此指示蛋白質之熱穩定性(參見van Mierlo及Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000)。 用於量測熱穩定性之另一實例性分析型光譜方法係螢光發射光譜(參見van Mierlo及Steemsma，上文文獻)。用於量測熱穩定性之另一實例性分析型光譜方法係核磁共振(NMR)光譜(參見例如van Mierlo及Steemsma，上文文獻)。 組合物之熱穩定性可以生物化學方式來量測。用於評價熱穩定性之實例性生物化學方法係熱激發分析。在「熱激發分析」中，使組合物於一系列高溫下經受所設定時間段。舉例而言，在一個實施例中，使測試scFv分子或包含scFv分子之分子經受一系列增加溫度並持續例如1-1.5小時。然後藉由相關生物化學分析來分析蛋白質之活性。舉例而言，若蛋白質係結合蛋白(例如scFv或含有scFv之多肽)，則可藉由功能或定量ELISA來測定結合蛋白之結合活性。 此一分析可以高通量格式及實例中所揭示之彼等利用大腸桿菌及高通量篩選來進行。CD20結合域(例如scFv)變體之文庫可利用業內已知之方法來產生。可誘導CD20結合域(例如scFv)表現且可使CD20結合域(例如scFv)經受熱激發。可分析所激發測試樣品之結合，且可按比例放大且進一步表徵彼等穩定CD20結合域(例如scFv)。 熱穩定性係利用任一上述技術(例如分析型光譜技術)藉由量測組合物之熔融溫度(Tm)來評估。熔融溫度係熱轉變曲線中點處之溫度，其中組合物中50%之分子處於摺疊狀態(參見例如Dimasi等人(2009) J. Mol Biol. 393: 672-692)。在一個實施例中，CD20結合域(例如scFv)之Tm值為約40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一個實施例中，IgG之Tm值為約40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一個實施例中，多價抗體之Tm值為約40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。 熱穩定性亦係利用分析型量熱技術(例如DSC)藉由量測組合物之比熱或比熱容(Cp)來評估。組合物之比熱係使1 mol水之溫度升高1℃所需之能量(例如以kcal/mol表示)。較大Cp係變性或無活性蛋白質組合物之標誌。組合物熱容之變化(ΔCp)係藉由測定組合物熱轉變之前及之後之比熱來量測。熱穩定性亦可藉由量測或測定其他熱力學穩定性參數(包括解摺疊之吉布斯自由能(Gibbs free energy，ΔG)、解摺疊焓(ΔH)或解摺疊熵(ΔS))來評估。使用一或多個上述生物化學分析(例如熱激發分析)來測定50%組合物保留其活性(例如結合活性)時之溫度(即TC 值)。 另外，與未經突變之CD20結合域(例如scFv)相比，CD20結合域(例如scFv)之突變改變CD20結合域(例如scFv)之熱穩定性。當將鼠類、人類化或人類CD20結合域(例如scFv)納入CART20構築體中時，CD20結合域(例如鼠類、人類化或人類scFv)賦予整體CD20 CART構築體熱穩定性。在一個實施例中，CD20結合域(例如scFv)包含賦予CD20結合域(例如scFv)熱穩定性之單一突變。在另一實施例中，CD20結合域(例如scFv)包含賦予CD20結合域(例如scFv)熱穩定性之多個突變。在一個實施例中，CD20結合域(例如scFv)中之多個突變對CD20結合域(例如scFv)之熱穩定性具有加和效應。b) 聚集 % 組合物之穩定性可藉由量測其聚集傾向來測定。聚集可藉由多種非限制性生物化學或生物物理技術來量測。舉例而言，可利用層析(例如粒徑篩析層析(SEC))來評估組合物之聚集。SEC係基於大小來分離分子。使用容許離子及小分子進入其內部但不容許較大分子進入之聚合凝膠之半固體珠粒來填充管柱。當將蛋白質組合物施加至管柱頂部時，緊湊摺疊之蛋白質(即非聚集蛋白質)經由比大蛋白質聚集物可用之溶劑大之體積來分佈。因此，大聚集物更快速移動通過管柱，且可以此方式將混合物分離或分級分離成其組分。每一部分可在其自凝膠溶析時單獨量化(例如藉由光散射)。因此，組合物之聚集%可藉由比較部分之濃度與施加至凝膠之蛋白質總濃度來測定。穩定組合物以基本上單一之部分自管柱溶析，且在溶析曲線或層析圖中呈現為基本上單一之峰。c) 結合親和力 組合物之穩定性可藉由測定其靶結合親和力來評價。業內已知眾多種用於測定結合親和力之方法。用於測定結合親和力之實例性方法採用表面電漿共振。表面電漿共振係可例如利用BIAcore系統藉由檢測生物感測器基質內之蛋白質濃度變化來分析即時生物特異性相互作用之光學現象(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)。關於其他描述參見Jonsson, U.等人(1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26；Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627；Johnsson, B.等人(1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131；及Johnnson, B.等人(1991) Anal. Biochem. 198:268-277。 在一個態樣中，CAR之抗原結合域包含與本文所述之抗原結合域胺基酸序列同源之胺基酸序列，且抗原結合域保留本文所述CD20抗體片段之期望功能性質。在一個具體態樣中，本發明之CAR組合物包含抗體片段。在另一態樣中，該抗體片段包含scFv。 在多個態樣中，CAR之抗原結合域係藉由修飾一或兩個可變區(例如VH及/或VL)內(例如一或多個CDR區內及/或一或多個框架區內)之一或多個胺基酸來改造。在一個具體態樣中，本發明之CAR組合物包含抗體片段。在另一態樣中，該抗體片段包含scFv。 熟習此項技術者將理解，本發明之抗體或抗體片段可經進一步修飾，使得改變其胺基酸序列(例如，與野生型相比)，但不改變期望活性。舉例而言，可對蛋白質進行其他核苷酸取代以取代「非必需」胺基酸殘基處之胺基酸。舉例而言，可使用來自同一側鏈家族之另一胺基酸殘基替代分子中之非必需胺基酸殘基。在另一實施例中，可使用側鏈家族成員之順序及/或組成不同之結構相似之串來替代(例如保守取代)胺基酸串，其中可使胺基酸殘基經具有相似側鏈之胺基酸殘基替代。 業內已定義具有相似側鏈之胺基酸殘基之家族，包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、具有β分枝側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。 一致性%在兩個或更多個核酸或多肽序列情況下係指兩個或更多個相同之序列。在比較窗口內或指定區域內如利用以下序列比較算法中之一者或藉由人工比對及目視檢查所量測針對最大對應比較及比對時，若兩個序列具有相同胺基酸殘基或核苷酸之指定百分比(例如，在指定區域內或在未指定時在整個序列內60%一致性，視情況70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性)，則兩個序列「實質上一致」。視情況，一致性存在於長度至少為約50個核苷酸(或10個胺基酸)之區域中，或更佳地存在於長度為100個至500個或1000個或更多個核苷酸(或20個、50個、200個或更多個胺基酸)之區域中。 就序列比較而言，一個序列通常用作參考序列與測試序列進行比較。在使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦中，必要時指定子序列坐標，並指定序列算法程式參數。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。然後，序列比較算法將基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性%。對序列實施比對以供比較之方法為業內所熟知。可藉由例如以下方式對序列實施最佳比對以供比較：Smith及Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c之局部同源性算法、Needleman及Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443之同源性比對算法、Pearson及Lipman, (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444之對相似性方法之探索、該等算法之電腦化執行方案(Wisconsin Genetics軟體包中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)或人工比對及目視檢查(參見例如Brent等人(2003) Current Protocols in Molecular Biology)。 適用於測定序列一致性及序列相似性%之演算法之兩個實例係BLAST及BLAST 2.0演算法，其分別闡述於Altschul等人(1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402；及Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410中。用於實施BLAST分析之軟體可經由National Center for Biotechnology Information公開獲得。 兩條胺基酸序列之間之一致性%可使用已併入ALIGN程式(2.0版)中之E. Meyers及W. Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)之算法、使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4來測定。此外，兩條胺基酸序列之間之一致性%可使用已納入GCG軟體包(在www.gcg.com上獲得)中之GAP程式中之Needleman及Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)算法、使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣及空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來測定。 在一個態樣中，本發明涵蓋起始抗體或片段(例如，scFv)胺基酸序列之產生功能等效分子之修飾。舉例而言，包含在CAR中之CD20結合域(例如scFv)之VH或VL可經修飾以保留CD20結合域(例如scFv)之起始VH或VL框架區之至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%+、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。本發明涵蓋整個CAR構築體之修飾(例如CAR構築體之各個域之一或多個胺基酸序列之修飾)以產生功能等效分子。CAR構築體可經修飾以保留起始CAR構築體之至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。 雙特異性CAR 在實施例中，多特異性抗體分子係雙特異性抗體分子。雙特異性抗體具有針對不超過兩種抗原之特異性。雙特異性抗體分子之特徵在於具有針對第一表位之結合特異性之第一免疫球蛋白可變域序列及具有針對第二表位之結合特異性的第二免疫球蛋白可變域序列。在實施例中，第一及第二表位處於相同抗原(例如相同蛋白質(或多聚蛋白之亞單位))上。在實施例中，第一與第二表位重疊。在實施例中，第一與第二表位不重疊。在實施例中，第一及第二表位處於不同抗原(例如，不同蛋白質(或多聚蛋白之不同亞單位))上。在實施例中，雙特異性抗體分子包含具有針對第一表位之結合特異性之重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列，及具有針對第二表位之結合特異性之重鏈可變域序列及輕鏈可變域序列。在實施例中，雙特異性抗體分子包含具有針對第一表位之結合特異性之半抗體，及具有針對第二表位之結合特異性的半抗體。在實施例中，雙特異性抗體分子包含具有針對第一表位之結合特異性之半抗體或其片段，及具有針對第二表位之結合特異性的半抗體或其片段。在實施例中，雙特異性抗體分子包含具有針對第一表位之結合特異性之scFv或其片段，及具有針對第二表位之結合特異性的scFv或其片段。在實施例中，第一表位定位於CD19上且第二表位定位於CD20、C22或ROR1上。 在某些實施例中，抗體分子係多特異性(例如，雙特異性或三特異性)抗體分子。用於產生雙特異性或異二聚體抗體分子之方案為業內已知；包括(但不限於)例如「隆凸於孔洞中」方式，例如US 5731168中所述；靜電牽引Fc配對，如例如WO 09/089004、WO 06/106905及WO 2010/129304中所述；鏈交換改造之域(SEED)異二聚體形成，如例如WO 07/110205中所述；Fab臂交換，如例如WO 08/119353、WO 2011/131746及WO 2013/060867中所述；雙抗體偶聯，例如其係使用具有胺反應性基團及硫氫基反應性基團之異雙功能試劑藉由抗體交聯來實施以產生雙特異性結構，如例如US 4433059中所述；雙特異性抗體決定子，其係藉由還原及氧化兩條重鏈之間之二硫鍵的循環重組來自不同抗體之半抗體(重鏈-輕鏈對或Fab)產生，如例如US 4444878中所述；三功能抗體，例如經由硫氫基反應性基團交聯之三個Fab'片段，如例如US5273743中所述；生物合成結合蛋白，例如經由C末端尾、較佳經由二硫鍵或胺反應性化學交聯交聯之scFv對，如例如US5534254中所述；雙功能抗體，例如經由已替代恆定域之白胺酸拉鍊(例如c-fos及c-jun)二聚化且具有不同結合特異性之Fab片段，如例如US5582996中所述；雙特異性及低特異性單價及低價受體，例如兩種抗體(兩個Fab片段)之經由一種抗體之CH1區與通常締合有輕鏈之另一抗體之VH區之間的多肽間隔體連接之VH-CH1區，如例如US5591828中所述；雙特異性DNA-抗體偶聯物，例如經由雙鏈DNA片段交聯抗體或Fab片段，如例如US5635602中所述；雙特異性融合蛋白，例如含有兩個scFv (在其與完整恆定區之間具有親水螺旋肽連接體)之表現構築體，如例如US5637481中所述；多價及多特異性結合蛋白，例如多肽之二聚體，其具有具Ig重鏈可變區之結合區域之第一域及具Ig輕鏈可變區之結合區域的第二域，通常稱為雙價抗體(亦涵蓋高次結構以產生雙特異性、三特異性或四特異性分子，如例如US5837242中所述；微小抗體構築體，其連接的VL與VH鏈藉助肽間隔體進一步連結至抗體鉸鏈區及CH3區，其可二聚化形成雙特異性/多價分子，如例如US5837821中所述；使用短肽連接體(例如5個或10個胺基酸)或根本不使用連接體以任一取向連接之VH及VL域，此可形成二聚體以形成雙特異性雙價抗體；三聚體及四聚體，如例如US5844094中所述；藉由肽鍵聯與C末端之可交聯基團連接之VH域(或家族成員之VL域)串進一步與VL域締合以形成一系列FV (或scFv)，如例如US5864019中所述；及經由肽連接體連接之具有VH及VL域二者之單鏈結合多肽經由非共價或化學交聯組合成多價結構，以形成例如使用scFV或雙價抗體型格式二者的同二價、異二價、三價及四價結構，如例如US5869620中所述。其他實例性多特異性及雙特異性分子及製備其之方法參見例如US5910573、US5932448、US5959083、US5989830、US6005079、US6239259、US6294353、US6333396、US6476198、US6511663、US6670453、US6743896、US6809185、US6833441、US7129330、US7183076、US7521056、US7527787、US7534866、US7612181、US2002004587A1、US2002076406A1、US2002103345A1、US2003207346A1、US2003211078A1、US2004219643A1、US2004220388A1、US2004242847A1、US2005003403A1、US2005004352A1、US2005069552A1、US2005079170A1、US2005100543A1、US2005136049A1、US2005136051A1、US2005163782A1、US2005266425A1、US2006083747A1、US2006120960A1、US2006204493A1、US2006263367A1、US2007004909A1、US2007087381A1、US2007128150A1、US2007141049A1、US2007154901A1、US2007274985A1、US2008050370A1、US2008069820A1、US2008152645A1、US2008171855A1、US2008241884A1、US2008254512A1、US2008260738A1、US2009130106A1、US2009148905A1、US2009155275A1、US2009162359A1、US2009162360A1、US2009175851A1、US2009175867A1、US2009232811A1、US2009234105A1、US2009263392A1、US2009274649A1、EP346087A2、WO0006605A2、WO02072635A2、WO04081051A1、WO06020258A2、WO2007044887A2、WO2007095338A2、WO2007137760A2、WO2008119353A1、WO2009021754A2、WO2009068630A1、WO9103493A1、WO9323537A1、WO9409131A1、WO9412625A2、WO9509917A1、WO9637621A2、WO9964460A1。上文所提及申請案之內容係全文以引用方式併入本文中。 實例性多特異性分子 在一些實施例中，抗體分子係多特異性(例如雙特異性)抗體分子，其包含一種、兩種或更多種結合特異性，例如針對第一抗原(例如B細胞表位)之第一結合特異性及針對相同或不同抗原(例如B細胞表位)之第二結合特異性。 在一個實施例中，第一及第二結合特異性係抗體分子，例如抗原結合域(例如，scFv)。在雙特異性抗體分子之每一抗體分子(例如，scFv)內，VH可在VL之上游或下游。在一些實施例中，上游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VL2 -VH2 。 在一些實施例中，上游抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)經排列其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VH2 -VL2 。 在一些實施例中，上游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VL2 -VH2 。 在一些實施例中，上游抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)經排列其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VH2 -VL2 。 在上述構形中之任一者中，視情況，連接體置於兩個抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)之間，例如若構築體排列為VH1 -VL1 -VL2 -VH2 則連接體置於VL1 與VL2 之間；若構築體排列為VL1 -VH1 -VH2 -VL2 則連接體置於VH1 與VH2 之間；若構築體排列為VL1 -VH1 -VL2 -VH2 則連接體置於VH1 與VL2 之間；或若構築體排列為VH1 -VL1 -VH2 -VL2 則連接體置於VL1 與VH2 之間。一般而言，兩個抗體片段或抗原結合域(例如scFv)之間之連接體應足夠長以避免兩個scFv之域之間錯配。連接體可為如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK (例如由其組成)。 在上述構形中之任一者中，視情況，連接體置於第一抗原結合域(例如scFv)之VL與VH之間。視情況，連接體置於第二抗原結合域(例如scFv)之VL與VH之間。在具有多個連接體之構築體中，任兩個或更多個連接體可相同或不同。因此，在一些實施例中，雙特異性CAR包含VL、VH及視情況一或多個呈如本文所述排列之連接體。 在一些實施例中，每一抗體分子、例如每一抗原結合域(例如，每一scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在其他實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在某些實施例中，抗體分子係雙特異性抗體分子，其具有針對第一B細胞表位之第一結合特異性及針對相同或不同B細胞抗原之第二結合特異性。例如，在一些實施例中，雙特異性抗體分子具有針對CD20之第一結合特異性及針對CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中之一或多者之第二結合特異性。在一些實施例中，雙特異性抗體分子具有針對CD19之第一結合特異性及針對CD20之第二結合特異性。在一些實施例中，雙特異性抗體分子具有針對CD19之第一結合特異性及針對CD22之第二結合特異性。 在一個實施例中，抗體分子係具有結合特異性(例如針對CD19之第一及/或第二結合特異性)之雙特異性抗體分子。在一個實施例中，結合特異性經構形其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VL2 -VH2 。在一個實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如CTL019 scFv (SEQ ID NO: 765)。在一些實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如人類化CD19 scFv，例如人類化CAR2。在一些實施例中，針對CD19之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD19之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD19之第一及/或第二結合特異性)經構形其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VH2 -VL2 。在一個實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如CTL019 scFv (SEQ ID NO: 765)。在一些實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如人類化CD19 scFv，例如人類化CAR2。在一些實施例中，針對CD19之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD19之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD19之第一及/或第二結合特異性)經構形其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VL2 -VH2 。在一個實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如CTL019 scFv (SEQ ID NO: 765)。在一些實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如人類化CD19 scFv，例如人類化CAR2。在一些實施例中，針對CD19之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD19之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD19之第一及/或第二結合特異性)經構形其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VH2 -VL2 。在一個實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如CTL019 scFv (SEQ ID NO: 765)。在一些實施例中，CD19結合特異性包含如表11中所繪示之VH及VL，例如人類化CD19 scFv，例如人類化CAR2。在一些實施例中，針對CD19之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD19之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，抗體分子係具有結合特異性(例如針對CD20之第一及/或第二結合特異性)之雙特異性抗體分子。在一個實施例中，結合特異性經構形其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VL2 -VH2 。在一個實施例中，CD20結合特異性包含如表1中所繪示之VH及VL，例如C3H2 scFv或C5H1 scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD20之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD20之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD20之第一及/或第二結合特異性)經構形其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VH2 -VL2 。在一個實施例中，CD20結合特異性包含如表1中所繪示之VH及VL，例如C3H2 scFv或C5H1 scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD20之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD20之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD20之第一及/或第二結合特異性)經構形其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VL2 -VH2 。在一個實施例中，CD22結合特異性包含如表1中所繪示之VH及VL，例如C3H2 scFv或C5H1 scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD20之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD20之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD20之第一及/或第二結合特異性)經構形其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VH2 -VL2 。在一個實施例中，CD22結合特異性包含如表1中所繪示之VH及VL，例如C3H2 scFv或C5H1 scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD20之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD20之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接。 在另一實施例中，抗體分子係具有結合特異性(例如針對CD22之第一及/或第二結合特異性)之雙特異性抗體分子。在一個實施例中，結合特異性經構形其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VL2 -VH2 。在一個實施例中，CD22結合特異性包含如表6中所繪示之VH及VL，例如CD22-65或CD22-65KD scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD22之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD22之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser，例如如在CD22-65s scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3，例如如在CD22-65 scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接，例如如在CD22-65ss scFv中。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD22之第一及/或第二結合特異性)經構形其VL (VL1 )在其VH (VH1 )上游且下游抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VL1 -VH1 -VH2 -VL2 。在一個實施例中，CD22結合特異性包含如表6中所繪示之VH及VL，例如CD22-65或CD22-65KD scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD22之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD22之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser，例如如在CD22-65s scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3，例如如在CD22-65 scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接，例如如在CD22-65ss scFv中。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD22之第一及/或第二結合特異性)經構形其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)經排列其VL (VL2 )在其VH (VH2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VL2 -VH2 。在一個實施例中，CD22結合特異性包含如表6中所繪示之VH及VL，例如CD22-65或CD22-65KD scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD22之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD22之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser，例如如在CD22-65s scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3，例如如在CD22-65 scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接，例如如在CD22-65ss scFv中。 在另一實施例中，結合特異性(例如針對CD22之第一及/或第二結合特異性)經構形其VH (VH1 )在其VL (VL1 )上游且下游抗體或抗體片段或抗原結合域(例如，scFv)經排列其VH (VH2 )在其VL (VL2 )上游，使得整體雙特異性抗體分子自N末端至C末端定向具有排列VH1 -VL1 -VH2 -VL2 。在一個實施例中，CD22結合特異性包含如表6中所繪示之VH及VL，例如CD22-65或CD22-65KD scFv之VH及VL。在一些實施例中，針對CD22之第一及/或第二結合特異性(例如，針對CD22之第一及/或第二scFv)包含VH區與VL區之間之連接體。在一些實施例中，VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser，例如如在CD22-65s scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3，例如如在CD22-65 scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接，例如如在CD22-65ss scFv中。 在一些實施例中，雙特異性抗體分子包含針對CD19之第一結合特異性(例如本文所述針對CD19之結合特異性中之任一者)及針對CD22之第二結合特異性(例如本文所述針對CD22之結合特異性中之任一者)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK (例如由其組成)。 在一個實施例中，雙特異性抗體分子包含針對CD19之第一結合特異性(例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性)及針對CD22之第二結合特異性(例如針對CD22之VL2-VH2或VH2-VL1結合特異性)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK (例如由其組成)。 在一個實施例中，雙特異性抗體分子包含針對CD22之第一結合特異性(例如針對CD22之VL2-VH2或VH2-VL1結合特異性)及針對CD19之第二結合特異性(例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK (例如由其組成)。 兩個或更多個抗體分子(例如如本文所述)可連接提供多特異性抗體分子，例如雙特異性、三特異性或更多特異性抗體分子。 在一些實施例中，上述多特異性(例如雙特異性)抗體分子中之任一者存在於如本文所述之CAR分子中。在實施例中，CAR分子包含包括第一及第二結合特異性、例如如本文所述(例如兩個抗體分子，例如兩個如本文所述之scFv)之雙特異性CAR。在一些實施例中，雙特異性CAR包含兩個抗體分子，其中第一結合特異性、例如第一抗體分子(例如第一抗原結合域，例如第一scFv)靠近跨膜域，在本文中亦稱為近端抗體分子(例如，近端抗原結合域)，且第二結合特異性、例如第二抗體分子(例如第二抗原結合域，例如第二scFv)遠離膜，在本文中亦稱為遠端抗體分子(例如，遠端抗原結合域)。因此，自N末端至C末端，CAR分子包含遠端結合特異性、例如遠端抗體分子(例如遠端抗原結合域，例如遠端scFV或scFv2)，視情況連接體，其後為近端結合特異性、例如近端抗體分子(例如近端抗原結合域，例如近端scFv或scFv1)，視情況經由連接體，至跨膜域及細胞內域，例如如本文所述。雙特異性CAR構形之示意圖繪示於圖27中。 在一些實施例中，CAR分子包含包括第一及第二結合特異性之雙特異性CAR。在一些實施例中，雙特異性CAR包含針對B細胞表位之第一結合特異性及針對相同或不同B細胞抗原之第二結合特異性。例如，在一些實施例中，雙特異性CAR分子具有針對CD20之第一結合特異性及針對CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中之一或多者之第二結合特異性。在一些實施例中，雙特異性CAR分子具有針對CD19之第一結合特異性及針對CD20之第二結合特異性。在一些實施例中，雙特異性CAR分子具有針對CD19之第一結合特異性及針對CD22之第二結合特異性。在一些實施例中，雙特異性CAR分子具有針對CD22之第一結合特異性及針對CD20之第二結合特異性。 在一些實施例中，CAR分子包含針對CD19之近端或遠端結合特異性，例如如本文所述之CD19結合特異性。在一個實施例中，CAR分子包含針對CD19之近端結合特異性(例如如本文所述之CD19結合特異性)及針對CD20之遠端結合特異性(例如如本文所述之CD20結合特異性)。在一個實施例中，CAR分子包含針對CD19之近端結合特異性(例如如本文所述之CD19結合特異性)及針對CD22之遠端結合特異性(例如如本文所述之CD22結合特異性)。在一個實施例中，CAR分子包含針對CD20之近端結合特異性(例如如本文所述之CD20結合特異性)及針對CD19之遠端結合特異性(例如如本文所述之CD19結合特異性)。在一個實施例中，CAR分子包含針對CD22之近端結合特異性(例如如本文所述之CD22結合特異性)及針對CD19之遠端結合特異性(例如如本文所述之CD19結合特異性)。 在一些實施例中，CAR分子包含針對CD22之近端或遠端結合特異性，例如如本文所述之CD22結合特異性。在一個實施例中，CAR分子包含針對CD22之近端結合特異性(例如如本文所述之CD22結合特異性)及針對CD20之遠端結合特異性(例如如本文所述之CD20結合特異性)。在一個實施例中，CAR分子包含針對CD20之近端結合特異性(例如如本文所述之CD20結合特異性)及針對CD22之遠端結合特異性(例如如本文所述之CD22結合特異性)。 在一個實施例中，CAR分子包含針對CD19之膜遠端結合特異性(例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性)及針對CD22之膜近端結合特異性(例如針對CD22之VL2-VH2或VH2-VL1結合特異性)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK (例如由其組成)。在一個實施例中，CAR分子包含針對CD19之膜遠端結合特異性，例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性，視情況Gly4 -Ser連接體或LAEAAAK連接體。在實施例中，CD22結合特異性包含CD22 VH及VL，其中VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser，例如如在CD22-65s scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3，例如如在CD22-65 scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接，例如如在CD22-65ss scFv中。 在一個實施例中，CAR分子包含針對CD19之膜近端結合特異性(例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性)及針對CD22之膜遠端結合特異性(例如針對CD22之VL2-VH2或VH2-VL1結合特異性)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK (例如由其組成)。在一個實施例中，CAR分子包含針對CD19之膜近端結合特異性，例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性，視情況Gly4 -Ser連接體或LAEAAAK連接體。在實施例中，CD22結合特異性包含CD22 VH及VL，其中VH區與VL區之間之連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser，例如如在CD22-65s scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 3，例如如在CD22-65 scFv中。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，VH區及VL區不使用連接體連接，例如如在CD22-65ss scFv中。 在一些實施例中，CAR分子包含針對CD20之近端或遠端結合特異性，例如如本文所述之CD20結合特異性。 在一個實施例中，CAR分子包含針對CD19之膜遠端結合特異性(例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性)及針對CD20之膜近端結合特異性(例如針對CD20之VL2-VH2或VH2-VL1結合特異性)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK (例如由其組成)。 在一些實施例中，CAR分子包含針對CD20之近端或遠端結合特異性，例如如本文所述之CD20結合特異性。在一個實施例中，CAR分子包含針對CD19之膜近端結合特異性(例如針對CD19之VL1-VH1結合特異性)及針對CD20之膜遠端結合特異性(例如針對CD20之VL2-VH2或VH2-VL1結合特異性)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK。在一些實施例中，連接體係由胺基酸序列：LAEAAAK組成。 在一個實施例中，CAR分子包含針對CD22之膜遠端結合特異性(例如針對CD22之VL1-VH1結合特異性)及針對CD20之膜近端結合特異性(例如針對CD20之VL2-VH2或VH2-VL1結合特異性)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK (例如由其組成)。 在一些實施例中，CAR分子包含針對CD20之近端或遠端結合特異性，例如如本文所述之CD20結合特異性。在一個實施例中，CAR分子包含針對CD22之膜近端結合特異性(例如針對CD22之VL1-VH1結合特異性)及針對CD20之膜遠端結合特異性(例如針對CD20之VL2-VH2或VH2-VL1結合特異性)。在一個實施例中，第一及第二結合特異性係於一個連續多肽鏈(例如單鏈)中。在一些實施例中，第一及第二結合特異性視情況包含如本文所述之連接體。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n 連接體，其中n係1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 1，例如連接體具有胺基酸序列Gly4 -Ser。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n = 3 (SEQ ID NO: 841)。在一些實施例中，連接體係(Gly4 -Ser)n ，其中n= 4 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序列：LAEAAAK。在一些實施例中，連接體係由胺基酸序列：LAEAAAK組成 在一些實施例中，CAR分子進一步包含人類前導序列，例如N末端之人類CD8α序列。 跨膜域 關於跨膜域，在多個實施例中，CAR可經設計以包含附接至CAR之細胞外域之跨膜域。跨膜域可包括毗鄰跨膜區之一或多個其他胺基酸，例如與衍生出跨膜蛋白之蛋白質之細胞外區域締合之一或多個胺基酸(例如細胞外區域之1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個直至15個胺基酸)及/或與衍生出跨膜蛋白之蛋白質之細胞內區域締合之一或多個其他胺基酸(例如細胞內區域之1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個直至15個胺基酸)。在一個態樣中，跨膜域係與CAR之其他域中之一者締合之域，例如在一個實施例中，跨膜域可來自衍生出信號傳導域、共刺激域或鉸鏈域之相同蛋白質。在另一態樣中，跨膜域並非衍生自衍生出CAR之任何其他域之相同蛋白質。在一些情況下，跨膜域可藉由胺基酸取代選擇或修飾以避免該等域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜域結合，例如以最小化與受體複合物之其他成員的相互作用。在一個態樣中，跨膜域能夠與CAR表現細胞之細胞表面上之另一CAR同二聚化。在不同態樣中，跨膜域之胺基酸序列可經修飾或取代以最小化與存在於同一CAR表現細胞中之天然結合伴侶之結合域的相互作用。 跨膜域可源自天然或重組來源。在來源為天然時，該域可源自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。在一個態樣中，每當CAR已結合至靶時，跨膜域皆能夠信號傳導至細胞內域。尤其用於本發明中之跨膜域可包括至少例如以下各項之跨膜區：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD22、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例如，CD8α、CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些實施例中，跨膜域可包括至少例如以下各項之跨膜區：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a、CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp。 在一些情況下，跨膜域可經由鉸鏈(例如，來自人類蛋白質之鉸鏈)附接至CAR之細胞外區域，例如CAR之抗原結合域。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈可為人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈(例如IgG4鉸鏈、IgD鉸鏈)、GS連接體(例如，本文所述之GS連接體)、KIR2DS2鉸鏈或CD8a鉸鏈。在一個實施例中，鉸鏈或間隔體包含SEQ ID NO: 799之胺基酸序列(例如，由其組成)。在一個態樣中，跨膜域包含SEQ ID NO: 801之跨膜域(例如，由其組成)。 在一個態樣中，鉸鏈或間隔體包含IgG4鉸鏈。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈或間隔體包含胺基酸序列SEQ ID NO: 814之鉸鏈。在一些實施例中，鉸鏈或間隔體包含由SEQ ID NO: 815之核酸序列編碼之鉸鏈。 在一個態樣中，鉸鏈或間隔體包含IgD鉸鏈。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈或間隔體包含胺基酸序列SEQ ID NO: 816之鉸鏈。在一些實施例中，鉸鏈或間隔體包含由(SEQ ID NO: 817)之核酸序列編碼之鉸鏈。 在一個態樣中，跨膜域可為重組域，在該情形下其將主要包含疏水殘基，例如白胺酸及纈胺酸。在一個態樣中，可發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體位於重組跨膜域之每一端。 視情況，長度介於2個與10個胺基酸之間之短寡肽或多肽連接體可在CAR之跨膜域與細胞質區域之間形成鏈接。甘胺酸-絲胺酸雙聯體提供尤其適宜之連接體。舉例而言，在一個態樣中，連接體包含GGGGS (SEQ ID NO: 834)之胺基酸序列。 在一個態樣中，鉸鏈或間隔體包含KIR2DS2鉸鏈。 細胞質域 CAR之細胞質域或區域包括細胞內信號傳導域。細胞內信號傳導域能夠活化其中已引入CAR之免疫細胞之至少一種正常效應物功能。術語「效應物功能」係指細胞之特殊功能。T細胞之效應物功能例如可為細胞溶解活性或輔助活性，包括分泌細胞介素。因此，術語「細胞內信號傳導域」係指轉導效應物功能信號且定向細胞以實施特殊功能之蛋白質部分。儘管通常可採用整個細胞內信號傳導域，但在許多情形下無需使用整條鏈。就使用細胞內信號傳導域之截短部分而言，可使用該截短部分來替代完整鏈，只要其轉導效應物功能信號即可。因此，術語細胞內信號傳導域意欲包括細胞內信號傳導域之足以轉導效應物功能信號之任何截短部分。 用於本發明CAR中之細胞內信號傳導域之實例包括T細胞受體(TCR)及在抗原受體接合後協同起起始信號轉導作用之共受體的細胞質序列，以及該等序列之任何衍生物或變體及具有相同功能性能力之任何重組序列。 已知僅經由TCR產生之信號不足以完全活化T細胞，且亦需要次級或共刺激信號。因此，可認為T細胞活化係由兩類不同的細胞質信號傳導序列來調介：經由TCR (初級細胞內信號傳導域)起始抗原依賴性初級活化之彼等，及以非抗原依賴性方式起提供次級或共刺激信號(次級細胞質信號傳導域，例如共刺激域)作用之彼等。 初級信號傳導域以刺激方式或以抑制方式調控TCR複合物之初級活化。以刺激方式起作用之初級細胞內信號傳導域可含有信號傳導基序，稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM。 尤其用於本發明中之含有ITAM之初級細胞內信號傳導域之實例包括以下各項之彼等：CD3ζ、共有FcRγ (FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ (FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10及DAP12。在一個實施例中，本發明CAR包含細胞內信號傳導域，例如CD3-ζ之初級信號傳導域。 在一個實施例中，初級信號傳導域包含經修飾ITAM域，例如與天然ITAM域相比具有改變(例如，增加或降低)的活性之突變ITAM域。在一個實施例中，初級信號傳導域包含含有經修飾ITAM之初級細胞內信號傳導域，例如含有最佳化及/或截短ITAM之初級細胞內信號傳導域。在實施例中，初級信號傳導域包含一個、兩個、三個、四個或更多個ITAM基序。 尤其用於本發明中之含有初級細胞內信號傳導域之分子之其他實例包括DAP10、DAP12及CD32之彼等。 CAR之細胞內信號傳導域可包含初級信號傳導域(例如CD3-ζ信號傳導域)本身，或其可與可用於本發明CAR情況下之任何其他期望細胞內信號傳導域組合。舉例而言，CAR之細胞內信號傳導域可包含初級信號傳導域(例如CD3-ζ信號傳導域)及共刺激信號傳導域。共刺激信號傳導域係指包含共刺激分子之細胞內域之CAR部分。共刺激分子係淋巴球有效因應抗原所需之除抗原受體或其配體外之細胞表面分子。該等分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1) (CD11a及CD18)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合之配體及諸如此類。舉例而言已展示，CD27共刺激增強活體外人類CART細胞之擴增、效應物功能及存活，且增加活體內人類T細胞持久性及抗腫瘤活性(Song等人，Blood. 2012; 119(3):696-706)。該等共刺激分子之其他實例包括NKp44、NKp30、NKp46、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD16a、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76及PAG/Cbp。 本發明CAR之細胞質部分內之細胞內信號傳導序列可以隨機或指定順序彼此連接。視情況，例如長度介於2個與10個胺基酸之間(例如，2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸)之短寡肽或多肽連接體可在細胞內信號傳導序列之間形成鏈接。在一個實施例中，可使用甘胺酸-絲胺酸雙聯體作為適宜連接體。在一個實施例中，可使用單一胺基酸(例如，丙胺酸、甘胺酸)作為適宜連接體。 在一個態樣中，細胞內信號傳導域經設計以包含兩個或更多個(例如，2個、3個、4個、5個或更多個)共刺激信號傳導域。在實施例中，兩個或更多個(例如，2個、3個、4個、5個或更多個)共刺激信號傳導域藉由連接體分子(例如，本文所述之連接體分子)分開。在一個實施例中，細胞內信號傳導域包含兩個共刺激信號傳導域。在一些實施例中，連接體分子係甘胺酸殘基。在一些實施例中，連接體係丙胺酸殘基。 在一個態樣中，細胞內信號傳導域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導域及CD28之信號傳導域。在一個態樣中，細胞內信號傳導域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導域及4-1BB之信號傳導域。在一個態樣中，4-1BB之信號傳導域係SEQ ID NO: 803之信號傳導域。在一個態樣中，CD3-ζ之信號傳導域係SEQ ID NO: 805之信號傳導域。 在一個態樣中，細胞內信號傳導域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導域及CD27之信號傳導域。在一個態樣中，CD27之信號傳導域包含SEQ ID NO: 818之胺基酸序列。在一個態樣中，CD27之信號傳導域係由SEQ ID NO: 819之核酸序列編碼。 在一個態樣中，本文所述之CAR表現細胞可進一步包含第二CAR，例如包括例如針對相同靶(CD20)或不同靶(例如，CD22、CD19、ROR1、CD10、CD33、CLL-1、CD34、CD123、FLT3、CD79b、CD179b及CD79a)之不同抗原結合域的第二CAR。在一個實施例中，第二CAR包括針對在急性骨髓性白血病細胞上表現之靶(例如CD22、CD19、ROR1、CD10、CD33、CLL-1、CD34、CD123、FLT3、CD79b、CD179b及CD79a)之抗原結合域。在一個實施例中，CAR表現細胞包含靶向第一抗原且包括具有共刺激信號傳導域但不具初級信號傳導域之細胞內信號傳導域的第一CAR，及靶向第二不同抗原且包括具有初級信號傳導域但不具共刺激信號傳導域之細胞內信號傳導域的第二CAR。儘管不希望受限於理論，將共刺激信號傳導域(例如4-1BB、CD28、CD27或OX-40)置於第一CAR上且將初級信號傳導域(例如CD3ζ)置於第二CAR上可將CAR活性限於表現兩個靶之細胞。在一個實施例中，CAR表現細胞包含包括CD20結合域、跨膜域及共刺激域之第一CD20 CAR，及靶向除CD20外之抗原(例如在AML細胞上表現之抗原，例如CD22、CD19、ROR1、CD10、CD33、CLL-1、CD34、CD123、FLT3、CD79b、CD179b或CD79a)且包括抗原結合域、跨膜域及初級信號傳導域之第二CAR。在另一實施例中，CAR表現細胞包含包括CD20結合域、跨膜域及初級信號傳導域之第一CD20 CAR，及靶向除CD20外之抗原(例如在AML細胞上表現之抗原，例如CD22、CD19、ROR1、CD10、CD33、CD123、CLL-1、CD34、FLT3、CD79b、CD179b或CD79a)且包括針對抗原之抗原結合域、跨膜域及共刺激信號傳導域的第二CAR。 在一個實施例中，CAR表現細胞包含本文所述之CD20 CAR及抑制性CAR。在一個實施例中，抑制性CAR包含結合在正常細胞而非癌細胞(例如亦表現CD20之正常細胞)上發現之抗原之抗原結合域。在一個實施例中，抑制性CAR包含抑制性分子之抗原結合域、跨膜域及細胞內域。舉例而言，抑制性CAR之細胞內域可為PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFβ之細胞內域。 在一個實施例中，當CAR表現細胞包含兩個或更多個不同CAR時，不同CAR之抗原結合域可使得該等抗原結合域不彼此相互作用。舉例而言，表現第一及第二CAR之細胞可具有不與第二CAR之抗原結合域形成締合之第一CAR之抗原結合域(例如，呈片段形式，例如scFv)，例如第二CAR之抗原結合域為VHH。 在一些實施例中，抗原結合域包含單一域抗原結合(SDAB)分子，包括互補決定區為單一域多肽之一部分之分子。實例包括(但不限於)重鏈可變域、通常不含輕鏈之結合分子、源自習用4鏈抗體之單一域、經改造域及除源自抗體之彼等外之單一域支架。SDAB分子可為現有技術中之任一者或任一將來單一域分子。SDAB分子可源自任何物種，包括(但不限於)小鼠、人類、駱駝、美洲駝、七鰓鰻、魚、鯊魚、山羊、兔及牛。此術語亦包括來自除駱駝科動物(Camelidae)及鯊魚外之物種之天然單一域抗體分子。 在一個態樣中，SDAB分子可源自在魚中發現之免疫球蛋白之可變區，例如其源自在鯊魚血清中發現之稱為新穎抗原受體(NAR)之免疫球蛋白同型。產生源自NAR可變區之單一域分子(「IgNAR」)之方法闡述於WO 03/014161及Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909中。 根據另一態樣，SDAB分子係天然單一域抗原結合分子，稱為不含輕鏈之重鏈。該等單一域分子揭示於例如WO 9404678及Hamers-Casterman, C.等人(1993) Nature 363:446-448中。為簡潔起見，源自通常不含輕鏈之重鏈分子之此可變域在本文中稱為VHH或奈米抗體，以區分其與四鏈免疫球蛋白之習用VH。此一VHH分子可源自駱駝科動物物種，例如駱駝、美洲駝、單峰駱駝、羊駝及原駝。除駱駝科動物外之其他物種亦可產生通常不含輕鏈之重鏈分子；該等VHH在本發明之範圍內。 SDAB分子可為重組、CDR移植、人類化、駱駝化、去免疫化及/或活體外產生的(例如藉由噬菌體展示選擇)。 亦已發現，具有包含在受體之抗原結合域之間相互作用之抗原結合域的複數個嵌合膜包埋受體之細胞可不合意，例如此乃因其抑制一或多個抗原結合域結合其同源抗原之能力。因此，本文揭示具有包含最小化該等相互作用之抗原結合域之第一及第二非天然嵌合膜包埋受體之細胞。本文亦揭示編碼包含最小化該等相互作用之抗原結合域之第一及第二非天然嵌合膜包埋受體之核酸、以及製備及使用該等細胞及核酸之方法。在實施例中，該第一及該第二非天然嵌合膜包埋受體中之一者之抗原結合域包含scFv，且另一者包含單一VH域，例如駱駝科動物、鯊魚或七鰓鰻單一VH域或源自人類或小鼠序列之單一VH域。 在一些實施例中，所主張本發明包含第一及第二CAR，其中該第一及該第二CAR中之一者之抗原結合域不包含可變輕鏈域及可變重鏈域。在一些實施例中，該第一CAR及該第二CAR中之一者之抗原結合域係scFv，且另一者不為scFv。在一些實施例中，該第一CAR及該第二CAR中之一者之抗原結合域包含單一VH域，例如駱駝科動物、鯊魚或七鰓鰻單一VH域或源自人類或小鼠序列之單一VH域。在一些實施例中，該第一CAR及該第二CAR中之一者之抗原結合域包含奈米抗體。在一些實施例中，該第一CAR及該第二CAR中之一者之抗原結合域包含駱駝科動物VHH域。 在一些實施例中，該第一CAR及該第二CAR中之一者之抗原結合域包含scFv，且另一者包含單一VH域，例如駱駝科動物、鯊魚或七鰓鰻單一VH域或源自人類或小鼠序列之單一VH域。在一些實施例中，該第一CAR及該第二CAR中之一者之抗原結合域包含scFv，且另一者包含奈米抗體。在一些實施例中，該第一CAR及該第二CAR中之一者之抗原結合域包含包含scFv，且另一者包含駱駝科動物VHH域。 在一些實施例中，當存在於細胞表面上時，該第一CAR之抗原結合域與其同源抗原之結合實質上不因存在該第二CAR而減少。在一些實施例中，在該第二CAR存在下該第一CAR之抗原結合域與其同源抗原之結合為在該第二CAR不存在下該第一CAR之抗原結合域與其同源抗原之結合的85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。 在一些實施例中，當存在於細胞表面上時，該第一及該第二CAR之抗原結合域彼此之締合小於二者皆為scFv抗原結合域時。在一些實施例中，該第一及該第二CAR之抗原結合域彼此之締合比二者皆為scFv抗原結合域時小85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。 在另一態樣中，本文所述之CAR表現細胞可進一步表現另一藥劑，例如增強CAR表現細胞之活性之藥劑。舉例而言，在一個實施例中，藥劑可為抑制抑制性分子之藥劑。在一些實施例中，抑制性分子(例如，PD1)可降低CAR表現細胞引起免疫效應物反應之能力。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFβ。在一個實施例中，抑制抑制性分子之藥劑包含第一多肽(例如抑制性分子)與向細胞提供正信號之第二多肽(例如，本文所述之細胞內信號傳導域)締合。在一個實施例中，藥劑包含例如抑制性分子(例如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFβ)或該等分子中任一者之片段(例如，該等分子中任一者之細胞外域之至少一部分)的第一多肽，及為本文所述之細胞內信號傳導域(例如，包含共刺激域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文所述)及/或初級信號傳導域(例如，本文所述之CD3ζ信號傳導域)的第二多肽。在一個實施例中，藥劑包含PD1或其片段(例如PD1細胞外域之至少一部分)的第一多肽，及本文所述細胞內信號傳導域(例如，本文所述之CD28信號傳導域及/或本文所述之CD3ζ信號傳導域)之第二多肽。PD1係CD28受體家族之抑制性成員，該家族亦包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。PD-1係在活化B細胞、T細胞及骨髓細胞上表現(Agata等人，1996 Int. Immunol 8:765-75)。已展示，PD1之兩個配體PD-L1及PD-L2在結合至PD1時下調T細胞活化(Freeman等人，2000 J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人，2001 Nat Immunol 2:261-8；Carter等人，2002 Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1在人類癌症中較為豐富(Dong等人，2003 J Mol Med 81:281-7；Blank等人，2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314；Konishi等人，2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫阻抑可藉由抑制PD1與PD-L1之局部相互作用來逆轉。 在一個實施例中，藥劑包含抑制性分子(例如程式化死亡配體1 (PD1))之細胞外域(ECD)，其可融合至跨膜域及細胞內信號傳導域(例如41BB及CD3ζ) (在本文中亦稱為PD1 CAR)。在一個實施例中，PD1 CAR在與本文所述之CD20 CAR組合使用時會改良T細胞之持久性。在一個實施例中，CAR係包含PD1之細胞外域(如SEQ ID NO: 820)之PD1 CAR。在一個實施例中，PD1 CAR包含SEQ ID NO: 820之胺基酸序列。 在一個實施例中，藥劑包含編碼PD1 CAR (例如，本文所述之PD1 CAR)之核酸序列。在一個實施例中，PD1 CAR之核酸序列係SEQ ID NO: 821。 在另一態樣中，本發明提供CAR表現細胞(例如，CART細胞或CAR表現NK細胞)群體。在一些實施例中，CAR表現細胞群體包含表現不同CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括第一細胞，其表現具有本文所述CD20結合域之CAR；及第二細胞，其表現具有不同CD20結合域(例如，本文所述不同於第一細胞所表現之CAR之CD20結合域的CD20結合域)之CAR。作為另一實例，CAR表現細胞群體可包括第一細胞，其表現包括CD20結合域(例如如本文所述)之CAR；及第二細胞，其表現包括針對除CD20外之靶(例如，CD22、CD19、ROR1、CD10、CD33、CD34、CLL-1、CD123、FLT3、CD79b、CD179b或CD79a)之抗原結合域之CAR。在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括例如第一細胞，其表現包括初級細胞內信號傳導域之CAR；及第二細胞，其表現包括次級信號傳導域(例如共刺激信號傳導域)之CAR。 在另一態樣中，本發明提供細胞群體，其中群體中之至少一個細胞表現具有本文所述CD20結合域之CAR，及表現另一藥劑(例如，增強CAR表現細胞之活性之藥劑)之第二細胞。舉例而言，在一個實施例中，藥劑可為抑制抑制性分子之藥劑。在一些實施例中，抑制性分子可例如降低CAR表現細胞引起免疫效應物反應之能力。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFβ。在一個實施例中，抑制抑制性分子之藥劑包含第一多肽(例如抑制性分子)與向細胞提供正信號之第二多肽(例如，本文所述之細胞內信號傳導域)締合。在一個實施例中，藥劑包含例如抑制性分子(例如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFβ)或該等分子中任一者之片段(例如，該等分子中任一者之細胞外域之至少一部分)的第一多肽，及為本文所述之細胞內信號傳導域(例如，包含共刺激域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文所述)及/或初級信號傳導域(例如，本文所述之CD3ζ信號傳導域)的第二多肽。在一個實施例中，藥劑包含PD1或其片段(例如，PD1之細胞外域之至少一部分)之第一多肽，及本文所述之細胞內信號傳導域(例如，本文所述之CD28信號傳導域及/或本文所述之CD3ζ信號傳導域)之第二多肽。 在一個態樣中，本發明提供方法，其包含投與CAR表現細胞群體(例如CAR表現細胞，例如表現不同CAR之細胞之混合物)與另一藥劑(例如激酶抑制劑，例如本文所述之激酶抑制劑)之組合。在另一態樣中，本發明提供方法，其包含投與細胞群體(其中群體中之至少一個細胞表現具有如本文所述抗癌症相關抗原結合域之CAR)及表現另一藥劑(例如增強CAR表現細胞之活性之藥劑)之第二細胞，與另一藥劑(例如激酶抑制劑，例如本文所述之激酶抑制劑)之組合。可調控嵌合抗原受體 在一些實施例中，其中可控制CAR活性之可調控CAR (RCAR)期望最佳化CAR療法之安全性及效能。存在可調控CAR活性之許多方式。舉例而言，可使用利用例如融合至二聚化域之半胱天冬酶之誘導型細胞凋亡(參見例如Di Stasa等人，N Engl. J. Med. 2011年11月3日; 365(18):1673-1683)作為本發明CAR療法中之安全開關。在一個實施例中，表現本發明CAR之細胞(例如，T細胞或NK細胞)進一步包含誘導型細胞凋亡開關，其中人類半胱天冬酶(例如，半胱天冬酶9)或經修飾形式融合至人類FKB蛋白之容許條件二聚化之修飾。在小分子(例如雷帕黴素類似物(例如，AP 1903、AP20187))存在下，誘導型半胱天冬酶(例如，半胱天冬酶9)經活化且引起表現本發明CAR之細胞(例如，T細胞或NK細胞)快速凋亡及死亡。基於半胱天冬酶之誘導型細胞凋亡開關(或此一開關之一或多個態樣)之實例已闡述於例如US2004040047；US20110286980；US20140255360；WO1997031899；WO2014151960；WO2014164348；WO2014197638；WO2014197638中；該等專利皆以引用方式併入本文中。 在態樣中，RCAR包含多肽之集合，在最簡單實施例中通常為兩種多肽之集合，其中本文所述標準CAR之組分(例如，抗原結合域及細胞內信號傳導域)分配在各別多肽或成員上。在一些實施例中，多肽之集合包括在二聚化分子存在時可使多肽彼此偶合(例如，可使抗原結合域偶合至細胞內信號傳導域)之二聚化開關。在一個實施例中，本發明之CAR利用如例如WO2014127261中所述之彼等二聚化開關，該專利以引用方式併入本文中。 在態樣中，RCAR包含兩個多肽或構件：1)細胞內信號傳導構件，其包含細胞內信號傳導域(例如本文所述之初級細胞內信號傳導域)及第一開關域；2)抗原結合構件，其包含例如如本文所述靶向CD19之抗原結合域及第二開關域。視情況，RCAR包含本文所述之跨膜域。在實施例中，跨膜域可置於細胞內信號傳導構件上、抗原結合構件上或二者上。(除非另有指示，否則當於本文中闡述RCAR之構件或元件時，順序可如所提供，但亦包括其他順序。換言之，在實施例中，順序係如文中所闡釋，但在其他實施例中，順序可不同。例如，跨膜區一側上之元件之順序可與實例不同，例如開關域相對於細胞內信號傳導域之位置可不同，例如顛倒)。 在實施例中，第一及第二開關域可形成細胞內或細胞外二聚化開關。在實施例中，二聚化開關可為同二聚化開關，例如在第一與第二開關域相同時；或異二聚化開關，例如在第一與第二開關域彼此不同時。 在實施例中，RCAR可包含「多開關」。多開關可包含異二聚化開關域或同二聚化開關域。在第一構件(例如，抗原結合構件)及第二構件(例如，細胞內信號傳導構件)上多開關獨立地包含複數個(例如，2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個)開關域。在實施例中，第一構件可包含複數個第一開關域，例如基於FKBP之開關域，且第二構件可包含複數個第二開關域，例如基於FRB之開關域。在實施例中，第一構件可包含第一及第二開關域，例如基於FKBP之開關域及基於FRB之開關域，且第二構件可包含第一及第二開關域，例如基於FKBP之開關域及基於FRB之開關域。 在實施例中，細胞內信號傳導構件包含一或多個細胞內信號傳導域(例如初級細胞內信號傳導域)及一或多個共刺激信號傳導域。 在實施例中，抗原結合構件可包含一或多個細胞內信號傳導域，例如一或多個共刺激信號傳導域。在實施例中，抗原結合構件包含複數個(例如，2個或3個)例如選自41BB、CD28、CD27、ICOS及OX40之本文所述之共刺激信號傳導域，且在實施例中，不含初級細胞內信號傳導域。在實施例中，抗原結合成員自細胞外至細胞內方向包含以下共刺激信號傳導域：41BB-CD27；41BB-CD27；CD27-41BB；41BB-CD28；CD28-41BB；OX40-CD28；CD28-OX40；CD28-41BB；或41BB-CD28。在該等實施例中，細胞內結合構件包含CD3ζ域。在一個該實施例中，RCAR包含(1)抗原結合構件，其包含抗原結合域、跨膜域及兩個共刺激域及第一開關域；及(2)細胞內信號傳導域，其包含跨膜域或膜系鏈域及至少一個初級細胞內信號傳導域及第二開關域。 實施例提供其中抗原結合構件並不系鏈至CAR細胞之表面之RCAR。此容許具有細胞內信號傳導構件之細胞便捷地與一或多個抗原結合域配對，而不使用編碼抗原結合構件之序列轉形細胞。在該等實施例中，RCAR包含：1)細胞內信號傳導構件，其包含：第一開關域、跨膜域、細胞內信號傳導域(例如，初級細胞內信號傳導域)及第一開關域；及2)抗原結合構件，其包含：抗原結合域及第二開關域，其中抗原結合構件不包含跨膜域或膜系鏈域，且視情況不包含細胞內信號傳導域。在一些實施例中，RCAR可進一步包含3)第二抗原結合構件，其包含：第二抗原結合域，例如結合與抗原結合域所結合之抗原不同之抗原的第二抗原結合域；及第二開關域。 本文亦提供其中抗原結合構件包含雙特異性活化及靶向能力之RCAR。在此實施例中，抗原結合構件可包含複數個(例如，2個、3個、4個或5個)抗原結合域，例如scFv，其中每一抗原結合域結合至靶抗原，例如不同抗原或相同抗原，例如相同抗原上之相同或不同表位。在實施例中，複數個抗原結合域為串聯的，且視情況，連接體或鉸鏈區置於每一抗原結合域之間。適宜連接體及鉸鏈區闡述於本文中。 實施例提供具有容許增殖轉換之構形之RCAR。在此實施例中，RCAR包含：1)細胞內信號傳導構件，其包含：視情況跨膜域或膜系鏈域；一或多個例如選自41BB、CD28、CD27、ICOS及OX40之共刺激信號傳導域，及開關域；及2)抗原結合構件，其包含：抗原結合域、跨膜域及初級細胞內信號傳導域(例如，CD3ζ域)，其中抗原結合構件不包含開關域，或不包含與細胞內信號傳導構件上之開關域二聚化之開關域。在實施例中，抗原結合構件不包含共刺激信號傳導域。在實施例中，細胞內信號傳導構件包含來自同二聚化開關之開關域。在實施例中，細胞內信號傳導構件包含異二聚化開關之第一開關域，且RCAR包含包括異二聚化開關之第二開關域之第二細胞內信號傳導構件。在該等實施例中，第二細胞內信號傳導構件包含與細胞內信號傳導構件相同之細胞內信號傳導域。在實施例中，二聚化開關在細胞內。在實施例中，二聚化開關在細胞外。 在本文所述之任一RCAR構形中，第一及第二開關域包含如本文所述基於FKBP-FRB之開關。 本文亦提供包含本文所述RCAR之細胞。可使用經改造以表現RCAR之任何細胞作為RCARX細胞。在實施例中，RCARX細胞係T細胞，且稱為RCART細胞。在實施例中，RCARX細胞係NK細胞，且稱為RCARN細胞。 本文亦提供包含RCAR編碼序列之核酸及載體。編碼RCAR之不同元件之序列可置於相同核酸分子(例如相同質體或載體，例如病毒載體，例如慢病毒載體)上。在實施例中，(i)編碼抗原結合構件之序列及(ii)編碼細胞內信號傳導構件之序列可存在於同一核酸(例如，載體)上。例如藉由使用各別啟動子或藉由使用雙順反子轉錄產物(其可藉由裂解單一轉譯產物或藉由轉譯兩種各別蛋白質產物產生兩種蛋白質)可產生相應蛋白質。在實施例中，編碼可裂解肽之序列(例如，P2A或F2A序列)置於(i)與(ii)之間。在實施例中，編碼IRES (例如，EMCV或EV71 IRES)之序列置於(i)與(ii)之間。在該等實施例中，(i)及(ii)轉錄為單一RNA。在實施例中，第一啟動子可操作地連接至(i)且第二啟動子可操作地連接至(ii)，使得(i)及(ii)轉錄為各別mRNA。 或者，編碼RCAR之不同元件之序列可置於不同核酸分子(例如不同質體或載體，例如病毒載體，例如慢病毒載體)上。例如，(i)編碼抗原結合構件之序列可存在於第一核酸(例如，第一載體)上，且(ii)編碼細胞內信號傳導構件之序列可存在於第二核酸(例如，第二載體)上。 二聚化開關 二聚化開關可為非共價或共價的。在非共價二聚化開關中，二聚化分子促進開關域之間之非共價相互作用。在共價二聚化開關中，二聚化分子促進開關域之間之共價相互作用。 在實施例中，RCAR包含基於FKBP/FRAP或基於FKBP/FRB之二聚化開關。FKBP12 (FKBP或FK506結合蛋白)係用作天然產物免疫阻抑藥物雷帕黴素之初始細胞內靶之豐富細胞質蛋白。雷帕黴素結合至FKBP及大PI3K同源物FRAP (RAFT、mTOR)。FRB係FRAP之足以結合FKBP-雷帕黴素複合物之93胺基酸部分(Chen, J.、Zheng, X. F.、Brown, E. J.及Schreiber, S. L. (1995)Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue .Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51。) 在實施例中，基於FKBP/FRAP (例如，基於FKBP/FRB)之開關可使用二聚化分子，例如雷帕黴素或雷帕黴素類似物。 FKBP之胺基酸序列係SEQ ID NO: 824。 在實施例中，FKBP開關域可包含FKBP之在雷帕黴素或雷帕黴素類似物存在下具有與FRB (SEQ ID NO: 825)或其片段或類似物結合能力之片段。 FRB之胺基酸序列係SEQ ID NO: 826。 「基於FKBP/FRAP (例如，基於FKBP/FRB)之開關」當用於本文中時，該術語係指包含以下各項之二聚化開關：第一開關域，其包含在雷帕黴素或雷帕黴素類似物(例如，RAD001)存在下具有與FRB或其片段或類似物結合能力之FKBP片段或其類似物，且與SEQ ID NO: 824或825之FKBP序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與該序列相差不超過30個、25個、20個、15個、10個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸殘基；及第二開關域，其包含在雷帕黴素或雷帕黴素類似物存在下具有與FRB或其片段或類似物結合能力之FRB片段或其類似物，且與SEQ ID NO: 826之FRB序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性或與該序列相差不超過30個、25個、20個、15個、10個、5個、4個、3個、2個或1個胺基酸殘基。在實施例中，本文所述之RCAR包含一個包含SEQ ID NO: 824或825中所揭示之胺基酸殘基之開關域，及一個包含SEQ ID NO: 826中所揭示之胺基酸殘基的開關域。 在實施例中，FKBP/FRB二聚化開關包含經修飾FRB開關域，其在基於FRB之開關域(例如，經修飾FRB開關域)、基於FKBP之開關域與二聚化分子(例如雷帕黴素或雷帕黴素類似物，例如RAD001)之間展現經改變的(例如，增強的)複合物形成。在實施例中，經修飾FRB開關域包含一或多個突變，例如2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個選自胺基酸位置L2031、E2032、S2035、R2036、F2039、G2040、T2098、W2101、D2102、Y2105及F2108處之突變，其中野生型胺基酸係突變成任何其他天然胺基酸。在實施例中，突變體FRB包含E2032處之突變，其中E2032突變成苯丙胺酸(E2032F)、甲硫胺酸(E2032M)、精胺酸(E2032R)、纈胺酸(E2032V)、酪胺酸(E2032Y)、異白胺酸(E2032I) (例如SEQ ID NO: 827)或白胺酸(E2032L) (例如SEQ ID NO: 828)。在實施例中，突變體FRB包含T2098處之突變，其中T2098突變成苯丙胺酸(T2098F)或白胺酸(T2098L)，例如SEQ ID NO: 829。在實施例中，突變體FRB包含E2032及T2098處之突變，其中E2032突變成任何胺基酸，且其中T2098突變成任何胺基酸，例如SEQ ID NO: 830。在實施例中，突變體FRB包含E2032I及T2098L突變，例如SEQ ID NO: 831。在實施例中，突變體FRB包含E2032L及T2098L突變，例如SEQ ID NO: 832。 其他適宜二聚化開關包括基於GyrB-GyrB之二聚化開關、基於赤黴素(Gibberellin)之二聚化開關、標籤/結合劑二聚化開關及halo標籤/snap標籤二聚化開關。遵循本文所提供之指導，熟習此項技術者將明瞭該等開關及相關二聚化分子。 二聚化分子 二聚化分子會促進開關域之間之締合。在二聚化分子相互作用存在下，開關域之間之締合容許與第一開關域締合(例如，融合)之多肽與第二開關域締合(例如，融合)之多肽之間的信號轉導。在非限制性含量之二聚化分子存在下，信號轉導增加1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍，例如如本文所述之系統中所量測。 可使用雷帕黴素及雷帕黴素類似物(rapamycin analog) (有時稱為雷帕黴素類似物(rapalogue)) (例如，RAD001)作為本文所述基於FKBP/FRB之二聚化開關中之二聚化分子。在實施例中，二聚化分子可選自雷帕黴素(西羅莫司(sirolimus))、RAD001 (依維莫司(everolimus))、咗他莫司(zotarolimus)、替西羅莫司(temsirolimus)、AP-23573 (瑞達福羅莫司(ridaforolimus))、拜爾利莫司(biolimus)及AP21967。適於與基於FKBP/FRB之二聚化開關一起使用之其他雷帕黴素類似物進一步闡述於標題為「組合療法」之部分或標題為「實例性mTOR抑制劑」之子部分中。 分流CAR 在一些實施例中，CAR表現細胞利用分流CAR。分流CAR方法更詳細闡述於PCT公開案WO2014/055442及WO2014/055657中，該等公開案以引用方式併入本文中。簡言之，分流CAR系統包含表現具有第一抗原結合域及共刺激域(例如，4-1BB)之第一CAR的細胞，且該細胞亦表現具有第二抗原結合域及細胞內信號傳導域(例如，CD3ζ)之第二CAR。當該細胞遇到第一抗原時，活化共刺激域，且該細胞增殖。當該細胞遇到第二抗原時，活化細胞內信號傳導域且起始細胞殺死活性。因此，CAR表現細胞僅在兩種抗原存在下完全活化。 RNA轉染 本文揭示用於產生活體外轉錄RNA CAR之方法。本發明亦包括可直接轉染至細胞中之CAR編碼RNA構築體。產生用於轉染中之mRNA之方法可涉及使用特殊設計之引子在活體外轉錄(IVT)模板，然後添加聚A，以產生長度通常為50-2000個鹼基之含有以下各項之構築體：3'及5'非轉譯序列(「UTR」)、5'帽及/或內部核糖體進入位點(IRES)、欲表現之核酸及聚A尾。由此產生之RNA可有效地轉染不同種類之細胞。在一個態樣中，模板包括針對CAR之序列。 在一個態樣中，CD20 CAR係由信使RNA (mRNA)編碼。在一個態樣中，將編碼CD20 CAR之mRNA引入免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)中，用於產生CAR表現細胞(例如，CART細胞或CAR NK細胞)。 在一個實施例中，活體外轉錄RNA CAR可以瞬時轉染形式引入細胞。RNA係利用聚合酶鏈式反應(PCR)產生之模板藉由活體外轉錄產生。來自任何來源之所關注DNA可利用適宜引子及RNA聚合酶藉由PCR直接轉化至模板中用於活體外mRNA合成。DNA之來源可為例如基因體DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或DNA之任何其他適宜來源。用於活體外轉錄之期望模板係本發明之CAR。舉例而言，用於RNA CAR之模板包含包括抗腫瘤抗體之單鏈可變域之細胞外區域；鉸鏈區、跨膜域(例如，CD8a之跨膜域)；及包括細胞內信號傳導域(例如，包含CD3-ζ之信號傳導域及4-1BB之信號傳導域)之細胞質區域。 在一個實施例中，欲用於PCR之DNA含有開放閱讀框。DNA可來自生物體基因體之天然DNA序列。在一個實施例中，核酸可包括5'及/或3'非轉譯區(UTR)中之一些或所有。核酸可包括外顯子及內含子。在一個實施例中，欲用於PCR之DNA係人類核酸序列。在另一實施例中，欲用於PCR之DNA係包括5'及3' UTR之人類核酸序列。或者，DNA可為通常不在天然生物體中表現之人工DNA序列。實例性人工DNA序列係含有基因之連接在一起形成編碼融合蛋白之開放閱讀框之部分者。DNA之連接在一起之部分可來自單一生物體或一種以上之生物體。 使用PCR來產生用於活體外轉錄用於轉染之mRNA之模板。實施PCR之方法為業內所熟知。用於PCR中之引子經設計以具有實質上與欲用作PCR模板之DNA之區域互補的區域。如本文所用之「實質上互補」係指其中引子序列中之大部分或所有鹼基互補、或一或多個鹼基不互補或錯配之核苷酸序列。實質上互補之序列能夠在用於PCR之退火條件下退火或與預期DNA靶雜交。引子可經設計以實質上與DNA模板之任一部分互補。舉例而言，引子可經設計以擴增核酸之通常在細胞中轉錄之部分(開放閱讀框)，包括5'及3' UTR。引子亦可經設計以擴增核酸之編碼所關注特定域之部分。在一個實施例中，引子經設計以擴增人類cDNA之編碼區，包括5'及3' UTR之所有或部分。可用於PCR之引子可藉由業內所熟知之合成方法來產生。「前置引子」係在欲擴增DNA序列上游之含有實質上與DNA模板上之核苷酸互補的核苷酸區域之引子。在本文中使用「上游」係指欲擴增DNA序列相對於編碼鏈之位置5。「後置引子」係在欲擴增DNA序列下游之含有實質上與雙鏈DNA模板互補之核苷酸區域之引子。在本文中使用「下游」係指欲擴增DNA序列相對於編碼鏈之位置3'。 可在本文所揭示之方法中使用可用於PCR之任何DNA聚合酶。試劑及聚合酶可自多種來源購得。 亦可使用具有促進穩定性及/或轉譯效率能力之化學結構。RNA較佳具有5'及3' UTR。在一個實施例中，5' UTR之長度介於1個與3000個核苷酸之間。欲添加至編碼區中之5'及3' UTR序列之長度可藉由不同方法來改變，該等方法包括(但不限於)設計退火至UTR之不同區域之用於PCR之引子。利用此方式，熟習此項技術者可改變在轉錄RNA轉染後達成最佳轉譯效率所需之5'及3' UTR長度。 5'及3' UTR可為所關注核酸之天然內源5'及3' UTR。或者，可藉由將UTR序列納入前置及後置引子中或藉由模板之任何其他修飾來添加不為所關注核酸內源之UTR序列。可使用不為所關注核酸內源之UTR序列來改變RNA之穩定性及/或轉譯效率。舉例而言，已知3' UTR序列中富含AU之元件可降低mRNA之穩定性。因此，可基於業內熟知UTR之性質來選擇或設計3' UTR以增加轉錄RNA之穩定性。 在一個實施例中，5' UTR可含有內源核酸之Kozak序列。或者，當如上文所述藉由PCR添加不為所關注核酸內源之5' UTR時，可藉由添加5' UTR序列重新設計共有Kozak序列。Kozak序列可增加一些RNA轉錄本之轉譯效率，但似乎並不為所有RNA能夠有效轉譯所必需。業內已知許多mRNA需要Kozak序列。在一些實施例中，5' UTR可為RNA基因體在細胞中穩定之RNA病毒之5’UTR。在一些實施例中，各種核苷酸類似物可用於3'或5' UTR中以阻礙外切酶降解mRNA。 為能夠在不需要基因選殖的情況下自DNA模板合成RNA，應將轉錄之啟動子附接至欲轉錄序列上游之DNA模板。當將用作RNA聚合酶啟動子之序列添加至前置引子之5'端時，RNA聚合酶啟動子被納入欲轉錄開放閱讀框上游之PCR產物中。在一較佳實施例中，啟動子係T7聚合酶啟動子，如本文在別處所述。其他有用啟動子包括(但不限於) T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。T7、T3及SP6啟動子之共有核酸序列為業內已知。 在一個較佳實施例中，mRNA在5'端具有帽及3'端具有聚(A)尾兩者，其決定細胞中mRNA之核糖體結合、轉譯起始及穩定性。在環形DNA模板(例如質體DNA)上，RNA聚合酶產生不適於在真核細胞中表現之長多聯產物。3' UTR端線性化之質體DNA之轉錄產生正常大小之mRNA，該mRNA即使在轉錄後經多腺苷酸化仍在真核轉染中無效。 在線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可將轉錄本之3'端延伸超出模板之最後一個鹼基(Schenborn及Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva及Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003))。 將聚A/T段整合至DNA模板中之習用方法係分子選殖。然而，整合至質體DNA中之聚A/T序列可使質體不穩定，此係自細菌細胞獲得之質體DNA模板通常經缺失及其他畸變高度污染之原因。此使得選殖程序不僅費力且耗時，且通常使其不可靠。此係在不選殖情況下構築具有聚A/T 3'段之DNA模板之方法高度合意之原因。 轉錄DNA模板之聚A/T區段可藉由以下方式來產生：在PCR期間藉由使用含有聚T尾(例如100T尾)之後置引子(大小可為50-5000 T)，或在PCR後藉由任何其他方法(包括但不限於DNA連接或活體外重組)。聚(A)尾亦為RNA提供穩定性且減少其降解。通常，聚(A)尾之長度與轉錄RNA之穩定性呈正相關。在一個實施例中，聚(A)尾介於100個與5000個腺苷之間。 RNA之聚(A)尾可在活體外轉錄後利用聚(A)聚合酶(例如大腸桿菌聚A聚合酶(E-PAP))進一步延伸。在一個實施例中，將聚(A)尾之長度自100個核苷酸增加至介於300個與400個核苷酸之間使得RNA之轉譯效率增加約兩倍。另外，將不同化學基團附接至3'端可增加mRNA穩定性。該附接可含有經修飾/人工核苷酸、適配體及其他化合物。舉例而言，可利用聚(A)聚合酶將ATP類似物納入聚(A)尾中。ATP類似物可進一步增加RNA之穩定性。 5'帽亦為RNA分子提供穩定性。在較佳實施例中，藉由本文所揭示方法產生之RNA包括5'帽。5'帽係利用業內已知及本文所述之技術提供(Cougot等人，Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski等人，RNA, 7:1468-95 (2001)；Elango等人，Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。 藉由本文所揭示方法產生之RNA亦可含有內部核糖體進入位點(IRES)序列。IRES序列可為起始非帽依賴性核糖體與mRNA之結合且幫助轉譯起始之任何病毒、染色體或人工設計序列。可包括任何適用於細胞電穿孔之溶質，該等溶質可含有促進細胞滲透及活力之因子，例如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑及表面活性劑。 可利用多種不同方法中之任一者(例如市售方法)將RNA引入靶細胞中，該等方法包括(但不限於)電穿孔(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.)或Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany)、利用脂質轉染之陽離子脂質體介導之轉染、聚合物囊封、肽介導之轉染或生物彈射粒子遞送系統(例如「基因槍」) (參見例如Nishikawa等人，Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)。 非病毒遞送方法 在一些態樣中，可利用非病毒方法將編碼本文所述CAR之核酸遞送至細胞或組織或個體中。 在一些實施例中，非病毒方法包括利用轉座子(亦稱為可轉座元件)。在一些實施例中，轉座子係可插入自身基因體中之位置處之DNA片段，例如能夠自我複製且將其拷貝插入基因體中之DNA片段，或可自較長核酸剪接出且插入基因體中之另一位置中之DNA片段。舉例而言，轉座子包含由用於轉座之反向重複側接基因構成之DNA序列。 利用轉座子之核酸遞送之實例性方法包括睡美人轉座子系統(Sleeping Beauty transposon system，SBTS)及piggyBac (PB)轉座子系統。參見例如Aronovich等人，Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20；Singh等人，Cancer Res. 15(2008):2961-2971；Huang等人，Mol. Ther. 16(2008):580-589；Grabundzija等人，Mol. Ther. 18(2010):1200-1209；Kebriaei等人，Blood. 122.21(2013):166；Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16；Bell等人，Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65；及Ding等人，Cell. 122.3(2005):473-83，該等參考文獻皆以引用方式併入本文中。 SBTS包括兩種組分：1)含有轉基因之轉座子及2)轉座酶之來源。轉座酶可使轉座子自載體質體(或其他供體DNA)轉座至靶DNA，例如宿主細胞染色體/基因體。舉例而言，轉座酶結合至載體質體/供體DNA，自質體切割出轉座子(包括轉基因)，並將其插入宿主細胞之基因體中。參見例如Aronovich等人。 實例性轉座子包括基於pT2之轉座子。參見例如Grabundzija等人，Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47；及Singh等人，Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971，該等文獻皆以引用方式併入本文中。實例性轉座酶包括Tc1/水手(mariner)型轉座酶，例如SB10轉座酶或SB11轉座酶(可自例如巨細胞病毒啟動子表現之過度活性轉座酶)。參見例如Aronovich等人；Kebriaei等人；及Grabundzija等人，該等文獻皆以引用方式併入本文中。 使用SBTS允許轉基因(例如編碼本文所述CAR之核酸)之有效整合及表現。本文提供例如利用轉座子系統(例如SBTS)產生穩定地表現本文所述CAR之細胞(例如，T細胞或NK細胞)的方法。 根據本文所述之方法，在一些實施例中，將一或多種含有SBTS組分之核酸(例如，質體)遞送至細胞(例如，T或NK細胞)。舉例而言，核酸係藉由標準核酸(例如，質體DNA)遞送方法(例如本文所述之方法，例如電穿孔、轉染或脂質轉染)來遞送。在一些實施例中，核酸含有包含轉基因(例如，編碼本文所述CAR之核酸)之轉座子。在一些實施例中，核酸含有包含轉基因(例如，編碼本文所述CAR之核酸)以及編碼轉座酶之核酸序列的轉座子。在一些實施例中，提供含有兩種核酸之系統，例如雙質體系統，例如其中第一質體含有包含轉基因之轉座子且第二質體含有編碼轉座酶之核酸序列。舉例而言，第一及第二核酸係共遞送至宿主細胞中。 在一些實施例中，表現本文所述CAR之細胞(例如，T或NK細胞)係藉由使用利用SBTS之基因插入及利用核酸酶(例如，鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化劑樣效應物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系統或經改造大範圍核酸酶重改造之歸巢核酸內切酶)之遺傳編輯的組合來產生。 在一些實施例中，使用非病毒遞送方法允許再程式化細胞(例如，T或NK細胞)，並將細胞直接輸注至個體中。非病毒載體之優點包括(但不限於)製造滿足患者群體、儲存期間之穩定性及缺少免疫原性所需之足量之便捷性及相對較低之成本。 編碼CAR之核酸構築體 本發明亦提供編碼一或多種本文所述之CAR構築體之核酸分子。在一個態樣中，核酸分子係以信使RNA轉錄本提供。在一個態樣中，核酸分子係以DNA構築體提供。 因此，在一個態樣中，本發明係關於編碼嵌合抗原受體(CAR)之經分離核酸分子，其中CAR包含CD20結合域(例如，鼠類、人類化或人類CD20結合域)、跨膜域及細胞內信號傳導域(包含刺激域(例如共刺激信號傳導域)及/或初級信號傳導域(例如ζ鏈))。在一個實施例中，CD20結合域係本文所述之CD20結合域，例如包含選自由以下組成之群之序列之CD20結合域：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429，或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，跨膜域係例如本文所述、例如選自由以下組成之群之蛋白質之跨膜域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO: 801之序列或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，CD20結合域藉由鉸鏈區(例如，本文所述之鉸鏈區)連接至跨膜域。在一個實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO: 799或SEQ ID NO: 814或SEQ ID NO: 816或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，經分離核酸分子進一步包含編碼共刺激域之序列。在一個實施例中，共刺激域係例如本文所述、例如選自由以下組成之群之蛋白質之功能性信號傳導域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)及4-1BB (CD137)。在一個實施例中，共刺激域包含SEQ ID NO: 803之序列或與其具有95%-99%一致性之序列。在一個實施例中，細胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及CD3ζ之功能性信號傳導域。在一個實施例中，細胞內信號傳導域包含SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 806之序列或與其具有95%-99%一致性之序列，及SEQ ID NO: 807或SEQ ID NO: 808之序列或與其具有95%-99%一致性之序列，其中包含細胞內信號傳導域之序列係在同一框架中且以單一多肽鏈形式表現。 在另一態樣中，本發明係關於編碼CAR構築體之經分離核酸分子，該CAR構築體包含SEQ ID NO: 797之前導序列；具有選自由以下組成之群之序列之scFv域：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429 (或與其具有95%-99%一致性之序列)；SEQ ID NO: 799或SEQ ID NO: 814或SEQ ID NO: 814 (或與其具有95%-99%一致性之序列)之鉸鏈區；具有SEQ ID NO: 801之序列(或與其具有95%-99%一致性之序列)之跨膜域；具有SEQ ID NO: 803之序列之4-1BB共刺激域或具有SEQ ID NO: 818之序列(或與其具有95%-99%一致性之序列)之CD27共刺激域；及具有SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807之序列(或與其具有95%-99%一致性之序列)之CD3ζ刺激域。 在另一態樣中，本發明係關於由核酸分子編碼之經分離多肽分子。在一個實施例中，經分離多肽分子包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 268、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 322、SEQ ID NO: 349、SEQ ID NO: 376、SEQ ID NO: 403及SEQ ID NO: 430，或與其具有95%-99%一致性之序列。 在另一態樣中，本發明係關於編碼包含CD20結合域、跨膜域及細胞內信號傳導域包含刺激域之嵌合抗原受體(CAR)分子的核酸分子，且其中該CD20結合域包含選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429，或與其具有95%-99%一致性之序列。 在一個實施例中，經編碼CAR分子進一步包含編碼共刺激域之序列。在一個實施例中，共刺激域係選自由以下組成之群之蛋白質之功能性信號傳導域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)及4-1BB (CD137)。在一個實施例中，共刺激域包含SEQ ID NO: 803之序列。在一個實施例中，跨膜域係選自由以下組成之群之蛋白質之跨膜域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137、CD154、KIR2DS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a及CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2R g (共用γ)、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4、(CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR及PAG/Cbp。 在一個實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO: 803之序列。在一個實施例中，細胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及ζ之功能性信號傳導域。在一個實施例中，細胞內信號傳導域包含SEQ ID NO: 803之序列及SEQ ID NO: 804之序列，其中包含細胞內信號傳導域之序列係在同一框架中且以單一多肽鏈形式表現。在一個實施例中，CD20結合域藉由鉸鏈區連接至跨膜域。在一個實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO: 799。在一個實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO: 799或SEQ ID NO: 814或SEQ ID NO: 816。 在另一態樣中，本發明係關於經編碼CAR分子，其包含SEQ ID NO: 797之前導序列；具有選自由以下組成之群之序列之scFv域：SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 267、SEQ ID NO: 294、SEQ ID NO: 321、SEQ ID NO: 348、SEQ ID NO: 375、SEQ ID NO: 402及SEQ ID NO: 429，或與其具有95%-99%一致性之序列，SEQ ID NO: 799或SEQ ID NO: 814或SEQ ID NO: 816之鉸鏈區；具有SEQ ID NO: 801之序列之跨膜域；具有SEQ ID NO: 803之序列之4-1BB共刺激域或具有SEQ ID NO: 818之序列之CD27共刺激域；及具有SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807之序列之CD3ζ刺激域。 編碼期望分子之核酸序列可利用業內已知之重組方法來獲得，例如利用標準技術藉由自表現該基因之細胞篩選文庫、自已知包括該基因之載體衍生出基因或自含有該基因之細胞及組織直接分離來獲得。或者，所關注基因可以合成方式而非選殖來產生。 本發明亦提供其中插入本發明DNA之載體。源自逆轉錄病毒(例如慢病毒)之載體係達成長期基因轉移之適宜工具，此乃因其容許轉基因長期穩定整合及其在子細胞中繁殖。慢病毒載體比源自致癌逆轉錄病毒(例如鼠類白血病病毒)之載體的額外優點在於，其可轉導非增殖細胞(例如肝細胞)。其亦具有低免疫原性之額外優點。 在另一實施例中，包含編碼本發明期望CAR之核酸之載體係腺病毒載體(A5/35)。在另一實施例中，編碼CAR之核酸之表現可利用轉座子(例如睡美人、crisper、CAS9及鋅指核酸酶)來實現。參見下文June等人，2009Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716，其以引用方式併入本文中。 在簡述中，編碼CAR之天然或合成核酸之表現通常係藉由將編碼CAR多肽或其部分之核酸可操作地連接至啟動子並將構築體納入表現載體中來達成。載體可適於在真核生物中複製及整合。典型選殖載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列及可用於調控期望核酸序列表現之啟動子。 本發明之表現構築體亦可利用標準基因遞送方案用於核酸免疫及基因療法。基因遞送之方法為業內已知。參見例如美國專利第5,399,346號、第5,580,859號、第5,589,466號，其全文皆以引用方式併入本文中。在另一實施例中，本發明提供基因療法載體。 核酸可選殖至多種類型之載體中。舉例而言，核酸可選殖至包括(但不限於)以下各項之載體中：質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒及黏粒。尤其受關注之載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及測序載體。 此外，可向細胞提供呈病毒載體形式之表現載體。病毒載體技術為業內所熟知且闡述於例如Sambrook等人，2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press, NY)及其他病毒學及分子生物學手冊中。可用作載體之病毒包括(但不限於)逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒及慢病毒。一般而言，適宜載體含有在至少一種生物體中發揮功能之複製起點、啟動子序列、方便的限制性核酸內切酶位點及一或多個可選擇標記物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。 已研發出多種基於病毒之系統用於將基因轉移至哺乳動物細胞中。舉例而言，逆轉錄病毒為基因遞送系統提供方便的平臺。可利用業內已知技術將所選基因插入載體中且包裝在逆轉錄病毒粒子中。然後可以活體內或離體方式將重組病毒分離並遞送至個體細胞中。多種逆轉錄病毒系統為業內已知。在一些實施例中，使用腺病毒載體。多種腺病毒載體為業內已知。在一個實施例中，使用慢病毒載體。 其他啟動子元件(例如增強子)調控轉錄起始之頻率。通常，該等元件位於起始位點上游之30-110 bp區域中，但已展示多個啟動子亦含有位於起始位點下游之功能元件。啟動子元件之間之間距通常較靈活，以使得元件在相對於彼此插入或移動時保留啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間之間距可在活性開始下降之前增加至50 bp。端視啟動子，似乎個別元件可協同或獨立地發揮活化轉錄之功能。實例性啟動子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。 能夠在哺乳動物T細胞中表現CAR轉基因之啟動子之實例係EF-1α (EF1a)啟動子。天然EF1a啟動子驅動負責將胺基醯基tRNA酶促遞送至核糖體之延伸因子-1複合物之α亞單位的表現。EF1a啟動子已廣泛地用於哺乳動物表現質體中，且已展示可有效地驅動來自選殖至慢病毒載體中之轉基因之CAR表現。參見例如Milone等人，Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)。在一個態樣中，EF1a啟動子包含以SEQ ID NO: 833提供之序列。 啟動子之另一實例係立即早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列係能夠驅動與其可操作地連接之任何多核苷酸序列之高表現量的強組成型啟動子序列。然而，亦可使用其他組成型啟動子序列，包括(但不限於)猿猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺失病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、愛艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動子以及人類基因啟動子，例如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、延伸因子-1α啟動子、血紅素啟動子及肌酸激酶啟動子。此外，本發明應不限於使用組成型啟動子。亦涵蓋誘導型啟動子作為本發明之一部分。使用誘導型啟動子提供能夠在期望該表現時啟動可操作地連接之多核苷酸序列的表現或在不期望該表現時關閉表現之分子開關。誘導型啟動子之實例包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、糖皮質素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。 為評價CAR多肽或其部分之表現，欲引入細胞中之表現載體亦可含有可選擇標記物基因或報導基因或二者，以幫助自欲經由病毒載體轉染或感染所尋求之細胞群體鑑別及選擇表現細胞。在其他態樣中，可選擇標記物可攜載於DNA之各別片段上且用於共轉染程序中。可選擇標記物及報導基因二者可側接有適宜調控序列以使得能夠在宿主細胞中表現。有用可選擇標記物包括(例如)抗生素抗性基因，例如neo及諸如此類。 報導基因係用於鑑別潛在轉染之細胞且用於評估調控序列之功能。一般而言，報導基因係不存在於接受者生物體或組織中或不由其表現且編碼其表現係由一些可容易檢測之性質(例如酶促活性)呈現之多肽的基因。報導基因之表現係在將DNA引入接受者細胞中後在適宜時間下分析。適宜報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌性鹼性磷酸酶之基因或綠色螢光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適宜表現系統為業內所熟知且可利用已知技術製備或以商業方式獲得。一般而言，將展示報導基因之最高表現量之具有最小5'側接區之構築體鑑別為啟動子。可將該等啟動子區域連接至報導基因且用於評估藥劑調節啟動子驅動之轉錄之能力。 在一個實施例中，載體可進一步包含編碼第二CAR之核酸。在一個實施例中，第二CAR包括針對在急性骨髓性白血病細胞上表現之靶(例如CD22、CD19、ROR1、CD10、CD33、CD34、CLL-1、CD123、FLT3、CD79b、CD179b或CD79a)之抗原結合域。在一個實施例中，載體包含編碼靶向第一抗原且包括具有共刺激信號傳導域但不具初級信號傳導域之細胞內信號傳導域的第一CAR之核酸序列，及編碼靶向第二不同抗原且包括具有初級信號傳導域但不具共刺激信號傳導域之細胞內信號傳導域的第二CAR之核酸。在一個實施例中，載體包含編碼包括CD20結合域、跨膜域及共刺激域之第一CD20 CAR的核酸，及編碼靶向除CD20外之抗原(例如在AML細胞上表現之抗原，例如CD22、CD19、ROR1、CD10、CD33、CD34、CLL-1、CD123、FLT3、CD79b、CD179b或CD79a)且包括抗原結合域、跨膜域及初級信號傳導域之第二CAR的核酸。在另一實施例中，載體包含編碼包括CD20結合域、跨膜域及初級信號傳導域之第一CD20 CAR的核酸，及編碼靶向除CD20外之抗原(例如在AML細胞上表現之抗原，例如CD22、CD19、ROR1、CD10、CD33、CLL-1、CD34、CD123、FLT3、CD79b、CD179b或CD79a)且包括針對抗原之抗原結合域、跨膜域及共刺激信號傳導域之第二CAR的核酸。 在一個實施例中，載體包含編碼本文所述之CD20 CAR之核酸及編碼抑制性CAR之核酸。在一個實施例中，抑制性CAR包含結合在正常細胞而非癌細胞(例如亦表現CD20之正常細胞)上發現之抗原之抗原結合域。在一個實施例中，抑制性CAR包含抑制性分子之抗原結合域、跨膜域及細胞內域。舉例而言，抑制性CAR之細胞內域可為PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFβ之細胞內域。 業內已知將基因引入細胞中且在細胞中表現之方法。在表現載體之情況下，可藉由業內之任何方法容易地將載體引入宿主細胞(例如哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞)中。舉例而言，可藉由物理、化學或生物方式將表現載體轉移至宿主細胞中。 用於將多核苷酸引入宿主細胞中之物理方法包括硫酸鈣沈澱、脂質轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及諸如此類。用於產生包含載體及/或外源核酸之細胞之方法為業內所熟知。參見例如Sambrook等人，2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press, NY)。用於將多核苷酸引入宿主細胞中之較佳方法係磷酸鈣轉染。 用於將所關注多核苷酸引入宿主細胞中之生物方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體且尤其逆轉錄病毒載體已成為最廣泛用於將基因插入哺乳動物(例如人類)細胞中之方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、皰疹單純型病毒I、腺病毒及腺相關病毒及諸如此類。參見例如美國專利第5,350,674號及第5,585,362號。 用於將多核苷酸引入宿主細胞中之化學方式包括膠質分散系統，例如大分子複合物、奈米膠囊、微球體、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、膠束、混合膠束及脂質體。用作活體外及活體內遞送媒劑之實例性膠質系統係脂質體(例如人工膜囊泡)。可獲得目前最佳技術靶向遞送核酸之其他方法，例如使用靶向微粒子或其他適宜亞微米大小之遞送系統遞送多核苷酸。 在利用非病毒遞送系統之情形下，實例性遞送媒劑係脂質體。涵蓋使用脂質調配物將核酸引入宿主細胞中(活體外、離體或活體內)。在另一態樣中，核酸可與脂質締合。與脂質締合之核酸可囊封於脂質體之水性內部，散置在脂質體之脂質雙層內，經由與脂質體及寡核苷酸二者締合之連接分子附接至脂質體，包埋於脂質體中，與脂質體複合，分散在含有脂質之溶液中，與脂質混合，與脂質組合，以懸浮液形式含於脂質中，含有膠束或與其複合或以其他方式與脂質締合。脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體締合之組合物並不限於溶液中之任何特定結構。舉例而言，其可以雙層結構、膠束或「塌陷」結構存在。其亦可簡單地散置於溶液中，可能形成大小或形狀不均勻之聚集物。脂質係可為天然或合成脂質之脂肪物質。舉例而言，脂質包括天然存在於細胞質中之脂肪小滴以及含有長鏈脂肪族烴及其衍生物之化合物類別，例如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛。 適於使用之脂質可自商業來源獲得。舉例而言，雙十四烷基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可自Sigma, St. Louis, MO獲得；磷酸雙十六烷基酯(「DCP」)可自K & K Laboratories (Plainview, NY)獲得；膽固醇(「Choi」)可自Calbiochem-Behring獲得；雙十四烷基磷脂醯甘油(「DMPG」)及其他脂質可自Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.)獲得。脂質於氯仿或氯仿/甲醇中之原液可儲存在約-20℃下。使用氯仿作為唯一溶劑，此乃因其比甲醇更容易蒸發。「脂質體」係涵蓋多種藉由產生封閉脂質雙層或聚集物形成之單一及多層脂質媒劑的一般術語。脂質體之特徵可在於具有磷脂雙層膜及內部水性介質之囊泡狀結構。多層脂質體具有多個藉由水性介質分開之脂質層。其係在磷脂懸浮於過量水溶液中時自發形成。脂質組分在閉合結構形成之前經歷自我重排且將水及所溶解溶質包埋在脂質雙層之間(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5: 505-10)。然而，亦涵蓋在溶液中具有與正常囊泡狀結構不同之結構之組合物。舉例而言，脂質可呈膠束結構或僅以脂質分子之非均勻聚集物形式存在。亦涵蓋lipofectamine-核酸複合物。 無論將外源核酸引入宿主細胞中所使用之方法抑或以其他方式將細胞暴露於本發明抑制劑下，為確認在宿主細胞中存在重組DNA序列，可實施多種分析。該等分析包括例如熟習此項技術者所熟知之「分子生物學」分析，例如南方墨點(Southern blotting)及北方墨點(Northern blotting)、RT-PCR及PCR；「生物化學」分析，例如檢測特定肽之存在或不存在，例如藉由免疫學方式(ELISA及西方墨點)或藉由本文所述之分析，以鑑別出屬本發明範圍內之藥劑。 本發明進一步提供包含編碼CAR之核酸分子之載體。在一個態樣中，CAR載體可直接轉導至細胞(例如T細胞或NK細胞)中。在一個態樣中，載體係選殖或表現載體，例如載體，包括(但不限於)一或多種質體(例如表現質體、選殖載體、微環、微載體、雙微染色體)、逆轉錄病毒及慢病毒載體構築體。在一個態樣中，載體能夠在哺乳動物T細胞或NK細胞中表現CAR構築體。在一個態樣中，哺乳動物T細胞係人類T細胞。 細胞之來源 可在擴增及遺傳性地修飾或其他修飾之前，自個體獲得細胞(例如T細胞或天然殺手(NK)細胞)之來源。術語「個體」意欲包括其中可引發免疫反應之活的生物體(例如哺乳動物)。個體之實例包括人類、猴、黑猩猩、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉基因物種。T細胞可自多種來源獲得，該等來源包括末梢血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位點之組織、腹水、胸膜滲出液、脾組織及腫瘤。在本發明之某些態樣中，免疫效應細胞(例如T細胞)可自利用任何數量之熟習此項技術者已知之技術(例如Ficoll™分離)自個體收集之一單位血液獲得。在一較佳態樣中，來自個體循環血液之細胞係藉由血球分離獲得。血球分離產物通常含有淋巴球(包括T細胞)、單核球、顆粒球、B細胞、其他有核白血球、紅血球及血小板。在一個態樣中，藉由血球分離收集之細胞可經洗滌以移除血漿部分，且視情況使細胞置於適宜緩衝液或培養基中用於後續處理步驟。在本發明之一個態樣中，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞。在替代性態樣中，洗滌溶液缺少鈣且可缺少鎂或可缺少許多但非所有二價陽離子。在鈣不存在下之初始活化步驟可使得活化放大。如熟習此項技術者將容易地瞭解，洗滌步驟可藉由熟習此項技術者已知之方法完成，例如根據製造商之說明書藉由利用半自動「無逆流」離心機(例如Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)來完成。洗滌後，可將細胞重懸浮於多種生物相容性緩衝液中，例如不含Ca之PBS、不含Mg之PBS、PlasmaLyte A或其他含或不含緩衝液之鹽水溶液。或者，可移除血球分離樣品之不期望組分且將細胞直接重懸浮於培養基中。 在一個態樣中，藉由溶解紅血球且清除單核球自末梢血淋巴球分離T細胞，例如藉由PERCOLLTM 梯度離心或藉由逆流離心淘析來分離。 本文所述之方法可包括例如利用例如負向選擇技術(例如本文所述)選擇為T調控細胞清除群體之特定免疫效應細胞(例如，T細胞)亞群CD25+清除細胞。較佳地，T調控清除細胞群體含有少於30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%之CD25+細胞。 在一個實施例中，利用抗CD25抗體或其片段或CD25結合配體IL-2自該群體移除T調控細胞(例如，CD25+ T細胞)。在一個實施例中，抗CD25抗體或其片段或CD25結合配體偶聯至受質(例如，珠粒)，或以其他方式包覆於受質(例如，珠粒)上。在一個實施例中，抗CD25抗體或其片段偶聯至如本文所述之受質。 在一個實施例中，利用來自MiltenyiTM 之CD25清除試劑自該群體移除T調控細胞(例如，CD25+ T細胞)。在一個實施例中，細胞對CD25清除試劑之比率係1e7個細胞對20 uL、或1e7個細胞對15 uL、或1e7個細胞對10 uL、或1e7個細胞對5 uL、或1e7個細胞對2.5 uL、或1e7個細胞對1.25 uL。 在一個實施例中，欲清除之免疫效應細胞群體包括約6 × 109 個CD25+ T細胞。在其他態樣中，欲清除之免疫效應細胞群體包括約1 × 109 至1× 1010 個CD25+ T細胞及其間之任一整數值。在一個實施例中，所得群體T調控清除細胞具有2 × 109 個T調控細胞(例如CD25+細胞)或更少(例如1 × 109 、5 × 108 、1 × 108 、5 × 107 、1 × 107 或更少之CD25+細胞)。 在一個實施例中，利用CliniMAC系統與清除管設置(例如管162-01)自該群體移除T調控細胞(例如，CD25+細胞)。在一個實施例中，在清除設置(例如DEPLETION2.1)上運行CliniMAC系統。 本文所述之方法可包括一個以上之選擇步驟，例如一個以上之清除步驟。可藉由負向選擇與例如針對為負向選擇細胞所獨有之表面標記物之抗體的組合完成T細胞群體之富集。一種方法係經由負磁免疫黏附或流式細胞術使用針對存在於負向選擇細胞上之細胞表面標記物之單株抗體的混合物進行細胞分選及/或選擇。舉例而言，為藉由負向選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物可包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。 本文所述之方法可進一步包括自表現腫瘤抗原(例如不包含CD25之腫瘤抗原，例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)之群體移除細胞，由此提供適於表現CAR (例如，本文所述之CAR)之T調控清除細胞(例如，CD25+清除細胞)及腫瘤抗原清除細胞的群體。在一個實施例中，腫瘤抗原表現細胞係與T調控細胞(例如，CD25+細胞)同時移除。舉例而言，抗CD25抗體或其片段及抗腫瘤抗原抗體或其片段可附接至相同受質(例如，珠粒)，其可用於移除細胞，或抗CD25抗體或其片段或抗腫瘤抗原抗體或其片段可附接至各別珠粒，其混合物可用於移除細胞。在一些實施例中，T調控細胞(例如，CD25+細胞)之移除及腫瘤抗原表現細胞之移除係依序進行，且可例如以任一順序進行。 亦提供包括以下步驟之方法：自表現檢查點抑制劑(例如本文所述之檢查點抑制劑)之群體移除細胞(例如PD1+細胞、LAG3+細胞及TIM3+細胞中之一或多者)，由此提供T調控清除細胞(例如，CD25+清除細胞)及檢查點抑制劑清除細胞(例如，PD1+、LAG3+及/或TIM3+清除細胞)之群體。實例性檢查點抑制劑包括B7-H1、B&-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM (例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA及LAIR1。在一個實施例中，檢查點抑制劑表現細胞係與T調控細胞(例如，CD25+細胞)同時移除。舉例而言，抗CD25抗體或其片段及抗檢查點抑制劑抗體或其片段可附接至相同珠粒，其可用於移除細胞，或抗CD25抗體或其片段及抗檢查點抑制劑抗體或其片段可附接至各別珠粒，其混合物可用於移除細胞。在一些實施例中，T調控細胞(例如，CD25+細胞)之移除及檢查點抑制劑表現細胞之移除係依序進行，且可例如以任一順序進行。 本文所述之方法可包括正向選擇步驟。舉例而言，T細胞可藉由與抗CD3/抗CD28 (例如，3×28)偶聯之珠粒(例如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)一起培育足以對期望T細胞進行正向選擇之時間段來分離。在一個態樣中，時間段為約30分鐘。在另一態樣中，時間段介於30分鐘至36小時或更長及其間之所有整數值範圍內。在另一態樣中，時間段為至少1小時、2小時、3小時、4小時、5小時或6小時。在另一較佳態樣中，時間段為10小時至24小時。在一個態樣中，培育時間段為24小時。在與其他細胞類型相比T細胞極少的任何情況下(例如在自腫瘤組織或自免疫受損個體分離腫瘤浸潤淋巴球(TIL)中)，可利用較長培育時間來分離T細胞。此外，利用較長培育時間可增加捕獲CD8+ T細胞之效率。因此，藉由簡單地縮短或延長時間可使T細胞與CD3/CD28珠粒結合，及/或藉由增加或減小珠粒對T細胞之比率(如本文進一步所述)，可在培養起始時或在該過程期間之其他時間點優先選擇或不選擇T細胞亞群。另外，藉由增加或減小珠粒或其他表面上之抗CD3及/或抗CD28抗體之比率，可在培養起始時或在其他期望時間點優先選擇或不選擇T細胞亞群。 在一個實施例中，可選擇表現以下各項中之一或多者之T細胞群體：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、顆粒酶B及穿孔蛋白或其他適宜分子，例如其他細胞介素。可藉由例如PCT公開案第WO 2013/126712號中所述之方法來確定用於細胞表現之篩選方法。 為藉由正向或負向選擇來分離期望細胞群體，可改變細胞及表面(例如粒子，例如珠粒)之濃度。在某些態樣中，可期望顯著減小珠粒及細胞混合在一起之體積(例如增加細胞之濃度)，以確保細胞與珠粒之最大接觸。舉例而言，在一個態樣中，使用約100億個細胞/ml、90億/ml、80億/ml、70億/ml、60億/ml或50億/ml之濃度。在一個態樣中，使用10億個細胞/ml之濃度。在一個態樣中，使用75百萬、80百萬、85百萬、90百萬、95百萬或100百萬個細胞/ml之細胞濃度。在其他態樣中，可使用125百萬或150百萬個細胞/ml之濃度。 利用高濃度可增加細胞產率、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度可更有效地捕獲可弱表現所關注靶抗原之細胞，例如CD28陰性T細胞，或來自存在許多腫瘤細胞之樣品(例如白血病血液、腫瘤組織等)。該等細胞群體可具有治療價值且將期望獲得。舉例而言，利用高濃度之細胞可更有效地選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。 在相關態樣中，可期望使用較低濃度之細胞。藉由大量稀釋T細胞與表面(例如粒子，例如珠粒)之混合物，最小化粒子與細胞之間之相互作用。此選擇表現大量與粒子結合之期望抗原之細胞。舉例而言，稀釋濃度之CD4+ T細胞比CD8+ T細胞表現更高量之CD28且更有效地被捕獲。在一個態樣中，所用細胞之濃度為5 × 10e6/ml。在其他態樣中，所用濃度可為約1 × 105 /ml至1 × 106 /ml及其間之任一整數值。 在其他態樣中，可在2℃-10℃或在室溫下在旋轉器上以不同速度將細胞培育不同時間長度。 亦可在洗滌步驟後冷凍用於刺激之T細胞。不希望受限於理論，冷凍及後續解凍步驟藉由在細胞群體中移除顆粒球且在一定程度上移除單核球來提供更均勻之產物。在移除血漿及血小板之洗滌步驟後，可將細胞懸浮於冷凍溶液中。儘管許多冷凍溶液及參數為業內已知且可用於此情況下，但一種方法涉及利用含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白之PBS，或含有10%葡聚糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO或31.25% PlasmaLyte-A、31.25%右旋糖5%、0.45% NaCl、10%葡聚糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO之培養基或含有例如羥乙基澱粉及PlasmaLyte A之其他適宜細胞冷凍培養基，然後以1°/分鐘之速率將細胞冷凍至-80℃且儲存在液氮儲存罐之氣相中。可使用其他受控冷凍方法以及在-20℃下或液氮中之立即不受控冷凍。 在某些態樣中，如本文所述將低溫保藏之細胞解凍且洗滌並在室溫下靜置1小時，然後利用本發明方法進行活化。 本發明亦涵蓋在可能需要如本文所述之擴增細胞之前之一定時間段下自個體收集血液樣品或血球分離產物。因此，可在任何所需時間點下收集欲擴增細胞之來源及期望細胞(例如T細胞)，分離且冷凍，以供後期於免疫效應細胞療法中用於任何數量之將受益於免疫效應細胞療法之疾病或病況(例如本文所述之彼等)。在一個態樣中，血液樣品或血球分離物係取自一般健康個體。在某些態樣中，血液樣品或血球分離物係取自具有罹患疾病之風險、但尚未罹患疾病之一般健康個體，且分離並冷凍所關注細胞以供後期使用。在某些態樣中，T細胞可在隨後時間擴增、冷凍及使用。在某些態樣中，樣品係自診斷如本文所述之特定疾病後不久但在任何治療之前之患者收集。在另一態樣中，細胞係自在任何數量之相關治療模式之前自個體之血液樣品或血球分離物分離，該等治療模式包括(但不限於)使用以下各項之治療：藥劑，例如那他珠單抗(natalizumab)、依法利珠單抗(efalizumab)、抗病毒劑；化學療法；輻射；免疫阻抑劑，例如環孢素、硫唑嘌呤、胺甲喋呤、黴酚酸酯及FK506；抗體或其他免疫燒蝕劑，例如坎帕斯(CAMPATH)、抗CD3抗體、癌得星(cytoxan)、氟達拉濱(fludarabine)、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228及輻照。 在本發明之另一態樣中，T細胞係在使個體保留功能性T細胞之治療後直接自患者獲得。就此而言，已觀察到，在某些癌症治療後，尤其在使用損害免疫系統之藥物治療後，在治療後不久在患者通常因治療而恢復之時段期間，所獲得T細胞之品質可能最佳或其離體擴增能力得到改良。同樣，利用本文所述之方法進行離體操縱後，該等細胞可處於增強植入及活體內擴增之較佳狀態。因此，本發明涵蓋在此恢復期間收集血球，包括T細胞、樹突細胞或造血譜系之其他細胞。此外，在某些態樣中，可使用動員(例如利用GM-CSF之動員)及調理方案在個體中產生其中尤其在治療後所定義時間窗期間有利於具體細胞類型之重建、再循環、再生及/或擴增之條件。說明性細胞類型包括T細胞、B細胞、樹突細胞及免疫系統之其他細胞。 在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之免疫效應細胞係自已接受低免疫增強劑量之mTOR抑制劑之個體獲得。在實施例中，在足夠時間後或在低免疫增強劑量之mTOR抑制劑之足夠投藥後收穫經改造以表現CAR之免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)群體，使得個體中或自個體收穫之PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞/NK細胞)之含量或PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞/NK細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如，T細胞/NK細胞)之比率至少瞬時增加。 在一些實施例中，具有或經改造以表現CAR之免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)群體可藉由與一定量之增加PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)之數量或增加PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞/NK細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之比率的mTOR抑制劑接觸來離體治療。 在一個實施例中，T細胞群體為二醯基甘油激酶(DGK)缺乏的。DGK缺乏細胞包括不表現DGK RNA或蛋白質或具有降低或抑制的DGK活性之細胞。DGK缺乏細胞可藉由遺傳方式(例如投與RNA干擾劑，例如siRNA、shRNA、miRNA，以降低或防止DGK表現)來產生。或者，DGK缺乏細胞可藉由使用本文所述之DGK抑制劑處理來產生。 在一個實施例中，T細胞群體為伊卡洛斯(Ikaros)缺乏的。伊卡洛斯缺乏細胞包括不表現伊卡洛斯RNA或蛋白質或具有降低或抑制的伊卡洛斯活性之細胞，伊卡洛斯缺乏細胞可藉由遺傳方式(例如投與RNA干擾劑，例如siRNA、shRNA、miRNA，以降低或防止伊卡洛斯表現)來產生。或者，伊卡洛斯缺乏細胞可藉由使用伊卡洛斯抑制劑(例如，雷利竇邁(lenalidomide))處理來產生。 在實施例中，T細胞群體為DGK缺乏及伊卡洛斯缺乏的，例如不表現DGK及伊卡洛斯或具有降低或抑制的DGK及伊卡洛斯活性。該等DGK及伊卡洛斯缺乏細胞可藉由本文所述之任一方法產生。 在實施例中，NK細胞係自個體獲得。在另一實施例中，NK細胞係NK細胞系，例如NK-92細胞系(Conkwest)。 同種異體CART 在本文所述之實施例中，免疫效應細胞可為同種異體免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞。舉例而言，細胞可為同種異體T細胞，例如缺少功能性T細胞受體(TCR)及/或人類白血球抗原(HLA) (例如，I類HLA及/或II類HLA)表現之同種異體T細胞。 缺少功能性TCR之T細胞可例如經改造使得其不在其表面上表現任何功能性TCR，經改造使得其不表現一或多個包含功能性TCR之亞單位，或經改造使得其在其表面上產生極少功能性TCR。或者，T細胞可例如藉由表現TCR之一或多個亞單位之突變或截短形式來表現實質上受損之TCR。術語「實質上受損之TCR」意指此TCR不會引發宿主中之不利免疫反應。該等細胞可經由使用一或多個如本文所述之基因編輯系統來產生。在實施例中，基因編輯系統靶向編碼TCR組分之序列，例如TCR α恆定鏈基因(TRAC)或其調控元件中之序列。在實施例中，基因編輯系統靶向編碼TCR組分之序列，例如TCR β恆定鏈基因(TRBC)或其調控元件中之序列。 本文所述之T細胞可例如經改造使得其不在其表面上表現功能性HLA。舉例而言，本文所述之T細胞可經改造使得細胞表面表現HLA (例如1類HLA及/或II類HLA)下調。該等細胞可經由使用一或多個如本文所述之基因編輯系統來產生。在實施例中，基因編輯系統靶向編碼一或多個HLA分子之組分之序列。在實施例中，基因編輯系統靶向編碼影響一或多個HLA分子之表現之因子的序列。在實施例中，基因編輯系統靶向I類MHC表現之調控劑，例如編碼β-2微球蛋白(B2M)之序列。在實施例中，基因編輯系統靶向編碼II類MHC分子表現之調控劑(例如CIITA)之序列。在實施例中，將靶向I類MHC表現之調控劑(例如B2M)及II類MHC分子表現之調控劑(例如CIITA)二者之基因編輯系統引入細胞中，使得至少I類MHC分子及至少一個II類MHC分子表現下調。 在一些實施例中，T細胞可缺少功能性TCR及功能性HLA，例如I類HLA及/或II類HLA。 缺少功能性TCR及/或HLA之表現之經修飾T細胞可藉由任何適宜方式(包括敲除或敲低TCR或HLA之一或多個亞單位)來獲得。舉例而言，T細胞可包括利用siRNA、shRNA、成簇規律間隔之短迴文重複(CRISPR)轉錄活化劑樣效應物核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)之TCR及/或HLA敲低。 在一些實施例中，同種異體細胞可為藉由例如本文所述之任何方法不表現或表現少量抑制性分子之細胞。舉例而言，細胞可為不表現或表現少量例如可降低CAR表現細胞引起免疫效應物反應之能力之抑制性分子的細胞。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFβ。抑制性分子之抑制(例如藉由在DNA、RNA或蛋白質層級上抑制)可最佳化CAR表現細胞性能。在實施例中，可使用抑制核酸(例如抑制核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)、成簇規律間隔之短迴文重複(CRISPR)、轉錄活化劑樣效應物核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)，例如如本文所述。 抑制例如TCR或HLA之siRNA及shRNA 在一些實施例中，在T細胞中TCR表現及/或HLA表現可利用靶向編碼TCR及/或HLA之核酸之siRNA或shRNA來抑制。 siRNA及shRNA在T細胞中之表現可利用任何習用表現系統(例如，例如慢病毒表現系統)來達成。 下調TCR組分之表現之實例性shRNA闡述於例如美國公開案第2012/0321667號中。下調I類HLA及/或II類HLA基因之表現之實例性siRNA及shRNA闡述於例如美國公開案第US 2007/0036773號中。 抑制例如TCR或HLA之CRISPR 如本文所用之「CRISPR」或「針對TCR及/或HLA之CRISPR」或「抑制TCR及/或HLA之CRISPR」係指成簇規律間隔之短迴文重複之集合或包含重複之此一集合之系統。如本文所用之「Cas」係指CRISPR相關蛋白。「CRISPR/Cas」系統係指可用於沉默或突變TCR及/或HLA基因之源自CRISPR及Cas之系統。 天然CRISPR/Cas系統發現於約40%之經測序真細菌基因體及90%之經測序古細菌中。Grissa等人(2007)BMC Bioinformatics 8: 172。此系統係賦予外源遺傳元件(例如質體及噬菌體)抗性且提供獲得性免疫性形式之原核免疫系統類型。Barrangou等人(2007)Science 315: 1709-1712；Marragini等人(2008)Science 322: 1843-1845。 CRISPR/Cas系統已經修飾用於真核生物(例如小鼠或靈長類動物)中之基因編輯(沉默、增強或改變特定基因)。Wiedenheft等人(2012)Nature 482: 331-8。此係藉由將含有特殊設計之CRISPR及一或多個適宜Cas之質體引入真核細胞中來實現。 CRISPR序列(有時稱為CRISPR基因座)包含交替重複及間隔體。在天然CRISPR中，間隔體通常包含細菌之外源序列(例如質體或噬菌體序列)；在TCR及/或HLA CRISPR/Cas系統中，間隔體源自TCR或HLA基因序列。 來自CRISPR基因座之RNA由Cas蛋白組成型表現且經其處理成小RNA。該等小RNA包含側接有重複序列之間隔體。RNA引導其他Cas蛋白以在RNA或DNA層級上沉默外源遺傳元件。Horvath等人(2010)Science 327: 167-170；Makarova等人(2006)Biology Direct 1: 7。因此，間隔體以與siRNA類似之方式用作RNA分子之模板。Pennisi (2013)Science 341: 833-836。 由於該等間隔體天然存在於許多不同類型之細菌中，故CRISPR之確切排列及Cas基因之結構、功能及數量及其產物在各物種之間略有不同。Haft等人(2005)PLoS Comput. Biol. 1: e60；Kunin等人(2007)Genome Biol. 8: R61；Mojica等人(2005)J. Mol. Evol. 60: 174-182；Bolotin等人(2005)Microbiol. 151: 2551-2561；Pourcel等人(2005)Microbiol. 151: 653-663；及Stern等人(2010)Trends. Genet . 28: 335-340。舉例而言，Cse (Cas亞型，大腸桿菌)蛋白(例如，CasA)形成將CRISPR RNA轉錄本處理成Cascade保留之間隔體重複單元之功能複合物Cascade。Brouns等人(2008)Science 321: 960-964。在其他原核生物中，Cas6處理CRISPR轉錄本。大腸桿菌中之基於CRISPR之噬菌體失活需要Cascade及Cas3而非Cas1或Cas2。強烈熾熱球菌(Pyrococcus furiosus)及其他原核生物中之Cmr (Cas RAMP模組)蛋白與識別並裂解互補靶RNA之小CRISPR RNA形成功能複合物。較簡單CRISPR系統依賴於蛋白質Cas9，其係具有兩個活性切割位點、一者針對每一雙螺旋鏈之核酸酶。組合Cas9及經修飾CRISPR基因座RNA可用於基因編輯系統中。Pennisi (2013)Science 341: 833-836。 因此，CRISPR/Cas系統可用於編輯TCR及/或HLA基因(添加或缺失一或多個鹼基對)或引入過早終止，由此降低靶基因或染色體序列(例如TCR及/或HLA)之表現。或者，CRISPR/Cas系統可如RNA干擾一樣使用，以可逆方式關閉TCR及/或HLA基因。在哺乳動物細胞中，例如，RNA可將Cas蛋白(例如缺少核酸酶活性之Cas蛋白，例如dCas9)引導至TCR及/或HLA啟動子，從而在空間上阻斷RNA聚合酶。 可利用業內已知、例如美國公開案第20140068797號中所述之技術產生抑制例如TCR及/或HLA之人工CRISPR/Cas系統。本文所述可用於本發明中之CRISPR系統包括例如PCT申請公開案WO2017/093969中所述之彼等，該公開案之內容係全文以引用方式併入本文中。 抑制例如TCR及/或HLA之TALEN 「TALEN」或「針對HLA及/或TCR之TALEN」或「抑制HLA及/或TCR之TALEN」係指轉錄活化劑樣效應物核酸酶，其係可用於編輯HLA及/或TCR基因之人工核酸酶。 TALEN係以人工方式藉由將TAL效應物DNA結合域融合至DNA裂解域來產生。轉錄活化劑樣效應(TALE)可經改造以結合任何期望DNA序列，包括HLA或TCR基因之一部分。藉由組合經改造之TALE與DNA裂解域，可產生特異性針對任何期望DNA序列(包括HLA或TCR序列)之限制酶。然後可將該等序列引入細胞中，其中其可用於基因體編輯。Boch (2011)Nature Biotech . 29: 135-6；及Boch等人(2009)Science 326: 1509-12；Moscou等人(2009)Science 326: 3501。 TALE係由黃單胞菌屬(Xanthomonas)細菌分泌之蛋白質。DNA結合域含有高度保守之重複33-34胺基酸序列，第12及第13胺基酸除外。該兩個位置高度可變，從而展示與特定核苷酸識別之強相關。因此，其可經改造以結合至期望DNA序列。 為產生TALEN，使TALE蛋白融合至為野生型或突變FokI核酸內切酶之核酸酶(N)。已針對FokI於TALEN中之用途對其作出若干突變；該等突變例如改良裂解特異性或活性。Cermak等人(2011)Nucl. Acids Res. 39: e82；Miller等人(2011)Nature Biotech. 29: 143-8；Hockemeyer等人(2011)Nature Biotech. 29: 731-734；Wood等人(2011)Science 333: 307；Doyon等人(2010)Nature Methods 8: 74-79；Szczepek等人(2007)Nature Biotech. 25: 786-793；及Guo等人(2010)J. Mol. Biol. 200: 96。 FokI域用作二聚體，此需要兩種具有針對靶基因體中具有正確定向及間距之位點的獨特DNA結合域之構築體。TALE DNA結合域與FokI裂解域之間之胺基酸殘基數及兩個個別TALEN結合位點之間的鹼基數似乎係達成高活性程度之重要參數。Miller等人(2011)Nature Biotech. 29: 143-8。 HLA或TCR TALEN可在細胞內部用於產生雙鏈斷裂(DSB)。若修復機制經由非同源末端連接不正確地修復斷裂，則可在斷裂位點處引入突變。舉例而言，不正確修復可引入移碼突變。或者，可將外源DNA與TALEN一起引入細胞中；此端視外源DNA之序列及染色體序列而定，此過程可用於校正HLA或TCR基因中之缺陷或將此一缺陷引入wt HLA或TCR基因中，由此減少HLA或TCR之表現。 特異性針對HLA或TCR中之序列之TALEN可利用業內已知之任何方法、包括利用模組組分之各種方案來構築。Zhang等人(2011)Nature Biotech. 29: 149-53；Geibler等人(2011)PLoS ONE 6: e19509。 抑制例如HLA及/或TCR之鋅指核酸酶 「ZFN」或「鋅指核酸酶」或「針對HLA及/或TCR之ZFN」或「抑制HLA及/或TCR之ZFN」係指鋅指核酸酶，其係可用於編輯HLA及/或TCR基因之人工核酸酶。 與TALEN一樣，ZFN包含融合至DNA結合域之FokI核酸酶域(或其衍生物)。在ZFN之情形下，DNA結合域包含一或多個鋅指。Carroll等人(2011)Genetics Society of America 188: 773-782；及Kim等人(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160。 鋅指係由一或多個鋅離子穩定之小蛋白質結構基序。鋅指可包含例如Cys2His2，且可識別約3 bp序列。各種已知特異性之鋅指可組合產生識別約6 bp、9 bp、12 bp、15 bp或18 bp序列之多指多肽。可利用多種選擇及模組組裝技術來產生識別特定序列之鋅指(及其組合)，該等技術包括噬菌體展示、酵母單雜交系統、細菌單雜交及雙雜交系統以及哺乳動物細胞。 與TALEN一樣，ZFN必須二聚化以裂解DNA。因此，需要ZFN對靶向非迴文DNA位點。兩個個別ZFN必須結合DNA之不同鏈，且其核酸酶適當地間隔開。Bitinaite等人(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5。 亦與TALEN一樣，ZFN可在DNA中產生雙鏈斷裂，若不正確地修復則此可產生移碼突變，導致HLA及/或TCR在細胞中之表現及量減少。ZFN亦可與同源重組一起使用來突變HLA或TCR基因。 特異性針對HLA及/或TCR中之序列之ZFN可利用業內已知之任一方法構築。Cathomen等人(2008)Mol. Ther. 16: 1200-7；及Guo等人(2010)J. Mol. Biol. 400: 96。 免疫效應細胞(例如，T細胞)之活化及擴增 免疫效應細胞(例如T細胞)通常可使用如例如以下專利中所述之方法活化及擴增：美國專利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；及美國專利申請公開案第20060121005號。 通常，免疫效應細胞之發明群體可藉由與表面接觸來擴增，該表面具有附接至其之刺激CD3/TCR複合物相關信號之藥劑及刺激T細胞表面上之共刺激分子之配體。特定而言，T細胞群體可如本文所述來刺激，例如藉由與固定在表面上之抗CD3抗體或其抗原結合片段或抗CD2抗體接觸，或藉由與蛋白激酶C活化劑(例如苔蘚蟲素)以及鈣離子載體接觸來刺激。對於T細胞表面上輔助分子之共刺激，使用結合輔助分子之配體。舉例而言，可在適於刺激T細胞增殖之條件下使T細胞群體與抗CD3抗體及抗CD28抗體接觸。為刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞增殖，使用抗CD3抗體及抗CD28抗體。抗CD28抗體之實例包括9.3、B-T3、XR-CD28 (Diaclone, Besançon, France)，其可與業內通常已知之其他方法同樣使用(Berg等人，Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998；Haanen等人，J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999；Garland等人，J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。 在某些態樣中，針對T細胞之主要刺激信號及共刺激信號可藉由不同方案來提供。舉例而言，提供每一信號之藥劑可在溶液中或偶合至表面。當偶合至表面時，該等藥劑可偶合至相同表面(即呈「順式」形式)或偶合至各別表面(即呈「反式」形式)。或者，一種藥劑可偶合至表面且另一藥劑在溶液中。在一個態樣中，提供共刺激信號之藥劑與細胞表面結合，且提供初級活化信號之藥劑在溶液中或偶合至表面。在某些態樣中，兩種藥劑皆可在溶液中。在一個態樣中，藥劑可呈可溶形式，且然後與表面交聯，例如表現Fc受體之細胞或抗體或將與該等藥劑結合之其他結合劑。就此而言，參見例如美國專利申請公開案第20040101519號及第20060034810號，該等公開案係關於所涵蓋用於活化及擴增本發明T細胞之人工抗原呈遞細胞(aAPC)。 在一個態樣中，將兩種藥劑固定在珠粒上，固定在同一珠粒上(即「順式」)，或固定在各別珠粒上(即「反式」)。舉例而言，提供初級活化信號之藥劑係抗CD3抗體或其抗原結合片段，且提供共刺激信號之藥劑係抗CD28抗體或其抗原結合片段；且兩種藥劑以等效分子量共固定至同一珠粒。在一個態樣中，使用與用於CD4+ T細胞擴增與T細胞生長之珠粒結合之每一抗體1:1的比率。在本發明之某些態樣中，使用一定比率之與珠粒結合之抗CD3:CD28抗體使得與利用1:1比率觀察到之擴增相比，觀察到T細胞擴增增加。在一個特定態樣中，與利用1:1比率觀察到之擴增相比，觀察到約1倍至約3倍的增加。在一個態樣中，與珠粒結合之CD3:CD28抗體之比率介於100:1至1:100及其間所有整數值範圍內。在本發明之一個態樣中，多於抗CD3抗體之抗CD28抗體結合至粒子，即CD3:CD28之比率小於1。在本發明之某些態樣中，結合至珠粒之抗CD28抗體對抗CD3抗體之比率大於2:1。在一特定態樣中，使用結合至珠粒之抗體之1:100 CD3:CD28比率。在一個態樣中，使用結合至珠粒之抗體之1:75 CD3:CD28比率。在另一態樣中，使用結合至珠粒之抗體之1:50 CD3:CD28比率。在一個態樣中，使用結合至珠粒之抗體之1:30 CD3:CD28比率。在一較佳態樣中，使用結合至珠粒之抗體之1:10 CD3:CD28比率。在一個態樣中，使用結合至珠粒之抗體之1:3 CD3:CD28比率。在另一態樣中，使用結合至珠粒之抗體之3:1 CD3:CD28比率。 可使用1:500至500:1及其間之任何整數值之粒子對細胞之比率來刺激T細胞或其他靶細胞。如熟習此項技術者可容易地瞭解，粒子對細胞之比率可端視粒子相對於靶細胞之大小而定。舉例而言，大小較小之珠粒僅可結合少數細胞，而較大珠粒可結合許多細胞。在某些態樣中，細胞對粒子之比率介於1:100至100:1及其間之任何整數值範圍內，且在其他態樣中，該比率包含1:9至9:1及其間之任何整數值，其亦可用於刺激T細胞。產生T細胞刺激之抗CD3偶合粒子及抗CD28偶合粒子對T細胞之比率可如上文所述而變化，然而某些較佳值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1及15:1，其中一個較佳比率為至少1:1粒子/T細胞。在一個態樣中，使用1:1或更小之粒子對細胞比率。在一個特定態樣中，較佳粒子:細胞比率為1:5。在其他態樣中，粒子對細胞比率可端視刺激時間而變化。舉例而言，在一個態樣中，在第一天時粒子對細胞之比率為1:1至10:1，且每天或每隔一天此後保持10天以1:1至1:10之最終比率(基於添加時間之細胞計數)將其他粒子添加至細胞中。在一個特定態樣中，在第一天刺激時粒子對細胞之比率為1:1，且在第三天及第五天刺激時調整至1:5。在一個態樣中，每天或每隔一天添加粒子，在第一天時添加至1:1之最終比率，且在第三天及第五天刺激時添加至1:5之最終比率。在一個態樣中，在第一天刺激時粒子對細胞之比率為2:1，且在第三天及第五天刺激時調整至1:10。在一個態樣中，每天或每隔一天添加粒子，在第一天時添加至1:1之最終比率，且在第三天及第五天刺激時添加至1:10之最終比率。熟習此項技術者將瞭解，多種其他比率可適用於本發明中。特定而言，比率將端視粒子大小以及細胞大小及類型而變化。在一個態樣中，在第一天時所用最典型比率為約1:1、2:1及3:1。 在本發明之其他態樣中，組合細胞(例如T細胞)與藥劑包覆之珠粒，隨後分離珠粒與細胞，及然後培養細胞。在一替代性態樣中，在培養之前，不分離藥劑包覆之珠粒與細胞，而一起培養。在另一態樣中，首先藉由施加力(例如磁力)濃縮珠粒及細胞，從而增加細胞表面標記物之連接，由此誘發細胞刺激。 舉例而言，可藉由使抗CD3及抗CD28所附接之順磁珠粒(3×28個珠粒)與T細胞接觸來連接細胞表面蛋白。在一個態樣中，於緩衝液(例如PBS (不含二價陽離子，諸如鈣及鎂))中組合細胞(例如104 至109 個T細胞)與珠粒(例如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T順磁珠粒，比率為1:1)。而且，熟習此項技術者可輕易地瞭解，可使用任何細胞濃度。舉例而言，在樣品中靶細胞可能極稀少且僅包含樣品的0.01%，或整個樣品(即100%)可能包含所關注靶細胞。因此，任何細胞數量皆在本發明之情況中。在某些態樣中，可期望顯著減小珠粒及細胞混合在一起之體積(即增加細胞之濃度)，以確保細胞與珠粒之最大接觸。舉例而言，在一個態樣中，使用約100億個細胞/ml、90億/ml、80億/ml、70億/ml、60億/ml或50億/ml之濃度。在一個態樣中，使用大於100百萬個細胞/ml。在另一態樣中，使用10百萬、15百萬、20百萬、25百萬、30百萬、35百萬、40百萬、45百萬或50百萬個細胞/ml之細胞濃度。在另一態樣中，使用75百萬、80百萬、85百萬、90百萬、95百萬或100百萬個細胞/ml之細胞濃度。在其他態樣中，可使用125百萬或150百萬個細胞/ml之濃度。利用高濃度可增加細胞產率、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度可更有效地捕獲可能弱表現所關注靶抗原之細胞，例如CD28陰性T細胞。在某些態樣中，該等細胞群體可具有治療價值且將期望獲得。舉例而言，利用高濃度之細胞可更有效地選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。 在一個實施例中，經編碼CAR (例如，本文所述之CAR)之核酸轉導之細胞係例如藉由本文所述之方法擴增。在一個實施例中，使細胞在培養物中擴增若干小時(例如約2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、15小時、18小時、21小時)至約14天(例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天)之時段。在一個實施例中，使細胞擴增4天至9天之時段。在一個實施例中，使細胞擴增8天或更短(例如7天、6天或5天)之時段。在一個實施例中，使細胞(例如，本文所述之CD19 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR或ROR1 CAR細胞)在培養物中擴增5天，且在相同培養條件下所得細胞比在培養物中擴增9天之相同細胞更強效。可藉由例如多種T細胞功能(例如增殖、靶細胞殺死、細胞介素產生、活化、遷移或其組合)來定義功效。在一個實施例中，在抗原刺激後與在相同培養條件下在培養物中擴增9天之相同細胞相比，擴增5天之細胞(例如，本文所述之CD19 CAR細胞)展示細胞倍增增加至少一倍、兩倍、三倍或四倍。在一個實施例中，使細胞(例如，表現本文所述CD19 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR或ROR1 CAR之細胞)在培養物中擴增5天，且與在相同培養條件下在培養物中擴增9天之相同細胞相比，所得細胞展現較高的促發炎細胞介素產生(例如，IFN-γ及/或GM-CSF含量)。在一個實施例中，與在相同培養條件下在培養物中擴增9天之相同細胞相比，擴增5天之細胞(例如，本文所述之CD19 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR或ROR1 CAR細胞)展示促發炎細胞介素產生(例如，IFN-γ及/或GM-CSF含量)增加至少一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更大(以pg/ml表示)。 在本發明之一個態樣中，可將混合物培養若干小時(約3小時)至約14天或其間之任何小時整數值。在一個態樣中，可將混合物培養21天。在本發明之一個態樣中，將珠粒及T細胞一起培養約8天。在一個態樣中，將珠粒及T細胞一起培養2-3天。若干刺激週期亦可能合意，使得T細胞之培養時間可為60天或更長。適用於T細胞培養之條件包括可含有增殖及活力所需因子之適宜培養基(例如最小必需培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 15 (Lonza))，該等因子包括血清(例如胎牛或人類血清)、介白素-2 (IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ及TNF-α或熟習此項技術者已知用於細胞生長之任何其他添加劑。用於細胞生長之其他添加劑包括(但不限於)表面活性劑、人血漿蛋白粉及還原劑(例如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇)。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15及X-Vivo 20，最佳者添加有胺基酸、丙酮酸鈉及維生素，不含血清或補充有適量血清(或血漿)或所定義之激素群及/或對於T細胞生長及擴增足夠之細胞介素量。抗生素(例如青黴素(penicillin)及鏈黴素(streptomycin))僅包括於實驗培養物而非欲輸注至個體中之細胞培養物中。將靶細胞維持在支持生長所需之條件下，例如適宜溫度(例如37℃)及氣氛(例如空氣加5% CO2 )。 在一個實施例中，在包括一或多種介白素之適宜培養基(例如，本文所述之培養基)中擴增細胞，該等介白素使細胞在14天擴增時段內增加至少200倍(例如，200倍、250倍、300倍、350倍)，例如如藉由本文所述之方法(例如流式細胞術)所量測。在一個實施例中，在IL-15及/或IL-7 (例如，IL-15及IL-7)存在下擴增細胞。 已暴露於多個刺激時間下之T細胞可展現不同特徵。舉例而言，典型血液或血球分離之末梢血單核細胞產品具有大於細胞毒性或阻抑T細胞群體(TC、CD8+)之輔助T細胞群體(TH、CD4+)。T細胞藉助刺激CD3及CD28受體之離體擴增產生在約第8-9天之前主要由TH細胞組成而在約第8-9天之後T細胞群體包含日益增加之TC細胞群體的T細胞群體。因此，端視治療之目的，向個體輸注主要包含TH細胞之T細胞群體可能有利。類似地，若已分離TC細胞之抗原特異性亞組，則在較大程度上擴增此亞組可能有益。 此外，除CD4及CD8標記物外，其他表型標記物顯著變化，但在很大程度上在細胞擴增過程期間可再生。因此，該可再生性使得可針對具體目的來調適活化T細胞產物。 構築CAR (例如CD20 CAR)後，可立即使用多種分析來評估分子之活性，例如(但不限於)在抗原刺激後使T細胞擴增之能力，在再刺激不存在下持續T細胞擴增之能力，及在適宜活體外及動物模型中之抗癌活性。評估CAR (例如CD20 CAR)之效應之分析進一步詳細闡述於下文中。 可使用初級T細胞中之CAR表現之西方墨點分析來檢測單體及二聚體之存在。參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。極簡言之，使表現CAR之T細胞(CD4+ 及CD8+ T細胞之1:1混合物)在活體外擴增10天以上，然後溶解並在還原條件下實施SDS-PAGE。藉由西方墨點利用針對TCR-ζ鏈之抗體檢測含有全長TCR-ζ細胞質域及內源TCR-ζ鏈之CAR。在非還原條件下使用相同T細胞亞組進行SDS-PAGE分析以允許評估共價二聚體形成。 可藉由流式細胞術量測抗原刺激後CAR+ T細胞之活體外擴增。舉例而言，用αCD3/αCD28 aAPC刺激CD4+ 及CD8+ T細胞之混合物，然後在欲分析之啟動子控制下用表現GFP之慢病毒載體轉導。實例性啟動子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。在培養第6天時在CD4+ 及/或CD8+ T細胞亞組中藉由流式細胞術評估GFP螢光。參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。或者，在第0天時用αCD3/αCD28包覆之磁珠刺激CD4+ 及CD8+ T細胞之混合物，並在第1天時利用表現CAR以及eGFP之雙順反子慢病毒載體利用2A核糖體跳躍序列用CAR轉導。在洗滌後，用CD19+ K562細胞(K562-CD19)、野生型K562細胞(K562野生型)或在抗CD3及抗CD28抗體存在下表現hCD32及4-1BBL之K562細胞(K562-BBL-3/28)再刺激培養物。將外源IL-2以100 IU/ml每隔一天添加至培養物中。藉由流式細胞術利用基於珠粒之計數來列舉GFP+ T細胞。參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。可利用抗CD20 T細胞(參見例如Gill等人，Blood 2014;123:2343)或抗CD20 CAR T細胞實施類似分析。 亦可量測在再刺激不存在下之持續CAR+ T細胞擴增。參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。簡言之，在第0天用αCD3/αCD28包覆之磁珠刺激、並在第1天用所指示之CAR轉導後，在培養第8天時利用Coulter Multisizer III粒子計數器、Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter量測平均T細胞體積(fl)。 亦可使用動物模型來量測CART活性。舉例而言，可使用利用人類CD19特異性CAR+ T細胞之異種移植物模型來治療免疫缺失小鼠之原發性人類前B ALL。參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。極簡言之，在建立ALL後，使小鼠隨機化至治療組。將不同數量之經αCD19-ζ及αCD19-BB-ζ改造之T細胞以1:1比率共注射至帶有B-ALL之NOD-SCID-γ−/− 小鼠中。在T細胞注射後之不同時間下評估來自小鼠之脾DNA中之αCD19-ζ及αCD19-BB-ζ載體的拷貝數。以每週間隔評價動物之白血病。量測注射αCD19-ζ CAR+ T細胞或模擬物轉導之T細胞之小鼠中的末梢血CD19+ B-ALL母細胞計數。利用對數秩測試比較各組之存活率曲線。另外，亦可分析NOD-SCID-γ−/− 小鼠中在T細胞注射後4週時之絕對末梢血CD4+ 及CD8+ T細胞計數。向小鼠注射白血病細胞，且3週後注射經改造以藉由編碼連接至eGFP之CAR之雙順反子慢病毒載體表現CAR之T細胞。在注射之前藉由與模擬物轉導之細胞混合將T細胞正規化至45%-50%輸入GFP+ T細胞，且藉由流式細胞術確認。以1週間隔評價動物之白血病。利用對數秩測試比較CAR+ T細胞組之存活率曲線。可使用CD20 CART進行類似實驗。 可評估劑量依賴性CAR治療反應。參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。舉例而言，在第21天時注射CAR T細胞、等數量之模擬物轉導之T細胞或不注射T細胞之小鼠中在建立白血病後35-70天獲得末梢血。對每組小鼠隨機採血以確定末梢血CD19+ ALL母細胞計數，且然後在第35天及第49天殺死。在第57天及第70天評估剩餘動物。可使用CD20 CART進行類似實驗。 細胞增殖及細胞介素產生之評價先前已闡述於例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)中。簡言之，在微量滴定板上藉由以2:1之最終T細胞:K562比率混合經洗滌之T細胞與表現CD19 (K19)或CD32及CD137之K562細胞(KT32-BBL)來實施CAR介導之增殖之評價。在使用前用γ-輻射輻照K562細胞。將抗CD3 (純系OKT3)及抗CD28 (純系9.3)單株抗體添加至含有KT32-BBL細胞之培養物中以用作刺激T細胞增殖之陽性對照，此乃因該等信號支持長期CD8+ T細胞離體擴增。 在培養物中利用CountBright™螢光珠粒(Invitrogen, Carlsbad, CA)及流式細胞術如製造商所述列舉T細胞。藉由GFP表現利用經改造具有表現eGFP-2A連接之CAR之慢病毒載體的T細胞鑑別CAR+ T細胞。對於不表現GFP之CAR+ T細胞，用生物素化重組CD19蛋白及二級抗生物素蛋白-PE偶聯物檢測CAR+ T細胞。亦同時用特異性單株抗體(BD Biosciences)檢測T細胞上之CD4+及CD8+ 表現。根據製造商之說明書使用人類TH1/TH2細胞介素細胞計數珠粒陣列套組(BD Biosciences, San Diego, CA)或使用Luminex 30重套組(Invitrogen)，對在再刺激後24小時收集之上清液實施細胞介素量測。利用BD Fortessa流式細胞儀評價螢光，且根據製造商之說明書分析數據。可使用CD20 CART進行類似實驗。 可藉由標準51Cr釋放分析來評價細胞毒性。參見例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。簡言之，在37℃下，用51Cr (呈NaCrO4 形式，New England Nuclear, Boston, MA)將靶細胞(K562系及初級前B-ALL細胞)加載2小時同時頻繁攪動，在完全RPMI中洗滌兩次且平鋪至微量滴定板中。以效應細胞:靶細胞(E:T)之不同比率將效應T細胞與孔中之完全RPMI中之靶細胞混合。亦製備僅含培養基(自發釋放，SR)或triton-X100洗滌劑之1%溶液(總釋放，TR)的其他孔。在37℃下培育4小時後，收穫每一孔之上清液。然後利用γ粒子計數器(Packard Instrument Co., Waltham, MA)量測所釋放之51Cr。以至少一式三份實施每一條件，且利用下式計算溶解百分比：溶解% = (ER- SR) / (TR - SR)，其中ER表示針對每一實驗條件釋放之平均51Cr。 可使用成像技術來評估CAR在帶有腫瘤之動物模型中之特定輸送及增殖。該等分析已闡述於例如Barrett等人，Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)中。簡言之，向NOD/SCID/γc-/- (NSG)小鼠IV注射Nalm-6細胞，7天後在用CAR構築體電穿孔後4小時注射T細胞。用慢病毒構築體穩定轉染T細胞以表現螢火蟲螢光素酶，且使小鼠針對生物發光成像。或者，可如下量測Nalm-6異種移植物模型中單次注射CAR+ T細胞之治療效能及特異性：向NSG小鼠注射經轉導以穩定表現螢火蟲螢光素酶之Nalm-6，然後在7天後單次尾靜脈注射經CAR電穿孔之T細胞。使動物在注射後之不同時間點下成像。舉例而言，可產生在第5天(治療前2天)及第8天(CAR+ PBL後24 hr)時代表性小鼠中之螢火蟲螢光素酶陽性白血病之光子密度熱圖。 亦可使用其他分析(包括本文實例部分中所述之彼等以及業內已知之彼等)來評估本文所揭示之CD20 CAR或CD22 CAR構築體。 治療性應用 CD20、CD19及/或CD22相關疾病及/或病症 本發明尤其提供用於治療與CD20、CD19及/或CD22之表現相關之癌症或疾病或與表現CD20、CD19及/或CD22之細胞相關之病況的組合物及方法。在一些實施例中，癌症或疾病包括例如增生性疾病(例如癌症或惡性病)或癌前病況(例如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期)；或與表現CD20、CD19及/或CD22之細胞相關之非癌症相關適應症。在一個態樣中，與CD20之表現相關之癌症或疾病係血液癌症。在一個態樣中，血液癌症包括(但不限於) B細胞惡性病。在一個態樣中，血液癌症係白血病或淋巴瘤。在一個態樣中，癌症(例如與CD20、CD19及/或CD22之表現相關之癌症)包括癌症及惡性病，包括(但不限於)例如一或多種急性白血病包括(但不限於) B細胞急性淋巴球性白血病(BALL)、T細胞急性淋巴球性白血病(TALL)、小淋巴球性白血病(SLL)、急性淋巴球性白血病(ALL)；一或多種慢性白血病，包括(但不限於)慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)；其他血液癌症或血液病況，包括(但不限於)外套細胞淋巴瘤(MCL)、B細胞前淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤、柏基特氏淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴球增生性病況、MALT淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞贅瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症及「白血病前期」 (其係因骨髓血球之無效產生(或發育不良)而集合在一起之血液病況之不同集合)。在一些實施例中，與CD20、CD19及/或CD22表現相關之疾病包括(但不限於)表現CD20、CD19及/或CD22之非典型及/或非古典癌症、惡性病、癌前病況或增生性疾病及其任何組合。 亦可包括與CD20之表現相關之非癌症相關適應症。與CD20之表現相關之非癌症相關適應症包括(但不限於)例如自體免疫疾病(例如，狼瘡、類風濕性關節炎、多發性硬化、自體免疫溶血性貧血、純紅血球再生不良、特發性血小板減少紫斑症、伊文氏症候群(Evans syndrome)、血管炎、大皰性皮膚病、1型糖尿病、休格倫氏症候群(Sjogren's syndrome)、抗NMDA受體腦炎及德維克氏病(Devic's disease)、葛瑞夫茲氏眼病變(Graves' ophthalmopathy)及自體免疫胰臟炎)、發炎性病症(過敏及氣喘)及移植。 在一個態樣中，本發明提供治療與CD20、CD19及/或CD22表現相關之疾病之方法。在一個態樣中，本發明提供治療其中腫瘤之一部分對CD20、CD19及/或CD22呈陰性且腫瘤之一部分對CD20、CD19及/或CD22呈陽性之疾病的方法。舉例而言，本發明CAR可用於治療已經歷與CD20、CD19及/或CD22之表現相關之疾病治療之個體，其中已經歷與CD20、CD19及/或CD22之表現相關之治療之個體展現與CD20、CD19及/或CD22的表現相關之疾病。 在一個態樣中，本發明係關於用於在哺乳動物T細胞或NK細胞中表現之包含可操作地連接至啟動子之包含如本文所述CAR的載體。在一個態樣中，本發明提供表現CAR之重組T細胞用於治療CD20、CD19及/或CD22表現腫瘤，其中表現CD20 CAR、CD19 CAR或CD22 CAR之重組T細胞分別稱為CD20 CART、CD19 CART或CD22 CART。在一個態樣中，本發明之CD19 CART或CD22 CART能夠使腫瘤細胞與在其表面上表現之至少一個本發明CD20 CAR、CD19 CAR或CD22 CAR接觸，使得CART靶向腫瘤細胞且抑制腫瘤生長。 在一個態樣中，本發明係關於抑制表現CD20、CD19及/或CD22之腫瘤細胞之生長之方法，其包含使腫瘤細胞與本發明之CD20 CD19-CAR T細胞及/或CD22-CAR T細胞或表現CD20-CAR、CD19-CAR及/或CD22-CAR之NK細胞接觸，使得CAR表現細胞因應抗原而活化且靶向癌細胞，其中抑制腫瘤之生長。 在一個態樣中，本發明係關於治療個體之癌症之方法。該方法包含向個體投與本發明之CD20-CAR、CD19-CAR及/或CD22-CAR表現細胞，使得治療個體之癌症。可藉由本發明之CD20-CAR、CD19-CAR及/或CD22-CAR表現細胞治療之癌症之實例係與CD20之表現相關之癌症。可藉由本發明之CD20-CAR、CD19-CAR及/或CD22-CAR表現細胞治療之癌症之實例包括(但不限於)本文所述之血液癌症。本發明包括一種類型之細胞療法，其中細胞經遺傳性地修飾以表現嵌合抗原受體(CAR)且將CAR表現細胞輸注至有需要之接受者。所輸注細胞能夠殺死接受者中之腫瘤細胞。與抗體療法不同，CAR修飾之細胞能夠在活體內複製，從而產生可引起持續腫瘤控制之長期持久性。在多個態樣中，在向患者投與細胞後，投與患者之T細胞或其後代在患者中存留至少4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月、2年、3年、4年或5年。 本發明亦包括一種類型之細胞療法，其中免疫效應細胞(例如NK細胞或T細胞)經例如活體外轉錄之RNA修飾以瞬時表現嵌合抗原受體(CAR)且將CAR表現(例如CART或CAR表現NK)細胞輸注至有需要之接受者。所輸注細胞能夠殺死接受者中之癌細胞。因此，在多個態樣中，在向患者投與CAR表現細胞(例如T或NK細胞)後，投與患者之CAR表現細胞(例如T或NK細胞)存在短於1個月，例如3週、2週、1週。 不希望受限於任何特定理論，由CAR修飾之T細胞或NK細胞引發之抗腫瘤免疫反應可為主動或被動免疫反應，或或者可歸因於直接對間接免疫反應。在一個態樣中，CAR轉導之T細胞或NK細胞展現特異性促發炎細胞介素分泌及強效的因應表現CD20之人類癌細胞之細胞溶解活性，抵抗可溶性CD20抑制，調介旁觀者殺死並調介現有人類腫瘤之消退。舉例而言，表現CD20之腫瘤之異質場內的無抗原腫瘤細胞可能易受CD20重定向T細胞或NK細胞間接破壞之影響，該間接破壞係先前抵抗毗鄰抗原陽性癌細胞作出之反應。 在一個態樣中，本發明之CAR修飾之T細胞(例如全人類CAR表現細胞)可為用於哺乳動物之離體免疫及/或活體內療法之疫苗類型。在一個態樣中，哺乳動物係人類。 關於離體免疫，在將細胞投與哺乳動物中之前在活體外進行以下中之至少一者：i) 擴增細胞，ii) 將編碼CAR之核酸引入細胞，或iii) 低溫保藏細胞。 離體程序為業內所熟知且更全面論述於下文中。簡言之，自哺乳動物(例如人類)分離細胞，且用表現本文所揭示CAR之載體進行遺傳性地修飾(即活體外轉導或轉染)。可向哺乳動物接受者投與CAR修飾之細胞以提供治療益處。哺乳動物接受者可為人類，且CAR修飾之細胞對於接受者而言可為自體。或者，細胞對於接受者而言可為同種異體、同基因或異種。 造血幹細胞及祖細胞之離體擴增程序闡述於美國專利第5,199,942號中，該專利以引用方式併入本文中，該程序可應用於本發明之細胞。業內已知其他適宜方法，因此本發明並不限於任何特定的細胞離體擴增方法。簡言之，T細胞之離體培養及擴增包含：(1) 自哺乳動物之末梢血收穫物或骨髓外植體收集CD34+造血幹細胞及祖細胞；及(2) 離體擴增該等細胞。 除美國專利第5,199,942號中所述之細胞生長因子外，可使用其他因子(例如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配體)來培養及擴增細胞。 除根據離體免疫利用基於細胞之疫苗外，本發明亦提供用於活體內免疫來引發針對患者中之抗原之免疫反應的組合物及方法。 通常，如本文所述活化及擴增之細胞可用於治療及預防在免疫受損個體中產生之疾病。特定而言，本發明之CAR修飾細胞用於治療與CD20之表現相關之疾病、病症及病況。在某些態樣中，本發明細胞用於治療具有罹患與CD20之表現相關之疾病、病症及病況之風險之患者。因此，本發明提供治療或預防與CD20之表現相關之疾病、病症及病況之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之本發明之CAR修飾細胞。 在一個態樣中，本發明之CAR表現細胞可用於治療增生性疾病(例如癌症或惡性病)或癌前病況(例如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期)。在一個態樣中，與CD20之表現相關之癌症係血液癌症、白血病前期、過度增生性病症、增生或發育不良，其特徵在於細胞之異常生長。 在一個態樣中，本發明之CAR表現細胞用於治療癌症，其中癌症係血液癌症。血液癌症病況係侵襲血液、骨髓及淋巴系統之癌症類型，例如白血病及惡性淋巴球增生性病況。 白血病可分類為急性白血病及慢性白血病。急性白血病可進一步分類為急性骨髓性白血病(AML)及急性淋巴球性白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性骨髓性白血病(CML)及慢性淋巴球性白血病(CLL)。其他相關病況包括骨髓發育不良症候群(MDS，之前稱為「白血病前期」)，其係因骨髓性血球之無效產生(或發育不良)及轉形成AML之風險而集合在一起之血液病況之不同集合。 淋巴瘤係自淋巴球發育之血球腫瘤之群。實例性淋巴瘤包括非霍奇金氏淋巴瘤及霍奇金氏淋巴瘤。 在一個態樣中，本發明之組合物及CAR表現細胞尤其可用於治療B細胞惡性病，例如非霍奇金氏淋巴瘤，例如DLBCL、濾泡性淋巴瘤或CLL。 非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)係自B或T細胞形成之淋巴球之癌症之群。NHL發生在任一年齡且特徵通常在於大於正常之淋巴結、體重損失及發熱。不同類型之NHL分類為攻擊(快速生長)型及惰(緩慢生長)型。B細胞非霍奇金氏淋巴瘤包括柏基特氏淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤(CLL/SLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞性淋巴瘤及外套細胞淋巴瘤。T細胞非霍奇金氏淋巴瘤之實例包括蕈樣肉芽腫、退行性大細胞淋巴瘤及前體T淋巴母細胞性淋巴瘤。在骨髓或幹細胞移植後發生之淋巴瘤通常係B細胞非霍奇金氏淋巴瘤。參見例如Maloney. NEJM. 366.21(2012):2008-16。 瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)係自B細胞發育而來之NHL形式。DLBCL係攻擊性淋巴瘤，其可在淋巴結中或在淋巴系統外、例如在胃腸道、睪丸、甲狀腺、皮膚、乳房、骨或腦中產生。通常在DLBCL中觀察到細胞形態之三種變體：中心母細胞性、免疫母細胞性及退行性。中心母細胞性形態最為常見且具有大小為中等至大之淋巴球及最少細胞質之外觀。存在若干DLBCL亞型。舉例而言，原發性中樞神經系統淋巴瘤係一種僅侵襲腦之類型之DLBCL且以與侵襲腦外區域之DLBCL不同之方式治療。另一類型之DLBCL係原發性縱膈B細胞淋巴瘤，其通常發生在較年輕患者中且在胸中快速生長。DLBCL之症狀包括頸、腋窩或腹股溝之無痛快速腫脹，其係由擴大的淋巴結引起。對於一些個體，腫脹可為疼痛的。DLBCL之其他症狀包括盜汗、不明原因的發熱及體重損失。儘管大多數DLBCL患者為成人，但此疾病有時發生在兒童中。DLBCL之治療包括化學療法(例如，環磷醯胺、多柔比星(doxorubicin)、長春新鹼(vincristine)、普賴松(prednisone)、依託泊苷(etoposide))、抗體(例如，瑞圖宣(Rituxan))、輻射或幹細胞移植物。 濾泡性淋巴瘤係一種類型之非霍奇金氏淋巴瘤且係濾泡中心B細胞(中心細胞及中心母細胞)之淋巴瘤，其具有至少部分濾泡模式。濾泡性淋巴瘤細胞表現B細胞標記物CD10、CD19、CD20及CD22。濾泡性淋巴瘤細胞通常對CD5呈陰性。在形態上，濾泡性淋巴瘤腫瘤係由含有中心細胞(亦稱為裂解濾泡中心細胞或小細胞)及中心母細胞(亦稱為大非裂解濾泡中心細胞或大細胞)之混合物之濾泡構成。濾泡由非惡性細胞、幾乎T細胞包圍。濾泡主要含有中心細胞及少量中心母細胞。世界衛生組織(WHO)在形態上將疾病分為以下等級：等級1 (＜5個中心母細胞/高倍視野(hpf)；等級2 (6-15個中心母細胞/hpf)；等級3 (＞15個中心母細胞/hpf)。等級3進一步細分成以下各級：等級3A (仍存在中心細胞)；等級3B (濾泡幾乎完全由中心母細胞組成)。濾泡性淋巴瘤之治療包括化學療法(例如烷基化劑)、核苷類似物、含蒽環之方案(例如稱為CHOP-環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼、普賴松/普賴蘇濃(prednisolone)之組合療法)、抗體(例如利妥昔單抗(rituximab))、放射性免疫療法及造血幹細胞移植。 CLL係特徵在於骨髓、血液、淋巴結及脾中之贅瘤細胞增殖及累積之B細胞惡性病。診斷CLL時之中值年齡為約65歲。當前治療包括化學療法、輻射療法、生物療法或骨髓移植。有時，症狀係以手術方式(例如脾切除術移除擴大的脾)或藉由輻射療法(例如對腫脹淋巴結減積)治療。用於治療CLL之化學治療劑包括例如氟達拉濱、2-氯去氧腺苷(克拉屈濱(cladribine))、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、長春新鹼、噴司他汀(pentostatin)、環磷醯胺、阿倫單抗(alemtuzumab) (坎帕斯-1H)、多柔比星及普賴松。用於CLL之生物療法包括抗體，例如阿倫單抗、利妥昔單抗及奧法木單抗(ofatumumab)；以及酪胺酸激酶抑制劑療法。可使用多個準則來分類CLL之階段，例如Rai或Binet系統。Rai系統將CLL闡述為具有5個階段：階段0，其中僅存在淋巴球增多；階段I，其中存在淋巴結病；階段II，其中存在脾腫大、淋巴結病或二者皆有；階段III，其中存在貧血、器官巨大症或二者皆有(進展定義為體重損失、疲勞、發熱、肥大器官巨大症及淋巴球計數快速增加)；及階段IV，其中存在貧血、血小板減少症、器官巨大症或其組合。在Binet分期系統下存在三個類別：階段A，其中存在淋巴球增多且少於三個淋巴結擴大(此階段包括所有Rai階段0患者、一半Rai階段I患者及1/3之Rai階段II患者)；階段B，其中涉及兩個或更多個淋巴結；及階段C，其中存在貧血或血小板減少症或二者皆有。該等分類系統可與免疫球蛋白基因之突變量測值組合以提供疾病狀態之更準確表徵。存在突變免疫球蛋白基因與改良之預後相關聯。 在另一實施例中，本發明之CAR表現細胞用於治療癌症或例如具有白血病幹細胞之白血病。舉例而言，白血病幹細胞係CD34+ /CD38- 白血病細胞。 本發明尤其提供治療癌症之組合物及方法。在一個態樣中，癌症係血液癌症，包括(但不限於)一或多種急性白血病，包括(但不限於) B細胞急性淋巴球性白血病(BALL)、T細胞急性淋巴球性白血病(TALL)、小淋巴球性白血病(SLL)、急性淋巴球性白血病(ALL)；一或多種慢性白血病，包括(但不限於)慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)；其他血液癌症或血液病況，包括(但不限於)外套細胞淋巴瘤(MCL)、B細胞前淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤、柏基特氏淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴球增生性病況、MALT淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞贅瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症及「白血病前期」 (其係因骨髓性血球之無效產生(或發育不良)而集合在一起之血液病況的不同集合)及與CD20表現相關之疾病，包括(但不限於)表現CD20之非典型及/或非古典癌症、惡性病、癌前病況或增生性疾病；及其任何組合。 本發明之CAR修飾細胞可單獨投與，或作為醫藥組合物與稀釋劑及/或其他組分(例如IL-2或其他細胞介素或細胞群體)組合投與。 在另一態樣中，本發明之CAR表現細胞可用於治療先前經CD19 CAR表現細胞治療之個體。在一些實施例中，本發明之CAR表現細胞係在先前經CD19 CAR表現細胞治療之癌症或其他病況復發後投與。 在一些實施例中，癌症或其他病況表現CD19。在一些實施例中，癌症或其他病況表現CD20。在一些實施例中，癌症或其他病況表現CD19及CD20。 在一些實施例中，癌症或其他病況先前對CD19 CAR表現細胞無反應。在一些實施例中，個體癌症或其他病況對用CD19 CAR表現細胞治療有反應。在一些實施例中，癌症或其他病況對用CD19 CAR表現細胞治療之反應性大於其現有反應性。在一些實施例中，癌症或其他病況對用CD19 CAR表現細胞治療有反應。在一些實施例中，癌症或其他病況對用CD19 CAR表現細胞治療有反應且不再對CD19 CAR表現細胞有反應。 在一些實施例中，同步投與CD19 CAR表現細胞及CD20 CAR表現細胞(例如，如本文所述)。在一些實施例中，由於對CD19 CAR表現細胞之反應性減小或損失，同步投與CD19 CAR表現細胞及CD20 CAR表現細胞(例如，如本文所述)。在一些實施例中，已中斷CD19 CAR表現細胞療法。在一些實施例中，由於對CD19 CAR表現細胞之反應性減小或損失，已中斷CD19 CAR療法。 在一些實施例中，同步投與CD19 CAR表現細胞及CD22 CAR表現細胞(例如，如本文所述)。在一些實施例中，由於對CD19 CAR表現細胞之反應性減小或損失，同步投與CD19 CAR表現細胞及CD22 CAR表現細胞(例如，如本文所述)。在一些實施例中，已中斷CD19 CAR表現細胞療法。在一些實施例中，由於對CD19 CAR表現細胞之反應性減小或損失，已中斷CD19 CAR療法。 在一些實施例中，同步投與CD22 CAR表現細胞及CD20 CAR表現細胞(例如，如本文所述)。在一些實施例中，由於對CD22 CAR表現細胞之反應性減小或損失，同步投與CD22 CAR表現細胞及CD20 CAR表現細胞(例如，如本文所述)。在一些實施例中，CD22 CAR表現細胞療法已中斷。在一些實施例中，由於對CD22 CAR表現細胞之反應性減小或損失，已中斷CD22 CAR療法。 在一些實施例中，同步投與CD22 CAR表現細胞及CD20 CAR表現細胞(例如，如本文所述)。在一些實施例中，由於對CD20 CAR表現細胞之反應性減小或損失，同步投與CD22 CAR表現細胞及CD20 CAR表現細胞(例如，如本文所述)。在一些實施例中，已中斷CD20 CAR表現細胞療法。在一些實施例中，由於對CD20 CAR表現細胞之反應性減小或損失，已中斷CD20 CAR療法。 本發明亦提供抑制CD20表現細胞群體之增殖或減小該群體之方法，該等方法包含使包含CD20表現細胞之細胞群體與結合至CD20表現細胞之本發明之CD20 CAR表現細胞接觸。在具體態樣中，本發明提供抑制表現CD20之癌細胞群體之增殖或減小該群體之方法，該等方法包含使CD20表現癌細胞群體與結合至CD20表現細胞之本發明之CD20 CAR表現細胞接觸。在一個態樣中，本發明提供抑制表現CD20之癌細胞群體之增殖或減小該群體之方法，該等方法包含使CD20表現癌細胞群體與結合至CD20表現細胞之本發明之CD20 CAR表現細胞接觸。在某些態樣中，在患有B惡性病或與CD20表現細胞相關之另一癌症之個體或其動物模型中，本發明之CD20 CAR表現細胞使細胞及/或癌細胞之數量、數目、量或百分比相對於陰性對照降低至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%。在一個態樣中，個體係人類。 本發明亦提供預防、治療及/或管控與CD20表現細胞相關之疾病(例如，表現CD20之血液癌症或非典型癌症)之方法，該等方法包含向有需要之個體投與結合至CD20表現細胞之本發明之CD20 CAR表現細胞。在一個態樣中，個體係人類。與CD20表現細胞相關之病症之非限制性實例包括自體免疫疾病(例如，狼瘡、類風濕性關節炎、多發性硬化自體免疫溶血性貧血、純紅血球再生不良、特發性血小板減少紫斑症、伊文氏症候群、血管炎、大皰性皮膚病、1型糖尿病、休格倫氏症候群、抗NMDA受體腦炎及德維克氏病、葛瑞夫茲氏眼病變及自體免疫胰臟炎)、發炎性病症(過敏及氣喘)、移植及癌症(例如表現CD20之血液癌症或非典型癌症)。 本發明亦提供預防、治療及/或管控與CD20表現細胞相關之疾病之方法，該等方法包含向有需要之個體投與結合至CD20表現細胞之本發明之CD20 CAR表現細胞。在一個態樣中，個體係人類。 本發明提供預防與CD20表現細胞相關之癌症復發之方法，該等方法包含向有需要之個體投與結合至CD20表現細胞之本發明之CD20 CAR表現細胞。在一個態樣中，該等方法包含向有需要之個體投與有效量之結合至CD20表現細胞之本文所述CD20 CAR表現細胞與有效量之另一療法的組合。 在一些實施例中，CD20表現細胞表現CD19、CD123、FLT-3、ROR-1、CD79b、CD179b、CD79a、CD10、CD34及/或CD22。在某些實施例中，CD20表現細胞表現CD19。在一些實施例中，CD20表現細胞不表現CD19。 在一些實施例中，個體係CD19 CAR療法之不反應者。在一些實施例中，個體係CD19 CAR療法之部分反應者。在一些實施例中，個體係CD19 CAR療法之完全反應者。在一些實施例中，個體係CD19 CAR療法之非復發者。在一些實施例中，個體係CD19 CAR療法之復發者。 在一些實施例中，先前對用CD19 CAR表現細胞治療有反應之癌症或其他病況不表現CD19。在一些實施例中，先前對用CD19 CAR表現細胞治療有反應之癌症或其他病況之CD19表現量相對於癌症或其他病況對用CD19 CAR表現細胞治療有反應時減少10%、20%、30%、40%、50%或更大。在一些實施例中，先前對用CD19 CAR表現細胞治療有反應之癌症或其他病況表現CD22及/或CD123。 在一些實施例中，本發明之CD20 CAR表現細胞係在先前經CD19 CAR表現細胞治療之癌症或其他病況復發後投與。在一些實施例中，同步投與CD19 CAR表現細胞及CD20 CAR表現細胞，如本文所述。 骨髓燒蝕 在一個態樣中，本發明提供用於骨髓燒蝕之組合物及方法。舉例而言，在一個態樣中，本發明提供用於根除個體中現有骨髓之至少一部分之組合物及方法。本文闡述在某些情況下，本發明之包含CD20 CAR之CD20表現細胞根除CD20陽性骨髓骨髓性祖細胞。 在一個態樣中，本發明提供骨髓燒蝕之方法，其包含向需要骨髓燒蝕之個體投與本發明之CD20 CAR表現細胞。舉例而言，本發明方法可用於根除患有其中骨髓移植或骨髓重調理為有益治療策略之疾病或病症之個體的一些或所有現有骨髓。在一個態樣中，在個體中在骨髓移植之前實施本發明之骨髓燒蝕方法，其包含投與本文在別處闡述之CD20 CAR表現細胞。因此，在一個態樣中，本發明之方法提供骨髓或幹細胞移植之前之細胞調理方案。在一個態樣中，骨髓移植包含幹細胞移植。骨髓移植可包含自體或同種異體細胞移植。 本發明提供治療疾病或病症之方法，其包含投與本發明之CD20表現細胞以根除現有骨髓之至少一部分。該方法可用作治療其中骨髓移植有益之任一疾病或病症之治療方案的至少一部分。亦即，本發明方法可用於需要骨髓移植之任一個體中。在一個態樣中，包含投與CD20表現細胞之骨髓燒蝕可用於治療AML。在某些態樣中，藉助本發明方法之骨髓燒蝕可用於治療血液癌症、實體腫瘤、血液疾病、代謝失調、HIV、HTLV、溶酶體儲積症及免疫缺失。 本文所揭示之組合物及方法可用於根除現有骨髓之至少一部分以治療血液癌症，包括(但不限於)本文所述之癌症，例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、ALL、AML、CLL、CML、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(例如DLBCL或濾泡性淋巴瘤)及多發性骨髓瘤。 本文所揭示之組合物及方法可用於治療血液疾病，尤其包括(但不限於)骨髓發育不良、貧血、陣發性夜間血紅素尿症、再生不良性貧血、獲得性純紅血球貧血、戴-布二氏貧血(Diamon-Blackfan anemia)、范康尼貧血(Fanconi anemia)、血細胞減少症、無巨核細胞性血小板減少症、骨髓增生性病症、真性紅血球增多症、原發性血小板增多症、骨髓纖維化、血紅素異常症、鐮形血球疾病、重度β地中海型貧血。 在一個態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其包含骨髓調理，其中個體之至少一部分骨髓藉由本發明之CD20 CAR表現細胞根除。舉例而言，在某些情況下，個體之骨髓包含可藉由CD20 CAR表現細胞之活性靶向並消除之惡性前體細胞。在一個態樣中，骨髓調理療法包含根除天然骨髓後向個體投與骨髓或幹細胞移植物。在一個態樣中，組合骨髓重調理療法與一或多種其他抗癌療法，包括(但不限於)抗腫瘤CAR療法、化學療法、輻射及諸如此類。 在一個態樣中，在輸注骨髓或幹細胞移植物之前可能需要根除所投與之CD20 CAR表現細胞。CD20 CAR表現細胞之根除可利用任何適宜策略或治療來完成，包括(但不限於)使用自殺基因、使用RNA編碼之CAR之有限CAR持久性或抗T細胞模式(包括抗體或化學療法)。 CD22相關之疾病及/或病症 本發明尤其提供用於治療與CD22之表現相關之疾病或與表現CD22之細胞相關之病況(包括例如增生性疾病(例如癌症或惡性病)或癌前病況；或與表現CD22之細胞相關之非癌症相關適應症)的組合物及方法。在一個態樣中，與CD22之表現相關之癌症係血液癌症。在一個態樣中，血液癌症包括(但不限於) B細胞惡性病。在一個態樣中，血液癌症係白血病或淋巴瘤。在一個態樣中，與CD22之表現相關之癌症包括癌症及惡性病，包括(但不限於)例如一或多種急性白血病，包括(但不限於) B細胞急性淋巴球性白血病(BALL)、T細胞急性淋巴球性白血病(TALL)、小淋巴球性白血病(SLL)、急性淋巴球性白血病(ALL)；一或多種慢性白血病，包括(但不限於)慢性淋巴球性白血病(CLL)；其他血液癌症或血液病況，包括(但不限於)外套細胞淋巴瘤(MCL)、B細胞前淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤、柏基特氏淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴球增生性病況、MALT淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞贅瘤及瓦登斯特隆巨球蛋白血症。在另一實施例中，與CD22表現相關之疾病包括(但不限於)表現CD22之非典型及/或非古典癌症、惡性病、癌前病況或增生性疾病；及其任何組合。 亦可包括與CD22之表現相關之非癌症相關適應症。與CD22之表現相關之非癌症相關適應症包括(但不限於)例如自體免疫疾病(例如，狼瘡、類風濕性關節炎、多發性硬化自體免疫溶血性貧血、純紅血球再生不良、特發性血小板減少紫斑症、伊文氏症候群、血管炎、大皰性皮膚病、1型糖尿病、休格倫氏症候群、抗NMDA受體腦炎及德維克氏病、葛瑞夫茲氏眼病變及自體免疫胰臟炎)、發炎性病症(過敏及氣喘)及實體器官或造血球移植。 在一個態樣中，本發明提供治療與CD22表現相關之疾病之方法。在一個態樣中，本發明提供治療其中腫瘤之一部分對CD22呈陰性且腫瘤之一部分對CD22呈陽性之疾病的方法。舉例而言，本發明之CAR可用於治療已經歷與CD22之表現相關之疾病治療之個體，其中已經歷與CD22之表現相關之治療之個體展現與CD22的表現相關之疾病。 在一個態樣中，本發明係關於用於在哺乳動物細胞(例如，T細胞或NK細胞)中表現之包含可操作地連接至啟動子之CD22 CAR的載體。在一個態樣中，本發明提供表現CD22 CAR之重組T細胞用於治療CD22表現腫瘤，其中表現CD22 CAR之重組T細胞稱為CD22 CART。在一個態樣中，本發明之CD22 CART或CD22 CAR表現NK細胞能夠使腫瘤細胞與在其表面上表現之至少一個本發明CD22 CAR接觸，使得CART或CD22 CAR表現NK細胞靶向腫瘤細胞且抑制腫瘤之生長。 在一個態樣中，本發明係關於抑制表現CD22之腫瘤細胞之生長的方法，其包含使腫瘤細胞與本發明之CD22 CAR細胞(例如，T細胞或NK細胞)接觸，使得CART因應抗原而活化且靶向癌細胞，其中抑制腫瘤之生長。 在一個態樣中，本發明係關於治療個體之癌症之方法。該方法包含向個體投與本發明之CD22 CAR表現細胞(例如，T細胞或NK細胞)，使得治療個體之癌症。可藉由本發明之CD22 CAR表現細胞(例如，T細胞或NK細胞)治療之癌症之實例係與CD22之表現相關之癌症。可藉由本發明之CD22 CAR表現細胞(例如，T細胞或NK細胞)治療之癌症之實例包括(但不限於)本文所述之血液癌症。 本發明包括一種類型之細胞療法，其中細胞(例如，T細胞或NK細胞)經遺傳性地修飾以表現嵌合抗原受體(CAR)且將CAR表現細胞(例如，T細胞或NK細胞)輸注至有需要之接受者。所輸注細胞能夠殺死接受者中之腫瘤細胞。與抗體療法不同，CAR修飾之細胞(例如T細胞或NK細胞)能夠在活體內複製，從而產生可引起持續腫瘤控制之長期持久性。在多個態樣中，在向患者投與T細胞後，投與患者之細胞(例如T細胞或NK細胞)或其後代在患者中存留至少4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月、2年、3年、4年或5年。 本發明亦包括一種類型之細胞療法，其中免疫效應細胞(例如NK細胞或T細胞)經例如活體外轉錄之RNA修飾以瞬時表現嵌合抗原受體(CAR)且將CAR表現(例如，CART或CAR表現NK細胞)細胞輸注至有需要之接受者。所輸注細胞能夠殺死接受者中之癌細胞。因此，在多個態樣中，在向患者投與CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞)後，投與患者之CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞)存在短於1個月，例如3週、2週、1週。 不希望受限於任何特定理論，由CAR修飾之細胞(例如T細胞或NK細胞)引發之抗腫瘤免疫反應可為主動或被動免疫反應，或或者可歸因於直接對間接免疫反應。在一個態樣中，CAR轉導之細胞(例如T細胞或NK細胞)展現特異性促發炎細胞介素分泌及強效的因應表現CD22之人類癌細胞之細胞溶解活性，抵抗可溶性CD22抑制，調介旁觀者殺死並調介現有人類腫瘤之消退。舉例而言，表現CD22之腫瘤之異質場內的無抗原腫瘤細胞可能易受CD22重定向T細胞間接破壞之影響，該間接破壞係先前抵抗毗鄰抗原陽性癌細胞作出之反應。 在一個態樣中，本發明之CAR修飾細胞(例如，T細胞或NK細胞) (例如全人類CAR表現細胞)可為用於哺乳動物之離體免疫及/或活體內療法之疫苗類型。在一個態樣中，哺乳動物係人類。 關於離體免疫，在將細胞投與哺乳動物中之前在活體外進行以下中之至少一者：i) 擴增細胞，ii) 將編碼CAR之核酸引入細胞，或iii) 低溫保藏細胞。 離體程序為業內所熟知且更全面論述於下文中。簡言之，自哺乳動物(例如人類)分離細胞，且用表現本文所揭示CAR之載體進行遺傳性地修飾(例如活體外轉導或轉染)。可向哺乳動物接受者投與CAR修飾之細胞以提供治療益處。哺乳動物接受者可為人類，且CAR修飾之細胞對於接受者而言可為自體。或者，細胞對於接受者而言可為同種異體、同基因或異種。 造血幹細胞及祖細胞之離體擴增程序闡述於美國專利第5,199,942號中，該專利以引用方式併入本文中，該程序可應用於本發明之細胞。業內已知其他適宜方法，因此本發明並不限於任何特定的細胞離體擴增方法。簡言之，T細胞之離體培養及擴增包含：(1) 自哺乳動物之末梢血收穫物或骨髓外植體收集CD34+造血幹細胞及祖細胞；及(2) 離體擴增該等細胞。 除美國專利第5,199,942號中所述之細胞生長因子外，可使用其他因子(例如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配體)來培養及擴增細胞。 除根據離體免疫利用基於細胞之疫苗外，本發明亦提供用於活體內免疫來引發針對患者中之抗原之免疫反應的組合物及方法。 通常，如本文所述活化及擴增之細胞可用於治療及預防在免疫受損個體中產生之疾病。特定而言，本發明之CAR修飾細胞(例如，T細胞或NK細胞)用於治療與CD22之表現相關之疾病、病症及病況。在某些態樣中，本發明細胞用於治療具有罹患與CD22之表現相關之疾病、病症及病況之風險之患者。因此，本發明提供治療或預防與CD22之表現相關之疾病、病症及病況之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之本發明之CAR修飾細胞(例如T細胞或NK細胞)。 在一個態樣中，本發明之CAR表現細胞可用於治療增生性疾病(例如癌症或惡性病)或癌前病況。在一個態樣中，與CD22之表現相關之癌症係血液癌症、白血病前期、過度增生性病症、增生或發育不良，其特徵在於細胞之異常生長。 在一個態樣中，本發明之CAR表現細胞用於治療癌症，其中癌症係血液癌症。血液癌症病況係侵襲血液、骨髓及淋巴系統之癌症類型，例如白血病及惡性淋巴球增生性病況。 白血病可分類為急性白血病及慢性白血病。急性白血病可進一步分類為急性骨髓性白血病(AML)及急性淋巴球性白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性骨髓性白血病(CML)及慢性淋巴球性白血病(CLL)。其他相關病況包括骨髓發育不良症候群(MDS，之前稱為「白血病前期」)，其係因骨髓性血球之無效產生(或發育不良)及轉形成AML之風險而集合在一起之血液病況之不同集合。 淋巴瘤係自淋巴球發育之血球腫瘤之群。實例性淋巴瘤包括非霍奇金氏淋巴瘤及霍奇金氏淋巴瘤。 在一個態樣中，本發明之組合物及CART細胞或CAR表現NK細胞尤其可用於治療B細胞惡性病，例如非霍奇金氏淋巴瘤，例如DLBCL、濾泡性淋巴瘤或CLL。 非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)係自B或T細胞形成之淋巴球之癌症之群。NHL發生在任一年齡且特徵通常在於大於正常之淋巴結、體重損失及發熱。不同類型之NHL分類為攻擊(快速生長)型及惰(緩慢生長)型。B細胞非霍奇金氏淋巴瘤包括柏基特氏淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤(CLL/SLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞性淋巴瘤及外套細胞淋巴瘤。T細胞非霍奇金氏淋巴瘤之實例包括蕈樣肉芽腫、退行性大細胞淋巴瘤及前體T淋巴母細胞性淋巴瘤。在骨髓或幹細胞移植後發生之淋巴瘤通常係B細胞非霍奇金氏淋巴瘤。參見例如Maloney. NEJM. 366.21(2012):2008-16。 瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)係自B細胞發育而來之NHL形式。DLBCL係攻擊性淋巴瘤，其可在淋巴結中或在淋巴系統外、例如在胃腸道、睪丸、甲狀腺、皮膚、乳房、骨或腦中產生。通常在DLBCL中觀察到細胞形態之三種變體：中心母細胞性、免疫母細胞性及退行性。中心母細胞性形態最為常見且具有大小為中等至大之淋巴球及最少細胞質之外觀。存在若干DLBCL亞型。舉例而言，原發性中樞神經系統淋巴瘤係一種僅侵襲腦之類型之DLBCL且以與侵襲腦外區域之DLBCL不同之方式治療。另一類型之DLBCL係原發性縱膈B細胞淋巴瘤，其通常發生在較年輕患者中且在胸中快速生長。DLBCL之症狀包括頸、腋窩或腹股溝之無痛快速腫脹，其係由擴大的淋巴結引起。對於一些個體，腫脹可為疼痛的。DLBCL之其他症狀包括盜汗、不明原因的發熱及體重損失。儘管大多數DLBCL患者為成人，但此疾病有時發生在兒童中。DLBCL之治療包括化學療法(例如，環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼、普賴松、依託泊苷)、抗體(例如，瑞圖宣)、輻射或幹細胞移植物。 濾泡性淋巴瘤係一種類型之非霍奇金氏淋巴瘤且係濾泡中心B細胞(中心細胞及中心母細胞)之淋巴瘤，其具有至少部分濾泡模式。濾泡性淋巴瘤細胞表現B細胞標記物CD10、CD19、CD20及CD22。濾泡性淋巴瘤細胞通常對CD5呈陰性。在形態上，濾泡性淋巴瘤腫瘤係由含有中心細胞(亦稱為裂解濾泡中心細胞或小細胞)及中心母細胞(亦稱為大非裂解濾泡中心細胞或大細胞)之混合物之濾泡構成。濾泡由非惡性細胞、幾乎T細胞包圍。濾泡主要含有中心細胞及少量中心母細胞。世界衛生組織(WHO)在形態上將疾病分為以下等級：等級1 (＜5個中心母細胞/高倍視野(hpf)；等級2 (6-15個中心母細胞/hpf)；等級3 (＞15個中心母細胞/hpf)。等級3進一步細分成以下各級：等級3A (仍存在中心細胞)；等級3B (濾泡幾乎完全由中心母細胞組成)。濾泡性淋巴瘤之治療包括化學療法(例如烷基化劑)、核苷類似物、含蒽環之方案(例如稱為CHOP-環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼、普賴松/普賴蘇濃之組合療法)、抗體(例如利妥昔單抗)、放射性免疫療法及造血幹細胞移植。 CLL係特徵在於骨髓、血液、淋巴結及脾中之贅瘤細胞增殖及累積之B細胞惡性病。診斷CLL時之中值年齡為約65歲。當前治療包括化學療法、輻射療法、生物療法或骨髓移植。有時，症狀係以手術方式(例如脾切除術移除擴大的脾)或藉由輻射療法(例如對腫脹淋巴結減積)治療。用於治療CLL之化學治療劑包括例如氟達拉濱、2-氯去氧腺苷(克拉屈濱)、氮芥苯丁酸、長春新鹼、噴司他汀、環磷醯胺、阿倫單抗(坎帕斯-1H)、多柔比星及普賴松。用於CLL之生物療法包括抗體，例如阿倫單抗、利妥昔單抗及奧法木單抗；以及酪胺酸激酶抑制劑療法。可使用多個準則來分類CLL之階段，例如Rai或Binet系統。Rai系統將CLL闡述為具有5個階段：階段0，其中僅存在淋巴球增多；階段I，其中存在淋巴結病；階段II，其中存在脾腫大、淋巴結病或二者皆有；階段III，其中存在貧血、器官巨大症或二者皆有(進展定義為體重損失、疲勞、發熱、肥大器官巨大症及淋巴球計數快速增加)；及階段IV，其中存在貧血、血小板減少症、器官巨大症或其組合。在Binet分期系統下存在三個類別：階段A，其中存在淋巴球增多且少於三個淋巴結擴大(此階段包括所有Rai階段0患者、一半Rai階段I患者及1/3之Rai階段II患者)；階段B，其中涉及兩個或更多個淋巴結；及階段C，其中存在貧血或血小板減少症或二者皆有。該等分類系統可與免疫球蛋白基因之突變量測值組合以提供疾病狀態之更準確表徵。存在突變免疫球蛋白基因與改良之預後相關聯。 在另一實施例中，本發明之CAR表現細胞用於治療癌症或例如具有白血病幹細胞之白血病。舉例而言，白血病幹細胞係CD34+ /CD38- 白血病細胞。 本發明尤其提供治療癌症之組合物及方法。在一個態樣中，癌症係血液癌症，包括(但不限於)一或多種急性白血病，包括(但不限於) B細胞急性淋巴球性白血病(BALL)、T細胞急性淋巴球性白血病(TALL)、小淋巴球性白血病(SLL)、急性淋巴球性白血病(ALL)；一或多種慢性白血病，包括(但不限於)慢性淋巴球性白血病(CLL)；其他血液癌症或血液病況，包括(但不限於)外套細胞淋巴瘤(MCL)、B細胞前淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤、柏基特氏淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴球增生性病況、MALT淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞贅瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症及與CD22表現相關之疾病，包括(但不限於)表現CD22之非典型及/或非古典癌症、惡性病、癌前病況或增生性疾病；及其任何組合。 本發明之CAR修飾細胞可單獨投與，或作為醫藥組合物與稀釋劑及/或其他組分(例如IL-2或其他細胞介素或細胞群體)組合投與。 本發明亦提供抑制CD22表現細胞群體之增殖或減小該群體之方法，該等方法包含使包含CD22表現細胞之細胞群體與結合至CD22表現細胞之本發明之CD22 CAR表現細胞接觸。在具體態樣中，本發明提供抑制表現CD22之癌細胞群體之增殖或減小該群體之方法，該等方法包含使CD22表現癌細胞群體與結合至CD22表現細胞之本發明之CD22 CAR表現細胞接觸。在一個態樣中，本發明提供抑制表現CD22之癌細胞群體之增殖或減小該群體之方法，該等方法包含使CD22表現癌細胞群體與結合至CD22表現細胞之本發明之CD22 CART接觸。在某些態樣中，在患有B惡性病或與CD22表現細胞相關之另一癌症之個體或其動物模型中，本發明之CD22 CAR表現細胞使細胞及/或癌細胞之數量、數目、量或百分比相對於陰性對照降低至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%。在一個態樣中，個體係人類。 本發明亦提供用於預防、治療及/或管控與CD22表現細胞相關之疾病(例如，表現CD22之血液癌症或非典型癌症)之方法，該等方法包含向有需要之個體投與結合至CD22表現細胞之本發明之CD22 CAR表現細胞。在一個態樣中，個體係人類。與CD22表現細胞相關之病症之非限制性實例包括自體免疫疾病(例如，狼瘡、類風濕性關節炎、多發性硬化自體免疫溶血性貧血、純紅血球再生不良、特發性血小板減少紫斑症、伊文氏症候群、血管炎、大皰性皮膚病、1型糖尿病、休格倫氏症候群、抗NMDA受體腦炎及德維克氏病、葛瑞夫茲氏眼病變及自體免疫胰臟炎)、發炎性病症(過敏及氣喘)、移植及癌症(例如表現CD22之血液癌症或非典型癌症)。 本發明亦提供預防、治療及/或管控與CD22表現細胞相關之疾病之方法，該等方法包含向有需要之個體投與結合至CD22表現細胞之本發明之CD22 CAR表現細胞。在一個態樣中，個體係人類。 本發明提供預防與CD22表現細胞相關之癌症復發之方法，該等方法包含向有需要之個體投與結合至CD22表現細胞之本發明之CD22 CAR表現細胞。在一個態樣中，該等方法包含向有需要之個體投與有效量之結合至CD22表現細胞之本文所述CD22 CAR表現細胞與有效量之另一療法的組合。 在一些實施例中，CD22表現細胞表現CD19、CD123、FLT-3、ROR-1、CD79b、CD179b、CD79a、CD10、CD34及/或CD20。在某些實施例中，CD22表現細胞表現CD19。在一些實施例中，CD22表現細胞不表現CD19。 在一些實施例中，個體係CD19 CAR療法之不反應者。在一些實施例中，個體係CD19 CAR療法之部分反應者。在一些實施例中，個體係CD19 CAR療法之完全反應者。在一些實施例中，個體係CD19 CAR療法之非復發者。在一些實施例中，個體係CD19 CAR療法之部分復發者。在一些實施例中，個體係CD19 CAR療法之完全復發者。 在一些實施例中，先前對用CD19 CAR表現細胞治療有反應之癌症或其他病況不表現CD19。在一些實施例中，先前對用CD19 CAR表現細胞治療有反應之癌症或其他病況之CD19表現量相對於癌症或其他病況對用CD19 CAR表現細胞治療有反應時減少10%、20%、30%、40%、50%或更大。在一些實施例中，先前對用CD19 CAR表現細胞治療有反應之癌症或其他病況表現CD22及/或CD123。 在一些實施例中，本發明之CD22 CAR表現細胞係在先前經CD19 CAR表現細胞治療之癌症或其他病況復發後投與。在一些實施例中，同步投與CD19 CAR表現細胞及CD22 CAR表現細胞，如本文所述。用於治療多發性骨髓瘤之 CD19 CAR T 細胞 即使使用化學療法、靶向療法及自體幹細胞移植之當前方案，骨髓瘤仍視為無法治癒之疾病。在一項研究(未揭示)中闡述使用含有嵌合抗原受體之針對CD19之自體T細胞(慢病毒/CD19:4-1BB:CD3ζ；亦稱為「CART19」或CTL019)治療多發性骨髓瘤(MM)。此實例展示針對CD19之CAR療法具有基於靶向表現極低(無法藉由大部分方法檢測)量之CD19之骨髓瘤幹細胞及/或腫瘤細胞建立較深長期耐久緩解的潛能。用於霍奇金氏淋巴瘤之 CAR19 T 細胞療法 CAR19 T細胞療法亦可用於治療霍奇金氏淋巴瘤(HL)。霍奇金氏淋巴瘤之特徵在於存在源自純系生髮中心B細胞之惡性霍奇金氏裡-斯(Reed-Sternberg) (HRS)細胞。有若干因素指示CAR19 T細胞療法對HL之治療效能。HL腫瘤之CD19染色展示腫瘤及腫瘤微環境內之CD19表現(CD19+ )細胞。研究已展示，表現CD19之純系B細胞群體(CD20+ CD27+ ALDH+ )負責產生並維持霍奇金氏淋巴瘤細胞系，且亦在大多數HL患者之血液中循環(Jones等人，Blood, 2009, 113(23):5920-5926)。亦已表明此純系B細胞群體可導致或促進產生惡性HRS細胞。因此，CART19療法會清除促進腫瘤形成或腫瘤細胞維持之此B細胞群體。另一研究展示，在多個鼠類模型中，B細胞清除減緩實體腫瘤生長(Kim等人，J Immunotherapy, 2008, 31(5):446-57)。在HL腫瘤微環境中清除B細胞引起某一抗腫瘤效應之觀念的支持下，正在臨床上測試當前療法(例如瑞圖宣)對HL中之腫瘤B細胞之靶向及清除(Younes等人，Blood, 2012, 119(18):4123-8)。亦已展示，與慢性發炎相關之重新誘癌可具有B細胞依賴性(de Visser等人，Cancer Cell, 2005, 7(5):411-23)。該等研究之結果指示，尤其在HL腫瘤微環境中靶向B細胞群體將可用於藉由降低或抑制疾病進展或腫瘤生長來治療HL。CLL 患者之不反應者亞組展現增加的免疫檢查點抑制劑分子之表現 在一項研究(數據未公開)中，評價自34名CLL患者臨床製造之CART19細胞之免疫檢查點抑制劑分子(例如PD-1、LAG3及TIM3)之表現。已知此同類群組對CART19之反應且因此可評價反應與生物標記物表現模式之間之關聯。mTOR 抑制對老年人之免疫衰老之效應 mTOR抑制對免疫衰老之效能闡述於例如國際申請案WO/2015/073644之實例1中，且該申請案之全文皆以引用方式併入本文中。 老年個體中針對疫苗之免疫反應之增強 mTOR抑制對增強免疫反應之效能闡述於例如國際申請案WO/2015/073644之實例2中，且該申請案之全文皆以引用方式併入本文中。 低劑量mTOR抑制增加能量及鍛煉； mTOR抑制對能量及鍛煉之效應闡述於例如國際申請案WO/2015/073644之實例3中，且該申請案之全文皆以引用方式併入本文中。 RAD001對P70 S6激酶之抑制 mTOR抑制對P70 S6激酶之效應抑制闡述於例如國際申請案WO/2015/073644之實例4中，且該申請案之全文皆以引用方式併入本文中。 外源IL-7增強CAR T細胞之功能 在CAR T細胞授受性轉移後，一些患者經歷CAR T細胞之有限持久性，此可產生次最佳程度之抗腫瘤活性。在此實例中，在小鼠異種移植物模型中評價投與外源人類IL-7之效應，其中已觀察到針對CAR T細胞之初始次最佳反應。 組合療法 本文所述之CAR表現細胞可與其他已知藥劑及療法組合使用。如本文所用之「組合」投與意指，在個體患病期間將兩種(或更多種)不同治療遞送至個體，例如在個體已經診斷患有病症之後且在病症治癒或消除之前或治療已出於其他原因停止之前遞送兩種或更多種治療。在一些實施例中，一種治療之遞送仍在開始遞送第二種治療時進行，以使得存在投與重疊。此在本文中有時稱為「同時」或「同步遞送」。在一些實施例中，一種治療之遞送係在開始另一種治療之遞送之前結束。在任一情形之一些實施例中，治療因組合投與而更有效。舉例而言，第二種治療更有效，例如使用較少第二種治療即可觀察到等效效應，或第二種治療在較大程度上減輕症狀，該程度大於在不存在第一種治療下投與第二種治療時觀察到之程度或使用第一種治療觀察到之類似情況。在一些實施例中，遞送使得症狀或與病症相關之其他參數之減輕程度比利用在不存在另一種治療下遞送一種治療所觀察到之減輕程度更高。兩種治療之效應可為部分加和、完全加和或大於加和的。遞送可使得當遞送第二種治療時仍可檢測到所遞送之第一種治療的效應。 本文所述之CAR表現細胞及至少一種其他治療劑可同時、在相同或各別組合物中或依序投與。對於依序投與，可首先投與本文所述之CAR表現細胞，且可其次投與另一藥劑，或可顛倒投與順序。 CAR療法及/或其他治療劑、程序或模式可在活動性病症時段期間或在緩解或活動性較低之疾病時段期間投與。CAR療法可在另一治療之前、與該治療同步、在治療後或在病症緩解期間投與。 在組合投與時，CAR療法及另一藥劑(例如，第二或第三藥劑)或所有皆可以高於、低於或等於每一藥劑個別使用(例如作為單一療法)之量或劑量的量或劑量來投與。在某些實施例中，CAR療法、另一藥劑(例如，第二或第三藥劑)或所有之所投與量或劑量低於(例如，低至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)每一藥劑個別使用(例如，作為單一療法)的量或劑量。在一些實施例中，CAR療法、另一藥劑(例如，第二或第三藥劑)或所有之產生期望效應(例如，癌症治療)之量或劑量低於(例如，低至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)每一藥劑個別使用(例如，作為單一療法)之達成相同治療效應所需的量或劑量。 在其他態樣中，本文所述之CAR表現細胞可用於治療方案與以下各項之組合中：手術、細胞介素、輻射或化學療法，例如癌得星、氟達拉濱、組織蛋白去乙醯酶抑制劑、去甲基化劑或肽疫苗，例如Izumoto等人，2008 J Neurosurg 108:963-971中所述。 在某些情況下，本發明化合物係與諸如以下等其他治療劑組合：其他抗癌劑、抗過敏劑、抗噁心劑(或止吐藥)、止痛劑、細胞保護劑及其組合。 考慮用於組合療法中之一般化學治療劑包括阿那曲唑(anastrozole) (Arimidex®)、比卡魯胺(bicalutamide) (Casodex®)、硫酸博來黴素(bleomycin sulfate) (Blenoxane®)、白消安(busulfan) (Myleran®)、白消安注射液(Busulfex®)、卡培他濱(capecitabine) (Xeloda®)、N4-戊氧基羰基-5-去氧-5-氟胞苷、卡鉑(carboplatin) (Paraplatin®)、卡莫司汀(carmustine) (BiCNU®)、氮芥苯丁酸(Leukeran®)、順鉑(cisplatin) (Platinol®)、克拉屈濱(Leustatin®)、環磷醯胺(Cytoxan®或Neosar®)、阿糖胞苷(cytarabine)、胞嘧啶阿糖核苷(Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射液(DepoCyt®)、達卡巴嗪(dacarbazine) (DTIC-Dome®)、更生黴素(dactinomycin) (放線菌素D (Actinomycin D)、Cosmegan)、鹽酸道諾黴素(daunorubicin hydrochloride) (Cerubidine®)、檸檬酸道諾黴素脂質體注射液(DaunoXome®)、地塞米松(dexamethasone)、多西他賽(docetaxel) (Taxotere®)、鹽酸多柔比星(Adriamycin®、Rubex®)、依託泊苷(Vepesid®)、磷酸氟達拉濱(Fludara®)、5-氟尿嘧啶(Adrucil®、Efudex®)、氟他胺(flutamide) (Eulexin®)、替紮他濱(tezacitibine)、吉西他濱(Gemcitabine) (二氟脫氧胸苷)、羥基脲(Hydrea®)、伊達比星(Idarubicin) (Idamycin®)、異環磷醯胺(ifosfamide) (IFEX®)、伊立替康(irinotecan) (Camptosar®)、L-天冬醯胺酶(ELSPAR®)、甲醯四氫葉酸鈣(leucovorin calcium)、美法侖(melphalan) (Alkeran®)、6-巰基嘌呤(Purinethol®)、胺甲喋呤(Folex®)、米托蒽醌(mitoxantrone) (Novantrone®)、滅髓瘤(mylotarg)、太平洋紫杉醇(paclitaxel) (Taxol®)、白蛋白結合型紫杉醇(nab-paclitaxel) (Abraxane®)、菲妮克絲(phoenix) (釔90/MX-DTPA)、噴司他汀(pentostatin)、具有卡莫司汀植入物之聚苯丙生20 (polifeprosan 20) (Gliadel®)、檸檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate) (Nolvadex®)、替尼泊苷(teniposide) (Vumon®)、6-硫鳥嘌呤、噻替派(thiotepa)、替拉紮明(tirapazamine) (Tirazone®)、注射用鹽酸托泊替康(topotecan hydrochloride for injection) (Hycamptin®)、長春鹼(vinblastine) (Velban®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春瑞濱(vinorelbine) (Navelbine®)。 與本發明化合物組合之尤其受關注之抗癌劑包括：抗腫瘤抗生素；酪胺酸激酶抑制劑；烷基化劑；抗微管或抗有絲分裂劑；或溶瘤病毒。 實例性酪胺酸激酶抑制劑包括(但不限於)鹽酸厄洛替尼(Erlotinib hydrochloride) (Tarceva®)；利尼伐尼(Linifanib) (N-[4-(3-胺基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N'-(2-氟-5-甲基苯基)尿素，亦稱為ABT 869，可自Genentech購得)；蘋果酸舒尼替尼(Sunitinib malate) (Sutent®)；伯舒替尼(Bosutinib) (4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)胺基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基六氫吡嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-甲腈，亦稱為SKI-606，且闡述於美國專利第6,780,996號中)；達沙替尼(Dasatinib) (Sprycel®)；帕唑帕尼(Pazopanib) (Votrient®)；索拉菲尼(Sorafenib) (Nexavar®)；凡德他尼(Zactima) (ZD6474)；及伊馬替尼(Imatinib)或甲磺酸伊馬替尼(Gilvec®及Gleevec®)。 實例性烷基化劑包括(但不限於)奧利沙鉑(Oxaliplatin) (Eloxatin®)；替莫唑胺(Temozolomide) (Temodar®及Temodal®)；更生黴素(亦稱為放線菌素-D) (Cosmegen®)；美法侖(亦稱為L-PAM、L-沙可來新(L-sarcolysin)及苯丙胺酸氮芥) (Alkeran®)；六甲蜜胺(亦稱為六甲基三聚氰胺(HMM)，Hexalen®)；卡莫司汀(BiCNU®)；苯達莫司汀(Bendamustine) (Treanda®)；白消安(Busulfex®及Myleran®)；卡鉑(Paraplatin®)；洛莫司汀(亦稱為CCNU、CeeNU®)；順鉑(亦稱為CDDP、Platinol®及Platinol®-AQ)；氮芥苯丁酸(Leukeran®)；環磷醯胺(Cytoxan®及Neosar®)；達卡巴嗪(亦稱為DTIC、DIC及咪唑甲醯胺，DTIC-Dome®)；六甲蜜胺(亦稱為六甲基三聚氰胺(HMM)、Hexalen®)；異環磷醯胺(Ifex®)；普瑞斯汀(Prednumustine)；丙卡巴肼(Procarbazine) (Matulane®)；甲基二氯乙胺(亦稱為氮芥、莫斯汀(mustine)及甲基二氯乙胺鹽酸鹽，Mustargen®)；鏈脲菌素(Zanosar®)；噻替派(亦稱為硫代磷醯胺、TESPA及TSPA，Thioplex®)；環磷醯胺(Endoxan®、Cytoxan®、Neosar®、Procytox®、Revimmune®)；及苯達莫司汀HCl (Treanda®)。 實例性抗腫瘤抗生素包括例如多柔比星(Adriamycin®及Rubex®)；博來黴素(lenoxane®)；道諾黴素(鹽酸道諾黴素、柔紅黴素(daunomycin)及鹽酸紅比黴素(rubidomycin hydrochloride)，Cerubidine®)；道諾黴素脂質體(檸檬酸道諾黴素脂質體，DaunoXome®)；米托蒽醌(DHAD，Novantrone®)；表柔比星(Epirubicin) (Ellence™)；伊達比星(Idamycin®、Idamycin PFS®)；絲裂黴素C (Mutamycin®)；格爾德黴素(Geldanamycin)；除莠黴素(Herbimycin)；近灰黴素(Ravidomycin)；及去乙醯基近灰黴素。 實例性抗微管或抗有絲分裂劑包括(但不限於)長春花生物鹼(例如酒石酸長春瑞濱(Navelbine®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春地辛(Vindesine) (Eldisine®))；紫杉烷(例如太平洋紫杉醇及多西他賽)；及雌氮芥(Emcyl®或Estracyt®)。 在一些實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與溶瘤病毒組合投與。在實施例中，溶瘤病毒能夠在癌細胞中選擇性複製且觸發癌細胞之死亡或減緩其生長。在一些情形下，溶瘤病毒對非癌細胞不具或具有最小效應。溶瘤病毒包括(但不限於)溶瘤腺病毒、溶瘤單純皰疹病毒、溶瘤反轉錄病毒、溶瘤小病毒、溶瘤牛痘病毒、溶瘤辛得比斯病毒(oncolytic Sinbis virus)、溶瘤流行性感冒病毒或溶瘤RNA病毒(例如，溶瘤裡奧病毒(oncolytic reovirus)、溶瘤新城雞瘟病毒(oncolytic Newcastle Disease Virus，NDV)、溶瘤麻疹病毒或溶瘤水皰性口炎病毒(VSV))。 在一些實施例中，溶瘤病毒係US2010/0178684 A1中所述之病毒，例如重組溶瘤病毒，該專利係全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，重組溶瘤病毒包含編碼免疫或發炎反應之抑制劑之核酸序列(例如，異源核酸序列)，例如如US2010/0178684 A1中所述，該專利係全文以引用方式併入本文中。在實施例中，重組溶瘤病毒(例如溶瘤NDV)包含促細胞凋亡蛋白(例如凋亡素)、細胞介素(例如GM-CSF、干擾素-γ、介白素-2 (IL-2)、腫瘤壞死因子-α)、免疫球蛋白(例如針對ED-B纖連蛋白之抗體)、腫瘤相關抗原、雙特異性轉接蛋白(例如針對NDV HN蛋白及T細胞共刺激受體(例如CD3或CD28)之雙特異性抗體或抗體片段；或人類IL-2與針對NDV HN蛋白之單鏈抗體之間的融合蛋白)。參見例如Zamarin等人，Future Microbiol. 7.3(2012):347-67，其係全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，溶瘤病毒係US 8591881 B2、US 2012/0122185 A1或US 2014/0271677 A1中所述之嵌合溶瘤NDV，該等專利各自係全文以引用方式併入本文中。 在一些實施例中，溶瘤病毒包含條件複製型腺病毒(CRAd)，其經設計以排他性地在癌細胞中複製。參見例如Alemany等人，Nature Biotechnol. 18(2000):723-27。在一些實施例中，溶瘤腺病毒包含Alemany等人之第725頁上之表1中所述者，該文獻係全文以引用方式併入本文中。 實例性溶瘤病毒包括(但不限於)以下各項： B群溶瘤腺病毒(ColoAd1) (PsiOxus Therapeutics Ltd.) (參見例如臨床試驗標識符：NCT02053220)； ONCOS-102 (先前稱為CGTG-102)，其係包含顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)之腺病毒(Oncos Therapeutics) (參見例如臨床試驗標識符：NCT01598129)； VCN-01，其係經遺傳性地修飾之編碼人類PH20玻尿酸酶之溶瘤人類腺病毒(VCN Biosciences, S.L.) (參見例如臨床試驗標識符：NCT02045602及NCT02045589)； 條件複製型腺病毒ICOVIR-5，其係其已經修飾以在癌細胞中利用下調的視網膜母細胞瘤/E2F路徑選擇性複製之源自野生型人類腺病毒血清型5 (Had5)之病毒(Institut Català d'Oncologia) (參見例如臨床試驗標識符：NCT01864759)； 塞裡病毒(Celyvir)，其包含源自感染溶瘤腺病毒ICOVIR5之自體間葉幹細胞(MSC)之骨髓(Hospital Infantil Universitario Niño Jesús, Madrid, Spain/ Ramon Alemany) (參見例如臨床試驗標識符：NCT01844661)； CG0070，其係條件複製型溶瘤血清型5腺病毒(Ad5)，其中人類E2F-1啟動子驅動必需E1a病毒基因之表現，由此將病毒複製及細胞毒性限於Rb路徑缺陷性腫瘤細胞(Cold Genesys, Inc.) (參見例如臨床試驗標識符：NCT02143804)；或 DNX-2401 (之前稱為δ-24-RGD)，其係已經改造以在視網膜母細胞瘤(Rb)路徑缺乏細胞中選擇性複製且更有效地感染表現某些RGD結合整聯蛋白之細胞之腺病毒(Clinica Universidad de Navarra, Universidad de Navarra/ DNAtrix, Inc.) (參見例如臨床試驗標識符：NCT01956734)。 在一些實施例中，本文所述之溶瘤病毒係藉由注射(例如皮下、動脈內、靜脈內、肌內、鞘內或腹膜內注射)來投與。在實施例中，本文所述之溶瘤病毒係經腫瘤內、經皮、經黏膜、經口、鼻內或經肺投與來投與。 在一些實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與第二CD20抑制劑(例如CD20抗體或CD20抗體藥物偶聯物)組合(例如，在其之前、與其同時及/或在其之後)投與。 實例性CD20抗體包括(但不限於)利妥昔單抗(Riuxan®及MabThera®)；托西莫單抗(Tositumomab) (Bexxar®)；及奧法木單抗(Arzerra®)。 實例性CD20抗體藥物偶聯物包括(但不限於)替伊莫單抗(Ibritumomab tiuxetan) (Zevalin®)；及托西莫單抗。 在一個實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與靶向GITR及/或調節GITR功能之分子(例如GITR激動劑及/或清除調控T細胞(Treg)之GITR抗體)組合投與個體。在一個實施例中，GITR結合分子及/或調節GITR功能之分子(例如，GITR激動劑及/或清除Treg之GITR抗體)係在CAR表現細胞之前投與。舉例而言，在一個實施例中，GITR激動劑可在細胞之血球分離之前投與。在一個實施例中，個體患有CLL。實例性GITR激動劑包括例如GITR融合蛋白及抗GITR抗體(例如，二價抗GITR抗體)，例如美國專利第6,111,090號、歐洲專利第090505B1號、美國專利第8,586,023號、PCT公開案第WO 2010/003118號及第2011/090754號中所述之GITR融合蛋白，或例如美國專利第7,025,962號、歐洲專利第1947183B1號、美國專利第7,812,135號、美國專利第8,388,967號、美國專利第8,591,886號、歐洲專利第EP 1866339號、PCT公開案第WO 2011/028683號、PCT公開案第WO 2013/039954號、PCT公開案第WO2005/007190號、PCT公開案第WO 2007/133822號、PCT公開案第WO2005/055808號、PCT公開案第WO 99/40196號、PCT公開案第WO 2001/03720號、PCT公開案第WO99/20758號、PCT公開案第WO2006/083289號、PCT公開案第WO 2005/115451號、美國專利第7,618,632號及PCT公開案第WO 2011/051726號中所述之抗GITR抗體。 在一個實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與mTOR抑制劑(例如本文所述之mTOR抑制劑，例如雷帕黴素類似物，例如依維莫司)組合投與個體在一個實施例中，mTOR抑制劑係在CAR表現細胞之前投與。舉例而言，在一個實施例中，mTOR抑制劑可在細胞之血球分離之前投與。 在一個實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與GITR激動劑(例如本文所述之GITR激動劑)組合投與個體。在一個實施例中，GITR激動劑係在CAR表現細胞(例如CD20 CAR表現細胞)之前投與。舉例而言，在一個實施例中，GITR激動劑可在細胞之血球分離之前投與。 在一個實施例中，本文所述之CAR表現細胞係與蛋白酪胺酸磷酸酶抑制劑(例如本文所述之蛋白酪胺酸磷酸酶抑制劑)組合投與個體。在一個實施例中，蛋白酪胺酸磷酸酶抑制劑係SHP-1抑制劑，例如本文所述之SHP-1抑制劑，例如葡萄糖酸銻鈉。在一個實施例中，蛋白酪胺酸磷酸酶抑制劑係SHP-2抑制劑。 在一個實施例中，本文所述之CAR表現細胞可與激酶抑制劑組合使用。 在實施例中，此方式可用於最佳化本文所述CAR細胞在個體中之性能。儘管不希望受限於理論，但人們認為在實施例中，未經修飾之內源免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)之性能有所改良。儘管不希望受限於理論，但人們認為在實施例中，CD20 CAR表現細胞之性能有所改良。在一些實施例中，具有或經改造以表現CAR之細胞(例如，T細胞或NK細胞)可藉由與一定量之增加PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞/NK細胞)之數量或增加PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞/NK細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之比率的mTOR抑制劑接觸來離體治療。 在實施例中，在投與本文所述之CAR表現細胞(例如，T細胞或NK細胞)之前起始低免疫增強劑量之mTOR抑制劑(例如別位抑制劑，例如RAD001，或催化抑制劑)的投與。在實施例中，CAR細胞係在mTOR抑制劑之足夠時間或足夠投藥後來投與，使得PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞/NK細胞)之含量或PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞/NK細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)之比率至少瞬時增加。 在實施例中，在足夠時間後或在低免疫增強劑量之mTOR抑制劑之足夠投藥後收穫經改造以表現CAR之細胞(例如，T細胞或NK細胞)，使得個體中或自個體收穫之PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)之含量或PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞/NK細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)之比率至少瞬時增加。 在一些實施例中，mTOR抑制劑係經一定時間量投與以足以減小個體末梢血中或自個體分離之T細胞之製劑中PD-1陽性T細胞之比例、增加PD-1陰性T細胞之比例或增加PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞之比率。 在一些實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5%但不超過90%之mTOR抑制劑相關，例如如根據p70 S6K抑制所量測。在一些實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少10%但不超過40%之mTOR抑制相關，例如如根據p70 S6K抑制所量測。 在一個實施例中，激酶抑制劑係CDK4抑制劑，例如本文所述之CDK4抑制劑，例如CD4/6抑制劑，例如6-乙醯基-8-環戊基-5-甲基-2-(5-六氫吡嗪-1-基-吡啶-2-基胺基)-8H -吡啶并[2,3-d ]嘧啶-7-酮鹽酸鹽(亦稱為帕博西尼(palbociclib)或PD0332991)。在一個實施例中，激酶抑制劑係BTK抑制劑，例如本文所述之BTK抑制劑，例如依魯替尼(ibrutinib)。在一個實施例中，激酶抑制劑係mTOR抑制劑，例如本文所述之mTOR抑制劑，例如雷帕黴素、雷帕黴素類似物OSI-027。mTOR抑制劑可為例如mTORC1抑制劑及/或mTORC2抑制劑，例如本文所述之mTORC1抑制劑及/或mTORC2抑制劑。在一個實施例中，激酶抑制劑係MNK抑制劑，例如本文所述之MNK抑制劑，例如4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d ]嘧啶。MNK抑制劑可為例如MNK1a、MNK1b、MNK2a及/或MNK2b抑制劑。在一個實施例中，激酶抑制劑係DGK抑制劑，例如本文所述之DGK抑制劑，例如DGKinh1 (D5919)或DGKinh2 (D5794)。在一個實施例中，激酶抑制劑係選自以下各項之CDK4抑制劑：阿羅辛A (aloisine A)；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275 2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(3S,4R)-3-羥基-1-甲基-4-六氫吡啶基]-4-𠳭酮；克唑替尼(crizotinib) (PF-02341066)；2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(2R ,3S )-2-(羥基甲基)-1-甲基-3-吡咯啶基]-4H -1-苯并吡喃-4-酮鹽酸鹽(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H -咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N -[4-(三氟甲基)苯基]-1H -苯并咪唑-2-胺(RAF265)；因地蘇蘭(indisulam) (E7070)；羅可韋汀(roscovitine) (CYC202)；帕博西尼(PD0332991)；地那西布(dinaciclib) (SCH727965)；N-[5-[[(5-第三丁基噁唑-2-基)甲基]硫基]噻唑-2-基]六氫吡啶-4-甲醯胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H -嘧啶并[5,4-d ][2]苯氮呯-2-基]胺基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲醯基胺基)-1H-吡唑-3-甲酸N-(六氫吡啶-4-基)醯胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H -咪唑-5-基]-N -[4-(甲基磺醯基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；及XL281 (BMS908662)。 在一個實施例中，激酶抑制劑係CDK4抑制劑，例如帕博西尼(PD0332991)，且帕博西尼係以每天約50 mg、60 mg、70 mg、75 mg、80 mg、90 mg、100 mg、105 mg、110 mg、115 mg、120 mg、125 mg、130 mg、135 mg (例如，75 mg、100 mg或125 mg)之劑量持續一段時間(例如，每天持續28天週期之14-21天，或每天持續21天週期之7-12天)來投與。在一個實施例中，投與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個帕博西尼週期。 在一個實施例中，激酶抑制劑係選自以下之BTK抑制劑：依魯替尼(PCI-32 765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；及LFM-A13。 在一個實施例中，激酶抑制劑係BTK抑制劑，例如依魯替尼(PCI-32765)，且依魯替尼係以每天約250 mg、300 mg、350 mg、400 mg、420 mg、440 mg、460 mg、480 mg、500 mg、520 mg、540 mg、560 mg、580 mg、600 mg (例如，250 mg、420 mg或560 mg)之劑量持續一段時間(例如，每天持續21天週期，或每天持續28天週期)來投與。在一個實施例中，投與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個依魯替尼週期。 在一個實施例中，激酶抑制劑係選自以下各項之mTOR抑制劑：替西羅莫司；瑞達福羅莫司(1R ,2R ,4S )-二甲基亞磷酸4-[(2R )-2[(1R ,9S ,12S ,15R ,16E ,18R ,19R ,21R ,23S ,24E ,26E ,28Z ,30S ,32S ,35R )-1,18-二羥基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五側氧基-11,36-二氧雜-4-氮雜三環[30.3.1.04,9 ]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基環己基酯，亦稱為AP23573及MK8669；依維莫司(RAD001)；雷帕黴素(AY22989)；塞馬莫德(semapimod)；(5-{2,4-雙[(3S )-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d ]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-胺基-8-[反式 - 4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d ]嘧啶-7(8H )-酮(PF04691502)；及N 2 -[1,4-二側氧基-4-[[4-(4-側氧基-8-苯基-4H -1-苯并吡喃-2-基)嗎啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精胺醯基甘胺醯基-L-α-天冬胺醯基L-絲胺酸內鹽(SF1126)；及XL765。 在一個實施例中，激酶抑制劑係mTOR抑制劑，例如雷帕黴素，且雷帕黴素係以每天約3 mg、4 mg、5 mg、6 mg、7 mg、8 mg、9 mg、10 mg (例如，6 mg)之劑量持續一段時間(例如，每天持續21天週期，或每天持續28天週期)來投與。在一個實施例中，投與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個雷帕黴素週期。在一個實施例中，激酶抑制劑係mTOR抑制劑，例如依維莫司，且依維莫司係以每天約2 mg、2.5 mg、3 mg、4 mg、5 mg、6 mg、7 mg、8 mg、9 mg、10 mg、11 mg、12 mg、13 mg、14 mg、15 mg (例如，10 mg)之劑量持續一段時間(例如，每天持續28天週期)來投與。在一個實施例中，投與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個依維莫司週期。 在一個實施例中，激酶抑制劑係選自以下各項之MNK抑制劑：CGP052088；4-胺基-3-(對-氟苯基胺基)-吡唑并[3,4-d ]嘧啶(CGP57380)；尾孢醯胺(cercosporamide)；ETC-1780445-2；及4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d ]嘧啶。 亦可使用抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調神經磷酸酶(環孢素及FK506)或抑制對生長因子誘導之信號傳導至關重要之p70S6激酶(雷帕黴素)的藥物。(Liu等人，Cell 66:807-815, 1991；Henderson等人，Immun. 73:316-321, 1991；Bierer等人，Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)。在另一態樣中，本發明之細胞組合物可與以下各項結合(例如，在其之前、同時或之後)投與患者：骨髓移植、利用化學治療劑(例如氟達拉濱)之T細胞剝除療法、外部光束輻射療法(XRT)、環磷醯胺及/或抗體(例如OKT3或坎帕斯)。在一個態樣中，本發明之細胞組合物係在B細胞剝除療法(例如與CD20反應之藥劑，例如瑞圖宣)之後投與。舉例而言，在一個實施例中，個體可經歷高劑量化學療法然後進行末梢血幹細胞移植之標準治療。在某些實施例中，在移植後，使個體接受本發明之擴增免疫細胞之輸注。在另一實施例中，擴增細胞係在手術之前或之後投與。 一些患者可能在投與期間或在投與後經歷本發明化合物及/或其他抗癌劑之過敏反應；因此，通常投與抗過敏劑以使過敏反應之風險降至最低。適宜抗過敏劑包括皮質類固醇，例如地塞米松(例如Decadron®)、倍氯米松(beclomethasone) (例如Beclovent®)、氫化可體松(hydrocortisone) (亦稱為可體松、氫化可體松琥珀酸鈉、氫化可體松磷酸鈉且以商標名Ala-Cort®、磷酸氫化可體松、Solu-Cortef®、Hydrocort Acetate®及Lanacort®出售)、普賴蘇濃(以商標名Delta-Cortel®、Orapred®、Pediapred®及Prelone®出售)、普賴松(以商標名Deltasone®、Liquid Red®、Meticorten®及Orasone®出售)、甲基潑尼松龍(methylprednisolone) (亦稱為6-甲基潑尼松龍、乙酸甲基潑尼松龍、甲基潑尼松龍琥珀酸鈉，以商標名Duralone®、Medralone®、Medrol®、M-Prednisol®及Solu-Medrol®出售)；抗組胺，例如苯海拉明(diphenhydramine) (例如Benadryl®)、羥嗪及賽庚啶(cyproheptadine)；及支氣管擴張劑，例如β腎上腺素能受體激動劑、沙丁胺醇(albuterol) (例如Proventil®)及特布他林(terbutaline) (Brethine®)。 一些患者可能在投與本發明化合物及/或其他抗癌劑期間及之後經歷噁心；因此，使用止吐藥來預防噁心(上部胃)及嘔吐。適宜止吐藥包括阿瑞匹坦(aprepitant) (Emend®)、昂丹司瓊(ondansetron) (Zofran®)、鹽酸格拉司瓊(granisetron HCl) (Kytril®)、氯羥去甲安定(lorazepam) (Ativan®)、地塞米松(Decadron®)、丙氯拉嗪(prochlorperazine) (Compazine®)、卡索匹坦(casopitant) (Rezonic®及Zunrisa®)及其組合。 通常開具用以減輕在治療時段期間經歷之疼痛之藥劑以使得患者更加舒適。通常使用常見的非處方止痛藥，例如Tylenol®。然而，類鴉片(opioid)止痛藥(例如氫可酮(hydrocodone)/對乙醯胺基酚(paracetamol)或氫可酮/乙醯胺酚(acetaminophen) (例如，Vicodin®)、嗎啡(morphine) (例如，Astramorph®或Avinza®)、羥考酮(oxycodone) (例如，OxyContin®或Percocet®)、鹽酸羥嗎啡酮(oxymorphone hydrochloride)(Opana®)及芬太尼(fentanyl) (例如，Duragesic®))亦可用於中度或重度疼痛。 在努力保護正常細胞免受治療毒性並限制器官毒性中，可使用細胞保護劑(例如神經保護劑、自由基清除劑、心臟保護劑、蒽環類外滲物中和劑、營養素及諸如此類)作為輔助療法。適宜細胞保護劑包括阿米福汀(Amifostine) (Ethyol®)、麩醯胺酸、地美司鈉(dimesna) (Tavocept®)、美司鈉(Mesnex®)、右雷佐生(dexrazoxane) (Zinecard®或Totect®)、紮利羅登(xaliproden) (Xaprila®)及甲醯四氫葉酸(亦稱為甲醯四氫葉酸鈣、噬橙菌因子(citrovorum factor)及亞葉酸)。 藉由編號、通用名或商品名來標識之活性化合物之結構可自標準綱要「The Merck Index」之現行版本或自例如國際專利(例如IMS World Publications)等數據庫獲得。 可與本發明化合物組合使用之上文所提及化合物可如業內、例如上文所引用文件中所述來製備及投與。 在一個實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含至少一種本發明化合物(例如，本發明化合物)或其醫藥上可接受之鹽以及適於單獨或與其他抗癌劑一起投與人類或動物個體之醫藥上可接受之載劑。 在一個實施例中，本發明提供治療患有細胞增生性疾病(例如癌症)之人類或動物個體之方法。本發明提供治療需要該治療之人類或動物個體之方法，其包含向個體單獨或與其他抗癌劑組合投與治療有效量之本發明化合物(例如，本發明化合物)或其醫藥上可接受之鹽。 特定而言，組合物將調配在一起作為組合治療劑或進行單獨投與。 在組合療法中，本發明化合物及其他抗癌劑可無具體時間限制地同時、同步或依序投與，其中該投與在患者體內提供治療有效量之兩種化合物。 在較佳實施例中，本發明化合物及其他抗癌劑通常係藉由輸注或以經口方式以任一順序依序投與。投藥方案可端視疾病之階段、患者之身體健康狀況、個別藥物之安全特徵及個別藥物之耐受性以及投與該組合之主治醫師及從業醫師熟知之其他準則而變化。端視用於治療之具體週期，可彼此相隔幾分鐘、幾小時、幾天或甚至幾週投與本發明化合物及其他抗癌劑。另外，週期可包括在治療週期期間較一藥物更經常地投與另一種藥物及每次以不同的劑量投與藥物。 在本發明之另一態樣中，提供包括一或多種本發明化合物及如本文所揭示之組合伴侶之套組。代表性套組包括(a)本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽，(b)至少一種組合伴侶，例如如上文所指示，其中該套組可包含包裝插頁或其他標記(包括投與說明書)。 本發明化合物亦可有利地與已知治療方法(例如，投與激素或尤其輻射)組合。特定而言，本發明化合物可用作輻射敏化劑，尤其用於治療對輻射療法展現差敏感性之腫瘤。 在一個實施例中，可向個體投與減輕或改善與投與CAR表現細胞相關之副作用的藥劑。與投與CAR表現細胞相關之副作用包括(但不限於) CRS及嗜血性淋巴組織球血症(HLH) (亦稱為巨噬細胞活化症候群(MAS))。CRS之症狀包括高熱、噁心、瞬時低血壓、低氧及諸如此類。CRS可包括臨床全身體徵及症狀，例如發熱、疲勞、厭食症、肌痛、關節痛、噁心、嘔吐及頭痛。CRS可包括臨床皮膚體徵及症狀，例如疹。CRS可包括臨床胃腸體徵及症狀，例如噁心、嘔吐及腹瀉。CRS可包括臨床難治性體徵及症狀，例如呼吸急促及低氧血症。CRS可包括臨床心血管體徵及症狀，例如心動過速、脈壓寬、低血壓、心搏出量增加(早期)及心搏出量潛在減少(晚期)。CRS可包括臨床凝血體徵及症狀，例如d-二聚體升高、具或不具出血症之低纖維蛋白原血症。CRS可包括臨床腎體徵及症狀，例如氮質血症。CRS可包括臨床肝體徵及症狀，例如轉胺酶炎及高膽紅素血症。CRS可包括臨床神經體徵及症狀，例如頭痛、精神狀態改變、意識錯亂、譫妄、喚詞困難或弗蘭克失語症(frank aphasia)、幻覺、顫抖、癡呆、步態改變及癲癇發作。因此，本文所述之方法可包含向個體投與本文所述之CAR表現細胞且進一步投與一或多種管控因用CAR表現細胞治療產生之升高量之可溶性因子的藥劑。在一個實施例中，在個體中升高之可溶性因子係IFN-g、TNFα、IL-2及IL-6中之一或多者。在實施例中，在個體中升高之因子係IL-1、GM-CSF、IL-10、IL-8、IL-5及弗萊托肯(fraktalkine)中之一或多者。因此，經投與以治療此副作用之藥劑可為中和該等可溶性因子中之一或多者之藥劑。在一個實施例中，中和該等可溶性形式中之一或多者之藥劑係抗體或其抗原結合片段。該等藥劑之實例包括(但不限於)類固醇(例如皮質類固醇)、TNFα抑制劑及IL-6抑制劑。TNFα抑制劑之實例係抗TNFα抗體分子，例如英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol)及戈利木單抗(golimumab)。TNFα抑制劑之另一實例係融合蛋白，例如依那西普(entanercept)。TNFα之小分子抑制劑包括(但不限於)黃嘌呤衍生物(例如配妥西菲林(pentoxifylline))及安非他酮(bupropion)。IL-6抑制劑之實例係抗IL-6抗體分子，例如托珠單抗(tocilizumab) (toc)、賽瑞蘆單抗(sarilumab)、依斯利莫單抗(elsilimomab)、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301及FM101。在一個實施例中，抗IL-6受體抗體分子係托珠單抗。基於IL-1R之抑制劑之實例係阿那白滯素(anakinra)。 在一些實施例中，向個體投與皮質類固醇，例如尤其甲基普賴蘇濃、氫化可體松。 在一些實施例中，向個體投與血管加壓劑，例如去甲腎上腺素、多巴胺(dopamine)、苯福林(phenylephrine)、腎上腺素、抗利尿激素或其組合。 在實施例中，可向個體投與退熱劑。在實施例中，可向個體投與止痛劑。 在一個實施例中，可向個體投與增強CAR表現細胞之活性之藥劑。舉例而言，在一個實施例中，藥劑可為抑制抑制性分子之藥劑。在一些實施例中，抑制性分子(例如，程式化死亡配體1 (PD1))可降低CAR表現細胞引起免疫效應物反應之能力。抑制性分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFβ。抑制性分子之抑制(例如藉由在DNA、RNA或蛋白質層級上抑制)可最佳化CAR表現細胞性能。在實施例中，可使用抑制核酸(例如抑制核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)或成簇規律間隔之短迴文重複(CRISPR)、轉錄活化劑樣效應物核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)來抑制抑制性分子在CAR表現細胞中之表現。在實施例中，抑制劑係shRNA。在實施例中，抑制性分子係在CAR表現細胞內被抑制。在該等實施例中，抑制抑制性分子之表現之dsRNA分子連接至編碼CAR之組分(例如，所有組分)的核酸。在一個實施例中，抑制信號之抑制劑可為例如結合至抑制性分子之抗體或抗體片段。舉例而言，藥劑可為結合至PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4之抗體或抗體片段(例如，伊匹單抗(ipilimumab，亦稱為MDX-010及MDX-101，且以Yervoy®出售; Bristol-Myers Squibb；曲美木單抗(Tremelimumab，可自Pfizer購得之IgG2單株抗體，之前稱為替西木單抗(ticilimumab)、CP-675,206)。)。在實施例中，藥劑係結合至TIM3之抗體或抗體片段。在實施例中，藥劑係結合至LAG3之抗體或抗體片段。在實施例中，藥劑係結合至CEACAM (例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)之抗體或抗體片段。 PD1係CD28受體家族之抑制性成員，該家族亦包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。PD1係在活化B細胞、T細胞及骨髓細胞上表現(Agata等人，1996 Int. Immunol 8:765-75)。已展示，PD1之兩個配體PD-L1及PD-L2在結合至PD1時下調T細胞活化(Freeman等人，2000 J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人，2001 Nat Immunol 2:261-8；Carter等人，2002 Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1在人類癌症中較為豐富(Dong等人，2003 J Mol Med 81:281-7；Blank等人，2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314；Konishi等人，2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫阻抑可藉由抑制PD1與PD-L1之局部相互作用來逆轉。PD1、PD-L1及PD-L2之抗體、抗體片段及其他抑制劑可在業內獲得且可與本文所述之CD20 CAR組合使用。舉例而言，尼沃魯單抗(nivolumab，亦稱為BMS-936558或MDX1106; Bristol-Myers Squibb)係特異性阻斷PD1之全人類IgG4單株抗體。尼沃魯單抗(純系5C4)及特異性結合至PD1之其他人類單株抗體揭示於US 8,008,449及WO2006/121168中。匹利珠單抗(Pidilizumab) (CT-011; Cure Tech)係結合至PD1之人類化IgG1k單株抗體。匹利珠單抗及其他人類化抗PD1單株抗體揭示於WO2009/101611中。派姆單抗(Pembrolizumab) (之前稱為蘭布魯珠單抗(lambrolizumab)，且亦稱為Keytruda、MK03475; Merck)係結合至PD1之人類化IgG4單株抗體。派姆單抗及其他人類化抗PD1抗體揭示於US 8,354,509及WO2009/114335中。MEDI4736 (Medimmune)係結合至PDL1之人類單株抗體，且抑制配體與PD1之相互作用。MDPL3280A (Genentech / Roche)係結合至PD-L1之人類Fc最佳化IgG1單株抗體。針對PD-L1之MDPL3280A及其他人類單株抗體揭示於美國專利第7,943,743號及美國公開案第20120039906號中。其他抗PD-L1結合劑包括YW243.55.S70 (重鏈及輕鏈可變區展示於WO2010/077634中之SEQ ID NO: 20及21中)及MDX-1 105 (亦稱為BMS-936559，及例如揭示於WO2007/005874中之抗PD-L1結合劑)。AMP-224 (B7-DCIg; Amplimmune；例如WO2010/027827及WO2011/066342中所揭示)係阻斷PD1與B7-H1之間之相互作用的PD-L2 Fc融合物可溶性受體。其他抗PD1抗體尤其包括AMP 514 (Amplimmune)，例如US 8,609,089、US 2010028330及/或US 20120114649中所揭示之抗PD1抗體。 TIM3 (T細胞免疫球蛋白-3)亦負調控T細胞功能，特定而言在分泌IFN-g之CD4+ T輔助1及CD8+ T細胞毒性1細胞中，且在T細胞耗竭中起關鍵作用。抑制TIM3與其配體(例如，半乳糖凝集素-9 (Gal9)、磷脂醯絲胺酸(PS)及HMGB1)之間之相互作用可增加免疫反應。TIM3及其配體之抗體、抗體片段及其他抑制劑可在業內獲得且可與CAR (例如本文所述之CD20 CAR)組合使用。舉例而言，靶向TIM3之抗體、抗體片段、小分子或肽抑制劑結合至TIM3之IgV域以抑制與其配體之相互作用。抑制TIM3之抗體及肽揭示於WO2013/006490及US20100247521中。其他抗TIM3抗體包括RMT3-23之人類化形式(揭示於Ngiow等人，2011, Cancer Res, 71:3540-3551中)及純系8B.2C12 (揭示於Monney等人，2002, Nature, 415:536-541中)。抑制TIM3及PD-1之雙特異性抗體揭示於US20130156774中。 在一些實施例中，增強CAR表現細胞之活性之藥劑係CEACAM抑制劑(例如，CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5抑制劑)。在一個實施例中，CEACAM之抑制劑係抗CEACAM抗體分子。實例性抗CEACAM-1抗體闡述於WO 2010/125571、WO 2013/082366、WO 2014/059251及WO 2014/022332中，例如單株抗體34B1、26H7及5F4；或其重組形式，如例如US 2004/0047858、US 7,132,255及WO 99/052552中所述。在一些實施例中，抗CEACAM抗體結合至CEACAM-5，如例如Zheng等人，PLoS One. 2010年9月2日;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)中所述，或與CEACAM-1及CEACAM-5交叉反應，如例如WO 2013/054331及US 2014/0271618中所述。 不期望受限於理論，人們認為癌胚抗原細胞黏著分子(CEACAM) (例如CEACAM-1及CEACAM-5)至少部分地調介抗腫瘤免疫反應之抑制(參見例如Markel等人，J Immunol. 2002年3月15日;168(6):2803-10；Markel等人，J Immunol. 2006年11月1日;177(9):6062-71；Markel等人，Immunology. 2009年2月;126(2):186-200；Markel等人，Cancer Immunol Immunother. 2010年2月;59(2):215-30；Ortenberg等人，Mol Cancer Ther. 2012年6月;11(6):1300-10；Stern等人，J Immunol. 2005年6月1日;174(11):6692-701；Zheng等人，PLoS One. 2010年9月2日;5(9). pii: e12529)。舉例而言，CEACAM-1已闡述為TIM-3之異嗜性配體且在TIM-3介導之T細胞耐受及耗竭中起作用(參見例如WO 2014/022332；Huang等人(2014) Nature doi:10.1038/nature13848)。在實施例中，已展示在異種移植物結腸直腸癌模型中，共阻斷CEACAM-1及TIM-3會增強抗腫瘤免疫反應(參見例如WO 2014/022332；Huang等人(2014)，上文文獻)。在一些實施例中，共阻斷CEACAM-1及PD-1會降低T細胞耐受，如例如WO 2014/059251中所述。因此，CEACAM抑制劑可與本文所述之其他免疫調節劑(例如，抗PD-1及/或抗TIM-3抑制劑)一起使用來增強針對癌症(例如，黑色素瘤、肺癌(例如，NSCLC)、膀胱癌、結腸癌、卵巢癌及如本文所述之其他癌症)之免疫反應。 LAG3 (淋巴球活化基因-3或CD223)係在活化T細胞及B細胞上表現之細胞表面分子，已展示其在CD8+ T細胞耗竭中起作用。LAG3及其配體之抗體、抗體片段及其他抑制劑可在業內獲得且可與CAR (例如本文所述之CD20 CAR)組合使用。舉例而言，BMS-986016 (Bristol-Myers Squib)係靶向LAG3之單株抗體。IMP701 (Immutep)係拮抗劑LAG3抗體，且IMP731 (Immutep及GlaxoSmithKline)係清除LAG3抗體。其他LAG3抑制劑包括IMP321 (Immutep)，其係結合至II類MHC分子且活化抗原呈遞細胞(APC)之LAG3及Ig之可溶性部分的重組融合蛋白。其他抗體揭示於例如WO2010/019570中。 在一些實施例中，增強CAR表現細胞之活性之藥劑可為例如包含第一域及第二域之融合蛋白，其中第一域係抑制性分子或其片段，且第二域係與正信號相關之多肽，例如包含如本文所述之細胞內信號傳導域之多肽。在一些實施例中，與正信號相關之多肽可包括CD28、CD27、ICOS之共刺激域，例如CD28、CD27及/或ICOS之細胞內信號傳導域，及/或例如本文所述之例如CD3ζ之初級信號傳導域。在一個實施例中，融合蛋白係由表現CAR之相同細胞表現。在另一實施例中，融合蛋白係由不表現抗CD20 CAR之細胞(例如，T細胞或NK細胞)表現。 在一個實施例中，增強本文所述CAR表現細胞之活性之藥劑係miR-17-92。 與低劑量之mTOR抑制劑之組合 在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之細胞係與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑組合投與。 在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5%但不超過90%、至少10%但不超過90%、至少15%但不超過90%、至少20%但不超過90%、至少30%但不超過90%、至少40%但不超過90%、至少50%但不超過90%、至少60%但不超過90%、或至少70%但不超過90%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。 在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5%但不超過80%、至少10%但不超過80%、至少15%但不超過80%、至少20%但不超過80%、至少30%但不超過80%、至少40%但不超過80%、至少50%但不超過80%、或至少60%但不超過80%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。 在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5%但不超過70%、至少10%但不超過70%、至少15%但不超過70%、至少20%但不超過70%、至少30%但不超過70%、至少40%但不超過70%、或至少50%但不超過70%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。 在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5%但不超過60%、至少10%但不超過60%、至少15%但不超過60%、至少20%但不超過60%、至少30%但不超過60%、或至少40%但不超過60%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。 在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5%但不超過50%、至少10%但不超過50%、至少15%但不超過50%、至少20%但不超過50%、至少30%但不超過50%、或至少40%但不超過50%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。 在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5%但不超過40%、至少10%但不超過40%、至少15%但不超過40%、至少20%但不超過40%、至少30%但不超過40%、或至少35%但不超過40%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。 在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少5%但不超過30%、至少10%但不超過30%、至少15%但不超過30%、至少20%但不超過30%、或至少25%但不超過30%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。 在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少1%、2%、3%、4%或5%但不超過20%、至少1%、2%、3%、4%或5%但不超過30%、至少1%、2%、3%、4%或5%但不超過35%、至少1%、2%、3%、4%或5%但不超過40%、或至少1%、2%、3%、4%或5%但不超過45%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。 在實施例中，mTOR抑制劑之劑量與至少1%、2%、3%、4%或5%但不超過90%之mTOR抑制相關，或提供該mTOR抑制。 如本文所論述，mTOR抑制之程度可表示為P70 S6激酶抑制之程度，例如mTOR抑制之程度可藉由P70 S6激酶活性之減小量、例如藉由P70 S6激酶受質之磷酸化減小來確定。mTOR抑制之程度可藉由本文所述之方法、例如藉由Boulay分析或藉由西方墨點之磷酸化S6含量量測值來評估。 實例性mTOR抑制劑 如本文所用之術語「mTOR抑制劑」係指抑制細胞中之mTOR激酶之化合物或配體或其醫藥上可接受之鹽。在實施例中，mTOR抑制劑係別位抑制劑。在實施例中，mTOR抑制劑係催化抑制劑。 別位mTOR抑制劑包括中性三環化合物雷帕黴素(西羅莫司)；雷帕黴素相關化合物，其為與雷帕黴素具有結構及功能相似性之化合物，包括例如抑制mTOR活性之雷帕黴素衍生物、雷帕黴素類似物(rapamycin analog) (亦稱為雷帕黴素類似物(rapalog))及其他巨環內酯化合物。 雷帕黴素係由吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)產生之已知巨環內酯抗生素，其具有式A中所展示之結構
Figure 02_image001
(A) 參見例如McAlpine, J.B.等人，J. Antibiotics (1991) 44: 688；Schreiber, S.L.等人，J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433；美國專利第3,929,992號。業內對雷帕黴素提出多種編號方案。為避免混淆，當在本文中命名具體雷帕黴素類似物時，利用式A之編號方案給出雷帕黴素之名稱。 可用於本發明中之雷帕黴素類似物係例如O-取代類似物，其中雷帕黴素之環己基環上之羥基經OR1 替代，其中R1 係羥基烷基、羥基烷氧基烷基、醯基胺基烷基或胺基烷基；例如RAD001，亦稱為依維莫司，如US 5,665,772及WO94/09010中所述，該等專利之內容皆以引用方式併入本文中。其他適宜雷帕黴素類似物包括在26或28位經取代之彼等。雷帕黴素類似物可為上文所提及類似物之差向異構物，特定而言在40位、28位或26位經取代之類似物之差向異構物，且可視情況進一步氫化，例如如US 6,015,815、WO95/14023及WO99/15530中所述，該等專利之內容皆以引用方式併入本文中，例如ABT578 (亦稱為咗他莫司)或US 7,091,213、WO98/02441及WO01/14387中所述之雷帕黴素類似物，該等專利之內容皆以引用方式併入本文中，例如AP23573，亦稱為瑞達福羅莫司。 來自US 5,665,772之適用於本發明中之雷帕黴素類似物的實例包括(但不限於) 40-O-苄基-雷帕黴素、40-O-(4’-羥基甲基)苄基-雷帕黴素、40-O-[4’-(1,2-二羥基乙基)]苄基-雷帕黴素、40-O-烯丙基-雷帕黴素、40-O-[3’-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4(S)-基)-丙-2’-烯-1’-基]-雷帕黴素、(2’E,4’S)-40-O-(4’,5’-二羥基戊-2’-烯-1’-基)-雷帕黴素、40-O-(2-羥基)乙氧基羰基甲基-雷帕黴素、40-O-(2-羥基)乙基-雷帕黴素、40-O-(3-羥基)丙基-雷帕黴素、40-O-(6-羥基)己基-雷帕黴素、40-O-[2-(2-羥基)乙氧基]乙基-雷帕黴素、40-O-[(3S)-2,2-二甲基二氧戊環-3-基]甲基-雷帕黴素、40-O-[(2S)-2,3-二羥基丙-1-基]-雷帕黴素、40-O-(2-乙醯氧基)乙基-雷帕黴素、40-O-(2-菸醯基氧基)乙基-雷帕黴素、40-O-[2-(N-嗎啉基)乙醯氧基]乙基-雷帕黴素、40-O-(2-N-咪唑基乙醯氧基)乙基-雷帕黴素、40-O-[2-(N-甲基-N’-六氫吡嗪基)乙醯氧基]乙基-雷帕黴素、39-O-去甲基-39,40-O,O-伸乙基-雷帕黴素、(26R)-26-二氫-40-O-(2-羥基)乙基-雷帕黴素、40-O-(2-胺基乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-乙醯胺基乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-菸醯胺基乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-(N-甲基-咪唑并-2’-基乙氧基甲醯胺基)乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-乙氧基羰基胺基乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-甲苯基磺醯胺基乙基)-雷帕黴素及40-O-[2-(4’,5’-二乙氧羰基-1’,2’,3’-三唑-1’-基)-乙基]-雷帕黴素。 可用於本發明中之其他雷帕黴素類似物係其中雷帕黴素之環己基環上之羥基及/或28位羥基經羥基酯基團替代之類似物，例如於US RE44,768中發現之雷帕黴素類似物，例如替西羅莫司。 可用於本發明中之其他雷帕黴素類似物包括以下彼等：其中16位甲氧基經另一取代基、較佳(視情況經羥基取代)炔基氧基、苄基、正甲氧基苄基或氯苄基替代及/或其中39位甲氧基與39碳一起缺失，以使得雷帕黴素之環己基環變成缺少39位甲氧基之環戊基環；例如如WO95/16691及WO96/41807中所述，該等專利之內容皆以引用方式併入本文中。該等類似物可進一步經修飾，使得雷帕黴素之40位羥基經烷基化及/或32-羰基經還原。 來自WO95/16691之雷帕黴素類似物包括(但不限於) 16-去甲氧基-16-(戊-2-炔基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-(丁-2-炔基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-(炔丙基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-(4-羥基-丁-2-炔基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-苄基氧基-40-O-(2-羥基乙基)-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-苄基氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-鄰-甲氧基苄基-雷帕黴素、16-去甲氧基-40-O-(2-甲氧基乙基)-16-戊-2-炔基)氧基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-甲醯基-42-nor-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-羥基甲基-42-nor-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-羧基-42-nor-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-(4-甲基-六氫吡嗪-1-基)羰基-42-nor-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-(嗎啉-4-基)羰基-42-nor-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-[N-甲基, N-(2-吡啶-2-基-乙基)]胺甲醯基-42-nor-雷帕黴素及39-去甲氧基-40-去氧基-39-(對甲苯磺醯基亞肼基甲基)-42-nor-雷帕黴素。 來自WO96/41807之雷帕黴素類似物包括(但不限於) 32-去側氧基-雷帕黴素、16-O-戊-2-炔基-32-去側氧基-雷帕黴素、16-O-戊-2-炔基-32-去側氧基-40-O-(2-羥基-乙基)-雷帕黴素、16-O-戊-2-炔基-32-(S)-二氫-40-O-(2-羥基乙基)-雷帕黴素、32(S)-二氫-40-O-(2-甲氧基)乙基-雷帕黴素及32(S)-二氫-40-O-(2-羥基乙基)-雷帕黴素。 另一適宜雷帕黴素類似物係如US2005/0101624中所述之優米莫司(umirolimus)，該專利之內容以引用方式併入本文中。 RAD001 (或者稱為依維莫司(Afinitor®))具有化學名稱(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羥基乙氧基)-3-甲氧基環己基]-1-甲基乙基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧雜-4-氮雜-三環[30.3.1.04,9]三十六-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-戊酮 別位mTOR抑制劑之其他實例包括西羅莫司(雷帕黴素，AY-22989)、40-[3-羥基-2-(羥基甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕黴素(亦稱為替西羅莫司或CCI-779)及瑞達福羅莫司(AP-23573/MK-8669)。別位mTor抑制劑之其他實例包括咗他莫司(ABT578)及優米莫司。 或者或另外，已發現催化ATP競爭性mTOR抑制劑直接靶向mTOR激酶域且靶向mTORC1及mTORC2二者。該等化合物亦係比該等別位mTOR抑制劑(如雷帕黴素)更有效之mTORC1抑制劑，此乃因其調節抗雷帕黴素mTORC1輸出，例如4EBP1-T37/46磷酸化及帽依賴性轉譯。 催化抑制劑包括：BEZ235或2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-側氧基-8-喹啉-3-基-2,3-二氫-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-苯基]-丙腈或單甲苯磺酸鹽形式。BEZ235之合成闡述於WO2006/122806中；CCG168 (或者稱為AZD-8055；Chresta, C.M.等人，Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298)，其具有化學名稱{5-[2,4-雙-((S)-3-甲基-嗎啉-4-基)-吡啶并[2,3d]嘧啶-7-基]-2-甲氧基-苯基}-甲醇；3-[2,4-雙[(3S)-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲醯胺(WO09104019)；3-(2-胺基苯并[d]噁唑-5-基)-1-異丙基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(WO10051043及WO2013023184)；N-(3-(N-(3-((3,5-二甲氧基苯基)胺基)喹喏啉-2-基)胺磺醯基)苯基)-3-甲氧基-4-甲基苯甲醯胺(WO07044729及WO12006552)；PKI-587 (Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645)，其具有化學名稱1-[4-[4-(二甲基胺基)六氫吡啶-1-羰基]苯基]-3-[4-(4,6-二嗎啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]尿素；GSK-2126458 (ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43)，其具有化學名稱2,4-二氟-N-{2-甲氧基-5-[4-(4-嗒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺醯胺；5-(9-異丙基-8-甲基-2-嗎啉基-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(WO10114484)；(E)-N-(8-(6-胺基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1-(6-(2-氰基丙-2-基)吡啶-3-基)-3-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-亞基)氰胺(WO12007926)。 催化mTOR抑制劑之其他實例包括8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-六氫吡嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氫-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(WO2006/122806)及Ku-0063794 (Garcia-Martinez JM等人，Biochem J., 2009, 421(1), 29-42.. Ku-0063794 is a specific inhibitor of the mammalian target of rapamycin (mTOR)。) WYE-354係催化mTor抑制劑之另一實例(Yu K等人(2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240)。 可根據本發明使用之mTOR抑制劑亦包括前述任一者之前藥、衍生物、醫藥上可接受之鹽或其類似物。 mTOR抑制劑(例如RAD001)可經調配以基於業內已充分建立之方法基於本文所述之具體劑量來遞送。特定而言，美國專利6,004,973 (以引用方式併入本文中)提供可與本文所述之mTOR抑制劑一起使用之調配物之實例。 mTOR抑制之評估 mTOR使激酶P70 S6磷酸化，由此活化P70 S6激酶且容許其磷酸化其受質。mTOR抑制之程度可表示為P70 S6激酶抑制之程度，例如mTOR抑制之程度可藉由P70 S6激酶活性之減小量、例如藉由P70 S6激酶受質之磷酸化減小來確定。mTOR抑制之程度可藉由在抑制劑不存在下(例如在投與抑制劑之前)及在抑制劑存在下或在投與抑制劑後量測P70 S6激酶活性(P70 S6激酶磷酸化受質之能力)來確定。P70 S6激酶之抑制程度給出mTOR之抑制度。因此，若P70 S6激酶被抑制40%，則mTOR活性(如藉由P70 S6激酶活性所量測)被抑制40%。本文所提及之抑制程度或抑制度係在劑量間隔內之平均抑制度。舉例而言，若抑制劑係以每週一次給予，則抑制度係藉由該間隔(即一週)內之平均抑制度來給出。 Boulay等人，Cancer Res, 2004, 64:252-61 (其以引用方式併入本文中)教示可用於評價mTOR抑制度之分析(在本文中稱為Boulay分析)。在實施例中，該分析依賴於在投與mTOR抑制劑(例如RAD001)之前及之後生物樣品之P70 S6激酶活性之量測值。可在經mTOR抑制劑治療後之預選時間下(例如，在治療後24小時、48小時及72小時)獲取樣品。可使用例如來自皮膚或末梢血單核細胞(PBMC)之生物樣品。自樣品製備總蛋白質提取物。藉由免疫沈澱利用特異性識別P70 S6激酶之抗體自蛋白質提取物分離P70 S6激酶。可在活體外激酶分析中量測經分離P70 S6激酶之活性。可在容許受質磷酸化之條件下，將經分離激酶與40S核糖體亞單位受質(其係P70 S6激酶之內源受質)及γ-32 P一起培育。然後，可在SDS-PAGE凝膠上解析反應混合物，且利用磷像儀分析32 P信號。對應於40S核糖體亞單位之大小之32 P信號指示磷酸化受質及P70 S6激酶之活性。可藉由以下方式計算激酶活性之增加及減小：量化磷酸化受質之32 P信號之區域及強度(例如，利用ImageQuant, Molecular Dynamics)，將任意單位值分配至所量化信號，及比較投與後之值與投與前之值或參考值。舉例而言，激酶活性之抑制%可使用下式來計算：1-(投與後獲得之值/投與前獲得之值) × 100。如上文所述，本文所提及之抑制程度或抑制度係劑量間隔內之平均抑制度。 用於評估激酶活性(例如，P70 S6激酶活性)之方法亦提供於US 7,727,950中，該專利以引用方式併入本文中。 mTOR抑制度亦可藉由PD1陰性T細胞對PD1陽性T細胞之比率變化來評估。來自末梢血之T細胞可藉由業內已知之方法鑑別為PD1陰性或陽性。 低劑量mTOR抑制劑 本文所述之方法利用低免疫增強劑量之mTOR抑制劑，例如別位mTOR抑制劑，包括雷帕黴素類似物，例如RAD001。相比之下，完全或接近完全抑制mTOR路徑之抑制劑含量為免疫阻抑性且用於例如預防器官移植排斥。另外，完全抑制mTOR之高劑量之雷帕黴素類似物亦抑制腫瘤細胞生長且用於治療多種癌症(參見例如Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors. Salvadori M. World J Transplant. 2012年10月24日;2(5):74-83；Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma: Role of mTOR Inhibition. Finn RS. Liver Cancer. 2012年11月;1(3-4):247-256；Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma. Moeini A, Cornellà H, Villanueva A. Liver Cancer. 2012年9月;1(2):83-93；Targeted cancer therapy - Are the days of systemic chemotherapy numbered? Joo WD, Visintin I, Mor G. Maturitas. 2013年9月20日.；Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor. Santoni M, Berardi R, Amantini C, Burattini L, Santini D, Santoni G, Cascinu S. Int J Cancer. 2013年10月2日)。 本發明至少部分地基於以下令人驚奇的發現：mTOR抑制劑之遠低於用於當前臨床環境中之劑量之劑量在增加個體之免疫反應及增加PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞比率方面具有優異效應。令人驚奇的是，僅產生mTOR活性之部分抑制之低劑量之mTOR抑制劑能夠有效地改良人類個體中的免疫反應且增加PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞之比率。 或者或另外，不希望受限於任何理論，人們認為例如與未經治療之個體相比，低免疫增強劑量之mTOR抑制劑可例如至少瞬時地增加幼稚T細胞數。或者或另外，儘管亦不希望受限於理論，但人們認為在足量時間或足夠投藥後使用mTOR抑制劑治療會產生以下中之一或多者： 增加以下標記物中之一或多者在例如記憶T細胞(例如，記憶T細胞前體)上之表現：CD62L高 、CD127高 、CD27+ 及BCL2； 減少KLRG1例如在記憶T細胞(例如，記憶T細胞前體)上之表現；及 增加記憶T細胞前體(例如，具有以下特徵中之任一者或該等特徵之組合之細胞)數：增加的CD62L高 、增加的CD127高 、增加的CD27+ 、減少的KLRG1及增加的BCL2； 且其中例如與未經治療之個體相比，例如至少瞬時出現上述任一變化(Araki, K等人(2009)Nature 460:108-112)。記憶T細胞前體係處於分化程式早期之記憶T細胞。舉例而言，記憶T細胞具有以下特徵中之一或多者：增加的CD62L高 、增加的CD127高 、增加的CD27+ 、減少的KLRG1及/或增加的BCL2。 在實施例中，本發明係關於mTOR抑制劑(例如別位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素類似物、雷帕黴素或RAD001；或催化mTOR抑制劑)之組合物或劑型，其在所選投藥方案下以例如每天一次或每週一次投與時與以下各項相關：與完全或顯著免疫阻抑不相關、但與免疫反應之增強相關之mTOR抑制度。 mTOR抑制劑(例如別位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素類似物、雷帕黴素或RAD001；或催化mTOR抑制劑)可於持續釋放調配物中提供。本文所述之組合物或單位劑型中之任一者可於持續釋放調配物中提供。在一些實施例中，持續釋放調配物將具有低於立即釋放調配物之生物利用度。例如，在實施例中，為獲得立即釋放調配物之類似治療效應，持續釋放調配物將具有約2倍至約5倍、約2.5倍至約3.5倍或約3倍的於立即釋放調配物中所提供之抑制劑量。 在實施例中，提供例如RAD001之立即釋放形式，其通常係以每週投與一次來使用，每單位劑型具有0.1 mg至20 mg、0.5 mg至10 mg、2.5 mg至7.5 mg、3 mg至6 mg或約5 mg。對於每週一次投與，該等立即釋放調配物對應於持續釋放形式，其分別具有0.3 mg至60 mg、1.5 mg至30 mg、7.5 mg至22.5 mg、9 mg至18 mg或約15 mg mTOR抑制劑，例如別位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001。在實施例中，兩種形式皆係基於一次/週來投與。 在實施例中，提供例如RAD001之立即釋放形式，其通常係以每天投與一次來使用，每單位劑型具有0.005 mg至1.5 mg、0.01 mg至1.5 mg、0.1 mg至1.5 mg、0.2 mg至1.5 mg、0.3 mg至1.5 mg、0.4 mg至1.5 mg、0.5 mg至1.5 mg、0.6 mg至1.5 mg、0.7 mg至1.5 mg、0.8 mg至1.5 mg、1.0 mg至1.5 mg、0.3 mg至0.6 mg或約0.5 mg。對於每天一次投與，該等立即釋放形式對應於持續釋放形式，其分別具有0.015 mg至4.5 mg、0.03 mg至4.5 mg、0.3 mg至4.5 mg、0.6 mg至4.5 mg、0.9 mg至4.5 mg、1.2 mg至4.5 mg、1.5 mg至4.5 mg、1.8 mg至4.5 mg、2.1 mg至4.5 mg、2.4 mg至4.5 mg、3.0 mg至4.5 mg、0.9 mg至1.8 mg或約1.5 mg mTOR抑制劑，例如別位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001。對於每週一次投與，該等立即釋放形式對應於持續釋放形式，其分別具有0.1 mg至30 mg、0.2 mg至30 mg、2 mg至30 mg、4 mg至30 mg、6 mg至30 mg、8 mg至30 mg、10 mg至30 mg、1.2 mg至30 mg、14 mg至30 mg、16 mg至30 mg、20 mg至30 mg、6 mg至12 mg或約10 mg mTOR抑制劑，例如別位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001。 在實施例中，提供例如RAD001之立即釋放形式，其通常係以每天投與一次來使用，每單位劑型具有0.01 mg至1.0 mg。對於每天一次投與，該等立即釋放形式對應於持續釋放形式，其分別具有0.03 mg至3 mg mTOR抑制劑，例如別位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001。對於每週一次投與，該等立即釋放形式對應於持續釋放形式，其分別具有0.2 mg至20 mg mTOR抑制劑，例如別位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001。 在實施例中，提供例如RAD001之立即釋放形式，其通常係以每週投與一次來使用，每單位劑型具有0.5 mg至5.0 mg。對於每週一次投與，該等立即釋放形式對應於持續釋放形式，其分別具有1.5 mg至15 mg mTOR抑制劑，例如別位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001。 如上文所述，mTOR路徑之一個靶係P70 S6激酶。因此，可用於本文所述方法及組合物中之mTOR抑制劑之劑量係在mTOR抑制劑不存在下足以達成相對於P70 S6激酶之活性不大於80%之P70 S6激酶活性抑制的彼等，例如如藉由本文所述之分析(例如，Boulay分析)所量測。在另一態樣中，本發明提供在mTOR抑制劑不存在下足以達成相對於P70 S6激酶活性不大於38%之P70 S6激酶活性抑制之mTOR抑制劑的量。 在一個態樣中，例如在投與人類個體時，可用於本發明方法及組合物中之mTOR抑制劑之劑量足以達成90 +/-5% (即、85%-95%)、89+/-5%、88+/-5%、87+/-5%、86+/-5%、85+/-5%、84+/-5%、83+/-5%、82+/-5%、81+/-5%、80+/-5%、79+/-5%、78+/-5%、77+/-5%、76+/-5%、75+/-5%、74+/-5%、73+/-5%、72 +/-5%、71 +/-5%、70 +/-5%、69 +/-5%、68 +/-5%、67 +/-5%、66 +/-5%、65 +/-5%、64 +/-5%、63 +/-5%、62 +/-5%、61 +/-5%、60 +/-5%、59 +/-5%、58 +/-5%、57 +/-5%、56 +/-5%、55 +/-5%、54 +/-5%、54 +/-5%、53 +/-5%、52 +/-5%、51 +/-5%、50 +/-5%、49 +/-5%、48 +/-5%、47 +/-5%、46 +/-5%、45 +/-5%、44 +/-5%、43 +/-5%、42 +/-5%、41 +/-5%、40 +/-5%、39 +/-5%、38 +/-5%、37 +/-5%、36 +/-5%、35 +/-5%、34 +/-5%、33 +/-5%、32 +/-5%、31 +/-5%、30 +/-5%、29 +/-5%、28 +/-5%、27 +/-5%、26 +/-5%、25 +/-5%、24 +/-5%、23 +/-5%、22 +/-5%、21 +/-5%、20 +/-5%、19 +/-5%、18 +/-5%、17 +/-5%、16 +/-5%、15 +/-5%、14 +/-5%、13 +/-5%、12 +/-5%、11 +/-5%或10 +/-5%之P70 S6激酶活性抑制，例如如藉由本文所述之分析(例如，Boulay分析)所量測。 個體中之P70 S6激酶活性可利用業內已知之方法來量測，例如根據美國專利7,727,950中所述之方法、藉由磷酸P70 S6K含量及/或磷酸P70 S6含量之免疫印跡分析或藉由活體外激酶活性分析來量測。 如本文所用提及mTOR抑制劑之劑量之術語「約」係指mTOR抑制劑之量之至多+/- 10%變化，但可包括在所述劑量周圍無變化。 在一些實施例中，本發明提供方法，其包含向個體投與在目標谷值內之劑量之mTOR抑制劑，例如別位抑制劑，例如RAD001。在一些實施例中，該谷值顯著低於與用於器官移植及癌症患者中之投藥方案相關之谷值。在實施例中，投與mTOR抑制劑(例如RAD001或雷帕黴素)以產生小於產生免疫阻抑或抗癌效應之谷值之½、1/4、1/10或1/20的谷值。在實施例中，投與mTOR抑制劑(例如RAD001或雷帕黴素)以產生小於經FDA批准之用於免疫阻抑或抗癌指示之包裝插頁上提供的谷值之½、1/4、1/10或1/20的谷值。 在實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供0.1 ng/ml至10 ng/ml、0.1 ng/ml至5 ng/ml、0.1 ng/ml至3 ng/ml、0.1 ng/ml至2 ng/ml或0.1 ng/ml至1 ng/ml之目標谷值之劑量的mTOR抑制劑，例如別位抑制劑，例如RAD001。 在實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供0.2 ng/ml至10 ng/ml、0.2 ng/ml至5 ng/ml、0.2 ng/ml至3 ng/ml、0.2 ng/ml至2 ng/ml或0.2 ng/ml至1 ng/ml之目標谷值之劑量的mTOR抑制劑，例如別位抑制劑，例如RAD001。 在實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供0.3 ng/ml至10 ng/ml、0.3 ng/ml至5 ng/ml、0.3 ng/ml至3 ng/ml、0.3 ng/ml至2 ng/ml或0.3 ng/ml至1 ng/ml之目標谷值之劑量的mTOR抑制劑，例如別位抑制劑，例如RAD001。 在實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供0.4 ng/ml至10 ng/ml、0.4 ng/ml至5 ng/ml、0.4 ng/ml至3 ng/ml、0.4 ng/ml至2 ng/ml或0.4 ng/ml至1 ng/ml之目標谷值之劑量的mTOR抑制劑，例如別位抑制劑，例如RAD001。 在實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供0.5 ng/ml至10 ng/ml、0.5 ng/ml至5 ng/ml、0.5 ng/ml至3 ng/ml、0.5 ng/ml至2 ng/ml或0.5 ng/ml至1 ng/ml之目標谷值之劑量的mTOR抑制劑，例如別位抑制劑，例如RAD001。 在實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供1 ng/ml至10 ng/ml、1 ng/ml至5 ng/ml、1 ng/ml至3 ng/ml或1 ng/ml至2 ng/ml之目標谷值之劑量的mTOR抑制劑，例如別位抑制劑，例如RAD001。 如本文所用之術語「谷值」係指在下一劑量之前，血漿中即刻藥物濃度或兩個劑量之間之最低藥物濃度。 在一些實施例中，RAD001之目標谷值介於約0.1 ng/ml與4.9 ng/ml之間。在實施例中，目標谷值低於3 ng/ml，例如介於0.3 ng/ml或更小與3 ng/ml之間。在實施例中，目標谷值低於3 ng/ml，例如介於0.3 ng/ml或更小與1 ng/ml之間。 在另一態樣中，本發明可利用與RAD001之指定目標谷值生物等效之目標谷值相關之量的除RAD001外之mTOR抑制劑。在實施例中，除RAD001外之mTOR抑制劑之目標谷值係給出與本文所述RAD001之谷值所給出相同之mTOR抑制度的含量(例如，如藉由本文所述之方法(例如，P70 S6之抑制)所量測)。 醫藥組合物：mTOR抑制劑 在一個態樣中，本發明係關於醫藥組合物，其包含經調配與本文所述之CAR細胞組合使用之mTOR抑制劑，例如如本文所述之mTOR抑制劑。 在一些實施例中，mTOR抑制劑經調配以與例如如本文所述之另一藥劑組合投與。 一般而言，本發明化合物將以如上文所述之治療有效量經由業內已知之任一常用及可接受之模式、單獨或與一或多種治療劑組合投與。 醫藥調配物可使用習用溶解及混合程序來製備。舉例而言，在一或多種本文所述賦形劑存在下，使散裝藥物物質(例如mTOR抑制劑或該化合物之穩定形式(例如與環糊精衍生物或其他已知複合劑之複合物))溶解於適宜溶劑中。通常將mTOR抑制劑調配成醫藥劑型以提供藥物之容易控制劑量並給予患者美觀且容易處置之產品。 本發明化合物可以醫藥組合物形式藉由任何習用途徑、特定而言腸內(例如經口，例如以錠劑或膠囊形式)或非經腸(例如以可注射溶液或懸浮液形式)、經局部(例如以洗劑、凝膠、軟膏劑或乳霜形式或以鼻或栓劑形式)來投與。在mTOR抑制劑係與如本文所述之另一藥劑組合投與(同時或單獨)時，在一個態樣中，兩種組分可藉由同一途徑(例如，非經腸)來投與。或者，另一藥劑可藉由相對於mTOR抑制劑不同之途徑來投與。舉例而言，mTOR抑制劑可經口投與，且另一藥劑可非經腸投與。 持續釋放 本文所揭示之mTOR抑制劑(例如，別位mTOR抑制劑或催化mTOR抑制劑)可以醫藥調配物以包含本文所揭示之mTOR抑制劑(例如，雷帕黴素或RAD001)之經口固體劑型形式來提供，其與立即釋放(IR)錠劑相比滿足產物穩定性要求及/或具有有利的藥物動力學性質，例如降低的平均血漿峰值濃度、降低的患者間及患者內藥物吸收程度及血漿峰值濃度變化、降低的Cmax / Cmin 比率及/或降低的食物效應。所提供之醫藥調配物可容許更精確的劑量調整及/或降低不良事件之頻率，因此為患者提供較安全的本文所揭示mTOR抑制劑(例如，雷帕黴素或RAD001)治療。 在一些實施例中，本發明提供本文所揭示mTOR抑制劑(例如，雷帕黴素或RAD001)之穩定延長釋放調配物，其係多顆粒系統且可具有功能層及包衣。 如本文所用之術語「延長釋放多顆粒調配物」係指能夠在延長時間段內(例如在至少1小時、2小時、3小時、4小時、5小時或6小時內)釋放本文所揭示之mTOR抑制劑(例如雷帕黴素或RAD001)之調配物。延長釋放調配物可含有由特殊賦形劑(例如如本文所述)製成之基質及包衣，其係以使活性成分在攝取後之延長時間段內可利用之方式調配。 術語「延長釋放」可與術語「持續釋放」(SR)或「長期釋放」互換使用。根據藥典Ph. Eur (第7版)專著中對於錠劑及膠囊及USP一般章節＜1151＞中對於醫藥劑型之定義，術語「延長釋放」係指口服投藥後不立即釋放活性藥物物質而是在延長時間內釋放之醫藥調配物。根據「Guidance for Industry: Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms」 (FDA CDER, 1997)之定義，如本文所用之術語「立即釋放」 (IR)係指在短於60分鐘內釋放85%活性藥物物質之醫藥調配物。在一些實施例中，術語「立即釋放」意指在30分鐘時間內自錠劑釋放藥物，例如mTOR抑制劑，例如依維莫司，例如如在本文所述之溶解分析中所量測。 本文所揭示mTOR抑制劑(例如，雷帕黴素或RAD001)之穩定延長釋放調配物之特徵可在於，利用業內已知之分析(例如如本文所述之溶解分析)之活體外釋放圖譜：在37℃下向溶解容器中填充900 mL含有0.2%十二烷基硫酸鈉之磷酸鹽緩衝液(pH 6.8)，且藉由分別根據USP測試專著711及Ph.Eur.測試專著2.9.3.根據USP在75 rpm下利用槳板方法實施溶解。 在一些實施例中，在活體外釋放分析中，本文所揭示mTOR抑制劑(例如，雷帕黴素或RAD001)之穩定延長釋放調配物根據以下釋放說明釋放mTOR抑制劑： 0.5h：＜45%或＜40，例如＜30% 1h：20-80%，例如30%-60% 2h：＞50%或＞70%，例如＞75% 3h：＞60%或＞65%，例如＞85%，例如＞90%。 在一些實施例中，在活體外溶解分析中，本文所揭示mTOR抑制劑(例如，雷帕黴素或RAD001)之穩定延長釋放調配物不早於45 min、60 min、75 min、90 min、105 min或120 min釋放50%之mTOR抑制劑。ROR1 抑制劑 本文亦提供ROR1抑制劑及組合療法，例如本文所述之CD20 CAR表現細胞與ROR1抑制劑之組合。ROR1抑制劑包括(但不限於)抗ROR1 CAR表現細胞(例如CART)及抗ROR抗體(例如，抗ROR1單或雙特異性抗體)及其片段。在一些實施例中，抗ROR1抑制劑可用於治療本文所述之疾病。 實例性抗ROR1抑制劑闡述於Hudecek等人，Clin. Cancer Res. 19.12(2013):3153-64中，該文獻以引用方式併入本文中。舉例而言，抗ROR1抑制劑包括Hudecek等人中所述之抗ROR1 CART (例如，如Hudecek等人，第3155頁第一整段中所述產生，該文獻以引用方式併入本文中)。在其他實例中，抗ROR1抑制劑包括包含以下文獻中所述之2A2及R12抗ROR1單株抗體之VH及/或VL序列的抗體或其片段：Hudecek等人，段落橋頁3154-55；Baskar等人，MAbs 4(2012):349-61；及Yang等人，PLoS ONE 6(2011):e21018，該等文獻皆以引用方式併入本文中。 在一些實施例中，ROR1抑制劑包括靶向ROR1之抗體或其片段(例如，單鏈可變片段(scFv))，包括US 2013/0101607中所述之彼等，例如US 2013/0101607之SEQ ID NO: 1或2，該文獻以引用方式併入本文中。在一些實施例中，抗ROR1抗體片段(例如，scFv)偶聯或融合至生物活性分子，例如以形成使免疫細胞(例如T細胞或NK細胞)定向因應ROR1表現細胞之嵌合抗原受體(CAR)。 在一些實施例中，實例性ROR1抑制劑包括抗ROR1單株抗體，稱為UC-961 (西妥珠單抗(Cirmtuzumab))。參見例如臨床試驗標識符第NCT02222688號。西妥珠單抗可用於治療癌症，例如慢性淋巴球性白血病(CLL)、卵巢癌及黑色素瘤。參見例如Hojjat-Farsangi等人，PLoS One. 8(4): e61167；及NCT02222688。 在一些實施例中，西妥珠單抗係經靜脈內(例如以靜脈內輸注)投與。舉例而言，每一輸注提供約700-7000 µg (例如，700-750 µg、750-800 µg、800-850 µg、850-900 µg、900-950 µg、950-1000 µg、1000-1500 µg、1500-2000 µg、2000-2500 µg、2500-3000 µg、3000-3500 µg、3500-4000 µg、4000-4500 µg、4500-5000 µg、5000-5500 µg、5500-6000 µg、6000-6500 µg或6500-7000 µg)西妥珠單抗。在一些實施例中，西妥珠單抗係以10-100 µg/kg體重(例如10-15 µg/kg體重、15-20 µg/kg體重、20-25 µg/kg體重、25-30 µg/kg體重、30-35 µg/kg體重、35-40 µg/kg體重、40-45 µg/kg體重、45-50 µg/kg體重、50-55 µg/kg體重、55-60 µg/kg體重、60-65 µg/kg體重、65-70 µg/kg體重、70-75 µg/kg體重、75-80 µg/kg體重、80-85 µg/kg體重、85-90 µg/kg體重、90-95 µg/kg體重或95-100 µg/kg體重)之劑量投與。在一個實施例中，西妥珠單抗係以15 µg/kg體重之起始劑量投與。 在一些實施例中，西妥珠單抗係以至少7天(例如7天、14天、21天、28天、35天或更多天)之投藥間隔投與。舉例而言，西妥珠單抗係以至少1週(例如1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、24週、26週、28週、20週、22週、24週、26週、28週、30週或更多週)之投藥間隔投與。 在一些實施例中，西妥珠單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔持續一段時間(例如至少1週，例如1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、22週、24週、26週、28週、30週、40週、50週、60週或更多週、或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或更多個月、或1年、2年、3年、4年、5年或更多年)來投與。舉例而言，西妥珠單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔持續總共至少2個劑量/治療週期(例如至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、18個、20個或更多個劑量/治療週期)投與。 在一些實施例中，抗ROR1抗體偶聯或以其他方式結合至治療劑。 在一些實施例中，ROR1抑制劑包括抗ROR1 CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗ROR1 CAR構築體或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之ROR1結合CAR編碼之細胞。舉例而言，抗ROR1 CAR表現細胞(例如CART)係藉由將ROR1-CAR (其包含ROR1結合域)改造至細胞(例如，T細胞或NK細胞)中例如以與本文所述之CAR表現細胞組合投與來產生。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞於授受性療法之使用方法。 在另一態樣中，本文提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及ROR1 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現ROR1 CAR之第二細胞。在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括例如第一細胞，其表現包括初級細胞內信號傳導域之CAR (例如，CD19 CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR或CD22 CAR)；及第二細胞，其表現包括次級信號傳導域之CAR (例如，CD19 CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR或CD22 CAR))。 CD22抑制劑 本文提供CD22抑制劑及組合療法，例如CD22抑制劑與本文所述之CAR表現細胞(例如，本文所述之CD20 CAR表現細胞)之組合。 在一個實施例中，CD22抑制劑係本文所述之CD22抑制劑。CD22抑制劑可為例如抗CD22抗體(例如，抗CD22單或雙特異性抗體)或CD22 CART，例如表6中所述。在一些實施例中，抗CD22抗體偶聯或以其他方式結合至治療劑。實例性治療劑包括例如微管破壞劑(例如，單甲基奧裡斯他汀E (monomethyl auristatin E))及毒素(例如，白喉毒素或假單胞菌屬(Pseudomonas)外毒素-A、蓖麻毒蛋白)。 在實施例中，抗CD22抗體係抗CD22單株抗體-MMAE偶聯物(例如，DCDT2980S)。在實施例中，抗體係抗CD22抗體之scFv，例如抗體RFB4之scFv。此scFv可融合至假單胞菌屬外毒素-A之全部或片段(例如，BL22)。在實施例中，抗體係人類化抗CD22單株抗體(例如，依帕珠單抗(epratuzumab))。在實施例中，抗體或其片段包含抗CD22抗體之Fv部分，其視情況共價融合至假單胞菌屬外毒素-A之全部或片段或(例如，38 KDa片段) (例如，莫妥莫單抗帕蘇托(moxetumomab pasudotox))。在實施例中，抗CD22抗體係視情況偶聯至毒素之抗CD19/CD22雙特異性抗體。例如，在一個實施例中，抗CD22抗體包含抗CD19/CD22雙特異性部分(例如，識別人類CD19及CD22之兩個scFv配體)，其視情況連接至白喉毒素(DT)之全部或一部分，例如白喉毒素(DT)之前389個胺基酸DT 390，例如針對配體之毒素，例如DT2219ARL。在另一實施例中，雙特異性部分(例如，抗CD19/抗CD22)連接至毒素，例如去醣基化蓖麻毒蛋白A鏈(例如，Combotox)。 在一個實施例中，抗CD22抗體選自針對抗CD19/CD22雙特異性配體之毒素(例如，識別人類CD19及CD22之兩個scFv配體，其連接至白喉毒素(DT)之前389個胺基酸DT 390，例如DT2219ARL)；抗CD22單株抗體-MMAE偶聯物(例如，DCDT2980S)；抗CD22抗體RFB4之scFv融合至假單胞菌屬外毒素-A之片段(例如，BL22)；去醣基化蓖麻毒蛋白A鏈偶聯之抗CD19/抗CD22 (例如，Combotox)；人類化抗CD22單株抗體(例如，依帕珠單抗)；或抗CD22抗體之Fv部分共價融合至假單胞菌屬外毒素-A之38 KDa片段(例如，莫妥莫單抗帕蘇托)。 在一個實施例中，抗CD22抗體係針對抗CD19/CD22雙特異性配體之毒素(例如，DT2219ARL)，且針對抗CD19/CD22雙特異性配體之毒素係以約1 µg/kg、2 µg/kg、3 µg/kg、4 µg/kg、5 µg/kg、6 µg/kg、7 µg/kg、8 µg/kg、9 µg/kg、10 µg/kg、11 µg/kg、12 µg/kg、13 µg/kg、14 µg/kg、15 µg/kg、20 µg/kg、25 µg/kg、30 µg/kg、40 µg/kg、60 µg/kg、80 µg/kg、100 µg/kg、120 µg/kg、140 µg/kg、160 µg/kg、180 µg/kg、200 µg/kg、220 µg/kg、250 µg/kg、300 µg/kg、350 µg/kg、400 µg/kg、450 µg/kg、500 µg/kg、600 µg/kg、700 µg/kg、800 µg/kg、900 µg/kg、1 mg.kg (例如，30 µg/kg、40 µg/kg、60 µg/kg或80 µg/kg)之劑量持續一段時間(例如每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天或更多天)來投與。在一些實施例中，針對抗CD19/CD22雙特異性配體之毒素係經由靜脈內輸注來投與。 在一個實施例中，抗CD22抗體係BL22，且BL22係以約1 µg/kg、2 µg/kg、3 µg/kg、4 µg/kg、5 µg/kg、6 µg/kg、7 µg/kg、8 µg/kg、9 µg/kg、10 µg/kg、11 µg/kg、12 µg/kg、13 µg/kg、14 µg/kg、15 µg/kg、20 µg/kg、25 µg/kg、30 µg/kg、40 µg/kg、60 µg/kg、80 µg/kg、100 µg/kg、120 µg/kg、140 µg/kg、160 µg/kg、180 µg/kg、200 µg/kg、220 µg/kg、250 µg/kg、300 µg/kg、350 µg/kg、400 µg/kg、450 µg/kg、500 µg/kg、600 µg/kg、700 µg/kg、800 µg/kg、900 µg/kg、1 mg.kg (例如，3 µg/kg、30 µg/kg、40 µg/kg或50 µg/kg)之劑量持續一段時間(例如每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天或更多天)來投與。在一些實施例中，BL22係每天、每隔一天、每三天或每四天持續一段時間(例如持續4天週期、6天週期、8天週期、10天週期、12天週期或14天週期)投與。在一個實施例中，投與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個BL22週期。在一些實施例中，BL22係經由靜脈內輸注來投與。 在一個實施例中，抗CD22抗體係去醣基化蓖麻毒蛋白A鏈偶聯之抗CD19/抗CD22 (例如，Combotox)，且去醣基化蓖麻毒蛋白A鏈偶聯之抗CD19/抗CD22係以約500 µg/m2 、600 µg/m2 、700 µg/m2 、800 µg/m2 、900 µg/m2 、1 mg/m2 、2 mg/m2 、3 mg/m2 、4 mg/m2 、5 mg/m2 、6 mg/m2 或7 mg/m2 之劑量持續一段時間(例如每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天或更多天)來投與。在一些實施例中，去醣基化蓖麻毒蛋白A鏈偶聯之抗CD19/抗CD22係每天、每隔一天、每三天或每四天持續一段時間(例如持續4天週期、6天週期、8天週期、10天週期、12天週期或14天週期) (例如，每隔一天持續6天)投與。在一個實施例中，投與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12或更多個去醣基化蓖麻毒蛋白A鏈偶聯之抗CD19/抗CD22週期。在一些實施例中，去醣基化蓖麻毒蛋白A鏈偶聯之抗CD19/抗CD22係經由靜脈內輸注來投與。 在一個實施例中，抗CD22抗體係人類化抗CD22單株抗體(例如，依帕珠單抗)，且人類化抗CD22單株抗體係以約10 mg/m2 /週、20 mg/m2 /週、50 mg/m2 /週、100 mg/m2 /週、120 mg/m2 /週、140 mg/m2 /週、160 mg/m2 /週、180 mg/m2 /週、200 mg/m2 /週、220 mg/m2 /週、250 mg/m2 /週、260 mg/m2 /週、270 mg/m2 /週、280 mg/m2 /週、290 mg/m2 /週、300 mg/m2 /週、305 mg/m2 /週、310 mg/m2 /週、320 mg/m2 /週、325 mg/m2 /週、330 mg/m2 /週、335 mg/m2 /週、340 mg/m2 /週、345 mg/m2 /週、350 mg/m2 /週、355 mg/m2 /週、360 mg/m2 /週、365 mg/m2 /週、370 mg/m2 /週、375 mg/m2 /週、380 mg/m2 /週、385 mg/m2 /週、390 mg/m2 /週、400 mg/m2 /週、410 mg/m2 /週、420 mg/m2 /週、430 mg/m2 /週、440 mg/m2 /週、450 mg/m2 /週、460 mg/m2 /週、470 mg/m2 /週、480 mg/m2 /週、490 mg/m2 /週、500 mg/m2 /週、600 mg/m2 /週、700 mg/m2 /週、800 mg/m2 /週、900 mg/m2 /週、1 g/m2 /週或2 g/m2 /週(例如，360 mg/m2 /週或480 mg/m2 /週)之劑量持續一段時間(例如每1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週或更多週)來投與。在一些實施例中，第一劑量低於後續劑量(例如360 mg/m2 /週之第一劑量，然後370 mg/m2 /週之後續劑量)。在一些實施例中，人類化抗CD22單株抗體係經由靜脈內輸注來投與。 在一個實施例中，抗CD22抗體係莫妥莫單抗帕蘇托，且莫妥莫單抗帕蘇托係以約1 µg/kg、2 µg/kg、3 µg/kg、4 µg/kg、5 µg/kg、6 µg/kg、7 µg/kg、8 µg/kg、9 µg/kg、10 µg/kg、11 µg/kg、12 µg/kg、13 µg/kg、14 µg/kg、15 µg/kg、20 µg/kg、25 µg/kg、30 µg/kg、40 µg/kg、60 µg/kg、80 µg/kg、100 µg/kg、120 µg/kg、140 µg/kg、160 µg/kg、180 µg/kg、200 µg/kg、220 µg/kg、250 µg/kg、300 µg/kg、350 µg/kg、400 µg/kg、450 µg/kg、500 µg/kg (例如，5 µg/kg、10 µg/kg、20 µg/kg、30 µg/kg、40 µg/kg或50 µg/kg)之劑量持續一段時間(例如每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天或更多天)來投與。在一些實施例中，莫妥莫單抗帕蘇托係每天、每隔一天、每三天或每四天持續一段時間(例如持續4天週期、6天週期、8天週期、10天週期、12天週期或14天週期) (例如，每隔一天持續6天)投與。在一個實施例中，投與1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個或更多個莫妥莫單抗帕蘇托週期。在一些實施例中，莫妥莫單抗帕蘇托係經由靜脈內輸注來投與。 在一個實施例中，CD22抑制劑包括CD22 CAR表現細胞(例如CD22 CART或例如包含CD22結合域且改造至細胞(例如，T細胞或NK細胞)中以與CD20 CART組合投與之CD22-CAR)及其用於授受性療法之方法。在一些實施例中，CD22抑制劑包括表現CD22 CAR構築體或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之CD22 CAR編碼之細胞。舉例而言，CD22 CAR表現細胞(例如CART)係藉由將CD22-CAR (其包含CD22結合域)改造至細胞(例如，T細胞或NK細胞)中、例如以與本文所述之CAR表現細胞(例如本文所述之CD20 CART)組合投與來產生。 在另一態樣中，本發明提供CAR表現細胞群體，例如包含表現CD20 CAR及CD22 CAR之細胞之混合物之CAR表現細胞。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD22 CAR之第二細胞。在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括例如第一細胞，其表現包括初級細胞內信號傳導域之CAR (例如CD20 CAR或CD22 CAR)；及第二細胞，其表現包括次級信號傳導域之CAR (例如CD20 CAR或CD22 CAR)。在一個實施例中，CD20 CAR包含表1之序列或由其組成。在一個實施例中，CD22 CAR包含表6之序列或由其組成。CD19 抑制劑 本文提供CD19抑制劑及組合療法，例如CD19抑制劑與本文所述之CAR表現細胞(例如，本文所述之CD20 CAR表現細胞或本文所述之CD22 CAR表現細胞)之組合。CD19抑制劑包括(但不限於) CD19 CAR表現細胞(例如CD19 CAR表現細胞)或抗CD19抗體(例如，抗CD19單或雙特異性抗體，其可包含表11之序列或由其組成)或其片段或偶聯物。在實施例中，CD19抑制劑係與CD20、CD22或ROR1抑制劑(例如CD20、CD22或ROR1 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞)組合投與。 實例性抗CD19抗體或其片段或偶聯物包括(但不限於)布利莫單抗(blinatumomab)、SAR3419 (Sanofi)、MEDI-551 (MedImmune LLC)、Combotox、DT2219ARL (Masonic Cancer Center)、MOR-208 (亦稱為XmAb-5574; MorphoSys)、XmAb-5871 (Xencor)、MDX-1342 (Bristol-Myers Squibb)、SGN-CD19A (Seattle Genetics)及AFM11 (Affimed Therapeutics)。參見例如Hammer. MAbs. 4.5(2012): 571-77。 在一些態樣中，抗CD19抗體或其片段或偶聯物包含博納吐單抗(blinatomomab)。博納吐單抗係包含兩個scFv (一個結合至CD19且一個結合至CD3)之雙特異性抗體。博納吐單抗使T細胞定向攻擊癌細胞。參見例如Hammer等人；臨床試驗標識符第NCT00274742號及第NCT01209286號。在一些實施例中，博納吐單抗可用於治療NHL (例如，DLBCL)或ALL。 在一些實施例中，博納吐單抗係經靜脈內(例如以靜脈內輸注)投與。在一些實施例中，博納吐單抗係以約0.5至120 µg/m2 /24小時(例如約0.5-1 µg/m2 /24小時、1-5 µg/m2 /24小時、5-15 µg/m2 /24小時、15-30 µg/m2 /24小時、30-60 µg/m2 /24小時或60-120 µg/m2 /24小時)之劑量投與。 在一些實施例中，博納吐單抗係以至少4天(例如4天、7天、14天、21天、28天、35天或更多天)之投藥間隔投與。舉例而言，博納吐單抗係以至少0.5週(例如0.5週、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週或更多週)之投藥間隔投與。在一些實施例中，博納吐單抗係經由連續靜脈內輸注在2-8週/週期內(例如在2-3週/週期、3-4週/週期、4-5週/週期、5-6週/週期、6-7週/週期或7-8週/週期內)投與。 在一些實施例中，博納吐單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔持續一段時間(例如至少2週，例如至少2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週或更多週)來投與。舉例而言，博納吐單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔持續總共至少4個劑量/治療週期(例如，至少4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個或更多個劑量/治療週期)投與。 在一些態樣中，抗CD19抗體包含MEDI-551。MEDI-551係Fc經改造以具有增強的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)之人類化抗CD19抗體。參見例如Hammer等人；及臨床試驗標識符第NCT01957579號。在一些實施例中，MEDI-551可用於治療B細胞惡性病(例如NHL、CLL、DLBCL及多發性骨髓瘤)、多發性硬化及硬皮症。 在一些實施例中，MEDI-551係經靜脈內(例如以靜脈內輸注)投與。在一些情形下，MEDI-551係以約0.5-12 mg/kg (例如0.5-1 mg/kg、1-2 mg/kg、2-4 mg/kg、4-8 mg/kg或8-12 mg/kg)之劑量投與。 在一些實施例中，MEDI-551係以至少1週(例如1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、24週、26週、28週、20週、22週、24週、26週、28週、30週或更多週)之投藥間隔投與。在一些實施例中，MEDI-551係以至少7天(例如7天、14天、21天、28天、35天或更多天)之投藥間隔投與。 在一些實施例中，MEDI-551係以本文所述之劑量及投藥間隔持續一段時間(例如至少1週，例如1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、22週、24週、26週、28週、30週、40週、50週、60週或更多週、或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或更多個月、或1年、2年、3年、4年、5年或更多年)來投與。舉例而言，MEDI-551係以本文所述之劑量及投藥間隔持續總共至少2個劑量/治療週期(例如，至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、18個、20個或更多個劑量/治療週期)投與。 在一些態樣中，抗CD19抗體或其片段或偶聯物包含Combotox。Combotox係結合至CD19及CD22之免疫毒素之混合物。免疫毒素係由融合至去醣基化蓖麻毒蛋白A鏈之scFv抗體片段構成。參見例如Hammer等人；及Herrera等人，J. Pediatr. Hematol. Oncol. 31.12(2009):936-41；Schindler等人，Br. J. Haematol. 154.4(2011):471-6。在一些實施例中，Combotox可用於治療B細胞白血病，例如ALL。 在一些實施例中，Combotox係經靜脈內(例如以靜脈內輸注)投與。在一些情形下，Combotox係以約1-10 mg/m2 (例如約1-2 mg/m2 、2-3 mg/m2 、3-4 mg/m2 、4-5 mg/m2 或5-6 mg/m2 、6-7 mg/m2 、7-8 mg/m2 、8-9 mg/m2 或9-10 mg/m2 )之劑量投與。 在一些實施例中，Combotox係以至少2天(例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、21天、28天、35天或更多天)之投藥間隔投與。在一些實施例中，Combotox係以本文所述之劑量及投藥間隔持續一段時間(例如至少1週，例如至少1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、22週、24週、26週、28週、30週、40週、50週、60週或更多週、或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或更多個月、或1年、2年、3年、4年、5年或更多年)來投與。舉例而言，Combotox係以本文所述之劑量及投藥間隔持續總共至少4個劑量/治療週期(例如，至少4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、18個、20個或更多個劑量/治療週期)投與。 在一些態樣中，抗CD19抗體或其片段或偶聯物包含DT2219ARL。DT2219ARL係靶向CD19及CD22之雙特異性免疫毒素，其包含兩個scFv及截短白喉毒素。參見例如Hammer等人；及臨床試驗標識符第NCT00889408號。在一些實施例中，DT2219ARL可用於治療B細胞惡性病，例如B細胞白血病及淋巴瘤。 在一些實施例中，DT2219ARL係經靜脈內(例如以靜脈內輸注)投與。在一些實施例中，DT2219ARL係以約20-100 µg/kg (例如約20-40 µg/kg、40-60 µg/kg、60-80 µg/kg或80-100 µg/kg)之劑量投與。 在一些實施例中，DT2219ARL係以至少2天(例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、21天、28天、35天或更多天)之投藥間隔投與。在一些實施例中，DT2219ARL係以本文所述之劑量及投藥間隔持續一段時間(例如至少2週，例如至少2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、22週、24週、26週、28週、30週、40週、50週、60週或更多週、或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或更多個月、或1年、2年、3年、4年、5年或更多年)來投與。舉例而言，DT2219ARL係以本文所述之劑量及投藥間隔持續總共至少4個劑量/治療週期(例如，至少4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、18個、20個或更多個劑量/治療週期)投與。 在一些態樣中，抗CD19抗體或其片段或偶聯物包含SGN-CD19A。SGN-CD19A係包含連接至合成細胞毒性細胞殺死劑單甲基奧裡斯他汀F (MMAF)之抗CD19人類化單株抗體之抗體-藥物偶聯物(ADC)。參見例如Hammer等人；及臨床試驗標識符第NCT01786096號及第NCT01786135號。在一些實施例中，SGN-CD19A可用於治療B細胞ALL、NHL (例如，DLBCL、外套細胞淋巴瘤或濾泡性淋巴瘤)、柏基特氏淋巴瘤或白血病或B譜系淋巴母細胞性淋巴瘤(B-LBL)。 在一些實施例中，SGN-CD19A係經靜脈內(例如以靜脈內輸注)投與。在一些實施例中，SGN-CD19A係以約0.1-10 mg/kg (例如約0.1-0.3 mg/kg、0.3-0.6 mg/kg、0.6-1 mg/kg、1-2 mg/kg、2-3 mg/kg、3-4 mg/kg、4-5 mg/kg、5-6 mg/kg、6-7 mg/kg、7-8 mg/kg、8-9 mg/kg或9-10 mg/kg)之劑量投與。 在一些實施例中，SGN-CD19A係以至少7天(例如7天、14天、21天、28天、35天或更多天)之投藥間隔投與。舉例而言，SGN-CD19A係以至少1週(例如1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、24週、26週、28週、20週、22週、24週、26週、28週、30週或更多週)之投藥間隔投與。 在一些實施例中，SGN-CD19A係以本文所述之劑量及投藥間隔持續一段時間(例如至少2週，例如至少2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、22週、24週、26週、28週、30週、40週、50週、60週或更多週、或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或更多個月、或1年、2年、3年、4年、5年或更多年)來投與。舉例而言，SGN-CD19A係以本文所述之劑量及投藥間隔持續總共至少4個劑量/治療週期(例如，至少4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、18個、20個或更多個劑量/治療週期)投與。 在一些態樣中，抗CD19抗體包含MOR-208 (亦稱為XmAb-5574)。MOR-208係具有增強的FcγRIIIA結合之Fc經改造之抗CD19人類化單株抗體，其產生經改良之ADCC活性。參見例如臨床試驗.gov標識符第NCT01685008號、第NCT01685021號、第NCT02005289號及第NCT01161511號；Hammer等人；Woyach等人，Blood 124.24(2014)。在一些實施例中，MOR-208可用於治療NHL (例如，FL、MCL、DLBCL)、CLL、小淋巴球性淋巴瘤、前淋巴球性白血病或B細胞急性淋巴母細胞性白血病(B-ALL)。 在一些實施例中，MOR-208係經靜脈內(例如以靜脈內輸注)投與。在一些實施例中，MOR-208係以約0.3至12 mg/kg (例如約0.3-0.5 mg/kg、0.5-1 mg/kg、1-2 mg/kg、2-4 mg/kg、3-6 mg/kg、6-9 mg/kg或9-12 mg/kg)之劑量投與。 在一些實施例中，MOR-208係以至少2天(例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、14天、21天、28天、35天或更多天)之投藥間隔投與。舉例而言，MOR-208係以至少1週(例如1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、24週、26週、28週、20週、22週、24週、26週、28週、30週或更多週)之投藥間隔投與。 在一些實施例中，MOR-208係以本文所述之劑量及投藥間隔持續一段時間(例如至少1週，例如至少1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、22週、24週、26週、28週、30週、40週、50週、60週或更多週、或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或更多個月、或1年、2年、3年、4年、5年或更多年)來投與。舉例而言，MOR-208係以本文所述之劑量及投藥間隔持續總共至少4個劑量/治療週期(例如，至少4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、18個、20個或更多個劑量/治療週期)投與。 在一些態樣中，抗CD19抗體或其片段或偶聯物包含SAR3419。SAR3419係包含經由可裂解連接體偶聯至美登素(maytansine)衍生物之抗CD19人類化單株抗體之抗CD19抗體-藥物偶聯物(ADC)。參見例如Younes等人，J. Clin. Oncol. 30.2(2012): 2776-82；Hammer等人；臨床試驗標識符第NCT00549185號；及Blanc等人，Clin Cancer Res. 2011;17:6448-58。在一些實施例中，SAR3419可用於治療NHL (瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)及濾泡性小裂細胞性淋巴瘤)或B細胞ALL。 在一些實施例中，SAR3419係經靜脈內(例如以靜脈內輸注)投與。在一些實施例中，SAR3419係以約10-270 mg/m2 (例如約10-25 mg/m2 、25-50 mg/m2 、50-75 mg/m2 、75-100 mg/m2 、100-125 mg/m2 、125-150 mg/m2 、150-175 mg/m2 、175-200 mg/m2 、200-225 mg/m2 、225-250 mg/m2 或250-270 mg/m2 )之劑量投與。 在一些實施例中，SAR3419係以至少7天(例如7天、14天、21天、28天、35天或更多天)之投藥間隔投與。舉例而言，SAR3419係以至少1週(例如1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、24週、26週、28週、20週、22週、24週、26週、28週、30週或更多週)之投藥間隔投與。 在一些實施例中，SAR3419係以本文所述之劑量及投藥間隔持續一段時間(例如至少2週，例如至少2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、22週、24週、26週、28週、30週、40週、50週、60週或更多週、或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或更多個月、或1年、2年、3年、4年、5年或更多年)來投與。舉例而言，SAR3419係以本文所述之劑量及投藥間隔持續總共至少4個劑量/治療週期(例如，至少4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、18個、20個或更多個劑量/治療週期)投與。 在一些態樣中，抗CD19抗體包含XmAb-5871。XmAb-5871係Fc經改造之人類化抗CD19抗體。在一些實施例中，XmAb-5871可用於治療自體免疫疾病，例如狼瘡。參見例如Hammer等人。 在一些態樣中，抗CD19抗體包含MDX-1342，其係具有增強的ADCC之人類Fc經改造之抗CD19抗體。在一些實施例中，MDX-1342可用於治療CLL及類風濕性關節炎。參見例如Hammer等人。 在一些態樣中，抗CD19抗體包含AFM11。AFM11係靶向CD19及CD3之雙特異性抗體。在一些實施例中，AFM11可用於治療NHL (例如，DLBCL)、ALL或CLL。參見例如Hammer等人；及臨床試驗標識符第NCT02106091號。在一些實施例中，AFM11係以靜脈內輸注來投與。 在一些實施例中，本文所述之抗CD19抗體偶聯或以其他方式結合至治療劑，例如化學治療劑(例如，本文所述之化學治療劑)、肽疫苗(例如闡述於Izumoto等人，2008 J Neurosurg 108:963-971中)、免疫抑制劑(例如，本文所述之免疫抑制劑)或免疫燒蝕劑(例如，本文所述之免疫燒蝕劑)，例如環孢素、硫唑嘌呤、胺甲喋呤、麥考酚酯(mycophenolate)、FK506、坎帕斯、抗CD3抗體、細胞毒素、氟達拉濱、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228或細胞介素。 在一些實施例中，CD19抑制劑包括抗CD19 CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗CD19 CAR構築體之細胞。在實施例中，抗CD19 CAR構築體包含鼠類scFv序列。舉例而言，包含鼠類scFv序列之抗CD19 CAR構築體係PCT公開案WO2012/079000中所提供之CAR19構築體；US 7,446,190中所提供之CAR19構築體；WO2014/031687中所提供之CAR19構築體；或基因庫登錄號HM852952中所提供及本文以SEQ ID NO: 223提供之CAR19構築體。在一個實施例中，抗CD19結合域係WO2012/079000中所述之scFv。在一個實施例中，抗CD19結合域係US 7,446,190中所述之scFv。在一個實施例中，抗CD19結合域係WO2014/031687中所述之scFv。在一個實施例中，抗CD19結合域係基因庫登錄號HM852952中所述之scFv或與其至少95%、例如95%-99%一致之序列。在實施例中，抗CD19結合域係PCT公開案WO2012/079000中所提供之CAR構築體之一部分。在實施例中，抗CD19結合域係US 7,446,190中所提供之CAR構築體之一部分。在實施例中，抗CD19結合域係WO2014/031687中所提供之CAR構築體之一部分。在實施例中，抗CD19結合域係基因庫登錄號HM852952中所提供之CAR構築體之一部分。在一些情形下，CAR之抗CD19抗原結合域係與衍生出其之scFv鼠類序列相比經人類化之scFv抗體片段。舉例而言，CAR之抗CD19抗原結合域係人類化scFv抗體片段，例如如PCT公開案WO2014/153270中所述，該公開案以引用方式併入本文中。在實施例中，抗CD19結合域包含表11之至少一個(例如，2個、3個、4個、5個或6個)序列。 舉例而言，抗CD19 CAR表現細胞(例如CART)係藉由將CD19-CAR (其包含CD19結合域)改造至細胞(例如，T細胞或NK細胞)中、例如以與本文所述之CAR表現細胞組合投與來產生。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞於授受性療法之使用方法。 在另一態樣中，本文提供CAR表現細胞群體(例如CAR表現細胞)，其包含表現CD20 CAR及CD19 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD19 CAR之第二細胞。CD123 抑制劑 CD123亦稱為介白素-3受體之α-鏈(IL-3RA)。IL-3受體(IL-3R)係由α及β鏈構成之異二聚體。IL-3R係膜受體。IL-3Rα鏈係具有360個胺基酸殘基之醣蛋白。通常在一些白血病病症中觀察到CD123之異常。CD123在多種血液惡性病(例如急性骨髓性及B淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突贅瘤(BPDCN)及毛細胞白血病)中過表現。 本文提供CD123抑制劑及組合療法。CD123抑制劑包括(但不限於)小分子、重組蛋白、抗CD123 CAR表現細胞(例如CART)及抗CD123抗體(例如，抗CD123單或雙特異性抗體)及其片段。在一些實施例中，抗CD123抑制劑可用於治療本文所述之B細胞惡性病。在實施例中，CD123抑制劑係與CD20抑制劑(例如CD20 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞)組合投與。 在一個實施例中，CD123抑制劑係重組蛋白，例如包含CD123受體之天然配體(或片段)。舉例而言，重組蛋白係SL-401 (亦稱為DT388IL3; University of Texas Southwestern Medical Center)，其係包含融合至截短白喉毒素之人類IL-3之融合蛋白。參見例如Testa等人，Biomark Res. 2014; 2: 4；及臨床試驗標識符第NCT00397579號。 在另一實施例中，CD123抑制劑係抗CD123抗體或其片段。在一個實施例中，抗CD123抗體或其片段包含單株抗體，例如單特異性或雙特異性抗體或其片段。舉例而言，抗CD123抗體或其片段包含CSL360 (CSL Limited)。CSL360係結合至CD123之重組嵌合單株抗體。在一些實施例中，CSL360係經靜脈內(例如藉由靜脈內輸注)投與。舉例而言，CSL360係以0.1-10 mg/kg (例如0.1-0.5 mg/kg、0.5-1 mg/kg、1-5 mg/kg或5-10 mg/kg)之劑量投與。參見例如臨床試驗標識符第NCT01632852號；及Testa等人。 在另一實施例中，CD123抗體或其片段包含CSL362 (CSL Limited)。CSL362係靶向CD123且經最佳化以增強抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)之活化的人類化單株抗體。在一些實施例中，CSL362係經靜脈內(例如藉由靜脈內輸注)投與。在一些實例中，CSL362係以0.1-12 mg/kg (例如0.1-0.2 mg/kg、0.2-0.5 mg/kg、0.5-1 mg/kg、1-6 mg/kg或6-12 mg/kg)之劑量投與。參見例如臨床試驗標識符第NCT01632852號。 在一個實施例中，CD123抗體或其片段包含雙特異性抗體，例如MGD006 (MacroGenics)。MGD006係靶向CD123及CD3之雙特異性抗體。參見例如臨床試驗標識符第NCT02152956號。 在一些實施例中，CD123抑制劑偶聯或以其他方式結合至治療劑。 在一些實施例中，CD123抑制劑包括抗CD123 CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗CD123 CAR構築體或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之CD123結合CAR編碼之細胞。舉例而言，抗CD123 CAR表現細胞(例如CART)係藉由將CD123-CAR (其包含CD123結合域)改造至細胞(例如，T細胞或NK細胞)中、例如以與本文所述之CAR表現細胞組合投與來產生。在實施例中，抗CD123 CAR構築體包含scFv序列，例如US 2014/0322212 A1中所提供之scFv序列，該專利以引用方式併入本文中。在一個實施例中，抗CD123結合域係US 2014/0322212 A1中所述之scFv。在實施例中，抗CD123結合域係US 2014/0322212 A1中所提供之CAR構築體之一部分。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞於授受性療法之使用方法。 在另一態樣中，本文提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及CD123 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD123 CAR之第二細胞。 CD10抑制劑 分化簇10 (CD10)亦稱為腦啡肽酶、膜金屬-肽鏈內切酶(MME)、中性肽鏈內切酶(NEP)及急性淋巴母細胞性白血病共同抗原(CALLA)。CD10係由膜金屬-肽鏈內切酶(MME)基因編碼之酶。CD10係在前B表型之白血病細胞上表現且係急性淋巴球性白血病共同抗原。 本文亦提供CD10抑制劑及組合療法。CD10抑制劑包括(但不限於)小分子、重組蛋白、抗CD10 CAR表現細胞(例如CART)及抗CD10抗體(例如，抗CD10單或雙特異性抗體)及其片段。在一些實施例中，抗CD10抑制劑可用於治療本文所述之B細胞惡性病。在實施例中，CD10抑制劑係與CD20抑制劑(例如CD20 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞)組合投與。 在實施例中，CD10抑制劑包含小分子，例如沙庫比曲(sacubitril) (Novartis)、纈沙坦(valsartan)/沙庫比曲(Novartis)、奧馬曲拉(omapatrilat) (Bristol-Myers Squibb)、RB-101、UK-414,495 (Pfizer)或其醫藥上可接受之鹽或衍生物。 在實施例中，CD10抑制劑包含沙庫比曲(AHU-377; Novartis) (4-{[(2S ,4R )-1-(4-聯苯基)-5-乙氧基-4-甲基-5-側氧基-2-戊基]胺基}-4-側氧基丁酸)或其醫藥上可接受之鹽或衍生物。沙庫比曲之結構展示於下文中。
Figure 02_image003
在另一實施例中，CD10抑制劑包含纈沙坦/沙庫比曲(LCZ696; Novartis)或其醫藥上可接受之鹽或衍生物。纈沙坦/沙庫比曲係包含纈沙坦及沙庫比曲之1:1混合物之組合藥物。纈沙坦((S )-3-甲基-2-(N -{[2'-(2H -1,2,3,4-四唑-5-基)聯苯-4-基]甲基}戊醯胺基)丁酸)之結構展示於下文中。
Figure 02_image004
在實施例中，CD10抑制劑包含奧馬曲拉(Bristol-Myers Squibb) ((4S ,7S ,10aS )-5-側氧基-4-{[(2S )-3-苯基-2-硫基丙醯基]胺基}-2,3,4,7,8,9,10,10a-八氫吡啶并[6,1-b ] [1,3]硫氮呯-7-甲酸)或其醫藥上可接受之鹽或衍生物。奧馬曲拉之結構展示於下文中。
Figure 02_image005
在實施例中，CD10抑制劑包含RB-101 (N -(3-{[(2S )-2-胺基-4-(甲硫基)丁基]二硫基}-2-苄基丙醯基)-L-苯基丙胺酸苄基酯)或其醫藥上可接受之鹽或衍生物。RB-101之結構展示於下文中。
Figure 02_image007
在實施例中，CD10抑制劑包含UK-414,495 (Pfizer) ((R)-2-({1-[(5-乙基-1,3,4-噻二唑-2-基)胺甲醯基]環戊基}甲基)戊酸)或其醫藥上可接受之鹽或衍生物。UK-414,495之結構展示於下文中。
Figure 02_image008
在一些實施例中，CD10抑制劑偶聯或以其他方式結合至治療劑。 在一些實施例中，CD10抑制劑包括抗CD10 CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗CD10 CAR構築體或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之CD10結合CAR編碼之細胞。舉例而言，抗CD10 CAR表現細胞(例如CART)係藉由將CD10-CAR (其包含CD10結合域)改造至細胞(例如，T細胞或NK細胞)中、例如以與本文所述之CAR表現細胞組合投與來產生。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞於授受性療法之使用方法。 在另一態樣中，本文提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及CD10 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD10 CAR之第二細胞。 CD34抑制劑 分化簇34 (CD34)亦稱為造血祖細胞抗原CD34且係用作細胞-細胞黏著因子之細胞表面醣蛋白。CD34有時在一些癌症/腫瘤上表現，該等癌症/腫瘤係例如腺泡狀軟組織肉瘤、前B-ALL、AML、AML-M7、隆突性皮膚纖維肉瘤、胃腸基質瘤、巨細胞纖維母細胞瘤、粒細胞肉瘤、卡波西氏肉瘤、脂肪肉瘤、惡性纖維性組織細胞瘤、惡性周圍神經鞘瘤、顱內血管外皮細胞瘤、腦脊髓膜瘤、神經纖維瘤、神經鞘瘤及乳頭狀甲狀腺癌。 本文亦提供CD34抑制劑及組合療法。CD34抑制劑包括(但不限於)小分子、重組蛋白、抗CD34 CAR表現細胞(例如CART)及抗CD34抗體(例如，抗CD34單或雙特異性抗體)及其片段。在一些實施例中，抗CD34抑制劑可用於治療本文所述之B細胞惡性病。在實施例中，CD34抑制劑係與CD20抑制劑(例如CD20 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞)組合投與。 在實施例中，CD34抑制劑包含靶向CD34之單株抗體或其片段或包含抗CD34單株抗體或其片段之免疫脂質體。 在實施例中，CD34抑制劑包含抗體或其片段，例如My-10單株抗體或包含My-10單株抗體之免疫脂質體，如Mercadal等人，Biochim. Biophys. Acta. 1371.1(1998):17-23中所述。在一些實施例中，CD34抑制劑包含含有靶向CD34表現細胞之癌症藥物(例如多柔比星)之免疫脂質體，如Carrion等人，Life Sci. 75.3(2004):313-28中所述。在實施例中，CD34抑制劑包含針對CD34之單株抗體，如Maleki等人，Hum. Antibodies. 22(2013):1-8中所述。在另一實施例中，CD34抑制劑包含靶向CD34之單株抗體，如Maleki等人，Cell J. 16.3(2014):361-66中所述。 在一些實施例中，CD34抑制劑偶聯或以其他方式結合至治療劑。 在一些實施例中，CD34抑制劑包括抗CD34 CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗CD34 CAR構築體或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之CD34結合CAR編碼之細胞。舉例而言，抗CD34 CAR表現細胞(例如CART)係藉由將CD34-CAR (其包含CD34結合域)改造至細胞(例如，T細胞或NK細胞)中、例如以與本文所述之CAR表現細胞組合投與來產生。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞於授受性療法之使用方法。 在另一態樣中，本文提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及CD34 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD34 CAR之第二細胞。 FLT-3抑制劑 Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT-3) (亦稱為分化簇抗原135 (CD135)、受體型酪胺酸蛋白激酶FLT3或胎兒肝激酶-2 (Flk2))係受體酪胺酸激酶。FLT-3係細胞介素Flt3配體(FLT3L)之細胞介素受體。FLT-3在許多造血祖細胞之表面上表現且對於淋巴球發育至關重要。FLT3基因在白血病(例如急性骨髓性白血病(AML))中通常突變。 本文亦提供FLT-3抑制劑及組合療法。FLT-3抑制劑包括(但不限於)小分子、重組蛋白、抗FLT-3 CAR表現細胞(例如CART)及抗FLT-3抗體(例如，抗FLT-3單或雙特異性抗體)及其片段。在一些實施例中，抗FLT-3抑制劑可用於治療本文所述之B細胞惡性病。在實施例中，FLT-3抑制劑係與CD20抑制劑(例如CD20 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞)組合投與。 在一些實施例中，FLT-3抑制劑包含小分子，例如奎紮替尼(quizartinib) (Ambit Biosciences)、米哚妥林(midostaurin) (Technische Universitat Dresden)、索拉菲尼(Bayer and Onyx Pharmaceuticals)、舒尼替尼(Pfizer)、來他替尼(lestaurtinib) (Cephalon)或其醫藥上可接受之鹽或衍生物。 在一些實施例中，FLT-3抑制劑包含奎紮替尼(AC220; Ambit Biosciences)或其醫藥上可接受之鹽或衍生物。奎紮替尼係小分子受體酪胺酸激酶抑制劑。奎紮替尼(1-(5-(第三丁基)異噁唑-3-基)-3-(4-(7-(2-嗎啉基乙氧基)苯并[d ]咪唑并[2,1-b]噻唑-2-基)苯基)尿素)之結構展示於下文中。
Figure 02_image010
在一些實施例中，FLT-3抑制劑包含米哚妥林係(PKC412; Technische Universität Dresden)或其醫藥上可接受之鹽或衍生物。米哚妥林係蛋白激酶抑制劑，其為星狀孢菌素(一種來自根孢鏈黴菌(Streptomyces staurosporeus)之生物鹼)之半合成衍生物。 米哚妥林((9S ,10R ,11R ,13R )-2,3,10,11,12,13-六氫-10-甲氧基-9-甲基-11-(甲基胺基)-9,13-環氧基-1H ,9H -二吲哚并[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]吡咯并[3,4-j][1,7]苯并二氮雜環辛-1-酮)之結構展示於下文中。
Figure 02_image012
在一些實施例中，米哚妥林係例如以約25-200 mg (例如約25-50 mg、50-100 mg、100-150 mg或150-200 mg)之劑量經口投與。舉例而言，米哚妥林係例如以約25-200 mg每天兩次(例如約25-50 mg、50-100 mg、100-150 mg或150-200 mg每天兩次)之劑量經口投與。參見例如臨床試驗標識符第NCT01830361號。 在實施例中，FLT-3抑制劑包含索拉菲尼(Bayer and Onyx Pharmaceuticals)或其醫藥上可接受之鹽或衍生物。索拉菲尼係多種酪胺酸蛋白激酶(例如，VEGFR及PDGFR)、Raf激酶(例如，C-Raf及B-Raf)及一些細胞內絲胺酸/蘇胺酸激酶(例如C-Raf、野生型B-Raf及突變體B-Raf)之小分子抑制劑。參見例如labeling.bayerhealthcare.com/html/products/pi/Nexavar_PI.pdf。索拉菲尼(4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]胺甲醯基胺基]苯氧基]-N -甲基-吡啶-2-甲醯胺)之結構展示於下文中。
Figure 02_image014
在一些實施例中，FLT-3抑制劑包含舒尼替尼(先前稱為SU11248; Pfizer)或其醫藥上可接受之鹽或衍生物。舒尼替尼係抑制多種受體酪胺酸激酶(包括FLT3)之小分子經口藥物。舒尼替尼已經食品藥品管理局(FDA)批准用於治療腎細胞癌(RCC)及伊馬替尼抗性胃腸基質瘤(GIST)。舒尼替尼(N -(2-二乙基胺基乙基)-5-[(Z )-(5-氟-2-側氧基-1H-吲哚-3-亞基)甲基]-2,4-二甲基-1H -吡咯-3-甲醯胺)之結構展示於下文中。
Figure 02_image016
在一些實施例中，FLT-3抑制劑包含來他替尼(CEP-701; Cephalon)或其醫藥上可接受之鹽或衍生物。來他替尼係與星狀孢菌素結構相關之酪胺酸激酶抑制劑。來他替尼((9S ,10S ,12R )-2,3,9,10,11,12-六氫-10-羥基-10-(羥基甲基)-9-甲基-9,12-環氧基-1H -二吲哚并[1,2,3-fg :3',2',1'-kl ]吡咯并[3,4-i ][1,6]苯并二氮雜環辛-1-酮)之結構展示於下文中。
Figure 02_image018
在一些實施例中，來他替尼係例如以約40-100 mg每天兩次(例如約40-60 mg、50-70 mg、60-80 mg、70-90 mg或80-100 mg每天兩次)之劑量經口投與。參見例如臨床試驗標識符第NCT00079482號；或第NCT00030186號。 在一些實施例中，FLT-3抑制劑偶聯或以其他方式結合至治療劑。 在一些實施例中，FLT-3抑制劑包括抗FLT-3 CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗FLT-3 CAR構築體或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之FLT-3結合CAR編碼之細胞。舉例而言，抗FLT-3 CAR表現細胞(例如CART)係藉由將FLT-3-CAR (其包含FLT-3結合域)改造至細胞(例如，T細胞或NK細胞)中、例如以與本文所述之CAR表現細胞組合投與來產生。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞於授受性療法之使用方法。 在另一態樣中，本文提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及FLT-3 CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現FLT-3 CAR之第二細胞。 CD79b抑制劑 CD79b亦稱為免疫球蛋白相關β，其係B淋巴球抗原受體多聚複合物之組分。CD79b與另一輔助蛋白(稱為CD79a) (免疫球蛋白相關α)形成異二聚體，且該異二聚體與B細胞上之表面免疫球蛋白複合。CD79b對於B淋巴球抗原受體之組裝及表面表現至關重要。CD79b及CD79a對於前B細胞及B細胞發育至關重要。突變及異常CD79b表現出現在許多B-CLL細胞中且在B-CLL中可與B淋巴球抗原受體之表面表現損失及/或缺陷性信號傳導相關聯。參見例如Thompson等人，Blood 90.4(1997):1387-94。在一些情形下，CD79b之突變體形式或剪接變體之過表現與B-CLL及其他淋巴性惡性病中之B淋巴球抗原受體減少相關聯。參見例如Cragg等人，Blood 100.9(2002):3068-76。 本文提供CD79b抑制劑及組合療法。CD79b抑制劑包括(但不限於)小分子、重組蛋白、抗CD79b CAR表現細胞(例如CART)及抗CD79b抗體(例如，抗CD79b單或雙特異性抗體)及其片段。在一些實施例中，抗CD79b抑制劑可用於治療本文所述之B細胞惡性病。在實施例中，CD79b抑制劑係與CD20抑制劑(例如CD20 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞)組合投與。 在實施例中，CD79b抑制劑係抗CD79b抗體或其片段。在一個實施例中，抗79b抗體或其片段包含單株抗體，例如單特異性或雙特異性抗體或其片段。舉例而言，抗CD79b抗體或其片段包含泊拉妥珠單抗維多汀(polatuzumab vedotin) (Roche)，其係一種抗CD79b抗體藥物偶聯物。在實施例中，泊拉妥珠單抗維多汀用於治療癌症，例如NHL，例如濾泡性淋巴瘤或DLBCL，例如復發性或難治性濾泡性淋巴瘤或DLBCL。參見例如NCT02257567。在實施例中，抗CD79b抗體或其片段包含MGD010 (MacroGenics)，其係包含結合至CD32B及D79B之組分之雙特異性抗體。參見例如NCT02376036。 在一些實施例中，CD79b抑制劑偶聯或以其他方式結合至治療劑。 在一些實施例中，CD79b抑制劑包括抗CD79b CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗CD79b CAR構築體或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之CD79b結合CAR編碼之細胞。舉例而言，抗CD79b CAR表現細胞(例如CART)係藉由將CD79b-CAR (其包含CD79b結合域)改造至細胞(例如，T細胞或NK細胞)中、例如以與本文所述之CAR表現細胞組合投與來產生。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞於授受性療法之使用方法。 在另一態樣中，本文提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及CD79b CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD79b CAR之第二細胞。 CD79a抑制劑 CD79a亦稱為免疫球蛋白相關α。CD79a與CD79b異二聚化形成B淋巴球抗原受體多聚複合物之組分。CD79a在許多血液癌症(例如急性白血病(例如，AML)、B細胞淋巴瘤及骨髓瘤)中表現。 本文提供CD79a抑制劑及組合療法。CD79a抑制劑包括(但不限於)小分子、重組蛋白、抗CD79a CAR表現細胞(例如CART)及抗CD79a抗體(例如，抗CD79a單或雙特異性抗體)及其片段。在一些實施例中，抗CD79a抑制劑可用於治療本文所述之B細胞惡性病。在實施例中，CD79a抑制劑係與CD20抑制劑(例如CD20 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞)組合投與。 在實施例中，CD79a抑制劑係抗CD79a抗體或其片段。在一個實施例中，抗CD79a抗體或其片段包含單株抗體，例如單特異性或雙特異性抗體或其片段。舉例而言，抗CD79a抗體或其片段包含Polson等人，Blood 110.2(2007):616-23中所述之抗CD79a抗體或其片段，該文獻以引用方式併入本文中。舉例而言，抗CD79a抗體或其片段包含Polson等人，參見上文中所述之7H7、15E4或16C11抗體或其片段。 在一些實施例中，CD79a抑制劑偶聯或以其他方式結合至治療劑。 在一些實施例中，CD79a抑制劑包括抗CD79a CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗CD79a CAR構築體或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之CD79a結合CAR編碼之細胞。舉例而言，抗CD79a CAR表現細胞(例如CART)係藉由將CD79a-CAR (其包含CD79a結合域)改造至細胞(例如，T細胞或NK細胞)中、例如以與本文所述之CAR表現細胞組合投與來產生。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞於授受性療法之使用方法。 在另一態樣中，本文提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及CD79a CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD79a CAR之第二細胞。 CD179b抑制劑 CD179b亦稱為免疫球蛋白λ樣多肽1 (IGLL1)。CD179b係異二聚輕鏈與膜結合Ig μ重鏈複合之亞單位。輕鏈及重鏈一起形成前B細胞受體。CD179b之突變與B細胞缺失及無丙種球蛋白血症相關聯。CD179b在一些癌細胞(例如前體B細胞淋巴母細胞性淋巴瘤細胞)中表現。 本文提供CD179b抑制劑及組合療法。CD179b抑制劑包括(但不限於)小分子、重組蛋白、抗CD179b CAR表現細胞(例如CART)及抗CD179b抗體(例如，抗CD179b單或雙特異性抗體)及其片段。在一些實施例中，抗CD179b抑制劑可用於治療本文所述之B細胞惡性病。在實施例中，CD179b抑制劑係與CD20抑制劑(例如CD20 CAR表現細胞，例如本文所述之CAR表現細胞，例如表現包含鼠類、人類或人類化抗體結合域之CAR之細胞)組合投與。 在實施例中，CD179b抑制劑係抗CD179b抗體或其片段。在一個實施例中，抗179b抗體或其片段包含單株抗體，例如單特異性或雙特異性抗體或其片段。 在一些實施例中，CD179b抑制劑偶聯或以其他方式結合至治療劑。 在一些實施例中，CD179b抑制劑包括抗CD179b CAR表現細胞，例如CART，例如表現抗CD179b CAR構築體或由包含scFv、CDR或VH及VL鏈之CD179b結合CAR編碼之細胞。舉例而言，抗CD179b CAR表現細胞(例如CART)係藉由將CD179b-CAR (其包含CD179b結合域)改造至細胞(例如，T細胞或NK細胞)中、例如以與本文所述之CAR表現細胞組合投與來產生。本文亦提供本文所述之CAR表現細胞於授受性療法之使用方法。 在另一態樣中，本文提供CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)群體，其包含表現CD20 CAR及CD179b CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CAR表現細胞群體可包括表現CD20 CAR之第一細胞及表現CD179b CAR之第二細胞。CD20 抑制劑 本文提供CD20抑制劑及組合療法，例如一或多種CD20抑制劑。在一些實施例中，本文所述之方法及組合物(例如，CD20 CAR表現細胞)進一步包括第二CD20抑制劑。舉例而言，本文所述之CD20 CAR表現細胞係與第二CD20抑制劑組合投與。CD20抑制劑包括(但不限於) CD20 CAR表現細胞(例如CD20 CART細胞、CD20 CAR表現NK細胞)或抗CD20抗體(例如，抗CD20單或雙特異性抗體)或其片段。 在一個實施例中，第二CD20抑制劑係抗CD20抗體或其片段。在實施例中抗體係單特異性抗體，且在另一實施例中抗體係雙特異性抗體。在實施例中，CD20抑制劑係嵌合小鼠/人類單株抗體，例如利妥昔單抗。在實施例中，CD20抑制劑係人類單株抗體，例如奧法木單抗。在實施例中，CD20抑制劑係人類化抗體，例如歐瑞珠單抗(ocrelizumab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、奧卡妥珠單抗(ocaratuzumab)或PRO131921 (Genentech)。在實施例中，CD20抑制劑係包含抗CD20抗體之一部分之融合蛋白，例如TRU-015 (Trubion Pharmaceuticals)。 舉例而言，抗CD20抗體選自利妥昔單抗、奧法木單抗、歐瑞珠單抗、維妥珠單抗、奧妥珠單抗、TRU-015 (Trubion Pharmaceuticals)、奧卡妥珠單抗或Pro131921 (Genentech)。參見例如Lim等人，Haematologica. 95.1(2010):135-43。 在一些實施例中，抗CD20抗體包含利妥昔單抗。利妥昔單抗係結合至CD20且引起CD20表現細胞之細胞溶解之嵌合小鼠/人類單株抗體IgG1κ，例如如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf中所述。 在一些實施例中，利妥昔單抗係經靜脈內(例如以靜脈內輸注)投與。舉例而言，每一輸注提供約500-2000 mg (例如，約500-550 mg、550-600 mg、600-650 mg、650-700 mg、700-750 mg、750-800 mg、800-850 mg、850-900 mg、900-950 mg、950-1000 mg、1000-1100 mg、1100-1200 mg、1200-1300 mg、1300-1400 mg、1400-1500 mg、1500-1600 mg、1600-1700 mg、1700-1800 mg、1800-1900 mg或1900-2000 mg)之利妥昔單抗。 在一些實施例中，利妥昔單抗係以150 mg/m2 至750 mg/m2 (例如約150-175 mg/m2 、175-200 mg/m2 、200-225 mg/m2 、225-250 mg/m2 、250-300 mg/m2 、300-325 mg/m2 、325-350 mg/m2 、350-375 mg/m2 、375-400 mg/m2 、400-425 mg/m2 、425-450 mg/m2 、450-475 mg/m2 、475-500 mg/m2 、500-525 mg/m2 、525-550 mg/m2 、550-575 mg/m2 、575-600 mg/m2 、600-625 mg/m2 、625-650 mg/m2 、650-675 mg/m2 或675-700 mg/m2 )之劑量投與，其中m2 指示個體之體表面積。 在一些實施例中，利妥昔單抗係以至少4天(例如4天、7天、14天、21天、28天、35天或更多天)之投藥間隔投與。舉例而言，利妥昔單抗係以至少0.5週(例如0.5週、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週或更多週)之投藥間隔投與。 在一些實施例中，利妥昔單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔持續一段時間(例如至少2週，例如至少2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週或更多週)來投與。舉例而言，利妥昔單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔持續總共至少4個劑量/治療週期(例如，至少4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個或更多個劑量/治療週期)來投與。 在一些態樣中，抗CD20抗體包含奧法木單抗。奧法木單抗係分子量為約149 kDa之抗CD20 IgG1κ人類單株抗體。舉例而言，奧法木單抗係利用轉基因小鼠及雜交瘤技術產生且係自重組鼠類細胞系(NS0)表現及純化。參見例如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；及臨床試驗標識符第NCT01363128號、第NCT01515176號、第NCT01626352號及第NCT01397591號。 在一些實施例中，奧法木單抗係以靜脈內輸注來投與。舉例而言，每一輸注提供約150-3000 mg (例如，約150-200 mg、200-250 mg、250-300 mg、300-350 mg、350-400 mg、400-450 mg、450-500 mg、500-550 mg、550-600 mg、600-650 mg、650-700 mg、700-750 mg、750-800 mg、800-850 mg、850-900 mg、900-950 mg、950-1000 mg、1000-1200 mg、1200-1400 mg、1400-1600 mg、1600-1800 mg、1800-2000 mg、2000-2200 mg、2200-2400 mg、2400-2600 mg、2600-2800 mg或2800-3000 mg)之奧法木單抗。 在一些實施例中，奧法木單抗係以至少4天(例如4天、7天、14天、21天、28天、35天或更多天)之投藥間隔投與。舉例而言，奧法木單抗係以至少1週(例如1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、24週、26週、28週、20週、22週、24週、26週、28週、30週或更多週)之投藥間隔投與。 在一些實施例中，奧法木單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔持續一段時間(例如至少1週，例如1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、22週、24週、26週、28週、30週、40週、50週、60週或更多週、或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或更多個月、或1年、2年、3年、4年、5年或更多年)來投與。舉例而言，奧法木單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔持續總共至少2個劑量/治療週期(例如，至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、18個、20個或更多個劑量/治療週期)來投與。 在一些態樣中，抗CD20抗體包含歐瑞珠單抗。歐瑞珠單抗係人類化抗CD20單株抗體，例如如臨床試驗標識符第NCT00077870號、第NCT01412333號、第NCT00779220號、第NCT00673920號、第NCT01194570號及Kappos等人，Lancet. 19.378(2011):1779-87中所述。 在一些實施例中，歐瑞珠單抗係以靜脈內輸注來投與。舉例而言，每一輸注提供約50-2000 mg (例如，約50-100 mg、100-150 mg、150-200 mg、200-250 mg、250-300 mg、300-350 mg、350-400 mg、400-450 mg、450-500 mg、500-550 mg、550-600 mg、600-650 mg、650-700 mg、700-750 mg、750-800 mg、800-850 mg、850-900 mg、900-950 mg、950-1000 mg、1000-1100 mg、1100-1200 mg、1200-1300 mg、1300-1400 mg、1400-1500 mg、1500-1600 mg、1600-1700 mg、1700-1800 mg、1800-1900 mg或1900-2000 mg)之歐瑞珠單抗。 在一些實施例中，歐瑞珠單抗係以至少7天(例如7天、14天、21天、28天、35天或更多天)之投藥間隔投與。舉例而言，歐瑞珠單抗係以至少1週(例如1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、24週、26週、28週、20週、22週、24週、26週、28週、30週或更多週)之投藥間隔投與。 在一些實施例中，歐瑞珠單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔持續一段時間(例如至少2週，例如至少2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、22週、24週、26週、28週、30週、40週、50週、60週或更多週、或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或更多個月、或1年、2年、3年、4年、5年或更多年)來投與。舉例而言，歐瑞珠單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔持續總共至少4個劑量/治療週期(例如，至少4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、18個、20個或更多個劑量/治療週期)投與。 在一些態樣中，抗CD20抗體包含維妥珠單抗。維妥珠單抗係針對CD20之人類化單株抗體。參見例如臨床試驗標識符第NCT00547066號、第NCT00546793號、第NCT01101581號及Goldenberg等人，Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55。 在一些實施例中，維妥珠單抗係經皮下或靜脈內(例如以靜脈內輸注)投與。在一些實施例中，維妥珠單抗係以50-800 mg/m2 (例如約50-60 mg/m2 、60-70 mg/m2 、70-80 mg/m2 、80-90 mg/m2 、90-100 mg/m2 、100-110 mg/m2 、110-120 mg/m2 、120-130 mg/m2 、130-140 mg/m2 、140-150 mg/m2 、150-160 mg/m2 、160-170 mg/m2 、170-180 mg/m2 、180-190 mg/m2 、190-200 mg/m2 、200-225 mg/m2 、225-250 mg/m2 、250-275 mg/m2 、275-300 mg/m2 、300-325 mg/m2 、325-350 mg/m2 、350-375 mg/m2 、375-400 mg/m2 、400-425 mg/m2 、425-450 mg/m2 、450-475 mg/m2 、475-500 mg/m2 、500-525 mg/m2 、525-550 mg/m2 、550-575 mg/m2 、575-600 mg/m2 、600-625 mg/m2 、625-650 mg/m2 、650-675 mg/m2 、675-700 mg/m2 、700-725 mg/m2 、725-750 mg/m2 、750-775 mg/m2 或775-800 mg/m2 )之劑量投與。在一些實施例中，投與劑量為50-400 mg (例如50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、175 mg、200 mg、225 mg、250 mg、275 mg、300 mg、325 mg、350 mg、375 mg或400 mg)之維妥珠單抗。 在一些實施例中，維妥珠單抗係以至少7天(例如7天、14天、21天、28天、35天或更多天)之投藥間隔投與。舉例而言，維妥珠單抗係以至少1週(例如1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、24週、26週、28週、20週、22週、24週、26週、28週、30週或更多週)之投藥間隔投與。 在一些實施例中，維妥珠單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔持續一段時間(例如至少2週，例如至少2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、22週、24週、26週、28週、30週、40週、50週、60週或更多週、或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或更多個月、或1年、2年、3年、4年、5年或更多年)來投與。舉例而言，維妥珠單抗係以本文所述之劑量及投藥間隔持續總共至少4個劑量/治療週期(例如，至少4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、18個、20個或更多個劑量/治療週期)來投與。 在一些態樣中，抗CD20抗體包含GA101。GA101 (亦稱為奧妥珠單抗或RO5072759)係人類化及經醣基化改造之抗CD20單株抗體。參見例如Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96；臨床試驗標識符第NCT01995669號、第NCT01889797號、第NCT02229422號及第NCT01414205號；及www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf。 在一些實施例中，GA101係經靜脈內(例如以靜脈內輸注)投與。舉例而言，每一輸注提供約100-3000 mg (例如，約100-150 mg、150-200 mg、200-250 mg、250-500 mg、300-350 mg、350-400 mg、400-450 mg、450-500 mg、500-550 mg、550-600 mg、600-650 mg、650-700 mg、700-750 mg、750-800 mg、800-850 mg、850-900 mg、900-950 mg、950-1000 mg、1000-1200 mg、1200-1400 mg、1400-1600 mg、1600-1800 mg、1800-2000 mg、2000-2200 mg、2200-2400 mg、2400-2600 mg、2600-2800 mg或2800-3000 mg)之GA101。 在一些實施例中，GA101係以至少7天(例如7天、14天、21天、28天、35天或更多天)之投藥間隔投與。舉例而言，GA101係以至少1週(例如1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、24週、26週、28週、20週、22週、24週、26週、28週、30週或更多週)之投藥間隔投與。舉例而言，GA101係以至少1個月(例如1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或更多個月)之投藥間隔投與。在一些實施例中，GA101係以1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天之投藥間隔投與。 在一些實施例中，GA101係以本文所述之劑量及投藥間隔持續一段時間(例如至少1週，例如1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週、22週、24週、26週、28週、30週、40週、50週、60週或更多週、或1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或更多個月、或1年、2年、3年、4年、5年或更多年)來投與。舉例而言，GA101係以本文所述之劑量及投藥間隔持續總共至少2個劑量/治療週期(例如，至少2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、18個、20個或更多個劑量/治療週期)來投與。 在一些態樣中，抗CD20抗體包含AME-133v。AME-133v (亦稱為LY2469298或奧卡妥珠單抗)係針對CD20之人類化IgG1單株抗體，其具有與利妥昔單抗相比增加的FcγRIIIa受體親和力及增強的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性。參見例如Robak等人，BioDrugs 25.1(2011):13-25；及Forero-Torres等人，Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403。 在一些態樣中，抗CD20抗體包含PRO131921。PRO131921係經改造以具有與利妥昔單抗相比較佳的FcγRIIIa結合及增強的ADCC之人類化抗CD20單株抗體。參見例如Robak等人，BioDrugs 25.1(2011):13-25；及Casulo等人，Clin Immunol. 154.1(2014):37-46；臨床試驗標識符第NCT00452127號。在一些實施例中，PRO131921係經靜脈內(例如以靜脈內輸注)投與。在一些實施例中，PRO131921係以15 mg/m2 至1000 mg/m2 (例如約15-20 mg/m2 、20-25 mg/m2 、25-30 mg/m2 、30-35 mg/m2 、35-40 mg/m2 、40-45 mg/m2 、45-50 mg/m2 、50-55 mg/m2 、55-60 mg/m2 、60-65 mg/m2 、65-70 mg/m2 、70-75 mg/m2 、75-80 mg/m2 、80-85 mg/m2 、85-90 mg/m2 、90-95 mg/m2 、95-100 mg/m2 、100-125 mg/m2 、125-150 mg/m2 、150-175 mg/m2 、175-200 mg/m2 、200-226 mg/m2 、225-250 mg/m2 、250-300 mg/m2 、300-325 mg/m2 、325-350 mg/m2 、350-375 mg/m2 、375-400 mg/m2 、400-425 mg/m2 、425-450 mg/m2 、450-475 mg/m2 、475-500 mg/m2 、500-525 mg/m2 、525-550 mg/m2 、550-575 mg/m2 、575-600 mg/m2 、600-625 mg/m2 、625-650 mg/m2 、650-675 mg/m2 、675-700 mg/m2 、700-725 mg/m2 、725-750 mg/m2 、750-775 mg/m2 、775-800 mg/m2 、800-825 mg/m2 、825-850 mg/m2 、850-875 mg/m2 、875-900 mg/m2 、900-925 mg/m2 、925-950 mg/m2 、950-975 mg/m2 或975-1000 mg/m2 )之劑量投與，其中m2 指示個體之體表面積。 在一些態樣中，抗CD20抗體包含TRU-015。TRU-015係衍生自針對CD20之抗體之域的抗CD20融合蛋白。TRU-015小於單株抗體，但保留Fc介導之效應物功能。參見例如Robak等人，BioDrugs 25.1(2011):13-25。TRU-015含有連接至人類IgG1鉸鏈、CH2及CH3域之抗CD20單鏈可變片段(scFv)，但缺少CH1及CL域。在一些情形下，TRU-015係經靜脈內(例如以靜脈內輸注)投與。在一些實施例中，TRU-015係以0.01-30 mg/kg (例如0.01-0.015 mg/kg、0.015-0.05 mg/kg、0.05-0.15 mg/kg、0.15-0.5 mg/kg、0.5-1 mg/kg、1-1.5 mg/kg、1.5-2.5 mg/kg、2.5-5 mg/kg、5-10 mg/kg、10-15 mg/kg、15-20 mg/kg、20-25 mg/kg或25-30 mg/kg體重)之劑量投與。在一些實施例中，TRU-015係以至少1天(例如間隔1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天)之投藥間隔投與。參見例如Burge等人，Clin Ther. 30.10(2008):1806-16。 在一些實施例中，本文所述之抗CD20抗體偶聯或以其他方式結合至治療劑，例如化學治療劑(例如本文所述之化學治療劑，例如癌得星、氟達拉濱、組織蛋白去乙醯酶抑制劑、去甲基化劑、肽疫苗、抗腫瘤抗生素、酪胺酸激酶抑制劑、烷基化劑、抗微管或抗有絲分裂劑、CD20抗體或本文所述之CD20抗體藥物偶聯物)、抗過敏劑、抗噁心劑(或止吐藥)、止痛劑或本文所述之細胞保護劑。 在一個實施例中，抗原結合域CAR (例如，CD19、ROR1、CD20、CD22、CD123、CD10、CD34、FLT-3、CD79b、CD179b或CD79a抗原結合域)包含scFv部分，例如人類、人類化或鼠類scFv部分。scFv前面可為例如SEQ ID NO: 797中所提供之可選前導序列，且其後可為例如SEQ ID NO: 799或SEQ ID NO: 814或SEQ ID NO: 816中所提供之可選鉸鏈序列、例如SEQ ID NO: 801中所提供之跨膜區、包括SEQ ID NO: 803之細胞內信號傳導域及包括SEQ ID NO: 805或SEQ ID NO: 807之CD3ζ序列，例如其中該等域鄰接且處於同一閱讀框中以形成單一融合蛋白。 在一些實施例中，本發明涵蓋包含編碼CAR (例如，CD19 CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR、FLT-3 CAR、CD79b CAR、CD179b CAR或CD79a CAR)之核酸分子之重組核酸構築體，其中核酸分子包含編碼抗原結合域之核酸序列(例如本文所述，例如與編碼細胞內信號傳導域之核酸序列鄰接且處於同一閱讀框中)。可用於CAR中之實例性細胞內信號傳導域包括(但不限於)例如CD3-ζ、CD28、4-1BB及諸如此類之一或多個細胞內信號傳導域。在一些情況下，CAR可包含CD3-ζ、CD28、4-1BB及諸如此類之任一組合。 在一個實施例中，抗原結合域(例如，CD19、ROR1、CD20、CD22、CD123、CD10、CD34、FLT-3、CD79b、CD179b或CD79a抗原結合域)之特徵在於抗體或抗體片段之特定功能特徵或性質。舉例而言，在一個實施例中，包含抗原結合域之本發明之CAR組合物部分特異性結合人類B細胞抗原(例如，CD19、ROR1、CD20、CD22、CD123、CD10、CD34、FLT-3、CD79b、CD179b或CD79a)或其片段。在某些實施例中，scFv與前導序列鄰接且處於同一閱讀框中。在一個態樣中，前導序列係以SEQ ID NO:797提供之多肽序列。 在一個實施例中，抗原結合域係片段，例如單鏈可變片段(scFv)。在一個實施例中，抗原結合域係Fv、Fab、(Fab')2或雙功能(例如雙特異性)雜交抗體(例如，Lanzavecchia等人，Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987))。在一個態樣中，本發明之抗體及其片段以野生型或增強的親和力結合B細胞蛋白或其片段。在一些情況下，人類scFv可衍生自展示文庫。 在一個實施例中，抗原結合域(例如scFv)包含至少一個突變，使得突變scFv賦予CAR構築體經改良之穩定性。在另一實施例中，抗原結合域(例如scFv)包含至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個源自例如人類化過程之突變，使得突變scFv賦予CAR構築體經改良之穩定性。 在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括例如第一細胞，其表現包括初級細胞內信號傳導域之CAR (例如，CD19 CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR、FLT-3 CAR、CD79b CAR、CD179b CAR或CD79a CAR)；及第二細胞，其表現包括次級信號傳導域之CAR (例如，CD19 CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR、FLT-3 CAR、CD79b CAR、CD179b CAR或CD79a CAR)。 在一些實施例中，第一及第二CAR分子係在不同細胞(例如第一及第二細胞)中表現。 在一些實施例中，第一及第二CAR分子係在相同細胞(例如相同免疫效應細胞)中表現。 在一個實施例中，第一CAR分子係CD19 CAR且第二CAR分子係CD22。在一個實施例中，第一CAR分子係CD19 CAR且第二CAR分子係CD20。在一個實施例中，第一CAR分子係CD20 CAR且第二CAR分子係CD22。。在一些實施例中，相同細胞或不同細胞表現兩種CAR (例如，本文所述之CD19 CAR及CD20 CAR；本文所述之CD19 CAR及CD22 CAR；本文所述之CD20 CAR及本文所述之CD22 CAR；或兩種以上之CAR，例如本文所述之CD22 CAR、本文所述之CD20 CAR及本文所述之CD19 CAR。在一些實施例中，可將編碼一個以上CAR分子之核酸引入例如具有置於編碼第一與第二CAR分子之核酸之間的2A或IRES位點之單一載體上之細胞中，或可經由一種以上之載體(例如，包含編碼第一CAR之核酸序列之第一載體及包含編碼第二CAR之核酸序列之第二載體)引入。 醫藥組合物及治療 本發明之醫藥組合物可包含CAR表現細胞(例如複數個如本文所述之CAR表現細胞)與一或多種醫藥上或生理上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合。該等組合物可包含緩衝液，例如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水及諸如此類；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，例如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，例如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；及防腐劑。在一個態樣中，本發明組合物經調配以供靜脈內投與。 本發明之醫藥組合物可以適於欲治療(或預防)疾病之方式投與。投與之數量及頻率將由諸如患者之病況以及患者疾病之類型及嚴重程度等要素來確定，但適宜劑量可藉由臨床試驗來確定。 在一個實施例中，醫藥組合物實質上不含、例如無可檢測量之例如選自由以下組成之群之污染物：內毒素、微漿菌(mycoplasma)、複製勝任慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、殘餘抗CD3/抗CD28包覆之珠粒、小鼠抗體、所彙集之人類血清、牛血清白蛋白、牛血清、培養基組分、載體包裝細胞或質體組分、細菌及真菌。在一個實施例中，細菌係選自由以下組成之群中之至少一者：糞產鹼菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大腸桿菌、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)及A群釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes group A)。 當指示「免疫有效量」、「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，欲投與之本發明組合物之精確量可由醫師藉由考慮患者(個體)之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及病況之個體差異來確定。在一些實施例中，包含細胞(例如本文所述T細胞或NK細胞)之醫藥組合物可以104 至109 個細胞/kg體重、在一些情況下105 至106 個細胞/kg體重(包括彼等範圍內之所有整數值)之劑量來投與。在一些實施例中，細胞(例如本文所述之T細胞或NK細胞)可以3×104 個、1×106 個、3×106 個或1×107 個細胞/kg體重來投與。細胞組合物亦可以該等劑量投與多次。該等細胞可藉由利用免疫療法中通常已知之輸注技術來投與(參見例如Rosenberg等人，New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988)。 在某些態樣中，可期望向個體投與活化細胞(例如T細胞或NK細胞)，且然後隨後再抽取血液(或實施血球分離)，根據本發明活化來自其之細胞，且向患者再輸注該等活化及擴增之細胞。此過程可每隔幾週實施多次。在某些態樣中，細胞(例如T細胞或NK細胞)可自10cc至400cc之血液抽取物活化。在某些態樣中，細胞(例如T細胞或NK細胞)係自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc之血液抽取物活化。 標的組合物之投與可以任何方便方式實施，包括氣溶膠吸入、注射、攝取、輸液、植入或移植。本文所述之組合物可以下列方式投與患者：經動脈、皮下、皮內、腫瘤內、鼻內、髓內、肌內、靜脈內(i.v.)注射或腹膜內。在一個態樣中，本發明之細胞組合物(例如T細胞或NK細胞組合物)係藉由皮內或皮下注射投與患者。在一個態樣中，本發明之細胞組合物(例如T細胞或NK細胞組合物)係藉由i.v.注射來投與。細胞組合物(例如T細胞或NK細胞組合物)可直接注射至腫瘤、淋巴結或感染位點中。 在特定實例性態樣中，個體可經歷白血球分離，其中以離體方式收集、富集或清除白血球以選擇及/或分離所關注細胞(例如T或NK細胞)。該等細胞分離物(例如T細胞或NK細胞分離物)可藉由業內已知之方法來擴增並處理，使得可引入本發明之一或多個CAR構築體，由此產生本發明之CAR表現細胞，例如CAR T細胞或CAR表現NK細胞。隨後可使有需要之個體經歷使用高劑量化學療法然後進行末梢血幹細胞移植之標準治療。在某些態樣中，在移植後或同時，對個體輸注本發明之擴增CAR表現細胞。在另一態樣中，擴增細胞係在手術之前或之後投與。 在實施例中，例如在投與一或多個表現本文所述之CAR (例如本文所述之CD20結合CAR)之細胞之前，對個體實施淋巴清除。在實施例中，淋巴清除包含投與美法侖、癌得星、環磷醯胺及氟達拉濱中之一或多者。 欲投與患者之上述治療之劑量將隨所治療病況之精確性質及治療之接受者而變化。用於人類投與之劑量比例轉換可根據此技藝公認的實務做法來實施。例如，對於成年患者，治療劑(例如抗體，例如坎帕斯)之劑量通常可例如介於1 mg至約100 mg範圍內，例如每天投與1天與30天之間之時段。適宜日劑量係1 mg/天至10 mg/天，盡管在一些情況下可使用高達40 mg/天之較大劑量(闡述於美國專利第6,120,766號中)。 在一個實施例中，例如利用活體外轉錄將CAR引入細胞(例如T細胞或NK細胞)中，且個體(例如人類)接受本發明之CAR表現細胞(例如CAR T細胞或CAR表現NK細胞)之初始投與及本發明之CAR表現細胞(例如CAR T細胞或CAR表現NK細胞)之一或多次隨後投與，其中一或多次隨後投與係在先前投與後少於15天(例如14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天)時投與。在一個實施例中，向個體(例如人類)每週投與本發明之CAR表現細胞(例如CAR T細胞或CAR表現NK細胞)之一次以上的投與，例如每週投與本發明之CAR表現細胞(例如CAR T細胞或CAR表現NK細胞)之2次、3次或4次投與。在一個實施例中，個體(例如人類個體)每週接受CAR表現細胞(例如CAR T細胞或CAR表現NK細胞)之一次以上的投與(例如每週2次、3次或4次投與)(在本文中亦稱為週期)，其後一週不進行CAR表現細胞投與(例如CAR T細胞投與或CAR表現NK細胞投與)，及然後向個體投與CAR表現細胞(例如CAR T細胞或CAR表現NK細胞)之一或多次另外投與(例如CAR表現細胞(例如CAR T細胞或CAR表現NK細胞)之每週一次以上的投與)。在另一實施例中，個體(例如人類個體)接受一個以上週期的CAR表現細胞(例如CAR T細胞或CAR表現NK細胞)，且各週期間之時間少於10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。在一個實施例中，係以每隔一天每週3次投與來投與CAR表現細胞(例如CAR T細胞或CAR表現NK細胞)。在一個實施例中，將本發明之CAR表現細胞(例如CAR T細胞或CAR表現NK細胞)投與至少兩週、三週、四週、五週、六週、七週、八週或更多週。 在一些實施例中，個體可為成年個體(即，18歲及以上)。在某些實施例中，個體可介於1歲與30歲之間。在一些實施例中，個體為16歲或以上。在某些實施例中，個體介於16歲與30歲之間。在一些實施例中，個體為兒童個體(即，介於1歲與18歲之間)。 在一個態樣中，CAR表現細胞(例如CD20 CART)係利用慢病毒病毒載體(例如慢病毒)來產生。以該方式產生之CAR表現細胞(例如，CART)將具有穩定的CAR表現。 在一個態樣中，CAR表現細胞(例如CART)在轉導後4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天瞬時表現CAR載體。CAR之瞬時表現可藉由RNA CAR載體遞送來實現。在一個態樣中，藉由電穿孔將CAR RNA轉導至細胞(例如NK細胞或T細胞)中。 在多次治療後可在利用瞬時表現CAR T細胞或CAR表現NK細胞(特定而言使用帶有鼠類scFv之CAR表現細胞)治療之患者中出現之潛在問題係過敏反應。 不受限於此理論，人們認為此一過敏性反應可由發生體液抗CAR反應(即具有抗IgE同型之抗CAR抗體)之患者引起。人們認為當在暴露於抗原時存在10至14天中斷時，患者之產生抗體之細胞經歷自IgG同型(不會引起過敏反應)至IgE同型之類別轉換。 若患者在瞬時CAR療法進程期間具有產生抗CAR抗體反應之高風險(例如藉由RNA轉導產生之彼等)，則CART輸注中斷不應持續10至14天以上。 生物聚合物遞送方法 在一些實施例中，一或多個如本文所揭示之CAR表現細胞可經由生物聚合物支架(例如生物聚合物植入物)投與或遞送至個體。生物聚合物支架可支持或增強本文所述CAR表現細胞之遞送、擴增及/或分散。生物聚合物支架包含可為天然或合成之生物相容性(例如，實質上不引起發炎或免疫反應)及/或生物可降解聚合物。 適宜生物聚合物之實例包括(但不限於)任何濃度及任何比率之瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鹽、海藻酸鹽/磷酸鈣水泥(CPC)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、(1,2,3,4,6-五乙醯基a-D-半乳糖)、纖維素、甲殼質、幾丁聚糖、膠原、彈性蛋白、明膠、玻尿酸膠原、羥基磷灰石、聚(丁酸3-羥基酯-共-己酸3-羥基酯) (PHBHHx)、聚(交酯)、聚(己內酯) (PCL)、聚(交酯-共-乙交酯) (PLG)、聚氧化乙烯(PEO)、聚(乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)、聚氧化丙烯(PPO)、聚乙烯醇(PVA)、牛乳、大豆蛋白及大豆蛋白分離物單獨或與任何其他聚合物組合物之組合。生物聚合物可經促進黏著或遷移之分子(例如，結合至淋巴球之膠原受體之膠原模擬肽及/或刺激分子)加強或修飾，以增強欲遞送細胞之遞送、擴增或功能，例如抗癌活性。生物聚合物支架可為可注射的，例如凝膠或半固體或固體組合物。 在一些實施例中，在遞送至個體之前將本文所述之CAR表現細胞接種至生物聚合物支架上。在實施例中，生物聚合物支架進一步包含一或多種本文所述之其他治療劑(例如，另一CAR表現細胞、抗體或小分子)或增強CAR表現細胞之活性(例如，納入或偶聯至支架之生物聚合物)的藥劑。在實施例中，生物聚合物支架係經例如腫瘤內注射或手術植入腫瘤處或腫瘤附近，以足以調介抗腫瘤效應。生物聚合物組合物及其遞送方法之其他實例闡述於Stephan等人，Nature Biotechnology , 2015, 33:97-101；及WO2014/110591中。 CD20 CAR構築體 可用於實踐本發明之序列揭示於表1、表6、表11及表14中。在整個本申請案正文中，如本說明書正文(例如，表1)與序列表之間存在差異，則以本說明書正文為准。 分離出抗CD20單鏈可變片段。參見表1。將抗CD20 scFv選殖至包含CD3ζ鏈及4-1BB共刺激分子之慢病毒CAR表現載體中。參見表14。選殖方法進一步闡述於實例部分中。CD20 CAR之序列提供於下表1中。表1中之每一完整CAR胺基酸序列包括具有21個胺基酸之可選信號肽序列，對應於胺基酸序列：MALPVTALLLPLALLLHAARP。表1中之每一完整CAR核苷酸序列包括對應於前63個核苷酸之可選核苷酸信號肽序列，對應於核苷酸序列：ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC。表 1 . CD20 CAR 構築體
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Figure AA1-106
 表1之CD20 scFv域之重鏈可變域CDR (Kabat)序列之序列鑑別的綜述展示於表2中，且輕鏈可變域CDR (Kabat)序列之序列鑑別的綜述展示於表3中。SEQ ID NO係指在表1中發現之彼等。 表2. CD20抗體分子之重鏈可變域CDR (Kabat) SEQ ID NO
Figure 106134614-A0304-0001
 表3. CD20抗體分子之輕鏈可變域CDR (Kabat) SEQ ID NO
Figure 106134614-A0304-0002
 表4. CD20抗體分子之重鏈可變區SEQ ID NO
Figure 106134614-A0304-0003
 表5. CD20抗體分子之輕鏈可變區SEQ ID NO
Figure 106134614-A0304-0004
 然後將CAR scFv片段選殖至慢病毒載體中以產生呈單一編碼框之全長CAR構築體，且利用EF1α啟動子進行表現(SEQ ID NO: 833)。選殖方法進一步闡述於實例中。 VL及VH域在scFv中出現之順序可發生變化(即，VL-VH或VH-VL定向)，且其中三個或四個拷貝之「G4S」亞單位(其中每一亞單位包含序列GGGGS (SEQ ID NO: 834) (例如，(G4S)3 或(G4S)4 ))連接可變域以產生scFv域之整體，如例如表1中所展示。 CD22 CAR構築體 分離出抗CD22單鏈可變片段。參見表6。將抗CD22 scFv選殖至包含CD3ζ鏈及4-1BB共刺激分子之慢病毒CAR表現載體中。選殖方法進一步闡述於實例部分中。CD22 CAR之序列提供於下表6中。 表6. CD22 CAR構築體
Figure AA6
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 表6之CD22 scFv域之重鏈可變域CDR (Kabat)序列之序列鑑別的綜述展示於表7中，且輕鏈可變域CDR (Kabat)序列之序列鑑別的綜述展示於表8中。SEQ ID NO係指在表6中發現之彼等。 表7. CD22抗體分子之重鏈可變域CDR (Kabat) SEQ ID NO
Figure 106134614-A0304-0005
 表8. CD22抗體分子之輕鏈可變域CDR (Kabat)
Figure 106134614-A0304-0006
 表9. CD22抗體分子之重鏈可變區
Figure 106134614-A0304-0007
 表10. CD22抗體分子之輕鏈可變區
Figure 106134614-A0304-0008
 在一些實施例中，CD22 CAR包含scFv中VH與VL序列之間之短Gly-Ser連接體(例如，GGGGS連接體)，如構築體CD22-65s (例如表6)中所繪示。 在一些實施例中，CD22 CAR不具scFv中VH與VL序列之間之連接體序列，如構築體CD22-65ss (例如表6)中所繪示。 在另一實施例中，CD22 CAR相對於CD22-65s之胺基酸序列包含一或多個突變，例如VH及/或VL之FR區中之一或多個突變。在一個實施例中，CD22 CAR包含CD22-65s之VH區之胺基酸41處之突變(例如，CD22-65s之VH之41位Q經例如K取代)；及/或CD22-65s之VL之胺基酸40處之突變(例如，CD22-65s之VL之40位Q經例如D取代)。在一個實施例中，CD22CAR包含下文所繪示之CD22-65sKD之胺基酸序列。CD22-65s及CD22-65sKD之比對繪示於下文中。
Figure 02_image020
CD19 CAR構築體 在一個實施例中，CAR構築體之針對CD19之抗原結合域係抗原結合部分，例如以下文獻中所述之例如CAR (例如，CD19 CAR)、抗體或其抗原結合片段之CDR：PCT公開案WO2012/079000；PCT公開案WO2014/153270；Kochenderfer, J.N.等人，J. Immunother. 32 (7), 689-702 (2009)；Kochenderfer, J.N.等人，Blood, 116 (20), 4099-4102 (2010)；PCT公開案WO2014/031687；Bejcek, Cancer Research, 55, 2346-2351, 1995；或美國專利第7,446,190號，該等文獻各自係全文以引用方式併入本文中。 在一個實施例中，CD19 CAR包含在PCT公開案WO2012/079000中以SEQ ID NO: 12提供之胺基酸序列。在實施例中，胺基酸序列係 (MALPVTALLLPLALLLHAARP)diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: )或實質上與其同源之序列。信號肽之可選序列以大寫字母及括號展示。 在一個實施例中，胺基酸序列係： diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: )或實質上與其同源之序列。 在一個實施例中，CD19 CAR具有USAN標識TISAGENLECLEUCEL-T。在實施例中，CTL019係藉由穩定插入來調介之T細胞之基因修飾經由在EF-1α啟動子控制下用含有CTL019轉基因之自失活複製缺陷性慢病毒(LV)載體轉導而製得。CTL019可為基於轉基因陽性T細胞%遞送至個體之轉基因陽性及陰性T細胞之混合物。 在一些實施例中，CD19 CAR包含WO2014/153270之表3之抗原結合域(例如，人類化抗原結合域)，該專利以引用方式併入本文中。 鼠類CD19抗體之人類化期望用於臨床環境，其中小鼠特異性殘基可在接受CART19治療(即用經CAR19構築體轉導之T細胞治療)之患者中誘導人類抗小鼠抗原(HAMA)反應。人類化CD19 CAR序列之產生、表徵及效能闡述於國際申請案WO2014/153270中，該申請案係全文以引用方式併入本文中，包括實例1-5 (第115-159頁)，例如表3、4及5 (第125-147頁)。在一個實施例中，CD19 CAR包括WO2014/153270之表3之CAR分子或抗原結合域(例如，人類化抗原結合域)，該專利以引用方式併入本文中。編碼CD19 CAR分子及抗原結合域(例如根據Kabat或Chothia，包括一個、兩個、三個VH CDR；及一個、兩個、三個VL CDR)之胺基酸及核苷酸序列指定於WO2014/153270中。在實施例中，CD19 CAR或抗原結合域包含WO2014/153270 (以引用方式併入本文中)中所展示之胺基酸或具有WO2014/153270中所展示之核苷酸序列，或與任一上述序列實質上一致(例如，與任一上述序列至少85%、90%、95%或更大一致)之序列。 在一些實施例中，CD19 CAR構築體闡述於PCT公開案WO 2012/079000 (以引用方式併入本文中)中，且鼠類CD19 CAR及scFv構築體之胺基酸序列或與任一上述序列實質上一致之序列(例如，與本文所述之任一序列至少85%、90%、95%或更大一致)展示於下表11中。 表11. CD19 CAR構築體
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 含有人類化抗CD19 scFv域之CD19 CAR構築體闡述於PCT公開案WO 2014/153270中，該公開案以引用方式併入本文中。 抗CD19 scFv域之鼠類及人類化CDR序列之重鏈可變域序列展示於表12中，且輕鏈可變域序列展示於表13中。SEQ ID NO係指在表11中發現之彼等。在一些實施例中，鼠類或人類化CD19結合域之HCDR1係GVSLPDYGVS。 表12. CD19抗體之重鏈可變域CDR (Kabat) SEQ ID NO
Figure 106134614-A0304-0009
 表13. CD19抗體之輕鏈可變域CDR (Kabat) SEQ ID NO
Figure 106134614-A0304-0010
 一般CAR序列 可用於產生CAR之序列提供於下表14中。 表14. CAR組分之序列
Figure 106134614-A0304-0011
 CD19及CD22串聯CAR構築體 產生包含兩個靶向CD19及CD22之不同scFv之串聯CAR。所產生抗CD19 scFv及抗CD22 scFv構築體包括兩種不同連接體：LAEAAAK (SEQ ID NO: 838)及GGGGS。串聯CAR之產生及評估進一步闡述於實例13中。靶向CD22及CD19之單一CAR之序列提供於下表15中。 表15. 靶向CD22及CD19之單一CAR之胺基酸及核酸序列.
Figure AA15
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 實例 藉由參考以下實驗實例進一步詳細闡述本發明。除非另有說明，否則該等實例係僅出於說明目的而提供，且並不意欲具有限制性。因此，本發明決不應理解為限於以下實例，而應理解為涵蓋因本文所提供之教示而變得明瞭之任何及所有變化形式。 未加進一步闡述，人們認為，熟習此項技術者可使用前文描述及以下說明性實例來製備及利用本發明化合物並實踐所主張之方法。以下工作實例明確指出本發明之多個態樣，且不應理解為以任何方式限制本發明之其餘部分。實例 1 ：小鼠抗人類 CD20 單株抗體之產生 藉由基於細胞之免疫方法產生並選擇針對人類CD20靶之單株抗體組(Proetzel G, Ebersbach H及Zhang C., Methods Mol Biol, 901:1-10, 2012)。使人類CD20在小鼠前B細胞系300-19細胞之表面上轉染及表現。使用經CD20轉染之300-19細胞作為抗原用於免疫小鼠及在細胞融合後用於後續篩選特異性雜交瘤抗體。 根據經IACUC批准之標準動物使用方案(12 NBC 059)實施動物免疫及樣品收集。簡言之，用經人類CD20轉染之300-19細胞免疫5-6週齡之雌性Balb/c VAF小鼠(Charles River Laboratories)。用100 µL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)/動物中之約5×106 個細胞將小鼠皮下免疫4次。每2-3週實施注射以在動物中形成免疫反應。用於雜交瘤產生之細胞融合之前3天，用相同劑量之基於細胞之抗原對小鼠實施腹膜內加強免疫，且在細胞融合當天在滅菌手術條件下進行安樂死用於脾收集。 使用經免疫小鼠之脾來製備RPMI-1640培養基中之單細胞懸浮液。使脾細胞沈澱且用RPMI-1640培養基洗滌兩次。對於細胞融合以產生雜交瘤純系，將脾細胞與鼠類骨髓瘤P3X63Ag8.653細胞混合且利用聚乙二醇-1500作為促融劑根據標準融合方案(Zhang C., Methods Mol. Biol. 901:117-135, 2012)融合(Kearney J.F.等人，1979. J. Immunol., 123:1548-1550)。在細胞融合及離心後，將細胞懸浮於含有次黃嘌呤-胺喋呤-胸苷(HAT)補充物(Sigma H-0262)之完全RPMI-1640培養基(200 mL/脾)中，且以200 μL細胞懸浮液/孔平鋪於96孔平底板(Corning-Costar 3596)中。 在37℃、5% CO2 下培育3-4天後，自板之每一孔移除100 µL培養物上清液且更換為等體積之含有次黃嘌呤-胸苷(HT)補充物之(Sigma H-0137)完全RPMI-1640培養基。繼續在37℃下在5% CO2 氣氛中培育板直至雜交瘤純系生長成足夠大之群落用於抗體篩選。 雜交瘤篩選、次選殖及選擇 在融合後第2週雜交瘤細胞生長至板孔之一半鋪滿且培養物上清液變成橙色時，自培養板對雜交瘤上清液取樣以藉由免疫螢光流式細胞術進行抗體篩選。對於初步篩選，藉由流式細胞術利用經人類CD20轉染之300-19細胞對未經轉染之300-19細胞分析雜交瘤上清液。簡言之，將經人類CD20轉染之300-19細胞或未經轉染之細胞分別與50 μL雜交瘤上清液一起培育，然後用螢光黃-AffiniPure Fab片段山羊抗小鼠IgG (H+L)偶聯物標記且藉由流式細胞術及Becton Dickinson FACSCalibur以自動模式進行分析。 藉由流式細胞分析，自培養板鑑別且選擇與經人類CD20轉染之300-19細胞反應但不與未經轉染之300-19細胞反應之雜交瘤純系。在T12板中擴增期望雜交瘤純系以供進一步表徵。藉由限制性稀釋及藉由用Cellavista成像系統挑選單一群落次選殖所關注雜交瘤純系以獲得產生CD20特異性抗體之單株群體。在T12板中擴增所選雜交瘤次純系且冷凍用於低溫保藏或用於單株抗體產生。藉由利用市售同型試劑測試衍生自雜交瘤純系之特異性單株抗體之同型以確定抗體性質。 基於篩選結果，自用人類CD20抗原免疫小鼠鑑別且選擇19個人類CD20特異性雜交瘤純系組(數據未展示)。在人類腫瘤組織或細胞系上進一步測試雜交瘤抗體以鑑別出優勢純系用於抗體測序及基於其結合特徵及生物性質人類化。實例 2 ：小鼠 scFv 之人類化 根據熟習此項技術者所熟知之標準方法對優勢純系進行人類化(Jones等人，Nature, 321: 522-525, 1986；Reichmann等人，Nature, 332: 323-329, 1988；Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992)。 抗原結合位點包含互補決定區(CDR)及CDR外(即直接或間接影響結合之可變域(VL及VH)之框架區中)之位置。可直接影響結合之框架殘基可例如發現於位於CDR2與CDR3之間之所謂的「外」環區。間接影響結合之殘基例如發現於所謂的標區(Foote及Winter，1992)。人們認為其支持CDR構形。當選擇適宜受體框架來最小化最終人類化抗體與框架區中之人類種系受體序列之偏差數時，將CDR外之彼等位置考慮在內。實例 3 ：帶有人類化抗 CD20 scFv 之 CART 之分析及活體外活性 將如上文實例中所述產生之特異性針對CD20之人類化鼠類單鏈可變片段(scFv)選殖至包含CD3ζ鏈及4-1BB刺激分子之慢病毒CAR表現載體中；CD20-C2H1、CD20-C2H2、CD20-C2H3、CD20-C2H4、CD20-C3H1、CD20-C3H2、CD20-C3H3、CD20-C3H4、CD20-C5H1、CD20-C5H2、CD20-C5H3、CD20-C5H4、CD20-C8H1、CD20-C8H2、CD20-C8H3及CD20-C8H4。基於所公開CAR之scFv (Jensen等人，Mol. Ther., 2000，其以引用方式併入本文中)，納入大鼠scFv源CAR CD20-3及其人類化衍生物CAR-CD20-3m、CAR-CD20-3J、CAR-CD20-3H5k1及CAR-CD20-3H5k3以及CD20-8aBBz CAR作為對照。另外，構築CAR，其係基於奧法木單抗單株抗體(CD20-Ofa) (CAS登記號：679818-59-8，藥物庫登錄號：DB06650)之可變區。所有CD20 CAR示於表1中。基於該等CD20 CAR轉導之T細胞(「CD20 CART」或「CD20 CAR T細胞」)因應CD20表現(「CD20+」或「CD20陽性」)靶之效應T細胞反應之數量及品質選擇最佳構築體。效應T細胞反應包括(但不限於)細胞擴增、增殖、倍增、細胞介素產生及靶細胞殺死或細胞溶解活性(脫粒)。 CD20 CAR慢病毒之產生 使用人類化scFv編碼慢病毒轉移載體產生包裝於VSVg假型慢病毒粒子中之基因體材料。將編碼CAR之慢病毒轉移載體DNA與三種包裝組分VSVg、gag/pol及rev及lipofectamine試劑之組合混合以轉染Lenti-X 293T細胞(Clontech)，然後在12 - 18h後更換培養基。在更換培養基後30小時，收集培養基，過濾且儲存在-80℃下。 或者，在96孔板中以自動化小規模方式產生編碼CD20 CAR之慢病毒，其中使用新鮮未冷凍之含有病毒之上清液來轉導Jurkat T細胞報導基因細胞系。 CD20 CAR JNL細胞之產生 Jurkat NFAT螢光素酶(JNL)報導基因細胞系係基於急性T細胞白血病系Jurkat (RRID: CVCL_0367)。該系經修飾以在活化T細胞核因子(NFAT)反應元件之控制下表現螢光素酶。對於用CD20 CAR轉導，用50 µl新鮮的含有45 µm過濾之病毒之上清液轉導96孔板之10,000個JNL細胞/孔。將板在2000 rpm下旋轉3 min且培養4天。 評估CD20 CAR重定向JNL細胞之效能 為評估CD20 CAR活化JNL細胞之功能能力，將其與靶癌細胞共培養以藉由量化螢光素酶表現讀出其活化。比較基於人類化scFv之CAR CD20-C2H1、CAR CD20-C2H2、CAR CD20-C2H3、CAR CD20-C2H4、CAR CD20-C3H1、CAR CD20-C3H2、CAR CD20-C3H3、CAR CD20-C3H4、CAR CD20-C5H1、CAR CD20-C5H2、CAR CD20-C5H3、CAR CD20-C5H4、CAR CD20-C8H1、CAR CD20-C8H2、CAR CD20-C8H3及CAR CD20-C8H4與CD20-8aBBz及CD20-3、CD20-3m、CD20-3J、CD20-3H5k3及CD20-3H5k1。在所有分析中使用對照CAR CD20-3及CD20-8aBBz來比較分析變化及/或用作對照。使用EGFRvIII CAR T細胞(CAR 2174, Johnson等人，Science Translational Medicine 2015)作為非靶向對照。 將JNL CART細胞與柏基特氏淋巴瘤系Raji (RRID: CVCL_0511)及瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)系Pfeiffer (RRID: CVCL_3326)、HBL-1 (RRID: CVCL_4213)及TMD8 (RRID: CVCL_A442)共培養；慢性骨髓性白血病(CML)細胞系K562 (RRID: CVCL_0004)用作CD20陰性對照。在384孔板中以4:1、2:1、1:1及0.5:1之效應物對靶(E:T)比率設置共培養物且培育24h，此後藉由britelite plus報導基因分析系統(PerkinElmer, Waltham, MA)量化活化JNL CAR T細胞對螢光素酶之表現。自每孔發射之光之量(發光)係各別CAR之JNL活化之直接讀數。所有四個CD20陽性靶細胞系展示所有人類化CD20 CAR之活化(圖1A-D)。鼠類scFv之人類化不會產生與CD20之結合損失。融合至CAR之跨膜及信號傳導域之一些人類化scFv看上去已改良CAR活化JNL T細胞之效能。該等人類化scFv係CD20-C2H1、CD20-C2H3、CD20-C5H1、CD20-C5H2及CD20-C8H3。人類化小鼠CAR皆不展示CD20陰性系K562之活化(圖1E)。 CD20 CAR T細胞之產生 基於上文所述JNL報導基因分析之結果，選擇以下CAR來分析在原代T細胞中之效能：CD20-C2H1、CD20-C2H3、CD20-C3H2、CD20-C3H3、CD20-C5H1、CD20-C5H2及CD20-C8H2。另外，添加CD20-Ofa及對照CD20-8aBBz及CD20-3H5k3。藉由自健康血球分離之供體之血液開始產生CD20 CAR T細胞，該等供體之幼稚T細胞係藉由針對T細胞、CD4+及CD8+淋巴球進行負向選擇來獲得。藉由在T細胞培養基(RPMI-1640、10%熱不活化胎牛血清(FCS)、2 mM L-麩醯胺酸、1×青黴素/鏈黴素、100 μM非必需胺基酸、1 mM丙酮酸鈉、10 mM Hepes及55 μM 2-巰基乙醇)中以1:3 (T細胞對珠粒)之比率添加CD3/CD28珠粒(Dynabeads®人類T-擴增劑CD3/CD28, Thermo Fisher Scientific)來活化該等細胞。在37℃、5% CO2 下以24孔板之每孔1 mL培養基中之0.5×106 個T細胞培養T細胞。24小時後，當T細胞破裂時，添加0.5 mL未濃縮或較小體積之濃縮病毒上清液；以感染複數(MOI) 5轉導T細胞。T細胞開始以對數生長模式分裂，此係藉由量測細胞計數/mL來監測，且每兩天將T細胞稀釋於新鮮培養基中。在約10天後T細胞開始休眠；減緩生長速率及減小T細胞大小(接近350 fL)之組合決定欲低溫保藏用於後續分析之T細胞之狀態。所有CD20 CAR T細胞皆係在研究級(即，非臨床級)製造條件下產生。 在低溫保藏之前，在FACS Fortessa (BD)上藉由流式細胞分析測定經轉導細胞(在細胞表面上表現CD20特異性CAR)之百分比。病毒轉導展示相當表現量，此指示各別CAR之相似轉導效率(經轉導細胞%，圖2)以及表面表現(平均螢光強度，MFI)；且CD20-Ofa CAR展示最低表現量(MFI 1370對2200至4420)。CAR T細胞培養物之細胞計數指示，與未經轉導之T細胞(「UTD」)相比，帶有人類scFv之CAR-CD20對細胞正常擴增之能力無可檢測到之負面效應。 評估CD20 CAR重定向T細胞之效能. 為評估CD20 CAR T細胞之功能能力，將如上文所述產生之細胞解凍，計數且與靶癌細胞共培養以讀出其殺死能力、細胞介素分泌以及增殖。除帶有人類化scFv之CAR CD20-C2H1、CAR CD20-C2H3、CAR CD20-C3H2、CAR CD20-C3H3、CAR CD20-C5H1、CAR CD20-C5H2及CAR CD20-C8H2外，使用CD20-Ofa CAR以及對照CD20-8aBBz及CD20-3H5k3作為對照。使用EGFRvIII CAR及未經轉導之T細胞(UTD)作為非靶向T細胞對照。 為量測CD20 CAR T細胞因應CD20表現靶細胞之細胞介素產生，將CAR T細胞與柏基特氏淋巴瘤系Raji及瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)系Pfeiffer、HBL-1及TMD8共培養；慢性骨髓性白血病(CML)細胞系K562用作CD20陰性對照。以1:1之效應物:靶比率及96孔板之每孔25,000個細胞將細胞培養24 h，此後移除培養基，利用V-PLEX人類IFN-γ套組(Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD)進行細胞介素分析以供細胞介素量化。數據展示，大多數人類化小鼠CD20 CART以及CD20-8aBBz、CD20-Ofa及CD20-3H5k3 CART在與CD20陽性靶細胞系Raji、Pfeiffer、HBL1及TMD8一起培養時產生IFN-γ (圖3A及B)。CD20-C3H2及CD20-C3H3係最高細胞介素產生者，其量相似或高於CD20-8aBBz。CD20 CART在暴露於對照K562細胞後產生之細胞介素含量係無法檢測的(圖3A及B)，此指示無CD20 CAR之非特異性活化。 結論 在此處測試之所有人類化CD20特異性CAR皆以充分類似之方式在原代人類T細胞之細胞表面上表現。CD20-C2H1、CD20-C2H3、CD20-C3H2、CD20-C3H3、CD20-C5H1、CD20-C5H2及CD20-C8H2以與對照CD20-8aBBz及CD20-3H5k類似之方式表現；僅CD20-Ofa展示較低表現量。在JNL T細胞報導基因分析中，所有CD20 CAR T細胞展示相似的CD20特異性反應性。關於原代人類T細胞之IFN-γ產生，CD20-C3H2及CD20-C3H3展示與CD20-8aBBz相比稍佳或至少相等之功能。總之，與CD20陰性細胞系K562相比，轉移CD20 CAR誘導抗CD20反應性，但未檢測到脫靶功能。實例 4 ：帶有人類抗 CD22 scFv 之 CART 之分析及活體外活性 將抗CD22抗體之單鏈可變片段選殖至包含CD3ζ鏈及4-1BB刺激分子之慢病毒CAR表現載體中；比較CD22-57、CD22-58、CD22-59、CD22-60、CD22-61、CD22-62、CD22-63、CD22-64及CD22-65與CD22-53。所有CD22 CAR示於表6中。基於該等CD22 CAR轉導之T細胞(「CD22 CART」或「CD22 CAR T細胞」)因應CD22表現(「CD22+」)靶之效應T細胞反應之數量及品質來選擇最佳構築體。效應T細胞反應包括(但不限於)細胞擴增、增殖、倍增、細胞介素產生及靶細胞殺死或細胞溶解活性(脫粒)。 CD22 CAR T細胞之產生 使用人類scFv編碼慢病毒轉移載體產生包裝於VSVg假型慢病毒粒子中之基因體材料。將編碼CAR之慢病毒轉移載體DNA與三種包裝組分VSVg、gag/pol及rev及lipofectamine試劑之組合混合以轉染Lenti-X 293T細胞(Clontech)，然後在12 - 18h後更換培養基。在更換培養基後30小時，收集培養基，過濾且儲存在-80℃下。 藉由自健康血球分離之供體之血液開始產生CD22 CAR T細胞，該等供體之幼稚T細胞係藉由針對T細胞、CD4+及CD8+淋巴球進行負向選擇來獲得。藉由在37℃、5% CO2 下在T細胞培養基(RPMI1640、10%熱不活化胎牛血清(FCS)、2 mM L-麩醯胺酸、1×青黴素/鏈黴素、100 μM非必需胺基酸、1 mM丙酮酸鈉、10 mM Hepes及55 μM 2-巰基乙醇)中以1:3 (T細胞對)之比率添加CD3/CD28珠粒(Dynabeads®人類T-擴增劑CD3/CD28, Thermo Fisher Scientific)來活化該等細胞。以24孔板之每孔1 mL培養基中之0.5×106 個T細胞培養T細胞。24小時後，當T細胞破裂時，添加0.5 mL未濃縮或較小體積之濃縮病毒上清液；以感染複數(MOI) 5轉導T細胞。T細胞開始以對數生長模式分裂，此係藉由量測細胞計數/mL來監測，且每兩天將T細胞稀釋於新鮮培養基中。在約10天後T細胞開始休眠時，對數生長有所減弱。減緩生長速率及減小T細胞大小(接近約350 fL)之組合決定欲低溫保藏用於後續分析之T細胞之狀態。所有CD22 CAR T細胞皆係在研究級(即，非臨床級)製造條件下產生。 在低溫保藏之前，在FACS Fortessa (BD)上藉由流式細胞分析測定經轉導細胞(在細胞表面上表現CD22特異性CAR)之百分比。病毒轉導展示相當表現量，此指示各別CAR之相似轉導效率(經轉導細胞%，圖4)以及表面表現(平均螢光強度，MFI)。僅CD22-58展示較低表現量(MFI= 5,700，與其他CAR之＞20,000相比)。CAR T細胞培養物之細胞計數指示，與未經轉導之T細胞(「UTD」)相比，帶有人類scFv之CAR-CD22對細胞正常擴增之能力無可檢測到之負面效應。 評估CD22 CAR重定向T細胞之效能. 為評估CD22 CAR T細胞之功能能力，將如上文所述產生之細胞解凍，計數且與靶癌細胞共培養以讀出其殺死能力、細胞介素分泌以及增殖。除帶有人類scFv之CAR CD22-57、CD22-58、CD22-59、CD22-60、CD22-61、CD22-62、CD22-63、CD22-64及CD22-65外，使用CAR CD22-53作為對照。在所有分析中使用對照CAR CD22-53來比較分析變化及/或用作對照。使用EGFRvIII CAR及未經轉導之T細胞(UTD)作為非靶向T細胞對照。 T細胞殺死係針對急性淋巴母細胞性白血病(ALL)系Nalm6 (RRID: CVCL_0092)及SEM (RRID: CVCL_0095)；慢性骨髓性白血病(CML)細胞系K562 (RRID: CVCL_0004)用作CD22陰性對照。所有細胞系經轉導以表現作為細胞活力/殺死之報導基因之螢光素酶。在20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.63:1及0.31:1之效應物:靶細胞比率(E:T)滴定下量測CD22 CART之細胞溶解活性。藉由混合各別數目之T細胞與恆定數目之靶細胞(96孔板之每孔25,000個細胞)來起始分析。20小時後，藉由添加Bright-Glo™螢光素酶分析系統(Promega Corp., Madison, WI)試劑溶解孔中之剩餘細胞，以量化每孔中之剩餘細胞。相對於僅含靶細胞之孔計算「殺死%」。數據展示，用編碼慢病毒之CD22 CART轉導使抗CD22殺死活性轉移至T細胞(Nalm6 (圖5A)及SEM (圖5B))。UTD及EGFRvIII CAR表現T細胞僅展示背景殺死。類似地，CD22 CAR皆不展示CD22陰性對照系K562之殺死(圖5C)。CD22-64及CD22-65展示Nalm6及SEM靶細胞系二者之最高殺死。 為量測CD22 CAR T細胞因應CD22表現靶細胞之細胞介素產生，將CAR T細胞與ALL系SEM共培養；CML系K562用作CD22陰性對照。以1:1之效應物:靶比率及96孔板之每孔25,000個細胞將細胞培養24 h，此後移除培養基，利用V-PLEX人類IFN-γ套組(Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD)進行細胞介素分析以供細胞介素量化。數據展示，大多數新CD22 CART以及CD22-53 CART在與SEM一起培養時產生IFN-γ (圖6A)。CD22-63、CD22-64及CD22-65係最高細胞介素產生者。CD22 CART在暴露於對照K562細胞後產生之細胞介素量較低(圖6B)，此指示無CD22 CAR之非特異性效應。 在最後T細胞效能分析中，評價CD22 CAR T細胞之增殖能力。另外，將解凍的CAR T細胞與ALL系SEM共培養，同時CML系K562用作CD22陰性對照。在共培養之前輻照靶細胞系以防止孔之過度生長，然後將其以1:1之效應物:靶比率及96孔板之每孔30,000個細胞培養4天。其他對照係CD3/CD28珠粒(陽性對照，Dynabeads®人類T-擴增劑CD3/CD28, Thermo Fisher Scientific)以及單獨培養基(陰性對照)。在第4天時用抗CD3抗體以及可溶性CD22-Fc對細胞染色以檢測CAR表現。在BD Fortessa上獲取之前，將20 µl CountBright™絕對計數珠粒(Thermo Fisher Scientific)添加至每一樣品中以定量分析細胞數。圖7A展示每3000個計數珠粒之CD3+ T細胞數，而圖7B展示每3000個計數珠粒之CD3+ CAR+ CART數，如藉由CD22-Fc之結合所測定。數據展示CD22-64、CD22-65以及對照CD22-53 CAR T細胞之最強CD22誘導之增殖，其次為CD22-63。CART皆不展示因應CD22陰性系K562或因CAR之任何細胞固有刺激(例如藉由聚集)所致之增殖。 結論 大多數CD22特異性CAR以充分類似之方式在原代人類T細胞之細胞表面上表現：CD22-57、CD22-59、CD22-60、CD22-61、CD22-62、CD22-63、CD22-64及CD22-65與參考CAR CD22-53相當；僅CD22-58展示較低表現量。在T細胞功能分析中，與CD22-53相比，CD22-57及CD22-58係功能最小之CAR，而CD22-64及CD22-65之功能與其相等(IFN-γ產生及增殖)或更大(殺死)。總之，轉移CD22 CAR誘導抗CD22反應性，但未檢測到脫靶功能。實例 5 ： ALL 中之 CD22 CART 在NALM6異種移植物模型中評價一組CD22 CAR T細胞之活體內抗腫瘤活性。評估含有CAR構築體CD22-60、CD22-63及CD22-65之CAR T細胞對陽性對照(CD22-53及CD19)及模擬物CAR T細胞(EGFRvIII)。 材料及方法 細胞系： NALM6 (RRID: CVCL_0092)係源自患有在1976年復發之急性淋巴母細胞性白血病(ALL)之19歲男性之末梢血的人類白血病細胞系。使細胞生長於含有10%胎牛血清之RMPI培養基中。此細胞系以懸浮液形式生長於組織培養瓶中。此細胞系在靜脈內植入時在小鼠中存留且擴增。NALM6細胞已經修飾以表現螢光素酶，以使得亦可藉由使小鼠成像來監測該腫瘤細胞生長。 小鼠 ： 接受來自Jackson實驗室之6週齡NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ)小鼠(庫存編號005557)。在實驗之前容許動物適應Novartis NIBR動物設施達至少3天。根據Novartis ACUC規章及指導方針處置動物。在腫瘤植入前1天，將用於動物鑑別之電子詢答器植入左側腹上。 腫瘤植入： 收穫對數生長期之NALM6細胞且在50 ml falcon管中在1200 rpm下洗滌5分鐘，在生長培養基中洗滌一次且然後在冷的無菌PBS中洗滌兩次。將細胞以5×106 /ml之濃度重懸浮於PBS中，置於冰上，且立即在小鼠中注射。經由尾靜脈以200 μl靜脈內注射癌細胞。NALM6模型以內源方式表現CD22且因此可用於測試CD22重定向CAR T細胞之活體內效能。此模型在靜脈內植入小鼠中時生長良好且可針對腫瘤負荷量測值成像。在注射PBS中之1×106 個癌細胞後，腫瘤確立且可在3天內準確量測。基線量測值為4-6×10^5個光子/秒(p/s)。在7天內，平均生物發光量測值為2-4×10^6 p/s且未經處理之腫瘤截至21-26天達到終點量測值(2-3×10^9)。在腫瘤完全植入後通常立即測試治療劑之抗腫瘤活性。因此，使用此模型存在大的窗口，在此期間可觀察到CAR T細胞之抗腫瘤活性。 CAR T 細胞投藥： 在腫瘤植入後7天，向小鼠投用5×106 個CAR T細胞(總共12.3×106 個T細胞)。將細胞在37℃水浴中部分解凍，且然後藉由將1 ml溫生長培養基添加至含有細胞之管中來完全解凍。將所解凍之細胞轉移至50 ml falcon管中且用生長培養基調節至12 ml之最終體積。將細胞洗滌兩次且在300g下旋轉10分鐘且然後藉由血球計計數。然後以61.7×106 個細胞/ml冷PBS之濃度重懸浮T細胞且將其保持在冰上直至向小鼠投藥。經由尾靜脈向小鼠靜脈內注射200 μl T細胞達5×106 個CAR T細胞(總共12.3×106 個T細胞)/小鼠之劑量。用200 μl單獨PBS (PBS)、經模擬物EGFRvIII CAR轉導之T細胞、CD19 CAR T細胞、CD22-53 CAR T細胞以及新穎CD22-60、CD22-63或CD22-65 CAR T細胞治療5隻小鼠/組。所有細胞係自同一供體平行製備。 動物監測 ： 每天監測小鼠之健康狀態，包括每週兩次體重量測。體重變化%計算為(BW當前 - BW初始 )/(BW初始 ) × 100%。藉由使小鼠成像每週2次監測腫瘤。 結果 在B細胞急性淋巴母細胞性白血病異種移植物模型中評價CD22 CAR T細胞之抗腫瘤活性(Luo等人，Cancer Research 1989)。在第0天腫瘤細胞植入後，將帶有腫瘤之小鼠隨機化至治療組中且在腫瘤植入後7天時經由橫向尾靜脈靜脈內投與5×106 個CAR T細胞(總共12.3×106 個T細胞)。監測腫瘤生長及動物健康狀況直至動物達成終點。分別在第23天及第30天時，當腫瘤引起減少的後腿運動性時，對接受PBS或模擬物EGFRvIII CAR T細胞之小鼠實施安樂死。在第43天時對所有其他組實施安樂死。 所有治療組之平均生物發光繪製於圖8中。未接受任何T細胞之PBS治療組展示靜脈內注射之NSG小鼠中之基線NALM6腫瘤生長動力學。EGFRvIII治療組接受經對照CAR轉導之T細胞。在此模型中，該等細胞用作T細胞對照以展示人類供體T細胞之非特異性反應。在整個此研究中，PBS及模擬物治療組皆展示持續腫瘤進展。EGFRvIII組展示稍緩慢之腫瘤生長，此歸因於供體T細胞之背景活性。與EGFRvIII相比，CD22-60、CD22-63以及CD22-53皆展示顯著緩慢之腫瘤生長。CD22-65展示腫瘤消退且與陽性對照CD19相當。 論述 此研究展示，CD22特異性CAR T細胞CD22-65能夠引起NALM6腫瘤消退。儘管其他構築體展示腫瘤生長之減緩，但其皆不如CD22-65之效應完全或耐久。實例 6 ：帶有抗 CD20 及抗 CD22 scFv 之 CART 之活體外活性之比較分析 為比較靶向CD22或CD20之CAR T細胞之活體外活性，分別如實例3及4中所述產生對照CAR T細胞CD20-3及CD22-53。如實例3及4中所述實施CAR T細胞及癌細胞系之共培養。藉助IFN-γ分泌量測CAR T細胞之活化(圖9)。有趣的是，與CD22-53 CAR T細胞相比，CD20-3 CAR在與柏基特氏淋巴瘤系Raji (圖9A)及DLBCL系Pfeiffer (圖9B)一起培養時產生更多細胞介素分泌。相反，與CD20-3相比，ALL系SEM在較大程度上刺激CD22-53，但總體含量較低(圖9C)。 一般而言，此比較展示CD20及CD22 CAR二者對B細胞惡性病之一般反應。CAR T活化之偏差與各別靶細胞系上之CD20及CD22表現量相關聯。實例 7 ：帶有人類抗 CD20 scFv 之 CART 之活體內活性 在TMD8異種移植物模型中評價一組CD20 CAR T細胞之活體內抗腫瘤活性。評估含有CAR構築體CD20-C3H2、CD20-C5H1、CD20-3H5k3、CD20-Ofa及CD20-8aBBZ之CAR T細胞。CD20-C3H2、CD20-C5H1、CD20-3H5k3 CAR係基於人類化小鼠(C3H2及C5H1)及大鼠(3H5k3) CD20特異性scFv。CD20-8aBBZ係基於公開CD20靶向CAR (Jensen等人，Mol. Ther., 2000，其以引用方式併入本文中)。 細胞系： TMD8 (RRID: CVCL_A442)係活化B細胞(ABC)亞型之人類瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞系。使細胞以懸浮液形式生長於含有10%胎牛血清、1× HEPES、Pen/Strep、L-Glut及NEAA之MEM培養基中。TMD8在皮下(s.c.)植入時在小鼠中存留且生長。 小鼠 ： 接受來自Jackson實驗室之6週齡NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl /SzJ)小鼠(庫存編號005557)。在實驗之前容許動物適應Novartis NIBR動物設施達至少3天。根據Novartis ACUC規章及指導方針處置動物。在腫瘤植入前1天，將用於動物鑑別之電子詢答器植入左側腹上。 腫瘤植入： 收穫對數生長期之細胞且在50 ml falcon管中在1200 rpm下洗滌5分鐘，在生長培養基中洗滌一次且然後在冷無菌PBS中洗滌兩次。將細胞以25×106 /ml之濃度重懸浮於PBS中，置於冰上且在小鼠中注射。以200 μl s.c.注射癌細胞。TMD8模型以內源方式表現CD20且因此可用於測試CD20重定向CAR T細胞之活體內效能。此模型在s.c.植入小鼠中時生長良好，其可藉由測徑器量測來量測。在注射5×106 個癌細胞後，腫瘤確立且可在3-4天內準確量測。藉由測徑器量測(每週2-3次)來測定腫瘤體積且計算如下： 腫瘤體積=(max⁡(腫瘤X、腫瘤Y)*〖min⁡(腫瘤X、腫瘤Y)〗^2*π)/6 在9天內，腫瘤體積量測值為200 mm3 且未經處理之腫瘤截至15-18天達到終點量測值(＞1200 mm3 )。在腫瘤完全植入後通常立即測試治療劑之抗腫瘤活性。因此，使用此模型存在適宜窗口，在此期間可觀察到CAR T細胞之抗腫瘤活性。 CAR T 細胞投藥： 在腫瘤植入後9天向小鼠投用3×106 個CAR T細胞。將細胞在37℃水浴中部分解凍且然後藉由添加1 ml溫生長培養基完全解凍。將所解凍之細胞轉移至50 ml falcon管中且用生長培養基調節至12 ml之最終體積。將細胞洗滌兩次且在300g下旋轉10分鐘且然後藉由血球計計數。然後將T細胞以各別濃度重懸浮於冷PBS中且保持在冰上直至向小鼠投藥。經由尾靜脈以200 μl靜脈內注射CART，達3×106 個CAR T細胞之劑量。用200 μl單獨PBS (PBS)、EGFRvIII特異性模擬物CAR T細胞以及CD20-C3H2、CD20-C5H1、CD20-3H5k3、CD20-Ofa及CD20-8aBBZ治療5隻小鼠/組。所有細胞係自同一供體平行製備。 動物監測 ： 每天監測小鼠之健康狀態，包括每週兩次體重量測。體重變化%計算為(BW當前 - BW初始 )/(BW初始 ) × 100%。 在DLBCL白血病異種移植物模型中評價CD20 CAR T細胞之抗腫瘤活性(圖11)。在腫瘤細胞植入後，將帶有腫瘤之小鼠隨機化至治療組中且在腫瘤植入後第9天時經由橫向尾靜脈靜脈內投與CAR T細胞。監測腫瘤生長及動物健康狀況直至動物達成終點。在第17天時，對接受PBS或模擬物EGFRvIII特異性CAR T細胞之陰性對照組中之小鼠實施安樂死。接受CD20-Ofa及CD20-3H5k3之組亦展示無各別CART之效能且在第17天時對其實施安樂死。在第24天時對其他組實施安樂死。 未接受任何T細胞之PBS治療組展示基線TMD8腫瘤生長動力學。EGFRvIII治療組接受模擬物CAR轉導之T細胞且用作T細胞對照以展示在此模型中人類供體T細胞之非特異性反應。在整個此研究中，PBS及EGFRvIII治療組皆展示持續腫瘤進展。CD20-Ofa及CD20-3H5k3展示相似的生長動力學，此表明該等CART無抗腫瘤效能。CD20-C3H2、CD20-C5H1及對照CD20-8aBBZ CAR T細胞皆展示顯著較緩慢之腫瘤生長，且對CD20-C3H2可見最強且最快速之消退，其次為CD22-C5H1。 此研究展示CD20特異性CAR T細胞CD22-C3H2及CD22-C5H1能夠引起TMD8腫瘤消退。該效能優於公開之基準CARCD20-8aBBZ。實例 8 ：帶有具短連接體之人類抗 CD22 scFv 之 CART 之活體外活性 將編碼抗CD22抗體之單鏈可變片段(CD22-65、CD22-65s、陽性對照CD22 CAR m971 (m971)及m971s)之基因選殖至具有CD3ζ鏈及4-1BB刺激分子之慢病毒CAR表現載體中。CD3ζ鏈為野生型(Zwt)或攜載Q65K突變(Zmut)。基於該等CD22 CAR轉導之T細胞(「CD22 CART」或「CD22 CAR T細胞」)因應CD22表現(「CD22+」)靶之效應T細胞反應對構築體進行分級。效應T細胞反應包括(但不限於)細胞擴增、增殖、倍增、細胞介素產生及靶細胞殺死或細胞溶解活性(脫粒)。 CD22 CAR T 細胞 之產生： 使用編碼人類scFv之慢病毒轉移載體產生包裝於VSVg假型慢病毒粒子中之基因體材料。將編碼CAR之慢病毒轉移載體DNA與三種包裝組分VSVg、gag/pol及rev及lipofectamine試劑之組合混合以轉染Lenti-X 293T細胞(Clontech)，然後在12 - 18h後更換培養基。在更換培養基後30小時，收集培養基，過濾且儲存在-80℃下。 藉由自健康血球分離之供體之血液開始產生CD22 CAR T細胞，該等供體之T細胞係藉由T細胞、CD4+及CD8+淋巴球之負向選擇(Pan T細胞分離，Miltenyi)來富集。藉由在37℃、5% CO2 下在T細胞培養基(RPMI1640、10%熱不活化胎牛血清(FCS)、2 mM L-麩醯胺酸、1×青黴素/鏈黴素、100 μM非必需胺基酸、1 mM丙酮酸鈉、10 mM Hepes及55 μM 2-巰基乙醇)中以1:3 (T細胞對)之比率添加CD3/CD28珠粒(Dynabeads®人類T-擴增劑CD3/CD28, ThermoFisher Scientific)來活化T細胞。以24孔板之每孔1 mL培養基中之0.5×106 個T細胞培養T細胞。24小時後，當T細胞破裂時，添加未濃縮或濃縮之病毒上清液；以感染複數(MOI) 5轉導T細胞。T細胞開始增殖，此係藉由量測細胞濃度(以計數/mL表示)來監測，且每兩天將T細胞稀釋於新鮮T細胞培養基中。在約10天後T細胞開始休眠時，對數生長有所減弱。減緩生長速率及減小T細胞大小(接近約350 fL)之組合決定欲低溫保藏用於後續分析之T細胞之狀態。所有CD22 CAR T細胞皆係在研究級(即，非臨床級)製造條件下產生。 在低溫保藏之前，在FACS Fortessa (BD)上藉由流式細胞分析測定經轉導細胞(在細胞表面上表現CD22特異性CAR)之百分比(圖12)。病毒轉導展示相當表現量，此指示各別CAR之相似轉導效率以及表面表現。CAR T細胞培養物之細胞計數指示，與未經轉導之T細胞(「UTD」)相比，人類CD22 CAR對細胞正常擴增之能力無可檢測到之負面效應。 評估 CD22 CAR 重定向 T 細胞之功效 ：為評估CD22 CAR T細胞之功能能力，將如上文所述產生之細胞解凍，計數且與癌細胞共培養以讀出其殺死能力、細胞介素分泌以及增殖。使用帶有人類scFv之CAR CD22-65_Zmut、CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、m971_Zmut及m971s_Zmut且與用作非靶向T細胞對照之CD19 CAR以及未經轉導之T細胞(UTD)比較。 T細胞殺死係針對急性淋巴母細胞性白血病(ALL)系Nalm6 (RRID: CVCL_0092)及SEM (RRID: CVCL_0095)；慢性骨髓性白血病(CML)細胞系K562 (RRID: CVCL_0004)用作CD22陰性/低對照。所有細胞系經轉導以表現作為細胞活力/殺死之報導基因之螢光素酶。在10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.63:1及0.31:1之效應物:靶細胞比率(E:T)滴定下量測CD22 CART之細胞溶解活性。藉由混合各別數目之T細胞與恆定數目之靶細胞(96孔板之每孔25,000個細胞)來起始分析。20小時後，藉由添加Bright-Glo™螢光素酶分析系統(Promega)試劑溶解孔中之剩餘細胞，以量化每孔中之剩餘Luc表現癌細胞。相對於僅含靶細胞之孔(0%，最大Luc信號)計算「殺死%」。數據展示，在Nalm6 (圖13A))及SEM (圖13B))中用編碼慢病毒之CD22 CART轉導使抗CD22殺死活性轉移至T細胞。UTD T細胞僅展示背景殺死。類似地，CD22 CAR皆不展示CD22陰性對照系K562之殺死(圖13C)。所有CAR皆展示Nalm6及SEM靶細胞系二者之高殺死，其中m971s_Zmut、 CD22-65s_Zwt及CD22-65_Zwt為前3。 為量測CD22 CAR T細胞因應CD22表現靶細胞之細胞介素產生，將CAR T細胞與用作CD22陰性/低對照之上述plus K562相同之ALL系共培養。以1:1之效應物:靶比率及96孔板之每孔25,000個細胞將細胞培養24 h，此後移除培養基，利用V-PLEX人類IFN-γ套組(Meso Scale Diagnostics)進行細胞介素分析。該等數據展示，所有CD22 CART以及CD19 CART在與Nalm6或SEM共培養時產生IFN-γ (圖14)。m971s_Zmut、CD22-65s_Zwt及CD22-65_Zwt係最高細胞介素產生者。CD22 CART在暴露於對照K562細胞後產生之細胞介素量較低，此指示無CD22 CAR之非特異性效應。 在最後T細胞效能分析中，評價CD22 CAR T細胞之增殖能力。另外，將解凍的CAR T細胞與ALL系Nalm6及SEM共培養。用CellTracer Violet染料(ThermoFisher Scientific)對CART染色且在共培養之前輻照靶細胞系以防止孔中之過度生長。然後將其以1:1之效應物:靶比率及96孔板之每孔30,000個細胞培養4天。在第4天時，用抗CD3抗體以及可溶性CD22-Fc對細胞染色以檢測CAR表現。根據所有CD3+ T細胞之紫色染料之強度，螢光越低，增殖越強，此乃因T細胞之每一細胞分裂使得一半螢光保留於每一子代細胞中(圖15A)。未分裂細胞展示如對UTD可見之高螢光。利用FlowJo軟體量化細胞增殖且報告為「分裂指數」 (圖15B)。在此處，CD22-65s_Zwt係因應Nalm6最強增殖之CART且展示因應SEM之最高增殖。 此實驗中之所有CD22特異性CAR以充分類似之方式在原代人類T細胞之細胞表面上表現：CD22-65_Zmut、CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、m971_Zmut及m971s_Zmut。儘管所有CD22 CART皆在T細胞功能分析中展示效能，但m971s_Zmut、CD22-65s_Zwt及CD22-65_Zwt係所有3項分析中之前3位CART。總之，轉移CD22 CAR誘導抗CD22反應性，但未檢測到脫靶功能。實例 9 ：帶有具短連接體之人類抗 CD22 scFv 之 CART 之活體內活性 在NALM6及SEM異種移植物模型中評價一組CD22 CAR T細胞之活體內抗腫瘤活性。評估含有CAR構築體CD22-65_Zmut、CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、m971_Zmut及m971s_Zmut之CAR T細胞。 細胞系： Nalm6 (RRID: CVCL_0092)及SEM (RRID: CVCL_0095)皆為人類急性淋巴母細胞性白血病(ALL)細胞系。使細胞生長於含有10%胎牛血清之RMPI培養基中且二者以懸浮液形式生長。兩種細胞系在靜脈內植入時在小鼠中存留並擴增。細胞經修飾以表現螢光素酶，以使得亦可藉由在向小鼠注射受質螢光素後使小鼠成像監測該腫瘤細胞生長。 小鼠 ： 接受來自Jackson實驗室之6週齡NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ)小鼠(庫存編號005557)。在實驗之前容許動物適應Novartis NIBR動物設施達至少3天。根據Novartis ACUC規章及指導方針處置動物。在腫瘤植入前1天，將用於動物鑑別之電子詢答器植入左側腹上。 腫瘤植入： 收穫對數生長期之細胞且在50 ml falcon管中在1200 rpm下洗滌5分鐘，在生長培養基中洗滌一次且然後在冷無菌PBS中洗滌兩次。將細胞以5×106 /ml之濃度重懸浮於PBS中，置於冰上且在小鼠中注射。經由尾靜脈以200 μl靜脈內注射癌細胞。Nalm6及SEM模型皆以內源方式表現CD22且因此可用於測試CD22重定向CAR T細胞之活體內效能。該等模型在靜脈內植入小鼠中時生長良好，其可針對腫瘤負荷量測值成像。在注射1×106 個癌細胞後，腫瘤確立且可在3天內準確量測。基線量測值為4-6×105 個光子/秒(p/s)。在7天內，平均生物發光量測值為2-4×106 p/s且未經處理之腫瘤截至21-26天達到終點量測值(2-3×109 )。在腫瘤完全植入後通常立即測試治療劑之抗腫瘤活性。因此，使用該等模型存在大的窗口，在此期間可觀察到CAR T細胞之抗腫瘤活性。 CAR T 細胞投藥： 在腫瘤植入後7天向小鼠投用1×106 個CAR T細胞(用於處理Nalm6)及3×106 個CAR T細胞(用於處理SEM)。將細胞在37℃水浴中部分解凍且然後藉由添加1 ml溫生長培養基完全解凍。將所解凍之細胞轉移至50 ml falcon管中且用生長培養基調節至12 ml之最終體積。將細胞洗滌兩次且在300g下旋轉10分鐘且然後藉由血球計計數。然後將T細胞以各別濃度重懸浮於冷PBS中且保持在冰上直至向小鼠投藥。經由尾靜脈以200 μl靜脈內注射CART，對於帶有Nalm6及SEM之小鼠分別達1或3×106 個CAR T細胞之劑量。用200 μl單獨PBS (PBS)、未經轉導之T細胞(UTD)、CD19 CAR T細胞以及新穎CD22-65_Zmut、CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、m971_Zmut或m971s_Zmut CAR T細胞治療5隻小鼠/組。所有細胞係自同一供體平行製備。 動物監測 ： 每天監測小鼠之健康狀態，包括每週兩次體重量測。體重變化%計算為(BW當前 - BW初始 )/(BW初始 ) × 100%。藉由使小鼠成像每週2次監測腫瘤。 在兩個B細胞急性淋巴母細胞性白血病異種移植物模型中評價CD22 CAR T細胞之抗腫瘤活性。在第0天腫瘤細胞植入後，將帶有腫瘤之小鼠隨機化至治療組中且在腫瘤植入後7天時經由橫向尾靜脈靜脈內投與CAR T細胞。監測腫瘤生長及動物健康狀況直至動物達成終點。 在Nalm6模型中，在第22天時，當腫瘤引起減少的後腿運動性時，對接受PBS或UTD T細胞之小鼠實施安樂死。在第40天時對所有其他組實施安樂死。在靜脈內注射之NSG小鼠中，未接受任何T細胞之PBS治療組展示基線Nalm6腫瘤生長動力學。UTD治療組接受未經轉導之T細胞且用作T細胞對照以展示在此模型中人類供體T細胞之非特異性反應。在整個此研究中，PBS及UTD治療組皆展示持續腫瘤進展。CD22-65_Zmut、CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、m971_Zmut及m971s_Zmut CAR T細胞皆展示顯著較緩慢之腫瘤生長。CD22-65s_Zwt及m971_Zmut展示完全腫瘤消退，如根據平均生物發光所指示(圖16)。 在SEM模型中，在第27天時，當腫瘤引起減少的後腿運動性時，對接受PBS或UTD T細胞之小鼠實施安樂死。在第45天時對所有其他組實施安樂死。在靜脈內注射之NSG小鼠中，未接受任何T細胞之PBS治療組展示基線SEM腫瘤生長動力學。UTD治療組接受未經轉導之T細胞且用作T細胞對照以展示在此模型中人類供體T細胞之非特異性反應。在整個此研究中，PBS及UTD治療組皆展示持續腫瘤進展。 CD22-65_Zmut、CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、m971_Zmut、m971s_Zmut及CD19 CAR T細胞皆展示顯著較緩慢之腫瘤生長。CD19 CART展示最快速之腫瘤消退，其次為CD22-65s_Zwt及m971s_Zmut (圖17A)。亦產生各別組中之單一小鼠之生物發光曲線，此強調CD22-65s_Zwt及m971s_Zmut二者與在scFv內具有較長連接體之CAR變體(分別為CD22-65_Zwt及m971_Zmut)相比較強之效能(圖17B)。此研究展示，CD22特異性CAR T細胞CD22-65s_Zwt能夠引起NALM6及SEM腫瘤二者之消退。該效能與m971 CAR變體相當且高於具有較長連接體之CD22-65變體。實例 10 ：抗 CD22 CAR T 細胞對 B 細胞急性淋巴母細胞性白血病之臨床效能與 scFv 連接體長度相關聯且可利用異種移植物模型來預測 . 患者及方法 ： 產生與在scFv之輕鏈與重鏈之間包括短連接體(1×(GGGGS); SL)之抗CD22 CAR相比包括較長連接體(4×(GGGGS); LL)之抗CD22 CAR (「CD22 CAR」) (圖18)。在患有r/r-ALL之成人(NCT02588456)及患有r/r-ALL之兒童(NCT02650414)之兩個先導臨床試驗中測試CD22 CAR LL構築體。利用慢病毒轉導產生CART22LL T細胞。方案指定之CART22劑量為2×106 -1×107 個細胞/kg (對於＜ 50 kg之小兒患者)及1-5×108 個細胞/kg (對於≥ 50 kg之小兒患者及成人患者)，在淋巴清除化學療法後輸注。患者特徵闡述於表16 中。表 16. 輸注 CART22LL T 細胞之患者之患者特徵 .
Figure 106134614-A0304-0012
 對於成人試驗，篩選5個患者，4個入選(1個患者撤回同意)及3個輸注(1個製造失敗)。對於小兒試驗，篩選9個患者，8個入選(1個篩選失敗)及6個輸注(兩個患者不進行輸注用於疾病進展)。 對於臨床前研究，產生CART22LL 及CART22SL 且利用異種移植物模型進行活體內測試。向NSG小鼠植入螢光素酶+標準B-ALL細胞系(NALM6)或自CART19後復發之患者獲得之原代B-ALL細胞(CHP110R)。另外，使用2-光子成像來研究活體內行為及免疫突觸形成，且使用流式細胞術來評價T細胞活化。 12個患者中之10個成功製造CART22細胞。 在成人同類群組中，3/3個患者罹患CRS (1-3級)且未觀察到神經毒性；在小兒同類群組中，在5個可評估患者(1個因在預輸注骨髓時譜系轉換至AML而中斷)中，3/5罹患細胞介素釋放症候群(CRS) (皆為2級)且1個患者患有腦病(1級)。使CART22細胞在PB中擴增且在第11-18天時中值峰值為1977 (18-40314)個拷貝/ug DNA。在先前已接受CART19之成人患者中，在CART22擴增後觀察到第二CART19再擴增(圖19)。在第28天時在成人同類群組中，形態CR中經輸注之患者保持在CR中，而其他兩者不具反應(NR)。在小兒同類群組中，5個患者中之2個處於CR中，1個患者處於部分緩解(PR)中，隨後在2個月時轉化成具有不完全恢復之CR，且兩個具有NR。未觀察到CD22陰性白血病進展。 然後直接比較兩個不同的CAR22構築體(CART22S 與CART22SL )。在異種移植物模型中，CART22SL 顯著優於CART22LL (圖20)且具有經改良之總存活率。此外，CART22SL 在第17天時展示較高活體內增殖(圖21)。在機制上，活體2-光子成像展示，CART22SL 確立大於CART22LL 之延長的T細胞:白血病相互作用，此表明產生性突觸之確立(圖22)。此外，在帶有NALM-6之小鼠之BM之CART22SL 中觀察到活體內24 hr較高T細胞活化(CD69、PD-1)。 儘管可行且具有可管控之毒性，但CART22LL 引起r/r B-ALL患者之適度臨床反應。臨床前評估容許推斷出，將連接體縮短15個胺基酸可能藉由引起T細胞與其靶之間之更有效相互作用顯著增加CART22之抗白血病活性。最後，利用交叉試驗比較之條件，該等數據表明，異種移植物模型可預測CART產品之臨床效能且驗證活體內模型於主要候選者選擇之用途。實例 11 ：帶有具連接體變體之人類抗 CD22 scFv 之 CART 之活體外活性 . 將編碼抗CD22抗體之單鏈可變片段之基因選殖至具有CD3ζ鏈及4-1BB刺激分子之慢病毒CAR表現載體中。評估以下抗CD22 CAR構築體：CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt (短1× (GGGGS)連接體；SEQ ID NO: 835)、CD22-65ss_Zwt (在VH區與VL區之間無連接體；SEQ ID NO: 836)、CD22-65sLH_Zwt (VL區定向在N末端且VH區定向在C末端之短1× (GGGGS)連接體)、CD22-65sKD_Zwt (短1× (GGGGS)連接體且VH區及VL區之FR區突變；SEQ ID NO: 837)及CD22-m971s_Zmut (對照)。除CD22-65sLH_Zwt外，所有抗CD22 CAR構築體皆具有定向在N末端之VH區。 CD3ζ鏈為野生型(Zwt)或攜載Q65K突變(Zmut)。基於該等CD22 CAR轉導之T細胞(「CD22 CART」或「CD22 CAR T細胞」)因應CD22表現(「CD22+」)靶之效應T細胞反應對構築體進行分級。效應T細胞反應包括(但不限於)細胞擴增、增殖、倍增、細胞介素產生及靶細胞殺死或細胞溶解活性(脫粒)。 CD22 CAR T 細胞之產生 ：使用編碼人類scFv之慢病毒轉移載體產生包裝於VSVg假型慢病毒粒子中之基因體材料。將編碼CAR之慢病毒轉移載體DNA與三種包裝組分VSVg、gag/pol及rev及lipofectamine試劑之組合混合以轉染Lenti-X 293T細胞(Clontech)，然後在12 - 18h後更換培養基。在更換培養基後30小時，收集培養基，過濾且儲存在-80℃下。 藉由自健康血球分離之供體之血液開始產生CD22 CAR T細胞，該等供體之T細胞係藉由T細胞、CD4+及CD8+淋巴球之負向選擇(Pan T細胞分離，Miltenyi)來富集。藉由在37℃、5% CO2 下在T細胞培養基(RPMI1640、10%熱不活化胎牛血清(FCS)、2 mM L-麩醯胺酸、1×青黴素/鏈黴素、100 μM非必需胺基酸、1 mM丙酮酸鈉、10 mM Hepes及55 μM 2-巰基乙醇)中以1:3 (T細胞對)之比率添加CD3/CD28珠粒(Dynabeads®人類T-擴增劑CD3/CD28, ThermoFisher Scientific)來活化T細胞。以24孔板之每孔1 mL培養基中之0.5×106 個T細胞培養T細胞。24小時後，當T細胞破裂時，添加未濃縮或濃縮之病毒上清液；以感染複數(MOI) 5轉導T細胞。T細胞開始增殖，此係藉由量測細胞濃度(以計數/mL表示)來監測，且每兩天將T細胞稀釋於新鮮T細胞培養基中。在約10天後T細胞開始休眠時，對數生長有所減弱。減緩生長速率及減小T細胞大小(接近約350 fL)之組合決定欲低溫保藏用於後續分析之T細胞之狀態。所有CD22 CAR T細胞皆係在研究級(即，非臨床級)製造條件下產生。 在低溫保藏之前，在FACS Fortessa (BD)上藉由流式細胞分析測定經轉導細胞(在細胞表面上表現CD22特異性CAR)之百分比(圖23)。病毒轉導展示相當表現量，此指示各別CAR之相似轉導效率以及表面表現。CAR T細胞培養物之細胞計數指示，與未經轉導之T細胞(「UTD」)相比，人類CD22 CAR對細胞正常擴增之能力無可檢測到之負面效應。評估 CD22 CAR 重定向 T 細胞之功效 ：為評估CD22 CAR T細胞之功能能力，將如上文所述產生之細胞解凍，計數且與癌細胞共培養以讀出其殺死能力及細胞介素分泌。比較帶有人類scFv之CAR CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、CD22-65ss_Zwt、CD22-65sLH_Zwt、CD22-65sKD_Zwt及CD22-m971s_Zmut且使用EGFRvIII CAR T細胞以及未經轉導之T細胞(UTD)作為非靶向T細胞對照。 T細胞殺死係針對急性淋巴母細胞性白血病(ALL)系Nalm6 (RRID: CVCL_0092)及SEM (RRID: CVCL_0095)。兩種細胞系經轉導以表現作為細胞活力/殺死之報導基因之螢光素酶。在10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.63:1及0.31:1之效應物:靶細胞比率(E:T)滴定下量測CD22 CART之細胞溶解活性。藉由混合各別數目之T細胞與恆定數目之靶細胞(96孔板之每孔25,000個細胞)來起始分析。20小時後，藉由添加Bright-Glo™螢光素酶分析系統(Promega)試劑溶解孔中之剩餘細胞，以量化每孔中之剩餘Luc表現癌細胞。相對於僅含靶細胞之孔(0%，最大Luc信號)計算「殺死%」。數據展示，用編碼慢病毒之CD22 CART轉導使抗CD22殺死活性轉移至T細胞(Nalm6及SEM (圖24A-B))。UTD及EGFRvIII CAR T細胞僅展示背景殺死。所有CAR (CD22-65sLH_Zwt除外)皆展示Nalm6及SEM靶細胞系二者之高殺死。 為量測CD22 CAR T細胞因應CD22表現靶細胞之細胞介素產生，將CAR T細胞與上述相同之ALL系共培養。以1:1之效應物:靶比率及96孔板之每孔25,000個細胞將細胞培養24 h，此後移除培養基，利用V-PLEX人類IFN-γ套組(Meso Scale Diagnostics)進行細胞介素分析。該等數據展示，所有CD22 CART (CD22-65sLH_Zwt除外)在與Nalm6或SEM一起培養時產生IFN-γ (圖25)。 此實驗中之所有CD22特異性CAR以充分類似之方式在原代人類T細胞之細胞表面上表現：CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、CD22-65ss_Zwt、CD22-65sLH_Zwt、CD22-65sKD_Zwt及CD22-m971s_Zmut。另外所有CD22 CART在T細胞功能分析中皆展示效能，但CD22-65sLH_Zwt除外。實例 12 ：帶有具連接體變體之人類抗 CD22 scFv 之 CART 之活體內活性 . 在NALM6異種移植物模型中評價一組CD22 CAR T細胞之活體內抗腫瘤活性。評估含有CAR構築體CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、CD22-65ss_Zwt、CD22-65sLH_Zwt、CD22-65sKD_Zwt及CD22-m971s_Zmut (對照)之CAR T細胞。 細胞系 ：Nalm6 (RRID: CVCL_0092)係人類急性淋巴母細胞性白血病(ALL)細胞系。使細胞生長於含有10%胎牛血清之RMPI培養基中且二者以懸浮液形式生長。細胞在靜脈內植入時在小鼠中存留且擴增。細胞經修飾以表現螢光素酶，以使得亦可藉由在向小鼠注射受質螢光素後使小鼠成像監測該腫瘤細胞生長。 小鼠 ： 接受來自Jackson實驗室之6週齡NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ)小鼠(庫存編號005557)。在實驗之前容許動物適應Novartis NIBR動物設施達至少3天。根據Novartis ACUC規章及指導方針處置動物。在腫瘤植入前1天，將用於動物鑑別之電子詢答器植入左側腹上。 腫瘤植入： 收穫對數生長期之細胞且在50 ml falcon管中在1200 rpm下洗滌5分鐘，在生長培養基中洗滌一次且然後在冷無菌PBS中洗滌兩次。將細胞以5×106 /ml之濃度重懸浮於PBS中，置於冰上且在小鼠中注射。經由尾靜脈以200 μl靜脈內注射癌細胞。Nalm6細胞以內源方式表現CD22且因此可用於測試CD22重定向CAR T細胞之活體內效能。此模型在靜脈內植入小鼠中時生長良好，其可針對腫瘤負荷量測值成像。在注射1×106 個癌細胞後，腫瘤確立且可在3天內準確量測。基線量測值為4-6×105 個光子/秒(p/s)。在7天內，平均生物發光量測值為2-4×106 p/s且未經處理之腫瘤截至20-30天達到終點量測值(2-3×109 )。在腫瘤完全植入後通常立即測試治療劑之抗腫瘤活性。因此，使用該等模型存在大的窗口，在此期間可觀察到CAR T細胞之抗腫瘤活性。 CAR T 細胞投藥： 在腫瘤植入後7天向小鼠投用1×106 個CAR T細胞用於處理Nalm6。將細胞在37℃水浴中部分解凍且然後藉由添加1 ml溫生長培養基完全解凍。將所解凍之細胞轉移至50 ml falcon管中且用生長培養基調節至12 ml之最終體積。將細胞洗滌兩次且在300g下旋轉10分鐘且然後藉由血球計計數。然後將T細胞以各別濃度重懸浮於冷PBS中且保持在冰上直至向小鼠投藥。經由尾靜脈以200 μl靜脈內注射CART，達1×106 個CAR T細胞之劑量。用200 μl單獨PBS (PBS)、EGFRvIII轉導之T細胞以及新穎CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、CD22-65ss_Zwt、CD22-65sLH_Zwt、CD22-65sKD_Zwt及CD22-m971s_Zmut CAR T細胞治療5隻小鼠/組。所有細胞係自同一供體平行製備。 動物監測 ： 每天監測小鼠之健康狀態，包括每週兩次體重量測。體重變化%計算為(BW當前 - BW初始 )/(BW初始 ) × 100%。藉由使小鼠成像每週2次監測腫瘤。 在B細胞急性淋巴母細胞性白血病異種移植物模型中評價CD22 CAR T細胞之抗腫瘤活性。在第0天腫瘤細胞植入後，將帶有腫瘤之小鼠隨機化至治療組中且在腫瘤植入後7天時經由橫向尾靜脈靜脈內投與CAR T細胞。監測腫瘤生長及動物健康狀況直至動物達成終點。 在此Nalm6模型中，在第23天時，當腫瘤引起減少的後腿運動性時，對接受PBS或EGFRvIII T細胞之小鼠實施安樂死。在第37天時對所有其他組實施安樂死。然後測定所有治療組之平均生物發光(圖26)。在靜脈內注射之NSG小鼠中，未接受任何T細胞之PBS治療組展示基線Nalm6腫瘤生長動力學。EGFRvIII治療組接受模擬物轉導之T細胞且用作T細胞對照以展示在此模型中人類供體T細胞之非特異性反應。在整個此研究中，PBS及UTD治療組皆展示持續腫瘤進展。CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、CD22-65ss_Zwt、CD22-65sKD_Zwt及CD22-m971s_Zmut CAR T細胞皆展示顯著較緩慢之腫瘤生長。CD22-65s_Zwt、CD22-65ss_Zwt展示最強反應。 該等數據展示，CD22特異性CAR T細胞CD22-65s_Zwt及CD22-65ss_Zwt能夠在1×106 個CAR T細胞之低劑量下強烈抑制NALM6癌症之生長。該效能優於對照m971 CAR。實例 13 ：包括串聯抗 CD19 及抗 CD22 scFV 之 CART 之產生、表現及抗原活化 . 為測試經兩個不同scFV功能化之單一CART細胞是否可經CART識別之任一抗原活化，利用靶向CD19及CD22之scFV產生包含兩個連接在一起之不同scFV之CART (表15及17及圖27)。該等構築體之抗CD19識別部分相對於T細胞膜之位置(近端或遠端：分別為、靠近或遠離T細胞膜)有所不同。 所產生構築體探究連接兩個scFV之兩種不同連接體：LAEAAAK及GGGGS。LAEAAAK係更具剛性之連接體，而GGGGS連接體係更具撓性之連接體。亦研究抗CD22 scFV活化內輕鏈(L)及重鏈(H)之定向之影響。在所有構築體中，抗CD19 scFV定向為L/H (呈N至C末端定向)。亦探究連接抗CD22 scFV內之H及L鏈之兩種連接體：GGGGSGGGGSGGGGS及GGGGS (在表17及18中註解為「sh」)。亦產生經改造具有個別scFV (抗CD19或抗CD22)之對照構築體(表18). 表17：在靶向CD22及CD19之單一CART情況下產生之構築體.
Figure 02_image022
表18：經產生以靶向CD19或CD20之CAR構築體對照.
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CAR 表現之評估 ：將編碼表17及18中所列示之構築體之序列選殖至慢病毒主鏈載體中。所有構築體在其N末端包含人類CD8α之前導序列，預期其以共轉譯方式裂解且不包括於最終蛋白質產物中。藉由EF1α啟動子驅動轉基因表現。使用所得DNA來轉染HEK-293細胞用於病毒產生。實例性病毒效價展示於表19中。病毒效價係藉由FACS利用兩種不同染色試劑基於SupT1細胞中各個構築體之表面表現來確定。使用識別針對CD19及CD22-FC之scFv之抗個體遺傳型抗體對針對CD22之scFV染色。個別地實施染色。 表19：對在CD19及CD22靶向情況下測試之一些構築體獲得之病毒效價
Figure 02_image026
對於每一構築體，將利用兩種染色試劑獲得之病毒效價平均化且評估病毒轉導JNL細胞之能力。Jurkat細胞先前經NFAT-螢光素酶報導基因構築體轉導。使用感染複數3。測定用所指示構築體轉導後JNL中對CAR呈陽性之細胞% (圖28)。在轉導後7天藉由FACS利用用於檢查受感染SupT1細胞中之CAR表現相同之染色試劑測定CAR表現。在不共添加兩種試劑下個別地實施染色以避免妨礙。 該等數據展示，在細胞表面上檢測到跨越不同構築體之scFV，此指示靶向CD19及CD22二者之構築體之表現及輸送至細胞表面。使用自身為抗原(CD22-Fc)之染色試劑指示，針對CD22之scFV獲得正確摺疊之結構，此與CD22蛋白內之抗原識別相容。無論抗CD22 scFV臂經改造位於抗CD19 scFV臂之上游抑或下游，皆觀察到此結果。 CAR 活化之評估 ： 為評估包含兩個不同scFV之CAR是否可經任一靶抗原活化，共培養未經轉導(UTD)及經轉導之JNL與表現CD19 (K562-CD19)或CD22 (K562-CD22)之靶細胞系。當CAR識別CD19或CD22抗原時，CAR接合使得下游NFAT活化。JNL細胞中之NFAT-螢光素酶報導基因提供讀出CAR活化之量度。展示CD19及CD22在不同靶細胞系中之表現量(圖29)。 展示NFAT誘導之螢光素酶之含量作為CAR活性之量度(圖30)。基於圖28中所展示之數據，將添加至分析中之JNL細胞數正規化最低CAR表現。無論scFV相對於T細胞膜之定向如何，藉由兩個靶活化包含兩個scFV (一個針對CD19且另一個針對CD22)之所有構築體。單CAR係僅藉由其scFV識別之抗原(CD19或CD22)活化。 等效內容 本文引用之每一及所有專利、專利申請案及公開案之揭示內容係全文以引用方式併入本文中。儘管已參照具體態樣揭示本發明，但顯然，在不背離本發明之真實精神及範圍之情況下，熟習此項技術者可想到本發明之其他態樣及變化形式。意欲將隨附申請專利範圍視為包括所有該等態樣及等效變化形式。
在結合附圖閱讀時，將更好地理解本發明較佳實施例之以下詳細描述。出於說明本發明之目的，在圖式中展示當前較佳之實施例。然而，應理解，本發明並不限於圖式中所展示實施例之精確排列及方法。 圖1A-1E係展示測試CD20 CAR之功能之Jurkat NFAT螢光素酶(JNL)報導基因分析的圖。將CD20 JNL CAR T細胞與柏基特氏淋巴瘤系Raji及瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)系Pfeiffer、HBL-1及TMD8一起培養；慢性骨髓性白血病(CML)細胞系K562用作CD20陰性對照。發光讀數係CAR刺激之直接量度。所有四個靶細胞系展示所有人類化CD20 CAR之活化(圖1A-D)。人類化小鼠CAR皆不展示被CD20陰性系K562活化(圖1E)。 圖2係展示原代人類T細胞上CD20 CAR之表現量之圖。用可溶性生物素化ProteinL (0.1 µg/孔，GenScript, Piscataway, NJ)及鏈黴抗生物素蛋白-PE (1:300，R-藻紅素鏈黴抗生物素蛋白，Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)對細胞染色且藉由流式細胞術分析。圖中之上部數值展示CAR+細胞之百分比，下部數值闡述該陽性群體內之CAR表現量(幾何平均值)。 圖3A-3B係展示CD20 CAR T細胞因應CD20表現靶細胞之刺激分泌IFN-γ之方式的圖。在CAR T細胞與柏基特氏淋巴瘤系Raji及瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)系Pfeiffer、HBL-1及TMD8之共培養物之培養基中量測IFN-γ；慢性骨髓性白血病(CML)細胞系K562用作CD20陰性對照。將CART及靶細胞以1:1之效應物對靶細胞比率共培養24 h，此後收穫上清液且量化IFN-γ量。在兩次各別實驗中分析CART (分別為圖3A及圖3B)。 圖4係展示原代人類T細胞上CD22 CAR之表現量之圖。用可溶性CD22-Fc (0.2 ug/孔，R&D Systems, Minneapolis, MN)及抗人類Fc (1:300, R-藻紅素AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗人類IgG，Fcγ片段特異性，Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)二級抗體對細胞染色且藉由流式細胞術分析。圖中之數值展示CAR+細胞之百分比，下部數值闡述陽性群體內之CAR表現量(中值)。 圖5A-5C係展示CD22 CAR T細胞可有效地殺死CD22表現靶細胞之圖。CAR T細胞對急性淋巴母細胞性白血病(ALL)系Nalm6 (圖5A)及SEM (圖5B)以及CD22陰性CML系K562 (C)之20h殺死分析。將CART及靶細胞以不同效應物對靶細胞比率(E:T)共培養20 h，此後利用發光量化螢光素酶表現靶細胞。 圖6A-6B係展示CD22 CAR T細胞因應CD22表現靶細胞之刺激分泌IFN-γ之圖。在CAR T細胞與ALL系SEM (圖6A)以及CD22陰性CML系K562 (圖6B)之共培養物之培養基中量測IFN-γ。將CART及靶細胞以1:1之效應物對靶細胞比率共培養24 h，此後收穫上清液且量化IFN-γ量。 圖7A-7B係展示CD22 CAR T細胞因應CD22表現靶細胞之刺激增殖之圖。將CAR T細胞與ALL系SEM以及CD22陰性CML系K562以1:1之效應物對靶細胞比率共培養4天。然後用抗CD3抗體及可溶性CD22-Fc對CART染色以檢測CAR表現，然後利用計數珠粒藉由流式細胞術進行定量分析。(圖7A) CD3+細胞/3000珠粒之數量及(圖7B) CD3+ CAR+細胞/3000珠粒之數量。 圖8係展示根據實例5在ALL模型中測試之CD22 CAR T細胞之平均生物發光曲線之圖。 圖9A-9C係展示根據實例6 CD20-3 CAR T細胞及CD22-53 T細胞因應刺激分泌IFN-γ之方式之圖。在CAR T細胞與柏基特氏淋巴瘤系Raji (圖9A)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)系Pfeiffer (圖9B)、ALL系SEM (圖9C)之共培養物之培養基中量測IFN-γ。 圖10A-10B係展示代表性CAR之示意圖。 圖11係展示經表現模擬物EGFRvIII CAR、CD20-8aBBZ CAR、CD20-C3H2 CAR、CD20-C5H1 CAR、CD20-Ofa CAR及CD20-3H5k3 CAR之T細胞或經媒劑(PBS)治療之NSG小鼠之平均腫瘤體積(mm3 )的圖。 圖12係展示如利用流式細胞分析所測定，CD3ζ鏈包括Q65K突變之CD22 65 CAR (CD22-65_Zmut)、CD22-65野生型CAR (CD22-65_Zwt)、CD22-65s_Zwt CAR、m971_Zmut CAR及m971s_Zmut CAR之表現量的圖。 圖13A-C係展示CD22-65_Zmut、CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、m971_Zmut及m971s_Zmut CAR T細胞可有效地殺死CD22表現靶細胞之圖。展示CAR T細胞對ALL系Nalm6 (圖13A)、ALL系SEM (圖13B)及CD22陰性CML系K562 (圖13C)之20h殺死分析。亦展示未經轉導之T細胞(UTD)及CD19細胞。將CART及靶細胞以不同效應物對靶細胞比率(E:T)共培養20 h，此後利用發光量化螢光素酶表現靶細胞。 圖14係展示CD22-65_Zmut、CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、m971_Zmut、m971s_Zmut、CD19及UTD CAR T細胞因應CD22表現靶細胞之刺激分泌IFN-γ之圖。在CAR T細胞與ALL系Nalm6、ALL系SEM及CD22陰性CML系之共培養物之培養基中量測IFN-γ。將CART及靶細胞以1:1之效應物對靶細胞比率共培養24 h，此後收穫上清液且量化IFN-γ量。 圖15A-B係展示如利用細胞示蹤劑紫色染料所評價，與ALL系Nalm6及SEM共培養之CD22-65_Zmut、CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、m971_Zmut、m971s_Zmut、CD19及UTD CAR T細胞之增殖之圖。較低螢光展示隨T細胞之每次細胞分裂之較強增殖使得一半螢光保留於每一子代細胞中(圖15A)。未分裂細胞展示如UTD所展示之高螢光。利用FlowJo軟體量化細胞增殖且報告為「分裂指數」 (圖15B)。 圖16係展示經CD22-65_Zmut、CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、m971_Zmut或m971s_Zmut CAR T細胞治療之Nalm6小鼠中如根據平均生物發光指示之腫瘤消退之圖。治療亦包括T細胞及UTD或PBS。 圖17A-B係展示經CD22-65_Zmut、CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、m971_Zmut或m971s_Zmut CAR T細胞或UTD或PBS治療之SEM小鼠之腫瘤生長的圖。 圖18係在輕鏈與重鏈之間包括較長連接體(4×(GGGGS); LL)之抗CD22 CAR及包括短連接體(1×(GGGGS); SL)之抗CD22 CAR的示意圖。 圖19係展示先前接受CART19細胞治療且經CART22細胞治療之成年ALL患者中CART19及CART22細胞之DNA量(拷貝/ug)之圖。在用CART22細胞擴增後之第二CART19細胞再擴增。 圖20係展示經CAR22包括短連接體(CART22S )或長連接體(CART22SL )之CART22細胞治療之植入NALM6或CHP110R之NSG小鼠之總存活率的圖。 圖21係展示如利用流式細胞術所評價，在NSG小鼠中CART22SL 細胞在第17天時展示高於CART22LL 細胞之活體內增殖之圖。 圖22係展示如利用生體內2-光子成像所評價，在NSG小鼠中CART22SL 細胞建立多於CART22LL 細胞之延長的T細胞:白血病相互作用之圖。 圖23係展示如利用流式細胞分析所測定，T細胞中CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt (短1× (GGGGS)連接體；SEQ ID NO: 835)、CD22-65ss_Zwt (VH區與VL區之間無連接體；SEQ ID NO: 836)、CD22-65sLH_Zwt (VL區定向在N末端且VH區定向在C末端之短1× (GGGGS)連接體)、CD22-65sKD_Zwt (短1× (GGGGS)連接體且VH區及VL區之FR區突變；SEQ ID NO: 837)及CD22-m971s_Zmut (對照)之表現量的圖。 圖24A-B係展示帶有具短連接體(短1× (GGGGS)連接體；SEQ ID NO: 835)或無連接體之人類抗CD22 scFv之CD22 CAR T細胞可有效地殺死CD22表現靶細胞之圖。展示CAR T細胞對急性淋巴母細胞性白血病(ALL)系Nalm6 (圖24A)及SEM (圖24B)之20h殺死分析。 圖25係展示含有CAR CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、CD22-65ss_Zwt、CD22-65sKD_Zwt及CD22-m971s_Zmu之CD22 CAR T細胞因應CD22表現靶細胞之刺激分泌IFN-γ之圖。在CAR T細胞與ALL系Nalm6及SEM之共培養物之培養基中量測IFN-γ。 圖26係展示在經CD22-65_Zwt、CD22-65s_Zwt、CD22-65ss_Zwt、CD22-65sKD_Zwt及CD22-m971s_Zmut治療之Nalm6小鼠中如根據平均生物發光指示之腫瘤消退的圖。小鼠亦接受PBS或EGFRvIII T細胞。 圖27係展示實例性串聯CAR構築體之遠端及近端之示意圖。 圖28係展示利用識別針對CD19 (黑條)或CD22 (灰條)之scFV之試劑基於JNL細胞之FACS表面染色之CAR%的圖。在c171、c172及c173中分別使用1、0.8及2.2之感染複數。 圖29係展示利用FACS針對CD19及CD22對用於評價經表1中所展示之各個CAR功能化之JNL之活化的不同靶細胞系染色之圖。兩種染色試劑經藻紅蛋白(PE)標記。展示在表面上所檢測蛋白質之陽性細胞百分比以及MFI (平均螢光強度) (%)。 圖30係展示以1:1細胞比率與表現CD19或CD22之靶細胞系一起培育20hr之未經轉導(UTD)及經轉導JNL之圖。NFAT誘導之螢光素酶之含量(在y軸上散佈之任意單位)係CAR活性之量度。
<110> 瑞士商諾華公司(NOVARTIS AG) 賓夕法尼亞大學董事會(THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA)
<120> 利用嵌合抗原受體之癌症治療
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-0614-68
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Figure 106134614-A0305-02-0627-103
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<212> PRT
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<212> PRT
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<211> 15
<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0633-119
<210> 93
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0633-120
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 94
Figure 106134614-A0305-02-0633-121
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 95
Figure 106134614-A0305-02-0633-122
<210> 96
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 96
Figure 106134614-A0305-02-0634-123
<210> 97
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 97
Figure 106134614-A0305-02-0634-124
<210> 98
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 98
Figure 106134614-A0305-02-0634-125
<210> 99
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0635-126
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0635-127
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 101
Figure 106134614-A0305-02-0635-128
<210> 102
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 102
Figure 106134614-A0305-02-0635-131
Figure 106134614-A0305-02-0636-132
<210> 103
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
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Figure 106134614-A0305-02-0636-133
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Figure 106134614-A0305-02-0638-136
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Figure 106134614-A0305-02-0639-139
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Figure 106134614-A0305-02-0640-141
Figure 106134614-A0305-02-0641-142
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Figure 106134614-A0305-02-0645-153
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Figure 106134614-A0305-02-0646-156
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Figure 106134614-A0305-02-0650-169
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Figure 106134614-A0305-02-0651-172
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Figure 106134614-A0305-02-0653-175
Figure 106134614-A0305-02-0654-176
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Figure 106134614-A0305-02-0656-178
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Figure 106134614-A0305-02-0659-192
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<212> PRT
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<220>
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<221> source
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 158
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<212> PRT
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<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0665-208
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 161
Figure 106134614-A0305-02-0666-210
Figure 106134614-A0305-02-0667-211
Figure 106134614-A0305-02-0668-212
<210> 162
<211> 1476
<212> DNA
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<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0668-213
Figure 106134614-A0305-02-0669-214
<210> 163
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0669-215
<210> 164
<211> 17
<212> PRT
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<220>
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<210> 165
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0670-217
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<4o0> 166
Figure 106134614-A0305-02-0670-218
<210> 167
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0670-219
<210> 168
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 169
Figure 106134614-A0305-02-0671-221
<210> 170
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 170
Figure 106134614-A0305-02-0671-222
<210> 171
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 171
Figure 106134614-A0305-02-0671-224
Figure 106134614-A0305-02-0672-225
<210> 172
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<212> PRT
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 183
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<220>
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<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0678-245
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Figure 106134614-A0305-02-0679-247
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Figure 106134614-A0305-02-0680-249
Figure 106134614-A0305-02-0681-250
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Figure 106134614-A0305-02-0684-258
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-0686-267
<210> 200
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<220>
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<210> 213
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<212> PRT
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<220>
<221> source
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<400> 213
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Figure 106134614-A0305-02-0691-286
<210> 214
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<212> DNA
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<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0692-287
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0693-289
Figure 106134614-A0305-02-0694-291
Figure 106134614-A0305-02-0695-292
<210> 216
<211> 1476
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Figure 106134614-A0305-02-0696-294
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0697-299
<210> 221
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 221
Figure 106134614-A0305-02-0697-300
<210> 222
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 222
Figure 106134614-A0305-02-0697-301
<210> 223
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 223
Figure 106134614-A0305-02-0698-302
<210> 224
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 224
Figure 106134614-A0305-02-0698-303
<210> 225
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 225
Figure 106134614-A0305-02-0698-304
<210> 226
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 226
Figure 106134614-A0305-02-0698-305
Figure 106134614-A0305-02-0699-306
<210> 227
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 227
Figure 106134614-A0305-02-0699-307
<210> 228
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 228
Figure 106134614-A0305-02-0700-310
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0700-309
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0700-308
<210> 231
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0701-311
<210> 232
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 232
Figure 106134614-A0305-02-0701-312
<210> 233
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 233
Figure 106134614-A0305-02-0701-313
<210> 234
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 234
Figure 106134614-A0305-02-0701-314
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 235
Figure 106134614-A0305-02-0702-315
<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 236
Figure 106134614-A0305-02-0702-316
<210> 237
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 237
Figure 106134614-A0305-02-0702-317
Figure 106134614-A0305-02-0703-318
<210> 238
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0703-319
<210> 239
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0703-320
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0705-322
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-0707-325
Figure 106134614-A0305-02-0708-326
<210> 243
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 106134614-A0305-02-0710-333
Figure 106134614-A0305-02-0711-334
<210> 249
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<220>
<221> source
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<211> 8
<212> PRT
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<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0711-337
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-0714-345
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<211> 6
<212> PRT
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0715-348
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<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0715-349
<210> 264
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<220>
<221> source
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<210> 265
<211> 318
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<211> 20
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Figure 106134614-A0305-02-0718-354
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Figure 106134614-A0305-02-0719-356
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Figure 106134614-A0305-02-0720-358
Figure 106134614-A0305-02-0721-359
<210> 270
<211> 1476
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<221> source
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<221> source
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<221> source
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<220>
<221> source
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<400> 274
Figure 106134614-A0305-02-0724-365
<210> 275
<211> 6
<212> PRT
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<220>
<221> source
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<400> 275
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<210> 276
<211> 13
<212> PRT
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<220>
<221> source
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<400> 276
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 277
Figure 106134614-A0305-02-0724-368
<210> 278
<211> 8
<212> PRT
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<220>
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<400> 278
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<211> 15
<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<221> source
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<400> 280
Figure 106134614-A0305-02-0725-371
Figure 106134614-A0305-02-0726-372
<210> 281
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<221> source
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<221> source
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<210> 285
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 285
Figure 106134614-A0305-02-0727-377
<210> 286
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 286
Figure 106134614-A0305-02-0728-379
<210> 287
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 287
Figure 106134614-A0305-02-0728-381
<210> 288
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 288
Figure 106134614-A0305-02-0728-382
<210> 289
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 289
Figure 106134614-A0305-02-0728-383
<210> 290
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 290
Figure 106134614-A0305-02-0729-384
<210> 291
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 291
Figure 106134614-A0305-02-0729-386
<210> 292
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 292
Figure 106134614-A0305-02-0730-388
<210> 293
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 293
Figure 106134614-A0305-02-0730-389
<210> 294
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 294
Figure 106134614-A0305-02-0730-390
Figure 106134614-A0305-02-0731-391
Figure 106134614-A0305-02-0732-392
<210> 295
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 295
Figure 106134614-A0305-02-0732-393
<210> 296
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 296
Figure 106134614-A0305-02-0732-394
Figure 106134614-A0305-02-0733-395
Figure 106134614-A0305-02-0734-396
Figure 106134614-A0305-02-0735-397
<210> 297
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0735-398
Figure 106134614-A0305-02-0736-399
<210> 298
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 298
Figure 106134614-A0305-02-0736-400
<210> 299
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 299
Figure 106134614-A0305-02-0736-402
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<211> 13
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<212> PRT
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-0737-407
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Figure 106134614-A0305-02-0738-409
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Figure 106134614-A0305-02-0743-425
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Figure 106134614-A0305-02-0747-435
Figure 106134614-A0305-02-0748-436
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Figure 106134614-A0305-02-0749-438
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<212> PRT
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-0754-455
<210> 341
<211> 6
<212> PRT
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-0755-458
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-0760-468
Figure 106134614-A0305-02-0761-469
<210> 351
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<212> DNA
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Figure 106134614-A0305-02-0763-471
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<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0764-476
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0764-477
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0764-478
Figure 106134614-A0305-02-0765-479
<210> 359
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0765-480
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0765-481
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0765-482
Figure 106134614-A0305-02-0766-484
<210> 362
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0766-485
<210> 363
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 363
Figure 106134614-A0305-02-0767-486
<210> 364
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0767-487
<210> 365
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 365
Figure 106134614-A0305-02-0767-488
<210> 366
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 366
Figure 106134614-A0305-02-0767-489
<210> 367
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 367
Figure 106134614-A0305-02-0768-490
<210> 368
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 368
Figure 106134614-A0305-02-0768-491
<210> 369
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 369
Figure 106134614-A0305-02-0768-492
<210> 370
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 370
Figure 106134614-A0305-02-0768-493
<210> 371
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 371
Figure 106134614-A0305-02-0769-494
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 372
Figure 106134614-A0305-02-0769-495
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<211> 318
<212> DNA
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<400> 373
Figure 106134614-A0305-02-0770-496
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 374
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 375
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Figure 106134614-A0305-02-0772-499
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0773-502
Figure 106134614-A0305-02-0774-503
Figure 106134614-A0305-02-0775-504
<210> 378
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<212> DNA
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<220>
<221> source
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<400> 378
Figure 106134614-A0305-02-0775-505
Figure 106134614-A0305-02-0776-506
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 383
Figure 106134614-A0305-02-0777-511
<210> 384
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 384
Figure 106134614-A0305-02-0778-512
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 385
Figure 106134614-A0305-02-0778-513
<210> 386
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0778-514
<210> 387
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0778-515
<210> 388
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 388
Figure 106134614-A0305-02-0779-516
<210> 389
<211> 366
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Figure 106134614-A0305-02-0779-517
Figure 106134614-A0305-02-0780-518
<210> 390
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 390
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 391
Figure 106134614-A0305-02-0780-520
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 392
Figure 106134614-A0305-02-0780-521
<210> 393
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 393
Figure 106134614-A0305-02-0781-522
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 394
Figure 106134614-A0305-02-0781-523
<210> 395
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 395
Figure 106134614-A0305-02-0781-524
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 396
Figure 106134614-A0305-02-0782-525
<210> 397
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 397
Figure 106134614-A0305-02-0782-527
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 398
Figure 106134614-A0305-02-0782-528
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 399
Figure 106134614-A0305-02-0782-529
Figure 106134614-A0305-02-0783-530
<210> 400
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0783-531
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 401
Figure 106134614-A0305-02-0784-532
<210> 402
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 402
Figure 106134614-A0305-02-0784-533
Figure 106134614-A0305-02-0785-536
<210> 403
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<212> DNA
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<220>
<221> source
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<400> 403
Figure 106134614-A0305-02-0785-535
Figure 106134614-A0305-02-0786-537
<210> 404
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 404
Figure 106134614-A0305-02-0786-539
Figure 106134614-A0305-02-0787-540
Figure 106134614-A0305-02-0788-541
<210> 405
<211> 1476
<212> DNA
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<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0788-542
Figure 106134614-A0305-02-0789-543
<210> 406
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0790-544
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 407
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0790-546
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0790-547
<210> 410
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 410
Figure 106134614-A0305-02-0791-548
<210> 411
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<210> 412
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0791-550
<210> 413
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 413
Figure 106134614-A0305-02-0791-551
Figure 106134614-A0305-02-0792-552
<210> 414
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 414」
Figure 106134614-A0305-02-0792-553
<210> 415
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 415
Figure 106134614-A0305-02-0792-554
Figure 106134614-A0305-02-0793-555
<210> 416
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<210> 417
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 417
Figure 106134614-A0305-02-0793-557
<210> 418
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 418
Figure 106134614-A0305-02-0794-560
<210> 419
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 419
Figure 106134614-A0305-02-0794-562
<210> 420
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 420
Figure 106134614-A0305-02-0794-563
<210> 421
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 421
Figure 106134614-A0305-02-0794-564
<210> 422
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 422
Figure 106134614-A0305-02-0795-565
<210> 423
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 423
Figure 106134614-A0305-02-0795-566
<210> 424
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 424
Figure 106134614-A0305-02-0795-567
<210> 425
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 425
Figure 106134614-A0305-02-0795-568
<210> 426
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 426
Figure 106134614-A0305-02-0796-569
<210> 427
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 427
Figure 106134614-A0305-02-0796-570
Figure 106134614-A0305-02-0797-571
<210> 428
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 428
Figure 106134614-A0305-02-0797-572
<210> 429
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 429
Figure 106134614-A0305-02-0797-573
Figure 106134614-A0305-02-0798-574
<210> 430
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 430
Figure 106134614-A0305-02-0799-575
<210> 431
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 431
Figure 106134614-A0305-02-0799-576
Figure 106134614-A0305-02-0800-577
Figure 106134614-A0305-02-0801-578
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Figure 106134614-A0305-02-0819-618
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<213> 人工序列
<220>
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<211> 8
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<220>
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-0837-663
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<221> source
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<400> 495
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 496
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 498
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-0845-685
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Figure 106134614-A0305-02-0847-689
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<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0851-696
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Figure 106134614-A0305-02-0855-709
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<210> 537
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<212> PRT
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<212> PRT
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<210> 539
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<212> PRT
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<221> source
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<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0860-724
<210> 543
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0863-731
<210> 550
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0863-732
<210> 551
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0863-733
<210> 552
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 553
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 554
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0865-737
<210> 555
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0865-738
<210> 556
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0865-739
<210> 557
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 558
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 558
Figure 106134614-A0305-02-0866-741
<210> 559
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0866-742
<210> 560
<211> 7
<212> PRT
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<220>
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<400> 560
Figure 106134614-A0305-02-0866-743
<210> 561
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 561
Figure 106134614-A0305-02-0867-744
<210> 562
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 562
Figure 106134614-A0305-02-0867-745
<210> 563
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 563
Figure 106134614-A0305-02-0867-747
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<211> 110
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<213> 人工序列
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Figure 106134614-A0305-02-0870-752
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Figure 106134614-A0305-02-0875-767
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Figure 106134614-A0305-02-0878-779
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Figure 106134614-A0305-02-0880-783
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Figure 106134614-A0305-02-0884-797
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Figure 106134614-A0305-02-0887-809
Figure 106134614-A0305-02-0888-810
<210> 615
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<211> 15
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0889-814
Figure 106134614-A0305-02-0890-815
<210> 618
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0891-817
<210> 620
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0891-818
<210> 621
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0891-819
<210> 622
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0891-820
<210> 623
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0892-821
<210> 624
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 624
Figure 106134614-A0305-02-0892-822
<210> 625
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 625
Figure 106134614-A0305-02-0892-824
<210> 626
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0893-825
<210> 627
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 627
Figure 106134614-A0305-02-0893-826
<210> 628
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 628
Figure 106134614-A0305-02-0893-828
Figure 106134614-A0305-02-0894-829
<210> 629
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 629
Figure 106134614-A0305-02-0894-830
<210> 630
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 630
Figure 106134614-A0305-02-0894-831
<210> 631
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<400> 634
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Figure 106134614-A0305-02-0896-837
<210> 635
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<213> 人工序列
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Figure 106134614-A0305-02-0899-847
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Figure 106134614-A0305-02-0915-894
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<210> 687
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0916-897
<210> 688
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0916-898
<210> 689
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 106134614-A0305-02-0916-899
Figure 106134614-A0305-02-0917-900
<210> 690
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<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0917-901
<210> 691
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0918-902
<210> 692
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0918-903
Figure 106134614-A0305-02-0919-904
<210> 693
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
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Figure 106134614-A0305-02-0919-905
Figure 106134614-A0305-02-0920-906
<210> 694
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0920-907
<210> 695
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0920-908
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0921-909
<210> 697
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0921-910
<210> 698
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0933-948
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Figure 106134614-A0305-02-0938-964
Figure 106134614-A0305-02-0939-965
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Figure 106134614-A0305-02-0941-969
Figure 106134614-A0305-02-0942-970
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Figure 106134614-A0305-02-0945-981
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Figure 106134614-A0305-02-0946-982
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<212> PRT
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<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0946-983
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-0946-984
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<212> PRT
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<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0947-986
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-0947-987
<210> 759
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 106134614-A0305-02-0947-988
<210> 760
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-0948-989
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Figure 106134614-A0305-02-0949-991
<210> 762
<211> 15
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Figure 106134614-A0305-02-0949-992
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<212> PRT
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<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0949-993
Figure 106134614-A0305-02-0950-994
<210> 764
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<212> PRT
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<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0950-995
Figure 106134614-A0305-02-0951-996
Figure 106134614-A0305-02-0952-997
Figure 106134614-A0305-02-0953-998
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Figure 106134614-A0305-02-0954-1000
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Figure 106134614-A0305-02-0955-1002
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<213> 人工序列
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Figure 106134614-A0305-02-0956-1003
Figure 106134614-A0305-02-0957-1004
Figure 106134614-A0305-02-0958-1005
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Figure 106134614-A0305-02-0960-1010
Figure 106134614-A0305-02-0961-1011
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Figure 106134614-A0305-02-0963-1014
Figure 106134614-A0305-02-0964-1015
Figure 106134614-A0305-02-0965-1016
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Figure 106134614-A0305-02-0968-1020
Figure 106134614-A0305-02-0969-1021
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-0975-1044
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<212> PRT
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<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0980-1060
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 336
<212> DNA
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0983-1069
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0983-1070
Figure 106134614-A0305-02-0984-1071
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<212> DNA
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<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0984-1072
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0985-1073
Figure 106134614-A0305-02-0986-1074
<210> 817
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 817
Figure 106134614-A0305-02-0986-1075
Figure 106134614-A0305-02-0987-1076
<210> 818
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0987-1077
<210> 819
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0987-1078
<210> 820
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 820
Figure 106134614-A0305-02-0988-1079
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<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0989-1080
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-0989-1081
Figure 106134614-A0305-02-0990-1082
Figure 106134614-A0305-02-0991-1083
<210> 823
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 823
Figure 106134614-A0305-02-0991-1084
Figure 106134614-A0305-02-0992-1085
<210> 824
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<400> 824
Figure 106134614-A0305-02-0992-1086
Figure 106134614-A0305-02-0993-1087
<210> 825
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-0993-1088
<210> 826
<211> 93
<212> PRT
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<220>
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<213> 人工序列
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Figure 106134614-A0305-02-1009-1117
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Figure 106134614-A0305-02-1022-1133
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Figure 106134614-A0305-02-1025-1137
Figure 106134614-A0305-02-1026-1138
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Figure 106134614-A0305-02-1027-1140
Figure 106134614-A0305-02-1028-1141
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Figure 106134614-A0305-02-1049-1169
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Figure 106134614-A0305-02-1055-1176
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Figure 106134614-A0305-02-1060-1183
Figure 106134614-A0305-02-1061-1184
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Figure 106134614-A0305-02-1065-1189
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Figure 106134614-A0305-02-1070-1195
Figure 106134614-A0305-02-1071-1196
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Figure 106134614-A0305-02-1072-1198
Figure 106134614-A0305-02-1073-1199
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Figure 106134614-A0305-02-1075-1202
Figure 106134614-A0305-02-1076-1203
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Figure 106134614-A0305-02-1079-1207
Figure 106134614-A0305-02-1080-1208
Figure 106134614-A0305-02-1081-1209
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Figure 106134614-A0305-02-1084-1214
Figure 106134614-A0305-02-1085-1215
Figure 106134614-A0305-02-1086-1216
Figure 106134614-A0305-02-1087-1217
<210> 875
<211> 5
<212> PRT
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<221> source
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<213> 人工序列
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<211> 21
<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-1090-1224
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Figure 106134614-A0305-02-1092-1227
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Figure 106134614-A0305-02-1093-1229
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Figure 106134614-A0305-02-1094-1231
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Figure 106134614-A0305-02-1096-1235
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<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-1096-1236
Figure 106134614-A0305-02-1097-1237
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<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-1098-1239
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<221> source
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-1101-1246
<210> 895
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<212> DNA
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Figure 106134614-A0305-02-1102-1248
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<210> 899
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-1108-1270
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<220>
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<210> 917
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 17
<212> PRT
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<220>
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Figure 106134614-A0305-02-1111-1284
Figure 106134614-A0305-02-1112-1285
<210> 928
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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Figure 106134614-A0305-02-1112-1286
<210> 929
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-1112-1287
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 930
Figure 106134614-A0305-02-1112-1288
<210> 931
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-1113-1289
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Figure 106134614-A0305-02-1113-1290
<210> 933
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
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<211> 14
<212> PRT
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<220>
<221> source
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<212> PRT
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<220>
<221> source
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<210> 999
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> source
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<210> 1009
<211> 14
<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-1143-1399
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Figure 106134614-A0305-02-1145-1406
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Figure 106134614-A0305-02-1154-1420
Figure 106134614-A0305-02-1155-1421
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Figure 106134614-A0305-02-1159-1427
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Figure 106134614-A0305-02-1165-1435
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Figure 106134614-A0305-02-1168-1439
Figure 106134614-A0305-02-1169-1440
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Figure 106134614-A0305-02-1170-1442
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Figure 106134614-A0305-02-1172-1444
Figure 106134614-A0305-02-1173-1445
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-1174-1447
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Figure 106134614-A0305-02-1175-1449
Figure 106134614-A0305-02-1176-1450
Figure 106134614-A0305-02-1177-1451
<210> 1062
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Figure 106134614-A0305-02-1178-1453
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<212> PRT
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Figure 106134614-A0305-02-1179-1455
Figure 106134614-A0305-02-1180-1456
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Figure 106134614-A0305-02-1184-1461
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Figure 106134614-A0305-02-1186-1464
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<400> 1067
Figure 106134614-A0305-02-1186-1465
Figure 106134614-A0305-02-1187-1466
Figure 106134614-A0305-02-1188-1467
<210> 1068
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 1068
Figure 106134614-A0305-02-1188-1468
Figure 106134614-A0305-02-1189-1469
<210> 1069
<211> 491
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 1069
Figure 106134614-A0305-02-1190-1470
Figure 106134614-A0305-02-1191-1471
Figure 106134614-A0305-02-1192-1472
<210> 1070
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 1070
Figure 106134614-A0305-02-1192-1473
Figure 106134614-A0305-02-1193-1474
<210> 1071
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 1071
Figure 106134614-A0305-02-1193-1475
Figure 106134614-A0305-02-1194-1476
Figure 106134614-A0305-02-1195-1477
Figure 106134614-A0305-02-1196-1478
<210> 1072
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 1072
Figure 106134614-A0305-02-1196-1480
<210> 1073
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 1073
Figure 106134614-A0305-02-1196-1481
<210> 1074
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 1074
Figure 106134614-A0305-02-1197-1482
<210> 1075
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(7)
<223> /替代=「Gly」
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> /替代=「Pro」
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> /注釋=「序列中所給出之變體殘基相對於變體位置之註解中之彼等不具優先性」
<400> 1075
Figure 106134614-A0305-02-1197-1483
<210> 1076
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> /替代=「Ser」
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> /替代=「Tyr」
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> /替代=「Tyr」
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> /替代=「Gly」
<220>
<221> VARIANT
<222> (7)..(8)
<223> /替代=「Ser」
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(13)
<223> /注釋=「序列中所給出之變體殘基相對於變體位置之註解中之彼等不具優先性」
<400> 1076
Figure 106134614-A0305-02-1198-1484
<210> 1077
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> /替代=「Ser」
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> /替代=「His」
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> /注釋=「序列中所給出之變體殘基相對於變體位置之註解中之彼等不具優先性」
<400> 1077
Figure 106134614-A0305-02-1199-1485
<210> 1078
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 1078
Figure 106134614-A0305-02-1199-1486
<210> 1079
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> /替代=「Ile」
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> /注釋=「序列中所給出之變體殘基相對於變體位置之註解中之彼等不具優先性」
<400> 1079
Figure 106134614-A0305-02-1200-1487
<210> 1080
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 1080
Figure 106134614-A0305-02-1200-1488
<210> 1081
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成寡核苷酸」
<400> 1081
Figure 106134614-A0305-02-1200-1489
<210> 1082
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(30)
<223> /注釋=「此序列可涵蓋0-6個「Gly Gly Gly Gly Ser」重複單元」
<400> 1082
Figure 106134614-A0305-02-1201-1490
<210> 1083
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 1083
Figure 106134614-A0305-02-1201-1491
<210> 1084
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 1084
Figure 106134614-A0305-02-1201-1492
<210> 1085
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 1085
Figure 106134614-A0305-02-1202-1494
<210> 1086
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 1086
Figure 106134614-A0305-02-1202-1495
<210> 1087
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 1087
Figure 106134614-A0305-02-1202-1496
<210> 1088
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 1088
Figure 106134614-A0305-02-1203-1497
<210> 1089
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(30)
<223> /注釋=「此序列可涵蓋1-6個「Gly Gly Gly Gly Ser」重複單元」
<400> 1089
Figure 106134614-A0305-02-1203-1498
<210> 1090
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 1090
Figure 106134614-A0305-02-1203-1499
<210> 1091
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 1091
Figure 106134614-A0305-02-1204-1531
<210> 1092
<211> 5000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5000)
<223> /注釋=「此序列可涵蓋50-5000個核苷酸」
<220>
<221> source
<223> /注釋=「關於取代及較佳實施例之詳細描述參見如所提交之說明書」
<400> 1092
Figure 106134614-A0305-02-1204-1500
Figure 106134614-A0305-02-1205-1501
Figure 106134614-A0305-02-1206-1502
Figure 106134614-A0305-02-1207-1503
<210> 1093
<211> 2000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2000)
<223> /注釋=「此序列可涵蓋50-2000個核苷酸」
<400> 1093
Figure 106134614-A0305-02-1207-1504
Figure 106134614-A0305-02-1208-1505
Figure 106134614-A0305-02-1209-1506
<210> 1094
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<400> 1094
Figure 106134614-A0305-02-1209-1507
<210> 1095
<211> 5000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5000)
<223> /注釋=「此序列可涵蓋50-5000個核苷酸」
<400> 1095
Figure 106134614-A0305-02-1209-1508
Figure 106134614-A0305-02-1210-1509
Figure 106134614-A0305-02-1211-1510
Figure 106134614-A0305-02-1212-1511
<210> 1096
<211> 5000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5000)
<223> /注釋=「此序列可涵蓋100-5000個核苷酸」
<400> 1096
Figure 106134614-A0305-02-1213-1512
Figure 106134614-A0305-02-1214-1513
Figure 106134614-A0305-02-1215-1514
Figure 106134614-A0305-02-1216-1515
<210> 1097
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 1097
Figure 106134614-A0305-02-1216-1516
Figure 106134614-A0305-02-1217-1517
Figure 106134614-A0305-02-1218-1518
<210> 1098
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 1098
Figure 106134614-A0305-02-1218-1519
Figure 106134614-A0305-02-1219-1520
Figure 106134614-A0305-02-1220-1521
<210> 1099
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 1099
Figure 106134614-A0305-02-1221-1522
<210> 1100
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 1100
Figure 106134614-A0305-02-1221-1523
<210> 1101
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 1101
Figure 106134614-A0305-02-1221-1524
Figure 106134614-A0305-02-1222-1525
<210> 1102
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」
<400> 1102
Figure 106134614-A0305-02-1223-1526
Figure 106134614-A0305-02-1224-1527
<210> 1103
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」
<400> 1103
Figure 106134614-A0305-02-1224-1528

Claims (51)

  1. 一種編碼嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor；CAR)之經分離核酸分子，其中該CAR包含CD20結合域、跨膜域及細胞內信號傳導域，其中該CD20結合域包含輕鏈互補決定區1(LCDR1)、輕鏈互補決定區2(LCDR2)、輕鏈互補決定區3(LCDR3)、重鏈互補決定區1(HCDR1)、重鏈互補決定區2(HCDR2)及重鏈互補決定區3(HCDR3)，其中該LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2及HCDR3分別包含：(i)SEQ ID NO：147、148、149、136、137及138；(ii)SEQ ID NO：150、151、152、139、140及141；(iii)SEQ ID NO：153、154、155、142、143及144；(iv)SEQ ID NO：929、930、931、926、927及928；(v)SEQ ID NO：228、229、230、217、218及219；(vi)SEQ ID NO：231、232、233、220、221及222；(vii)SEQ ID NO：234、235、236、223、224及225；或(viii)SEQ ID NO：944、945、988、941、942及943。
  2. 如請求項1之經分離核酸分子，其中該經編碼之CAR包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中：(i)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：156、129、439、237、264、291、318或443之胺基酸序列；(ii)該輕鏈可變區包含具有SEQ ID NO：156、129、439、237、264、291、318或443之輕鏈可變區之至少1個、2個或3個修飾 但不超過30個、20個或10個修飾的胺基酸序列；(iii)該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：156、129、439、237、264、291、318或443之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列；(iv)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：145、118、437、226、253、280、307或441之胺基酸序列；(v)該重鏈可變區包含具有SEQ ID NO：145、118、437、226、253、280、307或441之輕鏈可變區之至少1個、2個或3個修飾但不超過30個、20個或10個修飾的胺基酸序列；(vi)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：145、118、437、226、253、280、307或441之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列；或(vii)該輕鏈可變區及該重鏈可變區分別包含：(a)SEQ ID NO：156及145；(b)SEQ ID NO：129及118；(c)SEQ ID NO：439及437；(d)SEQ ID NO：237及226；(e)SEQ ID NO：264及253；(f)SEQ ID NO：291及280；(g)SEQ ID NO：318及307；或(h)SEQ ID NO：443及441。
  3. 如請求項1或2之經分離核酸分子，其中： (i)該CD20結合域係scFv；(ii)該CD20結合域包含SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：294或SEQ ID NO：321之胺基酸序列，或與其具有至少95%一致性之胺基酸序列，或相對於上述胺基酸序列中任一者具有至少1個、2個或3個修飾但不超過20個、10個或5個修飾之胺基酸序列；或(iii)該編碼CD20結合域之核酸序列包含SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：295或SEQ ID NO：322之核苷酸序列，或與其具有至少95%一致性之核苷酸序列。
  4. 如請求項1或2之經分離核酸分子，其中該核酸分子包含：(i)SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：438、SEQ ID NO：227、SEQ ID NO：254、SEQ ID NO：281、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：442、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：440、SEQ ID NO：238、SEQ ID NO：265、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：444之核苷酸序列，或與其具有至少95%一致性之核苷酸序列；或(ii)SEQ ID NO：157及146、SEQ ID NO：130及119、SEQ ID NO：440及438、SEQ ID NO：238及227、SEQ ID NO：265及254、SEQ ID NO：292及281、SEQ ID NO：319及308或SEQ ID NO：444及442之核苷酸序列。
  5. 如請求項1或2之經分離核酸分子，其中：(i)該跨膜域包含選自由以下組成之群之蛋白質之跨膜域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137及CD154；(ii)該跨膜域包含包括SEQ ID NO：801之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾但不超過20個、10個或5個修飾的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：801之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列；(iii)該跨膜域包含SEQ ID NO：801之胺基酸序列；(iv)編碼該跨膜域之核酸序列包含SEQ ID NO：802之核苷酸序列，或與其具有至少95%一致性之核苷酸序列；(v)該CD20結合域藉由鉸鏈區連接至該跨膜域；(vi)該CD20結合域藉由鉸鏈區連接至該跨膜域，其中該鉸鏈區包含SEQ ID NO：799或SEQ ID NO：814之胺基酸序列，或與其具有至少95%一致性之胺基酸序列；或(vii)該CD20結合域藉由鉸鏈區連接至該跨膜域，其中編碼該鉸鏈區之核酸序列包含SEQ ID NO：800或SEQ ID NO：815之核苷酸序列，或與其具有至少95%一致性之核苷酸序列。
  6. 如請求項1或2之經分離核酸分子，其中：(i)該細胞內信號傳導域包含共刺激域；(ii)該細胞內信號傳導域包含共刺激域，其中該共刺激域係獲自選 自由以下組成之群之蛋白質之功能性信號傳導域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)；(iii)該細胞內信號傳導域包含共刺激域，其中該共刺激域包含具有SEQ ID NO：803之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾但不超過20個、10個或5個修飾的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：803之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列；(iv)該細胞內信號傳導域包含共刺激域，其中該共刺激域包含SEQ ID NO：803之胺基酸序列；(v)該細胞內信號傳導域包含共刺激域，其中編碼該共刺激域之核酸序列包含SEQ ID NO：804之核苷酸序列，或與其具有至少95%一致性之核苷酸序列；(vi)該細胞內信號傳導域包含初級(primary)信號傳導域；(vii)該細胞內信號傳導域包含初級信號傳導域，其中該初級信號傳導域包含CD3ζ之功能性信號傳導域；(viii)該細胞內信號傳導域包含初級信號傳導域，其中該初級信號傳導域包含SEQ ID NO：805或SEQ ID NO：807之胺基酸序列；(ix)該細胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及/或CD3ζ之功能性信號傳導域；(x)該細胞內信號傳導域包含具有SEQ ID NO：803之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：805或SEQ ID NO：807之序列之至少1個、2個或3個修飾但不超過20個、10個或5個修飾的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：803之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：805或SEQ ID NO：807之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列；(xi)該細胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：803之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：805或SEQ ID NO：807之胺基酸序列；(xii)該細胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：803之胺基酸序列及SEQ ID NO：805或SEQ ID NO：807之胺基酸序列；(xiii)該細胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：803之胺基酸序列及SEQ ID NO：805或SEQ ID NO：807之胺基酸序列，其中包含該細胞內信號傳導域之序列係在同一框架中且以單一多肽鏈表現；或(xiv)編碼該細胞內信號傳導域之核酸序列包含SEQ ID NO：804之核苷酸序列或與其具有至少95%一致性之核苷酸序列，及/或SEQ ID NO：893、808、806或1074之核苷酸序列或與其具有至少95一致性之核苷酸序列。
  7. 如請求項1或2之經分離核酸分子，其進一步包含前導序列。
  8. 如請求項7之經分離核酸分子，其中該前導序列編碼包含SEQ ID NO：797之胺基酸序列之多肽。
  9. 如請求項1或2之經分離核酸分子，其中：(i)該經編碼之CAR包含SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：296或SEQ ID NO：323之胺基酸序列，或與其具有至少95%一致性之胺基 酸序列，或包含SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：296或SEQ ID NO：323之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾但不超過30個、20個、10個或5個修飾的胺基酸序列，其中該CAR包括或不包括包含SEQ ID NO：797之胺基酸序列之信號肽；(ii)該經編碼之CAR包含SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：296或SEQ ID NO：323之胺基酸序列，其中該CAR包括或不包括包含SEQ ID NO：797之胺基酸序列之信號肽；(iii)該核酸分子包含SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：270、SEQ ID NO：297或SEQ ID NO：324之核苷酸序列，或與其具有至少95%一致性之核苷酸序列，其中該核酸分子包括或不包括SEQ ID NO：798之核苷酸序列；或(iv)該核酸分子包含SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：270、SEQ ID NO：297或SEQ ID NO：324之核苷酸序列，其中該核酸分子包括或不包括SEQ ID NO：798之核苷酸序列。
  10. 一種經分離多肽分子，其係由如請求項1至9中任一項之核酸分子編碼。
  11. 一種經分離CAR分子，其包含CD20結合域、跨膜域及細胞內信號傳 導域，其中該CD20結合域包含輕鏈互補決定區1(LCDR1)、輕鏈互補決定區2(LCDR2)、輕鏈互補決定區3(LCDR3)、重鏈互補決定區1(HCDR1)、重鏈互補決定區2(HCDR2)及重鏈互補決定區3(HCDR3)，其中該LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2及HCDR3分別包含：(i)SEQ ID NO：147、148、149、136、137及138；(ii)SEQ ID NO：150、151、152、139、140及141；(iii)SEQ ID NO：153、154、155、142、143及144；(iv)SEQ ID NO：929、930、931、926、927及928；(v)SEQ ID NO：228、229、230、217、218及219；(vi)SEQ ID NO：231、232、233、220、221及222；(vii)SEQ ID NO：234、235、236、223、224及225；或(viii)SEQ ID NO：944、945、988、941、942及943。
  12. 如請求項11之經分離CAR分子，其中該CAR分子包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中：(i)該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：156、129、439、237、264、291、318或443之胺基酸序列；(ii)該輕鏈可變區包含具有SEQ ID NO：156、129、439、237、264、291、318或443之輕鏈可變區之至少1個、2個或3個修飾但不超過30個、20個或10個修飾的胺基酸序列；(iii)該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：156、129、439、237、264、291、318或443之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列； (iv)該重鏈可變區包含SEQ ID NO：145、118、437、226、253、280、307或441之胺基酸序列；(v)該重鏈可變區包含具有SEQ ID NO：145、118、437、226、253、280、307或441之輕鏈可變區之至少1個、2個或3個修飾但不超過30個、20個或10個修飾的胺基酸序列；(vi)該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：145、118、437、226、253、280、307或441之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列；或(vii)該輕鏈可變區及該重鏈可變區分別包含：(a)SEQ ID NO：156及145；(b)SEQ ID NO：129及118；(c)SEQ ID NO：439及437；(d)SEQ ID NO：237及226；(e)SEQ ID NO：264及253；(f)SEQ ID NO：291及280；(g)SEQ ID NO：318及307；或(h)SEQ ID NO：443及441。
  13. 如請求項11或12之經分離CAR分子，其中：(i)該CD20結合域係scFv；或(ii)該CD20結合域包含SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：294或SEQ ID NO：321之胺基酸序列，或與其具有至少95%一致性之胺基酸 序列。
  14. 如請求項11或12之經分離CAR分子，其中：(i)該CAR分子包含選自由以下組成之群之蛋白質之跨膜域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137及CD154；(ii)該跨膜域包含具有SEQ ID NO：801之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾但不超過20個、10個或5個修飾的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：801之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列；(iii)該跨膜域包含SEQ ID NO：801之胺基酸序列；(iv)該CD20結合域藉由鉸鏈區連接至該跨膜域，其中該鉸鏈區包含SEQ ID NO：799或SEQ ID NO：814之胺基酸序列，或與其具有至少95%一致性之胺基酸序列。
  15. 如請求項11或12之經分離CAR分子，其中：(i)該細胞內信號傳導域包含共刺激域，(ii)該細胞內信號傳導域包含共刺激域，其中該共刺激域包含選自由以下組成之群之蛋白質之功能性信號傳導域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)；(iii)該細胞內信號傳導域包含共刺激域，其中該共刺激域包含具有 SEQ ID NO：803之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾但不超過20個、10個或5個修飾的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：803之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列；(iv)該細胞內信號傳導域包含共刺激域，其中該共刺激域包含SEQ ID NO：803之胺基酸序列；(v)該細胞內信號傳導域包含初級信號傳導域；(vi)該細胞內信號傳導域包含初級信號傳導域，其中該初級信號傳導域包含CD3ζ之功能性信號傳導域；(vii)該細胞內信號傳導域包含初級信號傳導域，其中該初級信號傳導域包含SEQ ID NO：805或SEQ ID NO：807之胺基酸序列；(viii)該細胞內信號傳導域包含4-1BB之功能性信號傳導域及/或CD3ζ之功能性信號傳導域；(ix)該細胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：803之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：805之胺基酸序列；(x)該細胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：803之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：807之胺基酸序列；(xi)該細胞內信號傳導域包含具有SEQ ID NO：803之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：805或SEQ ID NO：807之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾但不超過20個、10個或5個修飾的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：803之胺基酸序列及/或SEQ ID NO：805或SEQ ID NO：807之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列；或(xii)該細胞內信號傳導域包含SEQ ID NO：803之胺基酸序列及SEQ ID NO：805或SEQ ID NO：807之胺基酸序列，其中包含該細胞內信號傳導域之序列係在同一框架中且以單一多肽鏈表現。
  16. 如請求項11或12之經分離CAR分子，其進一步包含前導序列。
  17. 如請求項16之經分離CAR分子，其中該前導序列包含SEQ ID NO：797之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：797之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列。
  18. 如請求項11或12之經分離CAR分子，其包含：(i)SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：296或SEQ ID NO：323之胺基酸序列，或與其具有至少95%一致性之胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：296或SEQ ID NO：323之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾但不超過30個、20個、10個或5個修飾的胺基酸序列，其中該CAR分子包括或不包括包含SEQ ID NO：797之胺基酸序列之信號肽；或(ii)SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：269、SEQ ID NO：296或SEQ ID NO：323之胺基酸序列，其中該CAR分子包括或不包括包含SEQ ID NO：797之胺基酸序列之信號肽。
  19. 一種CD20結合域，其包含輕鏈互補決定區1(LCDR1)、輕鏈互補決定區2(LCDR2)、輕鏈互補決定區3(LCDR3)、重鏈互補決定區1(HCDR1)、重鏈互補決定區2(HCDR2)及重鏈互補決定區3(HCDR3)，其中該LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2及HCDR3分別包含：(i)SEQ ID NO：147、148、149、136、137及138；(ii)SEQ ID NO：150、151、152、139、140及141；(iii)SEQ ID NO：153、154、155、142、143及144；(iv)SEQ ID NO：929、930、931、926、927及928；(v)SEQ ID NO：228、229、230、217、218及219；(vi)SEQ ID NO：231、232、233、220、221及222；(vii)SEQ ID NO：234、235、236、223、224及225；或(viii)SEQ ID NO：944、945、988、941、942及943。
  20. 如請求項19之CD20結合域，其中：(i)該CD20結合域係scFv；(ii)該CD20結合域包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該輕鏈可變區及該重鏈可變區之胺基酸序列包含：(a)SEQ ID NO：156及145；(b)SEQ ID NO：237及226；(c)SEQ ID NO：129及118；(d)SEQ ID NO：264及253；(e)SEQ ID NO：291及280；(f)SEQ ID NO：318及307； (g)SEQ ID NO：439及437；或(h)SEQ ID NO：443及441；(iii)該CD20結合域包含：輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：264、SEQ ID NO：291、SEQ ID NO：318或SEQ ID NO：443之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾但不超過30個、20個或10個修飾的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：439、SEQ ID NO：237、SEQ ID NO：264、SEQ ID NO：291、SEQ ID NO：318或SEQ ID NO：443之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列；及/或重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：226、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：280、SEQ ID NO：307或SEQ ID NO：441之胺基酸序列之至少1個、2個或3個修飾但不超過30個、20個或10個修飾的胺基酸序列，或與SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：437、SEQ ID NO：226、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：280、SEQ ID NO：307或SEQ ID NO：441之胺基酸序列具有至少95%一致性之胺基酸序列；或(iv)該CD20結合域包含SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：267、SEQ ID NO：294或SEQ ID NO：321之胺基酸序列，或與其具有至少95%一致性之胺基酸序列。
  21. 一種核酸分子，其包含：(i)第一核酸分子，其編碼如請求項11至18中任一項之CAR分子，及(ii)第二核酸分子，其編碼結合B細胞抗原之CAR分子。
  22. 如請求項21之核酸分子，其中該第一及第二核酸分子置於單一核酸分子上，或該第一及第二核酸分子置於各別核酸分子上。
  23. 如請求項21或22之核酸分子，其中該B細胞抗原為：(i)CD19、CD22、CD10、CD34、CD123、FLT-3、ROR-1、CD79b、CD79a或CD179b；或(ii)CD19或CD22。
  24. 如請求項21或22之核酸分子，其中該結合至B細胞抗原之CAR分子結合至CD19且包含：(i)分別含有SEQ ID NO：773、774、775、776、777及778之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；(ii)含有SEQ ID NO：765之胺基酸序列之scFv；或(iii)含有SEQ ID NO：764之胺基酸序列之CAR，其中該CAR分子包括或不包括包含SEQ ID NO：797之胺基酸序列之信號肽。
  25. 如請求項21或22之核酸分子，其中該結合至B細胞抗原之CAR分子結合至CD19且包含： (i)分別含有SEQ ID NO：785、786、787、788、789及790之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；(ii)含有SEQ ID NO：1047之胺基酸序列之scFv；或(iii)含有SEQ ID NO：1049之胺基酸序列之CAR，其中該CAR分子包括或不包括包含SEQ ID NO：797之胺基酸序列之信號肽。
  26. 如請求項21或22之核酸分子，其中該結合至B細胞抗原之CAR分子結合至CD22且包含：(i)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別包含：(a)SEQ ID NO：719、720、721、730、731及732；(b)SEQ ID NO：722、723、724、733、734及735；(c)SEQ ID NO：725、726、727、736、737及738；或(d)SEQ ID NO：1036、1037、1038、1039、1040及1041；(ii)含有SEQ ID NO：742、835、836或837之胺基酸序列之scFv；或(iii)含有SEQ ID NO：744之胺基酸序列之CAR，其中該CAR分子包括或不包括包含SEQ ID NO：797之胺基酸序列之信號肽。
  27. 如請求項21或22之核酸分子，其中：(i)編碼可裂解肽之核苷酸序列或編碼IRES之核苷酸序列係置於該第一核酸分子與該第二核酸分子之間；(ii)該第一核酸分子及該第二核酸分子包含單一啟動子；(iii)該第一核酸分子及該第二核酸分子包含單一啟動子，其中該單 一啟動子係EF-1α啟動子；(iv)該第一核酸分子包含第一啟動子，且該第二核酸分子包含第二啟動子；或(v)該核酸分子包含RNA或DNA。
  28. 如請求項27之核酸分子，其中：(i)該可裂解肽為P2A或F2A；(ii)該第一核酸分子及該第二核酸分子包含作為雙順反子轉錄產物(bicistronic transcription product)之單一啟動子；及/或(iii)該EF-1α啟動子包含SEQ ID NO：833之核苷酸序列。
  29. 一種經分離多肽分子，其係由如請求項21至28中任一項之核酸分子編碼。
  30. 一種多特異性抗體分子或CAR分子，其對CD20具有第一結合特異性，及對CD19、CD22、CD10、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中之一或多者具有第二結合特異性，其中該第一結合特異性包含如請求項19或20之CD20結合域。
  31. 一種核酸分子，其編碼如請求項30之多特異性抗體分子或CAR分子。
  32. 一種載體，其包含如請求項1至9、21至28或31中任一項之核酸分 子、編碼如請求項10或29之多肽分子之核酸分子、編碼如請求項11至18中任一項之CAR分子之核酸分子、編碼如請求項19或20之CD20結合域之核酸分子、或編碼如請求項30之多特異性抗體分子或CAR分子之核酸分子。
  33. 如請求項32之載體，其中該載體係選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體或逆轉錄病毒載體。
  34. 一種細胞，其包含如請求項1至9、21至28或31中任一項之核酸分子、如請求項10或29之多肽分子、如請求項11至18中任一項之CAR分子、如請求項19或20之CD20結合域、如請求項30之多特異性抗體分子或CAR分子或如請求項32或33之載體。
  35. 一種製備細胞之方法，其包含將T細胞或NK細胞用如請求項1至9、21至28或31中任一項之核酸分子或如請求項32或33之載體進行轉導。
  36. 一種產生RNA改造細胞群體之方法，其包含將活體外轉錄之RNA或合成RNA引入至細胞中，其中該RNA包含如請求項1至9、21至28或31中任一項之核酸分子。
  37. 一種免疫效應細胞群體，其包含：(i)第一細胞群體，其包含如請求項1至9、21至28或31中任一項之核酸分子、如請求項10或29之多肽分子、如請求項11至18中任一項之CAR 分子、如請求項19或20之CD20結合域或如請求項32或33之載體；及(ii)第二細胞群體，其包含編碼結合B細胞抗原之核酸分子。
  38. 如請求項37之細胞群體，其中該B細胞抗原為：(i)CD19、CD22、CD10、CD34、CD123、FLT-3、ROR-1、CD79b、CD79a或CD179b；或(ii)CD19或CD22。
  39. 如請求項37或38之細胞群體，其中該結合B細胞抗原之CAR結合至CD19且包含編碼CD19 CAR之核苷酸序列，其中該CD19 CAR包含：(i)分別含有SEQ ID NO：773、774、775、776、777及778之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；(ii)含有SEQ ID NO：765之胺基酸序列之scFv；或(iii)含有SEQ ID NO：764之胺基酸序列之CAR，其中該CAR分子包括或不包括包含SEQ ID NO：797之胺基酸序列之信號肽。
  40. 如請求項37或38之細胞群體，其中該結合B細胞抗原之CAR結合至CD19且包含編碼CD19 CAR之核苷酸序列，其中該CD19 CAR包含：(i)分別含有SEQ ID NO：785、786、787、788、789及790之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3；(ii)含有SEQ ID NO：1047之胺基酸序列之scFv；或(iii)含有SEQ ID NO：1049之胺基酸序列之CAR，其中該CAR分子包括或 不包括包含SEQ ID NO：797之胺基酸序列之信號肽。
  41. 如請求項37或38之細胞群體，其中該結合B細胞抗原之CAR結合至CD22且包含編碼CD22 CAR之核苷酸序列，其中該CD22 CAR包含：(i)HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別包含：(a)SEQ ID NO：719、720、721、730、731及732；(b)SEQ ID NO：722、723、724、733、734及735；(c)SEQ ID NO：725、726、727、736、737及738；或(d)SEQ ID NO：1036、1037、1038、1039、1040及1041；(ii)含有SEQ ID NO：742、835、836或837之胺基酸序列之scFv；或(iii)含有SEQ ID NO：744之胺基酸序列之CAR，其中該CAR分子包括或不包括包含SEQ ID NO：797之胺基酸序列之信號肽。
  42. 一種包含如請求項1至9、21至28或31中任一項之核酸分子、如請求項10或29之多肽分子、如請求項11至18中任一項之CAR分子、如請求項19或20之CD20結合域、如請求項30之多特異性抗體分子或CAR分子或如請求項32或33之載體之細胞之用途，其係用於製備提供個體抗腫瘤免疫性之藥物。
  43. 一種表現如請求項1至9、21至28或31中任一項之核酸分子、如請求項10或29之多肽分子、如請求項11至18中任一項之CAR分子、如請求項19或20之CD20結合域、如請求項30之多特異性抗體分子或CAR分子或如 請求項32或33之載體之細胞之用途，其係用於製備治療患有與CD20、CD19或CD22之表現相關癌症或疾病的個體之藥物。
  44. 一種表現如請求項1至9、21至28或31中任一項之核酸分子、如請求項10或29之多肽分子、如請求項11至18中任一項之CAR分子、如請求項19或20之CD20結合域、如請求項30之多特異性抗體分子或CAR分子或如請求項32或33之載體之細胞之用途，其係用於製備治療個體癌症之藥物。
  45. 如請求項43或44之用途，其中：(i)該疾病或癌症係急性骨髓性白血病(AML)、B細胞急性淋巴母細胞性白血病(BALL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、外套細胞淋巴瘤(MCL)、B細胞前淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤、柏基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞淋巴瘤、大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴球增生性病況、MALT淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良或骨髓發育不良症候群、骨髓增生性贅瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突細胞贅瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、白血病前期(preleukemia)，或其組合； (ii)該疾病或癌症係淋巴瘤；(iii)該疾病或癌症係瀰漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma；DLBCL)；或(iv)該疾病或癌症係B細胞惡性病；(v)該疾病或癌症係血液癌症；或(vi)該疾病或癌症係選自由白血病及淋巴瘤組成之群。
  46. 如請求項42至44中任一項之用途，其中該藥物進一步包含B細胞抑制劑，或係用於與B細胞抑制劑併用，該B細胞抑制劑係選自CD19、CD22、CD10、CD34、CD123、FLT-3、ROR-1、CD79b、CD79a或CD179b之抑制劑中一或多者。
  47. 如請求項46之用途，其中：(i)該B細胞抑制劑係小分子抑制劑；(ii)該B細胞抑制劑係結合至CD10、CD19、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a中一或多者之多肽、可溶性配體、抗體或其抗原結合片段；(iii)該B細胞抑制劑係抑制性核酸，其中該抑制性核酸包含dsRNA、siRNA或shRNA；(iv)該B細胞抑制劑係表現結合B細胞抗原之CAR之細胞，其中該B細胞抗原包含CD19、CD22、CD10、CD34、CD123、FLT-3、ROR-1、CD79b、CD79a或CD179b；(v)該B細胞抑制劑係在該細胞之前投與； (vi)該B細胞抑制劑係與該細胞同時投與；或(vii)該B細胞抑制劑係在該細胞之後投與。
  48. 如請求項42至44中任一項之用途，其中該細胞係與以下組合投與：(i)增加表現CAR分子之細胞效能的藥劑；(ii)可改善一或多種與投與該細胞相關副作用的藥劑；或(iii)治療與CD20相關疾病之藥劑。
  49. 如請求項34、37及38中任一項之細胞或細胞群體，其進一步表現：(i)抑制性分子，其包含包括抑制性分子之至少一部分的第一多肽與包括來自細胞內信號傳導域之正信號的第二多肽締合；或(ii)抑制性分子，其包含包括PD1之至少一部分之第一多肽及包括共刺激域及初級信號傳導域之第二多肽。
  50. 一種CD20抑制劑之用途，其係用於製備治療對CD19抑制劑不反應者、部分反應者或復發者之個體的藥物，其中該治療包含向該個體投與該CD20抑制劑，其中該CD20抑制劑係由如請求項1至9、21至28或31中任一項之核酸分子編碼。
  51. 如請求項50之用途，其中該CD19抑制劑包含CD19 CAR療法。
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