TWI508736B

TWI508736B - 結合至ｉｌ－２３之以纖維連接蛋白為主之架構域蛋白質

Info

Publication number: TWI508736B
Application number: TW100105496A
Authority: TW
Inventors: 艾力克司布希; 路其拉達斯古塔; 琳達恩格; 陸梅爾許尼維司
Original assignee: 必治妥美雅史谷比公司
Priority date: 2010-02-18
Filing date: 2011-02-18
Publication date: 2015-11-21
Also published as: TN2012000372A1; US9714281B2; BR112012019881A2; EA201270713A1; CN102762591A; AR080229A1; SG183215A1; PE20130041A1; WO2011103105A1; US8927693B2; HK1179276A1; ZA201206969B; MX2012009050A; EP2536757B1; CA2790329A1; JP2013520426A; US20130012436A1; CL2012002296A1; US20150274806A1; TW201130501A

Description

結合至IL-23之以纖維連接蛋白為主之架構域蛋白質

本發明係關於結合介白素23(IL-23)、具體而言IL-23之p19亞單位之以纖維連接蛋白為主的架構域蛋白質。本發明亦係關於創新蛋白質在治療應用中用於治療自身免疫疾病之用途。本發明進一步係關於包含此等蛋白質、編碼此等蛋白質或其片段之聚核苷酸之細胞，且係關於包含編碼該等創新蛋白質之聚核苷酸的載體。

IL-23係IL-12異源二聚體細胞因子家族之成員。其含有與IL-12共有之p40亞單位及獨特的p19亞單位。IL-23經由IL-12Rβ1及IL-23R組成之異源二聚體受體複合物發送信號(Aggarwal S等人。Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17. J Biol Chem.278:1910-4,2003)。IL-23係用於治療慢性炎症性病症(例如多發性硬化症、類風濕性關節炎、牛皮癬及克隆氏病(Crohn's disease))之潛在靶。

以纖維連接蛋白為主之架構係能發展到結合任一所關注化合物之蛋白質成員。該等蛋白質通常利用衍生自纖維連接蛋白III型(Fn3)或Fn3-樣結構域之架構，以具有天然或改造抗體(亦即，多株、單株或單鏈抗體)之特徵之方式作用，且另外具有結構優勢。具體而言，該等抗體模擬物之結構已經設計而具有最佳摺疊、穩定性及溶解性，甚至在通常導致抗體結構及功能損失之條件下亦如此。以纖維連接蛋白為主之架構蛋白質之實例係阿德奈汀^TM (Adnectin^TM )(Adnexus,Bristol-Myers Squibb R&D公司)。

纖維連接蛋白III型(Fn3)結構域自N-末端至C-末端按順序包含β或β樣鏈A；環AB；β或β樣鏈B；環BC；β或β樣鏈C；環CD；β或β樣鏈D；環DE；β或β樣鏈E；環EF；β或β樣鏈F；環FG；及β或β樣鏈G。環AB、BC、CD、DE、EF及FG中之任一者或全部均可參與靶結合。BC、DE及FG環在結構與功能兩方面皆與免疫球蛋白之互補決定區(CDR)類似。美國專利第7,115,396號闡述Fn3結構域蛋白質，其中改變BC、DE及FG環可獲得高親和力TNFα黏合劑。美國公開案第2007/0148126號闡述Fn3結構域蛋白質，其中改變BC、DE及FG環可獲得高親和力VEGFR2黏合劑。

獲得經改良纖維連接蛋白域架構蛋白質對於治療性治療自身免疫病症將較為有利。產生介白素17(IL-17;「Th17細胞」)之效應T細胞亞群具有高促炎性並誘導嚴重自身免疫。Th17細胞表現不同於Th1及Th2細胞之細胞因子及趨化因子亞群，包括IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)、IL-22、IL-17A及IL-17F以及趨化因子受體CCR6。IL-23藉由活化T細胞來促進IL-17產生(Aggarwal S等人。Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17. J Biol Chem.278:1910-4,2003)且係誘導產生IL-17之CD4+ T細胞擴增的關鍵細胞因子。暴露於IL-23似乎係決定Th17細胞之致病性的關鍵特徵。

本申請案提供針對人類IL-23特異性p19亞單位之阿德奈汀。本發明之一個態樣提供包含Fn3結構域之多肽，其中一或多個溶劑可及環已經隨機化或突變處理。在一些實施例中，Fn3結構域係衍生自人類纖維連接蛋白III型結構域之野生型第10模塊(¹⁰ Fn3)的Fn3結構域。在一些實施例中，本發明之¹⁰ Fn3多肽與人類¹⁰ Fn3結構域至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%一致。

在一些實施例中，一或多個選自BC、DE及FG之環之長度可相對於相應人類纖維連接蛋白環延長或縮短。

在一些實施例中，本發明多肽包含纖維連接蛋白III型第10(¹⁰ Fn3)結構域，其中該¹⁰ Fn3結構域包含環AB；環BC；環CD；環DE；環EF；及環FG；且具有至少一個選自環BC、DE及FG之環且該環之胺基酸序列相對於人類¹⁰ Fn3結構域中相應環之序列經改變。

在一些實施例中，本發明多肽包含Fn3結構域，其包含與非環區至少80%、85%，90%、95%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明蛋白質之BC環包含選自由SEQ ID NO: 2-6組成之群的胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明蛋白質之DE環包含選自由SEQ ID NO: 7-48組成之群的胺基酸序列。

在一些實施例中，本發明蛋白質之FG環包含選自由SEQ ID NO: 49-59組成之群的胺基酸序列。

在一些實施例中，¹⁰ Fn3結構域可以胺基酸取代、插入或缺失開始及/或結束。

在一些實施例中，本發明蛋白質包含一個展示於SEQ ID NO: 2-6中之BC環序列中之環序列、一個展示於SEQ ID NO: 7-48中之DE環序列及一個展示於SEQ ID NO: 49-59中之FG環序列。

在一些實施例中，本發明蛋白質包含與SEQ ID NO: 2-59中任一者之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的BC、DE及FG環胺基酸序列。

在一些實施例中，抗IL-23阿德奈汀包含SEQ ID NO: 60-100中任一者之胺基酸序列。

在一些實施例中，抗IL-23阿德奈汀包含SEQ ID NO: 60-100中任一者之3至96位之Fn3結構域胺基酸序列。

在一些實施例中，抗IL-23阿德奈汀包含與SEQ ID NO: 60-100中任一者之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列。

在一個態樣中，抗IL-23阿德奈汀進一步包含藥物代謝動力學(PK)部分。在一些實施例中，PK部分包含聚乙二醇(PEG)。

在一個態樣中，本申請案提供可用於治療自身免疫疾病之抗IL-23阿德奈汀。

在一個態樣中，本發明提供包含纖維連接蛋白III型第10(¹⁰ Fn3)結構域及抗IL-23阿德奈汀之融合多肽，其中該¹⁰ Fn3結構域以1 μM或更低之Kd結合至HSA。在某些實施例中，¹⁰ Fn3結構域包含與SEQ ID NO: 103至少70%一致之胺基酸序列。在一個實施例中，¹⁰ Fn3結構域包含具有SEQ ID NO: 104中所述胺基酸序列之BC環、具有SEQ ID NO: 105中所述胺基酸序列之DE環及具有SEQ ID NO: 106中所述胺基酸序列之FG環。在另一實施例中，¹⁰ Fn3結構域包含以下中之一或多者：具有SEQ ID NO: 104中所述胺基酸序列之BC環、具有SEQ ID NO: 105中所述胺基酸序列之DE環及具有SEQ ID NO: 106中所述胺基酸序列之FG環。

在一個實施例中，融合多肽之¹⁰ Fn3結構域亦結合至以下中之一或多者：恒河猴血清白蛋白(RhSA)、食蟹猴血清白蛋白(CySA)或鼠類血清白蛋白(MuSA)。在其他實施例中，¹⁰ Fn3結構域不與RhSA、CySA或MuSA中之一或多者交叉反應。

在某些實施例中，融合多肽之¹⁰ Fn3結構域以1 μM或更低之Kd結合至HSA。在一些實施例中，¹⁰ Fn3結構域以500 nM或更低之Kd結合至HSA。在其他實施例中，¹⁰ Fn3結構域以至少200 nM、100 nM、50 nM、20 nM、10 nM或5 nM之Kd結合至HSA。

在其他實施例中，融合多肽之¹⁰ Fn3結構域結合至HSA之結構域I或II。在一個實施例中，¹⁰ Fn3結構域結合至HSA之結構域I與II二者。在一些實施例中，¹⁰ Fn3結構域在5.5至7.4之pH範圍下結合至HSA。在其他實施例中，¹⁰ Fn3結構域在pH 5.5下以200 nM或更低之Kd結合至HSA。在另一實施例中，¹⁰ Fn3結構域在5.5至7.4之pH範圍下以至少500 nM、200 nM、100 nM、50 nM、20 nM、10 nM或5 nM之Kd結合至HSA。在一個實施例中，¹⁰ Fn3結構域在pH 5.5下以至少500 nM、200 nM、100 nM、50 nM、20 nM、10 nM或5 nM之Kd結合至HSA。

在一些實施例中，在血清白蛋白存在下融合多肽之血清半衰期為在血清白蛋白不存在下多肽之血清半衰期的至少5倍。在某些實施例中，在血清白蛋白存在下融合多肽之血清半衰期為在血清白蛋白不存在下多肽之血清半衰期的至少2倍、5倍、7倍、10倍、12倍、15倍、20倍、22倍、25倍、27倍或30倍。在一些實施例中，血清白蛋白係HSA、RhSA、CySA或MuSA中之任一者。

在某些實施例中，在血清白蛋白存在下融合多肽之血清半衰期係至少20小時。在某些實施例中，在血清白蛋白存在下融合多肽之血清半衰期係至少10小時、12小時、15小時、20小時、25小時、30小時、40小時、50小時、75小時、90小時、100小時、110小時、120小時、130小時、150小時、170小時或200小時。在一些實施例中，觀察靈長類動物(例如，人類或猴)或鼠類之融合多肽之半衰期。

在任一上述態樣及實施例中，¹⁰ Fn3結構域包含選自SEQ ID NO: 107、111、115、119及123-143之序列。

定義：

「多肽」意指無論長度、轉錄後修飾或功能，具有兩個或更多個胺基酸之任一序列。在本文中，「多肽」、「肽」與「蛋白質」可互換使用。多肽可包括天然胺基酸及非天然胺基酸，例如彼等闡述於美國專利第6,559,126號中者，該專利以引用方式併入本文中。多肽亦可以多種標準化學方式中之任一者來修飾(例如，胺基酸可經保護基團修飾；羧基末端胺基酸可成為末端醯胺基；胺基末端殘基可經基團修飾以(例如)增強親油性；或多肽可經化學糖基化或以其他方式修飾以增加穩定性或活體內半衰期)。多肽修飾可包括另一結構(例如環狀化合物或其他分子)與多肽之連接且亦可包括含有一或多個呈經改變構型(即，R或S；或L或D)之胺基酸的多肽。本發明肽係衍生自纖維連接蛋白之第10III型結構域之蛋白質，其已經修飾以特異性結合IL-23之p19亞單位且在本文中稱為「阿德奈汀」或「抗IL-23阿德奈汀」。

術語「PK」係「藥物代謝動力學」之縮寫且涵蓋化合物之性質，包括(例如)藉由個體之吸收、分佈、代謝及消除。「PK調節蛋白質」或「PK部分」係指當與生物活性分子融合或一起投與時，影響生物活性分子之藥物代謝動力學性質之任一蛋白質、肽或部分。PK調節蛋白質或PK部分之實例包括PEG、人類血清白蛋白(HSA)黏合劑(如美國公開案第20050287153號及第20070003549號中所揭示)、人類血清白蛋白、Fc或Fc片段及糖(例如，唾液酸)。

本文中之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為：在比對各序列及(若需要)引入缺口以達成最大序列一致性百分比後，候選序列中與所選序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基之百分率，且不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分。出於測定胺基酸序列一致性百分比目的之比對可以熟習此項技術者所習知之多種方式來達成，例如，使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。彼等熟習此項技術者可確定用於量測比對之合適參數，包括在所比較序列全長範圍內達到最大比對所需要之任何演算法。

「經分離」多肽係已經過鑒定並自其天然環境組份中分離及/或回收之多肽。其天然環境之污染組份係會干擾抗體之診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質性溶質或非蛋白質性溶質。在較佳實施例中，可將多肽純化至(1)如藉由Lowry方法測定，含有95重量%以上之多肽，且最佳含有99重量%以上之多肽，(2)可藉由使用旋杯式序列分析儀至少獲得N末端殘基或內部胺基酸序列之程度，或(3)如藉由SDS-PAGE在還原或非還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或(較佳)銀染色所量測已達到同質性。由於多肽天然環境之至少一種組份可能不存在，因此所分離多肽包括重組細胞內之原位多肽。然而，經分離多肽通常可藉由至少一個純化步驟來製備。

胺基酸序列或化合物之「半衰期」通常可定義為在活體內由於(例如)天然機制所致序列或化合物之降解及/或序列或化合物之清除或螯合而使多肽血清濃度降低50%時所耗時間。半衰期可依本身已知之任一方式(例如藉由藥物代謝動力學分析)來確定。適宜技術應為熟習此項技術者所明瞭，且通常可涉及(例如)以下步驟：向靈長類動物適宜地投與適宜劑量的本發明之胺基酸序列或化合物；以規律間隔收集來自該靈長類動物之血樣或其他試樣；測定本發明之胺基酸序列或化合物在該血樣中之量或濃度；及自由此獲得之數據(曲線)計算相對於本發明之胺基酸序列或化合物時之初始投藥量，直至其量或濃度降低50%所需之時間。可參照(例如)標準手冊，例如Kenneth,A等人：Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters等人，Pharmacokinete analysis: A Practical Approach(1996)。亦可參照「Pharmacokinetics」,M Gibaldi及D Perron，由Marcel Dekker出版，第2修訂版(1982)。

半衰期可使用諸如t1/2-α、t1/2-β及曲線下面積(AUC)等參數來表示。在本說明書中，「半衰期之增加」係指該等參數中之任一個、該等參數中之任兩個或所有三個該等參數之增加。「半衰期之增加」尤其係指t1/2-β之增加，且有或無t1/2-α及/或AUC或二者之增加。

概述

本申請案提供針對人類IL-23特異性p19亞單位之阿德奈汀。為了鑑別IL-23特異性拮抗劑，使用抗p40 mAb將IL-23呈遞至大型阿德奈汀合成文庫。對結合至IL-23 p19亞單位之阿德奈汀篩選與人類IL-23之結合，對IL-23/IL-23R相互作用之競爭及對IL-23誘導之T細胞系中之信號傳導之抑制。藉由降低靶濃度並選擇具有緩慢解離速率之抗IL-23阿德奈汀使抗IL-23阿德奈汀經受於進一步選擇壓力。根據此優化過程，將阿德奈汀家族確定為具有有利的生物化學及生物物理學性質之IL-23特異性抑制劑。

以纖維連接蛋白為主之架構

本申請案之一個態樣提供包含Fn3結構域之多肽，其中一或多個溶劑可及環已經隨機化或突變處理。在一些實施例中，Fn3結構域係衍生自人類纖維連接蛋白III型結構域(¹⁰ Fn3)之野生型第10模塊的Fn3結構域：VSDVPRDLEVV AATPTSLLISWDAPAVTVR YYRITYGETGGNSPVQEFTVPG SKST ATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKP ISINYRT (SEQ ID NO: 1)。在以上¹⁰ Fn3序列中，對BC、DE及FG環加下劃線。

已報導多種突變型¹⁰ Fn3架構。在一個態樣中，Asp 7、Glu 9及Asp 23中之一或多者由另一胺基酸(例如不帶負電荷之胺基酸殘基(例如，Asn、Lys等))替代。已報導與野生型形式相比，該等突變在中性pH下具有促進突變¹⁰ Fn3之更大穩定性之效應(參見，PCT公開案第WO 02/04523號)。已揭示¹⁰ Fn3架構中有益或無作用之多種額外改變。例如，參見Batori等人，Protein Eng. 2002年12月；15(12): 1015-20；Koide等人，Biochemistry 2001年8月28日；40(34):10326-33。

¹⁰ Fn3蛋白質之變體與野生型二者之特徵在於相同結構，即7個命名為A至G之β鏈結構域序列及6個連結該7個β鏈結構域序列之環區(AB環、BC環、CD環、DE環、EF環及FG環)。位於最靠近N-及C末端處之β鏈可採用呈溶液之β樣構象。在SEQ ID NO: 1中，AB環對應於殘基15-16，BC環對應於殘基21-30，CD環對應於殘基39-45，DE環對應於殘基51-56，EF環對應於殘基60-66，且FG環對應於殘基76-87(Xu等人，Chemistry & Biology 2002 9:933-942)。

在一些實施例中，¹⁰ Fn3多肽可與展示於SEQ ID NO: 1中之人類¹⁰ Fn3結構域至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%一致。在一或多個該等環中通常可出現許多變化。¹⁰ Fn3多肽之每一β或β樣鏈均可基本上由與SEQ ID NO: 1之相應β或β樣鏈之序列至少80%、85%、90%、95%或100%一致的胺基酸序列組成，前提為此變化不會破壞多肽在生理條件中之穩定性。

在一些實施例中，本揭示內容提供包含纖維連接蛋白III型第10(¹⁰ Fn3)結構域之多肽，其中該¹⁰ Fn3結構域包含環AB；環BC；環CD；環DE；環EF；及環FG；且具有至少一個選自環BC、DE及FG之環且該環之胺基酸序列相對於人類¹⁰ Fn3結構域中相應環之序列經改變。在一些實施例中，改變BC及FG環，在一些實施例中，改變BC、DE及FG環，即，Fn3結構域包含非天然存在之環。「經改變」意指胺基酸序列中一或多處相對於模板序列(相應人類纖維連接蛋白結構域)之變化且包括胺基酸加成、缺失及取代。改變胺基酸序列通常可經由核酸編碼序列之有意、盲目或自發序列變化來達成，且可藉由任一技術(例如PCR、易錯PCR或化學DNA合成)來進行。

在一些實施例中，一或多個選自BC、DE及FG之環之長度可相對於相應人類纖維連接蛋白環延長或縮短。在一些實施例中，該環之長度可延長2至25個胺基酸。在一些實施例中，該環之長度可減少1至11個胺基酸。因此，為了優化抗原結合，可在¹⁰ Fn3環之長度上改變長度及序列，以獲得最大可能的抗原結合靈活性及親和力。

在一些實施例中，多肽包含Fn3結構域，其包含與SEQ ID NO: 1之非環區至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，其中至少一個選自BC、DE及FG之環經改變。在一些實施例中，經改變BC環具有最多10個胺基酸取代、最多4個胺基酸缺失、最多10個胺基酸插入或其組合。在一些實施例中，經改變DE環具有最多6個胺基酸取代、最多4個胺基酸缺失、最多13個胺基酸插入或其組合。在一些實施例中，FG環具有最多12個胺基酸取代、最多11個胺基酸缺失、最多25個胺基酸插入或其組合。

在一些實施例中，本發明蛋白質之BC環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：GHYPMHV(SEQ ID NO: 2)、GHYPLHV(SEQ ID NO: 3)、GHYPMHI(SEQ ID NO: 4)、GHYPLHI(SEQ ID NO: 5)及GHYPLHL(SEQ ID NO: 6)。

在一些實施例中，本發明蛋白質之DE環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：HRTH(SEQ ID NO: 7)、YYHY(SEQ ID NO: 8)、SKQH(SEQ ID NO: 9)、SNVH(SEQ ID NO: 10)、NRAH(SEQ ID NO: 11)、RKTY(SEQ ID NO: 12)、RSRY(SEQ ID NO: 13)、SRYY(SEQ ID NO: 14)、PHRY(SEQ ID NO: 15)、RSTH(SEQ ID NO: 16)、SRIY(SEQ ID NO: 17)、HQRY(SEQ ID NO: 18)、KQVY(SEQ ID NO: 19)、AHRY(SEQ ID NO: 20)、RSRH(SEQ ID NO: 21)、ARQY(SEQ ID NO: 22)、RTQY(SEQ ID NO: 23)、PRYH(SEQ ID NO: 24)、MRQH(SEQ ID NO: 25)、SRKY(SEQ ID NO: 26)、RQKY(SEQ ID NO: 27)、HAKY(SEQ ID NO: 28)、SNRY(SEQ ID NO: 29)、NTSH(SEQ ID NO: 30)、SQVY(SEQ ID NO: 31)、NRVY(SEQ ID NO: 32)、PRSH(SEQ ID NO: 33)、RTKY(SEQ ID NO: 34)、SRYH(SEQ ID NO: 35)、PRRY(SEQ ID NO: 36)、RQKY(SEQ ID NO: 37)、RYKY(SEQ ID NO: 38)、VPRH(SEQ ID NO: 39)、TPKH(SEQ ID NO: 40)、RSKY(SEQ ID NO: 41)、SRKY(SEQ ID NO: 42)、VPRY(SEQ ID NO: 43)、PRRY(SEQ ID NO: 44)、RMRH(SEQ ID NO: 45)、PPRH(SEQ ID NO: 46)、RQIY(SEQ ID NO: 47)及MRQH(SEQ ID NO: 48)。

在一些實施例中，本發明蛋白質之FG環包含選自由以下組成之群的胺基酸序列:YYNEADYSQI(SEQ ID NO: 49)、YYQEYEYRYI(SEQ ID NO: 50)、YYMEEKYAVI(SEQ ID NO: 51)、YYAQENYKEI(SEQ ID NO: 52)、YYKEANYREI(SEQ ID NO: 53)、YYAQEEYHII(SEQ ID NO: 54)、YYKEADYSQI(SEQ ID NO: 55)、YYEQVEYREI(SEQ ID NO: 56)、YYEQPIYATI(SEQ ID NO: 57)、YYEQVEYREI(SEQ ID NO: 58)及YYSEELYKYI(SEQ ID NO: 59)。

¹⁰ Fn3結構域可以胺基酸變化開始。舉例而言，一額外MG序列可位於Fn3結構域之N末端處。通常M將裂解，在N末端處留下G。在一些實施例中，序列可位於¹⁰ Fn3結構域之C末端處。舉例而言，在定點聚乙二醇化中，其中將諸如GSGC(SEQ ID NO: 101)等含有半胱胺酸之連接體添加至C末端。或者，天然存在之C末端尾之聚乙二醇化，已藉由將Ser改變為Cys使其突變以獲得含有半胱胺酸之連接體EIDKPC Q(SEQ ID NO: 102)。本發明包含GSGC連接體之抗IL-23阿德奈汀的實例包括AT1001014、ATI001015、ATI001016、ATI001044、ATI001045及ATI001047。ATI000934係本發明包含EIDKPCQ連接體之抗IL-23阿德奈汀的一實例。

在一些實施例中，本發明蛋白質包含一個來自展示於SEQ ID NO: 2-6中之BC環序列的環序列、一個展示於SEQ ID NO: 7-48中之DE環序列及一個展示於SEQ ID NO: 49-59中之FG環序列。在一些實施例中，本發明蛋白質包含與SEQ ID NO: 2-59中任一者之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的BC、DE及FG環胺基酸序列。

此外，熟習此項技術者將認識到，展示於SEQ ID NO: 2-6中之BC環序列共享共有序列基序GHYPX₁ HX₂ (SEQ ID NO: 257)，其中X₁ 係M或L，且X₂ 係I或V，且展示於SEQ ID NO: 49-59中之FG環序列共享共有序列基序YYX₃ X₃ X₃ X₃ YX₃ X₃ I(SEQ ID NO: 258)，其中X₃ 可係任一胺基酸。因此，將可能生成結合IL-23之其他阿德奈汀，其利用適合共有序列GHYPX₁ HX₂ 之BC環及/或利用除彼等明確列示於SEQ ID NO: 49-59中者以外之其他FG環(其適合模式YYX₃ X₃ X₃ X₃ YX₃ X₃ I)。

在一些實施例中，抗IL-23阿德奈汀包含SEQ ID NO: 60-100中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗IL-23阿德奈汀包含SEQ ID NO: 60-100中任一者之3至96位的Fn3結構域胺基酸序列。在一些實施例中，抗IL-23阿德奈汀包含與SEQ ID NO: 60-100中之任一者至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗IL-23阿德奈汀包含與SEQ ID NO: 60-100中任一者之3至96位的胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗IL-23阿德奈汀可經聚乙二醇化且/或含有his-標籤。本文所用ATI000934係指環序列與構建體1571G06(Seq ID 87)之環序列一致之蛋白質，且該蛋白質在C末端處含有殘基EIDKPC Q，其中該蛋白質經聚乙二醇化且含有his-標籤。ATI001014係指環序列與構建體1571G04(Seq ID 86)之環序列一致之蛋白質，且該蛋白質在C末端處含有GSGC連接體，其中該蛋白質經聚乙二醇化且含有his-標籤。ATI001015係指環序列與構建體1572G06(Seq ID 91)之環序列一致之蛋白質，且該蛋白質在C末端處含有GSGC連接體，其中該蛋白質經聚乙二醇化且含有his-標籤。ATI001016係指環序列與構建體1490B03(Seq ID 79)之環序列一致之蛋白質，且該蛋白質在C末端處含有GSGC連接體，其中該蛋白質經聚乙二醇化且含有his-標籤。ATI001044係指環序列與構建體1490B03(Seq ID 79)之環序列一致之蛋白質，且該蛋白質在C末端處含有GSGC連接體，但該蛋白質未經聚乙二醇化且不含有his標籤。ATI001045係指環序列與構建體1490B03(Seq ID 79)之環序列一致之蛋白質，且該蛋白質在C末端處含有GSGC連接體，其中該蛋白質經聚乙二醇化且不含有his標籤。ATI001047係指環序列與構建體1571G04(Seq ID 86)之環序列一致之蛋白質，且該蛋白質在C末端處含有GSGC連接體，其中該蛋白質經聚乙二醇化且不含有his標籤。

纖維連接蛋白經由其整合素結合基序「精胺酸-甘胺酸~天冬胺酸」(RGD)天然地結合某些類型之整合素。在一些實施例中，多肽包含缺乏(RGD)整合素結合基序之¹⁰ Fn3結構域。

藥物代謝動力學部分

在一個態樣中，本申請案提供進一步包含藥物代謝動力學(PK)部分之抗IL-23阿德奈汀。經改良藥物代謝動力學可根據感知性治療需要來評估。通常期望可藉由增加蛋白質在給予後在血清中保持可用之時間來增加生物利用度及/或延長劑量間隔時間。在一些情況下，期望提高蛋白質血清濃度隨時間之連續性(例如，減小蛋白質血清濃度在投與後不久與投與前不久之差異)。抗IL-23阿德奈汀可連接至相對於未經修飾阿德奈汀將該多肽在哺乳動物(例如，小鼠、大鼠或人類)中之清除率降低3倍以上之部分。經改良藥物代謝動力學之其他量測可包括血清半衰期，其通常分為α階段及β階段。此兩個階段中之一或二者可藉由添加合適部分來顯著改良。

傾向於延緩蛋白質自血液清除之部分(本文中稱為「PK部分」)包括聚氧化烯烴部分(例如，聚乙二醇、糖(例如，唾液酸))及良好耐受之蛋白質部分(例如，Fc、Fc片段、轉鐵蛋白或血清白蛋白)。阿德奈汀可融合至白蛋白或白蛋白之片段(部分)或變體，如美國公開案第20070048282號中所述。

在一些實施例中，PK部分係血清白蛋白結合蛋白，例如彼等闡述於美國公開案第2007/0178082號及第2007/0269422號中者。

在一些實施例中，PK部分係血清免疫球蛋白結合蛋白，例如彼等闡述於美國公開案第2007/0178082號中者。

在一些實施例中，阿德奈汀包含聚乙二醇(PEG)。一或多個PEG分子可連接於蛋白質上之不同位置，且此連接可藉由與胺、硫醇或其他適宜反應基團反應來達成。胺部分可係(例如)在多肽N末端或存在於諸如離胺酸或精胺酸等胺基酸中之胺基團處發現的一級胺。在一些實施例中，PEG部分連接於多肽上之位置，該位置選自由以下組成之群：a)N末端；b)介於N末端與最N末端β鏈或β樣鏈之間；c)位於多肽上與靶結合位點對置之面上之環；d)介於C末端與最C末端β鏈或β樣鏈之間；及e)在C末端處。

聚乙二醇化可藉由定點聚乙二醇化來達成，其中將適宜反應基團引入蛋白質中以產生聚乙二醇化優先發生之位點。在一些實施例中，對蛋白質進行修飾以在期望位置處引入半胱胺酸殘基，從而允許對半胱胺酸進行定點聚乙二醇化。PEG之分子量可大幅度變化且可具支鏈或為直鏈。

在一些實施例中，阿德奈汀包含Fn3結構域及PK部分。在一些實施例中，Fn3結構域係¹⁰ Fn3結構域。在一些實施例中，相對於僅Fn3結構域，PK部分使多肽之血清半衰期延長5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%、400%、600%、800%、1000%或更多。

在一些實施例中，PK部分係聚合糖。在一些實施例中，PK部分係聚乙二醇部分。在一些實施例中，PK部分係血清白蛋白結合蛋白。在一些實施例中，PK部分係人類血清白蛋白。在一些實施例中，PK部分係血清免疫球蛋白結合蛋白。在一些實施例中，PK部分係轉鐵蛋白。在一些實施例中，PK部分係對血清蛋白質具有特異性之另一阿德奈汀。

生物物理學及生物化學表徵

本申請案提供包含結合至IL-23之p19亞單位之Fn3結構域的阿德奈汀。如表1及實例4中所展示，可在平衡常數(例如，解離常數，K_D )方面及在動力學常數(例如，結合速率常數K_on 及解離速率常數k_off )方面對多肽與靶分子之結合進行評估。阿德奈汀通常將以小於500 nM、100 nM、10 nM、1 nM、500 pM、200 pM、100 pM之K_D 結合至靶分子，但可耐受更高K_D 值，其中K_off 足夠低或K_on 足夠高。

本發明之抗IL-23阿德奈汀家族之BC、DE及FG環序列以及相應全長SEQ ID NO呈現於下表1中。

*親和力測定方法：根據廠商說明書將抗His抗體mAb050(RnD Systems,MN)在乙酸鹽5.0中稀釋至20 μg/mL並在CM5晶片表面(GE Healthcare,Piscataway,NJ)之流動池1及2上固定至約9000 RU。在25℃下在HBS-EP(10 mM Hepes，150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.05%表面活性劑P20)中實施所有表面電漿實驗。經2分鐘將IL-23注射至抗His mAb捕獲之阿德奈汀上，隨後為10分鐘之解離階段。使用Biacore T100評價軟體完成結合特異性之評價。其他詳細方法闡述於實例4中。

其他抗IL-23阿德奈汀表徵闡述於表2中。

(n.d.：未測定)(詳細方法闡述於實例4中)。

核酸-蛋白質融合技術

在一個態樣中，本申請案提供包含結合IL-23之p19亞單位之纖維連接蛋白III型結構域的阿德奈汀。一種快速製作並測試具有特異性結合性質之Fn3結構域的方法係Adnexus,Bristol-Myers Squibb R&D公司之核酸-蛋白質融合技術。本發明利用稱為PROfusion^TM 之活體外表現及標籤技術，其採用核酸-蛋白質融合(RNA-及DNA-蛋白質融合)來鑑別對於與蛋白質結合較為重要的新穎多肽及胺基酸基序。核酸-蛋白質融合技術係使蛋白質共價偶合至其編碼遺傳資訊的技術。關於RNA-蛋白質融合技術及以纖維連接蛋白為主之架構蛋白質文庫篩選方法之詳細說明，參見Szostak等人，美國專利第6,258,558號、第6,261,804號、第6,214,553號、第6,281,344號、第6,207,446號、第6,518,018號、第6,818,418號及Roberts及Szostak，Proe Natl,Acad. Sci. 94:12297-12302,1997，其以引用方式併入本文中。

載體及聚核苷酸實施例

可化學合成編碼任一本文所揭示各種蛋白質或多肽之核酸。可選擇密碼子使用以改良在細胞中之表現。此等密碼子使用將取決於所選細胞類型。已針對大腸桿菌(E. coli)及其他細菌、以及哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞及昆蟲細胞研發專門的密碼子使用模式。例如，參見Mayfield等人，Proe Natl Acad Sci U S A. 2003年1月21日；100(2):438-42;Sinclair等人Protein Expr Purif. 2002年10月；26(1):96-105；Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001年10月；12(5):446-9；Makrides等人。Microbiol Rev. 1996年9月；60(3):512-38；及Sharp等人。Yeast. 1991年10月；7(7):657-78。

核酸操縱之一般技術闡述於(例如)以下文獻中：Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第1至3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1989，或F. Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing and Wiley-Interscience: New York,1987)及週期性更新，其以引用方式併入本文中。通常，編碼多肽之DNA可操作地連接至衍生自哺乳動物、病毒或昆蟲基因之適宜轉錄或轉譯調節元件。此等調節元件包括轉錄啟動子、控制轉錄之可選操縱子序列、編碼適宜mRNA核糖體結合位點之序列及控制轉錄及轉譯終止之序列。另外納入在宿主中複製之能力以幫助識別轉化體，該能力一般藉由複製起點及選擇基因賦予。

本文所述蛋白質不僅可以重組方式直接產生，且亦可作為與異源多肽之融合多肽以重組方式來產生，該異源多肽較佳為信號序列或在成熟蛋白質或多肽之N末端具有特異性解離位點之其他多肽。所選異源性信號序列較佳係由宿主細胞識別及處理(即藉由信號肽酶解離)者。

對於不能識別及處理天然信號序列之原核宿主細胞而言，可用選自(例如)鹼性磷酸酶、青黴素酶、1pp、或熱穩定腸毒素II前導序列之群之原核信號序列取代該信號序列。

對於酵母分泌而言，天然信號序列可經以下來取代：例如酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列(包括酵母菌屬(Saccharomyces)及克魯維酵母屬(Kluyveromyces)之α-因子前導序列)、或酸性磷酸酶前導序列、白色念珠菌(C.albicans)葡萄糖澱粉酶前導序列、或美國專利5,631,144中所述信號。在哺乳動物細胞表現中，可使用哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導序列，例如單純疱疹gD信號。在閱讀框中此前體區之DNA與編碼蛋白質之DNA連接。

表現及選殖載體二者皆含有使載體能在一或多個所選宿主細胞內複製之核酸序列。一般而言，在選殖載體中此序列係使載體能獨立於宿主染色體DNA複製者，且其包括複製起點或自主複製序列。對於各種細菌、酵母、及病毒而言，該等序列係眾所周知。來自質粒pBR322之複製起點適用於大多數革蘭氏(Gram)陰性細菌，2微米質粒起點適用於酵母，且各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用於哺乳動物細胞中之選殖載體。一般而言，哺乳動物表現載體不需要複製起點組份(通常可使用SV40起點，僅係由於其含有早期啟動子)。

表現及選殖載體可含有選擇基因，其亦稱為可選標記物。典型選擇基因編碼具有以下性質之蛋白質：(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如，胺苄西林(ampicillin)、新黴素、胺甲喋呤或四環素)之抗性，(b)補足營養缺陷型不足，或(c)供給無法自複合培養基中獲得之關鍵營養素，例如編碼桿菌(Bacilli)之D-丙胺酸消旋酶之基因。

表現及選殖載體通常含有可由宿主有機體識別且與編碼本發明蛋白質(例如，以纖維連接蛋白為主之架構蛋白質)之核酸可操作地連接之啟動子。適合與原核宿主一起使用之啟動子包括phoA啟動子、β-內醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色胺酸(trp)啟動子系統、及雜合啟動子(例如tan啟動子)。然而，其他已知細菌啟動子亦適合。用於細菌系統之啟動子亦可含有與編碼本發明蛋白質之DNA可操作地連接之Shine-Dalgarno(S.D.)序列。對於真核生物而言，啟動子序列亦係已知的。事實上，所有真核基因皆具有AT-富集區，其位於轉錄起始位點上游約25到30個鹼基處。在許多基因之轉錄開始點上游70至80個鹼基處發現的另一序列係CNCAAT區，其中N可為任一核苷酸。在大多數真核基因之3'端處為AATAAA序列，其可能係向編碼序列3'端添加聚A尾之信號。所有該等序列皆以適當方式插入真核生物表現載體中。

與酵母宿主一起使用之適宜啟動序列之實例包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酶(例如，烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸酯變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶、及葡糖激酶)之啟動子。

在哺乳動物宿主細胞中自載體轉錄係受(例如)以下啟動子控制：自病毒(例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、鳥類肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、肝炎-B病毒及最佳猿猴病毒(Simian Virus)40(SV40))基因組獲得之啟動子、自異源哺乳動物啟動子(例如，肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)獲得之啟動子、自熱激啟動子獲得之啟動子，條件為此等啟動子皆與宿主細胞系統相容。

藉由高等真核生物編碼本發明蛋白質之DNA之轉錄通常可藉由將增強子序列插入載體中來增強。當前已知許多增強子序列係來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-甲胎蛋白及胰島素)。然而，通常可使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括位於複製起點遲側上之SV40增強子(bp 100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、位於複製起點遲側上之多瘤病毒增強子及腺病毒增強子。關於激活真核啟動子之增強元件亦可參見Yaniv，Nature 297：17-18(1982)。增強子可在肽編碼序列之5'或3'位置剪接至載體中，但較佳係位於啟動子之5'位點。

用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類細胞或來自其他多細胞有機體之有核細胞)中之表現載體亦可含有終止轉錄及穩定mRNA所需之序列。此等序列通常可自真核生物或病毒DNA或cDNA之5'及(偶而)3'未轉譯區獲得。該等區域含有在編碼本發明蛋白質之mRNA的未轉譯部分中轉錄為多腺苷酸化片段之核苷酸區段。一有用轉錄終止組份係牛生長激素多腺苷酸化區。參見WO 94/11026及本文所揭示之表現載體。

重組DNA亦可包括可用於純化蛋白質之任一類型之蛋白質標籤序列。蛋白質標籤之實例包括但不限於組胺酸標籤、FLAG標籤、myc標籤、HA標籤或GST標籤。與細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主一起使用之合適選殖及表現載體可參見Cloning Vectors: A Laboratory Manual,(Elsevier,New York,1985)，其相關揭示內容以引用方式納入本文中。

使用適於宿主細胞之方法將表現構建體引入宿主細胞中，如熟習此項技術者所明瞭。用於將核酸引入至宿主細胞中之多種方法為業內已知，其包括但不限於電穿孔；採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質之轉染；微粒轟擊；脂轉染；及感染(其中載體係感染劑)。

適宜宿主細胞包括原核生物、酵母、哺乳動物細胞或細菌細胞。適宜細菌包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體，例如大腸桿菌或芽孢桿菌屬(Bacillus spp)。較佳地，亦可使用來自酵母菌屬之酵母(例如釀酒酵母(S. cerevisiae)來產生多肽。亦可採用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統來表現重組蛋白質。用於在昆蟲細胞中產生異源蛋白質之杆狀病毒系統係由Luckow及Summers綜述(Bio/Technology,6:47,1988)。適宜哺乳動物宿主細胞系之實例包括內皮細胞、CO8-7猴腎細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、人類胚胎腎細胞、HeLa、293、293T及BHK細胞系。藉由培養適宜宿主/載體系統以表現重組蛋白質來製備經純化多肽。對於許多應用而言，本文所揭示之許多多肽之小尺寸將使在大腸桿菌中之表現成為較佳表現方法。隨後自培養基或細胞提取物純化蛋白質。

蛋白質產生

宿主細胞係經本文所述用於蛋白質產生之表現或選殖載體轉化，且在經修改適於誘導啟動子、選擇轉化體、或擴增編碼期望序列之基因之習用營養培養基中進行培養。在此處所展示之實例中，用於高通量蛋白質產生(HTPP)及中等規模產生之宿主細胞係BL21 DE3 plysS-細菌菌株。用於產生本發明蛋白質之宿主細胞可在多種培養基中進行培養，例如彼等闡述於以下文獻中者：Ham等人，Meth. Enz. 58:44(1979)；Barites等人，Anal. Bioehem. 102:255(1980)；美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655號、第5,122,469號、第6,048,728號、第5,672,502號或美國專利第Re.30,985號。亦可以熟習此項技術者已知之合適濃度納入任何其他所需補加物。諸如溫度、pH及諸如此類等培養條件係先前用於所選表現用宿主細胞之條件，且對熟習此項技術者係顯而易見的。

本文所揭示蛋白質亦可使用細胞轉譯系統產生。出於此等目的，必須對編碼多肽之核酸進行修飾以允許進行活體外轉錄以產生mRNA並允許mRNA在所用無特定細胞之系統(無真核生物(例如哺乳動物或酵母)細胞之轉譯系統或無原核生物(例如細菌細胞)之轉譯系統)中進行無細胞轉譯。

本發明蛋白質亦可藉由化學合成(例如，藉由闡述於Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，1984,The Pierce Chemical公司，Rockford,IL中之方法)產生。蛋白質之修飾亦可藉由化學合成產生。

本發明蛋白質可藉由蛋白質化學領域中通常已知的用於蛋白質之分離/純化方法來純化。非限制性實例包括萃取、再結晶、鹽析(例如，利用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超濾、吸附層析、離子交換層析、疏水層析、正相層析、反相層析、凝膠過濾、凝膠滲透層析、親和層析、電泳、反流分佈或該等方法之任何組合。在純化後，多肽可交換至不同緩衝液中及/或藉由業內已知多種方法中之任一者(包括但不限於過濾及透析)來濃縮。

經純化多肽為較佳至少85%純、或較佳至少95%純且最佳至少98%純。無論純度之確切數值為多少，多肽之純度均足以用作醫藥產品。

使用平臺製造製程來製備抗IL-23阿德奈汀。實例1闡述該製造製程之一實例。阿德奈汀係在大腸桿菌(E. coli)中產生。大腸桿菌MG1655細胞係經表現載體(pBMS2008/ATI001044)轉化，該表現載體產生呈作為包涵體之不溶形式之蛋白質。使重組菌株在攪拌罐發酵器中生長。發酵結束時，將包涵體收集，溶解並再摺疊於製劑中以供純化。使用馬來醯亞胺連接體使經純化阿德奈汀偶聯至40 kDa具支鏈甲氧基PEG。隨後將偶聯材料再純化以去除游離PEG、游離阿德奈汀及產物相關雜質。對散裝藥物物質實施品質控制測試。

活體內治療用途

在一個態樣中，本申請案提供抗IL-23阿德奈汀，其可用於治療自身免疫疾病，例如狼瘡(例如，紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎)、橋本甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、原發性黏液水腫、格雷夫斯病(Graves' disease)、惡性貧血、自身免疫性萎縮性胃炎、阿狄森病(Addison's disease)、糖尿病(例如胰島素依賴性糖尿病、I型糖尿病)、古德帕斯徹氏症候群(Goodpasture's syndrome)、重症肌無力、天皰瘡、克隆氏病、交感性眼炎、自身免疫性葡萄膜炎、多發性硬化症、自身免疫性溶血性貧血、特發性血小板減少症、原發性膽汁性肝硬化、慢性作用肝炎、潰瘍性結腸炎、乾燥症候群(Sjogren's syndrome)、風濕性疾病(例如，類風濕性關節炎)、多肌炎、硬皮症及混合性結締組織病。

本申請案亦提供向個體投與抗IL-23阿德奈汀之方法。在某些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，抗IL-23阿德奈汀係哺乳動物、尤其人類在醫藥上可接受的。「醫藥上可接受」之多肽係指投與動物而無顯著不良醫療後果(例如基本上不含內毒素或具有極低內毒素含量)之多肽。

調配物及投與

本申請案進一步提供包含本文所述抗IL-23阿德奈汀之醫藥上可接受之組合物，其中該組合物基本上不含內毒素。藉由將具有期望純度之所述阿德奈汀與可選生理上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編輯(1980))混合來製備包含抗IL-23阿德奈汀之治療調配物以用於儲存，該等調配物呈水溶液、凍乾或其他乾燥調配物之形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒性，且包括緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖、及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；鼇合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型表面活性劑，例如TWEEN^TM 、PLURONICS^TM 或聚乙二醇(PEG)。

本發明調配物亦可視需要含有一種以上用於所治療特定適應症之活性化合物，較佳為彼等相互間不會產生不利影響之具有互補活性者。此等分子適於以對欲達成目的有效之量以組合形式存在。

用於體內投與之調配物必須無菌。此可藉由經由無菌過濾膜過濾來容易地達成。

熟習此項技術者應瞭解，各治療劑之劑量將端視藥劑特性而定。

對於治療應用而言，抗IL-23阿德奈汀係以醫藥上可接受之劑型投與個體。其可以濃注劑形式經靜脈內投與或經一段時間藉由連續輸注來投與，或藉由皮下途徑投與。醫藥上可接受之適宜載劑、稀釋劑及賦形劑為業內所熟知且可藉由彼等熟習此項技術者根據臨床表現保證來確定。適宜載劑、稀釋劑及/或賦形劑之實例包括：(1)達爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco's phosphate buffered saline)、(2) 0.9%鹽水(0.9% w/v NaCl)及(3) 5%(w/v)右旋糖。

本發明方法可在活體外、活體內或離體實施。

可如上文針對治療應用所述以共投與或依序投與方式來投與抗IL-23阿德奈汀與一或多種額外治療劑。熟習此項技術者應瞭解，用於共投與之醫藥上可接受之適宜載劑、稀釋劑及賦形劑將端視所投與特定治療劑之特性而定。

當蛋白質以水性劑型而非凍乾形式存在時，其通常將以約0.1 mg/ml至100 mg/ml之濃度來調配，但允許使用超出該等範圍外之多種濃度。對於治療疾病而言，抗IL-23阿德奈汀之合適劑量將取決於：待治療疾病類型、疾病嚴重程度及病程、投與阿德奈汀之目的係預防抑或治療、先前療程、患者臨床史及對阿德奈汀之反應，以及主治醫師之決定。蛋白質係一次性或經一系列治療以適當方式投與患者。

結合血清白蛋白之阿德奈汀 ^TM (SABA)之融合物

在某些態樣中，本申請案提供包含抗IL23-阿德奈汀之融合蛋白，其融合至結合至人類血清白蛋白之¹⁰ Fn3結構域(結合血清白蛋白之阿德奈汀^TM (¹⁰ Fn3結構域)或SABA)。此等融合蛋白在白蛋白存在下可相對於僅抗IL23-阿德奈汀延長血清半衰期。

在某些態樣中，本申請案提供包含¹⁰ Fn3結構域之融合蛋白，該結構域特異性結合至血清白蛋白(例如，人類血清白蛋白(HSA))以延長融合蛋白之t_1/2 。

在某些實施例中，相對於當不偶聯至SABA時抗IL23-阿德奈汀之血清半衰期，延長融合至SABA之抗-IL23-阿德奈汀之血清半衰期。在某些實施例中，相對於當不融合至SABA時抗IL23-阿德奈汀之血清半衰期，SABA融合物之血清半衰期長至少20%、40%、60%、80%、100%、120%、150%、180%、200%、400%、600%、800%、1000%、1200%、1500%、1800%、1900%、2000%、2500%或3000%。在其他實施例中，SABA融合物之血清半衰期為當不融合至SABA時抗IL23-阿德奈汀之血清半衰期的至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍或50倍。在一些實施例中，SABA融合物之血清半衰期係至少10小時、15小時、20小時、25小時、30小時、35小時、40小時、50小時、60小時、70小時、80小時、90小時、100小時、110小時、120小時、130小時、135小時、140小時、150小時、160小時或200小時。

因此，本文所述SABA融合分子可用於藉由在抗IL23-阿德奈汀與SABA之間形成融合物來延長抗IL23-阿德奈汀之半衰期。此等融合分子可用來治療對IL23之生物活性作出反應之病況。本發明涵蓋SABA融合分子在藉由IL-23失調所引起之疾病中之用途。

融合物可藉由將抗IL23-阿德奈汀連接至SABA分子之任一端來形成，即，SABA-抗IL23-阿德奈汀或抗IL23-阿德奈汀-SABA排列。

在一個態樣中，本發明提供包含抗IL23-阿德奈汀之融合蛋白，該抗IL23-阿德奈汀包含結合血清白蛋白之¹⁰ Fn3結構域。在例示性實施例中，本文所述結合血清白蛋白之¹⁰ Fn3蛋白質以小於3 μM、2.5 μM、2 μM、1.5 μM、1 μM、500 nM、100 nM、50 nM、10 nM、1 nM、500 pM、200 pM、100 pM、50 pM或10 pM之K_D 結合至HSA。在例示性實施例中，本文所述結合血清白蛋白之¹⁰ Fn3蛋白質在25℃或37℃下在5.5至7.4之pH範圍下以小於3 μM、2.5 μM、2 μM、1.5 μM、1 μM、500 nM、100 nM、50 nM、10 nM、1 nM、500 pM、200 pM、100 pM、50 pM或10 pM之K_D 結合至HSA。在一些實施例中，與在7.4或更大之pH下對HSA之結合親和力相比，本文所述結合血清白蛋白之¹⁰ Fn3蛋白質在小於7.4之pH下更緊密地結合至HSA。

在某些實施例中，本文所述包含結合HSA之¹⁰ Fn3結構域的融合蛋白亦可結合來自猴、大鼠或小鼠中之一或多者之血清白蛋白。在某些實施例中，本文所述結合血清白蛋白之¹⁰ Fn3蛋白質以小於3 μM、2.5 μM、2 μM、1.5 μM、1 μM、500 nM、100 nM、50 nM、10 nM、1 nM、500 pM或100 pM之K_D 結合至恒河猴血清白蛋白(RhSA)或食蟹猴血清白蛋白(CySA)。

在某些實施例中，本文所述包含結合血清白蛋白之¹⁰ Fn3結構域的融合蛋白結合至HSA之結構域I及/或結構域II。在一個實施例中，本文所述包含結合血清白蛋白之¹⁰ Fn3結構域的融合蛋白不結合至HSA之結構域III。

在某些實施例中，融合蛋白之結合血清白蛋白之¹⁰ Fn3(SABA)部分包含與野生型¹⁰ Fn3結構域(SEQ ID NO: 1)具有至少40%、50%、60%、70%、75%、80%或85%一致性的序列。在一個實施例中，相對於野生型¹⁰ Fn3結構域修飾BC、DE或FG環之中至少一者。在另一實施例中，相對於野生型¹⁰ Fn3結構域修飾BC、DE或FG環中之至少二者。在另一實施例中，相對於野生型¹⁰ Fn3結構域修飾BC、DE及FG環中之所有三者。在其他實施例中，SABA包含與表3中所展示26個核心SABA序列中之任一者(即，SEQ ID NO: 103、107、111、115、119及123-143)或表3中所展示延伸SABA序列中之任一者(即，SEQ ID NO: 188-215，無6xHIS標籤)具有至少40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致性的序列。

在某些實施例中，將核心胺基酸殘基固定且在除核心胺基酸殘基以外之殘基處進行任一取代、保守取代、缺失或加成。在例示性實施例中，用多肽替代BC、DE及FG環，該等多肽包含來自下表3中所展示HSA黏合劑中任一者之BC、DE及FG環序列(即，表3中之SEQ ID NO: 103、107、111、115、119及123-143)。

在某些實施例中，SABA(例如，如上文所述SABA核心序列或基於其之序列)可經修飾以包含N末端延伸序列及/或C末端延伸序列。例示性延伸序列展示於表3中。舉例而言，命名為SABA1.1之SEQ ID NO: 188包含核心SABA 1序列(SEQ ID NO: 103)，其具有N末端序列MGVSDVPRDLE(SEQ ID NO: 144，命名為AdNT1)及C末端序列EIDKPSQ(SEQ ID NO: 153)。SABA1.1在C末端處進一步包含His6標籤，然而，應瞭解，His6標籤係完全可選的且可位於N-或C末端延伸序列內之任何位置。此外，表3中所提供例示性N-或C末端延伸序列(SEQ ID NO: 144-163)中之任一者及其變體均可用來修飾表3中所提供之任一給定SABA核心序列。

在其他實施例中，當設計SABA融合分子時，尾序列可視需要與其他已知連接體序列(例如，表3中之SEQ ID NO: 164-187)組合。

偶聯連接體

SABA融合物可係共價或非共價連接。在一些實施例中，結合血清白蛋白之¹⁰ Fn3可直接或經由多肽連接體間接連接至抗IL23-阿德奈汀。接合Fn3之適宜連接體係彼等允許單獨結構域彼此獨立地摺疊形成三維結構者，該三維結構允許高親和力結合至靶分子。

本發明提供滿足該等要求之多個適宜連接體，其包括以甘胺酸-絲胺酸為主之連接體、以甘胺酸-脯胺酸為主之連接體以及具有胺基酸序列PSTSTST(SEQ ID NO: 184)之連接體。本文所述實例顯示，經由多肽連接體接合之Fn3結構域保持其靶結合功能。在一些實施例中，連接體係以甘胺酸-絲胺酸為主之連接體。該等連接體包含甘胺酸及絲胺酸殘基且長度可為介於8個與50個之間、10個與30個之間及10個與20個之間之胺基酸。實例包括具有胺基酸序列(GS)₇ (SEQ ID NO: 171)、G(GS)₆ (SEQ ID NO: 166)及G(GS)₇ G(SEQ ID NO: 168)之連接體。其他連接體含有麩胺酸，且包括(例如)(GSE)₅ (SEQ ID NO: 173)及GGSE GGSE(SEQ ID NO: 177)。其他例示性甘胺酸-絲胺酸連接體包括(GS)₄ (SEQ ID NO: 170)、(GGGGS)₇ (SEQ ID NO: 179)、(GGGGS)₅ (SEQ ID NO: 180)及(GGGGS)₃ G(SEQ ID NO: 181)。在一些實施例中，連接體係以甘胺酸-脯胺酸為主之連接體。該等連接體包含甘胺酸及脯胺酸殘基且長度可為介於3個與30個之間、10個與30個之間及3個與20個之間之胺基酸。實例包括具有胺基酸序列(GP)₃ G(SEQ ID NO: 182)及(GP)₅ G(SEQ ID NO: 183)之連接體。在其他實施例中，連接體可係以脯胺酸-丙胺酸為主之連接體，其長度為介於3個與30個之間、10個與30個之間及3個與20個之間之胺基酸。以脯胺酸丙胺酸為主之連接體之實例包括(例如)(PA)₃ (SEQ ID NO: 185)、(PA)₆ (SEQ ID NO: 186)及(PA)₉ (SEQ ID NO: 187)。預期最佳連接體長度及胺基酸組成可藉由常規實驗藉由業內熟知之方法來確定。

在一些實施例中，本文所述融合物係經由具有蛋白酶位點之多肽連接體連接，該蛋白酶位點可藉由血液或靶組織中之蛋白酶裂解。可使用此等實施例來釋放治療蛋白質以達成更好地遞送或治療性質或更有效地產生。

可在介於Fn3結構域與多肽連接體之間之Fn3結構域之C末端處引入額外連接體或間隔體。可在介於Fn3結構域與多肽連接體之間之Fn3結構域之N末端處引入額外連接體或間隔體。

在一些實施例中，治療部分可直接或經由聚合連接體間接連接至SABA。可使用聚合連接體來優化改變融合物之各組份間之距離以產生具有以下特性中之一或多者的蛋白質融合物：1)降低或增加一或多個蛋白質結構域在與所關注蛋白質結合時之結合空間位阻，2)增加蛋白質穩定性或溶解性，3)減少蛋白質凝集，及4)增加蛋白質之總體親合力或親合力。

在一些實施例中，治療部分經由生物相容性聚合物(例如聚合糖)連接至SABA。聚合糖可包括可藉由血液或靶組織中之酶裂解的酶裂解位點。可使用此等實施例來釋放治療蛋白質以達成更好地遞送或治療性質或更有效地產生。

結合血清白蛋白之阿德奈汀TM(SABA)序列之概述

本申請案中所提及之許多SABA序列概述於下表3中。除非另有說明，否則所有N末端延伸均以單下劃線表示，所有C末端尾/延伸均以雙下劃線表示，且連接體序列帶有邊框。將各核心SABA序列之環區BC、DE及FG加上陰影。

實例 實例1：製造製程 發酵及收穫

利用無菌基礎培養基來製備生產發酵物。將小瓶解凍並用來接種含有生長培養基之轉移容器。將接種物立即轉移至生產發酵物中。在攪拌的同時在34℃之溫度下維持培養物並使其生長至OD₆₀₀ 為5-10(1 OD單位係約1×10⁹ 個細胞/mL)。在此OD下開始添加進料培養基。發酵繼續進行至OD₆₀₀ =25，此時藉由添加異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導培養物產生阿德奈汀。容器溫度在誘導時自34℃增加至39℃。每小時以無菌方式採樣並測試細胞密度。

在9至12小時之誘導發酵後，藉由以下方式來準備自容器收穫：使溫度降至25℃，添加乙二胺四乙酸(EDTA)至最終濃度為10 mM，藉由添加氫氧化鈉使pH增至7.8並減慢攪拌。在1小時保持期後，將發酵器內含物排入收集容器中。

包涵體之製備

藉由使材料穿過微射流均質機使收穫彙集物之細胞破裂，該微射流均質機使細胞破裂並釋放其內含物。在細胞破裂後，使用疊盤式離心機(disc stack centrifuge)藉由極高離心力在連續過程中將固相與液相分離來收集包涵體。然後用緩衝液將包涵體洗滌兩次(20-25℃)並用水(20-25℃)洗滌兩次。每次藉由離心收集經洗滌包涵體。回收呈漿液形式之經洗滌包涵體。

包涵體之溶解及蛋白質再摺疊

將溶解緩衝液添加至包涵體漿液中，隨後在室溫下攪拌1 hr。在此過程期間達成OD₂₈₀ =20(總蛋白質)之目標。

使用兩步式稀釋法實施蛋白質再摺疊。以一份溶解包涵體與半份稀釋緩衝液(v/v)之比率將稀釋緩衝液添加至溶解包涵體中。藉由將溶解包涵體添加至再摺疊緩衝液中實施第二次稀釋以達成OD₂₈₀ =0.7(總蛋白質)之目標。在室溫下攪拌的同時實施稀釋。在1小時完成混合後，終止攪拌並使蛋白質溶液在室溫下保持過夜。使經溶解及再摺疊之阿德奈汀穿過0.8 μm至0.22 μm過濾器並藉由A₂₈₀ 及RP-HPLC測試蛋白質含量。

純化及與PEG之偶聯

將經再摺疊及過濾之阿德奈汀直接裝載至陽離子交換(CEX1)管柱上進行初始捕獲。將結合材料用洗滌緩衝液洗滌並用50 mM乙酸鈉、500 mM氯化鈉、1.5%丙二醇(pH 5.5)洗脫。分析彙集洗脫物之純度、特性、濃度及內毒素。

使用疏水相互作用層析(HIC)來進一步純化來自捕獲層析之洗脫物。將CEX1洗脫物直接裝載至HIC管柱上，洗滌並隨後用50 mM乙酸鈉、30%丙二醇(pH 5.5)洗脫。分析彙集洗脫物之純度、特性及濃度。

隨後用40 kDa具支鏈PEG之馬來醯亞胺衍生物(mPEG2-MAL)將經純化阿德奈汀直接模式化。在室溫下攪拌HIC洗脫物並添加mPEG2-MAL。在室溫下混合1 hr後，將反應混合物在相同溫度下培育過夜。隨後在最終CEX管柱(CEX2)上處理聚乙二醇化溶液。採樣測試蛋白質含量、純度及內毒素。

用75 mM乙酸將聚乙二醇化溶液之pH及電導率分別調節至4.0及1.0 mS/cm，隨後裝載於最終陽離子交換管柱(CEX2)上以供再純化。在裝載後，用緩衝液洗滌結合材料並隨後用50 mM乙酸鈉、25 mM氯化鈉(pH 5.0)洗脫。採樣測試蛋白質含量、純度及內毒素。

在配備有具有V型絲網之30 kDa標稱分子量截止膜的切向流過濾單元中將CEX2洗脫物濃縮至15 mg/mL。使存於50 mM乙酸鈉、25 mM氯化鈉(pH5.0)中之散裝藥物物質穿過0.22 μm過濾器並在-80℃下冷凍。

實例2：基因、載體及宿主細胞

產生在T7啟動子控制下編碼蛋白質之質粒以用於菌株構建。使用此質粒DNA來轉化感受態大腸桿菌K-12 MG1655細胞(F-λ-,ilvG-rfb-50 rph-1)。將宿主菌株設計為允許在添加IPTG後誘導基因表現。經轉化MG1655菌株對卡那黴素(kanamycin)具有抗性。蛋白質表現載體展示於圖2中。使用自板選擇之單菌落接種發酵培養物，隨後將其分成等份試樣並凍結以用作研究細胞庫。

實例3：生物物理學及生物化學表徵

藉由若干綜合性分析方法來檢查本發明蛋白質之結構及品質。

MALDI-MS

藉由MALDI分析質譜特徵。為了評價對試樣進行MALDI分析的準確性，將20個個別點置於各試樣之鋼板上並依序進行分析。總共產生20個譜。

肽譜

使用肽譜來確認自本發明蛋白質以及相應未聚乙二醇化蛋白質之cDNA序列所預測胺基酸序列(一級結構)之正確表現。為了獲得完整序列覆蓋，採用胰蛋白酶(對Lys及Arg殘基之C末端側進行裂解)及內蛋白酶Glu-C(對Glu殘基之C末端側進行裂解)來生成兩個重疊肽片段組。亦使用肽譜來確定共價轉譯後修飾，其包括殘餘N末端甲硫胺酸、二硫橋接、天冬醯胺之脫醯胺、甲硫胺酸氧化(等)。藉由液相層析質譜(LC-MS)經由分子量及串聯質譜(MSMS)鑑別並表徵肽，該串聯質譜經由碰撞誘導解離(CID)提供部分序列資訊。

SDS-PAGE

使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來顯現未聚乙二醇化及聚乙二醇抗IL-23阿德奈汀之分子量帶型。在具有或無還原劑之試樣緩衝液中準備試樣。在SDS中加熱後，在預澆注梯度(4-20%)聚丙烯醯胺凝膠上對試樣及分子量標記物進行電泳分析。在電泳後，將凝脂固定並使用考馬斯藍染色。目測評估試樣帶型之等效性。

尺寸排除層析/多角度光散射(SECMALS)

使用尺寸排除層析(SEC)對單體、高分子量(HMW)及低分子量(LMW)物質進行定量分析。在SEC分離後，藉由多角度光散射並聯用差式折射儀來測定分離物質之分子量。

實例4：活體外非臨床藥理學 藉由SPR測定之K _D

藉由表面電漿共振(SPR)來表徵結合特性。以2至4種含量將人類IL-23固定在Proteon XPR(Bio-Rad)晶片表面之一個維度中並暴露於相同SPR晶片表面上另一維度中之6種不同濃度的抗IL-23阿德奈汀下。此允許在不存在再生時進行動力學測定。在25℃及37℃下使用兩塊相同晶片進行動力學測定。使用Langmuir相互作用模型及常數參數擬合以ProteOn Manager軟體來實施對動力學參數之評價。

如下表4中所展示，該等抗IL-23阿德奈汀之解離速率在25℃下較緩慢(約10^-5 s^-1 )。甚至在37℃下，解離速度亦接近SPR技術之檢測限，因此所報告解離常數量測值可能係低估值。

溶液相親和力

使用動力學排除分析(KinExA)來量測ATI001045對人類IL-23之溶液親和力。在一種模式中，對三個濃度中之每一者以一式兩份實施hIL-23滴定。相對未結合ATI001045濃度係藉由在人類IL-23固體基質上進行捕獲，隨後用識別阿德奈汀架構之經螢光標記之抗體進行檢測來量測。因技術限制，可量測之最低濃度係0.75 nM。因此，儘管表5中所展示之整體K_D 分析給出K_D 之估計值為51 pM，但在95%置信區間內親和力可低至個位數之pM或高至150 pM。

亦可在KinExA中使用替代模式來量測ATI001045及ATI001047對人類IL-23之溶液親和力。對人類IL-23之三個(ATI001045)或單一(ATI001047)濃度中之每一者(最低濃度為一式四份)實施阿德奈汀之一式兩份滴定。相對未結合人類IL-23濃度係藉由在非聚乙二醇化ATI001045固體基質上進行捕獲，隨後用識別hIL-23之p40亞單位之經螢光標記之抗體進行檢測來量測。表6中所展示整體K_D 分析給出ATI001045之K_D 為9.4 pM(其中95%置信區間為22 pM至2.4 pM)且ATI001047之K_D 為36.3 pM(其中95%置信區間為60.1 pM至19.4 pM)。

Kit225細胞上之STAT3磷酸化

Parham等人(A receptor for the heterodimeric cytokine IL-23 is composed of IL-12Rβ1 and a novel cytokine receptor subunit,IL-23R.J Immunol. 2002年6月1日；168(11):5699-708)自人類IL-2依賴性T細胞系Kit225選殖IL-23R。已藉由FACS分析針對IL-12RB1與IL-23R二者之表現對該等細胞進行表徵並藉由刺激pSTAT3使其對IL-23作出反應且藉由刺激pSTAT4使其對IL-12作出反應。將Kit225細胞接種至96孔板中並在FBS及IL-2不存在下在37℃下靜置3 hr。在此接種後，施用人類重組IL-23(或與拮抗劑預培育1 hr之IL-23)並使細胞返回培育箱中在37℃下保持15分鐘以刺激STAT3磷酸化(縮寫為p-STAT3)。在96孔板中以一式兩份分析每一條件。藉由將細胞置於冰上並添加冰冷PBS來終止刺激。最後，依照標準方案使細胞沉澱並裂解且藉由ELISA來檢測pSTAT3之產生。

IL-23用於刺激之最佳濃度係35 pM。藉由抗p40單株抗體(mAb1510)以及抗p19多株抗體(AF1716)之滴定證實IL-23誘導之pSTAT3之抑制。ATI001045、ATI001047、ATI001014及ATI001016具有等效活性且IC₅₀ 為約300 pM，為抗p19多株抗體效能的約150倍，而ATI001015之IC50為約1.2 nM，為抗p19多株抗體效能的約40倍。阿德奈汀ATI000934之效能為ATI001045的1/3，且IC₅₀ 為1 nM(表7)。

人類PBMC上之STAT3磷酸化

研發基於次級細胞之確認性分析，其目的在於評價作為原代人類細胞中之作用機制的STAT3磷酸化。來自健康供體之外週血單核細胞(PBMC)主要由原初及靜止T細胞組成，該等細胞通常表現較低量IL-23R且當用外源性IL-23刺激時不會產生明顯反應。然而，用IL-2對原初PBMC進行多株活化可使原初T細胞活化並分化，且隨後增加IL-23R表現。該等活化細胞隨後對活化STAT途徑之外源性IL-23刺激敏感，從而導致STAT3磷酸化。

使用市售抗體(AF1716(抗p19 pAb)及mAb1510(抗p40 mAb)，二者均來自R&D Systems)作為陽性對照來抑制IL-23誘導之STAT3磷酸化。使用來自多個供體之血液在10個單獨實驗中比較6種阿德奈汀之抑制活性(概述於表8中)。亞群之例示性數據展示於圖4中。抗IL-23阿德奈汀抑制STAT3磷酸化之效能顯著(>150倍)大於抗p19，但與抗p40單株抗體之效能之1/5相似。

藉由鼠脾細胞產生IL-23誘導之細胞因子 利用原代細胞之初始細胞分析設計為可評價抗IL-23阿德奈汀抑制鼠類Th17細胞分泌IL-23依賴性細胞因子之能力。為了區別分析用鼠類Th17細胞，用磁性珠粒富集CD4+ T細胞，將其與經輻照脾細胞共培養並在TGF-β及IL-6以及IL-4及IFN-γ之中和抗體存在下用抗CD3活化。在培養6天後，收穫極化Th17細胞，將其再接種於96孔板中並用100 ng/ml人類IL-23及5 ng/ml鼠類IL-2刺激。需要添加IL-2以維持細胞存活力並使得可因應IL-23而穩健地產生細胞因子，但不會顯著誘導IL-17A或IL-22單獨產生。由於IL-2誘導較低量細胞因子分泌，因此各試樣組均包括僅用IL-2刺激之細胞來作為對照，其具有在不存在IL-23時所產生細胞因子之基線量。IL-23依賴性反應可藉由計算IL-2與IL-23組合所誘導細胞因子之量與僅藉由IL-2所誘導基線量之間之差來評價。在用IL-2及IL-23再刺激Th17細胞期間添加一定劑量範圍之阿德奈汀以測試其抑制潛能。平行運行一定劑量範圍之人類抗p40抗體(R&D Systems MAB1510)作為評估IL-23抑制之陽性對照。在96孔板中以三個相同孔測試每一條件。在4天後，彙集一式三份測試中之條件化培養基，清除細胞碎片，並藉由ELISA分析IL-17A與IL-22二者之濃度。與僅藉由IL-2所誘導之量相比，用IL-2及IL-23刺激Th17細胞誘導IL-17A之2至3倍增加及IL-22之至少5倍增強。ATI000934、ATI001014、ATI001015、ATI001016、ATI001045及陽性對照抗p40單株抗體調介IL-23依賴性IL-17A及IL-22分泌之劑量依賴性減少。計算每一阿德奈汀以及抗p40對照抑制IL-17A與IL-22二者分泌之IC₅₀ 值且該等數據概述於表9中。所有所測試阿德奈汀抑制IL-23依賴性IL-17A分泌之效能均在為抗p40對照的2倍內且抑制IL-23依賴性IL-22產生之效能均在為抗p40對照的2至3倍內。

藉由人類T細胞產生IL-23誘導之細胞因子 藉由對來自正常健康供體的經EDTA處理之全血進行密度梯度分離獲得PBMC。自與綿羊紅血細胞(SRBC)形成玫瑰花環之PBMC的E+部分準備T細胞。在37℃下將T細胞以100,000細胞/孔平鋪於塗佈有抗CD3(OKT,10 μg/ml)之96孔平底板中且保持1小時並用PBS洗滌。製備含有抗CD28(9.3,1 μg/ml)及IL-1β(10 ng/ml)或IL-1β+IL-23(1 ng/ml)之RPMI-FCS培養基之混合物。已顯示此細胞因子之組合可促進人類T細胞分化為分泌IL-17之T細胞。將起始濃度為1 μg/ml之ATI001045添加至含有IL-1β+IL-23之混合物中。使用Duoset ELISA顯影套組(R&D Systems)檢測上清液中之IL-17。僅使用IL-1β作為背景，ATI001045以2.0 nM±1.6 nM之EC₅₀ (n=4種不同供體)抑制IL-17產生。使用市售抗p40抗體(MAB1510)作為內部對照並以2.2±1.4 nM之EC₅₀ (n=3)抑制IL-17產生。供體228之例示性數據展示於圖6中。 抗IL-23阿德奈汀對IL-23與IL-12之選擇性

使用表2中所示阿德奈汀以及ATI001016來檢查對IL-23/IL-12之生物化學選擇性。結合分析涉及在經固定抗His抗體上捕獲抗IL-23阿德奈汀，隨後使IL-23或IL-12流過阿德奈汀。藉由比較濃度為IL-23之100倍之IL-12的結合信號來評估阿德奈汀對IL-23之選擇性。圖7中之例示性數據顯示，ATI001016對10 nM人類IL-23展示穩健結合(約40 RU)，而對於1 μM人類IL-12無可檢測結合。

NK-92細胞係已知藉由分泌IFN-γ以IL-2依賴性方式對IL-12作出反應之人類天然殺傷細胞系。通常對細胞進行洗滌以去除IL-2，隨後將其接種至96孔板中，之後用25 pM重組人類IL-12(或與拮抗劑預培育之IL-12)處理並再培育20小時。藉由ELISA分析澄清上清液之IFN-γ。

製備表2中所列示每一阿德奈汀純系始於5 μM之4點式5倍系列稀釋液並將其與25 pM IL-12在37℃下一起培育30分鐘，之後添加至NK-92細胞中。將ATI001045及ATI001016始於5 μM之12點式5倍系列稀釋液與25 pM IL-12在37℃下一起培育30分鐘，之後添加至NK-92細胞中。表2中所示純系以及ATI001045或ATI001016在任一所測試濃度下均未以可檢測程度抑制IFN-γ分泌，表明該等抗IL-23阿德奈汀並不抑制IL-12與NK-92細胞表面上受體之相互作用。其似乎與陰性對照及100 nM抗p19多株抗體相當。作為陽性對照，抗p40單株抗體(mAb1510)以0.07 nM之IC₅₀ 抑制IL-12誘導之IFN-γ分泌(圖8)。

抗IL-23阿德奈汀在藥效學模型中封阻IL-23誘導之IL-17

根據以下時間表經腹膜內(IP)對雌性C57B1/6小鼠注射重組鼠類IL-2及人類IL-23。

在給予IL-2及IL-23之最後劑量後7至8小時、即時間=30 h時將所有小鼠無痛致死。收集血清並藉由ELISA分析IL-17及IL-23。

人類IL-23結合至小鼠受體並誘導諸如IL-17及IL-22等細胞因子產生。來自經腹膜內(IP)給予IL-2及人類IL-23之動物的脾細胞在離體培養中受到抗小鼠CD3e刺激時會分泌IL-17。在經受表10中所述處理方案之動物血清中可檢測出大量IL-17，其中用IL-2對C57B1/6小鼠實施初免，24小時後，在另外24小時時段內進行IL-2+IL-23之3次雙注射。據推測，IL-2以多株方式原位活化並擴增Th群且上調節IL-23受體表現。此提供在活體內環境中研究藥物作用機制及藥物濃度與效應之間之關係的方法。用抗p40單株抗體mAb1510驗證該模型(數據未展示)。在8個單獨實驗中測試5種抗IL-23阿德奈汀抑制產生鼠類IL-17之能力，其係在8個單獨實驗中給予IL-2+IL-23之初始劑量前2小時以0.5 mg/kg、0.15 mg/kg、0.05 mg/kg及0.015 mg/kg經皮下給予。ATI001045之例示性劑量反應數據展示於圖9a中(所計算平均ED₅₀ 為0.03 mg/kg)。所有所測試抗IL-23阿德奈汀均顯示對血清中人類IL-23鼠類IL-17之產生具有劑量依賴性抑制，但不同阿德奈汀之抑制程度會有所不同。

抗IL-23阿德奈汀在IL-23誘導之皮膚棘皮症模型中之活性

經真皮內將IL-23注射至小鼠背部皮膚內或外耳耳廓內以誘導真皮感染及表皮增生(棘皮症)(Yan Zheng Interleukin-22,a TH17 cytokine,mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosis,Nature第445卷/2007年2月8日)。在該等研究中，將重組人類IL-23(rHuIL-23)注射至小鼠耳中以探索異常皮膚IL-23暴露之下游結果。

每隔一天向6至8週齡C57BL/6雌性小鼠之右耳中注射5μg雙鏈重組人類IL-23直至第12天。將PBS注射至對側耳中作為對照。在一個研究中，在第一次注射IL-23前約2小時開始用ATI001045進行處理，且每週持續3次直至第12天。以0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg之劑量經皮下投與ATI001045。在第二次研究中，在IL-23投與前約1小時以1 mg/kg、3 mg/kg或10 mg/kg經腹膜內投與媒劑或ATI000934-123(1753E02)且之後每週投與3次直至第10天。在第0天及第4天以10 mg/kg經腹膜內給予抗HuIL-12/IL-23 p40抗體(R&D mAb1510)作為陽性對照。每隔一天使用Mitutoyo(2412F號)遊標卡尺量測耳厚度(一英吋之千分之一)，之後進行下一次耳注射。藉由自每隻動物之IL-23注射耳之量測值減去對照耳之值計算耳厚度。在研究結束(ATI001045為第14天且ATI000934為第12天)時，在用CO₂ 氣體實施安樂死後，在發際線處切除耳並在H&E染色載玻片上對甲醛固定/石蠟包埋組織進行組織學檢查。

總之，在此研究中，1 mg/kg、3 mg/kg及10 mg/kg劑量之ATI000934對IL-23誘導之耳增厚達成相似程度之抑制(圖10)。自第5天一直到第12天研究結束，包括抗p40組在內的所有處理組之耳厚度均顯著(p<0.01 ANOVA/Dunnette's)小於媒劑。第12天，在最後一次劑量後48小時獲得末端血漿試樣並分析ATI000934之循環量，其分別測定為11 μg/ml、18 μg/ml、36 μg/ml。

在第12天進行最後一次量測後，收集10隻動物/組之耳進行屍體剖檢以供常規組織學檢查。儘管投與ATI000934之大多數動物患有棘皮症及真皮浸潤，但組織學嚴重程度評分低於在媒劑處理動物中所觀察者。無明顯劑量反應。儘管投與抗p40之所有動物亦患有棘皮症及真皮浸潤，但組織學嚴重程度評分亦低於在媒劑處理動物中所觀察者。

與媒劑(PBS)處理動物相比，自第5天一直到第14天，ATI001045(1 mg/kg及3 mg/kg)劑量依賴性減小耳厚度(p<0.01，相對於媒劑ANOVA/Dunnett's，圖10)。相比之下，在任一研究日，0.1 mg/kg劑量量與媒劑處理均不具有統計差異性(p>0.05)。用0.3 mg/kg進行處理達成在第5天、第7天、第9天於統計學上小於媒劑之中間減小。評價在最後一次劑量後48小時所收集血清試樣之ATI001045之循環量，其對於0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg之劑量，分別測定為0.698 μg/ml、2.72 μg/ml、8 μg/ml、22.5 μg/ml。組織學分析顯示，投與ATI001045可使IL-23誘導之細胞浸潤及棘皮症劑量依賴性減少，此與耳厚度評分相關。

實例5：本文所用材料及方法 高通量蛋白質產生(HTPP)

將所選黏合劑選殖至pET9d載體中並轉化至大腸桿菌BL21 DE3 plysS細胞中，將該等細胞以24孔模式接種於含有50 μg/mL卡那黴素之5 ml LB培養基中並在37℃下生長過夜。藉由吸入200 μl過夜培養物並將其分配於合適孔中來製備5 ml新鮮LB培養基(50 μg/mL卡那黴素)培養物用於誘導表現。使培養物在37℃下生長直至A600為0.6至0.9。在用1 mM異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導後，使培養物在30℃下表現6小時並藉由在4℃下以2750 g離心10分鐘來收穫。

藉由使細胞沉澱(呈24孔模式)再懸浮於450 μl裂解緩衝液(50 mM NaH₂ P0₄ ，0.5 M NaCl，1xComplete^TM 蛋白酶抑制劑混合劑(不含EDTA)(Roche)，1 mM PMSF，10 mMCHAPS，40 mM咪唑，1 mg/ml溶菌酶，30 μg/ml DNA酶，2 μg/ml抑肽酶，pH 8.0)中來使其裂解並在室溫下振盪1至3小時。將裂解物澄清且藉由轉移至裝配有96孔1.2 ml捕捉板(catch plate)之96孔Whatman GF/D Unifilter中而重排為96孔模式並藉由正壓力過濾。將澄清裂解物轉移至已用平衡緩衝液(50 mM NaH₂ PO₄ ，0.5 M NaCl，40 mM咪唑，pH 8.0)平衡之96孔Ni-螯合板中並培育5 min。藉由正壓力去除未結合材料。用洗滌緩衝液1號(50 mM NaH₂ PO₄ ，0.5 M NaCl，5 mM CHAPS，40 mM咪唑，pH 8.0)以2×0.3 ml/孔洗滌樹脂，其中藉由正壓力去除每一洗滌液。在洗脫前，用50 μl洗脫緩衝液(PBS+20 mM EDTA)洗滌各孔，將其培育5 min並藉由正壓力丟棄此次洗滌液。藉由向各孔中施加額外的100 μl洗脫緩衝液來洗脫蛋白質。在室溫下培育30分鐘後，以200 g將各板離心5分鐘並將洗脫蛋白質收集於96孔捕捉板中，該等捕捉板含有在洗脫前添加於洗脫捕捉板底部之5 μl 0.5 M MgCl₂ 。使用總蛋白質分析(BCA)利用SGE作為蛋白質標準來量化洗脫蛋白質。

以纖維連接蛋白為主之架構蛋白質不溶黏合劑之中等規模表現及純化

對於表現，將所選純系及隨後HIS6標籤選殖至pET9d載體中並在大腸桿菌BL21 DE3 plysS細胞中表現。使用20 ml接種培養物(自單一平鋪菌落產生)接種1升含有50 μg/ml卡那黴素及34 μg/ml氯黴素片(chloramphenicol)之LB培養基或TB-過夜表現培養基(自動誘導)。在37℃下培育LB培養基中之培養物直至A600為0.6至1.0，此時用1 mM異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)對該等培養物實施誘導並在30℃下生長4小時。將TB-過夜表現培養基中生長之培養物在37℃下培育5小時，此時使溫度降至18℃並生長19小時。藉由在4℃下以10,000 g離心30分鐘來收穫培養物。在-80℃下冷凍細胞沉澱。在冰上使用Ultra-turrax均質器(IKA works)將細胞沉澱再懸浮於25 ml裂解緩衝液(20 mM NaH₂ PO₄ ，0.5 M NaCl，1x Complete^TM 蛋白酶抑制劑混合劑(不含EDTA)(Roche)，pH 7.4)中。藉由使用M-110S型微射流均質機(Microfluidics)進行高壓均質化(18,000 psi)達成細胞裂解。藉由在4℃下以23,300 g離心30分鐘來分離不溶部分。用20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl(pH 7.4)洗滌自對裂解物離心所回收之不溶沉澱。經由超音波處理將該沉澱再溶解於存於20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl(pH 7.4)中之6.0 M鹽酸胍中，隨後在37度下培育1至2小時。將再溶解沉澱過濾至0.45 μM並裝載至用20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl/6.0 M胍(pH 7.4)緩衝液平衡的Histrap管柱上。在裝載後，用額外25 CV之相同緩衝液洗滌管柱。用存於20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl/6.0 M胍-HCl(pH 7.4)中之50 mM咪唑洗脫結合蛋白。藉由針對50 mM乙酸鈉/150 mM NaCl(pH 4.5)或PBS(pH 7.2)進行透析使經純化蛋白質再摺疊。

以纖維連接蛋白為主之架構蛋白質可溶黏合劑之中等規模表現及純化

作為不溶黏合劑之純化之替代，亦可使用可溶黏合劑之純化。對於表現，將所選純系及隨後HIS6標籤選殖至pET9d載體中並在大腸桿菌BL21 DE3 plysS細胞中表現。使用20 ml接種培養物(自單一平鋪菌落產生)接種1升含有50 μg/ml卡那黴素及34 μg/ml氯黴素片之LB培養基或TB-過夜表現培養基(自動誘導)。在37℃下培育LB培養基中之培養物直至A600為0.6至1.0，此時用1 mM異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)對該等培養物實施誘導並在30℃下生長4小時。將TB-過夜表現培養基中生長之培養物在37℃下培育5小時，此時使溫度降至18℃並生長19小時。藉由在4℃下以10,000 g離心30分鐘來收穫培養物。在-80℃下冷凍細胞沉澱。在冰上使用Ultra-turrax均質器(IKA works)將細胞沉澱再懸浮於25 ml裂解緩衝液(20 mM NaH₂ PO₄ ，0.5 M NaCl，1x Complete^TM 蛋白酶抑制劑混合劑(不含EDTA)(Roche)，pH 7.4)中。藉由使用M-110S型微射流均質機(Microfluidics)進行高壓均質化(18,000 psi)達成細胞裂解。藉由在4℃下以23,300 g離心30分鐘來分離可溶部分。經由0.45 μM過濾器使上清液澄清。將澄清裂解物裝載至用20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl(pH 7.4)預平衡之Histrap管柱(GE)上。然後用25管柱體積之相同緩衝液、之後20管柱體積之20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl/25 mM咪唑(pH 7.4)及隨後35管柱體積之20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl/40 mM咪唑(pH 7.4)洗滌管柱。用15管柱體積之20 mM磷酸鈉/500 mM NaCl/500mM咪唑(pH 7.4)洗脫蛋白質，根據A280下之吸光率彙集各部分並針對1x PBS,50 mM Tris,150 mM NaCl(pH 8.5)或50 mM NaOAc,150 mM NaCl(pH 4.5)進行透析。藉由以0.22 μM過濾去除任何沉澱。

以纖維連接蛋白為主之架構蛋白質(阿德奈汀)可經各種尺寸及類型之PEG進行聚乙二醇化。為允許聚乙二醇化，可藉由使胺基酸(通常為絲胺酸)單點突變為半胱胺酸對天然存在之殘基EIDKPSQ(發現於10FN3蛋白質之C末端處)進行修飾。於單一半胱胺酸殘基處對蛋白質進行聚乙二醇化係藉由使各種馬來醯亞胺衍生之PEG形式偶聯，將PEG試劑與蛋白質溶液組合並培育來達成。一替代方法係用GSGC連接體替換EIDKPSQ尾且同樣使用半胱胺酸殘基進行聚乙二醇化。經由半胱胺酸上之硫醇基與PEG試劑之馬來醯亞胺官能團間之邁克爾加成化學反應(Michael-addition chemistry)使含有經改造半胱胺酸殘基之阿德奈汀與PEG偶聯。簡言之，在微酸性至中性條件下以莫耳過量將40 kDa PEG添加至蛋白質溶液中。使反應在在室溫下進行2小時至過夜。隨後將反應物施加至離子交換管柱中以將聚乙二醇化阿德奈汀與未反應PEG-馬來醯亞胺及非聚乙二醇化阿德奈汀分離。亦可使用SE/HPLC方法。經純化聚乙二醇阿德奈汀通常係藉由SDS-PAGE及尺寸排除層析來分析。

實例6 候選的結合血清白蛋白之阿德奈汀 ^T ^M (SABA)之篩選及選擇

對DNA文庫應用稱為PROfusion之選擇技術(例如，參見Roberts及Szostak,Proc Natl Acad Sci U S A. 94(23):12297-302,1997及WO 2008/066752)，其中將可變區設計為¹⁰ Fn3之BC、DE及FG環。自此設計創建具有大於10¹³ 個分子之隨機文庫，並對HSA之生物素化形式施加選擇壓力以分離具有期望結合性質之候選的結合血清白蛋白之阿德奈汀^TM (SABA)。

高通量蛋白質產生(HTTP)方法

使用高通量蛋白質產生方法(HTPP)純化各種結合HSA之阿德奈汀^TM 。將所選黏合劑選殖至含有HIS6標籤之pET9d載體並轉化至大腸桿菌BL21(DE3)PLysS細胞中。將經轉化細胞以24孔模式接種於含有50 μg/mL卡那黴素之5 ml LB培養基中並在37℃下生長過夜。藉由吸入200 μl過夜培養物並將其分配於合適孔中來製備5 ml新鮮LB培養基(50 μg/mL卡那黴素)培養物用於誘導表現。使培養物在37℃下生長直至A600為0.6至0.9。在用1 mM異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導後，使培養物在30℃下再生長4小時並藉由在4℃下以3220×g離心10分鐘來收穫。在80℃下冷凍細胞沉澱。

藉由使細胞沉澱(呈24孔模式)再懸浮於450 μl裂解緩衝液(50 mM NaH₂ PO₄ ，0.5 M NaCl，1x Complete^TM 蛋白酶抑制劑混合劑(不含EDTA)(Roche)，1 mM PMSF，10 mM CHAPS，40 mM咪唑，1 mg/ml溶菌酶，30 μg/ml DNA酶，2 μg/ml抑肽酶，pH 8.0)中來使其裂解並在室溫下振盪1小時。將裂解物澄清並藉由轉移至裝配有96孔650 μl捕捉板之96孔Whatman GF/D Unifilter中而重排為96孔模式並以200×g離心5分鐘。將澄清裂解物轉移至已用平衡緩衝液(50 mM NaH₂ PO₄ ，0.5 M NaCl，10 mM CHAPS，40 mM咪唑，pH 8.0)平衡之96孔Ni-螯合板中並培育5 min。去除未結合材料。用洗滌緩衝液1號(50 mM NaH₂ PO₄ ，0.5 M NaCl，5 mM CHAPS，40 mM咪唑，pH 8.0)以2×0.3 ml/孔洗滌樹脂。接下來，用PBS以3×0.3 ml/孔洗滌樹脂。在洗脫前，用50 μl洗脫緩衝液(PBS+20 mM EDTA)洗滌各孔，將其培育5 min並藉由真空丟棄此次洗滌液。藉由向各孔中施加額外的100 μl洗脫緩衝液來洗脫蛋白質。在室溫下培育30分鐘後，以200×g將各板離心5分鐘並將洗脫蛋白質收集於含有5 μl 0.5 M MgCl₂ 之96孔捕捉板中，該等捕捉板黏著於Ni-板底部。使用BCA蛋白質分析利用SGE(對照阿德奈汀^TM )作為蛋白質標準來量化洗脫蛋白質。SGE阿德奈汀係已用SGE替換整合素結合結構域(第78至80位之胺基酸RGD)之野生型¹⁰ Fn3結構域(SEQ ID NO: 1)。

HSA、RhSA及MuSA直接結合ELISA

對於分析HSA之直接黏合劑而言，在4℃下用存於PBS中之10 μg/mL HSA(Sigma,St. Louis,MO)塗佈MaxiSorp^TM 板(Nunc International,Rochester,NY)並過夜，隨後在室溫下在酪蛋白封阻緩衝液(Thermo Scientific,Rockford,IL)中封阻1至3小時。對於單點篩選分析而言，將經純化HTPP阿德奈汀^TM 以1:20稀釋於酪蛋白封阻緩衝液中並在室溫下使其結合至各孔中之HSA並保持1小時。對於劑量反應分析而言，使用0.1 nM至最多1 μM之範圍之濃度。在PBST中實施洗滌以去除未結合阿德奈汀^TM 後，在室溫下將以1:2500稀釋於酪蛋白封阻緩衝液中之抗His mAb-HRP偶聯物(R&D Systems,MN)添加至經結合帶His-標籤之阿德奈汀^TM 中並保持1小時。藉由用PBST洗滌來去除過量偶聯物並根據廠商說明書使用TMB檢測試劑(BD Biosciences)檢測經結合阿德奈汀^TM 。

候選的結合血清白蛋白之阿德奈汀TM(SABA)之鑑別

作為針對HSA/RhSA/MuSA結合及生物物理學標準進行篩選之結果，鑑別並選擇4種獨特的結合血清白蛋白之阿德奈汀^TM (SABA)以在小鼠中評價其半衰期。對4種SABA實施中等規模產生以進行活體外及活體內表徵。表3提供26個自PROfusion鑑別之獨特SABA核心序列之序列(命名為SABA 1-26)。SABA4具有在中等規模產生之前固定之架構突變。SABA4之架構完美形式係SABA5。就BC、DE及FG環而言，SABA4及SABA5具有一致序列。

實例7 候選SABA之產生及調配 SABA之中等規模蛋白質產生

將所選SABA及隨後His₆ 標籤選殖至pET 9d載體中並在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS細胞中表現(關於每一帶His-標籤之SABA序列(命名為SABA1.1、SABA2.1、SABA3.1及SABA5.1)，參見表3)。使用20 ml接種培養物(自單一平鋪菌落產生)來接種1升含有50 μg/mL卡那黴素之LB培養基。使培養物在37℃下生長直至A₆₀₀ 為0.6至1.0。在用1 mM異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導後，使培養物在30℃下再生長4小時並藉由在4℃下以10,000×g離心30分鐘來收穫。在80℃下冷凍細胞沉澱。在冰上使用Ultra-turrax均質器(IKA works)將細胞沉澱再懸浮於25 mL裂解緩衝液(20 mM NaH₂ PO₄ ，0.5 M NaCl，1x Complete^TM 蛋白酶抑制劑混合劑(不含EDTA)(Roche)，pH 7.4)中。藉由使用M-110S型微射流均質機(Microfluidics)進行高壓均質化(18,000 psi)達成細胞裂解。藉由在4℃下以23,300×g離心30分鐘來分離可溶部分。經由0.45 μM過濾器使上清液澄清。將澄清裂解物裝載至用20 mM NaH₂ PO₄ ,0.5 M NaCl(pH 7.4)預平衡之HisTrap管柱(GE)上。然後用25管柱體積之20 mM NaH₂ PO₄ ,0.5 M NaCl(pH 7.4)、之後20管柱體積之20 mM NaH₂ PO₄ ,0.5 M NaCl,25 mM咪唑(pH 7.4)及隨後35管柱體積之20 mM NaH₂ PO₄ ,0.5 M NaCl,40 mM咪唑(pH 7.4)洗滌管柱。用15管柱體積之20 mM NaH₂ PO₄ ,0.5 M NaCl,500 mM咪唑(pH 7.4)洗脫蛋白質，根據A₂₈₀ 下之吸光率彙集各部分並針對1x PBS,50 mM Tris,150 mM NaCl(pH 8.5)或50 mM NaOAc,150 mM NaCl(pH 4.5)進行透析。藉由以0.22 μm過濾去除任何沉澱。

中等規模表現及純化獲得高純度及活性之阿德奈汀^TM ，其係以可溶形式表現且自細菌胞質溶膠之可溶部分純化。在移動相(100 mM NaPO₄ ,100 mM NaSO₄ ,150 mM NaCl,pH 6.8)中對Superdex 200或Superdex 7510/30GL(GE Healthcare)進行SEC分析顯示主要為單體阿德奈汀^TM 。

SABA1.2之調配物

選擇一種特定SABA(SABA1.2(SEQ ID NO: 180))進行初步調配物篩選。SABA1.2包含¹⁰ Fn3之「核心1」序列上之(ED)₅ 延伸。對於SABA1.2，確定10 mM丁二酸、8%山梨醇、5%甘胺酸(pH 6.0)且產物濃度為5 mg/mL之穩定調配物。在此調配物中，蛋白質熔融溫度係75℃，如藉由差示掃描量熱法(DSC)使用1.25 mg/mL之蛋白質濃度所量測。該調配物提供在4℃及25℃下令人滿意的物理及化學穩定性，其中初始聚集體濃度為1.2%。在穩定一個月後，聚集濃度極低(在4℃下為1.6%且在25℃下為3.8%)。在5次自-80℃及-20℃轉變為環境溫度之冷凍-解凍循環後，此調配物中之蛋白質亦穩定。另外，在此調配物中，在4℃及環境溫度下，SABA1.2可在至少20 mg/mL蛋白質濃度下溶解，而無沉澱或聚集增加。

實例8 候選SABA之生物物理學表徵 尺寸排除層析

對得自中等規模製程之候選SABA實施標準尺寸排除層析(SEC)。在Agilent 1100或1200 HPLC系統上使用Superdex 200 10/30或Superdex 75 10/30管柱(GE Healthcare)對中等規模產生之材料實施SEC，其中在A₂₁₄ nm及A₂₈₀ nm下進行UV檢測且進行螢光檢測(激發=280 nm，發射=350 nm)。採用在SEC管柱之合適流速下之100 mM硫酸鈉，100 mM磷酸鈉，150 mM氯化鈉之緩衝液(pH 6.8)。使用凝膠過濾標準品(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)進行分子量校正。

對中等規模產生之純化SABA進行SEC之結果顯示主要單體阿德奈汀^TM 且洗脫物相對於所示球狀凝膠過濾標準品(BioRad)在約10 kDa範圍內。

熱穩定性

對中等規模產生之SABA實施差示掃描量熱法(DSC)分析以確定其相應T_m 。在N-DSC II熱量計(Calorimetry Sciences公司)中藉由在3個大氣壓力下使溫度以1度/分鐘之速率自5℃斜升至95℃來掃描1 mg/ml溶液。相對於以合適緩衝液運行之對照，使用最佳擬合利用Orgin軟體(OrginLab公司)分析數據。SEC及DSC分析結果概述於表11中。

實例9 結合至血清白蛋白之候選SABA1之表徵

自HTPP及/或中等規模擴增材料純化之所選SABA純系的動力學係藉由在Biasensor CM5晶片表面上捕獲相應血清白蛋白(HSA/RhSA/MuSA)並使一系列濃度之SABA流過參照流動池與所捕獲白蛋白二者來確定。另外，結合至白蛋白係在pH 5.5至pH 7.4之範圍內之各種pH條件下實施。結合HSA之阿德奈汀^TM SABA2.1、SABA3.1、SABA4.1(SABA5.1)及SABA1.1與RhSA交叉反應，但不與MuSA交叉反應。SABA2及SABA4結合具有pH敏感性，而純系SABA3顯示與HSA之結合具有低至pH 6.0之pH抗性。SABA1.1符合生物化學標準，其具有低至pH 5.5之pH抗性及親和力/動力學。

藉由Biacore來確定結構域譜。自HTPP及/或中等規模擴增材料純化之所選SABA純系係藉由在Biasensor CM5晶片表面上捕獲HSA或僅由HSA-結構域I及II或HSA-結構域III組成之構建體並使一系列濃度之SABA流過參照流動池與所捕獲白蛋白二者來確定。純系SABA2及SABA1結合至HSA及HSA-結構域I-II構建體，而非HSA-結構域III構建體。純系SABA3及SABA4結合至HSA，而非HSA-結構域I-II或HSA-結構域III構建體。結果概述於表12中。

實例10 候選SABA之活體內t _1/2 之檢查

測定HSA在小鼠中之半衰期以允許在小鼠中評價結合HSA之阿德奈汀^TM ，此乃因結合HSA之阿德奈汀^TM 不與MuSA交叉反應。以20 mg/kg(圖11A)及50 mg/kg劑量(圖11B)將HSA注射至約6週齡Ncr裸雌性小鼠之尾靜脈中，並藉由ELISA測定注射後間期所取血樣中HSA之濃度。以20 mg/kg及50 mg/kg注射至小鼠中之HSA之t_1/2 分別測定為約24 hr及約20 hr。

SABA1-4在小鼠中之半衰期測定 製備結合HSA之純系SABA1.1、SABA2.1、SABA3.1及SABA4.1之1升大腸桿菌生長物，將其純化並去除內毒素。將各SABA變體注射至小鼠之尾靜脈中，並藉由ELISA測定在注射後間期所取血樣中之濃度。比較在約6週齡Ncr裸雌性小鼠中存在或不存在HSA時各SABA之藥物代謝動力學特徵。共注射HSA之小鼠具有與各SABA預混合之HSA(HSA以3至4莫耳過量)，此乃因結合純系對HSA及RhSA具有選擇性且不結合小鼠血清白蛋白。SABA1.1在小鼠血漿中之半衰期係0.56小時，而共注射HSA之SABA1.1之半衰期係5.6小時，半衰期增加約10倍(圖12A)。SABA2.1在小鼠血漿中之半衰期係0.24小時，而共注射HSA之SABA2.1之半衰期係2.8小時，半衰期增加約12倍(圖12B)。SABA3.1在小鼠血漿中之半衰期係0.28小時，而共注射HSA之SABA3.1之半衰期係0.53小時，半衰期增加約2倍(圖12C)。SABA4.1在小鼠血漿中之半衰期係0.66小時，而共注射HSA之SABA4之半衰期係4.6小時，半衰期增加約7倍(圖12D)。本實例之概述展示於圖13A中。 SABA1.1及SABA5.1在食蟹猴中之半衰期測定

在獼猴中進行SABA1.1及SABA5.1之3週單劑量概念驗證性研究以評估在2隻獼猴中經靜脈內給予1 mg/kg(mpk)劑量之藥物代謝動力學。使用基於定量ELISA之分析來評價藥物代謝動力學，研發該分析以檢測血漿試樣中之阿德奈汀^TM 。SABA1.1之半衰期在96至137小時之範圍內。SABA5.1之半衰期為約12小時且在ELISA中僅可量測至最長120小時。圖14A及B概述該等純系之數據並比較食蟹猴之數據。

實例11 結合至血清白蛋白之SABA1之表徵 SABA1.1及1.2結合至HSA及RhSA

在中性pH及25℃下，SABA1.2、即包含(ED)₅ 延伸之「核心1」¹⁰ Fn3(SEQ ID NO: 190)結合至人類血清白蛋白(HSA)，其中平均締合速率常數(ka)為8.21E+03 M^-1 s^-1 ，且平均解離速率常數(kd)為4.43E-04 s^-1 ，所計算平均K_d 為55.3 nM(表13)。對於恒河猴血清白蛋白(RhSA)而言，所量測平均締合速率常數係6.6E+03 M^-1 s^-1 ，且解離速率常數係3.78E-03 s^-1 ，獲得580 nM之所計算平均K_d 。在最多1 μM下在SABA1.2與小鼠或大鼠血清白蛋白之間不能觀測到可量測相互作用(表13及圖15)。在37℃下，ka及kd增加介於2至5倍之間，導致對HSA之親和力增加約2倍且對RhSA之親和力增加1/2(表13)。

另外，實施量熱滴定以測定SABA1與HSA間之化學計量比。對於此研究而言，使用SABA1.1、即包含His6延伸之「核心1」¹⁰ Fn3(SEQ ID NO: 189)。以8.1 μM之濃度將HSA(10 μl/注射115 μM蛋白質溶液)注射至含有SABA1.1之量熱細胞中。在37℃下在PBS緩衝液(pH 7.4)中實施實驗。圖16顯示SABA1.1以1:1化學計量比結合至HSA。

SABA1.2在低pH下有效地結合至HSA

白蛋白之長半衰期(例如，HSA之t_1/2 為19天)主要歸於以下事實：其係藉由在存在於核內體內之低pH條件下結合至新生Fc受體、FcRn而自內吞途徑再循環。如表14中所展示，在核內體pH為5.5時，SABA1.2可有效地結合HSA，表明SABA1在結合至HSA後其t_1/2 亦將受益於FcRn再循環機制。

SABA1.2結合至HSA之結構域I及II，而非結構域III

使用重組HSA片段將SABA1.2在白蛋白上之結合位點定位至N-末端結構域I或II且SABA1.2對結構域III無可檢測結合(圖17)。由於結構域III係HSA中主要與FcRn相互作用之結構域，因此SABA1.2與FcRn競爭結合HSA之可能性較低，亦提高了全面影響再循環機制以延長半衰期的可能性。

實例12 SABA1.2之活體內藥理學

在獼猴中進行SABA1.2之4週單一劑量毒理學前研究以評估在兩種不同劑量量下之藥物代謝動力學及免疫原性。亦在3週單劑量毒理學前研究中評價藥物代謝動力學及免疫原性，該研究包括靜脈內投與組與皮下投與組二者。另外，在兩個單獨單劑量毒理學前研究中，使用基於定量ELISA之分析評價SABA1.2在獼猴中之藥物代謝動力學，研發該分析以檢測血漿試樣中之SABA1.2。

經靜脈內將SABA1.2以1 mpk及10 mpk投與猴。如圖18及下文所述參數所顯示，Cmx及AUC與劑量大約呈線性增加。使用WinNonlin軟體實施非房室分析來評價藥物代謝動力學參數。SABA1.2在10 mpk下之清除率(CL)係0.15 ml/hr/kg，β期半衰期(t_1/2 )係143小時，分佈體積(Vz)係30 mL/kg，且總藥物暴露量(AUCall)係5,609,457 hr*nmol/L(表15)。SABA1.2在1 mpk下之清除率(CL)係0.4 ml/hr/kg，半衰期(t_1/2 )係124小時，分佈體積(Vz)係72 mL/kg，且總藥物暴露量(AUCall)係214,636 hr*nmol/L(表15)。

在經皮下或經靜脈內投與SABA1.2後，β期藥物代謝動力學特徵相似(圖19)。使用WinNonlin軟體實施非房室分析來評價藥物代謝動力學參數。SABA1.2在靜脈內1 mpk下之清除率(CL)係0.22 ml/hr/kg，β期半衰期(t_1/2 )係125小時，分佈體積(Vz)係40 mL/kg，且總藥物暴露量(AUCall)係357,993 hr*nmol/L(表15)。SABA1.2在皮下1 mpk下之清除率(CL)係0.32 ml/hr/kg，β期半衰期(t_1/2 )係134小時，分佈體積(Vz)係62 mL/kg，且總藥物暴露量(AUCall)係251,339 hr*nmol/L(表15)。與靜脈內相比，皮下相對生物利用度(F)係0.7。

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<210>　249

<211>　330

<212>　DNA

<213>　人工

<220>

<223>　寡核苷酸

<220>

<221>　misc_feature

<223>　1572C09

<400>　249

<210>　250

<211>　330

<212>　DNA

<213>　人工

<220>

<223>　寡核苷酸

<220>

<221>　misc_feature

<223>　1572H05

<400>　250

<210>　251

<211>　330

<212>　DNA

<213>　人工

<220>

<223>　寡核苷酸

<220>

<221>　misc_feature

<223>　1572H08

<400>　251

<210>　252

<211>　330

<212>　DNA

<213>　人工

<220>

<223>　寡核苷酸

<220>

<221>　misc_feature

<223>　1550A07

<400>　252

<210>　253

<211>　330

<212>　DNA

<213>　人工

<220>

<223>　寡核苷酸

<220>

<221>　misc_feature

<223>　1550C05

<400>　253

<210>　254

<211>　330

<212>　DNA

<213>　人工

<220>

<223>　寡核苷酸

<220>

<221>　misc_feature

<223>　1550E03

<400>　254

<210>　255

<211>　330

<212>　DNA

<213>　人工

<220>

<223>　寡核苷酸

<220>

<221>　misc_feature

<223>　1550E06

<400>　255

<210>　256

<211>　330

<212>　DNA

<213>　人工

<220>

<223>　寡核苷酸

<220>

<221>　misc_feature

<223>　1550H05

<400>　256

<210>　257

<211>　7

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　多肽

<220>

<221>　misc_feature

<223>　BC環共有序列基序

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(5)..(5)

<223>　Xaa可係M或L

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(7)..(7)

<223>　Xaa可係I或V

<400>　257

<210>　258

<211>　10

<212>　PRT

<213>　人工

<220>

<223>　多肽

<220>

<221>　misc_feature

<223>　FG環共有序列基序

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(3)..(6)

<223>　Xaa可係任一天然存在之胺基酸

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(8)..(9)

<223>　Xaa可係任一天然存在之胺基酸

<400>　258

圖1展示本發明抗IL23阿德奈汀之全長DNA序列比對。

圖2：如實例2中所述pBMS2008/ATI001044蛋白質表現載體。

圖3展示本發明抗IL23阿德奈汀之全長胺基酸序列比對。

圖4展示如實例4中所述抗IL-23阿德奈汀抑制PBMC pSTAT3之代表性IC₅₀ 曲線。

圖5展示如實例4中所述抗IL-23阿德奈汀及抗p40單株抗體(MAB1510)抑制IL-23依賴性IL-17A之代表性IC₅₀ 曲線。

圖6展示ATI001045對供體228(如實例4中所測試4種供體中之一者)中IL-23-誘導PBMC產生IL-17之抑制。

圖7展示抗IL-23阿德奈汀之代表性選擇性數據。展示扣除緩衝液之感應圖，其繪示結合至如實例4中所述所捕獲ATI001016之10 nM IL-23及1 μM IL-12之締合期及解離期。

圖8展示抗IL-23阿德奈汀不會抑制如實例4中所述NK-92細胞中IL-12誘導之IFN-γ產生。

圖9a展示在如實例4中所述小鼠藥效學模型中ATI001045抑制血清IL-17量。

圖9b展示在如實例4中所述小鼠藥效學模型中比較抗IL-23阿德奈汀之抑制活性。

圖10a展示如實例4中所述人類IL-23誘導之棘皮症的ATI000934劑量反應。

圖10b展示如實例4中所述人類IL-23誘導之棘皮症的AT1001045劑量反應。

圖11展示小鼠之活體內HSA半衰期。以20 mg/kg(圖11A)或50 mg/kg(圖11B)將HSA注射至小鼠中。

圖12a-d展示SABA1-SABA4在小鼠中之半衰期測定。

圖13a展示在與HSA共注射時，SABA1-4中小鼠中之半衰期延長之圖表概述。圖13b比較食蟹猴與小鼠之數據。

圖14A-B展示SABA1.1及SABA5.1在食蟹猴中之半衰期測定。

圖15展示藉由直接結合ELISA分析來測試結合至人類、小鼠及大鼠之白蛋白之SABA1.2。

圖16展示SABA1.1與HSA化學計量比之測定。

圖17展示結合至HSA之重組結構域片段之SABA1.2的Biacore分析。

圖18展示以1 mpk及10 mpk給予之SABA1.2在猴中之藥物代謝動力學特徵。

圖19展示經靜脈內或皮下以1 mpk給予之SABA1.2在猴中之藥物代謝動力學特徵。

(無元件符號說明)

Claims

一種多肽，其包含纖維連接蛋白III型第10結構域(¹⁰ Fn3)，其中該¹⁰ Fn3結構域包含與SEQ ID NO：1之非環區至少80%一致之胺基酸序列，以及選自SEQ ID NO：2-6之BC環、選自SEQ ID NO：7-48之DE環及選自SEQ ID NO：49-59之FG環，其中該多肽結合IL-23之p19亞單位。
如請求項1之多肽，其中該BC、DE及FG環胺基酸序列與由SEQ ID NO：60-100中任一所組成之BC、DE及FG環區相同。
如請求項1或2之多肽，其進一步包含一或多個選自由以下組成之群的藥物代謝動力學(PK)部分：聚乙二醇、唾液酸、Fc、Fc片段、轉鐵蛋白、血清白蛋白、血清白蛋白結合蛋白及血清免疫球蛋白結合蛋白。
如請求項3之多肽，其中該PK部分係聚乙二醇。
如請求項1之多肽，其進一步包含半胱胺酸連接體。
如請求項5之多肽，其中該半胱胺酸連接體選自由以下胺基酸組成之群：展示於SEQ ID NO：101中之GSGC及展示於SEQ ID NO：102中之EIDKPCQ。
一種醫藥上可接受之組合物，其包含如請求項1至6中任一項之多肽，其中該組合物基本上不含內毒素。
一種用於調節Th17細胞之致病性的活體外方法，其包含使如請求項1至6中任一項之多肽以有效量與IL-23接觸，以干擾內源性IL-23與Th17細胞之反應。
一種如請求項1至6中任一項之多肽的用途，其用於製造用以調節Th17細胞之致病性的藥劑。