CN111718422A

CN111718422A - 靶向于cd19的嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN111718422A
Application number: CN202010455682.0A
Authority: CN
Inventors: 刘爽; 张青; 张普民
Original assignee: Guangzhou Heavy Pound Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Heavy Pound Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2020-05-26
Publication date: 2020-09-29

Abstract

本发明公开了一种靶向于CD19的嵌合抗原受体及其应用，包括细胞外识别域和细胞内信号转导结构域，其中，细胞外识别域依次包括信号肽、抗原识别区、铰链区和跨膜区，所述抗原识别区为CD19单链抗体，所述CD19单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变去与所述轻链可变区之间通过连接肽连接。本发明的抗CD19蛋白的抗体，亲和力显著提高；基于抗CD19抗体改造成的嵌合抗原受体T细胞可以增强对表达CD19肿瘤细胞的杀伤能力。

Description

靶向于CD19的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及技术领域，具体涉及一种靶向于CD19的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

嵌合性抗原受体Chimeric antigen receptor(CAR)技术是利用基因工程方法，赋予T细胞具有识别肿瘤细胞表面抗原的能力，并特异性识别和杀伤肿瘤细胞，没有HLA(人类白细胞抗原)的限制。CAR的结构由细胞外识别域和细胞内信号转导结构域组成：细胞外识别域可以特异性地识别肿瘤表面特异性蛋白(抗原)，细胞内信号转导结构域用来启动T淋巴细胞识别肿瘤细胞(靶细胞)表面蛋白后的免疫应答，发挥细胞毒作用，杀伤靶细胞。

CAR的细胞外识别域由信号肽(Signal peptide，SP)、识别抗原的单链抗体结构域(scFv)的胞外区、连接区(Linker)、铰链区(Hinge)，以及跨膜区(transmembrane,TM)组成；细胞内信号转导结构域由共刺激分子和CD35(CD32)胞内段组成。无共刺激分子为第一代CAR，含有1个共刺激分子(CD28.4-1BB.O×40,1ICOoS等)为第二代CAR，含有2个共刺激分子为第三代CAR。亟需研发一种新的靶向于CD19的嵌合抗原受体。

发明内容

为此，本发明提供一种靶向于CD19的嵌合抗原受体及其应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种靶向于CD19的嵌合抗原受体，包括细胞外识别域和细胞内信号转导结构域，其中，细胞外识别域依次包括信号肽、抗原识别区、铰链区和跨膜区，所述抗原识别区为CD19单链抗体，所述CD19单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变去与所述轻链可变区之间通过连接肽连接。

本发明的一个实施例中，所述CD19单链抗体重链可变区为如下a或b或c：

其由SEQ ID NO.1中第第1-120所示的氨基酸残基组成；

将a)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失/或添加且具有相同功能的肽链；

与a)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的肽链；

和/或，

所述连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第121-135位。

本发明的一个实施例中，所述信号肽为CD8信号肽；

所述跨膜区选自CD28、CD3ζ、CD4、CD8和CD2中的一种或多种跨膜结构；

所胞内信号结构域包括胞内共激分子和信号结构域；

所述信号结构域选自CD3ζ、CD5、CD28和CD124中的一种或多种。

本发明还提供编码所述的靶向于CD19的嵌合抗原受体的核酸分子，或，含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞。

本发明的一个实施例中，所述重组载体为将所述核酸分子导入慢病毒载体中，得到表达上述所述的嵌合抗原受体的慢病毒载体；所述重组病毒为将所述重组载体导入宿主细胞，包装得到重组病毒；和/或，所述细胞为将所述重组载体通过所述慢病毒转染到T细胞中，得到表达所述嵌合抗原受体的T细胞。

本发明还提供一种产品，其包含上述所述嵌合抗原受体、所述的核酸分子或所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞。

本发明还提供所述嵌合抗原受体或所述核酸分子或所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用；或上述所述嵌合抗原受体或所述核酸分子或所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞在制备杀伤肿瘤细胞的产品中的应用。

本发明的一个实施例中，所述肿瘤为CD19阳性肿瘤；和/或所述肿瘤来源于B淋巴细胞的血液肿瘤、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤中的人一种或数种组合；和/或，所述产品为药物或试剂盒或自体回输制剂。

本发明中，CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。

本发明具有如下优点：

本发明的抗CD119蛋白的抗体，亲和力显著提高；基于抗CD19抗体改造成的嵌合抗原受体T细胞可以增强对表达CD19肿瘤细胞的杀伤能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明提供的CD19 3C61 scFvELISA实验结果柱状图；

图2为本发明提供的CART-CD19感染效率；

图3为本发明提供的CART-CD19细胞分群检测结果，CD4阳性和CD8阳性的T细胞比例；

图4A-4C为本发明提供的CART-CD19细胞杀伤实验结果图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECMLAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECMLAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECMLAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1、CD19-scFv抗原序列噬菌体展示筛选

CD19-scFv抗原序列噬菌体展示筛选，包括如下步骤：

1、突变库的构建

以pCAN-FMC63质粒(购自GE公司)为模板，利用随机引物PCR引入突变，引物如下表1所示：

表1

获得的FMC63scFv的重链(H)及轻链(L)的CDR1、CDR2、CDR3突变库PCR产物分别命名为H1、H2、H3、L1、L2和L3。用Sfi I和Not I对PCR产物及pCANTAB 5E酶切回收后，经T4 DNA连接酶16℃连接过夜。连接产物电转至TG1感受态细胞，2×YT重悬并于37℃复苏1h后，取菌液梯度稀释进行平板计数，得到各个突变库库容至少10⁸，其余菌液全部涂布2×YT(GA)平板(葡萄糖2％，青霉素100μg/ml)。从上述突变库中分别随机挑取20个单克隆送测序，多样性均100％。

2、噬菌体抗体库的淘选

加入20nM CD19-his-biotin抗原(CD19抗原购自SinoBiological；Biotin标记试剂购自Sigma)与噬菌体抗体库室温孵育2h，再将混合物转入链霉亲和素磁珠中(购自LifeTechnology)室温共孵育15min。PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，再加入胰酶37℃作用30min，从而洗脱下结合的噬菌体。将胰酶消化洗脱下的噬菌体感染4ml对数期的TG1菌体，37℃静置30min，取部分菌液梯度稀释进行平板计数，其余菌液全部涂布2YT(GA：5％葡萄糖，100μg/ml青霉素)平板，用于下一轮的包装。包装后的噬菌体可用于下一轮的淘选，共进行4轮淘选富集，每轮淘选10倍稀释梯度降低抗原浓度，并逐轮增加PBST-PBS洗涤次数。(四轮淘选的CD19-his-biotin抗原浓度分别为20nM、2nM、0.2nM和0.02nM，PBST-PBS洗涤次数分别为7、10、15、20次)。

3、高亲和力scFv的筛选和鉴定

对淘选出单克隆的表达上清中的可溶性scFv进行ELISA筛选，从而获得CD19抗原的特异性抗体CD19 3C61 scFv。ELISA初步筛选后，挑取阳性信号至少2倍大于阴性信号的克隆送测序，分析测序结果，提取出富集较多的CDR区域对应的克隆。

具体的步骤为：从第3轮和第4轮淘选后的H和L突变库各随机挑取单克隆于96孔板中，37℃摇床培养过夜；将过夜培养的单克隆培养液转接于新的96孔板中，37℃摇床培养至对数期后加IPTG至终浓度1mM，30℃摇床培养过夜；往包被有亲和素的96孔板中加入100μlCD123-his-biotin(1μg/ml)，室温孵育1h；PBST洗板3次；先往洗后的96孔板中加50μl稀释液(PBS/0.05％Tween20/1％BSA)，再每孔加入相应的50μl昨日诱导过夜后的菌液上清，其中孔H11和H12分别为阴性及阳性对照；室温孵育1h；PBST洗板3次；每孔加入100μl anti-myc-HRP(1:10,000稀释)，其中孔H12加入100μlanti-his-HRP(1:10,000稀释)，室温孵育1h；PBST洗板3次；加入100μl TMB，避光、室温孵育10min；加入100μl 2M H₂SO₄终止反应，并读取A₄₅₀nm。ELISA实验结果如下表2及图1所示：

表2

如上表2及图1中，Negative control具体是指没有插入scFv的噬菌体，用抗Myc标签抗体检测，此处阳性特指CD19抗原成功包被在板子上。

通过上表2及图1中的结果可知，噬菌体上的scFv可以结合CD19抗原。得到CD19-scFv。

CD19-scFv包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区之间通过连接肽连接，重链可变区包括重链可变区互补决定区1CDR-H1、重链可变区互补决定区2CDR-H2和重链可变区互补决定区3CDR-H3；轻链包括轻链可变区，轻链包括轻链可变区互补决定区1CDR-L1、轻链可变区互补决定区2CDR-L2和轻链可变区互补决定区3CDR-L3。

具体的，重链可变区互补决定区1CDR-H1的氨基酸序列为如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第26-35所示的氨基酸残基组成。重链可变区互补决定区2CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第50-65所示的氨基酸残基组成。重链可变区互补决定区3CDR-H3的氨基酸序列SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第98-109所示的氨基酸残基组成。轻链可变区互补决定区1CDR-L1的氨基酸序列SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第159-168所示的氨基酸残基组成。轻链可变区互补决定区2CDR-L2的氨基酸序列SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第185-191所示的氨基酸残基组成。轻链可变区互补决定区3CDR-L3的氨基酸序列SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第224-232所示的氨基酸残基组成。重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第1-120所示的氨基酸残基组成。轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第136-242所示的氨基酸残基组成。连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第121-135所示的氨基酸残基组成。

CD19-scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGKRGPLTFGGGTKLEIT。

对应地，重链可变区互补决定区1CDR-H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列中第76-105所示的核苷酸组成。重链可变区互补决定区2CDR-H2的核苷酸序列如SEQID NO.2所示核苷酸序列中第148-195所示的核苷酸组成。重链可变区互补决定区3CDR-H3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列中第292-327所示的核苷酸组成。轻链可变区互补决定区1CDR-L1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列中第475-499所示的核苷酸组成。轻链可变区互补决定区2CDR-L2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列中第553-573所示的核苷酸组成。轻链可变区互补决定区3CDR-L3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列中第676-696所示的核苷酸组成。重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列中第1-360所示的核苷酸组成。轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列中第406-726所示的核苷酸组成。连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列中第361-405所示的核苷酸组成。

CD19-scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

GAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTA TTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGT TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCGTCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGG GTAAGAGGGGGCCGTTGACTTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACA。

实施例2、高亲和力CD19-scFv改造为CAR-CD19

1、CAR的设计说明：本发明选用二代CAR框结构。

2、CAR的结构及构建：本发明中，靶向于CD19的嵌合抗原受体可简称为CAR-CD19。

本发明中，CAR-CD19由依次连接的CD8信号肽、CD19-scFv、CD8铰链及跨膜区、胞内4-1BB(亦即CD137)、胞内CD3ζ融合而成。

D8α铰链区(SEQ ID No.3)：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD；

CD8α跨膜区(SEQ ID No.4)：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；

4-1BB(SEQ ID No.5)：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCE；

CD3zeta(SEQ ID No.6)：LRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

实施例3、CAR-CD19修饰的T细胞(CART-CD19)的制备与表型验证

1、CART-CD19的制备：CART-CD19制备的具体步骤如下：

(1)PBMC分离

a.将新鲜血液转移到50mL离心管中。用生理盐水按照1:1(体积比)进行稀释，轻轻上下吹打3-5次混匀。

b.将6mL Ficoll加入到15mL离心管中，竖直放置到水平台面上静止备用。将稀释好的血液(总体积8mL)用移液管缓慢均匀加入到竖直放置在台面的含Ficoll溶液的离心管中。

c.将加好血液与Ficoll的离心管轻轻转移至离心机中。在转移离心管过程尽量减少晃动，保持离心管竖直，以避免打破液面分层。室温400g离心30分钟。

d.离心结束后，轻轻转移离心管至超净台中。用移液器吸取中间的白膜层转移至新的50mL离心管中。尽量避免吸取到下层或上层的细胞，避免造成污染。

e.加入30mL生理盐水至上述转移出来的淋巴细胞中，轻轻吹打混匀，60-100g室温离心10分钟。重复洗涤淋巴细胞，去除上清，加入一定量的完全培养基重悬细胞。

f.计数调整密度为5*10⁵细胞/ml，预先处理过的12孔板中每孔加入1ml。将培养板放置于37℃，5％CO₂培养箱培养48小时。

(2)慢病毒感染

g.收集上述PBMC，室温300g离心4min，调整密度为1*10⁶细胞/ml，新的6孔板中每孔加入1ml细胞，实验组加入10.5μl CD19二代CAR的慢病毒(病毒滴度为2*10⁸/mL，MOI＝3)；对照组加入10⁵μl对照病毒(病毒滴度为2*10⁷/mL，MOI＝3)，每孔加入一定的TRANS B感染试剂。

h.将细胞培养板置于37℃，5％CO₂培养箱培养。

i.第三天每孔加入1ml新鲜的培养基，继续培养。

j.第七天计数计算扩增倍数。

(3)实验结果

本次制备，初始PBMC细胞量均为1E+6，第七天时实验组PBMC细胞量为9.40E+06，其中99.8％为CD3+T细胞，细胞扩增倍数约为9.4倍，如表3所示，CART-CD19细胞增殖。

表3

2、CART-CD19表型检测

(1)实验目的：确定CART-CD19及对照组的感染效率包括三组：T cell ctrl、Tcell ctrl+CD19 antibody以及CART-CD19 cell+CD19 antibody。

(2)流式细胞仪检测所制备细胞GFP的表达，具体的试验方法包括如下步骤：a.计数每个细胞取出1.0×10⁶个，1000rpm，离心3min，加入100μl FACS buffer重悬细胞，加入15μl APC anti-human CD8、15μl PE anti-human CD4、15μl PerCY5.5 anti-human CD3。

b.4℃避光孵育30min，1000rpm，离心3min，去掉上清加入FACS buffer再洗两遍。

c.加入150μl FACS buffer重悬细胞，FACS检测荧光。

(3)实验结果

如图2所示，利用CD19-CAR制备的慢病毒可高效感染T细胞，CART-CD19比例为50％～70％之间，细胞生长状态良好。

3、CART的细胞分群检测

(1)实验目的：确定CART-CD123的细胞中T细胞的亚群分布特征。

(2)实验设计：流式细胞仪检测所制备细胞表面标志物，检测标的及意义如下表4所示，T细胞亚群分布。

具体的试验方法包括如下步骤：

a.计数每个细胞取出1.0×10⁶个，1000rpm，离心3min，加入100μl FACS buffer重悬细胞，加入15μl APC anti-human CD8、15μl PE anti-human CD4、15μl PerCY5.5 anti-human CD3。

c.加入150μl FACS buffer重悬细胞，FACS检测荧光。

表4

(3)实验结果

CART-CD19细胞分群检测结果如图3所示，CD4阳性和CD8阳性的T细胞比例。所制备的CART-CD19细胞分群如表5所示：

表5

4、CART-CD19杀伤Raji或Nalm6实验

1、CART-CD19杀伤Raji，LDH(Roche)Cat.No.11 644 793 001，具体步骤如下：

(1)取部分细胞，离心计数，调整细胞密度，按下表设置组别，铺至96孔中(每组3孔)，每孔细胞数控制在3×10³～5×10⁴范围内。实验分组如表6所示。

表6

(2)37℃，5％CO₂，孵育细胞6h或12h

(3)6h或12h后，96孔板离心，250×g离心10min

(4)小心吸取上清100μl至新96孔板中，

(5)配备LDH反应液：bottle1：bottle2＝1:45,(现配现用)

(6)往上清液中加入100μlLDH反应液，室温(15～25℃)避光孵育0.5～1h

(7)ELISA酶标仪检测490nm的吸收光，设置参考波长630nm

(8)根据公式，计算细胞毒性：细胞毒性％＝(靶效细胞组-效应细胞组-lowcontrol)/(High control-Low control)*100

2、实验结果

如图4A-图4C所示，CD19-CART相比于没有基因修饰的T细胞能有效杀伤CD19表达阳性的RAJI细胞；对无CD19表达阳性的K562细胞无特异性杀伤作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 广州重磅生物科技有限公司

<120> 靶向于CD19的嵌合抗原受体及其应用

<130> GG20732750A

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 242

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser

130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala

145 150 155 160

Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp

165 170 175

Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly

180 185 190

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln

210 215 220

Gln Gly Lys Arg Gly Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Thr

<210> 2

<211> 726

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gaggtgaaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccgtc 60

acatgcactg tctcaggggt ctcattaccc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120

ccacgaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggta gtgaaaccac atactataat 180

tcagctctca aatccagact gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatttact actgtgccaa acattattac 300

tacggtggta gctatgctat ggactactgg ggccaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggacat ccagatgaca 420

cagactacat cctccctgtc tgcctctctg ggagacagag tcaccatcag ttgcagggca 480

agtcaggaca ttagtaaata tttaaattgg tatcagcaga aaccagatgg aactgttaaa 540

ctcctgatct accatacatc aagattacac tcaggagtcc cgtcaaggtt cagtggcagt 600

gggtctggaa cagattattc tctcaccatt agcaacctgg agcaagaaga tattgccact 660

tacttttgcc aacagggtaa gagggggccg ttgactttcg gaggggggac caagctggag 720

atcaca 726

<210> 3

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 4

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 5

<211> 41

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 5

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

35 40

<210> 6

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln

1 5 10 15

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

20 25 30

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

35 40 45

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 7

<211> 67

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tcacatgcac tgtctcaggg gtctcattac ccgactatgg tgtaagctgg attcgccagc 60

ctccacg 67

<210> 8

<211> 79

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

agggtctgga gtggctggga gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc 60

tcaaatccag actgaccat 79

<210> 9

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ccatttacta ctgtgccaaa cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg 60

gccaaggaac ct 72

<210> 10

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

acagagtcac catcagttgc agggcaagtc aggacattag taaatattta aattggtatc 60

agcagaaacc ag 72

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ctggagagga gtcccatcaa ggttcag 27

<210> 12

<211> 64

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga ggggggacca 60

agct 64

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ccctcatagt tagcgtaacg 20

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

agcggataac aatttcacac agga 24

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ccctgagaca gtgcatgtga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

tcccagccac tccagaccct 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

tttggcacag tagtaaatgg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

gcaactgatg gtgactctgt 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

gtagatcagg agtttaacag 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

ttggcaaaag taagtggcaa 20

Claims

1.一种靶向于CD19的嵌合抗原受体，包括细胞外识别域和细胞内信号转导结构域，其中，细胞外识别域依次包括信号肽、抗原识别区、铰链区和跨膜区，所述抗原识别区为CD19单链抗体，所述CD19单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变去与所述轻链可变区之间通过连接肽连接。

2.如权利要求1所述的靶向于CD19的嵌合抗原受体，其特征在于，

所述CD19单链抗体重链可变区为如下a或b或c：

a)其由SEQ ID NO.1中第第1-120所示的氨基酸残基组成；

b)将a)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失/或添加且具有相同功能的肽链；

c)与a)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的肽链；

和/或，

3.如权利要求1-3任一项所述的靶向于CD19的嵌合抗原受体，其特征在于，

所述信号肽为CD8信号肽；

所胞内信号结构域包括胞内共激分子和信号结构域；

所述信号结构域选自CD3ζ、CD5、CD28和CD124中的一种或多种。

4.编码权利要求1-3任一项所述的靶向于CD19的嵌合抗原受体的核酸分子，或，含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞。

5.如权利要求6所述的重组载体或细胞，其特征在于，

所述重组载体为将所述核酸分子导入慢病毒载体中，得到表达权利要求1-3任一所述的嵌合抗原受体的慢病毒载体；

所述重组病毒为将所述重组载体导入宿主细胞，包装得到重组病毒；

和/或，所述细胞为将所述重组载体通过所述慢病毒转染到T细胞中，得到表达所述嵌合抗原受体的T细胞。

6.一种产品，其包含权利要求1-5中任一所述嵌合抗原受体、权利要求4所述的核酸分子或所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞。

7.权利要求1-3任一项所述嵌合抗原受体或权利要求4所述核酸分子或所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞在制备预防和/或治疗肿瘤产品中的应用；

或权利要求1-3任一项所述嵌合抗原受体或权利要求4所述核酸分子或所述的重组载体、表达盒、重组菌、重组病毒或细胞在制备杀伤肿瘤细胞的产品中的应用。

8.如权利要求6所述的产品或权利要求7所述的应用，其特征在于，

所述肿瘤为CD19阳性肿瘤；

和/或所述肿瘤来源于B淋巴细胞的血液肿瘤、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤中的人一种或数种组合；

和/或，所述产品为药物或试剂盒或自体回输制剂。