DE102021132017A1

DE102021132017A1 - In-vitro-herstellung peptidbeladener mhc-klasse-i-moleküle

Info

Publication number: DE102021132017A1
Application number: DE102021132017.8A
Authority: DE
Inventors: Sebastian Hartmut Springer
Original assignee: Jacobs University gGmbH
Current assignee: Constructor University Bremen Ggmbh De
Priority date: 2021-12-06
Filing date: 2021-12-06
Publication date: 2023-06-07
Also published as: WO2023104256A1

Abstract

Die Erfindung stellt ein In-vitro-Verfahren zum Herstellen eines mit einem Ziel-Peptid beladenen MHC-Klasse-I-Moleküls durch Austauschen eines an eine Peptidbindungsstelle eines MHC-Klasse-I-Molekül gebundenen Platzhalter-Peptids gegen das Ziel-Peptid bereit, wobei das Platzhalter-Peptid und das Ziel-Peptid voneinander verschieden sind, und wobei das MHC-Klasse-I-Molekül mit dem an seine Peptidbindungsstelle gebundenen Platzhalter-Peptid in einer Lösung mit a) dem Ziel-Peptid und b) einem Austauschhelfermolekül zusammengebracht wird, und wobei das Austauschhelfermolekül eine organische C1-C6-Verbindung mit einer Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe, ausgenommen eine Aminosäure oder ein Peptid, ist, und wobei dieWasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe ausgewählt ist aus -OH, -COOH, -CONH2, -SH, =NH, -NH- oder NH2.

Description

Die Erfindung betrifft ein In-vitro-Verfahren zur Herstellung eines mit einem Ziel-Peptid beladenen MHC-Klasse-I-Moleküls.
Der Haupthistokompatibilitätskomplex („major histocompatibility complex“, MHC) umfasst eine Gruppe von Genen, die MHC-Proteine bzw. MHC-Proteinkomplexe kodieren, die eine wichtige Rolle im Immunsystem von Wirbeltieren spielen. Unter anderem kodiert der Haupthistokompatibilitätskomplex MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Proteine, die von der Zelle aufbereitete Peptid-Antigene auf der Zelloberfläche präsentieren, damit diese von T-Lymphozyten erkannt werden können. MHC-Moleküle des Menschen werden auch als HLA-Proteine (HLA = human leucocyte antigen) bezeichnet.
MHC-Klasse-I-Moleküle sind membranständige Proteine an der Oberfläche kernhaltiger Körperzellen von höheren Wirbeltieren. Sie dienen der Präsentation von kurzen antigenischen Peptiden mit einer Länge von typischerweise 8 bis 11 Aminosäuren gegenüber zytotoxischen T-Zellen und spielen eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr gegen Viren, Bakterien und andere Pathogene sowie maligne Zellen. Aufgrund der Polygenie des MHC-Komplexes und des extremen Polymorphismus der MHC-Gene existiert eine sehr große Anzahl unterschiedlicher MHC-Klasse-I-Moleküle, die wiederum eine sehr große Anzahl unterschiedlicher Peptide binden können.
Es ist bekannt, rekombinante MHC-Klasse-I-Moleküle zu verwenden, zum Beispiel, um die Wechselwirkung zwischen T-Zell-Rezeptoren zytotoxischer T-Zellen und MHC-Klasse-I-Molekülen zu untersuchen, T-Zellen zu aktivieren, zu detektieren oder zu isolieren. Die Herstellung solcher rekombinanter MHC-Klasse-I-Moleküle, die zur Ausnutzung des Aviditätseffektes häufig zu Multimeren komplexiert werden, ist allerdings schwierig, wenn die MHC-Klasse-I-Moleküle aus dem ungefalteten (denaturierten) Zustand erzeugt werden, da sie sich nur korrekt falten oder gefaltet bleiben, wenn ein geeignetes Peptid zugegen ist. Das bedeutet für den Fall, dass man einen bestimmten Komplex aus einem MHC-Klasse-I-Molekül und einem bestimmten Peptid einsetzen möchte, dieser Komplex aufwändig aus den einzelnen Komponenten hergestellt werden muss.
Es sind daher Verfahren entwickelt worden, um diesen Prozess zu vereinfachen, indem bei einem bereits gefalteten peptidbeladenen MHC-Klasse-I-Moleküle das gebundene Peptid gegen ein gewünschtes Ziel-Peptid ausgetauscht wird. Ein solches Verfahren ist beispielsweise in der WO 2013/102458 A1 beschrieben. Bei dem in der WO 2013/102458 Al beschriebenen Verfahren wird der Austausch eines Platzhalter-Peptids gegen ein Ziel-Peptid mittels einer Aminosäure, einer modifizierten Aminosäure oder eines Peptids, z.B. Di- oder Tripeptids, katalysiert (s. auch Saini SK, Ostermeir K, Ramnarayan VR, Schuster H, Zacharias M, and Springer S, Dipeptides promote folding and peptide binding of MHC class I molecules, Proc Natl Acad Sci USA 110, 15383-15388, doi:10.1073/pnas.1308672110; Saini SK, Schuster H, Ramnarayan VR, Rammensee HG, Stevanovic S, Springer S. Dipeptides catalyze rapid peptide exchange on MHC class I molecules, Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(1):202-207, doi:10.1073/pnas.1418690112). Bei einem solchen Verfahren ist es zur Herstellung eines mit einem gewünschten Ziel-Peptid beladenen MHC-Klasse-I-Moleküls nicht nötig, von einem ungefalteten MHC-Klasse-I-Molekül auszugehen und den oben beschriebenen aufwändigen Faltungsprozess zu durchlaufen. Auch in der WO 2017/197244 ist ein Verfahren zur Durchführung eines Peptidaustausches an einem MHC-Klasse-I oder MHC-Klasse-II-Molekül mit einem daran gebundenen Peptid offenbart. Bei dem Verfahren wird der Austausch in Gegenwart eines Peptidaustauschfaktors vorgenommen, wobei der Peptidaustauschfaktor ein Dipeptid sein kann, beispielsweise Glycyl-Methionin, Glycyl-Cyclohexylalanin, Glycyl-Leucine, Glycyl-Arginin, Glycyl-Lysin, Glycyl-(tert)-Butylalanin oder Glycyl-Homoleucin.
Für MHC-Klasse-II-Moleküle, die sich in Ihrer Struktur und Funktion wesentlich von MHC-Klasse-I-Molekülen unterscheiden, ist bereits vor längerer Zeit vorgeschlagen worden, Ethanol oder andere kleine H-Bindungsdonoren zum Peptid-Austausch bei MHC-Klasse-II-Molekülen zu verwenden (s. z.B. Falk K, Lau JM, Santambrogio L, Esteban VM, Puentes F, Rötzschke O, Strominger JL, Ligand Exchange of Major Histocompatibility Complex Class II Proteins Is Triggered by H-bond Donor Groups of Small Molecules, J. Biol. Chem. 277, 2709-2715, doi:10.1074/jbc.M109098200).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Herstellung von definierten Komplexen aus einem MHC-Klasse-I-Molekül und einem Ziel-Peptid zu vereinfachen.
Zur Lösung der Aufgabe stellt die Erfindung ein In-vitro-Verfahren zum Herstellen eines mit einem Ziel-Peptid beladenen MHC-Klasse-I-Moleküls durch Austauschen eines an eine Peptidbindungsstelle eines MHC-Klasse-I-Molekül gebundenen Platzhalter-Peptids gegen das Ziel-Peptid bereit, wobei das Platzhalter-Peptid und das Ziel-Peptid voneinander verschieden sind, und wobei das MHC-Klasse-I-Molekül mit dem an seine Peptidbindungsstelle gebundenen Platzhalter-Peptid in einer Lösung mit a) dem Ziel-Peptid und b) einem Austauschhelfermolekül zusammengebracht wird, und wobei das Austauschhelfermolekül eine organische C₁-C₆-Verbindung mit einer Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe, ausgenommen eine Aminosäure oder ein Peptid, ist, und wobei die Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe ausgewählt ist aus -OH, -COOH, -CONH₂, -SH, =NH, -NH- oder NH₂.
Es wurde überraschend gefunden, dass kleine organische Moleküle (C₁-C₆-Verbindungen), bei denen es sich nicht um eine gegebenenfalls modifizierte Aminosäure oder ein Peptid, beispielsweise Di- oder Tripeptid, handelt, und die mindestens eine Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe aufweisen, wie beispielsweise Ethanol, geeignet sind, bei einem MHC-Klasse-I-Molekül einen Austausch eines von dem MHC-Klasse-I-Molekül gebundenen Peptids gegen ein gewünschtes Peptid zu katalysieren. Dies kann beispielsweise vorteilhaft genutzt werden, um rekombinante MHC-Klasse-I-Moleküle herzustellen, die mit einem bestimmten Ziel-Peptid beladen sind. Derartige mit bestimmten Ziel-Peptiden beladene MHC-Klasse-I-Moleküle können zum Beispiel dazu verwendet werden, um gezielt die Wechselwirkung zwischen T-Zell-Rezeptoren und MHC-Klasse-I-Molekülen zu untersuchen oder um T-Zellen zu isolieren oder zu identifizieren.
Unter einem „MHC-Molekül“ oder „MHC-Protein“ wird ein Protein des Haupthistokompatibilitätskomplexes verstanden, d.h. ein Protein, das vom Haupthistokompatibilitätskomplex kodiert wird. MHC-Moleküle werden in verschiedene Klassen, z.B. Klasse I und Klasse II, unterteilt. Unter dem Begriff „MHC-Klasse-I-Protein“ „MHC-Klasse-I-Molekül“, „Klasse-I-Molekül“, „MHC-I-Molekül“, MHC-Klasse-I-Protein", „Klasse-I-Protein“ oder „MHC-I-Protein“ wird ein Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-I-Protein, unter dem Begriff „MHC-Klasse-II-Protein“ „MHC-Klasse-II-Molekül“, „Klasse-II-Molekül“, „MHC-II-Molekül“, MHC-Klasse-II-Protein", „Klasse-II-Protein“ oder „MHC-II-Protein“ ein Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-II-Protein verstanden. MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Proteine sind vom Haupthistokompatibilitätskomplex (engl. „Major Histocompatibility Complex“, MHC) kodierte Transmembranproteine und an der zellulären Immunantwort beteiligt. MHC-Klasse-I-Proteine binden Peptide aus dem Zellinneren, wie beispielsweise aus dem Cytosol oder dem Lumen der endocytischen Organellen und präsentieren diese an der Zelloberfläche den zytotoxischen T-Zellen (Antigenpräsentation). Von MHC-Klasse-II-Proteinen präsentierte Antigene veranlassen die Bindung von CD-4-positiven T-Helferzellen. Ein MHC-I-Molekül besteht in der Regel aus einer schweren Alpha-Kette (α-Kette) auch kurz „hc“, Molekulargewicht ca. 44 kDa (etwa 350 Aminosäuren) mit drei extrazellulären Domänen (α1, α2 und α3) und einer Transmembrandomäne sowie einer nicht kovalent daran gebundenen leichten Beta-Kette (ß-Kette, auch „β2-Mikroglobulin“ oder kurz „β2m“, ca. 12 kDa, 99 Aminosäuren). Menschliche MHC-Klasse-I-Proteine werden auch als HLA-Proteine (HLA = human leukocyte antigen) bezeichnet. Der Begriff umfasst sowohl klassische MHC-Klasse-I-Proteine wie HLA-A, HLA-B und HLA-C als auch nicht-klassische MHC-Klasse-I-Proteine wie HLA-E, HLA-F und HLA-G. MHC-Klasse-II-Proteine bestehen in der Regel aus zwei nahezu gleich großen Ketten, einer Alpha-Kette (α-Kette, ca. 33 kDa) und einer Beta-Kette (β-Kette, ca. 30 kDa) mit jeweils einer extrazellulären Domäne, einem Transmembransegment und einer relativ kurzen cytosolischen Komponente. Die extrazelluläre Domäne umfasst zwei Domänen (α1, α2 bzw. β1, β2), wobei die Peptidbindungsstelle (Peptidbindungsdomäne) von Teilen der membranfernen bzw. distalen α1 - und der β1 -Kette gebildet wird. MHC-Klasse-II-Moleküle werden beim Menschen von drei Isotypen kodiert: HLA-DP, HLA-DQ und HLA-DR (zur Bedeutung von „HLA“ s.o.). Die HLA-DP-Ketten werden von Genen kodiert, die als HLA-DPA (für die Alpha-Kette) oder HLA-DPB (für die Beta-Kette) bezeichnet werden. Die Ketten für HLA-DQ und -DR werden auf die gleiche Weise kodiert. Sowohl MHC-Klasse-I-Gene als auch MHC-Klasse-II-Gene sind stark polymorph. Jeder gegebene Allotyp eines MHC-Klasse-I-Moleküls oder MHC-Klasse-II-Moleküls kann Tausende verschiedener Peptide binden. Der Begriff „MHC-Molekül“ oder „MHC-Protein“ umfasst zudem auch peptidbindende Fragmente aller dieser Proteine, insbesondere die extrazelluläre Domäne oder Abschnitte davon. Unter einem „Abschnitt“ oder „Fragment“ werden hier insbesondere zusammenhängende Teilsequenzen von mindestens 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 80, 90 oder mindestens 100 Aminosäuren verstanden. Der Begriff umfasst auch MHC-Proteine nicht-menschlicher Wirbeltierspezies, beispielsweise von Maus (Mus musculus), Ratte (Rattus norvegicus), Rind (Bos taurus), Pferd (Equus equus) oder Grüner Meerkatze (Macaca mulatta). Die MHC-Klasse-I-Proteine der Maus werden beispielsweise als H-2-Proteine bezeichnet, die von den Genloci H-2D, H-2K und H-2L kodiert werden. Ein bestimmter Allotyp eines Maus-MHC-Klasse-I-Proteins ist beispielsweise H-2Kb oder H-2Ld. Unterklassen von MHC-Klasse-II-Proteinen der Maus sind beispielsweise H-2A, H-2E und H-2P-Proteine. Der Begriff „MHC-Molekül“ oder „MHC-Protein“ umfasst auch synthetische (rekombinante) MHC-Moleküle, d.h. Moleküle, die natürlichen MHC-Molekülen strukturell und funktional entsprechen.
Die Begriffe „Peptidbindungsstelle“ oder „Peptidbindungsdomäne“ bezeichnen den Bereich eines MHC-Proteins, der in der Lage ist, ein Peptid-Antigen nicht-kovalent zu binden. Bei MHC-Klasse-I-Molekülen wird die Peptidbindungsstelle beispielsweise von der Alpha-Kette gebildet, insbesondere einer von der α1 - und α2-Domäne durch entsprechende Faltung gebildeten Furche.
Unter einem „peptidfreien MHC-Molekül“ oder „leeren MHC-Molekül“ wird ein unbeladenes MHC-Molekül verstanden, d.h. ein MHC-Molekül, an das kein Peptid (Antigen) gebunden ist.
Unter einem „peptidbeladenen MHC-Molekül“ wird hier ein Komplex aus Peptid und MHC-Molekül verstanden. Ein Komplex aus Peptid und MHC-Protein, d.h. ein MHC-Protein, beispielsweise MHC-Klasse-I-Protein, mit daran gebundenem Peptid, wird hier gegebenenfalls synonym auch als „Peptid/MHC-Protein-Komplex“ oder „MHC-Protein/Peptid-Komplex“ bezeichnet. Ein Komplex aus Peptid und MHC-Klasse-I-Protein wird auch als „Klasse-I-Peptid-Komplex“ oder „Peptid/MHC-I“ bezeichnet. Als Abkürzung für einen solchen Komplex wird auch „pMHC-I“ verwendet. Ein Komplex aus Peptid und MHC-Klasse-II-Protein wird auch als „Klasse-II-Peptid-Komplex“ oder „Peptid/MHC-II“ bezeichnet. Als Abkürzung für einen solchen Komplex wird auch „pMHC-II“ verwendet. Die Begriffe „antigenpräsentierendes MHC-Klasse-I-Protein“ oder „antigenpräsentierendes MHC-Klasse-II-Protein“ werden synonym zu dem jeweiligen Komplex verwendet. „Antigenpräsentierend“ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass das MHC-Klasse-I-Protein oder das MHC-Klasse-II-Protein ein Peptid (Antigen) gebunden aufweist.
Unter einem „Platzhalter-Peptid“ wird hier ein Peptid verstanden, das an die Peptidbindungsstelle eines MHC-Moleküls, beispielsweise MHC-Klasse-I-Moleküls nicht-kovalent gebunden ist und dazu vorgesehen ist, gegen ein bestimmtes anderes Peptid („Ziel-Peptid“) ausgetauscht zu werden. Es handelt sich vorzugsweise um ein Peptid mit einer Länge von 8 bis 11, vorzugsweise 8-10, Aminosäuren. Es kann sich beispielsweise um ein synthetisches Peptid mit definierten Eigenschaften (z.B. mit einer bestimmten Aminosäuresequenz und/oder Affinität) handeln. Der Begriff umfasst auch synthetische Peptide, die nicht-natürliche oder modifizierte Aminosäuren enthalten.
Unter einem „Ziel-Peptid“ wird ein Peptid, vorzugsweise ein Peptid mit einer Länge von 8 bis 11 Aminosäuren, weiter bevorzugt 8-10 Aminosäuren Länge verstanden, mit dem ein MHC-Molekül unter Verdrängung eines Platzhalter-Peptids beladen wird.
Unter einem „Austauschhelfermolekül“ wird ein Molekül verstanden, welches den Austausch eines Platzhalter-Peptids gegen ein Ziel-Peptid fördert. Fördern bedeutet beispielsweise, dass in Gegenwart des Austauschhelfermoleküls bei einer gegebenen Anzahl von MHC-Molekülen ein größerer Anteil von Platzhalter-Peptiden gegen ein Ziel-Peptid ausgetauscht wird als in Abwesenheit des Austauschhelfermoleküls und/oder in Gegenwart des Austauschhelfermoleküls der Austausch eines Platzhalter-Peptids gegen ein Ziel-Peptid mit größerer Geschwindigkeit abläuft als in Abwesenheit des Austauschhelfermoleküls. Ein Beispiel für ein Austauschhelfermolekül im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Ethanol-Molekül. Gegebenenfalls wird hier auch der Begriff „Austauschkatalysator“ synonym zum Ausdruck „Austauschhelfermolekül“ verwendet.
Unter einer „Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe“, syonym auch als „H-Bindungsdonorgruppe“ oder „Wasserstoffdonorgruppe“ bezeichnet und gegebenenfalls mit „X-H“ oder „XH“ symbolisiert, wird eine funktionelle Gruppe eines Moleküls verstanden, die in der Lage ist, ein Wasserstoffatom für eine Wasserstoffbrückenbindung bereitzustellen. Unter den Begriff fallen beispielsweise die Hydroxylgruppe (-OH, auch „Hydroxygruppe“), Carboxylgruppe (-COOH, auch „Carboxygruppe“), Carbamoylgruppe (-CONH₂), Thiolgruppe (-SH), Iminogruppe (=NH oder -NH-) oder Aminogruppe (-NH₂). Eine Wasserstoffbrückenbindung ist eine nicht-kovalente und nicht-ionische auf elektrostatischen Kräften beruhende chemische Bindung zwischen einem kovalent an ein Atom eines ersten Moleküls gebundenen Wasserstoffatom mit einer positiven Partialladung und einem Atom eines zweiten Moleküls oder einem anderen Atom des ersten Moleküls mit negativer Partialladung. Anders ausgedrückt, handelt es bei einer Wasserstoffbrückenbindung um eine attraktive Wechselwirkung zwischen einer Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe (X-H) und einem Protonenakzeptor (Y).
Der Begriff „organische C₁-C₆-Verbindung“ bezeichnet eine organische Verbindung aus ein bis sechs C-Atomen. Der Begriff schließt somit organische Verbindungen mit einem, zwei, drei, vier, fünf oder sechs Kohlenstoffatomen ein. Der Begriff schließt auch organische Verbindungen mit Heteroatomen im Kohlenstoffgerüst ein. Der Begriff umfasst aliphatische und aromatische, zyklische und azyklische Verbindungen.
Der Ausdruck „ausgenommen eine Aminosäure oder ein Peptid“ in Bezug auf die organische C₁-C₆-Verbindung bedeutet, dass die organische C₁-C₆-Verbindung weder eine Aminosäure noch ein Peptid, d.h. eine Verbindung aus zwei oder mehr Aminosäuren, beispielsweise ein Di- oder Tripeptid, ist. Unter einer Aminosäure wird eine Verbindung verstanden, die eine mit einem Kohlenstoffatom verbundene Aminogruppe (-NH₂) und eine mit demselben oder einem anderen Kohlenstoffatom der Verbindung verbundene Carboxylgruppe (-COOH) enthält. Die organische C₁-C₆-Verbindung gemäß der Erfindung enthält demnach nicht gleichzeitig eine Aminogruppe (-NH₂) und eine Carboxylgruppe (-COOH). Der Ausdruck schließt auch ein, dass die Verbindung keine „modifizierte Aminosäure“ ist, oder ein Peptid, das eine „modifizierte Aminosäure“ enthält. Unter einer „modifizierten Aminosäure“ wird eine Aminosäure verstanden, bei der eine andere chemische Verbindung so kovalent an die Aminogruppe, an die Carboxylgruppe, oder an beide Gruppen, gebunden ist, dass mindestens ein H-Atom der Aminogruppe und/oder die OH-Gruppe oder das H der OH-Gruppe der Carboxylgruppe durch eine andere chemische Verbindung substituiert sind. Das gilt auch für Verbindungen, bei denen die Carbonylgruppe C=O der Carboxylgruppe durch eine Thiocarbonylgruppe C=S ersetzt ist, wie beispielsweise bei einer Thioamidbindung. Die organische C₁-C₆-Verbindung enthält demnach nicht gleichzeitig a) eine Carboxylgruppe und b) eine Aminogruppe, bei der mindestens ein H-Atom durch eine andere chemische Gruppierung substituiert ist (z.B. durch eine Acylgruppe), oder a) eine Aminogruppe und b) eine Carboxylgruppe, bei der die OH-Gruppe oder das H der OH-Gruppe substituiert sind, z.B. die OH-Gruppe durch eine Aminogruppe, oder a) eine Aminogruppe, bei der ein H-Atom durch eine andere chemische Gruppierung substituiert ist, und b) eine Carboxylgruppe, bei der die OH-Gruppe oder das H der OH-Gruppe substituiert sind.
Unter einem „Alkohol“ wird eine organische Verbindung verstanden, die eine oder mehrere jeweils an ein Kohlenstoffatom gebundene Hydroxylgruppen (-OH) aufweist, wobei jedes eine OH-Gruppe tragende Kohlenstoffatom sp3-hybridisiert ist und außer an die Hydroxylgruppe nur an Kohlenstoff- oder Wasserstoffatome gebunden ist. Unter einem „mehrwertigen Alkohol“ wird ein Alkohol mit mehr als einer Hydroxylgruppe verstanden, unter einem „einwertigen Alkohol“ ein Alkohol mit nur einer Hydroxylgruppe.
Unter einem „Alkanol“ wird eine organische Verbindung mit der Formel R-OH verstanden, wobei Rein Alkylrest ist, bei dem ein oder mehrere H-Atome gegebenenfalls durch weitere OH-Gruppen substituiert sein können. Ein einwertiges Alkanol ist ein Alkanol der allgemeinen Formel C_nH_2n+1OH. Beispiele für einwertige Alkanole sind Methanol und Ethanol.
Der Ausdruck, wonach das „MHC-Klasse-I-Molekül mit dem an seine Peptidbindungsstelle gebundenen Platzhalter-Peptid in einer Lösung mit a) dem Ziel-Peptid und b) einem Austauschhelfermolekül zusammengebracht wird“ bedeutet, dass ein mit einem Platzhalter-Peptid beladenes MHC-Klasse-I-Molekül, ein Ziel-Peptid und ein Austauschhelfermolekül in einer für die Austauschreaktion geeigneten Lösung, vorzugsweise einer wässrigen Lösung, und unter für die Austauschreaktion geeigneten Bedingungen, beispielsweise hinsichtlich pH-Wert, Temperatur und Salzgehalt, miteinander in Kontakt gebracht werden. Geeignete Bedingungen sind beispielsweise in Saini et al. 2015 beschrieben (Saini SK, Schuster H, Ramnarayan VR, Rammensee HG, Stevanovic S, Springer S. Dipeptides catalyze rapid peptide exchange on MHC class I molecules, Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(1):202-207, doi:10.1073/pnas.1418690112). Geeignete Bedingungen schließen beispielsweise wässrige Lösungen mit 150 mM NaCl und 15 mM anorganischem Phosphat, pH 7, oder 150 mM NaCl, 50 mM Tris·C1, pH 8, ein.
Das Austauschhelfermolekül kann jede organische C₁-C₆-Verbindung mit mindestens einer Wasserstoffbindungsdonorgruppe sein, ausgenommen eine Aminosäure oder ein Peptid. Bevorzugt ist das Austauschhelfermolekül eine aliphatische C₁-C₆-Verbindung. Das Austauschhelfermolekül kann zyklisch oder azyklisch sein, ist aber bevorzugt azyklisch.
Das Austauschhelfermolekül weist mindestens eine Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe auf, kann aber auch mehrere, d.h. zwei oder mehr, der genannten Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppen beinhalten, wobei diese gleich oder verschieden sein können. Es ist jedoch bevorzugt, wenn beim Vorhandensein mehrerer Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppen diese untereinander gleich, beispielsweise alle OH-Gruppen, alle COOH-Gruppen oder alle SH-Gruppen, sind. Wenn das Austauschhelfermolekül mehr als eine der genannten Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppen enthält und mindestens zwei davon voneinander verschieden sind, ist für den Fall, dass die erste Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe -COOH oder CONH₂ ist, die zweite, davon verschiedene Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe nicht NH₂, =NH oder -NH-. Es ist weiter bevorzugt, dass, wenn das Austauschhelfermolekül eine Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe enthält, die ausgewählt ist aus NH₂, =NH oder -NH-, das Austauschhelfermolekül keine Carbonylgruppe (C=O) oder Thioncarbonylgruppe (C=S) enthält. Weiter bevorzugt ist, dass, wenn das Austauschhelfermolekül -CONH₂ als Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe enthält, das Austauschhelfermolekül keine weitere Carbonylgruppe (C=O) oder eine Thiocarbonylgruppe (C=S) enthält.
Besonders bevorzugt ist das Austauschhelfermolekül ein C₁-C₆-Alkohol, bevorzugt ein einwertiger oder zweiwertiger C₁-C₆-Alkohol, weiter bevorzugt ein C₁-C₆-Alkanol, vorzugsweise ein einwertiges oder zweiwertiges C₁-C₆-Alkanol, besonders bevorzugt Ethanol.

Beispiele für geeignete Austauschhelfermoleküle sind in Tabelle 1 angegeben: Tabelle 1: Beispiele für mögliche Austauschhelfermoleküle und deren CAS-Nummern.

Bezeichnung	CAS-Nummer
Methanol	67-56-1
Ethanol	64-17-5
1-Propanol	71-23-8
2-Propanol	67-63-0
Ethylenglycol	107-21-1
1,2-Propandiol	57-55-6
1,3-Propandiol	504-63-2
n-Butanol	71-36-3
2-Methyl-1-Propanol	78-83-1
2-Butanol	78-92-2
2-Methyl-2-Propanol	75-65-0
Pentan-1-ol	71-41-0
Pentan-2-ol	6032-29-7
Pentan-3-ol	584-02-1
2-Methyl-butan-1-ol	137-32-6
2-Methyl-butan-2-ol	75-85-4
3-Methyl-butan-1-ol	123-51-3
3-Methyl-butan-2-ol	598-75-4

2,2-Dimethyl-1-propanol	75-84-3
Formamid	75-12-7
Acetamid	60-35-5
Propanamid	79-05-0

Die Liste von geeigneten Austauschhelfermolekül-Verbindungen in der obigen Tabelle 1 ist nicht abschließend oder in irgendeiner Weise als beschränkend zu verstehen. Von der Erfindung sind auch weitere, in der obigen Tabelle 1 nicht genannte Verbindungen erfasst, beispielsweise die 17 Strukturisomere des Hexanols (C₆H₁₃OH). Bei optische aktiven Verbindungen sind auch deren Stereoisomere erfasst. Darüber hinaus kommen auch Derivate der in der Tabelle 1 aufgeführten oder beispielsweise der genannten Hexanole, d.h. Verbindungen, die ein oder mehrere weitere funktionelle Gruppen enthalten, als Austauschhelfermolekül in Betracht. Der Fachmann ist leicht in der Lage, anhand der vorliegenden Offenbarung und gegebenenfalls seines allgemeinen Fachwissens ohne erfinderisches Zutun und ohne unzumutbaren Aufwand weitere geeignete Austauschhelfermoleküle aufzufinden.
Es ist besonders bevorzugt, dass die Bindungsaffinität des Ziel-Peptids zur Peptidbindungsstelle des MHC-Klasse-I-Moleküls höher ist als die Bindungsaffinität des Platzhalter-Peptids zur Peptidbindungsstelle des MHC-Klasse-I-Molekül. Das Ziel-Peptid weist daher bevorzugt eine im Vergleich zum Platzhalter-Peptid höhere Assoziationskonstante, weiter bevorzugt eine mindestens um den Faktor 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10, weiter bevorzugt eine mindestens um den Faktor 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder 100 höhere Assoziationskonstante auf. Es ist grundsätzlich aber auch möglich, eine gewünschte Peptidbeladung von MHC-Klasse-I-Molekülen zu bewirken, indem das Ziel-Peptid im Verhältnis zum Platzhalter-Peptid im Überschuss, beispielsweise in einem Verhältnis von mindestens 5:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1 oder mindestens 100:1 in der Lösung vorhanden ist. Selbstverständlich kann auch ein Ziel-Peptid mit höherer Bindungsaffinität in vorteilhafter Weise im Überschuss, d.h. in höherer Konzentration gegenüber dem Platzhalter-Peptid, in der Lösung vorliegen.
Das mit einem Ziel-Peptid beladene MHC-Klasse-I-Molekül kann auch als Teil eines multimeren Komplexes, beispielweise direkt oder indirekt gebunden an Avidin oder Streptavidin, vorliegen.
Die Erfindung betrifft auch ein Kit zur Durchführung des oben näher beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend a) eine Lösung enthaltend ein mit einem Platzhalter-Peptid beladenes MHC-Klasse-I-Molekül und b) ein Austauschhelfermolekül. Das Austauschhelfermolekül ist vorzugsweise von der das peptidbeladene MHC-Klasse-I-Molekül umfassenden Lösung getrennt in einem gesonderten Behälter in dem Kit enthalten.
Bei dem Platzhalter-Peptid handelt es sich bevorzugt um ein Peptid mit 8-11, weiter bevorzugt 8-10, besonders bevorzugt 8-9 Aminosäuren, z.B. NLVPMVATA oder FAPGNYPAL.
Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Kit ferner ein Ziel-Peptid zum Austausch gegen das Platzhalter-Peptid.
Die Erfindung wird im Folgenden zur Veranschaulichung anhand von Figuren und Ausführungsbeispielen näher beschrieben.

1. Stark schematisierte Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
2. Peptid-Austausch bei einem MHC-Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, β2m, und dem Platzhalter-Peptid NLVPMVATA; Ziel-Peptid: NLVPKVATV; Austauschhelfermolekül: Ethanol; „Keines“ bedeutet, dass bei dieser Probe kein Austauschhelfermolekül hinzugefügt wurde.
3. Peptid-Austausch bei einem MHC-Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, β2m, und dem Platzhalter-Peptid NLVPMVATA; (Ziel-Peptid: NLVPKVATV; Austauschhelfermolekül: Methanol; „Keines“ bedeutet, dass bei dieser Probe kein Austauschhelfermolekül hinzugefügt wurde.
4. Peptid-Austausch bei einem MHC-Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*24:02, β2m, und dem Platzhalter-Peptid TYGPVFMCL; Ziel-Peptid: QYTPVSKLF; Austauschhelfermolekül: Ethanol; „Keines“ bedeutet, dass bei dieser Probe kein Austauschhelfermolekül hinzugefügt wurde.
5. Peptid-Austausch bei einem MHC-Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, β2m, und dem Platzhalter-Peptid NLVPMVATA; Ziel-Peptid: NLVPKVATV; Austauschhelfermolekül: Methanol; „Keines“ bedeutet, dass bei dieser Probe kein Austauschhelfermolekül hinzugefügt wurde.
6. Peptid-Austausch bei einem MHC-Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*24:02, β2m, und dem Platzhalter-Peptid TYGPVFMCL; Ziel-Peptid: QYTPVSKLF; Austauschhelfermoleküle: Ethanol; Dipeptid GF; „Keines“ bedeutet, dass bei dieser Probe kein Austauschhelfermolekül hinzugefügt wurde.

1 zeigt eine vereinfachte und schematisierte Darstellung des Prinzips des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die 1 zeigt im oberen Teil einen ersten MHC-Klasse-I-Peptid-Komplex 1, d.h. ein mit einem Platzhalter-Peptid 6 beladenes MHC-Klasse-I-Molekül 2, bestehend aus einer schweren Kette (α-Kette) 3 und einer leichten Kette (β2-Mikroglobulin, β2m) 4. Das Platzhalter-Peptid 6 ist an die Peptidbindungsstelle 5 des MHC-Klasse-I-Moleküls 2 gebunden. Der MHC-Klasse-I-Peptid-Komplex 1 wird mit einem Ziel-Peptid 7, das sich von dem Platzhalter-Peptid 6 unterscheidet, und einem Austauschhelfermolekül 8, zum Beispiel Ethanol, in einer geeigneten Lösung zusammengebracht. Eine H-Bindungsdonorgruppe 9 ist hier durch -XH symbolisiert, wobei X beispielsweise für O, S oder N stehen kann. Das Austauschhelfermolekül 8 katalysiert durch Wechselwirkung mit dem Platzhalter-Peptid 6 und/oder den die Peptidbindungsstelle 5 auskleidenden Aminosäuren die Verdrängung des Platzhalter-Peptids 6 aus der Peptidbindungsstelle 5 und den Austausch gegen das Ziel-Peptid 7. Im unteren Teil der 1 ist der resultierende MHC-Klasse-I-Peptid-Komplex 10 aus dem eingangs eingesetzten MHC-Klasse-I-Molekül 2 und dem daran gebundenen Ziel-Peptid 7 dargestellt.
Beispiele:
Die folgenden Ausführungsbeispiele betreffen einen Peptid-Austausch bei einem MHC-Peptid-Komplex nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Aminosäuresequenzen der Platzhalter- sowie Ziel-Peptide sind im Einbuchstabencode angegeben.
Beispiel 1. Peptid-Austausch bei einem MHC-Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, β2m, und dem Platzhalter-Peptid NLVPMVATA (Ziel-Peptid: NLVPKVATV; Austauschhelfermolekül: Ethanol).
Schritt 1. Die folgenden Stammlösungen wurden vorbereitet oder bereitgestellt: Assay-Puffer (eine gepufferte 50 mM HEPES (C₈H₁₈N₂O₄S), 150 mM NaCl, 7.5 pH Lösung ist, die bei 2-8°C gelagert wird); MHC-Peptid-Komplex, bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, β2m, und dem Platzhalter-Peptid NLVPMVATA mit einer Konzentration von 10 µg/mL in 150 mM NaCl und 15 mM Kaliumphosphat, pH 7.0; Ziel-Peptid war NLVPKVATV, wobei die Seitenkette des Lysin (K) an Position 5 des Peptids mit Fluorescein derivatisiert war, so dass das Fluorescein kovalent an die Seitenkette des Peptids gebunden war; das Ziel-Peptid lag mit einer Konzentration 1 mM in 100% DMSO vor; Austauschhelfermolekül: Ethanol.
Schritt 2. Vorbereitung des Peptid-Austauschs: 50 µL einer Lösung des MHC-Peptid-Komplex in Assay-Puffer mit einer Konzentration von 600 nM wurden in die Vertiefungen A1 - A9 einer nicht-bindenden, schwarzen, Polystyrol-96-Well-Platte mit flachem Boden pipettiert. In die Vertiefungen B1 - B9 wurden je 50 µL Assay-Puffer pipettiert (für die jeweilige Hintergrundmessung). 25 µL von 80% Austauschhelfermolekül in Assay-Puffer wurden in die Vertiefungen A1 - A3 und B1 - B3 pipettiert. 25 µL 40% Austauschhelfermolekül in Assay-Puffer wurden jeweils in Vertiefung A4 - A6 und B4 - B6 pipettiert. In Vertiefung A7-A9 und B7-B9 wurden je 25 µL Assay-Puffer pipettiert. Zu jeder Vertiefung 1-9 der 96-Well-Platte der Reihe A und B wurden 25 µL des Ziel-Peptids mit einer Konzentration von 400 nM (das fluoreszierend markierte Peptid wurde bis zur Nutzung kühl und im Dunkeln gelagert) in Assay-Puffer pipettiert und durch kurzes Auf- und Ab-Pipettieren vermischt. Somit war die End-Konzentration in jeder Vertiefung 100 nM Ziel-Peptid und 300 nM MHC-Peptid-Komplex.
Schritt 3. Messung des Peptid-Austauschs: Die 96-Well-Platte wurde in einen Platten-Leser (z.B. TECAN Infinite M1000 PRO) gelegt und für 3 Stunden analysiert. Die Bindung des Ziel-Peptids an das MHC-Molekül wurde verfolgt durch die Messung der Fluoreszenzanisotropie (oder Fluoreszenzpolarisation) des Ziel-Peptids (s. z.B. Saini SK, Schuster H, Ramnarayan VR, Rammensee HG, Stevanovic S, Springer S. Dipeptides catalyze rapid peptide exchange on MHC dass I molecules, Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(1):202-207, doi:10.1073/pnas.1418690112). Eine ansteigende Fluoreszenzanisotropie zeigt eine zunehmende Bindung des fluoreszenzmarkierten Ziel-Peptids an das MHC-Molkül an. Die Messung wurde bei Raumtemperatur (25°C) mit einer Anregungswellenlänge von 470 nm und Emissionswellenlänge von 517 nm durchgeführt. Alle 30 Sekunden wurde eine Messung aller Vertiefungen vorgenommen.
Schritt 4. Die Daten wurden mit der instrumenteigenen Software oder mit anderen geeigneten Programmen verarbeitet.
2 zeigt das Ergebnis des in Beispiel 1 beschrieben Peptidaustauschexperimentes. Wie auch bei den 3 bis 6 bedeutet „Keines“ in der Legende, dass bei dieser Probe kein Austauschhelfermolekül hinzugefügt wurde.
Beispiel 2. Peptid-Austausch bei einem MHC-Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, β2m, und dem Platzhalter-Peptid NLVPMVATA (Ziel-Peptid: NLVPKVATV; Austauschhelfermolekül: Methanol).
Die experimentelle Ausführung von Beispiel 2 ist identisch mit der von Beispiel 1, mit der Ausnahme, dass das Austauschhelfermolekül hier Methanol war.
3 zeigt das Ergebnis des in Beispiel 2 beschriebenen Peptidaustauschexperimentes.
Beispiel 3. Peptid-Austausch bei einem MHC-Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*24:02, β2m, und dem Platzhalter-Peptid TYGPVFMCL (Ziel-Peptid: QYTPVSKLF; Austauschhelfermolekül: Ethanol).
Die experimentelle Ausführung von Beispiel 3 ist identisch mit der von Beispiel 1, mit den folgenden Ausnahmen: Der MHC-Peptid-Komplex bestand aus der schweren Kette von HLA-A*24:02, β2m, und dem Platzhalter-Peptid TYGPVFMCL; das Ziel-Peptid war QYTPVSKLF, welches in der in Beispiel 1 genannten Weise an der Seitenkette des Lysin-Restes mit Fluorescein modifiziert war.
4 zeigt das Ergebnis des in Beispiel 3 beschrieben Peptidaustauschexperimentes.
Beispiel 4. Peptid-Austausch bei einem MHC-Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, β2m, und dem Platzhalter-Peptid NLVPMVATA (Ziel-Peptid: NLVPKVATV; Austauschhelfermolekül: Methanol).
Die experimentelle Ausführung von Beispiel 3 ist identisch mit der von Beispiel 1, mit den folgenden Ausnahmen: Der MHC-Peptid-Komplex bestand aus der schweren Kette von HLA-B*27:05, β2m, und dem Platzhalter-Peptid RRDJRSVAL (hierbei bezeichnet der Buchstabe J die photo-spaltbare Aminosäure 3-amino-3-(2-nitrophenyl)propionsäure); das Ziel-Peptid ist GRVFIIKSY, welches in der in Beispiel 1 genannten Weise an der Seitenkette des Lysin-Restes mit Fluorescein modifiziert war.
5 zeigt das Ergebnis des in Beispiel 4 beschriebenen Peptidaustauschexperimentes wie.
Beispiel 5. Peptid-Austausch bei einem MHC-Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*24:02, β2m, und dem Platzhalter-Peptid TYGPVFMCL (Ziel-Peptid: QYTPVSKLF; Austauschhelfermoleküle: Ethanol und das Dipeptid GF).
Schritt 1. Die folgenden Stammlösungen wurden vorbereitet oder bereitgestellt: Assay-Puffer (eine gepufferte 50 mM HEPES (C₈H₁₈N₂O₄S), 150 mM NaCl, 7.5 pH Lösung, die bei 2-8°C gelagert wird); MHC-Peptid-Komplex, bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, β2m, und dem Platzhalter-Peptid TYGPVFMCL mit einer Konzentration von 10 µg/mL in 150 mM NaCl und 15 mM Kaliumphosphat, pH 7.0; Ziel-Peptid war QYTPVSKLF, wobei die Seitenkette des Lysin (K) an Position 7 des Peptids mit Fluorescein derivatisiert war, so dass das Fluorescein kovalent an die Seitenkette des Peptids gebunden war; das Ziel-Peptid lag mit der Konzentration 1 mM in 100% DMSO vor; Austauschhelfermolekül: Ethanol; Austauschhelfermolekül: GF (Dipeptid Glycyl-Phenylalanin), 80 mM in Assay-Puffer.
Schritt 2. Vorbereitung des Peptid-Austauschs: 50 µL einer Lösung des MHC-Peptid-Komplex in Assay-Puffer mit einer Konzentration von 600 nM wurden in die Vertiefungen A1 - A12 einer nicht-bindenden, schwarzen, Polystyrol-96-Well-Platte mit flachem Boden pipettiert. 25 µL 40 mM Dipeptid in Assay-Puffer wurden jeweils in Vertiefungen A1 - A3 und B1 - B3 pipettiert. In Vertiefungen A4 - A6 und B4 - B6 wurden je 12.5 µL 80 mM Dipeptid pipettiert. Nach 15 Minuten Inkubationszeit wurden in Vertiefung A4 - A6 und B4 - B6, 12.5 µL 80% Austauschhelfermolekül (EtOH) in Assay-Puffer hinzugefügt. 25 µL von 40% Austauschhelfermolekül (EtOH) in Assay-Puffer wurden in die Vertiefungen A7 - A9 und B7 - B9 pipettiert. In Vertiefungen A10 - A12 und B10 - B12 wurden 25 µL Assay-Puffer pipettiert (als Negativ-Kontrolle). Zu jeder Vertiefung der Reihe A und B der 96-Well-Platte wurden 25 µL des mit FITC markierten Ziel-Peptids mit einer Konzentration von 400 nM (das fluoreszierend markierte Peptid wurde bis zur Nutzung kühl und im Dunkeln gelagert) pipettiert und durch kurzes Auf- und Ab-Pipettieren vermischt. Somit war die End-Konzentration in jeder Vertiefung 100 nM fluoreszierend markiertes Ziel-Peptid und 300 nM MHC-Peptid-Komplex.
Schritt 3. Messung des Peptid-Austauschs: Die 96-Well-Platte wurde in einen Platten-Leser (z.B. TECAN Infinite M1000 PRO) gelegt und für 3 Stunden analysiert. Die Bindung des Ziel-Peptids an das MHC-Molekül wurde durch die Messung der Fluoreszenzanisotropie (oder Fluoreszenzpolarisation) des Ziel-Peptids verfolgt. Die Messung wurde bei Raumtemperatur (25°C) mit einer Anregungswellenlänge von 470 nm und Emissionswellenlänge von 517 nm durchgeführt. Alle 30 Sekunden wurde eine Messung aller Vertiefungen vorgenommen.
Schritt 4. Die Daten werden mit der instrumenteigenen Software oder mit anderen geeigneten Programmen verarbeitet.
6 zeigt das Ergebnis des in Beispiel 5 beschriebenen Peptidaustauschexperimentes.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2013/102458 A1 [0005]
WO 2013/102458 [0005]
WO 2017/197244 [0005]

Claims

In-vitro-Verfahren zum Herstellen eines mit einem Ziel-Peptid beladenen MHC-Klasse-I-Moleküls durch Austauschen eines an eine Peptidbindungsstelle eines MHC-Klasse-I-Molekül gebundenen Platzhalter-Peptids gegen das Ziel-Peptid, wobei das Platzhalter-Peptid und das Ziel-Peptid voneinander verschieden sind, und wobei das MHC-Klasse-I-Molekül mit dem an seine Peptidbindungsstelle gebundenen Platzhalter-Peptid in einer Lösung mit a) dem Ziel-Peptid und b) einem Austauschhelfermolekül zusammengebracht wird, und wobei das Austauschhelfermolekül eine organische C₁-C₆-Verbindung mit einer Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe, ausgenommen eine Aminosäure oder ein Peptid, ist, und wobei die Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe ausgewählt ist aus -OH, -COOH, -CONH₂, -SH, =NH, -NH- oder NH₂.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Austauschhelfermolekül eine aliphatische C₁-C₆-Verbindung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Austauschhelfermolekül ein C₁-C₆-Alkohol, bevorzugt ein einwertiger C₁-C₆-Alkohol, weiter bevorzugt ein C₁-C₆-Alkanol, besonders bevorzugt Ethanol ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bindungsaffinität des Ziel-Peptids zur Peptidbindungsstelle des MHC-Klasse-I-Molekül höher ist als die Bindungsaffinität des Platzhalter-Peptids zur Peptidbindungsstelle des MHC-Klasse-I-Molekül.
Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend a) eine Lösung enthaltend ein mit einem Platzhalter-Peptid beladenes MHC-Klasse-I-Molekül und b) ein Austauschhelfermolekül.
Kit nach Anspruch 5, ferner umfassend ein Ziel-Peptid zum Austausch gegen das Platzhalter-Peptid.