MX2012009050A

MX2012009050A - Proteinas de dominio de andamiaje de fibronectina que se unen a interleucina 23 (il-23).

Info

Publication number: MX2012009050A
Application number: MX2012009050A
Authority: MX
Inventors: Linda Engle; Alex Bush; Ruchira Dasgupta; Lumelle Schneeweis
Original assignee: Squibb Bristol Myers Co
Priority date: 2010-02-18
Filing date: 2011-02-16
Publication date: 2012-09-07
Also published as: US9714281B2; SG183215A1; KR20130010461A; TN2012000372A1; PE20130041A1; CL2012002296A1; EP2536757A1; TWI508736B; EP2536757B1; WO2011103105A1; ZA201206969B; TW201130501A; BR112012019881A2; CA2790329A1; CN102762591A; US20130012436A1; AR080229A1; AU2011218243A1; JP2013520426A; US8927693B2

Abstract

La presente invención se refiere a proteína de dominio de andamiaje basada en fibronectina que se une a interleucina 23 (IL-23), específicamente a la subunidad p19 de IL-23. La invención también se refiere al uso de las proteínas innovadoras en aplicaciones terapéuticas para tratar enfermedades autoinmunes. La invención se refiere adicionalmente a células que comprenden tales proteínas, polinucleótidos que codifican tales proteínas o fragmentos de las mismas y a vectores que comprenden los polinucleótidos que codifican las proteínas innovadoras.

Description

PROTEINAS DE DOMINIO DE ANDAMIAJE DE FIBRONECTINA QUE SE UNEN A INTERLEUCINA 23 (IL-23) Campo de la Invención La presente invención se refiere a proteína de dominio de andamiaje basada en fibronectina que se une a interleucina 23 (IL-23), específicamente a la subunidad pl9 de IL-23. La invención también se refiere al uso de las proteínas innovadoras en aplicaciones terapéuticas para tratar enfermedades autoinmunes . La invención se refiere adicionalmente a células que comprenden tales proteínas, polinucleótidos que codifican tales proteínas o fragmentos de las mismas y a vectores que comprenden los polinucleótidos que codifican las proteínas innovadoras.

Antecedentes de la Invención La IL-23 es un miembro de la familia de citocinas heterodiméricas de la IL-12. Esta contiene la subunidad p40, que es común a IL-12 y una subunidad pl9 única. La IL-23 envía señales a través de un complejo receptor heterodimérico constituido por IL-12R 1 e IL-23R (Aggarwal S et al. "Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin- 17" . J Biol Chem.278: 1910-4, 2003) . La IL-23 es un objetivo potencial para el tratamiento de trastornos inflamatorios crónicos tales como esclerosis múltiple, artritis reumatoide, Ref . : 232869 soriasis y enfermedad de Crohn.

Los armazones basados en fibronectina son una familia de proteínas capaces de desarrollarse para unirse a cualquier compuesto de interés. Estas proteínas, que hacen generalmente uso de un andamiaje derivado de una fibronectina de tipo III (Fn3) o dominio similar a Fn3 , funcionan en una manera característica de anticuerpos naturales o modificados (es decir, anticuerpos policlonales , monoclonales , o de cadena simple) y, además, poseen ventajas estructurales. Específicamente, la estructura de estos imitadores de anticuerpos se ha diseñado para plegamiento, estabilidad y solubilidad óptimos, incluso en condiciones que conducen normalmente a la pérdida de la estructura y de la función en anticuerpos.- Un ejemplo de proteínas de andamiaje basadas en fibronectina son las Adnectinas™ (Adnexns, a Bristol-Myers Squibb R&D Company) .

Los dominios de la fibronectina de tipo III (Fn3) comprenden, en orden desde el extremo N-terminal hasta el C-terminal, una cadena beta o similar a beta, A; un bucle, AB; una cadena beta o similar a beta, B; un bucle, BC una cadena beta o similar a beta C; un bucle CD; una cadena beta o similar a beta D; un bucle DE; una cadena beta o similar a beta, E; un bucle, EF; una cadena beta o similar a beta F; un bucle FG; y una cadena beta o similar a beta G. Cualquiera de todos los bucles AB, BC, CD, DE, EF y FG puede participar en la unión a objetivo. Los bucles BC, DE y FG son tanto funcionalmente como estructuralmente análogos a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de inmunoglobulinas . La Patente de los Estados Unidos N° 7,115,396 describe las proteínas de dominio Fn3 en las que las alteraciones en los bucles BC, DE y FG dan como resultado aglutinantes de TNFOÍ de alta afinidad. La Publicación de los Estados Unidos N° 2007/0148126 describe proteínas de dominio Fn3 en las que las alteraciones en los bucles BC, DE y FG dan como resultado aglutinantes VEGFR2 de alta afinidad.

Sería ventajoso obtener proteínas- de andamiaje de dominio de fibronectina mejoradas para el tratamiento terapéutico de trastornos autoinmunes . Un subgrupo de células T efectores que producen interleucina 17 (IL-17; "células Thl7") son altamente proinflamatorios e inducen autoinmunidad grave. Las células Thl7 expresan un subgrupo distinto de citocinas y quimiocinas comparadas con células Thl y Th2 , incluyendo IL-6, factor de necrosis tumoral (T F, por sus siglas en inglés), IL-22 , IL-17A y IL-17F así como el receptor de quimiocinas CCR6. IL-23 promueve la producción de IL-17 por células T activados (Aggarwal S et al., "Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin- 17" , J Biol Chem. 278:1910-1914, (2003)) y es una citocina clave para inducir expansión de células T CD4+ que producen IL-17. La exposición a IL-23 parece ser que es la característica clave que determina la patogenicidad de las células Thl7.

Sumario de la Invención La solicitud proporciona Adnectins™ frente a la subunidad pl9 específica de IL-23 humana. Un aspecto de la invención proporciona polipéptidos que comprenden dominio de Fn3 en el que uno o más de los bucles accesibles a disolvente se ha alterado al azar o mutado. En algunas modalidades, el dominio Fn3 es un dominio Fn3 derivado del décimo módulo natural del dominio de fibronectina humana de tipo III (10Fn3) . En algunas modalidades, el polipéptido 10Fn3 de la invención es por lo menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, o 90% idéntico al dominio 10Fn3 humano.

En algunas modalidades, uno o más bucles seleccionados de BC, DE y FG pueden prolongarse o acortarse en longitud en relación al bucle de fibronectina humana correspondiente.

En algunas modalidades, los polipéptidos de la invención comprenden un dominio décimo de fibronectina de tipo III (10Fn3) , en los que el dominio 10Fn3 comprende un bucle, AB ; un bucle, BC; un bucle, CD; un bucle, DE; un bucle EF; y un bucle FG; y tienen por lo menos un bucle seleccionado de los bucles BC, DE y FG con una secuencia de aminoácidos alterada en relación a la secuencia del bucle correspondiente del dominio 10Fn3 humano.

En algunas modalidades, el polipéptido de la invención comprende un dominio Fn3 que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80, 85, 90, 95, 98, 99 o 100% idéntica a las regiones que no son bucles .

En algunas modalidades, el bucle BC de la proteína de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID NoS: 2-6.

En algunas modalidades, el bucle DE de la proteína de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID NoS: 7-48.

En algunas modalidades, el bucle FG de la proteína de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID NoS: 49-59.

En algunas modalidades, el dominio 10Fn3 puede comenzar y/o finalizar con sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos .

En algunas modalidades, la proteína de la invención comprende una secuencia de bucle de las secuencias de bucle BC mostradas en las SEC ID N°s: 2-6, una secuencia bucle de DE mostrada en las SEC ID NoS: 7-48 y una secuencia de bucle de FG mostrada en las SEC ID NoS: 49-59.

En algunas modalidades, la proteína de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de bucle BC, DE y FG en por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 o 100% idéntica a cualquiera de las SEC ID N.oS: 2-59.

En algunas modalidades, la Adnectina anti-IL-23 comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEC ID N°s: 60-100.

En algunas modalidades, la Adnectina anti-IL-23 comprende la secuencia de aminoácidos desde la posición 3-96 de una cualquiera de las SEC ID NoS: 60-100.

En algunas modalidades, la Adnectina anti-IL-23 comprende la secuencia de aminoácidos idéntica por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 ó 100% a cualquiera de las SEC ID NoS: 60-100.

En un aspecto, la Adnectina anti-IL-23 comprende adicionalmente una fracción farmacocinética (PK, por sus siglas en inglés) . En algunas modalidades, el resto de PK comprende polietilenglicol (PEG) .

En un aspecto, la solicitud proporciona una Adnectina anti-IL-23 útil en el tratamiento de enfermedades autoinmunes .

En un aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende un dominio décimo de fibronectina de tipo III (10Fn3) y Adnectina anti-IL-23, en el que el dominio 10Fn3 se une a HSA con una Kd de 1 µ? o menos . En ciertas modalidades, el dominio 10Fn3 comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos idéntica en un 70% a la SEC ID N° : 103. En una modalidad, el dominio 10Fn3 comprende un bucle BC que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID N° : 104, un bucle DE que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID N° : 105, y un bucle FG que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID N° : 106. En otra modalidad, el dominio 10Fn3 comprende uno o más de un bucle BC que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID N° : 104, un bucle DE que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID N° : 105, y un bucle DE que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID N° : 106.

En una modalidad, el dominio 10Fn3 del polipéptido de fusión también se une a una o más de la seroalbúmina de macaco de la India (RhSA) , seroalbúmina de macaco de Java (CySA) , o seroalbúmina murina (MuSA) . En otras modalidades, el dominio 10Fn3 no reacciona de forma cruzada con una o más de RhSA, CySA o MuSA.

En ciertas modalidades, el dominio 10Fn3 del polipéptido de fusión se une a HSA con una Kd de 1 µ? o menos. En ciertas modalidades, el dominio 10Fn3 se une a HSA con una Kd de 500 nM o menos. En otras modalidades, el dominio 10Fn3 se une a HSA con una Kd de por lo menos 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, o 5 nM..

En otras modalidades, el dominio 10Fn3 del polipéptido de fusión se une al dominio I o II de HSA. En una modalidad, el dominio 10Fn3 se une a ambos dominios I y II de HSA. En algunas modalidades, el dominio 10Fn3 se une a HSA en un intervalo de H de 5.5 a 7.4. En ciertas modalidades, el dominio 10Fn3 se une a HSA con una Kd de 200 nM o menos a pH 5.5. En otra modalidad, el dominio 10Fn3 se une a HSA con una Kd de por lo menos 500 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, o 5 nM en un intervalo de pH de 5.5 a 7.4. En una modalidad, el dominio 10Fn3 se une a HSA con una Kd de por lo menos 500 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 10 nM, o 5 nM a pH 5.5.

En algunas modalidades, la semivida en suero del polipéptido de fusión es por lo menos 5 veces mayor que la semivida en suero del polipéptido en ausencia de seroalbúmina . En ciertas modalidades, la semivida en suero del polipéptido de fusión es por lo menos 2 veces, 5 veces, 7 veces, 10 veces, 12 veces, 15 veces, 20 veces, 22 veces, 25 veces, 27 veces, o 30 veces mayor que la semivida en suero del polipéptido en ausencia de seroalbúmina. En algunas modalidades, la seroalbúmina bovina es cualquiera de HSA, RhSA, CySA, o MuSA.

En ciertas modalidades, la semivida en suero del polipéptido de fusión en presencia de seroalbúmina es por lo menos 20 horas. En ciertas modalidades, la semivida en suero del polipéptido de fusión en presencia de seroalbúmina es por lo menos 10 horas, 12 horas, 15 horas, 20 horas, 25 horas, 30 horas, 40 horas, 50 horas, 75 horas, 90 horas, 100 horas, 110 horas, 120 horas, 130 horas, 150 horas, 170 horas, o 200 horas. En algunas modalidades, la semivida del polipéptido de fusión se observa en un primate (por ejemplo, ser humano o mono) o un murino.

En cualquiera de los aspectos y modalidades anteriores, el dominio 10Fn3 comprende una secuencia de SEC ID N°: 107, 111, 115, 119, y 123-143.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra el alineamiento de secuencia de ADN de longitud total de la Adnectina anti-IL-23 de la invención.

La Figura 2 muestra el vector de expresión de proteína pBMS2008/ATI001044 como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 3 muestra el alineamiento de secuencia de aminoácidos de longitud total de la Adnectina anti-IL-23 de la invención.

La Figura 4 muestra curvas de CI50 representativas de inhibición de PBMC pSTAT3 por adnectina anti-IL-23 como se describen en el Ejemplo 4.

La Figura 5 muestra curvas de CI50 representativas para inhibición de IL-17A dependiente de IL-23 por adnectinas anti-IL-23 y anticuerpo monoclonal anti-p40 (MAB1510) como se describen en el Ejemplo 4.

La Figura 6 muestra inhibición de ATI001045 de producción de IL-17 inducida por IL-23 por PBMC de donante 228 (uno de 4 donantes puestos a prueba como se describe en el Ejemplo 4) .

La Figura 7 muestra datos de selectividad representativa para las adnectinas anti-IL-23. Los sensogramas a los que se les ha retirado la solución amortiguadora que ilustran las fases de asociación y disociación de unión de IL-23 10 nM y de IL-12 1 µ? a ATI001016 como se describe en el Ejemplo 4.

La Figura 8 muestra que las adnectinas anti-IL-23 no inhiben la producción de IF -? inducida por IL-12 en células NK-92 como se describe en el Ejemplo 4.

La Figura 9A muestra que ATI001045 inhibe niveles de IL-17 en suero en modelos farnmcodinámicos de ratón de IL-23 como se describe en el Ejemplo 4.

La Figura 9B muestra una comparación de actividades inhibidoras de adnectinas anti-IL-23 en un modelo farmacodinámico de ratón como se describe en el Ejemplo 4.

La Figura 10A muestra respuesta a dosis de ATI000934 en acantosis inducida por IL-23 humana como se describe en el Ejemplo 4.

La Figura 10B muestra respuesta a dosis de ATI001045 en acantosis inducida por IL-23 humana como se describe en el Ejemplo 4.

Las Figuras 11A-11B muestran semivida de HSA in vivo en ratones.

La HSA se inyectó en ratones a 20 mg/kg (Figura 11A) o a 50 mg/kg (Figura 11B) ..

Las Figuras 12A-12D muestran determinación de semivida de SABA1-SABA4 en ratones.

La Figura 13 muestra un sumario gráfico de potenciación de semivida en ratones de SABA1-4 cuando se coninyecta con HSA.

Las Figuras 14A-14B muestran la determinación de semivida para SABA1.1 y SABA5.1 en macaco de Java .

La Figura 15 muestra la. unión de SABA1.2 a albúminas de ser humano, ratón y rata por ensayo de ELISA de unión directa.

La Figura 16 muestra la determinación de estequiometría de SABA1.1 y de HSA. La Figura 17 muestra el análisis de Biacore de unión de SABA1.2 a fragmentos de dominio recombinante de HSA.

La Figura 18 muestra el perfil farmacocinético para SABA1.2 en monos administrados a 1 mpk y a 10 mpk.

La Figura 19 muestra el perfil farmacocinético para SABA1.2 en monos administrados intravenosamente o subcutáneamente a 1 mpk.

La siguiente talba compara datos de macaco de Java y ratones.

Descripción Detallada de la Invención Definiciones : Por un "polipéptido" se quiere decir cualquier secuencia de dos o más aminoácidos, sin tener en cuenta la longitud, modificación postraduccional, o función. "Polipéptido," ¦ "péptido" y "proteína" se usan intercambiablemente en el presente documento. Los polipéptidos pueden incluir aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales tales como aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos N° 6,559,126, incorporados en el presente documento por referencia. Los polipéptidos pueden modificarse en cualquiera de una diversidad de rutas químicas estándar (por ejemplo, un aminoácido puede modificarse por un grupo protector; el aminoácido carboxiterminal puede elaborarse dentro de un grupo amida terminal; el residuo amino-terminal puede modificarse con grupos para, por ejemplo, potenciar la lipofilicidad; o el polipéptido puede glicosilarse químicamente o modificarse de otra forma para incrementar estabilidad o semivida in vivo) . Las modificaciones polipeptídicas pueden incluir la unión de otra estructura tal como un compuesto cíclico u otra molécula al polipéptido y pueden incluir también polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos en una configuración alterada (es decir, R o S; o, L o D) . Los péptidos de la invención son proteínas derivadas del dominio décimo de tipo III de fibronectina que se han modificado para unirse específicamente a la subunidad pl9 de IL-23 y se refieren en el presente documento como "Adnectina" o "Adnectina anti-IL-23" .

El término "PK" es un acrónimo para "farmacinético (a) " y abarca propiedades de un" compuesto que incluyen, a modo de ejemplo, absorción, distribución, metabolismo y eliminación por un sujeto. Una "proteína de modulación PK" o "fracción PK" se refiere a cualquier proteína, péptido o fracción que afecta las propiedades farmacocinéticas de una molécula biológicamente activa cuando se condensa a o cuando se administra conjuntamente con la molécula biológicamente activa. Ejemplos de una proteína de modulación PK incluyen PEG, aglutinantes de seroalbúmina bovina (HSA, por sus siglas en inglés) (como se describen en las Publicaciones de los EE.UU. Nos 20050287153 y 20070003549) , seroalbúmina bovina, Fe o fragmentos de Fe y azúcares (por ejemplo, ácido siálico) .

"Identidad de secuencia de aminoácidos en porcentaje (%) " en el presente documento se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en una secuencia determinada, después de alinear las secuencias e introducir los huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y para no considerar cualquier sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede realizar de varias formas que están dentro del oficio en la técnica usando, por ejemplo, software informático disponible públicamente tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR®) . Las personas experimentadas en la técnica pueden determinar los parámetros adecuados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para alcanzar la alineación máxima a lo largo de toda la longitud de las secuencias que se están comparando.

Un polipéptido "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural . Componentes contaminantes del ambiente ' natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos para el polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos . En modalidades preferidas, el polipéptido se purificará (1) a más del 95% en peso de polipéptido como se determina por el procedimiento de Lowry y lo más preferiblemente más del 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener por lo menos residuos de secuencia N-terminal o secuencia de aminoácidos internos mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) para homogeneizar por SDS-PAGE en condición reductora o no reductora usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de las células recombinantes ya que- por lo menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará en por lo menos una etapa de purificación.

La "semivida" de una secuencia de aminoácidos o de un compuesto se puede definir generalmente como el tiempo tomado por la concentración sérica del polipéptido para reducirse al 50%, in vivo, por ejemplo debido a la degradación de la secuencia o compuesto y/o a la evacuación o captura de la secuencia o compuesto por mecanismos naturales. La semivida se puede determinar de cualquier manera conocida por sí misma, tal como por análisis farmacocinéticos . Las técnicas apropiadas serán claras para la persona experimentada en la técnica y pueden por ejemplo implicar generalmente las etapas de administrar apropiadamente al primate una' dosis apropiada de la secuencia de aminoácidos o del compuesto de la invención; recoger muestras de sangre u otras muestras del primate a intervalos regulares; determinar el nivel de concentración de la secuencia de aminoácidos o del compuesto de la invención en la muestra de sangre; y calcular a partir de (un lote de) los datos así obtenidos, el tiempo hasta que el nivel de concentración de la secuencia de aminoácidos o del compuesto de la invención se ha reducido en 50% comparado con el nivel inicial tras administrar dosis. Se hace por ejemplo referencia a manuales estándar, tales como Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters et al., Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996) . Se hace referencia también a "Pharmacokinetics" , M Gibaldi & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a edición rev. (1982) .

La semivida se puede expresar usando parámetros tales como las tl/2-alfa, tl/2-beta y el área bajo la curva (AUC) .

En la presente especificación, un "incremento en semivida" se refiere a un incremento en uño cualquiera de estos parámetros, dos cualquiera de estos parámetros, o todos estos tres parámetros. Un "incremento en semivida" se refiere en particular a un incremento en la tl/2-beta, bien con o bien sin un incremento en la tl/2-alfa y/o en la AUC o en ambas. Visión general La solicitud proporciona Adnectina frente a la subunidad pl9 específica de IL-23. Con el fin de identificar el antagonista específico de IL-23, IL-23 se presentó a grandes bibliotecas sintéticas de Adnectina usando mAb anti-p40. Las Adnectinas que se unieron a la subunidad pl9 de IL-23 se rastrearon para unión a IL-23 humana, la competición de la interacción de IL-23/IL-23R y la inhibición de la señalización inducida por IL-23 en una línea de células T. Las Adnectinas anti-IL-23 se sometieron a presión selectiva adicional disminuyendo la concentración objetivo y seleccionando para Adnectinas anti-IL-23 con velocidades de disociación lentas. A partir de este proceso de optimización se identificó una familia de Adnectinas como inhibidores específicos de IL-23 con propiedades bioquímicas y biofísicas favorables.

Armazones basados en fibronectina Un aspecto de la solicitud proporciona polipéptidos que comprenden dominio Fn3 en el que uno o más de los bucles accesibles a disolvente se ha alterado al azar o. mutado. En algunas modalidades, el dominio Fn3 es un dominio Fn3 derivado del décimo módulo natural del dominio de fibronectina humana de tipo III (10Fn3) . VSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLK PGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEC ID N° : 1) . En la secuencia de 10Fn3 anterior, los bucles BC, DE y FG están subrayados.

Se ha comunicado una diversidad de armazones de 10Fn3 mutantes. En un aspecto, uno o más de Asp 7, Glu 9 y Asp 23 se reemplaza por otro aminoácido, tal como, por ejemplo, un residuo de aminoácido cargado no negativamente (por ejemplo, Ash, Lys, etc.). Se ha comunicado que estas mutaciones tienen el efecto de promover mayor estabilidad del 10Fn3 mutante a pH neutro cuando se compara con la forma natural (véase, Publicación de PCT N° WO02/04523) . Se ha descrito una diversidad de alteraciones adicionales en el andamiaje de 10Fn3 que son bien beneficiosas o bien neutras. Véase, por ejemplo, Batori et al., Protein Eng. diciembre de 2002; 15(12): 1015-20; Koide et al., Biochemistry 28 de agosto de 2001 ; 40 (34 ) : 10326-33.

Tanto variantes de proteínas de 10Fn3 como proteínas naturales de 10Fn3 están caracterizadas por la misma estructura, es decir siete secuencias de dominios de cadena beta designadas de la A a la G y seis regiones de bucle (bucle AB, bucle BC, bucle CD, bucle DE, bucle EF y bucle FG) que conectan las siete secuencias de dominios de cadena beta. Las cadenas beta posicionadas. más cerca de los extremos N- y extermínales pueden adoptar una conformación similar a beta en solución. En la SEC ID N° : 1, el bucle AB corresponde a residuos 15-16, el bucle BC corresponde a residuos 21-30, el bucle CD corresponde a residuos 39-45, el bucle DE corresponde a residuos 51-56, el bucle EF corresponde a residuos 60-66 y el bucle FG corresponde a residuos 76-87 (Xu et al., Chemistry & Biology 2002 9:933-942).

En algunas modalidades, el polipéptido 10Fn3 puede ser por lo menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, o 90% idéntico al dominio 10Fn3 humano, mostrado en la SEC ID N° : 1. Mucha de la variabilidad tiene lugar generalmente en uno o dos de los bucles. Cada una de las laminas beta o cada una de las laminas similares a las beta de un polipéptido 10Fn3 puede consistir esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a la secuencia de una cadena beta o similar a beta correspondiente de SEC ID N": 1, dado que tal variación no altera la estabilidad del polipéptido en condiciones fisiológicas.

En algunas modalidades, los polipéptidos de la descripción comprenden un dominio décimo de fibronectina de tipo III (10Fn3) , en los que el dominio 10Fn3 comprende un bucle, AB; un bucle, BC; un bucle, CD; un bucle, DE; un bucle EF; y un bucle FG; y tiene por lo menos un bucle seleccionado de los bucles BC, DE y FG con una secuencia de aminoácidos alterada en relación a la secuencia del bucle correspondiente del dominio 10Fn3 humano. En algunas modalidades, los bucles BC y FG se alteran, en algunas modalidades, los bucles BC, DE y FG se alteran, es decir, los dominios de Fn3 comprenden dominios que no se dan en la naturaleza. Por "alterado" se quiere decir una o más alteraciones de secuencia de aminoácidos relativos a la secuencia de plantilla (dominio de fibronectina humana correspondiente) e incluye adiciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos. Alterar una secuencia de aminoácidos se puede lograr a través de variación de secuencia intencional, ciega o espontánea, generalmente de una secuencia codificante de ácidos nucleicos, y puede ocurrir por cualquier técnica, por ejemplo, PCR, PCR propensa a errores, o síntesis de ADN química.

En algunas modalidades, uno o más bucles seleccionados de BC, DE y FG pueden prolongarse o acortarse en longitud en relación al bucle de fibronectina humana correspondiente. En algunas modalidades, la longitud del bucle puede prolongarse desde 2 hasta 25 aminoácidos. En algunas modalidades, la longitud del bucle puede disminuirse en 1-11 aminoácidos. Para optimizar la unión a antígeno, por lo tanto, la longitud de un bucle de 10Fn3 se puede alterar así como en la secuencia para obtener la mayor flexibilidad y afinidad posibles en unión de antígeno.

En algunas modalidades, el polipéptido comprende un dominio de Fn3 que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80, 85, 90, 95, 98, 99 o 100% idéntica a las regiones no de bucle de la SEC ID N°: 1, en la que por lo menos un bucle seleccionado de BC, DE y FG está alterado. En algunas modalidades, el bucle BC alterado tiene hasta 10 sustituciones de aminoácidos, hasta 4 deleciones de aminoácidos, hasta 10 inserciones de aminoácidos, o una combinación de las mismas. En algunas modalidades, el bucle DE alterado tiene hasta 6 sustituciones de aminoácidos, hasta 4 deleciones de aminoácidos, hasta 13 inserciones de aminoácidos o una combinación de las mismas. En algunas modalidades, el bucle FG alterado tiene hasta 12 sustituciones de aminoácidos, hasta 11 deleciones de aminoácidos, hasta 25 inserciones de aminoácidos o una combinación de las mismas.

En algunas modalidades, el bucle BC de la proteína de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por GHYPMHV (SEC ID N° : 2), GHYPLHV (SEC ID N° : 3), GHYPMHI (SEC ID N° : 4), GHYPLHI (SEC ID N° : 5) y GHYPLHL (SEC ID N° : 6).

En algunas modalidades, el bucle DE de la proteína de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por HRTH (SEC ID N° : 7) , YYHY (SEC ID N° : 8) , SKQH (SEC ID N° : 9), SNVH (SEC ID N° : 10) , NRAH (SEC ID N°: 11), RKTY (SEC ID N° : 12), RSRY (SEC ID N° : 13), SRYY (SEC ID N° : 14) ., PHRY (SEC ID N° : 15), RSTH (SEC ID N° : 16), SRIY (SEC ID N° : 17), HQRY (SEC ID N° : 18), KQVY (SEC ID N° : 19), AHRY (SEC ID N° : 20), RSRH (SEC ID N° : 21), ARQY (SEC ID N° : 22), RTQY (SEC ID N° : 23), PRYH (SEC ID N° : 24), MRQH (SEC ID N° : 25), SRKY (SEC ID N° : 26), RQKY (SEC ID N° : 27), HAKY (SEC ID N° : 28) , SNRY (SEC ID N° : 29), NTSH (SEC ID N° : 30), SQVY (SEC ID N° : 31), NRVY (SEC ID N° : 32), PRSH (SEC ID N°: 33), RTKY (SEC ID N° : 34), SRYH (SEC ID N° : 35), PRRY (SEC ID N° : 36) , RQKY (SEC ID N° : 37), RYKY (SEC ID N° : 38), VPRH (SEC ID N°: 39), TPKH (SEC ID N° : 40), RSKY (SEC ID N° : 41), SRKY (SEC ID N° : 42), VPRY (SEC ID N° : 43), PRRY (SEC ID N° : 44), RMRH (SEC ID N° : 45), PPRH (SEC ID N° : 46), RQIY (SEC ID N° : 47) y MRQH (SEC ID N° : 48) .

En algunas modalidades, el bucle FG de la proteína de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por YY EADYSQI (SEC ID N° : 49) , YYQEYEYRYI (SEC ID N° : 50) , YYMEEKYAVI (SEC ID N° : 51) , YYAQENYKEI (SE ID N° : 52) , YYKEANYREI (SEC ID N° : 53) , YYAQEEYHII (SEC ID N° : 54) , YYKEADYSQI (SEC ID N° : 55) , YYEQVEYREI (SEC ID N° : 56) , YYEQPIYATI (SEC ID N° : 57) , YYEQVEYREI (SEC ID N° : 58) e YYSEELYKYI (SEC ID N° : 59).

El dominio 10Fn3 puede comenzar con alteraciones de aminoácidos. Por ejemplo, una secuencia MG adicional puede estar situada en el extremo N-terminal de un dominio Fn3. La M usualmente se escindirá, dejando a la G en el extremo N-terminal. En algunas modalidades, las secuencias pueden situarse en el extremo C-terminal del dominio 10Fn3. Por ejemplo, la PEGilación dirigida a sitio en donde un conector que contiene cisteína tal como GSGC (SEC ID N° : 101) se agrega al extremo C-terminal. Alternativamente, la PEGilación de la cola del extremo C-terminal que se da en la naturaleza que se ha mutado cambiando la Ser a una Cys para un conector que contiene cisteína EIDKPCK (SEC ID N° : 102). Ejemplos de la adnectina anti-IL-23 de la invención que comprenden el conector GSGC incluyen ATI001014, ATI001015, ATI001016, ATI001044, ATI001045 y ATI001047. ATI000934 es un ejemplo de la adnectina anti-IL-23 de la invención que comprende el conector EIDKPCQ.

En algunas modalidades, la proteína de la invención comprende una secuencia de bucle de las secuencias de bucle BC mostradas en las SEC ID N°s: 2-6, una secuencia bucle de DE mostrada en las SEC ID N°s: 7-48, una secuencia bucle de FG mostrada en las SEC ID N°s: 49-59. En algunas modalidades, la proteína de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de bucle BC, DE y FG de por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 o 100% idéntica a una cualquiera de las SEC ID N°s: 2-59.

Adicionalmente, una persona experimentada en la técnica reconocerá que las secuencias de bucles BC mostradas en las SEC ID N°s: 2-6 comparten un motivo de secuencia común GHYPXiHX2 (SEQ ID N°: 257) en donde Xi es bien M o bien L y X2 es bien I o bien V y las secuencias de bucle FG mostradas en las SEC ID N°s: 49-59 comparten un motivo de secuencia común YYX3X3X3X3YX3X31 (SEC ID N° : 258) en donde X3 puede ser cualquier aminoácido. Sería posible por lo tanto generar Adnectinas adicionales que se unen a IL-23 con bucles de BC que se ajustan a la secuencia consenso GHYPX1.HX2 y/o con otros bucles de FG, fuera de aquellos enumerados explícitamente en la SEC ID N°s: 49-59, que se ajustan al patrón YYX3X3X3X3YX3X31.

En algunas modalidades, la Adnectina anti-IL-23 comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEC ID N°s: 60-100. En algunas modalidades, la Adnectina anti-IL-23 comprende la secuencia de aminoácidos de dominio Fn3 de la posición 3-96 de una cualquiera de las SEC ID N°s: 60-100. En algunas modalidades, la Adnectina anti-IL-23 comprende la secuencia de aminoácidos idéntica en por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 o 100% a cualquiera de las SEC ID N°s: 60-100. En algunas modalidades, la Adnectina anti-IL-23 comprende la secuencia de aminoácidos idéntica en por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 o 100% a la secuencia de aminoácidos de la posición 3-96 de una cualquiera de las SEC ID N°s: 60-100.

En algunas modalidades, la Adnectina anti-IL-23 puede pegilarse y/o contener una marca de His. Como se usa en el presente documento, ATI000934 se refiere a una proteína en la que las secuencias de bucle son idénticas a aquellas de la construcción 1571G06 (Sec ID 87) y la proteína contiene los residuos EIDKPCQ en el extremo C-terminal en donde la proteína está pegilada y contiene una marca de His. ATI001014 se refiere a una proteína en la que las secuencias de bucle son idénticas a aquellas de la construcción 1571G04 (Sec ID 86) y la proteína contiene un conector GSGC en el extremo C-terminal en donde la proteína está pegilada y contiene una marca de His. ATI001015 se refiere a una proteína en la que las secuencias de bucle son idénticas a aquellas de la construcción 1572G06 (Sec ID 91) y la proteína contiene un conector GSGC en el extremo C-terminal en donde la proteína está pegilada y contiene una marca de His. ATI001016 se refiere a una proteína en la que las secuencias de bucle son idénticas a aquellas de la construcción 1490B03 (Sec ID 79) y la proteína contiene un conector GSGC en el extremo C-terminal en donde la proteína está pegilada y contiene una marca de His. ATI001044 se refiere a una proteína en la que las secuencias de bucle son idénticas a aquellas de la construcción 1490B03 (Sec ID 79) y la proteína contiene un conector GSGC en el extremo C-terminal, pero la proteína no está pegilada y no hay marca de His. ATI001045 se refiere a una proteína en la que las secuencias de bucle son idénticas a aquellas de la construcción 1490B03 (Sec ID 79) y la proteína contiene un conector GSGC en el extremo C-terminal en donde la proteína está pegilada; y no hay marca de His. ATI001047 se refiere a una proteína en la que las secuencias de bucle son idénticas a aquellas de la construcción 1571G04 (Sec ID 86) y la proteína contiene un conector GSGC en el extremo C-terminal en donde la proteína está pegilada; y no hay marca de His.

La fibronectina se une de forma natural a ciertos tipos de integrinas por su motivo de unión a integrinas, "arginina-glicina-ácido aspártico" (RGD) . En algunas modalidades, el polipéptido comprende un dominio de 10Fn3 que carece del motivo de unión a integrina (RGD) .

Fracciones farmacocinéticas En un aspecto, la solicitud proporciona Adnectina anti-IL-23 que comprende adicionalmente una fracción farmacocinética (PK) . Las farmacocinéticas mejoradas pueden evaluarse de acuerdo con la necesidad terapéutica percibida. A menudo es deseable incrementar la biodisponibilidad y/o incrementar el tiempo entre dosis, posiblemente incrementando el tiempo que una proteína permanece disponible en el suero después de administrar dosis. En algunos ejemplos, es deseable mejorar la continuidad de la concentración de proteína en suero a lo largo del tiempo (por ejemplo, disminuir la diferencia en concentración sérica de la proteína apenas después de la administración y apenas antes de la siguiente administración) . La Adnectina anti-IL-23 puede unirse a un resto que reduce la velocidad de aclaramiento del polipéptido en un mamífero (por ejemplo ratón, rata, o ser humano) en más de tres veces en relación a la Adnectina no modificada. Otras medidas de valores farmacocinéticos incrementados incluyen semivida sérica, que a menudo está dividida entre una fase alfa y una fase beta. Bien una de ellas o bien ambas fases pueden mejorarse significativamente por adición de un resto apropiado.

Las fracciones que tienden a ralentizar el aclaramiento de una proteína de la sangre, referidos en el presente documento como "fracciones PK" , incluyen fracciones de polioxialquileno, por ejemplo, polietilenglicol , azúcares (por ejemplo, ácido siálico) y fracciones de proteínas bien toleradas (por ejemplo, Fe, fragmentos de Fe, transíerrina, o seroalbúmina) .

En algunas modalidades, la fracción PK es una proteína de unión a inmunoglobulinas séricas tal como aquellas descritas en la Publicación de los Estados Unidos N°s 2007/0178082 y 2007/0269422.

En algunas modalidades, la fracción PK es una proteína de unión a inmunoglobulinas séricas tal como aquellas descritas en la Publicación de los Estados Unidos N° 2007/0178082.

En algunas modalidades, la fracción de Adnectina comprende polietilenglicol (PEG) . Una o más moléculas de PEG pueden unirse en diferentes posiciones en la proteína y tal unión puede lograrse por reacción con aminas, tioles u otros grupos reactivos adecuados. El resto de amina puede ser, por ejemplo, una amina primaria que se encuentra en el extremo N-terminal de un polipéptido o un grupo amina presente en un aminoácido, tal como lisina o arginina. En algunas modalidades, la fracción de PEG está unido en una posición en el polipéptido seleccionada del grupo constituido por: a) el extremo N-terminal; b) entre el extremo N-terminal y la cadena beta o la lamina similar a. beta más N-terminal; c) un bucle situado en una cara del polipéptido opuesto al sitio de unión al objetivo; d) entre el extremo C-terminal y la cadena beta o la cadena similar a beta más C-terminal; y e) en el extremo C-terminal .

La pegilación se puede llevar a cabo por pegilación dirigida a sitio, en la que un grupo reactivo adecuado se introduce dentro de la proteína para crear un sitio en donde tiene lugar la pegilación preferencialmente . En algunas modalidades, la proteína se modifica para introducir un residuo de cisteína en la posición deseada, permitiendo la pegilación dirigida a sitio en la cisteína. La PEG puede variar ampliamente en peso molecular y puede ser ramificada o lineal.

En algunas modalidades, la Adnectina comprende un dominio Fn3 y una fracción PK. En algunas modalidades, el dominio Fn3 es un dominio 10Fn3. En algunas modalidades, la fracción PK incrementa la semivida en suero del polipéptido en más de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 400, 600, 800, 1000% o más en relación al dominio Fn3 solo.

En algunas modalidades, la fracción PK es un azúcar polimérico. En algunas modalidades, la fracción PK es un azúcar polimérico. En algunas- modalidades, la fracción PK es una proteína de unión a seroalbúmina . En algunas modalidades, la fracción PK es una seroalbúmina humana. En algunas modalidades, la fracción PK es una proteína de unión a inmunoglobulina . En algunas modalidades, la fracción PK es transferrina . En algunas modalidades, la fracción PK es otra Adnectina específica para una proteína de suero.

Caracterización Biofísica y Bioquímica La solicitud proporciona Adnectina que comprende un dominio Fn3 que se une a la subunidad pl9 de IL-23. Como se muestra en la Tabla 1 y en el Ejemplo 4, la unión polipeptídica a una molécula diana puede evaluarse en términos de constantes de equilibrio (por ejemplo, de disociación, KD) y en términos de constantes cinéticas (por ejemplo, constante de velocidad de asociación, Kon y constante de velocidad de disociación, koff) . Una Adnectina se unirá generalmente a una molécula con una KD de menos de 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM, 100 p , aunque se pueden tolerar valores de KD más altos cuando la Koff es lo suficientemente baja o cuando la Kon es lo suficientemente alta .

Las secuencias de bucle BC, DE y FG de la familia de Adnectina anti-IL-23 de la invención están presentes en la Tabla 1 más adelante, así como la SEC ID N° de longitud total correspondiente.

Tabla 1: Familia de Adnectina Anti-IL-23 5 15 5 5 10 ?Procedimiento para determinaciones de afinidad: El anticuerpo anti-histidina, mAb050 (RnD System, M ) se diluyó hasta 20 g/ml en acetato 5.0 y se inmovilizó a -9000 UL en células de flujo 1 y 2 en una superficie de chip de CM5 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los experimentos de plasmón de superficie se llevaron a cabo en HBS-EP (Hepes 10 mM NaCl 150 mM EDTA 3 nM Tensioactivo P20 al 0.05%) a 25 °C. IL-23 se inyectó sobre Adenectinas capturadas de mAb anti-histidina durante 2 minutos seguidos por una fase de disociación de 10 minutos. La evaluación de la especificidad de unión se completó usando software de evaluación de Biacore T100. Procedimientos detallados adicionales se describen en el Ejemplo 4.

La caracterización de Adnectina anti-IL-23 adicional se describe en la Tabla 2.

Tabla 2: Adnectina Anti-IL-23 CI5o/CE5o (n.d.: no determinado) (Procedimientos detallados descritos en el Ejemplo 4) .

Tecnología de fusión de ácidos nucleicos -proteínas En un aspecto, la solicitud proporciona Adnectina que comprende dominios de fibronectina de tipo III que se unen a la · subunidad pl9 de IL-23. Una manera de fabricar y probar rápidamente los dominios de Fn3 con propiedades de unión específicas es la tecnología de fusión de ácido nucleico-proteína de Adnexus, a Bristol-Myers Squibb R&D Company. Esta descripción utiliza la expresión in vitro y la tecnología de marcado, llamada PROfusion™, que explota fusiones de proteínas-ácidos nucleicos (fusiones de ARN-proteína y de ADN-proteína) para identificar polipéptidos novedosos y motivos de aminoácidos que son importantes para unir las proteínas. La tecnología de fusión de ácidos nucleicos-proteínas es una tecnología que acopla covalentemente una proteína por su información genética codificada. Para una descripción detallada de la tecnología de fusión ARN-proteína y de los procedimientos de rastreo de proteínas de andamiaje basadas en fibronectina véase Szostak et al., Patentes de los Estados Unidos N°s: 6,258, 558; 6,261, 804; 6,214,553; 6,281,344; 6,207,446; 6,518,018; 6,818,418; y Roberts y Szostak, Proc. Nati. Acad. Sci. 94: 12297-12302, 1997, incorporadas en el presente documento por referencia.

Modalidades de Vectores y Polinucleótidos Los ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las diversas proteínas o polipéptidos revelados en el presente documento se pueden sintetizar químicamente. El uso de codón puede seleccionarse para mejorar la expresión en una célula. Tal uso del codón dependerá del tipo celular seleccionado. Los patrones de uso de codón especializado se han desarrollado para E. coli y otras bacterias, así como células de mamíferos, células vegetales, células de levaduras y células de insectos. Véase por ejemplo: Mayfield et al., Proc. Nati Acad Sci U.S.A. 21 de enero de 2003; 100(2): 438-42; Sinclair et al. Protein Expr Purif. octubre de 2002; 26(1): 96 -105; Connell ND . Curr Opin Biotechnol . octubre 2001; 12(5): 446-9; Makrides et al. Microbiol Rev. septiembre 1996; 60(3): 512-38; y Sharp et al. Yeast . octubre 1991 Oct;7(7) :657-78.

Se describen técnicas generales para manipulación de ácidos nucleicos por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volúmenes 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed., 1989, o F. Ausubel et al., Current Protocole in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley- Interscience : Nueva York, 1987) y actualizaciones periódicas, incorporadas en el presente documento por referencia. Generalmente, el ADN que codifica el polipéptido está unido operativamente a elementos transcripcionales o traduccionales adecuados derivados de genes de mamíferos, virales, o de insectos. Tales elementos reguladores incluyen un promotor transcripcional , una secuencia operadora opcional para controlar transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión ribosómica a ARNm adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y de la traducción. La capacidad para replicar en un huésped, usualmente conferida por un origen de replicación y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de t ansformantes se incorporan adicionalmente .

Las proteínas descritas en el presente documento se pueden producir recombinantemente no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferiblemente una secuencia señal u otros polipéptidos que tienen un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia señal heterologa seleccionada preferiblemente es una que se reconoce y procesa (es decir, se escinde por una señal peptidasa) por la célula huésped.

Para células huésped procariotas que no reconocen ni procesan una secuencia nativa señal, la secuencia señal está sustituida por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa , lpp, o secuencias líderes de enterotoxina II estables.

Para secreción de levaduras la secuencia señal nativa se puede sustituir mediante, por ejemplo, la secuencia líder de invertasa de levaduras, un factor líder (incluyendo factores líderes alfa de Saccharomyces y Kluyveromyces) , o secuencia líder de fosfatasa ácida, la secuencia líder de glucoamilasa de C. albicans, o la señal descrita en la Patente de los EE.UU. 5,631,144. En la expresión de células de mamíferos, las secuencias señal de mamíferos así como las secuencias líderes secretoras virales, por ejemplo, la señal gD del virus herpes simplex gD, están disponibles. El ADN para tales regiones precursoras puede estar ligado en fase de lectura al ADN que codifica la proteína.

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación esta secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación de secuencias que se replican de forma autónoma. Tales secuencias se conocen bien por una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para bacterias gram-negativas , el origen del plásmido de 2 micrómetros es adecuado para origen de levaduras y para diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamíferos. Generalmente, el componente de origen de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamíferos (el origen de SV40 se puede usar típicamente sólo porque contiene el promotor temprano) .

Los vectores de expresión y de clonación pueden contener un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable . Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o traciclina, (b) deficiencias autotróficas del complemento, o (c) nutrientes críticos de suministro no disponibles de medios de complejos, por ejemplo, el gen de racemasa que codifica D-alanina para Bacilos.

Los vectores de expresión y de clonación contienen usualmente un promotor que se reconoce por el organismo huésped y está operativamente unido al ácido nucleico que codifica la proteína de la invención, por ejemplo, una proteína de andamiaje basada en fibronectina . Los promotores adecuados para usar con huéspedes procariotas incluyen el promotor phoA, sistemas promotores de beta-lactamasa y de lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor de Tan. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para usar en sistemas bacterianos contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica la proteína para la invención. Las secuencias promotoras se conocen también para eucariotas . Virtualmente todos los genes de eucariotas tienen una región rica en AT aproximadamente 25 a 30 bases anterior en la cadena del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases antes del origen de transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas está una secuencia AATAAA que puede ser una señal para adición de cola de poli-A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias están apropiadamente insertadas en vectores de expresión eucariotas .

Ejemplos de secuencias promotoras apropiadas para usar con huéspedes de levaduras incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas , tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fos of uctoquinasa , glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, priruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa .

La transcripción a partir de vectores en células huésped de mamíferos se puede controlar, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tales como Adenovirus 2), papilomavirus bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus , un retrovirus, virus de la hepatitis-B y lo más preferiblemente Virus de los Simios 40 (SV40) , a partir de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina , a partir de promotores de choque térmico, dado que tales promotores son compatibles con los sistemas de células huésped.

La transcripción de proteínas codificantes de ADN de la invención por eucariotas superiores se incrementa a menudo insertando una secuencia potenciadora en el vector. Muchas secuencias potenciadoras se conocen ahora a partir de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, alfa-feto proteína e insulina) . Típicamente, sin embargo, alguien usará un potenciador de un virus celular eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado más adelante del origen de replicación (pares de bases 100-270) , el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus , el potenciador de polioma en el lado más adelante del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) en elementos potenciadores para activación de promotores eucariotas . El potenciador puede unirse en el vector en una posición 5' o 3' a la secuencia que codifica el péptido, pero está localizada preferiblemente en un sitio 5' desde el promotor.

Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (por ejemplo, células de levadura, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos, o células nucleadas de otros organismos pluricelulares) contendrán también secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles a partir de las regiones no traducidas de ADN o de ADNc eucariota en 5', y, ocasionalmente, en 3', o a partir de las regiones no traducidas de ADN o de ADNc virales en 5', y,' ocasionalmente, en 3'. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida de ARNm que codifica la proteína de la invención. Un componente de terminación de la transcripción es la región de poliadenilación de hormonas del crecimiento bovinas. Véase el documento W094/11026 y el vector de expresión descrito en el mismo.

El ADN recombiiante puede incluir también cualquier tipo de secuencia de marca de proteína que puede ser útil para purificar la proteína. Los ejemplos de marcas de proteína incluyen pero no se limitan a una marca de histidina, una marca de FLAG, una marca de myc, una marca de HA, o una marca de GST . Se pueden encontrar vectores de clonación y expresión para usar con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levaduras y de mamíferos en Cloning Vectors : A Laboratory Manual, (Elsevier, Nueva York, 1985), la descripción de los cuales se incorpora en el presente documento por referencia.

La construcción de expresión se introduce dentro de la célula huésped usando un procedimiento apropiado para la célula huésped, como será evidente para alguien con oficio en la técnica. Se conocen en la técnica una diversidad de procedimientos para introducir ácidos nucleicos dentro de células huésped, incluyendo, pero no limitadas a, electroporación; transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles ; lipofección; e infección (donde el vector es un agente infeccioso) .

Las células huésped apropiadas incluyen procariotas, levaduras, células de mamífero o células bacterianas. Las bacterias apropiadas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacillus spp. Se puede usar también para producción de polipéptidos levadura, preferiblemente del género Saccharomyces , tales como S. cerevisiae. Diversos sistemas de cultivo de células de insectos o de mamíferos se pueden emplear también para expresar proteínas recombinantes . Los sistemas de baculovirus para producción de proteínas heterólogas en células de insecto se revisan por Luckow et al., (Bio/Technology, 6: 47,. 1988). Ejemplos de líneas celulares de mamíferos huésped incluyen líneas celulares de células endoteliales , células de riñon de mono C08-7, CV-1, células L, C127, 3T3 , ovario de hámster chino (CHO) , células de riñon embrionario humano, HeLa, 293, 293T y BHK. Se preparan polipéptidos purificados cultivando sistemas de huésped/vector adecuados para expresar las proteínas recombinantes. Para muchas aplicaciones, el pequeño tamaño de muchos de los polipéptidos revelados en el presente documento haría la expresión en E. coli el procedimiento preferido para la expresión. La proteína se- purifica después a partir de medios de cultivo o de extractos celulares.

Producción de Proteínas Las células huésped se transforman con la expresión descrita en el presente documento de vectores de clonación para producción de proteínas y se cultivan en medios de nutrientes convencionales modificados para producción de proteínas y cultivados en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. En los ejemplos mostrados aquí, las células huésped usadas para producción de proteínas de alto rendimiento (HTPP, por sus siglas en inglés) y de producción de escala media fue la cepa bacteriana BL21 DE3 plysS. Las células huésped usadas para producir las proteínas de esta invención pueden cultivarse en una diversidad de medios, tales como aquellos descritos en Ham et al., Meth. Enzymol . 58: 44 (1979), Barites et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), Patentes de los Estados Unidos N°s 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 5,122,469; 6,048,728; 5,672,502; o Patente de los Estados Unidos N° RE30,985. Cualquier otro suplemento necesario se puede incluir en concentraciones apropiadas que serían conocidas para las personas experimentadas en la técnica. Las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH y similares, son aquellas usadas previamente con la célula huésped seleccionada para expresión, y serán evidentes para la persona experimentada en la técnica.

Las proteínas descritas en el presente documento pueden producirse también usando sistemas de traducción celulares. Para tales propósitos los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido deben modificarse para permitir transcripción in vitro para producir ARNm y para permitir traducción libre de células del ARNm en el sistema libre de células particular que se está utilizando (eucariota tal como sistema de traducción libre de células de mamíferos o de levaduras o procariota tal como un sistema de traducción libre de células bacteriano).

Las proteínas de la invención pueden producirse también por síntesis química (por ejemplo, por los procedimientos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed. , 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL) . Se pueden producir también modificaciones a la proteína por síntesis química.

Las proteínas de la presente invención pueden purificarse por procedimientos de aislamiento/purificación para proteínas generalmente conocidas en el campo de la química de proteínas. Los ejemplos no limitantes incluyen extracción, recristalización, precipitación de proteínas por sales (por ejemplo con sulfato de amonio o con sulfato de sodio), centrifugación, diálisis, ultrafiltración, cromatografí de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía en fase normal, cromatografía en fase inversa, filtración de gel, cromatografía de permeación de gel, cromatografía de afinidad, electroforesis , distribución a contracorriente o cualquier combinación de éstos. Después de purificación, los polipéptidos se pueden intercambiar en diferentes soluciones amortiguadoras y/o se pueden concentrar por cualquiera de una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, filtración y diálisis. Él polipéptido purificado está preferiblemente por lo menos puro al 85%, o está preferiblemente por lo menos puro al 95% y lo más preferiblemente por lo menos puro al 98%. Sin tener en cuenta el valor numérico exacto de la pureza, el polipéptido está suficientemente puro para usar como un producto farmacéutico.

Se usó un proceso de elaboración de plataformas para preparar Adnectina anti-IL-23. El ejemplo 1 describe un ejemplo del procedimiento de elaboración. La Adnectina se produce en Escherichia coli (E. coli) . Las células E. coli MG1655 se transformaron con vector de expresión (pBMS2008/ATI001044) que produce la proteína en una forma insoluble como cuerpos de inclusión. La cepa recombinante se cultiva en termentadores de tanque agitado. Al final de la fermentación los cuerpos de inclusión se recogen, se solubilizan y se vuelven a plegar en la preparación para purificación. La Adnectina purificada está conjugada con un metoxi-PEG ramificado de 40 kDa usando un conector de maleimida. El material conjugado se repurifica subsiguientemente para eliminar PEG libre, Adnectina libre e impurezas relacionadas con el producto. La modalidad de pruebas de control de calidad se lleva a cabo en la mayor parte de sustancia fármaco.

Usos terapéuticos in vivo En un aspecto, la solicitud proporciona Adnectina anti-IL-23 útil en el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como lupus (por ejemplo lupus eritematoso, nefritis de lupus) , tiroiditis de Hashimoto, mixedema primario, enfermedad de Graves, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmune, enfermedad de Addison, diabetes (por ejemplo diabetes mellitus dependiente de insulina, diabetes mellitus de tipo I), síndrome de Goodpasture, miastenia gravis, pénfigo, enfermedad de Crohn, oftalmía simpática, uveitis autoinmune, esclerosis múltiple, anemia hemolítica autoinmune, trombocitopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis de acción crónica, colitis ulcerosa, síndrome de Sjógren, enfermedades reumáticas (por ejemplo, artritis reumatoide) , polimiositis , escleroderma y enfermedad del tejido conectivo mixta.

La solicitud también proporciona métodos para administrar Adnectinas anti-IL-23 a un sujeto. En algunas modalidades, el sujeto es un ser humano. En algunas modalidades, las Adnectinas anti-IL-23 son farmacéuticamente aceptables para un mamífero, en particular para un ser humano. Un polipéptido "farmacéuticamente aceptable" hace referencia a un polipéptido que se administra a un animal sin consecuencias médicas adversas significativas, tal como esencialmente libre de endotoxinas o que tiene niveles muy bajos de endotoxinas.

Formulación y Administración La solicitud proporciona adicionalmente composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden la Adnectina anti-IL-23 descrita en el presente documento, en las que la composición está esencialmente libre de endotoxina. Las formulaciones terapéuticas que comprenden Adnectina anti-IL-23 se preparan para almacenamiento mezclando la Adnectina descrita que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de soluciones acuosas, liofilizadas u otras formulaciones secadas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metilparabeno o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como seroalbúmina , gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextranos; agentes quelantes tales como EDTA, azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de proteínas de Zn) ; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, PLURONIC® o polietilenglicol (PEG) .

Las formulaciones en el presente documento pueden contener también más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, preferiblemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan adversamente unas a otras. Tales moléculas están presentes apropiadamente en combinación en cantidades que son efectivas para los propósitos deseados.

Las formulaciones a usarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto puede lograrse fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

La persona experimentada en la técnica entenderá que la dosificación de cada agente terapéutico será dependiente de la identidad del agente.

Para aplicaciones terapéuticas, la Adnectina anti-IL-23 se administra a un sujeto, en una forma posológica farmacéuticamente aceptable. Pueden administrarse intravenosamente en forma de una inyección intravenosa rápida o por infusión continua durante un periodo de tiempo, o por vías subcutáneas. Los vehículos, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados, se conocen bien y se pueden determinar por las personas experimentadas en la técnica de acuerdo con las garantías de la situación clínica. Ejemplos de vehículos, diluyentes y/o excipientes adecuados incluyen: (1) Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, (2) solución salina al 0.9% (NaCl al 0.9% p/v) y (3) dextrosa al 5% (p/v) .

El procedimiento de la presente invención se puede practicar in vitro, in vivo, o ex vivo.

La administración de Adnectina anti-IL-23 y de uno o más agentes terapéuticos adicionales, si se coadministran o si se administran secuencialmente , puede tener lugar como se describe anteriormente para aplicaciones terapéuticas. Los vehículos, diluyentes y excipientes para coadministración se entenderá por la persona experimentada en la técnica que dependen de la identidad del agente terapéutico particular que se esté administrando.

Cuando está presente en una forma de dosificación acuosa, más que liofilizada, la · roteína se formulará típicamente a una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a 100 mg/ml, aunque se permite variación amplia fuera de estos intervalos . Para el tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de Adnectina anti-IL-23 dependerá del tipo de enfermedad a tratarse, de la gravedad y del curso de la enfermedad, si la Adnectina se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, del curso de la terapia anterior, de la historia clínica del paciente y de la respuesta a la Adnectina del paciente y de la discreción del médico que atiende. La proteína se administra apropiadamente al paciente en una vez o durante una serie de tratamientos .

Fusiones de Adnectina de Unión a Seroalbúmina (SABA, por sus siglas en inglés) En ciertos aspectos, la solicitud proporciona proteínas de fusión que comprenden Adnectina anti-IL23 fusionada con dominios 10Fn3 que se unen a seroalbúmina humana (una Adnectina de Unión a Seroalbúmina (domibnio 10Fn3) o SABA) . Tales proteínas de fusión han prolongado semividas en suero en presencia de albúmina en relación a la Adnectina anti-IL23 sola .

En ciertos aspectos, la solicitud proporciona proteínas de fusión que comprenden dominios 10Fn3 que se unen específicamente a seroalbúmina, por ejemplo, seroalbúmina humana (HSA, por sus siglas en inglés) para prolongar la tx/2 de la proteína de fusión.

En ciertas modalidades, la semivida sérica de la Adnectina anti-IL-23 condensada a la SABA se incrementa en relación a la semivida de la Adnectina anti-IL-23 cuando no está conjugada a la SABA. En ciertas modalidades, la semivida sérica de la fusión de SABA es por lo menos 20, 40, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1500, 1800, 1900, 2000, 2500, o 3000% más larga en relación a la semivida sérica de la Adnectina anti-IL-23 cuando no está condensada a la SABA. En otras modalidades, la semivida sérica de la fusión de SABA es por lo menos 1.5 veces, 2 veces, 2.5 veces, 3 veces, 3.5 veces, 4 veces, 4.5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 10 veces, 12 veces, 13 veces, 15 veces, 17 veces, 20 veces, 22 veces, 25 veces, 27 veces, 30 veces, 35 veces, 40 veces, o 50 veces más grande que la semivida en suero de la Adnectina anti-IL-23 cuando no está condensada a la SABA. En algunas modalidades, la semivida en suero de la fusión de SABA es por lo menos 10 horas, 15 horas, 20 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, 50 horas, 60 horas, 70 horas, 80 horas, 90 horas, 100 horas, 110 horas, 120 horas, 130 horas, 135 horas, 140 horas, 150 horas, 160 horas, o 200 horas.

Por lo tanto, las moléculas de fusión de SABA descritas en el presente documento son útiles para incrementar la semivida de Adnectina anti-IL23 creando una fusión entre Adnectina anti-IL23 y la SABA. Tales moléculas de fusión se pueden usar para tratar las afecciones que. responden a la actividad biológica de IL23. La presente invención contempla el uso de moléculas de fusión de SABA en enfermedades causadas por la desregulación de IL-23.

La fusión puede formarse uniendo Adnectina anti-IL23 a cada extremo de la molécula de SABA, es decir, disposiciones SABA-Adnectina anti-IL23 o Adnectina anti-IL23-SABA.

En un aspecto, la descripción proporciona proteínas de fusión que comprenden Adnectina anti-IL23 que comprende un dominio 10Fn3 de unión a seroalbúmina. En modalidades ejemplares, las proteínas de 10Fn3 de unión a seroalbúmina descritas en el presente documento se unen a HSA con una ¾ de menos de 3 uM, 2.5 µ?, 2 µ?, 1.5 µ?, 1 µ?, 500 nM, 100 nM, 50 p?, 10 ??, 1 ??, 500 ??, 100 ??, 100 ??, 50 ?? o 10 ??. En ciertas modalidades ejemplares, las proteínas de 10Fn3 de unión a seroalbúmina descritas en el presente documento se unen a HSA con una ¾ de menos de 3 µ?, 2.5 µ?, 2 µ?, 1.5 µ?, 1 µ?, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 500 M, 100 pM. 100 M, 50 pM o 10 pM a un intervalo de pH de 5.5 a 7.4 a 25°C o 37°C. En algunas modalidades, las proteínas de 10Fn3 de unión a seroalbúmina descritas en el presente documento se unen muy estrechamente a HSA a un pH de menos de 7.4 cuando se compara con la afinidad de unión para HSA a un pH de 7.4 o mayor.

En ciertas modalidades, las proteínas de fusión que comprenden dominios 10Fn3 de unión a HSA descritos en el presente documento pueden también unir seroalbúmina a partir de uno o más de mono, rata, o ratón. En ciertas modalidades, las proteínas de 10Fn3 de unión a seroalbúmina descritas en el presente documento se unen a seroalbúmina de macaco de la India (RhSA) o a seroalbúmina de macaco de Java (CySA) con una ¾ de menos de 3 uM, 2.5 µ?, 2 µ?, 1.5 µ?, 1 µ?, 500 ??, 100 ??, 50 ??, 10 ??, 1 ??, 500 ? o 100 ?.

En ciertas modalidades, las proteínas de fusión que comprenden dominios 10Fn3 de unión a seroalbúmina descritas en el presente documento se unen al dominio I y/o al dominio II de la HSA. En una modalidad, las proteínas de fusión que comprenden dominios 10Fn3 de unión a seroalbúmina descritas en el presente documento no se unen al dominio III de la HSA.

En ciertas modalidades, la parte 10Fn3 de unión a seroalbúmina (SABA) de las proteínas de fusión comprende una secuencia que tiene por lo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% u 85% de identidad con el dominio 10Fn3 natural (SEC ID N° : 1). En una modalidad, por lo menos uno de los bucles BC, DE, o FG se modifica en relación al dominio de 10Fn3 natural. En otra modalidad, por lo menos dos de los bucles BC, DE, o FG se modifica en relación al dominio de 10Fn3 natural. En otra modalidad, todos los tres de los bucles BC, DE, o FG se modifica en relación al dominio de 10Fn3 natural . En otras modalidades, una SABA comprende una secuencia que tiene por lo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de identidad a una cualquiera de las 26 secuencias de SABA de núcleo mostradas en la Tabla 3 (es decir, SEC ID N° : 103, 107, 111, 115, 119 y 123-143) o cualquiera de las secuencias SABA prolongadas mostradas en la Tabla 3 (en este caso, SEC ID N° : 188-215, menos la marca de 6 x HIS) .

En ciertas modalidades, los residuos de aminoácidos del núcleo están fijos y cualquier sustitución, sustitución conservadora, deleción o adición tienen .lugar en residuos distintos a los residuos aminoacídicos de núcleo. .En modalidades ejemplares, los bucles BC, DE y FG se reemplazan con polipéptidos que comprenden las secuencias de bucles BC, DE y FG de cualesquiera de las sustancias que se unen a HSA mostrados en la Tabla 3 a continuación (en este caso, SEC ID N°s: 103, 107, 111, 115, 119 y 123-143 en la Tabla 3) .

En ciertas modalidades, se puede modificar una SABA (por ejemplo, una secuencia de núcleo de SABA o una secuencia basada en ella como se describe anteriormente) para comprender una secuencia de extensión N-terminal y/o una secuencia de extensión C-terminal. Las secuencias de extensión ejemplares se muestran en la Tabla 3. Por ejemplo, la SEC ID N° : 188 designada como SABAl.l comprende la secuencia de SABA 1 de núcleo (SEC ID N° : 103) con una secuencia N-terminal GVSDVPRDLE (SEC ID N° : 144, designada como AdNTl) y una secuencia C-terminal EIDKPSQ (SEC ID N° : 153). SABAl.l comprende adicionalmente una marca de His6 en el extremo C-terminal, sin embargo, se entendería que la marca de His6 es completamente opcional y se puede situar en cualquier sitio dentro de las secuencias de extensión N- o C-terminales. Adicionalmente, cualquiera de las secuencias de prolongación N- o C-terminal ejemplares proporcionada en la Tabla 3 (SEC ID N° : 144-163), y cualquier variante, pueden usarse para modificar cualquier secuencia núcleo de SABA dada proporcionada en la Tabla 3.

En otras modalidades, las secuencias de cola se pueden combinar con otras secuencias de conector conocidas (por ejemplo, SEC ID N°s: 164-187 en la Tabla 3) como sea necesario cuando se diseña una molécula de fusión SABA.

Conectores de Conjugación Las fusiones de SABA pueden estar unidas covalentemente o no covalentemente. En algunas modalidades, un 10Fn3 de unión a seroalbúmina puede estar unido directamente o indirectamente a una molécula heteróloga por medio de un conector polipeptídico. Los conectores apropiados para unir Fn3 son aquellos que permiten los dominios separados para plegar independientemente unos de otros formando una estructura tridimensional que permite unión de alta afinidad a una molécula objetivo.

La descripción proporciona una serie de conectores adecuados que cumplen estos requerimientos, incluyendo conectores basados en glicina-serina, conectores basados en glicina-prolina, así como el conector que tiene la secuencia de aminoácidos PSTSTST (SEC ID N° : 184) . Los Ejemplos descritos en el presente documento demuestran que los dominios de Fn3 unidos por medio de conectores polipeptídicos mantienen su función de unión al objetivo. En algunas modalidades, el conector es un conector basado en glicina-serina. Estos ligandos comprenden residuos de glicina y serina y pueden estar entre 8 y 50, 10 y 30 y 10 y 20 aminoácidos en longitud. Ejemplos incluyen conectores que tienen una secuencia de aminoácidos (GS)7 (SEC ID N° : 171), G(GS)6 (SEC ID N° : 166), y G(GS)6 (SEC ID N° : 168). Otros conectores contienen ácido glutámico, e incluyen, por ejemplo, (GSE)5 (SEC ID N° : 173) y GGSE GGSE (SEC ID N° : 177) . Otros conectores de glicina-serina ejemplares incluyen (GS)4 (SEC ID N° : 170), (GGGGS) 7 (SEC ID N° : 179), (GGGGS) 5 (SEC ID N° : 180), (GGGGS) 3G (SEC ID N° : 181). En algunas modalidades, el conector es un conector basado en glicina-prolina. Estos ligandos comprenden residuos de glicina y prolina y pueden estar entre 3 y 50, 10 y 30 y 3 y 20 aminoácidos en longitud. Ejemplos incluyen conectores que tienen una secuencia de aminoácidos (GS)3G (SEC ID N° : 182), (GP)5G (SEC ID N° : 183). En otras modalidades, el conector puede ser un conector basado en prolina-alanina que tiene entre 3 y 30, 10 y 30, y 3 y 20 aminoácidos de longitud. Ejemplos de conectores basados en prolina alanina incluyen, por ejemplo, (PA)3 (SEC ID N° : 185), (PA)6 (SEC ID N° : 186), y (PA)9 (SEC ID N° : 187). Se contempla que la longitud de conector óptima y la composición de aminoácidos óptima se pueden determinar por experimentación de rutina por procedimientos bien conocidos en la técnica.

En algunas modalidades, las fusiones descritas en el presente documento están unidas por medio de un conector polipeptídico que tiene un sitio de proteasa que es escindible por una proteasa en la sangre o en el tejido objetivo. Tales modalidades se pueden usar para liberar una proteína terapéutica para mejor suministro o para mejores propiedades terapéuticas o para producción más eficiente.

Se pueden introducir conectores o espaciadores adicionales en el extremo C-terminal de un dominio Fn3 entre el dominio Fn3 y el conector polipeptídico. Los conectores o espaciadores adicionales se pueden introducir en el extremo N-terminal de un dominio Fn3 entre el dominio Fn3 y el conector polipeptídico.

En algunas modalidades, un resto terapéutico puede estar unido directamente o indirectamente a una SABA por medio de un conector polimérico. Los conectores poliméricos se pueden usar para variar óptimamente la distancia entre cada componente de la fusión para crear una proteína de fusión con una o más de las siguientes características: 1) impedimento estérico reducido o incrementado de uno o más dominios proteicos cuando se unen a una proteína de interés, 2) estabilidad o solubilidad de proteínas incrementada, 3) agregación proteica disminuida y 4) avidez o afinidad general incrementada de la proteína.

En algunas modalidades, se une una fracción terapéutica a SABA por medio de un polímero biocompatible tal como un azúcar polimérico. El azúcar polimérico puede incluir un sitio de escisión enzimático que es escindible por una enzima en la sangre o en el tejido objetivo. Tales modalidades se pueden usar para liberar proteínas terapéuticas para mejor suministro o para mejores propiedades terapéuticas o para producción más eficiente.

Sumario de Secuencias de Adnectinas de Unión a Seroalbúmina (SABA) Muchas de las secuencias referenciadas en esta solicitud se resumen en la Tabla 3 más adelante. A menos que se especifique lo contrario, todas las prolongaciones N-terminales están indicadas con un subrayado simple, todas las colas/prolongaciones C-terminales están indicadas con un subrayado doble, y las secuencias de conector están dentro de un rectángulo. Las regiones de bucles BC, DE y FG están sombreadas para cada secuencia SABA de núcleo.

Tabla 3. Sumario de secuencias ejemplares de SABA Ej emplos Ejemplo 1 Proceso de Elaboración Fermentación y Cosecha Una fermentación de producción se prepara con medio basal estéril. Se descongela y se usa un vial para inocular un recipiente de transferencia que contiene medio de crecimiento. El inoculo se transfiere inmediatamente a la fermentación de producción. El cultivo se mantiene a temperatura de 34°C con agitación y se deja crecer hasta que se alcanza una D060o de 5-10 (una unidad de DO es aproximadamente lxlO9 células/ml) . La adición de medio de alimentación se inicia a esta DO. La fermentación se lleva a cabo a D06oo = 25 punto en el que se induce el cultivo produciendo la Adnectina por la adición de ß-D-l-tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) . La temperatura del recipiente se incrementa desde 34°C hasta 39°C al tiempo de la inducción. Las muestras se toman asépticamente cada hora y se ponen a prueba con respecto a la densidad celular.

Después de 9-12 horas de fermentación inducida el recipiente se prepara para cosecha reduciendo la temperatura a 25°C, por adición de ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) a una concentración final de hidróxido de sodio y por reducción de agitación. Después de un periodo de retención de una hora el contenido en el termentador se vacía en un recipiente de cosecha.

Preparación de Cuerpos de Inclusión La alteración celular de la acumulación de cosecha se hace haciendo pasar el material a través de un microfluidif icador MICROFLUIDIZER® que altera las células y libera sus contenidos. Después de la alteración celular los cuerpos de inclusión se recogen usando una centrífuga de discos separando fases sólidas y líquidas en un proceso continuo por fuerzas centrífugas extremadamente altas. Los cuerpos de inclusión se lavaron después dos veces con solución amortiguadora (20-25°C) y dos veces con agua (20-25°C) . Cada vez los cuerpos de inclusión lavados se recogen por centrifugación. Los cuerpos de inclusión lavados se recuperaron como una suspensión.

Solubilización de los Cuerpos de Inclusión y Replegamiento de las Proteínas La solución amortiguadora de solubilización se agrega a la suspensión de cuerpos de inclusión seguido por agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. Se marca como objetivo durante este proceso una D02so = 20.

El replegamiento de proteínas se lleva a cabo usando un procedimiento de dilución en dos etapas. Se agrega solución amortiguadora de dilución a los cuerpos de inclusión solubilizados a una proporción de una parte de cuerpos de inclusión solubilizados frente a media parte de solución amortiguadora de dilución (v/v) . Una segunda dilución se lleva a cabo agregando cuerpos de inclusión solubilizados para solución amortiguadora de replegamiento marcando como objetivo una D02eo = 0- (proteína total). Las diluciones se llevan a cabo mientras se agita a temperatura ambiente. Después de mezcla cuidadosa durante una hora, la agitación se detiene y la solución de proteínas se mantiene a temperatura ambiente durante toda una noche. La Adnectina solubilizada y replegada se hace pasar a través de un filtro de 0.8 µ?t?-0.22 pm y se prueba para contenido en proteínas por A28o y HPLC en fase inversa.

Purificación y Conjugación a PEG La Adnectina replegada y filtrada se carga directamente sobre una columna de intercambio catiónico (CEX1) para captura inicial. El material unido se lava con solución amortiguadora de lavado y se eluye con acetato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 500 mM, propilenoglicol al 1.5%, pH 5.5. El acumulo de eluido se somete a ensayos de pureza, identidad, concentración y endotoxina.

El eluido de la cromatografía de captura se purifica adicionalmente usando cromatografía de interacción hidrófoba (HIC, por sus siglas en inglés) . El eluido de CEX1 se carga directamente en la columna de HIC, se lava y subsiguientemente se eluye con acetato de sodio 50 mM, propilenoglicol al 30%, pH 5.5. El acúmulo de eluido se somete a ensayos de pureza, identidad y concentración.

La Adnectina purificada se formatea después directamente con un derivado de maleimida de un PEG ramificado de 40 kDa (mPEG2-MAL) . El eluido de HIC se agita a temperatura ambiente y se agrega la mPEG2-MAL. Después de 1 hora de mezclar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se deja incubar durante toda una noche a la misma temperatura. La solución de PEGilación se procesó después en la columna de CEX final (CEX2) . Se tomaron muestras para contenido en proteínas, pureza y endotoxina.

El pH y la conductividad de la solución de PEGilación se ajustan a 4.0 y a 1.0 ms/cm respectivamente, con ácido acético 75 mM antes de cargar en la columna de intercambio catiónico (CEX2) para repurificación. Una vez cargado, el material unido se lavó con solución amortiguadora y se eluyó subsiguientemente con acetato de sodio 50' mM, cloruro de sodio 25 mM, pH 5.0. Se tomaron muestras para contenido en proteínas, pureza y endotoxina.

El eluido de CEX2 se concentra a 15 mg/ml en una unidad de filtración de flujo tangencial equipada con una membrana de límite de peso molecular nominal de 30 kDa con un tamiz V. La sustancia de fármaco en bruto en acetato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 25 mM, pH 5.0, se hace pasar a través de un filtro de 0.22 µ?? y se congela a -80°C.

Ejemplo 2 Gen, Vector y Célula Huésped Se generó un plásmido que codifica la proteína bajo el control del promotor T7 para usar en construcción de cepa. Este ADN de plásmido se usó transformando células de E. coli K-12 MG1655 competentes (F-lambda-, ilvG-rfb-50 rph-1) . La cepa huésped se diseñó para permitir inducción de expresión a partir de genes durante la adición de IPTG. La cepa MG1655 transformada es resistente a kanamicina. El vector de expresión de proteínas se muestra en la Figura 2. Se usa una selección de colonias simple de placas inoculando un cultivo de fermentación del que se toman alícuotas y se congela usándose como un banco de células de investigación.

Ejemplo 3 Caracterización Biofísica y Bioquímica La estructura y calidad de la proteína de la invención se examinó por varios procedimientos analíticos comprensivos. EM-MALDI Los perfiles espectrales de masas se analizaron por MALDI . Para evaluar la precisión de los análisis de MALDI en las muestras, se situaron 20 puntos individuales en la placa de acero para cada muestra y se analizaron secuencialmente .

Se generaron un total de 20 espectros.

Mapeado de Péptidos Se usó el mapeado de péptidos confirmando la expresión correcta de la secuencia de aminoácidos (estructura primaria) predicha a partir de la secuencia de ADNc para la proteína de la invención así como para la proteína desPEGilada correspondiente. Con el fin de obtener la cobertura de la secuencia completa, se emplearon tripsina (escisión al lado C-terminal de los residuos de Lys y Arg) y endoproteasa Glu-C (escisión en el lado C-terminal de los residuos de Glu) proporcionando dos grupos solapantes de fragmentos peptídicos. Se usó mapeo peptídico determinando modificaciones postraduccionales covalentes que incluyen metionina N- terminal residual, formación de puentes disulfuro, desamidación de asparragina, oxidación de metionina (etc.). Los péptidos se identificaron y caracterizaron por cromatografía liquida-espectrometría de masas (CL-EM) por medio de peso molecular y espectrometría de masas en tándem (MS/MS) que proporciona información de secuencias parcial por medio de disociación inducida por colisión (CID, por sus siglas en inglés) .

SDS-PAGE Se usó electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE, por sus siglas en inglés) visualizando patrones de formación de bandas de Adnectinas anti-IL-23 desPEGiladas y PEGiladas. Las muestras se prepararon en una solución amortiguadora de muestra con o sin un agente reductor. Después de calentar en SDS, las muestras y los marcadores de peso molecular se analizaron electroforáticamente en geles de poliacrilamida de gradiente (4-20%), premoldeados . Después de electroforesis , los geles se fijaron y tiñeron usando Azul de Coomassie. La equivalencia de los patrones de formación de bandas de muestras se evaluó visualmente .

Cromatografía de Exclusión por Tamaño/Dispersión Lumínica de Muí i -Ángulo (SECMALS, por sus siglas en inglés) Se usó cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) para el análisis cuantitativo de especies monoméricas, de Alto Peso Molecular (HMW) y de Bajo Peso Molecular (LM , por sus siglas en inglés) . Después la separación de SEC, se determinó la masa molecular de especies separadas por dispersión lumínica multiángulo en tándem con un refractómero diferencial.

Ejemplo 4 Farmacología No Clínica In vi tro KD por SPR Las características de unión se caracterizaron por Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR, por sus siglas en inglés) . Se inmovilizó IL-23 de ser humano a dos niveles diferentes en una dimensión de superficies de chips de Proteon XPR (Bio-Rad) y se expuso a 6 concentraciones diferentes de adnectinas anti-IL-23 en la otra dimensión de la misma superficie de chip de SPR. Esto permitió determinación cinética en ausencia de regeneración. Se usaron chips duplicados para determinaciones cinéticas a 25 °C y a 37°C. Se llevó a cabo evaluación de parámetros cinéticos usando el modelo de interacción de Langmuir y el ajuste de parámetro constante con el software de ProteOn Manager.

Como se muestra en la Tabla 4 más adelante, las velocidades de disociación para estas adnectinas anti-IL-23 son lentas (del orden de 10"5 s"1) a 25°C. Incluso a 37°C las velocidades de disociación están cerca del límite de detección para tecnologías de SPR de tal forma que es posible que las medidas de constantes de disociación estén subestimadas.

Tabla 4: Parámetros cinéticos de adnectina anti-IL-23 frente a IL-23 humana inmovilizada directamente Afinidad de Fase de Solución La afinidad de solución de ATI001045 para IL-23 humana se midió usando un Ensayo de Exclusión Cinética (KinExA) . En un formato las valoraciones duplicadas de hIL-23 se llevaron a cabo para cada una de tres concentraciones. La concentración de ATI001045 no unida relativa se midió por captura en una matriz sólida IL-23 humana seguida por detección con un anticuerpo marcado fluorescentemente que reconoce el andamiaje de Adnectina. Debido a las limitaciones técnicas, la concentración más baja que puede probarse fue 0.75 nM. Así, mientras que el análisis de KD global mostrado en la Tabla 5, da una estimación de 51 pM para la KD, la afinidad podría ser tan baja como un solo dígito de pM o tal alta como 150 pM en un intervalo de confianza de.l 95%.

Tabla 5: Medidas de afinidad de fase en solución para ATI001045 La afinidad de solución de ATI001045 y ATI001047 para IL-23 humana se midió también usando un formato alternado en KinExA. Se llevaron a cabo valoraciones duplicadas de adnectinas para cada una de tres concentraciones (ATI001045) o para concentraciones individuales (ATI001047) de IL-23 humana (cuadruplicadas para la concentración más baja) . La concentración de IL-23 humana no unida relativa se midió por captura en una matriz sólida de ATI001045 no pegilada seguida por detección con un anticuerpo marcado fluorescentemente que reconoce la subunidad p40 de IL-23. El análisis de KD global mostrado en la Tabla 6 da una KD de 9.4 pM con un intervalo de confianza de 95% de 22-2.4 pM para ATI001045 y una KD de 36.3 pM con un intervalo de confianza del 95% de 60.1 a 19.4 pM.

Tabla 6 : Medidas de afinidad de fase en solución Fosforilación de STAT3 en Células Kit225 Parham et al. ("A receptor for the heterodimeric cytokine IL-23 is composed of IL-12Rbetal and a novel cytokine receptor subunit, IL-23R" . J Immunol . 1 de junio de 2002; 168(11) : 5699-708) clonaron la IL-23R a partir de la línea de células T dependiente de IL-2 humana, Kit225. Estas células se han caracterizado para expresión tanto de IL-12RB1 como de IL-23R por análisis de FACS y respondieron a IL-23 por estimulación de pSTAT3 y a IL-12 por estimulación de pSTAT4. Las células Kit225 se sembraron en placas de 96 pocilios y entraron en quiescencia en la ausencia de FBS e IL-2 durante 3 horas a 37°C. Después de esta incubación, se aplicó la IL-23 recombinante (o la IL-23 preincubada con antagonista durante 1 hora) y las células se devolvieron al incubador durante 15 minutos a 37 °C para estimular la fosforilación de STAT3 (abreviada como p-STAT3) . Cada condición se ensayó por duplicado en placas de 96 pocilios. La estimulación se detuvo situando las células en hielo y por adición de PBS enfriado en hielo. Finalmente, las células se sedimentaron y se lisaron tras protocolos estándares y la producción de pSTAT3 se detectó por ELISA.

La concentración óptima de la IL-23 para estimulación fue 35 pM. Se demostró la inhibición de la pSTAT3 inducida por 11-23 por una titulación de anticuerpo monoclonal anti-p40 (mAbl510) así como un anticuerpo policlonal anti-pl9 (AF1716) . ATI001045, ATI001047, ATI001014 y ATI001016 tienen actividad equivalente con una CI5o de -300 pM, aproximadamente 150 veces más potente que el anticuerpo policlonal anti-pl9 mientras ATI001015 tiene una CI50 de -1.2 nM, aproximadamente 40 veces más potente el anticuerpo monoclonal anti-pl9. La Adnectina ATI000934 es 1/3 de la potencia de ATI001045, con una-CIso de 1 nM (Tabla 7) .

Tabla 7: Inhibición de IL-23 indujo fosforilación de STAT3 por antagonistas anti- IL-23 Fosforilación de STAT3 en PBMC Humanas Un ensayo confirmador basado en células secundarias se desarrolló con la meta de evaluar fosforilación de STAT3 como un mecanismo de acción en células humanas primarias. Las células mononucleares humanas periféricas (PBMC, por sus siglas en inglés) de seres humanos sanos consisten principalmente en linfocitos T que no han sido tratadas previamente y quiescentes que expresan nominalmente niveles bajos de IL-23R y no responden apreciablemente cuando se estimulan con IL-23 exógena. Sin embargo, la activación policlonal de PBMC que no han sido tratadas previamente con IL-2 resultan en activación y diferenciación de linfocitos T que no han sido tratados previamente con expresión de IL-23R incrementada subsiguientemente de IL-23R. Estos linfocitos activados son después susceptibles a estimulación con IL-23 exógena que active la ruta de STAT, dando como resultado fosforilación de STAT3.

Los anticuerpos comercialmente disponibles (AF1716, un pAb anti-pl9 y Mabl510, un mAb anti-p40, ambos de R&D Systems) se usaron como controles positivos para inhibición de fosforilación de STAT3 inducida por IL-23. La actividad inhibidora de seis adnectinas se comparó en diez experimentos por separado usando sangre de múltiples donantes (resumidos en Tabla 8) . Los datos ejemplares para un subgrupo se muestran en la Figura 4. Las adnectinas anti-IL-23 fueron significativamente (> 150 veces) más potentes que la anti-pl9 en inhibición de fosforilación de STAT3 pero similares a 5 veces menos potentes que el anticuerpo monoclonal anti-p40.

Tabla 8: Inhibición de PBMC pSTAT3 mediante antagonistas anti-IL-23 Producción de Citocinas Inducida por IL-23 por Esplenocitos de Ratón Se diseñaron ensayos celulares iniciales con células primarias para evaluar la capacidad de adnectinas anti-IL-23 para inhibir la secreción de citocinas dependiente de IL-23 desde linfocitos Thl7 murinos . Para diferenciar linfocitos Thl7 murinos por análisis, se enriquecieron linfocitos T CD4+ con perlas magnéticas, se co-cultivaron con esplenocitos irradiados y se activaron con anti-CD3 en presencia de TGF-ß e IL-6 y anticuerpos neutralizantes por IL-4 e IFN-?. Después de 6 días en cultivo, los linfocitos Thl7 polarizados se recogieron, se re-sembraron en una placa de 96 pocilios y se estimularon con IL-23 humana a 100 ng/ml y con IL-2 murina a 5 ng/ml. La adición de IL-2 se requirió para mantener la' viabilidad celular y para permitir producción de citocinas sólida en respuesta a IL-23 pero no indujeron fuertemente producción de IL-17A o de IL-22 solas. Debido a que IL-2 induce un nivel bajo de secreción de citocinas, cada grupo de muestras incluyó células estimuladas con IL-2 sola controlando niveles básales de citocina producidos en la ausencia de IL-23. La respuesta dependiente de IL-23 se evaluó calculando la diferencia entre el nivel de citocina inducida por la combinación de IL-2 e IL-23 y el nivel de línea base inducido por IL-2 sola. Se . añadió un intervalo de dosis de adnectinas durante la re-estimulación de los linfocitos Thl7 con IL-2 e IL-23 para poner a prueba su potencial inhibidor. Un intervalo de dosificación de anticuerpo anti-p40 humano (MAB1510 de R&D Systems) se hizo funcionar en paralelo en forma de controles positivos evaluando inhibición de IL-23. Cada condición se puso a prueba en pocilios triplicados de una placa de 96 pocilios. Después de 4 días, los medios condicionados a partir de los triplicados se almacenaron, se vaciaron de restos celulares y se sometieron a ensayo tanto para concentraciones de IL-17A como para concentraciones de IL-22 por ELISA.

La estimulación de linfocitos Thl7 con IL-2 e IL-23 indujo un incremento de 2 a 3 veces de IL-17A y por lo menos una potenciación de 5 veces de IL-22 comparada con los niveles inducidos por IL-2 sola. ATI000934, ATI001014, ATI001015, ATI001016, ATI001045 y el anticuerpo monoclonal anti-p40 de control positivo mediaron un decrecimiento dependiente de dosis en secreción de IL-17A e IL-22 dependiente de IL-23. Los valores de CI50 para inhibición de secreción tanto de IL-17A como de IL-22 se calcularon para cada adnectina así como el control anti-p40 y estos datos se resumieron en la Tabla 9. Todas las adnectinas probadas fueron dentro de dos veces tan potentes como el control anti-p40 para inhibición de secreción de IL-17A dependiente de IL-23 y fueron dentro de 2 a 3 veces tan potentes para inhibición de producción de IL-22 dependiente de IL-23.

Tabla 9: Inhibición de citocinas dependientes de IL-23 por Adnectinas anti-IL-23.

Producción de Citocinas Inducida por IL-23 por células T Humanas Se obtuvieron PBMC por separación de gradiente de densidad de sangre completa tratada con EDTA de donantes sanos normales. Las células T se prepararon a partir de fracciones de E+ de PBMC circundadas con glóbulos rojos de oveja (SRBC, por sus siglas en inglés) . Las células T se plaquearon a 100,000 células por pocilio en placas de fondo plano de 96 pocilios que se recubrieron con anti-CD3 (OKT a 10 yg/ml) durante 1 hora a 37°C y se lavaron con PBS . Se prepararon mezclas de RPMI-FCS conteniendo anti-CD28 (9.3 a 1 vg/ml) e IL-?ß (10 ng/ml) o IL-?ß + IL-23 (1 ng/ml) . Esta combinación de citocinas se ha mostrado que promueve la diferenciación de células T humanas en linfocitos T secretoras de IL-17. Se añadió concentración de partida de ATI001045, de 1 pg/ml a la mezcla conteniendo IL-?ß + IL-23. IL-17 se detectó en sobrenadantes usando kits de desarrollo de ELISA de Duoset ( &D Systems) . ATI001045 inhibió producción de IL-17 con una CE50 de 2.0 ± 1.6 nM (n = 4 donantes diferentes), usando la IL-?ß sola como antecedente. El anticuerpo anti-p40 comercial (MAB1510) se usó como un control interno e inhibió la producción de IL-17 con una CE50 de 2.2 ± 1.4 nM (n = 3) . Los datos ejemplares del donante 228 se muestran en la Figura 6.

Selectividad de Adnectina Anti-IL-23 para IL-23 sobre IL-12 ATI001016, la versión marcada con His6 de ATI001045, se usó examinando la selectividad bioquímica para con IL-23/IL-12. El análisis de unión implicó la captura de- Adnectinas anti-IL-23 en anticuerpo anti-His inmovilizado seguido por flujo de IL-23 o de IL-12 sobre la Adnectina. La selectividad de Adnectinas para IL-23 se evaluó comparando la señal de unión para una concentración 100 veces más alta de IL-12 sobre IL-23. Como se muestra en la Figura 7 ATI001016 presentó unión sólida (-40 RU) hacia IL-23 humana 10 nM mientras que no se observó unión detectable para IL-12 humana 1 µ?.

Las células NK-92 son una línea celular de linfocitos citolíticos naturales humanos que responden a IL-12 en una manera dependiente de IL-2 segregando IFN-?. Las células se lavan típicamente eliminando IL-2 después se siembran en placas de 96 pocilios, después se tratan con IL-12 humana recombinante 25 pM (o con IL-12 preincubada con antagonistas) y se incuban durante 20 horas adicionales. Los sobrenadantes aclarados se sometieron a ensayo para IFN-? por ELISA.

Se preparó una serie de diluciones de 5 veces empezando en 5 µ , de 4 puntos, de cada uno de los clones de adnectina enumerados en Tabla 2 e incubados con IL-12 25 pM durante 30 minutos a 37 °C antes de la adición a células NK-92. Se incubaron series de diluciones de 5 veces empezando en 5 µ , de 12 puntos, de ATI001045 y de ATI001016 con IL-12 25 pM durante 30 minutos a 37°C antes de la adición a- células NK-92. Ninguno de los clones enumerados en la Tabla 2 ni ATI001045 ni ATI001016 inhibieron detectablemente secreción de IFN-? a cualquiera de las concentraciones probadas demostrando que estas adnectinas anti-IL-23 no inhiben la interacción de IL-12 con los receptores en la superficie de los linfocitos NK-92. Ellas parecen equivalentes a un control negativo y a un anticuerpo policlonal anti-pl9 100 nM . Como un control positivo, el anticuerpo monoclonal anti-p40 (mAbl510) inhibió secreción de IFN-? inducida por IL-2 con una CI50 de 0.07 nM (Figura 8) .

Adnectina Anti-IL-23 Bloquea IL-17 inducida por IL-23 en un Modelo Farmacodinámico Se inyectaron intraperitonealmente (IP) ratones C57B1/6 hembra con IL-2 murina recombinante y con IL-23 humana de acuerdo con el siguiente programa.

Tabla 10: Programa de Dosificación e Inyección Todos los ratones se sometieron a eutanasia 7 - 8 horas después de la dosis final de IL-2 e IL-23 a Tiempo = 30 h. El suero se recogió y se sometió a ensayo para IL-17 e IL-23 por ELISA.

La IL-23 humana se une al receptor de ratón e induce la producción de citocinas tales como IL-17 e IL-22. Esplenocitos de animales a los que se han administrado intraperitonealmente (IP) dosis de IL-2 y IL-23 humana segregan IL-17 cuando se estimulan en cultivo ex vivo con anti-CD3e de ratón. Se pueden detectar niveles significativos de IL-17 en el suero de animales que se sometieron al régimen de tratamiento descrito en la Tabla 14 en el que los ratones C57B1/6 se ceban con IL-2 24 horas antes de 3 inyecciones duales de IL-2 + IL-23 durante un espacio de tiempo adicional de 24 horas. Presumiblemente, IL-2 activa y expande policlonalmente las poblaciones de Th in situ y regula por incremento la expresión del receptor IL-23. Esto proporciona un procedimiento en donde los mecanismos de acción de fármacos y la relación entre la concentración de fármacos y el efecto en un marco in vivo se puede investigar. El modelo se validó con un anticuerpo monoclonal anti-p40, mAbl510 (datos no mostrados). En ocho experimentos separados, se pusieron a prueba cinco adnectinas anti-IL-23 para su capacidad para inhibir la producción de IL-17 murina cuando se administraron subcutáneamente a 0.5, 0.15, 0.05 y 0.015 mg/kg 2 horas antes de la dosis inicial de IL-2 + IL-23 en dos experimentos por separado. Los datos de respuesta a dosis ejemplar para ATI001045 se muestran en la Figura 9a (DE50 promedio calculada de 0.03 mg/kg) . Todas las adnectinas anti-IL-23 probadas mostraron inhibición dependiente de la dosis de producción de IL-17 murina IL-23 humana en suero aunque la extensión de la inhibición fue variable por las adnectinas. Actividad de ATI001045 en el Modelo de Acantosis Cutánea Inducido por IL-23 La inyección intradérmica de IL-23 dentro de la piel de la espalda o dentro del pabellón auricular del oído externo de ratones indujo inflamación dérmica e hiperplasia de la epidermis (acantosis) (Yang Zheng Interlueukin-22, a TH17 cytoquine, mediates IL-23-induced termal inflammation and acanthosis, Nature Vol . 445/8 de febrero de 2007). En estos estudios, la IL-23 humana recombinante (rHuIL-23) se inyectó dentro de los oídos de los ratones explorando las consecuencias posteriores de exposición a 11-23 cutánea aberrante .

Se inyectaron ratones hembra C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad con 5 pg de IL-23 humana bicatenaria, recombinante, dentro del oído derecho cada dos días hasta el Día 12. Se inyectó PBS dentro del oído contra-lateral como un control. En un estudio, el tratamiento con ATI001045 comenzó aproximadamente 2 horas entes de la primera inyección de IL-23 y se continuó 3 veces por semana hasta el Día 12. ATI001045 se administró CS a dosis de 0.1, 0.3, 1.3 mg/kg. En un segundo estudio se administró IP vehículo o ATI000934 -123 (1753E02) a l, 3, o 10 mg/kg aproximadamente 1 hora antes de administración de IL-23 y tres veces por semana a partir de entonces hasta el Día 10. Se dio IP Anticuerpo anti-HUIL-12/IL-23 p40 (mAbl510 de R&D) a 10 mg/kg en el Día 0 y en el Día 4 como un control positivo. El grosor del oído (en milésimas de pulgada) se midió cada dos días, antes de la primera inyección en el oído siguiente, usando un calibrador de cuadrante de Mitutoyo (#2412F) . Se calculó el grosor del oído sustrayendo el valor del oído control de la medida para el oído inyectado por IL-23 para cada animal. Al final del estudio (Día 14 para ATI01045 y Día 12 para ATI000934) , después de eutanasia con gas C02, los oídos se escindieron en el nacimiento del pelo y los tejidos fijados en formalina/embebidos en parafina se examinaron histológicamente en portaobjetos teñidos con H&E.

En general, las dosis de 1, 3 y 10 mg/kg de ATI000934 proporcionaron un nivel similar de inhibición de engrosamiento de oreja inducido por IL-23 en este estudio (Figuras 10A-10B) . El grosor de la oreja en todos los grupos de tratamiento fue significativamente (p < 0.01 ANOVA/de Dunnette) menos que con Vehículo, incluyendo el grupo anti-p40, a partir del Día 5 hasta el final del estudio en el Día 12. En el Día 12, las muestras de plasma terminales se obtuvieron 48 horas después de la última dosis y se analizaron para niveles circulantes de ATI000934 que se determinó que eran 11, 18, 36 pg/ml respectivamente.

Después de la última medida en el Día 12, se recogieron las orejas en la necropsia para examen histológico de rutina a partir de 10 animales por grupo. La mayoría de los animales administrados con ATI000934 tuvieron acantosis e infiltrados dermales, pero la valoración de gravedad histológica se redujo a partir de aquella observada en animales tratados con vehículo. No hubo respuesta a dosis evidente. Todos los animales administrados con anti-p40 también tuvieron acantosis e infiltrados dérmicos, pero la valoración de gravedad histológica se redujo también a partir de aquella observada en animales tratados con vehículo.

ATI001045 (a 1 mg/kg y a 3 mg/kg) redujo de forma dependiente de la dosis el grosor de la oreja comparado con los animales tratados con vehículo (PBS) desde el Día 5 hasta el Día 14 (p < 0.01 frente a Vehículo ANOVA/Dunnett ' s , Figura 10) . En contraste, el nivel de dosis de 0.1 mg/kg no fue estadísticamente diferente (p > 0.05) del tratamiento con vehículo en un día de estudio. Las muestras de suero recogidas 48 horas después de la última dosis se evaluaron para niveles circulantes de ATI01045 que se determinó que eran 0.698, 2.72, 8, 22.5 yg/ml para dosis de 0.1, 0.3, 1, 3 mg/kg respectivamente. Los análisis histológicos revelaron que la administración de ATI001045 dio como resultado una reducción de dosis dependiente de infiltrados celulares y acantosis inducidos por IL-23 con valoración de grosor del oído .

Ej emplo 5 Material y Procedimientos Usados En el Presente Documento Producción de Proteínas de Alto Rendimiento (HTPP) El aglutinante seleccionado se clonó dentro del vector PET9d y se transformó en células de E. coli BL21 DE3 pLysS que se inocularon en 5 mi de medio LB que contiene 50 g/ml de kanamicina en un formato de 24 pocilios y se cultivaron a 37°C durante toda una noche. Cultivos de 5 mi de medio LB fresco (kanamicina a 50 µ9/??1) se prepararon para expresión inducible por aspiración de 200 µ? a partir del cultivo durante toda una noche y se dispensaron dentro del pocilio adecuado. Los cultivos se cultivaron a 37°C hasta A600 0.6-0.9. Después de la inducción con isopropil^-tiogalactósido (IPTG) con 1 mM el cultivo se expresó durante 6 horas a 30°C y se recogieron por centrifugación durante 10 minutos a 2750 g a 4°C.

Se lisaron la pelotillas celulares (en formato de 24 pocilios) . por resuspensión en 450 µ? de solución amortiguadora de Lisis (NaH2P04 50 mM, NaCl 0.5 M, Cóctel Inhibidor de Proteasas Completo- libre de EDTA lx (Roche) , PMSF 1 mM, CHAPS 10 mM, Imidazol 40 mM, lisozima a 1 mg/ml , ADNsa a 30 pg/ml , aprotonina a 2 µg/ml, pH 8.0) y se agitaron a temperatura ambiente durante 1-3 horas. Los lisados se aclararon y se volvieron a sacudir en un formato de 96 pocilios por transferencia en un Whatman GF/D Unifilter de 97 pocilios ajustado con una placa de captación de 12 mi, de 96 pocilios y filtrado mediante presión positiva. Los lisados aclarados se transfirieron a una Placa Quelante de Ni de 96 pocilios que se había equilibrado con tampón de equilibración (NaH2P04 50 mM, NaCl 0.5 M, Imidazol 40 mM, pH 8.0) y se incubaron durante 5 min. El material no unido se retiró mediante presión positiva. La resina se lavó 2 x 0.3 ml/pocillo con solución amortiguadora de lavado N° : 1 (NaH2P0 50 mM, NaCl 0.5 M, CHAPS 5 mM, Imidazol 40 mM, pH 8.0) con cada lavado eliminado mediante presión positiva. Antes de la elución cada pocilio se lavó con solución amortiguadora de Elución de 50 µ? (PBS + EDTA 20 mM) , se incubó durante 5 minutos y este lavado se eliminó mediante presión positiva. La proteína se eluyó aplicando 100 µ? de solución amortiguadora de elución adicionales a cada pocilio. Después de una elución de 30 minutos a temperatura ambiente la(s) placa (s) se centrifugó/centrifugaron durante 5 minutos a 200 g y la proteína eluida se recoge en placas de captación de 96 pocilios que contienen 5 µ? de MgCl2 0.5.M agregados al fondo de la placa de captación antes de la elución. La proteína eluida se cuantificó usando un ensayo de BCA con SGE como el estándar proteico.

Expresión y purificación a mediana escala de ligantes de proteínas de andamiaje basadas en fibronectina insolubles Para expresión, el/los clon(es) seleccionado (s) , seguido (s) por la marca de HIS6, se clonó/clonaron en un vector pET9d y se expresó/expresaron en células de E.coli BL21 DE3 pLysS. Se usaron veinte mi de un cultivo de inoculo (generado a partir de una colonia plaqueada individual) inoculando 1 litro de medio LB o de Medios de Expresión Durante Toda Una Noche de TB (auntoinducción) que contiene carbenicilina a 50 µg/ml y cloranfenicol a 34 µg/ml . Los cultivos en medio LB se incubaron a 37 °C hasta A600 0.6-1.0 tiempo en el que se indujeron con isopropil-p-tiogalactósido (IPTG) y se cultivaron durante 4 horas a 30°C. Los cultivos cultivados en Medios de Expresión Durante Toda Una Noche de TB se incubaron a 37 °C durante 5 horas tiempo al que se la temperatura se bajó a 18 °C durante 19 horas. Los cultivos se recogieron por centrifugación durante 30 minutos a = 10000 g a 4°C. Los sedimentos celulares se congelaron a -80 °C. El sedimento celular se volvió a suspender en 25 mi de solución amortiguadora de lisis (NaH2P04 20 mM, NaCl 0.5 M, Cóctel Inhibidor de Proteasa Completo- libre de EDTA lx (Roche) , pH 7.4) usando un homogeneizador Ultra-turrax (IKA works) en hielo. La lisis celular se logró por homogeneización a alta presión (> 124.110 103, pascales (18.000 psi)) usando un Microfluidif icador MICROFLUIDIZER® Modelo M-110S (Microfluidics) . La fracción insoluble se separó por centrifugación durante 30 minutos a > 23.300 g a 4°C. El sedimento insoluble recuperado por centrifugación del lisado se lavó con fosfato de sodio 20 mM/NaCl 500 mM, pH 7.4. El sedimento se volvió a solubilizar en clorhidrato de guanidina 6.0 M en fosfato de sodio 20 mM/NaCl 500 M pH 7.4 con sonicación seguida por incubación a 37 grados durante 1-2 horas. El sedimento resolubilizado se filtró a 0.45 µp? y se cargó sobre una columna Histrap equilibrada con solución amortiguadora de pH 7.4 de fosfato de sodio 20 mM/NaCl 500 M/guanidina. Después de cargar, la columna se lavó por 25 CV adicionales con la misma solución amortiguadora. La proteína unida se eluyó con Imidazol 50 mM en fosfato de sodio 20 mM/NáCl 500 mM/guan-HCl 6.0 M pH 7.4. La proteína purificada se volvió a plegar por diálisis frente a acetato de sodio 50 mM/NaCl 150 mM pH 4.5 o PBS pH 7.2.

Expresión y purificación a mediana escala de aglutinantes de proteínas de andamiaje basadas en fibronectina solubles Como una alternativa a la purificación de aglutinantes insolubles, se puede usar también la purificación de aglutinantes solubles. Para expresión, el/los clon (es) seleccionado (s) , seguido(s) por la marca de HIS6, se clonó/clonaron en un vector pET9d y se expresó/expresaron en células de E.coli BL21 DE3 pLysS . Se usaron veinte mi de un cultivo de inoculo (generado a partir de una colonia plaqueada individual) inoculando 1 litro de medio LB o de Medios de Expresión Durante Toda Una Noche de TB (autoinducción) que contiene carbenicilina a 50 g/ml y cloranfenicol a 34 µg/ml. Los cultivos en medio LB se incubaron a 37°C hasta A600 0.6-1.0 tiempo en el que se indujeron con isopropil-^-tiogalactósido (IPTG) y se cultivaron durante 4 horas a 30°C. Los cultivos cultivados en Medios de Expresión Durante Toda Una Noche de TB se incubaron a 37 °C durante 5 horas tiempo al que se la temperatura se bajó a 18 °C durante 19 horas. Los cultivos se recogieron por centrifugación durante 30 minutos a > 10000 g a 4°C. Los sedimentos celulares se congelaron a -80°C. El sedimento celular se volvió a suspender en 25 mi de solución amortiguadora de lisis (NaH2P04 20 mM, NaCl 0.5 M, Cóctel Inhibidor de Proteasa Completo-libre de EDTA lx (Roche) , pH 7.4) usando un homogeneizador ULTRA-TURRAX® (IKA works) en hielo. La lisis celular se logra por homogeneización a alta presión (> 124.110 103 pascales (18,000 psi) ) usando un Microfluidificador MICROFLUIDIZER® Modelo M-110S (Microfluidics) . La fracción soluble se separa por centrifugación durante 30 minutos a > 23,300 g a 4°C. El sobrenadante se aclara por medio de filtro de 0,45 µp?. El lisado aclarado se carga sobre una columna HISTRAP® (GE) pre-equilibrada con el fosfato de sodio 20 mM/BaCl 500 M pH 7.4. La columna se lava después con 25 volúmenes de columna de la misma solución amortiguadora, seguidos por 20 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM/NaCl 500 M/lmidazol 25 mM, pH 7.4 y después 35 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM/NaCl 500 M/lmidazol 40 mM, pH 7.4. La proteína se eluye con 15 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM/NaCl 500 M/lmidazol 500 mM, pH 7.4, las fracciones se almacenaron en base a absorbancia a A280 y se dializaron contra PBS lx, Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8.5 o NaOAc 50 mM; NaCl 150 mM; pH 4.5. Cualquier precipitado se retiró filtrando a 0.22 µp?.

Las proteínas de andamiaje basadas en fibronectina (Adnectinas) pueden pegilarse con diversos tamaños y tipos de PEG . Para permitir la pegilación, los residuos EIDKPSQ que se dan en la naturaleza, encontrados en el extremo C-terminal de las proteínas 10FN3 se pueden modificar por una mutación puntual individual de un aminoácido, típicamente una serina, a una cisteína. La PEGilación de la proteína en el residuo de cisteína individual se lleva a cabo conjugando diversas formas de PEG derivati zadas de maleimida, combinando el reactivo PEG con la solución de la proteína e incubando. Un procedimiento alternativo es reemplazar la cola de EIDKPSQ con un conector GSGC y de forma similar usar el residuo de cisteína para PEGilación. Las adnectinas que contienen un residuo de cisteína se conjugaron con PEG por medio de química de adición de Michael entre el grupo tiol en la cisteína y el grupo funcional de maleimida del reactivo PEG. Brevemente, se agregan 40 kDa de PEG en un exceso molar para solución de proteínas en condiciones de ligeramente acidas a neutras. La reacción se aplica después a una columna de intercambio iónico para separar la Adnectina PEGilada de la PEG-maleimida no reaccionada y de la Adnectina no PEGilada. Los procedimientos de SE/HPLC se pueden usar también. La Adnectina PEGilada purificada se analiza típicamente por SDS-PAGE y cromatografía de exclusión por tamaño.

Ejemplo 6 Rastreo y selección de Adnectina de unión a seroalbúmina (SABA) candidata Una técnica de selección conocida como PROfusión (ver por ejemplo, Roberts et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA. 94(23): 12297-302, 1997 y O 2008/066752) se aplicó a una biblioteca de ADN con regiones variables diseñadas dentro de los bucles de BC, DE y FG de 10Fn3. Una biblioteca al azar de más de 1013 moléculas se creó a partir de este diseño, y la presión de selección se aplicó contra una forma biotinilada de HSA aislando Adnectina de unión a seroalbúmina (SABA) candidata con propiedades de unión deseables .

Proceso de producción de proteínas de alto rendimiento (HTTP) Las diversas Adnectinas de unión a HSA se purificaron usando un proceso de producción de proteínas de alto rendimiento (HTPP) . Los aglutinantes seleccionados se clonaron en vector pET9d que contiene una marca de HIS6 y se transformaron en células de E. coli BL21 (DE3 ) pLysS . Las células transformadas se inocularon en 5 mi de medio LB que contienen 50 ug/ml de Kanamicina en un formato de 24 pocilios y se cultivaron a 37°C durante toda una noche. Se prepararon cultivos de 5 mi de medio LB recién preparado (50 ug/ml de Kanamicina) para expresión inducible aspirando 200 µ? del cultivo durante toda una noche y dispensándolo dentro del pocilio apropiado. Los cultivos se cultivaron a 37°C hasta A600 0.6-0.9. Después de inducción con isopropil-ß-tiogalactósido (IPTG) 1 mM, el cultivo se cultivó durante otras 4 horas a 30°C y se recogió por centrifugación durante 10 minutos a 3220 x g a 4°C. Los Sedimentos Celulares se congelaron a -80°C.

Los sedimentos celulares (en formato de 24 pocilios) se lisaron por resuspensión en 450 µ? de solución amortiguadora de Lisis (NaH2P04 50 mM, NaCl 0.5 M, Cóctel Inhibidor de Proteasa Completo- libre de EDTA lx (Roche) , PMSF 1 mM, CHAPS 10 mM, Imidazol 40 mM, 1 mg/ml de lisozima, 30 µg/ml de ADNsa, 2 yg/ml aprotonina, pH 8.0) y se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Los lisados se aclararon y se volvieron a sacudir en un formato de 96 pocilios por transferencia en un Whatman GF/D Unifilter de 96 pocilios ajustado con una placa de captación de 650 µ? de 96 pocilios y se centrifugaron durante 5 minutos a 200 x g. Los lisados aclarados se transfirieron a una Placa Quelante de Ni de 96 pocilios que se han equilibrado con solución amortiguadora de equilibrio (NaH2P04 50 mM, NaCl 0.5 M, CHAPS 10 mM, Imidazol 40 mM, pH 8.0) y se incubaron durante 5 minutos. Se retiró el material no unido. La resina se lavó 2 x 0.3 ml/pocillo con solución amortiguadora de lavado N° : 1 (NaH2P04 50 mM, NaCl 0.5 M, CHAPS 5 mM, Imidazol 40 mM , pH 8.0). Después la resina se lavó con 3 x 0.3 ml/pocillo con PBS . Antes de la elución cada pocilio se lavó con solución amortiguadora de Elución de 50 µ? (PBS + EDTA 20 raM) , se incubó durante 5 minutos y este lavado se eliminó mediante vacío. La proteína se eluyó aplicando 100 µ? de solución amortiguadora de elución adicionales a cada pocilio. Después de incubación de 30 minutos a temperatura ambiente las placa (s) se centrifugaron durante 5 minutos a 200 x g y la proteína eluida se recogió en placas de 96 pocilios que contienen 5 µ? de MgCl2 0.5 M fijados al fondo de las placas de Ni. La proteína eluida se cuantificó usando un ensayo de Proteínas de BCA con SGE (Adnectina control) como el estándar proteico. La Adenectina de SGE es un dominio de 10Fn3 natural (SEC ID N° : 1) en el que el dominio de unión a integrinas (aminoácidos RGD en posiciones 78-80) se ha reemplazado con SGE.

ELISA de unión directa a HSA, RhSA y MuSA Para someter a ensayos aglutinantes directos a HSA, se revistieron placas axiSorp™ (Nunc International, Rochester, NY) con 10 pg/ml de HSA (Sigma, San Luís, MO) en PBS a 4°C durante toda una noche seguido por su bloqueo en solución amortiguadora de bloqueo de caseína (Thermo Scientific, Rockford, IL) durante 1-3 horas a temperatura ambiente. Para ensayos de rastreo de un sólo punto, se diluyeron Adnectinas HTPP 1:20 en solución amortiguadora de bloqueo de caseína y se dejaron unir a . HSA en cada pocilio durante 1 hora a temperatura ambiente. Para ensayos de respuesta a dosis, se usaron las concentraciones que varían desde 0.1 nM hasta 1 µ? . Después de lavar en PBST eliminando Adnectinas no unidas, se agregó conjugado mAb-HRP anti-His (R&D Systems, MN) diluido 1:2500 en solución amortiguadora de bloqueo de caseína a la Adnectina marcada con His durante 1 hora a temperatura ambiente. El conjugado en exceso se eliminó lavando con PBST y las Adnectinas unidas se detectaron usando reactivos de detección de TMB (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Identificación de Adnectina de unión a seroalbúmina bovina (SABA) Como un resultado del rastreo de la unión a HSA/RhSA/MuSA y de los criterios biofísicos, se identificaron cuatro únicas ' Adnectinas de unión a seroalbúmina (SABA) y se eligieron para tener evaluadas sus semividas en ratones. Con el fin de llevar a cabo la caracterización in vitro e in vivo, se asumieron escalas intermedias para las cuatro SABA. La tabla 3 proporcionó las secuencias de veintiséis secuencias de núcleo de SABA únicas identificadas a partir de PROfusión, designadas como SABA 1-26. SABA4 tiene una mutación de andamiaje que se fijó antes de realizar la escala intermedia. La versión perfecta en el andamiaje de SABA4 es SABA5. SABA4 y SABA5 tienen secuencias idénticas en los bucles de BC, DE y FG.

Ejemplo 7 Producción y formulación de las SABAs candidatas Producción proteica a mediana escala de SABA Las SABAs seleccionadas seguidas por la marca de His6, se clonaron en un vector pET 9d se expresaron en células de E. coli BL21 (DE3 ) LysS (véase Tabla 3 para cada secuencia de SABA marcada con His designada SABA1.1, SABA2.1 , SABA3.1 y SABA5.1) . Se usaron 20 mi de un cultivo de inoculo (generado a partir de una colonia de placa individual) inoculando 1 litro de medio LB conteniendo 50 ug/ml de Kanamicina. El cultivo se cultivó a 37°C hasta A600 0.6-1.0. Después de inducción con isopropil- ß- tiogalactósido (IPTG) 1 mM el cultivo se cultivó durante otras 4 horas a 30°C y se recogió por centrifugación durante 30 minutos a = 10.000 x g a 4 °C. Los Sedimentos Celulares se congelaron a -80°C. El sedimento celular se volvió a suspender en 25 mi . de solución amortiguadora de lisis (NaH2P04 20 mM, NaCl 0.5 M, Inhibidor de Proteasas Completo- libre de EDTA lx (Roche), pH 7.4) usando un homogeneizador ULTRA-TURRAX® (IKA works) en hielo. La lisis celular se logró por homogeneización a alta presión (= 124.110 103 paséales (18.000 psi)) usando un Microfluidif icador MICROFLUIDIZER® Modelo M-110S (Microfluidics) . La fracción soluble se separó por centrifugación durante 30 minutos a 23.300 x g a 4°C. El sobrenadante se aclaró por medio de filtro de 0.45 µ??. El lisado aclarado se aclaró en una columna HISTRAP® (GE) pre-equilibrada con NaH2P04 20 mM, NaCl 0.5 M, pH 7.4. La columna se lavó después con 25 volúmenes de columna de NaH2P04 20 mM, NaCl 0.5 M, pH 7.4, seguidos por 20 volúmenes de columna de NaH2P04 20 mM, NaCl 0.5 ?,. imidazol 25 mM pH 7.4 y después 35 volúmenes de columna de NaH2P04 20 mM, NaCl 0.5 M, imidazol 40 mM pH 7.4. La proteína se eluyó con 15 volúmenes de columna de NaH2P04 20 mM, NaCl 0.5 M, imidazol 500 mM pH 7.4, fracciones almacenadas basadas en absorbancia a A2BO y dializadas frente a PBS lx, Tris 50 mM, NaCl 150 mM pH 8.5 o NaOAc 50 mM; NaCl 150 mM; pH 4.5. Cualquier precipitado se retiró filtrando a 0.22 pin .

La expresión y la purificación a mediana escala produjeron Adnectinas altamente puras y activas que se expresaron en una forma soluble y se purificaron a partir de la fracción soluble del citosol bacteriano. El análisis de SEC en un SUPERDEX® 200 o SUPERDEX® 75 10/30GL en una fase móvil de NaP04 100 mM, NaS04 100 mM, NaCl 150 mM, pH 6.8 (GE Healthcare) demostró Adnectinas predominantemente monoméricas.

Formulación de SABA1.2 Una SABA específica, SABA1.2 (SEC ID N° : 180), se eligió para un rastreo de formulación preliminar. SABA1.2 comprende una extensión (DE)5 de la secuencia "núcleo 1" de 10Fn3. Para SABA1.2 , se identificó una formulación estable de ácido succínico 10 mM, sorbitol al 8%, glicina al 5% a pH 6.0 y a una concentración de producto de 5 mg/ml. En esta formulación la temperatura de fusión de proteína fue 75 °C según se determinó por Calorimetría de Exploración Diferencial (DSC) usando una concentración de proteína de 1.25 mg/ml. La formulación proporcionó estabilidad física y química satisfactoria a 4°C y 25 °C, con un nivel de agregado inicial al 1.2%. Después de un mes de estabilidad, el nivel de agregación fue muy bajo (1.6% a 4°C y 3.8% a 25°C) . La proteína también fue estable en esta formulación después de cinco ciclos de congelación- fusión según efectuó transición desde -80 °C y -20°C hasta temperatura ambiente. Además, en esta formulación SABA1.2 fue soluble a por lo menos 20 mg/ml de concentración de proteína a 4°C y temperatura ambiente con ninguna precipitación o con ningún incremento en agregación.

Ejemplo 8 Caracterización biofísica de las SABA candidatas Cromatografía de exclusión por tamaño La cromatografía de exclusión por tamaño estándar (SEC) se llevó a cabo en las SABAs candidatas que resultan del proceso de elaboración de escala mediana. La SEC de material preparado a escala mediana se llevó a cabo usando una columna SUPERDEX® 200 10/30 o una columna SUPERDEX® 75 10/30 (GE Healthcare) en un sistema de HPLC Agilent 1100 ó 1200 con detección de UV a A2u nm y a A2eo nm y con detección de fluorescencia (excitación = 280 nm, emisión = 350 nm) . Se empleó una solución amortiguadora de sulfato de sodio 100 mM, fosfato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 6.8 a velocidad de flujo apropiada de la columna de SEC empleada. Se usaron estándares de filtración de gel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) para calibración de peso molecular.

Los resultados de la SEC en las SABAs purificadas de escala mediana mostraron predominantemente Adnectina monomérica y elución en el intervalo aproximado de 10 kDa frente a estándares de Filtración de Geles globulares (BioRad) como se mostraron.

Termoestabilidad Los análisis de Calorimetría de Exploración Diferencial (DSC, por sus siglas en inglés) de las SABAs de escala mediana se llevaron a cabo determinando sus Tm' s respectivas. Una solución de 1 mg/ml se exploró en un calorímetro N-DSC II (Calorimetry Sciences Corp) elevando la temperatura de 5°C a 95°C a una velocidad de 1 grado por minuto a presión de 303975 pascales (3 atmósferas) . Los datos se analizaron frente a un funcionamiento control en la solución amortiguadora apropiada usando un mejor ajuste usando Software de Orgin (OrginLab Corp) . Los resultados de análisis de SEC y DSC se resumen en la Tabla 11.

Tabla 11. Sumario de análisis de SEC y DSC en las SABAs candidatas .

Ejemplo 9 Caracterización de unión de SABA1 candidata a seroalbúmina Las propiedades cinéticas de los clones de SABA seleccionados purificados a partir de HTPP y/o material presente en escala mediana se determinaron capturando la seroalbúmina respectiva (HSA/RhSA/MuSA) sobre la superficie de un chip Biasensor CM5 y haciendo fluir una serie de concentraciones de SABAs o tanto sobre el flujo celular de referencia como sobre las albúminas capturadas. Además, la unión a albúmina se llevó a cabo en varias condiciones de pH que varían desde pH 5.5 hasta pH 7.4. Las Adnectinas que se unen a HSA SABA2.1 , SABA3.1 , SABA4.1 (SABA5.1) y SABA1.1 se hicieron reaccionar de forma cruzada con RhSA pero no reaccionan de forma cruzada con MuSA. La unión a SABA2 y a SABA4 es sensible a pH mientras que la SABA3 de clon demostró resistencia a uniendo a HSA por debajo de pH 6.0. SABA1.1 ajusta criterios bioquímicos para resistencia a pH y afinidad/propiedades cinéticas por debajo de pH 5.5.

El mapeado de dominio se determinó por Biacore . Los clones de SABA seleccionados purificados a partir de HTPP y/o material preparado a escala mediana se determinaron capturando HSA o una construcción constituida por solamente dominio I y II de HSA o de dominio III de HSA en la superficie de un chip Biasensor CM5 y haciendo fluir una serie de concentraciones de las SABA tanto sobre el flujo celular de referencia como sobre las albúminas capturadas. Las SABA2 y SABA1 de clones se unen a HSA y a la construcción de los dominios I-II de HSA pero no a la construcción del dominio III de HSA. Las SABA3 y SABA4 de clones se unen a HSA pero no a ninguna de las construcciones de los dominios I-II de HSA ni del dominio III de HSA. Los resultados se resumieron en la tabla 12.

Tabla 12. Afinidad y Cinéticas de Unión de SABAs Candidatas ( SABA1.1, 2.1, 3.1 y 4.1) .

Ejemplo 10 Examen de la ti/2 in vivo de SABAs candidatas La semivida de HSA en ratones se determinó permitiendo evaluación de Adnectinas de unión a HSA en ratones teniendo en cuenta que las Adnectinas de unión a HSA no reaccionan de forma cruzada con MuSA. Se inyectó HSA en la vena del rabo de ratones hembra atímicos de aproximadamente 6 semanas de edad a una dosis de 20 mg/kg (Figura 10A) y a una dosis de 50 mg/kg (Figura 10B) y la concentración de HSA en muestras de sangre tomadas a intervalos después de la inyección se determinó por ELISA. La ti/2 de HSA inyectada en ratones a 20 mg/kg y a 50 mg/kg se determinó que es -24 horas y -20 horas, respectivamente .

Determinación de semivida de SABA1-4 en ratones Un litro de cultivo en E. coli de SABA1.1, SABA2.1 , SABA3.1 y SABA4.1 de clones de unión a HSA se preparó, se purificó y se le retiraron las endotoxinas. Cada variante de SABA se inyectó dentro de la vena del rabo de ratones, y la concentración en muestras de sangre tomadas a intervalos después de la inyección se determinó por ELISA.

Los perfiles farmacocinéticos de cada SABA se compararon en presencia o ausencia de HSA en ratones hembra atímicos Ncr de aproximadamente 6 semanas de edad. Los ratones que se coninyectaron con HSA tenían la HSA premezclada con cada una de las SABA (HSA en un exceso molar de 3-4) debido a que el clon de unión fue selectivo para HSA y RhSA y no se unió a seroalbúmina bovina. La semivida de SABA1.1 en plasma de ratones fue 0.56 horas mientras que la semivida de SABA1.1 co- inyectada con HSA fue 5.6 horas, un incremento de -10 veces en semivida (Figura 12A) . La¦ semivida de SABA2.1 en plasma de ratones fue 0.24 horas mientras que la semivida de SABA2.1 co- inyectada con HSA fue 2.8 horas, un incremento de -12 veces en semivida (Figura 12B) . La semivida de SABA3.1 en plasma de ratones fue 0.28 horas mientras que la semivida de SABA3.1 co-inyectada con HSA fue 0.53 horas, un incremento de ~2 veces en semivida (Figura 12C) . La semivida de SABA4.1 en plasma de ratones fue 0.66 horas mientras que la semivida de SABA4 co-inyectada con HSA fue 4.6 horas, un incremento de ~7 veces en semivida (Figura 12D) . Un sumario del presente ejemplo se muestra en la Figura 13.

Determinación de semivida de SABAl.l y SABA5.1 en macacos de Java Se llevó a cabo una prueba de dosis única de tres semanas de estudio de concepto de SABA1.1 y SABA5.1 en macacos de Java evaluando farmacocinéticas a una dosis intravenosa de 1 mg por kg (mpk) en dos macacos de Java. Las farmacocinéticas se evaluaron usando un ensayo cuantitativo basado en ELISA que se desarrolló para detectar la Adnectina en muestras de plasma. SABAl.l tiene una semivida en el intervalo de 96-137 horas. SABA5.1 tiene una semivida de aproximadamente 12 horas y sólo fue medible en el ELISA hasta 120 horas. Las Figuras 14 A y 14 B resumen datos para estos clones y comparan datos de macaco de Java.

Ejemplo 11 Caracterización de unión de SABA1 a seroalbúmina SABAl.l y 1.2 se unen a HSA y a RhSA SABA1.2, un 10Fn3 de "núcleo 1" que comprende una extensión de (DE)5 (SEC ID N° : 190) se unió a seroalbúmina humana (HSA) a pH neutro y a 25°C con una constante de velocidad de asociación promedio (ka) de 8.21E+03 M^s"1 y una constante de velocidad de disociación promedio (kd) de 4.43E-04 s"1, para una K¿ promedio calculada de 55.3 nM (Tabla 13) . Para seroalbúmina de rhesus (RhSA) , la constante de velocidad de asociación medida fue 6.6E+03 M"1s"1, y la constante de velocidad de disociación promedio fue, 3.78E-03 s"1, dando una ¾ promedio calculada de 580 nM. No se pudo observar interacción medible entre SABA1.2 y seroalbúmina de ratón o rata hasta 1 µ? (Tabla 13 y Figura 15) . A 37°C, la ka y la kd se incrementaron entre 2 a 5 veces, conduciendo a un incremento de ~2 veces en afinidad para HSA y a un incremento de 1/2 de la afinidad por RhSA (Tabla 13) .

Tabla 13. Parámetros cinéticos para unión a SABA1.2 para albúminas, en solución amortiguadora HBS-P. 1 Adicionalmente , se llevó a cabo una valoración calorimétrica determinando la estequiometría entre SABA1 y HSA. Para este estudio, se usó SABA1.1, un 10Fn3 "de núcleo 1" que comprende una extensión de His6 (SEC ID N° : 189) . Se inyectó HSA (10 µ? por inyección de solución de proteínas 115 µ?) en la célula calorimétrica que contiene SABA1.1 a una concentración de 8.1 µ?. El experimento se llevó a cabo a 37 °C en solución amortiguadora de PBS de pH 7.4. La Figura 16 muestra que SABA1.1 se une a HSA con estequiometría 1:1.

SABA1.2 se une potentemente a HSA a pH bajo La semivida larga de albúminas (por ejemplo, ti/2 de HSA es 19 días) se debe en gran parte al hecho de que se reciclan a partir de una ruta endocítica por unión al receptor Fe neonatal, FcRn, según las condiciones de pH bajo que existen dentro del endosoma. Como se muestra en la Tabla 4 SABA1.2 une potentemente HSA al pH endosómico de pH de 5.5, sugiriendo que ti/2 de SABA1, una vez unida a HSA, se beneficiaría del mecanismo de reciclaje de FcRn.

Tabla 14. Comparación de cinéticas de unión a albúmina a pH 7.4 y 5.5, en solución amortiguadora de MES.

SABA1.2 se une a dominios I y II de HSA , pero no a dominio III El sitio de unión SABA1.2 en albúmina se mapeó en los dominios N-terminales I o II usando fragmentos de HSA recombinantes y no hay unión detectable al dominio III (Figura 17) . Debido a que el dominio III es el dominio de HSA que interacciona principalmente con FcRn, es menos probable que SABA1.2 compita por unión a HSA con FcRn, incrementando de nuevo la posibilidad de impulsar el mecanismo de reciclaje para semivida potenciada.

Ejemplo 12 Farmacología in vivo de SABA1.2 Se llevó a cabo un estudio pretoxicológico de dosis individual de cuatro semanas de SABA1.2 en macacos de Java evaluando las características farmacocinéticas y la toxicidad a dos niveles de dosis diferentes. Las características farmacocinéticas y la inmunogenicidad se evaluaron también en un estudio pretoxicológico de dosis única, de tres semanas que incluyó tanto administración intravenosa como administración cutánea. Adicionalmente , las farmacocinéticas de SABA1.2 se evaluaron en dos estudios pretoxicológicos aparte en macacos de Java usando un ensayo basado en ELISA cuantitativo que se administró para detectar SABA1.2 en muestras de plasma.

SABA1.2 se administró a monos a 1 mpk y a 10 mpk intravenosamente . Como se muestra en la Figura 18 y en los parámetros descritos a continuación, la Cmáx y el AUC se incrementaron de forma aproximadamente lineal con dosis. Los análisis no compartimentales usando software INNONLIN® se llevaron a cabo evaluando parámetros farmacocinéticos . El aclaramiento (CL) para SABA1.2 a 10 mpk fue de 0.15 ml/hr/kg, la semivida (ti/2) de la fase beta fue 143 horas, el volumen de distribución (Vz) fue 30 ml/kg y la exposición a fármacos total (AUCall) fue 5.609.457 hr x nmol/1 (Tabla 15). El aclaramiento (CL) para SABA1.2 a 1 mpk fue de 0.4 ml/hr/kg, la semivida (ti/2) fue 124 horas, el volumen de distribución (Vz) fue 72 ml/kg y la exposición a fármacos total (AUCall) fue 214.636 hr x nmol/1 (Tabla 15).

Después de administración subcutánea o intravenosa de SABA1.2 , los perfiles farmacocinéticos de fase beta fueron similares (Figura 19) . Los análisis no compartimentales usando software WINNONLIN® se llevaron a cabo evaluando parámetros farmacocinéticos . El aclaramiento (CL) para SABA1.2 a 1 mpk intravenosamente .fue de 0.22 ml/hr/kg, la semivida (t1/2) de la fase beta fue 125 horas, el volumen de distribución (Vz) fue 40 ml/kg y la exposición a fármacos total (AUCall) fue 357.993 hr x nmol/1 (Tabla 15). El aclaramiento (CL) para SABA1.2 a 1 mpk subcutáneamente fue de 0.32 ml/hr/kg, la semivida (tx/2) de la fase beta fue 134 horas, el volumen de distribución (Vz) fue 62 ml/kg y la exposición a fármacos total (AUCall) fue 251.339 hr x nmo (Tabla 15) . La biodisponibilidad relativa subcutánea comparada con la intravenosa fue 0.7.

Tabla 15. Parámetros Farmacociné icos para SABAl .2 en Ratones .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un polipéptido caracterizado porque comprende un dominio décimo de fibronectina de tipo III (10Fn3) en el que el 10Fn3 tiene por lo menos un bucle seleccionado del bucle BC, DE y FG con una secuencia de aminoácidos alterada en relación a la secuencia del correspondiente bucle del dominio 10Fn3 humano y uniéndose el polipéptido a la subunidad pl9 de IL-23 con una KD de menos de 500 nM.

2. Un polipéptido caracterizado porque comprende un dominio décimo de fibronectina de tipo III (10Fn3) en el que el 10Fn3 tiene por lo menos un bucle seleccionado del bucle BC, DE y FG con una secuencia de aminoácidos alterada en relación a la secuencia del correspondiente bucle del dominio 10Fn3 humano y uniéndose el polipéptido al epitopo estructural de la subunidad pl9 de IL-23.

3. El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el bucle BC es seleccionado de las SEC ID Nqs: 2-6.

4. El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el bucle DE está seleccionado de las SEC ID N°s: 7-48.

5. El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el bucle FG es seleccionado de las SEC ID N°s: 49-59.

6. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del bucle BC, DE o FG es por lo menos idéntica en 80% a cualquiera de las SEC ID N°s: 2-59.

7. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del bucle BC, DE o FG es por lo menos idéntica en 90% a cualquiera de las SEC ID N°s: 60-100.

8. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido es por lo menos idéntica en 90% a los aminoácidos 3-96 de las SEC ID N°s: 60-100.

9. El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el resto de secuencia del bucle BC es GHYPX1.HX2 mostrado en la SEC ID N° : 257, en el que ? es ya sea metionina o ya sea leucina y X2 es ya sea isoleucina o ya sea valina.

10. El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el motivo de secuencia del bucle FG es YYX3X3X3X3YX3X3 I mostrado en la SEC ID N° : 258, en el que X3 puede ser cualquier aminoácido.

11. El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque comprende adicionalmente una o más fracciones farmacocinéticas (PK) seleccionadas del grupo que consiste de polietilenglicol , ácido siálico, Fe, fragmento de Fe, transíerrina, seroalbúmina , una proteína de unión a seroalbúmina y una proteína de unión a inmunoglobulina .

12. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la fracción PK es polietilenglicol.

13. El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque comprende adicionalmente un conector de cisteína.

14. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el conector de cisteína es seleccionado del grupo que consiste de los aminoácidos GSGC mostrados en la SEC ID N° : 101 y por los aminoácidos EIDKPCQ mostrados en la SEC ID N°: 102.

15. Una composición f rmacéuticamente aceptable caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la que la composición está esencialmente libre de endotoxinas.

16. Un procedimiento para regular la patogenicidad de los linfocitos Thl7 caracterizado porque comprende poner en contacto el polipéptido de la reivindicación 1-14 con IL-23 en una cantidad efectiva para interferir con la reacción de IL-23 endógena con las células Th

l7.