JP5959438B2 - 疾患を治療するための剤 - Google Patents

Description

本発明は、疾患を治療するための剤、特に、Ｔ細胞の表面受容体ＣＤ４を通したＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の活性化を介する治療に関する。本発明は、かかる剤を同定するためのスクリーニング方法、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化可能な剤、疾患、特に自己免疫疾患の治療における前記剤の使用、及びインビトロにおいて実施される方法における前記剤の使用を含む。

Ｔ細胞は、リンパ球に属し、免疫系における多数の重要な機能に関与している。哺乳類では、Ｔ細胞（胸腺細胞）は、骨髄において形成される造血前駆細胞から、胸腺において分化する。特徴的な表面受容体、主に糖タンパク質ＣＤ４及びＣＤ８が発現することが、分化プロセスの一部である。ＣＤ４を発現するＴ細胞、所謂ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ複合体に結合するが（非特許文献１及び２）、一方、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ複合体に結合する（非特許文献３）。Ｔ細胞は、血液及びリンパ液中に放出される。

ＣＤ４陽性細胞は、ヘルパーＴ亜集団（Ｔｈ１及びＴｈ２）だけではなく、制御性Ｔ細胞にも分化することができる。制御性Ｔ細胞は、サブクラスに更に分類することができ、胸腺に由来する制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）、誘導性制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）が最もよく研究されている。

例えば、Ｔｒ１又はＴｈ３等の他のＴｒｅｇ亜集団も存在するが、本発明は、ＣＤ４陽性胸腺に由来するＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）及び誘導性Ｔｒｅｇについて言及する。これらは、両方共転写因子Ｆｏｘｐ３を発現する。大きな違いとしては、Ｆｏｘｐ３は、ｎＴｒｅｇにおいて安定的且つ永続的に発現し、これによりＴｒｅｇの不可逆的な表現型が裏付けられるが、誘導性Ｔｒｅｇは、誘導性又は一過性のＦｏｘｐ３発現を示すので、表現型は可逆的である。

Ｔｒｅｇは、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、又はＩＬ−３５等の免疫調節性サイトカインを分泌し、例えば、炎症促進性サイトカインの産生抑制、直接的な細胞接触、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）における活性化状態又は機能の調節等の幾つかの機序を介して、エフェクターＴ細胞に対する抑制活性を発揮する（非特許文献４）。ＣＤ４陽性ＣＤ２５Ｔｒｅｇ細胞の主な特徴は、アネルギー性の表現型、即ち、ＴＣＲが刺激されても増殖しないことであるが、これは、外因性ＩＬ−２の添加により回復させることができる。

Ｔｒｅｇの重要な役割は、免疫反応及び自己寛容に関連するホメオスタシスの維持を含む。Ｔｒｅｇの機能不全は、自己免疫疾患と相関がある。

一般的に、制御性Ｔ細胞は、表面受容体糖タンパク質であるＣＤ４、ＣＤ２５を介して単離することができ、ＦＯＸＰ３の細胞内染色を特徴とする。更なる表面タンパク質は、Ｔｒｅｇ細胞においてダウンレギュレートされるＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）であり、これは、Ｔｒｅｇの更なる精製に用いることができる。更に、ＣＤ３９（エンドヌクレオチダーゼ）（非特許文献５）又はＧＡＲＰ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎｓ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ（ＧＡＲＰ又はＬＲＲＣ３２）（非特許文献６）の発現。

ヒトＣＤ４は、１２番染色体にコードされており、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する。そのＴ細胞表面受容体としての自然界における機能は、ＭＨＣクラスＩＩ複合体の結合によるＴ細胞の活性化に関する。更に、ＣＤ４は、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０タンパク質、Ｐ４ＨＢ／ＣＤＩタンパク質、及びヒトヘルペスウイルスＨＨＶ−７カプシドタンパク質に結合することができる。また、ＨＩＶ−１ｇｐ１２０及びＶｐｕタンパク質との相互作用についても報告されている。ＣＤ４は、４５８アミノ酸を有する。ペプチド配列を図１に示す。

ＵｎｉＰｒｏｔ ｅｎｔｒｙ Ｐ０１７３０は、以下の表１及び図６に示されるＣＤ４のドメイン構造を提供する。最初の２５アミノ酸は、シグナルペプチドであり、生物学的に活性のある形態においては切断されている。２６位〜３９６位は、細胞外ドメインを構成し、続く３９７位〜４１８位は膜貫通ドメインである。Ａｓｎ_２９６及びＡｓｎ_３２５は、公知のグリコシル化部位である（非特許文献７及び８）。

最後の部分である４１９位〜４５８位は、細胞質ドメインである。これは、ＣＤ４に結合するリガンドにより活性化されるシグナル伝達経路の一部であるチロシンタンパク質キナーゼＬＣＫ（ｐ５６^ｌｃｋ）の結合部位である（非特許文献９及び１０）。

細胞外部分は、４つの免疫グロブリン様ドメインを含む。最初のドメインであるＮ−末端ドメインは、２６位〜１２５位を含み、Ｉｇ様Ｖ型ドメインである。抗体に対する相同性に基づいて、前記ドメインは、抗原相補性決定領域であるＣＤ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の３つのホモログを有する（非特許文献１１）（図６を参照されたい）。ＣＤＲ１からＣＤＲ２に及ぶ範囲は、クラスＩＩ ＭＨＣ分子（非特許文献１２）、ｇｐ１２０ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（非特許文献１３）、及び抗ＣＤ４抗体（非特許文献１４）の結合に関与している。ＣＤＲ２のＰｈｅ_６８は、クラスＩＩ ＭＨＣ分子及びｇｐ１２０ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の認識及び結合において重要な役割を果たしている（非特許文献１５）。ＣＤ４の公知のリガンドは全て、Ｎ末端のＩｇ様Ｖ型ドメインに結合する。

制御性Ｔ細胞の作用機序は、完全に明らかになっている訳ではない。ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇは、ポリクローナル及び抗原特異的なＴ細胞の活性化を阻害する。この抑制は、例えば、ＴＣＲを介したＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｔｒｅｇの活性化を必要とする細胞接触依存性機序により媒介され得るが、Ｔｒｅｇは、ＴＣＲの活性化又はマイトジェン抗体による刺激を受けても増殖反応を示さない（アネルギー性）（非特許文献１６）。一旦刺激を受けると、Ｔｒｅｇは、抗原非依存的にＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞に応答し、更に、Ｂ細胞の活性化及びクローン増殖を阻害することができるようになる。

ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は、免疫系の活性に対する制御作用を有するという能力により、免疫系に対する制御を発揮することが望ましい自己免疫疾患等の疾患を治療するための標的候補として認識されている。

自己免疫は、自身を構成する部分を（分子以下のレベルまで）「自己」として認識することができない生物の欠陥であり、その結果、自身の細胞及び組織に対しても免疫反応が生じてしまう。かかる異常な免疫反応に起因する任意の疾患を自己免疫疾患と呼ぶ。自己免疫疾患としては、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、Ｉ型真性糖尿病（Ｔ１Ｄ）、重症筋無力症（ＭＧ）、自己免疫多腺性症候群ＩＩ型（ＡＰＳ−ＩＩ）、橋本甲状腺炎（ＨＴ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、及び自己免疫リンパ増殖症候群（ＡＬＳ）が挙げられる。

自己免疫疾患は、「自己」分子、即ち、ホストの細胞によって産生される分子をＴ細胞が認識し、反応するときに生じる。抗原提示細胞（ＡＰＣ）により処理される自己抗原の提示により「自己反応性」Ｔ細胞が活性化されると、前記Ｔ細胞のクローン性増殖及び特定組織への遊走が導かれ、前記特定組織において前記Ｔ細胞は、炎症及び組織破壊を誘導する。

自己免疫疾患の治療に成功している主な治療戦略は、免疫抑制薬の使用によるこれらエフェクターＴ細胞機能の抑制である。しかし、これら免疫抑制薬は、選択性が低いので全身において免疫抑制を誘導し、免疫系の有害な機能だけではなく有用な機能までも阻害してしまう。結果として、感染症、癌、及び薬物毒性等の幾つかのリスクが生じる場合がある。

一般的に、ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、自己免疫の開始及び維持において重要な役割を果たしていると認められている。したがって、免疫抑制剤としてＣＤ４^＋Ｔ細胞表面分子に対するｍＡｂ、特に抗ＣＤ４ｍＡｂを使用することが提案されている。多数の臨床試験によって、このアプローチの潜在的重要性が確認されたが、同時に、慣用的な臨床診療における使用により適した抗ＣＤ４ｍＡｂを作製するために取り組むべき幾つかの課題も浮かび上がった。

提案されているＣＤ４ｍＡｂの幾つかの異なる作用機序としては、以下が挙げられる：（１）ＣＤ４−ＭＨＣ ＩＩ相互作用と拮抗してＴ細胞の活性化を阻害する、（２）ＣＤ４の細胞表面発現の減少により測定されるＣＤ４受容体の調節、（３）Ｔ細胞受容体の架橋が存在しないとＣＤ４受容体を介したシグナル伝達が部分的にしか生じないので、後のＴ細胞活性化を抑制し、ＣＤ４によるＴ細胞のアポトーシスを誘発することができる、（４）Ｆｃ媒介補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）によりＣＤ４ Ｔ細胞を枯渇させる、及び（５）制御性Ｔ細胞を刺激する。

Ｔ細胞を標的とする幾つかの抗ＣＤ４抗体が、臨床的に開発されており（非特許文献１７〜２４）、これらは、ほんの僅かなＣＤ４抗体を用いてＣＤ４細胞を枯渇させることを主な目的とする。この作用は、ＴＲＸ−１、ＴＮＸ−３５５、ＩＤＥＣ−１５１、ＯＫＴｃｄｒ４Ａ等の他の機序に起因すると考えられる。

自己免疫疾患を治療するために制御性Ｔ細胞を活性化させることを目的とする剤を使用するアプローチは、極めて困難であることが立証されている。作動性抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ−３（非特許文献２５）を用いるＴＣＲを介したＴｒｅｇの活性化、又は超作動性抗ＣＤ２８抗体ＴＧＮ１４１２を用いる共刺激分子ＣＤ２８を介したＴｒｅｇの活性化は、制御性Ｔ細胞集団及び他の従来のＴ細胞を完全に枯渇させると共に、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、及びＩＬ−２を含む炎症促進性サイトカインを全身誘導し、過剰量を放出させて、ヒトにおいて臨床的に明らかなサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を生じさせる（非特許文献２６）。

しかし、近年、ＣＤ４＋ＣＤ２５制御性Ｔ細胞を活性化させることができるヒト化抗ＣＤ４抗体が報告されている（特許文献１）。特許文献１に記載されている抗体は、非特許文献２７に記載されているマウスＩｇＧ１抗ヒトＣＤ４抗体であるマウス抗体ｍＢ−Ｆ５のヒト化バージョンである。ｍＢ−Ｆ５のエピトープは、ヒトＣＤ４のＩｇ様Ｃ２型１及び２型ドメイン、即ち、図６に示されるアミノ酸１６２からアミノ酸２３２に及ぶと非特許文献２７に報告されている。

これら抗体のうちの１つであるＢＴ０６１と呼ばれる抗体（ヒト化モノクローナルＩｇＧ１）を用いたその後の臨床試験において、乾癬及び関節リウマチに罹患している患者の治療に成功したことが報告されており（特許文献２〜５）、これら抗体が、安全に且つ良好な有効性で自己免疫疾患を治療できるという証拠が示された。

国際公開第２００４／０８３２４７号パンフレット 国際公開第２００９／１１２５０２号パンフレット 国際公開第２００９／１２１６９０号パンフレット 国際公開第２００９／１２４８１５号パンフレット 国際公開第２０１０／０３４５９０号パンフレット

Ｒｅｉｎｅｒｚ ａｎｄ Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ，Ｃｅｌｌ １９，８２１−８２７（１９８０） Ｒｅｉｎｅｒｚ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７７，１５８８−１５９２（１９８０） Ｆｉｔｃｈ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５０，５０−６９（１９８６） Ｓｈｅｖａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００９）３０；６３６−６４５ Ｂｏｒｓｅｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００７）１１０，１２２５−１２３２ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００９）１０６，３２．１３４３９−１３４４４ Ｋｏｅｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，９５０２−９５０７（１９８８） Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，２１２８６−２１２９５（１９８９） Ｒｕｄｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５，５１９０−５１９４（１９８８） Ｖｅｉｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５５，３０１（１９８８） Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７，７１５０−７１５４（１９９０） Ｍｏｅｂｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９，１２００８−１２００１２（１９９２） Ｍｏｅｂｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６，５０７−５１７（１９９２） Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０，１１６８３−１１６８７（１９９３） Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４，１６１９２−１６２０２（２００５） Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２ ：３８９（２００２） Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｋｏｏｐｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２５（１１）：２０６５−７６（１９９８） Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２９（２）：２２０−９（２００２） Ｃｈｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ３９（１０）：１１３９−４６（２０００） Ｈｅｒｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６９（２）：１０３２−４３（２００１） Ｋｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ．１８（１）：４５−５２（２００１） Ｍｏｕｒａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６５（５）：６３２−４１（１９９８） Ｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３９（１１）：１４３３−９（２００３） Ｊａｂａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８（１）：９４−１０３（１９９７） Ａｂｒａｍｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ，Ｎ Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．１９９２ Ｓｅｐ ３；３２７（１０）：７３６ Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ，Ｎ Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．２００６ Ｓｅｐ ７；３５５（１０）：１０１８−２８ Ｒａｃａｄｏｔ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍ．，１０，３６５−３７４（１９９２）

有望な臨床結果が得られたことにより、同様の性質を有する更なる治療剤の開発に対する注目が高まっている。したがって、本発明の目的は、かかる剤を同定するためのスクリーニング方法、及び更なる治療剤を提供することにある。

したがって、本発明は、ＣＤ４に結合可能な分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）１以上の候補分子を提供する工程と；
（ｂ）前記１以上の候補分子が、ヒトＣＤ４の以下の領域：アミノ酸１４８〜１５４、アミノ酸１６４〜１６８、及びアミノ酸１８５〜１９２のうちの１以上に結合可能であるかどうかを判定する工程と；
（ｃ）工程（ｂ）においてＣＤ４に結合可能であると判定された分子を選択する工程と
を含む方法を提供する。

本発明者らは、予想外にも、ヒト化抗体ＢＴ０６１が、これまでリガンド結合部位として認識されていなかったＣＤ４ドメインに結合することを見出した。この知見は、前記ドメインが、ＢＴ０６１が由来するマウス抗体ｍＢ−Ｆ５のエピトープとして当技術分野において公知であったことを考慮しても非常に驚くべきことである。また、本発明者らは、ＣＤ４分子の結合に関与しているＢＴ０６１の残基を確定し、驚くべきことに、ＢＴ０６１のＣＤＲの全てがＣＤ４の結合に関与している訳ではないことを見出した。

結合領域の同定及び結合機序の詳細により、更なるスクリーニング方法、並びにＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化可能な抗体及び抗体断片の開発が可能となった。

したがって、本発明は、また、ＣＤ４に結合可能な抗体又は抗体断片をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２と、ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３とを含む抗体又は抗体断片であって、前記ＣＤＲはそれぞれ、その配列中に以下に記載するアミノ酸置換を任意で含んでいてもよいＣＤＲである抗体又はその断片を提供する工程と：
（ｉ）Ｓｅｒ３２；Ｇｌｙ３３；及びＴｙｒ３４を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｉｉ）Ｌｅｕ５４；及びＩｌｅ５７を含む軽鎖ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）Ａｓｐ３１、Ｇｌｕ３１、Ｔｈｒ３１、Ｃｙｓ３１、Ｐｒｏ３１、Ｍｅｔ３１、又はＴｙｒ３１を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｉｖ）Ｔｙｒ１０３、Ｐｈｅ１０３、又はＨｉｓ１０３；Ａｒｇ１０４；Ｔｙｒ１０５；Ａｓｐ１０６；及びＴｒｐ１１０、Ｐｈｅ１１０、Ｈｉｓ１１０、又はＴｙｒ１１０を含む重鎖ＣＤＲ３、
（ｂ）前記抗体又は抗体断片がＣＤ４に結合可能であるかどうかを判定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）においてＣＤ４に結合可能であると判定された抗体又は抗体断片を選択する工程と
を含み、
前記抗体又は抗体断片が、ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含まない方法を提供する。

更に、本発明は、ＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２と、ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３とを含むＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化可能な抗体又は抗体断片であって、前記ＣＤＲはそれぞれ、その配列中に以下に記載するアミノ酸置換を任意で含んでいてもよいＣＤＲであり、
（ｉ）Ｓｅｒ３２；Ｇｌｙ３３；及びＴｙｒ３４を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｉｉ）Ｌｅｕ５４；及びＩｌｅ５７を含む軽鎖ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）Ａｓｐ３１、Ｇｌｕ３１、Ｔｈｒ３１、Ｃｙｓ３１、Ｐｒｏ３１、Ｍｅｔ３１、又はＴｙｒ３１を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｉｖ）Ｔｙｒ１０３、Ｐｈｅ１０３、又はＨｉｓ１０３；Ａｒｇ１０４；Ｔｙｒ１０５；Ａｓｐ１０６；及びＴｒｐ１１０、Ｐｈｅ１１０、Ｈｉｓ１１０、又はＴｙｒ１１０を含む重鎖ＣＤＲ３、
前記抗体又は抗体断片が、ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含まない抗体又は抗体断片を提供する。

一例として以下の図面を参照して本発明を例証する。
図１は、ヒトＣＤ４のペプチド配列（配列番号１）及びジスルフィド架橋を示す（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０１７３０）。 図２Ａは、ヒト化抗体ＢＴ０６１の軽鎖のペプチド配列（配列番号２）を示す。ＣＤＲの残基をボックス内に示す（ＣＤＲ１：配列番号４、ＣＤＲ２：配列番号５、ＣＤＲ３：配列番号６）。点線枠で囲まれている残基は、結晶構造によって表されない。 図２Ｂは、ヒト化抗体ＢＴ０６１の重鎖のペプチド配列（配列番号３）を示す。ＣＤＲの残基をボックス内に示す（ＣＤＲ１：配列番号７、ＣＤＲ２：配列番号８、ＣＤＲ３：配列番号９）。点線枠で囲まれている残基は、結晶構造によって表されない。 図３は、ＣＤ４−ＢＴ０６１の結晶構造の非対称単位の図を提供する。 図４は、ＣＤ４複合体及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子の結晶構造を重ねたＣＤ４−ＢＴ０６１結晶構造の図を提供する（ＰＤＢコード １ＪＬ４）。 図５は、ＣＤ４複合体及びｇｐ１２０ＨＩＶ−１タンパク質の結晶構造を重ねたＣＤ４−ＢＴ０６１結晶構造の図を提供する（ＰＤＢコード ２ＮＹ１）。更に、ｇｐ１２０ＨＩＶ−１タンパク質は、抗体１７ｂに結合している。 図６は、ヒトＣＤ４のペプチド配列（配列番号１）及びドメイン構造を示す（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ０１７３０）。 図７は、ＣＤ４の表面上におけるＢＴ０６１結合部位の図を提供する。ここに示す全てのアミノ酸は、Ｎ−末端のＩｇ様Ｖ型ドメインの次に存在するＩｇ様Ｃ２型１ドメインの一部である。 図８は、ＢＴ０６１のアミノ酸軽鎖配列（配列番号２）を提供する。ＣＤ４に対する結合に関与しているアミノ酸を、丸みを帯びた枠で囲む。 図９は、ＢＴ０６１のアミノ酸重鎖配列（配列番号３）を提供する。ＣＤ４に対する結合に関与しているアミノ酸を、丸みを帯びた枠で囲む。 図１０は、ＣＤ４の表面上におけるＢＴ０６１結合部位の図を提供する。ＢＴ０６１重鎖のＴｙｒ_１０５の結合ポケットを形成するアミノ酸を丸で囲む。 図１１は、ＣＤ４の表面上におけるＢＴ０６１結合部位の図を提供する。ＢＴ０６１重鎖のＡｒｇ_１０４〜Ａｓｐ_１０６の結合ポケットを形成するアミノ酸を丸で囲む。 図１２は、ＣＤ４の表面上におけるＢＴ０６１結合部位の図を提供する。ＢＴ０６１軽鎖のＴｙｒ_３４の結合ポケットを形成するアミノ酸を丸で囲む。

スクリーニング方法
本発明は、ＣＤ４、好ましくはヒトＣＤ４に結合可能な１以上の分子をスクリーニングする方法を提供する。上記の通り、本明細書に提供する情報は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化可能である、ＣＤ４と抗体ＢＴ０６１との相互作用について説明する。特に、ＢＴ−０６１は、ヘルパーＴ細胞及び制御性Ｔ細胞の両方に結合し、ヘルパーＴ細胞を活性化することなしに制御性Ｔ細胞を選択的に活性化させる。ＢＴ０６１の構造及びＢＴ０６１がＣＤ４の細胞外ドメインとどのように相互作用しているかを知ることにより、ＣＤ４の結合及び制御性Ｔ細胞の選択的活性化の観点でＢＴ０６１と同様の性質を有する剤を設計及び製造する手段を提供できる。

第１の態様では、本発明は、ＣＤ４に結合可能な分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）１以上の候補分子を提供する工程と、（ｂ）前記１以上の候補分子が、以下のヒトＣＤ４の領域又はアミノ酸：アミノ酸１４８〜１５４、アミノ酸１６４〜１６８、並びにアミノ酸１８５、１８７、１８９、１９０、及び１９２のうちの１以上に結合可能であるかどうかを判定する工程と；（ｃ）工程（ｂ）においてＣＤ４に結合可能であると判定された分子を選択する工程とを含む方法を提供する。より具体的には、前記ヒトＣＤ４の領域は、アミノ酸１４８〜１５４、アミノ酸１６４〜１６８、及びアミノ酸１８５〜１９２である。

１つの実施形態では、工程（ａ）〜（ｃ）をコンピュータシステムで完了することができ、ＣＤ４と１以上の候補分子との相互作用は、ＢＴ０６１とヒトＣＤ４との間の相互作用に関して本明細書に提供される情報に基づいてモデル化される。即ち、スクリーニングは、コンピュータ支援分子設計を介して実施される。特に、ＣＤ４、特にその細胞外領域の三次元構造モデルは、ＣＤ４の少なくとも一部についてのアミノ酸配列の相互作用、及び当業者に公知のソフトウェア、例えば、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））又はＢｅｎｃｈｗａｒｅ ３Ｄ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｔｒｉｐｏｓ）を用いてコンピュータシステムで作成される。更に、これらプログラムによって、１以上の候補分子の配列及び／又は構造情報の入力又はデノボ合成が可能になる。次いで、ＢＴ０６１結合にとって重要であると同定されたＣＤ４の領域に結合する候補分子の能力（これについては以下で更に論じる）について調べることができる。

具体的には、ＣＤ４に結合可能な分子をスクリーニングする方法は、工程（ａ）及び（ｂ）を含んでいてもよい：（ｉ）少なくともアミノ酸１４８〜１５４、アミノ酸１６４〜１６８、並びにアミノ酸１８５、１８７、１８９、１９０、及び１９２を含むＣＤ４由来のアミノ酸をコンピュータシステム又はプログラムに入力する工程と；（ｉｉ）前記アミノ酸配列によりコードされているポリペプチド又はペプチドの三次元モデルを作成する工程と；（ｉｉｉ）１以上の候補分子の三次元構造を作成又は入力する工程と；（ｉｖ）ＣＤ４のアミノ酸配列と候補分子のアミノ酸配列との間の相互作用をシミュレーションして、前記候補分子が、アミノ酸１４８〜１５４、アミノ酸１６４〜１６８、並びにアミノ酸１８５、１８７、１８９、１９０、及び１９２を介してＣＤ４に結合可能であるかどうかを判定する工程。

候補分子の選択は、下記実施例１に記載するＣＤ４−ＢＴ０６１相互作用の特徴を考慮することにより更に限定することができる。具体的には、候補分子は、塩橋なしにＣＤ４の領域に結合する分子及び／又は以下を含むＣＤ４表面の結合ポケットのうちの１以上に収容される１以上の成分を含む分子に限定することができる：
（ｉ）ＣＤ４のアミノ酸残基Ｓ１５２、Ｖ１５３、Ｑ１５４、Ｑ１６４、Ｇ１６５、Ｔ１８５、Ｖ１８６、Ｌ１８７、及びＫ１９２（図１０に示す）；
（ｉｉ）ＣＤ４のアミノ酸残基Ｓ１５０、Ｓ１５２、Ｇ１６５、及びＧ１６６（図１１に示す）；及び／又は
（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｓ１５０、Ｐ１５１、Ｓ１５２、及びＫ１６７（図１２に示す）。

このコンピュータで実行される実施形態の方法は、更に、工程（ｃ）において選択された分子を生成する工程（ｄ）を更に含んでいてもよい。例えば、選択された分子がペプチドである場合、コンピュータを用いて前記ペプチドのアミノ酸配列を入手し、前記ペプチドをインビトロで製造する。その後、前記選択された分子とＣＤ４の関連する領域／アミノ酸を含むペプチド又はポリペプチドとを接触させることにより、又は前記選択された分子とＣＤ４を発現する細胞とを接触させることにより、前記選択された分子の活性をインビトロで評価することができる。これらインビトロにおける工程については、工程（ａ）〜（ｃ）をインビトロで実施する第１の態様の実施形態に関連して以下で更に説明する。

具体的には、上記コンピュータ支援実施形態に代えて、前記スクリーニング方法の工程（ａ）〜（ｃ）をインビトロで実施してもよく、工程（ｂ）は、１以上の候補分子とＣＤ４の関連する領域／アミノ酸とを接触させ、前記候補分子がこれら領域のうちの１以上に結合可能であるかどうかを判定することを含んでいてもよい。この実施形態の例は、ＣＤ４に結合可能な１以上の分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）ヒトＣＤ４の以下の領域：アミノ酸１４８〜１５４、アミノ酸１６４〜１６８、及びアミノ酸１８５〜１９２のうちの１以上を含むペプチドと前記１以上の分子とを接触させる工程と；（ｂ）前記１以上の分子が前記ペプチドの前記１以上の領域に結合するかどうかを判定する工程とを含み、前記分子が、ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含まない方法を含む。

本発明の方法は、好ましくは、分子のライブラリをスクリーニングすることを含む。具体的には、前記ライブラリは、当技術分野において公知の方法に従って調製したファージディスプレイライブラリであってよい。前記ライブラリは、多数の異なるアミノ酸／ペプチドの系統的な組み合わせを反映したペプチドライブラリであってもよい。通常、ペプチドライブラリは、平面又はビーズとして作製することができる固相上、多くの場合樹脂上で合成される（固相ペプチド合成）。このライブラリは、タンパク質−タンパク質相互作用、創薬、タンパク質の精製、及び異なる親和性を有する抗体変異体を作製するための抗体認識配列における変異について用いることができる。

ファージディスプレイライブラリに加えて、更なるライブラリとしては、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、リボソーマルディスプレイ、及びポリソーマルディスプレイが挙げられる。リボソーマルディスプレイは、選択工程において固定化リガンドに結合させるために複合体として用いられる、ｍＲＮＡ前駆体に会合している翻訳されたタンパク質を得るプロセスを含む。ｍＲＮＡディスプレイでは、ピューロマイシンの連結を介して、ｍＲＮＡ前駆体に会合している翻訳されたペプチド又はタンパク質を得る。

細菌ディスプレイは、フローサイトメトリー又は反復選択手順（バイオパニング）を用いてスクリーニングすることができる、細菌の表面上にディスプレイされたポリペプチドのライブラリ技術を表す。

酵母ディスプレイ（Ａｂｂｏｔｔ）技術では、対象タンパク質は、酵母の表面上にＡｇａ２ｐタンパク質との融合物としてディスプレイされる。Ａｇａ２ｐタンパク質は、酵母の細胞接合中に細胞接触を媒介するために、酵母が自然界で用いているタンパク質である。したがって、Ａｇａ２ｐを介するタンパク質のディスプレイでは、細胞表面からタンパク質を突出させて、酵母の細胞壁における他の分子との相互作用の可能性を最小化する。酵母ディスプレイライブラリと、磁気分離及びフローサイトメトリーとの併用は、定向進化を通じて、略全ての受容体に対して高親和性を有するタンパク質リガンドを単離するための非常に有効な方法である。

ポリソーマルディスプレイは、細菌のポリソームにディスプレイされる非常に大きなペプチドライブラリを含む（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。ＭＵＬＴＩＰＩＮ（登録商標）ペプチド技術を用いてライブラリを作製してもよい（Ｔｒｉｂｂｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２）２６７：２７−３５）。

インビトロにおける接触工程では、ヒトＣＤ４の以下の領域又はアミノ酸（「ＣＤ４の関連する領域／アミノ酸」）のうちの１以上を含むペプチド又はポリペプチドと選択された分子又は候補分子とを接触させてもよい：アミノ酸１４８〜１５４、アミノ酸１６４〜１６８、並びにアミノ酸１８５、１８７、１８９、１９０、及び１９２。これらアミノ酸は、図６に示す通り番号付けされている。好ましくは、前記ヒトＣＤ４の領域は、アミノ酸１４８〜１５４、アミノ酸１６４〜１６８、及びアミノ酸１８５〜１９２である。より好ましくは、前記ペプチド又はポリペプチドは、これら領域の全てを含む。更により好ましくは、前記ペプチド又はポリペプチドは、ヒトＣＤ４の以下のアミノ酸のうちの少なくとも１つを更に含む：Ｌｙｓ２６、Ａｒｇ１５６、Ａｒｇ１５９、Ｌｙｓ１６１、及びＬｙｓ１９２。最も好ましくは、前記ペプチド又はポリペプチドは、ヒトＣＤ４のＩｇ様Ｃ２−１型ドメイン（即ち、アミノ酸１２６〜２０５）を含み、任意でＩｇ様Ｖ型ドメインも含む。特に、ＣＤ４のＤ１を利用して、エピトープを安定化させる。したがって、前記ペプチド又はポリペプチドを競合結合アッセイにおいて用いる場合、Ｄ１の使用が好ましい。しかし、これら領域から１アミノ酸又は２アミノ酸を除去してもよいことに留意すべきである。ペプチドの長さは、５０アミノ酸未満が好ましく、２０アミノ酸未満がより好ましい。

ペプチドは、例えば、ＣＤ４を酵素で切断することにより作製されるペプチド、又はホスト細胞の発現により直接作製されるペプチド等の天然ペプチドであってもよく、合成ペプチドであってもよい。また、ペプチドは、ペグ化、リン酸化、アミド化、アセチル化、ビオチン若しくはＦＩＴＣ等の蛍光色素による標識、又はアイソトープによる標識等を介して修飾されてもよい。「複数の抗原ペプチド適用（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」等の技術を用いて更に修飾してもよい。かかる技術を用いて、高力価の抗ペプチド抗体及び合成ペプチドワクチンを生成することができる。このシステムは、リシンのα−アミノ基及びε−アミノ基を利用して、複数のペプチド鎖が結合できる骨格を形成する。リシン力価数に依存して、様々な数のペプチド分岐鎖を合成することができる。これにより、タンパク質担体に抗原をコンジュゲートさせる必要がなくなる（Ｂｒｉａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９２）．１５６；２：ｐｐ２５５−２６５）。

上記の通り、本発明の方法は、ヒトＣＤ４に由来するペプチド配列を用いて実施されることが好ましい。しかし、他の哺乳類のＣＤ４タンパク質の相同領域、又はＩｇ様Ｃ２−１型ドメインを含有する他の分子を用いても同様に実施することができる。

前記１以上の分子、選択された分子、又は候補分子と、ペプチドとを接触させる工程、及び前記１以上の分子が前記ペプチドの１以上の領域に結合するかどうかを検出する工程は、当技術分野において公知の方法に従って実施することができる。具体的には、本発明の１つの実施形態では、前記ペプチドは、膜にスポット又は固定されている直鎖ペプチドである。接触工程中、ＣＤ４ペプチド配列に結合可能な分子が捕捉される。

別の実施形態では、野生型ヒトＣＤ４エピトープの立体構造を模倣可能なペプチドを作製する。これは、当技術分野において公知である、構造に基づく分子設計方法によって行うことができる。

スクリーニングに用いることができるディスプレイ方法について以下に言及する。

直鎖エピトープをスクリーニングするために、エピトープマッピング技術を用いてもよい。標的エピトープの一部を表すアミノ酸配列（例えば、１０アミノ酸〜１５アミノ酸）であって１アミノ酸が重複しているアミノ酸配列を膜（例えば、セルロース）にスポットする。次いで、スポットされているアミノ酸配列を認識するタンパク質又はペプチドについてスクリーニングすることが可能である。高親和性結合剤を選択するために様々なストリンジェンシーの条件を用いて数ラウンドの選択を行ってもよい。

不連続なエピトープについてスクリーニングするために、ファージディスプレイ等の技術が開発されている。現在標準的な直鎖又は環状のペプチドのライブラリは、約１０^９個の独立したクローンという多様性を有する。即ち、理論的には、７つ以下のランダム化された位置を有するライブラリについて、可能な配列レパートリを包括的に網羅することができる。ペプチドとそのｍＲＮＡとのカップリングは、ＲＮＡ／ペプチド／リボソームの小粒子又はｍＲＮＡ／ペプチド複合体のみを含む無細胞系で達成されるので、インビトロ翻訳系により更に多様性の高いペプチドライブラリが得られる。更なるライブラリとしては、ポリソーマル又はリボソーマルディスプレイ（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １９９４；９１（１９）：９０２２−６）又はＰＲＯフュージョン技術（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，ＰＮＡＳ（１９９７）９４（２３）：１２２９７−３０２）が挙げられる。後者の技術は、ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡがコードしているペプチド又はタンパク質との間の共有結合による融合を含み、前記ペプチド又はタンパク質は、３’末端にペプチジルアクセプタ抗生物質であるピューロマイシンを有する合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳により生成することができる。

オリゴヌクレオチドライブラリを含有する外面上で発現するスクリーニング用ペプチドを調製することを含むミニ細胞ディスプレイ（米国特許第７，１２５，６７９号明細書）も可能である。同様に、細菌の鞭毛タンパク質であるＦｌｉＣ及びチオレドキシンを用いるＦｌｉｔｒｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）ランダムペプチドライブラリを用いてもよい。

更に、上述のディスプレイ方法に加えて、質量分析又は固相エピトープ回収（ＳＰＨＥＲＥ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を利用してもよい（Ｌａｗｅｎｄｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００２）１６９：２４１４−２４２１）。

１つの実施形態では、結合の検出は、Ｘ線結晶解析又はＮＭＲを実施することを含む。具体的には、当技術分野において公知であるＸ線結晶解析法を用いて、塩橋なしにペプチドに結合する分子を選択することができる。

これに代えて又はこれに加えて、第１の態様の方法は、選択された分子又は候補分子と、ＣＤ４を発現する細胞、特にＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞とを接触させることを含んでいてもよい。特にＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の活性を調節する、特に活性化させる（好ましくは、ヘルパーＴ細胞を活性化させることなしにＴｒｅｇ細胞を選択的に活性化させる）選択された分子又は候補分子の能力を判定するか、又は特にＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）のインビトロ培養物における特定のリンパ球集団において、ＣＤ４受容体の発現を減少させるか若しくはダウンモジュレートする前記選択された分子又は候補分子の能力を判定するためにこれを行ってもよい。これら実施形態では、選択された分子又は候補分子は、抗体又は抗体断片、特に、以下に更に論じるＩｇＧ１型の抗体又は抗体断片であることが好ましい。

調節アッセイの場合、Ｔｒｅｇは、一般的に、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、及び／又はＣＤ１２７を選別し、更にＦｏｘＰ３で細胞内を染色するための市販の単離キットを用いて単離することができる（磁気ビーズ単離）。Ｔｒｅｇは、ＣＤ１２７陰性であり、ＣＤ２５及びＦｏｘｐ３陽性である。細胞表面に結合しているエクトヌクレオチダーゼであるＣＤ３９を用いて、強いサプレッサ機能を有するＴｒｅｇを精製することもできる（Ｍａｎｄａｐａｔｈｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００９）．３４６（１−２），５５−６３）。市販のキットでは、ＣＤ４＋のネガティブセレクションと、その後のＣＤ２５＋のポジティブ単離との組み合わせを用いて、ＣＤ４ＣＤ２５陽性細胞集団を得ることができる。これら細胞を更に処理してもよい。ＣＤ２５及び転写因子Ｆｏｘｐ３は、Ｔｒｅｇの抑制機能に関連する発現マーカーである。Ｆｏｘｐ３による細胞内染色によって制御性の表現型が確認されるが、細胞内が染色されたことによりその細胞は生存することができなくなり、更に治療に使用することもできない。Ｆｏｘｐ３は、活性化Ｔｒｅｇ／機能的に活性であるＴｒｅｇの細胞内マーカーとして一般的に使用される。

更に、ＢＴ０６１及びスクリーニングされる分子は他の市販抗体に結合するエピトープとは異なるエピトープに結合するという事実から、市販の単離キット（磁気ビーズ単離）、及びＣＤ４におけるＢＴ０６１結合部位と競合しない更に別のＣＤ４抗体（例えば、ＳＫ−３ ＯＫＴ４）を用いてＴｒｅｇを精製し、次いで、候補分子又は選択された分子によるＴｒｅｇの活性化についてアッセイすることができる。

Ｔｒｅｇを活性化する候補分子の能力は、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性エフェクターＴ細胞とＴｒｅｇとを共培養することにより、候補分子と接触させた後、Ｔｒｅｇの抑制活性を調べることによりアッセイすることができる。活性化されたＴｒｅｇは、ＣＦＳＥで標識可能なＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞の増殖を阻害することができる（ＣＦＳＥ希釈アッセイを介した細胞増殖の評価）。或いは、エフェクター細胞の増殖は、［３Ｈ］チミジンを組み込むことにより判定することもできる。

より具体的には、抑制能は、例えば、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によりアッセイすることができる。エフェクターＴ細胞の細胞分裂は、Ｔｒｅｇの抑制作用により阻害され得る。このために、放射線照射された同種の刺激因子ＰＢＭＣでナイーブな自己ＣＤ４＋ＣＤ２５−レスポンダーＴ細胞を刺激する。Ｔｒｅｇ又は従来のＴ細胞で培養物の量を調節し、チミジンの組み込みにより増殖をアッセイすることができる。

また、Ｔｒｅｇの活性化は、（国際公開第２００８／０９２９０５号パンフレットに記載の通り）サイクリックＡＭＰ産生の測定を介してアッセイしてもよい。

また、共培養物中の活性化Ｔｒｅｇにより影響を受けるサイトカインを測定して、エフェクター細胞に対するこれら細胞の活性を判定することもできる。例えば、Ｔｒｅｇは、また、ＩＬ−２の消費を介してその抑制活性を発揮して、エフェクターＴ細胞の増殖を阻害する。また、ＩＬ−４又はＩＦＮガンマは、共培養アッセイにおいても測定することができ、活性化Ｔｒｅｇの場合は減少する。更に、ＣＤ２５等のエフェクターＴ細胞における表面活性化マーカーは、Ｔｒｅｇ細胞が活性化され、抑制活性を発揮したときに減少する。

更に、共培養物中の活性化Ｔｒｅｇにより誘導されるエフェクター細胞（これもＣＤ４陽性であってよい）における（Ｂｉｍ等の因子を介した）細胞死の判定は、Ｔｒｅｇが活性化されるかどうかを調べる更なる方法である（Ｐａｎｄｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００７）８ １３５３−１３６２）。

Ｔｒｅｇは血中に少量（２％〜１０％）しか存在しないので、幾つかの増殖ストラテジが知られている。例えば、抗ＣＤ３でＴＣＲを刺激した後、抗ＣＤ２８及びラパマイシンで共刺激して、Ｔ細胞の数を増加させることができる。ラパマイシンは、Ｔｒｅｇの選択的生存を促進するが、エフェクターＴ細胞の生存は促進しない。

幾つかのポリクローナル増殖プロトコールが利用可能である。例えば、ＣＤ４／ＣＤ２５についてポジティブセレクションを行った後、抑制能を保持しながらＴｒｅｇ数を増加させることができるＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５と組み合わせて（刺激のために）抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を用いることにより、インビトロでＴｒｅｇ細胞をポリクローナルに増殖させることができる（Ｅａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００５）１１５：３−９）。

ＣＤ４発現の調節に関して、抗ＣＤ４抗体を添加することにより、細胞表面におけるＣＤ４受容体の発現を減少させることができることに留意すべきである。この特徴は、ＣＤ４の結合の程度を求めるための有効なアッセイの基礎として用いることができる。具体的には、このアッセイでは、接触工程は、（ｉ）候補分子又は選択された分子とヒトドナーの血液に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とを３７℃でインキュベートすることと、（ｉｉ）ＣＤ４の結合についてＢＴ０６１と競合しない抗ＣＤ４標識抗体で前記インキュベートされた細胞を染色することと、（ｉｉｉ）染色の量を検出して、ＣＤ４受容体の占有率を求め、それによって細胞表面上に存在するＣＤ４分子の量を求めることとを含む。

より具体的には、このアッセイは、ヒトドナーの血液からＰＢＭＣ（即ち、リンパ球及び単球）を単離し、次いで、これを様々な濃度の候補分子又は選択された分子（好ましくは、抗体又は抗体断片）と共に３７℃でインキュベートすることを含む。３時間インキュベートした後、ＢＴ０６１が結合するエピトープとは異なるＣＤ４上のエピトープに結合する蛍光色素で標識された抗体、例えば、フィコエリトリン抗ＣＤ４等を添加することにより細胞を染色する。これら染色抗体は、特定のリンパ球集団におけるＣＤ４受容体を標識する。用いられるＢＴ０６１エピトープ及び蛍光色素で標識されたＣＤ４抗体は、ＣＤ４分子上の異なるエピトープを認識するので競合しないため、この技術を用いれば、候補分子又は選択された分子によるＣＤ４の結合とは独立に、細胞表面上のＣＤ４受容体の量を測定することが可能になる。抗体で標識された細胞がレーザービームを通過し刺激される、フローサイトメトリーにおいて測定を実施する。レーザービームにより刺激されると、染色されている細胞は、結合している抗体に比例して蛍光を発し、発せられた光はフローサイトメーターにより捕捉され、次いで、当技術分野において公知であるソフトウェア、例えば、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ）を用いて評価される。ソフトウェア（Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｌｉｎｅ Ａｓｓａｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓｔｅｇｍａｎｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ等）を用いて、次いで、並行して測定される標準物質に対するサンプルの相対活性（効力）を計算することができる。

本発明のこの態様の更なる実施形態では、接触工程は、ＣＤ４ペプチド又はポリペプチド（好ましくは、ＣＤ４のＤ１及びＤ２を含む）又はＣＤ４を発現する細胞、及び候補分子／選択された分子と、ＢＴ０６１の重鎖及び軽鎖の可変ドメインを有する競合抗体又は抗体断片とを接触させて、候補／選択された分子が前記競合抗体又は抗体断片のＣＤ４に対する結合をブロック可能であるかどうかを判定することを含んでいてもよい。

第１の態様における１以上の候補分子は、ペプチドであっても非ペプチドであってもよい。具体的には、前記１以上の分子は、ミモトープ、ペプチド模倣物質、小分子、天然のリポカリン又は改変されたリポカリンに基づく認識タンパク質、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ＤＡＲＰｉｎ、フィブロネクチン、アフィボディ、Ｋｕｎｉｔｚ型阻害剤、ペプチドアプタマー、リボザイム、毒素、ｃａｍｅｌｉｄ、抗体、抗体断片、又は抗体由来分子であってもよい。

ミモトープは、タンパク質、炭水化物、又は脂質のエピトープを模倣するペプチドであり、ファージディスプレイライブラリによって作製することができる。抗体により選択された場合、ミモトープは、Ｂ細胞のエピトープのみを表し、抗原／アレルゲン特異的なＴ細胞のエピトープを欠いている。担体にカップリングしているか又は複数の抗原ペプチドにおいて提示されている形態のミモトープは、免疫原性を獲得し、ワクチン接種したときにエピトープ特異的な抗体反応を誘導する。

ペプチド模倣物質は、ペプチドを模倣するよう設計された小さなペプチド様鎖である。典型的に、分子の性質を変化させるために、既存のペプチドを修飾することにより作製される。例えば、分子の安定性又は生物活性を変化させるための修飾を行うことにより作製することができる。これら修飾は、天然には生じないペプチドの変化を含む（例えば、骨格の変更及び非天然アミノ酸の組み込み）。

ペプチド模倣物質の例は、アポトーシスと呼ばれるプログラム細胞死の形態に癌細胞を誘導するために、標的タンパク質に結合させる目的で設計及び合成されたものであった。本質的に、これらは、細胞内のアポトーシス経路を活性化する重要な相互作用を模倣することにより機能する。

フォルダマーは、非共有相互作用により安定化されている二次構造に適応する別個の鎖分子又はオリゴマーである（Ｇｅｌｌｍａｎ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ（１９９８）３１（４）：１７３−１８０；Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（２００１）１０１（１２）：３８９３−４０１２）。フォルダマーは、へリックス及びβ−シート等の正確に規定されている立体構造に折り畳むタンパク質、核酸、及び多糖類の能力を模倣する人工分子である。フォルダマーは、分子の自己構築、分子の認識、及びホスト−ゲスト化学的性質を含む多数の興味深い超分子的性質を示すことが立証されている。フォルダマーは、生体分子のモデルとして研究され、抗菌活性を示すことが示されている。また、新規機能物質を開発するための重要な用途を有する可能性もある。

小分子は、ポリマーの定義には当てはまらない低分子量有機化合物である。小分子の分子量の上限は、約８００ダルトンであり、これは、細胞内の作用部位に達することができるように細胞膜を通過して速やかに拡散することが可能な分子量である。小分子は、タンパク質、核酸、又は多糖類等の生体ポリマーに対して高い親和性を示し、更に、生体ポリマーの活性又は機能を変化させる。

ＤＡＲＰｉｎ（設計アンキリン反復タンパク質）は、抗原又は抗原構造を認識することもできる人工タンパク質である。ＤＡＲＰｉｎは、構造的にアンキリンタンパク質に由来し、約１４ｋＤａ（１６６アミノ酸）であり、且つ３つの反復モチーフからなる。ＤＡＲＰｉｎは、抗原に対して抗体と同程度の親和性を示す（Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ（２００８）１３，Ｎｒ．１５−１６，Ｓ．６９５−７０１）。

アフィボディ（登録商標）分子は、多数の標的タンパク質に対して特異的に結合するよう改変することができる小さく且つロバストな高親和性タンパク質分子である。

「ｃａｍｅｌｉｄ」という用語は、ラクダ類により産生され、且つ重鎖ホモダイマーを含む抗体、及びこれら抗体の誘導体を指す（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１２８；１−３；ｐｐ．１７８−１８３（２００９））。

候補分子は、抗体又は抗体断片であることが好ましい。語句「抗体、抗体断片、又は抗体由来分子」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体、及び抗体断片を網羅する。用語「抗体断片」は、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’_２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片を含む断片、並びにダイアボディ又はトリボディを含む。これらは、ヒト化抗体又はヒト抗体に基づくことが好ましい。前記抗体は、定常領域／ドメイン、即ち、Ｆｃ部分を含むことがより好ましい。抗体がヒト定常領域を含む場合、この定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む任意のクラスの免疫グロブリン、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプに由来する定常ドメインの中から選択することができる。好ましい定常領域は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１の定常ドメインの中から選択される。

異なるＩｇサブクラスのＦｃ部分には、個々のサブクラスに対して特異的である細胞内ＦｃＲが結合している。異なる親和性でＩｇＧアイソタイプに結合する３つの異なるＦｃＲクラス、ＣＤ１６、ＣＤ３２、及びＣＤ６４が知られている。単球、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び他の細胞等の様々な異なる免疫細胞で多様なパターンのＦｃγＲが発現する。本発明者らは、インビトロにおいて、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する抗体ＢＴ０６１の定常領域の能力が、Ｔ細胞においてＣＤ４をダウンモジュレートする抗体の能力にとって重要であることを見出した。具体的には、インビトロにおける研究は、単球で主に発現しているＦｃγ受容体であるＦｃγ１受容体の能力が主に関与しており、ＰＢＭＣの培養物における単球の存在が、ＢＴ０６１で処理されたＴ細胞においてＣＤ４をダウンモジュレートするのに必要且つ十分であることを示す。

したがって、本発明の実施形態では、候補分子は、Ｆｃ受容体、好ましくはＦｃγＲＩ（即ち、ＣＤ６４）に結合可能であり、最も好ましくはＩｇＧ１抗体のＦｃ部分を含む。これに加えて又はこれに代えて、候補分子は、Ｆｃ受容体を介して単球に結合可能である。

本発明のこの態様では、スクリーニングされる分子は、ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体又は抗体断片ではない。これらＣＤＲ配列を図２Ａ及び２Ｂに示す。好ましい実施形態では、スクリーニングされる分子は、Ｒａｃａｄｏｔ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍ．，１０，３６５−３７４（１９９２））に記載されているマウスＢ−Ｆ５分子ではない。

１以上の候補分子が抗体又は抗体断片である本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、前記抗体又は抗体断片は、ＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２と、ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３とを含み、前記ＣＤＲはそれぞれ、その配列中に以下に記載するアミノ酸置換を任意で含んでいてもよいＣＤＲである：
（ｉ）Ｓｅｒ３２；Ｇｌｙ３３；及びＴｙｒ３４を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｉｉ）Ｌｅｕ５４；及びＩｌｅ５７を含む軽鎖ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）Ａｓｐ３１、Ｇｌｕ３１、Ｔｈｒ３１、Ｃｙｓ３１、Ｐｒｏ３１、Ｍｅｔ３１、又はＴｙｒ３１を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｉｖ）Ｔｙｒ１０３、Ｐｈｅ１０３、又はＨｉｓ１０３；Ａｒｇ１０４；Ｔｙｒ１０５；Ａｓｐ１０６；及びＴｒｐ１１０、Ｐｈｅ１１０、Ｈｉｓ１１０、又はＴｙｒ１１０を含む重鎖ＣＤＲ３。

或いは、候補分子は、ＢＴ０６１のＶドメイン（即ち、配列番号２及び配列番号３）の配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するＶドメインを含み、且つ軽鎖ＶドメインのＣＤＲ１における配列モチーフＳＧＹＳＹ（配列番号１０）、軽鎖ＶドメインのＣＤＲ２における配列モチーフＬＡＳＩＬＥ（配列番号１１）、及び重鎖ＶドメインのＣＤＲ３における配列モチーフＳＹＹ／Ｆ／ＨＲＹＤ（配列番号１３）を含む抗体又は抗体断片である。

この方法では、スクリーニングされる１以上の分子は、抗体ＢＴ０６１、及び本発明者らがＢＴ０６１抗体とＣＤ４との相互作用において重要であると同定したＢＴ０６１内の残基に対する類似性によって規定される候補分子のセットである。具体的には、この方法は、ＢＴ０６１に比べて略同程度又はより優れた結合親和性／特異性、及びＴｒｅｇ活性化活性を有する分子を同定する方法であることが好ましい。

ヒト化抗体ＢＴ０６１の軽鎖及び重鎖のペプチド配列を、それぞれ図２Ａ及び２Ｂに示す。これら図中では、軽鎖及び重鎖のＣＤＲをマークしている。本明細書では、これらＣＤＲ内のアミノ酸残基は、残基の種類及び数によって同定されており、前記数は、図２Ａ及び２Ｂに表されている軽鎖又は重鎖ＢＴ０６１抗体の可変領域内のアミノ酸の位置を表す。残基の種類及び数は、言及されるＢＴ０６１ ＣＤＲのアミノ酸残基を明確に同定するために使用される。しかし、残基の数は、前記方法においてスクリーニングされる候補抗体又は断片におけるその位置に前記残基が存在すると限定することを意図するものではないことを理解されたい。例えば、この実施形態の抗体において、非必須アミノ酸残基が軽鎖のセクション１〜３０から欠失している場合、Ｓｅｒ３２は、軽鎖ＣＤＲ１内の３１位に存在してもよい。

好ましい実施形態では、ＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２の配列、並びにＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３の配列中のアミノ酸置換は、以下の表４及び５に記載されるアミノ酸置換から選択される。より好ましくは、抗体又は抗体断片は、Ｔｙｒ５３又はＰｈｅ５３を含む軽鎖と、Ｓｅｒ２８を含む重鎖とを含む（実施例１の表７に示す通り）。これに代えて又はこれに加えて、抗体若しくは抗体断片は、Ａｓｐ６４を含有する軽鎖を含む、及び／又は抗体若しくは抗体断片は、Ａｓｐ３１及びＧｌｕ５６のうちの少なくとも１つを有する重鎖を含む（実施例１の表８に示す通り）。抗体又は抗体断片は、ＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ３及び／又はＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ２を更に含んでいてもよく、これらＣＤＲの配列中にアミノ酸置換が任意で存在し、前記アミノ酸置換は、表４及び５に記載されるアミノ酸置換から選択される。

スクリーニング方法で用いるための候補抗体又は抗体断片は、ＢＴ０６１の既知の配列を突然変異させることにより作製することができる。具体的には、突然変異がＣＤＲ内に存在する場合、前記突然変異は、上記アミノ酸が確実に保持されるか、又は確実に望ましい置換が行われる標的突然変異であってもよい。

スクリーニング方法の工程（ａ）がインビトロで実施される場合、標的突然変異誘発を用いて、ＣＤＲ内の規定の位置でアミノ酸交換を生じさせることができる。アミノ酸に対応するＤＮＡ配列を知ることにより、様々な望ましいアミノ酸置換を含有する特定の突然変異体のライブラリを作製することができる。スクリーニング方法の工程（ａ）〜（ｃ）がコンピュータシステムで実施される場合、ＣＤ４に関連して上に記載した方法と同様の方法でアミノ酸配列を入力することにより、候補抗体又は抗体断片の三次元構造を作成することができる。

等配電子変異（Ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、立体効果を引き起こさない、即ち、如何なる方法においても抗体の立体構造を変化させない変異である。

本発明の第２の態様では、ＣＤ４と結合可能な抗体又は抗体断片である候補分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）ＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２と、ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３とを含み、前記ＣＤＲはそれぞれ、その配列中に以下に記載するアミノ酸置換を任意で含んでいてもよいＣＤＲである抗体又はその断片を提供する工程と：
（ｉ）Ｓｅｒ３２；Ｇｌｙ３３；及びＴｙｒ３４を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｉｉ）Ｌｅｕ５４；及びＩｌｅ５７を含む軽鎖ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）Ａｓｐ３１、Ｇｌｕ３１、Ｔｈｒ３１、Ｃｙｓ３１、Ｐｒｏ３１、Ｍｅｔ３１、又はＴｙｒ３１を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｉｖ）Ｔｙｒ１０３、Ｐｈｅ１０３、又はＨｉｓ１０３；Ａｒｇ１０４；Ｔｙｒ１０５；Ａｓｐ１０６；及びＴｒｐ１１０、Ｐｈｅ１１０、Ｈｉｓ１１０、又はＴｙｒ１１０を含む重鎖ＣＤＲ３、
（ｂ）前記抗体又は抗体断片がＣＤ４に結合可能であるかどうかを判定する工程と、（ｃ）工程（ｂ）においてＣＤ４に結合可能であると判定された抗体又は抗体断片を選択する工程と
を含み、
前記抗体又は抗体断片が、ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含まない方法を提供する。

１つの実施形態では、本発明の第２の態様に係るスクリーニング方法の工程（ａ）〜（ｃ）は、本発明の第１の態様に関連して上に記載した方法と同様の方法でコンピュータシステムにおいて実施してもよい。具体的には、ＢＴ０６１とそのＣＤ４エピトープとの相互作用にとって重要な残基において、本明細書に提供される情報に基づいてインシリコで多数のＢＴ０６１変異体を作製し、これら変異体とＣＤ４との相互作用をシミュレーションすることができる。

この実施形態では、前記方法は、更に、候補抗体又は抗体断片とＣＤ４を発現している細胞とを接触させる工程を更に含んでいてもよい。

コンピュータシステムで実施する実施形態に代わる実施形態では、本発明の第２の態様に係るスクリーニング方法の工程（ａ）〜（ｃ）は、インビトロで実施してもよく、工程（ｂ）は、候補抗体又は抗体断片とＣＤ４を発現している細胞とを接触させることを含んでいてもよい。ＣＤ４に結合する能力は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化させる候補の能力に基づいて判定されることが好ましい。

具体的には、本発明のこの態様は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化可能な抗体又は抗体断片をスクリーニングする方法であって、
（ａ）１以上の抗体又は抗体断片と、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞とを接触させる工程と、
（ｂ）前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化する前記抗体又は抗体断片の能力を評価する工程と、
（ｃ）前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化する抗体又は抗体断片を同定する工程と
を含み、
前記抗体又は抗体断片が、ＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２と、ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３とを含み、前記ＣＤＲはそれぞれ、その配列中に以下に記載するアミノ酸置換を任意で含んでいてもよいＣＤＲであり：
（ｉ）Ｓｅｒ３２；Ｇｌｙ３３；及びＴｙｒ３４を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｉｉ）Ｌｅｕ５４；及びＩｌｅ５７を含む軽鎖ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）Ａｓｐ３１、Ｇｌｕ３１、Ｔｈｒ３１、Ｃｙｓ３１、Ｐｒｏ３１、Ｍｅｔ３１、又はＴｙｒ３１を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｉｖ）Ｔｙｒ１０３、Ｐｈｅ１０３、又はＨｉｓ１０３；Ａｒｇ１０４；Ｔｙｒ１０５；Ａｓｐ１０６；及びＴｒｐ１１０、Ｐｈｅ１１０、Ｈｉｓ１１０、又はＴｙｒ１１０を含む重鎖ＣＤＲ３、
前記抗体又は抗体断片が、ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含まない方法を提供する。

本発明の第１の態様に係るスクリーニング方法に関連して上に提供した実施形態及び好ましい特徴の記載は、本発明の第２の態様に係るスクリーニング方法にも当てはまることに留意すべきである。

本発明のこれら両態様は、更に使用したり下流で分析したりするために、選択された分子、特に選択された抗体又は抗体断片の産生を更に含んでいてもよい。

したがって、本発明は、更に、前記方法により得ることができる治療組成物を製造する方法を提供する。具体的には、前記方法は、
（ａ）上記スクリーニング方法に係る方法を用いてＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化可能であると判定された分子を選択する工程と、
（ｂ）前記分子を含む治療組成物を製造する工程と
を含む。

具体的には、前記治療組成物は、前記分子と、１以上の薬学的に許容し得る担体又は希釈剤とを合わせることにより製造することができる。

抗体及び抗体断片
本発明者らの研究により、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞との相互作用及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の活性化にとって重要であるＢＴ０６１の特徴を同定することができた。これにより、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化可能なＢＴ０６１抗体の特定の突然変異体／変異体が同定された。

したがって、第３の態様では、本発明は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化可能な抗体又は抗体断片であって、ＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２と、ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３とを含み、前記ＣＤＲはそれぞれ、その配列中に以下に記載するアミノ酸置換を任意で含んでいてもよいＣＤＲであり：
（ｉ）Ｓｅｒ３２；Ｇｌｙ３３；及びＴｙｒ３４を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｉｉ）Ｌｅｕ５４；及びＩｌｅ５７を含む軽鎖ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）Ａｓｐ３１、Ｇｌｕ３１、Ｔｈｒ３１、Ｃｙｓ３１、Ｐｒｏ３１、Ｍｅｔ３１、又はＴｙｒ３１を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｉｖ）Ｔｙｒ１０３、Ｐｈｅ１０３、又はＨｉｓ１０３；Ａｒｇ１０４；Ｔｙｒ１０５；Ａｓｐ１０６；及びＴｒｐ１１０、Ｐｈｅ１１０、Ｈｉｓ１１０、又はＴｙｒ１１０を含む重鎖ＣＤＲ３、
ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含まない抗体又は抗体断片を提供する。

或いは、第３の態様は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化可能な抗体又は抗体断片であって、ＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２と、ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３とを含み、前記ＣＤＲはそれぞれ、その配列中に以下に記載するアミノ酸置換を任意で含んでいてもよいＣＤＲであり：
（ｉ）Ｓｅｒ３２又はＰｒｏ３２；Ｇｌｙ３３又はＡｌａ３３；及びＴｙｒ３４を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｉｉ）Ｌｅｕ５４、Ｉｌｅ５４又はＴｈｒ５４；及びＩｌｅ５７、Ｌｅｕ５７；Ｖａｌ５７又はＴｈｒ５７を含む軽鎖ＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）Ａｓｐ３１、Ｇｌｕ３１、Ｔｈｒ３１、Ｃｙｓ３１、Ｐｒｏ３１、Ｍｅｔ３１又はＴｙｒ３１を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｉｖ）Ｔｙｒ１０３、Ｐｈｅ１０３又はＨｉｓ１０３；Ａｒｇ１０４；Ｔｙｒ１０５；Ａｓｐ１０６；及びＴｒｐ１１０、Ｐｈｅ１１０、Ｈｉｓ１１０又はＴｙｒ１１０を含む重鎖ＣＤＲ３、
ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含まない抗体又は抗体断片を提供する。

上述の通り、ヒト化抗体ＢＴ０６１の軽鎖及び重鎖のペプチド配列を、それぞれ、図２Ａ及び２Ｂに示す。これら図中では、軽鎖及び重鎖のＣＤＲをマークしている。上述の通り、これらＣＤＲ内のアミノ酸残基は、残基の種類及び数によって同定されており、前記数は、図２Ａ及び２Ｂに表されている軽鎖又は重鎖ＢＴ０６１抗体の可変領域内のアミノ酸の位置を表す。残基の種類及び数は、言及されるＢＴ０６１ ＣＤＲのアミノ酸残基を明確に同定するために使用される。しかし、残基の数は、本発明の候補抗体又は断片におけるその位置に前記残基が存在すると限定することを意図するものではないことを理解されたい。例えば、この実施形態の抗体において、非必須アミノ酸残基が軽鎖のセクション１〜３０から欠失している場合、Ｓｅｒ３２は、軽鎖ＣＤＲ１内の３１位に存在してもよい。

好ましい実施形態では、ＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２の配列、並びにＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３の配列中のアミノ酸置換は、上記表４及び５に記載されるアミノ酸置換から選択される。より好ましくは、抗体又は抗体断片は、Ｔｙｒ５３又はＰｈｅ５３を含む軽鎖と、Ｓｅｒ２８を含む重鎖とを含む。これに代えて又はこれに加えて、抗体若しくは抗体断片は、Ａｓｐ６４を含有する軽鎖を含む、及び／又は抗体若しくは抗体断片は、相互作用にとって重要であることが実施例１の表８に示されているアミノ酸のうちの少なくとも１つを有する重鎖を含む。具体的には、重鎖は、Ａｓｐ３１及び／又はＧｌｕ５６を含む。抗体又は抗体断片は、ＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ３及び／又はＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ２を更に含んでいてもよく、これらＣＤＲの配列中にアミノ酸置換が任意で存在し、前記置換は、表４及び５に記載される置換から選択される。

具体的には、ＢＴ０６１抗体によるＣＤ４エピトープの認識及び結合は、３つの相補性決定領域、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の特定の構成及び立体構造に基づいている。ＣＤＲ４に直接接触するのは軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２、並びに重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ３のみであるにもかかわらず、６つのＣＤＲ全てが非常に密に配置されており、互いの立体構造を相互に支持している。結果として、ＣＤＲにおける多くの位置では、如何なるアミノ酸置換もＢＴ０６１の親和性及び効力を著しく低下させてしまう。しかし、幾つかの位置では、置換されても構造が不安定化しない。

かかる保存的置換の例を表４及び５に提供する。これら表では、全体の相互作用ネットワークが保存されるように配列変異が選択されている。引力及び反発相互作用のシンタックスが維持される。定向極性相互作用は、反転する場合がある。例えば、水素架橋のドナー−アクセプター対、塩橋のイオン性パートナー、又は双極子−四極子相互作用のパートナーの位置が入れ替わる場合がある。

更なる実施形態では、抗体又は抗体断片は、以下の配列（配列番号１４）を含み：
（「Ｘ」と記載されている２４〜２９位、３１位、３７位、６０位、９６〜９８位、及び１０１位のアミノ酸は、表４における対応する位置に示されているアミノ酸から選択される）
更に、以下の配列（配列番号１５）を含む。
（「Ｘ」と記載されている３１〜３４位、５１〜６７位、１０３位、１０７〜１１０位、１１１位、及び１１２位のアミノ酸は、表５における対応する位置に示されているアミノ酸から選択される）

具体的には、ＢＴ０６１の軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２及び重鎖のＣＤＲ３内の特定のアミノ酸モチーフが、ＣＤ４の結合にとって重要である。したがって、抗体又は抗体断片は、ＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１に由来するＳＧＹＳＹ（配列番号１０）、及び／又はＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ２に由来する配列ＬＡＳＩＬＥ（配列番号１１）、及び／又はＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ３に由来する配列ＹＹＲＹＤ（配列番号１２）を含んでいてもよい。

更に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化可能な抗体又は抗体断片は、抗体ＢＴ０６１のＶドメインと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であるＶドメインを有していてもよく、前記Ｖドメインは、
（ｉ）軽鎖ＶドメインのＣＤＲ１における配列モチーフＳＧＹＳＹ（配列番号１０）、
（ｉｉ）軽鎖ＶドメインのＣＤＲ２における配列モチーフＬＡＳＩＬＥ（配列番号１１）、及び
（ｉｉｉ）重鎖ＶドメインのＣＤＲ３における配列モチーフＳＹＸＲＹＤ（式中、Ｘは、Ｙ、Ｆ、又はＨである）（配列番号１３）を含むが、
但し、前記抗体又は抗体断片は、抗体ＢＴ０６１のＶドメインと１００％同一であるＶドメインを含まない。

本発明の第３の態様の特定の実施形態では、抗体又は抗体断片は、以下の単一アミノ酸置換を含むＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ配列及びＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ配列を含むか、
（ｉ）重鎖におけるＡ６３Ｇ；
（ｉｉ）重鎖におけるＲ３３Ｋ；又は
（ｉｉｉ）軽鎖におけるＬ９８Ｉ
或いは、前記抗体又は抗体断片は、以下の二重アミノ酸置換を含むＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ配列及びＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ配列を含む
（ｉ）重鎖におけるＲ３３Ｋ及びＡ６３Ｇ；又は
（ｉｉ）軽鎖におけるＬ９８Ｉ及び重鎖におけるＲ３３Ｋ。

本発明のこれら特定の実施形態では、抗体又は抗体断片は、ＢＴ０６１の重鎖及び軽鎖の残りの可変ドメイン配列を更に含んでいてもよい。

本発明の抗体又はその断片は、具体的には、（国際公開第２００４／０８３２４７号パンフレットに記載の通り）マウスＢ−Ｆ５抗体及びＢＴ０６１抗体の可変ドメインをコードすることが知られているポリヌクレオチド配列の突然変異誘発により製造することができる。

本発明の第１及び第２の態様に関連して上に記載した抗体及び抗体断片の定義及び好ましい実施形態は、本発明の第３の態様にも当てはまることに留意すべきである。具体的には、前記抗体及び断片は、ＩｇＧ１抗体が好ましい、及び／又は前記抗体又は抗体断片が、Ｆｃ受容体、好ましくはＦｃγＲＩ（即ち、ＣＤ６４）に結合可能であるようなＦｃ部分を含むことが好ましい。最も好ましくは、前記抗体又は抗体断片は、ＩｇＧ１抗体のＦｃ部分を含む。これに加えて又はこれに代えて、前記抗体又は抗体断片は、Ｆｃ受容体を介して単球に結合可能である。

更に、本発明は、ヒトＣＤ４タンパク質のうちの５０未満のアミノ酸を含み、且つヒトＣＤ４の以下の領域：アミノ酸１４８〜１５４、アミノ酸１６４〜１６８、及びアミノ酸１８５〜１９２のうちの１以上を含む単離ペプチドを提供する。前記単離ペプチドは、これら領域のうちの２つを含むことが好ましく、３つを含むことがより好ましい。これに加えて又はこれに代えて、前記単離ペプチドは、３０未満のアミノ酸を含み、最も好ましくは、前記単離ペプチドは、２０未満のアミノ酸を含む。

更に、本発明は、上記単離ペプチドのミモトープペプチドを提供する。

また、本発明は、本明細書に記載する抗体又は抗体断片をコードする核酸を含む。前記核酸は、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよいが、ＤＮＡが好ましく、抗体又は断片のＨ鎖又はＬ鎖のＶドメインをコードするＤＮＡが最も好ましい。ポリヌクレオチドは、完全なＨ鎖及びＬ鎖を発現させるために、ヒトのＨ鎖又はＬ鎖の定常領域をコードするポリヌクレオチドと融合させてもよい。

また、本発明は、発現カセットを使用し、ここで、上記ポリヌクレオチドは、選択されたホスト細胞における前記ポリヌクレオチドの転写及び翻訳の制御を可能にするために適切な制御配列に連結されている。更なる実施形態は、上記ポリヌクレオチド又は発現カセットを含む組換えベクターである。

上記の通り、ポリヌクレオチドは、選択されたホスト細胞における前記ポリヌクレオチドの転写及び翻訳の制御を可能にする適切な制御配列に発現ベクター内で連結していてもよい。これら組換えＤＮＡコンストラクトは、組換えＤＮＡ及び遺伝子工学の周知の技術により得ることができ、また、ホスト細胞に導入することができる。

有用なホスト細胞は、原核細胞であっても、真核細胞であってもよい。中でも、好適な真核細胞は、植物細胞、サッカロミセス属等の酵母細胞、ショウジョウバエ属又はスポドプテラ属等の昆虫細胞、及びＨｅＬａ、ＣＨＯ、３Ｔ３、Ｃ１２７、ＢＨＫ、ＣＯＳ等の哺乳類細胞である。本明細書に記載する抗体又は断片は、発現に好適な条件下で前記抗体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含有するホスト細胞を培養し、前記ホスト細胞の培養物から前記抗体を回収することにより得ることができる。

本発明によれば、ホスト細胞は、本発明の抗体を産生する細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより得られるハイブリドーマであってもよい。

前記抗体又は抗体断片は、以下に更に記載する通り医療用途及び非医療用途を有する。

医療用途の場合、本明細書に記載する抗体又は抗体断片を医薬組成物に製剤化してもよい。具体的には、本発明の医薬組成物は、抗体又は抗体断片と、薬学的に許容し得る担体又は希釈剤とを含む。

更に、前記抗体又は抗体断片は、標識を更に含んでいてもよい。抗体の標識技術は、当技術分野において周知である。したがって、一例としては、ＧＦＰ又は蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、高性能ｄｙＬｉｇｈｔ）等の蛍光標識、放射性アイソトープ、ビオチン、ＨＲＰ等で抗体を標識してもよい。

抗体及びエピトープの使用
本発明は、更に、本発明の抗体又は抗体断片を用いる治療方法を提供する。前記抗体又は抗体断片は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を選択的に活性化可能であるので、治療法において特定の用途を有する。本発明は、自己免疫疾患若しくは移植拒絶に罹患している被験体を治療する方法、又は被験体が自己免疫疾患若しくは移植拒絶に罹患するのを予防する方法であって、本発明に係る抗体又は抗体断片を前記被験体に投与することを含む方法を提供する。同様に、本発明は、医療、特に、自己免疫疾患又は移植拒絶の治療において使用するための本明細書に記載する抗体又は抗体断片を提供する。したがって、本発明は、自己免疫疾患又は移植拒絶の治療において使用される医薬を製造するための、本明細書に記載する抗体又は抗体断片の使用を提供する。好適な医療用途及び治療方法は、国際公開第２００９／１１２５０２号パンフレット、国際公開第２００９／１２１６９０号パンフレット、国際公開第２００９／１２４８１５号パンフレット、及び国際公開第２０１０／０３４５９０号パンフレットにおいてＢＴ０６１について記載されているものであり、これらの開示は参照することにより本明細書に援用される。

好ましい実施形態では、自己免疫疾患は、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、心筋炎、移植片対宿主反応又は宿主対移植片反応等の移植関連疾患、又は全身性臓器許容に関する問題から選択される。乾癬及び関節リウマチの治療が特に好ましい。

本発明は、更に、自己免疫疾患若しくは移植拒絶に罹患している被験体を治療する方法、又は被験体が自己免疫疾患若しくは移植拒絶に罹患するのを予防する方法であって、前記被験体からＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を含むサンプルを採取し、前記サンプルと本明細書に記載する抗体又は抗体断片とを接触させてＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化させ、活性化された細胞を前記被験体に投与することを含む方法を提供する。かかる方法は、インビトロにおいてＴｒｅｇ細胞の数を増加させる工程を更に含んでいてもよい。これは、本明細書に記載する増殖ストラテジを用いて行うことができる（Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

同様に、本発明は、本発明の抗体又は抗体断片を用いてインビトロで活性化されている活性化型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を提供する。これら活性化型制御性Ｔ細胞は、医療、特に自己免疫疾患又は移植拒絶の治療において使用することができる。同様に、本発明は、自己免疫疾患又は移植拒絶の治療において使用される医薬を製造するための、本発明の抗体又は抗体断片を用いて活性化されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の使用を提供する。

関節リウマチ等の自己免疫疾患の患者のＴｒｅｇは抑制能が低いが、これは、ＴＮＦα等の炎症促進性サイトカインに起因している可能性がある。本発明は、自己免疫疾患に罹患しており、且つ（必須ではないが）正常に機能しないＴｒｅｇ集団を有する場合がある患者のＴｒｅｇをスクリーニング、単離、及び／又は活性化する方法を含む。本発明の抗体及びその断片の特異的結合様式により、ＣＤ４に結合可能になるだけではなく、より重要なことにＴｒｅｇを活性化することが可能になる。Ｔｒｅｇの単離は、本発明のＢＴ０６１又は抗体若しくは抗体断片を用いて行うことができる。後で活性化工程を行う場合、ＣＤ４に対する結合についてＢＴ０６１と競合しないＣＤ４抗体によってＣＤ４の選択を行わなければならない。或いは、活性化工程前に、増殖ストラテジを含んでいてもよい。

本発明では、ＢＴ０６１及び／又は本発明の抗体若しくは抗体断片を用いてＴｒｅｇを単離し、「Ｔｒｅｇ細胞に基づく免疫療法」において患者に戻してもよい。或いは、患者に筋肉内投与又は皮下投与することにより直接Ｔｒｅｇを刺激してもよい。

Ｔｒｅｇに基づく免疫療法は、自己免疫疾患又は移植における耐容性を誘導するための大きな注目を集めている治療法である。Ｆｏｘｐ３の発現を誘導するレチノイン酸の使用、又は抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体による刺激に加えて骨髄由来のＤＣと共培養する等、インビトロで誘導性Ｔｒｅｇ（Ｔｒｅｇ）を生成する幾つかのアプローチが存在する。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５４６３１号は、ＬＡＰ及びＣＤ１２１ｂを用いて自己免疫疾患を治療する（「Ｔｒｅｇに基づく免疫療法」）ためのＦｏｘｐ３ Ｔｒｅｇの精製方法について言及している。

治療用途には大量のＴｒｅｇが必要であり、また、これら細胞はその制御性表現型を保持していなければならない。現在、これを達成するには、天然のＴｒｅｇを選択するしかない。インビトロ方法によって生成される誘導性Ｔｒｅｇは、表現型がエフェクター細胞に戻ってしまう場合があるという問題点を有するので、患者にとって予測不可能なリスクが生じる。

しかし、ＢＴ０６１は、混合リンパ球反応においてＴｒｅｇを活性化することが立証されている（国際公開第２００９／１１２５０２Ａ１号パンフレット）。これは、本明細書に記載するＣＤ４に対する予想外の特異的結合様式によるものである。

インビトロにおける用途
本発明の抗体、抗体断片、及び単離ペプチドは、多数のインビトロにおける用途も有する。具体的には、本明細書に記載する抗体又は抗体断片は、インビトロにおいてＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化するため、又はインビトロにおいてＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を同定するために用いることができる。

より具体的には、本発明の抗体又は抗体断片は、サンプル中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の存在をスクリーニングする方法において用いることができる。かかる方法は、標識抗体又は抗体断片と前記サンプルとを接触させる工程と、前記サンプルを洗浄して、結合していない抗体を除去する工程と、前記サンプル中における前記標識の存在を検出する工程とを含んでいてもよい。

具体的には、かかるスクリーニング方法では、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は、活性化型ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞である。サンプルは、自己免疫疾患に罹患している被験体から採取した血液サンプルが好ましい。

また、本発明は、本明細書に記載する抗体又は抗体断片でコーティングされた磁気ビーズを含むＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の単離キットについても記載する。前記キットは、更に、第２の抗ＣＤ２５抗体及び／又は抗ＣＤ４＋抗体を含んでいてもよい。更なる選択工程、例えば、ＣＤ３９のポジティブセレクション、ＣＤ１２７のネガティブセレクション、ＣＤ１９陽性細胞の枯渇等を実施するための更なる抗体を含んでいてもよい。Ｔｒｅｇ表現型について更に特性評価するために、ＬＡＰ（潜在関連ペプチド）、ＧＡＲＰ、又はＣＤ１２１ｂ（ＩＬ−１ ２型受容体）を用いてもよい。

Ｔｒｅｇの単離後、本発明の抗体又は抗体断片を用いて単離した細胞を凍結保存してもよい（Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２００８）３；９：ｅ ３１６１）。

更に、本発明は、インビトロにおいてＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化させる方法であって、前記細胞と本明細書に記載する抗体又は抗体断片とを接触させる工程を含む方法を提供する。活性化型Ｔｒｅｇの抑制能を評価する方法は、（上記ＭＬＲに加えて）サイトカイン放出を介してエフェクターＴ細胞の活性化状態を判定するか、又はエフェクターＴ細胞において活性化マーカーを発現させるＭＬＲアッセイを含む（参照することにより本明細書に援用される国際公開第２００９／１１２５９２Ａ１号パンフレットに記載されている増殖及びサイトカインアッセイ等）。かかる方法は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を単離する第１の工程を含んでいてもよい。抗体を用いてかかる工程を行う場合、この抗体は、非競合ＣＤ４抗体（例えば、ＯＫＴ４又はＳＫ３）でなければならない。これによって、ＣＤ４における異なるエピトープに結合する本発明の抗体又は抗体断片を用いる主な工程において細胞を活性化させることが可能になる。別のシナリオでは、ＣＤ２５若しくはＣＤ３９等の、ＣＤ４とは異なるＴｒｅｇの他の表面発現マーカーを用いて、又はＣＤ１２７を介したネガティブセレクションによって細胞を単離してもよい。

本発明の抗体は、Ｔｒｅｇを刺激可能であることが既に知られており、これは、エフェクターＴ細胞との共培養により確認することができる。Ｔｒｅｇは、アロ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞によるＩＬ−２及びＩＦＮγの産生を阻害することにより、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖を抑制することができる。更に、予め活性化されているＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇは、抑制されているＣＤ８＋細胞を、再刺激してもＣＤ２５を発現できないようにすることが示されている（国際公開第２００９／１１２５９２号パンフレット）。

次に、以下の特定の実施形態に関連して本発明を更に説明する。

実施例１ ＢＴ０６１と複合体化しているＣＤ４の結晶構造
Ｘ線回折により、ＢＴ０６１ Ｆａｂ断片と複合体しているヒトＣＤ４の結晶構造を得た。

ＢＴ０６１（Ｆａｂ）：ＣＤ４の結晶化手順
以下の従来の方法を用いて組換えヒトＣＤ４を生成した：昆虫細胞で異種発現させるために、標準的な手順によりＣＤ４の様々なコンストラクトをベクターにクローニングし、次いで、ＮｉＮＴＡを用いて精製した。プロテアーゼパパインを用いてインタクトな抗体からＢＴ０６１のＦａｂ断片を切り出し、プロテインＡにより精製した。次いで、サイズ排除クロマトグラフィーによりＦａｂ断片を更に精製した。

精製タンパク質とモル過剰のＣＤ４とを混合することによりＣＤ４−Ｆａｂ複合体を形成し、サイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。

共結晶化方法により、ＣＤ４：ＢＴ０６１複合体の結晶を調製した。即ち、約１２００の異なる条件を用いた標準的なスクリーニング、及び文献データを用いて同定した結晶化条件の両方を使用する結晶化試験において、前記精製複合体を用いた。標準的なストラテジ、結晶化に重大な影響を与える系統的に変動するパラメータ、例えば、温度、タンパク質濃度、液滴比等を用いて、最初に得られた条件を最適化した。また、ｐＨ又は沈殿剤濃度を系統的に変動させることによりこれら条件を精密化した。

結晶を急速冷凍し、１００Ｋの温度で測定した。

低温条件を用いてＳＷＩＳＳ ＬＩＧＨＴ ＳＯＵＲＣＥ（ＳＬＳ，Ｖｉｌｌｉｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でＣＤ４：ＢＴ０６１複合体のＸ線回折データを収集した。構造を解析し、最終分解能を２．９Ａまで精密化した。

結晶は、非対称単位において２つの複合体と共に空間群Ｐ２１に属する。プログラムＸＤＳ及びＸＳＣＡＬＥを用いてデータを加工した。データ収集統計値を以下の表６に要約する。

分子置換により、構造を決定及び解析するために必要な位相情報を得た。ＣＤ４及びＦａｂ断片の公開モデルをサーチモデルとして用いた。

次いで、ソフトウェアパッケージＣＣＰ４及びＣＯＯＴを用い、標準的なプロトコールに従って、モデルの構築及び精密化を行った。（図３に示す通り）非対称単位は、２つのかかる複合体からなり、全体ＲＭＳ分解能は２．９Åである。

結晶構造では、ＣＤ４分子にシグナルペプチドは存在せず、ペプチド鎖は、Ｉｇ様Ｖ型ドメイン、Ｉｇ様Ｃ２型１ドメイン、及びＩｇ様Ｃ２型２ドメインの一部のみを含む。結晶構造中の正確な鎖は、図１に示されている通り、アミノ酸残基２６〜２５８に及ぶ。図１では、結晶構造によって表されないアミノ酸を点線枠で囲む。したがって、ＣＤ４分子は、最初の２つのジスルフィド架橋のみを有し、一方は、Ｃｙｓ_４１とＣｙｓ_１０９との間、他方は、Ｃｙｓ_１５５とＣｙｓ_１８４との間に存在する。

結晶構造における２つのＢＴ０６１単位の軽鎖は、図２Ａに示されている通り、一方の単位の１位〜２１５位、及び他方の単位の１位〜１８２位に及ぶ。ＢＴ０６１の軽鎖には、Ｃｙｓ_２３−Ｃｙｓ_９２及びＣｙｓ_１３８−Ｃｙｓ_１９８の２つのジスルフィド架橋が存在する。

結晶構造における２つのＢＴ０６１単位の重鎖は、図２Ｂに示されている通り、一方の単位の２位〜２１９位、及び他方の単位の２位〜２２０位に及ぶ。ＢＴ０６１の重鎖には２つのジスルフィド架橋が存在し、一方は、Ｃｙｓ_２２とＣｙｓ_９８との間、他方は、Ｃｙｓ_１５１とＣｙｓ_２０７との間である。

結晶構造の解析により、ＣＤ４の他の公知のリガンドとは対照的に、ＢＴ０６１の結合にはＩｇ様Ｃ２型１ドメインのみが関与していることが示された。これは、付録に示す結晶構造によって表される完全に新規な結合様式を構成している。

図３に示す通り、ＢＴ０６１は、ＣＤ４のＮ−末端ドメインには結合しないが、（図４及び５に示す通り）ＢＴ０６１と、クラスＩＩ ＭＨＣ分子又はｇｐ１２０ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質とが同時に結合する可能性はある。

結晶構造を詳細に解析することにより、ＣＤ４及びＢＴ０６１の両方のアミノ酸が相互作用していることが明らかになった。距離の基準に基づいて選択を行った。結晶構造の分解能を考慮して、ＢＴ０６１のアミノ酸の任意の非水素原子の周囲、球半径ｄ＝４．５Å以内に非水素原子を有する全てのＣＤ４アミノ酸を相互作用パートナーとして選択した。半径ｄは、非結合相互作用の典型的な距離３Åに結晶構造分解能２．９Åの半分を加えたものとして選択した（ｄ＝３Å＋１／２×２．９Å＝４．４５Å）。

したがって、結晶構造は、図７に示す通り、ＣＤ４の表面上の結合部位が、７つの保存アミノ酸（Ｇｌｙ_１４８〜Ｇｌｎ_１５４）のクラスタ、６つの保存アミノ酸（Ｇｌｎ_６４〜Ｔｈｒ_１６８）のクラスタに加えて、Ｔｈｒ_１８５、Ｌｅｕ_１８７、Ａｓｎ_１８９、Ｇｌｎ_１９０、及びＬｙｓ_１９２からなることを示す。

表７は、ＣＤ４とＢＴ０６１との相互作用パートナーのマトリクスを示す。純粋な１：１の相互作用は僅かしか存在せず、列記したＣＤ４及びＢＴ０６１のアミノ酸のうちの大部分は、１超のパートナーと相互作用する。この相互作用は、主に水素結合であり、ファンデルワールス力及び極性相互作用により補われる。

表７の上段に、ＢＴ０６１のアミノ酸と相互作用するＣＤ４のアミノ酸を示す。左端に、ＣＤ４と相互作用するＢＴ０６１のアミノ酸を示す。各「Ｘ」は、少なくとも１つの相互作用に対応する。１：１で相互作用する対は僅かしか存在しないので、複数の列又は行に広がるパターンがみられる。ＣＤ４のＳｅｒ_１５０及びＰｒｏ_１５１は、ＢＴ０６１の軽鎖及び重鎖の両方と相互作用する。Ｖａｌ_１８６は、ＢＴ０６１重鎖のＴｙｒ_１０５の結合ポケットの重要な部分であるが、ここには記載していない。その理由は、ＢＴ０６１のアミノ酸と直接相互作用している訳ではないためである。同定されている相互作用は、全て、水素結合、極性相互作用、ファンデルワールス接触、又はこれらの種類の相互作用の組み合わせのいずれかである。相互作用するアミノ酸の同定は、付録に示す結晶構造に基づいている。他の分子パートナーの非水素原子に対してｄ＝４．５Åよりも近い距離に少なくとも１つの非水素結合を有する全てのアミノ酸を考慮して、距離の基準を適用した。概略を述べると、ｄは、非共有相互作用の典型的な距離である３Åに結晶構造の全体の分解能（２．９Å）の半分を加えたものに対応する。

図７は、相対配向の概略図としてＢＴ０６１の結合部位のＣＤ４アミノ酸を示す。上述の距離の基準を直接満たすアミノ酸に加えて、多数のアミノ酸が、ＢＴ０６１及びＣＤ４の両方の立体構造を少し変化させることによりＢＴ０６１との更なる相互作用に利用可能になる。これらアミノ酸、Ａｒｇ_１５６、Ｇｌｎ_１８８、Ａｓｎ_１８９、Ｇｌｎ_１９０、及びＬｙｓ_１９２は、ＣＤ４のシグナル伝達機序に関与している可能性がある。

ＢＴ０６１は、ＣＤ４に対して軽鎖及び重鎖の両方で結合する。軽鎖の各アミノ酸を図８に示す。ＣＤ４に対する結合に関与している重鎖のアミノ酸を図９に示す。

ＢＴ０６１重鎖のＴｒｙ_１０５は、ＣＤ４との相互作用にとって非常に重要な役割を果たす。その側鎖は、ＣＤ４の表面上のポケットに完全に適合する（図１０）。

塩橋は、抗体間の相互作用の典型的な要素であるにも関わらず、結晶構造中にはＣＤ４とＢＴ０６１との間の塩橋が存在しない。興味深いことに、ＢＴ０６１は、多数の分子内塩橋を示す。これらのうちの１つは、Ａｒｇ_１０４とＡｓｐ_１０６との間に形成され、ＣＤ４の表面上のポケットと極性相互作用する（図１１）。分子内塩橋の形成は、バッファ活性を有する基質に影響を受ける場合があり、これは、次いで、ＢＴ０６１の立体構造の変化及びＣＤ４との複合体化を誘導することができるので、ＣＤ４のシグナル伝達に寄与する。

ＣＤ４との相互作用にとって非常に重要な他の残基は、ＢＴ０６１軽鎖のＴｒｙ_３４である。重鎖のＴｙｒ_１０５と同様に、Ｔｙｒ_３４はＣＤ４の表面上のポケット内に収容される（図１２）。

ＣＤ４とＢＴ０６１との複合体の結晶構造を、ＣＤ４とクラスＩＩ ＭＨＣ分子との複合体、及びＣＤ４とｇｐ１２０ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質との複合体の立体構造と比較すると、ＢＴ０６１が、ＣＤ４表面の完全に異なる部分に結合していることが直ちに分かる。ＣＤ４の他のリガンドに対して、ＢＴ０６１はＣＤ４の細胞外部分の反対側に結合し（図４及び５）、他のリガンドの結合部位には干渉しない。

以下の表８に示す通り、ＢＴ０６１の電荷補償アミノ酸との更なる相互作用に、ＣＤ４のアミノ酸Ｌｙｓ_２６、Ａｒｇ_１５６、Ｌｙｓ_１６１、及びＬｙｓ_１９２が利用可能である。

表８の上段に、ＢＴ０６１のアミノ酸と塩橋を形成することができるＣＤ４のアミノ酸を示す。左端に、ＢＴ０６１の塩橋パートナーである可能性のあるアミノ酸を示す。各「Ｘ」は、塩橋可能であることを示す。示されている対は、上記ｄ＝４．５Åという距離の基準を満たしてはいない。しかし、ＣＤ４及びＢＴ０６１の立体構造を少し変化させることにより、示されている塩橋が形成される場合がある。ＢＴ０６１では、配列のシフトは、軽鎖のＳｅｒ_５６〜Ｇｌｙ_６８、並びに重鎖のＳｅｒ_２５〜Ｃｙｓ_３２、及びＳｅｒ_５２〜Ｇｌｙ_５９に及び、これらはＣＤ４のＡｓｐ_３１及びＧｌｕ_５６と塩橋を形成することができる。

実施例２ ＢＴ０６１の突然変異体の作製及び試験
ＤＮＡ操作及び抗体産生の標準的な技術を用いて、ＢＴ０６１の可変ドメインをコードしているヌクレオチド配列に特定の突然変異を導入し、突然変異型アミノ酸配列、延いては、抗体又は抗体断片を発現させることにより、ＢＴ０６１可変ドメイン突然変異体を製造した。

以下のＢＴ０６１変異体を作製した：
（１）６つのＣＤＲ全てにそれぞれ１つずつ突然変異を有する６つの変異体：軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３における突然変異は、それぞれＧ３３Ａ、Ａ５５Ｇ、及びＬ９８Ｉであり；重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３における突然変異は、それぞれＲ３３Ｋ、Ａ６３Ｇ、及びＳ１０１Ｔである；
（２）１つの可変ドメインに２つの突然変異を有する１つの変異体：重鎖可変ドメインにおけるＲ３３Ｋ及びＡ６３Ｇ；
（３）重鎖及び軽鎖の両方の平行突然変異を有する３つの変異体（例えば、（１）に記載の重鎖及び軽鎖の変異体の組み合わせ）：軽鎖Ｌ９８Ｉと重鎖Ｒ３３Ｋ；軽鎖Ａ５５Ｇと重鎖Ｒ３３Ｋ；及び軽鎖Ｇ３３Ａと重鎖Ｒ３３Ｋ。

ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化させるＢＴ０６１変異体の能力をインビトロアッセイによって判定した。ＣＤ４に結合しない抗体をネガティブコントロールとして用いた。また、このアミノ酸がＢＴ０６１の結合に重要であると予測された実施例１で得られた結果に基づいて、重鎖ＣＤＲ３に突然変異（Ｙ１０５Ｗ）を有するＢＴ０６１変異体もネガティブコントロールとして作製した。ポジティブコントロールとして、軽鎖及び重鎖のマスター配列から産生した抗体、及び臨床試験用に産生されたＢＴ０６１のサンプルを用いた。

インビトロアッセイ：
抗体ＢＴ０６１の変異体による、健常ドナー由来のＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制能の誘導を、アロ反応性混合リンパ球反応（間接的共培養）において評価した。

ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を第１のドナー（ドナーＡ）から新たに単離した。密度勾配遠心分離により、ＥＤＴＡ−血液からＰＢＭＣを得た。既に記載されている通り（Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ｊｕｌ １５；１７９（２）：１３２２−３０）、Ｔｒｅｇ、レスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ）、及びＡＰＣをＰＢＭＣから免疫学的に分離した。プレートに結合している抗体と共にＴｒｅｇを２日間プレインキュベートした、又はプレートに結合している抗体無しでＴｒｅｇを２日間プレインキュベートした。既に記載されている通り（Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，２００７）、６色フローサイトメトリーによりＴｒｅｇの数及び表現型を決定した。Ｔ細胞が枯渇し且つ照射を受けたＰＢＭＣ（第１のドナーＡ）の存在下で、プレインキュベートしたＴｒｅｇをレスポンダーＴ細胞（第２のドナーＢ）に移した。刺激後、［^３Ｈ］チミジンを添加し、５日間後にレスポンダーＴ細胞の増殖を測定した。

結果：
インビトロアッセイの結果を以下の表９に示す。レスポンダーＴ細胞による阻害率を各変異体につき３回ずつ測定し、平均した。

予測通り、ＬＣマスターＨＣ Ｙ１０５Ｗのノックアウト突然変異体は、ＣＤ４には結合せず、制御性Ｔ細胞を活性化させることはできなかった。更に、この結果は、重鎖内の単一位置が、少なくとも表５に記載される置換（活性が保持されている単一変異体ＨＣ Ｒ３３Ｋ、Ａ６３Ｇ；及び二重変異体ＨＣ Ｒ３３Ｋ及びＡ６３Ｇ）に従って突然変異し得ることを示す。更に、結晶構造に関する研究から予測された通り、ループを形成する軽鎖におけるＴｒｙ_３４の周囲の残基が、結合にとって重要であると考えられる。

付録

Claims (20)

1. ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化可能な抗体又は抗体断片であって、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に対応する下記軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に対応する下記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３とを含み、
   （ｉ）Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、又はＡｓｎ２４；Ａｌａ、又はＧｌｙ２５；Ｓｅｒ、又はＴｈｒ２６；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＧｌｕ２７；Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、又はＰｒｏ２８；Ｖａｌ、Ａｌａ、又はＩｌｅ２９；Ｓｅｒ３０；Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＡｓｐ３１；Ｓｅｒ３２；Ｇｌｙ３３；Ｔｙｒ３４；Ｓｅｒ３５；Ｔｙｒ３６；Ｉｌｅ、Ｖａｌ、又はＬｅｕ３７；及びＴｙｒ３８からなる軽鎖ＣＤＲ１、
   （ｉｉ）Ｌｅｕ５４；Ａｌａ５５；Ｓｅｒ５６；Ｉｌｅ５７；Ｌｅｕ５８；Ｇｌｕ５９；及びＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、又はＡｓｐ６０からなる軽鎖ＣＤＲ２、
   （ｉｉｉ）Ｇｌｎ９３；Ｈｉｓ９４；Ｓｅｒ９５；Ａｒｇ、又はＬｙｓ９６；Ｇｌｕ、Ａｓｐ、又はＡｒｇ９７；Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、又はＩｌｅ９８；Ｐｒｏ９９；Ｔｒｐ１００；及びＴｈｒ、又はＳｅｒ１０１からなる軽鎖ＣＤＲ３、
   （ｉｖ）Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、又はＴｙｒ３１；Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、又はＶａｌ３２；Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＧｌｕ３３；Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、又はＶａｌ３４；及びＴｙｒ３５からなる重鎖ＣＤＲ１、
   （ｖ）Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、又はＧｌｙ５１；Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、又はＴｈｒ５２；Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、又はＩｌｅ５３；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＴｙｒ５４；Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、又はＧｌｕ５５；Ｇｌｕ、Ａｓｐ、又はＡｒｇ５６；Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、又はＧｌｕ５７；Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓ５８；Ｇｌｙ、又はＳｅｒ５９；Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒ６０；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＡｓｐ６１；Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、又はＨｉｓ６２；Ａｌａ、Ｇｌｙ、又はＳｅｒ６３；Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、又はＡｒｇ６４；Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、又はＡｓｎ６５；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＧｌｙ６６；Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、又はＧｌｕ６７；及びＧｌｙ６８からなる重鎖ＣＤＲ２、
   （ｖｉ）Ｓｅｒ１０１；Ｔｙｒ１０２；Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、又はＨｉｓ１０３；Ａｒｇ１０４；Ｔｙｒ１０５；Ａｓｐ１０６；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、又はＧｌｕ１０７；Ｇｌｙ、又はＡｌａ１０８；Ａｌａ、又はＳｅｒ１０９；Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、又はＴｙｒ１１０；Ｐｈｅ１１１；Ａｌａ、又はＳｅｒ１１２；及びＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、又はＡｓｎ１１３からなる重鎖ＣＤＲ３、
   前記抗体又は抗体断片が、ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の全ては含まないことを特徴とする抗体又は抗体断片。
2. ＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ３に由来する配列ＹＹＲＹＤを含む請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
3. 抗体又は抗体断片が、Ｔｙｒ５３又はＰｈｅ５３を含む軽鎖、及びＳｅｒ２８を含む重鎖の少なくともいずれかを含む請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
4. 抗体又は抗体断片が、Ａｓｐ６４を含有する軽鎖を含む請求項１又は３に記載の抗体又は抗体断片。
5. 抗体又は抗体断片が、Ｇｌｕ５６を含有する重鎖を含む請求項１、３、又は４に記載の抗体又は抗体断片。
6. 下記（ａ）又は（ｂ）のＣＤＲ配列を含む請求項１及び３から５のいずれかに記載の抗体又は抗体断片：
   （ａ）以下の単一アミノ酸置換を含むＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ配列及びＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ配列：
   （ｉ）重鎖におけるＡ６３Ｇ；
   （ｉｉ）重鎖におけるＲ３３Ｋ；又は
   （ｉｉｉ）軽鎖におけるＬ９８Ｉ；
   （ｂ）以下の二重アミノ酸置換を含むＢＴ０６１軽鎖のＣＤＲ配列及びＢＴ０６１重鎖のＣＤＲ配列：
   （ｉｖ）重鎖におけるＲ３３Ｋ及びＡ６３Ｇ；又は
   （ｖ）軽鎖におけるＬ９８Ｉ及び重鎖におけるＲ３３Ｋ。
7. ＢＴ０６１重鎖及びＢＴ０６１軽鎖の残りの可変ドメイン配列を更に含む請求項６に記載の抗体又は抗体断片。
8. ＣＤ６４に結合可能なＦｃ受容体を更に含む請求項１から７のいずれかに記載の抗体又は抗体断片。
9. 抗体が、ＩｇＧ抗体である請求項１から８のいずれかに記載の抗体。
10. 請求項１から９のいずれかに記載の抗体又は抗体断片をコードしていることを特徴とする核酸。
11. 請求項１０に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。
12. 請求項１０に記載の核酸又は請求項１１に記載のベクターを含むことを特徴とするホスト細胞又はハイブリドーマ。
13. 請求項１から９のいずれかに記載の抗体又は抗体断片を産生する方法であって、前記抗体又は抗体断片を発現させる条件下で培養培地中にて請求項１２に記載のホスト細胞を培養し、前記培養培地から前記抗体又は抗体断片を分離する工程を含むことを特徴とする方法。
14. 請求項１から９のいずれかに記載の抗体又は抗体断片を含み、薬学的に許容し得る担体を更に含むことを特徴とする医薬組成物。
15. 標識を更に含む請求項１から９のいずれかに記載の抗体又は抗体断片。
16. ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化させるためのインビトロにおける方法であって、前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞と請求項１から９のいずれかに記載の抗体又は抗体断片とを接触させることを含むことを特徴とする方法。
17. 自己免疫疾患又は移植拒絶の治療のための医薬であって、請求項１から９のいずれかに記載の抗体又は抗体断片を有効成分として含むことを特徴とする医薬。
18. インビトロにおいてＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化させるため又は同定するための請求項１から９のいずれかに記載の抗体又は抗体断片の使用。
19. サンプル中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の存在をスクリーニングする方法であって、請求項１５に記載の標識抗体又は標識抗体断片と前記サンプルとを接触させ、前記サンプルを洗浄して結合していない抗体を除去し、前記サンプル中の前記標識の存在を検出する工程を含むことを特徴とする方法。
20. 請求項１から９のいずれかに記載の抗体又は抗体断片でコーティングされた磁気ビーズと、第２の抗ＣＤ４抗体又は抗ＣＤ２５抗体とを含むことを特徴とするＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を単離するためのキット。