CN107922474A - 靶向hiv融合的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多肽，其包含CD4结合部分、gp41结合部分、HIV融合肽抑制剂部分和它们的组合。更具体地，本发明涉及多肽，其包含结合CD4的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白、结合gp41的N17结构域的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白和HIV融合肽抑制剂或它们的组合。本发明也涉及所述创新性蛋白在治疗HIV的治疗应用中的用途。

Description

靶向HIV融合的多肽

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年4月24日提交的美国临时申请系列号62/152,271和2015年11月19日提交的美国临时申请系列号62/257,474的优先权；其整个内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及包含CD4结合部分、gp41结合部分、HIV融合肽抑制剂部分和它们的组合的多肽。更具体地，本发明涉及这样的多肽，其包含结合CD4的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白、结合gp41的N17结构域的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白和HIV融合肽抑制剂或它们的组合。本发明也涉及所述创新性蛋白在治疗HIV的治疗应用中的用途。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征（AIDS）是被称作人免疫缺陷病毒（HIV）的逆转录病毒的感染的结果。它仍然是一个重大医学问题，据估计在2013年末世界上有3500万人受到感染。在那一年中，存在210万例新感染，150万人死于AIDS引起的并发症。

HIV-感染的个体的当前疗法由经批准的抗逆转录病毒剂的组合组成。超过二十四种药物目前被批准用于HIV感染，无论是作为单一药剂，固定剂量组合，还是单个片剂方案，后二者含有2-4种经批准的药剂。这些药剂属于许多不同种类，它们靶向病毒酶或病毒蛋白在病毒生命周期中的功能。因而，将药剂分类为核苷酸逆转录酶抑制剂（NRTI）、非核苷酸逆转录酶抑制剂（NNRTI）、蛋白酶抑制剂（PI）、整合酶抑制剂（INI）或进入抑制剂（一种进入抑制剂, 马拉韦罗, 靶向宿主CCR5蛋白，而另一种, 恩夫韦肽, 是靶向病毒gp160蛋白的gp41区域的肽）。另外，不具有抗病毒活性的药代动力学增强剂（cobicistat）已经被批准用于与需要强化的抗逆转录病毒剂（ARV）联合使用。

尽管有药剂和药物组合的武装（armamentarium），仍然存在对新抗逆转录病毒剂的医学需要，这部分地归因于对抵抗感染的长期给药的需要。记载了与长期毒性有关的重大问题，从而建立了解决和预防这些并存病（例如，CNS、CV/代谢、肾病）的需要。并且，由于抗性株的存在或出现或者由于归因于休药期或不利副作用的不顺从，当前疗法的逐渐增加的失效率持续成为问题。例如，尽管治疗，已经估计63%的接受联合治疗的主体仍然是病毒血的，因为它们具有>500拷贝/ml的病毒载量(Oette, M. 等人, “Primary HIV DrugResistance and Efficacy of First-Line Antiretroviral Therapy Guided byResistance Testing”, J. Acq. Imm. Def. Synd., 41(5):573-581 (2006))。在这些患者中，76%具有耐受一类或多类抗逆转录病毒剂的病毒。所以，需要更方便的新药物，对抗性的发生具有高遗传屏障，且具有与当前药剂相比改善的安全性。

现在众所周知的是，HIV通过特定过程感染细胞，通过所述过程在细胞膜和病毒膜之间发生融合。该过程的普遍接受的模型是，病毒包膜糖蛋白复合物（gp120/gp41）与靶细胞的膜上的细胞表面受体相互作用。gp120与细胞受体（例如，与趋化因子共受体诸如CCR5或CXCR4组合的CD4）结合以后，在gp120/gp41复合物中诱导构象变化，其允许gp41插入靶细胞的膜中并介导膜融合。因为这些进入过程发生在细胞膜上，它们适合被包括生物肽的大分子抑制(Haqqani等人, Antiviral Res., 98:158 (2013))。例如，经批准的抗病毒肽恩夫韦肽(FUZEON®)靶向gp41的参与膜融合的区域。较大多肽诸如单克隆抗体也可以抑制病毒进入的不同方面。靶向病毒进入的第一步（与细胞受体CD4的相互作用）的单克隆抗体(伊巴珠单抗（ibalizumab）; Bruno等人, J. Antimicrob. Chemother., 65:1839 (2010))、以及靶向共受体CCR5的单克隆抗体(PRO-140; Tenorio, Curr. HIV/AIDS Rep., 8:1(2011))已经在2a期试验中表现出阳性结果。这些抗体也具有作为长效抗逆转录病毒的性质，具有每周至每月的潜在定量施用方案(Jacobson等人, J. Infect. Dis., 201:1481(2010)；Jacobson等人, Antimicrob. Agents Chemother., 53:450 (2009))。

肽进入抑制剂的另一种性质是，如果两种肽抑制剂彼此连接，或如果单一抑制剂通过结合膜生物分子定位在作用部位附近，可以得到增强的或协同的效能。因而，将融合肽抑制剂连接至靶向CCR5的单克隆抗体(Kopetzki等人, Virol. J., 5:56 (2008))或将胆固醇部分连接至肽融合抑制剂的C-端以将它置于靶细胞膜表面处(Ingallinela等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106:5801 (2009)；Augusto等人, J. Antimicrob. Chemother., 69:1286 (2014))，与单独分子相比会急剧增加组合的分子的效能。类似地，由与伊巴珠单抗融合的靶向gp120的抗-HIV-1中和抗体片段组成的双特异性抗体表现出与各种抑制剂相比效能的协同增加(Sun等人, J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 66:473(2014))。本发明的Combinectin分子利用了这些各种性质。

发明概述

本发明涉及包含CD4结合部分、gp41结合部分、HIV融合肽抑制剂部分和它们的组合的多肽。

本发明的一个实施方案涉及多肽，其包含结合CD4的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白、结合gp41的N17结构域的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白和HIV融合肽抑制剂。

在本发明的一个实施方案中，所述三种结构域通过接头彼此连接。在本发明的另一个实施方案中，所述三种结构域可以以任意次序彼此连接。在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO: 3、5、7或9的非接头区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

本发明也涉及多肽，其包含结合CD4的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白和结合gp41的N17结构域的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白。在本发明的一个实施方案中，所述两种结构域通过接头彼此连接。在本发明的另一个实施方案中，所述两种结构域可以以任意次序彼此连接。

本发明也涉及多肽，其包含结合CD4的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白和HIV融合肽抑制剂。在本发明的一个实施方案中，所述两种结构域通过接头彼此连接。在本发明的另一个实施方案中，所述两种结构域可以以任意次序彼此连接。

本发明也涉及多肽，其包含结合gp41的N17结构域的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白和HIV融合肽抑制剂。在本发明的一个实施方案中，所述两种结构域通过接头彼此连接。在本发明的另一个实施方案中，所述两种结构域可以以任意次序彼此连接。在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO: 410-428的非接头区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

本发明的另一个实施方案也涉及多肽。其包含三种活性结构域：结合CD4的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白、gp41结合部分和HIV融合肽抑制剂部分。本发明也涉及多肽，其包含结合gp41的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白、CD4结合部分和HIV融合肽抑制剂部分。本发明也涉及多肽，其包含CD4结合部分、gp41结合部分和HIV融合肽抑制剂。在本发明的一个实施方案中，所述两种结构域通过接头彼此连接。在本发明的另一个实施方案中，所述两种结构域可以以任意次序彼此连接。

本发明也涉及多肽，其包含两种活性结构域：结合CD4的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白和gp41结合部分。本发明也涉及多肽，其包含结合gp41的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白和CD4结合部分。本发明也涉及多肽，其包含CD4结合部分和HIV融合肽抑制剂。本发明也涉及多肽，其包含gp41结合部分和HIV融合肽抑制剂。在本发明的一个实施方案中，所述两种结构域通过接头彼此连接。在本发明的另一个实施方案中，所述两种结构域可以以任意次序彼此连接。

本发明的另一个实施方案也涉及抗-CD4 Adnectin、抗-N17Adnectin或HIV融合肽抑制剂。在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含分别与SEQ ID NO: 95-114或SEQ IDNO: 115-371或SEQ ID NO: 372-392的非接头区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在本发明的另一个实施方案中，将药代动力学(PK)部分连接至本发明的多肽。PK部分的例子包括、但不限于聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、转铁蛋白、血清白蛋白(HSA)、血清白蛋白结合蛋白和血清免疫球蛋白结合蛋白。在本发明的一个实施方案中，所述PK部分可以连接至接头区域或本发明的多肽的N-或C-端。在本发明的另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO: 4、6、8或10的非接头区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

本发明也涉及多肽，其包含SEQ ID NO: 3-10所示的序列中的任一个的氨基酸序列。

本发明也涉及药物组合物，其包含一种或多种本发明的多肽和载体。

本发明还提供了治疗主体中的HIV的方法，所述方法包括施用有效量的本发明的多肽。

附图说明

图1是替代性Combinectin的简图。所述Adnectin之一结合CD4，第二个Adnectin结合gp41的HR1区域。所述肽也结合gp41的HR1区域。Combinectin的不同组分通过接头以任意次序彼此连接。所述Combinectin中的任一个可以具有连接的PK部分，诸如HSA或Fc。

图2显示了Fc融合体-Combinectin 3137(SEQ ID NO:4)、3151(SEQ ID NO:6)和人血清白蛋白(HSA)融合体-Combinectin 3191(SEQ ID NO:8)和3202(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。Fc和HSA序列以粗体显示。抗-CD4 Adnectin序列标有下划线。抗-N17 Adnectin序列标有双下划线。HIV抑制剂肽序列标有下划线以粗体显示。接头序列以斜体显示。

图3显示了在实施例2中描述的Combinectin 3137、3151、3191和3202的效能(EC₅₀和EC₉₀)。

图4显示了在实施例3中描述的Combinectin 3137、3151、3191和3202的PK性质。

图5显示了与HIV融合肽抑制剂组合的抗-N17 Adnectin的氨基酸序列，其对应于在表4中描述的序列减去N-端和C-端延伸区域。抗-N17 Adnectin序列标有双下划线。HIV融合肽抑制剂序列标有下划线以粗体显示。接头序列以斜体显示。

图6显示了抗-CD4 Adnectin的CD环的WebLogo。WebLogo产生序列标识，即在多序列比对内的图案的图解表示。每个标识由字母的堆叠组成，序列中的每个位置一个堆叠。每个堆叠的总高度指示在该位置处的序列保守(以位为单位测量)，而在堆叠内的符号的高度反映了在该位置处的对应氨基或核酸的相对频率(Crooks, G.E. 等人, “WebLogo: Asequence logo generator”, Genome Research, 14:1188-1190 (2004))。

图7显示了抗-CD4 Adnectin的FG环的WebLogo (Schneider, T.D. 等人,“Sequence Logos: A New Way to Display Consensus Sequences”, Nucleic Acids Res., 18:6097-6100 (1990))。

图8显示了HIV融合肽抑制剂的点突变数据。在HIV融合肽抑制剂的C-端附近的天冬氨酸(D)被沿着x轴列出的氨基酸替换。

发明详述

定义

除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与熟练的技术人员的通常理解相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和组合物可以用在本发明的实践或测试中，但是本文描述了优选的方法和组合物。

本文中使用的“多肽”表示2个或更多个氨基酸的任意序列，不论长度、翻译后修饰或功能。“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换地使用。可以以多种标准化学方式（例如，氨基酸可用保护基团修饰；可使羧基末端氨基酸成为末端酰胺基；氨基末端残基可用基团修饰以例如增强亲脂性；或多肽可经化学糖基化或以其它方式修饰以增加稳定性或体内半衰期）中的任一种修饰多肽。多肽修饰可以包括另一结构（诸如环状化合物或其它分子）与所述多肽的连接，且也可以包括含有一个或多个呈经改变的构型（即，R或S；或L或D）的氨基酸的多肽。

本发明的肽可以包括，例如，从纤连蛋白的第十个III型结构域衍生出的蛋白，其已经被修饰成结合gp41的CD4或N17结构域，且在本文中被称作“抗-CD4 Adnectin”、“抗-N17 Adnectin”、“CD4 Adnectin”或“gp41 Adnectin”。本发明的多肽也可以包括HIV包膜糖蛋白gp41的七肽重复2 (HR2)区域以后模型化的肽，其通过结合gp41的七肽重复1 (HR1)区域而抑制融合，且在本文中被称作“HIV融合肽抑制剂”或“融合肽抑制剂”。本发明的多肽也包括包含与抗-N17 Adnectin连接的抗-CD4 Adnectin的“Combinectin”，所述抗-N17Adnectin连接至HIV融合肽抑制剂(图1)。可替换地，所述Combinectin包含与抗-N17Adnectin连接的抗-CD4 Adnectin或与HIV融合肽抑制剂连接的抗-N17 Adnectin或与HIV融合肽抑制剂连接的抗-CD4 Adnectin。

本文中使用的“多肽链”表示这样的多肽：其中其每个结构域通过肽键、而不是非共价相互作用或二硫键连接至其它结构域。

“分离的”多肽是已经经过鉴定并从其天然环境的组分分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分是干扰所述的诊断或治疗用途的物质，且可以包括重组宿主细胞蛋白和其它蛋白性的或非蛋白性的溶质。在一个实施方案中，将所述多肽纯化至(1)大于95重量%的多肽(如通过Lowry方法测定的)，且最优选地超过99重量%，(2)均质，通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE使用考马斯蓝或银染色确定。通常通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。

“氨基酸序列同一性百分比(%)”在本文中定义为：比对所述序列，如果必要的话引入间隙以实现最大序列同一性百分比，且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分以后，候选序列中与所选序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术中的多种方式实现，例如，使用公众可得到的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR®)软件。本领域技术人员可以容易地确定用于测量比对的适当参数，包括在所对比的序列全长上达到最大比对所需要的任何算法。例如，如下计算给定氨基酸序列A相对、与或针对给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(其可以可替换地叙述为相对、与或针对给定氨基酸序列B具有或包含特定%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)：100×分数X/Y，其中X是通过序列比对程序ALIGN-2（在该程序的A和B的比对中）评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A相对B的%氨基酸序列同一性将不等于B相对A的%氨基酸序列同一性。

本文中使用的“保守置换”表示将一个氨基酸残基用另一个替换，而不改变所述肽的总构象和功能，包括，但不限于，将一个氨基酸用具有类似性质（例如，极性、氢键合潜力、酸性、碱性、形状、疏水、芳族等）的氨基酸替换。具有类似性质的氨基酸是本领域众所周知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水-碱性氨基酸，且可以是可互换的。类似地，异亮氨酸（一种疏水氨基酸）可以用亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸替换。可以彼此置换的中性亲水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。本发明的“取代”或“修饰”包括已经从天然存在的氨基酸改变或修饰的那些氨基酸。这样，应当理解，在本发明的上下文中，保守置换在本领域中被视作另一种具有类似性质的氨基酸对一种氨基酸的置换。

本文中使用的术语“结合位点”表示蛋白的与本发明的特定蛋白相互作用或结合的位点或部分(例如，CD4, gp41)(例如，因为表位被抗体识别)。结合位点可以从连续氨基酸或通过蛋白的三级折叠而紧靠的非连续氨基酸形成。从连续氨基酸形成的结合位点通常在暴露于变性溶剂后保留，而通过三级折叠形成的结合位点通常在用变性溶剂处理后丢失。

通过应用通常用于抗体的表位作图的标准技术，包括、但不限于蛋白酶绘图和突变分析，可以确定本发明的抗-CD4部分或抗-N17部分的结合位点。可替换地，使用结合相同多肽（例如，CD4或gp41）的参比蛋白(例如，另一种Adnectin或抗体)通过竞争测定可以确定结合位点。如果测试蛋白和参比分子(例如，另一种Adnectin或抗体)竞争，那么它们结合相同结合位点或结合足够近以致于一个分子的结合会干扰其它分子的结合位点。

在本文中互换使用的术语“特异性地结合”、“特异性结合”、“选择性的结合”和“选择性地结合”表示这样的蛋白：其表现出对CD4或gp41的亲和力，但是不会显著地结合(例如，小于约10%结合)不同的多肽，如通过本领域可得到的技术测量的，例如，但不限于，Scatchard分析和/或竞争性结合测定(例如，竞争ELISA、BIACORE®SPR测定)。在例如本发明的蛋白的结合结构域对CD4或gp41是特异性的情况下，该术语也是适用的。

本文中使用的术语“优先地结合”表示这样的情形：其中本发明的肽对CD4或gp41的结合比它对不同多肽的结合大至少约20%，如通过本领域可得到的技术所测量的，例如，但不限于，Scatchard分析和/或竞争性结合测定(例如，竞争ELISA、BIACORE®SPR测定)。

本文中使用的术语“交叉反应性”表示这样的蛋白：其结合超过一种具有相同的或非常类似的结合位点的不同蛋白。

本文中使用的术语“K _d”意图表示特定Adnectin-蛋白、融合肽抑制剂-蛋白或Combinectin-蛋白(例如，CD4和/或gp41)相互作用的解离平衡常数，或Adnectin、融合肽抑制剂或Combinectin对蛋白(例如，CD4和/或gp41)的亲和力，如使用表面等离子体共振测定或细胞结合测定所测量的。本文中使用的“期望的K _d”表示对于预见到的目的而言足够的本发明的蛋白的K _d。例如，期望的K _d可以表示在体外测定（例如，基于细胞的萤光素酶测定）中引起功能效应所需的Combinectin的K _d。

本文中使用的术语“k _on”意图表示例如Combinectin向Combinectin/蛋白复合物中的结合的结合速率常数。

本文中使用的术语“k _off”意图表示例如Combinectin从Combinectin/蛋白复合物的解离的解离速率常数。

本文中使用的术语“IC₅₀”表示例如Combinectin的这样的浓度：其在体外或体内测定中将应答抑制至最大抑制应答的50%的水平，即，在最大抑制应答和未治疗应答之间的中途。

本文中关于本发明的蛋白的活性使用的术语“抑制”或“中和”是指，基本上拮抗、阻止、防止、抑制、减慢、破坏、消除、停止、减小或反转例如正在被抑制的对象（包括、但不限于，生物活性或性质、疾病或病症）的进展或严重程度的能力。抑制或中和优选地是至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高。

术语“PK”是“药代动力学”的首字母简略词，且包括化合物的性质，包括、例如主体的吸收、分布、代谢和消除。本文中使用的“PK调节蛋白”或“PK部分”表示，当与生物活性分子融合或一起施用时，影响生物活性分子的药代动力学性质的任何蛋白、肽或部分。PK调节蛋白或PK部分的例子包括PEG、人血清白蛋白(HSA)结合剂(如在美国公开号2005/0287153、美国专利号7,696,320、PCT公开号WO 2009/083804和WO 2009/133208中公开的)、人血清白蛋白、Fc或Fc片段及其变体和糖(例如，唾液酸)。

术语“CD4结合部分”表示阻断HIV表面蛋白gp120与CD4+ T细胞上的CD4受体的结合的任何部分。所述CD4结合部分可以是抗-CD4˗adnectin、˗抗体(诸如伊巴珠单抗)、˗结构域抗体(dAb)、˗抗体片段(Fab)、˗双特异性抗体及其融合蛋白。

术语“gp41结合部分”表示干扰病毒包膜糖蛋白复合物(gp120/gp41)与T细胞的相互作用的任何部分。所述gp41结合部分可以是抗-gp41˗adnectin、˗抗体(Ab)、˗结构域抗体(dAb)、˗抗体片段(Fab)、˗双特异性抗体及其融合蛋白。

“HIV融合肽抑制剂部分”表示通过结合gp41的七肽重复1 (HR1)区域而抑制融合的任何部分。融合肽抑制剂部分的例子包括从gp41的NHR和CHR区域衍生出的肽，分别命名为NHR和CHR肽。恩夫韦肽是CHR肽的一个例子。

本发明的肽可以包括，例如，CD4单克隆抗体伊巴珠单抗、抗-N17 Adnectin和HIV融合肽抑制剂。可替换地，本发明的肽可以包括抗-CD4 Adnectin、抗-N17 Adnectin和HIV融合肽抑制剂恩夫韦肽。

氨基酸序列或化合物的“半衰期”通常可以定义为，多肽的血清浓度在体内下降50%所需的时间（例如，由于所述序列或化合物的降解和/或通过天然机制对所述序列或化合物的清除或隔离）。所述半衰期可以以本身已知的任何方式来确定，诸如通过药代动力学分析。合适的技术将是本领域技术人员显而易见的，且可以例如通常涉及以下步骤：适当地给主体施用合适剂量的本发明的氨基酸序列或化合物；定期从所述主体收集血液样品或其它样品；确定所述血液样品中的本发明的氨基酸序列或化合物的水平或浓度；和从如此得到的数据(图)计算与给药后的最初水平相比在本发明的氨基酸序列或化合物的水平或浓度已经下降50%之前的时间。参考，例如，标准手册，诸如Kenneth, A. 等人, Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists，和Peters等人,Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach (1996)。还参考Gibaldi, M. 等人,Pharmacokinetics, 第二次修订版, Marcel Dekker (1982)。

使用参数诸如t_1/2-α、t_1/2-β、HL_λ_z和曲线下面积(AUC)可以表达半衰期。在本说明书中，“半衰期的增加”表示这些参数中的任意一个、这些参数中的任意两个、这些参数中的任意三个或这些参数中的所有四个的增加。

记法“mpk”、“mg/kg”或“mg /千克”表示毫克/千克。所有记法在本发明中互换使用。

在本文中互换使用的术语“个体”、“主体”和“患者”表示动物，优选哺乳动物（包括非灵长类动物和灵长类动物），包括、但不限于，鼠、猿猴、人类、哺乳动物耕作动物（例如，牛、猪、羊）、哺乳动物运动动物（例如，马）和哺乳动物宠物（例如，犬和猫）；优选地该术语表示人类。在一个特定实施方案中，所述主体是哺乳动物，优选地是人，且被HIV感染。

术语“治疗有效量”表示，给主体提供治疗益处所需的药剂的至少最低剂量，但是小于有毒剂量。例如，本发明的Combinectin的治疗有效量是这样的量：其在哺乳动物、优选人类中，导致受感染的个体内循环HIV的显著下降。

概述

本发明提供了结合CD4和/或gp41的新颖多肽。所述多肽包含CD4结合部分、gp41结合部分、HIV融合肽抑制剂部分和它们的组合。更具体地，本发明涉及多肽，其包含结合CD4的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白、结合gp41的N17结构域的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白和HIV融合肽抑制剂或它们的组合(在本文中被称作“Combinectin”)。

为了鉴别CD4和gp41 Adnectin，将可溶性CD4 (细胞外结构域)和gp41 (被设计成展示模仿gp41的一部分的三螺旋片段的不同人工构建体)呈递给Adnectin的大合成文库。针对CD4或gp41结合、针对生物物理性质和针对HIV-1抑制活性，筛选度过几轮选择的Adnectin。对从筛选中出现的最好的抗-CD4和抗-N17 Adnectin序列突变并进行具有增加的选择压力（通过降低靶浓度和/或选择具有较快结合速率和/或缓慢解离速率的抗-CD4或gp41 Adnectin实现）的另外选择轮。从该优化过程，将多个Adnectin家族（其中一些靶向CD4，且其它靶向gp41）鉴别为具有有利生化和生物物理学活性的HIV-1特异性抑制剂。

从与gp41 HR2有关的序列开始开发了一种经优化的靶向gp41的螺旋肽，且含有用于提高效能和跨HIV株的宽度以及增加抗性屏障的变化。有时合成地生产肽，且在其它时间将肽生产为与惰性或活性Adnectin的遗传融合体。在与gp41 Adnectin家族的成员的融合体中确定最佳的N-和C-末端位置。为了鉴别可以进一步增加效能的突变，使用具有不大效能的N-端修剪过的肽，使得改善更容易检测到。制备包含单个和多个点突变的惰性Adnectin-肽融合体的小文库，然后表达蛋白并针对生物物理性质和HIV-1抑制活性进行筛选。最终的肽家族由最佳长度肽组成，所述肽含有具有最有利特性的序列的不同组合。

I. 基于纤连蛋白的支架- Adnectin

本申请的一个方面提供了包含纤连蛋白III型(Fn3)结构域的抗-CD4和抗-N17Adnectin，其中一个或多个溶剂可接近环的部分或全部已经被随机化或突变。在某些实施方案中，一个或多个非环β链中的一个或多个残基也已经被随机化或突变。在某些实施方案中，所述Fn3结构域是从人纤连蛋白的第十个3型模块(¹⁰Fn3)衍生出的Fn3结构域：

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO:1) (BC、CD、DE和FG环标有下划线)

在其它实施方案中，可以改变¹⁰Fn3的非配体结合序列，即，“¹⁰Fn3支架”，前提条件是，¹⁰Fn3保留配体结合功能和/或结构稳定性。已经报告了多种突变体¹⁰Fn3支架。在一个方面，Asp 7、Glu 9和Asp 23中的一个或多个被另一氨基酸例如不带负电荷的氨基酸残基(例如，Asn、Lys等)替代。已报道，与野生型形式相比，这些突变在中性pH具有促进突变体¹⁰Fn3的更大稳定性的作用(参见，例如，PCT公开号WO 02/04523)。已公开了¹⁰Fn3支架中多种有益的或中性的额外改变。参见，例如，Batori等人, Protein Eng., 15(12):1015-1020 (2002年12月); Koide等人, Biochemistry, 40(34):10326-10333 (2001年8月28日)。

变体和野生型¹⁰Fn3蛋白二者的特征在于相同结构，即7个命名为A至G的β-链结构域序列以及6个连接所述7个β-链结构域序列的环区(AB环、BC环、CD环、DE环、EF环和FG环)。位于最靠近N-和C-末端处的β链可以采用在溶液中的β-样构象。在SEQ ID NO:1中，AB环对应于残基14-17，BC环对应于残基23-31，CD环对应于残基37-47，DE环对应于残基51-56，EF环对应于残基63-67，且FG环对应于残基75-87。

因此，在某些实施方案中，本发明的抗-CD4或抗-N17 Adnectin是与SEQ ID NO:1所示的人¹⁰Fn3结构域具有至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%同一性的¹⁰Fn3多肽。在一个或多个所述环中通常会发生许多变异。¹⁰Fn3多肽的每个β或β-样链可以基本上由这样的氨基酸序列组成：其与SEQ ID NO:1的相应β或β-样链的序列具有至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%同一性，前提条件是，这样的变异不会破坏所述多肽在生理条件下的稳定性。

在某些实施方案中，本发明提供了一种或多种包含第十个纤连蛋白III型(¹⁰Fn3)结构域的Adnectin，其中所述¹⁰Fn3结构域包含：环AB；环BC；环CD；环DE；环EF；和环FG；且具有至少一个选自环BC、CD、DE和FG的环，所述环具有与人¹⁰Fn3结构域的对应环的序列相比改变的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明的Adnectin包含这样的¹⁰Fn3结构域：其包含与SEQ ID NO:1的非环区域具有至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中至少一个选自BC、CD、DE和FG的环被改变。在某些实施方案中，所述BC和FG环被改变，且在某些实施方案中，所述BC、DE和FG环被改变，即， ¹⁰Fn3结构域包含非天然存在的环。在某些实施方案中，所述AB、CD和/或EF环被改变。在某些实施方案中，所述CD和FG环被改变。在某些实施方案中，环之间的链中的溶剂可接近的氨基酸被改变，具有或不具有邻接环的改变。“改变”是指相对于模板序列(对应的人纤连蛋白结构域)的一个或多个氨基酸序列改变，且包括氨基酸添加、缺失、置换或它们的组合。改变氨基酸序列可以通过（通常核酸编码序列）的故意的、胡乱的或自发的序列变异完成，且可以通过任意技术（例如，PCR、易出错的PCR或化学DNA合成）发生。

在某些实施方案中，一个或多个选自BC、CD、DE和FG的环可以在长度上比对应的人纤连蛋白环延长或缩短。在某些实施方案中，所述环的长度可以延长1-25个氨基酸。在某些实施方案中，所述环的长度可以减少1-11个氨基酸。因此，为了优化抗原结合，可以在长度上以及在序列上改变¹⁰Fn3的环，以得到在抗原结合中的最大可能柔性和亲和力。

在某些实施方案中，所述Adnectin包含Fn3结构域，其包含与SEQ ID NO:1的非环区域具有至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中至少一个选自BC、CD、DE和FG的环被改变。在某些实施方案中，所述改变的BC环具有多达1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸置换、多达1、2、3或4个氨基酸缺失、多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸插入或它们的组合。在某些实施方案中，所述改变的CD环具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸置换、多达1、2、3、4、5或6个氨基酸缺失、多达1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸插入或它们的组合。在某些实施方案中，所述改变的DE环具有多达1、2、3、4、5或6个氨基酸置换、多达1、2、3或4个氨基酸缺失、多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸插入或它们的组合。在某些实施方案中，所述FG环具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸置换、多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个氨基酸缺失、多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸插入或它们的组合。

延伸序列

在某些实施方案中，可以将本发明的Adnectin分子修饰成包含N-端延伸序列和/或C-端延伸。例如，可以将MG序列置于由SEQ ID NO: 1限定的¹⁰Fn3的N-端处。经常将M切掉，从而将G留在N-端处。本文描述的Adnectin也可以包含替代性C-端尾巴序列，在本文中被称作截短的C-端或C-端延伸序列。此外，可以将截短形式用作呈截短形式的治疗分子，或可以将替代性C-端延伸（诸如His6标签）添加至所述截短形式。在某些实施方案中，所述C-端延伸序列(也称为“尾巴”)包含E和D残基，且可以是8-50、10-30、10-20、5-10和2-4个氨基酸长度之间。在某些实施方案中，C-端延伸的第一残基是脯氨酸。在某些其它实施方案中，C-端延伸的第一残基是谷氨酸。

在某些实施方案中，所述N-端可以延长多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸，其可以在数轮选择之前或之后以任何方式改变，以便改善靶标结合、稳定性或二者。在其它实施方案中，所述C-端可以延长多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸，其可以在数轮选择之前或之后以任何方式改变，以便改善靶标结合、稳定性或二者。在其它实施方案中，N-和C-末端二者可以以此方式延长。

抗-CD4 Adnectin

本发明的抗-CD4 Adnectin环区域CD和FG的氨基酸序列包括、但不限于在下面表1中列出的那些。在表1中描述的CD环替代由SEQ ID NO:1定义的¹⁰Fn3的R30至T49。在表1中描述的FG环替代由SEQ ID NO:1定义的¹⁰Fn3的D67至N91。

表1也列出了包含列出的CD/FG环组合的每个抗-CD4 Adnectin的IC₅₀值。

表1 CD4 Adnectin - CD和FG环组合

在某些实施方案中，本发明的抗-CD4 Adnectin包含与SEQ ID NO: 13-94的CD/FG环区域组合具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明的抗-CD4 Adnectin包含与SEQ ID NO: 13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91和93中的任一个CD环区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明的抗-CD4 Adnectin包含与SEQ ID NO: 14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92和94中的任一个FG环区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

使用WebLogo (weblogo.berkeley.edu)来鉴别抗-CD4 Adnectin的共有序列。抗-CD4 Adnectin CD环的Y32、I34、Y36、Q46和F48是保守氨基酸(参见图6)。在某些实施方案中，所述抗-CD4 Adnectin包含保守氨基酸Y32、I34、Y36、Q46和F48中的一个或多个。

WebLogo将抗-CD4 Adnectin FG环的Y68、I70、V72、A74、T76、I88和I90鉴别为保守氨基酸(参见图7)。在某些实施方案中，所述抗-CD4 Adnectin包含保守氨基酸Y68、I70、V72、A74、T76、I88和I90中的一个或多个。

在某些实施方案中，所述抗-CD4 Adnectin包含保守氨基酸Y32、I34、Y36、Q46、F48、Y68、I70、V72、A74、T76、I88和I90中的一个或多个。

本发明的抗-CD4 Adnectin的全长氨基酸序列包括、但不限于在下面表2中列出的那些。表2也列出了每种抗-CD4 Adnectin的抗病毒EC₅₀值。

表2抗-CD4 Adnectin

在某些实施方案中，本发明的抗-CD4 Adnectin包含与SEQ ID NO: 95-114中的任一个具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明的抗-CD4 Adnectin包含与SEQ ID NO: 95-114中的任一个（不包括任何N-端延伸区域）具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明的抗-CD4 Adnectin包含与SEQ ID NO: 95-114中的任一个（不包括任何C-端延伸区域）具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明的抗-CD4 Adnectin包含与SEQ ID NO: 95-114中的任一个（不包括N-端和C-端延伸区域）具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，抗-CD4 Adnectin包含与SEQ ID NO: 95-114的CD环和FG环区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

抗-N17 Adnectin

本发明的抗-N17 Adnectin蛋白的全长氨基酸序列包括、但不限于在下面表3中列出的那些。表3也列出了每种抗-N17 Adnectin的抗病毒EC₅₀值。

表3抗-N17 Adnectin

在某些实施方案中，本发明的抗-N17 Adnectin包含与SEQ ID NO: 115-371中的任一个具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明的抗-N17 Adnectin包含与SEQ ID NO: 115-371中的任一个（不包括任何N-端延伸区域）具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明的抗-N17 Adnectin包含与SEQ ID NO: 115-371中的任一个（不包括任何C-端延伸区域）具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，本发明的抗-N17 Adnectin包含与SEQ ID NO: 115-371中的任一个（不包括N-端和C-端延伸区域）具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，抗-N17 Adnectin包含与SEQ ID NO: 115-371的BC环、DE环和FG环区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

以上序列的分析指示，抗-N17 Adnectin DE环的S52、V53、L54和S55是保守氨基酸。在某些实施方案中，所述抗-N17 Adnectin包含保守氨基酸S52、V53、L54和S55中的一个或多个。

另外，以上序列的分析指示，抗-CD4 Adnectin BC环的Y24是保守氨基酸。在某些实施方案中，抗-N17 Adnectin BC环的位置26是缬氨酸或亮氨酸。

以上序列的分析指示，抗-N17 Adnectin FG环的G78和S85是保守氨基酸。在某些实施方案中，所述抗-N17 Adnectin包含保守氨基酸G78和S85中的一个或多个。在某些实施方案中，抗-N17 Adnectin FG环的位置79是缬氨酸或异亮氨酸。

在某些实施方案中，所述抗-N17 Adnectin包含保守氨基酸Y24、V26、L26、S52、V53、L54、S55、G78、V79、I79和S85中的一个或多个。

抗-N17 Adnectin的点突变分析表明突变几个¹⁰Fn3非环支架位置的优点。具体地，突变位置T56和T58会强化效能。在某些实施方案中，所述抗-N17 Adnectin包含将T58突变为Asn、Glu或Gln。

II. HIV融合肽抑制剂

gp41的氨基酸序列和它在HIV-1的不同毒株之间的变异是众所周知的。认为融合(fusogenic)结构域(经常称作融合肽或FP)参与向靶细胞膜中的插入和靶细胞膜的破坏。含有跨膜锚序列的跨膜结构域朝向蛋白的C-端末端定位。在融合(fusogenic)结构域和跨膜锚之间是两个独特的区域，被称作七肽重复（HR）区域，每个区域具有多个七肽。包含HR1区域的氨基酸序列和包含HR2区域的氨基酸序列各自是HIV-1包膜蛋白中的相对保守区。gp41的外部结构域的一个代表性序列(进化枝B共有序列)如下：

所述融合肽由大约前23个氨基酸Ala512-Ser534组成。HR1区域具有多个连续7氨基酸残基段或“七肽”(每个七肽中的7个氨基酸命名为“a”至“g”)，其中疏水残基在第一个(“a”)和第四个(“d”)位置处占优势，它们同型地相互作用以形成3-螺旋束结构的核心。中性极性的氨基酸诸如谷氨酰胺也可能发生在这些位置。一种代表性的七肽以Leu545开始。HR1的一个高度保守部分由从Leu565至Leu581的17个残基组成，且被称作“N17”。

gp41的C-端部分包含HR2区域，其被认为在融合过程中形成α螺旋结构，并且结合进HR1三螺旋结构的槽中。HR2也包含七肽，尽管它们不会同型地相互作用，而是与来自HR1的氨基酸相互作用。一种代表性的七肽从Trp628处开始。

HIV融合肽抑制剂

本发明的HIV融合肽抑制剂包括、但不限于下述序列：

在某些实施方案中，所述HIV融合肽抑制剂包含与SEQ ID NO: 372-392中的任一个具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

观察到在HIV融合肽抑制剂的C-端区域中的点突变会强化效能。在某些实施方案中，在HIV融合肽抑制剂的C-端附近的天冬氨酸(D)的疏水替换会提供效能的至少10倍增加(图8)。在某些实施方案中，所述HIV融合肽抑制剂包含用“YK”、“LK”、“FK”或“WK”替换“DK”。

在C-端区域中的其它点突变研究表明了可以如何突变C-端氨基酸“WAS”并具有对效能的良好作用。在某些实施方案中，所述HIV融合肽抑制剂包含将C-端氨基酸“WAS”替换为“WFS”或“WAL”。

III. 接头

本发明的Combinectin的各个组分可以共价地或非共价地连接。在某些实施方案中，所述PK部分可以直接地或通过多肽接头间接地连接至Combinectin。

合适的接头是允许单独的结构域彼此独立地折叠从而形成允许与靶分子的高亲和力结合的三维结构的那些接头。

本发明提供了许多满足这些要求的合适接头，包括基于甘氨酸-丝氨酸的接头、基于甘氨酸-脯氨酸的接头。本文描述的实施例证实，通过多肽接头连接的Combinectin结构域保留它们的靶标结合功能。在某些实施方案中，所述接头是基于甘氨酸-丝氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和丝氨酸残基，且可以是在8-50、10-30、和10-20个氨基酸长度之间。例子包括具有氨基酸序列(GS)₇ (SEQ ID NO: 393)、G(GS)₆ (SEQ ID NO: 394)和G(GS)₇G(SEQ ID NO: 395)的接头。其它接头含有谷氨酸，且包括、例如，(GSE)₅ (SEQ ID NO: 396)和GGSEGGSE (SEQ ID NO: 397)。其它示例性的甘氨酸-丝氨酸接头包括(GS)₄ (SEQ IDNO: 398)、(GGGGS)₇ (SEQ ID NO: 399)、(GGGGS)₅ (SEQ ID NO: 400)、(GGGGS)₄ (SEQ IDNO: 401 (GGGGS)₃G (SEQ ID NO: 402)。在某些实施方案中，所述接头是基于甘氨酸-脯氨酸的接头。这些接头包含甘氨酸和脯氨酸残基，且可以是在3-30、10-30、和3-20个氨基酸长度之间。例子包括具有氨基酸序列(GP)₃G (SEQ ID NO: 403)和(GP)₅G (SEQ ID NO: 404)的接头。在其它实施方案中，所述接头可以是基于脯氨酸-丙氨酸的接头，其具有3-30、10-30、和3-20个氨基酸长度。基于脯氨酸丙氨酸的接头的例子包括，例如，(PA)₃ (SEQ ID NO:405)、(PA)₆ (SEQ ID NO: 406)和(PA)₉ (SEQ ID NO: 407)。在某些实施方案中，所述接头是基于谷氨酸-脯氨酸的接头。这些接头包含谷氨酸和脯氨酸残基，且可以是在3-30、10-30、和3-20个氨基酸长度之间。例子包括具有氨基酸序列ESPEPETPEDE (SEQ ID NO: 408)和(ESPEPETPED)₂E (SEQ ID NO: 409)的接头。预见到，通过本领域众所周知的方法通过例行实验可以确定最佳接头长度和氨基酸组成。

可以将接头或隔离物引入在抗-CD4部分的N-端、抗-CD4部分的C-端、抗-gp41部分的N-端、抗-gp41部分的C-端、HIV融合肽抑制剂的N-端或它们的组合。在某些实施方案中，在抗-CD4 Adnectin和抗-N17 Adnectin之间的优选接头是短的富含谷氨酰胺-脯氨酸的接头。在某些实施方案中，在抗-N17 Adnectin和HIV融合肽抑制剂之间的优选接头是柔性的富含甘氨酸-丝氨酸的接头。

IV. 抗-N17 Adnectin连接至HIV融合肽抑制剂Combinectin

本发明的抗-N17 Adnectin - HIV融合肽抑制剂Combinectin的氨基酸序列包括、但不限于在下面表4中列出的那些。表4也列出了每种抗-N17 Adnectin-HIV融合肽抑制剂Combinectin的抗病毒EC₅₀值。

表4抗-N17 Adnectin - HIV融合肽抑制剂Combinectin

在某些实施方案中，所述抗-N17 Adnectin - HIV融合肽抑制剂Combinectin或其融合蛋白包含与SEQ ID NO: 410-428中的任一个的非接头区域具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述抗-N17 Adnectin - HIV融合肽抑制剂Combinectin或其融合蛋白包含与SEQ ID NO: 410-428中的任一个的非接头区域（不包括任何N-端延伸区域）具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，抗-N17 Adnectin - HIV融合肽抑制剂Combinectin包含这样的抗-N17 Adnectin，所述抗-N17 Adnectin包含与SEQ ID NO: 410-428的BC环、DE环和FG环区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，所述抗-N17 Adnectin - HIV融合肽抑制剂Combinectin包含这样的HIV融合肽抑制剂，所述HIV融合肽抑制剂包含与SEQ ID NO: 410-428的HIV融合肽抑制剂具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

V. 抗-CD4 Adnectin连接至抗-N17 Adnectin连接至HIV融合肽抑制剂Combinectin

本发明的抗-CD4 Adnectin连接至抗-N17 Adnectin连接至HIV融合肽抑制剂Combinectin包括、但不限于下述序列：

在以上序列中，抗-CD4 Adnectin序列标有下划线。抗-N17 Adnectin序列标有双下划线。HIV融合肽抑制剂序列标有下划线以粗体显示。接头序列以斜体显示。

在某些实施方案中，所述Combinectin或其融合蛋白包含与SEQ ID NO: 3、5、7和9中的任一个具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述Combinectin或其融合蛋白包含与SEQ ID NO: 3、5、7和9中的任一个的非接头区域具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，所述Combinectin包含这样的抗-CD4 Adnectin，所述抗-CD4Adnectin包含与SEQ ID NO: 3、5、7和9的CD环和FG环区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，所述Combinectin包含这样的抗-N17 Adnectin，所述抗-N17Adnectin包含与SEQ ID NO: 3、5、7和9的BC环、DE环和FG环区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，所述Combinectin包含这样的HIV融合肽抑制剂，所述HIV融合肽抑制剂包含与SEQ ID NO: 3、5、7和9的HIV融合肽抑制剂具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

VI. 药代动力学部分

在一个方面，本申请提供了抗-CD4部分、抗-gp41部分、HIV融合肽抑制剂和它们的组合，进一步包含药代动力学(PK)部分。根据意识到的治疗需要，可以评估改善的药代动力学。经常合乎需要的是，增加生物利用度和/或增加剂量之间的时间，可能通过增加蛋白在给药以后在血清中保持可得到的时间。在某些情况下，合乎需要的是，改善蛋白的血清浓度随时间的连续性(例如，减小在给药以后不久和下一次给药之前不久蛋白的血清浓度的差异)。本发明的Combinectin可以连接至使多肽在哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或人)中的清除率相对于未修饰的Combinectin减小至少2倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍的部分。改善的药代动力学的其它测量可以包括血清半衰期，其经常分成α阶段和β阶段。通过添加适当的部分可以显著地改善任一个或两个阶段。例如，PK部分可以使多肽的血清半衰期相对于单独的Combinectin增加超过5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%、400%、600%、800%、1000%或更多。

减慢蛋白从血液的清除的部分，在本文中被称作“PK部分”，包括聚亚氧烷基部分(例如，聚乙二醇)、糖(例如，唾液酸)和良好耐受的蛋白部分(例如，Fc和片段及其变体、转铁蛋白或血清白蛋白)。本发明的Combinectin还可以融合至如在美国公开号2007/0048282中描述的白蛋白或白蛋白的片段(部分)或变体，或可以融合至一个或多个Adnectin或结合血清白蛋白、Fc或转铁蛋白的其它部分。

可以用在本发明中的其它PK部分包括在通过引用并入本文的Kontermann等人(Current Opinion in Biotechnology, 22:868-876 (2011))中描述的那些。这样的PK部分包括、但不限于人血清白蛋白融合体、人血清白蛋白缀合物、人血清白蛋白结合剂(例如，Adnectin PKE、AlbudAb、ABD)、XTEN融合体、PAS融合体(即，基于3种氨基酸脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的重组PEG模拟物)、碳水化合物缀合物(例如，羟乙基淀粉(HES))、糖基化、聚唾液酸缀合物和脂肪酸缀合物。

因此，在某些实施方案中，本发明提供了与PK部分（其为聚合糖）融合的Combinectin。在某些实施方案中，所述PK部分是聚乙二醇部分或Fc区。在某些实施方案中，所述PK部分是血清白蛋白结合蛋白诸如在美国公开号2007/0178082和2007/0269422中描述的那些。在某些实施方案中，所述PK部分是人血清白蛋白。在某些实施方案中，所述PK部分是转铁蛋白。

本发明的Fc融合体-Combinectin包括在图2的3137 (SEQ ID NO: 4)和3151 (SEQID NO: 6)中所示的序列。

在某些实施方案中，所述Fc融合体-Combinectin或其融合蛋白包含与SEQ ID NO:4和6中的任一个具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述Fc融合体-Combinectin或其融合蛋白包含与SEQ ID NO:4和6中的任一个的非接头区域具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，所述Fc融合体-Combinectin包含这样的抗-CD4 Adnectin，所述抗-CD4 Adnectin包含与SEQ ID NO: 4和6的CD环和FG环区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，所述Fc融合体-Combinectin包含这样的抗-N17 Adnectin，所述抗-N17 Adnectin包含与SEQ ID NO: 4和6的BC环、DE环和FG环区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，所述Fc融合体-Combinectin包含这样的融合肽抑制剂，所述融合肽抑制剂包含与SEQ ID NO: 4和6的HIV融合肽抑制剂具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

本发明的HSA融合体-Combinectin包括在图2的3191 (SEQ ID NO: 8)和3202(SEQ ID NO: 10)中所示的序列。

在某些实施方案中，所述HSA融合体-Combinectin或其融合蛋白包含与SEQ IDNO: 8和10中的任一个具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述HSA融合体-Combinectin或其融合蛋白包含与SEQ IDNO: 8和10中的任一个的非接头区域具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，所述HSA融合体-Combinectin包含这样的抗-CD4 Adnectin，所述抗-CD4 Adnectin包含与SEQ ID NO: 8和10的CD环和FG环区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，所述HSA融合体-Combinectin包含这样的抗-N17 Adnectin，所述抗-N17 Adnectin包含与SEQ ID NO: 8和10的BC环、DE环和FG环区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在其它实施方案中，所述HSA融合体-Combinectin包含这样的融合肽抑制剂，所述融合肽抑制剂包含与SEQ ID NO: 8和10的HIV融合肽抑制剂具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

聚乙二醇

在某些实施方案中，所述抗-CD4部分、抗-gp41部分、HIV融合肽抑制剂和它们的组合包含聚乙二醇(PEG)。PEG是一种众所周知的水溶性聚合物，其可商购得到或可以根据本领域众所周知的方法通过乙二醇的开环聚合来制备(Sandler等人, Polymer Synthesis, 第3卷, 第138-161页, Academic Press, New York)。术语“PEG”广泛地用于包括任何聚乙二醇分子，不考虑大小或在PEG的末端处的修饰，且可以由下式表示：X-O(CH₂CH₂O)_{n˗ 1}CH₂CH₂OH，其中n是20-2300，且X是H或末端修饰，例如，C_1-4烷基。PEG可以含有结合反应所必需的其它化学基团，其源自所述分子的化学合成；或其充当所述分子的部分的最佳距离的隔离物。另外，这样的PEG可以由一个或多个连接在一起的PEG侧链组成。具有超过一个PEG链的PEG被称作多臂或支链PEG。支链PEG描述在例如欧洲公开的申请号473084A和美国专利号5,932,462中。

一个或多个PEG分子可以连接于蛋白上的不同位置，且这样的连接可以通过与胺、硫醇或其它合适的反应基团反应来实现。胺部分可以是例如在多肽的N-端处存在的伯胺或存在于氨基酸（诸如赖氨酸或精氨酸）中的胺基团。在某些实施方案中，PEG部分连接于多肽上的位置，该位置选自：a)N-端；b)在N-端与最N-端β链或β-样链之间；c)位于与靶标结合位点相对的多肽面上的环或链残基；d)在C-端与最C-端β链或β-样链之间；e)在连接两个结合结构域的接头序列内，和f)在C-端。

聚乙二醇化可以通过定位聚乙二醇化实现，其中将合适的反应基团引入所述蛋白中以建立在此处优先发生聚乙二醇化的位点。在某些实施方案中，修饰所述蛋白以在期望的位置处引入半胱氨酸残基，从而允许在半胱氨酸上的定位聚乙二醇化。可以将突变引入蛋白编码序列中以产生半胱氨酸残基。这可能如下实现，例如，通过将一个或多个氨基酸残基突变为半胱氨酸。用于突变成半胱氨酸残基的优选氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸和其它亲水残基。优选地，要突变成半胱氨酸的残基是表面暴露的残基。算法基于基本序列或蛋白预测残基的表面可达性的领域众所周知的。可替换地，可以如下预测表面残基：在已经解决框架（基于此设计和演化结合多肽）的晶体结构(参见Himanen等人, Nature, 414:933-938 (2001))并因而鉴别出表面暴露的残基的情况下，对比结合多肽的氨基酸序列。使用例如PEG-马来酰亚胺、PEG-乙烯基砜、PEG-碘乙酰胺或PEG-邻吡啶基二硫化物，可以实现半胱氨酸残基的聚乙二醇化。

PEG通常用合适的活化基团活化，所述活化基团适合用于偶联至多肽上的期望部位。聚乙二醇化方法是本领域众所周知的，且进一步描述在Zalipsky, S. 等人, “Use ofFunctionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides”，Harris, J.M., Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, Plenus Press, New York (1992), Zalipsky, Advanced Drug Reviews,16:157-182 (1995)。

PEG可以在分子量方面宽泛地变化，且可以是支链或直链。通常，PEG的重量平均分子量是约100道尔顿至约150,000道尔顿。PEG的示例性重量平均分子量包括约20,000道尔顿、约40,000道尔顿、约60,000道尔顿和约80,000道尔顿。在某些实施方案中，PEG的分子量是40,000道尔顿。还可以使用具有前述任一种的总分子量的PEG的支链形式。在某些实施方案中，所述PEG具有两个支链。在其它实施方案中，所述PEG具有四个支链。在另一个实施方案中，所述PEG是缀合了两个Adnectin的双-PEG (NOF Corporation, DE-200MA)。

本领域已知的常规分离和纯化技术可以用于纯化聚乙二醇化的Adnectin，诸如尺寸排阻(例如，凝胶过滤)和离子交换色谱法。还可以使用SDS-PAGE分离产物。可以分离的产物包括单-、二-、三-、多-和未-聚乙二醇化的Adnectin、以及游离PEG。通过合并在洗脱峰周围的较宽级分以增加组合物中的单-PEG的百分比，可以控制单-PEG缀合物的百分比。约90%单-PEG缀合物代表收率和活性的良好平衡。

在某些实施方案中，所述聚乙二醇化的抗-CD4部分、抗-gp41部分、HIV融合肽抑制剂和它们的组合将优选地保留与未修饰的抗-CD4部分、抗-gp41部分、Adnectin或Combinectin有关的生物活性的至少约25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%。在某些实施方案中，生物活性表示它的结合CD4或gp41的能力，如通过K _d、k _on或k _off评估的。在某些实施方案中，相对于未聚乙二醇化的抗-CD4部分、抗-gp41部分、Adnectin或Combinectin，所述聚乙二醇化的抗-CD4部分、抗-gp41部分、Adnectin或其Combinectin显示出与CD4或gp41的结合的增加。

免疫球蛋白Fc结构域(和片段)

在某些实施方案中，将本发明的肽与免疫球蛋白Fc结构域或其片段或变体融合。本文中使用的“功能性Fc区”是保留结合FcRn的能力的Fc结构域或其片段。在某些实施方案中，功能性Fc区结合FcRn，但是不具有效应子功能。通过本领域已知的标准结合测定，可以确定Fc区或其片段的结合FcRn的能力。在其它实施方案中，所述Fc区或其片段结合FcRn且具有天然Fc区的至少一种“效应子功能”。示例性的“效应子功能”包括C1q结合；补体依赖性的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体; BCR)的下调，等。这样的效应子功能通常要求Fc区与结合结构域(例如，抗-CD4或抗-N-17 Adnectin)组合，且可以使用本领域已知的用于评价这样的抗体效应子功能的各种测定来评估。

“天然序列Fc区”包含与在自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。“变体Fc区”包含因为至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，相对于天然序列Fc区或相对于亲本多肽的Fc区，变体Fc区具有在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中的至少一个氨基酸置换，例如，约1至约10个氨基酸置换，和优选约1至约5个氨基酸置换。变体Fc区在本文中优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80%序列同一性，且最优选地与其具有至少约90%序列同一性，更优选地与其具有至少约95%序列同一性。

在一个示例性实施方案中，所述Fc结构域源自IgG1亚类，但是，也可以使用其它亚类(例如，IgG2、IgG3和IgG4)。下面显示了人IgG1免疫球蛋白Fc结构域的序列：

核心铰链序列标有下划线，且CH2和CH3区域以正常文字显示。应当理解，C-端甘氨酸和赖氨酸在本发明的Combinectin中是任选的。

通过将本发明的Adnectin连接至Fc分子的任一个末端，即，Fc-Adnectin或Adnectin-Fc排列，可以形成融合体。在某些实施方案中，所述Fc和Adnectin通过接头融合。

在某些实施方案中，在Adnectin融合体中使用的Fc区包含Fc分子的铰链区。本文中使用的“铰链”区域包含跨IgG1 Fc区的SEQ ID NO: 11 (DKTHTCPPCPAPELLG; SEQ IDNO: 12)的位置1-16的核心铰链残基。在某些实施方案中，所述Adnectin-Fc融合体呈现多聚体结构(例如，二聚体)，这部分地由于在铰链区内在SEQ ID NO: 11的位置6和9处的半胱氨酸残基。

在某些实施方案中，Adnectin-Fc融合体可以具有下述构型：1) Adnectin-铰链-Fc或2)铰链-Fc-Adnectin。因此，根据这些构型，可以使本发明的任何Adnectin与包含铰链序列的Fc区融合。在某些实施方案中，可以使用接头将Adnectin连接至铰链-Fc部分，例如，一种示例性的融合蛋白可以具有构型Adnectin-接头-铰链-Fc或铰链-Fc-接头-Adnectin。另外，取决于在其中生产融合多肽的系统，可以将前导序列置于融合多肽的N-端处。例如，如果在哺乳动物系统中生产融合体，可以将前导序列添加至融合分子的N-端。如果在大肠杆菌中生产融合体，甲硫氨酸将在融合序列前面。

VII. 核酸-蛋白融合技术

在一个方面，本发明提供了一种Adnectin，其包含结合CD4或gp41的N17结构域的纤连蛋白III型结构域。一种快速制作并测试具有特异性结合性质的Fn3结构域的方法是核酸-蛋白融合技术。本发明利用称为'PROfusion'的体外表达和标记技术，其采用核酸-蛋白融合体(RNA-和DNA-蛋白融合体)来鉴别对于与蛋白的结合而言重要的新颖多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白融合技术是使蛋白共价地偶联其编码遗传信息的技术。关于RNA-蛋白融合技术和基于纤连蛋白的支架蛋白文库筛选方法的详细描述，参见Szostak等人, 美国专利号6,258,558、6,261,804、6,214,553、6,281,344、6,207,446、6,518,018和6,818,418;Roberts等人, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:12297-12302 (1997)；和Kurz等人,Molecules, 5:1259-1264 (2000)，它们都通过引用并入本文。

VIII. 载体和多核苷酸

可以化学地合成编码本文中公开的任何蛋白或多肽的核酸。可以选择密码子用法以提高在细胞中的表达。这样的密码子用法将取决于所选择的细胞类型。已经开发了针对大肠杆菌和其它细菌、以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞的专门密码子用法模式。参见，例如，Mayfield等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (2003年1月21日); Sinclair等人, Protein Expr. Purif., 26(I):96-105 (2002年10月);Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (2001年10月); Makrides等人, Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (1996年9月)；和Sharp等人, Yeast, 7(7):657-678 (1991年10月)。

用于核酸操作的一般技术描述在，例如，Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 第1-3卷, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), 或Ausubel, F. 等人, Current Protocols in Molecular Biology, GreenPublishing and Wiley-Interscience, New York (1987)和定期更新，通过引用并入本文。通常，编码多肽的DNA可操作地连接至源自哺乳动物、病毒或昆虫基因的合适转录或翻译调节元件。这样的调节元件包括转录启动子、任选的控制转录的操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译的终止的序列。另外包含在宿主中复制的能力（常常由复制起点赋予）和促进转化体识别的选择基因。

本文描述的蛋白不仅可以直接重组生产，而且可以作为具有异源多肽的融合多肽生产，所述异源多肽优选地是信号序列或在成熟蛋白或多肽的N端处具有特异性切割位点的其它多肽。优选地选择的异源信号序列是被宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的信号序列。

对于不识别和加工天然信号序列的原核宿主细胞，信号序列被选自例如以下组的原核信号序列置换：碱性磷酸酶、青霉素酶、1 pp或热稳定的肠毒素II前导序列。

为了酵母分泌，可以将天然信号序列置换为例如酵母转化酶前导序列、a因子前导序列(包括酵母属和克鲁维酵母属α-因子前导序列)或酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列或在美国专利号5,631,144中描述的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌型前导序列（例如，单纯疱疹gD信号）是可得到的。这样的前体区域的DNA可以在读码框中连接至编码蛋白的DNA。

表达和克隆载体都含有使载体能在一个或多个所选宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中此序列是使载体能独立于宿主染色体DNA而复制的序列，且包括复制起点或自主复制序列。对于多种细菌、酵母和病毒而言，这样的序列是众所周知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2微米质粒起点适用于酵母，且多种病毒起点(SV40、多形瘤、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(通常可以仅使用SV40起点，因为它含有早期启动子)。

表达和克隆载体可以含有选择基因，其也被称为选择标记。典型选择基因编码这样的蛋白，其：(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如，氨苄西林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷型缺乏，或(c)供给从复合培养基不可得到的关键营养物，例如编码芽孢杆菌(Bacilli)的D-丙氨酸消旋酶的基因。

表达和克隆载体通常含有被宿主生物识别且与编码本发明蛋白(例如，基于纤连蛋白的支架蛋白)的核酸可操作地连接的启动子。适合用于与原核宿主一起使用的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子(诸如tan启动子)。但是，其它已知细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子也将含有与编码本发明蛋白的DNA可操作地连接的Shine-Dalgarno (S.D.)序列。已知真核生物的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT的区域，其位于转录起始位点上游约25-30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70-80个碱基处存在的另一个序列是CNCAAT区域，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端处是AATAAA序列，其可能是向编码序列3'端添加聚腺苷酸尾巴的信号。所有这些序列都适当地插入真核表达载体中。

用于与酵母宿主一起使用的合适启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶(诸如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸酯变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶)的启动子。

在哺乳动物宿主细胞中从载体转录可以受例如以下启动子控制：从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和最优选猿猴病毒40 (SV40))的基因组获得的启动子，从异源哺乳动物启动子(例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)获得的启动子，从热激启动子获得的启动子，前提是这样的启动子与宿主细胞系统相容。

经常通过将增强子序列插入载体中来增强高等真核生物对编码本发明蛋白的DNA的转录。当前已知许多来自哺乳动物基因的增强子序列(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。但是，通常将使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括在复制起点迟侧(late side)上的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点迟侧上的多形瘤增强子和腺病毒增强子。关于用于激活真核启动子的增强元件，也参见Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)。可以将增强子在肽编码序列的5'或3'位置剪接进载体中，但是优选地位于启动子的5'位点处。

在真核宿主细胞（例如，酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或来自其它多细胞生物的有核细胞）中使用的表达载体还将含有对于转录终止和稳定化mRNA所必需的序列。这样的序列通常可从真核生物或病毒DNA的5′和偶尔3′非翻译区或cDNA得到。这些区域含有被转录为编码本发明蛋白的mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素多腺苷酸化区域。参见WO 94/11026和在其中公开的表达载体。

重组DNA还可以包括可用于纯化蛋白的任何类型的蛋白标签序列。蛋白标签的例子包括，但不限于，组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签或GST标签。用于与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当克隆和表达载体可见于Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985)，其有关的公开内容特此通过引用并入。

使用适合于宿主细胞的方法将表达构建体引入宿主细胞中，这是本领域技术人员将明白的。将核酸引入宿主细胞中的多种方法是本领域已知的，包括，但不限于，电穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；和感染(其中载体是传染性病原体)。

合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞或细菌细胞。合适的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，大肠杆菌或芽孢杆菌属种。酵母，优选来自酵母属种的酵母如酿酒酵母，也可用于生产多肽。还可以采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。用于在昆虫细胞中生产异源蛋白的杆状病毒系统由Luckow等人(Bio/Technology, 6:47 (1988))综述。合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚胎肾细胞、HeLa、293、293T和BHK细胞系。通过培养合适的宿主/载体系统以表达重组蛋白，制备经纯化的多肽。对于许多应用，本文中公开的许多多肽的小尺寸将使得在大肠杆菌中的表达成为优选的表达方法。然后从培养基或细胞提取物纯化蛋白。

IX. 蛋白生产

本发明也涉及表达Combinectin或其融合蛋白的细胞系。使用本领域已知的标准技术，诸如本文描述的那些，可以完成生产Combinectin的细胞系的建立和分离。

将宿主细胞用本文描述的用于蛋白生产的表达或克隆载体转化，并在改良为适于诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因的常规营养培养基中培养。在这里所示的实施例中，用于高通量蛋白生产(HTPP)和中规模生产的宿主细胞是来自HMS174-细菌菌株的那些。

可以在多种培养基中培养用于生产本发明蛋白的宿主细胞。商购可得的培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、最低必需培养基((MEM)、(Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)和Dulbecco氏改良的伊格尔培养基((DMEM)，Sigma))适合用于培养宿主细胞。另外，在Ham等人, Meth. Enzymol., 58:44 (1979)、Barites等人, Anal. Biochem., 102:255 (1980)、美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655、5,122,469、6,048,728、5,672,502或美国专利号RE 30,985中描述的许多培养基可以用作宿主细胞的培养基。在需要时，可以给这些培养基中的任一种补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如庆大霉素药物)、痕量元素(定义为无机化合物，通常以在微摩尔范围内的终浓度存在)和葡萄糖或等效能源。还可以包括适当浓度的本领域技术人员已知的任何其它必要的补充物。培养条件诸如温度、pH等是先前与被选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，且对于普通技术人员而言是显而易见的。

还可以使用无细胞翻译系统生产本文中公开的蛋白。为了这样的目的，必须修饰编码所述多肽的核酸以允许体外转录而产生mRNA并允许mRNA在所用的特定无细胞系统(真核无细胞翻译系统诸如哺乳动物或酵母无细胞翻译系统，原核无细胞翻译系统诸如细菌无细胞翻译系统)中的无细胞翻译。

本发明的蛋白也可以通过化学合成产生(例如，通过在Solid Phase Peptide Synthesis, 第2版, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984)中描述的方法)。所述蛋白的修饰也可以通过化学合成产生。

通过蛋白化学领域中通常已知的蛋白分离/纯化方法，可以纯化本发明的蛋白。非限制性例子包括萃取、重结晶、盐析(例如，使用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、正相色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、凝胶渗透色谱法、亲和色谱法、电泳、逆流分布或这些方法的任何组合。纯化后，通过本领域已知的多种方法中的任何方法，包括、但不限于，过滤和透析，可以将多肽交换到不同的缓冲液中和/或浓缩。

经纯化的多肽优选地是至少85%纯的，或优选地至少95%纯的，和最优选地至少98%纯的。不论纯度的确切数值，所述多肽的纯度足以用作药物产品。

X. 生物物理学和生化表征

可以以平衡常数（例如，解离, K _d）的方式和以动力学常数（例如，结合速率常数, k _on和解离速率常数, k _off）的方式评估本发明的蛋白与靶分子（例如，CD4或gp41）的结合。本发明的蛋白通常以小于500 nM、100 nM、10 nM、1 nM、500 pM、200 pM或100 pM的K _d结合靶分子，但是可以耐受更高的K _d值，其中k _off是足够低的或k _on是足够高的。

关于结合亲和力的体外测定

使用多种体外测定可以鉴别结合CD4或gp41的蛋白。优选地，所述测定是允许同时筛选多种候选物的高通量测定。

在某些实施方案中，可以用BIACORE®系统实时监测生物分子相互作用，所述BIACORE®系统利用SPR来检测在玻璃支持物上的薄金膜的表面处的光共振角变化，这是由于直到300 nm以外表面的折射率的变化。BIACORE®分析会产生结合速率常数、解离速率常数、平衡解离常数和亲和常数。通过使用BIACORE®表面等离子体共振系统(Biacore,Inc.)评估结合速率常数和解离速率常数而得到结合亲和力。将生物传感器芯片活化以便共价偶联靶标。然后将靶标稀释并注射到芯片上面以得到用固定化材料的应答单位表示的信号。由于用共振单位(RU)表示的信号与固定化材料的质量成比例，这代表在基质上的固定化靶标密度的范围。在全局分析中同时拟合结合数据和解离数据以解出1:1双分子相互作用的净速率表达，从而产生k _on、k _off和R_max (饱和时的最大应答)的最佳拟合值。从SPR测量值计算关于结合的平衡解离常数K _d，表示为k _off/k _on。

在某些实施方案中，本发明的Combinectin表现出100nM或更低的K _d。优选地，所述K _d是10nM或更低。更优选地，所述K _d是1nM或更低。

在某些实施方案中，本发明的Combinectin表现出5 nM或更低、4 nM或更低、3 nM或更低、2.5 nM或更低、2 nM或更低、1.5 nM或更低、1 nM或更低、0.5 nM或更低、0.2 nM或更低或0.1 nM或更低的IC₅₀。优选地，所述IC₅₀是1.5 nM或更低. 更优选地，所述IC₅₀是0.5nM或更低。

应当理解，本文中上述测定是示例性的，并且可以使用本领域已知的用于确定蛋白之间的结合亲和力的任意方法(例如，基于荧光的转移(FRET)、酶联免疫吸附测定和竞争性结合测定(例如，放射免疫测定))来评估本发明的Combinectin的结合亲和力。

在本发明中，利用ELISA测定来鉴别结合CD4或gp41的Adnectin，其中通过BIACORE®SPR来确定亲和力。还使用FACS测定来确定CD4 Adnectin (单独的和作为完整Combinectin的部分)与天然地存在于T-细胞表面上的CD4的结合的EC₅₀。通过BIACORE®SPR测量肽亲和力。

如在下面表5中所述，CD4 Adnectin与CD4的结合亲合力范围(通过SPR)是0.3 nM至140 nM；N17 Adnectin与人工基于gp41的靶标的结合范围是0.5 nM至40 nM；肽结合的范围是0.2 nM至70 nM。本发明的Combinectin及其各个组分的基于SPR的亲和力显示在下面表5中。

表5 Combinectin和各个组分的结合亲合力

关于抑制活性的体外测定

存在多种本领域公知的体外系统，其允许检查Combinectin (或各种抑制剂或它们的组合)对HIV-1感染的效能。这些包括允许实验室衍生的病毒或不同毒株的临床分离物在培养的细胞或外周血单核细胞培养物中的完全复制的系统。另外，在不使用活病毒的情况下概括感染的早期细胞进入阶段的系统可以用于分析Combinectin、各种抑制剂或它们的组合的有效性。这些包括、但不限于含有使它们不能产生传染性病毒粒子的缺失的“假型化的”病毒，或仅表达HIV gp160基因的细胞（其可以用于监测HIV-1特异性的与靶细胞的融合反应）。

体内模型

本领域技术人员知晓多种本领域公知的动物模型，其允许复制和在某些情况下重现HIV感染的征状。这些模型可以用于测试本发明的Combinectin、各种抑制剂或它们的组合的效力。

XI. 治疗应用

在一个方面，本发明提供了可用于治疗HIV的Combinectin。因此，在某些实施方案中本发明提供了减弱或抑制主体中的HIV融合的方法，所述方法包括给主体施用有效量的本发明的Combinectin。在某些实施方案中，所述主体是人。在某些实施方案中，本发明的Combinectin对于哺乳动物、特别是人而言是药学上可接受的。“药学上可接受的”多肽表示在没有显著不利的医学后果的情况下施用给动物的多肽。

在某些实施方案中，将本发明的Combinectin与本领域已知可用于正在治疗的特定病症或疾病的药剂联合地（并行地或单独地）施用给主体。

在某些实施方案中，Combinectin疗法的靶患者群体是，由于例如年龄、预存状况、基因构成和/或并存病，不适合正在治疗的疾病的标准疗法的患者。本发明的Combinectin可以充当与重要副作用或安全性担忧有关的既存疗法的替代。

在某些实施方案中，Combinectin疗法的靶患者群体包括由于生活方式或其它恶化因素而处于感染高危中的未被感染的个体。使用Combinectin来保护这些个体免于受到HIV感染(暴露前预防)。

XII. 药物组合物

本发明还提供了包含本文描述的Combinectin或其融合蛋白的药物组合物，其中所述组合物是基本上无内毒素的，或至少含有不超过可接受的水平的内毒素，如适当的管理机构(例如，FDA)所确定的。

本发明的组合物可以呈以下形式：用于口服施用的丸剂、片剂、胶囊剂、液体或持续释放片剂；用于静脉内、皮下或胃肠外施用的液体；或用于局部施用的凝胶、洗剂、软膏剂、乳膏剂或聚合物或其它持续释放媒介物；或适合用于吸入或鼻内施用的可雾化混悬液。

本领域众所周知的用于制备组合物的方法参见，例如，Gennaro, A.R., 编,Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, Lippincott Williams& Wilkins, Philadelphia, PA (2000)。用于胃肠外施用的组合物可以例如含有赋形剂、无菌水、盐水、聚亚烷基二醇(诸如聚乙二醇)、植物来源的油类或氢化萘。生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制化合物的释放。纳米微粒组合物(例如，可生物降解的纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、脂质体)可以用于控制化合物的生物分布。其它潜在有用的胃肠外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。组合物中化合物的浓度随许多因素而变化，包括要施用的药物的剂量和施用途径。

可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度对接受者而言是无毒的，且包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂诸如EDTA；糖类诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如吐温、PLURONIC®或聚乙二醇(PEG)。

还可以将活性成分捕获在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，分别例如，羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基甲酰化)微胶囊，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊剂)中或在大乳剂中。这样的技术公开在Osol, A., 编, Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版(1980)。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明蛋白的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形物品（例如，薄膜或微胶囊）的形式。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟乙酸共聚物诸如LUPRON DEPOT®(由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟乙酸能够释放分子超过100天，某些水凝胶释放蛋白更短的时间段。当本发明的包囊化蛋白可以在体内保留长时间时，作为在37℃向水分暴露的结果，它们可以变性或聚集，从而导致生物活性的损失和免疫原性的可能变化。可以根据涉及的机制设计用于稳定化的合理策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫-二硫化物互换实现的分子间S-S键形成，通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制含水量、使用适当的添加剂和开发特定聚合物基质组合物，可以实现稳定化。

用于口服使用的本发明的组合物包括含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分的片剂。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂或填充剂（例如，蔗糖和山梨醇）、润滑剂、助流剂和抗粘着剂（例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、硅胶、氢化植物油或滑石）。用于口服使用的组合物也可以提供为咀嚼片剂或硬明胶胶囊剂（其中将活性成分与惰性固体稀释剂混合）或软明胶胶囊剂（其中将活性成分与水或油介质混合）。

要用于体内施用的药物组合物通常必须是无菌的。这可以通过穿过无菌过滤膜过滤来完成。在将所述组合物冻干的情况下，使用该方法的灭菌可以在冻干和重构之前或之后进行。用于胃肠外施用的组合物可以以冻干形式或以溶液形式储存。另外，通常将胃肠外组合物放在具有无菌访问端口的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。

一旦已经配制药物组合物，就可以将它作为溶液、混悬液、凝胶、乳剂、固体或脱水的或冻干的粉末储存在无菌管形瓶中。这样的制剂可以以现成即可使用的形式或以需要在施用前重构的形式(例如，冻干形式)储存。

本文中的组合物还可以含有超过一种对于正在治疗的特定适应症而言必要的活性化合物，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些。这样的分子适当地以对于预期目的而言有效的量存在于组合中。

XIII. 施用

使用标准的施用技术，包括口服、胃肠外、肺、透皮、肌肉内、鼻内、含服、舌下或栓剂施用，可以将包含本发明的Combinectin或其融合蛋白的药物组合物施用给具有HIV的主体。优选地，本发明的Combinectin的施用是胃肠外的。本文中使用的术语胃肠外包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道或腹膜内施用。通过静脉内或腹膜内或皮下注射进行的周围全身递送是优选的。

治疗有效剂量表示产生施用的预期治疗效果的剂量。要在治疗上采用的药物组合物的有效量将取决于例如治疗背景和目的。本领域技术人员会明白，治疗的适当剂量水平因而将部分地随递送的分子、正在使用的结合剂分子的适应症、施用途径以及患者的大小(体重、身体表面或器官大小)和状况(年龄和一般健康)而变化。

例如，可以最初在细胞培养测定中或在动物模型诸如小鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴中估计治疗有效剂量。还可以使用动物模型来确定适当的浓度范围和施用途径。然后可以使用这样的信息来确定在人类中有用的剂量和施用途径。

确切剂量将考虑到与需要治疗的主体有关的因素来确定，且可以使用标准技术来确定。调节剂量和施用以提供活性化合物的足够水平或维持期望的作用。可以考虑的因素包括疾病状态的严重程度、主体的一般健康、主体的年龄、重量和性别、施用的时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的应答。一般而言，在每天约0.01 mg/kg至约50 mg/kg、优选每天约0.01 mg/kg至约30 mg/kg、最优选每天约0.01 mg/kg至约20 mg/kg施用本发明的Combinectin。在某些实施方案中，在约0.01 mg/kg至约10 mg/kg、更优选约0.01至约5 mg/kg、最优选约0.01至约1 mg/kg的每周剂量施用本发明的Combinectin。可替换地，在约15至约100mg/周、约20至约80mg/周、约20至约60mg/周或约20至约25 mg/周施用本发明的Combinectin。

给药的频率将取决于使用的制剂中的结合剂分子的药代动力学参数。通常，施用组合物直到达到实现期望作用的剂量。所述组合物因此可以作为单剂量或作为随时间的多剂量(在相同或不同浓度/剂量)或作为连续输注来施用。常规地做出适当剂量的进一步细化。通过使用适当的剂量-响应数据，可以确定适当的剂量。例如，可以每天(例如，每天1次、2次、3次或4次)或以更低的频率(例如，每2天1次，每周或每月1次或2次)施用Combinectin。另外，如本领域已知的，针对年龄以及体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和疾病的严重程度的调节可能是必要的，且将由本领域技术人员通过例行实验确定。适当地一次性地或在一系列治疗中将Combinectin施用给患者。

Combinectin或其融合体、和一种或多种另外治疗剂的施用（无论是共同施用还是依次施用）可以如上所述针对治疗用途而发生。熟练的技术人员会理解，用于共同施用的合适的药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂取决于正在施用的特定治疗剂的身份。

XIV. 试剂盒和制成品

本发明的Combinectin可以提供在试剂盒中，即预定量的试剂与在本发明的治疗或诊断方法中的使用说明书的包装组合。

例如，在本发明的一个实施方案中，提供了一种制成品，其含有可用于治疗或预防上述障碍或病症的物质。所述制成品包含容器和标签。合适的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料制成，例如玻璃或塑料。所述容器容纳可有效地治疗HIV的本发明的组合物，且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的瓶子)。所述组合物中的活性剂是本发明的Combinectin。在容器表面上或伴随容器的标签指示，所述组合物用于治疗HIV。所述制成品还可以包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括从商业和用户观点看合乎需要的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明书的包装说明书。

通过引用并入

本文描述的所有文件和参考文献（包括专利文献和网站）各自通过引用并入本文件，达到如同在本文件中完整地或部分地书写的相同程度。

现在通过参考下述实施例来描述本发明，下述实施例仅仅是示例性的，且无意限制本发明。尽管已经参考其具体实施方案详细地描述了本发明，但是本领域技术人员会明白，可以对其做出多种变化和修改，而不脱离其精神和范围。

实施例

实施例1 - Combinectin生产/纯化

HIV Combinectin串联- 细菌

将DNA转化进BL21(DE3)细菌细胞中。

将细胞在细菌培养物中在约37℃培养至靶OD₆₀₀。

将培养温度降至约30℃，并用IPTG诱导培养物，并在几小时以后收获。

使用离心进行收获。

使用化学裂解和MICROFLUIDIZER®进行蛋白的回收，随后通过离心或切向流过滤进行澄清。将裂解物立即处理或冷冻用于以后使用。

通过疏水相互作用色谱法、随后的羟磷灰石色谱法和/或离子交换色谱法纯化。配制并使用切向流过滤浓缩。

HIV Combinectin-Fc构建体；哺乳动物细胞培养

将DNA转染进适当的哺乳动物细胞中。

使细胞在细胞培养物中生长。

通过离心和/或过滤进行收获。

使用亲和色谱法和离子交换色谱法纯化。

配制并使用切向流过滤浓缩。

HIV Combinectin-HuSA构建体；哺乳动物细胞培养

将DNA转染进适当的哺乳动物细胞中。

使细胞在细胞培养物中生长。

通过离心和/或过滤进行收获。

通过疏水相互作用色谱法、随后的羟磷灰石色谱法和/或离子交换色谱法纯化。

配制并使用切向流过滤浓缩。

实施例2 - Combinectin效能测定

MT-2细胞、HEK 293T细胞和NL_4˗3的前病毒DNA克隆得自NIH AIDS Research andReference Reagent Program。将MT-2细胞在补充了10%热灭活胎牛血清(FBS)、10 mMHEPES缓冲液pH 7.55和2 mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中繁殖。将HEK 293T细胞在补充了10%热灭活FBS、10 mM HEPES缓冲液pH 7.55和2 mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基中繁殖。在Bristol-Myers Squibb构建重组NL-Rluc病毒，其中来自NL_4˗3的前病毒克隆的nef基因的部分被Renilla萤光素酶基因替换。在用经修饰的pNL-Rluc前病毒克隆转染HEK 293T细胞以后3天收获复制感受态病毒。根据生产商的说明书，使用Lipofectamine Plus(Invitrogen, Carlsbad, CA)执行转染。使用萤光素酶酶活性作为生物标志物，在MT-2细胞中滴度病毒。在将肽加入96-孔平板之前1小时，使用NL-Rluc病毒以0.01的复数感染MT-2细胞。将肽连续稀释3倍，并将11种浓度一式三份地铺板。温育4-5天以后，将细胞处理并通过表达的萤光素酶的量定量病毒生长。使用来自Promega (Madison, WI)的双萤光素酶（Dual Luciferase）试剂盒，用经修改的生产商的方案，定量萤光素酶。将经稀释的被动裂解（Passive Lysis）溶液与重新悬浮的萤光素酶测定试剂（Luciferase Assay Reagent）预混合，并然后再悬浮于Stop & Glo®底物(2:1:1比率)中。将共计50 μL混合物加入测定平板上的每个抽吸孔中，并立即在Wallac TriLux (Perkin-Elmer, Waltham, MA)上测量萤光素酶活性。通过相对于没有加入肽的孔对比在有抑制性肽存在下产生的萤光素酶的量，计算50%有效浓度(EC₅₀)。

实施例3 - Combinectin药代动力学的评价

人CD4转基因小鼠模型

雄性和雌性杂合人CD4小鼠得自Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME。

WT小鼠PK研究

在雌性C57Bl/6 WT小鼠中进行8-21天单次静脉内推注剂量研究以评估各种Combinectin的PK性质。在10mg/kg施用Fc-Combinectin融合体，并在8.8mg/kg施用HSA-Combinectin融合体。将血浆样品收集在CPD中并在分析之前在-80℃保存。

hCD4小鼠PK研究

在杂合的hCD4小鼠中进行7-10天单次静脉内推注剂量研究以评估在有靶标存在下各种Combinectin的PK性质。Combinectin剂量和样品收集方法与上面关于WT小鼠所述相同。

食蟹猴研究

在雌性食蟹猴中进行1-周单剂量研究以确定Combinectin的PK。1mg/kg剂量以后，在指定的时间收集血清样品，等分并快速冷冻用于MSD或LC/MS分析。

药代动力学测量

使用中尺度技术平台或比色测量ELISA形式在小鼠或食蟹猴血浆中测量药物水平。将Fc-Combinectin融合体通过特异性地结合Combinectin的肽组分的蛋白PRD828 (BMS)捕获，并使用山羊抗-人IgG Fc-HRP缀合的pAb (Pierce #31413)检测。将HSA-Combinectin融合体通过PRD828捕获，并使用用钌标记的针对HSA的山羊pAb (Bethyl, TX #A80-229A)检测。使用5-参数对数拟合从标准曲线计算样品浓度。使用Phoenix WINNONLIN®6.3(Pharsight Corporation, Mountain View, CA)，使用血浆模型和线性上升（linear up）/对数下降（log down）计算方法，进行无房室分析。

Claims (52)

1.一种包含三种活性结构域的多肽，其中一种结构域是抗-CD4 Adnectin蛋白，第二种结构域是gp41结合部分，且第三种结构域是HIV融合肽抑制剂部分。

2.一种包含三种活性结构域的多肽，其中一种结构域是CD4结合部分，第二种结构域是抗-N17 Adnectin蛋白，且第三种结构域是HIV融合肽抑制剂部分。

3.一种包含三种活性结构域的多肽，其中一种结构域是CD4结合部分，第二种结构域是gp41结合部分，且第三种结构域是HIV融合肽抑制剂。

4.权利要求1-3的多肽，其中所述三种结构域通过接头以任意次序彼此连接。

5.权利要求1-3的多肽，所述多肽还包含一个或多个选自聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、转铁蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白结合蛋白和血清免疫球蛋白结合蛋白的药代动力学(PK)部分。

6.权利要求5的多肽，其中所述PK部分是Fc。

7.权利要求6的多肽，其中所述Fc连接至所述多肽的N-端。

8.权利要求5的多肽，其中所述PK部分是人血清白蛋白。

9.权利要求8的多肽，其中所述人血清白蛋白连接至所述多肽的N-端。

10.权利要求1的多肽，其中所述抗-CD4 Adnectin蛋白包含与SEQ ID NO: 95-114的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

11.权利要求2的多肽，其中所述抗-N17 Adnectin蛋白包含与SEQ ID NO: 115-371的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

12.权利要求3的多肽，其中所述HIV融合肽抑制剂包含与SEQ ID NO: 372-392的氨基酸序列与具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

13.一种包含两种活性结构域的多肽，其中一种结构域是抗-CD4 Adnectin蛋白，且另一种结构域是gp41结合部分或HIV融合肽抑制剂部分。

14.一种包含两种活性结构域的多肽，其中一种结构域是抗-N17 Adnectin蛋白，且另一种结构域是CD4结合部分或HIV融合肽抑制剂部分。

15.一种包含两种活性结构域的多肽，其中一种结构域是HIV融合肽抑制剂，且另一种结构域是gp41结合部分或CD4结合部分。

16.权利要求13-15的多肽，其中所述两种结构域通过接头以任意次序彼此连接。

17.权利要求13-15的多肽，所述多肽还包含一个或多个选自聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、转铁蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白结合蛋白和血清免疫球蛋白结合蛋白的药代动力学(PK)部分。

18.权利要求17的多肽，其中所述PK部分是Fc。

19.权利要求18的多肽，其中所述Fc连接至所述多肽的N-端。

20.权利要求17的多肽，其中所述PK部分是人血清白蛋白。

21.权利要求20的多肽，其中所述人血清白蛋白连接至所述多肽的N-端。

22.一种包含三种活性结构域的多肽，其中一种结构域是抗-CD4 Adnectin蛋白，第二种结构域是抗-N17 Adnectin蛋白，且第三种结构域是HIV融合肽抑制剂。

23.权利要求22的多肽，其中所述三种结构域通过接头以任意次序彼此连接。

24.权利要求22或23的多肽，所述多肽还包含一个或多个选自聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、转铁蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白结合蛋白和血清免疫球蛋白结合蛋白的药代动力学(PK)部分。

25.权利要求24的多肽，其中所述PK部分是Fc。

26.权利要求25的多肽，其中所述Fc连接至所述多肽的N-端。

27.权利要求24的多肽，其中所述PK部分是人血清白蛋白。

28.权利要求27的多肽，其中所述人血清白蛋白连接至所述多肽的N-端。

29.一种多肽，其包含与SEQ ID NO: 3、5、7或9的非接头区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

30.权利要求29的多肽，所述多肽还包含一个或多个选自聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、转铁蛋白、人血清白蛋白、血清白蛋白结合蛋白和血清免疫球蛋白结合蛋白的药代动力学(PK)部分。

31.权利要求30的多肽，其中所述PK部分是Fc。

32.权利要求31的多肽，其中所述Fc连接至所述多肽的N-端。

33.权利要求30的多肽，其中所述PK部分是人血清白蛋白。

34.权利要求33的多肽，其中所述人血清白蛋白连接至所述多肽的N-端。

35.一种多肽，其包含与SEQ ID NO: 4、6、8或10的非接头区域具有至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

36.一种多肽，其包含在SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列。

37.一种多肽，其包含在SEQ ID NO: 4中所示的氨基酸序列。

38.一种多肽，其包含在SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列。

39.一种多肽，其包含在SEQ ID NO: 6中所示的氨基酸序列。

40.一种多肽，其包含在SEQ ID NO: 7中所示的氨基酸序列。

41.一种多肽，其包含在SEQ ID NO: 8中所示的氨基酸序列。

42.一种多肽，其包含在SEQ ID NO: 9中所示的氨基酸序列。

43.一种多肽，其包含在SEQ ID NO: 10中所示的氨基酸序列。

44.一种包含两种活性结构域的多肽，其中一种结构域是抗-N17 Adnectin蛋白，且第二种结构域是HIV融合抑制剂肽。

45.权利要求44的多肽，其中所述两种结构域通过接头以任意次序彼此连接。

46.权利要求44或45的多肽，所述多肽还包含一个或多个选自聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、转铁蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白结合蛋白和血清免疫球蛋白结合蛋白的药代动力学(PK)部分。

47.权利要求46的多肽，其中所述PK部分是Fc。

48.权利要求47的多肽，其中所述Fc连接至所述多肽的N-端。

49.权利要求46的多肽，其中所述PK部分是人血清白蛋白。

50.权利要求49的多肽，其中所述人血清白蛋白连接至所述多肽的N-端。

51.一种药物组合物，其包含前述权利要求中的任一项的多肽和载体。

52.一种治疗主体中的HIV的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1-51中的任一项的肽或其组合物。