CN111253486A - 抗pd-1抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开了抗PD‑1抗体和包含抗PD‑1抗体的药物组合物，用于治疗疾病或病症。

Description

抗PD-1抗体及其用途
发明背景
免疫系统能够识别和消除肿瘤微环境中的肿瘤细胞。先天免疫和适应性免疫二者作为识别和去除这些细胞的互补网络起作用。免疫疗法是一种调节免疫系统以识别并随后消除肿瘤细胞的治疗方法。
发明内容
在某些实施方案中，本文公开了抗PD-1抗体、其药物组合物及其使用方法。
在某些实施方案中，本文公开了一种抗PD-1抗体，其包含三个可变重链互补决定区(CDR)和三个可变轻链互补决定区(CDR)，其中与纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab)相比，所述抗PD-1抗体与PD-1的胞外域上的不同表位特异性结合，并且其中所述抗PD-1抗体的结合亲和力与纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力相当。在一些实施方案中，VH CDR1序列由X1YX2MS组成；其中X1是S或T并且X2是G或T；VH CDR2序列由X3ISX4GGX5DTYYPDX6VKG组成；其中X3是T或Y；X4是G或F；X5是R或G；并且X6是S或T；并且VHCDR3序列由QX7X8X9X10X11X12X13X14X15X16组成；其中X7是R或G；X8是D或N；X9是S或Y；X10是A或E；X11是W或G；X12是F或A；X13是A或P；X14是H、F或Y；X15存在或不存在，并且如果存在，则是A；并且X16存在或不存在，并且如果存在，则是Y。
在某些实施方案中，本文公开了一种抗PD-1抗体，其包含三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)，其中：(a)VH CDR1序列由X1YX2MS组成；其中X1是S或T并且X2是G或T；(b)VH CDR2序列由X3ISX4GGX5DTYYPDX6VKG组成；其中X3是T或Y；X4是G或F；X5是R或G；并且X6是S或T；并且(c)VH CDR3序列由QX7X8X9X10X11X12X13X14X15X16组成；其中X7是R或G；X8是D或N；X9是S或Y；X10是A或E；X11是W或G；X12是F或A；X13是A或P；X14是H、F或Y；X15存在或不存在，并且如果存在，则是A；并且X16存在或不存在，并且如果存在，则是Y。
在一些实施方案中，VL CDR1序列由RASX17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28组成；其中X17是E或Q；X18是S或D；X19是V或I；X20是D或S；X21是S、N或D；X22是Y或F；X23是G或L；X24是I或N；X25存在或不存在，并且如果存在，则是S；X26存在或不存在，并且如果存在，则是F；X27存在或不存在，并且如果存在，则是M；X28存在或不存在，并且如果存在，则是N；VL CDR2序列由X29X30SX31X32X33S组成；其中X29是A或Y；X30是A或T；X31是N或R；X32是Q或L；X33是G或H；并且VLCDR3序列由QQX34X35X36X37PWT组成；其中X34是S或G；X35是K或D；X36是E或M；X37是V或I。
在一些实施方案中，所述VH CDR1序列选自SEQ ID NO：1、4或7。在一些实施方案中，所述VH CDR2序列选自SEQ ID NO：2、5或8。在一些实施方案中，所述VH CDR3序列选自SEQ ID NO：3、6或9。
在一些实施方案中，所述VL CDR1序列选自SEQ ID NO：19、22或25。在一些实施方案中，所述VL CDR2序列选自SEQ ID NO：20、23或26。在一些实施方案中，所述VL CDR3序列选自SEQ ID NO：21、24或27。
在一些实施方案中，所述VH CDR1序列选自SEQ ID NO：1、4或7；所述VH CDR2序列选自SEQ ID NO：2、5或8；并且所述VH CDR3序列由QX7X8X9X10X11X12X13X14X15X16组成；其中X7是R或G；X8是D或N；X9是S或Y；X10是A或E；X11是W或G；X12是F或A；X13是A或P；X14是H、F或Y；X15存在或不存在，并且如果存在，则是A；并且X16存在或不存在，并且如果存在，则是Y。
在一些实施方案中，所述VH CDR1序列选自SEQ ID NO：1、4或7；所述VH CDR2序列选自SEQ ID NO：2、5或8；并且所述VH CDR3序列选自SEQ ID NO：3、6或9。
在一些实施方案中，所述VL CDR1序列选自SEQ ID NO：19、22或25；所述VL CDR2序列选自SEQ ID NO：20、23或26；并且所述VL CDR3序列由QQX34X35X36X37PWT组成；其中X34是S或G；X35是K或D；X36是E或M；X37是V或I。
在一些实施方案中，所述VL CDR1序列由RASX17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28组成；其中X17是E或Q；X18是S或D；X19是V或I；X20是D或S；X21是S、N或D；X22是Y或F；X23是G或L；X24是I或N；X25存在或不存在，并且如果存在，则是S；X26存在或不存在，并且如果存在，则是F；X27存在或不存在，并且如果存在，则是M；X28存在或不存在，并且如果存在，则是N；所述VLCDR2序列选自SEQ ID NO：20、23或26；并且所述VL CDR3序列选自SEQ ID NO：21、24或27。
在一些实施方案中，所述VL CDR1序列选自SEQ ID NO：19、22或25；所述VL CDR2序列选自SEQ ID NO：20、23或26；并且所述VL CDR3序列选自SEQ ID NO：21、24或27。
在一些实施方案中，所述VH CDR1序列选自SEQ ID NO：10、13或16。在一些实施方案中，所述VH CDR2序列选自SEQ ID NO：11、14或17。在一些实施方案中，所述VH CDR3序列选自SEQ ID NO：12、15或18。
在一些实施方案中，所述VL CDR1序列选自SEQ ID NO：28、31或34。在一些实施方案中，所述VL CDR2序列选自SEQ ID NO：29、32或35。在一些实施方案中，所述VL CDR3序列选自SEQ ID NO：30、33、36。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：1-3的三个VH CDR和根据SEQ ID NO：19-21的三个VL CDR。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：4-6的三个VH CDR和根据SEQ ID NO：22-24的三个VL CDR。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：7-9的三个VH CDR和根据SEQ ID NO：25-27的三个VL CDR。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：10-12的三个VH CDR和根据SEQ ID NO：28-30的三个VL CDR。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：13-15的三个VH CDR和根据SEQ ID NO：31-33的三个VL CDR。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：16-18的三个VH CDR和根据SEQ ID NO：34-36的三个VL CDR。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：38的VH序列和根据SEQID NO：40的VL序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：42的VH序列和根据SEQID NO：44的VL序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：46的VH序列和根据SEQID NO：48的VL序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：50的VH序列和根据SEQID NO：52的VL序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：54的VH序列和根据SEQID NO：56的VL序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：58的VH序列和根据SEQID NO：60的VL序列。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体的结合亲和力高于纳武单抗的结合亲和力。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体的结合亲和力高于派姆单抗的结合亲和力。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体的结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体的结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％或更多。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体阻断PD-1与PD-L1和/或PD-L2的相互作用。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体在约5-7nM的抗体浓度范围下具有＞40％抑制、＞50％抑制或＞60％抑制。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体在6.67nM的抗体浓度下具有＞46％的抑制。
在一些实施方案中.所述抗PD-1抗体具有小于8e-9M、小于6e-9M、小于4e-9M、小于2.5e-9M、小于2e-9M、小于1.5e-9M或小于1.2e-9M的KD。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体具有约2.43e-9M的KD。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体具有约1.16e-9M的KD。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体具有与纳武单抗和/或派姆单抗相似的IC50。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体诱导细胞因子产生。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2或INF-γ。
在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含IgG1构架。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体包含IgG4构架。在一些实施方案中，所述构架是人源化IgG1或IgG4构架。在一些实施方案中，所述IgG4构架包含S228P突变。
在某些实施方案中，本文公开了一种抗PD-1抗体，其包含三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)，其中VH CDR1序列选自SEQ ID NO：1、4、7、10、13或16；VH CDR2序列选自SEQ ID NO：2、5、8、11、14或17；并且VH CDR3序列选自SEQID NO：3、6、9、12、15或18。在一些实施方案中，VL CDR1序列选自SEQ ID NO：19、22、25、28、31或34；VL CDR2序列选自SEQ ID NO：20、23、26、29、32或35；并且VL CDR3序列选自SEQ IDNO：21、24、27、30、33或36。
在某些实施方案中，本文公开了一种抗PD-1抗体，其包含根据SEQ ID NO：1-3的三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和根据SEQ ID NO：19-21的三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)。
在某些实施方案中，本文公开了一种抗PD-1抗体，其包含根据SEQ ID NO：4-6的三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和根据SEQ ID NO：22-24的三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)。
在某些实施方案中，本文公开了一种抗PD-1抗体，其包含选自SEQ ID NO：38和40、42和44、46和48、50和52、54和56、58和60的可变重链序列和可变轻链序列对。
在某些实施方案中，本文公开了一种抗PD-1抗体，其包含选自SEQ ID NO：62、64和66的可变重链序列和选自SEQ ID NO：68、70、72和74的可变轻链序列。
在某些实施方案中，本文公开了一种抗PD-1抗体，其包含选自SEQ ID NO：76、78、80和82的可变重链序列和选自SEQ ID NO：84、86、88、90和92的可变轻链序列。
在某些实施方案中，本文公开了药物组合物，其包含上述抗PD-1抗体和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于全身施用。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制用于肠胃外施用。
在某些实施方案中，本文公开了编码上述抗PD-1抗体的分离的核酸分子。
在某些实施方案中，本文公开了包含编码上述抗PD-1抗体的核酸序列的载体。
在某些实施方案中，本文公开了产生上述抗PD-1抗体的宿主细胞。
在某些实施方案中，本文公开了治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用上述抗PD-1抗体。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症是膀胱癌、脑癌、乳腺癌、膀胱癌、骨癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或子宫癌。在一些实施方案中，所述癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，所述癌症是霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，顺序地施用所述抗PD-1抗体和所述另外的治疗剂。在一些实施方案中，在施用所述另外的治疗剂之前向所述受试者施用所述抗PD-1抗体。在一些实施方案中，在施用所述抗PD-1抗体之前向所述受试者施用所述另外的治疗剂。在一些实施方案中，同时施用所述抗PD-1抗体和所述另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体和所述另外的治疗剂被配制为单独的剂型。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在某些实施方案中，本文公开了一种在患有癌症的受试者中加强细胞因子产生的方法，包括使所述受试者的细胞与上述抗PD-1抗体接触，从而诱使细胞因子产生相对于同一受试者的未接触所述抗体的细胞中的细胞因子产生而言增加。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，所述细胞因子是INF-γ。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症是膀胱癌、脑癌、乳腺癌、膀胱癌、骨癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或子宫癌。在一些实施方案中，所述癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，所述癌症是霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，顺序地施用所述抗PD-1抗体和所述另外的治疗剂。在一些实施方案中，在施用所述另外的治疗剂之前向所述受试者施用所述抗PD-1抗体。在一些实施方案中，在施用所述抗PD-1抗体之前向所述受试者施用所述另外的治疗剂。在一些实施方案中，同时施用所述抗PD-1抗体和所述另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体和所述另外的治疗剂被配制为单独的剂型。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在某些实施方案中，本文公开了一种诱导表达PD-L1和/或PD-L2的细胞的吞噬的方法，包括用上述抗PD-1抗体阻断所述细胞与表达PD-1的T细胞的结合，从而诱导所述细胞的吞噬。在一些实施方案中，所述细胞是癌性细胞。在一些实施方案中，所述细胞来自实体瘤。在一些实施方案中，所述细胞来自血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述细胞来自膀胱癌、脑癌、乳腺癌、膀胱癌、骨癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或子宫癌。在一些实施方案中，所述细胞来自淋巴瘤。在一些实施方案中，所述细胞来自霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，所述受试者是人。
在某些实施方案中，本文公开了包含上述抗PD-1抗体或上述药物组合物的试剂盒。
附图说明
本公开内容的各个方面在所附权利要求中具体阐述。本专利申请文件包含至少一个彩色附图。具有彩色附图的本专利申请的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
通过参考对在其中利用到本公开内容的原理的说明性实施方案加以阐述的以下详细描述和附图，将会对本公开内容的特征和优点获得更好的理解，在附图中：
图1是程序性死亡1(PD-1)受体及其配体-程序性死亡配体1(PD-L1)和程序性死亡配体2(PD-L2)，CD28和B7家族成员的草图。
图2示出了使用重组人PD-1蛋白进行2次加强免疫(boost)后，免疫接种小鼠的血清中的人PD-1特异性抗体水平。
图3示出了在PD-1/PD-L1结合测定中鼠抗体试样(hit)的阻断活性的完整曲线。
图4A示出了在ELISA测定中通过选定的抗PD-1抗体试样对PD-1/PD-L2结合的阻断。
图4B示出了在ELISA测定中通过选定的抗PD-1抗体试样对PD-1/PD-L2结合的阻断。
图5示出了鼠抗PD-1抗体对鼠PD-1的交叉反应性。
图6示出了在2剂量DC/T MLR测定中，抗-PD-1抗体增加IL-2产生。
图7示出了在2剂量DC/T MLR测定中，抗-PD-1抗体增加IFN-γ产生。
图8A示出了在未成熟DC/T MLR测定中IL-2产生通过抗hPD-1抗体试样的增加。
图8B示出了在未成熟DC/T MLR测定中IFN-γ产生通过抗hPD-1抗体试样的增加。
图9示出了在ELISA测定中嵌合抗PD-1抗体与人PD-1的结合。
图10A示出了针对嵌合抗体试样的基于FRET的PD-1/PD-L1结合/阻断测定。
图10B示出了针对嵌合抗体试样的基于FRET的PD-1/PD-L1结合/阻断测定。
图11示出了在基于蛋白质的ELISA测定中通过嵌合抗PD-1抗体对PD-1/PD-L2结合的阻断。
图12A示出了第一MLR测定中对嵌合抗体功能的验证。
图12B示出了第二MLR测定中对嵌合抗体功能的验证。
图13A示出了在Jurkat-NFAT萤光素酶报告基因测定中，选定嵌合PD-1抗体的功能活性的结果。
图13B示出了在Jurkat-NFAT萤光素酶报告基因测定中，选定嵌合PD-1抗体的功能活性的结果。
图14A示出了用于测试选定的PD-1抗体的基于细胞的PD-1/PD-L1结合阻断测定。
图14B示出了用于测试选定的PD-1抗体的基于细胞的PD-1/PD-L2结合阻断测定。
图15A-图15D示出了在人PD-1敲入小鼠中通过用抗PD-1抗体处理对MC38肿瘤生长的抑制。图15A：hIgG1同种型。图15B：Opdivo类似物。图15C：Xi31G1E10。图15D：Xi56B3C11。
图16A示出了通过ELISA测定的31G1E10人源化PD-1抗体的EC50。
图16B示出了通过ELISA测定的56B3C11人源化PD-1抗体的EC50。
图16C示出了通过ELISA测定的56B3C11人源化PD-1抗体的EC50。
图17A和图17B示出了在两个独立测定中人源化PD-1抗体的PD-1/PD-L1阻断活性。
图18A-图18E示出了在萤光素酶报告基因形式中，选定的人源化PD-1抗体对PD-1/PD-L1结合阻断的活性。
图19A示出了在基于细胞的PD-L1结合阻断测定中抗PD-1抗体变体的活性。
图19B示出了在基于细胞的PD-L2结合阻断测定中抗PD-1抗体变体的活性。
图20A和图20B示出了在DC/T MLR测定中，抗PD-1抗体变体增加IL-2产生。
图20C和图20D示出了在DC/T MLR测定中，抗PD-1抗体变体增加IFN-γ产生。
图21A和图21B示出了在CMV回忆测定中，抗PD-1抗体变体增加IFN-γ产生。
图22A示出了派姆单抗类似物在MC38肿瘤模型中的体内肿瘤抑制活性。
图22B示出了31G1E10-7在MC38肿瘤模型中的体内肿瘤抑制活性。
图22C示出了31G1E10-12在MC38肿瘤模型中的体内肿瘤抑制活性。
图22D示出了31G1E10-13在MC38肿瘤模型中的体内肿瘤抑制活性。
图22E示出了31G1E10-18在MC38肿瘤模型中的体内肿瘤抑制活性。
图23示出了选定的抗PD-1抗体的冻/融稳定性。
图24A示出了选定的抗PD-1抗体在4℃下的加速稳定性。
图24B示出了选定的抗PD-1抗体在25℃下的加速稳定性。
图24C示出了选定的抗PD-1抗体在40℃下的加速稳定性。
具体实施方式
程序性细胞死亡1也称为PDCD1，是一种I型跨膜糖蛋白。它是一种免疫受体，属于CD28/CTLA-4家族，该家族通过在与两种配体PD-L1或PD-L2(参见，例如，图1)中的任一种相互作用时募集蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2来负调节抗原受体信号传导。PD-1通过抑制PI3K/AKT途径的激活和转导来抑制T细胞增殖和相关细胞因子如IL-1、IL-4、IL-10和IFN-γ的产生。此外，PD-1的共连接通过使信号转导物去磷酸化来抑制BCR介导的信号传导。在一些情况下，PD-1被认为参与淋巴细胞克隆选择和外周耐受，并进一步有助于预防自身免疫疾病。此外，已显示PD-1是HIV感染中病毒特异性CD8+T细胞存活的调节剂。作为细胞表面分子，PDCD1调节适应性免疫应答。PD-1被其配体PD-L1或PD-L2的接合转导抑制T细胞增殖、细胞因子产生和细胞溶解功能的信号。
本文公开了与PD-1结合并抑制PD-1与其配体PD-L1和/或PD-L2的相互作用的抗体。在一些情况下，本文所述的抗体表现出许多期望的性质，例如，与PD-1(例如，与人PD-1)的高亲和力结合，增强肿瘤浸润淋巴细胞的增殖和扩增并减少肿瘤细胞的免疫逃避。
在某些实施方案中，本文还公开了包含抗PD-1抗体的药物组合物，用于治疗癌症的方法以及诱导肿瘤细胞杀伤活性的方法。
抗PD-1抗体
在某些实施方案中，本文公开了抗PD-1抗体。在一些实施方案中，与纳武单抗或派姆单抗相比，抗PD-1抗体与PD-1胞外域上的不同表位结合。在一些情况下，与纳武单抗和派姆单抗相比，抗PD-1抗体与PD-1胞外域上的不同表位结合。在一些情况下，抗PD-1抗体的结合亲和力与纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力相当。在另外的情况下，与纳武单抗和派姆单抗相比，抗PD-1抗体与PD-1胞外域上的不同表位特异性结合，并且抗PD-1抗体的结合亲和力与纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力相当。
在一些实施方案中，本文公开了一种抗PD-1抗体，其包含三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)，其中：
a)VH CDR1序列由X1YX2MS组成；
其中X1是S或T并且X2是G或T；
b)VH CDR2序列由X3ISX4GGX5DTYYPDX6VKG组成；
其中X3是T或Y；X4是G或F；X5是R或G；并且X6是S或T；
并且
c)VH CDR3序列由QX7X8X9X10X11X12X13X14X15X16组成；
其中X7是R或G；X8是D或N；X9是S或Y；X10是A或E；X11是W或G；X12是F或A；X13是A或P；X14是H、F或Y；X15存在或不存在，并且如果存在，则是A；并且X16存在或不存在，并且如果存在，则是Y。
在一些实施方案中，VH CDR1序列是SYGMS、TYGMS、SYTMS或TYTMS；VH CDR2序列由X3ISX4GGX5DTYYPDX6VKG组成，其中X3是T或Y；X4是G或F；X5是R或G；并且X6是S或T；并且VHCDR3序列由QX7X8X9X10X11X12X13X14X15X16组成，其中X7是R或G；X8是D或N；X9是S或Y；X10是A或E；X11是W或G；X12是F或A；X13是A或P；X14是H、F或Y；X15存在或不存在，并且如果存在，则是A；并且X16存在或不存在，并且如果存在，则是Y。
在一些实施方案中，VH CDR1序列由X1YX2MS组成，其中X1是S或T并且X2是G或T；VHCDR 2序列是TISGGGRDTYYPDSVKG、YISGGGRDTYYPDSVKG、TISFGGRDTYYPDSVKG、YISFGGRDTYYPDSVKG、TISGGGGDTYYPDSVKG、YISGGGGDTYYPDSVKG、YISFGGGDTYYPDSVKG、TISGGGRDTYYPDTVKG、YISFGGRDTYYPDTVKG、YISFGGGDTYYPDTVKG、TISFGGGDTYYPDTVKG或TISGGGGDTYYPDTVKG；并且VH CDR3序列由QX7X8X9X10X11X12X13X14X15X16组成，其中X7是R或G；X8是D或N；X9是S或Y；X10是A或E；X11是W或G；X12是F或A；X13是A或P；X14是H、F或Y；X15存在或不存在，并且如果存在，则是A；并且X16存在或不存在，并且如果存在，则是Y。
在一些实施方案中，VH CDR1序列由X1YX2MS组成，其中X1是S或T并且X2是G或T；VHCDR2序列由X3ISX4GGX5DTYYPDX6VKG组成，其中X3是T或Y；X4是G或F；X5是R或G；并且X6是S或T；并且VH CDR3序列是QRDSAWFAH、QGDSAWFAH、QRNSAWFAH、QRDYAWFAH、QRDSEWFAH、QRDSAGFAH、QRDSAWAAH、QRDSAWFPH、QRDSAWFAF、QRDSAWFAY、QGNSAWFAH、QGNYAWFAH、QGNSEWFAH、QGNSAGFAH、QGNSAWAAH、QGNSAWFPH、QGNSAWFAF、QGNSAWFAY、QGNYAWFAH、QGNYEWFAH、QGNYAGFAH、QGNYAWAAH、QGNYAWFPH、QGNYAWFAF、QGNYAWFAY、QGNYEWFAH、QGNYEGFAH、QGNYEWAAH、QGNYEWFPH、QGNYEWFAF、QGNYEWFAY、QGNYEGFAH、QGNYEGAAH、QGNYEGFPH、QGNYEGFAF、QGNYEGFAY、QGNYEGAAH、QGNYEGAPH、QGNYEGAPF、QGNYEGAPY、QRDSAWFAHA、QRDSAWFAHAY、QGNSAWFAHA、QGNSAWFAHAY、QGNYAWFAHA、QGNYAWFAHAY、QGNYEWFAHA、QGNYEWFAHAY、QGNYEGFAHA、QGNYEGFAHAY、QGNYEGAAHA或QGNYEGAAHAY。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含选自SEQ ID NO：1、4或7的VH CDR1序列；选自SEQ ID NO：2、5或8的VH CDR2序列；以及VH CDR3序列，其由QX7X8X9X10X11X12X13X14X15X16组成，其中X7是R或G；X8是D或N；X9是S或Y；X10是A或E；X11是W或G；X12是F或A；X13是A或P；X14是H、F或Y；X15存在或不存在，并且如果存在，则是A；并且X16存在或不存在，并且如果存在，则是Y。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)，其中VH CDR1是SYGMS、SYTMS、TYGMS、SFYIH、SDYAWN或NYWIE；VH CDR2是TISGGGRDTYYPDSVKG、YISFGGGDTYYPDTVKG、TISGGGRDTYYPDSVKG、WVYPGDTKYNEKFKG、YIIYSGSTSYNPSLKS或NILPGTNNTNYNEKFKG；并且VH CDR3是QRDSAWFAH、QGNYEGAPFAY、QRDSAWFAY、HNYDTMDY、NYGSSFYYFDY或TFYGPFDY。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)，其中VH CDR1是SYGMS、SYTMS或TYGMS；VH CDR2是TISGGGRDTYYPDSVKG、YISFGGGDTYYPDTVKG或TISGGGRDTYYPDSVKG；并且VH CDR3是QRDSAWFAH、QGNYEGAPFAY或QRDSAWFAY。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含选自表1的VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3。
表1.
Figure BDA0002220906740000141
Figure BDA0002220906740000151
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：
a)由RASX17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28组成的VL CDR1序列；其中X17是E或Q；X18是S或D；X19是V或I；X20是D或S；X21是S、N或D；X22是Y或F；X23是G或L；X24是I或N；X25存在或不存在，并且如果存在，则是S；X26存在或不存在，并且如果存在，则是F；X27存在或不存在，并且如果存在，则是M；X28存在或不存在，并且如果存在，则是N；
b)由X29X30SX31X32X33S组成的VL CDR2序列；
其中X29是A或Y；X30是A或T；X31是N或R；X32是Q或L；X33是G或H；以及
c)由QQX34X35X36X37PWT组成的VL CDR3序列；
其中X34是S或G；X35是K或D；X36是E或M；X37是V或I。
在一些实施方案中，VL CDR1是RASESVDSYGISFMN、RASQDISNFLN、RASESVDDYGISFMN、RASQEISGYLS、HASQGISSNIG或KSSQSLLNSNSQKNYLA；VL CDR2序列由X29X30SX31X32X33S组成，其中X29是A或Y；X30是A或T；X31是N或R；X32是Q或L；X33是G或H；并且VLCDR3序列由QQX34X35X36X37PWT组成，其中X34是S或G；X35是K或D；X36是E或M；X37是V或I。
在一些实施方案中，VL CDR1序列由RASX17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28组成，其中X17是E或Q；X18是S或D；X19是V或I；X20是D或S；X21是S、N或D；X22是Y或F；X23是G或L；X24是I或N；X25存在或不存在，并且如果存在，则是S；X26存在或不存在，并且如果存在，则是F；X27存在或不存在，并且如果存在，则是M；X28存在或不存在，并且如果存在，则是N；VL CDR2序列是AASNQGS、YTSRLHS、AASNQGS、AASTLDS、HGTNLED或FTSTRES；并且VL CDR3序列由QQX34X35X36X37PWT组成，其中X34是S或G；X35是K或D；X36是E或M；X37是V或I。
在一些实施方案中，VL CDR1序列由RASX17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28组成，其中X17是E或Q；X18是S或D；X19是V或I；X20是D或S；X21是S、N或D；X22是Y或F；X23是G或L；X24是I或N；X25存在或不存在，并且如果存在，则是S；X26存在或不存在，并且如果存在，则是F；X27存在或不存在，并且如果存在，则是M；X28存在或不存在，并且如果存在，则是N；VL CDR2序列由X29X30SX31X32X33S组成，其中X29是A或Y；X30是A或T；X31是N或R；X32是Q或L；X33是G或H；并且VLCDR3序列是QQSKEVPWT、QQGDMIPWT、QQSKEVPWT、LQYASYPLT、VQYAQFPPT或QQHYNTPYT。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)，其中VL CDR1是RASESVDSYGISFMN、RASQDISNFLN、RASESVDDYGISFMN、RASQEISGYLS、HASQGISSNIG或KSSQSLLNSNSQKNYLA；VL CDR2序列是AASNQGS、YTSRLHS、AASNQGS、AASTLDS、HGTNLED或FTSTRES；并且VL CDR3序列是QQSKEVPWT、QQGDMIPWT、QQSKEVPWT、LQYASYPLT、VQYAQFPPT或QQHYNTPYT。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)，其中VL CDR1是RASESVDSYGISFMN、RASQDISNFLN或RASESVDDYGISFMN；VL CDR2序列是AASNQGS、YTSRLHS或AASNQGS；并且VL CDR3序列是QQSKEVPWT、QQGDMIPWT或QQSKEVPWT。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含选自表2的VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。
表2.
Figure BDA0002220906740000171
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)，其中VH CDR1是SEQ ID NO：1，VH CDR2是SEQ ID NO：2，并且VH CDR3是SEQ ID NO：3；并且VL CDR1是19，VL CDR2是SEQ ID NO：20，并且VL CDR3是SEQID NO：21。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)，其中VH CDR1是SEQ ID NO：4，VH CDR2是SEQ ID NO：5，并且VH CDR3是SEQ ID NO：6；并且VL CDR1是22，VL CDR2是SEQ ID NO：23，并且VL CDR3是SEQID NO：24。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)，其中VH CDR1是SEQ ID NO：7，VH CDR2是SEQ ID NO：8，并且VH CDR3是SEQ ID NO：9；并且VL CDR1是25，VL CDR2是SEQ ID NO：26，并且VL CDR3是SEQID NO：27。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)，其中VH CDR1是SEQ ID NO：10，VH CDR2是SEQ ID NO：11，并且VH CDR3是SEQ ID NO：12；并且VL CDR1是28，VL CDR2是SEQ ID NO：29，并且VL CDR3是SEQ ID NO：30。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)，其中VH CDR1是SEQ ID NO：13，VH CDR2是SEQ ID NO：14，并且VH CDR3是SEQ ID NO：15；并且VL CDR1是31，VL CDR2是SEQ ID NO：32，并且VL CDR3是SEQ ID NO：33。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)，其中VH CDR1是SEQ ID NO：16，VH CDR2是SEQ ID NO：17，并且VH CDR3是SEQ ID NO：18；并且VL CDR1是34，VL CDR2是SEQ ID NO：35，并且VL CDR3是SEQ ID NO：36。
在一些实施方案中，抗体包含人源化抗体、鼠抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、单价抗体、二价抗体或多价抗体。
在一些实施方案中，抗体包含全长抗体。如本文所用，术语“全长”是指包含Fab区和Fc区的抗体，其中Fc区包含CH2和CH3结构域。在一些情况下，抗体包含全长人源化抗体。在其他情况下，抗体包含全长嵌合抗体。在另外的情况下，抗体包含单价全长抗体、二价全长抗体或多价全长抗体。
在一些实施方案中，抗体包括抗体片段。在一些情况下，抗体片段包括单价Fab’、二价Fab2、F(ab)’3片段、单链可变片段(scFv)、双scFv、(scFv)2、双抗体、微抗体、纳米抗体、三抗体、四抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)、单域抗体(sd抗体)、Ig NAR、骆驼抗体或其结合片段、双特异性抗体或其结合片段，或它们的化学修饰衍生物。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含如表3所示的VH和VL序列。
表3
Figure BDA0002220906740000191
Figure BDA0002220906740000201
Figure BDA0002220906740000211
Figure BDA0002220906740000221
Figure BDA0002220906740000231
Figure BDA0002220906740000241
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含与SEQ ID NO：38至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；或包含与SEQ ID NO：40至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些情况下，抗PD-1抗体包含与SEQ ID NO：38至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；并且包含与SEQ ID NO：40至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些情况下，抗PD-1抗体包含SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：40。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含与SEQ ID NO：42至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；或包含与SEQ ID NO：44至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些情况下，抗PD-1抗体包含与SEQ ID NO：42至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；并且包含与SEQ ID NO：44至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些情况下，抗PD-1抗体包含SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：44。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含与SEQ ID NO：46至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；或包含与SEQ ID NO：48至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些情况下，抗PD-1抗体包含与SEQ ID NO：46至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；并且包含与SEQ ID NO：48至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些情况下，抗PD-1抗体包含SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：48。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含与SEQ ID NO：50至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；或包含与SEQ ID NO：52至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些情况下，抗PD-1抗体包含与SEQ ID NO：50至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；并且包含与SEQ ID NO：52至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些情况下，抗PD-1抗体包含SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含与SEQ ID NO：54至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；或包含与SEQ ID NO：56至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些情况下，抗PD-1抗体包含与SEQ ID NO：54至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；并且包含与SEQ ID NO：56至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在各个实施方案中，抗PD-1抗体包含SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：56。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含与SEQ ID NO：58至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；或包含与SEQ ID NO：60至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些情况下，抗PD-1抗体包含与SEQ ID NO：58至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；并且包含与SEQ ID NO：60至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些情况下，抗PD-1抗体包含SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：60。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含如表4所示的VH和VL序列。
表4
Figure BDA0002220906740000261
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含如表5所示的VH和VL序列。
表5
Figure BDA0002220906740000262
Figure BDA0002220906740000271
在一些实施方案中，上述抗PD-1抗体的结合亲和力高于纳武单抗的结合亲和力。
在一些实施方案中，上述抗PD-1抗体的结合亲和力高于派姆单抗的结合亲和力。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体的结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。在一些情况下，结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约2倍。在一些情况下，结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约3倍。在一些情况下，结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约4倍。在一些情况下，结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约5倍。在一些情况下，结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约10倍。在一些情况下，结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约20倍。在一些情况下，结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约50倍。在一些情况下，结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约100倍。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体的结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％或更多。在一些实施方案中，抗PD-1抗体的结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约10％或更多。在一些实施方案中，抗PD-1抗体的结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约15％或更多。在一些实施方案中，抗PD-1抗体的结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约20％或更多。在一些实施方案中，抗PD-1抗体的结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约30％或更多。在一些实施方案中，抗PD-1抗体的结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约40％或更多。在一些实施方案中，抗PD-1抗体的结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约50％或更多。在一些实施方案中，抗PD-1抗体的结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约100％或更多。在一些实施方案中，抗PD-1抗体的结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约200％或更多。在一些实施方案中，抗PD-1抗体的结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约500％或更多。
在一些实施方案中，上述抗PD-1抗体在约5-7nM的抗体浓度范围下具有＞40％抑制、＞50％抑制或＞60％抑制。在一些情况下，抗PD-1抗体在约5-7nM的抗体浓度范围(例如，约5、5.5、6、6.5或7nM浓度)下具有＞40％的抑制。在一些情况下，抗PD-1抗体在约5-7nM的抗体浓度范围(例如，约5、5.5、6、6.5或7nM浓度)下具有＞50％的抑制。在一些情况下，抗PD-1抗体在约5-7nM的抗体浓度范围(例如，约5、5.5、6、6.5或7nM浓度)下具有＞60％的抑制。在一些情况下，抗PD-1抗体在6.67nM的抗体浓度下具有＞46％的抑制。
在一些实施方案中，上述抗PD-1抗体具有小于8e-9M、小于6e-9M、小于4e-9M、小于2.5e-9M、小于2e-9M、小于1.5e-9M或小于1.2e-9M的KD。在一些情况下，抗PD-1抗体具有小于8e-9M的KD。在一些情况下，抗PD-1抗体具有小于6e-9M的KD。在一些情况下，抗PD-1抗体具有小于4e-9M的KD。在一些情况下，抗PD-1抗体具有小于2.5e-9M的KD。在一些情况下，抗PD-1抗体具有小于2e-9M的KD。在一些情况下，抗PD-1抗体具有小于1.5e-9M的KD。在一些情况下，抗PD-1抗体具有小于1.2e-9M的KD。在一些情况下，抗PD-1抗体具有约2.43e-9M的KD。在一些情况下，抗PD-1抗体具有约1.16e-9M的KD。
在一些实施方案中，上述抗PD-1抗体具有与纳武单抗和/或派姆单抗相似的IC50。
在一些实施方案中，上述抗PD-1抗体诱导细胞因子产生。在一些情况下，细胞因子是IL-2或INF-γ。在一些情况下，细胞因子是IL-2。在一些情况下，细胞因子是INF-γ。
在一些实施方案中，上述抗PD-1抗体包含IgG1构架。在一些情况下，构架是人源化IgG1。
在一些实施方案中，上述抗PD-1抗体包含IgG4构架。在一些情况下，构架是人源化IgG4构架。在一些情况下，IgG4构架包含S228P突变。
使用方法
在某些实施方案中，本文公开了通过向有需要的受试者施用上述抗PD-1抗体来治疗癌症的方法。在一些情况下，癌症是实体瘤。在一些情况下，癌症是血液恶性肿瘤。在一些情况下，癌症是膀胱癌、脑癌、乳腺癌、膀胱癌、骨癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或子宫癌。在一些情况下，癌症是淋巴瘤。在一些情况下，癌症是霍奇金淋巴瘤。
在一些实施方案中，方法进一步包括施用另外的治疗剂。在一些情况下，另外的治疗剂包括一线癌症治疗。在一些情况下，另外的治疗剂包括化学治疗剂或辐射。
在一些实施方案中，受试者已经进行了手术。
在一些情况下，顺序施用抗PD-1抗体和另外的治疗剂。在一些情况下，在施用另外的治疗剂之前向受试者施用抗PD-1抗体。在其他情况下，在施用抗PD-1抗体之前向受试者施用另外的治疗剂。
在其他情况下，同时施用抗PD-1抗体和另外的治疗剂。
在其他情况下，将抗PD-1抗体和另外的治疗剂被配制为单独的剂型。
在一些实施方案中，本文还公开了一种在癌症患者中加强细胞因子产生的方法。在一些情况下，细胞因子由肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)产生。在一些情况下，细胞因子包括白细胞介素(IL)-2、IL-4、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、IL-10、干扰素-γ(IFN-γ)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些情况下，细胞因子是IL-2。在一些情况下，细胞因子是IL-4。在一些情况下，细胞因子是TNF-α。在一些情况下，细胞因子是TGF-β1。在一些情况下，细胞因子是IL-10。在一些情况下，细胞因子是IFN-γ。在一些情况下，细胞因子是GM-CSF。
在一些实施方案中，本文还公开了一种诱导表达PD-L 1和/或PD-L2的细胞的吞噬的方法，其包括用上述抗PD-1抗体阻断细胞与表达PD-1的T细胞的结合，从而诱导细胞的吞噬。在一些情况下，细胞是肿瘤细胞。在一些情况下，细胞来自实体瘤，例如，来自膀胱癌、脑癌、乳腺癌、膀胱癌、骨癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或子宫癌。在一些情况下，细胞来自血液恶性肿瘤，例如，淋巴瘤，如霍奇金淋巴瘤。
抗体产生
在一些实施方案中，通过向生产动物注射抗原组合物，经由标准方案产生抗体。参见，例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988。当使用完整蛋白质或蛋白质的较大部分时，可以通过用蛋白质和合适的佐剂(例如，弗氏佐剂、弗氏完全佐剂、水包油乳剂等)将生产动物免疫接种来产生抗体。当使用较小的肽时，有利于将肽与较大的分子缀合以制备免疫刺激性缀合物。可商购获得的常用缀合蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)和匙孔血蓝蛋白(KLH)。为了产生针对特定表位的抗体，可以使用衍生自完整序列的肽。或者，为了生成针对蛋白质靶标的相对较短肽部分的抗体，如果多肽与载体蛋白质，如卵清蛋白、BSA或KLH结合，则可以引起优异的免疫应答。
多克隆或单克隆抗原结合单位或抗体可以从经过遗传改变以产生人免疫球蛋白的动物产生。通过最初产生“敲除”动物，该“敲除”动物不产生动物天然抗体，并且用人抗体基因座(例如，通过使用人工染色体)稳定地转化该动物，可以产生转基因动物。在这种情况下，随后该动物仅产生人抗体。生成这些动物并从中获得抗体的技术描述于美国专利号6,162,963和6,150,584中，其通过引用整体并入于此。此类抗体可称为人异种抗体。
或者，可以从含有人可变区的噬菌体文库中产生抗原结合单位。参见美国专利号6,174,708，其通过引用整体并入于此。
在本文公开的任何实施方案的一些方面，抗原结合单位由杂交瘤产生。
对于单克隆抗原结合单位或单克隆抗体，可以通过分离经刺激的免疫细胞，如来自接种动物脾脏的免疫细胞，来形成杂交瘤。然后，这些细胞可以融合成能够在细胞培养中无限复制的永生细胞，如骨髓瘤细胞或经转化的细胞，从而产生永生的免疫球蛋白分泌细胞系。使用的永生细胞系可以选择为缺乏对于利用某些营养素所必需的酶。许多此类细胞系(如骨髓瘤)是本领域技术人员已知的，并且包括，例如：胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)。这些缺陷允许根据融合细胞在例如次黄嘌呤氨基蝶呤胸苷培养基(HAT)上生长的能力来选择融合细胞。
此外，抗原结合单位可以通过遗传工程产生。本发明使用人源化的、嵌合的或异种的人抗原结合单位，其在施用于人时产生较少的免疫应答。
本文公开的抗原结合单位可具有降低的诱导人类不期望的免疫应答(例如，过敏性休克)的倾向，并且还可表现出降低的引发免疫应答(例如，人抗鼠抗体“HAMA”应答)的倾向，这将会防止抗体治疗或成像剂的重复剂量。此类抗原结合单位包括，但不限于，人源化的、嵌合的或异种的人抗原结合单位。
嵌合抗原结合单位或嵌合抗体可以例如经由重组手段，通过将从鼠(或衍生自其他动物的)杂交瘤克隆获得的鼠可变轻链和重链区(VK和VH)与人恒定轻链和重链区组合以产生主要具有人结构域的抗体而制备。这种嵌合抗体的产生是本领域公知的，并且可以通过标准手段实现(例如，如美国专利号5,624,659中所述，其通过引用整体并入于此)。
应用于非人(例如啮齿动物或灵长类动物)抗体的术语“人源化”是杂合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段，它们含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中来自接受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或灵长类动物的CDR的具有所需特异性、亲和力和能力的残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可以包含在接受体抗体和输入的CDR或构架序列中均未发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改善和优化抗体性能，并在引入人体时使免疫原性最小化。在一些示例中，人源化抗体将包含至少一个可变域(通常两个可变域)中的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR区都对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且全部或基本上全部FR区都是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。
可将人源化抗体工程化为含有人样免疫球蛋白域，并且仅掺入动物来源抗体的互补决定区。这可以通过仔细检查单克隆抗原结合单位或单克隆抗体的可变区的超变环序列，并将其装配到人抗原结合单位或人抗体链的结构来实现。参见，例如，美国专利号6,187,287，其通过引用整体并入于此。
将非人抗体人源化的方法是本领域公知的。“人源化”抗体是至少部分序列已经从其初始形式改变以使其更像人免疫球蛋白的抗体。在一些版本中，重(H)链和轻(L)链恒定(C)区被人序列取代。这可以是包含可变(V)区和异源免疫球蛋白C区的融合多肽。在一些版本中，互补决定区(CDR)包含非人抗体序列，而V构架区也已转化为人序列。参见，例如，EP0329400。在一些版本中，通过设计人和小鼠V区的共有序列，并转换CDR之外的在共有序列之间不同的残基而将V区人源化。
原则上，来自人源化抗体的构架序列可以用作CDR移植的模板；然而，已经证明，直接CDR取代到这种构架中可导致对抗原的结合亲和力的显著丧失。Glaser等人(1992)J.Immunol.149：2606；Tempest等人(1992)Biotechnology 9：266；和Shalaby等人(1992)J.Exp.Med.17：217。人抗体(HuAb)与原始鼠抗体(muAb)的同源性越高，人构架就越不可能将可能降低亲和力的失真引入鼠CDR中。基于针对抗体序列数据库的序列同源性搜索，HuAbIC4提供了与muM4TS.22的良好构架同源性，不过其他高度同源的HuAb也是适用的，尤其是来自人亚群I的K L链或来自人亚群III的H链。Kabat等人(1987)。各种计算机程序如ENCAD(Levitt等人(1983)J.Mol.Biol.168：595)可用于预测V区的理想序列。因此，本发明包括具有不同可变(V)区的HuAb。确定合适的V区序列并优化这些序列在本领域技术人员的能力范围内。获得具有降低的免疫原性的抗体的方法还描述于美国专利号5,270,202和EP 699,755中。
通过使用亲本和人源化序列的三维模型来分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程，可以制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是本领域技术人员熟悉的。可获得说明并显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可以从共有序列和输入序列中选择并组合FR残基，从而实现期望的抗体特征，如增加的靶抗原亲和力。
本发明抗原结合单位的人源化过程可以如下。基于用于移植的人抗体种系的同源性、规范结构和物理性质来选择最适合的种系接受者重链和轻链可变区。对mVH/VL与移植的hVH/VL进行计算机建模，并生成原型人源化抗体序列。如果建模表明需要构架回复突变，则生成具有指示的FW变化的第二变体。合成编码所选种系构架和鼠CDR的DNA片段。将合成的DNA片段亚克隆至IgG表达载体中，并通过DNA测序确认序列。使人源化抗体在细胞如293F中表达，并在例如MDM吞噬测定和抗原结合测定中测试蛋白质。例如通过对表达靶抗原的细胞进行FACS将人源化抗原结合单位与亲本抗原结合单位在抗原结合亲和力方面进行比较。如果亲和力比亲本抗原结合单位低2倍以上，则可以生成第二轮人源化变体，并进行如上所述的测试。
如上所述，抗原结合单位可以是“单价的”或“多价的”。前者的每个抗原结合单位有一个结合位点，后者含有多个结合位点，能够结合相同或不同种类的多于一个抗原。根据结合位点的数目，抗原结合单位可以是二价的(具有两个抗原结合位点)、三价的(具有三个抗原结合位点)、四价的(具有四个抗原结合位点)等。
多价抗原结合单位可以基于其结合特异性进一步分类。“单特异性”抗原结合单位是能够结合一种或多种相同类型抗原的分子。“多特异性”抗原结合单位是对至少两种不同抗原具有结合特异性的分子。虽然这些分子通常仅结合两种不同的抗原(即双特异性抗原结合单位)，但当在本文中使用时，该表达涵盖具有额外特异性的抗体，如三特异性抗体。本公开内容进一步提供了多特异性抗原结合单位。多特异性抗原结合单位是能够结合至少两种不同抗原的多价分子。优选的多特异性抗原结合单位是双特异性分子和三特异性分子，分别表现出对两种和三种不同抗原的结合特异性。
多核苷酸和载体
在一些实施方案中，本公开内容提供了编码本文公开的任何抗原结合单位的分离的核酸。在另一个实施方案中，本公开内容提供了包含编码本文公开的任何抗原结合单位的核酸序列的载体。在一些实施方案中，本发明提供了分离的核酸，其编码本文公开的抗原结合单位的轻链CDR和重链CDR。
可以通过重组DNA技术、合成化学技术或其组合来制备本发明抗原结合单位。例如，通常使用本领域已知的标准分子技术将编码抗原结合单位的所需组分的序列，包括轻链CDR和重链CDR，组装克隆至表达载体中。这些序列可以从编码所需蛋白质序列的其他载体组装，使用各自模板核酸从PCR生成的片段组装，或通过编码所需序列的合成寡核苷酸组装而成。通过用包含感兴趣的抗原结合单位的表达载体转染合适的细胞，可以创建表达系统。
可以使用常规技术，包括但不限于杂交、PCR和DNA测序，容易地获得对应于现有抗体的轻链或重链的各个区的核苷酸序列并将其测序。产生单克隆抗体的杂交瘤细胞用作抗体核苷酸序列的优选来源。大量产生一系列单克隆抗体的杂交瘤细胞可以从公共或私有储存库获得。最大的存管机构是美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection)(atcc.org)，它提供了多种良好表征的杂交瘤细胞系。或者，抗体核苷酸可以从经免疫接种或未免疫接种的啮齿动物或人获得，并从器官如脾脏和外周血淋巴细胞获得。在Orlandi等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86：3833-3837；Larrick等人(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.160：1250-1255；Sastry等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.86：5728-5732；以及美国专利号5,969,108中描述了适用于提取和合成抗体核苷酸的特定技术。
编码抗原结合单位的多核苷酸也可以被修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定区的编码序列代替同源非人序列而进行置换。以这种方式，制备嵌合抗体，其保留了原始抗原结合单位的结合特异性。
还应理解，本发明中体现的多核苷酸包括编码示例性多肽的功能等同物及其片段的多核苷酸。功能等同的多肽包括增强、降低或不显著影响所编码多肽性质的多肽。功能等同物可以是具有保守氨基酸置换的多肽，包含融合的类似物，和突变体。
由于遗传密码的简并性，抗原结合单位编码序列的核苷酸，以及适合构建本发明的多核苷酸和载体的序列可以有相当大的变异。序列变体可具有修饰的DNA或氨基酸序列，一个或多个置换、缺失或添加，其净效应是保留所需的抗原结合活性。例如，可以在编码区中进行各种置换，其不改变编码的氨基酸且不导致保守变化。这些置换包括在本发明中。保守氨基酸置换包括以下组别内的置换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。虽然保守置换确实有效改变了将会产生的多肽中包含的一个或多个氨基酸残基，但该置换预计不会干扰将会产生的所得抗原结合单位的抗原结合活性。不改变编码的氨基酸残基的核苷酸置换可用于优化不同系统中的基因表达。适当的置换是本领域技术人员已知的那些，并且进行适当的置换以为了例如反映表达系统中的优选密码子使用。
如果需要，重组多核苷酸可包含有助于检测基因产物表达和基因产物纯化的异源序列。此类序列的示例是本领域已知的，并且包括编码报告蛋白的那些，该报告蛋白是诸如β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物。其他促进纯化的异源序列可编码表位，如Myc、HA(源自流感病毒血凝素)、His-6、FLAG，或免疫球蛋白、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和麦芽糖结合蛋白(MBP)的Fc部分。
本文公开的多核苷酸可与上述多种化学功能部分缀合。常用的部分包括能够产生可检测信号的标记、信号肽、增强免疫反应性的药剂、促进与固体支持物耦合的药剂、疫苗载体、生物应答修饰剂、顺磁标记和药物。这些部分可以通过重组或其他本领域已知的手段共价连接至多核苷酸。
本发明的多核苷酸可包含另外的序列，如相同转录单位内的另外的编码序列，控制元件如启动子，核糖体结合位点，以及多腺苷酸化位点，在相同或不同启动子控制下的另外的转录单位，允许宿主细胞克隆、表达和转化的序列，以及对于提供本发明实施方案而言可能需要的任何此类构建体。
本发明中体现的多核苷酸可以使用化学合成、重组克隆方法、PCR或其任何组合获得。化学多核苷酸合成的方法是本领域公知的，不需要在此详细描述。本领域技术人员可以使用本文提供的序列数据，通过使用DNA合成仪或从商业服务进行订购来获得所需的多核苷酸。
可以将包含所需序列的多核苷酸插入合适的载体中，进而可将该载体引入合适的宿主细胞中进行复制和扩增。因此，本发明包括多种载体，其包含本发明的一种或多种多核苷酸。还提供了可选择的表达载体文库，其包含编码本文公开的抗原结合单位的至少一种载体。
本发明的载体通常包含表达抗原结合单位所需的转录或翻译控制序列。合适的转录或翻译控制序列包括但不限于转录和翻译的复制起点、启动子、增强子、阻遏物结合区、转录起始位点、核糖体结合位点、翻译起始位点和终止位点。
启动子的选择在很大程度上将取决于其中引入载体的宿主细胞。还可以利用通常与所需轻链或重链基因相关联的启动子，只要这些控制序列与宿主细胞系统兼容。还可以使用细胞特异性或组织特异性的启动子。本领域技术人员已经描述并使用了各种各样的组织特异性启动子。在选择性动物细胞中起作用的示例性启动子包括肝细胞特异性启动子和心肌特异性启动子。根据受体细胞类型的选择，本领域技术人员将知道适用于构建本发明表达载体的其他合适的细胞特异性或组织特异性启动子。
使用已知的分子克隆或遗传工程技术，可将适当的转录控制序列、增强子、终止子或本领域已知的任何其他遗传元件整合成操作关系，任选地附加地，其中完整的可选融合基因将根据本发明进行表达。除上述元件之外，载体还可含有选择标记(例如，编码对用载体转化的宿主细胞生存或生长所必需的蛋白质的基因)，尽管这种标记基因也可以在共同引入宿主细胞的另一种多核苷酸序列上携带。
本发明的多核苷酸和载体具有几种特定用途。它们可用于例如产生抗原结合单位的表达系统。此类多核苷酸可用作引物，以实现所需多核苷酸的扩增。此外，本发明的多核苷酸还可用于药物组合物，包括疫苗、诊断剂和药物。
本发明的宿主细胞可尤其用作本发明多核苷酸的储存库、载体或用作根据其抗原结合特异性产生和筛选所需抗原结合单位的媒介物。
因此，本发明提供了一种鉴定与所需抗原具有免疫反应的抗原结合单位的方法。这种方法可包括以下步骤：(a)制备抗原结合单位的遗传多样性文库，其中文库包含至少一种本发明抗原结合单位；(b)使抗原结合单位的文库与所需抗原接触；(c)检测抗原结合单位与抗原之间的特异性结合，从而鉴定与所需抗原具有免疫反应的抗原结合单位。
抗原结合单位特异性结合所需抗原的能力可通过本领域熟知的各种程序来测试。参见Harlow和Lane (1988)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，New York；Gherardi等人(1990)J. Immunol.Meth.126：61-68。通常，表现出所需结合特异性的抗原结合单位可以通过免疫测定直接检测，例如，通过使标记的抗原结合单位与固定在固体支持物或基底上的抗原反应。通常，抗原附着至的基底是由免疫测定期间表现出低水平的非特异性结合的材料制造。示例性固体支持物由以下类型材料中的一种或多种制成：塑料聚合物、玻璃、纤维素、硝化纤维素、半导体材料和金属。在一些示例中，基底是培养皿、色谱珠、磁珠等。
对于此类固相测定，通过洗涤除去未反应的抗原结合单位。然而，在液相测定中，通过一些其他分离技术如过滤或色谱法来除去未反应的抗原结合单位。在将抗原与标记的抗原结合单位结合后，确定结合的标记的量。该技术的一个变体是竞争性测定，其中抗原与原始结合分子结合至饱和。当一群本发明抗原结合单位引入至复合物时，只有表现出较高结合亲和力的那些才能竞争，从而保持与抗原结合。
或者，可通过细胞分选来评估与给定抗原的特异性结合，细胞分选涉及在待分选细胞上呈递所需抗原，然后用与可检测药剂耦合的抗原结合单位标记靶细胞，随后在细胞分选器中将标记的细胞与未标记的细胞分离。荧光激活细胞分选(FACS)是一种复杂的细胞分离方法。使在细流中以单列行进的细胞通过激光束，然后测量由荧光标记的抗原结合单位结合的每个细胞的荧光。
洗脱的抗原结合单位的后续分析可涉及用于描述轻链和重链的氨基酸序列的蛋白质测序。基于推导的氨基酸序列，然后编码抗体多肽的cDNA可以通过重组克隆方法获得，该重组克隆方法包括PCR、文库筛选、现有核酸数据库中的同源性搜索或其任何组合。常用的数据库包括但不限于GenBank、EMBL、DDBJ、PDB、SWISS-PROT、EST、STS、GSS和HTGS。
当在噬菌体或细菌颗粒上展示抗原结合单位文库时，优选使用亲和色谱法进行选择。该方法通常继续将噬菌体抗原结合单位文库与抗原包被的板、柱基质、细胞或溶液中的生物素化抗原结合，然后捕获。洗涤与固相结合的噬菌体或细菌，然后通过可溶性半抗原、酸或碱洗脱该噬菌体或细菌。或者，增加抗原浓度可用于将抗原结合单位与亲和基质解离。如WO 92/01047所述，对于对抗原具有极高亲和力或亲合力的某些抗原结合单位，有效洗脱可能需要高pH或温和的还原溶液。
选择效率可能取决于多种因素的组合，包括洗涤期间的解离动力学，以及单个噬菌体或细菌上的多个抗原结合单位是否可以同时与固体支持物上的抗原结合。例如，具有快速解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体可以通过在固体支持物上使用短洗涤、多价展示和抗原的高包被密度来保留。相反，通过使用长洗涤、单价噬菌体和抗原的低包被密度可有利于选择具有缓慢解离动力学(和良好结合亲和力)的抗原结合单位。
如果需要，可以针对不相关抗原对抗原结合单位文库进行预先选择，以反选不需要的抗原结合单位。还可以针对相关抗原对文库进行预先选择，以分离例如抗独特型抗原结合单位。
宿主细胞
在一些实施方案中，本公开内容提供了表达本文公开的任何一种抗原结合单位的宿主细胞。本发明的宿主细胞通常包含编码本文公开的任何一种抗原结合单位的核酸。
本发明提供了用上述多核苷酸、载体或载体文库转染的宿主细胞。可以通过多种适当手段中的任一种将载体引入合适的原核或真核细胞中，包括电穿孔、微弹轰击；脂质转染、感染(其中载体与感染因子耦合)，使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质转染。引入载体的方法的选择通常将取决于宿主细胞的特征。
对于大多数动物细胞，上述任何手段都适用于载体递送。优选的动物细胞是能够大量(例如，在毫克水平下)表达外源引入的基因产物的脊椎动物细胞，优选哺乳动物细胞。优选细胞的非限制性示例是NIH3T3细胞、COS、HeLa和CHO细胞。
一旦被引入合适的宿主细胞，抗原结合单位的表达可以使用本领域已知的任何核酸或蛋白质测定来确定。例如，可使用与抗原结合单位多核苷酸的任何区互补的探针，通过常规杂交测定(例如RNA印迹分析)、扩增程序(例如RT-PCR)、SAGE(美国专利号5,695,937)和基于阵列的技术(参见例如美国专利号5,405,783、5,412,087和5,445,934)来检测和/或定量轻链CDR或重链CDR的转录mRNA，或抗原结合单位的存在。
载体的表达还可以通过检查表达的抗原结合单位来确定。本领域中有多种技术可用于蛋白质分析。它们包括但不限于放射免疫测定、ELISA(酶联免疫放射测定)、“三明治”免疫测定、免疫放射测定、原位免疫测定(使用例如，胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀测定、免疫荧光测定和SDS-PAGE。
抗原结合单位的制备
在一些实施方案中，本公开内容提供了产生本文公开的任何抗原结合单位的方法，其中该方法包括在适于表达抗原结合单位的条件下培养表达抗原结合单位的宿主细胞，以及分离由宿主细胞表达的抗原结合单位。
所表达的抗原结合单位可以使用本领域已知的多种蛋白质纯化技术分离。通常，抗原结合单位作为分泌的多肽从培养基中分离，尽管它们也可在无信号肽的情况下直接产生时从宿主细胞裂解物或细菌周质中回收。如果抗原结合单位是膜结合的，它们可以通过本领域技术人员常用的适当洗涤剂溶液溶解。回收的抗原结合单位可以通过盐沉淀(例如，用硫酸铵)、离子交换色谱法(例如在中性pH下在阳离子或阴离子交换柱上运行并用离子强度增加的步骤梯度洗脱)、凝胶过滤色谱法(包括凝胶过滤HPLC)以及标签亲和柱色谱法，或亲和树脂如蛋白A、蛋白G、羟基磷灰石和抗免疫球蛋白来进一步纯化。
此外，在本发明的方法和组合物中可以使用添加了化学连接体的衍生免疫球蛋白，可检测部分如荧光染料，酶，底物，化学发光部分，特异性结合部分如链霉亲和素、亲和素或生物素，或药物缀合物。
本文还公开了与化学功能部分缀合的抗原结合单位。通常，该部分是一种能够产生可检测信号的标记。这些缀合的抗原结合单位可用于例如检测系统，如肿瘤负荷的定量、转移灶的成像和肿瘤成像。此类标记是本领域已知的，并且包括但不限于放射性同位素、酶、荧光化合物、化学发光化合物、生物发光化合物底物辅助因子和抑制剂。参见，教导使用此类标签的专利示例，美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。该部分可以与抗原结合单位共价连接、重组连接或通过第二试剂如第二抗体、蛋白A或生物素-亲和素复合物与抗原结合单位缀合。
其他功能部分包括信号肽、增强免疫反应性的药剂、促进与固体支持物耦合的药剂、疫苗载体、生物应答修饰剂、顺磁标记和药物。信号肽是一种短氨基酸序列，其引导新合成的蛋白质通过细胞膜(通常是真核细胞中的内质网)以及细菌的内膜或内膜和外膜二者。信号肽可以位于多肽的N-末端部分或多肽的C-末端部分，并且信号肽可以在多肽的生物合成与分泌之间从细胞酶促除去。这种肽可以被掺入抗原结合单位中，以允许合成分子的分泌。
增强免疫反应性的药剂包括，但不限于，细菌超抗原。促进与固体支持物耦合的药剂包括，但不限于，生物素或亲和素。免疫原载体包括，但不限于，任何生理学上可接受的缓冲液。生物应答修饰剂包括细胞因子，特别是肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-2、白细胞介素-4、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和γ-干扰素。
合适的药物部分包括抗肿瘤剂。非限制性示例包括放射性同位素、长春花生物碱(如长春碱、长春新碱和硫酸长春地辛)、阿霉素、硫酸博来霉素、卡铂、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、盐酸柔红霉素、盐酸多柔比星、依托泊苷、氟尿嘧啶、洛莫司汀、盐酸氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、喷司他丁、哌泊澳烷、盐酸丙卡巴肼、链脲霉素、紫杉醇、硫鸟嘌呤和尿嘧啶氮芥。
免疫毒素，包括抗原结合单位，可以通过重组手段产生。各种免疫毒素的产生在本领域中是公知的，并且方法可以在例如，“Monoclonal Antibody-toxin Conjugates：Aiming the Magic Bullet，”Thorpe等人(1982)Monoclonal AntibodiesinClinicalMedicine，Academic Press，第168-190页；Vitatta(1987)Science 238：1098-1104；以及Winter和Milstein(1991)Nature 349：293-299中找到。合适的毒素包括但不限于蓖麻毒素、放射性核素、商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素A、白喉毒素、蓖麻毒素A链、真菌毒素如局限曲菌素，和磷脂酶。通常参见“Chimeric Toxins，”Olsnes和Pih1，Pharmac.Ther.15：355-381(1981)；以及“Monoclonal Antibodies for Cancer Detectionand Therapy，”Baldwin和Byers著，第159-179、224-266页，Academic Press(1985)。
化学功能部分可以重组制备，例如通过产生编码抗原结合单位和功能部分的融合基因。或者，抗原结合单位可以通过各种熟知的化学程序中的任何一种化学键合到该部分。例如，当该部分是蛋白质时，连接可以通过异双官能团交联剂，例如，SPDP、碳二亚胺戊二醛等。该部分可以通过第二试剂，如第二抗体、蛋白A或生物素-亲和素复合物共价连接或缀合。顺磁部分及其与抗体的缀合在本领域中是公知的。参见，例如，Miltenyi等人(1990)Cytometry 11：231-238。
药物组合物
在一些实施方案中，将抗PD-1抗体进一步配制为药物组合物。在一些情况下，药物组合物被配制用于通过多种施用途径施用于受试者，包括但不限于，肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内、动脉内、皮内、腹膜内、玻璃体内、大脑内或脑室内)、口服、鼻内、颊部、直肠或透皮施用途径。在一些情况下，本文所述的药物组合物被配制用于肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内、动脉内、皮内、腹膜内、玻璃体内、大脑内或脑室内)施用。在其他情况下，本文所述的药物组合物被配制用于口服施用。在其他情况下，本文所述的药物组合物被配制用于鼻内施用。
在一些实施方案中，药物制剂包括，但不限于，水性液体分散体、自乳化分散体、固体溶液、脂质体分散体、气溶胶、固体剂型、粉末、速释制剂、控释制剂、速溶制剂、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂(例如，纳米颗粒制剂)，以及混合速释和控释制剂。
在一些情况下，药物制剂包括多颗粒制剂。在一些情况下，药物制剂包括纳米颗粒制剂。示例性纳米颗粒包括，但不限于，顺磁性纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、金属纳米颗粒、富勒烯类材料、无机纳米管、树枝状高分子(如具有共价附接的金属螯合物)、纳米纤维、纳米角、纳米洋葱、纳米棒、纳米绳和量子点。在一些情况下，纳米颗粒是金属纳米颗粒，例如，钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、钇、锆、铌、钼、钌、铑、钯、银、镉、铪、钽、钨、铼、锇、铱、铂、金、钆、铝、镓、铟、锡、铊、铅、铋、镁、钙、锶、钡、锂、钠、钾、硼、硅、磷、锗、砷、锑及其组合、合金或氧化物的纳米颗粒。
在一些情况下，纳米颗粒包括核，或核与壳，如同核-壳纳米颗粒。在一些情况下，纳米颗粒有至少一个尺寸小于约500nm、400nm、300nm、200nm或100nm。
在一些实施方案中，药物组合物包括基于与本文公开的组合物的相容性以及所需剂型的释放特性而选择的载体或载体材料。示例性载体材料包括，例如粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。药学上相容的载体材料包括，但不限于，阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖硬脂酰乳酸钠、卡拉胶、单甘油酯、甘油二酯、预糊化淀粉等。参见，例如，Remington：The Science andPractice of Pharmacy，第19版(Easton，Pa.：Mack Publishing Company，1995)；Hoover，John E.，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania 1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.著.，PharmaceuticalDosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；以及PharmaceuticalDosage Forms and DrugDelivery Systems，第7版(Lippincott Williams&Wilkins1999)。
在一些情况下，药物组合物进一步包含pH调节剂或缓冲剂，其包括酸，如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；以及缓冲剂，如柠檬酸盐/葡萄糖、碳酸氢钠和氯化铵。这些酸、碱和缓冲剂包含在将组合物的pH维持在可接受范围内所需的量中。
在一些情况下，药物组合物包含一种或多种盐，其量为使组合物的克分子渗透压重量浓度达到可接受范围所需的量。这些盐包括具有钠、钾或铵阳离子和氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
在一些情况下，药物组合物进一步包含用于稳定化合物的稀释剂，因为它们可以提供更稳定的环境。溶解在缓冲溶液中的盐(其也可提供pH控制或维持)在本领域中用作稀释剂，包括，但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些情况下，稀释剂增加组合物的体积以促进压缩，或为用于胶囊填充的均匀混合物产生足够的体积。这些化合物可包括例如，乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、微晶纤维素如
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磷酸氢钙、二水合磷酸二钙；磷酸三钙、磷酸钙；无水乳糖、喷雾干燥的乳糖；预糊化淀粉、可压缩糖如
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(Amstar)；甘露醇、羟丙基甲基纤维素、乙酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯、基于蔗糖的稀释剂、糖粉；一代硫酸钙一水合物、硫酸钙二水合物；乳酸钙三水合物、葡聚糖结合剂；谷物水解固形物、直链淀粉；粉状纤维素、碳酸钙；甘氨酸、高岭土；甘露醇、氯化钠；肌醇、膨润土等。
在一些情况下，药物组合物包含崩解药剂或崩解剂以促进物质的分解或崩解。术语“崩解”包括剂型在与胃肠液接触时的溶解和分散。崩解药剂的示例包括淀粉，例如天然淀粉如玉米淀粉或马铃薯淀粉，预糊化淀粉如National 1551或
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或淀粉乙醇酸钠如
Figure BDA0002220906740000454
或
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纤维素如木材产品，甲基结晶纤维素例如
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Figure BDA0002220906740000457
PH101、
Figure BDA0002220906740000458
PH102、
Figure BDA0002220906740000459
PH105、
Figure BDA00022209067400004510
P100、
Figure BDA00022209067400004511
Ming
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和
Figure BDA00022209067400004513
甲基纤维素，交联羧甲基纤维素，或交联的纤维素如交联的羧甲基纤维素钠
Figure BDA00022209067400004514
交联的羧甲基纤维素或交联的交联羧甲基纤维素，交联淀粉如淀粉乙醇酸钠，交联聚合物如交联聚维酮、交联聚乙烯吡咯烷酮，海藻酸盐如海藻酸或海藻酸盐如海藻酸钠，粘土如
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HV(硅酸铝镁)，树胶如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶或黄蓍胶，淀粉乙醇酸钠，膨润土，天然海绵，表面活性剂，树脂如阳离子交换树脂，柑桔渣，十二烷基硫酸钠，与淀粉组合的十二烷基硫酸钠等。
在一些情况下，药物组合物包含填充剂，如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、葡萄糖、葡聚糖结合剂、葡聚糖、淀粉、预糊化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等。
润滑剂和助流剂也任选地包含在本文所述的药物组合物中，用于预防、减少或抑制材料的粘附或摩擦。示例性润滑剂包括，例如，硬脂酸，氢氧化钙，滑石，硬脂酰富马酸钠，烃类如矿物油或氢化植物油如氢化大豆油
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高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐如铝盐、钙盐、镁盐、锌盐，硬脂酸，硬脂酸钠，甘油，滑石，蜡，
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硼酸，苯甲酸钠，醋酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇(例如PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇如CarbowaxTM，油酸钠，苯甲酸钠，山嵛酸甘油酯，聚乙二醇，十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠、胶体二氧化硅如SyloidTM、
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淀粉如玉米淀粉，硅油，表面活性剂等。
增塑剂包括用于软化微胶囊材料或薄膜包衣以使其不易碎的化合物。合适的增塑剂包括，例如，聚乙二醇如PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450、PEG 3350和PEG 800，硬脂酸，丙二醇，油酸，三乙基纤维素和三醋精。增塑剂也可用作分散剂或润湿剂。
增溶剂包括诸如三醋精、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆汁盐、聚乙二醇200-600、糖原质、二甘醇单乙醚(transcutol)、丙二醇和二甲基异山梨醇等化合物。
稳定剂包括诸如任何抗氧化剂、缓冲剂、酸、防腐剂等化合物。
悬浮剂包括诸如聚乙烯吡咯烷酮，例如聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)，聚乙二醇，例如，聚乙二醇可具有的分子量为约300至约6000、或约3350至约4000、或约7000至约5400，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，乙酸羟甲基纤维素硬脂酸酯，聚山梨醇酯-80，羟乙基纤维素，海藻酸钠，树胶如黄蓍树胶和阿拉伯树胶、瓜尔树胶、黄原胶(包括黄原树胶)，糖，纤维素如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素，聚山梨醇酯-80，海藻酸钠，聚乙氧基化脱水山梨醇单月桂酸酯，聚乙氧基化脱水山梨醇单月桂酸酯，聚维酮等化合物。
表面活性剂包括诸如十二烷基硫酸钠、多库酯钠、吐温60或80、三醋精、维生素ETPGS、脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆、胆汁盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷与环氧丙烷的共聚物(例如
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(BASF))等化合物。另外的表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如，辛苯聚醇10、辛苯聚醇40。有时，包括表面活性剂以增强物理稳定性或用于其他目的。
粘度增强剂包括，例如，甲基纤维素、黄原树胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、海藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。
润湿剂包括诸如油酸、单硬脂酸甘油酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三醋精、吐温80、维生素E TPGS、铵盐等化合物。
治疗方案
在一些实施方案中，施用本文所述的药物组合物用于治疗应用。在一些实施方案中，药物组合物每天施用一次、每天施用两次、每天施用三次或更多次。每日、每天、每隔一天、每周五天、每周一次、每隔一周、每月两周、每月三周、每月一次、每月两次、每月三次或更多次施用药物组合物。药物组合物施用持续至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、2年、3年或更长时间。
在患者的状态确实改善的情况下，根据医生的判断，连续施用组合物；或者，所施用组合物的剂量暂时减少或暂停一段时间(即“药物假期”)。在一些情况下，药物假期的长度在2天至1年之间变化，仅举例来说包括，2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。药物假期期间的剂量减少为10％-100％，仅举例来说包括，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
一旦患者的病况有所改善，则根据需要施用维持剂量。随后，施用的剂量或频率或两者可以根据症状而降低至保持改善的疾病、病症或病况的水平。
在一些实施方案中，对应于这种量的给定药剂的量根据诸如特定化合物、疾病严重程度，需要治疗的受试者或宿主的身份(例如，体重)等因素而变化，但以本领域已知的方式根据病例的具体情况常规地确定，该具体情况包括例如所施用的特定药剂、施用途径和所治疗的受试者或宿主。在一些情况下，所需剂量方便地以单剂量或以分开的剂量呈现，该分开的剂量同时施用(或在短时间内施用)或以适当的间隔施用，例如，以每天两次、三次、四次或更多次子剂量施用。
前述范围仅是提示性的，因为关于个体治疗方案的变量数目很大，而且偏离这些推荐值的较大偏差并不罕见。此类剂量根据许多变量而改变，该变量不限于所用化合物的活性、待治疗的疾病或病况、施用方式、个体受试者的要求、所治疗的疾病或病况的严重程度，以及从业者的判断。
在一些实施方案中，此类治疗方案的毒性和治疗功效通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序确定，包括但不限于确定LD50(对群体的50％致死的剂量))和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果的剂量比为治疗指数，并且表示为LD50与ED50的比值。表现出高治疗指数的化合物是优选的。从细胞培养测定和动物研究获得的数据用于配制用于人的剂量范围。此类化合物的剂量优选在包含具有最小毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量在该范围内变化，这取决于所使用的剂型和所采用的施用途径。
试剂盒/制品
在某些实施方案中，本文公开了与本文所述的一种或多种组合物和方法一起使用的试剂盒和制品。此类试剂盒包含载体、包装或容器，其被分隔以接收一个或多个容器，如小瓶，管等，每个容器包含用于本文所述的方法的一个单独元件。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，容器由各种材料如玻璃或塑料形成。
本文提供的制品包含包装材料。药物包装材料的示例包括，但不限于，泡罩包装、瓶子、管、袋、容器、瓶子，以及适用于所选制剂和预期施用方式和治疗的任何包装材料。
例如，容器包含如本文所公开的抗PD-1抗体、用于产生本文所述的一种或多种抗体的宿主细胞，以及/或者包含编码本文所述抗体的核酸分子的载体。这些试剂盒任选地包含与其在本文所述方法中的用途相关的识别描述或标签或说明。
试剂盒通常包含列出内容物和/或使用说明的标签，以及带有使用说明的包装插页。通常还将包含一组说明。
在一个实施方案中，标签在容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当形成标签的字母、数字或其他字符被附着、模制或蚀刻到容器本身时，该标签在容器上；当标签存在于还容纳容器的器皿或载具内(例如作为包装插页)时，该标签与容器相关联。在一个实施方案中，标签用于指示内容物将用于特定治疗应用。例如，标签还指示在本文所述的方法中关于内容物的使用指导。
在某些实施方案中，药物组合物存在于包含含有本文提供的化合物的一个或多个单位剂型的包装或分配器装置中。例如，包装包括金属或塑料箔，如泡罩包装。在一个实施方案中，包装或分配器装置附有施用说明。在一个实施方案中，包装或分配器还附有与容器相关联的通知，其形式由管理药品的制造、使用或销售的政府机构出具，该通知反映了该机构批准该形式的药物用于人类或兽医学施用。例如，这种通知是美国食品和药物管理局批准用于处方药的标签，或批准的产品插页。在一个实施方案中，还制备了含有在相容的药物载体中配制的本文提供的化合物的组合物，将其置于合适的容器中，并标记治疗指定病况。
某些术语
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与所要求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同。应理解，前面的一般性描述和以下的详细描述仅是示例性和解释性的，并非限制要求保护的任何主题。在本申请中，除非另有特别说明，否则单数的使用包括复数。必须指出的是，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确说明。在本申请中，除非另有说明，否则“或”表示“和/或”。此外，术语“包括”(including)以及其他形式(如“include”、“includes”和“included”)的使用是非限制性的。
如本文所用，范围和量可表示为“约”一个特定的值或范围。约还包括确切的量。因此，“约5μL”指“约5μL”以及“5μL”。通常，术语“约”包括预计在实验误差范围内，例如，在15％、10％或5％内的量。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应解释为限制所描述的主题。
如本文所用，术语“个体”、“受试者”和“患者”是指任何哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，哺乳动物是非人哺乳动物。所有术语均不要求和限于以卫生保健工作者(例如医生、注册护士、执业护士、医师助理、护工或临终关怀工作者)的监督(例如，持续或间歇)为特征的情况。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链、环状或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且也可以被非氨基酸中断。该术语还包括已经被修饰的氨基酸聚合物，该修饰例如是通过硫酸化、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、碘化、甲基化、氧化、蛋白水解处理、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加(如精氨酸化)、遍在蛋白化，或任何其他操作，如与标记组分的缀合。
如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和拟肽。
由指定蛋白质“衍生”的多肽或氨基酸序列是指多肽的来源。优选地，多肽具有与序列中编码的多肽的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，或其部分，其中该部分由至少10-20个氨基酸，或至少20-30氨基酸或至少30-50个氨基酸组成，或者其可用序列中编码的多肽免疫识别。该术语还包括由指定核酸序列表达的多肽。
实施例
这些实施例仅用于说明目的，并不限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1免疫接种
为使用hPD-1蛋白进行免疫接种，将蛋白质与immunPlus(Genscript Inc.)交联，以增强与mPD-1的交叉反应性，然后将佐剂与蛋白质以1：1v/v比例混合、乳化并在腹腔注射。
实施例2通过ELISA的血清滴定
将hPD-1蛋白在4℃下吸附至96孔高蛋白结合板(Costar)上过夜。通过用PBS-Tween(0.1％v/v)洗涤三次，除去过量的hPD-1，并在室温(RT)下用在PBS中的1％w/v BSA(Sigma)将孔阻断1小时，板如前所述洗涤。制备小鼠血清的连续两倍滴定液，在试剂稀释剂(0.1％w/v BSA/PBS)中将样品稀释。将50μl/孔的滴定液添加至包被的ELISA板。将板在室温下温育至少1小时。温育后，板如前所述洗涤。然后将抗mIg-HRP抗体(试剂稀释剂中100ng/ml；50μl/孔)添加至板并在室温下温育1小时。如前所述通过洗涤除去未结合的HRP标记的抗小鼠Ig抗体。板如前所述洗涤，并向板添加50μL的TMB(Sigma)。然后通过添加50μL1M硫酸(Sinopharm Inc.)停止反应。在读板仪(Biotek)上测量450nm处的光密度(OD)。
实施例3使用Jurkat细胞通过流式细胞术确定血清滴度
将悬浮在FACS缓冲液(PBS+1％w/v BSA+0.1％w/v叠氮化钠)中的Jurkat细胞以25μl/孔、105个细胞/孔的密度分配至96孔u形底板(Greiner)中。制备小鼠血清的滴定液，在FACS缓冲液中稀释样品。然后将25μL/孔的该滴定液添加至细胞板。为确定由免疫接种引起的活性水平的变化，将来自免疫接种前的每只动物的血清在FACS缓冲液中以1/100稀释，并以25μL/孔添加至细胞。将细胞在4℃下温育1小时。用150μL PBS洗涤细胞两次，在每个洗涤步骤后离心，并吸出上清液(以300xg离心3分钟)。为检测抗体结合，将AlexaFluor山羊-抗-小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)在FACS缓冲液中以1/500稀释，并添加50μL至细胞。细胞在4℃下的黑暗中温育1小时，然后如上所述用150μL PBS洗涤两次，然后重悬于100μlFACS缓冲液中用于分析。AF647信号强度(几何平均)使用BD FACS Array仪器通过流式细胞术测量。
实施例4鼠组织分离和制备
将小鼠安乐死，将脾脏从免疫接种的小鼠切下，在1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，并保持在冰上直至进一步处理。在含有1x PBS(Invitrogen)和3％热灭活胎牛血清(FBS)(Invitrogen)的缓冲液中制备组织。通过将组织穿过45μm滤器(BD Falcon)粉碎，并用30ml 3％的FBS/PBS缓冲液冲洗，然后在4℃下以700g离心10分钟来分散脾细胞。为去除红细胞，将沉淀的脾细胞重悬于4ml红细胞裂解缓冲液(Sigma)中。温育4分钟后，通过添加3％的FBS/1x PBS缓冲液停止裂解反应。用45μm滤器过滤出细胞团。将剩余的脾细胞沉淀用于进一步的程序。
实施例5杂交瘤融合
将分离的脾细胞重悬于200μl BSA融合缓冲液中，洗涤一次并确定细胞计数。以相同方式处理SP2/0细胞，并用BSA融合缓冲液洗涤两次。使用BTX ECM 2001Electro CellManipulator(Harvard Apparatus)通过电融合将脾细胞以3∶1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合。将每个融合物在恢复培养基(Dulbecco改良Eagle培养基-高葡萄糖(无酚红、无L-G)，其含有OPI(Sigma)、L-Glutamax(Gibco)、20％FBS(Gibco，针对杂交瘤进行了批次测试)和2-巯基乙醇)中放置过夜，然后重悬于具有HAT的完全DMEM培养基中，铺板至96孔板中，并在筛选前培养另外7-10天。
实施例6初级筛选：与表达人PD-1的细胞结合
使用BD FACSCalibur流式细胞仪确定分泌的抗体与表达人PD-1的细胞的结合。将Raji细胞以每孔105个细胞接种于圆底96孔板的50μL F12+10％FBS(1.25x105个细胞/mL)中，并将杂交瘤细胞的培养上清液与细胞混合。在用FACS缓冲液洗涤3次后，用AF647标记的抗mIgG抗体将细胞染色，并通过BD FACSCalibur读取各个克隆的荧光强度。
实施例7表面等离子体共振(SPR)
使用Biacore T200表征系统(GE Healthcare)进行SPR分析。通过胺偶联固定抗小鼠抗体(GE Healthcare)，在CM5生物传感器芯片上产生抗小鼠捕获表面。在此表面捕获杂交瘤上清液中的抗体，并将256nM、64nM、16nM、4nM、1nM和0nM的人PD-1-his用作分析物。对于具有人Fc区的重组抗体，通过胺偶联将抗人IgG(Jackson Immunoresearch)固定在生物传感器表面上。人PD-1-his以128nM、32nM、8nM、2nM和0.5nM使用，并且结果与非结合对照抗体进行了参照。
实施例8前导抗体(lead antibody)候选物的序列恢复
使用选定的克隆制备总RNA，该总RNA用于RT-PCR反应以恢复重链和轻链V区。使用TRIzolTM试剂(Invitrogen)从杂交瘤细胞中提取总RNA。用分光光度法分析分离的RNA的数量和质量。将鼠IgG特异性反向引物与小鼠Ig-前导序列特异性正向引物的组用于重链。将鼠K恒定区特异性反向引物与鼠K前导序列特异性正向引物的组用于κ轻链。RT-PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，将具有预测大小的DNA凝胶纯化并在正向和反向方向上测序。将产物亚克隆至克隆载体中，并将个体菌落的DNA提交用于测序。使用标准限制酶消化和连接，将编码所选定的前导抗体的重链可变区的DNA克隆至具有人IgG4P恒定区的符合读框的单独pREP4表达质粒(Invitrogen)中，将编码轻链可变区的DNA克隆至具有人κ恒定区的符合读框的pREP4表达质粒中。
杂交瘤生成
实施例9免疫原
PD-1蛋白质由编码人PD-1(NP_005009.2)的胞外域(Met 1-Gln167)的DNA序列表达，其具有来自Sinobiologicals(His-tag)的C-末端多组氨酸标记。将该蛋白质用于免疫接种。
实施例10免疫接种
使用两种小鼠品系(Balb/c和C57/BL6)进行免疫接种，以生成抗PD-1单克隆抗体(表6)。分析来自连续加强免疫的血清或末梢血样品中是否存在特异性抗体(图2)。血清滴度数据用于选择用于杂交瘤融合的小鼠。实施例2和3描述了滴度确定方法的细节。
表6动物免疫接种的细节
Figure BDA0002220906740000541
实施例11杂交瘤融合
从最佳应答动物的脾脏制备单细胞悬浮液，并与骨髓瘤细胞电融合，之后在96孔板中接种和培养。然后将杂交瘤在选择培养基中培养7天，之后筛选上清液。
试样筛选与表征
实施例12通过FACS结合筛选初级杂交瘤克隆
首先使用表达人PD-1的CHO-K1细胞和作为对照的CHO-K1细胞，通过流式细胞术筛选杂交瘤上清液的PD-1结合。FACS如下进行：将每个反应50μL的2.5×105个细胞与杂交瘤上清液一起温育，并用3μg/ml的二抗(山羊-抗-小鼠IgG(H&L)iFlour647)检测与一抗结合的细胞。将纳武单抗设定为阳性对照，并将小鼠IgG(GenScript)设定为阴性对照(3μg/ml)。
选择约75个FACS阳性的初级克隆。
实施例13第二FACS结合测定
对选定的初级FACS结合克隆进行亚克隆，以获得单克隆细胞以供通过FACS结合进一步测试。与亲本克隆相比，一些亚克隆保留了结合活性，而另一些亚克隆失去了结合活性。
实施例14通过HTRF测定筛选阻断抗体
基于第二FACS结合测定的结果，鉴定了一组23种独特的阳性结合物。以2点剂量点形式进行CISBIO HTRF测定，以测量这些抗体试样对PD-1/PD-L1结合的阻断活性。使用PD-1/PDL1结合测定试剂盒(63ADK000CPLPEB)、人IgG对照(R&D系统)和抗PD-1参照抗体纳武单抗类似物。参照抗体的最高浓度为200nM，并进行了3倍连续稀释。将2μl稀释的抗体依次与4μl 10nM的PD-L1-Euk和4μl 500nM Tag-PD-1预混合。将混合物在室温下温育15分钟。然后添加10μl抗-Tag-XL665并将样品温育2小时。用Biotek Synergy Neo读板仪对板进行读数，并用Prism 5.0分析数据。数据以相对抑制百分比I％表示，其中平均阳性对照值为100％，平均阴性对照值为0％。
I％＝(平均PC值-样品值)/(平均PC值-平均NC值)*100％
曲线采用非线性4参数回归方法使用Graphpad Prism生成。表7中列出了具有至少50％抑制率的最优试样。
表7通过FRET测定确定鼠抗PD-1抗体对PD-1/PD-L1结合的阻断活性
Figure BDA0002220906740000561
使总共23种PD-1抗体在以下两个剂量点下经受HTRF阻断测定；66.7nM和6.67nM。基于9种参照抗体的初步研究选择2个剂量点。选择抗体31G1E10、56H6F7、42F11B8、31H7E10、45E4E8、33G5C7、56B3C11、42G2F11和6G12E8进行完整曲线测试。
实施例15通过FRET测定确定鼠抗PD-1抗体试样对PD-1/PD-L1结合的阻断活性
使用HTRF测定测量10个选定的抗PD-1试样的全剂量反应阻断活性。方法如上所述，并且通过3倍连续稀释制备抗体试样。结果如图3所示。
表8总结了用于PD-1/PD-L 1结合的鼠抗PD-1抗体的IC50。参照抗体纳武单抗的IC50值为3.79nM，其中最小I％为0.7153至12.74而最大I％为88.42至118.9。
基于完整曲线PD-1/PD-L1结合阻断数据，31G1E10、56H6F7、42F11B8、31H7E10、45E4E8、56B3C11和42G2F11具有与参照抗体(纳武单抗类似物)相当的IC50。与参照抗体相比，其他的抗体显示出较弱的PD-1/PD-L1阻断活性。
实施例16通过ELISA确定鼠抗PD-1抗体对PD-1/PD-L2结合的阻断活性
将100μl/孔2μg/ml h-PD-L2-His(Sinobiological)于4℃下在96孔板上包被过夜。洗涤3次后，添加100μl/孔1％BSA阻断溶液，并在室温下温育1小时。将0.5μg/ml PD-1蛋白(Sinobiological)与抗PD-1抗体(从33μg/mL以3倍连续稀释进行稀释)混合，并在室温下预温育0.5小时。添加50μl/孔预温育的缓冲液，并将样品在室温下温育2小时。将板洗涤3次，向孔添加50μl/孔的第二抗体山羊抗hIgG-HRP(Fc特异性，1∶5000)(Abcam)，并在室温下温育1小时。洗涤3次后，通过添加50μl TMB(Biopanda)持续1分钟使板显色，并通过添加50μl 1M HCL停止显色。使用Biotek SynergyNeo读板仪读取数据，并通过GraphPad Prism5.0数据分析软件进行分析。图4A和图4B显示了鼠抗PD-1抗体试样对PD-1/PD-L2结合的剂量依赖性阻断活性。
表8总结了鼠抗-PD-1抗体对PD-1/PD-L2结合的阻断活性。在测试的抗体中，克隆31G1E10的IC50值最低。
表8鼠抗体试样的PD-1/PD-L2阻断活性的计算IC50(nM)的总结
Figure BDA0002220906740000571
Figure BDA0002220906740000581
实施例17示例性抗PD-1抗体的表位分箱
以纳武单抗和派姆单抗类似物抗体为参照，使用Octet系统进行示例性抗PD-1抗体的表位分箱。分析了9种中和PD-1抗体和2种参照抗体，并根据它们与参照抗体的竞争性结合进行分组。通过Ni-NTA传感器捕获配体PD-1，并在参照抗体结合后，使抗体在含有PBSpH 7.4、0.1％BSA、0.02％吐温的测定缓冲液中流动。表位分箱研究显示，与参照抗体如纳武单抗和派姆单抗相比，鼠抗PD-1抗体属于不同组(表9)。
表9
克隆编号 纳武单抗/派姆单抗的表位差异
31G1E10* 不同
56H6F7 与纳武单抗竞争
42F11B8 不同
31H7E10 非常不同
45E4E8 不同于纳武单抗
33G5C7 非常不同
56B3C11* 与纳武单抗竞争
42G2F11 不同
6G12E8 不同
实施例18抗PD-1试样与鼠PD-1蛋白的交叉反应性
使用对过表达鼠PD-1的CHO细胞的FACS分析确定抗体试样的鼠PD-1的交叉反应性。将过表达人PD-1的CHO细胞作为对照。如图5所示，试样都不与鼠PD-1结合，相比之下，其与人PD-1有浓度依赖性结合。
实施例19鼠抗PD-1抗体试样的亲和力
基于上述结合和阻断测定的结果，通过Biacore表征系统选择6个试样进行详细的动力学研究。使用FC1作为参照池，将每种抗体捕获在流动池FC2中，各自100RU左右，然后注射不同浓度的抗原样品。用Biacore 8K评估软件(Biacore)计算从没有捕获抗体的情况下的信号中减去的在有捕获抗体的情况下的信号。运行缓冲液是HBS-EP+(10mM HEPES，150mMNaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20)。使用派姆单抗类似物(CrownBio)和纳武单抗类似物(Chempartners)作为参照抗体，测试了6种抗体的亲和力。结果总结在表10中。
表10与参照抗体相比，6种鼠抗体试样的结合动力学
克隆编号 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
31G1E10F12 1.71E+05 1.98E-04 1.16E-09
56H6F7D5 1.42E+05 7.05E-04 4.97E-09
42F11B8 1.10E+05 8.51E-04 7.71E-09
45E4B8E4 4.49E+05 6.89E-03 1.54E-08
56B3C11G9 1.22E+05 2.95E-04 2.43E-09
42G2F11C8 1.02E+05 6.76E-04 6.61E-09
派姆单抗 2.88E+06 4.74E-03 1.65E-09
纳武单抗 3.81E+05 1.52E-03 4.00E-09
实施例20通过成熟DC-T MLR测定对抗PD-1抗体进行功能验证
根据制造商提供的方案，单核细胞通过CD14珠(人，Miltenyi Biotec)从PBMC(ALLCELLS)分离。将单核细胞与IL-4(CrownBio，35ng/ml)和GM-CSF(50ng/ml)以每孔2×106个细胞(6孔板)培养7天。在第7天，向DC培养基添加1μg/ml LPS，用LPS培养DC细胞24小时。DC成熟后，添加20μM丝裂霉素C，并与DC一起温育90分钟。同时，通过使用全T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从PBMC中纯化人CD3+T细胞，将2×105个纯化的CD3+T细胞和4×104个同种异体成熟树突细胞在不存在或存在抗PD-1参照抗体或抗体试样的情况下以200μl的总体积共培养5天。在5天培养后，收集50μl培养物上清液，用于通过使用CISBIO试剂盒评估IL-2(图6)和IFN-γ(图7)的水平。
在一些情况下，与参照抗体相比，测试抗体如31G1E10具有相似的活性。
实施例21通过未成熟DC-T MLR测定对抗PD-1抗体进行附加功能验证
分离来自供体A5416的4x104个未成熟DC细胞和来自供体A5387的2x105个CD3+T细胞用于MLR测定和细胞因子确定。观察到在存在抗PD-1鼠抗体试样的情况下IL-2(图8A)和IFN-γ(图8B)的水平增加。然而，响应水平低于在成熟DC-T MLR测定中发现的响应水平(图6、图7)。
鼠抗PD-1抗体的嵌合
将包括31G1E10、56B3C11、56H6F7、42G3F11，45E4E8、42G2F11在内的6种鼠抗PD-1抗体试样的V区与具有S228P突变的人IgG4恒定区嵌合。
实施例22嵌合抗体试样的基于蛋白质的PD-1结合活性.
在基于蛋白质的ELISA测定中测试6种嵌合抗体与PD-1的结合。将PD-1蛋白以100μl/孔、1μg/ml包被在96孔板中。将嵌合抗体样品从3μg/ml进行3倍连续稀释，42G3F11(从9μg/ml)和45E4E8(从1μg/ml)除外。通过小鼠抗人IgG-Fc抗体(HRP，1∶2,500稀释)检测结合。使用派姆单抗和纳武单抗作为阳性对照以及IgG4作为阴性对照，绘制滴定曲线(图9)。
实施例23嵌合抗体阻断PD-1/PD-L1结合的活性
在FRET测定中测试6种嵌合抗体阻断PD-1/PD-L1结合的能力。进行两个单独的实验，每个实验均用派姆单抗和纳武单抗类似物作为阳性对照。图10A和图10B显示，测试的嵌合抗体以浓度依赖性方式抑制PD-1/PD-L1结合。IC50与派姆单抗或纳武单抗类似物相当。
实施例24嵌合抗体阻断PD-1/PD-L2结合的活性
将制备的PD-1蛋白包被在96孔微量培养板上，然后添加连续稀释的抗体样品和bio-PD-L2(Chempartner)溶液，并添加链霉亲和素-HRP(Sigma)以检测结合的PD-L2。图11显示，除42G2F11外，测试的嵌合抗体以浓度依赖性方式抑制PD-1/PD-L2结合。
实施例25通过MLR测定对嵌合抗体进行功能分析
使用DC/T MLR测定来评估具有人IgG4 S228P突变的嵌合鼠抗体。收集上清液用于IFN-γ确定。在两种测定中，与同种型对照相比，在存在嵌合抗PD-1抗体的情况下观察到显著增强的IFN-γ分泌(图12A和图12B)。观察到抗体31 G1E10、56B3C11和56H6F7与基准的效果相当的效果。
实施例26萤光素酶报告基因测定测量嵌合抗PD-1抗体的功能活性
使用Jurkat-NFAT-PD-1-萤光素酶和Hep3B-OS8-hPD-L1这两种工程化细胞系来测试PD-1依赖性下游效应的激活。在测定前一天将Hep3B-OS8-PDL1细胞铺板于96孔板(Perkin Elmer)中。在测定当天，在测定培养基中制备2x抗体溶液：200、40、8、1.6、0.32、0.064、0.0128和0 nM。从预先铺板的Hep3B-OS8-PDL1细胞中除去培养基。将50 μl抗体溶液添加至板并温育20-30分钟。同时，使用测定培养基代替生长培养基来收获Jurkat(6C8)-NFAT-PD-1细胞。将50 μlJurkat(6C8)-NFAT-PD-1细胞添加至板。将100 μl测定培养基添加至无细胞对照孔。将测定板在37℃，5％CO2的加湿温育箱中温育6小时。萤光素酶活性(图13A和图13B)由ONE-GloTM萤光素酶测定系统(Promega)使用发光计(ChemPartner)测量。阳性对照为Keytruda类似物，5.07mg/ml，阴性对照为hIgG4，5.91mg/ml。从Jurkat-NFAT报告分子测定计算的EC50如表11所示。
表11
抗体 EC50(nM)
Xi 31G1E10 0.157
Xi 56B3C11 0.196
Xi45E4E8 0.393
Xi56H6H7 0.192
Keytruda类似物 0.12(平均)
实施例27嵌合抗PD-1抗体前导在基于细胞的PD-L1结合阻断测定中的活性
使用基于FACS的PD-L1结合阻断测定来确认最优嵌合前导xi31G1E10和xi56B3C1的活性。用阻断缓冲液将板阻断30分钟。用TrypLE消化CHO-K1-PD-1-1F7细胞(Chempartner)，并用培养基停止消化。然后将细胞添加至阻断的板并离心，然后用稀释的抗体溶液重悬。将生物素标记的配体溶液添加至孔。将板充分摇动，在4℃下温育2小时，然后洗涤3次。将细胞用二抗(链霉亲和素(SA)-Alexa488，Life Technologies)溶液悬浮，并在4℃下温育1小时。洗涤细胞并将其重悬于阻断缓冲液中。将Keytruda类似物和Opdivo类似物设定为阳性对照。将hIgG4设定为阴性对照。配体为Bio-PD-L1(0.886mg/m1)和Bio-PD-L2(1.415mg/m1)。对细胞进行FACS(图14A和图14B)。
实施例28嵌合抗体前导抑制人PD-1敲入小鼠中的MC38肿瘤生长
将MC38肿瘤细胞作为单层培养物在体外维持在加有2mM谷氨酸的DMEM中。收获在指数生长阶段中生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。每只小鼠皮下接种MC38细胞(3x105个)以供肿瘤发展。在肿瘤细胞接种后第6天开始处理，此时平均肿瘤大小达到约70mm3。以10mpk使小鼠分别经受人IgG1同种型、Qpidvo类似物、Xi31G1E10和Xi56B3C11处理，每周三次，持续三周(n＝8只/组)。测量并绘制每只小鼠的肿瘤大小(图15A-15D)。
数据显示，参照抗体纳武单抗类似物、Xi31G1E10和Xi56B3C11的TGI分别为94％、84％和101％。这两种抗体的活性与纳武单抗类似物相当。
前导优化、表征与选择
实施例29人源化设计
鼠抗体31G1E10和56B3C11通过人种系结构匹配、CDR移植和回复突变人源化。人源化克隆31G1E10的变体的组合如表12所示。
表12
Figure BDA0002220906740000621
Figure BDA0002220906740000631
人源化克隆56B3C11的变体的组合如表13所示。
表13
Figure BDA0002220906740000632
实施例30通过基于ELISA的PD-1结合测定筛选人源化变体
首先通过PD-1结合测定筛选从上述设计生成的人源化变体。将1μg/ml的PD-1蛋白包被在96孔板上。以3倍连续稀释将测试抗体从10μg/ml稀释，并将100μL/孔添加至板。将板密封并在室温下温育1小时。用PBST(0.05％v/v)洗涤3次后，添加100μL/孔的第二抗体(抗人IgG HRP，在1％BSA/1X PBS中稀释1∶5000)，并温育1小时，然后用TMB使板显色。在BioTek读取器上在OD450处对板进行读取，并用Graphpad分析数据，以计算结合EC 50(图16A、16B和16C)。表14和15显示了每种克隆的衍生物的EC50。
表14. 31G1E10衍生物的EC50
Figure BDA0002220906740000633
Figure BDA0002220906740000641
表15.56B3C11衍生物的EC50
EC50 EC50
Xi56B3C11 0.07397 Xi56B3C11 0.07397
56B3C11-1 0.07722 56B3C11-11 0.1117
56B3C11-2 0.09484 56B3C11-12 0.1849
56B3C11-3 0.08802 56B3C11-13 0.1481
56B3C11-4 0.07979 56B3C11-14 0.1459
56B3C11-5 0.07815 56B3C11-15 0.1163
56B3C11-6 0.03044 56B3C11-16 0.1128
56B3C11-7 0.09073 56B3C11-17 0.06342
56B3C11-8 0.1047 56B3C11-18 0.06922
56B3C11-9 0.1061 56B3C11-19 0.07049
56B3C11-10 0.1172 56B3C11-20 0.05910
实施例31通过基于细胞的PD-1/PD-L1阻断测定筛选人源化变体
如前所述进行基于细胞的PD-1/PD-L1阻断测定，以从人源化变体中选择最优克隆。一些克隆进行了两次测试。阻断测定结果如图17A和图17B所示。
基于IC50计算(表16)，选择31G1E10的衍生克隆4、5、7、8、10、11和12以及56B3C11的衍生克隆2、3、4、5、6、13和18进行进一步的亲和力测量。
表16
Figure BDA0002220906740000642
Figure BDA0002220906740000651
实施例32人源化抗体的亲和力测定
进一步选择31G1E10的克隆4、5、7、8、10、11和12以及56B3C11的克隆2、3、4、5、6、13和18进行Octet结合亲和力研究。
使用来自Fortebio的两个传感器端头(AHC)将hFc-抗体蛋白质捕获到传感器表面，并添加到含有抗原的孔中，将仅具有缓冲液的孔设定为阴性对照。通过将传感器置于30℃的动力学缓冲液中5分钟进行解离过程。从所有曲线中减去参照物。再生条件：甘氨酸(pH＝1.5)中5秒以及PBS中5秒，重复5次。样品体积为200μL/孔。水合溶液体积为200μL/孔。流速为1000rpm/秒；生物传感器水合和样品板平衡10分钟。
Octet结果显示(表17)，与56B3C11的人源化变体相比，Xi31G1E10的人源化变体具有更低的解离速率。56B3C11的人源化变体的解离速率显示出更多变化。
表17
Figure BDA0002220906740000652
Figure BDA0002220906740000661
实施例33用于前导表征的Jurkat-NFAT萤光素酶报告基因测定
如前所述，在定量萤光素酶报告基因测定中测量PD-1/PD-L1功能阻断活性。将纳武单抗类似物和派姆单抗类似物设为参照物。
计算的IC50值总结于表18中。总体而言，这些克隆在彼此之间表现出相似的活性(图18A-18E)。为了进一步表征，IC50在纳武单抗或派姆单抗类似物参照的2倍范围内的克隆被突出，并经受进一步评估。
表18
Figure BDA0002220906740000662
Figure BDA0002220906740000671
实施例34人源化抗体的PD-1/PD-1配体结合阻断活性
如前所述，使用基于细胞的PD-1/PD-L1(图19A)和PD-1/PD-L2(图19B)结合阻断测定来测试克隆31G1E10-7、10、11、12和克隆56B3C11-13、-18。计算的IC50值如表19所示。
表19
Figure BDA0002220906740000672
实施例35在DC/T MLR测定中表征人源化抗体
通过梯度离心分离PBMC，培养单核细胞，粘附至培养皿。单核细胞在具有GM-CSF和IL-4的完全培养基中培养6天，在第3天更换培养基。在第5天收集DC细胞，并通过添加1μg/ml LPS使其成熟24小时，然后用丝裂霉素处理。同时，使用全T细胞分离试剂盒从PBMC纯化人CD3+T细胞。在不存在或存在抗PD-1参照抗体或人源化前导抗体的情况下，将2×105个纯化的CD3+T细胞和4×104个同种异体成熟树突细胞以200μl的总体积共培养5天。收集培养物上清液，分别用于评估在反应开始后3天的细胞因子IL-2水平(图20A和图20B)，以及反应开始后5天的IFN-γ水平(图20C和20D)。
如表20所示，在31G1E10变体和56B3C11变体中，IL-2产生的E50值彼此接近。然而，INF-γ水平显示出更多变化，并且未计算EC50值。
表20
Figure BDA0002220906740000673
Figure BDA0002220906740000681
实施例36用于评估人源化抗体的CMV抗原回忆试验
来自PBMC的人单核细胞通过梯度离心分离，并用0.4μg/ml CMV激活。将测试抗体添加培养物，并温育细胞5天。在第5天，收集培养物上清液，并通过ELISA测量IFN-γ水平(图21A和21B)。将Keytruda类似物设定为阳性对照。与单独CMV刺激的对照相比，所有测试的抗体均提高了IFN-γ水平。
实施例37人源化抗体在MC38同系肿瘤模型中的体内抗肿瘤功效
在hPD-1敲入小鼠中建立鼠MC38肿瘤生长抑制模型。将MC38肿瘤细胞作为单层培养物在体外维持在加有2mM谷氨酸的DMEM中。收获在指数生长阶段中生长的细胞，并计数用于肿瘤接种。每只小鼠皮下接种MC38细胞(3×105个)以供肿瘤发展。在肿瘤细胞接种后第6天开始处理，此时平均肿瘤大小达到约70mm3。每组由8只荷瘤小鼠组成。根据如实验设计表所示(表21)的预定方案将测试物施用于小鼠。
表21
Figure BDA0002220906740000682
使用卡尺每周两次测量肿瘤大小。然后使用肿瘤大小计算T/C值。使用下式计算各组的TGI：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100。Ti是处理组在给定日的平均肿瘤体积，T0是处理组在处理开始当天的平均肿瘤体积，Vi是与Ti同日的媒介物对照组的平均肿瘤体积，V0是媒介物组在处理开始当天的平均肿瘤体积。在每个时间点为每组的肿瘤体积提供统计结果的总结，包括平均值和平均值的标准误差(SEM)(图22A-图22E)。
在MC38肿瘤模型中，31G1E10和56B3C11二者的体内功效与派姆单抗相当。
实施例38重复冻融循环的稳定性测试
进行重复的冻/融循环，以评估4种最优的人源化抗体变体。将抗体冷冻和融化，持续8个循环。通过SEC-HPLC分析样品以确定纯度。通过Nanodrop测量抗体浓度，以确定回收率。如图23所示，重复的冷冻/融化研究显示，在重复的冷冻/融化循环后，31G1E10-12非常稳定，为几乎100％单体。两种56B3C11变体也非常稳定，整个研究中为98％单体。在31G1E10-7的情况下，蛋白质在研究中显示出一些变化。所有4种蛋白质的回收率一致地在98％至100％之间。
实施例39加速稳定性
进行加速稳定性测试以评估选定的前导抗体。将抗体在4℃、25℃和40℃下温育24天。在第0天(测试前)、第4、8、11、15和24天采集样品，并通过SEC-HPLC分析以确定纯度。通过Nanodrop测量抗体浓度，以确定回收率。
据显示，抗体31G1E10-12、56B3C11-13和56B3C11-18在所有温度下都非常稳定。这些抗体在40℃下24天的纯度分别为99.2％、97.7％和97.9％(图24C)。与31G1E10-12相比，31G1E10-7有一定波动，但总体上也非常稳定。在第24天，31G1E10-7的纯度为97.4％(4℃，图24A)、98.6％(25℃，图24B)和97.1％(40℃，图24C)。
实施例40溶解度测试
进行溶解度测试以评估选定的前导抗体。简言之，将31G1E10-7、-12和56B3C11-13、-18抗体从5mg/ml连续浓缩至11.4mg/ml、25mg/ml、55mg/ml和至多86mg/ml。在该过程中检查可见聚集，并且未观察到聚集。通过SEC-HPLC分析样品以确定纯度。通过Nanodrop测量抗体浓度，以确定回收率。
将31G1E10-7从4.1mg/ml浓缩至11.4mg/ml、25.2mg/ml、55mg/ml和86mg/ml。单体纯度分别为96.9％、96.9％、96.8％和96.8％。抗体以92.6％(11.4mg/ml)、91.1％(25.2mg/ml)、94.2％(55mg/ml)和91％(86mg/ml)回收。
将31G1E10-12从4.2mg/ml浓缩至10.2mg/ml、25.6mg/ml、55mg/ml和72mg/ml。所有样品的单体纯度均为100％。抗体以88.2％(10.2mg/ml)、94.8％(25.6mg/ml)、91.1％(55mg/ml)和84.2％(72mg/ml)回收。
将56B3C11-13从4.2mg/ml浓缩至10.2mg/ml、21.2mg/ml、45mg/ml和76mg/ml。所有样品的单体纯度为98.8％。抗体以88.3％(10.2mg/ml)、93.5％(21.2mg/ml)、91％(45mg/ml)和91％(76mg/ml)回收。
将56B3C11-18从4.2mg/ml浓缩至10.6mg/ml、22.4mg/ml、43mg/ml和84mg/ml。所有样品的单体纯度为98.2％。抗体以85.3％(10.6mg/ml)、93.9％(22.4mg/ml)、88.5％(43mg/ml)和99％(84mg/ml)回收。
实施例41通过DSC的热稳定性测量
使用差示扫描量热法(DSC)评估熔化温度(Tm)。使用配备有96孔板自动进样器的自动MicroCal VP-Capillary DSC进行扫描。扫描温度为25-100℃，扫描速率为60℃/h。使用Origin 7.0通过减去参照数据和基线并将蛋白质浓度归一化，对样品数据进行分析。使用非双态解折叠模型来拟合每种蛋白质的解折叠转变，以计算转变温度(Tm)。
31G1E10变体与56B3C11变体的熔化温度相似。31G1E10-12的Tm略高于31G1E10-7的Tm。56B3C11变体具有相似的Tm。56B3C11-13的Tm似乎比56B3C11-18略高。所有Tm均在正常范围内(表22)。
表22
Figure BDA0002220906740000711
尽管本文中已经示出并描述了本公开内容的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本公开内容的情况下现将想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文所述的本公开内容实施方案的各种替代方案均可用于实施本公开内容。旨在由以下权利要求来限定本公开内容的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
序列表
<110> 再鼎医药（上海）有限公司
<120> 抗PD-1抗体及其用途
<130> 091908416-P
<140> 201910939066.X
<141> 2019-09-27
<150> PCT/CN2018/107872
<151> 2018-09-27
<160> 153
<170> PatentIn version 3.5
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肽
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Gly
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肽
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<212> PRT
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<220>
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肽
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Ser Tyr Thr Met Ser
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<212> PRT
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<220>
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肽
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Tyr Ile Ser Phe Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
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<220>
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肽
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Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
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Gly
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Trp Val Tyr Pro Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly
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Ser Asp Tyr Ala Trp Asn
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Tyr Ile Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
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Asn Ile Leu Pro Gly Thr Asn Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
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Thr Phe Tyr Gly Pro Phe Asp Tyr
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Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn
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Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe Leu Asn
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<220>
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肽
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Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
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<223> 人工序列的描述：合成的
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Gln Gln Gly Asp Met Ile Pro Trp Thr
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<223> 人工序列的描述：合成的
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Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser
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<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 29
Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
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Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Leu Thr
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 31
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 32
His Gly Thr Asn Leu Glu Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 33
Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Pro Thr
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 34
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asn Ser Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 35
Phe Thr Ser Thr Arg Glu Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 36
Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 37
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 37
atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gtcctaattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60
gtgaagctgg tggagtctgg gggaggatta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatggcatgt cttgggttcg ccagactccg 180
gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtggtggtg gtcgtgacac ctactatcca 240
gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacaa cctgtacctg 300
caaatgaaca atctgaggtc tgaggacacg gccttgtatt actgtgcaag acagcgggat 360
tccgcctggt ttgctcactg gggccaaggg actcgggtca ctgtctctgc a 411
<210> 38
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 38
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Asn Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Arg Asp Ser Ala Trp Phe Ala His Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ala
130 135
<210> 39
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 39
atggagaaag acacactcct gctatgggtc ctgcttctct gggttccagg ttccacgggt 60
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120
atctcctgca gagccagcga aagtgttgat agttatggca ttagttttat gaactggttc 180
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 240
ggggtccctg ccagatttag tgtcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 300
cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 360
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 393
<210> 40
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 40
Met Glu Lys Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
35 40 45
Val Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Val Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser
85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
100 105 110
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 41
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 41
atgcgatgga actggatctt tctcttcctc ctgtcaataa ctgcaggtgt ccattgccag 60
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaggatgtcc 120
tgcaaggctt ctggttatac cttcacaagt ttctatatac actggatgaa gcagaggcct 180
ggacagggac ttgagtggat tggatgggtt tatcctggcg ataccaagta caatgagaag 240
ttcaagggca agaccacact gactgcagac aaatcttcca gcacagccta catgttgctc 300
agcggcctga cctctgagga ctctgcgacc tatttctgtg caaggcataa ttacgatacg 360
atggactact ggggtcaagg aacctcagtc accgtctcct ca 402
<210> 42
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 42
Met Arg Trp Asn Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Cys Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Phe Tyr Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Trp Val Tyr Pro Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
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Tyr Met Leu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe
100 105 110
Cys Ala Arg His Asn Tyr Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Ser Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 43
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 43
atggacatga gggttcctgc tcacgttttt ggcttcttgt tgctctggtt tccaggtgcc 60
aggtgtgaca tccagatggc ccagtctcca tcctccttat ctgcctctct gggagaaaga 120
gtcagtctca cttgtcgggc cagtcaggaa attagtggtt acttaagctg gcttcagcag 180
aaaccagatg gaactattaa acgcctgatc tacgccgcat ccactttaga ttctggtgtc 240
ccaaaaaggt tcagtggcag taggtctggg tcagattatt ctctcaccat cagcagcctt 300
gagtctgaag attttgcaga ctattactgt ctacaatatg ccagttatcc gctcacgttc 360
ggtgctggga ccaagctgga gctgaaa 387
<210> 44
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 44
Met Asp Met Arg Val Pro Ala His Val Phe Gly Phe Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Ala Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln
100 105 110
Tyr Ala Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
115 120 125
Lys
<210> 45
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 45
atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60
gttcagctgc agcagtctgg agctgagctg atgaagcctg gggcctcagt gaagatatcc 120
tgcaagactt ctggctacac attcagtaac tactggatag agtggataaa gcagaggccc 180
ggacatggcc ttgagtggat tggaaacatt ttacctggaa ctaataatac taattacaat 240
gagaagttca agggcaaggc cacattcaat gcagatagat cctcccacac agcctacatg 300
caactcagca gcctgacatc tgaggactct gccgtctatt actgtgcaag aactttctat 360
ggcccctttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 408
<210> 46
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 46
Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Leu Pro Gly Thr Asn Asn Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Asn Ala Asp Arg Ser Ser His
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Phe Tyr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 47
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 47
atggaatcac agacccaggt cctcatgttt cttctgctct gggtatctgg tgcctgtgca 60
gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact 120
atgagctgca agtccagtca gagcctttta aatagtaaca gtcaaaagaa ctatttggcc 180
tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaacttctgc tattctttac atccactagg 240
gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc 300
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gattacttct gtcagcaaca ttataacact 360
ccttacacgt tcgggggggg gaccaagctg gaaataaaa 399
<210> 48
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 48
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
20 25 30
Met Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Asn Ser Asn Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Leu Phe Phe Thr Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr
100 105 110
Phe Cys Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys
130
<210> 49
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 49
atgagagtgc tgattctttt gtggctgttc acagcctttc ctggtatcct gtctgatgtg 60
cagcttcagg agtcgggacc tggcctggtg aaaccttctc agtctctgtc cctcacctgc 120
actgtcactg gctactcaat caccagtgat tatgcctgga actggattcg gcagtttcca 180
ggaaacaaac tggagtggat gggctacata atctacagtg gtagcactag ctacaaccca 240
tctctcaaaa gtcgaatctc tatcactcga gacacatcca agaaccagtt cttcctgcag 300
ttgaattctg tgactactga ggacacagcc acatattact gtgcaagaaa ctacggtagt 360
agcttttact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 414
<210> 50
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 50
Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Ile
1 5 10 15
Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
20 25 30
Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
35 40 45
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Asn Tyr Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 51
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 51
atggacatga tggtccttgc tcagtttctt gcattcttgt tgctttggtt tccaggtgca 60
agatgtgaca tcctgatgac ccaatctcca tcctccatgt ctgtatctct gggagacaca 120
gtcagcatca cttgccatgc aagtcagggc attagcagta atatagggtg gttgcagcag 180
aaaccaggga aatcatttaa gggcctgatc tatcatggaa ccaacttgga agatggagtt 240
ccatcaaggt tcagtggcag tggatctgga gcagattatt ctctcaccat cagcagcctg 300
gaatctgaag attttgcaga ctattactgt gtacagtatg ctcagtttcc tccgacgttc 360
ggtggaggca ccaagctgga aatcaaa 387
<210> 52
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 52
Met Asp Met Met Val Leu Ala Gln Phe Leu Ala Phe Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Met Ser Val Ser Leu Gly Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ala Ser
35 40 45
Gln Gly Ile Ser Ser Asn Ile Gly Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ser Phe Lys Gly Leu Ile Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln
100 105 110
Tyr Ala Gln Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys
<210> 53
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 53
atgaatttcg ggctcagctt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt cctgtgtgaa 60
gtgatgctgg tggagtctgg gggaggttta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac tttcaatagt tataccatgt cttgggttcg ccagactcca 180
gagaagagac tggagtgggt cgcatacatt agttttggtg gtggtgacac ctactatcca 240
gacactgtta agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300
caaatgaaca gtctgaagtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag acagggtaac 360
tacgaggggg ctcccttcgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 417
<210> 54
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 54
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Leu Cys Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Asn Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Phe Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Pro Phe Ala Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
130 135
<210> 55
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 55
atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattttttaa actggtatca actgaaacca 180
gatggaacta ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 240
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattaccga cctggagcaa 300
gaagatattg ccacttacct ttgccaacag ggtgatatga ttccgtggac gttcggtgga 360
ggcaccaagc tggaaatcaa a 381
<210> 56
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 56
Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Asp Gly Thr Ile
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr
85 90 95
Asp Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Leu Cys Gln Gln Gly Asp
100 105 110
Met Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 57
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 57
atgaacttcg ggctcagctt gattttcctt gtcctaattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60
gtgaagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac tttcagtact tatggcatgt cttgggttcg ccagactccg 180
gagaagaggc tggagtgggt cgcaaccatt agtggtggtg gtcgtgacac ctactatcca 240
gacagtgtga aggggcgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacaa tttgtacctg 300
cagatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccttgtatt actgtgcaag acagcgggat 360
tccgcctggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 411
<210> 58
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 58
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Thr Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Asn Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Arg Asp Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
130 135
<210> 59
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 59
atggagaaag acacactcct gctatgggtc ctgcttctct gggttccagg ttccacaggt 60
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctaggaca gaggaccacc 120
atctcctgca gagccagcga aagtgttgat gattatggca ttagttttat gaactggttc 180
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 240
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 300
cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 360
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 393
<210> 60
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 60
Met Glu Lys Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Thr Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
35 40 45
Val Asp Asp Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser
85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
100 105 110
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 61
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 61
gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcagc ccggaggatc cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggca tgagctgggt gagacaggcc 120
cctggcaagg gactggagtg ggtgagcaca atcagcggcg gcggcaggga tacctactac 180
gctgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca actccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagcagagg 300
gactccgctt ggttcgccca ctggggacag ggcaccctgg tgaccgtgtc cagc 354
<210> 62
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Arg Asp Ser Ala Trp Phe Ala His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 63
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 63
gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcagc ccggaggatc cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggca tgagctgggt gagacaggcc 120
cctggcaagg gactggagtg ggtggccaca atcagcggcg gcggcaggga tacctactac 180
gctgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca actccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagcagagg 300
gactccgctt ggttcgccca ctggggacag ggcaccctgg tgaccgtgtc cagc 354
<210> 64
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Arg Asp Ser Ala Trp Phe Ala His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 65
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 65
gaggtgaagc tggtggagtc cggaggaggc ctggtgcagc ctggaggaag cctgagactg 60
agctgcgccg cctccggctt caccttcagc agctacggca tgtcctgggt gagacaggct 120
cctggcaagg gcctggagtg ggtggctacc atcagcggcg gaggcaggga cacctactac 180
gccgacagcg tgaaaggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagcagagg 300
gacagcgcct ggtttgccca ctggggccag ggaaccctgg tgaccgtgag cagc 354
<210> 66
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 66
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Arg Asp Ser Ala Trp Phe Ala His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 67
gacatcgtgc tgacccagtc ccctgccagc ctggctgtga gccctggaca gagggccacc 60
atcacctgca gggccagcga gagcgtggac agctacggca tcagcttcat gaactggtac 120
cagcagaagc ccggccagcc ccctaagctg ctgatctacg ccgccagcaa tcagggcagc 180
ggagtgcctg ccagattcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcaac 240
cccgtggagg ccaacgacac cgccaactac tactgccagc agtccaagga ggtgccctgg 300
accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aag 333
<210> 68
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 68
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 69
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 69
gacatcgtgc tgacccagtc ccctgccagc ctggctgtga gccctggaca gagggccacc 60
atcacctgca gggccagcga gagcgtggac agctacggca tcagcttcat gaactggtac 120
cagcagaagc ccggccagcc ccctaagctg ctgatctacg ccgccagcaa tcagggcagc 180
ggagtgcctg ccagattcag cgtgagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcaac 240
cccgtggagg ccaacgacac cgccaactac tactgccagc agtccaagga ggtgccctgg 300
accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aag 333
<210> 70
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 70
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Val Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 71
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 71
gacatcgtgc tgacccagtc ccctgccagc ctggctgtga gccctggaca gagggccacc 60
atcacctgca gggccagcga gagcgtggac agctacggca tcagcttcat gaactggttc 120
cagcagaagc ccggccagcc ccctaagctg ctgatctacg ccgccagcaa tcagggcagc 180
ggagtgcctg ccagattcag cgtgagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcaac 240
cccgtggagg ccaacgacac cgccaactac tactgccagc agtccaagga ggtgccctgg 300
accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aag 333
<210> 72
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 72
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Val Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 73
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 73
gacatcgtgc tgacccagag ccctgccagc ctggctgtgt cccctggaca gagggccacc 60
atcacctgca gagccagcga gagcgtggac agctacggca tcagcttcat gaactggttc 120
cagcagaaac ccggccagcc ccccaagctg ctgatctacg ccgccagcaa tcagggaagc 180
ggcgtgcctg ccagattcag cgtgagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcaac 240
cccgtggagg ccaacgacac cgccatgtac ttctgccagc agagcaagga ggtgccctgg 300
accttcggcc agggaaccaa ggtggagatc aag 333
<210> 74
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 74
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Val Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 75
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 75
gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcagc ctggcggaag cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacacca tgagctgggt gagacaggct 120
cctggcaagg gcctggagtg ggtgagctac atcagcttcg gcggcggcga cacctactac 180
cccgataccg tgaagggcag gttcaccatc tccagggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagcagggc 300
aattacgagg gcgccccttt cgcctattgg ggccaaggca ccctggtgac cgtgagcagc 360
<210> 76
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Phe Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115
<210> 77
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 77
gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcagc ctggcggaag cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcaac agctacacca tgagctgggt gagacaggct 120
cctggcaagg gcctggagtg ggtgagctac atcagcttcg gcggcggcga cacctactac 180
cccgataccg tgaagggcag gttcaccatc tccagggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagcagggc 300
aattacgagg gcgccccttt cgcctattgg ggccaaggca ccctggtgac cgtgagcagc 360
<210> 78
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Phe Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115
<210> 79
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 79
gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcagc ctggcggaag cctgagactg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcaac agctacacca tgagctgggt gagacaggct 120
cctggcaagg gcctggagtg ggtggcctac atcagcttcg gcggcggcga cacctactac 180
cccgataccg tgaagggcag gttcaccatc tccagggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagcagggc 300
aattacgagg gcgccccttt cgcctattgg ggccaaggca ccctggtgac cgtgagcagc 360
<210> 80
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Phe Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115
<210> 81
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 81
gaggtgcagc tggtggagag cggaggcgga ctggtgcaac ctggaggcag cctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcaac agctacacca tgtcctgggt gaggcaggcc 120
cctggcaaga gactggagtg ggtggcctac atcagcttcg gcggcggcga tacctactac 180
cccgacaccg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagcagggc 300
aactacgagg gagccccctt cgcttattgg ggccagggaa ccctggtgac cgtgagcagc 360
<210> 82
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Phe Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115
<210> 83
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 83
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggaga cagggtgacc 60
atcacctgca gggccagcca ggacatcagc aacttcctga actggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac accagcaggc tgcacagcgg cgtgcctagc 180
aggtttagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacatcg ccacctacta ctgccagcag ggcgacatga tcccctggac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Met Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 85
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 85
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggaga cagggtgacc 60
atcacctgca gggccagcca ggacatcagc aacttcctga actggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac accagcaggc tgcacagcgg cgtgcctagc 180
aggtttagcg gcagcggcag cggcaccgac tacaccttca ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacatcg ccacctacta ctgccagcag ggcgacatga tcccctggac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Met Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 87
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 87
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggaga cagggtgacc 60
atcacctgca gggccagcca ggacatcagc aacttcctga actggtacca gctgaagccc 120
ggcaaggcca tcaagctgct gatctactac accagcaggc tgcacagcgg cgtgcctagc 180
aggtttagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacatcg ccacctacta ctgccagcag ggcgacatga tcccctggac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321
<210> 88
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 88
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Met Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 89
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 89
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggaga cagggtgacc 60
atcacctgca gggccagcca ggacatcagc aacttcctga actggtacca gctgaagccc 120
ggcaaggcca tcaagctgct gatctactac accagcaggc tgcacagcgg cgtgcctagc 180
agatttagcg gcagcggcag cggcaccgac tacaccttca ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacatcg ccacctacct gtgccagcag ggcgacatga tcccctggac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321
<210> 90
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Leu Cys Gln Gln Gly Asp Met Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 91
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多核苷酸
<400> 91
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggaga cagggtgacc 60
atcacctgca gggccagcca ggacatcagc aacttcctga actggtacca gctgaagccc 120
ggcggcgcca tcaagctgct gatctactac accagcaggc tgcacagcgg cgtgcctagc 180
agatttagcg gcagcggcag cggcaccgac tacaccttca ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacatcg ccacctacct gtgccagcag ggcgacatga tcccctggac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321
<210> 92
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
多肽
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gly Ala Ile Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Leu Cys Gln Gln Gly Asp Met Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 93
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Thr或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Gly或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Arg或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> Ser或Thr
<400> 93
Xaa Ile Ser Xaa Gly Gly Xaa Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Xaa Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Glu或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Ser或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Val或Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Asp或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Ser, Asn或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Tyr或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> Gly或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Ile或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(15)
<223> 可能存在或可能不存在
<400> 94
Arg Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Phe Met Asn
1 5 10 15
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Ser或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Lys或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Glu或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Val或Ile
<400> 95
Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Trp Thr
1 5
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 96
Thr Tyr Thr Met Ser
1 5
<210> 97
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 97
Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 98
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 98
Thr Ile Ser Phe Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 99
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 99
Tyr Ile Ser Phe Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 100
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 101
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 101
Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 102
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 102
Tyr Ile Ser Phe Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 103
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 103
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 104
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 104
Tyr Ile Ser Phe Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 105
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 105
Thr Ile Ser Phe Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 106
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 107
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 107
Gln Gly Asp Ser Ala Trp Phe Ala His
1 5
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 108
Gln Arg Asn Ser Ala Trp Phe Ala His
1 5
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 109
Gln Arg Asp Tyr Ala Trp Phe Ala His
1 5
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 110
Gln Arg Asp Ser Glu Trp Phe Ala His
1 5
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 111
Gln Arg Asp Ser Ala Gly Phe Ala His
1 5
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 112
Gln Arg Asp Ser Ala Trp Ala Ala His
1 5
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 113
Gln Arg Asp Ser Ala Trp Phe Pro His
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 114
Gln Arg Asp Ser Ala Trp Phe Ala Phe
1 5
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 115
Gln Gly Asn Ser Ala Trp Phe Ala His
1 5
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 116
Gln Gly Asn Tyr Ala Trp Phe Ala His
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 117
Gln Gly Asn Ser Glu Trp Phe Ala His
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 118
Gln Gly Asn Ser Ala Gly Phe Ala His
1 5
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 119
Gln Gly Asn Ser Ala Trp Ala Ala His
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 120
Gln Gly Asn Ser Ala Trp Phe Pro His
1 5
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 121
Gln Gly Asn Ser Ala Trp Phe Ala Phe
1 5
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 122
Gln Gly Asn Ser Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 123
Gln Gly Asn Tyr Glu Trp Phe Ala His
1 5
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 124
Gln Gly Asn Tyr Ala Gly Phe Ala His
1 5
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 125
Gln Gly Asn Tyr Ala Trp Ala Ala His
1 5
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 126
Gln Gly Asn Tyr Ala Trp Phe Pro His
1 5
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 127
Gln Gly Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Phe
1 5
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 128
Gln Gly Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 129
Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Phe Ala His
1 5
<210> 130
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 130
Gln Gly Asn Tyr Glu Trp Ala Ala His
1 5
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 131
Gln Gly Asn Tyr Glu Trp Phe Pro His
1 5
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 132
Gln Gly Asn Tyr Glu Trp Phe Ala Phe
1 5
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 133
Gln Gly Asn Tyr Glu Trp Phe Ala Tyr
1 5
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 134
Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Ala His
1 5
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 135
Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Phe Pro His
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 136
Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Phe Ala Phe
1 5
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 137
Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Phe Ala Tyr
1 5
<210> 138
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 138
Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Pro His
1 5
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 139
Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Pro Phe
1 5
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 140
Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Pro Tyr
1 5
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 141
Gln Arg Asp Ser Ala Trp Phe Ala His Ala
1 5 10
<210> 142
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 142
Gln Arg Asp Ser Ala Trp Phe Ala His Ala Tyr
1 5 10
<210> 143
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 143
Gln Gly Asn Ser Ala Trp Phe Ala His Ala
1 5 10
<210> 144
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 144
Gln Gly Asn Ser Ala Trp Phe Ala His Ala Tyr
1 5 10
<210> 145
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 145
Gln Gly Asn Tyr Ala Trp Phe Ala His Ala
1 5 10
<210> 146
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 146
Gln Gly Asn Tyr Ala Trp Phe Ala His Ala Tyr
1 5 10
<210> 147
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 147
Gln Gly Asn Tyr Glu Trp Phe Ala His Ala
1 5 10
<210> 148
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 148
Gln Gly Asn Tyr Glu Trp Phe Ala His Ala Tyr
1 5 10
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 149
Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Phe Ala His Ala
1 5 10
<210> 150
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 150
Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Phe Ala His Ala Tyr
1 5 10
<210> 151
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 151
Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Ala His Ala
1 5 10
<210> 152
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
肽
<400> 152
Gln Gly Asn Tyr Glu Gly Ala Ala His Ala Tyr
1 5 10
<210> 153
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成的
6xHis tag
<400> 153
His His His His His His
1 5

Claims (87)

1.一种抗PD-1抗体，其包含三个可变重链互补决定区(CDR)和三个可变轻链互补决定区(CDR)，其中与纳武单抗和派姆单抗相比，所述抗PD-1抗体与PD-1的胞外域上的不同表位特异性结合，并且其中所述抗PD-1抗体的结合亲和力与纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力相当。
2.如权利要求1所述的抗PD-1抗体，其中：
a)VH CDR1序列由X1YX2MS组成；
其中X1是S或T并且X2是G或T；
b)VH CDR2序列由X3ISX4GGX5DTYYPDX6VKG组成；
其中X3是T或Y；X4是G或F；X5是R或G；并且X6是S或T；并且
c)VH CDR3序列由QX7X8X9X10X11X12X13X14X15X16组成；
其中X7是R或G；X8是D或N；X9是S或Y；X10是A或E；X11是W或G；X12是F或A；X13是A或P；X14是H、F或Y；X15存在或不存在，并且如果存在，则是A；并且X16存在或不存在，并且如果存在，则是Y。
3.一种抗PD-1抗体，其包含三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)，其中：
a)VH CDR1序列由X1YX2MS组成；
其中X1是S或T并且X2是G或T；
b)VH CDR2序列由X3ISX4GGX5DTYYPDX6VKG组成；
其中X3是T或Y；X4是G或F；X5是R或G；并且X6是S或T；并且
c)VH CDR3序列由QX7X8X9X10X11X12X13X14X15X16组成；
其中X7是R或G；X8是D或N；X9是S或Y；X10是A或E；X11是W或G；X12是F或A；X13是A或P；X14是H、F或Y；X15存在或不存在，并且如果存在，则是A；并且X16存在或不存在，并且如果存在，则是Y。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗PD-1抗体，其中
a)VL CDR1序列由RASX17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28组成；
其中X17是E或Q；X18是S或D；X19是V或I；X20是D或S；X21是S、N或D；X22是Y或F；X23是G或L；X24是I或N；X25存在或不存在，并且如果存在，则是S；X26存在或不存在，并且如果存在，则是F；X27存在或不存在，并且如果存在，则是M；X28存在或不存在，并且如果存在，则是N；
b)VL CDR2序列由X29X30SX31X32X33S组成；
其中X29是A或Y；X30是A或T；X31是N或R；X32是Q或L；X33是G或H；并且
c)VL CDR3序列由QQX34X35X36X37PWT组成；
其中X34是S或G；X35是K或D；X36是E或M；X37是V或I。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述VH CDR1序列选自SEQ ID NO：1、4或7。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述VH CDR2序列选自SEQ ID NO：2、5或8。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述VH CDR3序列选自SEQ ID NO：3、6或9。
8.如权利要求1-7中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述VL CDR1序列选自SEQ ID NO：19、22或25。
9.如权利要求1-8中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述VL CDR2序列选自SEQ ID NO：20、23或26。
10.如权利要求1-9中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述VL CDR3序列选自SEQ IDNO：21、24或27。
11.如权利要求1-3中任一项所述的抗PD-1抗体，其中：
a)所述VH CDR1序列选自SEQ ID NO：1、4或7；
b)所述VH CDR2序列选自SEQ ID NO：2、5或8；并且
c)所述VH CDR3序列由QX7X8X9X10X11X12X13X14X15X16组成；
其中X7是R或G；X8是D或N；X9是S或Y；X10是A或E；X11是W或G；X12是F或A；X13是A或P；X14是H、F或Y；X15存在或不存在，并且如果存在，则是A；并且X16存在或不存在，并且如果存在，则是Y。
12.如权利要求1-3中任一项所述的抗PD-1抗体，其中：
a)所述VH CDR1序列选自SEQ ID NO：1、4或7；
b)所述VH CDR2序列选自SEQ ID NO：2、5或8；并且
c)所述VH CDR3序列选自SEQ ID NO：3、6或9。
13.如权利要求1-3、11或12中任一项所述的抗PD-1抗体，其中
a)VL CDR1序列选自SEQ ID NO：19、22或25；
b)VL CDR2序列选自SEQ ID NO：20、23或26；并且
c)VL CDR3序列由QQX34X35X36X37PWT组成；
其中X34是S或G；X35是K或D；X36是E或M；X37是V或I。
14.如权利要求1-3、11、12或13中任一项所述的抗PD-1抗体，其中
a)所述VL CDR1序列由RASX17X18X19X20X21X22X23X24X25X26X27X28组成；
其中X17是E或Q；X18是S或D；X19是V或I；X20是D或S；X21是S、N或D；X22是Y或F；X23是G或L；X24是I或N；X25存在或不存在，并且如果存在，则是S；X26存在或不存在，并且如果存在，则是F；X27存在或不存在，并且如果存在，则是M；X28存在或不存在，并且如果存在，则是N；
b)所述VL CDR2序列选自SEQ ID NO：20、23或26；并且
c)所述VL CDR3序列选自SEQ ID NO：21、24或27。
15.如权利要求1-3或11-14中任一项所述的抗PD-1抗体，其中
a)所述VL CDR1序列选自SEQ ID NO：19、22或25；
b)所述VL CDR2序列选自SEQ ID NO：20、23或26；并且
c)所述VL CDR3序列选自SEQ ID NO：21、24或27。
16.如权利要求1所述的抗PD-1抗体，其中VH CDR1序列选自SEQ ID NO：10、13或16。
17.如权利要求1所述的抗PD-1抗体，其中VH CDR2序列选自SEQ ID NO：11、14或17。
18.如权利要求1所述的抗PD-1抗体，其中VH CDR3序列选自SEQ ID NO：12、15或18。
19.如权利要求1所述的抗PD-1抗体，其中VL CDR1序列选自SEQ ID NO：28、31或34。
20.如权利要求1所述的抗PD-1抗体，其中VL CDR2序列选自SEQ ID NO：29、32或35。
21.如权利要求1所述的抗PD-1抗体，其中VL CDR3序列选自SEQ ID NO：30、33、36。
22.如权利要求1-15中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体包含根据SEQID NO：1-3的三个VH CDR和根据SEQ ID NO：19-21的三个VL CDR。
23.如权利要求1-15中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体包含根据SEQID NO：4-6的三个VH CDR和根据SEQ ID NO：22-24的三个VL CDR。
24.如权利要求1-15中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体包含根据SEQID NO：7-9的三个VH CDR和根据SEQ ID NO：25-27的三个VL CDR。
25.如权利要求1所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：10-12的三个VH CDR和根据SEQ ID NO：28-30的三个VL CDR。
26.如权利要求1所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：13-15的三个VH CDR和根据SEQ ID NO：31-33的三个VL CDR。
27.如权利要求1所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：16-18的三个VH CDR和根据SEQ ID NO：34-36的三个VL CDR。
28.如权利要求1-15或22中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：38的VH序列和根据SEQ ID NO：40的VL序列。
29.如权利要求1或16-21中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：42的VH序列和根据SEQ ID NO：44的VL序列。
30.如权利要求1或16-21中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：46的VH序列和根据SEQ ID NO：48的VL序列。
31.如权利要求1或16-21中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：50的VH序列和根据SEQ ID NO：52的VL序列。
32.如权利要求1-15或23中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：54的VH序列和根据SEQ ID NO：56的VL序列。
33.如权利要求1-15或24中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体包含根据SEQ ID NO：58的VH序列和根据SEQ ID NO：60的VL序列。
34.如权利要求1-33中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体的结合亲和力高于纳武单抗的结合亲和力。
35.如权利要求1-33中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体的结合亲和力高于派姆单抗的结合亲和力。
36.如权利要求1-35中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体的结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。
37.如权利要求1-35中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体的结合亲和力比纳武单抗或派姆单抗的结合亲和力高约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％或更多。
38.如权利要求1-37中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体阻断PD-1与PD-L1和/或PD-L2的相互作用。
39.如权利要求38所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体在约5-7nM的抗体浓度范围下具有＞40％抑制、＞50％抑制或＞60％抑制。
40.如权利要求38所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体在6.67nM的抗体浓度下具有＞46％的抑制。
41.如权利要求1-40中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体具有小于8e-9M、小于6e-9M、小于4e-9M、小于2.5e-9M、小于2e-9M、小于1.5e-9M或小于1.2e-9M的KD。
42.如权利要求1-41中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体具有约2.43e-9M的KD。
43.如权利要求1-42中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体具有约1.16e-9M的KD。
44.如权利要求1-43中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体具有与纳武单抗和/或派姆单抗相似的IC50。
45.如权利要求1-44中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体诱导细胞因子产生。
46.如权利要求45所述的抗PD-1抗体，其中所述细胞因子是IL-2或INF-γ。
47.如权利要求1-46中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体包含IgG1构架。
48.如权利要求1-46中任一项所述的抗PD-1抗体，其中所述抗PD-1抗体包含IgG4构架。
49.如权利要求47或48所述的抗PD-1抗体，其中所述构架是人源化IgG1或IgG4构架。
50.如权利要求48或49所述的抗PD-1抗体，其中所述IgG4构架包含S228P突变。
51.一种抗PD-1抗体，其包含三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)，其中VH CDR1序列选自SEQ ID NO：1、4、7、10、13或16；VH CDR2序列选自SEQ ID NO：2、5、8、11、14或17；并且VH CDR3序列选自SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18。
52.如权利要求51所述的抗PD-1抗体，其中VL CDR1序列选自SEQ ID NO：19、22、25、28、31或34；VL CDR2序列选自SEQ ID NO：20、23、26、29、32或35；并且VL CDR3序列选自SEQ IDNO：21、24、27、30、33或36。
53.一种抗PD-1抗体，其包含根据SEQ ID NO：1-3的三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和根据SEQ ID NO：19-21的三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)。
54.一种抗PD-1抗体，其包含根据SEQ ID NO：4-6的三个可变重链(VH)互补决定区(CDR)和根据SEQ ID NO：22-24的三个可变轻链(VL)互补决定区(CDR)。
55.一种抗PD-1抗体，其包含选自SEQ ID NO：38和40、42和44、46和48、50和52、54和56、58和60的可变重链序列和可变轻链序列对。
56.一种抗PD-1抗体，其包含选自SEQ ID NO：62、64和66的可变重链序列和选自SEQ IDNO：68、70、72和74的可变轻链序列。
57.一种抗PD-1抗体，其包含选自SEQ ID NO：76、78、80和82的可变重链序列和选自SEQID NO：84、86、88、90和92的可变轻链序列。
58.一种药物组合物，其包含如权利要求1-57所述的抗PD-1抗体和药学上可接受的赋形剂。
59.如权利要求58所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于全身施用。
60.如权利要求58或59所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于肠胃外施用。
61.一种分离的核酸分子，其编码如权利要求1-57中任一项所述的抗体。
62.一种载体，其包含编码如权利要求1-57中任一项所述的抗体的核酸序列。
63.一种宿主细胞，其产生如权利要求1-57所述的抗PD-1抗体。
64.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用如权利要求1-57所述的抗PD-1抗体。
65.一种在患有癌症的受试者中加强细胞因子产生的方法，包括使所述受试者的细胞与如权利要求1-57所述的抗PD-1抗体接触，从而诱使细胞因子产生相对于同一受试者的未接触所述抗体的细胞中的细胞因子产生而言增加。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述细胞因子是IL-2。
67.如权利要求65所述的方法，其中所述细胞因子是INF-γ。
68.如权利要求64-67中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
69.如权利要求64-67中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液恶性肿瘤。
70.如权利要求64-69中任一项所述的方法，其中所述癌症是膀胱癌、脑癌、乳腺癌、膀胱癌、骨癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或子宫癌。
71.如权利要求64-69中任一项所述的方法，其中所述癌症是淋巴瘤。
72.如权利要求64-69中任一项所述的方法，其中所述癌症是霍奇金淋巴瘤。
73.如权利要求64-72中任一项所述的方法，进一步包括施用另外的治疗剂。
74.如权利要求64-73中任一项所述的方法，其中顺序地施用所述抗PD-1抗体和所述另外的治疗剂。
75.如权利要求74所述的方法，其中在施用所述另外的治疗剂之前向所述受试者施用所述抗PD-1抗体。
76.如权利要求74所述的方法，其中在施用所述抗PD-1抗体之前向所述受试者施用所述另外的治疗剂。
77.如权利要求64-73中任一项所述的方法，其中同时施用所述抗PD-1抗体和所述另外的治疗剂。
78.如权利要求64-77中任一项所述的方法，其中所述抗PD-1抗体和所述另外的治疗剂被配制为单独的剂型。
79.一种诱导表达PD-L1和/或PD-L2的细胞的吞噬的方法，包括用如权利要求1-57所述的抗PD-1抗体阻断所述细胞与表达PD-1的T细胞的结合，从而诱导所述细胞的吞噬。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述细胞是癌性细胞。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述细胞来自实体瘤。
82.如权利要求80所述的方法，其中所述细胞来自血液恶性肿瘤。
83.如权利要求80-82中任一项所述的方法，其中所述细胞来自膀胱癌、脑癌、乳腺癌、膀胱癌、骨癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食道癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、甲状腺癌或子宫癌。
84.如权利要求80-82中任一项所述的方法，其中所述细胞来自淋巴瘤。
85.如权利要求80-82中任一项所述的方法，其中所述细胞来自霍奇金淋巴瘤。
86.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
87.一种试剂盒，其包含如权利要求1-57所述的抗PD-1抗体或如权利要求58-60所述的药物组合物。
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