CN115768801A - 工程化松弛素及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新的重组松弛素‑2组合物及其制备方法。本文还公开了使用本发明的组合物治疗松弛素‑2相关紊乱或疾病的方法。

Description

工程化松弛素及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年5月8日提交的美国临时申请第63/021814号的优先权，其全部内容通过引用明确地并入本文。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，在此将其全文通过引用并入本文。所述ASCII副本在2021年5月6日创建，命名为117823-19620_SL.txt，大小为79204字节。
技术领域
本发明涉及用于调节松弛素-2活性的组合物和方法。
背景技术
松弛素是与胰岛素略微相关的小蛋白激素。它们通过其四种受体RXFP1、RXFP2、RXFP3和RXFP4调节多种生物学功能。这些中的第一个，RXFP1，由于其抗纤维化作用和其增强心输出量的能力而作为治疗靶标受到特别关注。其配体，松弛素-2，已经在治疗心力衰竭的大规模临床试验中进行了评价。松弛素受体也可以是治疗肺动脉高压和各种纤维化疾病的有效靶标。
松弛素及其受体都是生物化学上难处理的分子。松弛素由两条化学上不同的链组成，且现有的产生方法缓慢、昂贵且费力。此外，使用目前可用的方法产生的松弛素-2具有短的体内半衰期。因此，本领域需要具有高水平的生物活性、长的循环半衰期和有生产成本效益的重组松弛素-2蛋白。
发明内容
本文公开了新的松弛素-2组合物及其用于在受试者例如人受试者中调节(例如增强)松弛素-2活性的方法。本文公开的组合物和方法提供了在受试者中治疗和/或预防松弛素-2相关疾病的手段，所述受试者是例如可以受益于调节的(例如增加的或降低的)松弛素-2水平的受试者。
本文公开的组合物和方法是特别有利的，因为它们使用本文公开的提供优异性质的各种融合蛋白和多肽。例如，与天然松弛素-2蛋白相比，本发明的融合蛋白和多肽具有改善的药代动力学，例如更长的循环半衰期，或改善的活性，例如增强的RXFP1活化。已显示本发明的融合蛋白和多肽提供在细胞上RXFP1的改善的活化，EC50为约0.085nM至约465nM；并且表现出至少约77.5小时至至少约130小时的提高的循环半衰期。
因此，在一方面，本发明的特征在于融合蛋白。所述融合蛋白从N末端至C末端包含含有与SEQ ID NO：2的整个氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的氨基酸序列的第一肽；含有与选自DAASSHSHSSAR(SEQ ID NO：14)和DAAGANANAGAR(SEQ ID NO：16)的氨基酸序列的整个氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的氨基酸序列的肽接头；和含有与SEQ IDNO：1的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列的第二肽；其中第一肽、肽接头和第二肽可操作地连接。
在一个实施方案中，融合蛋白具有天然松弛素-2蛋白的活性。在另一个实施方案中，融合蛋白具有天然松弛素-2蛋白的至少约50％的活性。在另一个实施方案中，融合蛋白具有天然松弛素-2蛋白的至少约90％的活性。在另一个实施方案中，融合蛋白具有天然松弛素-2蛋白的至少约100％的活性。在一个实施方案中，融合蛋白具有天然松弛素-2蛋白的至少约150％的活性。
在另一个实施方案中，肽接头包含与选自DAASSHSHSSAR(SEQ ID NO：14)、DAASSHSHSSAA(SEQ ID NO：15)和DAAGANANAGAR(SEQ ID NO：16)的氨基酸序列的整个氨基酸序列具有至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，肽接头包含DAASSHSHSSAR(SEQ ID NO：14)、DAASSHSHSSAA(SEQ ID NO：15)或DAAGANANAGAR(SEQ ID NO：16)的氨基酸序列。
在再另一个实施方案中，第一肽具有与SEQ ID NO：2的整个氨基酸序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的氨基酸序列，第二肽具有与SEQID NO：1的整个氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列，其中融合蛋白具有天然松弛素-2活性。在又一个实施方案中，第一肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2、7、8、9和10，并且其中第二肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1和6。在一个实施方案中，其中第一肽包含选自M4K、M25K、W28A及其组合的置换。在另一个实施方案中，第一肽包含置换M4K、M25K和W28A。
在另一方面，本发明提供了一种融合蛋白。融合蛋白包含第一肽、肽接头和第二肽，其中融合蛋白的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54和55的氨基酸序列的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性。
在再另一方面，本发明提供了一种融合蛋白。融合蛋白包含第一肽、肽接头和第二肽，其中融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：55所示的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性。在一个实施方案中，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：55所示。
在本文描述的本发明的上述方面或任何其它方面的各种实施方案中，融合蛋白还包含第一可检测标记。在一个实施方案中，第一可检测标记可操作地连接至第一肽的N-末端或第二肽的C-末端。在另一个实施方案中，第一可检测标记是包含与SEQ ID NO：20的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白G(IgG)Fc肽。在再另一个实施方案中，第一可检测标记具有SEQ ID NO：20或21的氨基酸序列。在又一个实施方案中，第一可检测标记可操作地连接至第一肽的N-末端。
在一个实施方案中，融合蛋白还包含第二接头，其中第二接头可操作地连接至第一可检测标记的C-末端和连接至N-末端。在另一个实施方案中，第二接头选自Gly-Gly-Ser、Ala-Ala-Ala、Pro-Pro-Pro、Gly-Ser-Gly、(Gly-Ser-Gly)2(SEQ ID NO:57)和(Gly-Gly-Ser)4(SEQ ID NO:17)。
在一个实施方案中，融合蛋白具有大于约10小时的体内循环半衰期。在另一个实施方案中，融合蛋白具有约130小时的体内循环半衰期。
在另一个实施方案中，第一可检测标记是具有包含与选自SEQ ID NO：18和19的整个氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同一性的氨基酸序列的氨基酸序列的多组氨酸标签。在再另一个实施方案中，第一可检测剂包含SEQ ID NO：18或19的氨基酸序列。
在一个实施方案中，融合蛋白还包含第二可检测标记。在另一个实施方案中，第一可检测标记可操作地连接至第一肽的N-末端，第二可检测标记可操作地连接至第二肽的C-末端。在另一个实施方案中，第一可检测标记和第二可检测标记可操作地连接至第一肽的N-末端。在又一个实施方案中，第一可检测标记和第二可检测标记是不同的肽。
在上述方面的各种实施方案中，融合蛋白还包含可切割接头。在一个实施方案中，可切割接头是经历蛋白酶的特异性消化的肽。在另一个实施方案中，蛋白酶是HRV 3C蛋白酶或凝血酶。在再另一个实施方案中，可切割接头是具有SEQ ID NO：23的序列的肽或其变体。
在上述方面的各个实施方案中，融合蛋白还包含在融合蛋白的N-末端的信号肽。
在一个方面，本发明提供融合蛋白。融合蛋白包括可检测标记、第二接头、第一肽、肽接头和第二肽，其中融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：60或SEQ IDNO：61所示的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性。在一个实施方案中，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61所示。
在一个方面，本发明提供融合蛋白。融合蛋白包括可检测标记、第二接头、第一肽、肽接头和第二肽，其中融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：41中所示的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性。
在另一方面，本发明提供一种肽接头，其包含与选自DAASSHSHSSAR(SEQ ID NO：14)和DAAGANANAGAR(SEQ ID NO：16)的氨基酸的整个氨基酸序列具有至少约85％氨基酸同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种融合蛋白，其从N-末端到C-末端包括：包含松弛素B氨基酸序列的第一肽；肽接头；和包含松弛素A氨基酸序列的第二肽，其中所述融合蛋白具有天然松弛素-2蛋白的活性，并且其中所述融合蛋白具有选自以下的性质：(i)以约4.2nM或更小的EC50激活细胞表面上的松弛素-2受体RXFP1；(ii)至少约57℃的熔融温度；(iii)至少约77.5小时的循环半衰期；和(iv)其任何组合。
在另一方面，本发明提供了一种融合蛋白，其从N-末端到C-末端包含第一肽，其包含与SEQ ID NO：10的整个氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列；肽接头；和包含松弛素A氨基酸序列的第二肽。
在一个实施方案中，第一肽中对应于SEQ ID NO：10的氨基酸4的氨基酸为K；第一肽中对应于SEQ ID NO：10的氨基酸25的氨基酸是K；且第一肽中对应于SEQ ID NO：10的氨基酸28的氨基酸为A。
在另一个实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种融合蛋白，其从N-末端到C-末端包含含有松弛素B氨基酸序列的第一肽；含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的肽接头；和含有松弛素A氨基酸序列的第二肽。
在一个实施方案中，第一肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列；肽接头的氨基酸序列由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成；第二肽包含与SEQ ID NO：1的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；第二肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；第一肽包含与SEQ ID NO：10的整个氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列；肽接头包含SEQ IDNO：16的氨基酸序列；和第二肽包含与SEQ ID NO：1的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，或第一肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列；肽接头包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；和第二肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：1。
在另一方面，本发明提供了包含与SEQ ID NO：10的整个氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，对应于SEQ ID NO：10的氨基酸4的氨基酸是K；对应于SEQ IDNO：10的氨基酸25的氨基酸是K；且对应于SEQ ID NO：10的氨基酸28的氨基酸是A。
在另一个实施方案中，所述多肽包含含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在另一个实施方案中，多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：10组成。
在又一个实施方案中，所述多肽还包含与SEQ ID NO：16的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。在又一个实施方案中，所述多肽还包含含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
在又一个实施方案中，所述多肽还包含与SEQ ID NO：1的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。在又一个实施方案中，所述多肽还包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：16。
在另一方面，本发明提供了包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：16的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：16的氨基酸序列插置在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：10的氨基酸序列之间。
在再另一方面，本发明提供了包含编码上述方面的任何实施方案的融合蛋白或多肽的核苷酸序列的多核苷酸。在一个实施方案中，多核苷酸是RNA分子。
在又一方面，本发明提供了一种表达载体。表达载体包含上述方面的多核苷酸。在一个实施方案中，表达载体是质粒。在另一个实施方案中，表达载体是病毒载体。
在一个方面，本发明提供重组细胞。重组细胞包含上述方面的多核苷酸或表达载体。在一个实施方案中，细胞是原核细胞或真核细胞。在另一个实施方案中，细胞是选自大肠杆菌细胞和芽孢杆菌细胞的原核细胞。在另一个实施方案中，细胞是选自酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞的真核细胞。在又一个实施方案中，细胞是选自CHO细胞、HeLa细胞和293细胞的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，细胞是Expi293细胞。
在一个方面，本发明提供了产生上述方面的融合蛋白的方法，包括培养上述方面的重组细胞，并纯化融合蛋白。
在另一方面，本发明提供药物组合物。药物组合物包含有效量的上述任一方面的融合蛋白，或上述任一方面的多核苷酸，或上述任一方面的表达载体。
在另一方面，本发明提供了增强细胞中的松弛素-2相关活性的方法，其包括使细胞与上述任一方面的融合蛋白接触，从而增强细胞中的松弛素-2相关活性。在一个实施方案中，融合蛋白激活细胞表面上的松弛素-2受体RXFP1。在另一个实施方案中，所述方法提高细胞中的cAMP水平，从而诱导血管舒张、诱导血管生成因子的表达、诱导MMP的表达和诱导胶原降解。在再另一个实施方案中，细胞选自内皮细胞、血管平滑肌细胞、其它血管细胞、心肌细胞、其它心脏细胞和成纤维细胞。
在一个实施方案中，细胞在受试者体内。在另一个实施方案中，受试者患有松弛素-2相关紊乱。在又一个实施例中，该松弛素-2相关紊乱选自肾脏疾病、纤维化疾病和心血管疾病。在另一个实施方案中，紊乱选自局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、糖尿病性肾病、肝肾综合征、硬皮病、特发性肺纤维化、肾纤维、心脏纤维化、NASH、扩张型心肌病、舒张性心力衰竭、肺动脉高压、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、高血压和先兆子痫。
在一个方面，本发明提供了在有需要的受试者中治疗松弛素-2相关紊乱的方法。该方法包括向受试者施用有效量的上述任一方面的融合蛋白，上述任一方面的多核苷酸，上述任一方面的表达载体或以上方面的药物组合物，由此治疗该松弛素-2相关紊乱。在一个实施方案中，松弛素-2相关紊乱选自肾病、纤维化疾病和心血管疾病。在另一个实施方案中，紊乱选自局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、糖尿病性肾病、肝肾综合征、硬皮病、特发性肺纤维化、肾纤维、心脏纤维化、NASH、扩张型心肌病、舒张性心力衰竭、肺动脉高压、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、高血压和先兆子痫。在再另一个实施方案中，所述方法降低动脉压，增加肾动脉血流，增加心脏舒张时的心脏充盈，消解已形成的纤维化或抑制新的纤维化发展。
在另一方面，本发明提供一种试剂盒。试剂盒包含有效量的上述任一方面的融合蛋白、上述任一方面的多核苷酸、上述任一方面的表达载体或上述任一方面的药物组合物，以及使用说明。
附图说明
图1A-1C是显示重组松弛素-2蛋白SE001、SE201、SE202、SE203、SE204、SE205、SE206、SE207和SE301的电泳和考马斯蓝染色的图像。
图2是显示SE301的尺寸排阻色谱的图。
图3是显示使用差示扫描荧光测定法测定SE301的Tm的图。
图4是显示两种重组松弛素-2蛋白SE001和SE004与天然松弛素-2相比的活性的图。
图5是显示三种重组松弛素-2蛋白SE101、SE102和SE103与天然松弛素-2相比的活性的图。
图6是显示三种重组松弛素-2蛋白SE201、SE202和SE203与天然松弛素-2相比的活性的图。
图7是显示四种重组松弛素-2蛋白SE204、SE205、SE206和SE207与天然松弛素-2相比的活性的图。
图8是显示一种重组松弛素-2蛋白SE301与天然松弛素-2相比的活性的图。
图9是显示一种重组松弛素-2蛋白SE302与天然松弛素-2相比的活性的图。
图10是显示两种重组松弛素-2蛋白SE303和SE304与天然松弛素-2相比的活性的图。
图11是显示一种重组松弛素-2蛋白SE305与天然松弛素-2相比的活性的图。
图12是显示一种重组松弛素-2蛋白SE401与天然松弛素-2相比的活性的图。
图13是显示SE301的药代动力学数据的图。
图14是显示两种重组松弛素-2蛋白SE501和SE502与天然松弛素-2相比的活性的图。
图15是显示SE301的流式细胞数据的图。
具体实施方式
本发明至少部分地基于以下发现：与天然松弛素-2相比，重组单链松弛素-2蛋白，例如包含松弛素B链、接头和松弛素A链的融合蛋白，保持高水平的生物活性。在一些实施方案中，重组单链松弛素-2蛋白包含与其可操作地连接的免疫球蛋白G恒定区(Fc结构域)，而几乎不损害或不损害生物活性。因此，本文公开了新的重组松弛素-2组合物及其制备方法。本文还公开了使用本发明的组合物治疗松弛素-2相关紊乱或疾病的方法。根据本发明的重组单链松弛素-2蛋白具有几种优异的性质。例如，重组单链松弛素-2蛋白具有改善的药代动力学，例如更长的循环半衰期，或改善的活性，例如增强的RXFP1的最大活化。产生根据本发明的重组单链松弛素-2蛋白也是简单的和经济的。
I.定义
为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。
除非本文另有定义，与本发明结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应该是清楚的，然而，在任何潜在的歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。
在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求书的上下文中)，术语“一”和“一个”和“所述”以及类似指代的使用应解释为涵盖单数和复数(即，一个或多个)，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾。除非另外指明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文中另外指明，否则本文中数值范围的列举仅旨在用作单独提及所列举的或落入该范围内的每个单独的值速记方法，并且每个单独的值如同其被单独列举一样并入本说明书中。
术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的5％内，或更优选在1％内。
如本文所用，术语“基本上”是指表现出感兴趣的特征或性质的总体或接近总体范围或程度的定性条件。本领域普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)达到完成和/或进行到完成或者实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文的一些实施方案中可用于描述许多生物和化学现象中固有的潜在完全性的缺乏。
如本文所述，术语“治疗有效量”旨在包括当向患者施用用于治疗患有松弛素-2相关疾病的受试者的时足以实现该疾病的治疗(例如，通过减少、改善或维持现有疾病或疾病的一种或多种症状或其相关共病)的药剂或组合物的量。“治疗有效量”可以根据药剂或组合物、如何施用、疾病及其严重程度以及病史、年龄、体重、家族史、遗传构成由松弛素-2介导的病理过程的阶段、先前或伴随治疗(如果有的话)的类型以及待治疗患者的其它个体特征而变化。
通常，术语“治疗(treatment)”或“处理(treating)”被定义为向患者应用或施用治疗剂，或向来自患者的分离的组织或细胞系应用或施用治疗剂，所述患者具有疾病、疾病症状或患病的倾向，其目的是治愈、修复、减轻、缓解、改变、补救、改进、改善或影响疾病、疾病症状或患病的倾向。因此，治疗可包括阻止、抑制、预防、治疗或其组合。治疗尤其是指增加到持续进展的时间、加速缓解、诱导缓解、增加缓解、加速恢复、增加对替代疗法的功效/或降低对替代疗法的抗性或其组合。
“阻止(suppressing)”或“抑制(inhibiting)”尤其是指延迟症状发作、预防疾病复发、降低复发发作的次数或频率、增加症状发作之间的潜伏期、降低症状的严重性、降低急性发作的严重性、降低症状的数量、降低疾病相关症状的发生率、降低症状的潜伏期、改善症状、减少继发性症状、降低继发性感染、延长患者存活期或其组合。
在一个实施方案中，症状是原发性的，而在另一个实施方案中，症状是继发性的。
“原发性”是指作为疾病例如糖尿病的直接结果的症状，而继发性是指源于或继发于原始病因的症状。症状可以是疾病或病理状况的任何表现。
因此，如本文所用，术语“治疗”或“处理”包括任何本文所述的组合物的施用，并且包括：(i)预防疾病在可能易患疾病但尚未经历或表现疾病的病理学或症状学的受试者中发生；(ii)抑制正在经历或表现患病的病理学或症状学的受试者中的疾病(即，阻止病理学和/或症状学的进一步发展)；或(iii)改善正在经历或表现患病的病理学或症状学的受试者的疾病(即逆转病理学和/或症状学)。
疾病或紊乱的“治疗”、“预防”或“改善”是指延迟或防止这种疾病或紊乱的发作，逆转、减轻、改进、抑制、减缓或停止与这种疾病或紊乱相关的病症的进展、加重或恶化进展或者严重性。在一个实施方案中，疾病或紊乱的症状减轻至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％或至少50％。
与用于诊断紊乱的任何已知方法结合测定治疗的功效。紊乱的一种或多种症状的减轻表明组合物赋予临床益处。上述任何治疗方法可应用于任何合适的受试者，包括例如哺乳动物如狗、猫、牛、马、兔、猴，和最优选地，人。
如本文所用，术语“受试者”包括可受益于施用本发明的水凝胶或可植入药物递送装置的任何受试者。术语“受试者”包括动物，例如脊椎动物、两栖动物、鱼、哺乳动物、非人动物，包括人和灵长类，例如黑猩猩、猴等。在本发明的一个实施方案中，受试者是人。
术语“受试者”还包括农业生产性家畜，例如牛、绵羊、山羊、马、猪、驴、骆驼、水牛、兔、鸡、火鸡、鸭、鹅和蜜蜂；以及家养宠物，例如狗、猫、笼养鸟和观赏鱼，以及所谓的试验动物，例如仓鼠、豚鼠、大鼠和小鼠。
II.本发明的组合物
A.松弛素-2
人松弛素-2是具有多重多效作用的肽激素。最初认为仅是促进婴儿分娩的生殖激素，但最近的研究证明松弛素-2在炎性和基质重塑过程中起关键作用，并具有有效的血管舒张、血管生成和其它心脏保护作用。除了拮抗内皮素-1和血管紧张素II的血管收缩作用外，松弛素-2的血管舒张作用被认为涉及一氧化氮和明胶酶、基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的促进作用。这导致全身和肾血管舒张、动脉顺应性增加和其它血管变化。这些发现已导致松弛素-2作为用于治疗患有急性心力衰竭(AHF)和其他疾病的患者的药物进行评估。此外，松弛素-2的基质重塑作用增强了其作为快速起效但安全的抗纤维化剂的名声，其得到了在迄今为止评估的实验性疾病的每种临床前模型中成功抑制和/或逆转纤维化的能力的进一步支持。
松弛素-2的作用被认为是通过其天然受体RXFP1(最初命名为LGR7)介导的，RXFP1是含富亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体，其特征为异常大的胞外结构域。人松弛素-2还可以结合并激活相关受体RXFP2，RXFP2是胰岛素样肽3(INSL3)的天然受体，表明潜在的交叉反应性可能与其多样的作用有关。
天然松弛素-2具有包含两条链(松弛素A和松弛素B)和三个二硫键的胰岛素样核心结构。如本文所用，术语“天然松弛素-2”是指在受试者中天然产生的任何松弛素-2，例如人松弛素-2。人松弛素-2的天然存在的直系同源物，如小鼠松弛素-1，也被认为是本发明的天然松弛素-2。天然松弛素-2还包括使用任何重组方法产生的松弛素-2，并且具有与天然存在的松弛素-2基本相同的结构，即一级结构、二级结构和三级结构，以及基本相同的生物学活性，例如与RXFP1结合。
人松弛素A和B链来自单一基因产物(GenBank登录号CAA25460.1)。人前体松弛素-2蛋白通常在翻译后被蛋白水解，产生成熟的A/B形式。在一些实施方案中，示例性人天然松弛素-A具有SEQ ID NO：1(QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC)中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，示例性人天然松弛素-B具有SEQ ID NO：2(DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWS)中所示的氨基酸序列。人松弛素-2的小鼠等同物是鼠松弛素-1，类似地衍生自前体蛋白(GenBank登录号CAA81611.1)。在一些实施方案中，示例性小鼠天然松弛素-A具有SEQ IDNO：3(ESGGLMSQQCCHVGCSRRSIAKLYC)中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，示例性小鼠天然松弛素-B具有SEQ ID NO：4(RVSEEWMDGFIRMCGREYARELIKICGASVGRLAL)中所示的氨基酸序列。
B.重组松驰素-2
1.松弛素A和松弛素B
本发明提供重组松弛素-2蛋白，例如重组人松弛素-2，其与天然松弛素-2相比具有高水平的生物活性，同时允许用于增加的血清半衰期的修饰。术语“重组的”表示材料(例如，核酸或多肽)已经通过人为干预人工地或合成地(即，非天然地)改变。改变可以在自然环境或状态的材料上进行，或在从自然环境或状态中移除的材料上进行。例如，“重组核酸”是例如在克隆、DNA重排或其它熟知的分子生物学过程中通过重组核酸制备的核酸。“重组DNA分子”由通过这种分子生物学技术的方式连接在一起的DNA片段组成。本文所用的术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指使用重组DNA分子表达的蛋白质分子。“重组宿主细胞”是含有和/或表达重组核酸的细胞。术语重组松弛素-2和工程化松弛素-2可以互换使用。
重组松弛素-2蛋白包含天然松弛素A，例如人松弛素A，或其变体，和天然松弛素B，例如人松弛素B，或其变体。当蛋白质或肽的名称独立于术语“天然”或“变体”使用时，本文所用的“松弛素A”、“松弛素B”、“松弛素-2”和其它蛋白质或肽是指天然或变体蛋白质或肽。本文所用的术语“变体”是指由前体蛋白或肽(例如“亲本”蛋白或肽)的一个或多个氨基酸插入、置换或缺失衍生的蛋白质或肽。在某些实施方案中，变体包含至少一个修饰，所述修饰包括与前体蛋白或肽相比电荷的变化。在某些优选的实施方案中，前体蛋白或肽是天然蛋白或肽的亲本蛋白或肽。
在某些实施方案中，变体蛋白质或肽，例如变体人松弛素-A或松弛素-B，与天然蛋白质或肽具有至少约85％，例如约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列同一性。本文所用的术语“序列同一性”是指核酸或氨基酸分子对之间的比较，即两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联性。通常，对序列进行比对以便获得最高阶匹配。用于确定序列同一性的方法是已知的，并且可以通过商业上可获得的计算机程序来确定，所述计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的同一性百分比。这种计算机程序的典型示例是CLUSTAL。作为举例说明，具有与参考核苷酸序列具有至少例如90％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸是指，除了该多核苷酸序列可以包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸平均最多10个点突变外，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中最多10％的核苷酸可以被删除或用另一种核苷酸置换，或者参考序列中总核苷酸的最多10％的多个核苷酸可被插入参考序列中。参考序列的这些突变可以发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之间的任何位置，单独散布在参考序列中的核苷酸之间或在参考序列内的一个或多个连续组团中。类似地，氨基酸序列与参考氨基酸序列具有至少例如90％序列同一性的多肽意指，除了该多肽序列可以包括参考氨基酸的每100个氨基酸平均最多10个氨基酸改变外，该多肽的氨基酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得氨基酸序列具有与参考氨基酸序列的至少90％同一性的多肽，参考序列中最多10％的氨基酸残基可以被删除或用另一种氨基酸置换，或参考序列中总氨基酸残基的最多10％的多个氨基酸可以被插入参考序列中。参考序列的这些改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或这些末端位置之间的任何位置，或者单独地散布在参考序列的残基中或者在参考序列内的一个或多个连续组团中。
测定同一性的优选方法设计为给出测试的序列之间的最大匹配。在公开可用的计算机程序中描述了测定同一性的方法。确定两个序列之间同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人,1984,Nucl.Acid.Res.12:387；Genetics ComputerGroup,University of Wisconsin,Madison,Wis.,USA)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410)。BLASTX程序可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源公开获得(BLAST Manual,Altschul等人，NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.,USA；Altschul等人，同上)。众所周知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。例如，使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.,USA)，待测定序列同一性百分比的两个蛋白质进行比对，用于它们的相应氨基酸的最佳匹配(由算法测定的“匹配跨度”)。空位开放罚分(计算为平均对角线的3倍；“平均对角线”是所使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是通过特定比较矩阵分配给每个完全氨基酸匹配的分数或数目)和缺口延伸罚分(通常是缺口开放罚分的1/10倍)，以及比较矩阵如PAM250或BLOSUM62与算法结合使用。算法也使用标准比较矩阵(PAM 250比较矩阵参见Dayhoff等人,1978,Atlas of Protein Sequence and Structure,Vol.5,Suppl.3,(1978)；LOSUM 62比较矩阵参见Henikoff等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci USA 89:10915-10919)。
在某些实施方案中，变体人松弛素A包含置换Q1D(SEQ ID NO：5)。如这里所使用的，格式“L1NL2”表示在位置N处的置换。“L1”是代表天然蛋白或肽的N位处氨基酸的单字母符号。“N”是代表置换位置的数字，从天然蛋白或肽的第一氨基酸开始计数，例如，具有SEQID NO：1所示序列的人天然松弛素A的第一氨基酸，或具有SEQ ID NO：2所示序列的人天然松弛素B的第一氨基酸。“L2”是代表取代L1的氨基酸的单字母符号。
在某些实施方案中，变体人松弛素B包含截短的肽(SEQ ID NO：6)，其中前五个氨基酸(DSWME(SEQ ID NO：59))从人天然松弛素B中删除。在某些实施方案中，变体人松弛素B包含一个或多个选自M4K、R13A、R13D、R17A、R17D、I20A、I20D、M25K和W28A的置换。
在某些实施方案中，变体人松弛素B选自SEQ ID NO：7、8、9和10。
在一些实施方案中，变体人松弛素B具有SEQ ID NO：11、12和13中所示的序列。
在一些实施方案中，重组松弛素-2蛋白是单链蛋白，例如融合蛋白。在单链松弛素-2重组蛋白中，重组松弛素-2的松弛素A和松弛素B通过接头可操作地连接，例如共价连接。术语“可操作地连接”、“可操作的组合”和“可操作的顺序”是指核酸序列以产生能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子的方式连接。该术语还指氨基酸序列以使得产生功能性蛋白质的方式连接。在某些实施方案中，松弛素A、松弛素B和接头以下列可操作的顺序共价连接：
松弛素B-接头-松弛素A。
在某些实施方案中，重组松弛素-2包含具有氨基酸序列DAASSHSHSSAR(SEQ IDNO：14)或其变体的接头。在一些实施方案中，接头具有序列DAASSHSHSSAA(SEQ ID NO：15)。在一些实施方案中，重组松弛素-2包含具有DAAGANANAGAR(SEQ ID NO：16)的氨基酸序列或其变体的接头。具有氨基酸序列DAASSHSHSSAA(SEQ ID NO：15)的接头报道于关于产生天然松弛素-3的方法的公开出版物中(Luo等人，A simple approach for the preparation ofmature human relaxin-3,Peptides,2010)。
2.接头
在一些实施方案中，重组松弛素-2包含接头。接头以可操作的顺序共价连接重组松弛素-2的至少两个部件。本文所用的术语“接头”是指连接两个分子或部分(例如，两个肽如松弛素A和松弛素B)的化学基团或分子。通常，接头布置于通过共价键彼此连接的两个基团、分子或其它部分之间或在其侧翼，并因此将两者连接。在一些实施方案中，接头包含一个氨基酸或多个氨基酸(例如肽或蛋白质)。在一些实施方案中，接头包含可切割位点。例如，接头包括可被HRV3C蛋白酶裂解的肽。在一些实施方案中，接头是氨基酸的任何延伸片段并且是至少1个，至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少15个，其具有至少20个，至少25个，至少30个，至少40个，至少50个，或51个或更多个氨基酸。
在一些实施方案中，肽接头包含三肽Gly-Gly-Ser或其变体的重复序列(重复)，例如包含序列(GGS)n，其中n为至少1、2、3、4、5、6、7，代表8、9、10或11或更多个重复。在一些实施方案中，接头包含序列(GGS)4(SEQ ID NO：17)。在一些实施方案中，肽接头包含三肽Gly-Ser-Gly或其变体的重复序列(重复)，例如包含序列(GSG)n，其中n为至少1、2、3、4、5、6、7，代表8、9、10或11或更多个重复。在一些实施方案中，接头包含序列(GSG)2(SEQ ID NO：57)。在一些实施方案中，肽接头包含三肽Ala-Ala-Ala的重复序列(重复)，例如包含序列(AAA)n，其中n为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11或更多个重复。在一些实施方案中，肽接头包含三肽Pro-Pro-Pro的重复序列(重复)，例如包含序列(PPP)n，其中n为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11或更多个重复。
3.可检测标记
在一些实施方案中，本发明的重组松弛素-2还包含可检测的标记，例如酶标记、荧光标记或亲和标记，以允许检测和分离蛋白质。这样的可检测标记可以包括但不限于多组氨酸标签、免疫球蛋白Fc标签、myc标签、HA标签、谷胱甘肽S-转移酶、荧光标签或其变体。合适的酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶或乙酰胆碱脂酶。在一些实施方案中，可检测标记是多组氨酸标签，例如6xHis(SEQ ID NO：18)或其变体，或8xHis(SEQ ID NO：19)或其变体。在一些实施方案中，可检测标记可用于抗体亲和色谱或检测，例如蛋白C标签。蛋白C标签的实例包括但不限于具有EDQVDPRLIDGKGS(SEQ ID NO：24)的氨基酸序列的肽或其变体。
在一些实施方案中，可检测标记是免疫球蛋白Fc结构域，例如IgG1 Fc结构域(SEQID NO：20)，或其变体，例如包含N77Q置换的IgG1 Fc结构域(SEQ ID NO：21)。可检测标记也可具有其它功能。例如，免疫球蛋白Fc结构域标签可以增加受试者中重组松弛素-2的半衰期。Fc片段还通过Fcγ受体结合促进免疫效应因子功能，包括补体激活和细胞的细胞毒性。在一些实施方案中，重组单链松弛素-2的Fc片段可以包括一个或多个置换以减弱免疫效应因子功能，例如在IgG1 Fc区域中Asn297被Gln置换(在重组松弛素-2蛋白中称为N77Q)。Fc片段的示例性效应子功能减弱置换包括但不限于N297G(NG)和D265A、N297G、L234A、L235A和P329G。示例性的效应子功能减弱置换描述于Lo等人，Effector-attenuatingSubstitutions That Maintain Antibody Stability and Reduce Toxicity in Mice,J.Biol.Chem.,292,3900-08(2017)，其通过引用并入本文。
在某些实施方案中，可检测标记是血清白蛋白，例如人血清白蛋白或小鼠血清白蛋白。小鼠血清白蛋白的实例包括具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的蛋白质或其变体。
可检测标记可以可操作地连接，例如共价连接至松弛素A或松弛素B的N-末端或C-末端。可检测标记可以直接可操作地连接至松弛素A或松弛素B。可检测标记也可以通过接头，如GGS或GSG接头与松弛素A或松弛素B可操作地连接。
可检测标记也可以通过可切割接头，例如可被蛋白酶裂解的肽，可操作地连接至松弛素A或松弛素B。特异性裂解可切割接头的示例性蛋白酶包括但不限于凝血酶、HRV3C蛋白酶、因子Xa和TEV蛋白酶。HRV3C位点的实例包括但不限于具有LEVLFQGP(SEQ ID NO：23)或其变体，或GSLEVLFQGPG(SEQ ID NO：58)或其变体的氨基酸序列的肽。凝血酶位点的实例包括但不限于具有氨基酸序列LVPRGS(SEQ ID NO：56)或其变体的肽。
4.重组松弛素-2的生物活性
在一些实施方案中，本发明的重组松弛素-2与天然松弛素-2相比具有高水平的生物活性。例如，与天然松弛素-2相比，重组松弛素-2可具有约至少约50％至约至少2倍的生物活性。在一些实施方案中，与天然松弛素-2相比，重组松弛素-2具有至少约50％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％或约2倍的生物活性。在某些实施方案中，重组松弛素-2与天然松弛素-2相比具有超过约2倍的生物活性。
生物活性可以是天然松弛素-2的任何生物活性。例如，生物活性可以是重组松弛素-2结合天然松弛素-2的受体RXFP1的能力。松弛素-2与RXFP1的结合可以通过本领域任何公知的方法测量，例如放射性配体结合。在一些实施方案中，重组松弛素-2结合细胞表面上的RXFP1。
在一些实施方案中，生物活性可以是重组松弛素-2活化细胞表面上的RXFP1的能力。不希望受任何理论的束缚，本发明至少部分地基于令人惊讶的发现与天然的双链松弛素-2相比，一些示例性重组松弛素-2蛋白表现出更高的最大RXFP1活化。重组松弛素-2对RXFP1的激活可以使用本领域熟知的任何方法通过cAMP的增加来确定，例如测量cAMP驱动的报告基因(例如β-半乳糖苷酶)的活性。在细胞中重组松弛素-2对RXFP1的激活也可以通过使用本领域公知的方法测量某些基因如血管生成因子(例如，VEGF)的表达或MMP的表达来确定。在一些实施方案中，生物活性是松弛素-2的生理、生化活性或任何其它效应诱导的活性。示例性的生物活性包括但不限于血管舒张、胶原降解、血管生成、降低动脉血压、增加肾动脉血流、增加心脏舒张时的心脏充盈、消解已形成的纤维化和阻止新的纤维化发展。
在某些实施方案中，本发明提供了蛋白质或肽，例如重组松弛素-2，其在一个方面具有高水平的活性，例如天然松弛素-2的至少约50％至约2倍的生物活性，但在另一个方面具有低水平的活性，例如天然松弛素-2的小于约50％的生物活性。在一些实施方案中，与天然松弛素-2相比，重组松弛素-2在一个方面具有小于约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％的生物活性。例如，重组松弛素-2可以以高亲和力，例如，与天然松弛素-2相比至少约50％至约2倍的亲和力与RXFP1结合，但在激活RXFP1中的活性较低，例如，在激活RXFP1中的能力低于约50％。这样的重组松弛素-2可以是在需要其的受试者中降低松弛素-2活性的显性负性变体。
在一些实施方案中，本发明提供了具有改善的药代动力学特征的蛋白质或肽，例如重组松弛素-2。不希望受任何理论的束缚，本发明至少部分地基于令人惊讶的发现一些示例性重组松弛素-2蛋白与天然双链松弛素-2相比表现出长得多的循环半衰期。例如，本发明的重组单链松弛素-2可以具有大于约5小时，例如大于约10小时，大于约20小时，大于约50小时，大于约75小时，大于约100小时，大于约125小时或大于约150小时的循环半衰期。所陈述值中间的值和范围也是本发明的部分。在某些实施方案中，本发明的重组单链松弛素-2具有约130小时的循环半衰期。令人惊讶的是，本发明的单链松弛素-2可以具有比天然双链松弛素-2更长的循环半衰期。例如，天然双链松弛素-2的循环半衰期可小于约5小时。(参见，例如，Chen等人，The Pharmacokinetics of Recombinant Human Relaxin in Non-Pregnant Women after Intravenous,Intravaginal,and IntracervicalAdministration,Pharm.Res.10:834038(1993)，在此通过引用并入本文)。
本文所用的“循环半衰期”是指药物例如天然松弛素-2或重组单链松弛素-2的血浆浓度在生物体的全血中循环时其稳态减半所花费的时间。特定药剂的循环半衰期可根据多种因素而变化，所述因素包括但不限于药剂的剂量、制剂和/或施用途径。本领域普通技术人员能够使用本领域公知的方法，例如实施例3或Chen，同上中所述的方法，测定药剂例如蛋白质(例如重组松弛素-2)的循环半衰期。
5.编码重组松弛素-2的核酸分子
本发明还提供了编码本文所述的任何蛋白质或肽，例如重组松弛素-2的核酸分子。在一些实施方案中，本发明的核酸分子是DNA分子。在一些实施方案中，本发明的核酸分子是RNA分子。
编码任何蛋白质或肽，例如重组松弛素-2的DNA分子的单独的一个链或多个链可以从表达载体中的启动子转录。当要表达两种单独的蛋白质或肽以产生例如松弛素A和松弛素B时，可以将两种单独的表达载体共同引入(例如通过转染或感染)靶细胞中。
表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。与真核细胞相容的表达载体，优选与脊椎动物细胞相容的表达载体，可用于产生本文所述的重组松弛素-2。重组蛋白的产生和纯化是本领域熟知的，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook等人(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press中描述的方法。不希望受任何理论的束缚，本发明至少部分地基于令人惊讶的发现一些示例性重组松弛素-2蛋白可以以高产率产生(参见例如实施例3，表2)。
编码本文所述蛋白质例如重组松弛素-2的核酸可并入载体中。
天然或合成核酸的表达通常通过将编码目的基因的核酸可操作地连接至启动子上，并将构建体整合至表达载体中来实现。所述载体可适合于在真核生物中复制和整合。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和用于表达所需核酸序列的启动子。
另外的启动子元件，例如增强序列，调节转录起始的频率。通常，它们位于起始位点上游30-110bp的区域中，尽管最近显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间距通常是灵活的，使得当元件相对于彼此反转或移动时保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间距可以增加至分隔50bp。取决于启动子，似乎单个元件可以协同或独立地起作用以激活转录。
合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1a(EF-1a)。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒立即早期启动子和Rous肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。
此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被认为是本发明的部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在需要这样的表达时开启可操作连接的多核苷酸序列的表达，或在不需要表达时，关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
表达载体还可以含有选择标记基因或报告基因或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，选择标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染过程中。选择标记和报告基因都可以与合适的转录控制序列侧接，以便能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因可用于鉴定潜在转染的细胞和评价转录控制序列的功能性。通常，报告基因是不存在于受体来源中或不由受体来源表达的并编码其表达由一些容易检测的性质如酶活性表现的多肽的基因。在将DNA引入受体细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的，且可以使用已知技术制备或商购获得。通常，显示报告基因的最高表达水平的具有最小的5'侧翼区域的构建体确定为启动子。这样的启动子区域可以与报告基因连接并用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。
在某些实施方案中，表达载体是质粒载体，例如原核质粒载体或真核质粒载体。示例性原核质粒载体包括但不限于pET表达系列质粒和pGEX表达系列质粒。示例性的真核表达质粒包括但不限于酵母表达质粒、植物细胞表达质粒、昆虫细胞表达质粒、禽细胞表达质粒和哺乳动物表达质粒。示例性哺乳动物表达质粒包括但不限于pRc/CMV、pcDNA3.1、pcDNA4、pcDNA6、pGene/V5、pFUSE-hIgG1-Fc2、pTT和pED.dC。在某些实施方案中，表达质粒包含一个或多个可诱导元件以控制重组单链松弛素-2的表达。包含可诱导元件的示例性质粒包括但不限于pcDNA3.1-Zeo-tetO，一种修饰的pcDNA3.1质粒，用于四环素诱导的蛋白表达和Zeocin抗生素抗性。
在某些实施方案中，可以将本发明的表达载体递送至宿主细胞用于体外产生蛋白质或肽，例如重组松弛素-2。本发明还提供了含有编码本发明的任何蛋白质或肽的核酸分子或包含这种核酸分子的载体的重组细胞。将核酸分子引入细胞中的方法是本领域公知的，包括但不限于转化、转染、病毒感染或电穿孔。
宿主细胞的实例包括但不限于选自任何生命界的原核和真核细胞。真核细胞的实例包括但不限于原生生物、真菌、植物和动物细胞。宿主细胞的非限制性实例包括但不限于原核细胞大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO、HEK293、HeLa、Expi293F和COS；昆虫细胞系草地夜蛾细胞系Sf9和粉纹夜蛾细胞系HighFive；以及真菌细胞酿酒酵母。
在某些实施方案中，表达载体可用于将编码本发明的任何蛋白质或肽的基因递送至体内细胞和/或在体内细胞表达用于基因治疗。载体，包括那些来源于逆转录病毒如慢病毒的载体，是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期的、稳定的整合及其在子代细胞中的增殖。载体的实例包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。表达载体可以病毒载体的形式提供至细胞。病毒载体技术是本领域熟知的，并描述于各种病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中功能性的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一个或多个选择标记。
可与本文所述的方法和组合物一起使用的病毒载体系统包括但不限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不限于慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺相关病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，例如正痘病毒，例如牛痘病毒载体，或禽痘病毒，例如金丝雀痘或鸡痘；和(j)辅助病毒依赖性或无肠腺病毒。复制缺陷型病毒也可能是有利的。不同的载体将整合或不整合到细胞的基因组中。如果需要，构建体可以包括用于转染的病毒序列。或者，可以将构建体整合到能够附加型复制的载体中，例如EPV和EBV载体。用于破坏剂的重组表达的构建体通常需要调控元件，例如启动子、增强子等，以确保破坏剂在靶细胞中的表达。考虑用于载体和构建体的其它方面是本领域已知的。
将病毒载体体内递送至细胞中的方法是本领域公知的。病毒载体可以通过本领域已知的任何方式施用，包括但不限于口服、腹膜内或肠胃外途径，包括颅内(例如脑室内、脑实质内和鞘内)、静脉内、肌内、皮下、透皮、气道(气雾剂)、鼻、直肠和局部(包括口腔和舌下)施用。
包含编码本发明的任何蛋白质或肽的基因的RNA分子可用于体内递送和/或表达该基因用于基因治疗。配制和体内递送RNA分子基因的方法是本领域公知的，例如美国专利公开2016/0038612A1中描述的方法，其通过引用并入本文。
C.药物组合物和施用
本发明提供包含本发明的蛋白质或肽例如重组松弛素-2或核酸分子或表达载体的药物组合物。本发明的药物组合物与合适的载体、赋形剂和提供改善的转移、递送、耐受性等的其它试剂一起配制。许多合适的制剂可以在所有药物化学家已知的配方集中找到：Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏剂、胶冻剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(如LlPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA缀合物、无水吸收贴剂、水包油和油包水乳液、乳液卡波蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有卡波蜡的半固体混合物。还参见Powell等人，“Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
施用于患者的本发明的蛋白质、肽或核酸分子的剂量可根据患者的年龄和大小、目标疾病、病症、施用途径等而变化。优选的剂量通常根据体重或体表面积计算。根据病症的严重程度，可以调节治疗的频率和持续时间。施用重组松弛素-2的有效剂量和时间表可以根据经验确定；例如，可以通过定期评估来监测患者进展，并相应地调整剂量。此外，可以使用本领域公知的方法进行剂量的物种间缩放(例如，Mordenti等人，1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
各种递送系统是已知的并且可用于施用本发明的药物组合物，例如脂质体中包封、微粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如Wu等人，1987,J.BioI.Chem.262:4429-4432)。引入的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或粘膜衬层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。
本发明的药物组合物可以用标准针头和注射器皮下或静脉内递送。此外，就皮下递送而言，笔式递送装置容易应用于递送本发明的药物组合物。这种笔式递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔式递送装置通常使用含有药物组合物的可更换的药筒。一旦药筒内的所有药物组合物已被施用并且药筒是空的，则空药筒可容易地被丢弃并用包含药物组合物的新药筒替换。然后笔式递送装置可以重复使用。在一次性笔式递送装置中，不存在可更换的药筒。相反，一次性笔式递送装置预填充保持在装置内的贮存器中的药物组合物。一旦贮存器排空药物组合物，就丢弃整个装置。
许多可重复使用的笔和自动注射器递送装置应用于本发明的药物组合物的皮下递送中。实例包括但不限于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lillyand Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLlKTM(Sanofi-Aventis,Frankfurt,德国)，举几个例子。应用于皮下递送本发明的药物组合物的一次性笔式递送装置的实例包括但不限于SOLOSTARTM笔(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLlCKTMAutoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM笔(Abbott Labs,Abbott Park IL)，举几个例子。
在某些情况下，药物组合物可以在控释系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，同上；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料；参见，Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在另一个实施方案中，可以将控释系统置于组合物的靶标附近，因此仅需要全身性剂量的一部分(参见例如Goodson,1984,Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138)。在Langer,1990,Science 249:1527-1533的综述中讨论了其它控释系统。
可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制剂可以通过公知的方法制备。例如，可注射制剂可以例如通过将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备。作为用于注射的水性介质，有例如生理盐水、含葡萄糖和其它助剂等的等渗溶液，其可以与适当的增溶剂如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨醇酯80，HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。作为油性介质，使用例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂如苯甲酸苄酯、苄醇等组合使用。如此制备的注射剂优选填充在适宜的安瓶中。
有利地，将上述用于口服或肠胃外使用的药物组合物制备成适于符合活性成分剂量的单位剂量的剂型。单位剂量的此类剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂等。单位剂量中包含的前述抗体的量通常为每剂型约5至约500mg；特别是在注射形式中，，优选上述抗体对于其它剂型以约5至约100mg和约10至约250mg包含。
III.重组松弛素-2的治疗用途
A.使用重组松弛素-2的方法
本发明包括方法，所述方法包括向有需要的受试者施用包含本发明的重组松弛素-2的治疗组合物。治疗组合物可包含本文公开的任何蛋白质或肽和药学上可接受的载体或稀释剂。如本文所用，表述“有需要的受试者”是指表现出松弛素-2相关紊乱或疾病的一种或多种症状或指征的人或非人动物，或另外将受益于松弛素-2活性的增加或降低的人或非人动物。本发明的蛋白质或肽(以及包含其的治疗组合物)尤其可用于治疗其中RXFP1的活化或失活是有益的任何疾病或紊乱。
在某些实施方案中，本发明提供了用于激活细胞表面上的RXFP1的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的本发明的蛋白质或肽，例如重组松弛素-2，从而激活细胞表面上的RXFP1。细胞表面上RXFP1的激活可导致细胞反应，包括但不限于cAMP水平的升高、血管舒张、包括VEGF的血管生成因子的表达、MMP的表达和胶原降解。在一些实施方案中，细胞选自内皮细胞、血管平滑肌细胞、其它血管细胞、心肌细胞、其它心脏细胞和成纤维细胞。
在一些实施方案中，本发明提供治疗各种松弛素-2相关疾病的方法。如本文所用，术语“松弛素-2相关疾病”是由松弛素-2蛋白产生或松弛素-2蛋白活性引起的或与其相关的疾病或紊乱。术语“松弛素-2相关疾病”包括受益于松弛素-2蛋白活性增加的疾病、紊乱或病症。松弛素-2相关疾病的非限制性实例包括例如肾脏疾病，包括但不限于局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、糖尿病性肾病、肝肾综合征；纤维化疾病，包括但不限于硬皮病、特发性肺纤维化、肾纤维化，心脏纤维化、NASH；心血管疾病，包括扩张性心肌病、舒张性心力衰竭、肺动脉高压、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、高血压、先兆子痫。关于各种疾病或病症的体征和症状的进一步细节在本文中提供并且是本领域熟知的。
根据本发明的方法施用组合物可以导致患有松弛素-2相关疾病或紊乱的患者中松弛素-2相关疾病或紊乱的严重性、体征、症状或标志物的降低。该情况中的“降低”是指这种水平的统计学显著降低。降低(绝对降低或受试者中升高的水平与正常水平之间的差异的降低)可以是例如至少约20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％，或者至低于所用测定法的检测水平。
B.组合疗法和制剂
本发明包括包含本文所述的任何示例性蛋白质或肽(例如重组松弛素-2蛋白质)或核酸分子与一种或多种另外的治疗活性组分的组合的组合物和治疗制剂，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。
示例性的另外的治疗剂包括可用于治疗本文所述的任何松弛素-2相关紊乱的任何治疗剂。可以与本发明的重组松弛素-2蛋白或核酸分子组合或联合施用的示例性的另外治疗剂包括但不限于血管紧张素II受体阻断剂，例如阿齐沙坦、坎地沙坦、依普沙坦、氯沙坦、ACE抑制剂，例如赖诺普利、贝那普利、卡托普利、依那普利、莫昔普利、培哚普利、喹那普利、曲多普利，钙通道阻滞剂，例如，氨氯地平、氨氯地平和苯那普利、氨氯平和缬沙坦、地尔硫卓、非洛地平、依拉地平、尼卡地平、尼莫地平、奈索地平、维拉帕米，或利尿剂，例如，氯噻酮、氢氯噻嗪、美托拉宗、吲达帕胺、托塞米德、呋塞米、布美他奈德、阿米洛利、氨苯蝶啶、螺内酯、依普利酮，醛固酮拮抗剂，例如，螺内酯、依普利酮，地高辛，例如，拉诺辛，β受体阻滞剂，例如卡维地洛、美托洛尔、比索洛尔。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是用于纤维化的药物，包括但不限于小分子药物和抗体。示例性抗纤维化药物包括(但不限于)TGF-β抑制剂，例如，小分子，如羟尼酮、地司特泰(distiertide)，或抗体，如非苏木单抗(Fresolimumab)，PDGF或VEGF拮抗剂，例如，小分子，如伊马替尼、尼洛替尼；或靶向参与纤维化发病机理的细胞外因子的任何药物。用于纤维化的示例性药物的描述可见于例如Li等人，Drugs and Targets in Fibrosis,Frontiers in Pharm.,8:Article 855(2007)，在此通过引用并入本文。
另外的治疗活性组分可以在施用本发明的抗原结合分子之前、同时或之后不久施用；(为了本公开的目的，认为这样的施用方案是重组松弛素-2“与另外的治疗活性组分组 合”的施用)。
本发明包括其中本发明的重组松弛素-2与一种或多种本文别处描述的另外的治疗活性组分共同配制的药物组合物。
C.施用方案
根据本发明的某些实施方案，本发明的蛋白或肽，例如重组松弛素-2的多个剂量可以在限定的时间过程内施用于受试者。根据本发明该方面的方法包括向受试者顺序施用多剂量的本发明的重组松弛素-2。如本文所用，“顺序施用”意指在不同时间点，例如在由预定间隔(例如，数小时、数天、数周或数月)隔开的不同天，向受试者施用各剂量的本发明蛋白质或肽。本发明包括方法，所述方法包括向患者顺序施用单一初始剂量的重组松弛素-2，随后一个或多个二次剂量的重组松弛素-2，和任选地随后一个或多个三次剂量的重组松弛素-2。
术语“初始剂量”、“二次剂量”和“三次剂量”是指施用本发明的重组松弛素-2的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“二次剂量”是在初始剂量之后施用的剂量；且“三次剂量”是在二次剂量之后施用的剂量。初始剂量、二次剂量和三次剂量均可含有相同量的重组松弛素-2，但通常在施用频率方面彼此不同。然而，在某些实施方案中，初始、二次和/或三次剂量中包含的重组松弛素-2的量在治疗过程中彼此不同(例如，视情况向上或向下调节)。在某些实施方案中，在治疗方案开始时施用两个或更多个(例如，2、3、4或5个)剂量作为“负荷剂量”，随后是较不频繁地施用的后续剂量(例如，“维持剂量”)。
在本发明的一个示例性实施方案中，每个二次和/或三次剂量在紧接的前一剂量之后1至26(例如1,11/2,2,21/2,3,31/2,4,41/2,5,51/2,6,61/2,7,71/2,8,81/2,9,91/2,10,101/2,11,111/2,12,121/2,13,131/2,14,141/2,15,151/2,16,161/2,17,171/2,18,181/2,19,191/2,20,201/2,21,211/2,22,221/2,23,231/2,24,241/2,25,251/2,26,261/2或更多)周施用。本文所用的短语“紧接的前一剂量”是指在多次施用的顺序中，在施用顺序中的正下一剂量之前(没有插入剂量)施用于患者的重组松弛素-2的剂量。
根据本发明该方面的方法可以包括向患者施用任何数量的蛋白或肽(例如重组松弛素-2)的二次和/或三次剂量。例如，在某些实施方案中，仅向患者施用单一二次剂量。在其它实施方案中，向患者施用两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)二次剂量。同样，在某些实施方案中，仅向患者施用单一三次剂量。在其它实施方案中，向患者施用两个或更多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)三次剂量。
在涉及多个二次剂量的实施方案中，每个二次剂量可以以与其它二次剂量相同的频率施用。例如，每个二次剂量可在紧接的前一剂量后1-2周施用于患者。类似地，在涉及多个三次剂量的实施方案中，每个三次剂量可以以与其它三次剂量相同的频率施用。例如，每个三次剂量可在紧接的前一剂量之后2至4周施用于患者。或者，对患者施用二次和/或三次剂量的频率可以在治疗方案的过程中变化。在治疗过程中，也可以由医生根据临床检查后个体患者的需要调整施用频率。
在一个实施方案中，重组松弛素-2以基于体重的剂量施用于受试者。“基于体重的剂量”(例如，以mg/kg计的剂量)是根据受试者的体重而变化的蛋白质或肽的剂量。
在另一个实施方案中，蛋白质或肽，例如重组松弛素-2，以固定剂量施用受试者。“固定剂量”(例如，以mg计的剂量)是指对于所有受试者使用一个剂量的蛋白质或肽，例如重组松弛素-2，而不管任何具体的受试者相关因素，如体重。在一个特定的实施方案中，本发明的重组松弛素-2的固定剂量基于预定的体重或年龄。
通常，本发明的蛋白质或肽的合适剂量可以在约0.001至约200.0毫克/千克接受者体重的范围内，通常在约1至50mg/千克体重的范围内。例如，蛋白质或肽，例如重组松弛素-2，可以以每单个剂量约0.1mg/kg，约0.2mg/kg，约0.5mg/kg，约1mg/kg，约1.5mg/kg，约2mg/kg，约3mg/kg，约5mg/kg，约10mg/kg，约15mg/kg，约20mg/kg，约25mg/kg，约30mg/kg，约40mg/kg，约50mg/kg施用。所陈述值中间的值和范围也意图是本发明的部分。
在一些实施方案中，本发明的蛋白质或肽，例如重组松弛素-2以约10mg至约2500mg的固定剂量施用。在一些实施方案中，本发明的重组松弛素-2以约10mg，约15mg，约20mg，25mg，约30mg，约50mg，约75mg，约100mg，约125mg，约150mg，约175mg，200mg，约225mg，约250mg，约275mg，约300mg，约325mg，约350mg，约375mg，约400mg，约425mg，约450mg，约475mg，约500mg，约525mg，约550mg，约575mg，约600mg，约625mg，约650mg，约675mg，约700mg，约725mg，约750mg，约775mg，约800mg，约825mg，约850mg，约875mg，约900mg，约925mg，约950mg，约975mg，约1000mg，约1500mg，约2000mg或约2500mg的固定剂量施用。所陈述值中间的值和范围也意图是本发明的部分。
IV.试剂盒
本文所述的任何组合物可包含在试剂盒中。在非限制性实例中，试剂盒包含重组松弛素-2。
试剂盒还可以包括用于在受试者中使用重组松弛素-2的试剂或说明书。它还可以包括一种或多种缓冲剂。
试剂盒的组分可以以水性介质或冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置，组分可以放置于其中，优选合适地等分。当试剂盒中存在多于一种组分时(标记试剂和标记可包装在一起)，试剂盒通常还包含第二、第三或其它附加容器，附加组分可单独置于其中。试剂盒还可以包括用于容纳无菌的、药学上可接受的缓冲剂和/或其它稀释剂的第二容器装置。然而，在小瓶中可以包括各种组分组合。本发明的试剂盒通常还包括用于容纳本发明组合物例如重组松弛素-2的装置，和在用于商业销售的紧密封闭中的任何其它试剂容器。
当试剂盒的组分以一种和/或多种液体溶液提供时，液体溶液是水性溶液，特别优选无菌水溶液。然而，试剂盒的组分可作为干粉提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，粉末可通过添加合适的溶剂重构。设想溶剂也可以在另一个容器装置中提供。
通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应解释为限制性的。在整个本申请中引用的所有参考文献的全部内容在此明确地通过引用并入本文。
实施例
实施例1.重组松弛素-2蛋白
设计了允许在哺乳动物细胞中直接产生的松弛素-2蛋白的工程化形式。简言之，单链重组松弛素-2蛋白被设计为从N-末端到C-末端以可操作的顺序包含松弛素B-接头-松弛素A。重组松弛素-2蛋白任选地还包含第二接头和/或可检测标记。示例性单链重组松弛素-2蛋白的组分、结构和序列列于下表1中。单链重组松弛素-2蛋白具有几个优点，包括但不限于不需要下游加工或修饰步骤。
Figure BDA0003930655430000351
Figure BDA0003930655430000361
Figure BDA0003930655430000371
Figure BDA0003930655430000381
Figure BDA0003930655430000391
Figure BDA0003930655430000401
实施例2.重组单链松弛素-2蛋白的产生
使用标准分子生物学技术产生本发明的重组松弛素-2蛋白。简言之，将编码表1所列任一蛋白质的DNA可操作地连接并克隆到可诱导的pcDNA3.1-Zeo-tetO表达质粒或pFUSE-hIgG1-Fc2质粒中。用Expi Fectamine或聚乙烯亚胺(PEI)将重组质粒转染到Expi293F细胞中。对于一些重组质粒，用Expi293F细胞产生四环素诱导的稳定细胞系以表达重组松弛素-2蛋白。根据制造商的手册进行细胞培养和转染。收获细胞并使用本领域熟知的技术收集总蛋白。使用亲和色谱或者亲和色谱加尺寸排阻色谱纯化重组松弛素-2蛋白。固定化金属亲和色谱(IMAC)和尺寸排阻色谱用于含有6xHis标签(SEQ ID NO：18)或8xHis标签(SEQ ID NO：19)的重组松弛素-2蛋白。蛋白G抗体亲和色谱用于含有IgG1 Fc标签的重组松弛素-2蛋白。
实施例3.单链松弛素-2蛋白的生化数据
将纯化的重组单链松弛素-2蛋白进行SDS-PAGE电泳和考马斯蓝染色以测定分子量和纯度。如图1A-1C所示，示例性重组单链蛋白SE001具有约8kDa的预期分子量；示例性重组单链蛋白SE201、SE202、SE203、SE204、SE205、SE206、SE207和SE301具有约32kDa的预期分子量。考马斯蓝染色也证明经纯化的重组单链松弛素-2蛋白基本上不含污染蛋白。
对于SE301，通过测量洗脱级分在280nm处的吸收来监测亲和色谱后蛋白质的尺寸排阻色谱。图2表明通过亲和色谱纯化的SE301基本上不含污染蛋白。
使用差示扫描荧光测定法测定SE301的熔融温度(Tm)。如图3所示，SE301的Tm为约57℃。
实施例4.重组松弛素-2蛋白的活性
使用cAMP驱动的报告基因测定法测试重组松弛素-2蛋白的生物活性。在报告基因测定中，重组松弛素-2蛋白结合已通过瞬时转染在HEK293T细胞中表达的RXFP1受体。重组松弛素-2蛋白的结合激活RXFP1，从而引起细胞中cAMP水平的增加。cAMP信号级联导致启动子被cAMP应答元件(CRE)激活。启动子控制对于分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的报告基因的转录。结果，HEK293T细胞产生SEAP并分泌至细胞培养基中。然后将SEAP的底物4-甲基伞形酮磷酸酯(MUP)与培养基混合。根据培养基中存在的SEAP的量，反应可导致酶促产生荧光产物，该荧光产物可通过读板仪检测。因此，用于检测SEAP酶水平的荧光读数用作细胞中重组松弛素-2诱导的RXFP1激活的读数。根据制造商的手册进行细胞培养和转染。cAMP驱动的报告基因测定描述于Durocher等人，A Report Gene Assay for High-Throughput Screenof G-protein-coupled Receptors Stably or Transiently Expressed in HEK293 EBNACells Grown in Suspension Culture,Anal.Biochem.,284(2):316-26(2000)，和Liberles&Buck,A Second Class of Chemosensory Receptors in the OlfactoryEpithelium,Nature,442(7103):645-50(2006)，在此通过引用并入本文。
单链重组松弛素-2的活性和EC50总结在表2和图4-12中。
表2.重组松弛素-2蛋白的活性
Figure BDA0003930655430000421
Figure BDA0003930655430000431
*:修饰的pcDNA3.1质粒：pcDNA3.1-Zeo-tetO诱导型表达质粒。
实施例5.重组松弛素-2蛋白的药代动力学研究
为了测定SE301的血清药代动力学，对雄性CD-1小鼠进行单次腹膜内注射施用之后进行药代动力学研究。在无菌磷酸盐缓冲盐水中以10mg/mL制备纯化的SE301的储备制剂并储存在-80℃。
在给药日前一天，根据下表3稀释SE301的储备制剂。如果需要，在层流柜下分配稀释的制剂注射剂用于给药。在给药前一天使用未验证的方法进行剂量制剂分析。在研究开始前确定测试品(SE301制剂)的稳定性(室温下24小时)。在给药之前将测试品温热至室温至少30分钟，但不超过3小时(在不使用时)。
研究中使用9只雄性CD-1小鼠。每只小鼠在给药日为约7至约10周龄，体重为约29至约40克。在试验机构按照既定方案进行动物饲养和临床观察。实验设计示于下表3中。
表3
Figure BDA0003930655430000432
Figure BDA0003930655430000441
经由下腹部施用腹膜内注射(IP)剂量。剂量施用之前对动物称重，并根据体重调整剂量体积。在给药前、给药后2小时、24小时、72小时和168小时收集测试小鼠的血液样品。
对于对照血清，从下腔静脉收集来自雄性动物的血液样品。从可用的CD-1小鼠收集全血至含有聚合物二氧化硅活化剂(polymer silica activator)的市售管中。含有血液样品的真空采血管在离心之前(出现血清之后)在室温下保持30分钟。在收集后1小时内，将样品在4℃下以2500×g离心15分钟。将血清转移至预标记的聚乙烯微量离心管中。收集约5mL总雄性血清。立即将血清储存在-60℃或更低的温度下，直至进行生物分析或运输。该血清作为生物分析的对照血清。
为了制备用于PK分析的血清样品，在取样时间点从测试化合物处理组中的每只动物收集至少0.6mL血液样品。对于在给药第一小时内收集的样品，±1分钟被认为是可接受的。对于剩余时间点，在计划时间的5％内采集的样品被视为可接受，不视为方案偏离。将所有血液样品收集在含有聚合物二氧化硅活化剂的市售管中。收集血液之后，含有血液样品的试管在离心之前(出现血清之后)在室温下保持约30分钟。在收集后1小时内，将样品在4℃下以2500×g离心15分钟。然后在离心后收集血清，并制备一个等分试样(至少30μL)用于PK分析。然后将样品在干冰上快速冷冻并保持在-60℃或更低直至分析。进行合格的ELISA以分析SE301的量。
使用WinNonlin软件程序通过非区室方法分析血清浓度与时间数据和衍生的药代动力学参数。
药代动力学研究的结果显示在图13和下表4中。如图13和表4所示，SE301的循环半衰期在10mg/kg剂量下为约77.5小时，在1mg/kg剂量下为约90.7小时，和在0.2mg/kg剂量下为约130小时。
表4
剂量 T<sub>1/2</sub>
0.2mg/kg 130小时
1mg/kg 90.7小时
10mg/kg 77.5小时
实施例6.重组松弛素-2蛋白的活性
根据实施例4中描述的方法，使用cAMP驱动的报告基因测定法测试两种重组松弛素-2蛋白SE501和SE502的生物活性。
单链重组松弛素-2的氨基酸序列总结于表1中。
单链重组松弛素-2的活性和EC50总结在表5和图14中。
表5.重组松弛素-2蛋白的活性
Figure BDA0003930655430000451
*:修饰的pcDNA3.1质粒：pcDNA3.1-Zeo-tetO诱导型表达质粒。
实施例7.重组松弛素-2蛋白的流式细胞结合测定
用具有N-末端FLAG标签的RXFP1或空载体质粒瞬时转染的Expi293F细胞通过流式细胞分析测定SE301的结合亲和力。根据制造商的手册进行细胞培养和转染。将用RXFP1或空载体对照转染的细胞在20mM HEPES pH7.5，150mM氯化钠，2mM氯化钙和1％胎牛血清的缓冲液中在4℃孵育30分钟。向细胞中加入不同浓度的SE301并在4℃孵育1小时。将细胞用缓冲液洗涤两次，并将用Alexa488标记的M1抗体(M1-488)和用Alexa647标记的第二抗人Fc抗体(抗人FN-647)与细胞一起在4℃孵育30分钟。将细胞洗涤一次，重悬于100μL缓冲液中，并通过流式细胞术进行分析。通过前向散射面积相对侧向散射面积和前向散射面积相对前向散射高度对细胞进行门控。然后根据M1-488抗体与受体的FLAG标签的结合所指示的受体表达对细胞进行门控。根据抗人FN-647抗体的平均荧光强度绘制最终门控中的细胞以计算SE301的Kd。
流式细胞研究的结果示于图15。如图15所示，SE301对RXFP1的结合亲和力(Kd)为122nM。
通过引用并入本文
本文提及的所有公开出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文，如同每个单独的公开出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。在冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。
等同物
本领域技术人员将认识到，或能够仅使用常规实验确定，本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。这些等同物旨在被以下权利要求所涵盖。
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Claims (81)

1.一种融合蛋白，其从N-末端到C-末端包含：
第一肽，其包含与SEQ ID NO：2的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；
肽接头，其包含与选自DAASSHSHSSAR(SEQ ID NO：14)和DAAGANANAGAR(SEQ ID NO：16)的氨基酸序列的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；以及
第二肽，其包含与SEQ ID NO：1的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；
其中所述第一肽、所述肽接头和所述第二肽可操作地连接。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有天然松弛素-2蛋白的活性。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有天然松弛素-2蛋白的至少约50％的活性。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有天然松弛素-2蛋白的至少约90％的活性。
5.如权利要求4所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有天然松弛素-2蛋白的至少约100％的活性。
6.如权利要求5所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有天然松弛素-2蛋白的至少约150％的活性。
7.如权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白，其中所述肽接头包含与选自DAASSHSHSSSAR(SEQ ID NO：14)、DAASSHSHSSAA(SEQ ID NO：15)和DAAGANANAGAR(SEQ IDNO：16)的氨基酸序列的整个氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的融合蛋白，其中所述肽接头包含DAASSHSHSSAR(SEQ ID NO：14)、DAASSHSHSSAA(SEQ ID NO：15)或DAAGANANAGAR(SEQ ID NO：16)的氨基酸序列。
9.如权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一肽具有与SEQ ID NO：2的整个氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列，且所述第二肽具有与SEQ ID NO：1的整个氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列，其中所述融合蛋白具有天然松弛素-2活性。
10.如权利要求9所述的融合蛋白，其中所述第一肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：2、7、8、9和10，且其中所述第二肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1和6。
11.如权利要求9所述的融合蛋白，其中所述第一肽包含选自M4K、M25K、W28A及其组合的置换。
12.如权利要求11的融合蛋白，其中第一肽包含置换M4K，M25K和W28A。
13.一种融合蛋白，其包含第一肽、肽接头和第二肽，其中所述融合蛋白的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54和55的氨基酸序列的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性。
14.一种融合蛋白，其包含第一肽、肽接头和第二肽，其中所述融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：55所示的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性。
15.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：55所示。
16.如权利要求1-15中任一项所述的融合蛋白，其还包含第一可检测标记。
17.如权利要求16所述的融合蛋白，其中所述第一可检测标记可操作地连接至所述第一肽的N-末端或所述第二肽的C-末端。
18.如权利要求16或17所述的融合蛋白，其中所述第一可检测标记是包含与SEQ IDNO：20的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列的免疫球蛋白G(IgG)Fc肽。
19.如权利要求18所述的融合蛋白，其中所述第一可检测标记具有SEQ ID NO：20或21的氨基酸序列。
20.如权利要求18或19所述的融合蛋白，其中所述第一可检测标记可操作地连接至所述第一肽的N-末端。
21.如权利要求20所述的融合蛋白，其还包含第二接头，其中所述第二接头可操作地连接至所述第一可检测标记的C-末端和连接至N-末端。
22.如权利要求21所述的融合蛋白，其中所述第二接头选自Gly-Gly-Ser、Ala-Ala-Ala、Pro-Pro-Pro、Gly-Ser-Gly、(Gly-Ser-Gly)2(SEQ ID NO:57)和(Gly-Gly-Ser)4(SEQID NO:17)。
23.如权利要求18-22中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有大于约10小时的体内循环半衰期。
24.如权利要求23所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有约130小时的体内循环半衰期。
25.如权利要求16或17所述的融合蛋白，其中所述第一可检测标记是具有氨基酸序列的多组氨酸标签，其中所述氨基酸序列包含与选自SEQ ID NO：18和19的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。
26.如权利要求18所述的融合蛋白，其中所述第一可检测剂包含SEQ ID NO：18或19的氨基酸序列。
27.如权利要求16-26中任一项所述的融合蛋白，其还包含第二可检测标记。
28.如权利要求27所述的融合蛋白，其中所述第一可检测标记可操作地连接至所述第一肽的N-末端，且所述第二可检测标记可操作地连接至所述第二肽的C-末端。
29.如权利要求27所述的融合蛋白，其中所述第一可检测标记和所述第二可检测标记可操作地连接至所述第一肽的N-末端。
30.如权利要求27-29中任一项所述的融合蛋白，其中所述第一可检测标记和所述第二可检测标记是不同的肽。
31.如权利要求1-30中任一项所述的融合蛋白，其还包含可切割接头。
32.如权利要求31所述的融合蛋白，其中所述可切割接头是经受蛋白酶特异性消化的肽。
33.如权利要求32所述的融合蛋白，其中所述蛋白酶是HRV 3C蛋白酶或凝血酶。
34.如权利要求33所述的融合蛋白，其中所述可切割接头是具有SEQ ID NO：23序列的肽或其变体。
35.如权利要求1-34中任一项所述的融合蛋白，其还包含在所述融合蛋白的N-末端的信号肽。
36.一种融合蛋白，其包含可检测标记、第二接头、第一肽、肽接头和第二肽，其中所述融合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61所示的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性。
37.如权利要求36所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：41所示。
38.如权利要求36所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61所示。
39.一种肽接头，其包含与选自DAASSHSHSSAR(SEQ ID NO：14)和DAAGANANAGAR(SEQ IDNO：16)的氨基酸的整个氨基酸序列具有至少约85％氨基酸同一性的氨基酸序列。
40.一种融合蛋白，其从N-末端到C-末端包含：
包含松弛素B氨基酸序列的第一肽；
肽接头；以及
包含松弛素A氨基酸序列的第二肽，
其中所述融合蛋白具有天然松弛素-2蛋白的活性，且
其中所述融合蛋白具有选自以下的性质：
(i)以约4.2nM或更小的EC50活化细胞表面上的松弛素-2受体RXFP1；
(ii)至少约57℃的熔融温度；
(iii)至少约77.5小时的循环半衰期；以及
(iv)其任何组合。
41.一种融合蛋白，其从N-末端到C-末端包含：
第一肽，其包含与SEQ ID NO：10的整个氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列；
肽接头；以及
包含松弛素A氨基酸序列的第二肽。
42.如权利要求41所述的融合蛋白，其中所述第一肽中对应于SEQ ID NO：10的氨基酸4的氨基酸是K；所述第一肽中对应于SEQ ID NO：10的氨基酸25的氨基酸是K；且所述第一肽中对应于SEQ ID NO：10的氨基酸28的氨基酸为A。
43.如权利要求41或42所述的融合蛋白，其中所述肽接头包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
44.一种融合蛋白，其从N-末端到C-末端包含：
包含松弛素B氨基酸序列的第一肽；
包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的肽接头；以及
包含松弛素A氨基酸序列的第二肽。
45.如权利要求1-44中任一项所述的融合蛋白，其中：
所述第一肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列；
所述肽接头的氨基酸序列由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成；
所述第二肽包含与SEQ ID NO：1的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；
所述第二肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
所述第一肽包含与SEQ ID NO：10的整个氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列；所述肽接头包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；并且所述第二肽包含与SEQ ID NO：1的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；或
所述第一肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列；所述肽接头包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；且所述第二肽包含氨基酸序列SEQ ID NO：1。
46.一种多肽，其包含与SEQ ID NO：10的整个氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。
47.如权利要求46所述的多肽，其中对应于SEQ ID NO：10的氨基酸4的氨基酸是K；对应于SEQ ID NO：10的氨基酸25的氨基酸是K；且对应于SEQ ID NO：10的氨基酸28的氨基酸是A。
48.如权利要求46或47所述的多肽，其中所述多肽包含含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
49.如权利要求46-48中任一项所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO：10组成。
50.如权利要求46-49中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含与SEQ ID NO：16的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。
51.如权利要求46-50中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列。
52.如权利要求46-51中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含与SEQ ID NO：1的整个氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。
53.如权利要求46-52中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
54.一种包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：16。
55.一种包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：16的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：16的氨基酸序列插置在SEQ ID NO：1和SEQID NO：10的氨基酸序列之间。
56.一种多核苷酸，其包含编码如权利要求1-45中任一项所述的融合蛋白或如权利要求46-55中任一项所述的多肽的核苷酸序列。
57.如权利要求56所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是RNA分子。
58.一种表达载体，其包含如权利要求56所述的多核苷酸。
59.如权利要求58所述的表达载体，其中所述表达载体是质粒。
60.如权利要求58所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。
61.一种重组细胞，其包含如权利要求56或57所述的多核苷酸或如权利要求58-60中任一项所述的表达载体。
62.如权利要求61所述的重组细胞，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。
63.如权利要求62所述的重组细胞，其中所述细胞是选自大肠杆菌细胞和芽孢杆菌细胞的原核细胞。
64.如权利要求62所述的重组细胞，其中所述细胞是选自酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞的真核细胞。
65.如权利要求64所述的重组细胞，其中所述细胞是选自CHO细胞、HeLa细胞和293细胞的哺乳动物细胞。
66.如权利要求65所述的重组细胞，其中所述细胞是Expi293细胞。
67.一种产生如权利要求1-45中任一项所述的融合蛋白或如权利要求46-55中任一项所述的多肽的方法，其包括培养如权利要求61-66中任一项所述的重组细胞，并纯化所述融合蛋白。
68.一种药物组合物，其包含有效量的如权利要求1-45中任一项所述的融合蛋白，或如权利要求46-55中任一项所述的多肽，或如权利要求56或57所述的多核苷酸，或如权利要求58-60中任一项所述的表达载体。
69.一种增强细胞中松弛素-2相关活性的方法，其包括使所述细胞与如权利要求1-45中任一项所述的融合蛋白或如权利要求46-55中任一项所述的多肽接触，从而增强所述细胞中的松弛素-2相关活性。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述融合蛋白激活细胞表面上的松弛素-2受体RXFP1。
71.如权利要求69或70所述的方法，其中所述方法提高所述细胞中的cAMP水平，从而诱导血管舒张、诱导血管生成因子的表达、诱导MMP的表达和诱导胶原降解。
72.如权利要求69-71中任一项所述的方法，其中所述细胞选自内皮细胞、血管平滑肌细胞、其它血管细胞、心肌细胞、其它心脏细胞和成纤维细胞。
73.如权利要求69-71中任一项所述的方法，其中所述细胞在受试者体内。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述受试者患有松弛素-2相关紊乱。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述松弛素-2相关紊乱选自肾病、纤维化疾病和心血管疾病。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述紊乱选自局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、糖尿病性肾病、肝肾综合征、硬皮病、特发性肺纤维化、肾纤维、心脏纤维化、NASH、扩张型心肌病、舒张性心力衰竭、肺动脉高压、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、高血压和先兆子痫。
77.一种治疗有需要的受试者中的松弛素相关紊乱的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-45中任一项所述的融合蛋白，或如权利要求46-55中任一项所述的多肽，如权利要求56或57所述的聚核苷酸，如权利要求58-60中任一项所述的表达载体，或如权利要求68所述的药物组合物，从而治疗所述松弛素相关紊乱。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述松弛素-2相关紊乱选自肾病、纤维化疾病和心血管疾病。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述紊乱选自局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、糖尿病性肾病、肝肾综合征、硬皮病、特发性肺纤维化、肾纤维、心脏纤维化、NASH、扩张型心肌病、舒张性心力衰竭、肺动脉高压、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、高血压和先兆子痫。
80.如权利要求77-79中任一项所述的方法，其中所述方法降低动脉压，增加肾动脉血流，增加心脏舒张时的心脏充盈，消解已形成的纤维化或抑制新的纤维化发展。
81.一种试剂盒，其包含有效量的如权利要求1-45任一项所述的融合蛋白，或如权利要求46-55任一项所述的多肽、如权利要求56或57所述的多核苷酸、如权利要求58-60任一项所述的表达载体，或权利要求68所述的药物组合物，和使用说明。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US9567386B2 (en) * 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
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