TW201938203A - 靶向共有抗原之抗原結合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本發明提供HLA-肽靶及結合HLA-肽靶之抗原結合蛋白。本發明亦揭示鑑別該等HLA-肽靶以及鑑別結合特定HLA-肽靶之一或多種抗原結合蛋白之方法。

Description

靶向共有抗原之抗原結合蛋白
免疫系統採用兩種適應性免疫反應以提供對病原體之抗原特異性保護；體液免疫反應及細胞免疫反應，這些免疫反應分別涉及經由B淋巴細胞及T淋巴細胞之病原體抗原之特異性識別。
由於為細胞免疫性之抗原特異性效應子，T淋巴細胞於身體防禦抵抗由細胞內病原體(諸如病毒、細胞內細菌、支原體及細胞內寄生物)介導之疾病及藉由直接細胞溶解受感染細胞來防禦抵抗癌細胞中起著中心作用。T淋巴細胞反應之特異性係由結合至受感染細胞表面上之(主要組織相容性複合體)MHC分子的T-細胞受體(TCR)來賦予且通過其激活。T-細胞受體為選殖地分佈在個別T淋巴細胞上之抗原特異性受體，該等T淋巴細胞之抗原特異性庫經由類似於涉及產生抗體基因庫之彼等之體細胞基因重排機理產生。T-細胞受體包括跨膜分子之異二聚體，主要類型由α-β多肽二聚體及γ-δ多肽二聚體之更小子集組成。T淋巴細胞受體次單元包括類似於免疫球蛋白在細胞外域之可變區及恆定區、具有促進α及β鏈配對之半胱胺酸之短的鉸鏈區、跨膜及短的細胞質區。由TCR觸發之信號轉導經由CD3-ζ(包含信號轉導次單元之相關多次單元複合體)間接介導。
T淋巴細胞受體一般不識別天然抗原，而識別細胞表面呈現之複合體，該等複合體包含與用於呈遞肽抗原之主要組織相容性複合體(MHC)締合之抗原之細胞內處理片段。主要組織相容性複合體基因跨物種群體係高度多晶型，其包含各個別基因之多個共有對偶基因。於人類中，MHC被稱作人類白血球抗原(HLA)。
主要組織相容性複合體I類分子在體內實際上所有有核細胞之表面上表現且為包含跨膜重鏈之二聚體分子，該跨膜重鏈包含肽抗原結合裂隙及稱為β2-微球蛋白之更小細胞外鏈。MHC I類分子呈遞源自細胞溶質蛋白藉由蛋白酶體(細胞質中之多單元結構)之降解之肽(Niedermann G.,2002.Curr Top Microbiol Immunol.268：91-136；用於處理細菌性抗原，參考Wick M J及Ljunggren H G.,1999.Immunol Rev.172：153-62)。裂解肽藉由抗原處理相關轉運子(TAP)轉運至內質網(ER)之腔，其中使其結合至經組裝之I類分子之溝槽，及將所得MHC/肽複合體轉運至細胞膜以使抗原能呈遞至T淋巴細胞(Yewdell J W.,2001.Trends Cell Biol.11：294-7；Yewdell J W.及Bennink J R.,2001.Curr Opin Immunol.13：13-8)。或者，裂解肽可以TAP-獨立性方式負載在MHC I類分子上及亦可通過交叉呈遞方法呈遞細胞外衍生之蛋白質。因而，一旦確定複合體之結構(肽序列及MHC亞型)之同一性，特定MHC/肽複合體呈遞細胞表面上之新穎蛋白質結構，該細胞表面可藉由新穎抗原結合蛋白(例如，抗體或TCR)靶向。
腫瘤細胞可表現抗原且可呈現腫瘤細胞表面上之此等抗原。此等腫瘤相關抗原可用於開發用於特異性靶向腫瘤細胞之新穎免疫治療試劑。例如，腫瘤相關抗原可用於鑑別治療性抗原結合蛋白，例如， TCR、抗體或抗原結合片段。此等腫瘤相關抗原亦可於醫藥組合物(例如，疫苗)中利用。
本文中提供一種特異性結合至人類白血球抗原(HLA)-肽靶的經分離抗原結合蛋白(ABP)，其中該HLA-肽靶包含與HLA I類分子複合之HLA-限制性肽，其中該HLA-限制性肽位於該HLA I類分子之α1/α2異二聚體部分之肽結合溝槽中，且其中：該HLA I類分子為HLA亞型B*35：01且該HLA-限制性肽包含序列EVDPIGHVY，該HLA I類分子為HLA亞型A*02：01且該HLA-限制性肽包含序列AIFPGAVPAA，該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽包含序列ASSLPTTMNY，或該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽包含序列HSEVGLPVY。
於一些實施例中，該HLA-限制性肽之長度係介於約5至15個胺基酸之間。於一些實施例中，該HLA-限制性肽之長度係介於約8至12個胺基酸之間。於一些實施例中，該HLA I類分子為HLA亞型B*35：01且該HLA-限制性肽由序列EVDPIGHVY組成，該HLA I類分子為HLA亞型A*02：01且該HLA-限制性肽由序列AIFPGAVPAA組成，該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽由序列ASSLPTTMNY組成，或該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽由序列HSEVGLPVY組成。
於一些實施例中，該ABP包括抗體或其抗原結合片段。
於ABP之一些實施例中，該ABP包括抗體或其抗原結合片段，該HLA I類分子為HLA亞型B*35：01且該HLA-限制性肽包含序列 EVDPIGHVY。於一些實施例中，該HLA I類分子為HLA亞型B*35：01且該HLA-限制性肽由序列EVDPIGHVY組成。
於一些實施例中，該ABP包括CDR-H3，該CDR-H3包含選自以下之序列：CARDGVRYYGMDVW、CARGVRGYDRSAGYW、CASHDYGDYGEYFQHW、CARVSWYCSSTSCGVNWFDPW、CAKVNWNDGPYFDYW、CATPTNSGYYGPYYYYGMDVW、CARDVMDVW、CAREGYGMDVW、CARDNGVGVDYW、CARGIADSGSYYGNGRDYYYGMDVW、CARGDYYFDYW、CARDGTRYYGMDVW、CARDVVANFDYW、CARGHSSGWYYYYGMDVW、CAKDLGSYGGYYW、CARSWFGGFNYHYYGMDVW、CARELPIGYGMDVW及CARGGSYYYYGMDVW。
於一些實施例中，該ABP包括CDR-L3，該CDR-L3包含選自以下之序列：CMQGLQTPITF、CMQALQTPPTF、CQQAISFPLTF、CQQANSFPLTF、CQQANSFPLTF、CQQSYSIPLTF、CQQTYMMPYTF、CQQSYITPWTF、CQQSYITPYTF、CQQYYTTPYTF、CQQSYSTPLTF、CMQALQTPLTF、CQQYGSWPRTF、CQQSYSTPVTF、CMQALQTPYTF、CQQANSFPFTF、CMQALQTPLTF及CQQSYSTPLTF。
於一些實施例中，該ABP包含來自scFv之CDR-H3及CDR-L3，該scFv指定為：G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、 G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07或G5R4-P4B01。
於一些實施例中，該ABP包含來自scFv之所有三條重鏈CDR及所有三條輕鏈CDR，該scFv指定為：G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07或G5R4-P4B01。
於一些實施例中，該ABP包含選自以下之VH序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGIINPRSGSTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSAS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSHDINWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGDTGYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGVRGYDRSAGYWGQGTLVIVSSAS、EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSSYWMSWVRQAPGKGLEWISYISGDSGYTNYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCASHDYGDYGEYFQHWGQGTLVTVSSAS、EVQLLQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSDMNWVRQAPGKGLEWVAYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSWYCSSTSCGVNWFDPWGQGTLVTVSSAS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSDMNWVRQAPGKGLEWVASISSSGGYINYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVNWNDGPYFDYWGQGTLVTVSS、 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNFGVSWLRQAPGQGLEWMGGIIPILGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPTNSGYYGPYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDVMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSGYLVSWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNTAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFRNYPMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDNGVGVDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNIGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGIADSGSYYGNGRDYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYGISWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGVTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGDTKYSQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGTRYYGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSYTNYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVY YCARDVVANFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWMNPDSGSTGYAQRFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGHSSGWYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMHWVRQAPGKGLEWVSSITSFTNTMYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLGSYGGYYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSWFGGFNYHYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARELPIGYGMDVWGQGTTVTVSS、及QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIVGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS。
於一些實施例中，該ABP包含選自以下之VL序列：DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLQTPITFGQGTRLEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSSRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPPTFGPGTKVDIK、 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAISFPLTFGQSTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYMMPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYITPWTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYITPYTFGQGTKLEIK、DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKTSQSVLYRPNNENYLAWYQQKPGQPPKLLIYQASIREPGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQ YYTTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRFLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRPQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSHRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK、EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYAASARASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYGSWPRTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPVTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDISNHLNWYQQKPGKAPKLLIYDALSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGQGTKVEIK、及DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI YAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
於一些實施例中，該ABP包含來自scFv之VH序列及VL序列，該scFv指定為：G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-PID06、G5R4-P1H11、GSR4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07及G5R4-P4B01。
於一些實施例中，該ABP結合至限制性肽EVDPIGHVY之胺基酸位置2至8中之任一者或多者。
於ABP之一些實施例中，該ABP包括抗體或其抗原結合片段，該HLA I類分子為HLA亞型A*02：01且該HLA-限制性肽包含序列AIFPGAVPAA。於ABP之一些實施例中，該ABP包括抗體或其抗原結合片段，該HLA I類分子為HLA亞型A*02：01且該HLA-限制性肽由序列AIFPGAVPAA組成。
於一些實施例中，該ABP包括CDR-H3，該CDR-H3包含選自以下之序列：CARDDYGDYVAYFQHW、CARDLSYYYGMDVW、CARVYDFWSVLSGFDIW、CARVEQGYDIYYYYYMDVW、CARSYDYGDYLNFDYW、CARASGSGYYYYYGMDVW、CAASTWIQPFDYW、CASNGNYYGSGSYYNYW、CARAVYYDFWSGPFDYW、CAKGGIYYGSGSYPSW、CARGLYYMDVW、CARGLYGDYFLYYGMDVW、CARGLLGFGEFLTYGMDVW、CARDRDSSWTYYYYGMDVW、CARGLYGDYFLYYGMDVW、CARGDYYDSSGYYFPVYFDYW及 CAKDPFWSGHYYYYGMDVW。
於一些實施例中，該ABP包括CDR-L3，該CDR-L3包含選自以下之序列：CQQNYNSVTF、CQQSYNTPWTF、CGQSYSTPPTF、CQQSYSAPYTF、CQQSYSIPPTF、CQQSYSAPYTF、CQQHNSYPPTF、CQQYSTYPITI、CQQANSFPWTF、CQQSHSTPQTF、CQQSYSTPLTF、CQQSYSTPLTF、CQQTYSTPWTF、CQQYGSSPYTF、CQQSHSTPLTF、CQQANGFPLTF及CQQSYSTPLTF。
於一些實施例中，該ABP包括來自scFv之CDR-H3及CDR-L3，該scFv指定為：G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01或G8-P2C11。
於一些實施例中，該ABP包括來自scFv之所有三條重鏈CDR及所有三條輕鏈CDR，該scFv指定為：G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01或G8-P2C11。
於一些實施例中，該ABP包含選自以下之VH序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSRSAITWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGATNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYGDYVAYFQHWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFIGQYLHWVRQAPGQGLE WMGIINPSGDSATYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDLSYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPIGGGTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVYDFWSVLSGFDIWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVEQGYDIYYYYYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTLSSYPINWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGHADYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYDYGDYLNFDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSSISGRGDNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASGSGYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYFMHWVRQAPGQGLEWMGMVNPSGGSETFAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAASTWIQPFDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASNGNYYGSGSYYNYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTTYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAVYYDFWSGPFDYWGQGTLVTVSS、 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGGIYYGSGSYPSWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYGVSWVRQAPGQGLEWMGWISPYSGNTDYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNMYLHWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGDTNYAQTFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYGDYFLYYGMDVWGQGTKVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLLGFGEFLTYGMDVWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTTYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDRDSSWTYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSNYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYGDYFLYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSHAISWVRQAPGQGLEWMGVIIPSGGTSYTQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDSSGYYFPVYFDYWGQGTLVTVSS、及QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDT AVYYCARDPFWSGHYYYYGMDVWGQGTTVTVSS。
於一些實施例中，該ABP包含選自以下之VL序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSITSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNYNSVTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCWASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTPWTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAISNSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSTPPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPPTFGGGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNSYPPTFGQGTKLEIK、 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPITIGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPWTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSTPQTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSTPWTFGQGTKLEIK、EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGNSLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYGSSPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISGYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSTPLT FGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYTYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANGFPLTFGGGTKVEIK、及DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
於一些實施例中，該ABP包含來自scFv之VH序列及VL序列，該scFv指定為：G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01或G8-P2C11。
於一些實施例中，該ABP結合至限制性肽AIFPGAVPAA之胺基酸位置1至5中之任一者或多者。於一些實施例中，該ABP結合至限制性肽AIFPGAVPAA之胺基酸位置4及5中之一者或二者。
於一些實施例中，該ABP結合至HLA亞型A*02：01之胺基酸位置45至60中之任一者或多者。
於一些實施例中，該ABP結合至HLA亞型A*02：01之胺基酸位置56、59、60、63、64、66、67、70、73、74、132、150至153、155、156、158至160、162至164、166至168、170及171中之任一者或多者。
於ABP之一些實施例中，該ABP包括抗體或其抗原結合片段，該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽包含序列 ASSLPTTMNY。於ABP之一些實施例中，該ABP包括抗體或其抗原結合片段，該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽由序列ASSLPTTMNY組成。
於一些實施例中，該ABP包括CDR-H3，該CDR-H3包含選自以下之序列：CARDQDTIFGVVITWFDPW、CARDKVYGDGFDPW、CAREDDSMDVW、CARDSSGLDPW、CARGVGNLDYW、CARDAHQYYDFWSGYYSGTYYYGMDVW、CAREQWPSYWYFDLW、CARDRGYSYGYFDYW、CARGSGDPNYYYYYGLDVW、CARDTGDHFDYW、CARAENGMDVW、CARDPGGYMDVW、CARDGDAFDIW、CARDMGDAFDIW、CAREEDGMDVW、CARDTGDHFDYW、CARGEYSSGFFFVGWFDLW及CARETGDDAFDIW。
於一些實施例中，該ABP包括CDR-L3，該CDR-L3包含選自以下之序列：CQQYFTTPYTF、CQQAEAFPYTF、CQQSYSTPITF、CQQSYIIPYTF、CHQTYSTPLTF、CQQAYSFPWTF、CQQGYSTPLTF、CQQANSFPRTF、CQQANSLPYTF、CQQSYSTPFTF、CQQSYSTPFTF、CQQSYGVPTF、CQQSYSTPLTF、CQQSYSTPLTF、CQQYYSYPWTF、CQQSYSTPFTF、CMQTLKTPLSF及CQQSYSTPLTF。
於一些實施例中，該ABP包含來自scFv之CDR-H3及CDR-L3，該scFv指定為：R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、 R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08或R3G10-P5C08。
於一些實施例中，該ABP包含來自scFv之所有三條重鏈CDR及所有三條輕鏈CDR，該scFv指定為：R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08或R3G10-P5C08。
於一些實施例中，該ABP包含選自以下之VH序列：EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGISARSGRTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDQDTIFGVVITWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIHPGGGTTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDKVYGDGFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDDSMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFIGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDSSGLDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGL EWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVGNLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGVTFSTSAISWVRQAPGQGLEWMGWISPYNGNTDYAQMLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDAHQYYDFWSGYYSGTYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNSIINWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREQWPSYWYFDLWGRGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSTHDINWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSAIYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDRGYSYGYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGNTFIGYYVHWVRQAPGQGLEWVGIINPNGGSISYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSGDPNYYYYYGLDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLSYYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTGTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGDHFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIGPSDGSTTYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAENGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYVHWVRQAPGQGLEWMGIIAPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGGYMDVWGKGTTVTVSS、 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYLHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGDAFDIWGQGTMVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGRISPSDGSTTYAPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDMGDAFDIWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEDGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLSYYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTGTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGDHFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNNFAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDATNYAQKFQGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEYSSGFFFVGWFDLWGRGTQVTVSS、及QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIAPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETGDDAFDIWGQGTMVTVSS。
於一些實施例中，該ABP包含選自以下之VL序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYFTTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLI FDASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAEAFPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPITFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYIIPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQTYSTPLTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYSFPWTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYSTPLTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISRYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPRTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSLPYTFGQGTKVEIK、 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASKLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYGVPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPWTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQ TLKTPLSFGGGTKVEIK、及DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
於一些實施例中，該ABP包含來自scFv之VH序列及VL序列，該scFv指定為：R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08或R3G10-P5C08。
於一些實施例中，該ABP結合至限制性肽ASSLPTTMNY之胺基酸位置4、6及7中之任一者或多者。
於一些實施例中，該ABP結合至HLA亞型A*01：01之胺基酸位置49至56中之任一者或多者。
本文中亦提供一種特異性結合至人類白血球抗原(HLA)-肽靶的經分離抗原結合蛋白(ABP)，其中該HLA-肽靶包含與HLA I類分子複合之HLA-限制性肽，其中該HLA-限制性肽位於該HLA I類分子之α1/α2部分之肽結合溝槽中，且其中該HLA-肽靶係選自表A。
於一些實施例中，該HLA-限制性肽之長度係介於約5至15個胺基酸之間。於一些實施例中，該HLA-限制性肽之長度係介於約8至12個胺基酸之間。
於一些實施例中，該ABP包括抗體或其抗原結合片段。於一些實施例中，該抗原結合蛋白連接至支架，視情況該支架包括血清白蛋 白或Fc，視情況其中Fc為人類Fc且為IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM同型Fc。於一些實施例中，該抗原結合蛋白經由連接子連接至支架，視情況該連接子為肽連接子，視情況該肽連接子為人類抗體之鉸鏈區。於一些實施例中，該抗原結合蛋白包含Fv片段、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、scFv片段、scFv-Fc片段及/或單域抗體或其抗原結合片段。於一些實施例中，該抗原結合蛋白包含scFv片段。於一些實施例中，該抗原結合蛋白包括一或多個抗體互補決定區(CDR)，視情況六個抗體CDR。於一些實施例中，該抗原結合蛋白包括抗體。於一些實施例中，該抗原結合蛋白為單株抗體。於一些實施例中，該抗原結合蛋白為人源化、人類或嵌合抗體。於一些實施例中，該抗原結合蛋白係多特異性，視情況雙特異性。於一些實施例中，該抗原結合蛋白結合大於一種抗原或大於一個單抗原上之抗原決定基。於一些實施例中，該抗原結合蛋白包含選自IgG、IgA、IgD、IgE及IgM之類別之重鏈恆定區。於一些實施例中，該抗原結合蛋白包含類別人類IgG及選自IgG1、IgG4、IgG2及IgG3之子類別之重鏈恆定區。於一些實施例中，該抗原結合蛋白包含延長半衰期之一或多種修飾。於一些實施例中，該抗原結合蛋白包含經修飾之Fc，視情況該經修飾之Fc包含延長半衰期之一或多個突變，視情況該延長半衰期之一或多個突變為YTE。
於經分離ABP之一些實施例中，該ABP包含T細胞受體(TCR)或其抗原結合部分。於一些實施例中，該TCR或其抗原結合部分包含TCR可變區。於一些實施例中，該TCR或其抗原結合部分包含一或多個TCR互補決定區(CDR)。
於一些實施例中，該TCR包含α鏈及β鏈。於一些實施例 中，該TCR包含γ鏈及δ鏈。
於一些實施例中，該抗原結合蛋白為包含以下之嵌合抗原受體(CAR)之部分：包含該抗原結合蛋白之細胞外部分；及細胞內訊號域。於一些實施例中，該抗原結合蛋白包含scFv且該細胞內訊號域包含基於免疫受體酪胺酸之激活基序(ITAM)。於一些實施例中，該細胞內訊號域包含CD3-ζ(CD3)鏈之ζ鏈之訊號域。
於一些實施例中，該ABP還包含連接細胞外域及細胞內訊號域之跨膜域。於一些實施例中，該跨膜域包含CD28之跨膜部分。
於一些實施例中，該ABP還包含T細胞共刺激分子之細胞內訊號域。於一些實施例中，該T細胞共刺激分子為CD28、4-1BB、OX-40、ICOS或其任何組合。
於ABP之一些實施例中，該ABP包含TCR或其抗原結合部分，該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽包含序列ASSLPTTMNY。於一些實施例中，該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽由序列ASSLPTTMNY組成。於一些實施例中，該ABP包含選自表15之TCR α CDR3序列。於一些實施例中，該ABP包含選自表15之TCR β CDR3序列。於一些實施例中，該ABP包含選自TCR純系型ID編號：1至344中任一者之α CDR3及β CDR3序列。於一些實施例中，該ABP包含TCR α可變(TRAV)胺基酸序列、TCR α接合(TRAJ)胺基酸序列、TCR β可變(TRBV)胺基酸序列、TCR β多樣性(TRBD)胺基酸序列及TCR β接合(TRBJ)胺基酸序列，其中該等TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD及TRBJ胺基酸序列各者與選自TCR純系型ID編號：1至344之TCR純系型中之任一者之對應TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD及TRBJ胺基酸 序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
於一些實施例中，該ABP包含TCR α恆定(TRAC)胺基酸序列。於一些實施例中，該ABP包含TCR β恆定(TRBC)胺基酸序列。
於一些實施例中，該ABP包含具有與選自表16之α VJ序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之TCR α VJ序列。於一些實施例中，該ABP包含具有與選自表16之β V(D)J序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之TCR β V(D)J序列。於一些實施例中，該ABP包含TCR α VJ胺基酸序列及TCR β V(D)J胺基酸序列，其中該等TCR α VJ及該等TCR β V(D)J胺基酸序列各者與選自TCR純系型ID編號：1至344之TCR純系型中之任一者之對應TCR α VJ及TCR β V(D)J胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
於ABP之一些實施例中，該ABP包含TCR或其抗原結合部分，該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽包含序列HSEVGLPVY。於一些實施例中，該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽由序列HSEVGLPVY組成。
於一些實施例中，該ABP包含選自表18之TCR α CDR3序列。於一些實施例中，該ABP包含選自表18之TCR β CDR3序列。於一些實施例中，該ABP包含選自TCR純系型ID編號：345至447中任一者之α CDR3及β CDR3序列。於一些實施例中，該ABP包含TCR α可變(TRAV)胺基酸序列、TCR α接合(TRAJ)胺基酸序列、TCR β可變(TRBV)胺基酸序列、TCR β多樣性(TRBD)胺基酸序列及TCR β接合(TRBJ)胺基酸序列，其中該等TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD及TRBJ胺基酸序列各者與選自TCR純系型ID編號：345至447之TCR純系型中之任一者之對應 TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD及TRBJ胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。於一些實施例中，該ABP包含TCR α恆定(TRAC)胺基酸序列。於一些實施例中，該ABP包含TCR β恆定(TRBC)胺基酸序列。
於一些實施例中，該ABP包含具有與選自表19之α VJ序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之TCR α VJ序列。於一些實施例中，該ABP包含具有與選自表19之β V(D)J序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之TCR β V(D)J序列。於一些實施例中，該ABP包含TCR α VJ胺基酸序列及TCR β V(D)J胺基酸序列，其中該等TCR α VJ及該等TCR β V(D)J胺基酸序列各者與選自TCR純系型ID編號：345至447之TCR純系型中之任一者之對應TCR α VJ及TCR β V(D)J胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
本文中亦提供經分離HLA-肽靶，其中該HLA-肽靶包含與HLA I類分子複合之HLA-限制性肽，其中該HLA-限制性肽位於該HLA I類分子之α1/α2異二聚體部分之肽結合溝槽中，且其中該HLA-肽靶係選自表A。
於一些實施例中，該HLA I類分子為HLA亞型B*35：01且該HLA-限制性肽包含序列EVDPIGHVY，該HLA I類分子為HLA亞型A*02：01且該HLA-限制性肽包含序列AIFPGAVPAA，或該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽包含序列ASSLPTTMNY。於一些實施例中，該HLA I類分子為HLA亞型B*35：01且該HLA-限制性肽由序列EVDPIGHVY組成，該HLA I類分子為HLA亞型A*02：01且該HLA-限制性肽由序列AIFPGAVPAA組成，或該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01 且該HLA-限制性肽由序列ASSLPTTMNY組成。
於一些實施例中，該HLA-限制性肽之長度係介於約5至15個胺基酸之間。於一些實施例中，該HLA-限制性肽之長度係介於約8至12個胺基酸之間。
於一些實施例中，HLA亞型與限制性肽之締合使該HLA亞型之β2-微球蛋白次單元與該HLA亞型之α-次單元之非共價締合穩定。於一些實施例中，該HLA亞型之β2-微球蛋白次單元與該HLA亞型之α-次單元之穩定化締合藉由條件肽交換證實。
於一些實施例中，該經分離HLA-肽靶還包含親和標籤。於一些實施例中，該親和標籤為生物素標籤。於一些實施例中，該經分離HLA-肽靶與可檢測標記物複合。於一些實施例中，該可檢測標記物包括β2-微球蛋白結合分子。於一些實施例中，該β2-微球蛋白結合分子為經標記之抗體。於一些實施例中，該經標記之抗體為經螢光染料標記之抗體。
本文中亦提供一種組合物，其包含附接至固體擔體之如本文中所述之HLA-肽靶。於一些實施例中，該固體擔體包括珠、孔、膜、管、管柱、板、瓊脂糖、磁珠或晶片。
於一些實施例中，該HLA-肽靶包含親和力結合對之第一成員且該固體擔體包含親和力結合對之第二成員。於一些實施例中，該第一成員為鏈黴抗生物素(streptavidin)且該第二成員為生物素。
本文中亦提供一種反應混合物，其包含來自如表A中所述之HLA-肽靶之HLA亞型之經分離且純化的α-次單元；該HLA亞型之經分離且純化之β2-微球蛋白次單元；來自如表A中所述之HLA-肽靶之經分離且純化之限制性肽；及反應緩衝液。
本文中亦提供一種反應混合物，其包含如本文中所述之經分離HLA-肽靶；及自人類個體分離之複數種T細胞。於一些實施例中，該T細胞為CD8+ T細胞。
本文中亦提供一種經分離多核苷酸，其包含可以操作方式連接至啟動子之編碼如本文中所述之HLA-限制性肽之第一核酸序列，及編碼如本文中所述之HLA亞型之第二核酸序列，其中該第二核酸可以操作方式連接至與第一核酸序列相同或不同之啟動子，且其中該經編碼之肽及經編碼之HLA亞型形成如本文中所述之HLA/肽複合體。
本文中亦提供一種用於表現如本文中所述之穩定HLA-肽靶之套組，其包含第一構築體，該第一構築體包含可以操作方式連接至啟動子之編碼如本文中所述之HLA-限制性肽之第一核酸序列；及於表現穩定HLA-肽複合體之使用說明書。於一些實施例中，該第一構築體還包含編碼如本文中所定義之HLA亞型之第二核酸序列。於一些實施例中，該第二核酸序列可以操作方式連接至相同或不同啟動子。於一些實施例中，該套組還包含第二構築體，該第二構築體包含編碼如本文中所述之HLA亞型之第二核酸序列。於一些實施例中，該第一及第二構築體中之一者或二者為慢病毒載體構築體。
本文中亦提供一種宿主細胞，其包含如本文中所述之異種HLA-肽靶。本文中亦提供一種宿主細胞，其表現如由表A中之靶中之任一者所定義之HLA亞型。本文中亦提供一種宿主細胞，其包含編碼如表A中所述之HLA-限制性肽之多核苷酸，例如，編碼本文中所述之HLA-限制性肽之多核苷酸。
於一些實施例中，該宿主細胞不包括內源性MHC。於一些 實施例中，該宿主細胞包括外源性HLA。於一些實施例中，該宿主細胞為K562或A375細胞。
於一些實施例中，該宿主細胞為來自腫瘤細胞系之經培養細胞。於一些實施例中，該腫瘤細胞系表現如由表A中之靶中之任一者所定義之HLA亞型。於一些實施例中，該腫瘤細胞系表現如由表A中之靶中之任一者所定義之基因靶及HLA亞型。例如，該腫瘤細胞系可表現如由表A中之1號靶所定義之基因ABCB5及HLA亞型HLA-C*16：01。於一些實施例中，該腫瘤細胞系係選自腫瘤細胞系之資料庫或目錄。選擇可基於來自表A中所列靶中之任一者之基因靶的已知表現。選擇可基於來自表A中所列靶中之任一者之HLA亞型的已知表現。選擇可基於來自表A中所列靶中之任一者之基因靶及HLA亞型的已知表現。腫瘤細胞系之一示例性目錄包括(例如)美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)，其在https：//www.atcc.org/Products/Cells_and_Microorganisms/By_Disease_Model/Cancer/Tumor_Cell_Panels/Panels_by_Tissue_Type.aspx上可得。基於HLA類型及HLA表現，腫瘤細胞系之另一示例性目錄述於Boegel,Sebastian等人「A Catalog of HLA Type,HLA Expression,and Neo-Epitope Candidates in Human Cancer Cell Lines.」Oncoimmunology 3.8(2014)：e954893.PMC.Web.2018年10月8日，其全文以引用的方式併入本文中。於一些實施例中，該腫瘤細胞系係選自由以下組成之群：HCC-1599、NCI-H510A、A375、LN229、NCI-H358、ZR-75-1、MS751、OE19、MOR、BV173、MCF-7、NCI-H82、Colo829及NCI-H146。
本文中亦提供一種細胞培養系統，其包含如本文中所定義 之宿主細胞，及細胞培養基。於一些實施例中，該宿主細胞表現如由表A中之靶中之任一者所定義之HLA亞型，且其中該細胞培養基包含如由表A中之靶所定義之限制性肽。於一些實施例中，該宿主細胞為包含外源性HLA之K562細胞，其中該外源性HLA為如由表A中之靶中之任一者所定義之HLA亞型，且其中該細胞培養基包含如由表A中之靶所定義之限制性肽。
於ABP之一些實施例中，該抗原結合蛋白通過與HLA I類分子之接觸點及通過與HLA-肽靶之HLA-限制性肽之接觸點結合至該HLA-肽靶。於ABP之一些實施例中，該ABP與限制性肽或HLA亞型之胺基酸位置之結合，或影響HLA-肽靶與ABP之直接或間接結合之接觸點或殘基經由位置掃描、氫-氘交換或蛋白質結晶學測定。
於一些實施例中，該ABP可用作藥劑。於一些實施例中，該ABP可用於治療癌症，視情況其中該癌症表現HLA-肽靶或經預測為表現HLA-肽靶。於一些實施例中，該ABP可用於治療癌症，其中該癌症係選自實體腫瘤及血液科腫瘤。
本文中亦提供一種ABP，其為如本文中所述之ABP之經保守修飾之變異體。本文中亦提供一種抗原結合蛋白(ABP)，其與如本文中所述之抗原結合蛋白競爭結合。本文中亦提供一種抗原結合蛋白(ABP)，其結合由如本文中所述之抗原結合蛋白所結合之相同HLA-肽抗原決定基。
本文中亦提供一種經工程改造之細胞，其表現包含如本文中所述之抗原結合蛋白之受體。於一些實施例中，該經工程改造之細胞為T細胞，視情況可選的細胞毒性T細胞(CTL)。於經工程改造之細胞之一些 實施例中，該抗原結合蛋白係自異種啟動子表現。
本文中亦提供經分離多核苷酸或多核苷酸之集合，其編碼本文中所述之抗原結合蛋白或其抗原結合部分。
本文中亦提供一種經分離多核苷酸或多核苷酸之集合，其編碼本文中所述之HLA/肽靶。
本文中亦提供一種載體或載體之集合，其包含本文中所述之多核苷酸或多核苷酸之集合。
本文中亦提供一種宿主細胞，其包含本文中所述之多核苷酸或多核苷酸之集合，或本文中所述之載體或載體之集合，視情況其中該宿主細胞為CHO或HEK293，或視情況其中該宿主細胞為T細胞。
本文中亦提供一種產生抗原結合蛋白之方法，其包括利用本文中所述之宿主細胞表現該抗原結合蛋白及分離該經表現之抗原結合蛋白。
本文中亦提供一種醫藥組合物，其包含如本文中所述之抗原結合蛋白及醫藥上可接受之賦形劑。
本文中亦提供一種治療個體之癌症之方法，其包括對該個體投與有效量之如本文中所述之抗原結合蛋白或本文中所述之醫藥組合物，視情況其中該癌症係選自實體腫瘤及血液科腫瘤。於一些實施例中，該癌症表現HLA-肽靶或經預測為表現HLA-肽靶。
本文中亦提供一種套組，其包含本文中所述之抗原結合蛋白或本文中所述之醫藥組合物及使用說明書。
本文中亦提供一種組合物，其包含至少一種本文中所述之HLA-肽靶及佐劑。
本文中亦提供一種組合物，其包含至少一種本文中所述之HLA-肽靶及醫藥上可接受之賦形劑。
本文中亦提供一種組合物，其包含包含至少一種表A中所揭示之HLA-肽靶之多肽之胺基酸序列，視情況該胺基酸序列基本上由該多肽組成或由該多肽組成。
本文中亦提供一種病毒，其包含如本文中所述之經分離多核苷酸或多核苷酸之集合。於一些實施例中，該病毒為絲狀噬菌體。
本文中亦提供一種酵母細胞，其包含如本文中所述之經分離多核苷酸或多核苷酸之集合。
本文中亦提供一種鑑別如本文中所述之抗原結合蛋白之方法，其包括提供表A中所列之至少一種HLA-肽靶；及使該至少一種靶與該抗原結合蛋白結合，從而鑑別該抗原結合蛋白。
於一些實施例中，該抗原結合蛋白於包含複數個不同抗原結合蛋白之噬菌體呈現庫中呈遞。於一些實施例中，該噬菌體呈現庫實質上不含非特異性結合HLA-肽靶之HLA之抗原結合蛋白。
於一些實施例中，該抗原結合蛋白於包含複數個不同TCR或其抗原結合片段之TCR庫中呈遞。
於一些實施例中，進行該結合步驟一次以上，視情況至少三次。
於一些實施例中，該方法還包括使該抗原結合蛋白與不同於該HLA-肽靶之一或多種肽-HLA複合體接觸以測定該抗原結合蛋白是否選擇性結合該HLA-肽靶，視情況其中選擇性藉由量測該抗原結合蛋白與可溶性靶HLA-肽靶複合體相對於不同於靶複合體之可溶性HLA-肽複合體 之結合親和力來測定，視情況其中選擇性藉由量測該抗原結合蛋白與在一或多種細胞表面上表現之靶HLA-肽複合體相對於不同於在一或多種細胞表面上表現之靶複合體之HLA-肽複合體之結合親和力來測定。
本文中亦提供一種鑑別如本文中所述之抗原結合蛋白之方法，其包括獲得表A中所列之至少一種HLA-肽靶；對個體投與該HLA-肽靶，視情況與佐劑組合；及自該個體分離該抗原結合蛋白。
於一些實施例中，分離該抗原結合蛋白包括篩選該個體之血清以鑑別該抗原結合蛋白。
於一些實施例中，該方法還包括使該抗原結合蛋白與不同於該HLA-肽靶之一或多種肽-HLA複合體接觸以測定該抗原結合蛋白是否選擇性結合至該HLA-肽靶，視情況其中選擇性藉由量測該抗原結合蛋白與可溶性靶HLA-肽複合體相對於不同於靶複合體之可溶性HLA-肽複合體之結合親和力來測定，視情況其中選擇性藉由量測該抗原結合蛋白與在一或多種細胞表面上表現之靶HLA-肽複合體相對於不同於在一或多種細胞表面上表現之靶複合體之HLA-肽複合體之結合親和力來測定。
於一些實施例中，該個體為小鼠、兔或美洲駝。
於一些實施例中，分離該抗原結合蛋白包括自表現該抗原結合蛋白之個體分離B細胞及視情況自該分離B細胞直接選殖編碼該抗原結合蛋白之序列。於一些實施例中，該方法還包括使用B細胞創建雜交瘤。於一些實施例中，該方法還包括自B細胞選殖CDR。於一些實施例中，該方法還包括使B細胞永生化，視情況經由埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)轉形。於一些實施例中，該方法還包括創建包含B細胞之抗原結合蛋白之庫，視情況其中該庫為噬菌體呈現或酵母呈現。
於一些實施例中，該方法還包括使該抗原結合蛋白人源化。
本文中亦提供一種鑑別如本文中所述之抗原結合蛋白之方法，其包括獲得包含該抗原結合蛋白之細胞；使該細胞與包含表A中所列之至少一種HLA-肽靶之HLA-多聚體接觸；及經由該HLA-多聚體與該抗原結合蛋白之間之結合鑑別該抗原結合蛋白。
本文中亦提供一種鑑別如本文中所述之抗原結合蛋白之方法，其包括獲得一或多種包含該抗原結合蛋白之細胞；利用在天然或人工抗原呈遞細胞(APC)上呈遞之表A中所列之至少一種HLA-肽靶激活該一或多種細胞；及經由選擇藉由與表A中所列之至少一種HLA-肽靶相互作用激活之一或多種細胞鑑別該抗原結合蛋白。於一些實施例中，該細胞為T細胞，視情況CTL。於一些實施例中，該方法還包括分離該細胞，視情況使用流動式細胞測量術、磁分離或單細胞分離。於一些實施例中，該方法還包括將抗原結合蛋白定序。
本文中亦提供一種鑑別如本文中所述之抗原結合蛋白之方法，其包括提供表A中所列之至少一種HLA-肽靶；及使用該靶鑑別該抗原結合蛋白。
關於下列描述及附圖，本發明之此等及其他特徵、態樣及優點將變得更好理解，其中：圖1顯示人類白血球抗原(HLA)I類分子之一般結構。由使用者atropos235在en.wikipedia-Own work,CC BY 2.5上，https：//commons.wikimedia.org/w/index.php？curid=1805424。
圖2描繪用於將TCR選殖至表現系統供療法開發之示例性構築體元件。
圖3顯示HLA-肽靶「G5」之靶及微量池陰性對照設計。
圖4顯示HLA-肽靶「G8」及「G10」之靶及微量池陰性對照設計。
圖5顯示G5反向篩選(counterscreen)「微量池」及G5靶之HLA穩定性結果。
圖6顯示G5「完全」池反向篩選肽之HLA穩定性結果。
圖7顯示反向篩選肽及G8靶之HLA穩定性結果。
圖8顯示G10反向篩選「微量池」及G10靶之HLA穩定性結果。
圖9顯示附加G8及G10「完全」池反向篩選肽之HLA穩定性結果。
圖10顯示噬菌體上清液ELISA結果，其指示在連續淘選輪下，G5-、G8及G10結合噬菌體之累進濃化。
圖11顯示描述抗體選擇過程之流程圖，該過程包括scFv、Fab及IgG格式之標準及預期應用。
圖12A、12B及12C描繪Fab純系G5-P7A05至HLA-肽靶B*35：01-EVDPIGHVY、Fab純系R3G8-P2C10及G8-P1C11至HLA-肽靶A*02：01-AIFPGAVPAA、及Fab純系R3G10-P1B07至HLA-肽靶A*01：01-ASSLPTTMNY之生物層干涉法(BLI)結果。
圖13顯示針對位置掃描實驗之一般實驗設計。
圖14A顯示G5位置變異體-HLA之穩定性結果。
圖14B顯示Fab純系G5-P7A05與G5位置變異體-HLA之結合親和力。
圖15A顯示G8位置變異體-HLA之穩定性結果。
圖15B顯示Fab純系G8-P2C10與G8位置變異體-HLA之結合親和力。
圖16A顯示G10位置變異體-HLA之穩定性結果。
圖16B顯示Fab純系G10-P1B07與G10位置變異體-HLA之結合親和力。
圖17A、17B及17C顯示抗體結合至G5-、G8-或G10-呈遞K562細胞之代表性實例，如藉由流動式細胞測量術所檢測。
圖18顯示K562細胞結合至產生之靶特異性抗體之直方圖。
圖19顯示使用表現HLA亞型及選定HLA-肽靶之靶基因之腫瘤細胞系之細胞結合檢定的直方圖。
圖20顯示來自受試供者之靶特異性T細胞之數目(A)及靶特異性獨特TCR純系型之數目(B)。
圖21A顯示scFv G8-P1H08的示例性熱圖，其使用合併擾動視圖使跨HLA-肽靶G8之HLA部分整體視覺化。圖21B顯示來自晶體結構PDB5bs0上繪製之scFv G8-P1H08之HDX資料的實例。
圖22A顯示跨針對HLA-肽靶G8(HLA-A*02：01_AIFPGAVPAA)測試之所有ABP之HLA α1螺旋之熱圖。圖22B顯示跨針對HLA-肽靶G8(HLA-A*02：01_AIFPGAVPAA)測試之所有ABP之HLA α2螺旋之熱圖。圖22C顯示跨所測試之所有ABP之限制性肽AIFPGAVPAA之所得熱圖。
圖23A顯示scFv R3G10-P2G11的示例性熱圖，其使用合併擾動視圖使跨HLA-肽靶G10之HLA部分整體視覺化。
圖23B顯示來自晶體結構PDB5bs0上繪製之scFv R3G10-P2G11之HDX資料的實例。
圖24A顯示跨針對HLA-肽靶G10(HLA-A*01：01_ASSLPTTMNY)測試之所有ABP之HLA α1螺旋之所得熱圖。圖24B顯示跨針對HLA-肽靶G10(HLA-A*01：01_ASSLPTTMNY)測試之所有ABP之HLA α2螺旋之所得熱圖。圖24C顯示跨所測試之所有ABP之限制性肽ASSLPTTMNY之所得熱圖。
圖25描繪肽EVDPIGHVY之示例性光譜資料。該圖含有肽片段資訊以及與患者樣品有關之資訊(包括HLA類型)。
圖26描繪肽AIFPGAVPAA之示例性光譜資料。該圖含有肽片段資訊以及與患者樣品有關之資訊(包括HLA類型)。
圖27描繪肽ASSLPTTMNY之示例性光譜資料。該圖含有肽片段資訊以及與患者樣品有關之資訊(包括HLA類型)。
圖28描繪尺寸排除層析法級分(A)及在還原條件下，該等層析法級分之SDS-PAGE分析(B)。
圖29描繪包含Fab純系G8-P1C11及HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)之複合體之示例性晶體。
圖30描繪藉由Fab純系G8-P1C11結合至HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)形成之複合體之整體結構。
圖31描繪Fab純系G8-P1C11與HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)複合之晶體結構之精修電子密度區，所 描繪區域對應於限制性肽AIFPGAVPAA。
圖32描繪HLA與限制性肽之間之相互作用之LigPlot。晶體結構對應於與HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)複合之Fab純系G8-P1C11。
圖33描繪Fab VH及VL鏈與限制性肽之間之相互作用殘基之圖。晶體結構對應於與HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)複合之Fab純系G8-P1C11。
圖34描繪限制性肽與Fab鏈之間之相互作用之LigPlot。晶體結構對應於與HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)複合之Fab純系G8-P1C11。
圖35描繪Fab VH鏈與HLA之間之相互作用之LigPlot。晶體結構對應於與HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)複合之Fab純系G8-P1C11。
圖36描繪Fab VL鏈與HLA之間之相互作用之LigPlot。晶體結構對應於與HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)複合之Fab純系G8-P1C11。
圖37描繪HLA與限制性肽之間之相互作用之Pisa分析的介面匯總。晶體結構對應於與HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)複合之Fab純系G8-P1C11。
圖38描繪HLA與限制性肽之間之相互作用殘基之Pisa分析。晶體結構對應於與HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)複合之Fab純系G8-P1C11。
圖39描繪Fab VH鏈與限制性肽之間之相互作用殘基之Pisa 分析。晶體結構對應於與HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)複合之Fab純系G8-P1C11。
圖40描繪Fab VL鏈與限制性肽之間之相互作用殘基之Pisa分析。晶體結構對應於與HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)複合之Fab純系G8-P1C11。
圖41描繪Fab VH鏈與HLA之間之相互作用之Pisa分析的介面匯總。晶體結構對應於與HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)複合之Fab純系G8-P1C11。
圖42描繪Fab VH鏈與HLA之間之相互作用殘基之Pisa分析。晶體結構對應於與HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)複合之Fab純系G8-P1C11。
圖43描繪Fab VL鏈與HLA之間之相互作用之Pisa分析的介面匯總。晶體結構對應於與HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)複合之Fab純系G8-P1C11。
圖44描繪Fab VL鏈與HLA之間之相互作用殘基之Pisa分析。晶體結構對應於與HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)複合之Fab純系G8-P1C11。
圖45A描繪當用scFv純系G8-P1C11培育時，G8 HLA-肽複合體之HLA部分之示例性熱圖，其使用合併擾動視圖整體視覺化。
圖45B描繪來自與HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)複合之Fab純系G8-P1C11的晶體結構上繪製之scFv G8-P1C11之HDX資料的實例。
圖46描繪Fab純系G8-P1C11與G8位置變異體-HLA之結合 親和力。
圖47顯示K562細胞結合至G8-P1C11(HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)之靶特異性抗體)之直方圖。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2017年12月28日申請之美國臨時申請案第62/611,403號及2018年11月6日申請之美國臨時申請案第62/756,508號之權利，出於所有目的，該案之全文各者以引用的方式併入本文中。
除非另有指定，否則本文中所用之所有技術術語、記號及其他科學術語意欲具有由熟習此項技術者通常瞭解之含義。於一些情況下，為了清晰及/或出於便覽之目的，本文中定義具有通常所理解含義之術語，及本文中此等定義之納入不一定解釋為表示與此項技術中一般理解者不同。本文中所述或參考之技術及程序一般已充分理解且通常由熟習此項技術者使用習知方法採用，諸如，例如，於Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第4版(2012)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY中所述之廣泛利用之分子選殖方法。視情況而定，除非另有指明，否則一般根據製造商限定之協定及條件進行涉及可市面上購得之套組及試劑之使用之程序。
如本文中所用，除非上下文中另有明確指明，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。除非另有特定指明，否則術語「包括」、「諸如」及類似者意欲表達包含而非限制性。
如本文中所用，除非另有特定指明，否則術語「包括」亦具體而言包括實施例「由詳述要素組成」及「基本上由詳述要素組成」。 例如，「包含雙抗體」之多特異性ABP包括「由雙抗體組成」之多特異性ABP及「基本上由雙抗體組成」之多特異性ABP。
術語「約」指示且涵蓋指定值及該值以上及以下之範圍。於某些實施例中，術語「約」指示指定值±10%、±5%或±1%。於某些實施例中，在可適用之情況下，術語「約」指示指定值±該值之一個標準差。
術語「免疫球蛋白」係指一類結構相關蛋白，其一般包含兩對多肽鏈：一對輕(L)鏈及一對重(H)鏈。於「完整免疫球蛋白」中，此等鏈之所有四者藉由二硫鍵互連。已良好表徵免疫球蛋白之結構。參見，例如，Paul,Fundamental Immunology第7版，第5章(2013)Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,PA。簡言之，各重鏈通常包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區(CH)。該重鏈恆定區通常包含三個域，簡稱CH1、CH2及CH3。各輕鏈通常包含輕鏈可變區(VL)及輕鏈恆定區。該輕鏈恆定區通常包含一個域，簡稱CL。
本文中術語「抗原結合蛋白」或「ABP」以其最廣泛含義使用且包括某些類型之分子，該等分子包含特異性結合至抗原或抗原決定基之一或多個抗原結合域。
於一些實施例中，該ABP包括抗體。於一些實施例中，該ABP由抗體組成。於一些實施例中，該ABP基本上由抗體組成。ABP具體而言包括完整抗體(例如，完整免疫球蛋白)、抗體片段、ABP片段及多特異性抗體。於一些實施例中，該ABP包含替代支架。於一些實施例中，該ABP由替代支架組成。於一些實施例中，該ABP基本上由替代支架組成。於一些實施例中，該ABP包含抗體片段。於一些實施例中，該ABP由抗體 片段組成。於一些實施例中，該ABP基本上由抗體片段組成。於一些實施例中，該ABP包含TCR或其抗原結合部分。於一些實施例中，該ABP由TCR或其抗原結合部分組成。於一些實施例中，該ABP基本上由TCR或其抗原結合部分組成。於一些實施例中，CAR包括ABP。如本文中所提供，「HLA-肽ABP」、「抗HLA-肽ABP」或「HLA-肽特異性ABP」為ABP，其特異性結合至抗原HLA-肽。ABP包括包含經由可變區(諸如源自B細胞(例如，抗體)或T細胞(例如，TCR)之可變區)特異性結合至抗原或抗原決定基之一或多個抗原結合域之蛋白質。
本文中術語「抗體」以最廣泛含義使用且包括多株及單株抗體，其包含完整抗體及功能性(抗原結合)抗體片段，包含抗原結合片段(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重組IgG(rIgG)片段、能特異性結合抗原之可變重鏈(VH)區、包含單鏈可變片段(scFv)之單鏈抗體片段及單域抗體(例如，sdAb、sdFv、奈米抗體)片段。該術語涵蓋經遺傳改造及/或以其他方式修飾之形式之免疫球蛋白，諸如細胞內抗體、肽抗體(peptibodies)、嵌合抗體、全人類抗體、人源化抗體及異偶聯抗體、多特異性(例如，雙特異性)抗體、雙抗體、三抗體及四抗體、串聯二-scFv、串聯三-scFv。除非另有指明，否則術語「抗體」應理解為涵蓋其功能性抗體片段。該術語亦涵蓋完整或全長抗體，包括任何類別或子類別(包括IgG及其子類別、IgM、IgE、IgA及IgD)之抗體。
如本文中所用，「可變區」係指源自重組事件之可變核苷酸序列，例如，其可包括來自B細胞或T細胞(諸如經激活之T細胞或經激活之B細胞)之免疫球蛋白或T細胞受體(TCR)序列之V、J及/或D區。
術語「抗原結合域」意指能特異性結合至抗原或抗原決定 基之ABP之部分。抗原結合域之一實例為由ABP之抗體VH-VL二聚體形成之抗原結合域。抗原結合域之另一實例為由來自黏附素(Adnectin)之第十纖維連接蛋白III型域之某些環之多樣化形成之抗原結合域。抗原結合域可包括按該次序之來自重鏈之抗體CDR 1、2及3；及按該次序之來自輕鏈之抗體CDR 1、2及3。抗原結合域可包括TCR CDR，例如，αCDR1、αCDR2、αCDR3、βCDR1、βCDR2及βCDR3。本文中描述TCR CDR。
可將抗體VH及VL區進一步細分成散佈有更保守區域之高度可變性區域(「高可變區(HVR)」，亦稱作「互補決定區」(CDR))。將該等更保守區域稱作框架區(FR)。各VH及VL一般包括以下列順序(自N-端至C-端)排列之三個抗體CDR及四個FR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。抗體CDR涉及抗原結合且影響抗原特異性及ABP之結合親和力。參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest第5版(1991)Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD，其全文以引用的方式併入。
基於其恆定域之序列，可將來自任何脊椎動物物種之輕鏈指配至兩種類型(稱作κ(κ)及λ(λ))中之一者。
可將來自任何脊椎動物物種之重鏈指配至五種不同類別(或同型)：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM中之一者。亦將此等類別各自指定為α、δ、ε、γ及μ。基於序列及功能之差異，可將IgG及IgA類別進一步細分成子類別。人類表現下列子類別：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
抗體CDR之胺基酸序列邊界可藉由熟習此項技術者使用許多已知編號方案中之任一者確定，該等方案包括藉由以下所述之彼等： Kabat等人，見上(「Kabat」編號方案)；Al-Lazikani等人，1997,J.Mol.Biol.,273：927-948(「Chothia」編號方案)；MacCallum等人，1996,J.Mol.Biol.262：732-745(「接觸」編號方案)；Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.,2003,27：55-77(「IMGT」編號方案)；及Honegge及Plückthun，J.Mol.Biol.,2001,309：657-70(「AHo」編號方案)；其各者之全文以引用的方式併入本文中。
表20提供如由Kabat及Chothia方案所鑑別之抗體CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之位置。針對CDR-H1，使用Kabat及Chothia編號方案二者提供殘基編號。
可(例如)使用ABP編號軟體(諸如Abnum，在www.bioinf.org.uk/abs/abnum/上可得及述於Abhinandan及Martin，Immunology,2008,45：3832-3839中，其全文以引用的方式併入)指配抗體CDR。
*當使用Kabat編號公約編號時，CDR-H1之C-端在H32與H34之間變化(取決於CDR之長度)。
當提及ABP重鏈恆定區中之殘基時，一般使用「EU編號方案」(例如，如於Kabat等人，見上中所報導)。除非另有指明，否則使用EU編號方案係指本文中所述之ABP重鏈恆定區中之殘基。
本文中可交換使用術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」係指具有實質上類似於天然產生抗體結構之結構且具有包含Fc區之重鏈之抗體。例如，當用於提及IgG分子時，「全長抗體」為包含兩條重鏈及兩條輕鏈之抗體。
TCR CDR之胺基酸序列邊界可藉由熟習此項技術者使用許多已知編號方案中之任一者確定，該等方案包括(但不限於)IMGT獨特編號，如由以下所述：LeFranc,M.-P,Immunol Today.1997年11月；18(11)：509；Lefranc,M.-P.,「IMGT Locus on Focus：A new section of Experimental and Clinical Immunogenetics」,Exp.Clin.Immunogenet.,15,1-7(1998)；Lefranc及Lefranc，The T Cell Receptor FactsBook；及M.-P.Lefranc/Developmental and Comparative Immunology 27(2003)55-77，其全文以引用的方式併入本文中。
「ABP片段」包括完整ABP之部分，諸如完整ABP之抗原結合區或可變區。ABP片段包括(例如)Fv片段、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、scFv(sFv)片段及scFv-Fc片段。ABP片段包括抗體片段。抗體片段可包括Fv片段、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、scFv(sFv)片段、scFv-Fc片段及TCR片段。
「Fv」片段包含一個重鏈可變域及一個輕鏈可變域之非共價連接二聚體。
除了重鏈及輕鏈可變域外，「Fab」片段包含輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。可(例如)藉由重組方法或藉由全長ABP之木瓜蛋白酶消化產生Fab片段。
「F(ab’)2」片段含有鉸鏈區附近之由二硫鍵接合之兩個 Fab’片段。可(例如)藉由重組方法或藉由完整ABP之木瓜蛋白酶消化產生F(ab’)2片段。可(例如)藉由用ß-巰基乙醇處理將F(ab’)2片段解離。
「單鏈Fv」或「sFv」或「scFv」片段包含單一多肽鏈中之VH域及VL域。VH及VL一般藉由肽連接子連接。參見Plückthun A.(1994)。可使用任何適宜連接子。於一些實施例中，該連接子為(GGGGS)n。於一些實施例中，n=1、2、3、4、5或6。參見Rosenberg M.及Moore G.P.(編輯)，The Pharmacology of Monoclonal ABPs第113卷(第269至315頁)，Springer-Verlag,New York中之來自大腸桿菌(Escherichia coli)之ABP，其全文以引用的方式併入。
「scFv-Fc」片段包含連接至Fc域之scFv。例如，Fc域可連接至scFv之C-端。Fc域可跟隨VH或VL，取決於scFv中之可變域之取向(即，VH-VL或VL-VH)。可使用此項技術中已知或本文中所述之任何適宜Fc域。於一些情況下，Fc域包含IgG4 Fc域。
術語「單域抗體」係指一種分子，其中在無其他可變域之存在下，ABP之一個可變域特異性結合至抗原。單域ABP及其片段述於Arabi Ghahroudi等人，FEBS Letters,1998,414：521-526及Muyldermans等人，Trends in Biochem.Sci.,2001,26：230-245中，其全文各者以引用的方式併入本文中。單域ABP亦稱作sdAb或奈米抗體。
術語「Fc區」或「Fc」意指免疫球蛋白重鏈之C-端區域，於天然產生之抗體中，該重鏈與Fc受體及補體系統之某些蛋白質相互作用。各種免疫球蛋白之Fc區之結構及其中含有之醣基化位點係此項技術中已知。參見Schroeder及Cavacini，J.Allergy Clin.Immunol.,2010,125：S41-52，其全文以引用的方式併入。Fc區可為天然Fc區，或如此項 技術中或本發明其他地方所述經修飾之Fc區。
術語「替代支架」係指分子，其中一或多個區域可經多樣化以產生特異性結合至抗原或抗原決定基之一或多個抗原結合域。於一些實施例中，該抗原結合域以類似於ABP之結合之特異性及親和力結合抗原或抗原決定基。示例性替代支架包括衍生自以下之彼等：纖維連接蛋白(例如，AdnectinsTM)、β-夾心(例如，iMab)、脂鈣蛋白(lipocalin)(例如，Anticalins®)、EETI-II/AGRP、BPTI/LACI-D1/ITI-D2(例如，Kunitz域)、硫氧還蛋白(thioredoxin)肽適體、蛋白質A(例如，Affibody®)、錨蛋白(ankyrin)重複(例如，DARPins)、γ-B-晶狀體球蛋白/泛素(例如，人泛素(Affilin))、CTLD3(例如，四連接素(Tetranectin))、Fynomer及(LDLR-A模組)(例如，艾菲爾親和聚體(Avimer))。替代支架之額外資訊於Binz等人，Nat.Biotechnol.,2005 23：1257-1268；Skerra,Current Opin.in Biotech.,2007 18：295-304；及Silacci等人，J.Biol.Chem.,2014,289：14392-14398中提供；其全文各者以引用的方式併入本文中。替代支架為ABP之一種。
「多特異性ABP」為包含兩個或更多個不同抗原結合域之ABP，該等抗原結合域共同特異性結合兩個或更多個不同抗原決定基。該等兩個或更多個不同抗原決定基可為相同抗原(例如，藉由細胞表現之單個HLA-肽分子)或不同抗原(例如，藉由相同細胞表現之不同HLA-肽分子或HLA-肽分子及非HLA-肽分子)上之抗原決定基。於一些態樣中，多特異性ABP結合兩個不同抗原決定基(即，「雙特異性ABP」)。於一些態樣中，多特異性ABP結合三個不同抗原決定基(即，「三特異性ABP」)。
「單特異性ABP」為包含一或多個特異性結合至單一抗原 決定基之結合位點之ABP。單特異性ABP之一個實例為天然IgG分子，當二價(即，具有兩個抗原結合域)時，該分子識別兩個抗原結合域各者處之相同抗原決定基。結合特異性可存在於任何適宜價。
術語「單株抗體」係指來自實質上同源抗體之群體之抗體。實質上同源抗體之群體包括實質上相似且結合相同抗原決定基之抗體，除了可在單株抗體之產生期間正常出現之變異體外。此等變異體一般僅以少量存在。單株抗體通常藉由包含自複數個抗體選擇單一抗體之過程獲得。例如，選擇過程可為自複數個純系(諸如雜交瘤純系、噬菌體純系、酵母純系、細菌純系或其他重組DNA純系之池)選擇獨特純系。可進一步更改選定抗體(例如)以提高針對靶之親和力(「親和力成熟」)，以使抗體人源化，以提高其於細胞培養中之產量，及/或以降低其於個體中之免疫原性。
術語「嵌合抗體」係指一種抗體，其中重鏈及/或輕鏈之部分源自特定來源或物種，同時該重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同來源或物種。
非人類抗體之「人源化」形式為含有源自非人類抗體之最小序列之嵌合抗體。人源化抗體一般為人類抗體(接受者抗體)，其中來自一或多個CDR之殘基經來自非人類抗體(供者抗體)之一或多個CDR之殘基置換。供者抗體可為任何適宜非人類抗體，諸如小鼠、大鼠、兔、雞，或具有所需特異性、親和力或生物效應之非人類靈長類抗體。於一些情況下，選定之接收者抗體之框架區殘基經來自供者抗體之對應框架區殘基置換。人源化抗體亦可包含於接受者抗體或供者抗體中未發現之殘基。可作出此等修飾以進一步細化抗體功能。針對進一步細節，參見Jones等人， Nature,1986,321：522-525；Riechmann等人，Nature,1988,332：323-329；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,1992,2：593-596，其全文各者以引用的方式併入本文中。
「人類抗體」為具有對應於由人類或人類細胞產生之抗體或源自利用人類抗體庫或人類抗體編碼序列之非人類來源(例如，獲自人類來源或重新設計)之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列者。人類抗體具體而言不包括人源化抗體。
「親和力」係指分子(例如，ABP)之單個結合位點與其結合搭檔(例如，抗原或抗原決定基)之間之非共價相互作用之總和的強度。除非另有指明，否則如本文中所用，「親和力」係指內在結合親和力，其反映結合對(例如，ABP與抗原或抗原決定基)成員之間之1：1相互作用。分子X對其搭檔Y之親和力可由解離平衡常數(KD)表示。以下更詳細描述促進解離平衡常數之動力學組分。親和力可藉由此項技術中已知之常見方法量測，該等方法包括本文中所述彼等，諸如表面電漿子共振(SPR)技術(例如，BIACORE®)或生物層介面干涉法(例如，FORTEBIO®)。
關於ABP與靶分子之結合，術語「結合」、「特異性結合」、「特異性結合至」、「特異性針對」、「選擇性結合」及「選擇性針對」特定抗原(例如，多肽靶)或特定抗原上之抗原決定基意指可量測地不同於非特異性或非選擇性相互作用(例如，與非靶分子)之結合。特異性結合可(例如)藉由量測結合至靶分子並將其與結合至非靶分子相比較來量測。特異性結合亦可藉由與模擬靶分子上識別之抗原決定基之對照分子競爭來測定。於該情況下，若ABP與靶分子之結合受對照分子競爭性抑制，則指示特異性結合。於一些態樣中，HLA-肽ABP對非靶分子之親和力係小於對 HLA-肽之親和力之約50%。於一些態樣中，HLA-肽ABP對非靶分子之親和力係小於對HLA-肽之親和力之約40%。於一些態樣中，HLA-肽ABP對非靶分子之親和力係小於對HLA-肽之親和力之約30%。於一些態樣中，HLA-肽ABP對非靶分子之親和力係小於對HLA-肽之親和力之約20%。於一些態樣中，HLA-肽ABP對非靶分子之親和力係小於對HLA-肽之親和力之約10%。於一些態樣中，HLA-肽ABP對非靶分子之親和力係小於對HLA-肽之親和力之約1%。於一些態樣中，HLA-肽ABP對非靶分子之親和力係小於對HLA-肽之親和力之約0.1%。
如本文中所用，術語「kd」(sec-1)係指特定ABP-抗原相互作用之解離速率常數。亦將此值稱作koff值。
如本文中所用，術語「ka」(M-1×sec-1)係指特定ABP-抗原相互作用之締合速率常數。亦將此值稱作kon值。
如本文中所用，術語「KD」(M)係指特定ABP-抗原相互作用之解離平衡常數。KD=kd/ka。於一些實施例中，ABP之親和力根據此ABP與其抗原之間之相互作用之KD來描述。為了清晰，如此項技術中所知，更小KD值指示更高親和力相互作用，而更大KD值指示更低親和力相互作用。
如本文中所用，術語「KA」(M-1)係指特定ABP-抗原相互作用之締合平衡常數。KA=ka/kd。
「免疫偶聯物」為與一或多種異種分子(諸如治療劑(例如，細胞激素)或診斷劑)偶聯之ABP。
「Fc效應功能」係指具有Fc區之ABP之由Fc區介導之彼等生物活性，該等活性可取決於同型變化。ABP效應功能之實例包括C1q結 合以激活補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合以激活ABP-依賴性細胞細胞毒性(ADCC)及ABP依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。
當本文於兩種或更多種ABP之背景下使用時，術語「與...競爭」或「與...交叉競爭」指示兩種或更多種ABP競爭結合至抗原(例如，HLA-肽)。於一示例性檢定中，HLA-肽塗覆在表面且與第一HLA-肽ABP接觸，之後添加第二HLA-肽ABP。於另一示例性檢定中，第一HLA-肽ABP塗覆在表面且與HLA-肽接觸，及然後添加第二HLA-肽ABP。若第一HLA-肽ABP之存在減少第二HLA-肽ABP之結合，則於任一檢定中，該等ABP彼此競爭。術語「與...競爭」亦包括ABP之組合，其中一種ABP減少另一種ABP之結合，但是其中當以相反順序添加該等ABP時，未觀察到競爭。然而，於一些實施例中，第一及第二ABP抑制彼此之結合，不管添加其之順序。於一些實施例中，一種ABP減少另一種ABP與其抗原之結合至少25%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。熟習技工可基於ABP對HLA-肽之親和力及ABP之價選擇競爭檢定中所用之ABP之濃度。此定義中所述之檢定係說明性，且熟習技工可利用任何適宜檢定確定ABP是否彼此競爭。適宜檢定述於(例如)Cox等人，「Immunoassay Methods」，於2014年12月24日更新之Assay Guidance Manual[Internet]中(www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/；2015年9月29日訪問)；Silman等人，Cytometry,2001,44：30-37；及Finco等人，J.Pharm.Biomed.Anal.,2011,54：351-358中；其全文各者以引用的方式併入本文中。
術語「抗原決定基」意指特異性結合至ABP之抗原之部 分。抗原決定基往往由表面可達胺基酸殘基及/或糖側鏈組成且可具有特定三維結構特徵，以及特定電荷特徵。構象及非構象抗原決定基經辨別，因為與前者但非後者之結合可在變性溶劑之存在下失去。抗原決定基可包含直接參與結合之胺基酸殘基，及不直接參與結合之其他胺基酸殘基。ABP結合之抗原決定基可使用針對抗原決定基測定之已知技術(諸如，例如，針對ABP結合至具有不同點突變之HLA-肽變異體或至嵌合HLA-肽變異體之測試)測定。
在多肽序列與參考序列之間之「同一性」百分比經定義為於比對序列及引入空隙(若需要)以達成最大序列同一性百分比後，與參考序列中之胺基酸殘基相同之多肽序列中之胺基酸殘基的百分比。出於測定胺基酸序列同一性百分比之目的之比對可以此項技術中熟習之各種方式達成，例如，使用公開可得電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、MEGALIGN(DNASTAR)、CLUSTALW、CLUSTAL OMEGA或MUSCLE軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適宜參數，包括為達成在比較序列之全長之最大比對所需之任何演算法。
「保守置換」或「保守胺基酸置換」係指利用化學上或功能上相似胺基酸置換胺基酸。提供相似胺基酸之保守置換表係此項技術中熟知。舉例而言，於一些實施例中，認為於表21至23中所提供之胺基酸之組為彼此的保守置換。
額外保守置換可見於(例如)Creighton,Proteins：Structures and Molecular Properties第二版(1993)W.H.Freeman及Co.,New York,NY。將藉由使母體ABP中之胺基酸殘基一或多個保守置換產生之ABP稱作「經保守修飾之變異體」。
術語「胺基酸」係指二十種常見天然胺基酸。天然胺基酸包括丙胺酸(Ala；A)、精胺酸(Arg；R)、天冬醯胺酸(Asn；N)、天冬胺酸(Asp；D)、半胱胺酸(Cys；C)；麩胺酸(Glu；E)、麩胺醯胺(Gln；Q)、甘胺酸(Gly；G)、組胺酸(His；H)、異白胺酸(Ile；I)、白胺酸(Leu；L)、離胺酸(Lys；K)、甲硫胺酸(Met；M)、苯丙胺酸(Phe；F)、脯胺酸(Pro；P)、絲胺酸(Ser；S)、蘇胺酸(Thr；T)、色胺酸(Trp；W)、酪胺酸(Tyr；Y)及纈胺酸(Val；V)。
如本文中所用，術語「載體」係指能使連接其之另一核酸 繁殖之核酸分子。術語包括如自我複製核酸結構之載體以及併入宿主細胞之基因組之載體，該載體經引入該基因組中。某些載體能引導可以操作方式連接其之核酸之表現。本文中將此等載體稱作「表現載體」。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可交換使用且係指向其中引入外源核酸之細胞及此等細胞之後代。宿主細胞包括「轉化株」(或「經轉形細胞」)及「轉染子」(或「經轉染細胞」)，其各者包括經最初轉形或轉染之細胞及自其衍生之後代。此後代可與母細胞之核酸含量不完全相同，且可含有突變。
術語「治療(treating)」(及其變型，諸如「治療(treat/treatment)」係指臨床干預以試圖改變有需要個體之疾病或病狀之自然過程。針對預防及在臨床病理學之過程期間均可進行治療。治療之所需效果包括預防疾病之發生或再發生、減輕症狀、減少疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展率、改善或緩和疾病狀態、及緩解或改善預後。
如本文中所用，術語「治療上有效量」或「有效量」係指當對個體投與時，有效治療疾病或病症之本文中所提供之ABP或醫藥組合物之量。
如本文中所用，術語「個體」意指哺乳動物個體。示例性個體包括人類、猴、狗、貓、小鼠、大鼠、牛、馬、駱駝、山羊、兔及綿羊。於某些實施例中，該個體為人類。於一些實施例中，該個體患有可用本文中所提供之ABP治療之疾病或病狀。於一些態樣中，該疾病或病狀為癌症。於一些態樣中，該疾病或病狀為病毒感染。
使用術語「包裝插入物」係指通常包含於治療或診斷產品 (例如，套組)之商業包裝中之說明書，該等說明書含有關於此等治療或診斷產品之適應症、用途、劑量、投與、組合療法、濃度及/或有關使用之警告之資訊。
術語「腫瘤」係指所有贅生細胞生長及增生，無論是否惡性或良性，及所有癌前細胞及癌細胞及組織。術語「癌症」、「癌」、「細胞增生性病症」、「增生性病症」及「腫瘤」如本文中所指不互相排斥。術語「細胞增生性病症」及「增生性病症」係指與一定程度之異常細胞增生相關之病症。於一些實施例中，細胞增生性病症為癌症。於一些態樣中，腫瘤為實體腫瘤。於一些態樣中，腫瘤為血液科惡性病。
術語「醫藥組合物」係指製劑，其呈允許其中含有之活性成分之生物活性有效治療個體之此形式，且其不含有額外組分，該等組分以醫藥組合物中所提供之量對個體具有不可接受之毒性。
術語「調節(modulate/modulation)」係指降低或抑制或，或者激活或增加所述變數。
術語「增加」及「激活」係指所述變數之10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更大之增加。
術語「降低」及「抑制」係指所述變數之10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更大之減少。
術語「促效」係指誘導與受體之激活相關之生物反應之受體訊號的激活。「促效劑」為結合且促效受體之實體。
術語「拮抗」係指抑制與受體之激活相關之生物反應之受體訊號的抑制。「拮抗劑」為結合且拮抗受體之實體。
本文中術語「核酸」及「多核苷酸」可交換使用以係指任何長度之核苷酸(去氧核首酸或核糖核苷酸或其類似物)之聚合形式。多核苷酸可包括(但不限於)基因或基因片段之編碼或非編碼區、自聯接分析定義之基因座、外顯子、內顯子、信使RNA(mRNA)、cDNA、重組多核苷酸、分支之多核苷酸、質粒、載體、分離DNA、分離RNA、核酸探針及引物。多核苷酸可包括經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物。示例性經修飾之核苷酸包括(例如)5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基胺基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代之腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、懷布托星(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-胺基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶及2,6-二胺基嘌呤。
分離HLA-肽靶
主要組織相容性複合體(MHC)為藉由一組連接之基因座編碼之抗原之複合體，其於小鼠中統稱為H-2及於人類中統稱為HLA。兩種 主要類別之MHC抗原(I類及II類)各者包含一組細胞表面醣蛋白，該等醣蛋白於確定組織類型及移值物相容性中起作用。於移植反應中，細胞毒性T-細胞(CTL)反應主要抗I類醣蛋白，而輔助T-細胞反應主要抗II類醣蛋白。
本文中可交換稱作HLA I類分子之人類主要組織相容性複合體(MHC)I類分子在幾乎所有細胞表面上表現。此等分子於經由與α-β T-細胞受體相互作用呈遞肽至(例如)CD8+ T細胞中起作用，該等肽主要源自內源合成之蛋白質。I類MHC分子包括由與12-kDa輕鏈β-2微球蛋白非共價締合之46-kDa α鏈組成之異二聚體。該α鏈一般包括形成呈遞HLA-限制性肽之溝槽之α1及α2域，及與T細胞之CD8共受體相互作用之α3跨質膜域。圖1(先前技術)描繪I類HLA分子之一般結構。一些TCR可獨立於CD8共受體結合MHC I類(參見，例如，Kerry SE、Buslepp J、Cramer LA等人，Interplay between TCR Affinity and Necessity of Coreceptor Ligation：High-Affinity Peptide-MHC/TCR Interaction Overcomes Lack of CD8 Engagement.Journal of immunology(Baltimore,Md：1950).2003；171(9)：4493-4503)。
I類MHC限制性肽(本文中亦可交換稱作HLA限制性抗原、HLA-限制性肽、MHC限制性抗原、限制性肽或肽)一般經由與MHC分子中之對應結合袋相互作用之約兩個或三個錨殘基結合至重鏈α1-α2溝槽。β-2微球蛋白鏈於MHC I類細胞內運送、肽結合及構象穩定性中起著重要作用。針對大多數I類分子，MHC I類重鏈、肽(自體、非自體及/或抗原性)及β-2微球蛋白之異三聚體複合體之形成導致蛋白質成熟及輸出至細胞表面。
特定HLA亞型與HLA-限制性肽之結合形成具有獨特且新穎表面之複合體，該表面可藉由ABP(諸如，例如，T細胞上之TCR或抗體或其抗原結合片段)特異性識別。本文中將與HLA-限制性肽複合之HLA稱作HLA-肽或HLA-肽靶。於一些情況下，該限制性肽位於HLA分子之α1/α2溝槽。於一些情況下，該限制性肽經由與MHC分子中之對應結合袋相互作用之約兩個或三個錨殘基結合至HLA分子之α1/α2溝槽。
因此，本文中提供包含HLA-肽靶之抗原。該HLA-肽靶可包含具有限定之與特定HLA亞型複合之胺基酸序列之特異性HLA-限制性肽。
本文中所鑑別之HLA-肽靶可用於癌症免疫療法。於一些實施例中，本文中所鑑別之HLA-肽靶在腫瘤細胞表面呈遞。本文中所鑑別之HLA-肽靶可藉由人類個體中之腫瘤細胞表現。本文中所鑑別之HLA-肽靶可藉由一群人類個體中之腫瘤細胞表現。例如，本文中所鑑別之HLA-肽靶可為共同於一群患有癌症之人類個體中表現之共有抗原。
本文中所鑑別之HLA-肽靶可具有個別腫瘤類型之流行率。個別腫瘤類型之流行率可為約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、 74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。個別腫瘤類型之流行率可為約0.1%至100%、0.2至50%、0.5至25%或1至10%。
較佳地，HLA-肽靶一般於大多數正常組織中不表現。例如，HLA-肽靶於一些情況下，可於基因型-組織表現(GTEx)項目之組織中不表現，或於一些情況下，可僅於免疫特許組織或非必需組織中表現。示例性免疫特許組織或非必需組織包括睾丸、小唾液腺、子宮頸內膜及甲狀腺。於一些情況下，可將HLA-肽靶視為在必需組織或非免疫特許組織上不表現，若衍生限制性肽之基因之中位表現跨GTEx樣品係小於0.5 RPKM(讀數/千鹼基對轉錄子/百萬經修整讀數)，若基因跨GTEX樣品以大於10 RPKM不表現，若基因跨所有必需組織樣品於不多於兩個樣品中以>=5 RPKM表現，或其任何組合。
HLA-肽靶之示例性HLA I類亞型
於人類中，存在許多MHC單倍型(本文中可交換稱作MHC亞型、HLA亞型、MHC型及HLA型)。僅舉例而言，示例性HLA亞型包括HLA-A*01：01、HLA-A*02：01、HLA-A*02：03、HLA-A*02：04、HLA-A*02：07、HLA-A*03：01、HLA-A*03：02、HLA-A*11：01、HLA-A*23：01、HLA-A*24：02、HLA-A*25：01、HLA-A*26：01、HLA-A*29：02、HLA-A*30：01、HLA-A*30：02、HLA-A*31：01、HLA-A*32：01、HLA-A*33：01、HLA-A*33：03、HLA-A*68：01、HLA-A*68：02、HLA-B*07：02、HLA-B*08：01、HLA-B*13：02、HLA-B*15：01、HLA-B*15：03、HLA-B*18：01、HLA-B*27：02、HLA- B*27：05、HLA-B*35：01、HLA-B*35：03、HLA-B*37：01、HLA-B*38：01、HLA-B*39：01、HLA-B*40：01、HLA-B*40：02、HLA-B*44：02、HLA-B*44：03、HLA-B*46：01、HLA-B*49：01、HLA-B*51：01、HLA-B*54：01、HLA-B*55：01、HLA-B*56：01、HLA-B*57：01、HLA-B*58：01、HLA-C*01：02、HLA-C*02：02、HLA-C*03：03、HLA-C*03：04、HLA-C*04：01、HLA-C*05：01、HLA-C*06：02、HLA-C*07：01、HLA-C*07：02、HLA-C*07：04、HLA-C*07：06、HLA-C*12：03、HLA-C*14：02、HLA-C*16：01、HLA-C*16：02、HLA-C*16：04及其所有亞型，包括(例如)4位、6位及8位亞型。為熟習此項技術者所知，存在以上HLA型之對偶基因變異體，其所有涵蓋於本發明中。HLA類別對偶基因之完整列表可見於http：//hla.alleles.org/alleles/。例如，HLA I類對偶基因之完整列表可見於http：//hla.alleles.org/alleles/classl.html。
HLA-限制性肽
HLA-限制性肽(本文中可交換稱作「限制性肽」)可為腫瘤特異性基因(例如，癌症特異性基因)之肽片段。較佳地，癌症特異性基因於癌症樣品中表現。於癌症樣品中異常表現之基因可通過資料庫識別。僅舉例而言，示例性資料庫包括癌症基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA))研究網：http：//cancergenome.nih.gov/；國際癌症基因組聯合會(the International Cancer Genome Consortium)：https：//dcc.icgc.org/。於一些實施例中，癌症特異性基因具有於來自TCGA資料庫之至少5個樣品中至少10 RPKM之觀測表現。癌症特異性基因可具有可觀測雙峰分佈。
癌症特異性基因可具有於至少一個TCGA腫瘤組織中大於10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100個轉錄子/百萬(TPM)之觀測表現。於較佳實施例中，癌症特異性基因具有於至少一個TCGA腫瘤組織中大於100 TPM之觀測表現。於一些情況下，癌症特異性基因具有跨TCGA樣品之表現之觀測雙峰分佈。不希望受理論束縛，此雙峰表現模式與生物模型一致，其中存在所有腫瘤樣品中之基線處之最小表現及經歷表觀遺傳失調之腫瘤子集中之更高表現。
較佳地，癌症特異性基因一般於大多數正常組織中不表現。例如，癌症特異性基因可於一些情況下，於基因型-組織表現(GTEx)項目之組織中不表現，或可於一些情況下，於免疫特許組織或非必需組織中表現。示例性免疫特許組織或非必需組織包括睾丸、小唾液腺、子宮頸內膜及甲狀腺。於一些情況下，可將癌症特異性基因視為在必需組織或非免疫特許組織上不表現，若癌症特異性基因之中位表現跨GTEx樣品係小於0.5 RPKM(讀數/千鹼基對轉錄子/百萬比對閱讀)，若基因跨GTEX樣品以大於10 RPKM不表現，若基因跨所有必需組織樣品於不多於兩個樣品中以>=5 RPKM表現，或其任何組合。
於一些實施例中，癌症特異性基因滿足藉由GTEx之評估之下列標準：(1)腦、心或肺中之中位GTEx表現係小於0.1個轉錄子/百萬(TPM)，其中無一樣品超過5 TPM，(2)其他必需器官(排除睾丸、甲狀腺、小唾液腺)中之中位GTEx表現係小於2 TPM，其中無一樣品超過10 TPM。
於一些實施例中，癌症特異性基因不可於免疫細胞中表現，一般例如非干擾素家族基因、非眼睛相關基因、非嗅覺或味覺受體基 因、及非晝夜循環相關之基因(例如，非CLOCK、PERIOD、CRY基因)。
較佳地，限制性肽可在腫瘤表面上呈遞。
限制性肽可具有約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、或約15個胺基分子殘基及其中可衍生之任何範圍之大小。於特定實施例中，限制性肽具有約8、約9、約10、約11、或約12個胺基分子殘基之大小。限制性肽之長度可係約5至15個胺基酸，較佳地長度可係約7至12個胺基酸，或更佳地長度可係約8至11個胺基酸。
示例性HLA-肽靶
示例性HLA-肽靶示於表A中。於表A之各列中，顯示各複合體之HLA對偶基因及對應HLA-限制性肽序列。肽序列可由表A之各列中所示之各自序列組成。或者肽序列可包含表A之各列中所示之各自序列。或者肽序列可基本上由表A之各列中所示之各自序列組成。
於一些實施例中，HLA-肽靶為如表A中所示之靶。
於一些實施例中，HLA-限制性肽非來自選自WT1或MART1之基因。
與限制性肽配位體不締合之HLA I類分子一般係不穩定。因此，限制性肽與HLA分子之α1/α2溝槽之締合可使HLA亞型之β2-微球蛋白次單元與HLA亞型之α-次單元之非共價締合穩定。
HLA亞型之β2-微球蛋白次單元與HLA亞型之α-次單元之非共價締合之穩定性可使用任何適宜方法測定。例如，此穩定性可藉由以下評估：將HLA分子之不可溶聚集體溶解於高濃度脲(例如，約8M脲)中，及測定在脲移除(例如，藉由透析之脲移除)期間在限制性肽之存在下再摺疊之HLA分子之穩定性。此等再摺疊方法述於(例如)Proc.Natl. Acad.Sci.USA第89卷，第3429至3433頁，1992年4月中，以引用的方式併入本文中。
針對其他實例，此穩定性可使用條件HLA I類配位體評估。一般將條件HLA I類配位體設計為短的限制性肽，該等肽藉由結合至HLA分子之α1/α2溝槽使HLA I類分子之β2與α次單元之締合穩定，且該等肽含有於暴露於條件刺激物後允許限制性肽之裂解之一或多種胺基酸修飾。於條件配位體之裂解後，HLA分子之β2及α-次單元解離，除非此條件配位體經交換為結合至α1/α2溝槽且穩定HLA分子之限制性肽。條件配位體可藉由於已知HLA肽配位體中或於預測之高親和力HLA肽配位體中引入胺基酸修飾設計。針對結構資訊可得之HLA對偶基因，亦可使用側鏈之水可及性來選擇引入胺基酸修飾之位置。條件HLA配位體之使用可藉由允許批量製備穩定HLA-肽複合體而有利，可使用該等複合體以高通量方式審問測試限制性肽。條件HLA I類配位體及製備方法述於(例如)Proc Natl Acad Sci U S A.2008年3月11日；105(10)：3831-3836；Proc Natl Acad Sci U S A.2008年3月11日；105(10)：3825-3830；J Exp Med.2018年5月7日；215(5)：1493-1504；Choo,J.A.L.等人，Bioorthogonal cleavage and exchange of major histocompatibility complex ligands by employing azobenzene-containing peptides.Angew Chem Int Ed Engl 53,13390-13394(2014)；Amore,A.等人，Development of a Hypersensitive Periodate-Cleavable Amino Acid that is Methionine-and Disulfide-Compatible and its Application in MHC Exchange Reagents for T Cell Characterisation.ChemBioChem 14,123-131(2012)；Rodenko,B.等人，Class I Major Histocompatibility Complexes Loaded by a Periodate Trigger.J Am Chem Soc 131,12305-12313(2009)；及Chang,C.X.L.等人，Conditional ligands for Asian HLA variants facilitate the definition of CD8+ T-cell responses in acute and chronic viral diseases.Eur J Immunol 43,1109-1120(2013)中。此等參考文獻之全文以引用的方式併入本文中。
因此，於一些實施例中，本文中所述之(例如，表A中所述之)HLA-限制性肽使HLA分子之β2-及α-次單元之締合穩定的能力藉由進行條件配位體介導之交換反應及針對HLA穩定性之檢定來評估。HLA穩定性可使用任何適宜方法檢定，該方法包括(例如)質譜法分析、免疫檢定(例如，ELISA)、尺寸排除層析法及HLA多聚體染色，接著T細胞之流動式細胞測量術評估。
評估HLA亞型之β2-微球蛋白次單元與HLA亞型之α-次單元之非共價締合之穩定性的其他示例性方法包括使用二肽之肽交換。使用二肽之肽交換已述於(例如)Proc Natl Acad Sci U S A.2013年9月17日，110(38)：15383-8；Proc Natl Acad Sci U S A.2015年1月6日，112(1)：202-7中，其以引用的方式併入本文中。
本文中提供包含HLA-肽靶之可用抗原。該等HLA-肽靶可包含特定HLA-限制性肽，該肽具有限定之與特定HLA亞型對偶基因複合之胺基酸序列。
該HLA-肽靶可經分離及/或呈實質上純的形式。例如，該等HLA-肽靶可自其自然環境分離，或可藉助技術過程產生。於一些情況下，該HLA-肽靶以實質上無其他肽或蛋白質之形式提供。
該HLA-肽靶可以可溶性形式存在，及視情況可為重組 HLA-肽靶複合體。熟習技工可使用任何適宜方法產生及純化重組HLA-肽靶。適宜方法包括(例如)使用大腸桿菌(E.coli)表現系統、昆蟲細胞及類似者。其他方法包括合成產生，例如，使用無細胞系統。示例性適宜無細胞系統述於WO2017089756中，其全文以引用的方式併入本文中。
本文中亦提供包含HLA-肽靶之組合物。
於一些情況下，該組合物包含附接至固體擔體之HLA-肽靶。示例性固體擔體包括(但不限於)珠、孔、膜、管、管柱、板、瓊脂糖、磁珠及晶片。示例性固體擔體述於(例如)Catalysts 2018,8,92；doi：10.3390/catal8020092中，其全文以引用的方式併入本文中。
該HLA-肽靶可藉由此項技術中已知之任何適宜方法附接至固體擔體。於一些情況下，該HLA-肽靶共價附接至固體擔體。
於一些情況下，該HLA-肽靶經由親和力結合對附接至固體擔體。親和力結合對一般涉及兩個分子之間之特定相互作用。對其結合搭檔分子具有親和力之配位體可共價附接至固體擔體，及因此用作用於固定之誘餌。常見親和力結合對包括(例如)鏈黴抗生物素與生物素、抗生物素蛋白(avidin)與生物素；多組胺酸標記物與金屬離子(諸如銅、鎳、鋅及鈷)；及類似物。
HLA-肽靶可包含可檢測標記物。
醫藥組合物包含HLA-肽靶。
包含HLA-肽靶之組合物可為醫藥組合物。此組合物可包含多個HLA-肽靶。本文中描述示例性醫藥組合物。組合物可能引起免疫反應。組合物可包含佐劑。適宜佐劑包括(但不限於)1018 ISS、明礬、鋁鹽、Amplivax、AS15、BCG、CP-870、893、CpG7909、CyaA、 dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、Imiquimod、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、單磷醯基脂質A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel載體系統、PLG微粒子、瑞喹莫德(resiquimod)、SRL172、病毒小體(Virosome)及其他類病毒粒子、YF-17D、VEGF阱、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂苷之Aquila's QS21刺激元(Aquila Biotech，Worcester,Mass.，USA)、分枝桿菌(mycobacterial)提取物及合成細菌細胞壁模擬物，及其他專有佐劑(諸如Ribi's Detox.Quil或Superfos)。諸如不完全弗氏(Freund's)或GM-CSF之佐劑係可用的。先前已描述特異性針對樹突狀細胞之若干免疫學佐劑及其製備(例如，MF59)(Dupuis M等人，Cell Immunol.1998；186(1)：18-27；Allison A C；Dev Biol Stand.1998；92：3-11)。亦可使用細胞激素。已直接連接若干細胞激素以影響樹突狀細胞遷移至淋巴組織(例如，TNF-α)，加速樹突狀細胞成熟為T-淋巴細胞(例如，GM-CSF、IL-1及IL-4)之有效抗原呈遞細胞(美國專利案第5,849,589號，具體而言其全文以引用的方式併入本文中)及充當免疫佐劑(例如，IL-12)(Gabrilovich D I等人，J Immunother Emphasis Tumor Immunol.1996(6)：414-418)。HLA表面表現及將細胞內蛋白處理成在HLA上呈遞之肽亦可藉由干擾素-γ(IFN-γ)增強。參見，例如，York IA、Goldberg AL、Mo XY、Rock KL.Proteolysis and class I major histocompatibility complex antigen presentation.Immunol Rev.1999；172：49-66；及Rock KL,Goldberg AL.Degradation of cell proteins and the generation of MHC class I-presented peptides.Ann Rev Immunol.1999；17：12.739-779，其全文以引用的方式併入本文中。
HLA-肽ABP
本文中亦提供特異性結合至如本文中所揭示之HLA-肽靶之ABP。
HLA-肽靶可在任何適宜靶細胞(包括腫瘤細胞)之表面上表現。
ABP可特異性結合至人類白血球抗原(HLA)-肽靶，其中該HLA-肽靶包含與HLA I類分子複合之HLA-限制性肽，其中該HLA-限制性肽位於HLA I類分子之α1/α2異二聚體部分之肽結合溝槽。
於一些態樣中，在HLA-限制性肽不存在下，該ABP不結合HLA I類。於一些態樣中，在人類MHC I類不存在下，該ABP不結合HLA-限制性肽。於一些態樣中，該ABP結合呈遞正與HLA-限制性肽複合之人類MHC I類之腫瘤細胞，視情況其中該HLA-限制性肽為表徵癌症之腫瘤抗原。
ABP可結合至HLA-肽複合體之各部分(即，HLA及肽表示複合體之各部分)，當一起結合形成新穎靶及蛋白質表面以與ABP相互作用並藉由ABP結合時，其不同於由單獨肽或單獨HLA亞型呈遞之表面。一般而言在HLA-肽複合體之各部分不存在下，藉由HLA與肽之結合形成之新穎靶及蛋白質表面不存在。
ABP可能夠特異性結合包含HLA及(例如)源自腫瘤之HLA-限制性肽(HLA-肽)之複合體。於一些態樣中，在源自腫瘤之HLA-限制性肽不存在下，ABP不結合HLA。於一些態樣中，在HLA不存在下，ABP不結合源自腫瘤之HLA-限制性肽。於一些態樣中，當在細胞(諸如，腫瘤 細胞)上自然呈遞時，ABP結合包含HLA及HLA-限制性肽之複合體。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP調節HLA-肽與HLA-肽之一或多個配位體之結合。
ABP可特異性結合至如表A中所揭示之HLA-肽靶中之任一者。於一些實施例中，HLA-限制性肽非來自選自WT1或MART1之基因。
於更特定實施例中，ABP特異性結合至選自以下中任一者之HLA-肽靶：與包含序列EVDPIGHVY之HLA-限制性肽複合之HLA亞型B*35：01、與包含序列AIFPGAVPAA之HLA-限制性肽複合之HLA亞型A*02：01、及與包含序列ASSLPTTMNY之HLA-限制性肽複合之HLA亞型A*01：01。
於又更特定實施例中，ABP特異性結合至選自以下中任一者之HLA-肽靶：與基本上由序列EVDPIGHVY組成之HLA-限制性肽複合之HLA亞型B*35：01、與基本上由序列AIFPGAVPAA組成之HLA-限制性肽複合之HLA亞型A*02：01、及與基本上由序列ASSLPTTMNY組成之HLA-限制性肽複合之HLA亞型A*01：01。
於一些實施例中，ABP特異性結合至選自以下中任一者之HLA-肽靶：與由序列EVDPIGHVY組成之HLA-限制性肽複合之HLA亞型B*35：01、與由序列AIFPGAVPAA組成之HLA-限制性肽複合之HLA亞型A*02：01、及與由序列ASSLPTTMNY組成之HLA-限制性肽複合之HLA亞型A*01：01。
於一些實施例中，ABP為與本文中所提供之說明性ABP競爭之ABP。於一些態樣中，與本文中所提供之說明性ABP競爭之ABP結合與本文中所提供之說明性ABP相同之抗原決定基。
於一些實施例中，本文中所述之ABP於本文中稱作「變異體」。於一些實施例中，此等變異體衍生自本文中所提供之序列，例如，藉由親和力成熟、定向誘變、隨機誘變、或此項技術中已知或本文中所述之任何其他方法。於一些實施例中，此等變異體不衍生自本文中所提供之序列及且(例如)根據本文中所提供之方法重新分離以獲得ABP。於一些實施例中，變異體衍生自本文中所提供之序列中之任一者，其中作出一或多個保守胺基酸置換。於一些實施例中，變異體衍生自本文中所提供之序列中之任一者，其中作出一或多個非保守胺基酸置換。本文中描述保守胺基酸置換。示例性非保守胺基酸置換包括J Immunol.2008年5月1日；180(9)：6116-31中描述之彼等，其全文以引用的方式併入本文中。於較佳實施例中，非保守胺基酸置換不干涉或抑制功能變異體之生物活性。於又更佳實施例中，非保守胺基酸置換增強功能變異體之生物活性，使得功能變異體之生物活性相較於母體ABP增加。
包含抗體或其抗原結合片段之ABP
ABP可包含抗體或其抗原結合片段。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP包含輕鏈。於一些態樣中，該輕鏈為κ輕鏈。於一些態樣中，該輕鏈為λ輕鏈。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP包含重鏈。於一些態樣中，該重鏈為IgA。於一些態樣中，該重鏈為IgD。於一些態樣中，該重鏈為IgE。於一些態樣中，該重鏈為IgG。於一些態樣中，該重鏈為IgM。於一些態樣中，該重鏈為IgG1。於一些態樣中，該重鏈為IgG2。於一些態樣中，該重鏈為IgG3。於一些態樣中，該重鏈為IgG4。於一些態樣中，該重鏈為IgA1。於一些態樣中，該重鏈為IgA2。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP包含抗體片段。於一些實施例中，本文中所提供之ABP由抗體片段組成。於一些實施例中，本文中所提供之ABP基本上由抗體片段組成。於一些態樣中，該ABP片段為Fv片段。於一些態樣中，該ABP片段為Fb片段。於一些態樣中，該ABP片段為F(ab’)2片段。於一些態樣中，該ABP片段為Fab’片段。於一些態樣中，該ABP片段為scFv(sFv)片段。於一些態樣中，該ABP片段為scFv-Fc片段。於一些態樣中，該ABP片段為單域ABP之片段。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP片段衍生自本文中所提供之說明性ABP。於一些實施例中，本文中所提供之ABP片段非衍生自本文中所提供之說明性ABP且可(例如)根據本文中所提供之方法重新分離以獲得ABP片段。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP片段保留結合HLA-肽靶之能力，如藉由本文中所述之一或多個檢定或生物效應所量測。於一些實施例中，本文中所提供之ABP片段保留防止HLA-肽與如本文中所述之其配位體中之一或多者相互作用之能力。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP為單株ABP。於一些實施例中，本文中所提供之ABP為多株ABP。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP包括嵌合ABP。於一些實施例中，本文中所提供之ABP由嵌合ABP組成。於一些實施例中，本文中所提供之ABP基本上由嵌合ABP組成。於一些實施例中，本文中所提供之ABP包括人源化ABP。於一些實施例中，本文中所提供之ABP由人源化ABP組成。於一些實施例中，本文中所提供之ABP基本上由人源化ABP組成。於一些實施例中，本文中所提供之ABP包括人類ABP。於一些 實施例中，本文中所提供之ABP由人類ABP組成。於一些實施例中，本文中所提供之ABP基本上由人類ABP組成。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP包括替代支架。於一些實施例中，本文中所提供之ABP由替代支架組成。於一些實施例中，本文中所提供之ABP基本上由替代支架組成。可使用任何適宜替代支架。於一些態樣中，該替代支架係選自AdnectinTM、iMab、Anticalin®、EETI-II/AGRP、Kunitz域、硫氧還蛋白肽適體、Affibody®、DARPin、人泛素、四連接素(Tetranectin)、Fynomer、及艾菲爾親和聚體(Avimer)。
本文中亦揭示一種經分離人源化、人類或嵌合ABP，該ABP與本文中所揭示之ABP競爭結合至HLA-肽。
本文中亦揭示一種經分離人源化、人類或嵌合ABP，該ABP結合由本文中所揭示之ABP結合之HLA-肽抗原決定基。
於某些態樣中，ABP包含包含至少一個修飾之人類Fc區，該至少一個修飾減少結合至人類Fc受體。
已知當ABP於細胞中表現時，ABP於轉譯後經修飾。轉移後修飾之實例包括重鏈之C端處之離胺酸藉由羧肽酶之裂解；重鏈及輕鏈之N端處之麩胺醯胺或麩胺酸藉由焦麩胺酸化至焦麩胺酸之修飾；醣基化；氧化；脫醯胺；及醣化，及已知此等轉譯後修飾發生於各種ABP中(參見Journal of Pharmaceutical Sciences，2008，第97卷，第2426至2447頁，其全文以引用的方式併入)。於一些實施例中，ABP為已經歷轉譯後修飾之ABP或其抗原結合片段。已經歷轉譯後修飾之ABP或其抗原結合片段之實例包括已經歷在重鏈可變區之N端處之焦麩胺酸化及/或在重鏈 之C端處之離胺酸之缺失的ABP或其抗原結合片段。此項技術中已知，由於N端處之焦麩胺酸化及C端處之離胺酸之缺失之此轉譯後修飾對ABP或其片段之活性無任何影響(Analytical Biochemistry，2006，第348卷，第24至39頁，其全文以引用的方式併入)。
單特異性及多特異性HLA-肽ABP
於一些實施例中，本文中所提供之ABP為單特異性ABP。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP為多特異性ABP。
於一些實施例中，本文中所提供之多特異性ABP結合一個以上抗原。於一些實施例中，多特異性ABP結合2個抗原。於一些實施例中，多特異性ABP結合3個抗原。於一些實施例中，多特異性ABP結合4個抗原。於一些實施例中，多特異性ABP結合5個抗原。
於一些實施例中，本文中所提供之多特異性ABP結合HLA-肽抗原上之一個以上抗原決定基。於一些實施例中，多特異性ABP結合HLA-肽抗原上之2個抗原決定基。於一些實施例中，多特異性ABP結合HLA-肽抗原上之3個抗原決定基。
許多多特異性ABP構築體係此項技術中已知，且本文中所提供之ABP可呈任何適宜多特異性適宜構築體之形式提供。
於一些實施例中，多特異性ABP包括免疫球蛋白，該免疫球蛋白包含各者與共用輕鏈可變區(即，「共用輕鏈ABP」)配對之至少兩個不同重鏈可變區。共用輕鏈可變區形成具有兩個不同重鏈可變區各者之不同抗原結合域。參見Merchant等人，Nature Biotechnol.,1998,16：677-681，其全文以引用的方式併入。
於一些實施例中，多特異性ABP包括免疫球蛋白，該免疫 球蛋白包含連接至此免疫球蛋白之重鏈或輕鏈之N端或C端中之一或多者之ABP或其片段。參見Coloma及Morrison，Nature Biotechnol.,1997,15：159-163，其全文以引用的方式併入。於一些態樣中，此ABP包括四價雙特異性ABP。
於一些實施例中，多特異性ABP包括雜交免疫球蛋白，該雜交免疫球蛋白包含至少兩個不同重鏈可變區及至少兩個不同輕鏈可變區。參見Milstein及Cuello，Nature,1983,305：537-540；及Staerz及Bevan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,83：1453-1457；其全文各者以引用的方式併入本文中。
於一些實施例中，多特異性ABP包含具有更改之免疫球蛋白鏈以減少不具有多特異性之副產物之形成。於一些態樣中，ABP包含如美國專利案第5,731,168號(其全文以引用的方式併入)中所述之一或多個「杵臼(knobs-into-holes)」修飾。
於一些實施例中，多特異性ABP包含具有一或多個靜電修飾之免疫球蛋白鏈以促進Fc異多聚體之組裝。參見WO 2009/089004，其全文以引用的方式併入。
於一些實施例中，多特異性ABP包含雙特異性單鏈分子。參見Traunecker等人，EMBO J.,1991,10：3655-3659；及Gruber等人，J.Immunol.,1994,152：5368-5374；其全文各者以引用的方式併入本文中。
於一些實施例中，多特異性ABP包含藉由多肽連接子連接之重鏈可變域及輕鏈可變域，其中選擇該連接子之長度以促進具有所需多特異性之多特異性ABP之組裝。例如，當重鏈可變域及輕鏈可變域藉由大於12個胺基酸殘基之多肽連接子連接時，單特異性scFv一般形成。參見美 國專利案第4,946,778號及第5,132,405號，其全文各者以引用的方式併入本文中。於一些實施例中，多肽連接子長度減少至小於12個胺基酸殘基防止相同多肽鏈上之重鏈及輕鏈可變域配對，從而允許來自一條鏈之重鏈及輕鏈可變域與來自另一條鏈之互補域配對。因此，所得ABP具有多特異性，其中各結合位點之特異性由一條以上多肽鏈貢獻。包含由3與12個之間胺基酸殘基之連接子連接之重鏈及輕鏈可變域之多肽鏈形成主要二聚體(稱作雙抗體)。在0與2個之間胺基酸殘基之連接子下，三聚體(稱作三抗體)及四聚體(稱作四抗體)有利。然而，低聚合之精確類型似乎取決於胺基酸殘基組成及各多肽鏈中之可變域之順序(例如，VH-連接子-VL相對於VL-連接子-VH)，除了連接子長度外。熟習者可基於所需多特異性選擇適宜連接子長度。
Fc區及變異體
於某些實施例中，本文中所提供之ABP包含Fc區。Fc區可為野生型或其變異體。於某些實施例中，本文中所提供之ABP包含相較於天然Fc區具有一或多個胺基酸置換、插入或缺失之Fc區。於一些態樣中，此等置換、插入或缺失產生具有改變之穩定性、醣基化或其他特徵之ABP。於一些態樣中，此等置換、插入或缺失產生醣基化ABP。
「變異體Fc區」或「經工程改造之Fc區」包含不同於原生序列Fc區之胺基酸序列，由於至少一個胺基酸修飾，較佳地一或多個胺基酸置換。較佳地，變異Fc區相較於原生序列Fc區或相較於親本多肽之Fc區具有至少一個胺基酸置換，例如，原生序列Fc區中或親本多肽之Fc區中之約1至約10個胺基酸置換，及較佳地約1至約5個胺基酸置換。較佳地，本文中變異Fc區將具有與原生序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區至少 約80%同源性，及最佳地與之至少約90%同源性，更佳地與之至少約95%同源性。
術語「包含Fc-區之ABP」係指包含Fc區之ABP。可(例如)在ABP之純化期間或藉由重組工程改造編碼該ABP之核酸來移除Fc區之C端離胺酸(根據EU編號系統之殘基447)。因此，具有Fc區之ABP可包括含有或不含有K447之ABP。
於一些態樣中，本文中所提供之ABP之Fc區經修飾以產生具有對Fc受體改變之親和力之ABP，或更免疫惰性之ABP。於一些實施例中，本文中所提供之ABP變異體具有一些但非所有效應功能。此等ABP可係可用，例如，當ABP之半衰期於活體中係重要時，但是當某些效應功能(例如，補體激活及ADCC)係不必要或有害時。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP之Fc區為包含鉸鏈穩定突變S228P及L235E中之一或多者之人類IgG4 Fc區。參見Aalberse等人，Immunology,2002,105：9-19，其全文以引用的方式併入。於一些實施例中，該IgG4 Fc區包含下列突變中之一或多者：E233P、F234V及L235A。參見Armour等人，Mol.Immunol.,2003,40：585-593，其全文以引用的方式併入。於一些實施例中，該IgG4 Fc區包含位置G236處之缺失。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP之Fc區為包含一或多個突變以減少Fc受體結合之人類IgG1 Fc區。於一些態樣中，該一或多個突變係於選自以下之殘基中：S228(例如，S228A)、L234(例如，L234A)、L235(例如，L235A)、D265(例如，D265A)及N297(例如，N297A)。於一些態樣中，該ABP包含PVA236突變。PVA236意指胺基酸 序列ELLG(IgG1之胺基酸位置233至236或IgG4之EFLG)經PVA置換。參見美國專利案第9,150,641號，其全文以引用的方式併入。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP之Fc區經修飾，如於Armour等人，Eur.J.Immunol.,1999,29：2613-2624；WO 1999/058572；及/或英國專利申請案第98099518號中所述；其全文各者以引用的方式併入本文中。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP之Fc區為包含突變A330S及P331S中之一或多者之人類IgG2 Fc區。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP之Fc區具有選自以下之一或多個位置處之胺基酸置換：238、265、269、270、297、327及329。參見美國專利案第6,737,056號，其全文以引用的方式併入。此等Fc突變包括具有胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或多者處之置換之Fc突變，其包括具有殘基265及297經丙胺酸置換之所謂「DANA」Fc突變。參見美國專利案第7,332,581號，其全文以引用的方式併入。於一些實施例中，該ABP包含胺基酸位置265處之丙胺酸。於一些實施例中，該ABP包含胺基酸位置297處之丙胺酸。
於某些實施例中，本文中所提供之ABP包含具有改善ADCC之一或多個胺基酸置換之Fc區，諸如Fc區之位置298、333及334中之一或多者處之置換。於一些實施例中，本文中所提供之ABP包含具有位置239、332及330處之一或多個胺基酸置換之Fc區，如於Lazar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2006,103：4005-4010中所述，其全文以引用的方式併入。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP包含改善或減少 C1q結合及/或CDC之一或多個改變。參見美國專利案第6,194,551號；WO 99/51642；及Idusogie等人，J.Immunol.,2000,164：4178-4184；其全文各者以引用的方式併入本文中。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP包含一或多個改變以增加半衰期。具有增加之半衰期及與新生Fc受體(FcRn)之改善之結合之ABP述於(例如)Hinton等人，J.Immunol.,2006,176：346-356；及美國專利公開案第2005/0014934號中；其全文各者以引用的方式併入本文中。此等Fc變異體包括具有以下Fc區殘基中之一或多者處之置換之彼等：IgG之238、250、256、265、272、286、303、305、307、311、312、314、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428、及434。於一些實施例中，該ABP包含一或多個延長半衰期之非Fc修飾。示例性延長半衰期之非Fc修飾述於(例如)US20170218078中，其全文以引用的方式併入本文中。
於一些實施例中，本文中所提供之ABP包含一或多個Fc區變異體，如於美國專利案第7,371,826號、第5,648,260號及第5,624,821號；Duncan及Winter，Nature,1988,322：738-740；及WO 94/29351中所述；其全文各者以引用的方式併入本文中。
特異性針對B*35：01_EVDPIGHVY(HLA-肽靶「G5」)之抗體
於一些態樣中，本文中提供包含特異性結合HLA-肽靶之抗體或其抗原結合片段之ABP，其中該HLA-肽靶之HLA I類分子為HLA亞型B*35：01且該HLA-肽靶之HLA-限制性肽包含序列EVDPIGHVY(「G5」)，由序列EVDPIGHVY(「G5」)組成，或基本上由序列EVDPIGHVY(「G5」)組成。
CDR
特異性針對B*35：01_EVDPIGHVY之ABP可包含一或多個抗體互補決定區(CDR)序列，例如，可包含三個重鏈CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)及三個輕鏈CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。
特異性針對B*35：01_EVDPIGHVY之ABP可包含CDR-H3序列。該CDR-H3序列可係選自CARDGVRYYGMDVW、CARGVRGYDRSAGYW、CASHDYGDYGEYFQHW、CARVSWYCSSTSCGVNWFDPW、CAKVNWNDGPYFDYW、CATPTNSGYYGPYYYYGMDVW、CARDVMDVW、CAREGYGMDVW、CARDNGVGVDYW、CARGIADSGSYYGNGRDYYYGMDVW、CARGDYYFDYW、CARDGTRYYGMDVW、CARDVVANFDYW、CARGHSSGWYYYYGMDVW、CAKDLGSYGGYYW、CARSWFGGFNYHYYGMDVW、CARELPIGYGMDVW、及CARGGSYYYYGMDVW。
特異性針對B*35：01_EVDPIGHVY之ABP可包含CDR-L3序列。該CDR-L3序列可係選自CMQGLQTPITF、CMQALQTPPTF、CQQAISFPLTF、CQQANSFPLTF、CQQANSFPLTF、CQQSYSIPLTF、CQQTYMMPYTF、CQQSYITPWTF、CQQSYITPYTF、CQQYYTTPYTF、CQQSYSTPLTF、CMQALQTPLTF、CQQYGSWPRTF、CQQSYSTPVTF、CMQALQTPYTF、CQQANSFPFTF、CMQALQTPLTF、及CQQSYSTPLTF。
特異性針對B*35：01_EVDPIGHVY之ABP可包含特定重 鏈CDR3(CDR-H3)序列及特定輕鏈CDR3(CDR-L3)序列。於一些實施例中，該ABP包含scFv之CDR-H3及CDR-L3，來自該scFv指定為：G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07、或G5R4-P4B01。特異性結合B*35：01_EVDPIGHVY之經鑑別之scFv之CDR序列示於表5中。為了清晰，將各經鑑別之scFv命中指定為純系名稱，且各列含有針對該特定純系名稱之CDR序列。例如，由純系名稱G5_P7_E7鑑別之scFv包含重鏈CDR3序列CARDGVRYYGMDVW及輕鏈CDR3序列CMQGLQTPITF。
特異性針對B*35：01_EVDPIGHVY之ABP可包含來自scFv之六個CDR，該scFv指定為：G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07、或G5R4-P4B01。
VH
特異性針對B*35：01_EVDPIGHVY之ABP可包含VH序列。該VH序列可係選自QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGIINPRSGSTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSAS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSHDINWVRQAPGQGLE WMGWMNPNSGDTGYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGVRGYDRSAGYWGQGTLVIVSSAS、EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSSYWMSWVRQAPGKGLEWISYISGDSGYTNYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCASHDYGDYGEYFQHWGQGTLVTVSSAS、EVQLLQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSDMNWVRQAPGKGLEWVAYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSWYCSSTSCGVNWFDPWGQGTLVTVSSAS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSDMNWVRQAPGKGLEWVASISSSGGYINYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVNWNDGPYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNFGVSWLRQAPGQGLEWMGGIIPILGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPTNSGYYGPYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDVMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSGYLVSWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNTAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFRNYPMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDNGVGVDYWGQGTLVTVSS、 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNIGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGIADSGSYYGNGRDYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYGISWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGVTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGDTKYSQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGTRYYGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSYTNYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDVVANFDYWGQGTLVTVSSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWMNPDSGSTGYAQRFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGHSSGWYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMHWVRQAPGKGLEWVSSITSFTNTMYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLGSYGGYYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSWFGGFNYHYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSED TAVYYCARELPIGYGMDVWGQGTTVTVSS、及QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIVGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS。
VL
特異性針對B*35：01_EVDPIGHVY之ABP可包含VL序列。該VL序列可係選自DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLQTPITFGQGTRLEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSSRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPPTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAISFPLTFGQSTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLI YAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYMMPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYITPWTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYITPYTFGQGTKLEIK、DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKTSQSVLYRPNNENYLAWYQQKPGQPPKLLIYQASIREPGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRFLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRPQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSHRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK、EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYAASARASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYGSWPRTFGQGTKVEIK、 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPVTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDISNHLNWYQQKPGKAPKLLIYDALSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGQGTKVEIK、及DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
VH-VL組合
特異性針對B*35：01_EVDPIGHVY之ABP可包含特定VH序列及特定VL序列。於一些實施例中，特異性針對B*35：01_EVDPIGHVY之ABP包含來自scFv之VH序列及VL序列，該scFv指定為：G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07、及G5R4-P4B01。特異性結合B*35：01_ EVDPIGHVY之經鑑別之scFv之VH及VL序列示於表4中。為了清晰，將各經鑑別之scFv命中指定為純系名稱，且各列含有針對該特定純系名稱之VH及VL序列。例如，由純系名稱G5_P7_E7鑑別之scFv包含VH序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGIINPRSGSTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSAS及VL序列DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLQTPITFGQGTRLEIK。
特異性針對A*02：01_AIFPGAVPAA(HLA-肽靶「G8」)之抗體
於一些態樣中，本文中提供包含特異性結合HLA-肽靶之抗體或其抗原結合片段之ABP，其中該HLA-肽靶之HLA I類分子為HLA亞型B*02：01且該HLA-肽靶之HLA-限制性肽包含序列AIFPGAVPAA(「G8」)，由序列AIFPGAVPAA(「G8」)組成，或基本上由序列AIFPGAVPAA(「G8」)組成。
CDR
特異性針對A*02：01_AIFPGAVPAA之ABP可包含一或多個抗體互補決定區(CDR)序列，例如，可包含三個重鏈CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)及三個輕鏈CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。
特異性針對A*02：01_AIFPGAVPAA之ABP可包含CDR-H3序列。該CDR-H3序列可係選自CARDDYGDYVAYFQHW、CARDLSYYYGMDVW、CARVYDFWSVLSGFDIW、CARVEQGYDIYYYYYMDVW、CARSYDYGDYLNFDYW、 CARASGSGYYYYYGMDVW、CAASTWIQPFDYW、CASNGNYYGSGSYYNYW、CARAVYYDFWSGPFDYW、CAKGGIYYGSGSYPSW、CARGLYYMDVW、CARGLYGDYFLYYGMDVW、CARGLLGFGEFLTYGMDVW、CARDRDSSWTYYYYGMDVW、CARGLYGDYFLYYGMDVW、CARGDYYDSSGYYFPVYFDYW、及CAKDPFWSGHYYYYGMDVW。
特異性針對A*02：01_AIFPGAVPAA之ABP可包含CDR-L3序列。該CDR-L3序列可係選自CQQNYNSVTF、CQQSYNTPWTF、CGQSYSTPPTF、CQQSYSAPYTF、CQQSYSIPPTF、CQQSYSAPYTF、CQQHNSYPPTF、CQQYSTYPITI、CQQANSFPWTF、CQQSHSTPQTF、CQQSYSTPLTF、CQQSYSTPLTF、CQQTYSTPWTF、CQQYGSSPYTF、CQQSHSTPLTF、CQQANGFPLTF、及CQQSYSTPLTF。
特異性針對A*02：01_AIFPGAVPAA之ABP可包含特定重鏈CDR3(CDR-H3)序列及特定輕鏈CDR3(CDR-L3)序列。於一些實施例中，該ABP包含來自scFv之CDR-H3及CDR-L3，該scFv指定為：G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01、或G8-P2C11。特異性結合A*02：01_AIFPGAVPAA之經鑑別之scFv之CDR序列示於表7中。為了清晰，將各經鑑別之scFv命中指定為純系名稱，且各列含有針對該特定純系名稱之CDR序列。例如，藉由純系名稱G8-P1A03鑑別之scFv包含重鏈CDR3序列CARDDYGDYVAYFQHW及 輕鏈CDR3序列CQQNYNSVTF。
特異性針對A*02：01_AIFPGAVPAA之ABP可包含來自scFv之所有六個CDR，該scFv指定為：G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01、或G8-P2C11。
VH
特異性針對A*02：01_AIFPGAVPAA之ABP可包含VH序列。該VH序列可係選自QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSRSAITWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGATNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYGDYVAYFQHWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFIGQYLHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGDSATYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDLSYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPIGGGTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVYDFWSVLSGFDIWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVEQGYDIYYYYYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTLSSYPINWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGHADYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTA VYYCARSYDYGDYLNFDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSSISGRGDNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASGSGYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYFMHWVRQAPGQGLEWMGMVNPSGGSETFAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAASTWIQPFDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASNGNYYGSGSYYNYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTTYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAVYYDFWSGPFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGGIYYGSGSYPSWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYGVSWVRQAPGQGLEWMGWISPYSGNTDYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNMYLHWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGDTNYAQTFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYGDYFLYYGMDVWGQGTKVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGL EWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLLGFGEFLTYGMDVWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTTYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDRDSSWTYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSNYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYGDYFLYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSHAISWVRQAPGQGLEWMGVIIPSGGTSYTQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDSSGYYFPVYFDYWGQGTLVTVSS、及QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDPFWSGHYYYYGMDVWGQGTTVTVSS。
VL
特異性針對A*02：01_AIFPGAVPAA之ABP可包含VL序列。該VL序列可係選自DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSITSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNYNSVTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCWASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTPWTFGPGTKVDIK、 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAISNSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSTPPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPPTFGGGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNSYPPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPITIGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPWTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSTPQ TFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSTPWTFGQGTKLEIK、EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGNSLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYGSSPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISGYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSTPLTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYTYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANGFPLTFGGGTKVEIK、及DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
VH-VL組合
特異性針對A*02：01_AIFPGAVPAA之ABP可包含特定VH序列及特定VL序列。於一些實施例中，特異性針對A*02：01_AIFPGAVPAA之ABP包含來自scFv之VH序列及VL序列，該scFv指定為：G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01、或G8-P2C11。特異性結合A*02：01_AIFPGAVPAA之經鑑別之scFv之VH及VL序列示於表6中。為了清晰，將各經鑑別之scFv命中指定為純系名稱，且各列含有針對該特定純系名稱之VH及VL序列。例如，由純系名稱G8-P1A03鑑別之scFv包含VH序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSRSAITWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGATNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYGDYVAYFQHWGQGTLVTVSS及VL序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSITSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNYNSVTFGQGTKLEIK。
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY(HLA-肽靶「G10」)之抗體
於一些態樣中，本文中提供包含特異性結合HLA-肽靶之抗體或其抗原結合片段之ABP，其中該HLA-肽靶之HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-肽靶之HLA-限制性肽包含序列ASSLPTTMNY(「G10」)，由序列ASSLPTTMNY(「G10」)組成，或基本上由序列ASSLPTTMNY(「G10」)組成。
CDR
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之ABP可包含一或多個抗體互補決定區(CDR)序列，例如，可包含三個重鏈CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)及三個輕鏈CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之ABP可包含CDR-H3序列。該CDR-H3序列可係選自CARDQDTIFGvvITWFDPW、CARDKVYGDGFDPW、CAREDDSMDVW、CARDSSGLDPW、CARGVGNLDYW、CARDAHQYYDFWSGYYSGTYYYGMDVW、CAREQWPSYWYFDLW、CARDRGYSYGYFDYW、CARGSGDPNYYYYYGLDVW、CARDTGDHFDYW、CARAENGMDVW、CARDPGGYMDVW、CARDGDAFDIW、CARDMGDAFDIW、CAREEDGMDVW、CARDTGDHFDYW、CARGEYSSGFFFVGWFDLW、及CARETGDDAFDIW。
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之ABP可包含CDR-L3序列。該CDR-L3序列可係選自CQQYFTTPYTF、CQQAEAFPYTF、CQQSYSTPITF、CQQSYIIPYTF、CHQTYSTPLTF、CQQAYSFPWTF、CQQGYSTPLTF、CQQANSFPRTF、CQQANSLPYTF、CQQSYSTPFTF、CQQSYSTPFTF、CQQSYGVPTF、CQQSYSTPLTF、CQQSYSTPLTF、CQQYYSYPWTF、CQQSYSTPFTF、CMQTLKTPLSF、及CQQSYSTPLTF。
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之ABP可包含特定重鏈CDR3(CDR-H3)序列及特定輕鏈CDR3(CDR-L3)序列。於一些實施例中，該ABP包含來自scFv之CDR-H3及CDR-L3，該scFv指定為：R3G10- P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08、或R3G10-P5C08。特異性結合A*01：01_ASSLPTTMNY之經鑑別之scFv之CDR序列示於表9中。為了清晰，將各經鑑別之scFv命中指定為純系名稱，且各列含有針對該特定純系名稱之CDR序列。例如，藉由純系名稱R3G10-P1A07鑑別之scFv包含重鏈CDR3序列CARDQDTIFGVVITWFDPW及輕鏈CDR3序列CQQYFTTPYTF。
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之ABP可包含來自scFv之所有六個CDR，該scFv指定為：R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08、或R3G10-P5C08。
VH
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之ABP可包含VH序列。該VH序列可係選自EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGISARSGRTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDQDTIFGVVITWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIHPGGGTTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTA VYYCARDKVYGDGFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDDSMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFIGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDSSGLDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVGNLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGVTFSTSAISWVRQAPGQGLEWMGWISPYNGNTDYAQMLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDAHQYYDFWSGYYSGTYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNSIINWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREQWPSYWYFDLWGRGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSTHDINWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSAIYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDRGYSYGYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGNTFIGYYVHWVRQAPGQGLEWVGIINPNGGSISYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSGDPNYYYYYGLDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLSYYYMHWVRQAPGQGL EWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTGTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGDHFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIGPSDGSTTYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAENGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYVHWVRQAPGQGLEWMGIIAPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGGYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYLHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGDAFDIWGQGTMVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGRISPSDGSTTYAPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDMGDAFDIWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEDGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLSYYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTGTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGDHFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNNFAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDATNYAQKFQGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEYSSGFFFVGWFDLWGRGTQVTVSS、及 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIAPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETGDDAFDIWGQGTMVTVSS。
VL
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之ABP可包含VL序列。該VL序列可係選自DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYFTTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIFDASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAEAFPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPITFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYIIPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQTYSTPLTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYSFPWT FGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYSTPLTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISRYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPRTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSLPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASKLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYGVPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLI YAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPWTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQTLKTPLSFGGGTKVEIK、及DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
VH-VL組合
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之ABP可包含特定VH序列及特定VL序列。於一些實施例中，特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之ABP包含來自scFv之VH序列及VL序列，該scFv指定為：R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08、或R3G10-P5C08。特異性結合A*01：01_ASSLPTTMNY 之經鑑別之scFv之VH及VL序列示於表8中。為了清晰，將各經鑑別之scFv命中指定為純系名稱，且各列含有針對該特定純系名稱之VH及VL序列。例如，藉由純系名稱R3G10-P1A07鑑別之scFv包含VH序列EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGISARSGRTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDQDTIFGVVITWFDPWGQGTLVTVSS及VL序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYFTTPYTFGQGTKLEIK。
受體
所提供之ABP(例如，HLA-肽ABP)包括受體。該等受體可包括抗原受體及特異性結合本文中所揭示之HLA-肽靶之其他嵌合受體。該受體可為T細胞受體(TCR)。該受體可為嵌合抗原受體(CAR)。
TCR可係可溶性或膜結合的。抗原受體包括功能性非TCR抗原受體，諸如嵌合抗原受體(CAR)。亦提供表現受體之細胞及其於過繼細胞療法中之用途，諸如治療與HLA-肽表現相關之疾病及病症(包括癌症)。
包括CAR之示例性抗原受體及工程改造及引入此等受體至細胞中之方法包括(例如)於以下中所述之彼等：例如，國際專利申請公開案編號WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、美國專利申請公開案編號US2002131960、US2013287748、US20130149337、美國專利案第6,451,995號、第 7,446,190號、第8,252,592號、第8,339,645號、第8,398,282號、第7,446,179號、第6,410,319號、第7,070,995號、第7,265,209號、第7,354,762號、第7,446,191號、第8,324,353號及第8,479,118號，及歐洲專利申請案編號EP2537416，及/或Sadelain等人，Cancer Discov.2013年4月，3(4)：388-398；Davila等人，(2013)PLoS ONE 8(4)：e61338；Turtle等人，Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5)：633-39；Wu等人，Cancer,2012年3月.18(2)：160-75所述之彼等。於一些態樣中，抗原受體包括如美國專利案第7,446,190號中所述之CAR，及國際專利申請公開案編號：WO/2014055668 A1中所述之彼等。CAR之實例包括如上述公開案(諸如WO2014031687、美國專利案第8,339,645號、美國專利案第7,446,179號、US 2013/0149337、美國專利案第7,446,190號、美國專利案第8,389,282號)中任一者中所揭示之CAR，及其中抗原結合部分(例如，scFv)經抗體(例如，如本文中所提供)置換。
嵌合受體包括嵌合抗原受體(CAR)。嵌合受體(諸如CAR)一般包含細胞外抗原結合域，該域包含所提供之抗HLA-肽ABP(諸如抗HLA-肽抗體)中之一者、為所提供之抗HLA-肽ABP(諸如抗HLA-肽抗體)中之一者或包含於其內。因此，嵌合受體(例如CAR)通常包含一或多個HLA-肽ABP(諸如一或多個抗原結合片段、域或部分、或一或多個抗體可變域、及/或抗體分子，諸如本文中所述之彼等)於其細胞外部分。於一些實施例中，該CAR包含HLA-肽結合部分或ABP(例如，抗體)分子之部分，諸如抗體(例如，scFv抗體片段)之可變重(VH)鏈區及/或可變輕(VL)鏈區。
TCR
於一態樣中，本文中所提供之ABP(例如，特異性結合本文中所揭示之HLA-肽靶之ABP)包括T細胞受體(TCR)。TCR可經分離及純化。
於大多數T-細胞中，TCR為具有各自由TRA及TRB編碼之α(α)鏈及β-(β)鏈之異二聚體多肽。α鏈一般包含由TRAV編碼之α可變區、由TRAJ編碼之α接合區、及由TRAC編碼之α恆定區。β鏈一般包含由TRBV編碼之β可變區、由TRBD編碼之β多樣性區、由TRBJ編碼之β接合區、及由TRBC編碼之β恆定區。TCR-α鏈藉由VJ重組產生，且β鏈受體藉由V(D)J重組產生。額外TCR多樣性源自接合多樣性。可刪除若干鹼基及在各接合處添加其他(稱作N及P核苷酸)。於少數T細胞中，TCR包含γ及δ鏈。TCR γ鏈藉由VJ重組產生，及TCR δ鏈藉由V(D)J重組產生(Kenneth Murphy、Paul Travers及Mark Walport，Janeway's Immunology第7版，Garland Science，2007，其全文以引用的方式併入本文中)。TCR之抗原結合位點一般包含六個互補決定區(CDR)。α鏈貢獻三個CDR，αCDR1、αCDR2及αCDR3。β鏈亦貢獻三個CDR：βCDR1、βCDR2及βCDR3。αCDR3及βCDR3為最受V(D)J重組影響之區且占TCR庫之大部分變異。
TCR可特異性識別HLA-肽靶，諸如表A中所揭示之HLA-肽靶；因此TCR可為特異性結合至HLA-肽之ABP。TCR可係可溶性，例如，類似於由B細胞分泌之抗體。TCR亦可係膜結合，例如，在諸如T細胞或自然殺手(NK)細胞之細胞上。因此，TCR可用於對應於可溶性抗體及/或膜結合CAR之上下文中。
本文中所揭示之TCR中之任一者可包含α可變區、α接合區、視情況可選的α恆定區、β可變區、視情況可選的β多樣性區、β接合 區及視情況可選的β恆定區。
於一些實施例中，TCR或CAR為重組TCR或CAR。該重組TCR或CAR可包括本文中所識別之TCR中之任一者，但包含一或多個修飾。本文中描述示例性修飾，例如，胺基酸置換。本文中所述之胺基酸置換可參考IMGT命名法及如在www.imgt.org上所見之胺基酸編號作出。
重組TCR或CAR可為人類TCR或CAR，其包含全人類序列，例如，自然人類序列。重組TCR或CAR可保留其自然人類可變域序列，但是含有α恆定區、β恆定區或α及β恆定區二者之修飾。TCR恆定區之此等修飾可藉由(例如)驅動外源TCR鏈之優先配對改善TCR組裝及TCR基因療法之表現。
於一些實施例中，α及β恆定區藉由將整個人類恆定區序列置換成小鼠恆定區序列來修飾。此等「鼠源化」TCR及製備其之方法述於Cancer Res.2006年9月1日；66(17)：8878-86中，其全文以引用的方式併入本文中。
於一些實施例中，α及β恆定區藉由於人類TCR α恆定(TRAC)區、TCR β恆定(TRBC)區或TRAC及TRAB區中作出一或多個胺基酸置換來修飾，其將特定人類殘基交換為鼠科殘基(人類→鼠科胺基酸交換)。TRAC區中之一或多個胺基酸置換可包括在殘基90處之Ser置換、在殘基91處之Asp置換、在殘基92處之Val置換、在殘基93處之Pro置換、或其任何組合。人類TRBC區中之一或多個胺基酸置換可包括在殘基18處之Lys置換、在殘基22處之Ala置換、在殘基133處之Ile置換、在殘基139處之His置換、或以上任何組合。此等靶向胺基酸置換述於J Immunol，2010年6月1日，184(11)6223-6231中，其全文以引用的方式併入本文 中。
於一些實施例中，人類TRAC含有在殘基210處之Asp置換且人類TRBC含有在殘基134處之Lys置換。此等置換可促進α鏈與β鏈之間之鹽橋之形成及TCR鏈間二硫鍵之形成。此等靶向置換述於J Immunol，2010年6月1日，184(11)6232-6241中，其全文以引用的方式併入本文中。
於一些實施例中，人類TRAC及人類TRBC區經修飾以含有經引入之半胱胺酸，該等半胱胺酸可通過額外二硫鍵之形成改善外源TCR之優先配對。例如，人類TRAC可含有在殘基48處之Cys置換及人類TRBC可含有在殘基57處之Cys置換，述於Cancer Res.2007年4月15日；67(8)：3898-903及Blood.2007年3月15日；109(6)：2331-8中，其全文以引用的方式併入本文中。
重組TCR或CAR可包含α及β鏈之其他修飾。
於一些實施例中，α及β鏈藉由連接α及β鏈之細胞外域至完全人類CD3ζ(CD3-ζ)分子來修飾。此等修飾述於J Immunol，2008年6月1日，180(11)7736-7746；Gene Ther.2000年8月；7(16)：1369-77；及The Open Gene Therapy Journal,2011,4：11-22中，其全文以引用的方式併入本文中。
於一些實施例中，α鏈藉由於α鏈之跨膜區中引入疏水性胺基酸置換來修飾，如於J Immunol，2012年6月1日，188(11)5538-5546中所述；其全文以引用的方式併入本文中。
α或β鏈可藉由改變胺基酸序列中之N-醣基化位點中之任一者來修飾，如於J Exp Med.2009年2月16日；206(2)：463-475中所述；其 全文以引用的方式併入本文中。
α及β鏈各者可包含二聚化域，例如，異種二聚化域。此異種域可為白胺酸拉鏈、5H3域或疏水性脯胺酸濃化反域、或如此項技術中所知之其他類似形式。於一實例中，α及β鏈可藉由引入30mer區段至α及β細胞外域之羧基端來修飾，其中該等區段選擇性締合以形成穩定白胺酸拉鏈。此等修飾述於PNAS，1994年11月22日.91(24)11408-11412；https：//doi.org/10.1073/pnas.91.24.11408中，其全文以引用的方式併入本文中。
本文中經鑑別之TCR可經修飾以包含導致增加之親和力或半衰期之突變，諸如於WO2012/013913中所述之彼等，其全文以引用的方式併入本文中。
重組TCR或CAR可為單鏈TCR(scTCR)。此scTCR可包含融合至TCR α鏈恆定區細胞外序列之N端之α鏈可變區序列、融合至TCR β鏈恆定區細胞外序列之N端之TCR β鏈可變區、及連接α段之C端至β段之N端(或反之亦然)之連接子序列。於一些實施例中，scTCR之α及β段之恆定區細胞外序列藉由二硫鍵連接。於一些實施例中，連接子序列之長度及使得α及β段之可變區序列互相定向之二硫鍵之位置實質上如同於天然αβ T細胞受體中。示例性scTCR述於美國專利案第7,569,664號中，其全文以引用的方式併入本文中。
於一些情況下，scTCR之可變區可藉由短的肽連接子共價連接，諸如於Gene Therapy，第7卷，第1369至1377頁(2000)中所述。短的肽連接子可為絲胺酸濃化或甘胺酸濃化連接子。例如，連接子可為(Gly4Ser)3，如於Cancer Gene Therapy(2004)11，487-496中所述，其全 文以引用的方式併入。
重組TCR或其抗原結合片段可表現為融合蛋白。例如，TCR或其抗原結合片段可與毒素融合。此等融合蛋白述於Cancer Res.2002年3月15日；62(6)：1757-60中。TCR或其抗原結合片段可與抗體Fc區融合。此等融合蛋白述於J Immunol，2017年5月1日，198(1增刊)120.9中。
於一些實施例中，重組受體(諸如TCR或CAR，諸如其抗體部分)還包含間隔子，該間隔子可為或包含免疫球蛋白恆定區或變異體或其經修飾版本之至少一部分，諸如鉸鏈區，例如，IgG4鉸鏈區，及/或CH1/CL及/或Fc區。於一些實施例中，該恆定區或部分為人類IgG(諸如IgG4或IgG1)之恆定區或部分。於一些態樣中，恆定區之部分充當抗原識別組分(例如，scFv及跨膜域)之間之間隔子。間隔子可為相較於間隔子不存在下，於抗原結合後提供增加之細胞回應之長度。於一些實例中，間隔子長度係或約12個胺基酸或長度係不大於12個胺基酸。示例性間隔子包括具有以下之彼等：至少約10至229個胺基酸、約10至200個胺基酸、約10至175個胺基酸、約10至150個胺基酸、約10至125個胺基酸、約10至100個胺基酸、約10至75個胺基酸、約10至50個胺基酸、約10至40個胺基酸、約10至30個胺基酸、約10至20個胺基酸、或約10至15個胺基酸，且包括所列範圍中之任一者之端點之間的任何整數。於一些實施例中，間隔子區域具有約12個胺基酸或更少，約119個胺基酸或更少，或約229個胺基酸或更少。示例性間隔子包括單獨IgG4鉸鏈、連接至CH2及CH3域之IgG4鉸鏈、或連接至CH3域之IgG4鉸鏈。示例性間隔子包括(但不限於)於Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19：3153或國際專利申請公開案編 號WO2014031687中所述之彼等。於一些實施例中，該恆定區或部分為IgD之恆定區或部分。
受體(諸如TCR或CAR)之抗原識別域可連接至一或多個細胞內訊號組分，諸如於CAR之情況下，類比通過抗原受體複合體(諸如TCR複合體)激活及/或經由另一種細胞表面受體信號傳導之信號傳導組分。因此，於一些實施例中，HLA-肽特異性結合組分(例如，ABP，諸如抗體或TCR)連接至一或多個跨膜域及細胞內訊號域。於一些實施例中，該跨膜域融合至細胞外域。於一實施例中，使用與受體(例如，CAR)中之域中之一者天然締合之跨膜域。於一些情況下，該跨膜域經選擇或藉由胺基酸置換修飾以避免此等域結合至相同或不同表面膜蛋白之跨膜域以最小化與受體複合體之其他成員之相互作用。
於一些實施例中，跨膜域係源自天然或合成來源。在來源係天然之情況下，於一些態樣中，該域係源自任何膜結合或跨膜蛋白。跨膜區包含源自以下之彼等(即，包含至少以下之跨膜區)：T-細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、及/或CD 154。或者於一些實施例中，跨膜域係合成的。於一些態樣中，合成跨膜域包含佔優勢疏水性殘基(諸如白胺酸及纈胺酸)。於一些態樣中，苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體將在合成跨膜域之各端見到。於一些實施例中，連接係藉由連接子、間隔子及/或跨膜域。
細胞內訊號域包括類比或接近通過天然抗原受體之訊號、通過此受體與共刺激受體組合之訊號、及/或通過單獨共刺激受體之訊號之彼等。於一些實施例中，短的低聚肽或多肽連接子(例如，長度2與10個 胺基酸之間之連接子，諸如含有甘胺酸及絲胺酸者，例如，甘胺酸-絲胺酸二聯體)存在且形成受體之跨膜域與細胞質訊號域之間之連接。
受體(例如，TCR或CAR)可包含至少一個細胞內訊號組分。於一些實施例中，該受體包含TCR複合體之細胞內組分，諸如介導T-細胞激活及細胞毒性之TCR CD3鏈，例如，CD3ζ鏈。因此，於一些態樣中，結合HLA-肽之ABP(例如，抗體)連接至一或多個細胞訊號模組。於一些實施例中，細胞訊號模組包含CD3跨膜域、CD3細胞內訊號域、及/或其他CD跨膜域。於一些實施例中，受體(例如，CAR)還包含一或多個額外分子(諸如Fc受體-γ、CD8、CD4、CD25或CD16)之部分。例如，於一些態樣中，CAR包含CD3-ζ或Fc受體-γ與CD8、CD4、CD25或CD16之間之嵌合分子。
於一些實施例中，在TCR或CAR連接後，受體之細胞質域或細胞內訊號域激活免疫細胞(例如，經工程改造以表現受體之T細胞)之正常效應功能或反應中之至少一者。例如，於一些背景下，受體誘導T細胞之功能，諸如細胞活性或T-輔助細胞活性，諸如細胞激素或其他因子之分泌。於一些實施例中，使用抗原受體組分或共刺激分子之細胞內訊號域之截短部分代替完整免疫刺激鏈，例如，若其轉導效應功能信號。於一些實施例中，細胞內訊號域包含T細胞受體(TCR)之細胞質序列，及於一些態樣中，亦包含於天然背景中與此等受體相呼應作用以於抗原受體接合後啟動信號轉導之共受體之彼等，及/或此等分子之任何衍生物或變異體，及/或具有相同功能能力之任何合成序列。
於天然TCR之背景下，全激活一般不僅需要通過TCR之訊號，而且需要共刺激訊號。因此，於一些實施例中，為促進全激活，產生 二級或共刺激信號之組分亦包含於受體中，於其他實施例中，受體不包含產生共刺激信號之組分。於一些態樣中，額外受體於相同細胞中表現且提供產生二級或共刺激信號之組分。
於一些態樣中，將T細胞激活描述為藉由兩類細胞質訊號序列介導：通過TCR啟動抗原依賴性原始激活之彼等(初級細胞質訊號序列)，及以抗原獨立性方式起作用以提供二級或共刺激信號之彼等(二級細胞質訊號序列)。於一些態樣中，受體包含此等訊號組分中之一者或兩者。
於一些態樣中，受體包含調節TCR複合體之初級激活之初級細胞質訊號序列。以刺激方式起作用之初級細胞質訊號序列可含有已知為基於免疫受體酪胺酸之激活基序或ITAM之訊號基序。含有初級細胞質訊號序列之ITAM之實例包括衍生自TCR或CD3 ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3δ、CD3 ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d之彼等。於一些實施例中，CAR中之細胞質訊號分子包含細胞質訊號域、其部分或衍生自CD3 ζ之序列。
於一些實施例中，受體包含共刺激受體(諸如CD28、4-1BB、OX40、DAP10及ICOS)之訊號域及/或跨膜部分。於一些態樣中，相同受體包含激活及共刺激組分二者。
於一些實施例中，激活域包含於一個受體中，然而共刺激組分藉由識別另一抗原的另一受體提供。於一些實施例中，受體包括激活或刺激受體及共刺激受體，二者在相同細胞上表現(參見WO2014/055668)。於一些態樣中，HLA-肽靶向受體為刺激或激活受體；於其他態樣中，其為共刺激受體。於一些實施例中，細胞還包含抑制 受體(例如，iCAR，參見Fedorov等人，Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，諸如除了HLA-肽之受體識別抗原，藉此通過HLA-肽靶向受體遞送之激活信號藉由結合抑制受體至其配位體減少或抑制，例如，減少脫靶效應。
於某些實施例中，細胞內訊號域包含連接至CD3(例如，CD3-ζ)細胞內域之CD28跨膜及訊號域。於一些實施例中，細胞內訊號域包含連接至CD3 ζ細胞內域之嵌合CD28及CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激域。
於一些實施例中，受體涵蓋細胞質部分中之一或多個(例如，兩個或更多個)共刺激域及激活域(例如，初級激活域)。示例性受體包含CD3-ζ、CD28及4-1BB之細胞內組分。
於一些實施例中，CAR或其他抗原受體(諸如TCR)還包含標記(諸如細胞表面標記)，其可用於證實細胞之轉導或工程改造以表現該受體，諸如細胞表面受體之截短版本，諸如截短之EGFR(tEGFR)。於一些態樣中，標記物包含CD34、神經生長因子受體(NGFR)或表皮生長因子受體(例如，tEGFR)之所有或部分(例如，截短形式)。於一些實施例中，編碼標記之核酸可以操作方式連接至編碼連接子序列(諸如可斷裂連接子序列或核糖體跳過序列(例如，T2A))之多核苷酸。參見WO2014031687。於一些實施例中，編碼藉由T2A核糖體開關分離之CAR及EGFRt之構築體之引入可表現來自相同構築體之兩種蛋白質，使得EGFRt可用作標記以檢測表現此構築體之細胞。於一些實施例中，標記及視情況可選的連接子序列可為如公開專利申請案第WO2014031687號中所揭示之任一者。例如，標記可為視情況連接至連接子序列(諸如T2A核糖體跳過序列)之截短之 EGFR(tEGFR)。
於一些實施例中，標記為未在T細胞上自然發現或未在T細胞表面上自然發現之分子(例如，細胞表面蛋白)或其部分。
於一些實施例中，分子為非自身分子，例如，非自身蛋白質，即，無法被宿主免疫系統識別為「自身」者，細胞將以過繼轉移至該宿主。
於一些實施例中，標記不提供治療功能及/或不產生效應，而是用作用於遺傳改造(例如，用於選擇經成功工程改造之細胞)之標記。於其他實施例中，標記可為治療分子或以其他方式發揮一些所需作用之分子，諸如於活體內遇見細胞之配位體，諸如在過繼轉移及與配位體相遇後增強及/或抑制細胞反應之共刺激或免疫檢查點分子。
TCR或CAR可包含代替一或多個天然胺基酸之一個或經修飾之合成胺基酸。示例性經修飾之胺基酸包括(但不限於)胺基環己烷羧酸、正白胺酸、α-胺基正癸烷酸、高絲胺酸、S-乙醯基胺基甲基半胱胺酸、反式-3-及反式-4-羥基脯胺酸、4-胺基苯基丙胺酸、4-硝基苯基丙胺酸、4-氯苯基丙胺酸、4-羧基苯基丙胺酸、(3-苯基絲胺酸(3-羥基苯基丙胺酸、苯基甘胺酸、α-萘基丙胺酸、環己基丙胺酸、環己基甘胺酸、吲哚啉-2-甲酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酸、胺基丙二酸、胺基丙二酸單醯胺、N'-苄基-N'-甲基離胺酸、N',N'-二苄基離胺酸、6-羥基離胺酸、鳥胺酸、α-胺基環戊烷甲酸、α-胺基環己烷甲酸、α-胺基環庚烷甲酸、α-(2-胺基-2-降莰烷)-甲酸、α,γ-二胺基酪酸、α,γ-二胺基丙酸、高苯丙胺酸及α-四丁基甘胺酸。
於一些情況下，將CAR稱作第一、第二及/或第三代 CAR。於一些態樣中，第一代CAR為在抗原結合後僅提供CD3鏈誘導之信號者；於一些態樣中，第二代CAR為提供此信號及共刺激信號者，諸如包含來自共刺激受體(諸如CD28或CD137)之細胞內訊號域者；於一些態樣中，第三代CAR為包含不同共刺激受體之多個共刺激域者。
於一些實施例中，嵌合抗原受體包含含有本文中所述抗體或片段之細胞外部分。於一些態樣中，嵌合抗原受體包含含有本文中所述抗體或片段及細胞內訊號域之細胞外部分。於一些實施例中，抗體或片段包含scFv或單域VH抗體且細胞內域含有ITAM。於一些態樣中，細胞內訊號域包含CD3-ζ(CD3)鏈之ζ鏈之訊號域。於一些實施例中，嵌合抗原受體包含連接細胞外域及細胞內訊號域之跨膜域。
於一些態樣中，跨膜域含有CD28之跨膜部分。細胞外域與跨膜可直接或間接連接。於一些實施例中，細胞外域與跨膜藉由間隔子連接，諸如本文中所述任一者。於一些實施例中，嵌合抗原受體含有T細胞共刺激分子之細胞內域，諸如跨膜域與細胞內訊號域之間。於一些態樣中，T細胞共刺激分子為CD28或41BB。
於一些實施例中，CAR含有抗體(例如，抗體片段)、跨膜域(為或含有CD28或其功能變異體之跨膜部分)、及細胞內訊號域(含有CD28或其功能變異體之訊號部分及CD3 ζ或其功能變異體之訊號部分)。於一些實施例中，CAR含有抗體(例如，抗體片段)、跨膜域(為或含有CD28或其功能變異體之跨膜部分)、及細胞內訊號域(含有4-1BB或其功能變異體之訊號部分及CD3 ζ或其功能變異體之訊號部分)。於一些此等實施例中，受體還包含含有Ig分子(諸如人類Ig分子)之部分之間隔子，諸如Ig鉸鏈，例如，IgG4鉸鏈，諸如僅鉸鏈間隔子。
於一些實施例中，受體(例如，CAR)之跨膜域為人類CD28或其變異體之跨膜域，例如，人類CD28之27-胺基酸跨膜域(加入號：P10747.1)。
於一些實施例中，嵌合抗原受體含有T細胞共刺激分子之細胞內域。於一些態樣中，T細胞共刺激分子為CD28或41BB。
於一些實施例中，細胞內訊號域包含人類CD28或其功能變異體或部分之細胞內共刺激訊號域，諸如其41胺基酸域及/或諸如具有初始CD28蛋白之位置186至187處之LL至GG置換之域。於一些實施例中，細胞內域包含41BB或其功能變異體或部分之細胞內共刺激訊號域，諸如人類4-1BB(登錄號Q07011.1)或其功能變異體或部分之42-胺基酸細胞質域。
於一些實施例中，細胞內訊號域包含人類CD3 ζ刺激訊號域或其功能變異體，諸如人類CD3 ζ之同工異型物3之112 AA細胞質域(登錄號：P20963.2)或如美國專利案第7,446,190號或美國專利案第8,911,993號中所述之CD3 ζ訊號域。
於一些態樣中，間隔子僅含有IgG之鉸鏈區，諸如僅IgG4或IgG1之鉸鏈。於其他實施例中，間隔子為(例如Ig)鉸鏈，及連接至CH2及/或CH3域之IgG4鉸鏈。於一些實施例中，間隔子為Ig鉸鏈，例如，連接至CH2及CH3域之IgG4鉸鏈。於一些實施例中，間隔子為Ig鉸鏈，例如，僅連接至CH3域之IgG4鉸鏈。於一些實施例中，間隔子為或包含甘胺酸-絲胺酸濃化序列或其他可撓性連接子(諸如已知可撓性連接子)。
例如，於一些實施例中，CAR包含抗體或其片段，諸如HLA-肽抗體中之任一者，該等HLA-肽抗體包含本文中所述之單鏈抗體(sdAb，例如，僅含有VH區)及scFv、間隔子(諸如含有間隔子之Ig-鉸鏈中之任一者)、CD28跨膜域、CD28細胞內訊號域及CD3 ζ訊號域。於一些 實施例中，CAR包含抗體或片段，諸如HLA-肽抗體中之任一者，該等HLA-肽抗體包含本文中所述之sdAb及scFv、間隔子(諸如含有間隔子之Ig-鉸鏈中之任一者)、CD28跨膜域、CD28細胞內訊號域及CD3 ζ訊號域。
A*01：01_ASSLPTTMNY(SEQ ID NO：)[G10]之靶特異性TCR
於一些態樣中，本文中提供包含特異性結合HLA-肽靶之TCR或其抗原結合片段之ABP，其中該HLA-肽靶之HLA I類分子為HLA亞型A*01：01及該HLA-肽靶之HLA限制性肽包含序列ASSLPTTMNY(「G10」)。
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之TCR可包含αCDR3序列。該αCDR3序列可為表15中之αCDR3序列中之任一者。經鑑別之TCR純系型之α及βCDR3序列示於表15中。
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之TCR可包含βCDR3序列。該βCDR3序列可為表15中之βCDR3序列中之任一者。
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之TCR可包含特定αCDR3序列及特定βCDR3序列。例如，特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之TCR可包含來自表15中之經鑑別之TCR中之任一者的αCDR3序列及βCDR3序列。為了清晰，將各經鑑別之TCR指配TCR ID編號。例如，TCR ID編號1包含αCDR3序列CAGPGNTGKLIF及βCDR3序列CASSNAGDQPQHF。
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之TCR可包含TRAV、TRAJ、TRBV、視情況可選的TRBD及TRBJ胺基酸序列、視情況可選的TRAC序列及視情況可選的TRBC序列。例如，特異性針對 A*01：01_ASSLPTTMNY之TCR可包含TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD、TRBJ胺基酸序列、來自表14中之經鑑別之TCR中之任一者的TRAC序列及TRBC序列。為了清晰，將各經鑑別之TCR指配TCR ID編號。例如，TCR經指配之TCR ID編號1包含TRAV25序列、TRAJ37序列、TRAC序列、TRBV19序列、TRBD1序列、TRBJ1-5序列及TRBC1序列。
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之TCR可包含αVJ序列。該αVJ序列可為表16中之αVJ序列中之任一者。
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之TCR可包含βV(D)J序列。該βV(D)J序列可為表16中之βV(D)J序列中之任一者。
特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之TCR可包含αVJ序列及βV(D)J序列。例如，特異性針對A*01：01_ASSLPTTMNY之TCR可包含來自表16中之經鑑別之TCR中之任一者的αVJ序列及βV(D)J序列。經鑑別之TCR純系型之全長αV(J)及βV(D)J序列示於表16中。例如，TCR ID編號1包含αV(J)序列MLLITSMLVLWMQLSQVNGQQVMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSSTTLSNIQWYKQRPGGHPVFLIQLVKSGEVKKQKRLTFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYFCAGPGNTGKLIFGQGTTLQVK及βV(D)J序列MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSNAGDQPQHFGDGTRLSIL。
A*01：01_HSEVGLPVY之靶-特異性TCR
於一些態樣中，本文中提供包含特異性結合HLA-肽靶之TCR或其抗原結合片段之ABP，其中該HLA-肽靶之HLA I類分子為HLA 亞型A*01：01且該HLA-肽靶之HLA限制性肽包含序列HSEVGLPVY。
特異性針對A*01：01_HSEVGLPVY之TCR可包含αCDR3序列。該αCDR3序列可為表18中之αCDR3序列中之任一者。經鑑別之TCR純系型之α及βCDR3序列示於表18中。
特異性針對A*01：01_HSEVGLPVY之TCR可包含βCDR3序列。該βCDR3序列可為表18中之βCDR3序列中之任一者。
特異性針對A*01：01_HSEVGLPVY之TCR可包含特定αCDR3序列及特定βCDR3序列。例如，特異性針對A*01：01_HSEVGLPVY之TCR可包含來自表18中之經鑑別之TCR中之任一者的αCDR3序列及βCDR3序列。為了清晰，將各經鑑別之TCR指配TCR ID編號。例如，TCR ID編號345包含αCDR3序列CAANPGDYKLSF及βCDR3序列CASSSNYEQYF。
特異性針對A*01：01_HSEVGLPVY之TCR可包含TRAV、TRAJ、TRBV、視情況可選的TRBD及TRBJ胺基酸序列、視情況可選的TRAC序列及視情況可選的TRBC序列。例如，特異性針對A*01：01_HSEVGLPVY之TCR可包含TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD、TRBJ胺基酸序列、來自表17中之經鑑別之TCR中之任一者的TRAC序列及TRBC序列。為了清晰，將各經鑑別之TCR指配TCR ID編號。例如，TCR經指配之TCR ID編號345包含TRAV13-1序列、TRAJ20序列、TRAC序列、TRBV7-9序列、TRBJ2-7序列及TRBC2序列。
特異性針對A*01：01_HSEVGLPVY之TCR可包含αVJ序列。該αVJ序列可為表19中之αVJ序列中之任一者。
特異性針對A*01：01_HSEVGLPVY之TCR可包含βV(D)J 序列。該βV(D)J序列可為表19中之βV(D)J序列中之任一者。
特異性針對A*01：01_HSEVGLPVY之TCR可包含αVJ序列及βV(D)J序列。例如，特異性針對A*01：01_HSEVGLPVY之TCR可包含來自表19中之經鑑別之TCR中之任一者的αVJ序列及βV(D)J序列。經鑑別之TCR純系型之全長αV(J)及βV(D)J序列示於表19中。例如，TCR ID編號345包含αV(J)序列MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKGPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAANPGDYKLSFGAGTTVTVR及βV(D)J序列MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSSNYEQYFGPGTRLTVT。
經工程改造之細胞
亦提供細胞，諸如含有抗原受體(例如，含有包含本文中所述之抗HLA-肽ABP(例如，CAR或TCR)之細胞外域)之細胞。亦提供此等細胞之群體及含有此等細胞之組合物。於一些實施例中，針對此等細胞，組合物或群體經濃化，諸如其中表現HLA-肽ABP之細胞組成組合物之總細胞或某種細胞(諸如T細胞或CD8+或CD4+細胞)之至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或超過99%。於一些實施例中，組合物包含至少一種含有本文中所揭示之抗原受體之細胞。該等組合物為用於投與(諸如用於過繼細胞療法)之醫藥組合物及調配物。亦提供對個體(例如，患者)投與細胞及組合物之治療方法。
因此，亦提供表現包含受體(例如，TCR或CAR)之ABP之經遺傳工程改造之細胞。該等細胞一般為真核細胞(諸如哺乳動物細胞)，及通常為人類細胞。於一些實施例中，細胞係源自血液、骨髓、淋巴或類淋巴器官，為免疫系統之細胞，諸如先天性或適應性免疫之細胞，例如，骨髓或類淋巴細胞，包括淋巴細胞，通常T細胞及/或NK細胞。其他示例性細胞包括幹細胞，諸如多能幹細胞，包括經誘導之多能幹細胞(iPSC)。該等細胞通常為初級細胞，諸如直接自個體分離及/或自個體分離且冷凍之彼等。於一些實施例中，該等細胞包括T細胞或其他細胞類型之一或多個子集，諸如全T細胞群體、CD4+細胞、CD8+細胞，及其亞群，諸如藉由以下定義之彼等：功能、激活狀態、成熟性、分化潛能、擴增、再循環、定域化及/或持久能力、抗原特異性、抗原受體類型、特定器官或隔室之存在、標記或細胞激素分泌譜、及/或分化程度。關於待治療之個體，該等細胞可係同種異體及/或自體同源的。方法包括現成方法。於一些態樣中，諸如針對現成技術，該等細胞係多能(pluripotent/multipotent)，諸如幹細胞，諸如經誘導之多能幹細胞(iPSC)。於一些實施例中，該等方法包括自個體分離細胞，製備，處理，培養其及/或將其工程改造，如本文中所述，及在冷凍儲存之前或之後，將其再引入相同患者。
T細胞及/或CD4+及/或CD8+ T細胞之子類型及亞群為初始T(TN)細胞、效應T細胞(TEFF)、記憶T細胞及其子類型(諸如幹細胞記憶T(TSCM))、中樞記憶T(TCM)、效應記憶T(TEM)、或終末分化之效應記憶T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、不成熟T細胞、成熟T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細胞、黏膜相關之不變T(MALT)細胞、天然及適應性 調節T(Treg)細胞、輔助T細胞(諸如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡輔助T細胞、α/β T細胞及δ/γ T細胞)。
於一些實施例中，該等細胞為自然殺手(NK)細胞。於一些實施例中，該等細胞為單核細胞或粒性細胞，例如，骨髓細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球、樹突狀細胞、肥大細胞、嗜酸性白血球及/或嗜鹼性白血球。
該等細胞可經遺傳修飾以減少表現或敲除內源TCR。此等修飾述於Mol Ther Nucleic Acids.2012年12月；1(12)：e63；Blood.2011年8月；118(6)：1495-503；Blood.2012年6月14日；119(24)：5697-5705；Torikai、Hiroki等人，「HLA and TCR Knockout by Zinc Finger Nucleases：Toward「off-the-Shelf」Allogeneic T-Cell Therapy for CD19+ Malignancies.」Blood 116.21(2010)：3766；Blood.2018年1月18日；131(3)：311-322.doi：10.1182/blood-2017-05-787598；及WO2016069283中，其全文以引用的方式併入。
該等細胞可經遺傳修飾以促進細胞激素分泌。此等修飾述於Hsu C、Hughes MS、Zheng Z、Bray RB、Rosenberg SA、Morgan RA中。利用經密碼子最佳化IL-15基因工程改造之原代人類T淋巴細胞抵抗細胞激素戒斷誘導之細胞凋亡及在外源細胞激素不存在下長期堅持。J Immunol.2005；175：7226-34；Quintarelli C、Vera JF、Savoldo B、Giordano Attianese GM、Pule M、Foster AE，Co-expression of cytokine and suicide genes to enhance the activity and safety of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes.Blood.2007；110：2793-802；及Hsu C、Jones SA、Cohen CJ、Zheng Z、Kerstann K、Zhou J，Cytokine-independent growth and clonal expansion of a primary human CD8+ T-cell clone following retroviral transduction with the IL-15 gene.Blood.2007；109：5168-77。
已顯示T細胞上之趨化因子受體與腫瘤分泌之趨化因子之錯配導致T細胞次優轉運至腫瘤微環境中。為提高療法之功效，可將該等細胞遺傳修飾以增加腫瘤微環境中之趨化因子之識別。此等修飾之實例述於Moon等人，Expression of a functional CCR2 receptor enhances tumor localization and tumor eradication by retargeted human T cells expressing a mesothelin-specific chimeric antibody receptor.Clin Cancer Res.2011；17：4719-4730；及Craddock等人，Enhanced tumor trafficking of GD2 chimeric antigen receptor T cells by expression of the chemokine receptor CCR2b.J Immunother.2010；33：780-788中。
該等細胞可經遺傳修飾以增強共刺激/增強受體(諸如CD28及41BB)之表現。
T細胞療法之副作用可包括細胞激素釋放症候群及延長之B細胞耗盡。接受者細胞中之自殺/安全開關之引入可改良基於細胞療法之安全特性。因此，該等細胞可經遺傳修飾以包含自殺/安全開關。自殺/安全開關可為在表現基因之細胞上，賦予對藥劑(例如，藥物)敏感性之基因，及當細胞與該藥劑接觸或暴露於該藥劑時，其造成細胞死亡。示例性自殺/安全開關述於Protein Cell.2017年8月；8(8)：573-589中。自殺/安全開關可為HSV-TK。自殺/安全開關可為胞嘧啶脫胺酶、嘌呤核苷磷酸化酶或硝基還原酶。自殺/安全開關可為RapaCIDeTM，述於美國專利申請公 開案號US20170166877A1中。自殺/安全開關系統可為CD20/Rituximab，述於Haematologica.2009年9月；94(9)：1316-1320中。此等參考文獻之全文以引用的方式併入。
可將TCR或CAR引入接受者細胞中作為分裂受體，該分裂受體僅在異二聚小分子之存在下組裝。此等系統述於Science.2015年10月16日；350(6258)：aab4077及美國專利案第9,587,020號中，其以引用的方式併入本文中。
於一些實施例中，該等細胞包含一或多種核酸，例如，編碼本文中所揭示之TCR或CAR之多核苷酸，其中該多核苷酸經由遺傳工程改造引入，及從而表現如本文中所揭示之重組或經遺傳工程改造之TCR或CAR。於一些實施例中，核酸係異種，即，通常不存在於細胞或自該細胞獲得之樣品中，諸如獲自另一生物體或細胞者，其(例如)通常不於經工程改造之細胞及/或此細胞來源之生物體中發現。於一些實施例中，核酸非天然產生，諸如未於自然中發現之核酸，包括包含編碼來自多種不同細胞類型之各種域之核酸的嵌合組合者。
核酸可包含密碼子最佳化核苷酸序列。不限於特定理論或機理，據信核苷酸序列之密碼子最佳化增加mRNA轉錄之轉譯效率。核苷酸序列之密碼子最佳化可涉及將初始密碼子替換為編碼相同胺基酸，但是可藉由細胞內更容易獲得之tRNA轉譯之另一密碼子，因此增加轉譯效率。核苷酸序列之最佳化亦可減少將干擾轉譯之二級mRNA結構，因此增加轉譯效率。
可使用構築體或載體將TCR或CAR引入接受者細胞中。本文中描述示例性構築體。編碼TCR或CAR之α及β鏈之多核苷酸可於單個 構築體中或於分開構築體中。編碼α及β鏈之多核苷酸可以操作方式連接至啟動子，例如，異種啟動子。該異種啟動子可為強啟動子，例如，EF1α、CMV、PGK1、Ubc、β肌動蛋白、CAG啟動子及類似者。該異種啟動子可為弱啟動子。該異種啟動子可為可誘導啟動子。示例性可誘導啟動子包括(但不限於)TRE、NFAT、GAL4、LAC及類似者。其他示例性可誘導表現系統述於美國專利案第5,514,578號、第6,245,531號、第7,091,038號及歐洲專利案第0517805號中，其全文以引用的方式併入。
用於將TCR或CAR引入接受者細胞中之構築體亦可包含編碼信號肽(信號肽元件)之多核苷酸。該信號肽可促進引入之TCR或CAR之表面轉運。示例性信號肽包括(但不限於)CD8信號肽、免疫球蛋白信號肽，其中特定實例包括GM-CSF及IgG κ。此等信號肽述於Trends Biochem Sci.2006年10月；31(10)：563-71.Epub 2006年8月21日；及An等人，「Construction of a New Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor and the Anti-Leukemia Function Study of the Transduced T Cells.」Oncotarget 7.9(2016)：10638-010649.PMC.Web.2018年8月16日中，其以引用的方式併入本文中。
於一些情況(例如，其中α及β鏈自單一構築體或開放閱讀框表現之情況，或其中標記基因包含於構築體中之情況)下，構築體可包含核糖體跳過序列。核糖體跳過序列可為2A肽，例如，P2A或T2A肽。示例性P2A及T2A肽述於Scientific Reports第7卷，文章編號：2193(2017)中，其全文以引用的方式併入本文中。於一些情況下，在2A元件之上游引入FURIN/PACE裂解位點。FURIN/PACE裂解位點述於(例如)http：//www.nuolan.net/substrates.html中。該裂解肽亦可為因子Xa裂解位 點。於α及β鏈自單一構築體或開放閱讀框表現之情況下，構築體可包含內部核糖體進入位點(IRES)。
構築體還可包含一或多個標記基因。示例性標記基因包括(但不限於)GFP、螢光素酶、HA、lacZ。標記可為可選擇標記，諸如抗生素抗性標記、抗重金屬標記或抗生物殺菌劑標記，如為熟習此項技術者已知。標記可為用於營養缺陷型宿主之互補標記。示例性互補標記及營養缺陷型宿主述於Gene.2001年1月14日；263(1-2)：159-69中。此等標記可經由IRES、框移序列、2A肽連接子、與TCR或CAR融合表現，或自分開啟動子分開表現。
用於將TCR或CAR引入接受者細胞中之示例性載體或系統包括(但不限於)腺相關病毒、腺病毒、腺病毒+經改良之疫苗、安卡拉(Ankara)病毒(MVA)、腺病毒+逆轉錄病毒、腺病毒+仙台(Sendai)病毒、腺病毒+牛痘病毒、α病毒(VEE)複製子疫苗、反義寡核苷酸、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、CRISPR-Cas9、大腸桿菌、黃病毒(Flavivirus)、基因槍、皰疹病毒(Herpesviruses)、單純皰疹病毒、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、電穿孔、慢病毒(Lentivirus)、脂質轉染(Lipofection)、單核細胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)、麻疹病毒(Measles virus)、經改良之牛痘安卡拉病毒(MVA)、mRNA電穿孔、裸/質粒DNA、裸/質粒DNA+腺病毒、裸/質粒DNA+經改良之牛痘安卡拉病毒(MVA)、裸露/質粒DNA+RNA轉移、裸露/質粒DNA+牛痘病毒、裸露/質粒DNA+水皰性口炎病毒、新堡病病毒、非病毒、PiggyBacTM(PB)轉位子、基於奈米粒子之系統、脊髓灰質炎病毒(Poliovirus)、痘病毒(Poxvirus)、痘病毒+牛痘病毒、逆轉錄病毒、RNA轉移、RNA轉移+裸 露/質粒DNA、RNA病毒、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)、仙台病毒、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、類人猿病毒(Simian virus)、siRNA、睡美人(Sleeping Beauty)轉位子、變形鏈球菌(Streptococcus mutans)、牛痘病毒、委內瑞拉(Venezuelan)馬腦炎病毒複製子、水皰性口炎病毒、及霍亂弧菌(Vibrio cholera)。
於較佳實施例中，TCR或CAR經由以下引入接受者細胞中：腺相關病毒(AAV)、腺病毒、CRISPR-CAS9、皰疹病毒、慢病毒、脂質轉染、mRNA電穿孔、PiggyBacTM(PB)轉位子、逆轉錄病毒、RNA轉移、或睡美人轉位子。
於一些實施例中，用於將TCR或CAR引入接受者細胞中之載體為病毒載體。示例性病毒載體包括腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、慢病毒載體、皰疹病毒載體、逆轉錄病毒載體、及類似者。本文中描述此等載體。
用於將TCR或CAR引入接受者細胞中之TCR構築體之示例性實施例示於圖2中。於一些實施例中，TCR構築體自5’-3’方向包含下列多核苷酸序列：啟動子序列、信號肽序列、TCR β可變(TCRβv)序列、TCR β恆定((TCRβc)序列、裂解肽(例如，P2A)、信號肽序列、TCR α可變(TCRαv)序列、及TCR α恆定(TCRαc)序列。於一些實施例中，構築體之TCRβc及TCRαc序列包含一或多個鼠科區，例如，如本文中所述之全鼠科恆定序列或人類→鼠科胺基酸交換。於一些實施例中，構築體還包含TCRαc序列之3’、裂解肽序列(例如，T2A)，接著報導基因。於一實施例中，構築體自5’-3’方向包含下列多核苷酸序列：啟動子序列、信號肽序 列、TCR β可變(TCRβv)序列、含有一或多個鼠科區之TCR β恆定((TCRβc)序列、裂解肽(例如，P2A)、信號肽序列、TCR α可變(TCRαv)序列、及含有一或多個鼠科區之TCR α恆定(TCRαc)序列、裂解肽(例如，T2A)及報導基因。
圖3描繪將TCR選殖至表現系統供療法開發用之示例性構築體主鏈序列。
圖4描繪將經鑑別之A*0201_LLASSILCA特異性TCR選殖至表現系統供療法開發用之示例性構築體序列。
圖5描繪將經鑑別之A*0101_EVDPIGHLY特異性TCR選殖至表現系統供療法開發用之示例性構築體序列。
核苷酸、載體、宿主細胞及相關方法
亦提供編碼HLA-肽ABP之經分離核酸、包含核酸之載體、及包含載體及核酸之宿主細胞，以及產生ABP之重組技術。
核酸可係重組的。重組核酸可藉由連接天然或合成核酸片段至可於活細胞內複製之核酸分子或其片段在活細胞外部構築。出於本文中目的，複製可係於活體外複製或於活體內複製。
針對ABP之重組產生，編碼其之核酸可經分離並插入可複製載體用於進一步選殖(即，DNA之擴增)或表現。於一些態樣中，核酸可藉由同源重組產生，例如，如於美國專利案第5,204,244號中所述，其全文以引用的方式併入。
許多不同載體係此項技術中已知。載體組分一般包括下列中之一或多者：信號序列、複製起源、一或多個標記基因、增強子元件、啟動子、及轉錄終止序列，例如，如美國專利案第5,534,615號中所述， 其全文以引用的方式併入。
適用於表現ABP(例如，TCR、CAR、抗體或其抗原結合片段)之示例性載體或構築體包括(例如)pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,CA)、pET序列(Novagen,Madison,WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)及pEX系列(Clontech,Palo Alto,CA)。噬菌體(Bacteriophage)載體(諸如AGTlO、AGTl 1、AZapII(Stratagene)、AEMBL4及ANMl 149)亦適用於表現本文中所揭示之ABP。
以下提供適宜宿主細胞之說明性實例。此等宿主細胞非意在限制性，及可使用任何適宜宿主細胞以產生本文中所提供之ABP。
適宜宿主細胞包括任何原核(例如，細菌)、低等真核(例如，酵母)、或高等真核(例如，哺乳動物)細胞。適宜原核生物包括真細菌(eubacteria)，諸如革蘭氏(Gram)陰性或革蘭氏陽性生物體，例如，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，諸如埃希氏菌屬(Escherichia)(大腸桿菌)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)(鼠傷寒沙門氏桿菌(S.typhimurium))、沙雷氏菌屬(Serratia)(黏質沙雷氏菌(S.marcescans))、志賀氏桿菌屬(Shigella)、桿菌屬(Bacilli)(枯草桿菌(B.subtilis)及地衣芽孢桿菌(B.licheniformis))、假單胞菌屬(Pseudomonas)(銅綠假單胞菌(P.aeruginosa))及鏈黴菌(Streptomyces)。一個可用大腸桿菌選殖宿主為大腸桿菌294，雖然其他菌株(諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776及大腸桿菌W3110)亦適宜。
除了原核生物外，真核微生物(諸如絲狀真菌(filamentous fungi)或酵母)亦適宜選殖或表現編碼HLA-肽ABP之載體之宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通麵包酵母為常用低等真核宿主微生物。然而，許多其他屬、物種及株係可得且可用，諸如裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)(乳酸克魯維酵母菌(K.lactis)、脆壁克魯維酵母菌(K.fragilis)、保加利亞克魯維酵母菌(K.bulgaricus)、維克拉米克魯維酵母菌(K.wickeramii)、瓦爾蒂克魯維酵母菌(K.wattii)、果蠅克魯維酵母菌(K.drosophilarum)、耐熱菌克魯維酵母菌(K.thermotolerans)及馬克斯克魯維酵母菌(K.marxianus))、耶氏酵母屬(Yarrowia)、畢赤酵母(Pichia pastoris)、念珠菌(Candida)(白色念珠菌(C.albicans))、瑞氏木黴菌(Trichoderma reesia)、粗糙鏈孢菌(Neurospora crassa)、白絲酵母屬(Schwanniomyces)(西洋白絲酵母(S.occidentalis))、及絲狀真菌，諸如，例如，青黴菌屬(Penicillium)、彎頸黴菌屬(Tolypocladium)及曲黴菌屬(Aspergillus)(構巢曲黴菌(A.nidulans)及黑曲黴菌(A.niger)。
可用哺乳動物宿主細胞包括COS-7細胞、HEK293細胞；幼倉鼠腎(BHK)細胞；中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)；小鼠塞爾托利(sertoli)細胞；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、及類似者。
用於產生HLA-肽ABP之宿主細胞可於各種培養基中培養。可市面上購得之培養基(諸如，例如，Ham’s F10、最小必需培養基(Minimal Essential Medium，MEM)、RPMI-1640及杜貝科氏改良依格培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)適用於培養該等宿主細胞。此外，可使用於Ham等人，Meth.Enz.,1979,58：44；Barnes等人，Anal.Biochem.,1980,102：255；及美國專利案第4,767,704號、第 4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655號及第5,122,469號；或WO 90/03430及WO 87/00195中所述之培養基中之任一者。上述參考文獻各者之全文以引用的方式併入。
此等培養基中之任一者可視情況利用以下補充：激素及/或生長因子(諸如胰島素(insulin)、鐵傳遞蛋白(transferrin)或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素、痕量元素(經定義為通常以微莫耳範圍之最終濃度存在之無機化合物)、及葡萄糖或等量能源。亦可以熟習此項技術者已知之適宜濃度包含任何其他必需補充物。
培養條件(諸如溫度、pH及類似者)為先前利用針對表現選擇之宿主細胞使用之彼等，且將對一般熟習技工顯而易見。
當使用重組技術時，ABP可於細胞內、於細胞周質間隙中產生，或直接分泌至培養基中。若ABP於細胞內產生，作為第一步，例如，藉由離心或超濾移除微粒碎片(宿主細胞或裂解片段)。例如，Carter等人，(Bio/Technology,1992,10：163-167，其全文以引用的方式併入)描述分離分泌至大腸桿菌之細胞周質間隙之ABP之程序。簡言之，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯基氟化物(PMSF)之存在下，歷時約30分鐘，將細胞糊解凍。細胞碎片可藉由離心移除。
於一些實施例中，ABP於無細胞系統中產生。於一些態樣中，無細胞系統為如於Yin等人，mAbs,2012,4：217-225(其全文以引用的方式併入)中所述之活體外轉錄及轉譯系統。於一些態樣中，無細胞系統利用來自真核細胞或來自原核細胞之無細胞提取物。於一些態樣中，原核細胞為大腸桿菌。ABP之無細胞表現可係可用的，例如，在ABP呈不可 溶聚集體於細胞中累積之情況下或在來自細胞周質表現量低之情況下。
在將ABP分泌至培養基之情況下，一般使用可市面上購得之蛋白質濃度過濾器(例如，Amicon®或Millipore® Pellcon®超濾裝置)首先將來自此等表現系統之上清液濃縮。蛋白酶抑制劑(諸如PMSF)可包含於上述步驟中之任一者以抑制蛋白質水解及可包含抗生素以防止外來污染物之生長。
自細胞製備之ABP組合物可使用(例如)羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析及親和力層析法純化，利用親和力層析法為特別有用之純化技術。蛋白質A作為親和力配位體之適宜性取決於物種及ABP中存在之任何免疫球蛋白Fc域之同型。蛋白質A可用於純化包含人類γ1、γ2或γ4重鏈(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.,1983,62：1-13，其全文以引用的方式併入)之ABP。蛋白質G可用於所有小鼠同型及用於人類γ3(Guss等人，EMBO J.,1986,5：1567-1575，其全文以引用的方式併入)。
附接親和力配位體之基質為最常見瓊脂糖，但是其他基質係可得。機械上穩定基質(諸如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允許較可利用瓊脂糖達成者更快流率及更短處理時間。在ABP包含CH3域之情況下，BakerBond ABX®樹脂可用於純化。
用於蛋白質純化之其他技術，諸如在離子交換管柱上之分級分離、乙醇沉澱、逆相HPLC、矽膠層析法、肝素Sepharose®層析法、層析法聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沉澱亦可得，且可由一般技術者應用。
於任何初步純化步驟後，可使用約2.5至約4.5之pH之溶離緩衝液，使包含受關注之ABP及污染物之混合物經受低pH疏水相互作用層析法，一般在低鹽濃度(例如，約0至約0.25M鹽)下進行。
製備HLA-肽ABP之方法
HLA-肽抗原製備
用於分離或創建本文中所提供之ABP之HLA-肽抗原可為完整HLA-肽或HLA-肽之片段。該HLA-肽抗原可(例如)呈分離蛋白質或為在細胞表面上表現之蛋白質之形式。
於一些實施例中，HLA-肽抗原為HLA-肽之非天然變異體，諸如具有非自然產生之胺基酸序列或轉譯後修飾之HLA-肽蛋白質。
於一些實施例中，HLA-肽抗原藉由移除(例如)細胞內或跨膜序列或信號序列截短。於一些實施例中，HLA-肽抗原在其C-端融合至人類IgG1 Fc域或聚組胺酸標籤。
鑑別ABP之方法
結合HLA-肽之ABP可使用此項技術中已知之任何方法(例如，噬菌體呈現或個體之免疫)鑑別。
一種鑑別抗原結合蛋白之方法包括提供至少一個HLA-肽靶；及使該至少一個靶與抗原結合蛋白結合，從而鑑別該抗原結合蛋白。該抗原結合蛋白可存在於包含複數個不同抗原結合蛋白之庫中。
於一些實施例中，該庫為噬菌體呈現庫。該噬菌體呈現庫可經開發使得其實質上無非特異性結合HLA-肽靶之HLA之抗原結合蛋白。抗原結合蛋白可存在於包含複數個不同抗原結合蛋白之酵母呈現庫中。該酵母呈現庫可經開發使得其實質上無非特異性結合HLA-肽靶之HLA之抗原結合蛋白。
於一些實施例中，該庫為酵母呈現庫。
於一些實施例中，該庫為TCR呈現庫。示例性TCR呈現庫 及使用此等TCR呈現庫之方法述於WO 98/39482、WO 01/62908、WO 2004/044004、WO2005116646、WO2014018863、WO2015136072、WO2017046198、及Helmut等人，(2000)PNAS 97(26)14578-14583中，其全文以引用的方式併入本文中。
於一些態樣中，進行結合步驟一次以上，視情況至少三次，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10x。
此外，該方法亦可包括使抗原結合蛋白與一或多種不同於HLA-肽靶之肽-HLA複合體接觸以確定該抗原結合蛋白是否選擇性結合該HLA-肽靶。
鑑別抗原結合蛋白之另一種方法可包括獲得至少一個HLA-肽靶；對個體(例如，小鼠、兔或美洲駝)投與該HLA-肽靶，視情況與佐劑組合；及自該個體分離抗原結合蛋白。分離抗原結合蛋白可包括篩選個體之血清以鑑別該抗原結合蛋白。該方法亦可包括使抗原結合蛋白與一或多種不同於HLA-肽靶之肽-HLA複合體接觸(例如)以確定該抗原結合蛋白是否選擇性結合該HLA-肽靶。經鑑別之抗原結合蛋白可經人源化。
於一些態樣中，分離抗原結合蛋白包括自表現該抗原結合蛋白之個體分離B細胞。B細胞可用於創建雜交瘤。B細胞亦可用於選殖其CDR中之一或多者。B細胞亦可經永生化，例如，藉由使用EBV轉化。編碼抗原結合蛋白之序列可自永生化B細胞選殖或可直接自免疫個體分離之B細胞選殖。亦可創建包含B細胞之抗原結合蛋白之庫，視情況其中該庫為噬菌體呈現或酵母呈現。
鑑別抗原結合蛋白之另一種方法可包括獲得包含抗原結合蛋白之細胞；使該細胞與包含至少一個HLA-肽靶之HLA-多聚體(例如， 四聚體)接觸；及經由HLA-多聚體與抗原結合蛋白之間之結合鑑別該抗原結合蛋白。
該細胞可為(例如)T細胞，視情況為細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，或例如，自然殺手(NK)細胞。該方法還可包括視情況使用流動式細胞測量術、磁分離或單細胞分離分離該細胞。該方法還可包括將抗原結合蛋白定序。
鑑別抗原結合蛋白之另一種方法可包括獲得包含該抗原結合蛋白之一或多種細胞；利用在至少一種抗原呈遞細胞(APC)上呈遞之至少一個HLA-肽靶激活該一或多種細胞；及經由選擇藉由與至少一個HLA-肽靶相互作用激活之一或多種細胞鑑別該抗原結合蛋白。
該細胞可為(例如)T細胞，視情況為CTL，或例如，NK細胞。該方法還可包括視情況使用流動式細胞測量術、磁分離或單細胞分離分離該細胞。該方法還可包括將抗原結合蛋白定序。
製備單株ABP之方法
可(例如)使用首次由Kohler等人，Nature,1975,256：495-497(其全文以引用的方式併入)所述之雜交瘤方法及/或藉由重組DNA方法(參見例如，美國專利案第4,816,567號，其全文以引用的方式併入)獲得單株ABP。亦可(例如)使用基於噬菌體或酵母之庫獲得單株ABP。參見例如，美國專利案第8,258,082號及第8,691,730號，其全文各者以引用的方式併入。
於雜交瘤方法中，小鼠或其他適宜宿主動物經免疫以引起產生或能產生特異性結合至用於免疫之蛋白質之淋巴細胞。或者，淋巴細胞可於活體外免疫。然後使用適宜融合劑(諸如聚乙二醇)將淋巴細胞與骨 髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞。參見Goding J.W.,Monoclonal ABPs：Principles and Practice第3版(1986)Academic Press,San Diego,CA，其全文以引用的方式併入。
將雜交瘤細胞接種及生長於適宜培養基中，該培養基含有抑制未融合、親本骨髓瘤細胞之生長或生存之一或多種物質。例如，若親本骨髓瘤缺少酵素次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則雜交瘤之培養基通常將包含次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質防止HGPRT-缺陷細胞之生長。
可用骨髓瘤細胞為有效融合，藉由選擇之產生ABP之細胞支持ABP之穩定高水平產生，及為敏感培養基條件(諸如存在或不存在HAT培養基)之彼等。此等中，較佳骨髓瘤細胞系為鼠科骨髓瘤株，諸如源自MOPC-21及MC-11小鼠腫瘤(自索爾克研究所細胞分佈中心(Salk Institute Cell Distribution Center),San Diego,CA可得)之彼等，及SP-2或X63-Ag8-653細胞(自美國模式培養物保藏所，Rockville,MD可得)。亦已描述人類骨髓瘤及小鼠-人類異種骨髓瘤細胞系用於產生人類單株ABP。參見例如，Kozbor,J.Immunol.,1984,133：3001，其全文以引用的方式併入。
於鑑別會產生所需特異性、親和力及/或生物活性之ABP之雜交瘤細胞後，選定純系可藉由限制稀釋程序亞選殖及藉由標準方法生長。參見Goding，見上。出於此目的之適宜培養基包括(例如)D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，雜交瘤細胞可作為動物之腹水腫瘤於活體內生長。
編碼單株ABP之DNA可輕易地分離及使用習知程序(例 如，藉由使用能特異性結合至編碼單株ABP之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)定序。因此，雜交瘤細胞可充當編碼具有所需性質之ABP之DAN的可用來源。一旦分離，可將DNA放置於表現載體中，然後將該等表現載體轉染至宿主細胞(諸如細菌(例如，大腸桿菌)、酵母(例如，酵母(Saccharomyces)或畢赤酵母(Pichia sp.))、COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，或不以其他方式產生ABP之骨髓瘤細胞)中以產生單株ABP。
製備嵌合ABP之方法
製備嵌合ABP之說明性方法述於(例如)美國專利案第4,816,567號及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1984,81：6851-6855中；其全文各者以引用的方式併入。於一些實施例中，嵌合ABP藉由使用重組技術以組合非人類可變區(例如，源自小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類(諸如猴))與人類恆定區來製備。
製備人源化ABP之方法
人源化ABP可藉由利用對應人類ABP序列替換非人類單株ABP之結構部分之大多數或所有來產生。因此，產生雜交分子，其中僅抗原特異性可變，或CDR由非人類序列組成。獲得人源化ABP之方法包括以下中所述之彼等：例如，Winter及Milstein，Nature,1991,349：293-299；Rader等人，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,1998,95：8910-8915；Steinberger等人，J.Biol.Chem.,2000,275：36073-36078；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1989,86：10029-10033；及美國專利案第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,762號及第6,180,370號；其全文各者以引用的方式併入。
製備人類ABP之方法
人類ABP可藉由此項技術中已知之各種技術(例如，藉由使用轉基因動物(例如，人源化小鼠))產生。參見，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1993,90：2551；Jakobovits等人，Nature,1993,362：255-258；Bruggermann等人，Year in Immuno.,1993,7：33；及美國專利案第5,591,669號、第5,589,369號及第5,545,807號；其全文各者以引用的方式併入。人類ABP亦可源自噬菌體呈現庫(參見例如，Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.,1991,227：381-388；Marks等人，J.Mol.Biol.,1991,222：581-597；及美國專利案第5,565,332號及第5,573,905號；其全文各者以引用的方式併入)。人類ABP亦可藉由活體外激活之B細胞產生(參見例如，美國專利案第5,567,610號及第5,229,275號，其全文各者以引用的方式併入)。人類ABP亦可源自基於酵母之庫(參見例如，美國專利案第8,691,730號，其全文以引用的方式併入)。
製備ABP片段之方法
本文中所提供之ABP片段可藉由任何適宜方法製備，該方法包括本文中所述之說明性方法或此項技術中已知之彼等。適宜方法包括重組技術及全ABP之蛋白水解消化。製備ABP片段之說明性方法述於(例如)Hudson等人，Nat.Med.,2003,9：129-134中，其全文以引用的方式併入。製備scFv ABP之方法述於(例如)Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal ABPs，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag,New York，第269至315頁(1994)；WO 93/16185；及美國專利案第5,571,894號及第5,587,458號中；其全文各者以引用的方式併入。
製備替代支架之方法
本文中所提供之替代支架可藉由任何適宜方法製備，該方法包括本文中所述之說明性方法或此項技術中已知之彼等。例如，製備AdnectinsTM之方法述於Emanuel等人，mAbs,2011,3：38-48中，其全文以引用的方式併入。製備iMab之方法述於美國專利公開案第2003/0215914號中，其全文以引用的方式併人。製備Anticalins®之方法述於Vogt及Skerra，Chem.Biochem.,2004,5：191-199中，其全文以引用的方式併入。製備Kunitz域之方法述於Wagner等人，Biochem.& Biophys.Res.Comm.,1992,186：118-1145中，其全文以引用的方式併入。製備硫氧還蛋白肽適體之方法於Geyer及Brent，Meth.Enzymol.,2000,328：171-208(其全文以引用的方式併入)中提供。製備親合體(Affibodies)之方法於Fernandez,Curr.Opinion in Biotech.,2004,15：364-373(其全文以引用的方式併入)中提供。製備DARPin之方法於Zahnd等人，J.Mol.Biol.,2007,369：1015-1028(其全文以引用的方式併入)中提供。製備人泛素之方法於Ebersbach等人，J.Mol.Biol.,2007,372：172-185(其全文以引用的方式併入)中提供。製備四連接素(Tetranectin)之方法於Graversen等人，J.Biol.Chem.,2000,275：37390-37396(其全文以引用的方式併入)中提供。製備艾菲爾親和聚體之方法於Silverman等人，Nature Biotech.,2005,23：1556-1561(其全文以引用的方式併入)中提供。製備Fynomer之方法於Silacci等人，J.Biol.Chem.,2014,289：14392-14398(其全文以引用的方式併入)中提供。替代支架之其他資訊於Binz等人，Nat.Biotechnol.,2005 23：1257-1268；及Skerra,Current Opin.in Biotech.,2007 18：295-304(其全文各者以引用的方式併入)中提供。
製備多特異性ABP之方法
本文中所提供之多特異性ABP可藉由任何適宜方法製備，該方法包括本文中所述之說明性方法或此項技術中已知之彼等。製備共用輕鏈ABP之方法述於Merchant等人，Nature Biotechnol.,1998,16：677-681中，其全文以引用的方式併入。製備四價雙特異性ABP之方法述於Coloma及Morrison，Nature Biotechnol.,1997,15：159-163中，其全文以引用的方式併入。製備雜交免疫球蛋白之方法述於Milstein及Cuello，Nature,1983,305：537-540；及Staerz及Bevan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,83：1453-1457中；其全文各者以引用的方式併入。製備具有杵臼修飾之免疫球蛋白之方法述於美國專利案第5,731,168號中，其全文以引用的方式併入。製備具有靜電修飾之免疫球蛋白之方法於WO 2009/089004(其全文以引用的方式併入)中提供。製備雙特異性單鏈ABP之方法述於Traunecker等人，EMBO J.,1991,10：3655-3659；及Gruber等人，J.Immunol.,1994,152：5368-5374中；其全文各者以引用的方式併入。製備單鏈ABP(其連接子長度可變化)之方法述於美國專利案第4,946,778號及第5,132,405號中，其全文各者以引用的方式併入。製備雙抗體之方法述於Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90：6444-6448中，其全文以引用的方式併入。製備三抗體及四抗體之方法述於Todorovska等人，J.Immunol.Methods,2001,248：47-66中，其全文以引用的方式併入。製備三特異性F(ab’)3衍生物之方法述於Tutt等人，J.Immunol.,1991,147：60-69中，其全文以引用的方式併入。製備交聯ABP之方法述於美國專利案第4,676,980號；Brennan等人，Science,1985,229：81-83；Staerz等人，Nature,1985,314：628-631；及EP 0453082 中；其全文各者以引用的方式併入。製備由白胺酸拉鏈組裝之抗原結合域之方法述於Kostelny等人，J.Immunol.,1992,148：1547-1553中，其全文以引用的方式併入。經由DNL方法製備ABP之方法述於美國專利案第7,521,056號、第7,550,143號、第7,534,866號及第7,527,787號中；其全文各者以引用的方式併入。製備ABP及非ABP分子之雜交體之方法述於WO 93/08829中，其全文以引用的方式併入，例如，此等ABP。製備DAF ABP之方法述於美國專利公開案第2008/0069820號中，其全文以引用的方式併入。經由還原及氧化製備ABP之方法述於Carlring等人，PLoS One,2011,6：e22533中，其全文以引用的方式併入。製備DVD-IgsTM之方法述於美國專利案第7,612,181號中，其全文以引用的方式併入。製備DARTsTM之方法述於Moore等人，Blood,2011,117：454-451中，其全文以引用的方式併入。製備DuoBodies®之方法述於Labrijn等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2013,110：5145-5150；Gramer等人，mAbs,2013,5：962-972；及Labrijn等人，Nature Protocols,2014,9：2450-2463中；其全文各者以引用的方式併入。製備包含融合至IgG之CH3之C端之scFv的ABP述於Coloma及Morrison，Nature Biotechnol.,1997,15：159-163，其全文以引用的方式併入。製備ABP(其中Fab分子連接至免疫球蛋白之恆定區)之方法述於Miler等人，J.Immunol.,2003,170：4854-4861中，其全文以引用的方式併入。製備CovX-Bodies之方法述於Doppalapudi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2010,107：22611-22616中，其全文以引用的方式併入。製備Fcab ABP之方法述於Wozniak-Knopp等人，Protein Eng.Des.Sel.,2010,23：289-297中，其全文以引用的方式併入。製備TandAb® ABP之方法述於Kipriyanov等人，J.Mol.Biol.,1999,293：41-56及 Zhukovsky等人，Blood,2013,122：5116中，其全文各者以引用的方式併入。製備串聯Fab之方法述於WO 2015/103072中，其全文以引用的方式併入。製備ZybodiesTM之方法述於LaFleur等人，mAbs,2013,5：208-218中，其全文以引用的方式併入。
製備變異體之方法
可使用任何適宜方法將可變性引入編碼ABP之多核苷酸序列中，該方法包括易錯PCR、鏈替換及寡核苷酸定向誘變，諸如三核苷酸定向誘變(TRIM)。於一些態樣中，若干CDR殘基(例如，每次4至6個殘基)經隨機化。涉及抗原結合之CDR殘基可經特異性鑑別，例如，使用丙胺酸掃描誘變或建模。特定言之，CDR-H3及CDR-L3為經常成為靶用於突變。
可使用引用多樣性至可變區及/或CDR以產生二級庫。然後篩選該二級庫以識別具有改良親和力之ABP變異體。已(例如)於Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology,2001,178：1-37(其全文以引用的方式併入)中描述藉由自二級庫構築及再選擇之親和力成熟。
工程改造具有ABP之細胞之方法
亦提供表現ABP(包括包含抗體、CAR及TCR之受體)及產生表現此等ABP之經遺傳工程改造之細胞之方法、核酸、組合物及套組。遺傳工程改造一般涉及引入編碼重組或經工程改造之組分之核酸至細胞中，諸如藉由逆轉錄病毒轉導、轉染或轉形。
於一些實施例中，基因轉移藉由以下實現：首先刺激細胞，諸如藉由將其與誘導反應(諸如增生、生存及/或激活)之刺激物組合，例如，如藉由細胞激素或激活標記之表現所量測，接著轉導經激活細胞， 及於培養物中擴增至足以臨床應用之數量。
於一些情況下，刺激因子(例如，淋巴因子或細胞激素)之過度表現可對個體為毒性。因此，於一些情況下，經工程改造之細胞包括造成細胞對活體內陰性選擇易感之基因片段，諸如在過繼免疫療法之投與後。例如，於一些態樣中，細胞經工程改造使得其可由於投與其之患者之活體內條件之變化而被消除。陰性可選擇表現型可由插入基因引起，該基因賦予對所投與藥劑(例如，化合物)之敏感性。陰性可選擇基因包括賦予更昔洛韋(ganciclovir)敏感性之單純皰疹(Herpes simplex)病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人，Cell II：223,1977)、細胞次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、細胞腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(APRT)基因、細菌胞嘧啶脫胺酶(Mullen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：33(1992))。
於一些態樣中，細胞進一步經工程改造以促進細胞激素或其他因子之表現。引入經遺傳工程改造之組分(例如，抗原受體，例如，CAR)之各種方法係熟知且可利用所提供之方法及組合物使用。示例性方法包括轉移編碼受體之核酸，包括經由病毒(例如，逆轉錄病毒或慢病毒)轉導、轉位子及電穿孔。
於一些實施例中，使用重組感染病毒粒子，諸如，例如，源自類人猿病毒40(SV40)、腺病毒、腺相關病毒(AAV)之載體將重組核酸轉移至細胞中。於一些實施例中，使用重組慢病毒載體或逆轉錄病毒載體(諸如γ-逆轉錄病毒載體)將重組核酸轉移至T細胞中(參見，例如，Koste等人，(2014)Gene Therapy 2014年4月.3.doi：10.1038/gt.2014.25；Carlens等人，(2000)Exp Hematol 28(10)：1137- 46；Alonso-Camino等人，(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等人，Trends Biotechnol.2011年11月.29(11)：550-557)。
於一些實施例中，逆轉錄病毒載體具有長末端重複序列(LTR)，例如，源自以下之逆轉錄病毒載體：莫洛尼(Moloney)氏鼠科白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠科胚胎幹細胞病毒(MESV)、鼠科幹細胞病毒(MSCV)、脾竈形成病毒(SFFV)或腺相關病毒(AAV)。大多數逆轉錄病毒載體源自鼠科逆轉錄病毒。於一些實施例中，逆轉錄病毒包括源自任何鳥類或哺乳動物細胞來源之彼等。逆轉錄病毒通常係雙向性，意指其能感染若干物種(包括人類)之宿主細胞。於一實施例中，待表現之基因替代逆轉錄病毒gag、pol及/或env序列。已描述許多說明性逆轉錄病毒系統(例如，美國專利案第5,219,740號、第6,207,453號、第5,219,740號；Miller及Rosman(1989)BioTechniques 7：980-990；Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy 1：5-14；Scarpa等人，(1991)Virology 180：849-852；Burns等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8033-8037；及Boris-Lawrie及Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3：102-109)。
慢病毒轉導之方法係已知。示例性方法述於(例如)Wang等人，(2012)J.Immunother.35(9)：689-701；Cooper等人，(2003)Blood.101：1637-1644；Verhoeyen等人，(2009)Methods Mol Biol.506：97-114；及Cavalieri等人，(2003)Blood.102(2)：497-505中。
於一些實施例中，重組核酸經由電穿孔轉移至T細胞中(參見，例如，Chicaybam等人，(2013)PLoS ONE 8(3)：e60298；Van Tedeloo等人，(2000)Gene Therapy 7(16)：1431-1437；及Roth等人， (2018)Nature 559：405-409)。於一些實施例中，重組核酸經由轉位轉移至T細胞中(參見，例如，Manuri等人，(2010)Hum Gene Ther 21(4)：427-437；Sharma等人，(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；及Huang等人，(2009)Methods Mol Biol 506：115-126)。將遺傳物質引入免疫細胞中及於其中表現之其他方法包括磷酸鈣轉染(例如，如於Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York.N.Y.中所述)、原生質體融合、陽離子脂質體介導之轉染、鎢離子促進之微粒轟擊(Johnston,Nature,346：776-777(1990))、及磷酸鍶DNA共沉澱(Brash等人，Mol.Cell Biol.,7：2031-2034(1987))。
轉移編碼重組產物之核酸之其他方法及載體為(例如)於國際專利申請公開案號：WO2014055668及美國專利案第7,446,190號中所述之彼等。
在額外核酸中，例如，用於引入之基因為提高治療功效之彼等，諸如藉由促進經轉染細胞之存活力及/或功能；提供用於選擇及/或評價細胞之遺傳標記之基因(諸如)以評估活體內生存或局域化；提高安全性之基因，例如，藉由使細胞對活體內陰性選擇易感，如由Lupton S.D.等人，Mol.及Cell Biol.,11：6(1991)；及Riddell等人，Human Gene Therapy 3：319-338(1992)所述；亦參見Lupton等人之公開案PCT/US91/08442及PCT/US94/05601，該等公開案描述源自顯性陽性可選擇標記與陰性可選擇標記融合之雙功能可選擇融合基因之用途。參見，例如Riddell等人，美國專利案第6,040,177號，第14至17行。
製備經工程改造之細胞
於一些實施例中，經工程改造之細胞之製備包括一或多個 培養及/或製備步驟。用於引入HLA-肽-ABP(例如，TCR或CAR)之細胞可自樣品(諸如生物樣品，例如，獲自或源自個體者)分離。於一些實施例中，自其分離細胞之個體為患有疾病或病狀或需要細胞療法或將被投與細胞療法者。於一些實施例中，個體為需要特殊治療干預(諸如造成細胞經分離、處理及/或工程改造之過繼細胞療法)之人類。
因此，於一些實施例中，該等細胞為原代細胞，例如，原代人類細胞。樣品包括組織、流體及直接自個體取得之其他樣品，以及由一或多個處理步驟(諸如分離、離心、遺傳改造(例如，利用病毒載體轉導)、洗滌及/或培育)產生之樣品。生物樣品可為直接自生物來源獲得之樣品或經處理之樣品。生物樣品包括(但不限於)體液(諸如血液、血漿、血清、腦脊髓液、滑液、尿液及汗)、組織及器官樣品(包括由此衍生之經處理樣品)。
於一些態樣中，自其衍生或分離細胞之樣品為血液或源自血液之樣品，或為或源自血球分離或白血球分離產品。示例性樣品包括全血、外周血單核細胞(PBMC)、白血球、骨髓、胸腺、組織活組織檢查、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸相關類淋巴組織、黏膜相關類淋巴組織、脾、其他類淋巴組織、肝、肺、胃、腸、結腸、腎、胰、乳、骨、前列腺、子宮頸、睾丸、卵巢、扁桃體、或其他器官及/或由此衍生之細胞。在細胞療法(例如)過繼細胞療法之情況下，樣品包括來自自體同源及同種異體源之樣品。
於一些實施例中，該等細胞源自細胞系，例如，T細胞系。於一些實施例中，該等細胞獲自異種基因源，例如，獲自小鼠、大鼠、非人類靈長類或豬。
於一些實施例中，細胞之分離包括一或多個製備及/或基於非親和力之細胞分離步驟。於一些實例中，將細胞洗滌、離心及/或在一或多種試劑存在下培育(例如)以移除非所需組分，將所需組分濃化，裂解或移除對特定試劑敏感之細胞。於一些實例中，基於一或多種性質(諸如，密度、黏附性、尺寸、對特定組分之敏感性及/或抗性)將細胞分離。
於一些實例中，例如，藉由血球分離或白血球分離獲得來自個體之循環血液之細胞。於一些態樣中，樣品含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒性細胞、B細胞、其他有核白血球、紅血球及/或血小板，及於一些態樣中，含有除了紅血球及血小板以外之細胞。
於一些實施例中，將自個體收集之血球洗滌(例如)以移除血漿部分及將細胞放置於適宜緩衝液或介質中用於後續處理步驟。於一些實施例中，將細胞用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌。於一些實施例中，洗滌溶液缺失鈣及/或鎂及/或許多或所有二價陽離子。於一些態樣中，根據製造商之說明，藉由半自動「流過」離心機(例如，Cobe 2991細胞處理器，Baxter)完成洗滌步驟。於一些態樣中，根據製造商之說明，藉由正切流動過濾(TFF)完成洗滌步驟。於一些實施例中，於洗滌後，將細胞再懸浮於各種生物相容性緩衝液(諸如，例如，無Ca++/Mg++之PBS)中。於某些實施例中，移除血球樣品之組分及將細胞直接再懸浮於培養基中。
於一些實施例中，方法包括基於密度之細胞分離方法，諸如藉由將紅血球裂解及通過Percoll或Ficoll梯度離心來製備來自外周血之白血球。
於一些實施例中，分離方法包括基於細胞中一或多個特異性分子(諸如表面標記，例如，表面蛋白質、細胞內標記或核酸)之表現或 存在分離不同細胞類型。於一些實施例中，可使用任何已知基於此等標記之分離方法。於一些實施例中，分離為基於親和力或免疫親和力之分離。例如，於一些態樣中，分離包括基於細胞表現或一或多個標記(通常細胞表面標記)之表現水平分離細胞及細胞群體，例如，藉由利用特異性結合至此等標記之抗體或結合搭檔培育，一般接著洗滌步驟及自不結合至抗體或結合搭檔之彼等細胞分離結合抗體或結合搭檔之細胞。
此等分離步驟可基於陽性選擇(其中保留結合試劑之細胞用於進一步使用)，及/或陰性選擇(其中保留不結合至抗體或結合搭檔之細胞)。於一些實例中，保留兩種級分供進一步使用。於一些態樣中，在特異性鑑別異種群體中之細胞類型之抗體不可得，使得分離最好基於藉由細胞而非所需群體表現之標記進行之情況下，陰性選擇可係特別有用。
分離不必導致特定細胞群體或表現特定標記之細胞之100%濃化或移除。例如，特定類型之細胞(諸如表現標記之彼等)之陽性選擇或濃化係指增加此等細胞之數目或百分比，但是不必導致不表現標記之細胞之完全不存在。同樣，陰性選擇，特定類型之細胞(諸如表現標記之彼等)之移除或耗盡係指減少此等細胞之數目或百分比，但是不必導致所有此等細胞之完全移除。
於一些實例中，進行多輪分離步驟，其中來自一個步驟之經陽性或陰性選擇之級分經受另一分離步驟，諸如後續陽性或陰性選擇。於一些實例中，單一分離步驟可耗盡同時表現多個標記之細胞，諸如藉由利用複數個抗體或結合搭檔(各者對靶向陰性選擇之標記特異性)培育細胞。同樣，可藉由利用在各種細胞類型上表現之複數個抗體或結合搭檔培育細胞同時陽性選擇多個細胞類型。
例如，於一些態樣中，藉由陽性或陰性選擇技術分離特異性T細胞亞群，諸如陽性或表現高水平之一或多個表面標記之細胞，例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、及/或CD45RO+ T細胞。
例如，可使用CD3/CD28共軛磁珠(例如，DYNABEADS.RTM.M-450 CD3/CD28 T細胞擴增劑)陽性選擇CD3+、CD28+ T細胞。
於一些實施例中，藉由濃化特定細胞群體(藉由陽性選擇)或耗盡特定細胞群體(藉由陰性選擇)進行分離。於一些實施例中，陽性或陰性選擇藉由利用特異性結合至各自在經陽性或陰性選擇之細胞上表現或以相對較高水平(標記高)表現(標記+)之一或多個表面標記之一或多種抗體或其他結合劑培育細胞來實現。
於一些實施例中，T細胞藉由陰性選擇在非T細胞(諸如B細胞、單核細胞或其他白血球(諸如CD14))上表現之標記自外周血單核細胞(PBMC)樣品分離。於一些態樣中，使用CD4+或CD8+選擇步驟分離CD4+輔助細胞及CD8+細胞毒性T細胞。可藉由陽性或陰性選擇在一或多個初始、記憶及/或效應T細胞亞群上表現或相對較高水平表現之標記將此等CD4+及CD8+群體進一步分類成亞群。
於一些實施例中，CD8+細胞經進一步濃化或耗盡初始、中樞記憶、效應記憶及/或中樞基因幹細胞，諸如藉由基於與各自亞群相關之表面抗原之陽性或陰性選擇。於一些實施例中，進行中樞記憶T(TCM)細胞之濃化以增加功效，諸如以於投與後改善長期生存、擴增及/或移植物移入，於一些態樣中，該濃化於此等亞群中係特別穩健的。參見 Terakura等人，(2012)Blood.1：72-82；Wang等人，(2012)J Immunother.35(9)：689-701。於一些實施例中，組合經TCM濃化之CD8+ T細胞及CD4+ T細胞進一步增強功效。
於實施例中，記憶T細胞存在於CD8+外周血淋巴細胞之CD62L+及CD62L-子集二者中。外周血單核細胞(PBMC)可經濃化或耗盡CD62L-CD8+及/或CD62L+CD8+部分，諸如使用抗CD8及抗CD62L抗體。
於一些實施例中，中樞記憶T(TCM)細胞之濃化係基於CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、及/或CD 127之陽性或高表面表現；於一些態樣中，其係基於表現或高度表現CD45RA及/或粒酶B之細胞之陰性選擇。於一些態樣中，對TCM細胞濃化之CD8+群體之分離藉由耗盡表現CD4、CD14、CD45RA之細胞及對表現CD62L之細胞之陽性選擇或濃化來進行。於一態樣中，利用基於CD4表現選擇之細胞之陰性級分開始進行中樞記憶T(TCM)細胞之濃化，使其經受基於CD14及CD45RA之表現之陰性選擇及基於CD62L之陽性選擇。於一些態樣中，同時進行此等選擇及於其他態樣中，以任何順序依序進行此等選擇。於一些態樣中，於製備CD8+細胞群體或亞群中使用之基於相同CD4表現之選擇步驟亦用於產生CD4+細胞群體或亞群，使得來自基於CD4-之分離之陽性及陰性級分二者保留且用於方法之後續步驟中，視情況於一或多個其他陽性或陰性選擇步驟後。
於一特定實例中，使PBMC樣品或其他白血球樣品經受CD4+細胞之選擇，其中保留陽性及陰性級分。然後使陰性級分經受基於CD14及CD45RA或ROR1之表現之陰性選擇，及基於中樞記憶T細胞(諸如 CD62L或CCR7)之標記特徵之陽性選擇，其中以任何順序進行該等陽性及陰性選擇。
藉由識別具有細胞表面抗原之細胞群體將CD4+ T輔助細胞分類成初始、中樞記憶及效應細胞。CD4+淋巴細胞可藉由標準方法獲得。於一些實施例中，初始CD4+ T淋巴細胞為CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+ T細胞。於一些實施例中，中樞記憶CD4+細胞為CD62L+及CD45RO+。於一些實施例中，效應CD4+細胞為CD62L-及CD45RO-。
於一實例中，為藉由陰性選擇濃化CD4+細胞，單株抗體混合物通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。於一些實施例中，抗體或結合搭檔結合至固體擔體或基質(諸如磁珠或順磁珠)以允許分離細胞用於陽性及/或陰性選擇。例如，於一些實施例中，使用免疫磁性(或親和力磁性)分離技術將細胞及細胞群體分離(separated)或分離(isolated)(於Methods in Molecular Medicine，第58卷：Metastasis Research Protocols，第2卷：Cell Behavior In Vitro and In Vivo，第17至25頁，由：S.A.Brooks及U.Schumacher編輯Humana Press Inc.,Totowa,N.J.中評論)。
於一些態樣中，將待分離之細胞之樣品或組合物用小的、可磁化或磁回應物質(諸如磁回應粒子或微粒，諸如順磁珠(例如，諸如Dynabead或MACS珠))分離。磁回應物質(例如，粒子)一般直接或間接連接至結合搭檔(例如，特異性結合至分子(例如，在期望分離(例如，期望陰性或陽性選擇)之細胞或細胞群體上呈遞之表面標記)之抗體)。
於一些實施例中，磁性粒子或磁珠包含結合至特定結合成 員(諸如抗體或其他結合搭檔)之磁回應物質。存在許多熟知磁分離方法中使用之磁回應物質。適宜磁性粒子包括於Melday，美國專利案第4,452,773號中及於歐洲專利規範EP 452342 B中所述之彼等，其以引用的方式併入本文中。膠體大小粒子，諸如於Owen美國專利案第4,795,698號及Liberti等人，美國專利案第5,200,084號中所述之彼等為其他實例。
一般在抗體或結合搭檔或分子(諸如二級抗體或特異性結合至此等抗體或結合搭檔(其連接至磁性粒子或磁珠)之其他試劑)特異性結合至細胞表面分子(若在樣品內之細胞上呈遞)之條件下進行培育。
於一些態樣中，將樣品放置於磁場，及具有磁回應或其上連接之可磁化粒子之彼等細胞將被吸引至磁鐵及自未經標記之細胞分離。用於陽性選擇，保留被吸引至磁鐵之細胞；用於陰性選擇，保留未被吸引之細胞(未經標記之細胞)。於一些態樣中，在相同選擇步驟期間進行陽性及陰性選擇之組合，其中保留陽性及陰性級分及進一步處理或經受其他分離步驟。
於某些實施例中，將磁回應粒子於初級抗體或其他結合搭檔、二級抗體、凝集素(lectin)、酵素或鏈黴抗生物素中塗覆。於某些實施例中，經由對一或多種標記特異性之初級抗體之塗層將磁性粒子連接至細胞。於某些實施例中，將細胞而非珠用初級抗體或結合搭檔標記，及然後添加經細胞類型特異性二級抗體或其他結合搭檔(例如，鏈黴抗生物素)塗覆之磁性粒子。於某些實施例中，將經鏈黴抗生物素塗覆之磁性粒子與經生物素化之初級或二級抗體聯合使用。
於一些實施例中，將磁回應粒子連接至待隨後培育、培養及/或工程改造之細胞；於一些態樣中，將粒子連接至細胞用於對患者投 與。於一些實施例中，將可磁化或磁回應粒子自細胞移除。自細胞移除可磁化粒子之方法係已知且包括(例如)使用競爭非標記抗體、可磁化粒子或偶聯至可裂解連接子之抗體等。於一些實施例中，可磁化粒子係可生物降解。
於一些實施例中，基於親和力之選擇係經由磁激活之細胞分選(MACS)(Miltenyi Biotech,Auburn,Calif.)。磁激活之細胞分選(MACS)系統能高純度選擇具有其上連接之磁化粒子之細胞。於某些實施例中，MACS以一種模式操作，其中於施加外部磁場後，將非靶及靶物種依序溶離。即，將連接至磁化粒子之細胞保持在位置，同時將未連接之物種溶離。然後，於完成此第一個溶離步驟後，將陷留於磁場中及防止被溶離之物種以某種方式釋放，使得其可經溶離及回收。於某些實施例中，非靶細胞經標記及自細胞之異種群體耗盡。
於某些實施例中，使用進行該等方法之分離、細胞製備、分離、處理、培育、培養及/或調配步驟中之一或多者之系統、設備或裝置進行分離(isolation)或分離(separation)。於一些態樣中，使用系統於封閉或無菌環境中進行此等步驟各者(例如)以最小化誤差、使用者操作及/或污染。於一實例中，該系統為如於國際專利申請公開案號WO2009/072003或US 20110003380 A1中所述之系統。
於一些實施例中，系統或裝置於積體或獨立系統中及/或以自動化或可程式化方式進行分離、處理、工程改造及調配步驟中之一或多者(例如，所有)。於一些態樣中，系統或裝置包括與系統或裝置通訊之電腦及/或電腦程式，該電腦及/或電腦程式允許使用者計畫、控制、評估結果及/或調整處理、分離、工程改造及調配步驟之各種態樣。
於一些態樣中，使用CliniMACS系統(Miltenyi Biotec)進行分離及/或其他步驟，例如，細胞於封閉且無菌系統中以臨床級水平自動分離。元件可包括積體微電腦、磁分離裝置、蠕動泵及各種夾緊閥。於一些態樣中，積體電腦控制儀器之所有元件及指導系統以標準化序列進行重複程序。於一些態樣中，磁分離裝置包括可移動永久磁鐵及選擇管柱之支架。蠕動泵控制通過管組之流率，及連同夾緊閥確保通過系統之緩衝液之可控流動及細胞之連續懸浮。
於一些態樣中，該CliniMACS系統使用抗體偶聯之可磁化粒子，該等粒子以無菌、非熱原溶液形式供應。於一些實施例中，於用磁性粒子標記細胞後，將細胞洗滌以移除過量粒子。然後將細胞製備袋連接至管組，該管組繼而連接至含有緩衝液之袋及細胞收集袋。該管組由包含預管柱及分離管柱之預組裝無菌管組成，且僅供一次使用。於分離程序開始後，系統自動施加細胞樣品至分離管柱。將經標記細胞保留於管柱內，同時將未經標記細胞藉由一系列洗滌步驟移除。於一些實施例中，利用本文中所述方法使用之細胞群體未經標記且未保留於管柱中。於一些實施例中，利用本文中所述方法使用之細胞群體經標記且保留於管柱中。於一些實施例中，於移除磁場後，利用本文中所述方法使用之細胞群體自管柱溶離，及於細胞收集袋中收集。
於某些實施例中，使用CliniMACS Prodigy系統(Miltenyi Biotec)進行分離及/或其他步驟。於一些態樣中，該CliniMACS Prodigy系統裝備有允許自動洗滌及藉由離心分離細胞之細胞處理裝置。該CliniMACS Prodigy系統亦可包含車載攝像機及影像識別軟體，該軟體藉由識別源細胞產品之宏觀層確定最佳化細胞分離終點。例如，外周血可自 動分離成紅血球、白血球及血漿層。該CliniMACS Prodigy系統亦可包含積體細胞培養室，該室實現細胞培養協定，諸如，例如，細胞分化及擴增、抗原負載及長期細胞培養。輸入埠可允許介質之無菌移除及補充及可使用積體顯微鏡監測細胞。參見，例如，Klebanoff等人，(2012)J Immunother.35(9)：651-660，Terakura等人，(2012)Blood.1：72-82，及Wang等人，(2012)J Immunother.35(9)：689-701。
於一些實施例中，本文中所述之細胞群體經由流動式細胞測量術收集及濃化(或耗盡)，其中於流體流中攜帶針對多個細胞表面標記染色之細胞。於一些實施例中，本文中所述之細胞群體經由製備級螢光激活之細胞分選(FACS)收集及濃化。於某些實施例中，本文中所述之細胞群體藉由使用微電機系統(MEMS)晶片與基於FACS之檢測系統組合來收集及濃化(或耗盡)(參見，例如，WO 2010/033140，Cho等人，(2010)Lab Chip 10,1567-1573；及Godin等人，(2008)J Biophoton.1(5)：355-376)。於兩種情況下，可將細胞用多個標記標記，允許經良好限定之T細胞子集在高純度下分離。
於一些實施例中，將抗體或結合搭檔用一或多個可檢測標記標記以促進分離用於陽性及/或陰性選擇。例如，分離可基於結合至螢光標記之抗體。於一些實例中，於流體流中進行基於對一或多個細胞表面標記特異性之抗體或其他結合搭檔之結合之細胞的分離，諸如藉由螢光激活之細胞分選(FACS)，包含製備級(FACS)及/或微電機系統(MEMS)晶片，例如，與流動式細胞測量術檢測系統組合。此等方法允許同時基於多個標記之陽性及陰性選擇。
於一些實施例中，製備方法包括冷凍步驟，例如，在分 離、培育及/或工程改造之前或之後將細胞低溫保存。於一些實施例中，冷凍及後續解凍步驟移除粒細胞及某種程度上，細胞群體中之單核細胞。於一些實施例中，將細胞懸浮於冷凍溶液中(例如，於洗滌步驟後)以移除血漿及血小板。於一些態樣中，可使用各種已知冷凍溶液及參數中之任一者。一個實例涉及使用含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白(HSA)之PBS或其他適宜細胞冷凍介質。然後可將此用介質1：1稀釋使得DMSO及HAS之最終濃度各自為10%及4%。其他實例包括Cryostor®、CTL-CryoTM ABC冷凍介質及類似者。然後將細胞以1度/分鐘之速率冷卻至-80℃及儲存於液氮儲存罐之汽相中。
於一些實施例中，所提供之方法包括栽培(cultivation)、培育、培養(culture)及/或遺傳工程改造步驟。例如，於一些實施例中，提供培育及/或工程改造經耗盡之細胞群體及引發培養之組合物之方法。
因此，於一些實施例中，細胞群體於引發培養之組合物中培育。培育及/或工程改造可於培養容器(諸如裝置、室、孔、管柱、管、管組、閥、小瓶、培養皿、袋或用於培養細胞之其他容器)中進行。
於一些實施例中，在遺傳工程改造之前或與遺傳工程改造相關培育及/或培養細胞。培育步驟可包括培養(culture)、栽培(cultivation)、刺激、激活及/或繁殖。於一些實施例中，在刺激條件或刺激劑之存在下，培育組合物或細胞。此等條件包括經設計以誘導群體中細胞之增生、擴增、激活及/或生存，以模擬抗原暴露，及/或以準備好細胞用於遺傳工程改造(諸如用於引入重組抗原受體)之彼等。
該等條件可包括特定介質、溫度、氧含量、二氧化碳含量、時間、藥劑(例如，營養物、胺基酸、抗生素、離子及/或刺激因子(諸 如細胞激素、趨化因子、抗原、結合搭檔、融合蛋白、重組可溶受體)及經設計以激活細胞之任何其他藥劑)中之一或多者。
於一些實施例中，該等刺激條件或藥劑包括能激活TCR複合體之細胞內訊號域之一或多種藥劑(例如，配位體)。於一些態樣中，該藥劑打開或啟動T細胞中之TCR/CD3細胞內訊號級聯。此等藥劑可包括抗體(諸如對TCR組分特異性之彼等)及/或共刺激受體(例如，抗CD3、抗CD28，例如，結合至固體擔體(諸如珠)及/或一或多種細胞激素)。視情況，擴增方法還可包括添加抗CD3及/或抗CD28抗體至培養基(例如，以至少約0.5ng/ml之濃度)之步驟。於一些實施例中，刺激劑包括IL-2及/或IL-15，例如，至少約10單位/mL之IL-2濃度。
於一些態樣中，根據諸如於頒與Riddell等人之美國專利案第6,040,177號，Klebanoff等人，(2012)J Immunother.35(9)：651-660，Terakura等人，(2012)Blood.1：72-82，及/或Wang等人，(2012)J Immunother.35(9)：689-701中所述之彼等之技術進行培育。
於一些實施例中，藉由添加至引發培養之組合物飼養細胞，諸如不分裂外周血單核細胞(PBMC)(例如，使得針對待擴增之起始群體中之各T淋巴細胞，所得細胞群體含有至少約5、10、20或40或更多個PBMC飼養細胞)；及培育培養物(例如，持續足以擴增T細胞之數目之時間)將T細胞擴增。於一些態樣中，該不分裂飼養細胞可包括γ-照射PBMC飼養細胞。於一些實施例中，將PBMC用約3000至3600拉德(rad)之範圍之γ射線照射以防止細胞分裂。於一些實施例中，將PBMC飼養細胞用絲裂黴素(Mytomicin)C滅活。於一些態樣中，在添加T細胞群體之前，將飼養細胞添加至培養基中。
於一些實施例中，刺激條件包括適於人類T淋巴細胞生長之溫度，例如，至少約25℃，一般至少約30℃，及一般在或約37℃。視情況，培育還可包括添加不分裂EBV轉化之類淋巴母細胞(LCL)作為飼養細胞。LCL可用約6000至10,000拉德之範圍之γ射線照射。於一些態樣中，以任何適宜量(諸如至少約10：1之LCL飼養細胞與初始T淋巴細胞之比率)提供LCL飼養細胞。
於實施例中，抗原特異性T細胞(諸如抗原特異性CD4+及/或CD8+ T細胞)藉由利用抗原刺激初始或抗原特異性T淋巴細胞來獲得。例如，可藉由自感染個體分離T細胞及用相同抗原刺激活體外細胞，對巨細胞病毒抗原產生抗原特異性T細胞系或純系。
檢定
可使用此項技術中已知之各種檢定識別及表徵本文中所提供之HLA-肽ABP。
結合、競爭及抗原決定基定位(Mapping)檢定
本文中所提供之ABP之特異性抗原結合活性可藉由任何適宜方法評價，該方法包括使用SPR、BLI、RIA及MSD-SET，如本發明中其他地方所述。此外，抗原結合活性可藉由ELISA檢定使用流動式細胞測量術及/或西方墨點(Western blot)檢定評價。
用於量測兩種ABP之間，或ABP與另一種分子(例如，HLA-肽(諸如TCR)之一或多種配位體)之間之競爭之檢定述於本發明中其他地方及例如，於Harlow及Lane，ABPs：A Laboratory Manual ch.14,1988,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y中，其全文以引用的方式併入。
用於定位本文中所提供之ABP結合之抗原決定基之檢定述於(例如)Morris「Epitope Mapping Protocols,」，Methods in Molecular Biology第66卷，1996,Humana Press,Totowa,N.J中，其全文以引用的方式併入。於一些實施例中，藉由肽競爭測定抗原決定基。於一些實施例中，藉由質譜法測定抗原決定基。於一些實施例中，藉由誘變測定抗原決定基。於一些實施例中，藉由結晶學測定抗原決定基。
效應功能之檢定
可使用此項技術中已知之各種活體外及活體內檢定評價利用本文中所提供之ABP及/或細胞處理後之效應功能，該等檢定包括於Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol.,1991,9：457-492；美國專利案第5,500,362號、第5,821,337號；Hellstrom等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,1986,83：7059-7063；Hellstrom等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,1985,82：1499-1502；Bruggemann等人，J.Exp.Med.,1987,166：1351-1361；Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,1998,95：652-656；WO 2006/029879；WO 2005/100402；Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods,1996,202：163-171；Cragg等人，Blood,2003,101：1045-1052；Cragg等人，Blood,2004,103：2738-2743；及Petkova等人，Int’l.Immunol.,2006,18：1759-1769中所述之彼等；其全文各者以引用的方式併入。
醫藥組合物
本文中所提供之ABP、細胞或HLA-肽靶可於任何適宜醫藥組合物中調配及藉由任何適宜投與途徑投與。適宜投與途徑包括(但不限於)動脈內、皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、鼻、非經腸、肺及皮下 途徑。
醫藥組合物可包含一或多種醫藥賦形劑。可使用任何適宜醫藥賦形劑，及一般技術者能選擇適宜醫藥賦形劑。因此，以下提供之醫藥賦形劑意欲係說明性而非限制性。額外醫藥賦形劑包括(例如)於Handbook of Pharmaceutical Excipients，Rowe等人(編輯)第6版(2009)(其全文以引用的方式併入)中所述之彼等。
於一些實施例中，醫藥組合物包含消泡劑。可使用任何適宜消泡劑。於一些態樣中，消泡劑係選自醇、醚、油、蠟、矽氧烷、表面活性劑及其組合。於一些態樣中，消泡劑係選自礦物油、植物油、乙烯雙硬脂醯胺、石蠟、酯蠟、脂肪醇蠟、長鏈脂肪醇、脂肪酸皂、脂肪酸酯、矽乙二醇、氟矽氧烷、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物、聚二甲基矽氧烷-二氧化矽、醚、辛醇、山梨聚糖三油酸酯、乙醇、2-乙基己醇、二甲基聚矽氧烷、油醇、聚二甲矽氧烷及其組合。
於一些實施例中，醫藥組合物包含共溶劑。共溶劑之說明性實例包括乙醇、聚(乙烯)乙二醇、丁二醇、二甲基乙醯胺、甘油、丙二醇及其組合。
於一些實施例中，醫藥組合物包含緩衝劑。緩衝劑之說明性實例包括乙酸鹽、硼酸鹽、碳酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、氫氧化物、二乙醇胺、單乙醇胺、甘胺酸、蛋胺酸、瓜爾膠、麩胺酸單鈉及其組合。
於一些實施例中，醫藥組合物包含載劑或填料。載體或填料之說明性實例包括乳糖、麥芽糊精、甘露醇、山梨醇、殼聚糖、硬脂酸、黃原膠及其組合。
於一些實施例中，醫藥組合物包含表面活性劑。表面活性劑之說明性實例包括d-α生育酚、氯化苄烷銨、氯化苄乙氧銨、溴棕三甲銨(cetrimide)、氯化十六烷基吡啶、多庫酯鈉(docusate sodium)、山崳酸甘油酯、單油酸甘油酯、月桂酸、聚乙二醇(macrogol)15羥基硬脂酸酯、肉豆寇醇、磷脂、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧甘油酯、月桂基硫酸鈉、山梨聚糖酯、維生素E聚乙烯(乙二醇)琥珀酸酯及其組合。
於一些實施例中，醫藥組合物包含抗結塊劑。抗結塊劑之說明性實例包括磷酸鈣(三元)、羥甲基纖維素、羥丙基纖維素、氧化鎂及其組合。
可與醫藥組合物使用之其他賦形劑包括(例如)白蛋白、抗氧化劑、抗細菌劑、抗真菌劑、生物可吸收聚合物、螯合劑、可控釋放劑、稀釋劑、分散劑、溶解增強劑、乳化劑、凝膠劑、軟膏基、滲透增強劑、防腐劑、增溶劑、溶劑、穩定劑、糖及其組合。此等藥劑各者之特定實例述於(例如)Handbook of Pharmaceutical Excipients,Rowe等人(編輯)第6版(2009),The Pharmaceutical Press中，其全文以引用的方式併入。
於一些實施例中，醫藥組合物包含溶劑。於一些態樣中，該溶劑為鹽水溶液，諸如無菌等滲鹽水溶液或右旋糖溶液。於一些態樣中，該溶劑為注射用水。
於一些實施例中，醫藥組合物係呈粒子形式，諸如微粒或奈米粒。微粒及奈米粒可自任何適宜物質(諸如聚合物或脂質)形成。於一些態樣中，微粒或奈米粒為膠束、脂質體或聚合物囊泡。
本文中還提供包含ABP之無水醫藥組合物及劑型，因為水可促進一些ABP之降解。
本文中所提供之無水醫藥組合物及劑型可使用無水或含有低水分之成分及低水分或低濕度條件製備。若期望在製造、包裝及/或儲存期間與水分及/或濕度實質性接觸，則包含乳糖及包含一級或二級胺之至少一種活性成分之醫藥組合物及劑型可係無水。
應製備及儲存無水醫藥組合物使得維持其無水性質。因此，可使用防止暴露於水使得其可包含於適宜調配套組中之已知物質包裝無水組合物。適宜包裝之實例包括(但不限於)密封箔、塑膠、單位劑量容器(例如，小瓶)、透明包裝及條形包裝。
於某些實施例中，本文中所提供之ABP及/或細胞呈非經腸劑型調配。非經腸劑型可藉由各種途徑對個體投與，該等途徑包括(但不限於)皮下、靜脈內(包括輸注及團式注射)、肌肉內及動脈內。因為其投與通常繞過個體對污染物之自然防禦，非經腸劑型通常係無菌或能在對個體投與之前殺菌。非經腸劑型之實例包括(但不限於)準備注射用溶液、準備待溶解或懸浮於注射用醫藥上可接受之媒劑中之乾(例如，凍乾)產品、準備注射用懸浮液及乳液。
可用於提供非經腸劑型之適宜媒劑為熟習此項技術者熟知。實例包括(但不限於)：注射用水USP；水性媒劑，諸如但不限於氯化鈉注射液、林格氏(Ringer’s)注射液、右旋糖注射液、右旋糖及氯化鈉注射液、及乳酸林格氏注射液；水可混溶媒劑，諸如但不限於乙醇、聚乙二醇、及聚丙二醇；及非水性媒劑，諸如但不限於玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、豆蔻酸異丙酯及苯甲酸苄酯。
增加本文中所揭示之ABP及/或細胞中之一或多者之溶解度的賦形劑亦可併入非經腸劑型中。
於一些實施例中，非經腸劑型經凍乾。示例性凍乾調配物述於(例如)美國專利案第6,267,958號及第6,171,586號；及WO 2006/044908中；其全文各者以引用的方式併入。
於人類療法中，醫生將根據預防性或治癒性治療及根據特定針對待治療之個體之年齡、體重、病狀及其他因素確定其認為最適宜之劑量學。
於某些實施例中，本文中所提供之組合物為醫藥組合物或單一單位劑型。本文中所提供之醫藥組合物及單一單位劑型包含預防上或治療上有效量之一或多種預防性或治療性ABP。
將有效預防或治療病症或其一或多種症狀之ABP、細胞或組合物之量將隨著疾病或病狀之性質及嚴重度及投與ABP及/或細胞之途徑變化。頻率及劑量亦將根據對各個體特異性之因素取決於所投與之特定療法(例如，治療或預防劑)、病症、疾病或病狀之嚴重度、投與途徑以及個體之年齡、體重、反應及過去病史變化。可自源自活體外或動物模型測試系統之劑量-反應曲線推算有效劑量。
不同治療上有效量可適用於不同疾病及病狀，如將由一般技術者容易瞭解。類似地，足以預防、管理、治療或改善此等病症，但是不足以造成或足以降低與本文中所提供之ABP及/或細胞相關之副作用之量亦涵蓋於本文中所提供之劑量量及劑量頻率方案。另外，當對個體投與本文中所提供之組合物之多個劑量時，並非所有劑量需相同。例如，可增加對個體投與之劑量以提高組合物之預防或治療效果或可將其減少以降低 特定個體正在經歷之一或多種副作用。
於某些實施例中，可利用本文中所提供之ABP或組合物之一或多個負載劑量接著一或多個維持劑量引發治療或預防。
於某些實施例中，可投與本文中所提供之ABP、細胞或組合物之劑量以達成個體之血液或血清中之ABP及/或細胞之穩定狀態濃度。穩定狀態濃度可根據為熟習者可得之技術藉由量測確定或可基於個體之物理特徵，諸如身高、體重及年齡。
如本發明中其他地方更詳細討論，可視情況投與本文中所提供之ABP及/或細胞與可用於預防或治療疾病或病症之一或多種額外藥劑。此等額外藥劑之有效量可取決於調配物中存在之ABP之量、病症類型或治療、及此項技術中已知或本文中所述之其他因素。
治療應用
針對治療應用，以醫藥上可接受之劑型(諸如此項技術中已知之彼等及以上所討論之彼等)對哺乳動物(一般人類)投與ABP及/或細胞。例如，可靜脈內呈大劑量或藉由歷時一段時間之連續輸注、藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、或瘤內途徑對人類投與ABP及/或細胞。亦藉由瘤周圍、病竈內或病竈周圍途徑適宜投與ABP以發揮局部以及全身治療效果。腹膜內途徑可(例如)於治療卵巢腫瘤中特別有用。
本文中所提供之ABP及/或細胞可用於治療涉及HLA-肽之任何疾病或病狀。於一些實施例中，該疾病或病狀為可自利用抗HLA-肽ABP及/或細胞治療受益之疾病或病狀。於一些實施例中，該疾病或病狀為腫瘤。於一些實施例中，該疾病或病狀為細胞增生性病症。於一些實施 例中，該疾病或病狀為癌症。
於一些實施例中，提供本文中所提供之ABP及/或細胞用作藥劑。於一些實施例中，提供本文中所提供之ABP及/或細胞用於製造或製備藥劑。於一些實施例中，該藥劑係用於治療可自抗HLA-肽ABP及/或細胞受益之疾病或病狀。於一些實施例中，該疾病或病狀為腫瘤。於一些實施例中，該疾病或病狀為細胞增生性病症。於一些實施例中，該疾病或病狀為癌症。
於一些實施例中，本文中提供一種藉由對個體投與有效量之本文中所提供之ABP及/或細胞治療有需要之個體之疾病或病狀之方法。於一些態樣中，該疾病或病狀為癌症。
於一些實施例中，本文中提供一種藉由對個體投與有效量之本文中所提供之ABP及/或細胞治療有需要之個體之疾病或病狀之方法，其中該疾病或病狀為癌症，及該癌症係選自實體腫瘤及血液科腫瘤。
於一些實施例中，本文中提供一種調節有需要之個體之免疫反應之方法，其包括對該個體投與有效量之本文中所揭示之ABP及/或細胞或醫藥組合物。
組合療法
於一些實施例中，投與本文中所提供之ABP及/或細胞與至少一種額外治療劑。可投與任何適宜額外治療劑與本文中所提供之ABP及/或細胞。可將額外治療劑融合至ABP。於一些態樣中，該額外治療劑係選自放射、細胞毒性劑、毒素、化學治療劑、細胞抑制劑、抗激素劑、EGFR抑制劑、免疫調節劑、抗血管生成劑及其組合。於一些實施例中，該額外治療劑為ABP。
診斷方法
亦提供預測及/或檢測來自個體之細胞上之特定HLA-肽之存在的方法。可使用此等方法(例如)以預測及評價對利用本文中所提供之ABP及/或細胞治療之回應性。
於一些實施例中，自個體獲得血液或腫瘤樣品及測定表現HLA-肽之細胞之部分。於一些態樣中，測定藉由此等細胞表現之HLA-肽之相對量。表現HLA-肽之細胞之部分及藉由此等細胞表現之HLA-肽之相對量可藉由任何適宜方法測定。於一些實施例中，使用流動式細胞測量術作出此等量測。於一些實施例中，使用螢光輔助細胞分選(FACS)以作出此量測。參見，Li等人，J.Autoimmunity,2003,21：83-92關於評價外周血中之HLA-肽之表現之方法。
於一些實施例中，使用免疫沉澱及質譜法進行檢測來自個體之細胞上之特定HLA-肽之存在。此可藉由獲得諸如原始腫瘤樣品之腫瘤樣品(例如，冷凍腫瘤樣品)及應用免疫沉澱以分離一或多種肽來進行。可實驗測定或自第三方來源獲得腫瘤樣品之HLA對偶基因。該一或多種肽可經受質譜法(MS)以測定其序列。然後可根據資料庫搜索來自MS之光譜。於下節實例中提供實例。
於一些實施例中，使用適用於肽序列之基於電腦之模型及/或包含該肽序列之一或多個基因之RNA量測(例如，RNA seq或RT-PCR，或奈米串(nanostring))自腫瘤樣品進行預測來自個體之細胞上之特定HLA-肽之存在。使用之模型可係如於國際專利申請案號PCT/US2016/067159中所述，出於所有目的，該案之全文以引用的方式併入本文中。
套組
亦提供包含本文中所提供之ABP及/或細胞之套組。該等套組可用於治療、預防及/或診斷如本文中所述之疾病或病症。
於一些實施例中，該套組包含容器及插入容器或與容器相關之標籤或包裝。適宜容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器及IV溶液袋。該等容器可自各種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。該容器容納組合物自身或與有效治療、預防及/或診斷疾病或病症之另一種組合物組合之組合物。該容器可具有無菌進入端口。例如，若該容器為靜脈內溶液袋或小瓶，則其可具有由針刺入之端口。組合物中之至少一種活性劑為本文中所提供之ABP。標籤或包裝插入物指示組合物用於治療選定病狀。
於一些實施例中，該套組包含(a)具有其中含有之第一組合物之第一容器，其中該第一組合物包含本文中所提供之ABP及/或細胞；及(b)具有其中含有之第二組合物之第二容器，其中該第二組合物包含另外治療劑。於此實施例中，該套組還可包含指示組合物可用於治療特定病狀(例如，癌症)之包裝插入物。
或者，或另外，該套組還可包含包含醫藥上可接受之賦形劑之第二(或第三)容器。於一些態樣中，該賦形劑為緩衝劑。該套組還可包含自商業及使用者立場期望之其他物質，包括過濾器、針及注射器。
實例
以下為進行本發明之特定實施例之實例。僅出於說明性目的提供實例，且意欲不以任何方式限制本發明之範圍。已努力確保關於使用之數位(例如，量、溫度等)之精確度，但是當然應允許一些實驗誤差及偏離。
除非另有指明，否則本發明之實務將採用此項技術技能範圍內之蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學之習知方法。於文獻中充分解釋此等技術。參見，例如，T.E.Creighton,Proteins：Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman及公司，1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.，當前新加)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick及N.Kaplan編輯，Academic Press,Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton,Pennsylvania：Mack Publishing Company,1990)；Carey及Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)第A及B卷(1992)。
實例1：鑑別經預測之HLA-肽複合體
吾人鑑別兩類癌症特異性HLA-肽靶：第一類(癌症睾丸抗原，CTA)於大多數正常組織中不表現或以最小水平表現且於腫瘤樣品中表現。第二類(腫瘤相關抗原，TAA)於腫瘤樣品中高度表現且可於正常組織中有低表現。
吾人使用三個計算步驟鑑別基因靶：首先，吾人使用通過基因型-組織表現(GTEx)項目[1]可得之資料鑑別具有於大多數正常組織中低表現或不表現之基因。吾人自基因型-組織表現(GTEx)項目(版本V7p2)獲得聚集之基因表現資料。此資料集包含來自714個個體及53個不同組織類型之11,688個驗屍後樣品。使用RNA-Seq量測表現及根據GTEx標準管道(https：//www.gtexportal.org/home/documentationPage)計算處理。使用同工異型物表現之總和計算基因表現，該同工異型物表現使用RSEM v1.2.22[2]計算。
接下來，吾人使用來自癌症基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)研究網路：http：//cancergenome.nih.gov/之資料鑑別於癌症樣品中異常表現之彼等基因。吾人檢查自TCGA(資料發佈6.0)可得之11,093種樣品。因為GTEx及TCGA於其計算分析中使用人類基因組之不同註釋，吾人僅包含存在可得之兩個資料集之間之ENCODE定位的基因。
最後，於此等基因中，吾人鑑別使用在藉由串聯質譜法(MS/MS)定序之HLA呈遞肽上訓練之深度學習模型，可能藉由MHC I類蛋白呈遞作為細胞表面抗原的肽，如於國際專利申請案號PCT/US2016/067159中所述，出於所有目的，該案之全文以引用的方式併入本文中。
以下特定兩類基因之特定標準。
CTA納入標準
為鑑別CTA，吾人試圖定義排除於正常組織中表現之基因之標準，該標準足夠嚴格以確保腫瘤特異性，但是不排除自潛在偽影(諸如閱讀未對準)引起之非零量測。若基因滿足下列標準，則其有資格納入作為CTA：為腦、心或肺之部分之各器官中之中值GTEx表現係小於0.1個轉錄本/百萬(TPM)，其中無一樣品超過5 TPM。於其他必需器官中之中值GTEx表現係小於2 TPM，其中無一樣品超過10 TPM。針對被歸類為非必需之器官(睾丸、甲狀腺及小唾腺)，忽略表現。若基因於至少30種樣品中具有大於20 TPM之於TCGA中之表現，則認為其於腫瘤樣品中表現。
然後吾人檢查跨TCGA樣品之其餘基因之表現之分佈。當 吾人檢查已知CTA(例如，MAGE基因家族)時，吾人觀察到於對數空間中表現此等基因一般特徵為雙峰分佈。此分佈包括圍繞較低表現值之左模式及在較高表現水平下之右模式(或厚尾)。此表現模式與生物模型一致，其中在所有樣品之基線處檢測到一些最小表現及於經歷表觀遺傳失調之腫瘤子集中觀察到基因之較高表現。吾人評論跨TCGA樣品之各基因之表現分佈及遺棄其中吾人僅觀察到單峰分佈而不具有顯著右手尾之彼等。
TAA納入標準
藉由聚焦具有於腫瘤組織中較正常組織中高許多表現之基因鑑別TAA：吾人首先鑑別於所有GTEx必需、正常組織中中值TPM少於10之基因，及然後選擇於至少一種TCGA腫瘤組織中具有大於100 TPM之表現之子集。然後，吾人檢查此等基因各者之分佈及選擇具有表現之雙峰分佈以及於一或多種腫瘤類型中顯著提升之表現之額外證據之彼等。
進一步評論列表以消除已知於GTEx中未充分代表之組織中具有表現或可起源於腫瘤內之免疫細胞浸潤物之基因。此等步驟留給吾人56個CTA及58個TAA基因之最終列表。
吾人亦添加來自已知於癌症中呈遞之兩種額外蛋白質之肽。吾人添加來自EGFR-SEPT14融合蛋白[3]之連接肽及吾人添加來自KLK3(PSA)之肽。吾人亦添加來自與PSA：KLK2及KLK4相同基因家族之兩種基因之肽。
為鑑別可藉由MHC I類蛋白作為細胞表面抗原呈遞之肽，吾人使用推拉窗將此等蛋白質各者解析成其構成性8至11個胺基酸序列。吾人利用HLA肽呈遞深度學習模型處理此等肽及其側接序列以計算各肽以針對TCGA中之此基因觀測到之最大表現水平之呈遞可能性。若藉由吾人 之模型計算之其分位元數標準化之呈遞可能性大於0.001，吾人認為可呈遞肽(即，候選靶)。
結果示於表A中。為了清晰，將各HLA-肽指配表A中之靶編號。例如，HLA-肽靶1為HLA-C*16：01_AAACSRMVI，HLA-肽靶2為HLA-C*16：02_AAACSRMVI，及以此類推。
總之，實例提供可繼續作為ABP開發之候選靶之一大組腫瘤特異性HLA-肽。
參考文獻
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實例2：驗證經預測之HLA-肽複合體
在已知對來自各自HLA-肽複合體之各特定HLA對偶基因 陽性之腫瘤樣品上使用質譜法(MS)測定來自表A之HLA-肽複合體之肽之存在。
於組織樣品(1至4)之裂解及溶解後，使用經典免疫沉澱(IP)方法進行HLA-肽分子之分離。將新鮮冷凍組織首先於液氮中冷凍及粉碎(CryoPrep；Covaris,Woburn,MA)。添加裂解緩衝液(1% CHAPS，20mM Tris-HCl，150mM NaCl，蛋白酶及磷酸酶抑制劑，pH=8)以溶解組織及將樣品之1/10等分用於蛋白質組學及基因組定序工作。將其餘樣品在4℃下旋轉2小時以將碎片製成小球。針對HLA特異性IP，使用澄清裂解物。
使用偶聯至珠之抗體進行免疫沉澱，其中該抗體對HLA分子具特異性。針對泛I類HLA免疫沉澱，使用抗體W6/32(5)，針對II類HLA-DR，使用抗體L243(6)。在過夜培育期間，將抗體共價連接至NHS-瓊脂糖珠。於共價連接後，將該等珠洗滌及等分用於IP。可使用針對IP之額外方法，包括(但不限於)抗體之蛋白質A/G捕獲、磁珠分離或免疫沉澱常用之其他方法。
將裂解物添加至抗體珠及在4℃下旋轉過夜用於免疫沉澱。於免疫沉澱後，將該等珠自裂解物移除及將裂解物儲存用於額外實驗，包括額外IP。將IP珠洗滌以移除非特異性結合及將HLA/肽複合體用2N乙酸自該等珠溶離。使用分子量自旋柱將蛋白質組分自肽移除。所得肽藉由SpeedVac蒸發變乾及在MS分析之前在-20℃下儲存。
將經乾燥之肽於HPLC緩衝液A中復原及負載於C-18微毛細管HPLC管柱上用於進入質譜儀之梯度溶離。使用180分鐘之0至40%B(溶劑A-0.1%甲酸，溶劑B-0.1%甲酸/80%乙腈)之梯度將肽溶離至 Fusion Lumos質譜儀(Thermo)中。於具有120,000解析度之Orbitrap檢測器中收集肽質量/電荷(m/z)之MS1光譜，接著20次MS2掃描。使用資料依賴性擷取方式及於離子之MS2選擇後30秒之動態排除進行MS2離子之選擇。將MS1掃描之自動增益控制(AGC)設置為4 x 105及將MS2掃描之自動增益控制設置為1 x 104。用於定序HLA肽，可選擇+1、+2及+3電荷態用於MS2片段化。或者，可使用質量靶向方法獲得MS2光譜，其中僅選擇納入列表中列出之質量用於分離及片段化。此通常被稱作靶向質譜法(Targeted Mass Spectrometry)及以定性方式進行或可係定量。定量方法需要使用重標記之胺基酸合成待定量之各肽。(Doerr 2013)
使用Comet(7-8)對蛋白質資料庫搜索來自各分析之MS2光譜及使用Percolator(9-11)或使用積體重新定序及PEAKS之資料庫搜索演算法分選肽鑑別。使用Skyline(Lindsay K.Pino等人2017)或分析經預測之片段離子之其他方法分析來自靶向MS2實驗之肽。
在已知對來自各自HLA-肽複合體之各特定HLA對偶基因陽性之各種腫瘤樣品上，使用質譜法(MS)測定來自經預測之HLA-肽複合體之多個肽之存在。
許多胺基酸可出現胺基酸之自發修飾。半胱胺酸尤其易感此修飾且可氧化或經游離半胱胺酸修飾。額外N-端麩胺醯胺胺基酸可轉化成焦-麩胺酸。因為此等修飾各者導致質量變化，其可於MS2光譜中確定地指配。為於製備ABP中使用此等肽，該肽可需含有與質譜儀中所見相同之修飾。此等修飾可使用簡單實驗室及肽合成方法(Lee等人；Ref 14)創建。
參考文獻
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實例3：鑑別結合HLA-肽靶之抗體及其抗原結合片段
概觀
下列範例證實可鑑別抗體(Ab)，該等抗體識別腫瘤特異性HLA限制性肽。藉由此等Ab識別之總抗原決定基一般包括肽以及呈遞特定肽之HLA蛋白質二者之組成表面。以肽特異性方式識別HLA複合體之Ab經常係指類T細胞受體(TCR)之Ab或模擬TCR之Ab。源自腫瘤特異性基因產物MAGEA6、FOXE1、MAGE3/6，針對抗體發現選擇之HLA-肽 靶抗原各自為HLA-B*35：01_EVDPIGHVY(HLA-肽靶「G5」)、HLA-A*02：01_AIFPGAVPAA(HLA-肽靶「G8」)及HLA-A*01：01_ASSLPTTMNY(HLA-肽靶「G10」)。此等HLA-肽靶之細胞表面呈遞藉由自如實例2中所述之腫瘤樣品獲得之HLA複合體之質譜分析證實。於圖25至27中描繪代表性圖。
HLA-肽靶複合體及反向篩選肽-HLA複合體
使用HLA分子之條件配位體使用建立之方法重組產生HLA-肽靶G5、G8、G10以及反向篩選陰性對照肽-HLA。總之，針對HLA-肽靶各者產生18種反向篩選HLA-肽。設計該等18種反向篩選HLA-肽使得(A)認為陰性對照肽藉由相同HLA亞型(即，HLA相關之對照)呈遞或(B)認為陰性對照肽藉由不同HLA亞型呈遞。針對篩選1之靶及陰性對照肽-HLA複合體之分組示於圖3中(表1中所提供之詳細序列資訊)，及針對篩選2示於圖4中(表2中所提供之詳細序列資訊)。
HLA-肽靶複合體及反向篩選肽-HLA複合體之產生及穩定性分析
G5反向篩選「微量池」及G2靶之結果示於圖5中。所有三種反向篩選肽及G5肽營救HLA複合體免於解離。
額外G5「完全」池反向篩選肽之結果示於圖6中，證實其亦形成穩定HLA-肽複合體。
反向篩選肽及G8靶之結果示於圖7中。所有三種反向篩選肽及G8肽營救HLA複合體免於解離。
G10反向篩選「微量池」及G10靶之結果示於圖8中。所有三種反向篩選肽及G10肽營救HLA複合體免於解離。
額外G8及G10「完全」池反向篩選肽之結果示於圖9中，證實其亦形成穩定HLA-肽複合體。
噬菌體庫篩選
使用來自Distributed Bio Inc之高度多樣化SuperHuman 2.0合成初始scFv庫作為噬菌體呈現之輸入物質，其在超穩定及不同VH/VL支架上具有7.6 x 1010總多樣性。針對篩選1(參見圖3)及篩選2(參 見圖4)二者，使用為各自鑑別pHLA G5、G8及G10之scFv結合劑建立之協定實施三至四輪利用靶pHLA複合體之基於珠之噬菌體淘選(如表3中所示)。針對各輪淘選，在與靶pHLA之結合步驟之前，將噬菌體庫最初用18種混合之陰性pHLA複合體耗盡。在每輪篩選時，測定噬菌體效價以建立非結合噬菌體之移除。亦針對靶結合藉由ELISA測試輸出噬菌體上清液並建議G5-、G8及G10結合噬菌體之逐步濃化(參見圖10)。
使用良好建立之協定，個別輸出純系之細菌細胞周質提取物(PPE)隨後於96孔板中產生。藉由高流通量PPE ELISA使用PPE測試結合至靶pHLA抗原。將陽性純系定序及再排列以選擇序列獨特純系。然後將序列獨特純系於二級ELISA中測試以結合至相對於HLA匹配之陰性對照pHLA複合體之靶pHLA，從而建立靶特異性。G8陰性對照HLA複合體(即，A*24：02)不與G8靶HLA複合體(即，A*02：01)HLA匹配。因此，於自scFv庫擷取之TCR模擬Ab之進一步生物化學及功能表徵檢定中，將呈遞來自G7之肽LLFGYPVYV、GILGFVFTL或FLLTRILTI之HLA-A*02：01複合體用作G8之陰性對照之HLA匹配之微量池。
分離scFv目標物
針對當於PPE中表現時，發現係選擇性之scFv純系產生及純化個別、可溶性scFv蛋白質片段。如由scFv PPE ELISA所示，此等純系展示相較於結合至陰性對照pHLA之微量池至少三倍選擇性結合至靶pHLA。可溶性scFv產生允許進一步生物化學及功能表徵。
結合靶G5之scFv之所得VH及VL序列示於表4中。為清楚表4之組織，於表4中將各scFv指配純系名稱。例如，來自純系G5_P7_E7之scFv具有VH序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGIINPRSGSTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSAS及VL序列DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLQTPITFGQGTRLEIK。
結合靶G5之scFv之所得CDR序列示於表5中。為清楚表5之組織，於表5中將各scFv指配純系名稱。例如，來自純系G5_P7_E7之scFv具有為YTFTSYDIN之HCDR1序列、為GIINPRSGSTKYA之HCDR2序列、為CARDGVRYYGMDVW之HCDR3序列、為RSSQSLLHSNGYNYLD之LCDR1序列、為LGSYRAS之LCDR2序列及為CMQGLQTPITF之LCDR3序列，根據Kabat編號系統。
結合靶G8之scFv之所得VH及VL序列示於表6中。類似於表4組織表6。
結合靶G8之scFv之所得CDR序列示於表7中。類似於表5組織表7。
結合靶G10之scFv之所得VH及VL序列示於表8中。類似於表4組織表8。
結合靶G10之scFv之所得CDR序列示於表9中。類似於表5組織表9。
將許多純系格式化成scFv、Fab及IgG以促進生物化學、結構及功能表徵(參見表10)。
圖11描繪描述抗體選擇過程之流程圖，該過程包括scFv、Fab及IgG格式之標準及預期應用。簡言之，基於序列多樣性、結合親和力、選擇性及CDR3多樣性選擇純系用於進一步表徵。
為評估序列多樣性，使用集群軟體產生系統樹圖。亦考慮基於VH類型之scFv序列之經預測之3D結構。使用Octet HTX(ForteBio)量測如藉由平衡解離常數(KD)測定之結合親和力。利用純化scFv之ELISA滴定測定特異性肽-HLA複合體相較於陰性對照pHLA複合體之微量池或鏈黴抗生物素單獨之選擇性。針對各靶組基於各組內之Fab獲得之值之範圍測定KD之截止值及選擇性。基於序列家族之多樣性及CDR3序列選擇最終純系。
於噬菌體庫篩選及scFv分離後目標物之總數目於以上表10中列出。
材料及方法
HLA表現及純化：
使用建立之程序(Garboczi,Hung,& Wiley,1992)通過細 菌表現獲得重組蛋白質。簡言之，各種人類白血球抗原(HLA)之α鏈及β2微球蛋白鏈於BL21勝任大腸桿菌細胞(New England Biolabs)中分開表現。於自動誘導後，將細胞經由超音波處理於Bugbuster®加核酸酶(benzonase)蛋白質提取試劑(Novagen)中裂解。將所得內含體洗滌及於含有及不含有0.5% Triton X-100(50mM Tris、100mM NaCl、1mM EDTA)之洗滌緩衝液中超音波處理。於最終離心後，將內含團塊溶解於尿素溶液(8M尿素、25mM MES、10mM EDTA、0.1mM DTT，pH 6.0)中。使用布拉德福(Bradford)檢定(Biorad)定量濃度及將內含體在-80℃下儲存。
pHLA之再摺疊及純化：
藉由重組產生之次單元及使用建立之程序合成獲得之肽之再摺疊獲得HLA複合體。(Garboczi等人，1992)簡言之，將經純化之α及β2微球蛋白鏈於再摺疊緩衝液(100mM Tris pH 8.0、400mM L-精胺酸HCl、2mM EDTA、50mM氧化型麩胱甘肽、5mM還原型麩胱甘肽、蛋白酶抑制劑錠劑)中用靶肽或可裂解配位體再摺疊。將再摺疊溶液用Vivaflow 50或50R錯流盒(Sartorius Stedim)濃縮。進行三輪20mM Tris pH 8.0中之透析，各者持續至少8小時。針對抗體篩選及功能檢定，使用BirA生物素連接酶(Avidity)將經再摺疊之HLA酵素生物素化。使用連接至AKTA FPLC系統之HiPrep(16/60 Sephacryl S200)尺寸排除管柱將經再摺疊之蛋白質複合體純化。於鏈黴抗生物素凝膠阻滯檢定中，在非還原條件下，藉由在SDS-PAGE之前在室溫下用過量鏈黴抗生物素培育經再摺疊之蛋白質持續15分鐘來證實生物素化。將肽-HLA複合體等分及在-80℃下儲存。
肽交換：
藉由條件配位體肽交換及穩定性ELISA檢定評估HLA-肽穩定性。簡言之，在反向篩選或測試肽之存在或不存在下，使條件配位體HLA複合體經受±條件刺激。暴露於條件刺激自HLA複合體裂解條件配位體，導致HLA複合體之解離。若反向篩選或測試肽穩定結合HLA複合體之α1/α2溝槽，則其「營救」HLA複合體免於解離。總之，將100μL 50μM新穎肽(Genscript)及0.5μM於20mM Tris HCl及50mM NaCl中在pH 8下重組產生之可裂解配位元體負載之HLA之混合物放置在冰上。將混合物於配備有365nm UV燈之UV交聯連接子(CL-1000，UVP)中以約10cm距離照射15分鐘。
MHC穩定性檢定：
使用建立之程序進行MHC穩定性ELISA。(Chew等人2011；Rodenko等人，2006)將384孔透明平底聚苯乙烯微板(Corning)用50μl以2μg/mL含於PBS中之鏈黴抗生物素(Invitrogen)預塗覆。於37℃下培育2小時後，將孔用含0.05% Tween 20之PBS(四次，50μL)洗滌緩衝液洗滌，用50μl阻斷緩衝液(含2% BSA之PBS)處理，及在室溫下培育30分鐘。隨後，一式四份添加25μl用20mM Tris HCl/50mM NaCl300×稀釋之肽交換樣品。將該等樣品在室溫下培育15分鐘，用0.05% Tween洗滌緩衝液(4×50μL)洗滌，在室溫下用25μL經HRP偶聯之抗β2m(1μg/mL含於PBS中)處理15分鐘，用0.05% Tween洗滌緩衝液(4×50μL)洗滌，及用25μL ABTS溶液(Invitrogen)開發10至15分鐘。藉由添加12.5μL停止緩衝液(含0.01%疊氮化鈉之0.1M檸檬酸)停止反應。隨後使用分光光度計(SpectraMax i3x；Molecular Devices)在415nm下量測吸光度。
噬菌體淘選：
針對各輪淘選，將起始噬菌體之等分試樣放在一旁用於輸入效價測定及將其餘噬菌體對Dynabead M-280鏈黴抗生物素珠(Life Technologies)耗盡三次，接著對與100皮莫耳之混合之陰性肽-HLA複合體預結合之鏈黴抗生物素珠耗盡。針對第一輪淘選，在室溫下，在旋轉下，將100皮莫耳之結合至鏈黴抗生物素珠之肽-HLA複合體用耗盡之噬菌體培育2小時。利用含0.5% BSA之1X PBST(PBS+0.05% Tween-20)之三次五分鐘洗滌，接著利用含0.5% BSA之1X PBS之三次五分鐘洗滌以移除肽-HLA複合體結合珠之任何未結合之噬菌體。為自該等經洗滌之珠溶離結合噬菌體，添加1mL 0.1M TEA及在室溫下在旋轉下培育10分鐘。將經溶離之噬菌體自該等珠收集及用0.5mL 1M Tris-HCl pH 7.5中和。然後使用經中和之噬菌體感染對數生長TG-1細胞(OD600=0.5)及於37℃下感染1小時後，將細胞接種至含有100μg/mL羧苄青黴素(carbenicillin)之2YT培養基及2%葡萄糖(2YTCG)瓊脂板上用於輸出效價及隨後淘選輪之細菌生長。針對隨後輪之淘選，降低選擇抗原濃度，同時藉由洗滌次數之量及長度增加洗滌，如表3中所示。
輸入/輸出噬菌體效價：
將各輪輸入效價於2YT培養基中連續稀釋至1010。將對數期TG-1細胞用經稀釋之噬菌體效價(107-1010)感染及在無振盪下，在37℃下，培育30分鐘，接著在輕輕振盪下再培育30分鐘。將感染之細胞接種至2YTCG板上及在30℃下培育過夜。將個別純系計數以測定輸入效價。於感染至TG-1細胞之經溶離之噬菌體1小時後，進行輸出效價。將1、0.1、0.01及0.001μL感染細胞接種至2YTCG板上及在30℃下培育過夜。 將個別純系計數以測定輸出效價。
細菌周質提取物之選擇性靶結合：
針對scFv PPE ELISA，將塗覆鏈黴抗生物素之96孔及/或384孔板(Pierce)用含2μg/mL肽-HLA複合體之HLA緩衝液塗覆及在4℃下培育過夜。將板在各步驟之間用PBST(PBS+0.05% Tween-20)洗滌三次。在室溫下，將塗覆抗原之板用含3% BSA之PBS(阻斷緩衝液)阻斷1小時。於洗滌後，將scFv PPE添加至該等板中及在室溫下培育1小時。於洗滌後，添加含小鼠抗v5抗體(Invitrogen)之阻斷緩衝液以檢測scFv及在室溫下培育1小時。於洗滌後，添加HRP-山羊抗小鼠抗體(Jackson ImmunoResearch)及在室溫下培育1小時。然後在用TMB 1-組分微孔過氧化物酶受質(Microwell Peroxidase Substrate)(Seracare)檢測HRP活性之前，將該等板用PBST洗滌三次及用PBS洗滌3次及用2N硫酸中和。
針對陰性肽-HLA複合體反向篩選，如上所述進行scFv PPE ELISA，除了塗覆抗原外。即，使用由2μg/mL之彙集及塗覆至鏈黴抗生物素板上之三種陰性肽-HLA複合體各者組成之HLA微量池(參見表1及2)用於比較結合至其特定pHLA複合體。或者，HLA競爭由2μg/mL之彙集在一起及塗覆至鏈黴抗生物素板上之所有18種陰性肽-HLA複合體各者組成之池用於比較結合至其特定pHLA複合體。
scFv蛋白質片段之構建及產生：
將表現質粒轉化成BL21(DE3)株及於400mL大腸桿菌培養中與周質伴侶共同表現。將細胞團塊如下復原：10mL/1g生物數量，其中(25mM HEPES，pH 7.4，0.3M NaCl，10mM MgCl2，10%甘油，0.75% CHAPS，1mM DTT)加上溶解酵素及核酸酶及Lake Pharma蛋白酶 抑制劑混合物。將細胞懸浮液在振盪平臺上在室溫下培育30分鐘。在4℃下，將裂解物藉由13,000 x rpm離心15分鐘澄清。將澄清之裂解物負載至於IMAC緩衝液A(20mM Tris-HCl，Ph7.5；300mM NaCl/10%甘油/1mM DTT)中預平衡之5mL Ni NTA樹脂上。將樹脂用10管柱體積(CV)之緩衝液A(或直至達到穩定基線)，接著10CV之8% IMAC緩衝液B(20mM Tris-HCl，Ph7.5；300mM NaCl/10%甘油/1mM DTT/250mM咪唑)洗滌。將靶蛋白以20CV 100% IMAC緩衝液B之梯度溶離。將管柱用5CV之100% IMAC B洗滌以確保蛋白質完全移除。將溶離級分藉由SDS-PAGE及西方墨點法(抗His)分析及相應地彙集。將池用最終調配緩衝液(20mM Tris-HCl，pH 7.5；300mM NaCl/10%甘油/1mM DTT)透析，濃縮至最終蛋白質濃度>0.3mg/mL，等分至1mL小瓶中，及於液氮中快速冷凍。最終QC步驟包括SDS-PAGE及A280吸光度量測。
Fab蛋白質片段之構建及產生：
將選定之G5、G8及G10 Fab之構築體選殖至最佳化用於哺乳動物表現之載體。將各DNA構築體放大用於轉染及證實序列。針對各者，100mL暫態產生於HEK293細胞(Tuna293TM Process)中完成。將蛋白質藉由抗CH1純化純化，隨後藉由尺寸排除層析法(SEC)經由HiLoad 16/600 Superdex 200純化。用於SEC拋光之流動相為20mM Tris、50mM NaCl、pH 7。進行最終證實之CE-SDS分析。
IgG蛋白質之構建及產生：
將G系列抗體之表現構築體選殖至最佳化用於哺乳動物表現之載體。將各DNA構築體放大用於轉染及證實序列。針對各者，10mL暫態產生於HEK293細胞(Tuna293TM Process)中完成。將蛋白質藉由蛋白 質A純化純化及進行最終CE-SDS分析。
實例4：Fab純系對HLA-肽靶之親和力
經Fab格式化之抗體允許單體結合至其各自HLA-肽靶之精確評估，同時避免與IgG抗體格式二價相互作用之混雜效應。使用Octet Qke(ForteBio)藉由生物層干涉測量法(BLI)評估結合親和力。簡言之，將動力學緩衝液中之經生物素化之pHLA複合體負載至鏈黴抗生物素感測器中持續300秒，以在使用之最高濃度下對各Fab提供最佳nm位移回應(約0.6nm)之濃度。隨後將配位元體負載之梢於動力學緩衝液中平衡120秒。然後將配位元體負載之生物感測器於滴定至2倍稀釋液之Fab溶液中浸漬200秒。起始Fab濃度範圍自100nM至2μM，基於Fab之KD值反覆運算最佳化。量測於動力學緩衝液中之解離步驟持續200秒。使用ForteBio數據分析軟體使用1：1結合模型分析數據。
結果示於下表11中。經Fab格式化之抗體以高親和力結合至其各自HLA-肽靶。
圖12A、12B及12C各自描繪Fab純系G5-P7A05至HLA-肽靶B*35：01-EVDPIGHVY(12A)、Fab純系R3G8-P2C10及G8-P1C11至HLA-肽靶A*02：01-AIFPGAVPAA(12B，P2C10在左及P1C11在右)及Fab純系R3G10-P1B07至HLA-肽靶A*01：01-ASSLPTTMNY(12C)之BLI結果。
實例5：G5、G8及G10限制性肽序列之位置掃描
進行G5、G8及G10限制性肽之位置掃描以測定充當選定Fab純系或直接或間接影響HLA-肽靶與Fab之相互作用之關鍵殘基之接觸點的胺基酸殘基。
圖13描繪位置掃描實驗之一般實驗設計。利用跨所有位置掃描之G5、G8及G10肽序列中之單一位置處之胺基酸置換產生變異體G5、G8及G10限制性肽之位置掃描庫。特定位置處之胺基酸置換為丙胺酸(保守置換)、精胺酸(帶正電荷)或天冬胺酸(帶負電荷)。如實例3中所述，產生包含位置掃描庫成員及HLA亞型對偶基因之肽-HLA複合體。使用如實例3中所述之條件配位體肽交換及穩定性ELISA測定所得複合體之穩定性。此等穩定性分析可鑑別對結合及穩定HLA分子重要之限制性肽上之殘基。選定Fab純系與變異體肽-HLA複合體之結合親和力藉由如實例4中所述之BLI評估。導致穩定HLA複合體形成及削弱Fab結合之位置變異體可鑑別為選擇性結合HLA-肽靶之抗體之重要接觸點之殘基。
圖14A描繪G5位置變異體-HLA之穩定性結果，其指示大多數肽突變不影響彼等肽與相關pHLA之結合。
圖14B描繪Fab純系G5-P7A05與G5位置變異體-HLA之結合親和力，其指示可涉及之限制性肽之位置P2至P8直接或間接決定肽-HLA複合體與Fab純系之相互作用。
圖15A描繪G8位置變異體-HLA之穩定性結果，其指示位置P2、P7及P10不適合用Arg-或Asp-殘基置換及因此可重要用於肽結合HLA蛋白質。
圖15B描繪Fab純系G8-P2C10與G8位置變異體-HLA之結 合親和力，其指示可涉及之限制性肽之位置P1至P5直接或間接決定肽-HLA複合體與Fab純系之相互作用。
圖46描繪Fab純系G8-P1C11與G8位置變異體-HLA之結合親和力，其指示可涉及之限制性肽之位置P3至P6直接或間接決定肽-HLA複合體與Fab純系之相互作用。
圖16A描繪G10位置變異體-HLA之穩定性結果，其指示位置2、5、8及10不適合胺基酸置換及因此可重要用於肽結合HLA蛋白質。
圖16B描繪Fab純系G10-P1B07與G10位置變異體-HLA之結合親和力，其指示可涉及之限制性肽之位置P4、P6及P7直接或間接決定肽-HLA複合體與Fab純系之相互作用。
實例6：呈遞HLA-肽靶抗原之抗體結合細胞。
為驗證經鑑別之類TCR抗體於其自然情況下(例如，在抗原呈遞細胞之表面)結合其pHLA靶G5、G8及G10，將選定之純系再格式化成IgG及用於利用表現同源HLA-肽靶之K562細胞之結合實驗中。簡言之，將細胞用針對G5靶肽之HLA-B*35：01，針對G8靶肽之HLA-A*02：01，或針對G10靶肽之HLA-A*01：01轉導。然後將細胞用如表1及2中所說明之靶或陰性對照肽，使用建立之方法外源脈衝以在細胞表面上產生相關pHLA複合體。
結合至G5-、G8-或G10-呈遞K562細胞之抗體之代表性實例(如流動式細胞測量術所檢測)示於圖17A、17B及17C中。以選擇用於相關靶肽之劑量依賴性方式觀察抗體結合。
於另一流動式細胞測量術實驗中，將經HLA轉導之K562細胞用50μM如表1中針對G5及表2中針對G8及G10所列之靶或對照肽脈 衝，及將pHLA-特異性抗體藉由流動式細胞測量術檢測。將經HLA轉導之K562細胞用50μM靶或陰性對照肽脈衝及針對20μg/mL下之G5-P7A05、30μg/mL下之G8-2C10、30μg/mL下之G10-P1B07及30μg/mL下之G8-P1C11繪製抗體結合直方圖。於圖18及圖47中描繪直方圖。
材料及方法
K562細胞系產生
將Phoenix-AMPHO細胞(ATCC®,CRL-3213TM)於補充有10% FBS(Seradigm,97068-091)及Glutamax(GibcoTM,35050079)之DMEM(CorningTM,17-205-CV)中培養。將K-562細胞(ATCC®,CRL-243TM)於補充有10% FBS之IMDM(GibcoTM，31980097)中培養。脂質體轉染胺(Lipofectamine)LTX PLUS(Fisher Scientific,15338100)含有脂質體轉染胺試劑及PLUS試劑。自Fisher Scientific購得Opti-MEM(GibcoTM，31985062)。
將Phoenix細胞以5x105個細胞/孔於6孔板中接種及在37℃下培育過夜。用於轉染，將10μg質粒、10μL Plus試劑及100μL Opti-MEM在室溫下培育15分鐘。同時，在室溫下，將8μL脂質體轉染胺用92μL Opti-MEM培育15分鐘。合併此等兩個反應及在室溫下再培育15分鐘，之後添加800μL Opti-MEM。將培養基自該等Phoenix細胞吸出及將其用5mL預升溫Opti-MEM洗滌。將Opti-MEM自該等細胞吸出及添加脂質體轉染胺混合物。將細胞在37℃下培育3小時及添加3mL完全培養基。然後將該板在37℃下培育過夜。將培養基用Phoenix培養基置換及將該板在37℃下再培育2天。
收集培養基及通過至清潔6孔盤中之45μm過濾器過濾。將 20μL Plus試劑添加至各病毒懸浮液及在室溫下培育15分鐘，接著添加8μL/孔之脂質體轉染胺及在室溫下再培育15分鐘。將K562細胞計數及再懸浮至5E6個細胞/mL及將100μL添加至各病毒懸浮液。將6孔板以700g離心30分鐘及然後在37℃下培育5至6小時。然後將細胞及病毒懸浮液轉移至T25小瓶及添加7mL K562培養基。然後將細胞培育3天。然後將經轉導之K562細胞於補充有0.6μg/mL嘌呤黴素(Puromycin)(Invivogen,ant-pr-1)之培養基中培養及藉由流動式細胞測量術監測選擇。
流動式細胞測量術方法：
在前一夜將經HLA轉導之K562細胞於6孔板中用含有1% FBS之IDMEM中之50μM肽(Genscript)脈衝及在標準組織培養條件下培育。收穫細胞，於PBS中洗滌，及在室溫下，用eBioscience可固定活性染料eFluor 450染色15分鐘。於PBS+2% FBS中再洗滌後，將細胞用變化濃度之IgG再懸浮。在4℃下，將細胞用抗體培育1小時。於再洗滌後，在4℃下，歷時30分鐘以1：100添加PE偶聯之山羊抗人類IgG二級抗體(Jackson ImmunoResearch)。於PBS+2% FBS中洗滌後，將細胞於PBS+2% FBS中再懸浮及藉由流動式細胞測量術分析。使用Attune NxT軟體在Attune NxT流動式細胞測量術(ThermoFisher)上進行流動式細胞測量術分析。使用FlowJo分析數據。
實例7：結合至表現靶基因及HLA亞型之腫瘤細胞系之抗體
基於HLA亞型及所關注之靶基因之表現選擇腫瘤細胞系，如藉由公開可得資料庫(TRON http：//celllines.tron-mainz.de)所評估。用於細胞結合檢定之腫瘤細胞系之選擇示於下表12中。
LN229、BV173及Colo829腫瘤細胞系在標準組織培養條件下繁殖。如實例6中所述進行流動式細胞測量術法。將細胞用30μg/mL或0μg/mL抗體接著PE偶聯之抗人類二級IgG培育。
於圖19中描繪結果。圖A顯示G5-P7A05結合至膠質母細胞瘤株LN229之直方圖。圖B顯示G8-P2C10結合至白血病株BV173之直方圖。圖C顯示G10-P1B07結合至CRC株Colo829之直方圖。
實例8：鑑別結合HLA-肽靶HLA-A*01：01 ASSLPTTMNY或HLA-肽靶HLA-A*01：01_HSEVGLPVY之TCR
藉由處理來自健康供者之白血球分離樣品獲得外周血單核細胞(PBMC)。將冷凍PBMC解凍及用生物素化之CD45RO、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD34、CD36、CD57、CD123、抗HLA-DR、CD235a(血型糖蛋白(Glycophorin)A)、CD244及CD4抗體之混合物培育及隨後用抗生物素微珠磁標記用於自PBMC群體移除。將經濃化之初始CD8 T細胞用包括靶肽及適宜MHC分子之四聚體標記，用活/死及世系標記染色及藉由流動式細胞測量術細胞分選器分選。於多純系擴增後，可採用兩種路徑中之一者。若大部分群體對HLA-肽靶特異性，則可將T細胞群體作為整體定序。或者，可將具有對HLA-肽靶具特異性之TCR之細胞再分選，及僅將於再分選後分離之細胞使用10x基因組學單細胞解析成對免疫TCR分析方法定序。此處，將具有對HLA-肽靶HLA-A*01：01 ASSLPTTMNY特異性之TCR之細胞再分選及如上所述定序。具體而言，將兩千至八千個活T細胞指配至單細胞乳液中用於後續單細胞cDNA產生及全長TCR分析(通過恆定區之5’ UTR-確保α及β配對)。此方法利用轉錄本之5’端處之分子條碼模板切換寡糖。替代方法利用3’端處之分子條碼 恆定區寡糖。另一替代方法將RNA聚合酶啟動子偶合至TCR之5’或3’端。所有此等方法使能以單細胞水平識別及去褶積α及βTCR對。所得條碼cDNA轉錄本經歷最佳化酶促及庫構建工作流程以減少偏見並確保細胞池內之純系型之精確表現。將庫在Illumina’s MiSeq或HiSeq4000儀器(成對端150個週期)上定序用於約五至五萬次閱讀/細胞之靶定序深度。
通過10x所提供之軟體Cell Ranger處理定序閱讀。將定序閱讀用鉻細胞條碼及用於藉由細胞組裝V(D)J轉錄本之UMI標記。然後將針對各細胞組裝之重疊群藉由將組裝之重疊群定位至Ensemble v87 V(D)J參考序列來註釋。將純系型定義為獨特CDR3胺基酸序列之α、β鏈對。針對以2個細胞以上頻率存在之單一α及單一β鏈對過濾純系型以產生特定供者中之純系型/靶肽之最終列表。
利用針對ASSLPTTMNY之6個實驗及針對HSEVGLPVY靶之2個實驗分析兩種不同供者。圖20A及20B各者顯示每個實驗分離之靶特異性T細胞之數目及每個實驗鑑別之靶特異性獨特純系型之數目。各顏色代表來自一個實驗之資料。
表13描述跨所有實驗鑑別之T細胞及獨特TCR之累積數目及靶特異性T細胞/3百萬個初始CD8 T細胞之平均數目。
經鑑別之對HLA-肽*01：01_ASSLPTTMNY特異性之TCR純系型之註釋序列示於下表14中。為了清晰，將各經鑑別之TCR指配TCR ID編號。例如，指配TCR ID編號1之TCR包含TRAV25序列、TRAJ37序列、TRAC序列、TRBV19序列、TRBD1序列、TRBJ1-5序列及TRBC1序列。
經鑑別之TCR對HLA-肽A*01：01_ASSLPTTMNY特異性之純系型之α及βCDR3序列示於表15中。為了清晰，如於表14中，將各經鑑別之TCR指配TCR ID編號。例如，TCR ID編號1包含αCDR3序列CAGPGNTGKLIF及βCDR3序列CASSNAGDQPQHF。
經鑑別之對HLA-肽A*01：01_ASSLPTTMNY特異性之TCR純系型之全長αV(J)及βV(D)J序列示於表16中。例如，TCR ID編號1包含αV(J)序列MLLITSMLVLWMQLSQVNGQQVMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSSTTLSNIQWYKQRPGGHPVFLIQLVKSGEVKKQKRLTFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYFCAGPGNTGKLIFGQGTTLQVK及βV(D)J序列 MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSNAGDQPQHFGDGTRLSIL。
經鑑別之對HLA-肽A*01：01_HSEVGLPVY特異性之TCR純系型之註釋序列示於下表17中。為了清晰，將各經鑑別之TCR指配TCR ID編號。例如，指配TCR ID編號345之TCR包含TRAV13-1序列、TRAJ20序列、TRAC序列、TRBV7-9序列、TRBJ2-7序列及TRBC2序列。
經鑑別之對HLA-肽*01：01_HSEVGLPVY特異性之TCR純系型之α及βCDR3序列示於表18中。為了清晰，如於表17中，將各經鑑別之TCR指配TCR ID編號。例如，TCR ID編號345包含αCDR3序列CAANPGDYKLSF及βCDR3序列CASSSNYEQYF。
經鑑別之對HLA-肽*01：01_HSEVGLPVY特異性之TCR純系型之全長αV(J)及βV(D)J序列示於表19中。為了清晰，如於表17中，將各經鑑別之TCR指配TCR ID編號。例如，TCR ID編號345包含αV(J)序列MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKGPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAANPGDYKLSFGAGTTVTVR及βV(D)J序列MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSSNYEQYFGPGTRLTVT。
實例9：鑑別結合HLA-肽複合體之抗體或其抗原結合片段
鑑別靶向呈遞腫瘤抗原之MHC I類分子之單鏈可變片段(scFv)抗體
使用噬菌體呈現鑑別靶向呈遞所關注之腫瘤抗原之人類I類MHC分子之強效且選擇性單鏈抗體。製備噬菌體庫用於藉由移除非特異性I類MHC結合劑來篩選。利用不同於靶pMHC之多個可溶性人類肽-MHC(pMHC)分子篩選先已存在之噬菌體庫以移除非特異性結合I類MHC之scFv。為鑑別選擇性結合所關注之pMHC之scFv，利用靶pMHC進行至少1至3輪之用製備好之噬菌體庫淘選。然後對一組不相關pMHC評價於篩選中鑑別之scFv命中以鑑別選擇性結合至靶pMHC之scFv前導。將前導scFv表徵以測定靶結合特異性及親和力。將證明強效且選擇性結合之前導scFv轉變成全長IgG單株抗體(mAb)構築體。此外，將該等前導scFv併入雙特異性mAb構築體及可用於產生CAR T-細胞之嵌合抗原受體(CAR)構 築體。可構建全長雙特異性或基於scFV之雙特異性。
證明靶向活體外人類腫瘤細胞
利用免疫組織化學技術證明前導抗體與表現靶pMHC分子之人類腫瘤細胞或細胞系之特異性結合。將利用CAR-T構築體轉染之T細胞系用人類腫瘤細胞培育以證明殺死活體外腫瘤細胞。或者，將表現該靶之腫瘤細胞用雙特異性構築體(編碼ABP及效應域)及PBMC或T細胞培育。
活體內觀念證明
於活體內評價前導抗體或CAR-T構築體以證明人源化小鼠腫瘤模型中之定向腫瘤殺死。於植入人類腫瘤及PBMC之異種移植腫瘤模型中評價前導抗體或CAR-T構築體。量測抗腫瘤活性及與對照構築體相比以證明靶特異性腫瘤殺死。
使用兔B細胞選殖技術鑑別靶向呈遞腫瘤抗原之MHC I類分子之單株抗體(mAb)
鑑別靶向呈遞所關注之腫瘤抗原之人類I類MHC分子之強效且選擇性mAb。利用呈遞人類腫瘤抗原之可溶性人類pMHC分子用於免疫多隻小鼠或兔子，接著篩選源自經免疫動物之B細胞以鑑別表現結合至靶I類MHC分子之mAb之B細胞。編碼從小鼠或兔子篩選鑑別之mAb之序列係自分離B細胞選殖。然後該經回收mAB對比一組不相關pMHC進行評估以鑑別出選擇性結合至靶pMHC之前導mAb。將前導mAb完全表徵以測定靶結合親和力及選擇性。將證明強效且具選擇性結合之前導mAb人源化以產生全長人類IgG單株抗體(mAb)構築體。此外，將該等前導mAb併入雙特異性mAb構築體及可用於產生CAR T-細胞之嵌合抗原受體(CAR)構築體。可構建全長雙特異性或基於scFV之雙特異性。
證明活體外靶向人類腫瘤細胞
利用免疫組織化學技術證明前導抗體與表現靶pMHC分子 之人類腫瘤細胞之特異性結合。將利用CAR-T構築體轉染之T細胞系用人類腫瘤細胞培育以證明殺死活體外腫瘤細胞。或者，將表現該靶之腫瘤細胞用雙特異性構築體(編碼ABP及效應域)及PBMC或T細胞培育。
活體內觀念證明
於活體內評價前導抗體或CAR-T構築體以證明人源化小鼠腫瘤模型中之定向腫瘤殺死。於植入人類PBMC之異種移植腫瘤模型中評價前導抗體或CAR-T構築體。量測抗腫瘤活性及與對照構築體相比以證明靶依賴性腫瘤殺死。
將使用噬菌體呈現或B細胞選殖技術鑑別選擇性靶向呈遞腫瘤抗原之人類I類MHC分子之強效且選擇性ABP。ABP之效用將藉由顯示當併入抗體或CAR-T細胞構築體時，活體外及活體內ABP介導之腫瘤細胞殺死證明。
實例10：鑑別結合HLA-肽複合體之TCR
為選擇特異性鑑別共有抗原MHC/肽靶(SAT)之天然高親和力TCR，採用下列實驗步驟：
1.鑑別及分離MHC/肽靶反應性TCR
2.產生經工程改造之TCR T細胞
3.驗證TCR特異性
鑑別MHC/肽靶反應性TCR
將T細胞自患者之血液、淋巴結或腫瘤分離。將患者HLA匹配至SAT，及基於帶靶蛋白之表現選擇。然後針對SAT特異性T細胞，(例如)藉由分選SAT-MHC四聚體結合細胞或藉由分選於T細胞及經SAT脈衝之抗原呈遞細胞之活體外共同培養中刺激之激活細胞將T細胞濃化。
藉由SAT特異性T細胞之TCR之單細胞定序鑑別SAT相關之α-βTCR二聚體。或者，進行SAT特異性T細胞之批量TCR定序及使用TCR配對方法測定具有高概率匹配之α-β對。
或者或此外，可通過來自健康供者之初始T細胞之活體外啟動獲得SAT特異性T細胞。藉由經SAT脈衝之抗原呈遞細胞重複刺激獲自PBMC、淋巴結或臍帶血之T細胞以啟動抗原經歷型T細胞之分化。然後如上針對來自患者之SAT特異性T細胞所述類似鑑別TCR。
產生經工程改造之TCR T細胞
將TCR α及β鏈序列選殖至適宜構築體。將TCR自體同源或異種散裝T細胞用該等構築體轉導以產生經工程改造之TCR T細胞。在抗CD3抗體及IL-2細胞激素之存在下，將此等T細胞擴增用於後續實驗。於某些情況下，將初始TCR刪除或將插入之TCR修飾以增加適當多聚化。
活體外驗證TCR特異性
首先，使用表現適宜MHC之抗原呈遞細胞篩選負載經工程改造之TCR之T細胞的靶識別及用適宜靶脈衝。
然後測試於第一輪篩選中鑑別之TCR用於識別自然靶。基於HLA匹配之初始腫瘤及表現帶SAT蛋白之腫瘤細胞系之特異性識別提名前導TCR。
為確保特異性，基於脫靶識別取消選擇前導TCR。將其對覆蓋多個組織及器官類型之一組HLA匹配及錯配之細胞系及用一組傳染性疾病抗原脈衝之HLA匹配及錯配之抗原呈遞細胞篩選。取消選擇具有自體抗原或共用非自體抗原之特異性及非特異性脫靶識別之TCR。
實例11：鑑別MHC/肽靶反應性TCR
將T細胞自患者之血液、淋巴結或腫瘤分離。將患者HLA匹配至SAT，及基於帶靶蛋白之表現選擇。然後針對SAT特異性T細胞，(例如)藉由分選SAT-MHC四聚體結合細胞或藉由分選於T細胞及經SAT脈衝之抗原呈遞細胞之活體外共同培養中刺激之激活細胞將T細胞濃化。
藉由SAT特異性T細胞之TCR之單細胞定序鑑別SAT相關之α-βTCR二聚體。或者，進行SAT特異性T細胞之批量TCR定序及使用TCR配對方法測定具有高概率匹配之α-β對。
或者或此外，可通過來自健康供者之初始T細胞之活體外啟動獲得SAT特異性T細胞。藉由經SAT脈衝之抗原呈遞細胞重複刺激獲自PBMC、淋巴結或臍帶血之T細胞以啟動抗原經歷型T細胞之分化。然後如上針對來自患者之SAT特異性T細胞所述類似鑑別TCR。
實例12：產生經工程改造之TCR T細胞
將TCR α及β鏈序列選殖至適宜構築體。將TCR自體同源或異種散裝T細胞用該等構築體轉導以產生經工程改造之TCR T細胞。在抗CD3抗體及IL-2細胞激素之存在下，將此等T細胞擴增用於後續實驗。於某些情況下，將初始TCR刪除或將插入之TCR修飾以增加適當多聚化。
活體外驗證TCR特異性
首先，使用表現適宜MHC之抗原呈遞細胞篩選負載經工程改造之TCR之T細胞的靶識別及用適宜靶脈衝。
然後測試於第一輪篩選中鑑別之TCR用於識別自然靶。基於HLA匹配之初始腫瘤及表現帶SAT蛋白之腫瘤細胞系之特異性識別提名前導TCR。
為確保特異性，基於脫靶識別取消選擇前導TCR。將其對覆蓋多個組織及器官類型之一組HLA匹配及錯配之細胞系及用一組傳染性疾病抗原脈衝之HLA匹配及錯配之抗原呈遞細胞篩選。取消選擇具有自體抗原或共用非自體抗原之特異性及非特異性脫靶識別之TCR。
實例13：使用兔B細胞選殖技術鑑別靶向呈遞腫瘤抗原之MHC I類分子之單株抗體(mAb)
鑑別靶向呈遞所關注之腫瘤抗原之人類I類MHC分子之強效且具選擇性mAb。利用呈遞人類腫瘤抗原之可溶性人類pMHC分子用於免疫多隻小鼠或兔子，接著篩選源自經免疫動物之B細胞以鑑別表現結合至靶I類MHC分子之mAb之B細胞。編碼從小鼠或兔篩選所鑑別之mAb的序列係選殖自分離B細胞。然後該經回收之mAB對比一組不相關pMHC進行評估以鑑別出選擇性結合至靶pMHC之前導mAb。將前導mAb完全表徵 以判定靶結合親和力及選擇性。將證明強效且具選擇性結合之前導mAb人源化以產生全長人類IgG單株抗體(mAb)構築體。此外，將該等前導mAb併入雙特異性mAb構築體及可用於產生CAR T-細胞之嵌合抗原受體(CAR)構築體。可構建全長雙特異性或基於scFV之雙特異性。
證明靶向活體外人類腫瘤細胞
利用免疫組織化學技術證明前導抗體與表現靶pMHC分子之人類腫瘤細胞之特異性結合。將利用CAR-T構築體轉染之T細胞系用人類腫瘤細胞培育以證明殺死活體外腫瘤細胞。或者，將表現該靶之腫瘤細胞用雙特異性構築體(編碼ABP及效應域)及PBMC或T細胞培育。
活體內觀念證明
於活體內評價前導抗體或CAR-T構築體以證明人源化小鼠腫瘤模型中之定向腫瘤殺死。於植入人類PBMC之異種移植腫瘤模型中評價前導抗體或CAR-T構築體。量測抗腫瘤活性及與對照構築體相比以證明靶依賴性腫瘤殺死。
將使用噬菌體呈現或B細胞選殖技術鑑別選擇性靶向呈遞腫瘤抗原之人類I類MHC分子之強效且選擇性ABP。ABP之效用將藉由顯示當併入抗體或CAR-T細胞構築體時，活體外及活體內ABP介導之腫瘤細胞殺死證明。
實例14：藉由氫/氘交換及質譜法評估scFv-pHLA或Fab-pHLA結構
實驗程序
氫/氘交換。
在室溫(20至25℃)下，將20μM HLA-肽用3倍莫耳過量之scFv蛋白質培育20分鐘以產生用於交換實驗之複合體。針對Apo對照，將HLA-肽用等體積之50mM NaCl、20mM Tris pH 8.0培育。在4℃下，藉由Chronos 4.8.0軟體(Leap Technologies,Morrisville,NC)控制之自動化HDX PAL系統進行所有後續反應步驟。一式兩份進行氘交換。將5μl蛋白質複合體於50mM NaCl、20mM Tris pH 8.0中稀釋10倍(持續0分鐘， 對照時間點)或用D2O製備之相同緩衝液中稀釋10倍持續30秒，接著於0.8M鹽酸胍、0.4%乙酸(v/v)及75mM三(2-羧乙基)膦中定序持續3分鐘。將約50pmol之中止蛋白質複合體轉移至固定蛋白質XIII/胃蛋白酶管柱(NovaBioAssays,Woburn,MA)上用於經整合之線上蛋白質消化。
液相層析法、質譜法及HDX分析
使用含有阱C18管柱(5μM粒徑及2.1mm直徑)及分析C18管柱(1.9μM粒徑及1mm直徑)之UltiMate 3000 Basic Manual UHPLC系統(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)進行肽之層析法分離。將樣品用10%乙腈、0.05%三氟乙酸以40μl/min流率脫鹽2分鐘及將肽用增加濃度之95%乙腈、0.05%三氟乙酸以40μl/min流率溶離。利用具有設置在3800V之正離子電壓下之ESI源之Orbitrap Fusion Lumos質譜儀(ThermoFisher,Waltham,MA)進行質譜法。在進行氫-氘交換實驗之前，藉由資料依賴性LC/MS/MS及使用具有10ppm之肽前驅體重量公差及0.1Da之片段離子重量公差之PEAKS工作室(Bioinformatics Solutions Inc.,Waterloo,ON,Canada)搜索之資料分析各HLA-肽複合體之肽片段。搜索HLA、β2M及肽之序列，及使用誘餌-資料庫策略鑑別虛假檢測率。藉由LC/MS檢測及藉由具有0.22分鐘之滯留時間視窗大小及7.0ppm誤差之HDX工作平臺(Omics Informatics,Honolulu,HI)分析來自氫-氘實驗之肽。使用Pymol(Schrödinger,Cambridge,MA)將氘吸收之差異定位至相關蛋白質結晶結構。
結果
圖21A顯示當用scFv純系G8-P1H08培育時，G8 HLA-肽複合體之HLA部分之示例性熱圖，其使用合併擾動視圖其整體視覺化。
來自實例15中所述之晶體結構上繪製之scFv G8-P1H08之資料之實例示於圖21B中。
圖45A顯示當用scFv純系G8-P1C11培育時，G8 HLA-肽複合體之HLA部分之示例性熱圖，其使用合併擾動視圖其整體視覺化。
來自實例15中所述之晶體結構上繪製之scFv G8-P1C11之資料之實例示於圖45B中。
圖23A顯示當用scFv純系R3G10-P2G11培育時，G10 HLA-肽複合體之HLA部分之示例性熱圖，其使用合併擾動視圖其整體視覺化。
來自晶體結構PDB5bs0上繪製之scFv R3G10-P2G11之資料之實例示於圖23B中。描述藉由α1及α2螺旋形成之HLA結合裂縫中之限制性肽之晶體結構可見於URL https：//www.rcsb.org/structure/5bs0(Raman等人)。
為更好比較跨針對特定HLA-肽靶測試之ABP之資料，輸出各ABP之資料，及於Excel中產生熱圖。圖22A顯示跨針對HLA-肽靶G8(HLA-A*02：01_AIFPGAVPAA)測試之所有ABP之HLA α1螺旋之所得熱圖。圖22B顯示跨針對HLA-肽靶G8(HLA-A*02：01_AIFPGAVPAA)測試之所有ABP之HLA α2螺旋之所得熱圖。圖22C顯示跨所測試之所有ABP之限制性肽AIFPGAVPAA之所得熱圖。該等熱圖指示HLA-肽靶G8(HLA-A*02：01_AIFPGAVPAA)之HLA蛋白質(於α1螺旋中)之位置45至60，如可直接或間接參與決定HLA-肽靶與基於G8特異性抗體之ABP之間之相互作用。
圖24A顯示跨針對HLA-肽靶G10(HLA-A*01：01_ASSLPTTMNY)測試之所有ABP之HLA α1螺旋之所得熱圖。圖24B顯示跨針對HLA-肽靶G10(HLA-A*01：01_ASSLPTTMNY)測試之所有ABP之HLA α2螺旋之所得熱圖。圖24C顯示跨所測試之所有ABP之限制性肽ASSLPTTMNY之所得熱圖。該等熱圖指示HLA-肽靶G10(HLA- A*01：01_ASSLPTTMNY)之HLA蛋白質(於α1螺旋中)之位置49至56，如可直接或間接參與決定HLA-肽靶與基於G10特異性抗體之ABP之間之相互作用。
實例15：藉由結晶學評估Fab-pHLA結構
材料及方法
複合體純化及晶體篩選
將對應於(例如)HLA-肽靶G8(A*02：01_AIFPGAVPAA)之Fab片段濃縮以達到5mg/mL(100μM)，然後添加其對應HLA-MHC(1：1莫耳比率)及在4℃下培育30分鐘。然後將混合物在於1X PBS緩衝液中平衡之尺寸排除層析管柱(S200 16/60)上注射用於複合體純化。將含有Fab及HLA二者及具有與約94kDa之複合體一致之溶離體積之級分彙集及濃縮至10至12mg/mL(1AU=1mg/mL)。針對結晶條件使用以下商品篩篩選各經純化之複合體：PEGIon(Hampton research)、JCSG+(Molecular Dimensions)及JBS Screen 3及4(Jena Biosciences)。套組之選擇藉由表徵HLA-Fab複合體之已知結晶條件驅動，該等複合體主要基於使用PEG3350或PEG4000作為沉澱劑。於篩選後3至4週，於若干結晶條件(表24)下，繞射適宜晶體出現HLA-Fab組合。藉由UV檢查晶體之蛋白質性質。將晶體轉移至冷凍保護劑溶液(補充有25%甘油之結晶溶液)中及於液氮中快速冷凍。
數據收集及處理
在SOLEIL同步加速器(Gif sur Yvette,France)上在Proxima 2A光束線上收集繞射數據。使用XDS(1)進行數據處理及定標。使用來自CCP4套件(2)之MolRep及Arp/Warp使用針對HLA之PDB 5E6I (100%序列同一性)及針對Fab之5AZE(與VH之90%序列同一性)及5I15(與VL之97%序列同一性)作為進入模型進行分子置換。使用Buster TNT(GlobalPhasing,Inc)及Coot(CCP4套件)中之手工模型修改進行精修。
複合體純化
組合物產生個別蛋白質峰與形成之複合體峰之間之良好分離(圖28A)。增加培育時間至16小時(過夜)不改變所形成之複合體之比率(約50%之蛋白質存在於複合體中及50%作為有利蛋白質)。在還原條件下，藉由SDS PAGE之峰分析顯示彙集級分中之Fab鏈(30kDa)、HLA重鏈(約35kDa)及HLA輕鏈(BLM，<10kDa)之存在(圖28B)。
結晶及資料收集
將複合體彙集之級分濃縮及篩選。於3至4週後，晶體出現HLA-Fab複合體中之一些。A*02：01_AIFPGAVPAA-G8-P1C11 Fab複合體及所得晶體形成之結晶條件之概述示於表24中。
脫離所測試之條件，四種產生晶體。兩種產生繞射孔(1.7至2.0Å解析度)之晶體及經整合至P1空間組(表24)。結構解析可藉由組合分子置換(MolRep)與使用Arp/Warp之軟體自動建模。
包含Fab純系G8-P1C11及HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)之複合體之示例性晶體示於圖29中。此晶體使用商品篩JCSG，使用25%(w/v)PEG 3350 100mM Bis-Tris/鹽酸pH 5.5生長。使用此晶體產生以下結構資料。
結構分析
藉由結合Fab純系G8-P1C11至HLA-肽靶A*02：01_AIFPGAVPAA(「G8」)形成之複合體之整體結構示於圖30中。將個別蛋白質表示為平面。HLA與VH及VL之間之介面面積各自為747Å2及285Å2。
在精修期間，對應於肽之電子密度區係清晰可見及允許利用所提供之10個殘餘肽序列AIFPGAVPAA之肽側鏈清楚定位(圖31)。將與相互作用介面相關之所有區域精修；然而，於抗體恆定區仍需要一些精修。
下表25中提供下列資料中提及之複合體中之單體之編碼。
表25：於晶體分析中使用之單體編碼
HLA-肽相互作用
將限制性肽AIFPGAVPAA利用向Fab突出之殘基P4G5A6主要掩埋於HLA A*02：01結合口袋中。肽與HLA之間之相互作用表面為926Å2且代表總肽溶劑可達表面(1215Å2)之76%。肽與HLA之結合涉及9種氫鍵及範德瓦爾斯(van der Waals)相互作用(圖32)及產生-16.4kcal/mol之結合能。
氫相互作用之列表示於下表26中。
HLA與限制性肽之完全介面匯總示於圖37中。
來自限制性肽之殘基與HLA之相互作用之完全列表示於圖38中。
Fab-限制性肽相互作用
由於大多數肽掩埋於HLA之結合口袋中，僅其部分可用於與Fab鏈相互作用。此藉由觀察到肽之溶劑可達區之76%藉由其與HLA相 互作用佔據證實。肽與Fab之重鏈及輕鏈之間之相互作用表面各自為114.3及113.9Å2。此對應於總肽溶劑可達區之18%。PISA分析顯示僅兩種氫鍵涉及Fab與肽之間之相互作用：來自輕鏈之Tyr32之羥基與肽之Gly5之主鏈羰基相互作用及Tyr100A主鏈醯胺與肽之Pro4之主鏈羰基相互作用(參見以下針對氫相互作用之列表之表27)。
朝向限制性肽之Fab之識別模式係主要通過疏水相互作用及涉及溶劑分子之氫鍵(圖33及34)。Fab與限制性肽之間之相互作用之結合能各自為VH及VL鏈-2.0及-1.9kcal/mol。
Fab VH鏈與限制性肽之完全介面匯總，及來自Fab VH鏈之殘基與限制性肽相互作用之完全列表示於圖39中。
Fab VL鏈與限制性肽之完全介面匯總，及來自Fab VL鏈之殘基與限制性肽相互作用之完全列表示於圖40中。
Fab-HLA相互作用
Fab與HLA部分廣泛相互作用，如由總共1032Å2之HLA與Fab之間之介面面積所示。HLA與VH鏈之間之相互作用由疏水相互作用、6個H鍵及3個鹽橋組成(圖35，VH與HLA之間之相互作用；及圖36，VL與HLA之間之相互作用)。此相互作用表示主要相互作用具有747Å2(總接觸面積之72%)。
以下顯示Fab之VH鏈與HLA蛋白質之間之氫鍵接觸之表。
以下顯示Fab之VH鏈與HLA蛋白質之間鹽橋接觸之表。
Fab VH鏈HLA蛋白質之完全介面匯總示於圖41中。
來自Fab VH鏈之殘基與HLA蛋白質相互作用之完全列表示於圖42中。
Fab之VL鏈與HLA蛋白質之間之氫鍵接觸之列表示於下表30中。
Fab VL鏈HLA蛋白質之完全介面匯總示於圖43中。
來自Fab VL鏈之殘基與HLA蛋白質相互作用之完全列表示於圖44中。
雖然已參考較佳實施例及各種替代實施例特定顯示及描述本發明，但是熟習相關技術者應瞭解其中在不背離本發明之精神及範圍下可作出形式及細節之各種變化。
出於所有目的，於本說明書之主體內引用之所有參考文獻、發行之專利及專利申請案之全文以引用的方式併入本文中。
序列
表9：經鑑別之至G10之scFv的CDR序列(根據Kabat編號方案編號)

Claims (177)

  1. 一種特異性結合至人類白血球抗原(HLA)-肽靶之經分離抗原結合蛋白(ABP)，其中該HLA-肽靶包含與HLA I類分子複合之HLA-限制性肽，其中該HLA-限制性肽位於該HLA I類分子之α1/α2異二聚體部分之肽結合溝槽中，且其中：a.該HLA I類分子為HLA亞型B*35：01且該HLA-限制性肽包含序列EVDPIGHVY，b.該HLA I類分子為HLA亞型A*02：01且該HLA-限制性肽包含序列AIFPGAVPAA，c.該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽包含序列ASSLPTTMNY；或d.該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽包含序列HSEVGLPVY。
  2. 如請求項1之經分離ABP，其中該HLA-限制性肽之長度係介於約5至15個胺基酸之間。
  3. 如請求項2之經分離ABP，其中該HLA-限制性肽之長度係介於約8至12個胺基酸之間。
  4. 如請求項1至3中任一項之經分離ABP，其中a.該HLA I類分子為HLA亞型B*35：01且該HLA-限制性肽由序列 EVDPIGHVY組成，b.該HLA I類分子為HLA亞型A*02：01且該HLA-限制性肽由序列AIFPGAVPAA組成，c.該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽由序列ASSLPTTMNY組成；或d.該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽由序列HSEVGLPVY組成。
  5. 如前述請求項中任一項之經分離ABP，其中該ABP包括抗體或其抗原結合片段。
  6. 如請求項5之經分離ABP，其中該HLA I類分子為HLA亞型B*35：01且該HLA-限制性肽包含該序列EVDPIGHVY。
  7. 如請求項6之經分離ABP，其中該HLA I類分子為HLA亞型B*35：01且該HLA-限制性肽由該序列EVDPIGHVY組成。
  8. 如請求項6或7之經分離ABP，其中該ABP包括CDR-H3，該CDR-H3包含選自以下之序列：CARDGVRYYGMDVW、CARGVRGYDRSAGYW、CASHDYGDYGEYFQHW、CARVSWYCSSTSCGVNWFDPW、CAKVNWNDGPYFDYW、CATPTNSGYYGPYYYYGMDVW、CARDVMDVW、CAREGYGMDVW、CARDNGVGVDYW、 CARGIADSGSYYGNGRDYYYGMDVW、CARGDYYFDYW、CARDGTRYYGMDVW、CARDVVANFDYW、CARGHSSGWYYYYGMDVW、CAKDLGSYGGYYW、CARSWFGGFNYHYYGMDVW、CARELPIGYGMDVW及CARGGSYYYYGMDVW。
  9. 如請求項6至8中任一項之經分離ABP，其中該ABP包括CDR-L3，該CDR-L3包含選自以下之序列：CMQGLQTPITF、CMQALQTPPTF、CQQAISFPLTF、CQQANSFPLTF、CQQANSFPLTF、CQQSYSIPLTF、CQQTYMMPYTF、CQQSYITPWTF、CQQSYITPYTF、CQQYYTTPYTF、CQQSYSTPLTF、CMQALQTPLTF、CQQYGSWPRTF、CQQSYSTPVTF、CMQALQTPYTF、CQQANSFPFTF、CMQALQTPLTF及CQQSYSTPLTF。
  10. 如請求項6至9中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含來自scFv之CDR-H3及CDR-L3，該scFv指定為：G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07或G5R4-P4B01。
  11. 如請求項6至10中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含來自scFv之所有三條重鏈CDR及所有三條輕鏈CDR，該scFv指定為：G5_P7_E7、 G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07或G5R4-P4B01。
  12. 如請求項6至11中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含選自以下之VH序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGIINPRSGSTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSAS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSHDINWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGDTGYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGVRGYDRSAGYWGQGTLVIVSSAS、EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSSYWMSWVRQAPGKGLEWISYISGDSGYTNYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCASHDYGDYGEYFQHWGQGTLVTVSSAS、EVQLLQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSDMNWVRQAPGKGLEWVAYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSWYCSSTSCGVNWFDPWGQGTLVTVSSAS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSDMNWVRQAPGKGLEWVASISSSGGYINYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVNWNDGPYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNFGVSWLRQAPGQGLE WMGGIIPILGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPTNSGYYGPYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDVMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSGYLVSWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNTAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFRNYPMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDNGVGVDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNIGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGIADSGSYYGNGRDYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYGISWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGVTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGDTKYSQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGTRYYGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSYTNYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDVVANFDYWGQGTLVTVSS、 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWMNPDSGSTGYAQRFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGHSSGWYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMHWVRQAPGKGLEWVSSITSFTNTMYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLGSYGGYYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSWFGGFNYHYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARELPIGYGMDVWGQGTTVTVSS、及QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIVGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS。
  13. 如請求項6至12中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含選自以下之VL序列：DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLQTPITFGQGTRLEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSSRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQ ALQTPPTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAISFPLTFGQSTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYMMPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYITPWTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYITPYTFGQGTKLEIK、DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKTSQSVLYRPNNENYLAWYQQKPG QPPKLLIYQASIREPGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRFLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRPQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSHRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK、EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYAASARASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYGSWPRTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPVTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDISNHLNWYQQKPGKAPKLLIYDALSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGQGTKVEIK、及 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
  14. 如請求項6至13中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含來自scFv之VH序列及VL序列，該scFv指定為：G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07及G5R4-P4B01。
  15. 如請求項6至14中任一項之經分離ABP，其中該ABP結合至該限制性肽EVDPIGHVY之胺基酸位置2至8中之任一者或多者。
  16. 如請求項5之經分離ABP，其中該HLA I類分子為HLA亞型A*02：01且該HLA-限制性肽包含該序列AIFPGAVPAA。
  17. 如請求項16之經分離ABP，其中該HLA I類分子為HLA亞型A*02：01且該HLA-限制性肽由該序列AIFPGAVPAA組成。
  18. 如請求項16或17之經分離ABP，其中該ABP包括CDR-H3，該CDR-H3包含選自以下之序列：CARDDYGDYVAYFQHW、CARDLSYYYGMDVW、CARVYDFWSVLSGFDIW、 CARVEQGYDIYYYYYMDVW、CARSYDYGDYLNFDYW、CARASGSGYYYYYGMDVW、CAASTWIQPFDYW、CASNGNYYGSGSYYNYW、CARAVYYDFWSGPFDYW、CAKGGIYYGSGSYPSW、CARGLYYMDVW、CARGLYGDYFLYYGMDVW、CARGLLGFGEFLTYGMDVW、CARDRDSSWTYYYYGMDVW、CARGLYGDYFLYYGMDVW、CARGDYYDSSGYYFPVYFDYW及CAKDPFWSGHYYYYGMDVW。
  19. 如請求項16至18中任一項之經分離ABP，其中該ABP包括CDR-L3，該CDR-L3包含選自以下之序列：CQQNYNSVTF、CQQSYNTPWTF、CGQSYSTPPTF、CQQSYSAPYTF、CQQSYSIPPTF、CQQSYSAPYTF、CQQHNSYPPTF、CQQYSTYPITI、CQQANSFPWTF、CQQSHSTPQTF、CQQSYSTPLTF、CQQSYSTPLTF、CQQTYSTPWTF、CQQYGSSPYTF、CQQSHSTPLTF、CQQANGFPLTF及CQQSYSTPLTF。
  20. 如請求項16至19中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含來自scFv之CDR-H3及CDR-L3，該scFv指定為：G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01或G8-P2C11。
  21. 如請求項16至20中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含來自scFv 之所有三條重鏈CDR及所有三條輕鏈CDR，該scFv指定為：G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01或G8-P2C11。
  22. 如請求項16至21中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含選自以下之VH序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSRSAITWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGATNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYGDYVAYFQHWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFIGQYLHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGDSATYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDLSYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPIGGGTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVYDFWSVLSGFDIWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVEQGYDIYYYYYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTLSSYPINWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGHADYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYDYGDYLNFDYWGQGTLVTVSS、 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSSISGRGDNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASGSGYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYFMHWVRQAPGQGLEWMGMVNPSGGSETFAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAASTWIQPFDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASNGNYYGSGSYYNYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTTYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAVYYDFWSGPFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGGIYYGSGSYPSWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYGVSWVRQAPGQGLEWMGWISPYSGNTDYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNMYLHWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGDTNYAQTFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYGDYFLYYGMDVWGQGTKVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSED TAVYYCARGLLGFGEFLTYGMDVWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTTYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDRDSSWTYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSNYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYGDYFLYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSHAISWVRQAPGQGLEWMGVIIPSGGTSYTQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDSSGYYFPVYFDYWGQGTLVTVSS、及QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDPFWSGHYYYYGMDVWGQGTTVTVSS。
  23. 如請求項16至22中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含選自以下之VL序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSITSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNYNSVTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCWASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTPWTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAISNSLAWYQQKPGKAPKLLI YAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSTPPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPPTFGGGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNSYPPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPITIGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPWTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSTPQTFGQGTKVEIK、 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSTPWTFGQGTKLEIK、EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGNSLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYGSSPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISGYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSTPLTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYTYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANGFPLTFGGGTKVEIK、及DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
  24. 如請求項16至23中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含來自scFv 之VH序列及VL序列，該scFv指定為：G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01或G8-P2C11。
  25. 如請求項16至24中任一項之經分離ABP，其中該ABP結合至該限制性肽AIFPGAVPAA之胺基酸位置1至5中之任一者或多者。
  26. 如請求項25之經分離ABP，其中該ABP結合至該限制性肽AIFPGAVPAA之胺基酸位置4及5之一者或二者。
  27. 如請求項16至26中任一項之經分離ABP，其中該ABP結合至HLA亞型A*02：01之胺基酸位置45至60中之任一者或多者。
  28. 如請求項16至27中任一項之經分離ABP，其中該ABP結合至HLA亞型A*02：01之胺基酸位置56、59、60、63、64、66、67、70、73、74、132、150至153、155、156、158至160、162至164、166至168、170及171中之任一者或多者。
  29. 如請求項5之經分離ABP，其中該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽包含該序列ASSLPTTMNY。
  30. 如請求項29之經分離ABP，其中該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01 且該HLA-限制性肽由該序列ASSLPTTMNY組成。
  31. 如請求項29或30之經分離ABP，其中該ABP包括CDR-H3，該CDR-H3包含選自以下之序列：CARDQDTIFGVVITWFDPW、CARDKVYGDGFDPW、CAREDDSMDVW、CARDSSGLDPW、CARGVGNLDYW、CARDAHQYYDFWSGYYSGTYYYGMDVW、CAREQWPSYWYFDLW、CARDRGYSYGYFDYW、CARGSGDPNYYYYYGLDVW、CARDTGDHFDYW、CARAENGMDVW、CARDPGGYMDVW、CARDGDAFDIW、CARDMGDAFDIW、CAREEDGMDVW、CARDTGDHFDYW、CARGEYSSGFFFVGWFDLW及CARETGDDAFDIW。
  32. 如請求項29至31中任一項之經分離ABP，其中該ABP包括CDR-L3，該CDR-L3包含選自以下之序列：CQQYFTTPYTF、CQQAEAFPYTF、CQQSYSTPITF、CQQSYIIPYTF、CHQTYSTPLTF、CQQAYSFPWTF、CQQGYSTPLTF、CQQANSFPRTF、CQQANSLPYTF、CQQSYSTPFTF、CQQSYSTPFTF、CQQSYGVPTF、CQQSYSTPLTF、CQQSYSTPLTF、CQQYYSYPWTF、CQQSYSTPFTF、CMQTLKTPLSF及CQQSYSTPLTF。
  33. 如請求項29至32中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含來自scFv之CDR-H3及CDR-L3，該scFv指定為：R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、 R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08或R3G10-P5C08。
  34. 如請求項29至33中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含來自scFv之所有三條重鏈CDR及所有三條輕鏈CDR，該scFv指定為：R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08或R3G10-P5C08。
  35. 如請求項29至34中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含選自以下之VH序列：EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGISARSGRTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDQDTIFGVVITWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIHPGGGTTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDKVYGDGFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTA VYYCAREDDSMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFIGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDSSGLDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVGNLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGVTFSTSAISWVRQAPGQGLEWMGWISPYNGNTDYAQMLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDAHQYYDFWSGYYSGTYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNSIINWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREQWPSYWYFDLWGRGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSTHDINWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSAIYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDRGYSYGYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGNTFIGYYVHWVRQAPGQGLEWVGIINPNGGSISYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSGDPNYYYYYGLDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLSYYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTGTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGDHFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGL EWMGIIGPSDGSTTYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAENGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYVHWVRQAPGQGLEWMGIIAPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGGYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYLHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGDAFDIWGQGTMVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGRISPSDGSTTYAPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDMGDAFDIWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEDGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLSYYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTGTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGDHFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNNFAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDATNYAQKFQGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEYSSGFFFVGWFDLWGRGTQVTVSS、及QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIAPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETGDDAFDIWGQGTMVTVSS。
  36. 如請求項29至35中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含選自以下之VL序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYFTTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIFDASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAEAFPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPITFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYIIPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQTYSTPLTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYSFPWTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYSTPLT FGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISRYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPRTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSLPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASKLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYGVPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISTYLAWYQQKPGKAPKLLI YDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPWTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQTLKTPLSFGGGTKVEIK、及DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
  37. 如請求項29至36中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含來自scFv之VH序列及VL序列，該scFv指定為：R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08或R3G10-P5C08。
  38. 如請求項29至37中任一項之經分離ABP，其中該ABP結合至該限制性肽ASSLPTTMNY之胺基酸位置4、6及7中之任一者或多者。
  39. 如請求項29至38中任一項之經分離ABP，其中該ABP結合至HLA亞 型A*01：01之胺基酸位置49至56中之任一者或多者。
  40. 一種特異性結合至人類白血球抗原(HLA)-肽靶之經分離抗原結合蛋白(ABP)，其中該HLA-肽靶包括與HLA I類分子複合之HLA-限制性肽，其中該HLA-限制性肽位於該HLA I類分子之α1/α2異二聚體部分之肽結合溝槽，且其中該HLA-肽靶係選自表A。
  41. 如請求項40之經分離ABP，其中該HLA-限制性肽之長度係介於約5至15個胺基酸之間。
  42. 如請求項41之經分離ABP，其中該HLA-限制性肽之長度係介於約8至12個胺基酸之間。
  43. 如請求項40至42中任一項之經分離ABP，其中該ABP包括抗體或其抗原結合片段。
  44. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白連接至支架，視情況其中該支架包括血清白蛋白或Fc，視情況其中Fc為人類Fc且為IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM同型Fc。
  45. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白經由連接子連接至支架，視情況其中該連接子為肽連接子，視情況其中該肽連 接子為人類抗體之鉸鏈區。
  46. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含Fv片段、Fab片段、F(ab’) 2片段、Fab’片段、scFv片段、scFv-Fc片段及/或單域抗體或其抗原結合片段。
  47. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含scFv片段。
  48. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含一或多個抗體互補性決定區(CDR)，視情況六個抗體CDR。
  49. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包括抗體。
  50. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為單株抗體。
  51. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為人源化、人類或嵌合抗體。
  52. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係多特異性，視情況雙特異性。
  53. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白結合大於一種抗原或單抗原上之大於一個抗原決定基。
  54. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含選自IgG、IgA、IgD、IgE及IgM之類別之重鏈恆定區。
  55. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含該類別人類IgG及選自IgG1、IgG4、IgG2及IgG3之子類別之重鏈恆定區。
  56. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含延長半衰期之修飾。
  57. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含經修飾之Fc，視情況其中該經修飾之Fc包含延長半衰期之一或多個突變，視情況其中該延長半衰期之一或多個突變為YTE。
  58. 如前述請求項中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含T細胞受體(TCR)或其抗原結合部分。
  59. 如請求項58之抗原結合蛋白，其中該TCR或其抗原結合部分包含TCR可變區。
  60. 如請求項58或59之抗原結合蛋白，其中該TCR或其抗原結合部分包含一或多個TCR互補決定區(CDR)。
  61. 如請求項58至60中任一項之抗原結合蛋白，其中該TCR包含α鏈及β鏈。
  62. 如請求項58至61中任一項之抗原結合蛋白，其中該TCR包含γ鏈及δ鏈。
  63. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為嵌合抗原受體(CAR)之部分，該嵌合抗原受體包括：包含該抗原結合蛋白之細胞外部分；及細胞內訊號域。
  64. 如請求項63之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含scFv且該細胞內訊號域包含ITAM。
  65. 如請求項63或64之抗原結合蛋白，其中該細胞內訊號域包含CD3-ζ(CD3)鏈之ζ鏈之訊號域。
  66. 如請求項63至65中任一項之抗原結合蛋白，進一步包含連接該細胞外域及該細胞內訊號域之跨膜域。
  67. 如請求項66之抗原結合蛋白，其中該跨膜域包含CD28之跨膜部分。
  68. 如請求項63至67中任一項之抗原結合蛋白，進一步包含T細胞共刺激分子之細胞內訊號域。
  69. 如請求項68之抗原結合蛋白，其中該T細胞共刺激分子為CD28、4-1BB、OX-40、ICOS或其任何組合。
  70. 如請求項58至69中任一項之經分離ABP，其中該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽包含序列ASSLPTTMNY。
  71. 如請求項70之經分離ABP，其中該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽由序列ASSLPTTMNY組成。
  72. 如請求項70或71之經分離ABP，其中該ABP包含選自表15之TCR α CDR3序列。
  73. 如請求項70至72中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含選自表15之TCR β CDR3序列。
  74. 如請求項70至73中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含選自TCR純系型ID編號：1至344中之任一者之α CDR3及β CDR3序列。
  75. 如請求項70至74中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含TCR α可變(TRAV)胺基酸序列、TCR α接合(TRAJ)胺基酸序列、TCR β可變(TRBV)胺基酸序列、TCR β多樣性(TRBD)胺基酸序列及TCR β接合(TRBJ)胺基酸序列，其中該等TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD及TRBJ胺基酸序列各者與選自TCR純系型ID編號：1至344之TCR純系型中之任一者之對應TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD及TRBJ胺基酸序列為至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
  76. 如請求項70至75中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含TCR α恆定(TRAC)胺基酸序列。
  77. 如請求項70至76中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含TCR β恆定(TRBC)胺基酸序列。
  78. 如請求項70至77中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含具有與選自表16之α VJ序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之TCR α VJ序列。
  79. 如請求項70至78中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含具有與選自表16之β V(D)J序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之TCR β V(D)J序列。
  80. 如請求項70至79中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含TCR α VJ 胺基酸序列及TCR β V(D)J胺基酸序列，其中該等TCR α VJ及該等TCR β V(D)J胺基酸序列各者與選自TCR純系型ID編號：1至344之TCR純系型中之任一者之對應TCR α VJ及TCR β V(D)J胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
  81. 如請求項58至69中任一項之經分離ABP，其中該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽包含序列HSEVGLPVY。
  82. 如請求項81之經分離ABP，其中該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽由序列HSEVGLPVY組成。
  83. 如請求項81或82之經分離ABP，其中該ABP包含選自表18之TCR α CDR3序列。
  84. 如請求項81至83中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含選自表18之TCR β CDR3序列。
  85. 如請求項81至84中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含選自TCR純系型ID編號：345至447中之任一者之α CDR3及β CDR3序列。
  86. 如請求項81至85中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含TCR α可變(TRAV)胺基酸序列、TCR α接合(TRAJ)胺基酸序列、TCR β可變(TRBV)胺基酸序列、TCR β多樣性(TRBD)胺基酸序列及TCR β接合 (TRBJ)胺基酸序列，其中該等TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD及TRBJ胺基酸序列各者與選自TCR純系型ID編號：345至447之TCR純系型中之任一者之對應TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD及TRBJ胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同。
  87. 如請求項81至86中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含TCR α恆定(TRAC)胺基酸序列。
  88. 如請求項81至87中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含TCRβ恆定(TRBC)胺基酸序列。
  89. 如請求項81至88中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含具有與選自表19之α VJ序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之TCR α VJ序列。
  90. 如請求項81至89中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含具有與選自表19之β V(D)J序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之TCR β V(D)J序列。
  91. 如請求項81至90中任一項之經分離ABP，其中該ABP包含TCR α VJ胺基酸序列及TCR β V(D)J胺基酸序列，其中該等TCR α VJ及該等TCR β V(D)J胺基酸序列各者與選自TCR純系型ID編號：345至447之TCR純系型中之任一者之對應TCR α VJ及TCR β V(D)J胺基酸序列至少95%、96%、 97%、98%、99%或100%相同。
  92. 一種經分離HLA-肽靶，其中該HLA-肽靶包括與HLA I類分子複合之HLA-限制性肽，其中該HLA-限制性肽位於該HLA I類分子之α1/α2異二聚體部分之肽結合溝槽中，且其中該HLA-肽靶係選自表A。
  93. 如請求項92之經分離HLA-肽靶，其中a.該HLA I類分子為HLA亞型B*35：01且該HLA-限制性肽包含序列EVDPIGHVY，b.該HLA I類分子為HLA亞型A*02：01且該HLA-限制性肽包含序列AIFPGAVPAA，或該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽包含序列ASSLPTTMNY。
  94. 如請求項93之經分離HLA-肽靶，其中a.該HLA I類分子為HLA亞型B*35：01且該HLA-限制性肽由序列EVDPIGHVY組成，b.該HLA I類分子為HLA亞型A*02：01且該HLA-限制性肽由序列AIFPGAVPAA組成，或c.該HLA I類分子為HLA亞型A*01：01且該HLA-限制性肽由序列ASSLPTTMNY組成。
  95. 如請求項92至94中任一項之經分離HLA-肽靶，其中該HLA-限制性 肽之長度係介於約5至15個胺基酸之間。
  96. 如請求項92至95中任一項之經分離HLA-肽靶，其中該HLA-限制性肽之長度係介於約8至12個胺基酸之間。
  97. 如請求項92至96中任一項之經分離HLA-肽靶，其中該HLA亞型與該限制性肽之締合使該HLA亞型之β 2微球蛋白次單元與該HLA亞型之α-次單元之非共價締合穩定。
  98. 如請求項97之經分離HLA-肽靶，其中該HLA亞型之β 2微球蛋白次單元與該HLA亞型之α-次單元之穩定化締合經證實係由條件肽交換。
  99. 如前述請求項中任一項之經分離HLA-肽靶，進一步包括親和標籤。
  100. 如請求項99之經分離HLA-肽靶，其中該親和標籤為生物素標籤。
  101. 如前述請求項中任一項之經分離HLA-肽靶，其中該經分離HLA-肽靶與可檢測標記物複合。
  102. 如請求項101之經分離HLA-肽靶，其中該可檢測標記物包括β 2微球蛋白結合分子。
  103. 如請求項102之經分離HLA-肽靶，其中該β 2微球蛋白結合分子為經 標記之抗體。
  104. 如請求項103之經分離HLA-肽靶，其中該經標記之抗體為經螢光染料標記之抗體。
  105. 一種組合物，其包含附接至固體擔體之如前述請求項中任一項之HLA-肽靶。
  106. 如請求項105之組合物，其中該固體擔體包括珠、孔、膜、管、管柱、板、瓊脂糖、磁珠或晶片。
  107. 如請求項105或106之組合物，其中該HLA-肽靶包括親和力結合對之第一成員及該固體擔體包括該親和力結合對之第二成員。
  108. 如請求項107之組合物，其中該第一成員為鏈黴抗生物素(streptavidin)且該第二成員為生物素。
  109. 一種反應混合物，其包含a.來自如表A中所述之HLA-肽靶之HLA亞型之經分離且純化的α-次單元；a.該HLA亞型之經分離且純化之β2微球蛋白次單元；b.來自如表A中所述之HLA-肽靶之經分離且純化之限制性肽；及c.反應緩衝液。
  110. 一種反應混合物，其包含a.如前述請求項中任一項之經分離HLA-肽靶；及b.自人類個體分離之複數種T細胞。
  111. 如請求項110之反應混合物，其中該T細胞為CD8+ T細胞。
  112. 一種經分離多核苷酸，其包含可以操作方式連接至啟動子之編碼如請求項92至94中任一項所定義之HLA-限制性肽的第一核酸序列，及編碼如請求項92至94中任一項所定義之HLA亞型之第二核酸序列，其中該第二核酸可以操作方式連接至與第一核酸序列相同或不同之啟動子，且其中該經編碼之肽及經編碼之HLA亞型形成如請求項92至94中任一項所定義之HLA/肽複合體。
  113. 一種用於表現如請求項之穩定HLA-肽靶之套組，其包含第一構築體，該第一構築體包含可以操作方式連接至啟動子之編碼如請求項92至94中任一項所定義之HLA-限制性肽的第一核酸序列；及表現該穩定HLA-肽複合體之使用說明書。
  114. 如請求項113之套組，其中該第一構築體進一步包含編碼如請求項92至94中任一項所定義之HLA亞型之第二核酸序列。
  115. 如請求項114之套組，其中該第二核酸序列可以操作方式連接至相同 或不同啟動子。
  116. 如請求項113之套組，進一步包含第二構築體，該第二構築體包含編碼如請求項92至94中任一項所定義之HLA亞型之第二核酸序列。
  117. 如請求項113至116中任一項之套組，其中該第一構築體及第二構築體中之一者或二者為慢病毒載體構築體。
  118. 一種宿主細胞，其包含異種如請求項92至94中任一項之HLA-肽靶。
  119. 一種宿主細胞，其表現如由表A中之該等靶中之任一者所定義HLA亞型。
  120. 一種宿主細胞，其包含編碼如表A中所述之HLA-限制性肽之多核苷酸，例如，編碼如請求項92至94中任一項中所述之HLA-限制性肽之多核苷酸。
  121. 如請求項120之宿主細胞，其不包括內源性MHC。
  122. 如請求項121之宿主細胞，其包括外源性HLA。
  123. 如請求項122之宿主細胞，其為K562或A375細胞。
  124. 如前述請求項中任一項之宿主細胞，其為來自腫瘤細胞系之經培養細胞。
  125. 如請求項124之宿主細胞，其中該腫瘤細胞系表現如由表A中之該等靶中之任一者所定義之HLA亞型。
  126. 如請求項124之宿主細胞，其中該腫瘤細胞系係選自由以下組成之群：HCC-1599、NCI-H510A、A375、LN229、NCI-H358、ZR-75-1、MS751、OE19、MOR、BV173、MCF-7、NCI-H82、Colo829及NCI-H146。
  127. 一種細胞培養系統，其包含a.如前述請求項中任一項之宿主細胞，及b.細胞培養基。
  128. 如請求項127之細胞培養系統，其中該宿主細胞表現如由表A中之該等靶中之任一者所定義之HLA亞型，且其中該細胞培養基包含如由表A中之該等靶所定義之限制性肽。
  129. 如請求項127之宿主細胞，其中該宿主細胞為包含外源性HLA之K562細胞，其中該外源性HLA為如由表A中之該等靶中之任一者所定義之HLA亞型，且其中該細胞培養基包含如由表A中之該等靶所定義之限制性肽。
  130. 如前述請求項中任一項之ABP，其中該抗原結合蛋白通過與該HLA I類分子之接觸點且通過與該HLA-肽靶之該HLA-限制性肽之接觸點結合至該HLA-肽靶。
  131. 如請求項12、25、27、38、39或130中任一項之ABP，其中該ABP與該限制性肽或HLA亞型上之該等胺基酸位置之結合或該等接觸點係經由位置掃描、氫-氘交換或蛋白質結晶學測定。
  132. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其用作藥劑。
  133. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其用於治療癌症，視情況其中該癌症表現該HLA-肽靶或經預測為表現該HLA-肽靶。
  134. 如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白，其用於治療癌症，其中該癌症係選自實體腫瘤及血液科腫瘤。
  135. 一種ABP，其為如前述請求項中任一項之ABP之經保守修飾的變異體。
  136. 一種抗原結合蛋白(ABP)，其與如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白競爭結合。
  137. 一種抗原結合蛋白(ABP)，其結合由如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白所結合之相同HLA-肽抗原決定基。
  138. 一種經工程改造之細胞，其表現包含如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白之受體。
  139. 如請求項138之經工程改造之細胞，其為T細胞，視情況為細胞毒性T細胞(CTL)。
  140. 如請求項138或139之經工程改造之細胞，其中該抗原結合蛋白係自異種啟動子表現。
  141. 一種經分離多核苷酸或多核苷酸之集合，其編碼如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白或其抗原結合部分。
  142. 一種經分離多核苷酸或多核苷酸之集合，其編碼如前述請求項中任一項之HLA/肽靶。
  143. 一種載體或載體之集合，其包含如請求項141或142之多核苷酸或多核苷酸之集合。
  144. 一種宿主細胞，其包含如前述請求項中任一項之多核苷酸或多核苷酸之集合或如請求項143之載體或載體之集合，視情況其中該宿主細胞為 CHO或HEK293，或視情況其中該宿主細胞為T細胞。
  145. 一種產生抗原結合蛋白之方法，其包括利用如請求項144之宿主細胞表現該抗原結合蛋白且分離該表現之抗原結合蛋白。
  146. 一種醫藥組合物，其包含如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白及醫藥上可接受之賦形劑。
  147. 一種治療個體之癌症之方法，其包括對該個體投與有效量之如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白或如請求項146之醫藥組合物，視情況其中該癌症係選自實體腫瘤及血液科腫瘤。
  148. 如請求項147之方法，其中該癌症表現該HLA-肽靶或經預測為表現該HLA-肽靶。
  149. 一種套組，其包含如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白或如請求項146之醫藥組合物及使用說明書。
  150. 一種組合物，其包含至少一種如請求項92之HLA-肽靶及佐劑。
  151. 一種組合物，其包含至少一種如請求項92之HLA-肽靶及醫藥上可接受之賦形劑。
  152. 一種組合物，其包含包含表A中所揭示之至少一種HLA-肽靶之多肽之胺基酸序列，視情況該胺基酸序列基本上由該多肽組成或由該多肽組成。
  153. 一種病毒，其包含如前述請求項中任一項之經分離多核苷酸或多核苷酸之集合。
  154. 如請求項153之病毒，其中該病毒為絲狀噬菌體。
  155. 一種酵母細胞，其包含如前述請求項中任一項之經分離多核苷酸或多核苷酸之集合。
  156. 一種鑑別如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白之方法，其包括提供表A中所列之至少一種HLA-肽靶；及使該至少一種靶與該抗原結合蛋白結合，從而鑑別該抗原結合蛋白。
  157. 如請求項156之方法，其中該抗原結合蛋白於包含複數個不同抗原結合蛋白之噬菌體呈現庫中呈遞。
  158. 如請求項157之方法，其中該噬菌體呈現庫實質上不含有非特異性結合該HLA-肽靶之HLA之抗原結合蛋白。
  159. 如請求項156之方法，其中該抗原結合蛋白存在於包含複數個不同 TCR或其抗原結合片段之TCR庫中。
  160. 如請求項156至159中任一項之方法，其中進行該結合步驟一次以上，視情況至少三次。
  161. 如請求項156至160中任一項之方法，進一步包括使該抗原結合蛋白與不同於該HLA-肽靶之一或多種肽-HLA複合體接觸以測定該抗原結合蛋白是否選擇性結合該HLA-肽靶，視情況其中選擇性係藉由量測該抗原結合蛋白與可溶性靶HLA-肽複合體相對於不同於靶複合體之可溶性HLA-肽複合體之結合親和力來測定，視情況其中選擇性係藉由量測該抗原結合蛋白與在一或多種細胞表面上表現之靶HLA-肽複合體相對於不同於在一或多種細胞表面上表現之靶複合體之HLA-肽複合體之結合親和力來測定。
  162. 一種鑑別如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白之方法，其包括獲得表A中所列之至少一種HLA-肽靶；對個體投與該HLA-肽靶，視情況與佐劑組合；及自該個體分離該抗原結合蛋白。
  163. 如請求項162之方法，其中分離該抗原結合蛋白包括篩選該個體之血清以鑑別該抗原結合蛋白。
  164. 如請求項162之方法，進一步包括使該抗原結合蛋白與不同於該HLA-肽靶之一或多種肽-HLA複合體接觸以測定該抗原結合蛋白是否選擇性結合至該HLA-肽靶，視情況其中選擇性係藉由量測該抗原結合蛋白與 可溶性靶HLA-肽複合體相對於不同於靶複合體之可溶性HLA-肽複合體之結合親和力來測定，視情況其中選擇性係藉由量測該抗原結合蛋白與在一或多種細胞表面上表現之靶HLA-肽複合體相對於不同於在一或多種細胞表面上表現之靶複合體之HLA-肽複合體之結合親和力來測定。
  165. 如請求項162之方法，其中該個體為小鼠、兔或美洲駝。
  166. 如請求項162之方法，其中分離該抗原結合蛋白包括自表現該抗原結合蛋白之該個體分離B細胞及視情況自該分離B細胞直接選殖編碼該抗原結合蛋白之序列。
  167. 如請求項166之方法，進一步包括使用該B細胞創建雜交瘤。
  168. 如請求項166之方法，進一步包括自該B細胞選殖CDR。
  169. 如請求項166之方法，進一步包括使該B細胞永生化，視情況經由EBV轉形。
  170. 如請求項166之方法，進一步包括創建包含該B細胞之該抗原結合蛋白之庫，視情況其中該庫為噬菌體呈現或酵母呈現。
  171. 如請求項162之方法，進一步包括使該抗原結合蛋白人源化。
  172. 一種鑑別如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白之方法，其包括獲得包含該抗原結合蛋白之細胞；使該細胞與包含表A中所列之至少一種HLA-肽靶之HLA-多聚體接觸；及經由該HLA-多聚體與該抗原結合蛋白之間之結合鑑別該抗原結合蛋白。
  173. 一種鑑別如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白之方法，其包括獲得一或多種包含該抗原結合蛋白之細胞；利用在天然或人工抗原呈遞細胞(APC)上呈遞之表A中所列之至少一種HLA-肽靶激活該一或多種細胞；及經由一或多種細胞之選擇鑑別該抗原結合蛋白，該一或多種細胞藉由與表A中所列之至少一種HLA-肽靶相互作用激活。
  174. 如請求項172或173之方法，其中該細胞為T細胞，視情況為CTL。
  175. 如請求項172或173之方法，進一步包括分離該細胞，視情況使用流動式細胞測量術、磁分離或單細胞分離。
  176. 如請求項175之方法，進一步包括將該抗原結合蛋白定序。
  177. 一種鑑別如前述請求項中任一項之抗原結合蛋白之方法，其包括提供表A中所列之至少一種HLA-肽靶；及使用該靶鑑別該抗原結合蛋白。
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