ES2884267T3

ES2884267T3 - Polipéptidos dirigidos a la fusión con el vih

Info

Publication number: ES2884267T3
Application number: ES16718817T
Authority: ES
Inventors: Mark Krystal; David Wensel; Jonathan Davis
Original assignee: ViiV Healthcare UK No 5 Ltd
Current assignee: ViiV Healthcare UK No 5 Ltd
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2016-04-14
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2036-04-14
Also published as: SG11201708441RA; US11155602B2; JP7465378B2; WO2016171980A1; JP2023055875A; JP6894846B2; CO2017011583A2; JP2018516247A; CN107922474A; EP3286212B1; CL2017002687A1; EA035332B1; TW201643185A; KR20170138558A; AU2016252008A1; IL255122A0; CR20170482A; EP3286212A1; EA201792269A1; MX2017013687A

Abstract

Un polipéptido que comprende dos dominios activos, en donde un dominio es una proteína adnectina anti-CD4, en donde la proteína adnectina anti-CD4 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 95-114 y el otro dominio es una porción inhibidora peptídica de la fusión con el VIH en donde el inhibidor peptídico de la fusión con el VIH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 372-392.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos dirigidos a la fusión con el vih

Campo de la invención

La invención se refiere a polipéptidos que comprenden una porción de unión a CD4, una porción de unión a gp41, una porción inhibidora peptídica de la fusión con el VIH y combinaciones de estas. Más específicamente, la presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden una proteína del dominio de soporte a base de fibronectina que se fija a CD4, una proteína del dominio de soporte a base de fibronectina que se fija al dominio N17 de gp41 y un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH, o combinaciones de estos. La invención también se refiere al uso de las proteínas innovadoras en aplicaciones terapéuticas para tratar el VIH.

Antecedentes de la invención

El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es el resultado de la infección por el retrovirus conocido como virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Sigue siendo un problema médico de gran magnitud, y los cálculos indican que hacia fines de 2013 había 35 millones de personas infectadas a nivel mundial. Durante ese año, hubo 2,1 millones de infecciones nuevas, y 1,5 millones de personas murieron por complicaciones debidas al SIDA.

La terapia actual para individuos infectados con VIH consiste en una combinación de agentes antirretrovirales aprobados. Actualmente, hay más de dos docenas de fármacos aprobados para tratar la infección por VIH, ya sea como agentes únicos, como combinaciones de dosis fijas o regímenes de comprimido único. Los últimos dos contienen de 2 a 4 agentes aprobados. Estos agentes pertenecen a una cantidad de clases diferentes y se dirigen a una enzima viral o a la función de una proteína vírica durante el ciclo de vida del virus. Por lo tanto, los agentes se clasifican en inhibidores nucleótidos de la transcriptasa inversa (NRTI), inhibidores no nucleótidos de la transcriptasa inversa (NNRTI), inhibidores de la proteasa (PI), inhibidores de la integrasa (INI) o inhibidores de la entrada (uno de los inhibidores de la entrada, maraviroc, se dirige a la proteína CCR5 huésped, y el otro, enfuvirtide, es un péptido que se dirige a la región gp41 de la proteína gp160 viral). Además, se aprobó un potenciador farmacocinético sin actividad antiviral (cobicistat) para usar en combinación con agentes antirretrovirales (ARV) que requieren refuerzo.

Pese al arsenal terapéutico de combinaciones de agentes y fármacos, sigue existiendo la necesidad médica de hallar nuevos agentes antirretrovirales, debido en parte a que se necesitan dosis crónicas para combatir la infección. Se documentaron problemas significativos en relación con toxicidades a largo plazo, lo que generó la necesidad de tratar y prevenir estas comorbilidades (por ejemplo, enfermedad del SNC, cardiovascular/metabólica, renal). Además, los crecientes índices de fracaso en las terapias actuales continúan siendo un problema, debido a la presencia o el surgimiento de cepas resistentes o la falta de cumplimiento atribuida a períodos de descanso del fármaco o efectos secundarios adversos. Por ejemplo, a pesar del tratamiento, se estimó que el 63% de los sujetos que recibieron tratamiento conjunto permanecieron virémicos, dado que tenían cargas virales >500 copias/ml (Oette, M, Kaiser, R, Daumer, M, et al. Primary HIV Drug Resistance and Efficacy of First-Line Antiretroviral Therapy Guided by Resistance Testing. J Acq Imm Def Synd 2006; 41 (5):573-581). De estos pacientes, el 76% tenía virus que eran resistentes a una o más clases de agentes antirretrovirales. Como resultado, se necesitan nuevos fármacos que sean más convenientes, tengan grandes barreras genéticas contra el desarrollo de la resistencia y una mejor seguridad sobre los agentes actuales.

En la actualidad, se conoce que el VIH puede infectar células a través de un proceso mediante el cual ocurre una fusión entre la membrana celular y la membrana viral. El modelo generalmente aceptado de este proceso consiste en que el complejo de glucoproteínas de envoltura viral (gp120/gp41) interactúa con los receptores de la superficie celular en las membranas de las células diana. Después de la unión de gp120 a receptores celulares (por ejemplo, CD4 en combinación con un correceptor de quimiocina, tal como CCR5 o CXCR4), se induce un cambio en la conformación del complejo gp120/gp41 que permite que gp41 se inserte en la membrana de la célula diana y medie la fusión de membranas. Dado que estos procesos de entrada ocurren en la membrana celular, se encuentran susceptibles a la inhibición por parte de macromoléculas, que incluyen péptidos biológicos (Haqqani y Tilton, Antiviral Res.2013; 98:158). Por ejemplo, el péptido antiviral aprobado enfuvirtide (Fuzeon®) se dirige a una región de gp41 que participa de la fusión de membranas. Los polipéptidos de mayor tamaño, tales como los anticuerpos monoclonales, también pueden inhibir distintos aspectos de la entrada de virus. Un anticuerpo monoclonal que se dirige a la primera etapa de entrada de virus, la interacción con el receptor celular CD4 (ibalizumab; Bruno y Jacobson, J. Antimicrob. Chemother. 2010; 65:1839), así como un anticuerpo monoclonal que se dirige al correceptor CCR5 (PRO-140; Tenorio, Curr. HIV/AIDS Rep.2011; 8:1) demostraron resultados positivos en los ensayos de fase 2a. Estos anticuerpos también tienen la propiedad de ser antirretrovirales de acción prolongada, con regímenes de dosificación potenciales semanales a mensuales (Jacobson et al. J. Infect. Dis.

2010; 201:1481; Jacobson et al. Antimicrob. Agents Chemother 2009; 53:450).

Otra propiedad de los inhibidores peptídicos de la entrada es que se puede obtener una potencia mejorada o sinérgica si dos inhibidores peptídicos están unidos entre sí, o si un solo inhibidor se localiza cerca del sitio de acción a través de la unión a biomoléculas de la membrana. Por lo tanto, la unión de un inhibidor peptídico de la fusión a un anticuerpo monoclonal que se dirige a CCR5 (Kopetzki et al. Virol. J.2008; 5:56) o la unión de una porción de colesterol al terminal C de un inhibidor peptídico de la fusión para colocarse en la superficie de la membrana de la célula diana (Ingallinela et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 2009; 106:5801; Augusto et al. J. Antimicrob. Chemother. 2014; 69:1286) aumentan drásticamente la potencia de la molécula combinada en comparación con las moléculas por separado. De manera similar, los anticuerpos biespecíficos que consisten en fragmentos de anticuerpo neutralizante anti-VIH-1 que se dirigen a gp120 fusionados a ibalizumab mostraron aumentos sinérgicos de la potencia en comparación con los inhibidores individuales (Sun et al. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2014; 66:473). Las moléculas de combinectina de la invención aprovechan estas diversas propiedades.

El documento WO2011/077093 describe inhibidores de fusión de virus o inhibidores de entrada de virus que son moléculas bivalentes que comprenden una primera parte capaz de simular la función de un receptor en una célula de un mamífero, y una segunda parte capz de unirse a un virus, preferiblemente VIH.

Breve exposición de la invención

La invención se refiere a polipéptidos que comprenden una porción de unión a CD4, una porción de unión a gp41, una porción inhibidora peptídica de la fusión con el VIH y combinaciones de estas.

Una realización de la invención se refiere a polipéptidos que comprenden una proteína del dominio de soporte a base de fibronectina que se une a CD4, una proteína del dominio de soporte a base de fibronectina que se une al dominio N17 de gp41 y un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH.

En una realización de la invención, los tres dominios se conectan entre sí mediante conectores. En otra realización de la invención, los tres dominios pueden conectarse entre sí en cualquier orden. En otra realización de la descripción, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones noconectoras de SEQ ID NO: 3, 5, 7 o 9.

La divulgación también se refiere a polipéptidos que comprenden una proteína del dominio de soporte a base de fibronectina que se une a CD4 y una proteína del dominio de soporte a base de fibronectina que se une al dominio N17 de gp41. En una realización de la divulgación, los dos dominios se conectan entre sí mediante conectores. En otra realización de la divulgación, los dos dominios pueden conectarse entre sí en cualquier orden.

La invención también está dirigida a polipéptidos que comprenden una proteína del dominio de soporte a base de fibronectina que se une a CD4 y un inhibidor del péptido de fusión con el VIH. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido que comprende dos dominios activos en el que un dominio es una proteína adnectina anti-CD4, en el que la proteína adnectina anti-CD4 comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 95-114 y el otro dominio es una porción de inhibidor peptídico de la fusión con el VIH en el que el inhibidor peptídico de fusión con el VIH comprende una secuencias de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 372-392.

En una realización de la invención, los dos dominios se conectan entre sí por conectores. En otra realización de la invención, los dos dominios se pueden conectar en cualquier orden.

La divulgación unefusión con el VIHconectorestambién se refiere a polipéptidos que comprenden una proteína del dominio de soporte a base de fibronectina que se une al dominio N17 de gp41 y un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH. En una realización de la divulgación, los dos dominios se conectan entre sí mediante conectores. En otra realización de la divulgación, los dos dominios pueden conectarse entre sí en cualquier orden. En otra realización de la divulgación, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones no conectoras de SEQ ID NO: 410-428.

Otra realización de la invención también se refiere a polipéptidos que comprenden tres dominios activos, una proteína del dominio de soporte a base de fibronectina que se une a CD4, una porción de unión a gp41 y una porción inhibidora peptídica de la fusión con el VIH. La invención también se refiere a polipéptidos que comprenden una proteína del dominio de soporte a base de fibronectina que se une a gp41, una porción de unión a CD4 y una porción inhibidora peptídica de la fusión con el VIH. La invención también se refiere a polipéptidos que comprenden una porción de unión a CD4, una porción de unión a gp41 y un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido que comprende tres dominios activos en el que un dominio es una proteína adnectina anti-CD4, en el que la proteína adnectina anti-CD4 comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 95-114, un segundo dominio es una proteína Adnectina anti-N17, en el que la proteína Adnectina anti-N17 comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 115-371, y el tercer dominio es un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH en el que el inhibidor peptídico de la fusión con el VIH comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 372-392.

En una realización de la invención, los tres dominios se conectan entre sí mediante conectores. En otra realización de la invención, los tres dominios pueden conectarse entre sí en cualquier orden.

La divulgación también se refiere a polipéptidos que comprenden dos dominios activos, una proteína del dominio de soporte a base de fibronectina que se une a CD4 y una porción de unión a gp41. La divulgación también se refiere a polipéptidos que comprenden una proteína del dominio de soporte a base de fibronectina que se une a gp41 y una porción de unión a CD4. La invención también se refiere a polipéptidos que comprenden una porción de unión a CD4 y un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH. Esta divulgación también se refiere a polipéptidos que comprenden una porción de unión a gp41 y un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH. En una realización de la divulgación, los dos dominios se conectan entre sí mediante conectores. En otra realización de la invención, los dos dominios pueden conectarse entre sí en cualquier orden.

Otra realización de la invención también se refiere a adnectina anti-CD4, adnectina anti-N17 e inhibidores peptídicos de la fusión con el VIH. En otra realización de la invención, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones no conectoras de SEQ ID NO: 95 114 o SEQ ID NO: 115-371 o SEQ ID NO: 372-392, respectivamente.

En otra realización de la invención, una porción farmacocinética (PK) está unida a los polipéptidos de la invención. Los ejemplos de una porción PK incluyen, entre otros, polietilenglicol, ácido siálico, Fc, fragmento Fc, transferrina, albúmina de suero (HSA), una proteína de unión a albúmina de suero y una proteína de unión a inmunoglobulina de suero. En una realización de la invención, la porción PK puede estar unida a las regiones conectoras o al extremo N o C del polipéptido de la invención. En otra realización de la divulgación, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones no conectoras de SEQ ID NO: 4, 6, 8 o 10.

La divulgación también se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las secuencias que se muestran en SEQ ID NO: 3 - 10.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende uno o más de los polipéptidos de la invención y un portador.

La divulgación también proporciona un método para tratar el VIH en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de los polipéptidos de la invención.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona el polipéptido de la invención para uso en terapia. En otro aspecto adicional de la invención, se proporciona el polipéptido de la invención para uso en el tratamiento del VIH.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un diagrama de combinectinas alternativas. Una de las adnectinas se une a CD4, una segunda adnectina se une a la región HR1 de gp41. El péptido también se une en la región HR1 de gp41. Los distintos componentes de combinectina se conectan entre sí en cualquier orden mediante conectores. Cualquiera de las combinectinas puede tener una porción PK unida, tal como HSA o Fc.

La Figura 2 muestra las secuencias de aminoácidos de la fusión Fc-combinectina 3137(SEQ ID NO:4), 3151(SEQ ID NO:6) y la fusión albúmina de suero humano (HSA)-combinectina 3191 (SEQ ID NO:8) y 3202(SEQ iD NO:10). Las secuencias de Fc y HSA aparecen en negrita. Las secuencias de adnectina anti-CD4 están subrayadas. Las secuencias de adnectina anti-N17 tienen subrayado doble. Las secuencias de péptidos inhibidores de VIH están subrayadas y en negrita. Las secuencias de los conectores aparecen en cursiva.

La Figura 3 muestra la potencia (EC⁵⁰y EC⁹⁰) de las combinectinas 3137, 3151,3191 y 3202, como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 4 muestra las propiedades PK de las combinectinas 3137, 3151, 3191 y 3202, como se describe en el Ejemplo 3.

La Figura 5 muestra las secuencias de aminoácidos de adnectina anti-N17 en combinación con un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH, que corresponde a las secuencias descritas en la Tabla 4 sin las regiones extendidas en el extremo N y en el extremo C. Las secuencias de adnectina anti-N17 tienen subrayado doble. Las secuencias de inhibidores peptídicos de la fusión con el VIH están subrayadas y en negrita. Las secuencias de conectores aparecen en cursiva.

La Figura 6 muestra el WebLogo para el bucle CD de adnectina anti-CD4. Weblogo genera logos de secuencias, representaciones gráficas de los patrones dentro de un alineamiento de múltiples secuencias. Cada logo consiste en pilas de letras, con una pila para cada posición en la secuencia. La altura total de cada pila indica la conservación de las secuencias en esa posición (medida en bits), mientras que la altura de los símbolos dentro de la pila refleja la frecuencia relativa del aminoácido o ácido nucleico correspondientes en esa posición (Crooks GE et. al., WebLogo: A sequence logo generator, Genome Research, 14:1188-1190, (2004)).

La Figura 7 muestra el WebLogo para el bucle FG de adnectina anti-CD4 (Schneider TD, Stephens RM. 1990. Sequence Logos: A New Way to Display Consensus Sequences, Nucleic Acids Res. 18:6097-6100).

La Figura 8 muestra los datos de las mutaciones puntuales para el inhibidor peptídico de la fusión con el VIH. El ácido aspártico (D) cerca del extremo C del inhibidor peptídico de la fusión con el VIH se sustituyó por los aminoácidos enumerados a lo largo del eje x.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se usan en este documento tienen el mismo significado que le otorga habitualmente un experto de nivel medio en la técnica. Si bien se puede usar cualquier método y composición similares o equivalentes a los descritos en este documentopara poner en práctica o probar la presente invención, se prefieren los métodos y las composiciones descritos en este documento.

Como se usa en este documento, “polipéptido” se refiere a cualquier secuencia de dos o más aminoácidos, independientemente de la longitud, la modificación posterior a la traducción o la función. “Polipéptido”, “péptido" y “proteína” se usan de manera indistinta en este documento. Los polipéptidos se pueden modificar de varias maneras químicas estándares (por ejemplo, un aminoácido se puede modificar con un grupo protector; el aminoácido del extremo carboxi terminal se puede convertir en un grupo amido terminal; el resto del extremo amino terminal se puede modificar con grupos para mejorar, por ejemplo, la lipofiliia; o el polipéptido se puede glicosilar químicamente o modificar de otro modo para aumentar la estabilidad o la semivida in vivo). Las modificaciones de los polipéptidos pueden incluir la unión de otra estructura, tal como un compuesto cíclico u otra molécula al polipéptido y también pueden incluir polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos en una configuración alterada (es decir, R o S; o L o D).

Los péptidos de la invención pueden incluir, por ejemplo, proteínas derivadas del décimo dominio de tipo III de fibronectina que se han modificado para unirse a CD4 o al dominio N17 de gp41 y, en este documento, se denominan "adnectina anti-CD4", “adnectina anti-N17”, "adnectina CD4" o “adnectina gp41”. Los polipéptidos de la invención también pueden incluir péptidos modelados según la segunda región de repetición de siete aminoácidos, o repetición en heptada 2, (HR2) de la glicoproteína gp41 de envoltura de VIH, que inhiben la fusión mediante la unión a la región de repetición en héptada 1 (HR1) de gp41 y, en este documento, se denominan “inhibidor peptídico de la fusión con el VIH” o “inhibidor peptídico de la fusión”. Los polipéptidos de la invención también incluyen “combinectinas” que comprenden una adnectina anti-CD4 conectada a una adnectina anti-N17 conectada a un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH (Figura 1). De manera alternativa, la combinectina comprende una adnectina anti-CD4 conectada a una adnectina anti-N17 o una adnectina anti-N17 conectada a un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH o una adnectina anti-CD4 conectada a un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH.

Como se usa en este documento, una "cadena de polipéptidos" se refiere a un polipéptido en donde cada uno de los dominios se une a otros dominios mediante enlaces peptídicos, a diferencia de las interacciones no covalentes o los puentes de disulfuro.

Un polipéptido “aislado” es aquel que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían en usos terapéuticos o de diagnóstico para el polipéptido, y pueden incluir proteínas recombinantes de células huésped y otros solutos proteicos o no proteicos. En una realización, los polipéptidos se purificarán (1) hasta obtener más de 95% en peso de polipéptido según se determina mediante el método de Lowry y, lo más preferiblemente, más de 99% en peso, o (2) hasta alcanzar homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o tinción de plata. En general, el polipéptido aislado se puede preparar mediante al menos una etapa de purificación.

En este documento, “porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata, que son idénticos a los restos de aminoácidos en una secuencia seleccionada, después de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, sin tener en cuenta ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de varias maneras conocidas por los expertos de nivel medio en la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible para el público, tal como el software BLAST, BLAST-2, Al IGN, Al IGN-2 o Megalign (DNASTAR™). Los expertos de nivel medio en la técnica pueden determinar con facilidad los parámetros adecuados para medir el alineamiento, incluido cualquier algoritmo necesario para lograr el alineamiento máximo sobre la longitud total de las secuencias que se comparan. Por ejemplo, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A determinada para, con o contra una secuencia de aminoácidos B determinada (que, alternativamente, se puede parafrasear como una secuencia de aminoácidos A determinada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos para, con o contra una secuencia de aminoácidos B determinada) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y, en donde X es la cantidad de restos de aminoácidos clasificados como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en el alineamiento de A y B de ese programa, y en donde Y es la cantidad total de restos de aminoácidos en B. Se tendrá en cuenta que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el% de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A.

Como se usa en este documento, "sustitución conservadora" indica el reemplazo de un resto de aminoácido por otro sin alterar la conformación y función generales del péptido, lo que incluye, por ejemplo, el reemplazo de un aminoácido por uno con propiedades similares (por ejemplo, polaridad, potencial de unión al hidrógeno, acidez, alcalinidad, forma, hidrofobicidad, aromaticidad y similares). Los aminoácidos con propiedades similares son conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, la arginina, histidina y lisina son aminoácidos hidrófilos básicos y pueden ser intercambiables. De manera similar, la isoleucina, un aminoácido hidrófobo, puede ser reemplazada por leucina, metionina o valina. Los aminoácidos hidrófilos neutros, que se pueden sustituir entre sí, incluyen asparagina, glutamina, serina y treonina. En la presente invención, "sustituido"' o "modificado" significan que se incluyen los aminoácidos que se alteraron o modificaron de aminoácidos naturales. Cabe destacar que, en el contexto de la presente invención, una sustitución conservadora es reconocida en el estado de la técnica como una sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades similares.

Como se usa en este documento, la expresión “sitio de unión” se refiere al sitio o a la porción de una proteína (por ejemplo, CD4, gp41) que interactúa o se une a una proteína particular de la invención (por ejemplo, cuando un epítopo es reconocido por un anticuerpo). Los sitios de unión se pueden formar a partir de aminoácidos contiguos o no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. En general, los sitios de unión formados por aminoácidos contiguos quedan retenidos Después detras la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los sitios de unión formados por el plegamiento terciario se pierden Después detras el tratamiento con disolventes desnaturalizantes.

El sitio de unión para una porción anti-CD4 o una porción anti-N17 de la invención se puede determinar mediante la aplicación de técnicas estándares que se usan generalmente para el mapeo de epítopos de anticuerpos que incluyen, entre otros, mapeo de proteasa y análisis mutacional. De manera alternativa, un sitio de unión se puede determinar mediante un ensayo de competencia usando una proteína de referencia (por ejemplo, otra adnectina o anticuerpo) que se une al mismo polipéptido, por ejemplo, CD4 o gp41. Si la proteína de prueba y la molécula de referencia (por ejemplo, otra adnectina o anticuerpo) compiten, entonces se fijan al mismo sitio de unión o a sitios de unión que están lo suficientemente cercanos de manera que la unión de una molécula interfiera con la otra.

Las expresiones "se une específicamente a", “unión específica”, “unión selectiva" y “se une selectivamente”, que se usan de manera indistinta en este documento, se refieren a una proteína que exhibe afinidad a CD4 o gp41, pero no se une considerablemente (por ejemplo, menos de alrededor de 10% de unión) a un polipéptido diferente, según se mide mediante una técnica disponible en el estado de la técnica, tal como análisis de Scatchard y/o ensayo de unión competitiva (por ejemplo, ELISA de competitividad, ensayo de SPR BIACORE). La expresión también se aplica cuando, por ejemplo, un dominio de unión de una proteína de la invención es específico para CD4 o gp41.

Como se usa en este documento, la expresión "se une preferiblemente a" se refiere a que la unión de los péptidos de la invención a CD4 o gp41 es al menos alrededor de 20% mayor que la unión a un polipéptido diferente, según se mide mediante una técnica disponible en el estado de la técnica, tal como análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva (por ejemplo, ELISA de competitividad, ensayo de SPR BIACORE).

Como se usa en este documento, la expresión “reactividad cruzada” se refiere a una proteína que se une a más de una proteína diferente que tiene sitios de unión idénticos o muy similares.

Como se usa en este documento, el término “K^d” se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción particular adnectina-proteína, inhibidor peptídico de la fusión-proteína o combinectina-proteína (por ejemplo, CD4 y/o gp41) o a la afinidad de una adnectina, un inhibidor peptídico de la fusión o una combinectina hacia una proteína (por ejemplo, CD4 y/o gp41), según se mide mediante un ensayo de resonancia de plasmones superficiales o un ensayo de unión celular. Como se usa en este documento, una “K^ddeseada” se refiere a una K^dde una proteína de la invención que es suficiente para la finalidad contemplada. Por ejemplo, una K^ddeseada se puede referir a la K^dde una combinectina necesaria para provocar un efecto funcional en un ensayo in vitro, por ejemplo, un ensayo celular de luciferasa.

Como se usa en este documento, el término “foⁿ” se refiere a la constante de asociación para la asociación de, por ejemplo, una combinectina al complejo combinectina/proteína.

Como se usa en este documento, el término “fo^{f f}” se refiere a la constante de disociación para la disociación de, por ejemplo, una combinectina del complejo combinectina/proteína.

Como se usa en este documento, el término “IC⁵⁰” se refiere a la concentración de, por ejemplo, una combinectina que inhibe una respuesta, ya sea en un ensayo in vitro o in vivo, hasta un nivel que es 50% de la respuesta inhibidora máxima, es decir, un valor intermedio entre la respuesta inhibidora máxima y la respuesta sin tratamiento.

Como se usan en este documento, los términos "inhibir" o "neutralizar", con respecto a una actividad de una proteína de la invención, se refieren a la capacidad de antagonizar, prohibir, prevenir, impedir, hacer más lenta, alterar, eliminar, detener, reducir o revertir considerablemente, por ejemplo, la progresión o la gravedad del aspecto que se desea inhibir, que incluye, por ejemplo, una actividad o propiedad biológica, una enfermedad o una afección. La inhibición o neutralización es, preferiblemente, al menos alrededor de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más.

El término “PK” es un acrónimo de “farmacocinética” y abarca propiedades de un compuesto, que incluyen, por ejemplo, absorción, distribución, metabolismo y eliminación por parte de un sujeto. Como se usan en este documento, “proteína de modulación PK” o “porción PK” se refieren a cualquier proteína, péptido o porción que afecta a las propiedades farmacocinéticas de una molécula biológicamente activa cuando se fusiona con la molécula biológicamente activa o se administra junto con ella. Los ejemplos de una proteína de modulación PK o una porción PK incluyen PEG, aglutinantes de albúmina de suero humano (HSA) (descritos en la publicación estadounidense N.° 2005/0287153, patente estadounidense 7.696.320, las publicaciones PCT N os WO 2009/083804 y WO 2009/133208), albúmina de suero humano, Fc, fragmentos Fc y variantes de estos, y azúcares (por ejemplo, ácido siálico).

La expresión “porción de unión a CD4” se refiere a cualquier porción que bloquea la unión de la proteína superficial de VIH gp120 al receptor CD4 en linfocitos T CD4+. La porción de unión a CD4 puede ser adnectina, anticuerpo (tal como ibalizumab), anticuerpo de dominio (dAb), fragmentos de anticuerpo (Fab) o anticuerpo biespecífico anti-CD4, y proteínas de fusión de estos.

La expresión “porción de unión a gp41” se refiere a cualquier porción que interfiere con la interacción del complejo de glicoproteínas de envoltura viral (gp120/gp41) con los linfocitos T. La porción de unión a gp41 puede ser adnectina, anticuerpo (Ab), anticuerpo de dominio (dAb), fragmentos de anticuerpo (Fab) o anticuerpo biespecífico anti-gp41, y proteínas de fusión de estos.

Una “porción inhibidora peptídica de la fusión con el VIH” se refiere a cualquier porción que inhibe la fusión mediante la unión a la región de repetición en héptada 1 (HR1) de gp41. Los ejemplos de porción inhibidora peptídica de la fusión incluyen péptidos derivados de las regiones NHR y CHR de gp41, designados péptidos NHR y CHR, respectivamente. Enfuvirtide es un ejemplo de un péptido CHR.

Los péptidos de la divulgación pueden incluir, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CD4 ibalizumab, una adnectina anti-N17 y un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH. De manera alternativa, los péptidos de la invención pueden incluir una adnectina anti-CD4, una adnectina anti-N17 y el inhibidor peptídico de la fusión con el VIH enfuvirtide.

La "semivida" de un compuesto o secuencia de aminoácidos se puede definir, en general, como el tiempo que tarda la concentración sérica del polipéptido en reducirse en un 50% in vivo debido, por ejemplo, a la degradación de la secuencia o del compuesto y/o a la depuración o el secuestro de la secuencia o el compuesto mediante mecanismos naturales. La semivida se puede determinar de cualquier manera conocida per se, tal como mediante análisis farmacocinético. Las técnicas adecuadas serán evidentes para el experto de nivel medio en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, las etapas de administrar de manera adecuada a un sujeto una dosis adecuada de la secuencia de aminoácidos o el compuesto de la invención; tomar muestras de sangre u otras muestras del sujeto a intervalos regulares; determinar el nivel o la concentración de la secuencia de aminoácidos o el compuesto de la invención en la muestra de sangre; y calcular, a partir de (un gráfico de) los datos así obtenidos, el tiempo transcurrido hasta que el nivel o la concentración de la secuencia de aminoácidos o el compuesto de la invención se ha reducido en un 50% en comparación con el nivel inicial Después detras la administración de la dosis. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales estándares, tales como Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters et al., Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2.a edición rev., Marcel Dekker (1982).

La semivida se puede expresar mediante parámetros, tales como t ¹/²-alfa, t¹/²-beta, HL_lambda_z y el área debajo de la curva (AUC). En la presente memoria descriptiva, un “aumento de la semivida” se refiere a un aumento de cualquiera de estos parámetros, dos de estos parámetros, tres parámetros de estos parámetros o los cuatro parámetros.

Las notaciones "mpk", "mg/kg" o "mg por kg" se refieren a miligramos por kilogramo. Todas las notaciones se usan de manera indistinta a lo largo de la presente descripción.

Los términos "individuo", "sujeto" y "paciente", que se usan de manera indistinta en este documento, se refieren a un animal, preferiblemente un mamífero (que incluye un no primate y un primate), e incluyen, entre otros, murinos, simios, seres humanos, animales mamíferos de granja (por ejemplo, bovinos, porcinos, ovinos), animales mamíferos de deportes (por ejemplo, equinos) y mascotas mamíferas (por ejemplo, caninos y felinos); preferiblemente, el término se refiere a seres humanos. En una realización determinada, el sujeto es un mamífero, preferiblemente, un ser humano y está infectado con VIH.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere al menos a la dosis mínima, pero menor a una dosis tóxica, de un agente que es necesario para provocar un beneficio terapéutico en un sujeto. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una combinectina de la invención es una cantidad que, en mamíferos, preferiblemente, seres humanos, da como resultado una disminución significativa del VIH que circula dentro del individuo infectado.

Visión general

La presente invención proporciona polipéptidos novedosos que se unen a CD4 y/o gp41. Los polipéptidos comprenden una porción de unión a CD4, una porción de unión a gp41, una porción inhibidora peptídica de la fusión con el VIH y combinaciones de estas. Más específicamente, la presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden una proteína del dominio de soporte a base de fibronectina que se une a CD4, una proteína del dominio de soporte a base de fibronectina que se une al dominio N17 de gp41 y un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH, o combinaciones de estos. (en la presente denominadas “combinectinas”).

A fin de identificar las adnectinas CD4 y gp41, CD4 (dominio extracelular) y gp41 (diversas construcciones artificiales diseñadas para exhibir un segmento de triple hélice que imita una porción de gp41) solubles se presentaron a grandes bibliotecas sintéticas de adnectinas. Las adnectinas que sobrevivieron varias rondas de selección se cribaron para identificar la unión a CD4 o gp41, las propiedades biofísicas y la actividad inhibidora de VIH-1. Las mejores secuencias de adnectina anti-CD4 y anti-N17 que surgieron de los cribados se mutaron y se sometieron a rondas de selección adicionales con mayor presión selectiva, que se logró mediante disminución de la concentración de las dianas y/o selección de adnectinas anti-CD4 o gp41 con constantes de asociación rápidas y/o constantes de disociación lentas. De este proceso de optimización, se identificaron múltiples familias de adnectinas, algunas de ellas dirigidas a CD4, y otras dirigidas a gp41, como inhibidores específicos de VIH-1 con actividad bioquímica y biofísica favorable.

Se desarrolló un péptido helicoidal dirigido a gp41 optimizado a partir de secuencias relativas a HR2 de gp41 y que contenía cambios para mejorar la potencia y amplitud a lo largo de las cepas de VIH, así como aumentar la barrera de resistencia. Los péptidos se produjeron, en algunas ocasiones, de manera sintética, y en otras ocasiones, como fusiones genéticas a adnectinas inertes o activas. Las posiciones óptimas de los extremos N- y C-terminales se determinaron en fusiones con un miembro de la familia de adnectinas gp41. A fin de identificar mutaciones que aumentarían aún más la potencia, se usó un péptido recortado en el extremo N-terminal con potencia leve, de manera que las mejoras se pudieran detectar con mayor facilidad. Se produjeron pequeñas bibliotecas de la fusión péptidoadnectina inerte que comprendían mutaciones puntuales simples o múltiples, luego las proteínas se expresaron y se cribaron para identificar las propiedades biofísicas y la actividad inhibidora de VIH-1. La familia de péptidos final consistía en péptidos de longitud óptima con diversas combinaciones de las secuencias que tenían los perfiles más favorables.

I. Soportes a base de fibronectina - Adnectinas

Un aspecto de la solicitud proporciona adnectinas anti-CD4 y anti-N17 que comprenden un dominio de fibronectina tipo III (Fn3) en donde se ha aleatorizado o se ha mutado una parte o la totalidad de uno o más de los bucles accesibles al disolvente. En algunas realizaciones, también se han aleatorizado o mutado uno o más restos en una o más de las cadenas beta no bucle. En algunas realizaciones, el dominio Fn3 es un dominio Fn3 derivado del décimo módulo de fibronectina humana de tipo 3 (10Fn3):

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRG DSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO:1) (los bucles BC, CD, DE y FG están subrayados)

En otras realizaciones, las secuencias no de unión a ligandos de 10Fn3, es decir, el "soporte de 10Fn3”, se pueden alterar siempre que 10Fn3 retenga la función de unión al ligando y/o la estabilidad estructural. Se ha dado a conocer una variante de los soportes de 10Fn3 mutantes. En un aspecto, se reemplazan uno o más de Asp 7, Glu 9 y Asp 23 por otro aminoácido, por ejemplo, un resto de aminoácido no cargado negativamente (por ejemplo, Asn, Lys, etc.). Se informó que estas mutaciones tienen el efecto de promover una mayor estabilidad del mutante 10Fn3 a pH neutro en comparación con la la forma nativa (véase, por ejemplo, la publicación de PCT N.° WO 02/04523). Se describieron varias alteraciones adicionales en el soporte de 10Fn3 que son beneficiosas o neutras. Véase, por ejemplo, Batori et al., Protein Eng., 15(12):1015-1020 (diciembre de 2002); Koide et al., Biochemistry, 40(34):10326-10333 (28 de agosto de 2001).

Las proteínas 10Fn3 tanto variantes como nativas se caracterizan por la misma estructura, a saber, 7 secuencias de dominio de la cadena beta denominadas de A a G y 6 regiones de bucle (bucle AB, bucle BC, bucle CD, bucle DE, bucle EF y bucle FG) que conectan las 7 secuencias de dominio de la cadena beta. Las cadenas beta ubicadas más cerca de los extremos N y C terminales pueden adoptar una conformación tipo beta en disolución. En SEQ ID NO:1, el bucle AB corresponde a los restos 14-17, el bucle BC corresponde a los restos 23-31, el bucle CD corresponde a los restos 37-47, el bucle DE corresponde a los restos 51-56, el bucle EF corresponde a los restos 63-67, y el bucle FG corresponde a los restos 75-87.

En consecuencia, en algunas realizaciones, la adnectina anti-CD4 o anti-N17 de la divulgación es un polipéptido 10Fn3 que es al menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o 90% idéntico al dominio 10Fn3 humano, como se muestra en SEQ ID NO:1. En general, la mayor parte de la variabilidad ocurrirá en uno o más de los bucles. Cada una de las cadenas beta o tipo beta de un polipéptido 10Fn3 puede consistir esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a la secuencia de una cadena beta o tipo beta correspondiente de SEQ ID NO:1, siempre que esa variación no altere la estabilidad del polipéptido en condiciones fisiológicas.

En algunas realizaciones, la invención proporciona una o más adnectinas que comprenden un décimo dominio de fibronectina tipo III (10Fn3), en donde el dominio 10Fn3 comprende un bucle AB; un bucle BC; un bucle CD; un bucle DE; un bucle EF; y un bucle FG; y tiene al menos un bucle seleccionado de los bucles BC, CD, DE y FG con una secuencia de aminoácidos alterada con respecto a la secuencia del bucle correspondiente del dominio 10Fn3 humano. En algunas realizaciones, las adnectinas de la presente invención comprenden un dominio 10Fn3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones que no son de bucle de SEQ ID NO:1, en donde se altera al menos un bucle seleccionado de BC, CD, DE y FG. En algunas realizaciones, se alteran los bucles BC y FG, y en algunas realizaciones, se alteran los bucles BC, DE y FG, es decir, los dominios ¹⁰Fn3 comprenden bucles no naturales. En algunas realizaciones, se alteran los bucles AB, CD y/o EF. En algunas realizaciones, se alteran los bucles CD y FG. En algunas realizaciones, se alteran los aminoácidos accesibles al disolvente en las cadenas entre bucles, con o sin alteración de los bucles adyacentes. "Alterar" se refiere a una o más alteraciones de secuencias de aminoácidos con respecto a una secuencia molde (dominio de fibronectina humano correspondiente) e incluye adiciones, eliminaciones y sustituciones de aminoácidos, o una combinación de estas. La alteración de una secuencia de aminoácidos se puede lograr mediante la variación intencional, a ciegas o espontánea, en general, de una secuencia que codifica ácidos nucleicos, y se puede realizar mediante cualquier técnica, por ejemplo, PCR, PCR propensa a error o síntesis química de ADN.

En algunas realizaciones, se puede extender o acortar la longitud de uno o más bucles seleccionados de BC, CD, DE y FG con respecto al bucle de fibronectina humana correspondiente. En algunas realizaciones, la longitud del bucle se puede extender 1-25 aminoácidos. En algunas realizaciones, la longitud del bucle se puede disminuir 1-11 aminoácidos. Por lo tanto, para optimizar la unión al antígeno, se puede alterar un bucle de ¹⁰Fn3, así como la secuencia para obtener la mayor flexibilidad y afinidad posibles en la unión al antígeno.

En algunas realizaciones, las adnectinas comprenden un dominio Fn3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80, 85, 90, 95, 98, 99 o 100% idéntica a las regiones que no son de bucle de SEQ ID NO:1, en donde se altera al menos un bucle seleccionado de BC, CD, DE y FG. En algunas realizaciones, el bucle BC alterado tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 sustituciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3 o 4 eliminaciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 inserciones de aminoácidos o una combinación de estas. En algunas realizaciones, el bucle CD alterado tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 sustituciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3, 4, 5 o 6 eliminaciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 inserciones de aminoácidos o una combinación de estas. En algunas realizaciones, el bucle DE alterado tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3 o 4 eliminaciones de aminoácidos, hasta 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o 13 inserciones de aminoácidos o combinaciones de estas. En algunas realizaciones, el bucle FG alterado tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 sustituciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 eliminaciones de aminoácidos, hasta 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ,17 ,18 ,19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 inserciones de aminoácidos o combinaciones de estas.

Secuencias de extensión

En algunas realizaciones, las moléculas de adnectina de la presente invención se pueden modificar para comprender una secuencia de extensión del extremo N terminal y/o una extensión del extremo C terminal. Por ejemplo, una secuencia MG se puede ubicar en el extremo N terminal del ¹⁰Fn3 definido en SEQ ID NO: 1. Con frecuencia, M se escinde, lo que deja a G en el extremo N terminal. Las adnectinas descritas en este documento también pueden comprender secuencias cola del extremo C terminal alternativas, que en la presente se denominan secuencias de extensión del extremo C terminal o del extremo C terminal truncado. Además, la versión truncada se puede usar como moléculas truncadas en la forma truncada, o se pueden agregar extensiones del extremo C terminal alternativas, tales como la etiqueta His6, a la versión truncada. En algunas realizaciones, las secuencias de extensión del extremo C terminal (también denominadas "colas”) comprenden restos E y D, y pueden tener de 8 a 50, de 10 a 30, de 10 a 20, de 5 a 10 y de 2 a 4 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el primer resto de una extensión del extremo C terminal es una prolina. En otras realizaciones, el primer resto de una extensión del extremo C terminal es un ácido glutámico.

En algunas realizaciones, el extremo N terminal se puede extender hasta 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15 o más aminoácidos, que se pueden alterar de cualquier manera, antes o después de las rondas de selección, a fin de mejorar la estabilidad o la unión a la diana, o ambas. En otras realizaciones, el extremo C terminal se puede extender hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15 o más aminoácidos, que se pueden alterar de cualquier manera, antes o después de las rondas de selección, a fin de mejorar la estabilidad o la unión a la diana, o ambas. Aun en otras realizaciones, los terminales N y C se pueden extender de esta manera.

Adnectina anti-CD4

Las secuencias de aminoácidos de la región de bucle CD y FG de adnectina anti-CD4 de la invención se enumeran en la Tabla 1 a continuación. Los bucles CD descritos en la Tabla 1 reemplazan R30 a T49 de ¹⁰Fn3 definida por SEQ ID NO: 1. Los bucles FG descritos en la Tabla X reemplazan D67 a N91 de ¹⁰Fn3 definida por SEQ ID NO: 1.

La Tabla 1 también enumera los valores de IC⁵⁰para cada adnectina anti-CD4 que comprenden las combinaciones de bucles CD/FG enumeradas.

Tabla 1 Combinaciones de adnectina CD4 - bucles CD y FG

En algunas realizaciones, la adnectina anti-CD4 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las combinaciones de regiones de bucles CD/FG de SEQ ID NO: 13 94.

En algunas realizaciones, la adnectina anti-CD4 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a una cuqalquiera de las regiones de bucle CD de SEQ ID NOs: 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31,33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51,53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71,73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 y 93.

En algunas realizaciones, la adnectina anti-CD4 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a una cuqalquiera de las regiones de bucle FG de SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 ,34 , 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 y 94.

Se usó WebLogo (weblogo.berkeley.edu) para identificar las secuencias de consenso para adnectina anti-CD4. Y32, I34, Y36, Q46 y F48 del bucle CD de adnectina anti-CD4 son aminoácidos conservados (véase la Figura 6). En algunas realizaciones, la adnectina anti-CD4 comprende uno o más de los aminoácidos conservados Y32, I34, Y36, Q46 y F48.

Weblogo identificó que Y68, I70, V72, A74, T76, I88 e I90 del bucle FG de adnectina anti-CD4 son aminoácidos conservados (véase la Figura 7). En algunas realizaciones, la adnectina anti-CD4 comprende uno o más de los aminoácidos conservados Y68, l70, V72, A74, T76, I88 e I90.

En algunas realizaciones, la adnectina anti-CD4 comprende uno o más de los aminoácidos conservados Y32, I34, Y36, Q46, F48, Y68, I70, V72, A74, T76, I88 e I90.

Las secuencias de aminoácidos de longitud completa de adnectina anti-CD4 de la invención se enumeran en la Tabla 2 a continuación. La Tabla 2 también enumera los valores de EC50 antiviral para cada adnectina anti-CD4.

Tabla 2 Adnectina anti-CD4

En algunas realizaciones, la adnectina anti-CD4 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 95-114.

En algunas realizaciones, la adnectina anti-CD4 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 95-114, excluyendo la región extendida del extremo N terminal.

En algunas realizaciones, la adnectina anti-CD4 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 95-114, excluyendo la región extendida del extremo C terminal.

En algunas realizaciones, la adnectina anti-CD4 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 95-114, excluyendo las regiones extendidas del extremo N terminal y del extremo C terminal.

En otras realizaciones, la adnectina anti-CD4 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones de bucle CD y bucle FG de SEQ ID NO: 95-114.

Adnectina anti-N17

Las secuencias de aminoácidos de longitud completa de la proteína adnectina anti-N17 de la invención se enumeran en la Tabla 3 a continuación. La Tabla 3 también enumera los valores de EC⁵⁰antiviral para cada adnectina anti-N17.

Tabla 3 Adnectina anti-N17

En algunas realizaciones, la adnectina anti-N17 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 115-371.

En algunas realizaciones, la adnectina anti-N17 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 115-371, excluyendo la región extendida del extremo N terminal.

En algunas realizaciones, la adnectina anti-N17 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 115-371, excluyendo la región extendida del extremo C terminal.

En algunas realizaciones, la adnectina anti-N17 de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 115-371, excluyendo las regiones extendidas del extremo N terminal y del extremo C terminal.

En otras realizaciones, la adnectina anti-N17 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones de bucle BC, bucle DE y bucle FG de SEQ ID NO: 115-371.

El análisis de las secuencias anteriores indica que S52, V53, L54 y S55 del bucle DE de adnectina anti-N17 son aminoácidos conservados. En algunas realizaciones, la adnectina anti-N17 comprende uno o más de los aminoácidos conservados S52, V53, L54 y S55.

Además, el análisis de las secuencias anteriores indica que Y24 del bucle BC de adnectina anti-CD4 es un aminoácido conservado. En algunas realizaciones, la posición 26 del bucle BC de adnectina anti-N17 es valina o leucina.

El análisis de las secuencias anteriores indica que G78 y S85 del bucle FG de adnectina anti-N17 son aminoácidos conservados. En algunas realizaciones, la adnectina anti-N17 comprende uno o más de los aminoácidos conservados G78 y S85. En algunas realizaciones, la posición 79 del bucle FG de adnectina anti-N17 es valina o isoleucina.

En algunas realizaciones, la adnectina anti-N17 comprende uno o más de los aminoácidos conservados Y24, V26, L26, S52, V53, L54, S55 G78, V79, I79 y S85.

El análisis de las mutaciones puntuales de la adnectina anti-N17 mostró ventajas de mutar varias posiciones no bucle 10Fn3. Específicamente, las posiciones mutantes T56 y T58 reforzaron la potencia. En algunas realizaciones la adnectina anti-N17 comprende mutar T58 a Asn, Glu o Gln.

II. Inhibidores peptídicos de la fusión con el VIH

La secuencia de aminoácidos de gp41, y su variación entre cepas diferentes de VIH-, es conocida. Se cree que el dominio fusogénico (con frecuencia denominado péptido de fusión o FP) participa de la inserción en y la alteración de la membrana de la célula diana. El dominio de transmembrana, que contiene la secuencia de anclaje de transmembrana, se ubica hacia el extremo C terminal de la proteína. Entre el dominio fusogénico y el anclaje de transmembrana existen dos regiones distintas, conocidas como regiones de repetición en héptada (HR), en donde cada región tiene una pluralidad de héptadas. La secuencia de aminoácidos que comprende la región HR1 y la secuencia de aminoácidos que comprende la región HR2 son, cada una, regiones relativamente conservadas en la proteína de envoltura de VIH-1. Una secuencia representativa del dominio externo de gp41 (consenso de clado B) es la siguiente:

512 AVGIGAMFL GFLGAAGSTM GAASVTLTVQ ARQLLSGIVQ QQNNLLRAIE

561 AQQHLLQLTV WGIKQLQARV LAVERYLKDQ QLLGIWGCSG KLICTTAVPW

611 NASWSNKSLD EIWNNMTWME WEREIDNYTG LIYTLIEESQ NQQEKNEQEL

661 LELDKWASLW NWFDITNWLW YIK (SEQ ID NO:2)

El péptido de fusión consiste, aproximadamente, en los primeros 23 aminoácidos, Ala512-Ser534. La región HR1 tiene una pluralidad de tramos de restos de 7 aminoácidos contiguos o "héptadas" (los 7 aminoácidos en cada héptada se designan de "a" a "g"), en donde predominan los restos hidrófobos en la primera ("a") y la cuarta ("d") posición, que interactúan homotípicamente para formar el núcleo de la estructura de haz de 3 hélices. Los aminoácidos polares neutros, tales como glutamina, también pueden ocupar estas posiciones. Una héptada representativa comienza con Leu545. Una porción altamente conservada de HR1 consiste en los 17 restos de Leu565 a Leu581 y se denomina “N17”.

La porción de gp41 en el extremo C terminal comprende la región HR2, que se cree que forma una estructura alfa helicoidal durante el proceso de fusión, y se une a las ranuras de la estructura helicoidal triple de HR1. HR2 también comprende héptadas, si bien no interactúan homotípicamente, sino que interactúan con aminoácidos de HR1. Una héptada representativa comienza en Trp628.

Inhibidor peptídico de la fusión con el VIH

El inhibidor peptídico de la fusión con el VIH de la invención incluye las siguientes secuencias:

En algunas realizaciones, el inhibidor peptídico de la fusión con el VIH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 372-392.

Se observó que las mutaciones puntuales en la región C-terminal del inhibidor peptídico de la fusión con el VIH reforzaban la potencia. En algunas realizaciones, una sustitución hidrofóbica quel ácido aspártico (D) cerca del extremo C-terminal del inhibidor peptídico de la fusión con el VIH proporcionó al menos un incremento de 10 veces en la potencia (FIG: 8). En algunas realizaciones, el inhibidor peptídico de la fusión con el VIH comprende sustituir "DK" por "YK", "LK", "FK" o "WK".

Otros estudios de mutaciones puntuales en la región C-terminal indicaron como se pueden mutar los aminoácidos del extremo C-terminal "WAS" con buenos efectos sobre la potencia. En algunas realizaciones, el inhibidor peptídico de la fusión con el VIH comprende sustituir los aminoácidos "WAS" por "WFS" o "WAL".

III. Conectores

Los diversos componentes de la combinectina de la invención se pueden conectar de manera covalente o no covalente. En algunas realizaciones, la porción PK se puede conectar directa o indirectamente a una combinectina mediante un conector de polipéptidos.

Los conectores adecuados son aquellos que permiten que los dominios separados se plieguen independientemente entre sí y formen una estructura tridimensional que permite una alta afinidad de unión a una molécula diana.

La descripción proporciona varios conectores adecuados que cumplen con estos requisitos, lo que incluye conectores a base de glicina-serina, conectores a base de glicina-prolina. Los ejemplos descritos en este documento demuestran que los dominios de combinectina unidos mediante conectores de polipéptidos retienen su función de unión a la diana. En algunas realizaciones, el conector es un conector a base de glicina-serina. Estos conectores comprenden restos de glicina y serina, y pueden tener de 8 a 50, de 10 a 30 y de 10 a 20 aminoácidos de longitud. Los ejemplos incluyen conectores que tienen una secuencia de aminoácidos (GS)7 (SEQ ID NO: 393), G(GS)6 (SEQ ID NO: 394) y G(GS)zG (SEQ ID NO: 395). Otros conectores contienen ácido glutámico e incluyen, por ejemplo, (GSE)5 (SEQ ID NO: 396) y GGSEGGSE (SEQ ID NO: 397). Otros conectores de glicina-serina de ejemplo incluyen (GS)⁴(SEQ ID NO: 398), (GGGGS)^y(SEQ ID NO: 399), (GGGGS)⁵(SEQ ID NO: 400), (GGGGS)⁴(SEQ ID NO: 401), (GGGGS)³G (SEQ ID NO: 402). En algunas realizaciones, el conector es un conector a base de glicina-prolina. Estos conectores comprenden restos de glicina y prolina, y pueden tener de 3 a 30, de 10 a 30 y de 3 a 20 aminoácidos de longitud. Los ejemplos incluyen conectores que tienen una secuencia de aminoácidos (GP)³G (SEQ ID NO: 403) y (GP)⁵G (SEQ ID NO: 404). En otras realizaciones, el conector puede ser un conector a base de prolina-alanina que tiene de 3 a 30, de 10 a 30 y de 3 a 20 aminoácidos de longitud. Los ejemplos de conectores a base de prolina-alanina incluyen, por ejemplo, (PA)³(SEQ ID NO: 405), (PA)⁶(SEQ ID NO: 406) y (PA)⁹(SEQ ID NO: 407). En algunas realizaciones, el conector es un conector a base de ácido glutámico-prolina. Estos conectores comprenden restos de ácido glutámico y prolina, y pueden tener de 3 a 30, de 10 a 30 y de 3 a 20 aminoácidos de longitud. Los ejemplos incluyen conectores que tienen una secuencia de aminoácidos ESPEPETPEDE (SEQ ID NO: 408) y (ESPEp Et PED)²E (SEQ ID NO: 409). Se tiene en cuenta que la longitud de los conectores y la composición de aminoácidos óptimas se pueden determinar con experimentos de rutina mediante métodos conocidos en el estado de la técnica.

Se pueden introducir conectores o espaciadores en el extremo N terminal de la porción anti-CD4, el extremo C terminal de la porción anti-CD4, el extremo N terminal de la porción anti-gp41, el extremo C terminal de la porción anti-gp41, el extremo N terminal del inhibidor peptídico de la fusión con el VIH, o combinaciones de estos. En algunas realizaciones, los conectores preferidos entre la adnectina anti-CD4 y la adnectina anti-N17 son conectores cortos ricos en glutaminaprolina. En algunas realizaciones, el conector preferido entre la adnectina anti-N17 y el inhibidor peptídico de la fusión con el VIH son conectores flexibles ricos en glicina-serina.

IV. Combinectina de adnectina anti-N17 conectada a un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH

Las secuencias de aminoácidos de la combinectina de adnectina anti-N17 - inhibidor peptídico de la fusión con el VIH de la divulgación se enumeran en la Tabla 4 a continuación. La Tabla 4 también enumera los valores de EC50 antiviral para cada combinectina de adnectina anti-N17 - inhibidor peptídico de la fusión con el VIH.

Tabla 4 Adnectina anti-N17 - inhibidor peptídico de la fusión con el VIH

En algunas realizaciones de la divulgación, la combinectina de adnectina anti-N17 - inhibidor peptídico de la fusión con el VIH, o las proteínas de fusión de esta, comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones que no son de conectores de una cualquiera de SEQ ID NO: 410-428.

En algunas realizaciones de la divulgación, la combinectina de adnectina anti-N17 - inhibidor peptídico de la fusión con el VIH, o las proteínas de fusión de esta, comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones que no son de conectores de una cualquiera de SEQ ID NO: 410-428, excluyendo la región extendida del extremo N terminal.

En algunas realizaciones de la divulgación, la combinectina de adnectina anti-N17 - inhibidor peptídico de la fusión con el VIH, o las proteínas de fusión de esta, comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones bucle BC, bucle DE y bucle FG de SEQ ID NOs: 410 428.

En otras realizaciones de la divulgación, la combinectina de adnectina anti-N17 - inhibidor peptídico de la fusión con el VIH comprende un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica del inhibidor peptídico de la fusión con el VIH que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones bucle BC, bucle DE y bucle FG de de SEQ ID NO: 410-428.

V. Combinectina de adnectina anti-CD4 conectada a una adnectina anti-N17 conectada a un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH

La combinectina de adnectina anti-CD4 conectada a una adnectina anti-N17 conectada a un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH de la invención incluye las siguientes secuencias:

Combinectina 3137 (SEQ ID NO: 3) GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVHSYHIQYWPLGSYQRYQVFSVPGSKSTATISGLKPGVEYQIRVYAETG RGESDQSLGWIQIGYRTEESPEPETPEDEGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWQYKVHPYRYYRITYGETGGNSPVQE FTVPSVLSTAEISGLKPGVDYTITVYAVTRGVDSAPISINYRTPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEYEARIEALIRAAQ EQQEKNEAALRELYKWAL

Combinectina 3151 (SEQ ID NO: 5)

GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVHSYHIQYWPLGSYQRYQVFSVPGSKSTATISGLKPGVEYQIRVYAETG RGESDQSLGWIQIGYRTEESPEPETPEDEGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEYNVNPYRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPSVLSSAQISGLKPGVDYTITVYAVTRGVDSAPISINYRTPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEYEARIEALIRAAQE QQEKNEAALRELWKWAS

Combinectina 3191 (SEQ ID NO: 7)

GVS

SWDAPAVTVHSYHIQYWPLGSYQRYQVFSVPGSKSTATISGLKPGVEYQIRVYAETG

RGESDQSLGWIQIGYRTPESPEPETPEDEGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEYKVHPYRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPSVLSSAEISGLKPGVDYTITVYAVTYGIDSPPISINYRTEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEYEARIEALIRAAQE QQEKNEAALRELYKWAL

Combinectina 3202 (SEQ ID NO: 9)

GVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVHSYHIQYWPLGSYQRYQVFSVPGSKSTATISGLKPGVEYQIRVYAETG GADSDQSFGWIQIGYRTPESPEPETPEDEGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWEYKVHPYRYYRITYGETGGNSPVQEF TVPSVLSTAEISGLKPGVDYTITVYAVTRGVDSAPISINYRTPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGTIAEYAARIEALIRAAQ EQQEKNEAALRELYKWAS

En las secuencias anteriores, se subrayan las secuencias de adnectina anti-CD4. Las secuencias de adnectina anti-N17 tienen subrayado doble. Las secuencias de inhibidores peptídicos de la fusión con el VIH se subrayan en negrita. Las secuencias de conectores aparecen en cursiva.

En algunas realizaciones, la combinectina, o las proteínas de fusión de esta, comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7 y 9.

En algunas realizaciones, la combinectina, o las proteínas de fusión de esta, comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones que no son de conectores de cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7 y 9.

En otras realizaciones, la combinectina comprende una adnectina anti-CD4 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones de bucle CD y bucle FG de SEQ ID NO: 3, 5, 7 y 9.

En otras realizaciones, la combinectina comprende una adnectina anti-N17 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones de bucle BC, bucle DE y bucle FG de SEQ ID NO: 3, 5, 7 y 9.

En otras realizaciones, la combinectina comprende un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica al inhibidor peptídico de la fusión con el VIH de SEQ ID NO: 3, 5, 7 y 9.

IV. Porciones farmacocinéticas

En un aspecto, la solicitud proporciona una porción anti-CD4, una porción anti-gp41, un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH, y combinaciones de estos, que también comprenden una porción farmacocinética (PK). Se puede evaluar la farmacocinética mejorada de acuerdo con la necesidad terapéutica percibida. Con frecuencia, se desea aumentar la biodisponibilidad y/o el tiempo entre las dosis, posiblemente aumentando el tiempo que una proteína permanece disponible en el suero después de la administración de la dosis. En algunos casos, se desea mejorar la continuidad de la concentración sérica de la proteína en el tiempo (por ejemplo, disminuyendo la diferencia en la concentración sérica de la proteína poco después de la administración y poco antes de la siguiente administración). La combinectina de la invención puede estar unida a una porción que reduce la velocidad de depuración del polipéptido en un mamífero (por ejemplo, ratón, rata o ser humano) al menos 2 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, al menos 90 veces, al menos 100 veces, con respecto a la combinectina no modificada. Otras medidas para mejorar la farmacocinética pueden incluir la semivida sérica, que con frecuencia se divide en una fase alfa y una fase beta. Una o ambas fases se pueden mejorar considerablemente mediante la adición de una porción adecuada. Por ejemplo, la porción PK puede aumentar la semivida sérica del polipéptido en más del 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%, 400%, 600%, 800%, 1000% o más con respecto a la combinectina sola.

Las porciones que hacen más lenta la depuración de una proteína de la sangre, denominadas "porciones PK" en este documento, incluyen porciones de polioxialquileno (por ejemplo, polietilenglicol), azúcares (por ejemplo, ácido siálico) y porciones proteicas bien toleradas (por ejemplo, Fc, fragmentos y variantes de estos, transferrina o albúmina de suero). La combinectina de la invención también se puede fusionar con albúmina o con un fragmento (porción) o variante de albúmina como se describe en la publicación estadounidense N.° 2007/0048282, o se puede fusionar con una o más adnectinas u otras porciones que se unen a albúmina de suero, Fc o transferrina.

Otras porciones PK que se pueden usar en la invención incluyen las descritas en Kontermann et al., (Current Opinión in Biotechnology22:868-76 (2011)). Tales porciones PK incluyen, entre otras, fusiones de albúmina de suero humano, conjugados de albúmina de suero humano, aglutinantes de albúmina de suero humano (por ejemplo, adnectina PKE, AlbudAb, ABD), fusiones de XTEN, fusiones de PAS (es decir, miméticos de PEG recombinantes a base de los tres aminoácidos prolina, alanina y serina), conjugados de hidratos de carbono (por ejemplo, hidroxietil almidón (HES)), glicosilación, conjugados de ácido polisiálico y conjugados de ácidos grasos.

En consecuencia, en algunas realizaciones, la invención proporciona una combinectina fusionada a una porción PK que es un azúcar polimérico. En algunas realizaciones, la porción PK es una porción de polietilenglicol o una región Fc. En algunas realizaciones, la porción PK es una proteína de unión a la albúmina de suero, tal como las que se describen en las publicaciones estadounidenses N.os 2007/0178082 y 2007/0269422. En algunas realizaciones, la porción PK es albúmina de suero humano. En algunas realizaciones, la porción PK es transferrina.

La combinectina de fusión a Fc de la invención incluye las secuencias que se muestran en 3137 (SEQ ID NO: 4) y 3151 (SEQ ID NO: 6) de la Figura 2.

En algunas realizaciones, la combinectina de fusión a Fc, o las proteínas de fusión de esta, comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 4 y 6.

En algunas realizaciones, la combinectina de fusión a Fc, o las proteínas de fusión de esta, comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones que no son de conectores de cualquiera de SEQ ID NO: 4 y 6.

En otras realizaciones, la combinectina de fusión a Fc comprende una adnectina anti-CD4 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones de bucles CD y FG de SEQ ID NO: 4 y 6.

En otras realizaciones, la combinectina de fusión a Fc comprende una adnectina anti-N17 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones de bucle BC, bucle DE y bucle FG de SEQ ID NO: 4 y 6.

En otras realizaciones, la combinectina de fusión a Fc comprende un inhibidor peptídico de la fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica al inhibidor peptídico de la fusión con el VIH de SEQ ID NO: 4 y 6.

La combinectina de fusión a HSA de la invención incluye las secuencias que se muestran en 3191 (SEQ ID NO: 8) y 3202 (SEQ ID NO: 10) de la Figura 2.

En algunas realizaciones, la combinectina de fusión a HSA, o las proteínas de fusión de esta, comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 8 y 10.

En algunas realizaciones, la combinectina de fusión a HSA, o las proteínas de fusión de esta, comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones que no son de conectores de cualquiera de SEQ ID NO: 8 y 10.

En otras realizaciones, la combinectina de fusión a HSA comprende una adnectina anti-CD4 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones de bucle CD y bucle FG de SEQ ID NO: 8 y 10.

En otras realizaciones, la combinectina de fusión a HSA comprende una adnectina anti-N17 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones de bucle BC, bucle DE y bucle FG de SEQ ID NO: 8 y 10.

En otras realizaciones, la combinectina de fusión a HSA comprende un inhibidor peptídico de la fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica al inhibidor peptídico de la fusión con el VIH de SEQ ID NO: 8 y 10.

Polietilenglicol

En algunas realizaciones, la porción anti-CD4, la porción anti-gp41, el inhibidor peptídico de la fusión con el VIH, y combinaciones de estos, comprenden polietilenglicol (PEG). PEG es un polímero hidrosoluble conocido que se encuentra disponible en el comercio o se puede preparar mediante polimerización por apertura de anillo de etilenglicol de acuerdo con los métodos conocidos en el estado de la técnica (Sandler y Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, Nueva York, vol. 3, páginas 138-161). El término “PEG” se usa ampliamente para referirse a cualquier molécula de polietilenglicol, independientemente del tamaño o la modificación en un extremo del PEG, y se puede representar mediante la siguiente fórmula: X—O(CH²CH²O)n-iCH²CH²OH, en donde n es de 20 a 2300, y X es H o una modificación terminal, por ejemplo, alquilo C^1-4. PEG puede contener otros grupos químicos que son necesarios para las reacciones de unión, que son el resultado de la síntesis química de la molécula; o que actúan como espaciadores para mantener la distancia óptima de las partes de la molécula. Además, un PEG puede consistir en una o más cadenas laterales de PEG conectadas entre sí. Los PEG con más de una cadena PEG se denominan PEG ramificados o de múltiples ramificaciones. Los PEG ramificados se describen, por ejemplo, en la solicitud europea publicada N.° 473084A y en la patente estadounidense N.° 5.932.462.

Se pueden unir una o más moléculas de PEG en diferentes posiciones en la proteína, y esta unión se puede obtener mediante la reacción con aminas, tioles u otros grupos reactivos adecuados. La porción amina puede ser, por ejemplo, una amina primaria que se encuentra en el extremo N terminal de un polipéptido o un grupo amina presente en un aminoácido, tal como lisina o arginina. En algunas realizaciones, la porción PEG está unida en una posición del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en: a) el extremo N terminal; b) entre el extremo N terminal y la cadena beta o tipo beta más cercana al extremo N terminal; c) un bucle o resto de la cadena ubicado en una cara del polipéptido opuesta al sitio de unión a la diana; d) entre el extremo C terminal y la cadena beta o tipo beta más cercana al extremo C terminal; e) dentro de una secuencia de conectores que conecta dos dominios de unión, y f) en el extremo C terminal.

La PEGilación se puede lograr mediante PEGilación dirigida al sitio, en donde se introduce un grupo reactivo adecuado en la proteína para crear un sitio en donde, preferiblemente, se produce la PEGilación. En algunas realizaciones, la proteína se modifica para introducir un resto de cisteína en la posición deseada, lo que permite la PEGilación dirigida al sitio en la cisteína. Las mutaciones se pueden introducir en una secuencia codificadora de proteínas, a fin de generar restos de cisteína. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la mutación de uno o más restos de aminoácidos a cisteína. Los aminoácidos preferidos para que muten a un resto de cisteína incluyen serina, treonina, alanina y otros restos hidrófilos. Preferiblemente, el resto que se mutará a cisteína es un resto expuesto en la superficie. Los algoritmos son conocidos en el estado de la técnica porque predicen la accesibilidad a la superficie de los restos en función de la secuencia primaria o una proteína. De manera alternativa, los restos de superficie se pueden predecir comparando las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de unión, dado que se solucionó la estructura de cristal del marco, en función de qué polipéptido de unión se diseña y evoluciona (véase Himanen et al., Nature 2001;414:933-8) y, por ende, se identifican los restos expuestos en la superficie. La PEGilación de los restos de cisteína se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, PEG-maleimida, PEG-vinilsulfona, PEG-iodoacetamida o PEG-disulfuro de ortopiridilo.

En general, PEG se activa con un grupo de activación adecuado para acoplarse a un sitio deseado en el polipéptido. Los métodos de PEGilación son conocidos en el estado de la técnica y también se describen en Zalipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" en Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, Nueva York (1992) y en Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16: 157-182.

PEG puede presentar una amplia variación en cuanto al peso molecular y puede ser ramificado o lineal. En general, el peso molecular promedio de PEG es de alrededor de 100 Dalton a alrededor de 150.000 Dalton. Ejemplos de pesos moleculares promedio de PEG incluyen alrededor de 20.000 Dalton, alrededor de 40.000 Dalton, alrededor de 60.000 Dalton y alrededor de 80.000 Dalton. En algunas realizaciones, el peso molecular de PEG es de 40.000 Dalton. También se pueden usar versiones ramificadas de PEG que tienen un peso molecular total de cualquiera de los anteriores. En algunas realizaciones, PEG tiene dos ramificaciones. En otras realizaciones, PEG tiene cuatro ramificaciones. En otra realización, PEG es un bis-PEG (NOF Corporation, DE-200MA), al que se conjugan dos adnectinas.

Se pueden usar técnicas de separación y purificación convencionales conocidas en el estado de la técnica para purificar adnectinas PEGiladas, tales como cromatografía de exclusión por tamaño (por ejemplo, filtración en gel) y cromatografía de intercambio iónico. Los productos también se pueden separar usando SDS-PAGE. Los productos que se pueden separar incluyen adnectinas monoPEGiladas, diPEGiladas, triPEGiladas, poliPEGiladas y no PEGiladas, y libres de PEG. El porcentaje de conjugados mono-PEG se puede controlar agrupando fracciones más amplias alrededor del pico de elución para aumentar el porcentaje de mono-PEG en la composición. Alrededor del 90% de los conjugados mono-PEG representan un buen equilibrio entre rendimiento y actividad.

En algunas realizaciones, la porción anti-CD4, la porción anti-gp41, el inhibidor peptídico de la fusión con el VIH, y combinaciones de estos, PEGilados, retienen, preferiblemente, al menos alrededor de 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de la actividad biológica asociada a la porción anti-CD4, la porción anti-gp41, adnectina o combinectina no modificadas. En algunas realizaciones, "actividad biológica" se refiere a la capacidad de unirse a CD4 o gp41, como se evalúa mediante Kd, kon o koff. En algunas realizaciones, la porción anti-CD4, la porción anti-gp41, la adnectina o combinectina de estas PEGiladas muestran un aumento de la unión a CD4 o gp41 con respecto a la porción anti-CD4, la porción anti-gp41, adnectina o combinectina no PEGiladas.

Dominio Fc de inmunoglobulina (y fragmentos)

En algunas realizaciones, el péptido de la invención se fusiona a un dominio Fc de inmunoglobulina, o a un fragmento o variante de aquel. Como se usa en este documento, una "región Fc funcional" es un dominio Fc o un fragmento de este que retiene la capacidad de unirse a FcRn. En algunas realizaciones, una región Fc funcional se une a FcRn, pero no tiene funciones efectoras. La capacidad de la región Fc o un fragmento de esta de unirse a FcRn se puede determinar mediante ensayos de unión estándares conocidos en el estado de la técnica. En otras realizaciones, la región Fc o un fragmento de esta se une a FcRn y tiene al menos una “función efectora” de una región Fc nativa. Los ejemplos de “funciones efectoras” incluyen unión a C1q; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación descendente de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B; BCR), etc. En general, las funciones efectoras requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (por ejemplo, una adnectina anti-CD4 o anti-N-17), y se pueden analizar mediante varios ensayos conocidos en el estado de la técnica para evaluar las funciones efectoras del anticuerpo.

Una “región Fc de la secuencia nativa” comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc natural. Una “variante de la región Fc” comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de la secuencia nativa en al menos una modificación de aminoácidos. Preferiblemente, la variante de la región Fc tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fc de la secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido de origen, por ejemplo, de alrededor de 1 a alrededor de 10 sustituciones de aminoácidos y, preferiblemente, de alrededor de 1 a alrededor de 5 sustituciones de aminoácidos en una región Fc de la secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido de origen. La variante de la región Fc en la presente tiene, preferiblemente, al menos alrededor de 80% de identidad de secuencia con una región Fc de la secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido de origen y, lo más preferiblemente, al menos alrededor de 90% de identidad de secuencia con aquella, más preferiblemente, al menos alrededor de 95% de identidad de secuencia con aquella.

En un ejemplo de realización, el dominio Fc deriva de una subclase IgG1; sin embargo, también se pueden usar otras subclases (por ejemplo, IgG2, IgG3 e IgG4). A continuación, se muestra la secuencia de un dominio Fc de inmunoglobulina IgG1 humana:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11)

La secuencia bisagra del núcleo está subrayada, y las regiones CH2 y CH3 están en formato regular. Debe comprenderse que la glicina y la lisina del extremo C terminal son opcionales en la combinectina de la invención.

La fusión se puede formar uniendo una adnectina de la invención a cualquier extremo de la molécula Fc, es decir, disposiciones Fc-adnectina o adnectina-Fc. En algunas realizaciones, Fc y adnectina se fusionan mediante un conector.

En algunas realizaciones, la región Fc usada en la fusión de adnectina comprende la región bisagra de una molécula Fc. Como se usa en este documento, la región "bisagra" comprende los restos bisagra del núcleo que abarcan las posiciones 1-16 de SEQ ID NO: 11 (DkTHTCPPCPAPELLG; SEQ ID NO: 12) de la región Fc de IgG1. En algunas realizaciones, la fusión adnectina-Fc adopta una estructura multimérica (por ejemplo, dímero) que se debe, en parte, a los restos de cisteína en las posiciones 6 y 9 de SEQ ID NO: 11 en la región bisagra.

En algunas realizaciones, una fusión adnectina-Fc puede tener las siguientes configuraciones: 1) adnectina-bisagra-Fc o 2) bisagra-Fc-adnectina. Por lo tanto, cualquier adnectina de la presente invención se puede fusionar a una región Fc que comprende una secuencia bisagra de acuerdo con estas configuraciones. En algunas realizaciones, se puede usar un conector para unir la adnectina a la porción bisagra-Fc, por ejemplo, un ejemplo de proteína de fusión puede tener la configuración adnectina-conector-bisagra-Fc o bisagra-Fc-conector-adnectina. Además, según el sistema donde se produce el polipéptido de fusión, se puede ubicar una secuencia líder en el extremo N terminal del polipéptido de fusión. Por ejemplo, si la fusión se produce en un sistema de mamífero, se puede agregar una secuencia líder al extremo N terminal de la molécula de fusión. Si se produce la fusión en E. coli, la secuencia de fusión estará precedida por una metionina.

VII. Tecnología de fusión ácido nucleico-proteína

En un aspecto, la invención proporciona una adnectina que comprende dominios de fibronectina tipo III, que se une a CD4 o al dominio n17 de gp41. Una forma de obtener y evaluar rápidamente dominios Fn3 con propiedades de unión específicas es la tecnología de fusión ácido nucleico-proteína. En la presente se utiliza la tecnología de expresión y etiquetado in vitro, denominada "PROfusión", que explota las fusiones de ácido nucleico-proteína (fusiones de ARN-y ADN-proteína) para identificar motivos de polipéptidos y aminoácidos novedosos que son importantes para la unión a proteínas. La tecnología de fusión de ácido nucleico-proteína es una tecnología que acopla en forma covalente una proteína a su información genética codificante. Para obtener una descripción detallada de la tecnología de fusión de ARN-proteína y los métodos de cribado de la colección de proteínas de soporte a base de fibronectina, consulte Szostak et al., las patentes estadounidenses N.os 6.258.558, 6.261.804, 6.214.553, 6.281.344, 6.207.446, 6.518.018 y 6.818.418; Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997;94:12297-12302; y Kurz et al., Molecules, 2000;5:1259-64, que se incorporan en la presente como referencia.

VIII. Vectores y polinucleótidos

Los ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las diversas proteínas o polipéptidos descritos en la presente se pueden sintetizar químicamente. El uso de codoesn se puede seleccionar a fin de mejorar la expresión en una célula. El uso de codones dependerá del tipo de célula seleccionado. Se desarrollaron patrones de uso de codones especializados para E. co liy otras bacterias, así como células de mamíferos, células vegetales, células de levadura y células de insectos. Véase, por ejemplo: Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU, 100(2):438-442 (21 de enero de 2003); Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(I):96-105 (octubre de 2002); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (octubre de 2001); Makrides et al., Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (septiembre de 1996); y Sharp et al., Yeast, 7(7):657-678 (octubre de 1991).

Las técnicas generales para la manipulación de ácidos nucleicos se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a edición, Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), o Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1987) y sus actualizaciones periódicas. En general, el ADN que codifica el polipéptido se conecta operativamente a elementos adecuados reguladores de la transcripción o traducción derivados de genes de mamíferos, virus o insectos. Estos elementos reguladores incluyen un promotor de la transcripción, una secuencia operativa opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión a mARN ribosómico y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción. También se incorpora la capacidad de replicarse en un huésped, en general conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes.

Las proteínas descritas en la presente se pueden producir en forma recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es, preferiblemente, una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N terminal de la proteína o del polipéptido maduros. Preferiblemente, la secuencia señal heteróloga seleccionada es una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa de señal) por la célula huésped.

Para las células huésped procariotas que no reconocen ni procesan una secuencia señal nativa, la secuencia señal es sustituida por una secuencia señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1 pp o líderes de enterotoxina termoestable II.

Para la secreción de levadura, la secuencia señal nativa se puede sustituir, por ejemplo, por un líder de invertasa de levadura, un líder de factor (que incluye líderes de factores alfa de Saccharomyces y Kluyveromyces) o un líder de fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans o la secuencia señal descrita en la patente estadounidense N.° 5.631.144. En la expresión en células de mamíferos, se encuentran disponibles secuencias señal de mamíferos, así como líderes secretores virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simple. El ADN de esas regiones precursoras se puede conectar en el marco de lectura al ADN que codifica la proteína.

Los vectores de expresión y los vectores de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. En general, en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Estas secuencias son conocidas para diversas bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, el origen del plásmido de 2 dos micrómetrosD es adecuado para la levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos. En general, el origen del componente de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamíferos (el origen de SV40 puede usarse generalmente solo porque contiene el promotor temprano).

Los vectores de expresión y de clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o traciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) proporcionan nutrientes importantes que no están disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.

En general, los vectores de expresión y de clonación contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped, y está ligado operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína de la invención, por ejemplo, una proteína soporte a base de fibronectina. Los promotores adecuados para usar con huéspedes procarióticos incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos, tales como el promotor Tan. Sin embargo, también son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para usar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) conectada operativamente al ADN que codifica la proteína de la invención. Las secuencias promotoras son conocidas por eucariotas. Prácticamente, todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases corriente arriba del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases corriente arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos, se encuentra una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas aquellas secuencias se insertan de manera adecuada en los vectores de expresión eucarióticos.

Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para usar con huéspedes de la levadura incluyen los promotores de 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glucolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Se puede controlar la transcripción de vectores en células huésped de mamíferos, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como virus de polioma, virus de difteria aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y, lo más preferiblemente, virus del simio 40 (SV40), de promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque término, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de célula huésped.

En general, la transcripción del ADN que codifica una proteína de la invención mediante eucariotas superiores aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector. Se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). En general, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el último sitio del origen de replicación (bp 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el último sitio del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucarióticos. El potenciador se puede empalmar con el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificadora de péptidos, pero se ubica preferiblemente en el sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión que se usan en las células huésped eucariotas (por ejemplo, levadura, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del mARN. En general, estas secuencias se encuentran disponibles en las regiones no traducidas 5’ y, ocasionalmente, 3’ de ADN o cADN eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcriptos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mARN que codifica la proteína de la invención. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina. Véanse WO 94/11026 y el vector de expresión allí descrito.

El ADN recombinante también puede incluir cualquier tipo de secuencia de etiqueta de proteína que pueda ser útil para purificar la proteína. Los ejemplos de etiquetas de proteínas incluyen, entre otras, una etiqueta de histidina, una etiqueta FLAG, una etiqueta myc, una etiqueta HA o una etiqueta GST. Los vectores de expresión y clonación adecuados para usar con huéspedes celulares de bacterias, hongos, levadura y mamíferos se pueden encontrar en Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, Nueva York (1985).

La construcción de expresión se introduce en la célula huésped mediante un método adecuado para la célula huésped, como será evidente para el experto de nivel medio en la técnica. En el estado de la técnica se conocen varios métodos para introducir ácidos nucleicos en células huésped, que incluyen, entre otros, electroporación; transfección con cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; e infección (en donde el vector es un agente infeccioso).

Las células huésped adecuadas incluyen células de procariotas, levadura, mamíferos o bacterias. Las bacterias adecuadas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacillus spp. También se puede usar levadura, preferiblemente, de la especie Saccharomyces, tal como S. cerevisiae, para la producción de polipéptidos. También se pueden usar varios sistemas de cultivo celular de mamíferos o insectos para expresar proteínas recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos se describen en Luckow et al. (Bio/Technology, 6:47 (1988)). Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero adecuadas incluyen células endoteliales, células renales de mono C0S-7, CV-1, células L, C127, 3T3, ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano y líneas celulares HeLa, 293, 293T y BHK. Los polipéptidos purificados se preparan cultivando sistemas de huésped/vector adecuados para expresar las proteínas recombinantes. En muchas aplicaciones, debido al pequeño tamaño de los polipéptidos descritos en este documento, la expresión en E. coli sería el método de expresión preferido. Luego la proteína se purifica del medio de cultivo o de los extractos celulares.

IX. Producción de proteínas

La presente invención también se refiere a líneas celulares que expresan una combinectina o proteína de fusión de esta. La creación y el aislamiento de líneas celulares que producen una combinectina se pueden lograr usando técnicas estándares conocidas en el estado de la técnica, tales como las descritas en este documento.

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos en la presente para la producción de proteínas, y se cultivan en un medio de nutrientes convencional modificado según sea adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. En los ejemplos que se muestran en este documento, las células huésped que se usan para la producción de proteínas de alto rendimiento (HTPP) y la producción a mediana escala fueron las de la cepa bacteriana HMS174.

Las células huésped que se usan para obtener las proteínas de la presente invención se pueden cultivar en varios medios. Los medios disponibles en el comercio, tales como, Ham’s F10 (Sigma), medio esencial mínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar células huésped. Además, varios de los medios descritos en Ham et al., Meth Enzymol., 58:44 (1979), Barites et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), las patentes estadounidenses N.os 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655, 5.122.469, 6.048.728, 5.672.502 o la patente estadounidense N.° RE 30.985 se pueden usar como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se puede enriquecer, según sea necesario, con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), amortiguadores (tales como HEPES), nucleótidos (tales como, adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco gentamicina), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se pueden incluir otros complementos necesarios en concentraciones adecuadas conocidas por el experto de nivel medio en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las que se usaron previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán evidentes para el experto de nivel medio en la técnica.

Las proteínas descritas en la presente también se pueden obtener con sistemas de traducción sin células. Para ello, los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido se deben modificar para permitir la transcripción in vitro, a fin de producir mARN y permitir la traducción libre de células de mARN en el sistema libre de células particular que se usa (eucariótico, tal como un sistema de traducción libre de células de levadura o mamífero, o procariótico, tal como un sistema de traducción libre de células bacterianas).

Las proteínas de la invención también se pueden obtener mediante síntesis química (por ejemplo, mediante los métodos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2.a edición, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984)). Las modificaciones de la proteína también se pueden realizar mediante síntesis química.

Las proteínas de la presente invención se pueden purificar mediante métodos de aislamiento/purificación de proteínas generalmente conocidos en el campo de la química de las proteínas. Los ejemplos incluyen extracción, recristalización, salado (por ejemplo, con sulfato de amonio o sulfato de sodio), centrifugación, diálisis, ultrafiltración, cromatografía por adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de fase normal, cromatografía de fase inversa, filtración en gel, cromatografía de permeación en gel, cromatografía por afinidad, electroforesis, distribución a contracorriente o cualquier combinación de estos. Después de la purificación, los polipéptidos se pueden intercambiar en diferentes amortiguadores y/o se pueden concentrar mediante diversos métodos conocidos en el estado de la técnica, que incluyen, por ejemplo, filtración y diálisis.

El polipéptido purificado es, preferiblemente, al menos 85% puro, más preferiblemente, al menos 95% puro y, lo más preferiblemente, al menos 98% puro. Independientemente del valor numérico exacto de la pureza, el polipéptido es suficientemente puro para usar como producto farmacéutico.

X: Caracterización biofísica y bioquímica

La unión de la proteína de la invención a una molécula diana (por ejemplo, CD4 o gp41) se puede evaluar en términos de constantes de equilibrio (por ejemplo, disociación, Kd) y en términos de constantes cinéticas (por ejemplo, constante de asociación, kon, y constante de disociación, koff). En general, la proteína de la invención se une a una molécula diana con una Kd de menos de 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM o 100 pM, aunque se pueden tolerar valores de Kd más elevados cuando koff es suficientemente baja o kon es suficientemente alta.

Ensayos in vitro de afinidad de unión

Las proteínas que se unen a CD4 o gp41 se pueden identificar usando diversos ensayos in vitro. Preferiblemente, los ensayos son ensayos de alto rendimiento que permiten la evaluación de varios candidatos simultáneamente.

En algunas realizaciones, las interacciones biomoleculares se pueden controlar en tiempo real con el sistema Biacore, que utiliza SPR para detectar cambios en el ángulo de resonancia de la luz en la superficie de una película dorada delgada en un soporte de vidrio debido a los cambios en el índice refractario de la superficie hasta 300 nm de distancia. El análisis Biacore genera constantes de velocidad de asociación, constantes de velocidad de disociación, constantes de disociación de equilibrio y constantes de afinidad. La afinidad de unión se obtiene evaluando las constantes de velocidad de asociación y disociación con un sistema de resonancia de plasmones superficiales Biacore (Biacore, Inc.). Se activa un chip biosensor para el acoplamiento covalente de la diana. Luego, la diana se diluye y se inyecta en el chip para obtener una señal en unidades de respuesta de material inmovilizado. Dado que la señal en unidades de resonancia (RU) es proporcional a la masa de material inmovilizado, esto representa un rango de densidades diana inmovilizadas en la matriz. Los datos de asociación y disociación se ajustan simultáneamente en un análisis global para resolver la expresión de velocidad neta para una interacción biomolecular 1:1, lo que da como resultado mejores valores de ajuste para kon, koff y Rmax (respuesta máxima en saturación). Las constantes de disociación de equilibrio, Kd, se calculan de las mediciones SPR, como koff/kon.

En algunas realizaciones, la combinectina de la invención muestra una Kd de 100nM o menos. Preferiblemente, Kd es de 10 nM o menos. Más preferiblemente, Kd es de 1 nM o menos.

En algunas realizaciones, la combinectina de la invención muestra una IC⁵⁰de 5 nM o menos, 4 nM o menos, 3 nM o menos, 2,5 nM o menos, 2 nM o menos, 1,5 nM o menos, 1 nM o menos, 0,5 nM o menos, 0,2 nM o menos, o 0,1 nM o menos. Preferiblemente, IC⁵⁰es de 1,5 nM o menos. Más preferiblemente, IC⁵⁰es de 0,5 nM o menos.

Cabe destacar que los ensayos descritos anteriormente se dan a modo de ejemplo y que se puede utilizar cualquier método conocido en el estado de la técnica para determinar la afinidad de unión entre proteínas (por ejemplo, transferencia a base de fluorescencia (FRET), enzimoinmunoanálisis de adsorción y ensayos de unión competitiva (por ejemplo, radioinmunoensayos)), a fin de evaluar las afinidades de unión de la combinectina de la invención.

En la presente invención, se utilizaron ensayos ELISA para identificar las adnectinas que se unen a CD4 o gp41, y las afinidades se determinaron mediante SPR Biacore. También se usaron ensayos FACS para determinar la EC50 de unión de la adnectina CD4 (sola o como parte de la combinectina total) a CD4 como se presenta naturalmente en las superficies de linfocitos T. Las afinidades de los péptidos se midieron mediante SPR Biacore.

Como se describe en la Tabla 5 a continuación, el rango de afinidades de unión (mediante SPR) de adnectinas CD4 a CD4 fue de 0,3 nM a 140 nM; el rango de unión de adnectinas N17 a dianas a base de gp41 artificiales fue de 0,5 nM a 40 nM; el rango de unión de péptidos fue de 0,2 nM a 70 nM. Las afinidades basadas en SPR de la combinectina de la invención y de los componentes individuales de esta se muestran en la Tabla 5 a continuación.

Tabla 5

Afinidades de unión de combinectina y los componentes individuales

Ensayos in vitro de actividad inhibidora

Existen diversos sistemas in vitro reconocidos en el estado de la técnica que permiten el análisis de la potencia de la combinectina (o de inhibidores individuales o combinaciones de estos) contra la infección de VIH-1. Estos incluyen sistemas que permiten la replicación total de virus derivado de laboratorio o diversas cepas aisladas clínicas en células cultivadas o cultivos de monocitos de sangre periférica. Además, los sistemas que recapitulan las primeras etapas de infección en la entrada celular, sin usar un virus viable, se pueden usar para analizar la eficacia de la combinectina, los inhibidores individuales o las combinaciones de estos. Estos incluyen, entre otros, virus “pseudotipados” que contienen eliminaciones que les impiden producir células o viriones infecciosos que solo expresan el gen VIH gp160 que se puede usar para controlar la reacción de fusión específica de VIH-1 a células diana.

Modelos in vivo

Un experto de nivel medio en la técnica conoce diversos modelos de animales reconocidos en el estado de la técnica que permiten la replicación y, en algunos casos, recapitulan los síntomas de la infección por VIH. Estos modelos se pueden usar para evaluar la eficacia de la combinectina, los inhibidores individuales, o combinaciones de estos, de la invención.

IX. Aplicaciones terapéuticas

En un aspecto, la presente invención proporciona combinectinas útiles para el tratamiento de VIH. En consecuencia, en algunas realizaciones, la invención proporciona métodos para atenuar o inhibir la fusión con el VIH en un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de la combinectina de la invención. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, la combinectina de la invención es aceptable desde el punto de vista farmacéutico para un mamífero, en particular, un ser humano. Un polipéptido “aceptable desde el punto de vista farmacéutico” se refiere a un polipéptido que se administra a un animal sin consecuencias médicas adversas considerables.

En algunas realizaciones de la divulgación, la combinectina de la presente invención se administra a un sujeto en combinación (en forma concurrente o separada) con un agente conocido en el estado de la técnica que es útil para el trastorno o la enfermedad particulares que se tratan.

En algunas realizaciones, la población diana de pacientes para el tratamiento con combinectina es una que no puede recibir un tratamiento estándar para la enfermedad que se trata, por ejemplo, debido a factores como la edad, las afecciones preexistentes, la información genética y/o las comorbilidades. La combinectina de la invención puede funcionar como alternativa a tratamientos existentes asociados a efectos adversos sustanciales o problemas con respecto a la seguridad.

En algunas realizaciones, la población diana de pacientes para el tratamiento con combinectina comprende individuos no infectados con alto riesgo de infección, debido al estilo de vida u otros factores agravantes. La combinectina se usa para proteger a estos individuos de la infección por VIH (profilaxis previa a la exposición).

XII. Composiciones farmacéuticas

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una combinectina o proteínas de fusión de esta descritas en este documento, en donde la composición es esencialmente libre de endotoxinas, o al menos contiene solo los niveles aceptables de endotoxinas, según lo determina el organismo regulador correspondiente (por ejemplo, FDA).

Las composiciones de la presente invención pueden ser en forma de píldora, comprimido, cápsula, líquido o comprimido de liberación sostenida para la administración oral; un líquido para la administración intravenosa, subcutánea o parenteral; o gel, loción, ungüento, crema, polímero u otro vehículo de liberación sostenida para la administración local, o una suspensión pulverizable adecuada para la administración inhalatoria o intranasal.

Los métodos conocidos en el estado de la técnica para obtener composiciones se encuentran, por ejemplo, en “Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20.a ed., ed. A. R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pa.). Las composiciones para la administración parenteral pueden contener, por ejemplo, excipientes, agua estéril, solución salina, polialquilenglicoles, tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal o naftalenos hidrogenados. Se pueden usar polímeros de láctido biodegradable biocompatible, copolímeros de láctido/glicólido o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno para controlar la liberación de los compuestos. Se pueden usar composiciones nanoparticuladas (por ejemplo, nanopartículas biodegradables, nanopartículas de lípidos sólidos, liposomas) para controlar la biodistribución de los compuestos. Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. La concentración del compuesto en la composición varía según varios factores, que incluyen la dosis del fármaco que se desea administrar y la vía de administración.

Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol de fenol, butilo o bencilo; parabenos de alquilo, tales como parabeno de metilo o propilo; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, que incluyen glucosa, manosa o dextranos; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de proteína Zn); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN, PLURONIC™ o polietilenglicol (PEG).

Los ingredientes activos también pueden estar dentro de microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de gelatina o hidroximetilcelulosa y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980).

Se pueden realizar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen las proteínas de la invención; las matrices tienen aspecto de artículos con forma, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcohol vinílico)), poliláctidos (patente estadounidense N.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como LUPRON DEPOT TM (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Si bien los polímeros, tales como de etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glucólico, permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante períodos más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas de la invención permanecen en el cuerpo durante un largo tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, lo que da como resultado una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden elaborar estrategias razonables para la estabilización según el mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación del enlace S-S intermolecular mediante el intercambio de tiodisulfuro, la estabilización se puede lograr mediante la modificación de los restos de sulfhidrilo, la liofilización de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, el uso de aditivos adecuados y el desarrollo de composiciones de la matriz polimérica específica.

Las composiciones de la presente invención para uso oral incluyen comprimidos que contienen ingredientes activos en una mezcla con excipientes no tóxicos aceptables desde el punto de vista farmacéutico. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes o agentes de relleno inertes (por ejemplo, sacarosa y sorbitol), agentes lubricantes, agentes deslizantes y antiadhesivos (por ejemplo, estearato de magnesio, estearato de zinc, ácido esteárico, sílice, aceites vegetales hidrogenados o talco). Las composiciones para uso oral también se pueden proveer como comprimidos masticables o como cápsulas de gelatina dura, en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte o como cápsulas de gelatina blanda, en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o con un medio oleoso.

Con frecuencia, la composición farmacéutica que se usa para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se puede lograr mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización mediante este método se puede llevar a cabo antes o después de la liofilización y reconstitución. La composición para la administración parenteral se puede almacenar liofilizada o en solución. Además, las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón que se puede perforar con una aguja de inyección hipodérmica.

Una vez que la composición farmacéutica se formula, se puede almacenar en viales estériles como solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidratado o liofilizado. Estas formulaciones se pueden almacenar en forma lista para usar o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere de la reconstitución antes de la administración.

Las composiciones de este documento también pueden contener más de un compuesto activo, según sea necesario, para la afección particular que se trate, preferiblemente, aquellos que tienen actividades complementarias que no se perjudican entre sí. Estas moléculas están presentes de manera combinada en cantidades que son eficaces para la finalidad prevista.

XIII. Administración

Una composición farmacéutica que comprende una combinectina o proteínas de fusión de esta de la presente invención se puede administrar a un sujeto con VIH usando técnicas de administración estándares que incluyen la administración oral, parenteral, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o con supositorios. Preferiblemente, la administración de las combinectinas de la invención es por vía parenteral. Como se usa en este documento, el término "parenteral" tal como se usa aquí incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal o intraperitoneal. Se prefiere la administración sistémica periférica mediante inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.

Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a una dosis que produce los efectos terapéuticos para los cuales se la administra. Una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que se usará terapéuticamente depende, por ejemplo, de los objetivos y del contexto terapéutico. Un experto de nivel medio en la técnica comprenderá que los niveles de dosis adecuados para el tratamiento variarán, en parte, según la molécula que se administra, la indicación para la cual se usa la molécula del agente de unión, la vía de administración, el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de los órganos) y la afección (edad y salud general) del paciente.

Por ejemplo, la dosis terapéuticamente eficaz se puede calcular inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, tales como ratones, ratas, conejos, perros, cerdos o monos. También se puede usar un modelo animal para determinar el rango de concentración y la vía de administración adecuados. Luego, se puede usar esa información para determinar las dosis y las vías de administración útiles en seres humanos.

La dosis exacta se determinará en función de los factores relacionados con el sujeto que necesita tratamiento y se puede establecer mediante técnicas estándares. La dosis y la administración se ajustan para brindar niveles suficientes del compuesto activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden tener en cuenta incluyen la gravedad de la enfermedad, la salud del paciente, la edad, el peso y el sexo del sujeto, el tiempo y la frecuencia de administración, la combinación farmacológica, la sensibilidad a la reacción y la respuesta a la terapia. En general, la combinectina de la presente invención se administra de alrededor de 0,01 mg/kg a alrededor de 50 mg/kg por día, preferiblemente, de alrededor de 0,01 mg/kg a alrededor de 30 mg/kg por día, lo más preferiblemente, de alrededor de 0,01 mg/kg a alrededor de 20 mg/kg por día. En algunas realizaciones, la combinectina de la presente invención se administra en dosis semanales de alrededor de 0,01 mg/kg a alrededor de 10 mg/kg, más preferiblemente, de alrededor de 0,01 a alrededor de 5 mg/kg, lo más preferiblemente, de alrededor de 0,01 a alrededor de 1 mg/kg. De manera alternativa, la combinectina de la invención se administra de alrededor de 15 a alrededor de 100 mg/semana, de alrededor de 20 a alrededor de 80 mg/semana, de alrededor de 20 a alrededor de 60 mg/semana, o alrededor de 20 a alrededor de 25 mg/semana.

La frecuencia de administración de la dosis depende de los parámetros farmacocinéticos de la molécula del agente de unión en la formulación usada. En general, una composición se administra hasta que se obtiene una dosis que permite obtener el efecto deseado. Por lo tanto, la composición se puede administrar como una dosis única o como dosis múltiples (con la misma concentración/dosificación o con concentraciones/dosificaciones diferentes) en el tiempo, o como una infusión continua. Con frecuencia, se realiza un refinamiento de la dosis adecuada. Las dosis adecuadas se pueden determinar mediante el uso de datos adecuados de respuesta a la dosis. Por ejemplo, la combinectina se puede administrar diariamente (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 veces al día) o con menor frecuencia (por ejemplo, una vez cada dos días, una o dos veces por semana o mensualmente). Además, como se sabe en el estado de la técnica, puede ser necesario realizar ajustes en función de la edad, el peso corporal, la salud, el sexo, la alimentación, el tiempo de administración, las interacciones farmacológicas y la gravedad de la enfermedad, y los pueden determinar el experto de nivel medio en la técnica mediante experimentos de rutina. La combinectina se administra de manera adecuada al paciente una sola vez o durante una serie de tratamientos.

La administración de una combinectina o una fusión de esta, y uno o más agentes terapéuticos adicionales, ya sea coadministrados o administrados secuencialmente, se puede llevar a cabo como se describió anteriormente para las aplicaciones terapéuticas. Un experto de nivel medio en la técnica comprenderá que los portadores, diluyentes y excipientes adecuados y aceptables desde el punto de vista farmacéutico para la coadministración dependerán de las características del agente terapéutico particular que se administra.

XII. Kits y artículos de fabricación

La combinectina de la invención se puede proporcionar en un kit, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones de uso para métodos terapéuticos o de diagnóstico de la invención.

Por ejemplo, en una realización de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento o la prevención de trastornos o afecciones descritas anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes se pueden formar con diversos materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición de la invención que es eficaz para el tratamiento del VIH y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón que se puede perforar con una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es una combinectina de la invención. La etiqueta que se encuentra en el recipiente, o que está asociada a este, indica que la composición es útil para tratar el VIH. El artículo de fabricación también puede comprender un segundo recipiente que comprende un amortiguador aceptable desde el punto de vista farmacéutico, tal como solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseados desde el punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.

La invención se describe por referencia a los siguientes ejemplos, que son solo ilustrativos y no pretenden limitar la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Producción/purificación de combinectina

Tándem de combinectina VIH - bacteriano

El ADN se transformó en células bacterianas BL21 (DE3).

Las células se cultivaron en cultivo bacteriano a ~37C hasta alcanzar una OD⁶⁰⁰diana.

La temperatura de cultivo disminuyó a ~30C, y el cultivo se indujo con IPTG y se recolectó después de varias horas.

La recolección se realizó usando una centrifugadora.

La recuperación de proteína se realizó usando una lisis química y un microfluidizador, y luego se clarificó mediante centrifugación o filtración de flujo tangencial. El lisado se procesó inmediatamente o se congeló para usarse posteriormente.

Se purificó mediante cromatografía de interacción hidrófoba, luego cromatografía de hidroxiapatita y/o cromatografía de intercambio iónico. Se formuló y se concentró usando filtración de flujo tangencial.

Construcción Fc-combinectina VIH; Cultivo de células de mamíferos

El ADN se transfectó en células de mamífero adecuadas

Las células se cultivaron en cultivo celular

Se cosecharon mediante centrifugación y/o filtración

Se purificaron usando cromatografía por afinidad y cromatografía de intercambio iónico

Se formuló y se concentró usando filtración de flujo tangencial.

Construcción HuSA-combinectina VIH; Cultivo de células de mamíferos

El ADN se transfectó en células de mamífero adecuadas

Las células se cultivaron en cultivo celular

Se cosecharon mediante centrifugación y/o filtración

Se purificó mediante cromatografía de interacción hidrófoba, luego cromatografía de hidroxiapatita y/o cromatografía de intercambio iónico.

Se formuló y se concentró usando filtración de flujo tangencial.

Ejemplo 2 - Ensayo de potencia de combinectina

Se obtuvieron células MT-2, células HEK 293T y el clon de ADN proviral de NL^4-3del "AIDS Research and Reference Reagent Program" del NIH. Las células MT-2 se propagaron en medio RPMI 1640 enriquecido con 10% de suero bovino fetal (FBS) termoinactivado, 10 mM de tampón HEPES, pH 7,55 y 2 mM de L-glutamina. Las células HEK 293T se propagaron en medio DMEM enriquecido con 10% de FBS termoinactivado, 10 mM de tampón HEPES, pH 7,55 y 2 mM de L-glutamina. El virus NL-Rluc recombinante, en donde una sección del gen nef del clon proviral de NL^4-3se reemplazó con el gen luciferasa de Renilla, se produjo en Bristol-Myers Squibb. El virus competente para la replicación se cosechó 3 días después de la transfección de células HEK 293T con el clon proviral pNL-Rluc modificado. Se realizaron transfecciones con LipofectAMINE PLUS (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El virus se tituló en células MT-2 usando la actividad enzimática de luciferasa como biomarcador. El virus NL-Rluc usó, para infectar las células MT-2, una multiplicidad de 0,01 durante 1 hora antes de agregarse a los péptidos en placas de 96 cavidades. Los péptidos se diluyeron en serie 3 veces, y 11 concentraciones se colocaron en placas en triplicado. Después de 4-5 días de incubación, las células se procesaron y se cuantificaron para determinar el crecimiento del virus según la cantidad de luciferasa expresada. La luciferasa se cuantificó con el kit Dual Luciferase de Promega (Madison, WI), con modificaciones al protocolo del fabricante. La solución de lisis pasiva diluida se mezcló previamente con el reactivo del ensayo de luciferasa que se volvió a suspender y luego se volvió a suspender en sustrato de Stop & Glo (relación 2:1:1). Se agregó un total de 50 ql de la mezcla a cada cavidad aspirada en placas de ensayo, y se midió inmediatamente la actividad de luciferasa en Wallac TriLux (Perkin-Elmer, Waltham, MA). La concentración eficaz al 50% (EC50) se calculó comparando la cantidad de luciferasa que se produjo en presencia de un péptido inhibidor en comparación con las cavidades en donde no se añadió péptido.

Ejemplo 3 - Evaluación de la farmacocinética de las combinectinas

Modelo de ratón transgénico de CD4 humana

Se obtuvieron ratones macho y hembra heterocigóticos de CD4 humana de Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME. Estudios PK en ratones WT.

Se llevaron a cabo estudios de dosis única de bolo IV de 8-21 días en ratones WT C57Bl/6 hembra para evaluar las propiedades PK de las diversas combinectinas. Las fusiones Fc-combinectina se dosificaron a 10 mg/kg, y las fusiones HSA-combinectina se dosificaron a 8,8 mg/kg. Las muestras de plasma se recolectaron en CPD y se conservaron a -80 °C hasta el análisis.

Estudios PK en ratones hCD4.

Se llevaron a cabo estudios de dosis única de bolo IV de 7-10 días en ratones hCD4 heterocigóticos para evaluar las propiedades PK de diversas combinectinas en presencia de la diana. Las dosis de combinectinas y los métodos de recolección de muestras eran iguales a los descritos anteriormente para los ratones WT.

Estudios en Macaca fascicularis.

Se realizó un estudio de dosis única de 1 semana en Macaca fascicularis hembra para determinar la PK de las combinectinas. Después de una dosis de 1 mg/kg, las muestras de suero se recolectaron en los momentos indicados,

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que comprende dos dominios activos, en donde un dominio es una proteína adnectina anti-CD4, en donde la proteína adnectina anti-CD4 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 95-114 y el otro dominio es una porción inhibidora peptídica de la fusión con el VIH en donde el inhibidor peptídico de la fusión con el VIH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 372-392.

2. Un polipéptido que comprende dos dominios activos, en donde un dominio es una proteína adnectina anti-N17, en donde la proteína adnectina anti-N17 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 115-371, y el otro dominio es una porción inhibidora peptídica de la fusión con el VIH en donde el inhibidor peptídico de la fusión con el VIH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 372-392..

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde los dos dominios están conectados entre sí en cualquier orden mediante conectores.

4. El polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, que también comprende una o más porciones farmacocinéticas (PK) seleccionadas del grupo que consiste en polietilenglicol, ácido siálico, Fc, fragmento Fc, transferrina, albúmina de suero, una proteína de unión a albúmina de suero y una proteína de unión a inmunoglobulina de suero.

5. Un polipéptido que comprende tres dominios activos, en donde un dominio es una proteína adnectina anti-CD4, un segundo dominio es una proteína adnectina anti-N17, y el tercer dominio es un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH, en donde la proteína adnectina anti-CD4 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 95-114, en donde la proteína adnectina anti-N17 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 115-371 y el tercer dominio es un inhibidor peptídico de la fusión con el VIH, en donde el inhibidor peptídico de la fusión con el VIH comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 372-392.

6. El polipéptido de la reivindicación 5, en donde los tres dominios están conectados entre sí en cualquier orden mediante conectores.

7. El polipéptido de la reivindicación 5, que también comprende una o más porciones farmacocinéticas (PK) seleccionadas del grupo que consiste en polietilenglicol, ácido siálico, Fc, fragmento Fc, transferrina, albúmina de suero, una proteína de unión a albúmina de suero y una proteína de unión a inmunoglobulina de suero.

8. El polipéptido de la reivindicación 7, en donde la porción PK es albúmina de suero humano.

9. El polipéptido de la reivindicación 5, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones que no son de conectores de SEQ iD NO: 9.

10. El polipéptido de la reivindicación 5, que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones que no son de conectores de SEQ iD NO: 10.

11. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 9.

12. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 10.

13. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador.

14. Un polipéptido según las reivindicaciones 1-12 para uso en terapia.

15. Un polipéptido según las reivindicaciones 1 -12 para uso en el tratamiento del VIH.