CN107435065B

CN107435065B - 鉴定灵长类抗体的方法

Info

Publication number: CN107435065B
Application number: CN201710312074.2A
Authority: CN
Inventors: 余国良
Original assignee: Qyuns Therapeutics Co ltd
Current assignee: Jiangsu Quanxin biomedical Co.,Ltd.
Priority date: 2016-05-10
Filing date: 2017-05-05
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2037-05-05
Also published as: CN107435065A

Abstract

本申请提供了从灵长类动物中鉴定抗体的方法。在某些实施方式中，所述方法包括：对由合并的抗体生成B细胞群制备的cDNA进行测序，以获得多个抗体重链序列和多个抗体轻链序列；基于其CDR3序列将获得的抗体重链序列分成重链组；基于其CDR3序列将获得的抗体轻链序列分成轻链组；基于每组中抗体重链或轻链序列的数量，将重链组与轻链组配对；在每个配对的重链组和轻链组对中，将一个抗体重链序列与一个轻链序列配对；并测试包含所述配对的重链和轻链序列的候选抗体与抗原结合的情况。

Description

鉴定灵长类抗体的方法

相关申请的引用

本申请要求2016年5月10提交的美国临时申请62/333,941和2016年7月13日提交的美国申请15/208,850的优先权。其公开内容在此参考并入。

背景技术

抗体已经成为用于治疗各种病症，包括癌症、炎症和其它疾病的有效工具。然而，已经证明非人抗体诱导人免疫应答，这导致施用的抗体的中和并限制了这种抗体在治疗人类疾病中的应用。本领域尝试通过人源化来自非人动物(例如小鼠和兔)的单克隆抗体来克服该问题。例如，人源化抗体可以通过将适当的互补决定区(CDR)编码区段移植到人抗体框架中来实现。然而，通过CDR移植方法人源化的抗体通常存在与其特异性靶标的亲和力丧失的问题。

T细胞受体(TCR)是在T细胞表面发现的一种分子，负责识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原。TCR和抗原之间的结合具有相对低的亲和力并且是退化的，即许多TCRs识别相同的抗原，并且许多抗原被相同的TCR识别。TCR或特异性抗原的亲和力使其具有用于治疗的价值，例如使用过继免疫治疗的癌症治疗。为了扩大使用过继性免疫治疗的能力，有必要选择富集的肽特异性效应T细胞，以有效攻击肿瘤细胞并避免对正常组织的攻击。为此目的，这种配体特异性T细胞的TCRs可被克隆并在活化的T细胞中表达为转基因TCR，使得转基因T细胞获得确定的特异性并且不具有攻击正常宿主组织的能力。

因此，有必要不断开发新的方法来开发抗体和T细胞受体。

发明概述

一方面，本公开涉及鉴定与抗原结合的灵长类动物抗体的方法。在一些实施方式中，该方法可以包括以下步骤：a)从已经被抗原免疫的灵长类动物中获得抗体生成B细胞群； b)从抗体生成B细胞群中获得(i)多个抗体重链序列和(ii)多个抗体轻链序列；c)将所述获得的多个抗体重链序列分成至少一个重链组，其中所述重链组中的所述抗体重链序列在谱系上相关；d)将所获得的多个抗体轻链序列分成至少一个轻链组，其中所述轻链组中的所述抗体轻链序列在谱系上相关；e)选择所述重链组和所述轻链组；f)将来自所述重链组的重链序列与来自所述轻链组的轻链序列配对；和g)测试包含配对重链和轻链序列的候选抗体与抗原结合的情况。

在某些实施方式中，重链组中所述抗体重链序列的CDR3区含有不超过5个相对于彼此的氨基酸差异，并且轻链组中所述抗体轻链序列的CDR3区含有不超过5个相对于彼此的氨基酸差异。

在某些实施方式中，所述抗原是人抗原。

在某些实施方式中，所述抗体重链序列是抗体重链可变区序列，所述抗体轻链序列是抗体轻链可变区序列。

在某些实施方式中，所述灵长类动物是旧大陆猴、猩猩、大猩猩或黑猩猩。在某些实施方式中，所述灵长类动物是食蟹猕猴，恒河猴或豚尾猕猴。

在某些实施方式中，重链组中所述抗体重链序列的CDR3区含有0、1或2个相对于彼此的氨基酸差异，并且轻链组中所述抗体轻链序列的CDR3区含有0、1或2个相对于彼此的氨基酸差异。

在某些实施方式中，步骤b)通过测序编码来自单个B细胞或其培养物的重链和轻链序列的cDNAs来完成。

在某些实施方式中，步骤b)通过测序编码由多个B细胞制备的重链和轻链序列的cDNAs来完成。

在某些实施方式中，通过与抗原结合富集抗体生成B细胞群。

在某些实施方式中，重链组和轻链组都含有至少2个、至少5个、至少10个、至少 20个成员。

在某些实施方式中，步骤g)包括在阻断测定、中和测定、激动剂测定或拮抗剂测定中测试候选抗体。

在某些实施方式中，步骤g)包括在酶联免疫吸附测定中测试候选抗体。

在某些实施方式中，步骤b)包括获得至少100种不同的抗体重链序列和至少100种不同的抗体轻链序列。

在某些实施方式中，抗体生成B细胞获取自骨髓、脾脏、淋巴结或外周血。

在某些实施方式中，所述方法还包括：h)将所述重链序列与人重链序列比对，其中所述人重链序列与所述重链序列同源性最高；i)将所述轻链序列与人轻链序列比对，其中所述人轻链序列与所述轻链序列同源性最高；并且j)用人重链或人轻链序列的相应氨基酸取代重链或轻链序列中的至少一个氨基酸残基，从而产生人源化抗体。

另一方面，本公开提供了用于鉴定与抗原结合的T细胞受体(TCR)的方法，包括以下步骤：a)获得被所述抗原免疫接种的灵长类动物的T细胞群；b)从T细胞群获得(i)多个TCRα链序列和(ii)多个TCRβ链序列；c)将所获得的多个TCRα链序列分成至少一个TCRα链组，其中TCRα链组中的TCRα链序列在谱系上相关；d)将所获得的多个TCRβ链序列分成至少一个TCRβ链组，其中TCRβ链组中的TCRβ链序列在谱系上相关；e)选择TCRα链组和TCRβ链组；f)将来自TCRα链组的TCRα链序列与来自TCRβ链基团的TCRβ链序列配对；并且g)测试包含TCRα链序列和TCRβ链序列的候选TCR与抗原结合的情况。

在某些实施方式中，TCRα链组中所述TCRα链序列的CDR3区含有不超过5个相对于彼此的氨基酸差异，并且TCR中所述TCRβ链序列的CDR3区β链基团含有不超过5 个相对于彼此的氨基酸差异。

在某些实施方式中，所述抗原是人抗原。

在某些实施方式中，TCRα链序列是TCRα链可变区序列，TCRβ链序列是TCRβ链可变区序列。

在某些实施方式中，TCRα链组中所述TCRα链序列的CDR3区含有0、1或2个相对于彼此的氨基酸差异，并且TCR中所述TCRβ链序列的CDR3区β链基团含有0、1或2 个相对于彼此的氨基酸差异。

在某些实施方式中，步骤b)通过测序编码来自单个T细胞或其培养物的TCRα链和TCRβ链序列的cDNA来完成。

在某些实施方式中，步骤b)通过测序编码由多个T细胞制备的TCRα链和TCRβ链序列的cDNA来完成。

在某些实施方式中，T细胞通过与抗原结合来富集。

在某些实施方式中，TCRα链组和TCRβ链组都含有至少2个、至少5个或至少10 个成员。

在某些实施方式中，步骤g)包括在阻断测定、中和测定、激动剂测定或拮抗剂测定中测试候选TCR。

在某些实施方式中，步骤g)包括在酶联免疫吸附测定中测试候选TCR。

在某些实施方式中，步骤b)包括获得至少100种不同的TCRα链可变区序列和至少100种不同的TCRβ链可变区序列。

在某些实施方式中，T细胞获取自骨髓胸腺、淋巴结或外周血。

在某些实施方式中，所述方法还包括：h)将所述TCRα链序列与人TCRα链序列比对，其中所述人TCRα链序列与所述TCRα链序列同源性最高；i)将所述TCRβ链序列与人 TCRβ链序列比对，其中所述人TCRβ链序列与所述TCRβ链序列同源性最高；并且j)取代人TCRα链序列或人TCRβ链序列中的至少一个氨基酸残基，从而产生人源化TCR。

附图概述

图1示出了鉴定特异性结合抗原的灵长类动物抗体的一个实施方式。

图2示出了鉴定特异性结合抗原的灵长类动物抗体的第二个实施方式。

图3示出了鉴定特异性结合抗原的灵长类动物TCR的一个实施方式。

图4示出了识别特异性结合抗原的灵长类动物TCR的第二个实施方式。

图5A显示了在用PD-L1免疫的猴中产生的抗体的部分重链可变区序列的比对。

图5B显示了继图5A的重链可变区序列的比对。

图5C显示了继图5B的重链可变区序列的比对。

图6显示了在用PD-L1免疫的猴中产生的抗体的轻链可变区序列的比对。

图7显示在第二轮PCR后用PD-L1免疫的猴中产生的抗体的重链可变区序列的比对。

图8显示在第二轮PCR后用PD-L1免疫的猴中产生的抗体的轻链可变区序列的比对。

图9显示了在用PD-L1免疫的猴中产生的重链可变区序列的序列系统树。

图10显示了在用PD-L1免疫的猴中产生的轻链可变区序列的序列系统树。

发明详述

在上述发明概述和发明详述，以及权利要求书和附图中，参考了本发明的特定特征(包括方法步骤)。应当理解，本说明书中的本发明的公开内容包括这些特定特征的所有可能的组合。例如，当某一特定特征在本发明的特定方面或实施方式的背景下或特定权利要求中公开时，也可以最大程度地结合本发明的其他特定方面和实施方式和/或在其背景下，以及在本发明的整体上使用该特征。

必须指出，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“a”，“an”和“the”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。因此，例如，“细胞”指代的是一个或多个细胞，并且包括本领域技术人员已知的其等同物等等。

术语“包括”及其语法等效词在本文中用于表示其它组分、成分、步骤等任选存在。例如，一个包括(或“包含”)组分A、B和C的物体可以由组分A、B和C构成(即仅含有组分A、B和C)，或者可以不仅含有组分A、B和C而且还含有一个或多个其他组分。

在本文中提及包括两个或多个限定步骤的方法的情况下，所定义的步骤可以以任何顺序或同时进行(除非上下文排除了该可能性)，并且该方法可以包括在任何定义的步骤之前、在两个定义的步骤之间或在所有定义的步骤之后执行的，一个或多个其它步骤(除非上下文排除了该可能性)。

应当理解，当本文中给出数值范围时，在满足所述范围内明确排除的各界限的前提下，本公开涵盖该范围的上限和下限之间精确至下限单位的十分之一(除非上下文另有明确规定)的每个插入数值，以及在所述范围内的任何其他规定的或插入数值。如果所述范围包括一个或两个限制，则不包括这些限制中的一个或两个的范围也包括在本公开中。

应当注意，为了说明的简单和清楚，在适当的情况下，在不同的图中重复使用相同的参考数字以表示对应的或类似的元素。此外，阐述了许多具体细节，以便提供对本文所述实施方式的透彻理解，但本文描述的实施方式在没有具体细节的情况下仍可以实施。在其他情况下，尚未详细描述方法、程序和组件，以免模糊所描述的相关功能。并且，描述不应被认为是对本文描述的实施范围的限制。应当理解，除非另有说明，否则本公开中阐述的实施方式的描述和表征不应被视为相互排斥。

定义

在此提供本说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语和短语的含义。这些定义并不意味着在本质上是限制性的，并且用于提供对本发明的某些方面的更清楚的理解。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。这些术语为本领域技术人员所充分了解，是指由一种或多种特异性结合抗原的多肽组成的蛋白质。抗体的一种形式为抗体的典型结构单元。该形式是四聚体，由两对相同的抗体链组成，每对具有一个轻链和一个重链。在每对中，轻链和重链可变区共同负责与抗原结合，并且恒定区负责抗体效应子功能。

识别的人免疫球蛋白多肽包括κ和λ轻链以及α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ重链或其他物种中的等同物。全长免疫球蛋白“轻链”(约25kDa或约214个氨基酸)包含在N末端的约110个氨基酸的可变区和C端的κ或λ恒定区。类似地，全长免疫球蛋白“重链”(约50kDa或约446个氨基酸)包含可变区(约116个氨基酸)和上述重链恒定区之一，例如γ(约330个氨基酸)。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白，保留与抗原特异性结合能力的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白。可以可检测地标记抗体，例如用放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等。抗体可以进一步缀合到其它部分，例如特异性结合对的构件，如生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对的构件)等。抗体也可以结合固体载体，包括但不限于聚苯乙烯板或珠粒等。该术语还包括 Fab'、Fv、F(ab')2及(或)保留与抗原特异性结合能力的其它抗体片段和单克隆抗体。

抗体可以以各种其它形式存在，包括例如Fv、Fab和(Fab')2以及双功能(即双特异性)杂交抗体(例如，Lanzavecchia等，《欧洲免疫学期刊》17,105(1987))和单链 (例如，Huston等，《美国科学院院刊》85,58779-5883(1988)和Bird等，《科学》242,423-426(1988)，上述两篇文献通过引用并入本文)。(概述参见Hood等，“免疫学”，Benjamin，《纽约》第二版，1984，和Hunkapiller与Hood，《自然》323,15-16,1986)。

免疫球蛋白轻链或重链可变区由三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDRs”)中断的框架区(FR)组成。框架区和CDRs的范围已被精确定义(参见E.Kabat等，“免疫相关的蛋白序列”，美国卫生与公众服务部，1991)。不同轻链或重链的框架区的序列在同一物种内相对保守。抗体的构架区，即构成抗体的轻链和重链框架区的组合，用于定位和比对CDRs。CDRs主要负责与抗原表位结合。

术语“嵌合抗体”是指其轻链和重链基因通常通过基因工程技术，由属于不同物种的抗体可变区和恒定区基因构建的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段可以连接到人恒定区段，例如γ1和γ3。治疗性嵌合抗体的一个实例是由来自兔抗体的可变或抗原结合结构域和来自人抗体的恒定或效应子结构域组成的杂合蛋白，而其他哺乳动物物种也可使用。

术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”是指含有一个或多个已被来自人类抗体的相应位置的氨基酸取代的氨基酸(例如，在框架区，恒定区或CDR中)的非人(例如，小鼠、兔或灵长类动物)抗体。一般来说，与非人源化版本的相同抗体相比，人源化抗体在人宿主中产生的免疫应答降低。在本文中，提供CDRs的灵长类动物免疫球蛋白被称为“亲本”或“受体”，提供框架变化的人抗体称为“供体”。恒定区不必存在，但如果存在，其通常与人抗体恒定区基本相同，即至少约85-90％相同，优选地约95％以上相同。因此，在一些实施方式中，全长人源化灵长类动物重链或轻链免疫球蛋白含有人恒定区，灵长类CDRs和人框架。在许多实施方式中，“人源化抗体”是包含人源化可变轻链和/ 或人源化可变重链的抗体。例如，人源化抗体不包括如上定义的典型嵌合抗体，例如因为嵌合抗体的整个可变区是非人的。已经通过“人源化”过程“人源化”的经修饰的抗体与提供CDRs的亲本抗体结合到相同的抗原，并且与亲本抗体相比，在人体中通常具有较少的免疫原性。

术语“天然”抗体是指其中的抗体重链和轻链由多细胞生物体的免疫系统产生并配对的抗体。脾、淋巴结、骨髓和血清是产生天然抗体的组织的实例。例如，通过从抗原免疫的动物中分离的抗体生成细胞产生的抗体是天然抗体。

就改造抗体的V_H和VL链而言的术语“非天然配对”，是指未在天然抗体中发现的一个V_H和V_L对。因此，非天然配对抗体是两种不同天然抗体的V_H和V_L链的组合。非天然配对抗体的V_H和V_L链相对于提供该V_H和V_L链的两个不同的抗体的V_H和V_L链并未突变。例如，改造抗体的“非天然配对”IgH和IgL链可以包含来源于获取自动物的第一抗体生成细胞的IgH可变链和来源于获取自相同动物的第二抗体生成细胞的IgL可变链，其中由所述第一细胞产生的抗体的氨基酸序列与由所述第二细胞产生的抗体的氨基酸序列不同。在该实施例中，IgH和IgL链可以来自同一谱系组。含“非天然配对”的IgH链和IgL链的抗体的制备可以通过或不通过噬菌体展示技术。由此，抗体可包含或不包含病毒(例如，噬菌体M13)衍生序列。

术语“谱系相关的抗体”和“谱系相关抗体”以及其语法等效变体，是由有共同B细胞祖先的细胞产生的抗体。由相关的抗体生成细胞产生的相关的抗体结合到抗原的同一表位，而且通常在序列上非常类似，特别是在H3和L3CDR上。谱系相关抗体的H3和L3CDR 都有一个近似相同的序列(即相差由置换、插入或缺失所致的至多5个，即0、1、2、3、 4或5个残基差异)(参见授权于Couto的美国专利7,462,697)。在某些情况下，B细胞祖先包含具有重排的轻链VJC区和重排的重链VDJC区的基因组，并产生尚未经历亲和力成熟的抗体。存在于脾组织中的“初始”或“处女”B细胞，是示例性的B细胞的共同祖先。相关抗体通过共同的抗体祖先相关，例如初始B细胞祖先产生的抗体。术语“相关抗体”并非旨在描述一组不是由来自同一B细胞祖先的细胞产生的抗体。“谱系组”包括一组彼此之间谱系相关的抗体。

术语“表达”指通过基于基因的序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。

在将核酸序列插入细胞的上下文中的术语“引入”，是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指代将核酸序列纳入真核或原核细胞，其中所述核酸序列可暂时性地存在于细胞中或纳入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转变成能独立复制的复制子。

术语“核酸”涵盖DNA、RNA、其单链或双链和化学修饰物。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用。

术语“可操作地连接”是指元件的排列，其中所述组分配置为用以执行它们的常用功能。因此，给定的可操作地连接到多肽的信号肽指令细胞分泌多肽。在有启动子的情况下，可操作地连接到编码序列的启动子将指令编码序列的表达。启动子或其他控制元件只要具备指导编码序列的表达功能，则不必与编码序列邻接。例如，启动子序列和编码序列之间可存在未经翻译但已转录的插入序列，而启动子序列仍然可以被认为是“可操作地连接”到编码序列。

术语“多个”是指大于1个，例如大于2、大于约5、大于约10、大于约20、大于约 50、大于约100、大于约200、大于约500、大于约1000、大于约2000、大于约5000、大于约10000、大于约20000、大于约50000、大于约10万，大于约50万，大于约100万。“群体”中包含多个项目。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括编码的和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸，和具有修饰的肽骨架的多肽。

术语“治疗”或对病症或疾病的“治疗”是指对受试者提供临床受益，并且包括：(1)预防所述病症中的至少一种症状，即，致使一种症状不在可能暴露于或易于罹患所述疾病、但尚未经历或显示疾病症状的哺乳动物中显著发展，(2)抑制疾病，即阻止或减少疾病或其症状的发展，或(3)缓解疾病，即，造成疾病或其临床症状的消退。

术语“抗原”是指能够诱导适应性免疫应答的物质。具体地，抗原是用作适应性免疫应答的受体靶标的物质。抗原通常是结合到抗原特异性受体的分子，但不能独自诱导机体内的免疫应答。抗原通常是蛋白质和多糖，较少情况下是脂类。合适的抗原包括但不限于细菌的一部分(外壳、荚膜、细胞壁、鞭毛、菌毛和毒素)、病毒和其它微生物。本文中抗原还包括免疫原和半抗原。

术语“T细胞受体”(TCR)是指在T淋巴细胞(T细胞)的表面上发现的用于识别与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的抗原的分子。所述TCR通常为二硫键连接的膜锚定的异二聚体，其通常由高度可变的α和β链组成，其与CD3分子组成复合物。T 细胞中的少数(约5％)表达由可变γ和δ链形成的备用受体，。所述TCR的α链和β链的每个可变区具有三个高变区或互补决定区(CDR)，而β链的可变区具有一个通常不接触抗原的高变附加区域(HV4)。CDR3是负责识别处理过的抗原的主要CDR，虽然也证实了α链的CDR1与抗原肽的N末端部分相互作用，而β链的CDR1与抗原肽的C末端部分相互作用。CDR2被认为识别MHC。β链的CDR4被认为不参与抗原识别但被证实与超抗原相互作用。所述TCR的恒定区由短的连接序列组成，其中的半胱氨酸残基形成二硫键，导致形成两条链之间的链接。TCR与抗原之间的结合亲和力相对较低并且是退化的：也就是说，许多TCR识别相同的抗原，并且许多抗原被相同的TCR识别。

“灵长类动物”在本文中指灵长目哺乳动物，包括人类、猿和猴。灵长类动物的实例包括，但不限于，原猴类(例如狐猴、懒猴、树熊猴、金熊猴、眼镜猴)、新大陆猴(例如，狨猴、绢毛猴、卷尾猴、松鼠猴、猫头鹰猴、伶猴、僧面猴、吼猴、蜘蛛猴和绒毛猴)、旧世界猴(例如，艾伦沼泽猴、倭长尾猴、赤猴、绿猴、黑脸绿猴、贝尔山绿猴、坦塔罗斯猴、青腹绿猴、马尔布鲁克绿猴、德雷亚斯猴，狄安娜长尾猴，加纳长尾猴，大白鼻长尾猴、蓝猴、银猴、金丝猴、白喉长尾猴、白额长尾猴、坎氏长尾猴、洛氏长尾猴、冠毛长尾猴、邬氏长尾猴、丹氏长尾猴、小白鼻长尾猴、赤腹长尾猴、斯氏长尾猴、髭长尾猴、红尾长尾猴、尔氏长尾猴、高山长尾猴、阳光长尾猴、枭面长尾猴、洛马米长尾猴、白臀长尾猴、地中海猕猴、狮尾猴、豚尾猴、北豚尾猴、明打威猕猴、西比路猴、灰肢猕猴、穿靴猕猴、汤基猕猴、黑克猕猴、浅黑猕猴、黑冠猕猴、食蟹猕猴、短尾猴、猕猴、台湾猴、日本猕猴、斯里兰卡猕猴、冠毛猕猴、熊猴、藏酋猴、阿鲁纳恰尔猕猴、白颊猕猴、灰颊冠白睑猴、黑冠白睑猴、黑冠白睑猴安哥拉亚种、灰颊冠白睑猴乌干达亚种、约氏白睑猴、灰颊冠白睑猴喀麦隆亚种、奇庞吉猴、狒狒、狮尾狒、白枕白眉猴、红帽白眉猴、阿吉利白眉猴、金腹白眉猴、冠毛白眉猴、桑杰河白眉猴、山魈、黑疣猴、安哥拉疣猴、西非黑白疣猴、花斑疣猴、东非黑白疣猴、西方红疣猴、彭南特疣猴、尼日尔三角洲红疣猴、普氏红疣猴、桑给巴尔红疣猴、中部非洲红疣猴、乌干达红疣猴、乌德宗瓦红疣猴、布维尔红疣猴、灰叶猴、乌叶猴、叶猴属、白臀叶猴、仰鼻猴、长鼻猴、豚尾叶猴、长臂猿、猩猩、大猩猩、黑猩猩。

识别与抗原结合的灵长类动物抗体的方法

一方面，本发明涉及用于鉴定与抗原结合的灵长类动物抗体的方法。在某些实施方式中，所述方法可包括以下步骤：a)从已经被抗原免疫的灵长类动物中的抗体生成B细胞群中获取多个抗体重链序列和多个抗体轻链序列；b)将所述获取的多个抗体重链序列分为多个重链组，并且与之独立地，将所述获取的多个抗体轻链序列分为多个轻链组，其中：将包括长度相同且含有不超过5个相对于彼此的氨基酸取代的CDR3区的抗体重链序列分成一组；将包括长度相同且含有不超过5个相对于彼此的氨基酸取代CDR3区的抗体轻链序列分成一组；c)从步骤b)中成组的组中选择一个重链组和一个轻链组；d)将步骤c)中选取的组中的一个重链序列和一个轻链序列配对；并且e)测试包含d)中配对重链和轻链序列的抗体与抗原结合的情况。

本发明方法的一个实施方示在图1中示出。参考图1，所述方法的实施方式可能涉及用选择的抗原免疫非人灵长类动物。在图1中，从更大的抗体生成细胞群中，富集获得六个不同的产生结合靶抗原的抗体的抗体生成细胞A-F。然而，在许多实施方式中，可能有几百、几千或几百万个富集细胞。这些细胞中的每一个都产生含有自然配对的IgH和IgL 链的天然抗体。富集细胞所产生抗体的重链和轻链的氨基酸序列通过测序编码抗体的IgH 和IgL链的核酸获取(在某些情况下，只对编码抗体IgH和IgL链可变区的核酸进行测序)，将序列进行分析并投入谱系组，如上述所讨论的，谱系组是由具有共同B细胞祖先的细胞生成的抗体组群。这些抗体通常具有非常相似的序列，并具有长度相同且序列几乎相同的 H3CDR，以及长度相同且序列几乎相同的L3CDR。在图1所示的实施方式中，六个抗体生成细胞生成的抗体(AbA至AbF)分为两个谱系组(即谱系组1和2，其中AbA和AbB 在谱系组1中，AbC、AbD、AbE和AbF在谱系组2中)。抗体置于谱系组中后，选择来自至少一个谱系组的单一抗体(或在某些情况下，各谱系组中的多个抗体)例如，谱系组 1中的AbA和谱系组2中的AbC，用于在生物测定中测试，其中生物测定识别具有生物活性(例如阻断或中和活性)的抗体。一旦识别到具有生物活性的抗体，例如AbC，则对与识别到的抗体来自同一谱系组的其他抗体也进行测试，以识别与第一抗体具有相同的生物活性的第二抗体。在图1所示的示例中，测试了与抗体C属于同一谱系组的抗体D、E和 F。

许多非人灵长类动物，包括但不限于大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿、食蟹猕猴、恒河猴、豚尾猕猴，可以被用作抗体生成细胞的来源。在某些实施方式中，用于提供抗体生成细胞的非人灵长类动物是食蟹猕猴、恒河猴和豚尾猕猴。免疫动物的步骤在本领域公知，在Harlow等中有所记述(《抗体：一本实验手册》，第一版(1988)纽约冷泉港)。

合适的抗原包括Her2、GD2、PD-1(程序性细胞死亡1)、PD-L1(程序性死亡配体1)、EGF-R、CEA、CD52、CD20、Lym-1、CD6、补体激活受体(CAR)、EGP40、VEGF、肿瘤相关糖蛋白TAG-72AFP(甲胎蛋白)、BLyS(TNF和APOL相关配体)、CA125(癌抗原125)、CEA(癌胚抗原)、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR相关联的异多聚体)、CD4、CD11a(整合素αL)、CD14(单核细胞分化抗原)、CD20、CD22(B细胞受体)、CD23(低亲和力IgE受体)、CD25(IL-2受体α链)、CD30(细胞因子受体)、 CD33(髓样细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、CD44v6(白细胞介导的粘附)、 CD52(CAMPATH-1)、CD80(对CD28和CTLA-4的共刺激分子)、补体成分C5、CTLA、EGFR、嗜酸性粒细胞趋化因子(细胞因子A11)、HER2/neu、HLA-DR、HLA-DR10、 II类HLA、IgE、糖蛋白iib/iiia受体(整合素)、整合素a Vβ3、整合素a4β1和a4β7、整合素β2、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6R(IL6受体)、IL-12、IL-15、KDR(VEGFR-2)、 lewisy、间皮素、MUC1、MUC18、NCAM(神经细胞粘附分子)、癌胚纤连蛋白、PDGF βR(β血小板衍生生长因子受体)、PMSA、肾癌抗原G250、RSV、E-选择素、转化生长因子-β1，转化生长因子-β2、肿瘤坏死因子α、TRAIL-R1、VAP 1(血管粘附蛋白1) 或TNFα，或类似物的细胞外暴露的片段。在许多实施方式中，具有对应氨基酸序列的肽用作抗原，其氨基酸序列对应于上述列出的其中一个蛋白质的胞外结构域的一部分。

在某些实施方式中，亲和纯化方法用于分离产生结合抗原的抗体的抗体生成细胞。免疫动物的抗原可以固相固定并用于选择性保留在表面表达结合该抗原的抗体的抗体生成细胞，而其他的细胞被洗掉。保留的细胞可以通过多种方法洗脱，例如通过使用过量的抗原、离液剂、改变pH、盐浓度等。任何已知的将抗原固定或耦接至固相的方法都可以使用。例如，当抗原是癌细胞时，可以使用适当处理过的可结合细胞的微量滴定板，例如用于细胞培养的微量滴定板。在抗原是蛋白质的情况下，该蛋白质可通过已知的技术共价连接到固相，例如琼脂糖珠等。另外，标记的抗原可以用于特异性标记表达与抗原结合的抗体的细胞，标记的细胞随后可以通过细胞分选进行分离(例如通过流式细胞荧光分选技术)。在某些情况下，用于抗体纯化的方法可以适于分离抗体生成细胞。这些方法已知并有所记述，例如在J Immunol Methods.2003年11月；282(1-2):45-52；J Chromatogr A.2007年8 月10日；1160(1-2):44-55；J BiochemBiophys Methods.2002年5月31日；51(3):217-31。细胞也可用磁珠或通过任何其它已知的亲和固相捕获方法、方案进行分离。在某些实施方式中，抗原特异性抗体生成细胞可以通过例如Wrammert(《自然》2008 453:667-672)、 Scheid(《自然》2009 458:636-640)、Tiller(《免疫方法期刊》2008 329 112-124) 或Scheid(《美国科学院院刊》2008 105:9727-9732)所述的方法使用流式细胞术从血液中获得，其通过引用并入本文以公开上述方法。示例性的抗体生成细胞的富集方法包括对从脾、骨髓、淋巴结或其它淋巴器官获得细胞群采用流式细胞术(FACS)，例如通过孵育带有标记的非人灵长类动物特异性IgG的细胞，并用FACSVantage SE细胞分选仪(Becton-Dickinson,San Jose,Calif.)分选标记的细胞。在某些实施方式中，单个或近单个抗体生成细胞沉积在微量滴定板。如果采用FACS系统，分选的细胞富集之后可直接沉积到微量滴定板中。

富集可以将细胞群的大小减少至少50％，例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，并且在某些情况下，多个富集的抗体生成细胞基本纯净，即基本上不含其它不产生结合抗原的抗体的细胞，其中术语“基本纯净”是指分离的抗体生成细胞群，其中表达特异性结合抗原的抗体的细胞占全部细胞群的至少5％、10％、20 ％、30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或更多。抗体生成细胞的富集群体可作为细胞的混合物使用，或可作为单个细胞使用，例如，通过稀释和沉积到微量滴定板的单个孔中。

抗体生成细胞的富集群体可以包含至少5个、至少10个、至少30个、至少60个、至少100个、至少300个、至少500个、至少1000个、至少5000个、至少10,000个或至少100,000个，或更多的抗体生成细胞。

抗体生成细胞可以来源于血液、淋巴结或骨髓，以及其他组织。抗体生成细胞也可以由用抗凝血剂(如肝素或EDTA)收集的血液制备。可以使用标准程序，例如用聚蔗糖- 泛影葡胺(Pharmacia，Uppsula，Sweden)离心，从红细胞和多晶型物中进一步分离抗体生成细胞。抗体生成细胞也可以通过在EDTA存在下用诸如胶原酶和胰蛋白酶的酶解离从固体组织如淋巴结中制备。在优选的实施方式中，抗体生成细胞来源于血液，例如外周血单核细胞(PBMC)。

分离的抗体生成细胞在沉积后可以选择性地通过本领域技术人员已知的方法培养(即，在支持细胞的至少1个、至少5个或至少10个或更多细胞分裂的培养基中生长)(例如参见WO 01/55216)。

在某些实施方式中，富集细胞产生的抗体没有被很好地表征。因此，尽管基于特异性结合抗原的抗体的产生来分离抗体生成细胞，但是这些抗体结合的表位是未知的，并且抗体是否具有任何生物活性(例如中和或阻断活性)是未知的。此外，这些抗体的IgH和IgL链的可变区的核酸序列或氨基酸序列是未知的。

编码重链和轻链的序列可以使用本领域公知的技术从cDNA扩增，如聚合酶链式反应 (PCR)。参见Mullis，美国专利号4,683,195；Mullis等，美国专利号4,683,195；《聚合酶链式反应：当代分子生物学中的交流》，冷泉港出版社，纽约冷泉港，1989。简而言之，通过与DNA聚合酶进行连续反应，编码抗体可变区的cDNA片段指数性扩增。该反应用5'引物和3'DNA引物引导。在一些实施方式中，3'反义引物对应于免疫球蛋白链的恒定(或连接)区中的DNA序列，5'引物(或相关引物组)对应于免疫球蛋白链可变区中的DNA 序列。寡核苷酸引物的这种组合已经用于未知序列的鼠免疫球蛋白cDNA的PCR扩增(参见Sastry等，《美国科学院院刊》，1989和Orlandi等《美国科学院院刊》86:3833-3837， 1989)。或者可以进行“锚定聚合酶链反应”(参见Loh等，《科学》243:217-220，1989)。在这一过程中，第一链cDNA由上述3'DNA引物引导，然后用末端脱氧核苷酸转移酶将多(dG)尾加到所述链的3'末端。然后使用特异性3'DNA引物和由连接到具有便利限制性位点的序列的聚(dC)尾组成的另一寡核苷酸，通过PCR扩增该产物。然而，在许多实施方式中，使用跨越两条免疫球蛋白cDNA的起始密码子和终止密码子的引物扩增整个编码重链或轻链的多核苷酸，但也可以根据所需的扩增产物使用合适的引物。可以将合适的限制性位点和其他尾改造成扩增寡核苷酸，以促进扩增产物的克隆和进一步加工。使用巢式引物的扩增方法也可以使用，其中所述巢式引物是本领域技术人员熟知的。用于扩增抗体编码核酸的示例性方法也记述于例如Wrammert(《自然》2008 453：667-672)和Scheid (《自然》2009 458：636-640)中。在该实施方式中，细胞可以彼此保持分开(在这种情况下，扩增自单个细胞的初始扩增产物可以含有可以测序的单一种类)。

在某些实施方式中，获得至少1,000个重链序列和至少1,000个轻链序列。

一旦获得了抗体的重链和轻链的氨基酸序列，就可以基于序列相似性对抗体进行分组，以提供谱系相关的多组抗体。用于进行抗体序列的克隆分析的方法是已知的，并且记述于许多出版物，包括Magori-Cohen(《生物信息》2006,22：e332-40)、Manske(《临床免疫学》2006 120：106-20)、Kleinstein(《免疫学期刊》2003 171：4639-49)、Clement (《分子生态学》2000 9：1657-1659)、Mehr(《免疫学期刊》2004,17790-6)、Wrammert (《自然》2008453：667-672)、Scheid(《自然》2009 458：636-640)，其通过引用并入本文以公开上述方法。置于谱系组的抗体应全部来自单个非人灵长类动物。

在一些实施方式中，对抗体的氨基酸位置使用合适的编号系统编号，例如由Chothia (《分子生物学期刊》1998；278：457-79)或Kabat(1991，《免疫学相关蛋白序列》，DHHS，华盛顿特区)提供的编号系统。可以使用这些方法鉴定CDR和/或框架残基。编号的序列可以肉眼比对，或者通过采用比对程序比对，例如CLUSTAL程序套件之一 (Thompson等，《核酸研究》，22：4673-4680)。相关抗体组中抗体的可变区具有非常相似的氨基酸序列。例如，不计为便于序列比对而制造的间隔或插入，相关抗体组中的抗体的V_H或V_L结构域可以具有至少约80％相同(例如至少85％相同、至少90％相同、至少95％或至少98％或至少99％相同)的氨基酸序列。相关抗体组中的抗体具有彼此相似的V_L结构域以及彼此相似的V_H结构域。也就是说，在某些实施方式中，两种不同相关抗体的V_H或V_L结构域通常含有最多约10个(即一个、两个、三个、四个或五个或更多个) 氨基酸差异。氨基酸差异可以存在于可变结构域的任何位置，包括在任何CDR或任何框架区中。这些相关抗体具有几乎相同的H3CDR，以及几乎相同的L3CDR。在这些实施方式中，相关的任意两种抗体将具有各自长度相同且具有近似相同序列(即含有0、1、2、3、 4或5个氨基酸变化)的L3和H3CDRs。也就是说，两种抗体的L3CDR在长度上相同，并且在序列上几乎相同，并且两种抗体的H3CDR在长度上相同，并且在序列上几乎相同。

取决于获得序列的多少，在某些实施方式中，所述富集抗体可分为至少5组、至少10 组、至少20组、至少50组或至少100组或更多组，例如，高达200或500组或更多。取决于获得序列的多少，每组可含有2至数百种或更多种抗体。

一旦抗体被分组，从至少一些组中(例如，至少10％、至少20％、至少50或至少80％的组)每组取一个单一抗体进行第一生物测定，以识别具有生物活性的第一抗体。

生物测定可以确定抗体是否具有生物学效应，例如通过结合受体并阻断配体的结合，或通过结合并中和配体，或通过促进或抑制细胞表型，例如细胞生长、细胞增殖、细胞迁移、细胞活力(例如凋亡)、细胞分化、细胞粘附、细胞形状变化(例如，肾小管细胞形成)、补体依赖性细胞毒性CDC、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、受体激活、基因表达变化、翻译后修饰(例如磷酸化)的变化、蛋白质靶向的变化(例如，NFκB定位等)等，或通过抑制受体多聚化(例如二聚体或三聚体)或受体-配体相互作用等方式，来抑制受体和配体之间相互作用的能力。这样的生物测定在本领域公知。术语“生物测定”旨在排除只读取抗体结合靶标的能力的测定。本方法中可用的生物测定有多种，包括但不限于测量细胞表型的细胞测定，例如基因表达测定；和涉及特定动物的体内测定(在某些实施方式中可能是与靶标相关的病症的动物模型)。在某些情况下，该测定可以是血管化测定。

示例性VEGF生物测定包括在无细胞系统中使用分离的蛋白质的测定、在体外使用培养的细胞或体内的测定。示例性VEGF测定包括但不限于：受体酪氨酸激酶抑制测定(例如参见《癌症研究》2006年6月15日；66:6025-6032)、在体外HUVEC增殖测定(《FASEB 期刊》2006；20:2027-2035)、体内实体瘤疾病测定(美国专利号6,811,779)和体内血管生成测定法(《FASEB期刊》2006；20:2027-2035)。上述测定方法在本领域公知。对这些测定法的记述在此通过引用并入本文。

示例性TNF-α生物测定包括体内测定或使用无细胞系统或使用培养细胞的体外测定。因此，TNF-α试验包括体外的人全血测定和细胞介导的细胞毒性测定(美国专利号 6,090,382)、体外人肿瘤杀伤测定(例如参见，公开的美国专利申请20040185047)、体内肿瘤消退测定(美国专利申请20040002589)。另外的TNF-α测定法记述于多种出版物中，包括美国公布PG公布号20040151722、20050037008、20040185047、20040138427、 20030187231、20030199679和Balazovich(《血液》1996 88:690-696)。

示例性的PD-1和PD-L1生物测定包括使用无细胞系统或使用培养细胞的体外测定或体内测定法，测定法描述于多种出版物中，包括US 20100055102A1和WO 2012018538 A2。

受试抗体抑制其靶标的至少一种活性的约20％至100％，例如，至少约20％、至少约 30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、通常至多为约70％，至多为约80％，至多为约90％或更多。在某些测定中，受试抗体抑制其靶标的IC50值可为1×10^-7M或更小 (例如1×10^-7M或更小、1×10^-8M或更小、1×10^-9M或更小、通常低至1×10^-12M或 1×10^-13M)。在使用小鼠的试验中，受试抗体的ED50值可小于1毫克/小鼠(例如10毫微克/小鼠标至约1微克/小鼠)。在某些实施方式中，在配体的存在下，受试抗体可与细胞接触，并监测细胞的配体响应表型。

在本实施方式中，生物测定测试的抗体可包含自然配对的重链和轻链可变结构域，或非天然配对的重链和轻链(即来自相同谱系组的不同抗体的重链和轻链可变结构域)。由于抗体来自同一个谱系组，所以预期这些抗体是功能性的。

在识别到具有生物活性的第一抗体后，进一步在第二生物测定中测试第一抗体所在的同一谱系组中的其他抗体，以识别出与第一抗体具有相同生物活性的第二抗体。在某些情况下，测试同一谱系组中至少10％、至少20％、至少50％，或至少80％的抗体。所述第一生物测定与第二生物测定可以相同或不同。在某些实施方式中，多个抗体被测试，并选择具有最佳性质的抗体以供后续使用。

在特定实施方式中，进一步抗体可包含自然配对的重链和轻链可变结构域，或非天然配对的重链和轻链可变结构域(即来自相同谱系组的不同抗体的重链和轻链可变结构域)。由于抗体来自同一谱系组，所以预期这些抗体是功能性的。在特定实施方式中，重链和轻链的配对可以是例如系统性的(例如每条重链与每条轻链结合进行测试)或随机性的(例如，每条重链与随机选择的轻链一起测试)。

在某些实施方式中，特别是如果抗原在动物体内引起强烈反应，该方法可以在不存在抗体生成细胞的任何基于抗原富集的情况下在第一生物测定之前实施。在这些实施方式中，方法可以包括：a)从动物的B细胞群中获取抗体重链序列和抗体轻链序列，其中所述B细胞群未对产生特异性结合到靶抗原的抗体的B细胞进行富集，b)基于序列相似性对重链和轻链序列进行分组，以提供多个谱系相关抗体的组；c)在第一生物测定中每组取一个单一抗体进行测试，以识别出具有生物活性的第一抗体；并且，在第一抗体被鉴定后；并且d)在第二生物测定中测试相同组中的进一步抗体，从而识别出具有生物活性的第二抗体。

在某些实施方式中，抗体生成细胞可能不需要在测序之前富集或分离成单个细胞(在这种情况下，初始扩增产物将含有多种不同产物的混合物，可以通过将产物克隆或使用单分子测序技术，例如高通量测序来区分)。该方法的一个实施例在图2中示出。参照图2，该方法的实施方式可以包括用选择的抗原免疫非人灵长类动物。从免疫的灵长类动物收集抗体生成细胞群体。核酸由庞大的抗体生成细胞群制备。可以扩增编码抗体的重链和轻链(或在某些情况下，重链和轻链的可变区)的核酸。通过对编码抗体的重链和轻链的核酸进行测序，获得抗体生成细胞群体产生的抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列。分析该序列并将其放入谱系组中，如上所述，这些谱系组来源于同一个B细胞祖先的细胞产生的抗体的序列组。这些序列通常是非常相似的。例如，相同谱系组中的重链序列具有长度相同且且序列近似相同(例如氨基酸取代小于5个)的H3CDR。同样，同一谱系组中的轻链序列具有长度相同且序列近似相同(例如小于5个氨基酸取代)的L3CDR。在图2中， 6个重链可变区序列V_H1至V_H6分为两个谱系，即V_H1和V_H2在谱系组1(LGH1)中， V_H3、V_H4、V_H5和V_H6在谱系组2(LGH2)中。独立地，将6个轻链序列V_L1至V_L6 分为两个谱系组，即V_L1和V_L2在谱系组1(LGL1)中，V_L3、V_L4、V_L5和V_L6在谱系组2(LGL2)中。在序列放入谱系组之后，选择来自至少一个谱系组的单个重链，例如来自重链谱系组1的V_H1、来自重链谱系组2的V_H3，并与来自于至少一个谱系组的单一轻链，例如来自轻链谱系组1的V_L1、轻链谱系组2的V_L3，分别结合，以形成用于在生物测定中测试的抗体，其中该生物测定识别具有生物活性的抗体(例如阻断或中和活性)。一旦已识别出具有生物学活性的抗体，例如具有与V_L3配对的序列V_H3的抗体，则测试含有来自与识别到的抗体同一谱系组的序列的其它抗体，以识别出具有与第一抗体相同的生物活性的第二抗体。在图1所示的实施例中，测试了具有与V_L3配对的序列V_H3、与V_L4 配对的V_H4、与V_L5配对的V_H5，和与V_L6配对的V_H6、与V_L4配对的V_H3、与V_L6配对的V_H4、与V_L5配对的V_H3和与V_L6配对的V_H5的抗体。

在某些实施方式中，可能需要对谱系树的进一步分析来确定哪个重链谱系组与轻链谱系组配对。在一个实施方式中，可利用谱系组的大小来决定重链谱系组与轻链组如何配对。成员最多的重链谱系组与成员最多的轻链谱系组配对。成员第二多的重链谱系组与成员第二多的轻链谱系组配对，以此类推。

在某些实施方式中，可基于从一个或多个主导抗体中获取的重链和轻链序列来决定重链谱系组与轻链谱系组的配对方式。在一个实施方式中，由免疫的非人灵长类动物获得大量抗体生成细胞(例如超过10,000个细胞、20,000个细胞、50,000个细胞、100,000个细胞、200,000个细胞、500,000个细胞、1,000,000个细胞或更多)。由庞大的抗体生成细胞群制备核酸，通过高通量测序获得大量重链序列和轻链序列(例如超过100,000个序列、 200,000个序列、500,000个序列、1,000,000个序列)。如上所述，分析上述大量重链和轻链序列以分为谱系组。同时，富集少量抗体生成细胞(例如约5个细胞、10个细胞、20 个细胞、50个细胞、100个细胞、200个细胞、500个细胞，通常不超过1,000个细胞)以与特异性靶标结合并分离成单个细胞。通过对编码抗体的重链和轻链的核酸进行测序，获得每个单细胞的重链和轻链序列。分析从少量单个细胞获得的重链和轻链序列，以将其纳入由大量抗体生成细胞获取的谱系组中。每个单个细胞的重链和轻链序列的配对，为重链谱系组和轻链谱系组的配对提供了蓝图。

在某些实施方式中，本发明的方法可以包括用选出的抗原免疫非人灵长类动物，并在生物测定中测试由动物的抗体生成器官的第一部分产生的多个抗体(例如，脾脏的第一部分、淋巴结的第一部分、骨髓的第一部分或动物血液中外周血单核细胞(PBMC)群的第一部分等)，以识别具有生物活性的第一抗体。在这些实施方式中，抗体生成器官的第一和第二部分在该器官中不必在空间上分离。相反，由于器官的第一部分可以通过例如制备器官的单细胞悬浮液然后除去部分悬浮液来制备，器官的第一和第二部分在器官中可以是彼此交融的。以识别到抗体A具有生物活性为例。获得编码抗体IgH和IgL链的核苷酸序列。基于这些序列，设计对于与所鉴定的抗体处于相同谱系组中的抗体的重链和轻链特异的PCR引物，并且用于从抗体生成器官的第二部分获得与识别到的抗体在同一谱系组中的进一步的抗体的序列。测定进一步的抗体并识别出与第一抗体具有相同生物活性且来自相同谱系组的第二抗体。

上文讨论了该备选方法的许多示例性的方面，例如可以在该方法中使用哪些抗原和生物测定法等。在某些实施方式中，使用如上所述的生物测定法来识别从抗体生成器官的第一部分获得的主导抗体。在一个实施方式中，重链和轻链序列从PBMC直接扩增，并且在筛选之前在不同的细胞中表达重组抗体(例如如US20040067496中所述)。在另一实施方式中，由从动物的脾的一部分制备的RNA构建噬菌体展示文库，并对噬菌体展示文库进行筛选。识别出具生物活性的第一抗体，并对编码该抗体的核酸进行测序。

在某些实施方式中，编码谱系相关抗体的可变重链和可变轻链结构域的多核苷酸可以通过“CDR锚定PCR”从与第一抗体相同的动物中扩增，即，使用各自含有与母体抗体cDNA的CDR编码区互补的引物的引物对。在这些实施方式中，该方法可以包括：a)获得以下核苷酸序列：i)编码免疫动物的第一抗体的可变重链的重链编码核酸；和ii)编码第一抗体轻链的可变轻链编码核酸；b)从免疫的动物获得进一步抗体的重链和轻链的可变结构域的氨基酸序列，其使用：i)包含与所述重链编码核酸的CDR编码区互补的第一引物的第一引物对；和ii)包含与所述轻链编码核酸的CDR编码区互补的第二引物的第二引物对。通过翻译所获得的核苷酸序列确定进一步抗体的可变结构域的氨基酸序列后，可以使用上述方法分析氨基酸，以证实它们与第一抗体的谱系相关(例如，分析以确定重链和轻链的氨基酸序列是否与亲本抗体的氨基酸序列至少80％相同，以及如前所述的重链和轻链CDR3区是否长度相同、序列近似相同等等)。

很明显，在由动物获得编码第一抗体的核苷酸序列之后，可以使用多种技术来扩增从编码来自该动物的进一步抗体的序列。例如，可以使用反向PCR扩增编码第二抗体的重链和轻链序列(例如，使用两个背向彼此的引物)或通过使用特异性(其中特异性引物可以与第一抗体的不同序列，例如不同的CDR序列互补)或“通用”引物(其中通用引物与存在于多个不同的抗体编码多核苷酸中的序列互补)的锚定PCR，其中以cDNA作为模板，引物之一与第一CDR编码区互补。在某些情况下，通用引物可以与存在于至少10％(例如，至少20％、至少40％、至少50％或至少80％)的获取自所述动物的重链或轻链编码 cDNAs中的序列互补(例如，与编码存在于抗体的恒定区域或分泌信号中的保守序列的核酸互补)。在其他实施方式中，通用引物可以与例如克隆自所述动物的cDNA的载体中的侧翼序列，或连接到cDNA上的链接子互补。

在一个实施方式中，使用cDNA作为模板进行两次扩增反应，其中第一反应扩增第二抗体的重链可变结构域编码核酸，第二反应扩增第二抗体的轻链可变结构域编码核酸。在该实施方式中：a)第一反应使用：i)与第一抗体的重链编码核酸的CDR编码区(即，CDR1、CDR2或CDR3区)互补的CDR特异性引物和ii)与抗体重链cDNA的不可变结构域编码区互补的通用第二引物，例如与编码第一抗体重链恒定结构域或分泌信号的序列互补，如本公开的示例部分所示；和b)第二反应使用i)与第一抗体的轻链编码核酸的CDR编码区(即，CDR1、CDR2或CDR3区)互补的CDR特异性引物，和ii)与抗体轻链cDNA 的不可变结构域编码区互补的通用第二引物，例如与编码第一抗体轻链的恒定结构域或分泌信号的序列互补。

几种通过PCR克隆抗体序列的策略已知并可以容易地适用于本发明的方法(例如在公开的引物之外使用CDR特异性引物)。这些策略包括在如下的以及许多其它文献中所记述的：LeBoeuf(利用简并寡核苷酸与聚合酶链式反应对免疫球蛋白可变区基因进行克隆与测序《基因》1989 82:371-7)、Dattamajumdar(对任一重排小鼠免疫球蛋白可变基因的快速克隆《免疫遗传学》1996 43:141-51)、Kettleborough(为用聚合酶链式反应克隆小鼠免疫球蛋白基因文库优化引物《欧洲免疫学期刊》1993 23:206-11)、Babcook(由单个、分离的具有特定特异性的抗体生成淋巴细胞生成单克隆抗体的新策略《美国科学院院刊》 1996 93:7843-7848)以及Williams(免疫球蛋白超家族结构域的结构多样性《冷泉港定量生物学研讨会》1989 54:637-47)。在某些情况下，第二引物可以是不同引物的混合物或例如简并引物。

重链CDR特异性引物可以与编码第一抗体重链的CDR1、CDR2或CDR3区的序列互补，同样，轻链CDR特异性引物可以与编码第一抗体的轻链的CDR1、CDR2或CDR3区的序列互补。在某些实施方式中，可以选择特定的CDR特异性引物，因为其结合的CDR 序列可能比其它CDR序列变化小。

上述CDR锚定方法是有效的，因为与谱系相关的不同抗体家族中的可变结构域之间的大多数序列多样性在于CDR区域(即CDRs在不同抗体家族之间可变性相当高)，而 CDR区的序列在谱系相关的单个抗体家族的抗体中相对恒定。因为与该方法使用的引物互补的序列在相关抗体不同家族之间高度可变，所以只有相关抗体才能通过该方法成功扩增。

在本实施方式中，可以使用由抗体生成器官的第二部分制备的cDNA进行扩增反应。例如，可以使用获取自单细胞(或其培养物)的核酸或获取自库集细胞(例如皆含有cDNA的不同抗体生成细胞的细胞库)的核酸进行扩增反应。例如，细胞库可以含有来自至少10个、至少100个或至少1,000个不同抗体细胞的cDNA。预期大小的扩增产物可以直接测序或使用已知方法进行克隆和测序。

取决于抗原和抗体生成器官的第二部分中抗体生成细胞的数量，可以获得至少5个、至少10个、至少20个、至少50个或至少100个或更多个，例如多达200个、多达500 个、1,000个、5,000个或10,000个或更多个序列的重链和轻链可变序列。

在第二生物测定中测试进一步的抗体以识别与第一抗体具有相同生物活性的第二抗体。如上所述，第一和第二生物测定可以相同或不同。在某些情况下，在生物测定中测试至少30％(例如，至少70％、至少80％、或至少90％)的谱系相关抗体。在该实施方式中，进一步抗体可以含有天然配对的重链和轻链可变结构域，或非天然配对的重链和轻链 (即来自相同谱系组的不同抗体的重链和轻链可变结构域)。由于抗体来自相同的谱系组，因此预期这些抗体将是功能性的。在特定实施方案中，重链和轻链的配对可以是例如系统性的(例如每条重链与每条轻链结合进行测试)或随机性的(每条重链与随机选择的轻链一起测试)。通过本发明方法产生的抗体可用于诊断、抗体成像和治疗通过单克隆抗体疗法可治疗的疾病。特别地，通过本方法人源化的抗体可以用于被动免疫或去除不要的细胞或抗原，例如通过补体介导的溶解或抗体介导的细胞毒性作用(ADCC)，所有这些都不发生相关于先前许多抗体的大量免疫反应(例如过敏性休克)。例如，本发明的抗体可以用于治疗一种疾病，其中不想要的细胞的表面特异性表达识别抗体的蛋白质(例如HER2 或任何其它癌症特异性标记物)，或可以用于中和不良毒素、刺激物或病原体。人源化抗体特别可用于治疗多种类型的癌症，例如结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等，其中癌症与特定细胞标记物的表达相关。由于大多数(如果不是全部)疾病相关细胞和病原体具有作为抗体潜在靶标的分子标记物，许多疾病是人源化抗体的潜在适应症。

这包括自身免疫性疾病，其中特定类型的免疫细胞攻击自身抗原，例如胰岛素依赖型糖尿病、系统性红斑狼疮，恶性贫血、过敏和类风湿性关节炎；移植相关的免疫激活，如移植物排斥反应和移植物抗宿主病；其他免疫系统疾病，如感染性休克；感染性疾病，如病毒感染或细菌感染；心血管疾病，如血栓塞，以及神经系统疾病，如阿尔茨海默病。

特别值得关注的是一种与不存在抗体的对照组相比，对动物模型疾病或病症症状调节，即降低或增加至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约 70％、至少约80％、至少约90％或更多的抗体通常，所关注的单克隆抗体将导致受试动物更加类似于与其相当的非患有疾病或病症的动物。具有经本发明的方法和组合物确定的治疗价值的单克隆抗体被称为“治疗性”抗体。

产生人源化抗体的方法

在另一个方面，本公开涉及产生人源化抗体的方法。

在某些实施方式中，用于产生与抗原结合的人源化抗体的方法包括：a)根据上述方法识别抗原结合的抗体；b)将包含来自步骤a)中识别到的所述抗体的CDR区的序列移植到人抗体框架中以产生人源化抗体；和c)测试步骤b)中产生的所述人源化抗体与抗原结合的情况。

作为该方法的第一步，使用上述方法识别出与抗原结合的灵长类动物抗体。然后将灵长类动物抗体框架区的氨基酸序列与人抗体的抗体框架区进行比较，以找到与灵长类抗体框架基本相同的人抗体框架，例如，人抗体框架与步骤a)中识别的所述抗体的框架至少50 ％、60％、70％、80％、90％、95％、99％相同。在某些实施方式中，人抗体框架与步骤a)中识别的所述抗体的框架完全相同。

找到与识别到的灵长类动物抗体基本相同的人抗体框架后，将识别到的灵长类动物抗体的CDR序列(即H1CDR、H2CDR和H3CDR、L1CDR、L2CDR、L3CDR)移植到找到的人抗体框架以产生人源化抗体。

将CDR序列移植到人抗体框架的方法在本领域公知。在某些实施方式中，分离编码CDR序列的核苷酸序列并将其插入到编码人抗体框架的核苷酸序列中。通常是分离编码识别到的灵长类动物抗体的CDR1、CDR2和CDR3的核苷酸序列，并将其插入到编码人抗体框架的核苷酸序列中。在某些实施方式中，当人抗体框架与识别到的灵长类动物抗体几乎相同，例如具有至少90％、95％、99％同一性时，诱导编码灵长类动物抗体的核苷酸序列突变，以用人抗体框架中对应的氨基酸残基，来替代灵长类动物框架中与人抗体框架不同的氨基酸残基，，从而产生具有人抗体框架的人源化抗体。在某些实施方式中，灵长类动物抗体框架与人抗体构架完全相同，而该灵长类动物抗体在本文中可以视为人源化抗体。

识别与抗原结合的灵长类动物T细胞受体的方法

在一个方面，本发明涉及识别与抗原结合的灵长类动物T细胞受体的方法。在某些实施方式中，所述方法可以包括以下步骤：a)获得：来自经抗原免疫的灵长类动物的T细胞群的多个T细胞受体(TCR)α链序列和多个TCRβ链序列；b)将所获得的多个TCR α链序列分成多个α链组，并且独立地将所获得的多个TCRβ链序列分组成多个β链组，其中：包含长度相同并且相对于彼此含有不超过5个氨基酸取代的CDR3区的TCRα链序列被分在一组；包含长度相同并且相对于彼此含有不超过5个氨基酸取代的CDR3区的 TCR链序列被分在一组；c)从步骤b)中成组的组中选择一个α链组和一个β链组；d) 将来自步骤c)中选择的组中的1个α链序列和1个β链序列配对；和e)测试包含在步骤d)中配对的α链和β链序列的TCR与抗原结合的情况。

图3中示出了本发明方法的一个实施方式。参照图3，该方法的实施方式可以包括用选取的抗原免疫非人灵长类动物。在图3中，从大量的抗体生成细胞中，富集产生与目标抗原结合的抗体的六种不同的T细胞A-F。然而，在许多实施方式中，可能存在数百、数千或数百万个T细胞。这些细胞中的每一个都产生包含天然配对的α链和β链的天然TCR。由富集的T细胞产生的TCR的α链和β链的氨基酸序列通过对编码TCR的α链和β链的核酸测序而获得(在某些情况下，仅对编码TCR的α链和β链的可变区的核酸进行测序)，分析该序列并将其置于谱系组中，如上所述，谱系组为由共享共同T细胞祖先的细胞产生的TCR组。这些抗体通常具有非常相似的序列，并且具有长度相同且序列接近相同的α- 链CDR3以及长度相同且序列接近相同的β-链CDR3。在图3所示的实施方式中，如图3 所示，六个T细胞生成的TCRs(TCR-A至TCR-F)在两个谱系组中(即谱系组1和2，其中TCR-A和TCR-B在谱系组1中，TCR-C、TCR-D、TCR-E和TCR-F在谱系组2中)。在将TCRs置于谱系组之后，选取来自至少一个谱系组中的单个TCR(或在某些情况下，来自各谱系的多个TCRs)，例如来自第1谱系组的TCR-A和来自第2谱系组的TCR-C，进行生物测定，其中生物测定识别具有生物活性的TCR(例如T细胞活化测定)。一旦识别出一个具有生物学活性的TCR，例如TCR-C，则测试与来自与所识别的TCR同一谱系组的其它TCR，以识别出与第一TCR具有相同生物学活性的第二TCR。在图3所示的例子中，对与TCR C属同一谱系组的TCR-D、E和F进行了测试。

许多非人灵长类动物，包括但不限于大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿、食蟹猕猴、恒河猴、豚尾猕猴，可被用作T细胞的来源。在某些实施方式中，用于提供T细胞的非人灵长类动物是恒河猴、食蟹猕猴和豚尾猕猴。免疫动物程序在本领域公知，并记述于Harlow 等(“抗体：一本实验手册”，第一版(1988)纽约冷泉港)。

合适的抗原包括Her2、GD2、PD-1(程序性细胞死亡1)、PD-L1(程序性死亡配体 1)、EGF-R、CEA、CD52、CD20、Lym-1、CD6、补体激活受体(CAR)、EGP40、VEGF、肿瘤相关糖蛋白TAG-72AFP(甲胎蛋白)、BLyS(TNF和APOL相关配体)、CA125(癌抗原125)、CEA(癌胚抗原)、CD2(T细胞表面抗原)、CD3(与TCR相关联的异多聚体)、CD4、CD11a(整合素αL)、CD14(单核细胞分化抗原)、CD20、CD22(B细胞受体)、CD23(低亲和力IgE受体)、CD25(IL-2受体α链)、CD30(细胞因子受体)、 CD33(髓样细胞表面抗原)、CD40(肿瘤坏死因子受体)、CD44v6(白细胞介导的粘附)、 CD52(CAMPATH-1)、CD80(对CD28和CTLA-4的共刺激分子)、补体成分C5、CTLA、EGFR、嗜酸性粒细胞趋化因子(细胞因子A11)、HER2/neu、HLA-DR、HLA-DR10、 II类HLA、IgE、糖蛋白iib/iiia受体(整合素)、整合素a Vβ3、整合素a4β1和a4β 7、整合素β2、IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6R(IL6受体)、IL-12、IL-15、KDR(VEGFR-2)、 lewisy、间皮素、MUC1、MUC18、NCAM(神经细胞粘附分子)、癌胚纤连蛋白、PDGF βR(β血小板衍生生长因子受体)、PMSA、肾癌抗原G250、RSV、E-选择素、转化生长因子-β1，转化生长因子-β2、肿瘤坏死因子α、TRAIL-R1、VAP 1(血管粘附蛋白1) 或TNFα，或类似物的细胞外暴露的片段。在许多实施方式中，具有对应氨基酸序列的肽用作抗原，其氨基酸序列对应于上述列出的其中一个蛋白质的胞外结构域的一部分。

在某些实施方式中，用亲和纯化方法分离产生结合抗原的TCR的T细胞。用以免疫动物的抗原可以在固相固定并用于选择性保留在其表面表达结合抗原的TCR的T细胞，而其他的细胞被洗掉。保留的细胞可以通过多种方法洗脱，例如通过使用过量的抗原、离液剂、改变pH、盐浓度等。任何已知的将抗原固定或联接到固相的方法都可以使用。例如，当抗原是癌细胞时，可以使用结合细胞的适当处理的微量滴定板，例如用于细胞培养的微量滴定板。在当抗原是蛋白质的情况下，该蛋白质可通过已知的技术共价连接到固相，例如琼脂糖珠等。另外，标记的抗原可以用于特异性标记表达与抗原结合的细胞，标记的细胞随后可以通过细胞分选进行分离(例如通过流式细胞荧光分选技术)。细胞也可使用磁珠或通过任何其它已知的亲和固相捕获方法、方案进行分离。示例性的T细胞的富集方法包括对由骨髓、淋巴结或其它淋巴器官获得的细胞群进行流式细胞术(FACS)。在某些实施方式中，单个或近单个T细胞沉积在微量滴定板。如果采用FACS系统，分选的细胞富集之后可直接沉积到微量滴定板中。

富集可以将细胞群体的大小减小至少50％，例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，并且在某些情况下，多个富集的T细胞基本纯净，即基本上不含其它不产生结合抗原的TCR的细胞，其中术语“基本纯净”是指分离的T细胞群，其中表达特异性结合抗原的TCR的细胞占全部细胞群的至少5％、10％、20％、30 ％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或更多。T细胞的富集群体可作为细胞的混合物使用，或可作为单个细胞使用，例如通过稀释和沉积到微量滴定板的各个孔中。

T细胞的富集群体可以包含至少5个、至少10个、至少30个、至少60个、至少100 个、至少300个、至少500个、至少1000个、至少5000个、至少10,000个或至少100,000 个，或更多T细胞。

T细胞可以来源于血液、淋巴结或骨髓，以及其他组织。T细胞也可以由用抗凝血剂(如肝素或EDTA)收集的血液制备。可以使用标准程序，例如用聚蔗糖-泛影葡胺(Pharmacia，Uppsula，Sweden)离心，从红细胞和多晶型物中进一步分离T细胞。T细胞也可以通过在EDTA存在下用诸如胶原酶和胰蛋白酶的酶解离从固体组织如淋巴结中制备。在优选的实施方式中，T细胞来源于血液，例如外周血单核细胞(PBMC)。

分离的T细胞在沉积后可以选择性地通过本领域技术人员已知的方法培养(即在支持细胞的至少1个、至少5个或至少10个或更多细胞分裂的培养基中生长)。

在某些实施方式中，富集细胞产生的TCRs没有被很好地表征。因此，尽管基于特异性结合抗原的TCR的产生来分离T细胞，但是这些TCR结合的表位是未知的，并且TCRs 是否具有任何生物活性(例如诱导T细胞活化)是未知的。此外，这些TCRs的α链和β链的可变区的核酸序列或氨基酸序列是未知的。

编码α链和β链的序列可以使用本领域公知的技术从cDNA扩增，如聚合酶链式反应(PCR)。参见Mullis，美国专利号.4,683,195；Mullis等，美国专利号4,683,195；《聚合酶链式反应：当代分子生物学中的交流》，冷泉港出版社，纽约冷泉港，1989。简而言之，通过与DNA聚合酶进行连续反应，编码TCR可变区的cDNA片段指数性扩增。该反应用 5'引物和3'DNA引物引导。在一些实施方式中，3'反义引物对应于免疫球蛋白链的恒定(或连接)区中的DNA序列，5'引物(或相关引物组)对应于α链和β链可变区中的DNA序列。或者，可以进行“锚定聚合酶链反应”(参见Loh等，《科学》243:217-220,1989)。在这一过程中，第一链cDNA由上述3'DNA引物引导，然后用末端脱氧核苷酸转移酶将多 (dG尾)加到链的3'末端。然后使用特异性3'DNA引物和由连接到具有便利限制性位点的序列的聚(dC)尾组成的另一寡核苷酸，通过PCR扩增该产物。然而，在许多实施方式中，使用跨越α链和β链cDNA的起始密码子和终止密码子的引物扩增整个编码α链和β链的多核苷酸，但也可以根据所需的扩增产物使用合适的引物。可以将合适的限制性位点和其他尾改造成扩增寡核苷酸，以促进扩增产物的克隆和进一步加工。使用巢式引物的扩增方法也可以使用，其中所述巢式引物是本领域技术人员熟知的。在某些实施方式中，细胞可以彼此保持分开(在这种情况下，从单个细胞扩增的初始扩增产物可以含有可以测序的单一物质)。

在某些实施方式中，获得至少1,000个α链序列和至少1,000个β链序列。

一旦获得了TCR的α链和β链的氨基酸序列，就可以基于序列相似性对TCR进行分组，以提供谱系相关的多组TCR。用于进行TCR序列的克隆分析的方法是已知的，并且记述于许多出版物，包括Magori-Cohen(《生物信息》2006 22:e332-40)、Manske(《临床免疫学》2006 120:106-20)、Kleinstein(《免疫学期刊》2003 171:4639-49)、Clement(《分子生态学》2000 9:1657-1659)、Mehr(《免疫学期刊》2004 172 4790-6)、Wrammert(《自然》2008453:667-672)、Scheid(《自然》2009 458:636-640)，其通过引用并入本文以公开上述方法。置于谱系组的TCRs应全部来自单个非人灵长类动物。

相关TCR组中TCR的可变区具有非常相似的氨基酸序列。例如，不计为便于序列比对而制造的间隔或插入，相关TCR组中的TCR的可变区可以具有至少约80％相同(例如至少85％相同、至少90％相同、至少95％或至少98％或至少99％相同)的氨基酸序列。相关组中的TCR具有彼此相似的α链可变结构域以及彼此相似的β链可变结构域。也就是说，在某些实施方式中，两种不同相关TCR的可变结构域通常含有最多约10个(即一个、两个、三个、四个或五个或更多个)氨基酸差异。氨基酸差异可以存在于可变结构域的任何位置，包括在任何CDR或任何框架区中。这些相关TCRs具有几乎相同的α链CDR3，以及几乎相同的β链CDR3。在这些实施方式中，相关的任意两种TCRs将具有相同长度且具有接近相同序列(即含有0、1、2、3、4或5个氨基酸变化)的α-链CDR3s和β- 链CDR3s。也就是说，两种TCR的β链CDR3在长度上相同，并且在序列上几乎相同，并且两种TCR的α-链CDR3在长度上相同，并且在序列上几乎相同。

取决于获得序列的多少，在某些实施方式中，所述富集TCR可分为至少5组、至少10组、至少20组、至少50组或至少100组或更多组，例如，高达200或500组或更多。取决于获得序列的多少，每组可含有2至数百种或更多种TCR。

一旦TCRs被分组，从至少一些组中(例如，至少10％、至少20％、至少50或至少80％的组)每组取一个单一TCR进行第一生物测定，以识别具有生物活性的第一TCR。生物测定可以确定TCR是否具有生物学效应，例如激活免疫应答的能力，或通过促进或抑制细胞表型，例如细胞生长、细胞增殖、细胞迁移、细胞活力(例如凋亡)、细胞分化、细胞粘附、细胞形状变化(例如，肾小管细胞形成)、补体依赖性细胞毒性CDC、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、受体激活、基因表达变化、翻译后修饰(例如磷酸化)的变化、蛋白质靶向的变化(例如，NFκB定位等)等，或通过抑制受体多聚化(例如二聚体或三聚体)或受体-配体相互作用等。这样的生物测定在本领域公知。术语“生物测定”旨在排除只读取TCR结合靶标的能力的测定。本方法中可用的生物测定有多种，包括但不限于测量细胞表型的细胞测定，例如基因表达测定；和涉及特定动物的体内测定(在某些实施方式中可能是与靶标相关的病症的动物模型)。在某些情况下，该测定可以是血管化测定。

在某些实施方式中，生物测定测试的TCR可能包含自然配对的α链和β链可变结构域，或非天然配对的α链和β链(即来自相同谱系组的不同TCR的α链和β链可变结构域)。由于TCR来自同一个谱系组，所以预期这些TCR是功能性的。

在识别到具有生物活性的第一TCR后，在第二生物测定中测试第一TCR所在的同一谱系组中的进一步TCR，以识别出与第一TCR具有相同生物活性的第二TCR。在某些情况下，测试同一谱系组中至少10％、至少20％、至少50％，或至少80％的抗体。所述第一生物测定与第二生物测定可以相同或不同。在某些实施方式中，多个TCR被测试，并选择具有最佳性质的TCR以供后续使用。

在特定实施方式中，进一步TCR可包含自然配对的重链和轻链可变结构域，或非天然配对的α链和β链可变结构域(即来自相同谱系组的不同TCRs的α链和β链可变结构域)。由于TCR来自同一谱系组，所以预期这些TCR是功能性的。在特定实施方式中，α链和β链的配对可以是例如系统性的(例如每条α链与每条β链结合进行测试)或随机性的(例如每条α链与随机选择的β链一起测试)。

在某些实施方式中，特别是如果抗原在动物体内引起强烈反应，该方法可以在不存在 T细胞的任何基于抗原富集的情况下在第一生物测定之前实施。在这些实施方式中，方法可以包括：a)从动物的T细胞群中获取TCRα链序列和β链序列，其中所述T细胞群未富集对产生特异性结合到靶抗原的TCRT细胞进行富集，b)基于序列相似性对α链和β链序列进行分组，以提供多个谱系相关TCR的组；c)在第一生物测定中每组取一个单一TCR 进行测试，以识别出具有生物活性的第一TCR；并且，在第一TCR被鉴定后；并且d)在第二生物测定中测试相同组中的进一步TCRs，从而识别出具有生物活性的第二TCR。

在某些实施方式中，T细胞在可能不需要在测序之前富集或分离成单个细胞(在这种情况下，初始扩增产物将含有多种不同产物的混合物，可以通过将产物克隆或使用单分子测序技术，例如高通量测序来区分)。该方法的一个这样的实施方式在图4中示出。参照图4，该方法的实施方式可以包括用选择的抗原免疫非人灵长类动物。从免疫的灵长类动物收集T细胞群体。核酸由庞大的T细胞的群体制备。可以扩增编码TCR的α链和β链 (或在某些情况下，α链和β链的可变区)的核酸。通过对编码TCR的α链和β链的核酸进行测序，获得T细胞群体产生的TCR的α链和β链可变区的氨基酸序列。分析该序列并将其放入谱系组中，如上所述，这些谱系组来源于共享同一个T细胞祖先的细胞产生的 TCRs的序列组。这些序列通常是非常相似的。例如，相同谱系组中的α链序列具有长度相同且序列近似相同(例如氨基酸取代小于5个)的CDR3。同样，同一谱系组中的β链序列具有长度相同且序列近似相同(例如小于5个氨基酸取代)的CDR3。在图4中，6 个α链可变区序列Vα1至Vα6分为两个谱系，即Vα1和Vα2在谱系组1(LGα1) 中，Vα3、Vα4、Vα5和Vα6在谱系组2(LGα2)中。独立地，将6个β链序列V β1至Vβ6分为两个谱系组，即Vβ1和Vβ2在谱系组1(LGβ1)中，Vβ3、Vβ4、 Vβ5和Vβ6在谱系组2(LGβ2)中。在序列放入谱系组之后，选择来自至少一个谱系组的单个重链，例如来自重链谱系组1的Vα1、来自α链谱系组2的Vα3，并与来自于至少一个谱系组的单一β链，例如来自β链谱系组1的Vβ1、轻β谱系组2的Vβ3，分别结合，以形成用于在生物测定中测试的TCRs，其中该生物测定识别具有生物活性的 TCR。一旦已识别出具有生物学活性的TCR，例如具有与Vβ3配对的序列Vα3的TCR，则测试含有来自与识别到的TCR同一谱系组的序列的其它TCRs，以识别出具有与第一 TCR相同的生物活性的第二TCR。在图4所示的实施例中，测试了具有与Vβ3配对的序列Vα3、与Vβ4配对的Vα4、与Vβ5配对的Vα5，和与Vβ6配对的Vα6、与Vβ 4配对的Vα3、与Vβ6配对的Vα4、与Vβ5配对的Vα3和与Vβ6配对的Vα5的抗体。

在某些实施方式中，可能需要对谱系树的进一步分析来确定哪个α链谱系组与β链谱系组配对。在一个实施方式中，可利用谱系组的大小来决定α链谱系组与β链组如何配对。成员最多的α链谱系组与成员最多的β链谱系组配对。成员第二多的α链谱系组与成员第二多的β链谱系组配对，以此类推。

在某些实施方式中，可基于从一个或多个主导TCR中获取的α链和β链序列来决定α链谱系组与β链谱系组的配对方式。在一个实施方式中，由免疫的非人灵长类动物获得大量T细胞(例如超过10,000个细胞、20,000个细胞、50,000个细胞、100,000个细胞、 200,000个细胞、500,000个细胞、1,000,000个细胞或更多)。由庞大的T细胞群制备核酸，通过高通量测序获得大量α链序列和β链序列(例如，超过100,000个序列、200,000个序列、500,000个序列、1,000,000个序列)。如上所述，分析上述大量α链和β链序列以分为谱系组。同时，富集少量T细胞(例如约5个细胞、10个细胞、20个细胞、50个细胞、 100个细胞、200个细胞、500个细胞，通常不超过1,000个细胞)以与特异性靶标结合并分离成单个细胞。通过对编码抗体的α链和β链的核酸进行测序，获得每个单细胞的α链和β链序列。分析从少量单个细胞获得的α链和β链序列，以将其纳入由大量T细胞获取的谱系组中。每个单个细胞的α链和β链序列的配对，为α链谱系组和β链谱系组的配对提供了蓝图。

在某些实施方式中，本发明的方法可以包括用选出的抗原免疫非人灵长类动物，并在生物测定中测试由动物的T细胞生成器官的第一部分产生的多个TCRs(例如，淋巴结的第一部分、骨髓的第一部分或动物血液中外周血单核细胞(PBMC)群的第一部分等)，以识别具有生物活性的第一TCR。在这些实施方式中，T细胞生成器官的第一和第二部分在该器官中不必在空间上分离。相反，由于器官的第一部分可以通过例如制备器官的单细胞悬浮液然后除去部分悬浮液来制备，器官的第一和第二部分在器官可以是中彼此交融的。以识别到TCR A具有生物活性为例。获得编码TCRα链和β链的核苷酸序列。基于这些序列，设计对于与所鉴定的TCR处于相同谱系组中的TCR的α链和β链特异的PCR 引物，并且用于从T细胞生成器官的第二部分获得与识别到的TCR在同一谱系组中的进一步TCR的序列。测定进一步TCR并识别出与第一TCR具有相同生物活性且来自相同谱系组的第二TCR。

上文讨论了该备选方法的许多示例性的方面，例如可以在该方法中使用哪些抗原和生物测定法等。在某些实施方式中，使用如上所述的生物测定法来识别从T细胞生成器官的第一部分获得的主导TCR。在一个实施方式中，α链和β链序列从PBMC直接扩增，并且在筛选之前在不同的细胞中表达重组抗体(例如如US20040067496中所述)。在另一实施方式中，由从动物的淋巴结的一部分制备的RNA构建噬菌体展示文库，并对噬菌体展示文库进行筛选。识别出具生物活性的第一TCR，并对编码该TCR的核酸进行测序。

在某些实施方式中，编码谱系相关TCR的可变α链和β链结构域的多核苷酸可以通过“CDR锚定PCR”从与第一TCR相同的动物中扩增，即，使用各自含有与母体抗体cDNA 的CDR编码区互补的引物的引物对。在这些实施方式中，该方法可以包括：a)获得以下核苷酸序列：i)编码免疫动物的第一TCR的可变α链的α链编码核酸；和ii)编码第一 TCRβ链的可变β链编码核酸；b)从免疫的动物获得进一步TCR的α链和β链的可变结构域的氨基酸序列，其使用：i)包含与所述α链编码核酸的CDR编码区互补的第一引物的第一引物对；和ii)包含与所述β链编码核酸的CDR编码区互补的第二引物的第二引物对。通过翻译所获得的核苷酸序列确定进一步TCR的可变结构域的氨基酸序列后，可以使用上述方法分析氨基酸，以证实它们与第一TCR的谱系相关(例如，分析以确定α链和β链的氨基酸序列是否与亲本TCR的氨基酸序列至少80％相同，以及如前所述α链和β链 CDR3区是否长度相同、序列近似相同等等)。

很明显，在由动物获得编码第一TCR的核苷酸序列之后，可以使用多种技术来扩增编码来自该动物的进一步TCR的序列。例如，可以使用反向PCR扩增编码第二TCR的α链和β链序列(例如，使用两个背向彼此的引物)或通过使用特异性(其中特异性引物可以与第一TCR的不同序列，例如不同的CDR序列互补)或“通用”引物(其中通用引物与存在于多个不同的TCR编码多核苷酸中的序列互补)的锚定PCR，其中以cDNA作为模板，引物之一与第一CDR编码区互补。在某些情况下，通用引物可以与存在于的至少 10％(例如，至少20％、至少40％、至少50％或至少80％)的获取自所述动物的α链和β链编码cDNAs中的序列互补(例如，与编码存在于TCR恒定区域中的保守序列的核酸互补)。在其他实施方式中，通用引物可以与例如克隆自所述动物的cDNA的载体中的侧翼序列，或连接到cDNA上的链接子互补。

在一个实施方式中，使用cDNA作为模板进行两次扩增反应，其中第一反应扩增第二 TCR的α链可变结构域编码核酸，第二反应扩增第二TCR的β链可变结构域编码核酸。在该实施方式中：a)第一反应使用：i)与第一TCR的α链编码核酸的CDR编码区(即， CDR1、CDR2或CDR3区)互补的CDR特异性引物和ii)与TCRα链cDNA的不可变结构域编码区互补的通用第二引物，例如与编码第一TCRα链恒定结构域或分泌信号的序列互补，如本公开的示例部分所示；和b)第二反应使用i)与第一TCR的β链编码核酸的 CDR编码区(即，CDR1、CDR2或CDR3区)互补的CDR特异性引物，和ii)与TCRβ链cDNA的不可变结构域编码区互补的通用第二引物，例如与编码第一TCRβ链的恒定结构域或分泌信号的序列互补。

几种通过PCR克隆TCR序列的策略已知并可以容易地适用于本发明的方法(例如在公开的引物之外使用CDR特异性引物)。在某些情况下，第二引物可以是不同引物的混合物或例如简并引物。

α链CDR特异性引物可以与编码第一TCRα链的CDR1、CDR2或CDR3区的序列互补，同样，β链CDR特异性引物可以与编码第一TCR的β链的CDR1、CDR2或CDR3 区的序列互补。在某些实施方式中，可以选择特定的CDR特异性引物，因为其结合的CDR 序列可能比其它CDR序列变化小。

上述CDR锚定方法是有效的，因为与谱系相关的不同抗体家族中的可变结构域之间的大多数序列多样性在于CDR区域(即CDRs在不同TCR家族之间可变性相当高)，而 CDR区的序列在谱系相关的单个TCRs家族的TCRs中相对恒定。因为与该方法使用的引物互补的序列在相关TCRs不同家族之间高度可变，所以只有相关TCRs才能通过该方法成功扩增。

在本实施方式中，可以使用由T细胞生成器官的第二部分制备的cDNA进行扩增反应。例如，可以使用获取自单细胞(或其培养物)的核酸或获取看成库集细胞(例如皆含有cDNA 的不同T细胞的细胞库)的核酸进行扩增反应。例如，细胞库可以含有来自至少10个、至少100个或至少1,000个不同T细胞的cDNA。预期大小的扩增产物可以直接测序或使用已知方法进行克隆和测序。

取决于抗原和T细胞生成器官的第二部分中T细胞的数量，可以获得至少5个、至少10个、至少20个、至少50个或至少100个或更多个，例如多达200个、多达500个、1,000 个、5,000个或10,000个或更多个序列的α链和β链可变序列。

在第二生物测定中测试进一步的TCR以识别与第一TCR具有相同生物活性的第二TCR。如上所述，第一和第二生物测定可以相同或不同。在某些情况下，在生物测定中测试至少30％(例如，至少70％、至少80％、或至少90％)的谱系相关TCRs。在该实施方式中，进一步TCRs可以含有天然配对的α链和β链可变结构域，或非天然配对的α链和β链(即来自相同谱系组的不同TCRs的α链和β链可变结构域)。由于TCRs来自相同的谱系组，因此预期这些TCRs将是功能性的。在特定实施方案中，α链和β链的配对可以是例如系统性的(例如每条α链与每条β链结合进行测试)或随机性的(每条α链与随机选择的β链一起测试)。

特别值得关注的是一种与不存在TCR的对照组相比，对动物模型疾病或病症症状调节，即降低或增加至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多的TCR。通常，所关注的TCR将导致受试动物更加类似于与其相当的非患有疾病或病症的动物。具有已经使用本发明的方法和组合物确定的治疗价值的TCR被称为“治疗性”TCR。

编号的实施方式

1.一种方法，包括以下步骤：

a)从已经被抗原免疫的非人灵长类动物中获得抗体生成B细胞群；

b)由抗体生成B细胞群获得：

(i)多个抗体重链序列和

(ii)多个抗体轻链序列；

c)将所述获得的多个抗体重链序列分成至少一个重链组，其中所述重链组中的所述抗体重链序列在谱系上相关；

d)将所获得的多个抗体轻链序列分成至少一个轻链组，其中所述轻链组中的所述抗体轻链序列在谱系上相关；

e)选择所述重链组和所述轻链组；

f)将来自所述重链组的重链序列与来自所述轻链组的轻链序列配对；和

g)测试包含所述重链和轻链序列的候选抗体与抗原结合的情况。

2.根据实施方式1中所述方法，其中重链组中所述抗体重链序列的CDR3区含有不超过5个相对于彼此的氨基酸差异，并且轻链组中所述抗体轻链序列的CDR3区含有不超过5个相对于彼此的氨基酸差异。

3.根据实施方式1中所述方法，其中所述抗原是人抗原。

4.根据实施方式1中所述方法，其中所述抗体重链序列是抗体重链可变区序列，所述抗体轻链序列是抗体轻链可变区序列。

5.根据实施方式1中所述方法，其中所述灵长类动物是旧大陆猴、猩猩、大猩猩或黑猩猩。

6.根据实施方式1中所述方法，其中所述灵长类动物是食蟹猕猴，恒河猴或豚尾猕猴。

7.根据实施方式1中所述方法，其中重链组中所述抗体重链序列的CDR3区含有0、1或2个相对于彼此的氨基酸差异，并且轻链组中所述抗体轻链序列的CDR3区含有0、1 或2个相对于彼此的氨基酸差异。

8.根据实施方式1中所述方法，其中步骤b)通过测序编码来自单个B细胞或其培养物的重链和轻链序列的cDNA来完成。

9.根据实施方式1中所述方法，其中步骤b)通过测序编码由多个B细胞制备的重链和轻链序列的cDNA来完成。

10.根据实施方式1中所述方法，其中抗体生成B细胞群通过与抗原结合来富集。

11.根据实施方式1中所述方法，其中重链组和轻链组都含有至少2个成员。

12.根据实施方式1中所述方法，其中步骤g)包括在阻断测定、中和测定、激动剂测定或拮抗剂测定中测试候选抗体。

13.根据实施方式1中所述方法，其中步骤g)包括在酶联免疫吸附测定中测试候选抗体。

14.根据实施方式1中所述方法，其中步骤b)包括获得至少100种不同的抗体重链序列和至少100种不同的抗体轻链序列。

15.根据实施方式1中所述方法，其中抗体生成B细胞获取自骨髓、脾脏、淋巴结或外周血。

16.根据实施方式1中所述方法，所述方法还包括：

h)将所述重链序列与人重链序列比对，其中所述人重链序列与所述重链序列同源性最高；

i)将所述轻链序列与人轻链序列比对，其中所述人轻链序列与所述轻链序列同源性最高；

j)用人重链或人轻链序列的相应氨基酸取代重链或轻链序列中的至少一个氨基酸残基，从而产生人源化抗体。

17.一种用于鉴定与抗原结合的T细胞受体(TCR)的方法，包括以下步骤：

a)获得已被所述抗原免疫接种的灵长类动物的T细胞群；

b)从T细胞群获得

(i)多个TCRα链序列和

(ii)多个TCRβ链序列；

c)将所获得的多个TCRα链序列分成至少一个TCRα链组，其中TCRα链组中的TCRα链序列在谱系上相关；

d)将所获得的多个TCRβ链序列分成至少一个TCRβ链组，其中TCRβ链组中的TCRβ链序列在谱系上相关；

e)选择TCRα链组和TCRβ链组；

f)将来自TCRα链组的TCRα链序列与来自TCRβ链基团的TCRβ链序列配对；并且

g)测试包含TCRα链序列和TCRβ链序列的候选TCR与抗原结合的情况。

18.根据实施方式17中所述方法，其中在某些实施方式中，TCRα链组中所述TCRα链序列的CDR3区含有不超过5个相对于彼此的氨基酸差异，并且TCR中所述TCRβ链序列的CDR3区β链基团含有不超过5个相对于彼此的氨基酸差异。

19.根据实施方式17中所述方法，其中在某些实施方式中，所述抗原是人抗原。

20.根据实施方式17中所述方法，其中TCRα链序列是TCRα链可变区序列，TCRβ链序列是TCRβ链可变区序列。

21.根据实施方式17中所述方法，其中所述灵长类动物是旧大陆猴、猩猩、大猩猩或黑猩猩。

22.根据实施方式17中所述方法，其中所述灵长类动物是食蟹猕猴，恒河猴或豚尾猕猴。

23.根据实施方式17中所述方法，其中TCRα链组中所述TCRα链序列的CDR3区长度相同并含有0、1或2个相对于彼此的氨基酸取代，并且TCRβ链组中所述TCRβ链序列的CDR3区长度相同并含有0、1或2个相对于彼此的氨基酸取代。

24.根据实施方式17中所述方法，其中步骤b)通过测序编码来自单个T细胞或其培养物的TCRα链和TCRβ链序列的cDNAs来完成。

25.根据实施方式17中所述方法，其中步骤b)通过测序编码由多个T细胞制备的TCR α链和TCRβ链序列的cDNAs来完成。

26.根据实施方式17中所述方法，其中T细胞通过与抗原结合来富集。

27.根据实施方式17中所述方法，其中TCRα链组和TCRβ链组都含有至少2个成员。

28.根据实施方式17中所述方法，其中步骤g)包括在阻断测定、中和测定、激动剂测定或拮抗剂测定中测试候选TCR。

29.根据实施方式17中所述方法，其中步骤g)包括在酶联免疫吸附测定中测试候选 TCR。

30.根据实施方式17中所述方法，其中步骤b)包括获得至少100种不同的TCRα链可变区序列和至少100种不同的TCRβ链可变区序列。

31.根据实施方式17中所述方法，其中T细胞获取自骨髓、骨髓胸腺、淋巴结或外周血。

32.根据实施方式17中所述方法，其中所述方法还包括：

h)将所述TCRα链序列与人TCRα链序列比对，其中所述人TCRα链序列与所述TCR α链序列同源性最高；

i)将所述TCRβ链序列与人TCRβ链序列比对，其中所述人TCRβ链序列与所述TCR β链序列同源性最高；并且

j)取代人TCRα链序列或人TCRβ链序列中的至少一个氨基酸残基，从而产生人源化TCR。

为了说明本发明介绍如下的实施例。他们不以任何形式限制本发明。

实施例1

以下为一个识别特异性阻断PD-1和PD-L1结合的抗体的方法。

免疫与猴血采集

注射1mg抗原(在弗氏完全佐剂中连接到小鼠Fc片段(hPD-L1-mFc)的重组人PD-L1蛋白)免疫食蟹猕猴，并在第20、40和60天增加1mg抗原。在第0天(从10ml血液中)、19天(从10ml血液中)、39天(经10ml血液中)、59天(从12ml血液中)和65天(从 12ml血液血中)收集PBMC。

PD-L1抗体效价检测

使用以下方案，通过ELISA测量抗原抗体效价来检测免疫应答：

包被:在包被缓冲液(PBS)中将hPD-L1-mFc稀释至2ug/ml。以50ul/孔包被测定板。测定板在4℃培养过夜。

阻断：使板和测定稀释剂达到室温。用至少250ul/孔的洗涤缓冲液洗涤测定板3次。在纸上吸干测定板以去除残余缓冲液。用200ul/孔的测定稀释剂(PBS中2％的牛血清蛋白)阻断孔。在室温下培养2小时。

样品和对照组的制备：1用测定稀释剂稀释样品至1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000、1：256000。用至少250ul/孔的洗涤缓冲液洗涤测定板3次。将孔样品和对照品各50ul/成对加入到测定板。测定板在室温下培养2小时。

第二抗体:HRP抗人IgG(BD，Cat#555788)。用至少250ul/孔的洗涤缓冲液洗涤测定板3次。用测定稀释剂稀释第二抗体至1：2500。加入50ul/孔第二抗体，并在室温下培养1小时。

底物:用至少250ul/孔的洗涤缓冲液洗涤测定板5次。留出约1-2分钟的浸泡时间。在纸上吸干测定板以去除任何残余缓冲液。加入50ul/孔TMB，并在黑暗中室温培养5-10分钟。加入50ul/孔终止液。在450nm读板。

结果：结果如下所示。S05的效价范围为1.2-1.5×10⁵，Z05的效价范围为6-9×10⁴.

PBMC制备和存储

使用以下方案通过密度梯度离心(Sigma-HISTOPAQUE-1077, Cat#10771-6x100ml)由外周血全血制备PBMC悬浮液：提取相同体积的 HISTOPAQUE-1077至新的无菌管。小心将稀释的血铺于HISTOPAQUE-1077上。确保界面清晰。不要混合。以1500rpm(水平转子半径15厘米，约400g)，在室温下离心30分钟。小心吸取单核层(从顶部开始的第二层)并将其转移到一个新的无菌离心管中。添加等体积的PBS洗涤。用10mL PBS洗涤3次。将转速降至250×g(足以沉淀细胞而不损伤细胞的速度)离心10分钟。PBMC储存条件-1：10％DMSO+90％FBS、液氮；PBMC储存条件-2：在RNAPROTECT细胞试剂(Qiagen；Cat#76526)中将 PBMC重悬至10×106个细胞/ml并储存于-80度。

总RNA提取

使用以下方案，用RNEASY Plus微试剂盒(Qiagen,Cat#:74134)分离RNA：通过在离心管中以300×g离心5分钟将适当数量的细胞(小于1×10⁷个细胞)形成颗粒。通过加入600ul缓冲液RLT Plus破坏细胞，并通过涡旋或移液混合。将均质化的裂解物转移至置于2ml的收集管中的gDNA消除旋转柱。以≥8000×g(≥10,000rpm)离心 30秒。弃柱并保存穿柱液。在穿柱液中加入600ul 70％的乙醇，并通过移液充分拌匀。将至多700ul样品，包括任何沉淀物，转移至RNEASY旋转柱。轻轻盖上盖子，并以≥8000×g(≥10,000R rpm)离心15秒。丢弃穿柱液。(如果样品体积超过700ul，则离心同一RNEASY旋转柱上的连续等分。)。将700ul缓冲液RW1加入RNEASY 旋转柱。轻轻盖上盖子，并以≥8000×g(≥10,000rpm)离心15秒。丢弃穿柱液。将 500ul缓冲液RPE加入RNEASY旋转柱。轻轻盖上盖子，并以≥8000×g下(≥10,000 rpm)离心15秒。丢弃穿柱液。将500ul缓冲液RPE加入RNEASY旋转柱。轻轻盖上盖子，以≥8000×g(≥10,000rpm)离心2分钟。丢弃穿柱液。将RNEASY旋转柱置于新的1.5ml收集管中。将50μl不含RNA酶的水直接加入旋转柱膜。轻轻盖上盖子，并以≥8000×g(≥10,000rpm)离心1分钟以洗脱RNA。在-80℃保存。

抗体基因扩增所用第一轮PCR引物的列表

通过基因特异性引物(GSP)合成cDNA。(cDNASnthesis Kit；invitrogen, Cat#:18080-051)。用于重链可变区的PCR扩增的GSP如下：

γ-PCR1,SEQ ID NO:85(K＝G or T)。

用于轻链可变区的PCR扩增的GSP如下：

κ-PCR1,SEQ ID NO:95。

第一轮和第二轮PCR引物列表来自WeiXuMeng的论文(mAbs. 2015.Vol.7:707-718)。

表1.第一轮PCR引物列表

第一轮PCR引物列表-VH扩增

PCR反应条件：

第一轮PCR引物列表-κVL扩增

PCR反应条件：

使用第一轮PCR引物组的重链可变区基因扩增结果

用来自猕猴S05的PBMC的cDNA作为模板，扩增编码重链可变区的基因。运行琼脂糖凝胶之后，将具有所需尺寸的PCR产物切割、纯化并克隆到pMD19-T(Takara； Cat#6013)以用于测序，当使用LDRVH1A、LDRVH1B和LDRVH1C(参照表1和表2)作为5’端引物时，PCR产物含有大量非特异性条带。

表2.

重链可变区的比对结果如图5A-5C所示。

使用第一轮PCR引物组的轻链可变区基因扩增结果

用来自猕猴S05的PBMC的cDNA作为模板，扩增编码轻链可变区的基因。运行琼脂糖凝胶后，将具有所需尺寸的PCR产物切割、纯化并克隆到pMD19-T(Takara； Cat#6013)以用于测序，当使用LDRVk2、LDRVk5和LDRVk6(参照表1和表4)作为 5’端引物时，PCR产物含有大量非特异性条带。

表3.

轻链可变区的比对结果如图6所示。

抗体基因扩增所用第二轮PCR引物的列表

表4.第二轮PCR引物列表

第二轮PCR引物列表-VH1扩增

PCR反应条件：

第二轮PCR引物列表-κVL2扩增

PCR反应条件：

使用第二轮PCR引物组的重链可变区基因扩增结果

因为无法使用引物RhLDRVH1A,、RhLDRVH1B和RhLDRVH1C扩增编码重链可变区的DNA，因此尝试使用FRVH1(引物Rh FRVH1A IF5和Rh FRVH1B IF5 1： 1的混合物，参见表4和表5)。我们发现，使用所述引物能有效扩增具有良好序列多样性的抗体基因。

表5

来自第二轮PCR的重链可变区的比对结果如图7所示。

使用第二轮PCR引物组的轻链可变区基因扩增结果

因为无法使用引物LDRVk2、LDRVk5and LDRVk6扩增编码轻链可变区的 DNA，因此尝试使用FRVk L2(引物LDRVk2A IF5和LDRVk2B IF55 1：1的混合物，参见表4和表6)。我们发现，使用所述引物能有效扩增具有良好序列多样性的抗体基因。

表6.

来自第二轮PCR的轻链可变区的比对结果显示如图8所示。

系统发生分析

图9和图10示出了重链和轻链可变区的序列的系统发生树。所述重链可变区可以被分为至少四个谱系而所述轻链可变区可以被分为至少三个谱系。

识别具有阻断活性的抗体

来自每个谱系组(LGH1、LGH2、LGH、LGH4)的一个重链可变区基因与来自每个谱系组((LGL1、LGL2和LGL3)的一个轻链可变区基因配对，以产生候选抗体基因。候选抗体基因在24孔板上表达并测试其抗原结合能力。通过FACS测试结合抗原的抗体阻断PD-1和PD-L1结合作用的活性。经FACS测定具有阻断活性的抗体，其阻断活性随后通过混合淋巴细胞反应测定。

实施例2

以下是识别特异性阻断PD-1与PD-L1结合的T细胞受体(TCR)的示例：

简而言之，注射1mg抗原(人PD-L1蛋白)免疫两只食蟹猕猴，并在第20、40 和60天增加1mg抗原。在第45天和65天通过ELISA测量抗原抗体效价来检测免疫应答。随后在第0天、19天、39天、59天和69天收集PBMC，通过分选FACS或磁珠从其中富集具PD-L1结合能力的T细胞。然后分离T细胞的总RNA，从中制备cDNA。所述TCRα链和β-链可变区基因通过PCR克隆，然后进行深度测序以确定可变区基因序列。可变区基因序列根据其长度和在CDR3中的变化分组到不同谱系。TCRα链可变区基因随后与β链可变区基因配对，以产生候选TCR基因，其中从每个候选组仅选择一个α链/β链可变区基因。候选TCR基因小规模表达(在24孔或6孔平板)并测试其抗原结合活性。通过FACS测试结合抗原的TCR阻断PD-1和PD-L1结合作用的活性。经FACS测定具有阻断活性的TCR，其阻断活性随后通过混合淋巴细胞反应测定。

前面的描述仅提供示例性的实施方式，且旨在不限制本公开的范围、适用性或配置。相反，此前对示例性实施方式的描述将给本领域的技术人员提供使其得以实施一个或多个示例性实施方式的说明。应当理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的前提下对各要素的功能和安排进行各种改变。在此描述了多个实施方式，虽然不同实施方式对应不同特征，但是应当理解，就一个实施方式所述的特征也可以被并入其它实施方式。同样，任何所述实施方式中的单个或多个特征都不应被认为是在本发明的每个实施方式中都必需的，因为本发明的其他实施方式可以省略这些特征。

此前的描述中给出具体细节以供对实施方式的透彻理解。然而，本领域常规技术人员应当理解，在没有这些具体细节的情况下也可实践所述实施方式。例如，本发明中的电路、系统、网络、过程和其他元件可以显示为框图形式中的组件，以免不必要的细节使实施方式难以理解。在其他情况下，对公知的电路、过程、算法、结构和技术的显示可以不需要不必要的细节，以免使实施方式难以理解。

另外应注意，各个实施方式可描述为以流程图、作业图、数据流程图，结构图或框图绘制的过程。虽然在流程图中可能将操作描述为顺序过程，但是许多操作可以并行或同时执行。此外，操作的顺序可以重新安排。过程可在其全部操作完成时终止，但也可以包括图中未讨论或包括的额外的步骤或操作。

此外，并不是在所有实施方式中都可以发生任何特定描述的过程中的所有操作。过程可以对应于方法、功能、过程、子路径、子程序等。当过程对应于功能时，其终止对应于函数返回调用函数或主函数。

此外，所述实施方式可以至少部分地手动或自动实施。可以通过使用机器、硬件、软件、固件、中间件、微代码、硬件描述语言或其任意组合，来执行或至少辅助手动或自动的实施。实施于软件、固件、中间件或微代码中时，可以将用于执行必要任务的程序代码或代码段存储在机器可读介质中。处理器可以执行必要的任务。

虽然上文中已经给出了对一个或多个实施方式的详细描述，但是在不脱离本发明的精神的情况下，各种替代、修改及其等同形式对于本领域技术人员将是显而易见的。此外，除非明显不当或有另外的明确提示，否则应该假设不同实施方式的特征、装置和/或部件可以被替代和/或组合。因此，以上描述不应当作对本发明范围的限制。最后，一个或多个实施方式的一个或多个要素可以与一个或多个其他实施方式的一个或多个要素组合而不脱离本发明的范围。