TW201643185A - 靶向ｈｉｖ融合物之多肽 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關包含CD4結合部分、gp41結合部分、HIV融合肽抑制劑部分及其組合之多肽。更特定言之，本發明係關於多肽，其包含結合CD4的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白、結合gp41之N17域的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白及HIV融合肽抑制劑或其組合。本發明亦關於該等新穎蛋白在治療HIV之治療性應用中之用途。

Description

靶向HIV融合物之多肽
本發明係有關包含CD4結合部分、gp41結合部分、HIV融合肽抑制劑部分及其組合之多肽。更特定言之，本發明係關於多肽，其包含結合CD4的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白、結合gp41之N17域的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白及HIV融合肽抑制劑或其組合。本發明亦關於該等新穎蛋白在治療HIV之治療性應用中之用途。
後天免疫缺乏症候群(AIDS)為稱為人類免疫缺乏病毒(HIV)之逆轉錄病毒感染之結果。其仍為重大醫學問題，2013年底全世界感染的人估計有3500萬。在該年期間，有210萬新增感染，且150萬人死於因AIDS所致的併發症。
針對HIV感染個體的當前療法係由核准之抗逆轉錄病毒藥劑之組合組成。逾24種藥物當前已核准用於HIV感染，其為單一藥劑、固定的劑量組合或單一錠劑方案，後兩者含有2至4種經核准的藥劑。此等藥劑屬於多種不同類別，靶向病毒酶或病毒生命週期期間的病毒蛋白質功能。因此，藥劑分類為核苷酸逆轉錄酶抑制劑(NRTI)、非核苷酸逆轉錄酶抑制劑(NNRTI)、蛋白酶抑制劑(PI)、整合酶抑制劑(INI)或進入抑制劑(一種進入抑制劑(馬拉維若(maraviroc))靶向宿主CCR5蛋白質，而另一種(恩夫韋地(enfuvirtide))為靶向病毒gp160蛋白質之gp41區域的肽)。另外，無抗病毒活性的藥物動力學增強劑(考比西他 (cobicistat))已核准與需要強化之抗逆轉錄病毒藥劑(ARV)組合使用。
儘管藥劑與藥物組合提供，但醫學上仍需要新穎的抗逆轉錄病毒藥劑，原因部分地為需要長期給藥來對抗感染。與長期毒性有關的重要問題已有記載，從而產生解決及預防此等併發症(例如CNS、CV/代謝、腎疾病)的需要。此外，由於耐藥性病毒株的存在或出現或由於藥物假期所致的非順應性或不良副作用，因此當前療法的失敗率升高繼續成為問題。舉例而言，儘管存在療法，但據估計，接受組合療法之個體63%仍存在病毒血症，因為其病毒負荷>500個複本/毫升(Oette,M,Kaiser,R,Däumer,M，等人Primary HIV Drug Resistance and Efficacy of First-Line Antiretroviral Therapy Guided by Resistance Testing.J Acq Imm Def Synd 2006；41(5)：573-581)。在此等患者當中，76%具有對一或多個類別之抗逆轉錄病毒藥劑具有耐藥性的病毒。因此，需要更方便的新穎藥物，其對耐藥性的發展具有較高遺傳學障礙且具有優於當前藥劑的經改良之安全性。
現已熟知，細胞可經由細胞膜與病毒膜之間發生融合的過程經HIV感染。此過程之普遍接受的模型為病毒包膜糖蛋白複合物(gp120/gp41)與標靶細胞膜上之電池表面受體相互作用。在gp120與細胞受體結合(例如CD4與趨化因子共同受體(諸如CCR5或CXCR4)組合)之後，在gp120/gp41複合物中誘發構形變化，其允許gp41插入至標靶細胞膜中且介導膜融合。由於此等進入過程發生在細胞膜上，故其適合用於經大分子(其包括生物肽)抑制(Haqqani及Tilton,Antiviral Res.2013；98：158)。舉例而言，核准的抗病毒肽恩夫韋地(Fuzeon®)靶向gp41中參與膜融合之區域。較大多肽(諸如單株抗體)亦可抑制不同的病毒進入態樣。靶向病毒進入之第一步(與細胞受體CD4相互作用)的單株抗體(伊利祖單抗(ibalizumab)；Bruno及Jacobson,J.Antimicrob.Chemother.2010；65：1839)以及靶向共同受體CCR5的單株抗體(PRO- 140；Tenorio,Curr.HIV/AIDS Rep.2011；8：1)在2a期試驗中均展示出積極的結果。此等抗體亦具有作為長效抗逆轉錄病毒之特性，其中可能的給藥方案為每週一次至每月一次(Jacobson等人J.Infect.Dis.2010；201：1481；Jacobson等人Antimicrob.Agents Chemother 2009；53：450)。
肽進入抑制劑之另一特性為若兩種肽抑制劑彼此連接，或若單一抑制劑經由結合於膜生物分子而位於作用位點附近，則可獲得增強或協同效力。因此，融合肽抑制劑與靶向CCR5之單株抗體連接(Kopetzki等人Virol.J.2008；5：56)或膽固醇部分與肽融合抑制劑之C端連接以使其位於標靶細胞膜表面處(Ingallinela等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2009；106：5801；Augusto等人J.Antimicrob.Chemother.2014；69：1286)與單獨的分子相比會大幅增加組合分子之效力。類似地，由與伊利祖單抗融合的靶向gp120之抗HIV-1中和抗體片段組成的雙特異性抗體與個別抑制劑相比展示出效力之協同增加(Sun等人J.Acquir.Immune Defic.Syndr.2014；66：473)。本發明之康巴奈汀(Combinectin)分子利用此等各種特性。
本發明係有關包含CD4結合部分、gp41結合部分、HIV融合肽抑制劑部分及其組合之多肽。
本發明之一個實施例係有關多肽，其包含結合CD4的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白、結合gp41之N17域的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白及HIV融合肽抑制劑。
在本發明之一個實施例中，三個域利用連接子彼此連接。在本發明之另一實施例中，三個域可依任何次序彼此連接。在本發明之另一實施例中，多肽包含與SEQ ID NO：3、5、7或9之非連接子區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
本發明亦有關多肽，其包含結合CD4的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白及結合gp41之N17域的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白。在本發明之一個實施例中，兩個域利用連接子彼此連接。在本發明之另一實施例中，兩個域可依任何次序彼此連接。
本發明亦有關多肽，其包含結合CD4的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白及HIV融合肽抑制劑。在本發明之一個實施例中，兩個域利用連接子彼此連接。在本發明之另一實施例中，兩個域可依任何次序彼此連接。
本發明亦有關多肽，其包含結合gp41之N17域的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白及HIV融合肽抑制劑。在本發明之一個實施例中，兩個域利用連接子彼此連接。在本發明之另一實施例中，兩個域可依任何次序彼此連接。在本發明之另一實施例中，多肽包含與SEQ ID NO：410-428之非連接子區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
本發明之另一實施例亦有關多肽，其包含三個活性域，亦即，結合CD4的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白、gp41結合部分及HIV融合肽抑制劑部分。本發明亦有關多肽，其包含結合gp41的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白、CD4結合部分及HIV融合肽抑制劑部分。本發明亦有關多肽，其包含CD4結合部分、gp41結合部分及HIV融合肽抑制劑。在本發明之一個實施例中，兩個域利用連接子彼此連接。在本發明之另一實施例中，兩個域可依任何次序彼此連接。
本發明亦有關多肽，其包含兩個活性域，亦即，結合CD4的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白及gp41結合部分。本發明亦有關多肽，其包含結合gp41的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白及CD4結合部分。本發明亦有關多肽，其包含CD4結合部分及HIV融合肽抑制劑。本發明亦有關多肽，其包含gp41結合部分及HIV融合肽抑制劑。在本發明之 一個實施例中，兩個域利用連接子彼此連接。在本發明之另一實施例中，兩個域可依任何次序彼此連接。
本發明之另一實施例亦有關抗CD4阿德奈汀(Adnectin)、抗N17阿德奈汀及HIV融合肽抑制劑。在本發明之另一實施例中，多肽包含分別與SEQ ID NO：95-114或SEQ ID NO：115-371或SEQ ID NO：372-392之非連接子區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在本發明之另一實施例中，藥物動力學(PK)部分連接於本發明之多肽。PK部分之實例包括(但不限於)聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、運鐵蛋白、血清白蛋白(HSA)、血清白蛋白結合蛋白及血清免疫球蛋白結合蛋白。在本發明之一個實施例中，PK部分可連接於連接子區或本發明多肽之N端或C端。在本發明之另一實施例中，多肽包含與SEQ ID NO：4、6、8或10之非連接子區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
本發明亦有關多肽，其包含SEQ ID NO：3-10中展示的序列中之任一者的胺基酸序列。
本發明亦有關一種醫藥組合物，其包含一或多種本發明多肽及載劑。
本發明亦提供一種治療個體之HIV之方法，其包含投與有效量之本發明多肽。
圖1為替代康巴奈汀之圖式。阿德奈汀中之一個結合CD4，第二阿德奈汀結合gp41之HR1區。肽亦結合在gp41之HR1區中。康巴奈汀之不同組分利用連接子依任何次序彼此連接。康巴奈汀中之任一者可連接有PK部分，諸如HSA或Fc。
圖2展示Fc融合物-康巴奈汀3137(SEQ ID NO：4)、3151(SEQ ID NO：6)及人類血清白蛋白(HSA)融合物-康巴奈汀3191(SEQ ID NO：8)及3202(SEQ ID NO：10)之胺基酸序列。Fc及HSA序列呈粗體。抗CD4阿德奈汀序列加下劃線。抗N17阿德奈汀序列加雙下劃線。HIV抑制劑肽序列加下劃線呈粗體。連接子序列為斜體的。
圖3展示康巴奈汀3137、3151、3191及3202之效力(EC50及EC90)，如實例2中所述。
圖4展示康巴奈汀3137、3151、3191及3202之PK特性，如實例3中所述。
圖5展示與HIV融合肽抑制劑組合的抗N17阿德奈汀之胺基酸序列，其對應於表4中所述之序列減去N端及C端延長區。抗N17阿德奈汀序列加雙下劃線。HIV融合肽抑制劑序列加下劃線呈粗體。連接子序列為斜體的。
圖6展示抗CD4阿德奈汀之CD環的WebLogo。WebLogo產生序列標識，多個序列比對中的模式之圖形表示。每一標識由字母之堆疊組成，序列中的每一位置有一個堆疊。每一堆疊之總高度指示在該位置處的序列保守(以位元為單位量測)，而堆疊中符號之高度反映在該位置處相應的胺基或核酸之相對頻率(Crooks GE等人，WebLogo：A sequence logo generator,Genome Research,14：1188-1190,(2004))。
圖7展示抗CD4阿德奈汀之FG環的WebLogo(Schneider TD,Stephens RM.1990.Sequence Logos：A New Way to Display Consensus Sequences,Nucleic Acids Res.18：6097-6100)。
定義
除非另有定義，否則本文中所用的所有技術及科學術語均具有與熟習此項技術者通常所理解相同的意義。儘管類似或等效於本文所述之方法及組合物之任何方法及組合物可用於實踐或測試本發明，但 本文描述較佳方法及組合物。
如本文所用之「多肽」係指由兩個或更多個胺基酸組成之任何序列，與長度、轉譯後修飾或功能無關。「多肽」、「肽」及「蛋白」在本文中可互換使用。多肽可以多種標準化學方式中之任一者修飾(例如，胺基酸可用保護基修飾；羧基末端胺基酸可製成末端醯胺基團；胺基末端殘基可用基團修飾以例如增強親脂性；或多肽可以化學方式經糖基化或以其他方式經修飾以增加穩定性或延長活體內半衰期)。多肽修飾可包括將另一結構(諸如環狀化合物或其他分子)連接至多肽，且亦可包括含有一或多個呈改變組態(亦即R或S；或L或D)之胺基酸的多肽。
本發明之肽可包括例如已經修飾以結合於CD4或gp41之N17域的衍生自纖維結合蛋白之第十III型域之蛋白，且在本文中稱為「抗CD4阿德奈汀」、「抗N17阿德奈汀」、「CD4阿德奈汀」或「gp41阿德奈汀」。本發明之多肽亦可包括在HIV包膜糖蛋白gp41之七聯體重複2(HR2)區之後模型化的肽，其藉由結合gp41之七聯體重複1(HR1)區抑制融合且在本文中稱為「HIV融合肽抑制劑」或「融合肽抑制劑」。本發明之多肽亦包括「康巴奈汀」，其包含連接於與HIV融合肽抑制劑連接的抗N17阿德奈汀之抗CD4阿德奈汀(圖1)。或者，康巴奈汀包含連接於抗N17阿德奈汀之抗CD4阿德奈汀或連接於HIV融合肽抑制劑之抗N17阿德奈汀或連接於HIV融合肽抑制劑之抗CD4阿德奈汀。
如本文所用之「多肽鏈」係指其中多肽的域中之每一者利用肽鍵(與非共價相互作用或二硫鍵相對)接合於其他域之多肽。
「經分離」多肽為自其天然環境之組分鑑別及分離及/或回收之多肽。其天然環境之污染組分為可干擾多肽之診斷或治療用途之物質，且可包括重組宿主細胞蛋白及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在一個實施例中，多肽將經純化(1)達至多肽之大於95重量%，如利用洛瑞 方法(Lowry method)所測定，且最佳地超過99重量%，或(2)使用庫馬斯藍(Coomassie blue)或銀染色在還原或非還原性條件下根據SDS-PAGE達至均質。通常，經分離多肽將藉由至少一個純化步驟來製備。
「胺基酸序列一致性百分比(%)」在本文中定義為在比對序列且必要時引入空位以達成最大序列一致性百分比之後，且不將任何保守取代考慮為序列一致性之一部分，候選序列中之胺基酸殘基與所選序列中之胺基酸殘基一致的百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術中之技能範圍內的各種方式達成，例如使用公開可獲得之電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTARTM)軟體。熟習此項技術者可易於確定用於量測比對之適當參數，包括用於達成所比較序列之全長內之最大比對所需的任何演算法。舉例而言，既定胺基酸序列A相對於、與或對照既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者，其可表述為相對於、與或對照既定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%之既定胺基酸序列A)如下計算：100乘分數X/Y，其中X為在A與B之程式比對中藉由序列比對程式ALIGN-2評為一致匹配之胺基酸殘基的數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基總數目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%將不相等。
如本文所用，「保守取代」指示胺基酸殘基經另一胺基酸殘基置換，且不改變肽之整體構形及功能，包括(但不限於)胺基酸經具有類似特性(諸如，極性、氫鍵勢能、酸性、鹼性、形狀、疏水性、芳族以及其類似特性)之胺基酸置換。具有類似特性之胺基酸為此項技術中所熟知。舉例而言，精胺酸、組胺酸及離胺酸為親水性-鹼性胺基酸且可互換。類似地，異白胺酸(疏水性胺基酸)可經白胺酸、甲硫胺 酸或纈胺酸置換。可彼此取代之中性親水性胺基酸包括天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸及蘇胺酸。藉由「經取代」或「經修飾」，本發明包括已自天然存在之胺基酸改變或修飾的彼等胺基酸。照此，應瞭解，在本發明之情形下，保守取代在此項技術中公認為一種胺基酸經具有類似特性之另一胺基酸取代。
如本文所用，術語「結合位點」係指蛋白(例如CD4、gp41)與本發明之具體蛋白相互作用或結合(例如，如抗原決定基由抗體識別)之位點或部分。結合位點可由藉由蛋白質之三級摺疊並列之鄰接胺基酸或非鄰接胺基酸形成。由鄰接胺基酸形成之結合位點通常在暴露於變性溶劑時保留，而藉由三級摺疊形成之結合位點通常在變性溶劑處理時丟失。
本發明之抗CD4部分或抗N17部分之結合位點可藉由應用通常用於抗體之抗原決定基定位的標準技術測定，包括(但不限於)蛋白酶定位及突變分析。或者，結合位點可藉由競爭分析使用結合於相同多肽(例如CD4或gp41)之參考蛋白(例如另一種阿德奈汀或抗體)測定。若測試蛋白及參考分子(例如另一種阿德奈汀或抗體)競爭，則其結合於相同結合位點或結合於足夠接近的結合位點，使得一種分子之結合干擾其他分子。
如在本文中可互換地使用之術語「特異性地結合」、「特異性結合」、「選擇性結合」及「選擇性地結合」係指蛋白對CD4或gp41展現親和力，但不顯著結合(例如小於約10%結合)於不同多肽，如利用在此項技術中可用的技術所量測，諸如但不限於史卡查分析(Scatchard analysis)及/或競爭結合分析(例如競爭ELISA、BIACORE SPR分析)。當例如本發明之蛋白之結合域對CD4或gp41具有特異性時，該術語亦可適用。
如本文所用之術語「優先結合」係指以下情形：本發明之肽結 合CD4或gp41至少約20%大於其結合不同多肽，如利用在此項技術中可用的技術所量測，諸如(但不限於)史卡查分析及/或競爭結合分析(例如競爭ELISA、BIACORE SPR分析)。
如本文所用，術語「交叉反應性」係指蛋白結合於一種以上具有相同或極類似結合位點之不同蛋白。
如本文所用之術語「K d」意欲指具體阿德奈汀-蛋白、融合肽抑制劑-蛋白或康巴奈汀-蛋白(例如CD4及/或gp41)相互作用之解離平衡常數或阿德奈汀、融合肽抑制劑或康巴奈汀對蛋白(例如CD4及/或gp41)之親和力，如使用表面電漿子共振分析或細胞結合分析所量測。如本文所用之「所需K d」係指本發明之蛋白足夠用於預期目的之K d。舉例而言，所需K d可能指在活體外分析(例如基於細胞之螢光素酶分析)中引發功能性作用所需的康巴奈汀之K d。
如本文所用之術語「k on」意欲指例如康巴奈汀締合至康巴奈汀/蛋白複合物中之締合速率常數。
如本文所用之術語「k off」意欲指例如康巴奈汀自康巴奈汀/蛋白複合物解離之解離速率常數。
如本文所用之術語「IC50」係指例如在活體外或活體內分析中將反應抑制至最大抑制反應之50%水準(亦即最大抑制反應與未治療之反應之間的一半)的康巴奈汀之濃度。
如本文所用之術語「抑制」或「中和」在本發明之蛋白活性方面意謂對受抑制的進展或嚴重度進行基本上拮抗、壓制、阻止、限制、減緩、擾亂、消除、終止、減少或逆轉的能力，該進展或嚴重度包括(但不限於)生物活性或特性、疾病或病狀。該抑制或中和較佳為至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或95%以上。
術語「PK」為「藥物動力學」之縮略語且包涵個體對化合物之 包括例如吸收、分佈、代謝及消除之特性。如本文所用之「PK調節蛋白」或「PK部分」係指當與生物學活性分子融合或與生物學活性分子一起投與時影響該生物學活性分子之藥物動力學特性的任何蛋白、肽或部分。PK調節蛋白或PK部分之實例包括PEG、人類血清白蛋白(HSA)結合子(如美國公開案第2005/0287153號、美國專利7,696,320、PCT公開案第WO 2009/083804號及第WO 2009/133208號中所揭示)、人類血清白蛋白、Fc或Fc片段及其變異體、及糖(例如唾液酸)。
術語「CD4結合部分」係指阻斷HIV表面蛋白gp120結合於CD4+ T細胞上之CD4受體的任何部分。CD4結合部分可為抗-CD4-阿德奈汀、-抗體(諸如伊利祖單抗)、-域抗體(dAb)、-抗體片段(Fab)、-雙特異性抗體及其融合蛋白。
術語「gp41結合部分」係指干擾病毒包膜糖蛋白複合物(gp120/gp41)與T細胞之相互作用的任何部分。gp41結合部分可為抗-gp41-阿德奈汀、-抗體(Ab)、-域抗體(dAb)、-抗體片段(Fab)、-雙特異性抗體及其融合蛋白。
「HIV融合肽抑制劑部分」係指藉由結合gp41之七聯體重複1(HR1)區來抑制融合的任何部分。融合肽抑制劑部分之實例包括衍生自gp41之NHR及CHR區的肽，分別命名為NHR為CHR肽。恩夫韋地為CHR肽之實例。
本發明之肽可包括例如CD4單株抗體伊利祖單抗、抗N17阿德奈汀及HIV融合肽抑制劑。或者，本發明之肽可包括抗CD4阿德奈汀、抗N17阿德奈汀及融合肽抑制劑恩夫韋地。
胺基酸序列或化合物之「半衰期」通常可定義為多肽之血清濃度在活體內降低50%(例如，歸因於序列或化合物之降解及/或序列或化合物利用天然機制之清除或螯合)所耗費的時間。半衰期可以自身 已知的任何方式測定，諸如利用藥物動力學分析測定。合適的技術將為熟習此項技術者所清楚，且可例如通常涉及以下步驟：向個體適合地投予合適劑量的本發明之胺基酸序列或化合物；在有規律的時間間隔下自個體收集血液樣品或其他樣品；測定該血液樣品中本發明之胺基酸序列或化合物之含量或濃度；以及自由此獲得之資料(之曲線圖)計算直到與在給藥後初始含量相比本發明之胺基酸序列或化合物的含量或濃度降低50%的時間。例如參考標準手冊，諸如Kenneth,A等人，Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook for Pharmacists及Peters等人，Pharmacokinetic Analysis：A Practical Approach(1996)。亦參考Gibaldi,M等人，Pharmacokinetics，第2次修訂版，Marcel Dekker(1982)。
半衰期可使用諸如t1/2-α、t1/2-β、HL_λ_z及曲線下面積(AUC)之參數表述。在本發明書中，「半衰期延長」係指此等參數中之任一者、此等參數中之任兩者、此等參數中之任三者或此等參數中之所有四者的增加。
標記「mpk」、「mg/kg」或「mg/kg(mg per kg)」係指每公斤毫克。所有標記在本發明通篇中可互換使用。
術語「個體(individual)」、「個體(subject)」及「患者」在本文中可互換地使用，係指動物，較佳為哺乳動物(包括非靈長類動物及靈長類動物)，包括(但不限於)鼠類動物、猿猴、人類、哺乳類農場動物(例如牛類動物、豬類動物、綿羊類動物)、哺乳類體育運動動物(例如馬類動物)及哺乳類寵物(例如犬及貓)；較佳地，該術語係指人類。在某一實施例中，個體為哺乳動物，較佳為人類且感染有HIV。
術語「治療有效量」係指向個體賦予治療益處所必需的藥劑之至少最低劑量(但小於毒性劑量)。舉例而言，本發明之康巴奈汀之治療有效量為在哺乳動物(較佳人類)中引起經感染個體中循環HIV顯著 降低之量。
概述
本發明提供結合於CD4及/或gp41之新穎多肽。多肽包含CD4結合部分、gp41結合部分、HIV融合肽抑制劑部分及其組合。更特定言之，本發明係關於多肽，該等多肽包含結合CD4的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白、結合gp41之N17域的基於纖維結合蛋白之骨架域蛋白及HIV融合肽抑制劑或其組合。(本文中稱為「康巴奈汀」)。
為了鑑別CD4及gp41阿德奈汀，將可溶性CD4(細胞外域)及gp41(各種經設計以展示模擬gp41之一部分的三螺旋區段之人工構築體)呈現至阿德奈汀之較大合成文庫。針對CD4或gp41結合、生物物理學特性及HIV-1抑制活性篩選經受住數輪選擇之阿德奈汀。使自篩選中顯現的最佳抗CD4及抗N17阿德奈汀序列突變且在增加的選擇壓力下經歷其他輪選擇，藉由降低標靶濃度及/或選擇具有較快締合速率及/或較慢解離速率的抗CD4或gp41阿德奈汀來達成。自此最佳化程序，多個阿德奈汀家族(一些靶向CD4且其他靶向gp41)鑑別為具備有利的生物化學及生物物理學活性之HIV-1特異性抑制劑。
最佳化的gp41靶向螺旋肽以與gp41 HR2相關的序列開始發展，且含有用於改進跨HIV病毒株之效力及廣度以及增加耐藥性屏障的變化。肽時常以合成方式且在其他時候以基因融合物形式產生為惰性或活性阿德奈汀。在與gp41阿德奈汀家族之成員的融合物中測定最佳N端及C端位置。為了鑑別將進一步增加效力的突變，使用具備適中效力之N端修整肽，使得改進將更易於偵測。製得包含單個和多個點突變之惰性阿德奈汀-肽融合物之小型文庫，接著使蛋白表現且針對生物物理學特性及HIV-1抑制活性進行篩選。最終肽家族由具有最有利概況的具備各種序列組合之最佳長度肽組成。
I.基於纖維結合蛋白之骨架-阿德奈汀
本申請案之一個態樣提供抗CD4及抗N17阿德奈汀，其包含纖維結合蛋白III型(Fn3)域，其中部分或所有溶劑可接近環中之一或多者已經隨機化或突變。在一些實施例中，非環β股中之一或多者中的一或多個殘基亦經隨機化或突變。在一些實施例中，Fn3域為衍生自人類纖維結合蛋白之第十類型3模組之Fn3域(10Fn3)： T(SEQ ID NO：1)(BC、CD、DE及FG環加下劃線)
在其他實施例中，10Fn3之非配位體結合序列，亦即「10Fn3骨架」，可改變，其限制條件為10Fn3保留配位體結合功能及/或結構穩定性。多種突變體10Fn3骨架已經報導。在一個態樣中，Asp 7、Glu 9及Asp 23中之一或多者經另一胺基酸置換，諸如，不帶負電荷的胺基酸殘基(例如Asn、Lys等)。此等突變已經報導具有與野生型形式相比在中性pH下促進突變體10Fn3之較高穩定性之作用(參見例如PCT公開案第WO 02/04523號)。已揭示有益或中性的10Fn3骨架中之多種其他改變。參見例如，Batori等人，Protein Eng.,15(12)：1015-1020(2002年12月)；Koide等人，Biochemistry,40(34)：10326-10333(2001年8月28日)。
變異體及野生型10Fn3蛋白之特徵在於結構相同，亦即命名為A至G的七個β股域序列及連接七個β股域序列之六個環區(AB環、BC環、CD環、DE環、EF環及FG環)。定位最接近N端及C端之β股可在溶液中採用β樣構形。在SEQ ID NO：1中，AB環對應於殘基14-17，BC環對應於殘基23-31，CD環對應於殘基37-47，DE環對應於殘基51-56，EF環對應於殘基63-67，且FG環對應於殘基75-87。
因此，在一些實施例中，本發明之抗CD4或抗N17阿德奈汀為與展示於SEQ ID NO：1中之人類10Fn3域至少40%、50%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%或90%一致的10Fn3多肽。許多變異通常將在一或多個環中發生。10Fn3多肽之β或β樣股中之每一者可基本上由以下組成：與SEQ ID NO：1之相應的β或β樣股之序列至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列，其限制條件為此類變異不破壞多肽在生理條件中之穩定性。
在一些實施例中，本發明提供一或多種包含第十纖維結合蛋白III型(10Fn3)域之阿德奈汀，其中10Fn3域包含環AB；環BC；環CD；環DE；環EF；及環FG；且具有至少一個選自相對於人類10Fn3域之相應環的序列具有改變的胺基酸序列之環BC、CD、DE及FG的環。在一些實施例中，本發明之阿德奈汀包含10Fn3域，該10Fn3域包含與SEQ ID NO：1之非環區至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，其中至少一個選自BC、CD、DE及FG的環改變。在一些實施例中，BC及FG環改變，且在一些實施例中，BC、DE及FG環改變，亦即10Fn3域包含非天然產生之環。在一些實施例中，AB、CD及/或EF環改變。在一些實施例中，CD及FG環改變。在一些實施例中，在鄰接環改變或不改變之情況下，環之間的股中之溶劑可接近的胺基酸改變。「改變」意謂相對於模板序列(相應的人類纖維結合蛋白域)的一或多個胺基酸序列改變，且包括胺基酸添加、缺失、取代或其組合。改變胺基酸序列可經由通常核酸編碼序列之有意、盲目或自發序列變異來實現，且可利用任何技術，例如PCR、易錯PCR或化學DNA合成進行。
在一些實施例中，相對於相應的人類纖維結合蛋白環，一或多個選自BC、CD、DE及FG的環之長度可延長或縮短。在一些實施例中，環之長度可延長1-25個胺基酸。在一些實施例中，環之長度可減少1-11個胺基酸。因此，為了使抗原結合最佳化，10Fn3之環的長度以及序列可改變以在抗原結合中獲得最大可能的可撓性及親和力。
在一些實施例中，阿德奈汀包含Fn3域，該Fn3域包含與SEQ ID NO：1之非環區至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，其中至少一個選自BC、CD、DE及FG的環改變。在一些實施例中，改變的BC環具有至多1、2、3、4、5、6、7、8或9個胺基酸取代，至多1、2、3或4個胺基酸缺失，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸插入或其組合。在一些實施例中，改變的CD環具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個胺基酸取代，至多1、2、3、4、5或6個胺基酸缺失，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸插入或其組合。在一些實施例中，改變的DE環具有至多1、2、3、4、5或6個胺基酸取代，至多1、2、3或4個胺基酸缺失，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個胺基酸插入或其組合。在一些實施例中，FG環具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個胺基酸取代，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個胺基酸缺失，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個胺基酸插入或其組合。
延伸序列
在某些實施例中，本發明之阿德奈汀分子可經修飾以包含N端延伸序列及/或C端延伸部分。舉例而言，MG序列可位於由SEQ ID NO：1定義之10Fn3之N端。M通常將裂解掉，留下G在N端。本文所述之阿德奈汀亦可包含替代C端尾部序列，在本文中被稱作截短C端或C端延伸序列。進一步，截短型可以截短形式用作治療性分子，或替代C端延伸部分(諸如His6標籤)可添加至截短型中。在某些實施例中，C端延伸序列(亦稱為「尾部」)包含E及D殘基，且長度可在8與50個、10與30個、10與20個、5與10個及2與4個胺基酸之間。在某些實施例中，C端延伸部分之第一個殘基為脯胺酸。在某些其他實施例中，C 端延伸部分之第一個殘基為麩胺酸。
在一些實施例中，N端可延伸至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或15個以上胺基酸，其可在數輪選擇之前或之後以任何方式改變，以便改良標靶結合、穩定性或兩者。在其他實施例中，C端可延伸至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或15個以上胺基酸，其可在數輪選擇之前或之後以任何方式改變，以便改良標靶結合、穩定性或兩者。在再其他實施例中，N端及C端均可以此方式延伸。
抗CD4阿德奈汀
本發明之抗CD4阿德奈汀環區CD及FG之胺基酸序列在下表1中列出。表1中所述之CD環替換由SEQ ID NO：1定義之10Fn3之R30至T49。表X中所述之FG環替換由SEQ ID NO：1定義之10Fn3之D67至N91。
表1亦列出包含所列出之CD/FG環組合之每種抗CD4阿德奈汀的IC50值。
在一些實施例中，抗CD4阿德奈汀包含與SEQ ID No：13-94之CD/FG環區組合至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
WebLogo(weblogo.berkeley.edu)用於鑑別抗CD4阿德奈汀之共同序列。抗CD4阿德奈汀CD環之Y32、I34、Y36、Q46及F48為保守胺基酸(參見圖6)。在一些實施例中，抗CD4阿德奈汀包含保守胺基酸Y32、I34、Y36、Q46及F48中之一或多者。
抗CD4阿德奈汀FG環之WebLogo鑑別的Y68、I70、V72、A74、T76、I88及I90為保守胺基酸(參見圖7)。在一些實施例中，抗CD4阿德奈汀包含保守胺基酸Y68、I70、V72、A74、T76、I88及I90中之一或多者。
在一些實施例中，抗CD4阿德奈汀包含保守胺基酸Y32、I34、 Y36、Q46、F48、Y68、I70、V72、A74、T76、I88及I90中之一或多者。
本發明之抗CD4阿德奈汀之全長胺基酸序列在下表2中列出。表2亦列出每種抗CD4阿德奈汀之抗病毒EC50值。
在一些實施例中，本發明之抗CD4阿德奈汀包含與SEQ ID NO：95-114中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、 99%或100%一致的胺基酸序列，不包括N端延長區。
在一些實施例中，本發明之抗CD4阿德奈汀包含與SEQ ID NO：95-114中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，不包括C端延長區。
在一些實施例中，本發明之抗CD4阿德奈汀包含與SEQ ID NO：95-114中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，不包括N端及C端延長區兩者。
在其他實施例中，抗CD4阿德奈汀包含與SEQ ID No：95-114之CD環及FG環區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
抗N17阿德奈汀
本發明之抗N17阿德奈汀蛋白之全長胺基酸序列在下表3中列出。表3亦列出每種抗N17阿德奈汀之抗病毒EC50值。
在一些實施例中，本發明之抗N17阿德奈汀包含與SEQ ID NO：115-371中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，不包括N端延長區。
在一些實施例中，本發明之抗N17阿德奈汀包含與SEQ ID NO：115-371中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，不包括C端延長區。
在一些實施例中，本發明之抗N17阿德奈汀包含與SEQ ID NO：115-371中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，不包括N端及C端延長區兩者。
在其他實施例中，抗N17阿德奈汀包含與SEQ ID No：115-371之BC環、DE環及FG環區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
上述序列之分析指示抗N17阿德奈汀DE環之S52、V53、L54及 S55為保守胺基酸。在一些實施例中，抗N17阿德奈汀包含保守胺基酸S52、V53、L54及S55中之一或多者。
另外，上述序列之分析指示抗CD4阿德奈汀BC環之Y24為保守胺基酸。在一些實施例中，抗N17阿德奈汀BC環之位置26為纈胺酸或白胺酸。
上述序列之分析指示抗N17阿德奈汀FG環之G78及S85為保守胺基酸。在一些實施例中，抗N17阿德奈汀包含保守胺基酸G78及S85中之一或多者。在一些實施例中，抗N17阿德奈汀FG環之位置79為纈胺酸或異白胺酸。
在一些實施例中，抗N17阿德奈汀包含保守胺基酸Y24、V26、L26、S52、V53、L54、S55、G78、V79、I79及S85中之一或多者。
II.融合肽抑制劑
不同的HIV-1病毒株當中的gp41之胺基酸序列及其變異為熟知的。咸信促融域(通常稱為融合肽或FP)參與插入至標靶細胞膜中及標靶細胞膜之破壞。含有跨膜錨序列之跨膜域朝向蛋白之C端定位。在促融域與跨膜錨之間為兩個不同的區，稱為七聯體重複(heptad repeat，HR)區，每個區具有複數個七聯體。包含HR1區之胺基酸序列及包含HR2區之胺基酸序列在HIV-1包膜蛋白中各自為相對保守區。
gp41之外部域之代表序列(分枝系B共同序列)如下： (SEQ ID NO：2)
融合肽由大約前23個胺基酸(Ala512-Ser534)組成。HR1區具有複數個連續的7個胺基酸殘基片段或「七聯體」(每個七聯體中之7個胺基酸命名為「a」至「g」)，具有在第一(「a」)及第四(「d」)位置處 疏水性殘基之優勢，該等疏水性殘基同型地相互作用以形成3-螺旋束結構之核心。中性極性胺基酸(諸如麩醯胺酸)亦可佔據此等位置。一個代表性七聯體以Leu545開始。HR1之高度保守部分由自Leu565至Leu581之17個殘基組成，且稱為「N17」。
gp41之C端部分包含HR2區，咸信其在融合過程期間形成α螺旋結構，且結合至HR1三螺旋結構之槽中。HR2亦包含七聯體，不過其並不同型地相互作用而是與來自HR1之胺基酸相互作用。一個代表性七聯體以Trp628開始。
HIV融合肽抑制劑
本發明之HIV融合肽抑制劑包括以下序列：
在一些實施例中，HIV融合肽抑制劑包含與SEQ ID NO：372-392中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
III.連接子
本發明之康巴奈汀之各種組分可共價或非共價鍵聯。在一些實施例中，PK部分可直接連接至康巴奈汀或經由多肽連接子間接連接至康巴奈汀。
合適的連接子為使得各別域彼此獨立地摺疊，形成允許高親和力結合於標靶分子之三維結構的連接子。
本發明提供許多符合此等需求之合適的連接子，包括基於甘胺酸-絲胺酸的連接子、基於甘胺酸-脯胺酸的連接子。本文所述之實例展現經由多肽連接子連接的康巴奈汀域保留其標靶結合功能。在一些實施例中，連接子為基於甘胺酸-絲胺酸的連接子。此等連接子包含甘胺酸及絲胺酸殘基且長度可在8與50個、10與30個及10與20個胺基酸之間。實例包括具有胺基酸序列(GS)7(SEQ ID NO：393)、G(GS)6(SEQ ID NO：394)及G(GS)7G(SEQ ID NO：395)之連接子。其他連接子含有麩胺酸，且包括例如(GSE)5(SEQ ID NO：396)及GGSEGGSE(SEQ ID NO：397)。其他例示性甘胺酸-絲胺酸連接子包括(GS)4(SEQ ID NO：398)、(GGGGS)7(SEQ ID NO：399)、(GGGGS)5(SEQ ID NO：400)、(GGGGS)4(SEQ ID NO：401)、(GGGGS)3G(SEQ ID NO：402)。在一些實施例中，連接子為基於甘胺酸-脯胺酸的連接子。此等連接子包含甘胺酸及脯胺酸殘基且長度可在3與30個、10與30個及3與20個胺基酸之間。實例包括具有胺基酸序列(GP)3G(SEQ ID NO：403)及(GP)5G(SEQ ID NO：404)之連接子。在其他實施例中，連接子可為基於脯胺酸-丙胺酸的連接子，其長度在3與30個、10與30個及3與20個胺基酸之間。基於脯胺酸丙胺酸的連接子之實例包括例如(PA)3(SEQ ID NO：405)、(PA)6(SEQ ID NO：406)及(PA)9(SEQ ID NO：407)。在一些實施例中，連接子為基於麩胺酸-脯胺酸的連接子。此等連接子包含麩胺酸及脯胺酸殘基，且長度可在3 與30個、10與30個及3與20個胺基酸之間。實例包括具有胺基酸序列ESPEPETPEDE(SEQ ID NO：408)及(ESPEPETPED)2E(SEQ ID NO：409)之連接子。預期最佳連接子長度及胺基酸組成可利用此項技術中熟知之方法藉由常規實驗確定。
連接子或間隔子可在抗CD4部分之N端、抗CD4部分之C端、抗gp41部分之N端、抗gp41部分之C端、HIV融合肽抑制劑之N端或其組合處引入。在一些實施例中，在抗CD4阿德奈汀與抗N17阿德奈汀之間的較佳連接子為較短的富麩醯胺酸-脯胺酸連接子。在一些實施例中，在抗N17阿德奈汀與HIV融合肽抑制劑之間的較佳連接子為可撓性的富甘胺酸-絲胺酸連接子。
IV.連接於HIV融合肽抑制劑康巴奈汀之抗N17阿德奈汀
本發明之抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀之胺基酸序列在下表4中列出。表4亦列出每一抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀之抗病毒EC50值。
在一些實施例中，抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀或其融合蛋白包含與SEQ ID NO：410-428中之任一者之非連接子區至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，不包括N端延長區、C端延長區或N端及C端延長區兩者。
在其他實施例中，抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀包含抗N17阿德奈汀，該抗N17阿德奈汀包含與SEQ ID No：410-428之BC環、DE環及FG環區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
V.連接於與HIV融合肽抑制劑康巴奈汀連接之抗N17阿德奈汀的抗CD4阿德奈汀
本發明之連接於與HIV融合肽抑制劑康巴奈汀連接之抗N17阿德奈汀的抗CD4阿德奈汀包括以下序列：
康巴奈汀3137(SEQ ID NO：3)
康巴奈汀3151(SEQ ID NO：5)
康巴奈汀3191(SEQ ID NO：7)
康巴奈汀3202(SEQ ID NO：9)
在上述序列中，抗CD4阿德奈汀序列加下劃線。抗N17阿德奈汀序列加雙下劃線。HIV融合肽抑制劑序列加下劃線呈粗體。連接子序列為斜體的。
在一些實施例中，康巴奈汀或其融合蛋白包含與SEQ ID NO：3-10中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或100%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，康巴奈汀或其融合蛋白包含與SEQ ID NO：3-10中之任一者之非連接子區至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在其他實施例中，康巴奈汀包含抗CD4阿德奈汀，該抗CD4阿德奈汀包含與SEQ ID No：3-10之CD環及FG環區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在其他實施例中，康巴奈汀包含抗N17阿德奈汀，該抗N17阿德奈汀包含與SEQ ID No：3-10之BC環、DE環及FG環區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在其他實施例中，康巴奈汀包含融合肽抑制劑，該融合肽抑制劑包含與SEQ ID No：3-10之HIV融合肽抑制劑至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
IV.藥物動力學部分
在一個態樣中，本申請案提供抗CD4部分、抗gp41部分、HIV融合肽抑制劑及其組合，進一步包含藥物動力學(PK)部分。改進的藥物動力學可根據所感知的治療需求評估。通常，需要提高生物可用性及/或延長劑量之間的時間，可藉由延長在給藥之後蛋白在血清中保持可利用的時間來進行。在一些情況下，需要改進隨時間推移蛋白之血清濃度之連續性(例如，降低在投與之後不久與即將下一次投與之前蛋白之血清濃度的差值)。本發明之康巴奈汀可連接至一個部分，相對於未經修飾之康巴奈汀，該部分使多肽在哺乳動物(例如小鼠、大鼠或人類)中之清除率降低至少兩倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍。改進的藥物動力學之其他量度可包括血清半衰期，其通常分成α期及β期。任一期或兩期可藉由添加適當部分來顯著改 進。舉例而言，相對於單獨康巴奈汀，PK部分可使多肽之血清半衰期延長超過5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%、400%、600%、800%、1000%或1000%以上。
減緩蛋白自血液之清除率的部分(本文中稱為「PK部分」)包括聚氧伸烷基部分(例如聚乙二醇)、糖(例如唾液酸)及良好耐受的蛋白部分(例如Fc及其片段及變異體、運鐵蛋白或血清白蛋白)。本發明之康巴奈汀亦可融合至白蛋白或白蛋白之片段(部分)或變異體，如美國公開案第2007/0048282號中所述，或可融合至一或多種阿德奈汀或結合血清白蛋白、Fc或運鐵蛋白的其他部分。
可用於本發明之其他PK部分包括Kontermann等人(Current Opinion in Biotechnology 2011；22：868-76，其以引用的方式併入本文中)中所述之彼等。此類PK部分包括(但不限於)人類血清白蛋白融合物、人類血清白蛋白結合物、人類血清白蛋白結合子(例如阿德奈汀PKE、AlbudAb、ABD)、XTEN融合物、PAS融合物(亦即基於三種胺基酸脯胺酸、丙胺酸及絲胺酸之重組PEG模擬物)、碳水化合物結合物(例如羥乙基澱粉(HES))、糖基化、聚唾液酸結合物及脂肪酸結合物。
因此，在一些實施例中，本發明提供融合至PK部分(其為聚合糖)之康巴奈汀。在一些實施例中，PK部分為聚乙二醇部分或Fc區。在一些實施例中，PK部分為血清白蛋白結合蛋白，諸如美國公開案第2007/0178082號及第2007/0269422號中所述之彼等。在一些實施例中，PK部分為人類血清白蛋白。在一些實施例中，PK部分為運鐵蛋白。
本發明之Fc融合物-康巴奈汀包括圖2之3137(SEQ ID NO：4)及3151(SEQ ID NO：6)中展示的序列。
在一些實施例中，Fc融合物-康巴奈汀或其融合蛋白包含與SEQ ID NO：4及6中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，Fc融合物-康巴奈汀或其融合蛋白包含與SEQ ID NO：4及6中之任一者之非連接子區至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在其他實施例中，Fc融合物-康巴奈汀包含抗CD4阿德奈汀，該抗CD4阿德奈汀包含與SEQ ID NO：4及6之CD環及FG環區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在其他實施例中，Fc融合物-康巴奈汀包含抗N17阿德奈汀，該抗N17阿德奈汀包含與SEQ ID No：4及6之BC環、DE環及FG環區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在其他實施例中，Fc融合物-康巴奈汀包含融合肽抑制劑，該融合肽抑制劑包含與SEQ ID No：4及6之HIV融合肽抑制劑至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
本發明之HSA融合物-康巴奈汀包括圖2之3191(SEQ ID NO：8)及3202(SEQ ID NO：10)中展示的序列。
在一些實施例中，HSA融合物-康巴奈汀或其融合蛋白包含與SEQ ID NO：8及10中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在一些實施例中，HSA融合物-康巴奈汀或其融合蛋白包含與SEQ ID NO：8及10中之任一者之非連接子區至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在其他實施例中，HSA融合物-康巴奈汀包含抗CD4阿德奈汀，該抗CD4阿德奈汀包含與SEQ ID No：8及10之CD環及FG環區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在其他實施例中，HSA融合物-康巴奈汀包含抗N17阿德奈汀，該抗N17阿德奈汀包含與SEQ ID No：8及10之BC環、DE環及FG環區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
在其他實施例中，HSA融合物-康巴奈汀包含融合肽抑制劑，該融合肽抑制劑包含與SEQ ID No：8及10之HIV融合肽抑制劑至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
聚乙二醇
在一些實施例中，抗CD4部分、抗gp41部分、HIV融合肽抑制劑及其組合包含聚乙二醇(PEG)。PEG為市售或可根據此項技術中熟知之方法藉由乙二醇之開環聚合製備的熟知的水溶性聚合物(Sandler及Karo,Polymer Synthesis,Academic Press,New York，第3卷，第138-161頁)。術語「PEG」廣泛地用於涵蓋任何聚乙二醇分子，與尺寸或PEG之一端的修飾無關，且可由下式表示：X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH，其中n為20至2300且X為H或末端修飾，例如C1-4烷基。PEG可含有結合反應所需的其他化學基團；該等基團由分子之化學合成產生；或其充當用於分子各部分之最佳距離之間隔基。此外，此類PEG可由連接在一起的一或多個PEG側鏈組成。具有一個以上PEG鏈之PEG稱為多臂或分支鏈PEG。分支鏈PEG例如描述於歐洲公開申請案第473084A號及美國專利第5,932,462號中。
一或多個PEG分子可連接在蛋白上之不同位置處，且此類連接可藉由與胺、硫醇或其他合適之反應性基團反應來達成。胺部分可例如為多肽之N端處發現之一級胺或胺基酸(諸如離胺酸或精胺酸)中存在的胺基。在一些實施例中，PEG部分連接在多肽上選自由以下組成之群的位置處：a)N端；b)在N端與最N端β股或β樣股之間；c)位於多肽上與標靶結合位點相對之表面上的環或股殘基；d)在C端與最C端β股或β樣股之間；e)在連接兩個結合域之連接子序列中，及f)在C端處。
聚乙二醇化可藉由定點聚乙二醇化來達成，其中將合適的反應性基團引入至蛋白中以形成優先發生聚乙二醇化的位點。在一些實施例中，蛋白經修飾以在所需位置處引入半胱胺酸殘基，允許半胱胺酸上的定點聚乙二醇化。突變可引入至蛋白編碼序列中以產生半胱胺酸殘基。此可例如藉由使一或多個胺基酸殘基突變成半胱胺酸來達成。較佳用於突變成半胱胺酸殘基之胺基酸包括絲胺酸、蘇胺酸、丙胺酸及其他親水性殘基。較佳地，欲突變成半胱胺酸之殘基為表面暴露的殘基。用於基於一級序列或蛋白預測殘基之表面可接近性的演算法為此項技術中熟知的。或者，表面殘基可藉由比較結合多肽之胺基酸序列來預測，鑒於構架之晶體結構(結合多肽基於其設計及演進)已經解析(參見Himanen等人，Nature 2001；414：933-8)且由此表面暴露的殘基已經鑑別。半胱胺酸殘基之聚乙二醇化可使用例如PEG-順丁烯二醯亞胺、PEG-乙烯基碸、PEG-碘乙醯胺或PEG-鄰吡啶基二硫化物進行。
PEG通常用適合於偶合至多肽上所需位點的合適的活化基團活化。聚乙二醇化方法為此項技術中熟知的且進一步描述於以下中：Zalipsky,S.等人，「Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides」Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications,J.M.Harris,Plenus Press,New York(1992)及Zalipsky(1995)Advanced Drug Reviews 16：157-182。
PEG之分子量可大幅變化，且可為分支鏈或直鏈。通常，PEG之重量平均分子量為約100道爾頓(Dalton)至約150,000道爾頓。PEG之例示性重量平均分子量包括約20,000道爾頓、約40,000道爾頓、約60,000道爾頓及約80,000道爾頓。在某些實施例中，PEG之分子量為40,000道爾頓。亦可使用具有前述任一者之總分子量之PEG之分支鏈 型式。在一些實施例中，PEG具有兩個分支。在其他實施例中，PEG具有四個分支。在另一實施例中，PEG為雙-PEG(NOF Corporation，DE-200MA)，兩個阿德奈汀與其結合。
此項技術中已知的習知分離及純化技術可用於純化聚乙二醇化阿德奈汀，諸如尺寸排阻(例如凝膠過濾)及離子交換層析法。產物亦可使用SDS-PAGE分離。可分離的產物包括單-、二-、三-、聚-及未-聚乙二醇化阿德奈汀以及游離PEG。單-PEG結合物之百分比可藉由合併溶離峰周圍更廣的溶離份來控制以增大組合物中單-PEG之百分比。約90%單-PEG結合物表示產率及活性之良好平衡。
在一些實施例中，聚乙二醇化抗CD4部分、抗gp41部分、HIV融合肽抑制劑及其組合將較佳地保留與未經修飾之抗CD4部分、抗gp41部分、阿德奈汀或康巴奈汀相關的生物活性之至少約25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%。在一些實施例中，生物活性係指其結合於CD4或gp41之能力，如由K d、k on或k off評估。在一些實施例中，相對於未聚乙二醇化的抗CD4部分、抗gp41部分、阿德奈汀或康巴奈汀，其聚乙二醇化抗CD4部分、抗gp41部分、阿德奈汀或康巴奈汀展示出在與CD4或gp41結合方面的增加。
免疫球蛋白Fc域(及片段)
在一些實施例中，本發明之肽融合至免疫球蛋白Fc域或其片段或變異體。如本文所用，「功能性Fc區」為保持結合FcRn之能力的Fc域或其片段。在一些實施例中，功能性Fc區結合於FcRn，但不具有效應功能。Fc區或其片段結合FcRn之能力可藉由此項技術中已知之標準結合分析來確定。在其他實施例中，Fc區或其片段結合於FcRn且具有天然Fc區之至少一種「效應功能」。例示性的「效應功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下調細胞表面受體(例如B 細胞受體；BCR)等。此類效應功能一般需要Fc區與結合域(例如抗CD4或抗N-17阿德奈汀)組合且可使用各種此項技術中已知用於評估此類抗體效應功能之分析來評估。
「天然序列Fc區」包含與自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。「變異Fc區」包含與天然序列Fc區之胺基酸序列相差至少一個胺基酸修飾的胺基酸序列。較佳地，相較於天然序列Fc區或相較於親本多肽之Fc區，變異Fc區具有至少一個胺基酸取代，例如約一個至約十個胺基酸取代；且在天然序列Fc區中或親本多肽之Fc區中較佳具有約一個至約五個胺基酸取代。本文中的變異Fc區將較佳地具有與天然序列Fc區及/或與親本多肽的Fc區至少約80%序列一致性，並且最佳地與其至少約90%序列一致性，更佳地與其至少約95%序列一致性。
在一例示性實施例中，Fc域衍生自IgG1子類，然而，亦可使用其他亞類(例如IgG2、IgG3及IgG4)。以下展示人類IgG1免疫球蛋白Fc域之序列： K(SEQ ID NO：11)
核心鉸鏈序列加下劃線，且CH2及CH3區為常規文字。應瞭解，C端甘胺酸及離胺酸在本發明之康巴奈汀中為視情況選用的。
融合可藉由使本發明之阿德奈汀連接至Fc分子之任一端來形成，亦即，Fc-阿德奈汀或阿德奈汀-Fc配置。在某些實施例中，Fc及阿德奈汀經由連接子融合。
在一些實施例中，用於阿德奈汀融合物中之Fc區包含Fc分子之鉸鏈區。如本文所用，「鉸鏈」區包含橫跨IgG1 Fc區之SEQ ID NO： 11之位置1-16(DKTHTCPPCPAPELLG；SEQ ID NO：12)的核心鉸鏈殘基。在某些實施例中，阿德奈汀-Fc融合物部分地由於鉸鏈區中SEQ ID NO：11之位置6及9處的半胱胺酸殘基而採用多聚結構(例如二聚物)。
在某些實施例中，阿德奈汀-Fc融合物可具有以下組態：1)阿德奈汀-鉸鏈-Fc或2)鉸鏈-Fc-阿德奈汀。因此，本發明之任何阿德奈汀可根據此等組態融合至包含鉸鏈序列之Fc區。在一些實施例中，連接子可以用於將阿德奈汀連接至鉸鏈-Fc部分，例如，例示性融合蛋白可具有組態阿德奈汀-連接子-鉸鏈-Fc或鉸鏈-Fc-連接子-阿德奈汀。另外，視產生融合多肽之系統而定，前導序列可放在融合多肽之N端處。舉例而言，若融合物在哺乳動物系統中產生，則前導序列可添加至融合物分子之N端中。若融合物在大腸桿菌(E.coli)中產生，則融合物序列的前面將為甲硫胺酸。
V.核酸-蛋白融合技術
在一個態樣中，本發明提供阿德奈汀，其包含結合CD4或gp41之n17域的纖維結合蛋白III型域。一種快速製造及測試具有特定結合特性之Fn3域的方式為核酸-蛋白融合技術。本發明使用活體外表現及標籤技術，稱為『PROfusion』，其利用核酸-蛋白融合物(RNA-及DNA-蛋白融合物)來鑑別對於結合於蛋白重要的新穎多肽及胺基酸基元。核酸-蛋白融合技術為將蛋白共價偶合至其編碼基因資訊的技術。關於RNA-蛋白融合技術及基於纖維結合蛋白之骨架蛋白文庫篩選方法之詳細描述參見Szostak等人，美國專利第6,258,558號、第6,261,804號、第6,214,553號、第6,281,344號、第6,207,446號、第6,518,018號及第6,818,418號；Roberts等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,1997；94：12297-12302；及Kurz等人，Molecules,2000；5：1259-64，該等文獻均以引用的方式併入本文中。
VI.載體及聚核苷酸
編碼本文揭示之各種蛋白或多肽中之任一者的核酸可以化學方式合成。可選擇密碼子使用以改良細胞中之表現。此類密碼子使用將視所選擇之細胞類型而定。已針對大腸桿菌及其他細菌，以及哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞及昆蟲細胞研發專用密碼子使用模式。參見例如：Mayfield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(2)：438-442(2003年1月21日)；Sinclair等人，Protein Expr.Purif.,26(I)：96-105(2002年10月)；Connell,N.D.,Curr.Opin.Biotechnol.,12(5)：446-449(2001年10月)；Makrides等人，Microbiol.Rev.,60(3)：512-538(1996年9月)；及Sharp等人，Yeast,7(7)：657-678(1991年10月)。
核酸操縱之通用技術描述於例如以下中：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Ausubel,F等人，Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing and Wiley-Interscience,New York(1987)及定期更新(以引用的方式併入本文中)。通常，編碼多肽之DNA可操作地連接於來源於哺乳動物、病毒或昆蟲基因之合適的轉錄或轉譯調節元件。此類調節元件包括轉錄啟動子、用於控制轉錄的視情況選用之操縱序列、編碼合適的mRNA核糖體結合位點之序列、及控制轉錄及轉譯終止之序列。可額外併入通常由複製起點賦予之在宿主中複製之能力及促進轉型體識別之選擇基因。
本文所述之蛋白可以不僅直接重組地產生，而且以與異源多肽的融合多肽形式產生，該異源多肽較佳為信號序列或在成熟蛋白或多肽之N端處具有特異性裂解位點的其他多肽。所選異源信號序列較佳為經宿主細胞識別且處理(亦即藉由信號肽酶裂解)之信號序列。
對於並不識別且處理天然信號序列之原核宿主細胞，信號序列經例如選自鹼性磷酸酶、青黴素酶、1pp或熱穩定腸毒素II前導子之 群的原核信號序列取代。
對於酵母分泌，天然信號序列可經例如酵母轉化酶前導子、因子前導子(包括酵母(Saccharomyces)及克魯維酵母(Kluyveromyces)α-因子前導子)或酸磷酸酶前導子、白色念珠菌(C.albicans)澱粉酶前導子或美國專利第5,631,144號中所述之信號序列取代。在哺乳動物細胞表現時，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導子，例如單純疱疹病毒gD信號。此前驅物區域之DNA在閱讀框架中接合至編碼蛋白的DNA。
表現載體及選殖載體均含有使得載體能夠在一或多種所選宿主細胞中複製的核酸序列。通常，在選殖載體中，此序列為使得載體能夠獨立於宿主染色體DNA複製的序列，並包括複製起點或自主複製序列。此類序列對於多種細菌、酵母及病毒而言為熟知的。來自質體pBR322之複製起點適用於大多數革蘭氏陰性細菌(Gram-negative bacteria)，2微米質體起點適用於酵母，並且各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。通常，哺乳動物表現載體不需要複製起點組件(SV40起點可通常僅由於其含有早期啟動子而經使用)。
表現載體及選殖載體可含有選擇基因，亦稱為可選擇標記物。典型選擇基因編碼如下蛋白：(a)賦予對抗生素或其它毒素(例如安比西林(ampicillin)、新黴素(neomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)或四環素(tetracycline))的抗性；(b)補充營養缺陷型缺乏；或(c)供應不可獲自複合培養基之關鍵營養素，例如編碼用於桿菌的D-丙胺酸消旋酶之基因。
表現載體及選殖載體通常含有由宿主生物體識別且可操作地連接於編碼本發明蛋白(例如基於纖維結合蛋白之骨架蛋白)之核酸的啟動子。適用於原核宿主的啟動子包括phoA啟動子、β-內醯胺酶及乳糖 啟動子系統、鹼性磷酸酶、色胺酸(trp)啟動子系統及雜交啟動子，諸如tan啟動子。然而，其他已知細菌啟動子為合適的。適用於細菌系統中之啟動子亦將含有可操作地連接於編碼本發明蛋白之DNA的夏因-達爾加莫(Shine-Dalgamo，S.D.)序列。真核生物的啟動子序列已知。幾乎所有的真核基因均具有富AT區，其位於轉錄起始位點上游約25至30個鹼基處。在許多基因轉錄起點上游70至80個鹼基處發現的另一序列為CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。在大多數真核基因之3'端處為AATAAA序列，其可為聚A尾添加至編碼序列之3'端的信號。所有此等序列適合插入至真核表現載體中。
適合與酵母宿主一起使用之啟動序列之實例包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖分解酶的啟動子，該等糖分解酶諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙醣磷酸異構酶、磷酸葡萄糖異構酶以及葡糖激酶。
可控制哺乳動物宿主細胞中利用載體進行的轉錄，例如藉由獲自以下之病毒之基因組的啟動子：諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽鳥肉瘤病毒、細胞巨大病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒且最佳地猴病毒40(SV40)；或異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子；熱休克啟動子，限制條件為此類啟動子與宿主細胞系統相容。
編碼本發明蛋白之DNA由高級真核生物的轉錄可以藉由插入強化子序列至載體中而增加。現已知得自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)的許多強化子序列。然而，通常，將使用得自真核細胞病毒之強化子。實例包括複製起點(bp 100-270)後的SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、複製起點後的多瘤病毒強化子，及腺病毒強化子。亦參見Yaniv,Nature 297：17-18 (1982)，其關於用於活化真核啟動子之強化元件。強化子可在肽編碼序列之5'或3'位處剪接至載體中，但較佳位於始於啟動子之5'位點處。
真核宿主細胞(例如酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或來自其他多細胞生物體之有核細胞)中使用的表現載體亦將含有轉錄終止及穩定mRNA必需的序列。此類序列通常可獲自真核或病毒DNA或cDNA的5'及偶爾3'非轉譯區。此等區域在編碼本發明蛋白之mRNA的非轉譯部分中含有以聚腺苷酸化片段形式轉錄的核苷酸區段。一種有用的轉錄終止組分為牛生長激素聚腺苷酸化區。參見WO94/11026及其中所揭示之表現載體。
重組DNA亦可包括可適用於純化蛋白的任何類型之蛋白標籤序列。蛋白標籤之實例包括(但不限於)組胺酸標籤、FLAG標籤、myc標籤、HA標籤或GST標籤。適合與細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主一起使用之適當選殖及表現載體可見於Cloning Vectors：A Laboratory Manual,(Elsevier,New York(1985))，其相關揭示內容以引用的方式併入本文中。
使用適用於宿主細胞之方法(如熟習此項技術者將顯而易知的)將表現構築體引入宿主細胞。此項技術中已知多種用於將核酸引入宿主細胞之方法，包括(但不限於)電致孔；採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-聚葡萄糖或其他物質進行之轉染；微彈轟擊；脂質體轉染；及感染(其中載體為感染物)。
合適的宿主細胞包括原核細胞、酵母、哺乳動物細胞或細菌細胞。合適的細菌包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)。酵母，較佳來自酵母(Saccharomyces)物種，諸如釀酒酵母(S.cerevisiae)，亦可用於產生多肽。多種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統亦可用於表現重組蛋白。用於在昆蟲細胞中產生 異源蛋白質之桿狀病毒系統由Luckow等人(Bio/Technology,6：47(1988))評述。合適的哺乳動物宿主細胞株之實例包括內皮細胞、COS-7猴腎細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、人胚腎細胞、HeLa、293、293T及BHK細胞株。藉由培養合適的宿主/載體系統以表現重組蛋白來製備經純化之多肽。對於許多應用，本文中所揭示之多種多肽之小尺寸將使在大腸桿菌中表現成為較佳表現方法。隨後自培養基或細胞提取物純化蛋白。
VII.蛋白製造
本發明亦有關表現康巴奈汀或其融合蛋白之細胞株。產生康巴奈汀之細胞株之建立及分離可使用此項技術中已知的標準技術(諸如本文所述之彼等)實現。
宿主細胞經用於製造蛋白的本文所述之表現或選殖載體轉型，且在適於誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列的基因的經調節之習知營養物培養基中培養。在此處展示的實例中，用於高通量蛋白生產(HTPP)及中等規模生產之宿主細胞為來自HMS174-細菌菌株之彼等。
用於產生本發明蛋白之宿主細胞可在多種培養基中培養。市售培養基，諸如漢氏F10(Ham's F10)(Sigma)、最小必需培養基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM)(Sigma)，適用於培養宿主細胞。此外，Ham等人，Meth.Enzymol.,58：44(1979)、Barites等人，Anal.Biochem.,102：255(1980)、美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655號、第5,122,469號、第6,048,728號、第5,672,502號或美國專利第RE 30,985號中所述之許多培養基可用作宿主細胞之培養基。此等培養基中之任一者可視需要補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、 鹽(諸如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如健大黴素(Gentamycin)藥物)、微量元素(定義為通常以微莫耳範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能量來源。亦可以熟習此項技術者將已知之適當濃度包括任何其他必要的補充劑。培養條件(諸如溫度、pH及其類似條件)為先前經選擇用於表現的宿主細胞所用的培養條件，且對於一般技術者而言為顯而易見的。
本文中所揭示之蛋白亦可使用無細胞轉譯系統產生。對於此類目的，編碼多肽之核酸必須經修飾以允許活體外轉錄以產生mRNA，且允許使用不含特定細胞之系統中mRNA之無細胞轉譯(真核生物，諸如不含哺乳動物或酵母細胞之轉譯系統，或原核生物，諸如不含細菌細胞之轉譯系統)。
本發明之蛋白亦可藉由化學合成製備(例如藉由Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，The Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.(1984)中所描述之方法)。對蛋白之修飾亦可藉由化學合成產生。
本發明之蛋白可藉由蛋白質化學領域中通常已知之用於蛋白質之分離/純化方法來純化。非限制性實例包括提取、再結晶、鹽析(例如用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超濾、吸附層析、離子交換層析、疏水性層析、正相層析、逆相層析、凝膠過濾、凝膠滲透層析、親和層析、電泳、逆流分佈或此等方法之任何組合。在純化之後，多肽可交換至不同緩衝液中及/或藉由此項技術中已知的多種方法中之任一種濃縮，包括(但不限於)過濾及透析。
經純化之多肽較佳具有至少85%純度，更佳至少95%純度且最佳至少98%純度。無論純度之精確數值如何，多肽足夠純以用作醫藥產品。
VIII.生物物理學及生物化學表徵
本發明蛋白與標靶分子(例如CD4或gp41)之結合可在平衡常數(例如解離，K d)方面及在動力學常數(例如締合速率常數，k on及解離速率常數，k off)方面加以評估。本發明蛋白通常將以小於500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pM或100pM之K d結合於標靶分子，不過可容許較高K d值，其中k off足夠低或k on足夠高。
結合親和力之活體外分析
結合CD4或gp41之蛋白可使用各種活體外分析鑑別。較佳地，分析為允許同時篩選多個候選物之高通量分析。
在一些實施例中，生物分子相互作用可用Biacore系統實時監測，其使用SPR偵測玻璃支撐物上薄金膜之表面處光之共振角度因表面高達300nm遠之折射率變化所致的變化。Biacore分析產生締合速率常數、解離速率常數、平衡解離常數及親和力常數。結合親和力藉由使用Biacore表面電漿子共振系統(Biacore,Inc.)評估締合及解離速率常數來獲得。活化生物感測器晶片以用於標靶之共價偶合。接著，將標靶稀釋且注射於晶片上以獲得固定物質之反應單位的信號。由於共振單位(RU)的信號與固定物質之質量成比例，故此代表基質上固定標靶密度之範圍。締合及解離資料同時擬合整體分析以求解1：1雙分子相互作用之淨速率表示，得到k on、k off及Rmax(飽和處最大反應)之最佳擬合值。結合之平衡解離常數K d'由SPR量測計算為k off/k on。
在一些實施例中，本發明之康巴奈汀展現100nM或100nM以下之K d。較佳地，K d為10nM或10nM以下。更佳地，K d為1nM或1nM以下。
在一些實施例中，本發明之康巴奈汀展現5nM或5nM以下、4nM或4nM以下、3nM或3nM以下、2.5nM或2.5nM以下、2nM或2nM以下、1.5nM或1.5nM以下、1nM或1nM以下、0.5nM或0.5nM以下、0.2nM或0.2nM以下或0.1nM或0.1nM以下之IC50。較佳地， IC50為1.5nM或1.5nM以下。更佳地，IC50為0.5nM或0.5nM以下。
應瞭解，上文所描述之分析為例示性的，且此項技術中已知用於測定蛋白之間的結合親和力之任何方法(例如基於螢光之轉移(FRET)、酶聯結免疫吸附分析及競爭性結合分析(例如放射免疫分析))均可用於評估本發明之康巴奈汀的結合親和力。
在本發明中，ELISA分析用於鑑別結合於CD4或gp41之阿德奈汀，且親和力藉由Biacore SPR測定。FACS分析亦用於測定CD4阿德奈汀(單獨及作為完整康巴奈汀之一部分)與如T細胞表面上天然呈現之CD4之結合的EC50。肽親和力由Biacore SPR量測。
如下表5中所述，CD4阿德奈汀與CD4之結合親和力(根據SPR)之範圍為0.3nM至140nM；N17阿德奈汀結合於基於人造gp41之標靶的範圍為0.5nM至40nM；肽結合之範圍為0.2nM至70nM。本發明之康巴奈汀及其個別組分之基於SPR之親和力展示在下表5中。
抑制活性之活體外分析
存在允許檢查康巴奈汀(或個別抑制劑或其組合)對抗HIV-1感染之效力的各種此項技術中公認的活體外系統。此等包括允許在經培養細胞或周邊血液單核球培養物中完整複製實驗室衍生之病毒或各種病毒之臨床分離株的系統。此外，在不使用活病毒的情況下重現感染之早期細胞進入階段的系統可用於分析康巴奈汀、個別抑制劑或其組合 之有效性。此等包括(但不限於)「假模式化」病毒，其含有使其不能產生感染性病毒粒子或僅表現可用於監測與標靶細胞之HIV-1特異性融合反應的HIV gp160基因之細胞的缺失。
活體內模型
熟習此項技術者將知曉各種此項技術中公認的允許複製且在一些情況下重現HIV感染之症狀的動物模型。此等模型可用於測試本發明之康巴奈汀、個別抑制劑或其組合之功效。
IX.治療性應用
在一個態樣中，本發明提供適用於HIV治療之康巴奈汀。因此，在某些實施例中，本發明提供用於使個體之HIV融合物得以減毒或抑制的方法，其包含向個體投與有效量之本發明之康巴奈汀。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，本發明之康巴奈汀為哺乳動物、尤其人類醫藥學上可接受的。「醫藥學上可接受之」多肽係指投與動物且無顯著不良醫學後果之多肽。
在一些實施例中，本發明之康巴奈汀將與此項技術中已知適用於所治療之具體病症或疾病的藥劑組合(同時或分開)投與個體。
在一些實施例中，康巴奈汀治療之目標患者群體為因例如年齡、預先存在的病狀、基因組成及/或共存疾病而無法經受所治療疾病之標準療法的患者群體。本發明之康巴奈汀可用作與相當大的副作用或安全性問題相關的現有療法之替代方案。
在一些實施例中，康巴奈汀療法之目標患者群體包含因生活方式或其他加重因素而處於高度感染風險中之未感染個體。康巴奈汀用於保護此等個體免於經HIV感染(暴露前預防)。
X.醫藥組合物
本發明進一步提供醫藥組合物，其包含本文所述之康巴奈汀或其融合蛋白，其中該組合物基本上無內毒素，或至少含有不超過如由 適當監管機構(例如FDA)確定的可接受含量之內毒素。
本發明之組合物可呈以下形式：用於經口投與之丸劑、錠劑、膠囊、液體或持續釋放錠劑；用於靜脈內、皮下或非經腸投與之液體；或用於局部投與之凝膠、洗劑、軟膏、乳膏或聚合物或其他持續釋放媒劑、或用於吸入或鼻內投與之可霧化懸浮液。
此項技術中熟知的用於製造組合物之方法見於例如「Remington：The Science and Practice of Pharmacy」(第20版，A.R.Gennaro AR.編，2000,Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,Pa.)中。用於非經腸投與之組合物可例如含有賦形劑、無菌水、鹽水、聚伸烷基二醇(諸如聚乙二醇)、植物來源之油或氫化萘。生物可相容、可生物降解丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用於控制化合物之釋放。奈米顆粒組合物(例如可生物降解奈米粒子、固體脂質奈米粒子、脂質體)可用於控制化合物之生物分佈。其他潛在適用之非經腸傳遞系統包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物粒子、滲透泵、可植入輸注系統及脂質體。組合物中化合物之濃度視多種因素而變化，包括待投與之藥物之劑量及投藥途徑。
在所採用之劑量及濃度下，可接受之載劑、賦形劑或穩定劑對接受者無毒，且其包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；苄索氯銨；酚；丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或聚葡萄糖；螯合劑，諸如 EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如，Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如Tween、PLURONICTM或聚乙二醇(PEG)。
亦可將活性成分截留於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備的微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊))中、截留於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或截留於巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適的實例包括含有本發明蛋白之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與y乙基-L-麩胺酸之共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及亮丙瑞林乙酸鹽(leuprolide acetate)構成之可注射微球體)之可降解乳酸-乙醇酸共聚物及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物允許持續超過100天釋放分子，但某些水凝膠持續較短時間段釋放蛋白質。當本發明之囊封蛋白可能長時間留存於體內時，其可因在37℃下暴露於水分而變性或聚集，引起生物活性損失且其免疫原性可能變化。可視所涉及的機制而設計合理穩定化策略。舉例而言，若發現聚集機制係經由硫基-二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，則穩定化可藉由修飾巰基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適當添加劑及開發特定聚合基質組合物來達成。
用於經口使用的本發明之組合物包括含有與無毒性醫藥學上可接受之賦形劑混合的活性成分的錠劑。此等賦形劑可為例如惰性稀釋 劑或填充劑(例如蔗糖及山梨糖醇)、潤滑劑、助滑劑及抗黏著劑(例如硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、二氧化矽、氫化植物油或滑石)。用於經口使用之組合物亦可以咀嚼錠，或硬明膠膠囊(其中活性成分與惰性固體稀釋劑混合)，或軟明膠膠囊(其中活性成分與水或油介質混合)形式提供。
待用於活體內投與之醫藥組合物通常必須為無菌的。此可藉由無菌過濾膜過濾來實現。在凍乾組合物的情況下，可在凍乾及復原之前或之後使用此方法進行滅菌。非經腸投與之組合物可以凍乾形式儲存或儲存於溶液中。另外，非經腸組合物通常置放於具有無菌接取孔之容器中，例如具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。
一旦醫藥組合物已調配，即可將其以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或脫水或凍乾粉末形式儲存於無菌小瓶中。此等調配物可以即用形式或需要在投與前復原之形式(例如凍乾形式)儲存。
本文之組合物亦可含有超過一種為所治療之特定適應症所必需之活性成分，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之互補活性的活性成分。此類分子適合地以對預期目的有效之量存在於組合中。
XI.投與
包含本發明之康巴奈汀或其融合蛋白的醫藥組合物可使用標準投與技術(包括經口、非經腸、經肺、經皮、肌內、鼻內、頰內、舌下或栓劑投與)投與患有HIV之個體。較佳地，本發明之康巴奈汀之投與為非經腸的。如本文所用之術語非經腸包括靜脈內、肌內、皮下、經直腸、經陰道或腹膜內投與。藉由靜脈內或腹膜內或皮下注射之周邊全身傳遞為較佳的。
治療有效劑量係指產生其投與所達成之治療作用的劑量。治療上使用的醫藥組合物之有效量將根據例如治療情形及目標而定。熟習 此項技術者將瞭解，治療之適當劑量水準將因此部分地視以下各者而變化：所傳遞的分子、所使用的結合劑分子所針對的適應症、投與之途徑、及患者之尺寸(體重、體表或器官尺寸)及病狀(年齡及一般健康狀況)。
舉例而言，治療上有效的劑量可最初在細胞培養分析中或在諸如小鼠、大鼠、家兔、狗、豬或猴的動物模型中估算。動物模型亦可用於測定投與之適當濃度範圍及途徑。該等資訊可隨後用於確定適用於投與人類之劑量及途徑。
確切劑量將根據與需要治療之個體相關的因素確定，且可使用標準技術確定。調節劑量及投與以提供充足量之活性化合物或維持所需效果。可顧及的因素包括疾病病況之嚴重度、個體之一般健康狀況、個體之年齡、體重及性別、投與之時間及頻率、藥物組合、反應敏感性及對療法之反應。一般而言，本發明之康巴奈汀以每天約0.01mg/kg至約50mg/kg、較佳地每天約0.01mg/kg至約30mg/kg、最佳每天約0.01mg/kg至約20mg/kg投與。在一些實施例中，本發明之康巴奈汀以約0.01mg/kg至約10mg/kg、更佳地約0.01至約5mg/kg、最佳約0.01至約1mg/kg之每週劑量投與。或者，本發明之康巴奈汀以約15至約100mg/週、約20至約80mg/週、約20至約60mg/週、或約20至約25mg/週投與。
給藥頻率將視所用調配物中之結合劑分子的藥物動力學參數而定。通常，投與組合物直至達到達成所需作用之劑量。組合物可因此以單次劑量或隨時間推移的多次劑量(處於相同或不同濃度/劑量)形式投與，或以連續輸注形式投與。常規地對適當劑量作出進一步優化。適當劑量可經由使用適當的劑量-反應資料來確定。舉例而言，康巴奈汀可每天(例如每天一次、兩次、三次或四次)或較不頻繁地(例如每隔一天一次、每週一次或兩次、或每月一次)給予。此外，如此項技 術中已知，可能需要視年齡以及體重、一般健康狀況、性別、飲食、投藥時間、藥物相互相用及疾病嚴重度進行調節，且可由熟習此項技術者藉由常規實驗確定。一次性或歷經一系列治療向患者適當地投與康巴奈汀。
康巴奈汀或其融合物及一或多種其他治療劑之投與(無論共同投與或依序投與)可如上文所述進行以用於治療性應用。熟習此項技術者將理解用於共投與之合適的醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及賦形劑視所投與的具體治療劑之身分而定。
XII.套組及製品
本發明之康巴奈汀可以套組形式提供，套組為用於本發明之治療或診斷方法的呈預定量之試劑與說明書之經包裝組合。
舉例而言，在本發明之一個實施例中，提供含有適用於治療或預防上文所述的病症或病狀之材料的製品。製品包含容器及標記。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器及試管。容器可由各種材料形成，諸如玻璃或塑膠。容器容納對於治療HIV有效之本發明組合物且可具有無菌接取孔(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之活性劑為本發明之康巴奈汀。容器上或與容器相關的標記指示該組合物用於治療HIV。製品可進一步包含第二容器，該第二容器包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可以進一步包括自商業及使用者的觀點來看合乎需要的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、注射器及包裝插入物與使用說明書。
以引用的方式併入
本文所述之所有文件及參考文獻(包括專利文件及網站)均以引用的方式個別地併入本文件中，其引用的程度就如同完整或部分地編寫在本文件中一般。
本發明現參考以下實例描述，該等實例僅為說明性的，且不意欲限制本發明。雖然已參考本發明之特定實施例詳細描述本發明，但是對熟習此項技術者而言，在不偏離本發明之精神及範疇的情況下，可對其作出各種改變及修改將係顯而易見的。
實例 實例1-康巴奈汀製造/純化 HIV康巴奈汀串聯-細菌
轉型DNA至BL21(DE3)細菌細胞中。
細胞在細菌培養物中在約37℃下生長至目標OD600。
培養溫度下降至約30℃，且培養物用IPTG誘導且在數小時之後收集。
收集使用離心機進行。
蛋白之回收使用化學溶解及微流化床，隨後藉由離心或切向流過濾澄清來進行。立即處理溶解物或將其冷凍以供稍後使用。
依序藉由疏水性相互作用層析以及羥基磷灰石層析及/或離子交換層析純化。調配且使用切向流過濾濃縮。
HIV康巴奈汀-Fc構築體；哺乳動物細胞培養
DNA轉染至適當哺乳動物細胞中
細胞生長在細胞培養物中
藉由離心及/或過濾收集
使用親和層析及離子交換層析純化
調配且使用切向流過濾濃縮。
HIV康巴奈汀-HuSA構築體；哺乳動物細胞培養
DNA轉染至適當哺乳動物細胞中
細胞生長在細胞培養物中
藉由離心及/或過濾收集
依序藉由疏水性相互作用層析以及羥基磷灰石層析及/或離子交換層析純化。
調配且使用切向流過濾濃縮。
實例2-康巴奈汀效力分析
MT-2細胞、HEK 293T細胞及NL4-3之前病毒DNA純系獲自NIH AIDS研究及參考試劑規劃(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)。MT-2細胞在補充有10%熱不活化胎牛血清(FBS)、10mM HEPES緩衝液pH 7.55及2mM L-麩醯胺酸之RPMI 1640培養基中繁殖。HEK 293T細胞在補充有10%熱不活化FBS、10mM HEPES緩衝液pH 7.55及2mM L-麩醯胺酸之DMEM培養基中繁殖。重組NL-Rluc病毒(其中來自NL4-3之前病毒純系的nef基因之區段經海腎螢光素酶基因置換)在Bristol-Myers Squibb構築。用經修飾的pNL-Rluc前病毒純系轉染HEK 293T細胞之後3天收集複製勝任型病毒。轉染使用LipofectAMINE PLUS(Invitrogen,Carlsbad,CA)根據製造商的說明書進行。使用螢光素酶酶活性作為生物標記，在MT-2細胞中滴定病毒。使用NL-Rluc病毒、以0.01之複數感染MT-2細胞持續1小時，隨後添加至96孔盤中的肽中。肽以三倍連續稀釋，且將11種濃度一式三份地接種。在培育4-5天之後，處理細胞，且利用所表現的螢光素酶之量來定量細胞之病毒生長。在修改製造商方案的情況下，使用來自Promega(Madison,WI)之雙重螢光素酶套組定量螢光素酶。將經稀釋之被動溶解溶液(Passive Lysis solution)與再懸浮之螢光素酶分析試劑預混合且接著再懸浮於Stop & Glo受質(2：1：1比率)中。將總共50μL混合物添加至分析盤上的每一抽吸孔中，且在Wallac TriLux(Perkin-Elmer,Waltham,MA)上立即量測螢光素酶活性。50%有效濃度(EC50)藉由將在抑制性肽存在下產生的螢光素酶之量與其中不添加肽之孔比較來計算。
實例3-康巴奈汀藥物動力學之評估
人類CD4轉殖基因小鼠模型 雄性及雌性異型接合子人類CD4小鼠獲自Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME。
野生型小鼠PK研究. 8-21天單次IV快速給藥研究在雌性C57BL/6野生型小鼠中執行以評估各種康巴奈汀之PK特性。Fc-康巴奈汀融合物以10mg/kg給藥，且HSA-康巴奈汀融合物以8.8mg/kg給藥。將血漿樣品收集在CPD中且在-80℃下儲存直至分析。
hCD4小鼠PK研究. 7-10天單次IV快速給藥研究在異型接合子hCD4小鼠中執行以評估各種康巴奈汀在目標存在下之PK特性。康巴奈汀劑量及樣品收集方法與上文對於野生型小鼠所述的相同。
食蟹獼猴研究 . 1週單次劑量研究在雌性食蟹獼猴中進行以測定康巴奈汀之PK。在1mg/kg劑量之後，在指定時間下收集血清樣品，等分且快速冷凍以用於MSD或LC/MS分析。
藥物動力學量測 . 使用Mesoscale技術平台或比色ELISA形式量測小鼠或食蟹獼猴血漿中之藥物含量。Fc-康巴奈汀融合物經由特異性結合康巴奈汀之肽組分的蛋白PRD828(BMS)捕獲，且使用山羊抗人類IgG Fc-HRP結合pAb(Pierce編號31413)偵測。HSA-康巴奈汀融合物經由PRD828捕獲，且使用經釕標記之山羊pAb抗HSA(Bethyl,TX編號A80-229A)偵測。樣品濃度使用5參數對數擬合由標準曲線計算。非室分析使用Phoenix WinNonlin 6.3(Pharsight Corporation,Mountain View,CA)使用血漿模型及上升段線性下降段對數(linear up/log down)計算方法進行。
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<400> 359
<210> 360
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿德奈汀
<400> 360
<210> 361
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿德奈汀
<400> 361
<210> 362
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿德奈汀
<400> 362
<210> 363
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿德奈汀
<400> 363
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<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿德奈汀
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<210> 365
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿德奈汀
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<210> 366
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿德奈汀
<400> 366
<210> 367
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿德奈汀
<400> 367
<210> 368
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿德奈汀
<400> 368
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿德奈汀
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿德奈汀
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<210> 371
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿德奈汀
<400> 371
<210> 372
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 372
<210> 373
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 373
<210> 374
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 374
<210> 375
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 375
<210> 376
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 376
<210> 377
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 377
<210> 378
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 378
<210> 379
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 379
<210> 380
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 380
<210> 381
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 381
<210> 382
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 382
<210> 383
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 383
<210> 384
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 384
<210> 385
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 385
<210> 386
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 386
<210> 387
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 387
<210> 388
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 388
<210> 389
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 389
<210> 390
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 390
<210> 391
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 391
<210> 392
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV融合肽抑制劑
<400> 392
<210> 393
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子(GS)7
<400> 393
<210> 394
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子G(GS)6
<400> 394
<210> 395
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子G(GS)7G
<400> 395
<210> 396
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子(GSE)5
<400> 396
<210> 397
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子GGSEGGSE
<400> 397
<210> 398
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子(GS)4
<400> 398
<210> 399
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子(GGGGS)7
<400> 399
<210> 400
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子(GGGGS)5
<400> 400
<210> 401
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子(GGGGS)4
<400> 401
<210> 402
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子(GGGGS)3G
<400> 402
<210> 403
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子(GP)3G
<400> 403
<210> 404
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子(GP)5G
<400> 404
<210> 405
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子(PA)3
<400> 405
<210> 406
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子(PA)6
<400> 406
<210> 407
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子(PA)9
<400> 407
<210> 408
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子ESPEPETPEDE
<400> 408
<210> 409
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子(ESPEPETPED)2E
<400> 409
<210> 410
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 410
<210> 411
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 411
<210> 412
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 412
<210> 413
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 413
<210> 414
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 414
<210> 415
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 415
<210> 416
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 416
<210> 417
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 417
<210> 418
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 418
<210> 419
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 419
<210> 420
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 420
<210> 421
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 421
<210> 422
<211> 151
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 422
<210> 423
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 423
<210> 424
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 424
<210> 425
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 425
<210> 426
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 426
<210> 427
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 427
<210> 428
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗N17阿德奈汀-HIV融合肽抑制劑康巴奈汀
<400> 428

Claims (52)

  1. 一種多肽，其包含三個活性域，其中一個域為抗CD4阿德奈汀(Adnectin)蛋白，第二域為gp41結合部分，且第三域為HIV融合肽抑制劑部分。
  2. 一種多肽，其包含三個活性域，其中一個域為CD4結合部分，第二域為抗N17阿德奈汀蛋白，且第三域為HIV融合肽抑制劑部分。
  3. 一種多肽，其包含三個活性域，其中一個域為CD4結合部分，第二域為gp41結合部分，且第三域為HIV融合肽抑制劑。
  4. 如請求項1至3中任一項之多肽，其中該等三個域利用連接子依任何次序彼此連接。
  5. 如請求項1至3中任一項之多肽，其進一步包含一或多種選自由以下組成之群的藥物動力學(PK)部分：聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、運鐵蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白結合蛋白及血清免疫球蛋白結合蛋白。
  6. 如請求項5之多肽，其中該PK部分為Fc。
  7. 如請求項6之多肽，其中該Fc連接於該多肽之N端。
  8. 如請求項5之多肽，其中該PK部分為人類血清白蛋白。
  9. 如請求項8之多肽，其中該人類血清白蛋白連接於該多肽之N端。
  10. 如請求項1之多肽，其中該抗CD4阿德奈汀蛋白包含與SEQ ID NO：95-114之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  11. 如請求項2之多肽，其中該抗N17阿德奈汀蛋白包含與SEQ ID NO：115-371之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、 99%或100%一致的胺基酸序列。
  12. 如請求項3之多肽，其中該HIV融合肽抑制劑包含與SEQ ID NO：372-392之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  13. 一種多肽，其包含兩個活性域，其中一個域為抗CD4阿德奈汀蛋白，且另一域為gp41結合部分或HIV融合肽抑制劑部分。
  14. 一種多肽，其包含兩個活性域，其中一個域為抗N17阿德奈汀蛋白，且另一域為CD4結合部分或HIV融合肽抑制劑部分。
  15. 一種多肽，其包含兩個活性域，其中一個域為HIV融合肽抑制劑，且另一域為gp41結合部分或CD4結合部分。
  16. 如請求項13至15中任一項之多肽，其中該兩個域利用連接子依任何次序彼此連接。
  17. 如請求項13至15中任一項之多肽，其進一步包含一或多種選自由以下組成之群的藥物動力學(PK)部分：聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、運鐵蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白結合蛋白及血清免疫球蛋白結合蛋白。
  18. 如請求項17之多肽，其中該PK部分為Fc。
  19. 如請求項18之多肽，其中該Fc連接於該多肽之N端。
  20. 如請求項17之多肽，其中該PK部分為人類血清白蛋白。
  21. 如請求項20之多肽，其中該人類血清白蛋白連接於該多肽之N端。
  22. 一種多肽，其包含三個活性域，其中一個域為抗CD4阿德奈汀蛋白，第二域為抗N17阿德奈汀蛋白，且第三域為HIV融合肽抑制劑。
  23. 如請求項22之多肽，其中該三個域利用連接子依任何次序彼此連接。
  24. 如請求項22或23之多肽，其進一步包含一或多種選自由以下組成之群的藥物動力學(PK)部分：聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、運鐵蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白結合蛋白及血清免疫球蛋白結合蛋白。
  25. 如請求項24之多肽，其中該PK部分為Fc。
  26. 如請求項25之多肽，其中該Fc連接於該多肽之N端。
  27. 如請求項24之多肽，其中該PK部分為人類血清白蛋白。
  28. 如請求項27之多肽，其中該人類血清白蛋白連接於該多肽之N端。
  29. 一種多肽，其包含與SEQ ID NO：3、5、7或9之非連接子區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  30. 如請求項29之多肽，其進一步包含一或多種選自由以下組成之群的藥物動力學(PK)部分：聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、運鐵蛋白、人類血清白蛋白、血清白蛋白結合蛋白及血清免疫球蛋白結合蛋白。
  31. 如請求項30之多肽，其中該PK部分為Fc。
  32. 如請求項31之多肽，其中該Fc連接於該多肽之N端。
  33. 如請求項30之多肽，其中該PK部分為人類血清白蛋白。
  34. 如請求項33之多肽，其中該人類血清白蛋白連接於該多肽之N端。
  35. 一種多肽，其包含與SEQ ID NO：4、6、8或10之非連接子區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  36. 一種多肽，其包含SEQ ID NO：3中展示的胺基酸序列。
  37. 一種多肽，其包含SEQ ID NO：4中展示的胺基酸序列。
  38. 一種多肽，其包含SEQ ID NO：5中展示的胺基酸序列。
  39. 一種多肽，其包含SEQ ID NO：6中展示的胺基酸序列。
  40. 一種多肽，其包含SEQ ID NO：7中展示的胺基酸序列。
  41. 一種多肽，其包含SEQ ID NO：8中展示的胺基酸序列。
  42. 一種多肽，其包含SEQ ID NO：9中展示的胺基酸序列。
  43. 一種多肽，其包含SEQ ID NO：10中展示的胺基酸序列。
  44. 一種多肽，其包含兩個活性域，其中一個域為抗N17阿德奈汀蛋白，且第二域為HIV融合抑制劑肽。
  45. 如請求項44之多肽，其中該兩個域利用連接子依任何次序彼此連接。
  46. 如請求項44或45之多肽，其進一步包含一或多種選自由以下組成之群的藥物動力學(PK)部分：聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、運鐵蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白結合蛋白及血清免疫球蛋白結合蛋白。
  47. 如請求項46之多肽，其中該PK部分為Fc。
  48. 如請求項47之多肽，其中該Fc連接於該多肽之N端。
  49. 如請求項46之多肽，其中該PK部分為人類血清白蛋白。
  50. 如請求項49之多肽，其中該人類血清白蛋白連接於該多肽之N端。
  51. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至50中任一項之多肽及載劑。
  52. 一種如請求項1至50中任一項之多肽或如請求項51之組合物的用途，其用於製造供治療HIV用之藥物。
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