WO2023104256A1 - In-vitro-herstellung peptidbeladener mhc-klasse-i-moleküle - Google Patents

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WO2023104256A1
WO2023104256A1 PCT/DE2022/200276 DE2022200276W WO2023104256A1 WO 2023104256 A1 WO2023104256 A1 WO 2023104256A1 DE 2022200276 W DE2022200276 W DE 2022200276W WO 2023104256 A1 WO2023104256 A1 WO 2023104256A1
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peptide
molecule
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mhc class
mhc
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PCT/DE2022/200276
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Inventor
Sebastian Hartmut Springer
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Jacobs University Bremen Ggmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules

Definitions

  • the invention relates to an in vitro method for producing an MHC class I molecule loaded with a target peptide.
  • the major histocompatibility complex comprises a group of genes encoding MHC proteins or MHC protein complexes, which play an important role in the vertebrate immune system.
  • the major histocompatibility complex encodes MHC class I and MHC class II proteins that present cell-processed peptide antigens on the cell surface for recognition by T lymphocytes.
  • MHC class I molecules are membrane-bound proteins on the surface of nucleated body cells of higher vertebrates. They serve to present short antigenic peptides with a length of typically 8 to 11 amino acids to cytotoxic T cells and play an important role in the immune defense against viruses, bacteria and other pathogens as well as malignant cells. Due to the polygeny of the MHC complex and the extreme polymorphism of the MHC genes, there is a very large number of different MHC class I molecules, which in turn can bind a very large number of different peptides.
  • MHC class I molecules for example to study, activate, detect the interaction between T cell receptors of cytotoxic T cells and MHC class I molecules or to isolate.
  • MHC class I molecules which are often complexed to form multimers to exploit the avidity effect, is difficult if the MHC class I molecules are produced from the unfolded (denatured) state, since they only fold correctly or remain folded when an appropriate peptide is present. This means in the event that you use a specific complex of an MHC class I molecule and a specific peptide want, this complex has to be produced from the individual components in a complex manner.
  • WO 2017/197244 also discloses a method for carrying out a peptide exchange on an MHC class I or MHC class II molecule with a peptide bound thereto.
  • the exchange is carried out in the presence of a peptide exchange factor, which peptide exchange factor can be a dipeptide, for example glycyl methionine, glycyl cyclohexylalanine, glycyl leucine, glycyl arginine, glycyl lysine, glycyl-(tert)-butylalanine or glycyl -homoleucine.
  • a peptide exchange factor which peptide exchange factor can be a dipeptide, for example glycyl methionine, glycyl cyclohexylalanine, glycyl leucine, glycyl arginine, glycyl lysine, glycyl-(tert)-butylalanine or glycyl -homoleucine.
  • MHC class II molecules which differ significantly from MHC class I molecules in their structure and function, it has been proposed some time ago to use ethanol or other small H-bond donors for peptide exchange in MHC class -II molecules to use (see eg Falk K, Lau JM, Santambrogio L, Esteban VM, Puentes F, Rötzschke O, Strominger JL, Ligand Exchange of Major Histocompatibility Complex Class II Proteins Is Triggered by H-bond Donor Groups of Small Molecules, J. Biol. Chem. 277, 2709-2715, doi: 10.1074/jbc.M109098200).
  • the object of the present invention is to simplify the production of defined complexes from an MHC class I molecule and a target peptide.
  • small organic molecules which are not an optionally modified amino acid or a peptide, for example a di- or tripeptide, and which have at least one hydrogen bond donor group, such as ethanol, are suitable for catalyzing, in the case of an MHC class I molecule, an exchange of a peptide bound by the MHC class I molecule for a desired peptide.
  • This can be used to advantage, for example, to produce recombinant MHC class I molecules loaded with a specific target peptide.
  • Such MHC class I molecules loaded with certain target peptides can be used, for example be used to specifically study the interaction between T cell receptors and MHC class I molecules or to isolate or identify T cells.
  • MHC molecule or “MHC protein” is understood to mean a major histocompatibility complex protein, ie a protein encoded by the major histocompatibility complex. MHC molecules are divided into different classes, eg class I and class II.
  • MHC Class I protein means "MHC Class I molecule", “Class I molecule”, “MHC I molecule”, MHC Class I protein”, “Class I protein” or “MHC I protein” becomes a major histocompatibility complex class I protein
  • MHC class II protein MHC class II molecule
  • class II molecule class II molecule ', 'MHC II molecule', 'MHC class II protein', 'class II protein' or 'MHC II protein'
  • MHC class I and MHC class II proteins are major histocompatibility complex (MHC) encoded transmembrane proteins and are involved in the cellular immune response.
  • MHC class I proteins bind peptides from inside the cell, such as from the cytosol or the lumen of the endocytic organelles, and present them to the cytotoxic T cells on the cell surface (antigen presentation). Antigens presented by MHC class II proteins induce binding of CD-4 positive helper T cells.
  • An MHC I molecule usually consists of a heavy alpha chain (a chain), also known as “hc” for short, molecular weight approx. 44 kDa (approx. 350 amino acids) with three extracellular domains (a1, a2 and a3) and one Transmembrane domain and a non-covalently bound light beta chain (ß-chain, also "ß2-microglobulin” or "ß2m” for short, approx.
  • HLA human leukocyte antigen
  • the term encompasses both classical MHC class I proteins such as HLA-A, HLA-B and HLA-C and non-classical MHC class I proteins such as HLA-E, HLA-F and HLA-G.
  • MHC class II proteins usually consist of two chains of almost equal size, an alpha chain (a chain, approx. 33 kDa) and a beta chain (ß chain, approx. 30 kDa), each with one extracellular domain, a transmembrane segment and a relatively short cytosolic component.
  • the extracellular domain comprises two domains (al, a2 and ßl, ß2), where the Peptide binding site (peptide binding domain) is formed by parts of the membrane-distant or distal al - and the ßl chain.
  • MHC class II molecules are encoded by three isotypes in humans: HLA-DP, HLA-DQ and HLA-DR (for the meaning of "HLA” see above).
  • HLA-DP chains are encoded by genes called HLA-DPA (for the alpha chain) or HLA-DPB (for the beta chain).
  • the chains for HLA-DQ and -DR are encoded in the same way.
  • Both MHC class I genes and MHC class II genes are highly polymorphic.
  • MHC class I molecule or MHC class II molecule can bind thousands of different peptides.
  • MHC molecule or MHC protein
  • MHC protein also includes peptide-binding fragments of all of these proteins, in particular the extracellular domain or sections thereof.
  • a “section” or “fragment” is understood here to mean in particular contiguous partial sequences of at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 80, 90 or at least 100 amino acids.
  • the term also includes MHC proteins from non-human vertebrate species, for example from mouse (Mus musculus), rat (Rattus norvegicus), bovine (Bos taurus), horse (Equus equus) or green monkey (Macaca mulatta).
  • the mouse MHC class I proteins are referred to as H-2 proteins, which are encoded by the gene loci H-2D, H-2K and H-2L.
  • H-2Kb a particular allotype of a mouse MHC class I protein
  • subclasses of murine MHC class II proteins include H-2A, H-2E and H-2P proteins.
  • the term "MHC molecule" or "MHC protein” also includes synthetic (recombinant) MHC molecules, ie molecules that correspond structurally and functionally to natural MHC molecules.
  • peptide binding site or "peptide binding domain” refer to the region of an MHC protein that is capable of non-covalently binding a peptide antigen.
  • the peptide binding site is formed by the alpha chain, in particular a groove formed by the a1 and a2 domains by appropriate folding.
  • a "peptide-free MHC molecule” or "empty MHC molecule” means an unloaded MHC molecule, ie an MHC molecule to which no peptide (antigen) is bound.
  • a "peptide-loaded MHC molecule” is understood here to mean a complex of peptide and MHC molecule.
  • a complex of peptide and MHC protein, ie an MHC protein, for example MHC class I protein, with a peptide bound to it, is also referred to here synonymously as “peptide/MHC protein complex” or “MHC protein/ peptide complex”.
  • a complex of peptide and MHC class I protein is also referred to as "class I peptide complex” or "peptide/MHC-I”.
  • pMHC-I is also used as an abbreviation for such a complex.
  • a complex of peptide and MHC class II protein is also referred to as “class II peptide complex” or “peptide/MHC -II”.
  • pMHC-II is also used as an abbreviation for such a complex.
  • antigen presenting in this context means that the MHC class I protein or the MHC class II protein has a peptide (antigen) bound.
  • a “placeholder peptide” is a peptide that is non-covalently bound to the peptide binding site of an MHC molecule, such as an MHC class I molecule, and is intended to be targeted against a specific other peptide (“target peptide”). to be exchanged. It is preferably a peptide with a length of 8 to 11, preferably 8-10 amino acids. For example, it can be a synthetic peptide with defined properties (e.g. with a specific amino acid sequence and/or affinity). The term also includes synthetic peptides containing non-natural or modified amino acids.
  • a “target peptide” is understood to mean a peptide, preferably a peptide with a length of 8 to 11 amino acids, more preferably 8-10 amino acids, with which an MHC molecule is loaded with displacement of a placeholder peptide.
  • an “exchange helper molecule” is meant a molecule which promotes the exchange of a placeholder peptide for a target peptide. Promote means, for example, that in the presence of the exchange helper molecule at a given number of MHC molecules, a greater proportion of placeholder peptides are exchanged for a target peptide than in the absence of the exchange helper molecule and/or in the presence of the exchange helper molecule, the exchange of a placeholder peptide for a target peptide occurs at a greater rate than in the absence of the exchange helper molecule.
  • An example of an exchange helper molecule within the meaning of the present invention is an ethanol molecule.
  • exchange catalyst may also be used here as a synonym for the expression “exchange helper molecule”.
  • a “hydrogen bond donor group”, also referred to synonymously as “H bond donor group” or “hydrogen donor group” and optionally symbolized by “X-H” or “XH”, is understood to mean a functional group of a molecule that is capable of accepting a hydrogen atom for a provide hydrogen bonding.
  • a hydrogen bond is a non-covalent and non-ionic chemical bond based on electrostatic forces between a hydrogen atom covalently bonded to an atom of a first molecule with a partial positive charge and an atom of a second molecule or another atom of the first molecule with a partial negative charge.
  • a hydrogen bond is an attractive interaction between a hydrogen bond donor group (X-H) and a proton acceptor (Y).
  • organic Ci-Ce compound refers to an organic compound of one to six carbon atoms. The term thus includes organic compounds having one, two, three, four, five or six carbon atoms. The term also includes organic compounds with heteroatoms in the carbon skeleton. The term includes aliphatic and aromatic, cyclic and acyclic compounds.
  • the expression "other than an amino acid or a peptide” in relation to the organic Ci-Ce compound means that the organic Ci-Ce compound is neither a Amino acid is still a peptide, ie a compound of two or more amino acids, such as a di- or tripeptide.
  • amino acid is meant a compound containing an amino group (-NH2) attached to a carbon atom and a carboxyl group (-COOH) attached to the same or different carbon atom of the compound.
  • the organic Ci-Ce compound according to the invention therefore does not contain an amino group (-NH2) and a carboxyl group (-COOH) at the same time.
  • the term also includes that the compound is not a "modified amino acid” or a peptide containing a "modified amino acid”.
  • the organic Ci-Ce compound does not simultaneously contain a) a carboxyl group and b) an amino group in which at least one H atom is substituted by another chemical group (e.g. by an acyl group), or a) an amino group and b) a carboxyl group in which the OH group or the H of the OH group is substituted, for example the OH group by an amino group, or a) an amino group in which an H atom is substituted by another chemical group, and b ) a carboxyl group in which the OH group or the H of the OH group are substituted.
  • another chemical group e.g. by an acyl group
  • an “alcohol” is understood to mean an organic compound which has one or more hydroxyl groups (-OH) each bonded to a carbon atom, with each carbon atom bearing an OH group being sp3-hybridized and, except to the hydroxyl group, only to carbon or hydrogen atoms is bound.
  • a “polyhydric alcohol” is understood to be an alcohol with more than one hydroxyl group, and a “monohydric alcohol” is an alcohol with only one hydroxyl group.
  • alkanol is understood to mean an organic compound with the formula R-OH, where R is an alkyl radical in which one or more H atoms are optionally present can be substituted by further OH groups.
  • a monohydric alkanol is an alkanol of the general formula CnEEn+iOH. Examples of monohydric alkanols are methanol and ethanol.
  • the expression that the "MHC class I molecule having the surrogate peptide bound to its peptide binding site is brought into contact in a solution with a) the target peptide and b) an exchange helper molecule” means that a surrogate peptide-loaded MHC class I molecule, a target peptide and an exchange helper molecule in a solution suitable for the exchange reaction, preferably an aqueous solution, and under conditions suitable for the exchange reaction, e.g. pH, temperature and salinity become. Suitable conditions are described, for example, in Saini et al. 2015 (Saini SK, Schuster H, Ramnarayan VR, Rammensee HG, Stevanovic S, Springer S.
  • Suitable conditions include, for example, aqueous solutions containing 150 mM NaCl and 15 mM inorganic phosphate, pH 7, or 150 mM NaCl, 50 mM Tris Cl, pH 8.
  • the exchange helper molecule can be any organic Ci-Ce compound having at least one hydrogen bond donor group, except an amino acid or a peptide.
  • the exchange helper molecule is preferably an aliphatic Ci-Ce compound.
  • the exchange helper molecule can be cyclic or acyclic, but is preferably acyclic.
  • the exchange helper molecule has at least one hydrogen bond donor group, but can also contain several, ie two or more, of the hydrogen bond donor groups mentioned, which can be the same or different. However, it is preferred if, when a plurality of hydrogen bond donor groups are present, these are the same as one another, for example all OH groups, all COOH groups or all SH groups.
  • the exchange helper molecule is particularly preferably a Ci-Ce alcohol, preferably a monohydric or dihydric Ci-Ce alcohol, more preferably a Ci-Ce alkanol, preferably a monohydric or dihydric Ci-Ce alkanol, particularly preferably ethanol.
  • Table 1 Examples of possible exchange helper molecules and their CAS numbers.
  • suitable replacement helper molecule compounds in Table 1 above is not intended to be exhaustive or to be considered in any way limiting.
  • the invention also includes other compounds not mentioned in Table 1 above, for example the 17 structural isomers of hexanol (COHBOH). In the case of optically active compounds, their stereoisomers are also included.
  • derivatives of the hexanoies listed in Table 1 or, for example, those mentioned, i.e. compounds which contain one or more further functional groups can also be used as exchange helper molecules.
  • the person skilled in the art is easily able to find further suitable exchange helper molecules on the basis of the present disclosure and, where applicable, his general specialist knowledge without any inventive step and without unreasonable effort.
  • the binding affinity of the target peptide to the peptide binding site of the MHC class I molecule is higher than the binding affinity of the placeholder peptide to the peptide binding site of the MHC class I molecule.
  • the target peptide therefore preferably has an association constant that is higher than the placeholder peptide, more preferably at least by a factor of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10, more preferably at least by a factor of 15 , 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 100 higher association constants.
  • a target peptide loading of MHC class I molecules by using the target peptide in excess in relation to the placeholder peptide, for example in a ratio of at least 5: 1, 10: 1, 20 : 1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1 or at least 100:1 is present in the solution.
  • a target Peptide with higher binding affinity advantageously in excess, ie present in higher concentration compared to the placeholder peptide in the solution.
  • the MHC class I molecule loaded with a target peptide can also exist as part of a multimeric complex, for example linked directly or indirectly to avidin or streptavidin.
  • the invention also relates to a kit for carrying out the method according to the invention described in more detail above, comprising a) a solution containing an MHC class I molecule loaded with a placeholder peptide and b) an exchange helper molecule.
  • the replacement helper molecule is preferably included in the kit in a separate container separate from the solution comprising the peptide-loaded MHC class I molecule.
  • the placeholder peptide is preferably a peptide with 8-11, more preferably 8-10, particularly preferably 8-9 amino acids, e.g. NLVPMVATA or FAPGNYPAL.
  • the kit according to the invention preferably also comprises a target peptide to be exchanged for the placeholder peptide.
  • FIG. 1 Highly schematized representation of the method according to the invention.
  • FIG. 2. Peptide exchange in an MHC peptide complex consisting of the heavy chain of HLA-A*02:01, ⁇ 2m, and the placeholder peptide NLVPMVATA; target peptide: NLVPKVATV; exchange helper molecule: ethanol; “None” means that no exchange helper molecule was added to this sample.
  • FIG. 3. Peptide exchange in an MHC peptide complex consisting of the heavy chain of HLA-A*02:01, ⁇ 2m, and the placeholder peptide NLVPMVATA; (Target peptide: NLVPKVATV; Exchange helper molecule: methanol; "None” means that no exchange helper molecule was added to this sample.
  • FIG. 4 Peptide exchange in an MHC peptide complex consisting of the heavy chain of HLA-A*24:02, ⁇ 2m, and the placeholder peptide TYGPVFMCL; Target Peptide: QYTPVSKLF; exchange helper molecule: ethanol; “None” means that no exchange helper molecule was added to this sample.
  • FIG. 5 Peptide exchange in an MHC peptide complex consisting of the heavy chain of HLA-A*02:01, ⁇ 2m, and the placeholder peptide NLVPMVATA; target peptide: NLVPKVATV; exchange helper molecule: methanol; “None” means that no exchange helper molecule was added to this sample.
  • FIG. 6 Peptide exchange in an MHC peptide complex consisting of the heavy chain of HLA-A*24:02, ⁇ 2m, and the placeholder peptide TYGPVFMCL; Target Peptide: QYTPVSKLF; exchange helper molecules: ethanol; dipeptide GF; “None” means that no exchange helper molecule was added to this sample.
  • FIG. 1 shows a simplified and schematic representation of the principle of the method according to the invention.
  • the upper part of FIG. 1 shows a first MHC class I peptide complex 1, ie an MHC class I molecule 2 loaded with a placeholder peptide 6, consisting of a heavy chain (a chain) 3 and a light chain (ß2-microglobulin, ß2m) 4.
  • the placeholder peptide 6 is bound to the peptide binding site 5 of the MHC class I molecule 2.
  • the MHC class I peptide complex 1 is contacted with a target peptide 7, different from the placeholder peptide 6, and an exchange helper molecule 8, for example ethanol, in a suitable solution.
  • a H-bond donor group 9 is symbolized here by -XH, where X can be O, S or N, for example.
  • the exchange helper molecule 8 catalyzes the displacement of the placeholder peptide 6 from the interaction with the placeholder peptide 6 and/or the amino acids lining the peptide binding site 5 Peptide binding site 5 and exchange for the target peptide 7.
  • the lower part of FIG. 1 shows the resulting MHC class I peptide complex 10 from the MHC class I molecule 2 initially used and the target peptide bound to it 7 shown.
  • the following exemplary embodiments relate to a peptide exchange in an MHC peptide complex according to the method according to the invention.
  • Amino acid sequences of the placeholder and target peptides are given in single-letter code.
  • Example 1 Peptide exchange in an MHC peptide complex consisting of the heavy chain of HLA-A*02:01, ⁇ 2m, and the placeholder peptide NLVPMVATA (target peptide: NLVPKVATV; exchange helper molecule: ethanol).
  • Step 1 The following stock solutions were prepared or provided: Assay Buffer (a buffered 50 mM HEPES (C8H18N2O4S), 150 mM NaCl, 7.5 pH solution stored at 2-8°C); MHC peptide complex consisting of HLA-A*02:01, ß2m heavy chain and surrogate peptide NLVPMVATA at a concentration of 10 pg/mL in 150 mM NaCl and 15 mM potassium phosphate, pH 7.0;
  • the target peptide was NLVPKVATV in which the side chain of the lysine (K) at position 5 of the peptide was derivatized with fluorescein such that the fluorescein was covalently linked to the side chain of the peptide; the target peptide was at a concentration of 1 mM in 100% DMSO; Exchange helper molecule: ethanol.
  • Step 2 Preparation of peptide exchange: 50 pL of a solution of the MHC -peptide complex in assay buffer at a concentration of 600 nM was placed in wells A1 - A9 of a non-binding, black, polystyrene 96-well plate pipetted with a flat bottom. 50 pL of assay buffer were pipetted into each of the wells B1-B9 (for the respective background measurement). 25 pL of 80% exchange helper molecule in assay buffer was pipetted into wells A1 - A3 and B1 - B3. 25 pL of 40% exchange helper molecule in assay buffer were added to wells A4 - A6 and B4 - B6 pipetted.
  • 25 pL assay buffer each were pipetted into wells A7-A9 and B7-B9.
  • To each well 1-9 of row A and B 96-well plates was pipetted 25 pL of target peptide at a concentration of 400 nM (the fluorescently labeled peptide was stored in a cool and dark place until used) in assay buffer and mixed by briefly pipetting up and down.
  • the final concentration in each well was 100 nM target peptide and 300 nM MHC peptide complex.
  • Step 3 Measurement of peptide exchange: The 96-well plate was placed in a plate reader (e.g. TECAN Infinite Ml 000 PRO) and analyzed for 3 hours. Binding of the target peptide to the MHC molecule was monitored by measuring the fluorescence anisotropy (or fluorescence polarization) of the target peptide (see e.g. Saini SK, Schuster H, Ramnarayan VR, Rammensee HG, Stevanovic S, Springer S. Dipeptides catalyze rapid peptide exchange on MHC class I molecules, Proc Natl Acad Sei USA, 2015, 112(l):202-207, doi: 10.1073/pnas.1418690112).
  • a plate reader e.g. TECAN Infinite Ml 000 PRO
  • Increasing fluorescence anisotropy indicates increasing binding of the fluorescently labeled target peptide to the MHC molecule.
  • the measurement was performed at room temperature (25°C) with an excitation wavelength of 470 nm and an emission wavelength of 517 nm. A reading of all wells was taken every 30 seconds.
  • Step 4 The data were processed with the instrument's own software or with other suitable programs.
  • FIG. 2 shows the result of the peptide exchange experiment described in Example 1.
  • "None" in the legend means that no exchange helper molecule was added to this sample.
  • Example 2 Peptide exchange in an MHC peptide complex consisting of the heavy chain of HLA-A*02:01, ⁇ 2m, and the placeholder peptide NLVPMVATA (target peptide: NLVPKVATV; exchange helper molecule: methanol).
  • Example 2 The experimental design of Example 2 is identical to that of Example 1, except that the exchange helper molecule here was methanol.
  • FIG. 3 shows the result of the peptide exchange experiment described in Example 2.
  • Example 3 Peptide exchange in an MHC peptide complex consisting of the heavy chain of HLA-A*24:02, ⁇ 2m, and the placeholder peptide TYGPVFMCL (target peptide: QYTPVSKLF; exchange helper molecule: ethanol).
  • Example 3 The experimental design of Example 3 is identical to that of Example 1 with the following exceptions: the MHC -peptide complex consisted of the HLA-A*24:02 heavy chain, ⁇ 2m, and the surrogate peptide TYGPVFMCL; the target peptide was QYTPVSKLF modified in the manner described in Example 1 on the side chain of the lysine residue with fluorescein.
  • FIG. 4 shows the result of the peptide exchange experiment described in Example 3.
  • Example 4 Peptide exchange in an MHC peptide complex consisting of the heavy chain of HLA-A*02:01, ⁇ 2m, and the placeholder peptide NLVPMVATA (target peptide: NLVPKVATV; exchange helper molecule: methanol).
  • Example 3 The experimental design of Example 3 is identical to that of Example 1, with the following exceptions:
  • the MHC -peptide complex consisted of the HLA-B*27:05 heavy chain, ⁇ 2m, and the placeholder peptide RRDJRSVAL (herein denoted the letter J the photocleavable amino acid 3-amino-3-(2-nitrophenyl)propionic acid);
  • the target peptide is GRVFIIKSY modified in the manner described in Example 1 on the side chain of the lysine residue with fluorescein.
  • FIG. 5 shows the result of the peptide exchange experiment described in Example 4 as.
  • Example 5 Peptide exchange in an MHC peptide complex consisting of the heavy chain of HLA-A*24:02, ß2m, and the placeholder peptide TYGPVFMCL (target peptide: QYTPVSKLF; exchange helper molecules: ethanol and the dipeptide GF) .
  • Assay Buffer a buffered 50 mM HEPES (C8H18N2O4S), 150 mM NaCl, 7.5 pH solution stored at 2-8°C); MHC peptide complex consisting of HLA-A*02:01, ß2m heavy chain and surrogate peptide TYGPVFMCL at a concentration of 10 pg/mL in 150 mM NaCl and 15 mM potassium phosphate, pH 7.0; Target peptide was QYTPVSKLF, where the side chain of the lysine (K) at position 7 of the peptide was derivatized with fluorescein such that the fluorescein was covalently linked to the side chain of the peptide; the target peptide was at a concentration of 1 mM in 100% DMSO; exchange helper molecule: ethanol; Exchange helper molecule: GF (dipeptide glycyl - phenylalanine), 80 mM in as
  • Step 2 Preparation of peptide exchange: 50 pL of a solution of the MHC -peptide complex in assay buffer at a concentration of 600 nM was dispensed into wells A1 - A12 of a non-binding, black, polystyrene 96-well plate pipetted with a flat bottom. 25 pL of 40 mM dipeptide in assay buffer were pipetted into wells A1-A3 and B1-B3. 12.5 pL of 80 mM dipeptide were pipetted into wells A4-A6 and B4-B6.
  • each well of rows A and B of the 96-well plate 25 pL of the FITC-labeled target peptide at a concentration of 400 nM (the fluorescently labeled peptide was stored in a cool and dark place until use) was pipetted and briefly opened - and Ab pipetting mixed.
  • the final concentration in each well was 100 nM fluorescently labeled target peptide and 300 nM MHC peptide complex.
  • Step 3 Measurement of peptide exchange: The 96-well plate was placed in a plate reader (eg TECAN Infinite MI 000 PRO) and analyzed for 3 hours. Binding of the target peptide to the MHC molecule was monitored by measuring the fluorescence anisotropy (or fluorescence polarization) of the target peptide. The Measurement was performed at room temperature (25°C) with an excitation wavelength of 470 nm and an emission wavelength of 517 nm. A reading of all wells was taken every 30 seconds. Step 4. The data are processed with the instrument's own software or with other suitable programs.
  • a plate reader eg TECAN Infinite MI 000 PRO
  • FIG. 6 shows the result of the peptide exchange experiment described in Example 5.

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Abstract

Die Erfindung stellt ein In-vitro-Verfahren zum Herstellen eines mit einem Ziel-Peptid beladenen MHC-Klasse-I-Moleküls durch Austauschen eines an eine Peptidbindungsstelle eines MHC-Klasse-I-Molekül gebundenen Platzhalter-Peptids gegen das Ziel-Peptid bereit, wobei das Platzhalter-Peptid und das Ziel-Peptid voneinander verschieden sind, und wobei das MHC-Klasse-I-Molekül mit dem an seine Peptidbindungsstelle gebundenen Platzhalter-Peptid in einer Lösung mit a) dem Ziel-Peptid und b) einem Austauschhelfermolekül zusammengebracht wird, und wobei das Austauschhelfermolekül eine organische C1-C6-Verbindung mit einer Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe, ausgenommen eine Aminosäure oder ein Peptid, ist, und wobei die Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe ausgewählt ist aus –OH, –COOH, –CONH2, –SH, =NH, –NH– oder NH2.

Description

IN-VITRO-HERSTELLUNG PEPTIDBELADENER MHC-KLASSE-I-MOLEKÜLE
Die Erfindung betrifft ein In -vitro- Verfahren zur Herstellung eines mit einem Ziel-Peptid beladenen MHC-Klasse-I-Moleküls.
Der Haupthistokompatibilitätskomplex („major histocompatibility complex“, MHC) umfasst eine Gruppe von Genen, die MHC -Proteine bzw. MHC -Proteinkomplexe kodieren, die eine wichtige Rolle im Immunsystem von Wirbeltieren spielen. Unter anderem kodiert der Haupthistokompatibilitätskomplex MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse- Il-Proteine, die von der Zelle aufbereitete Peptid- Antigene auf der Zelloberfläche präsentieren, damit diese von T-Lymphozyten erkannt werden können. MHC -Moleküle des Menschen werden auch als HLA-Proteine (HLA = human leucocyte antigen) bezeichnet.
MHC-Klasse-I-Moleküle sind membranständige Proteine an der Oberfläche kernhaltiger Körperzellen von höheren Wirbeltieren. Sie dienen der Präsentation von kurzen antigenischen Peptiden mit einer Länge von typischerweise 8 bis 11 Aminosäuren gegenüber zytotoxischen T-Zellen und spielen eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr gegen Viren, Bakterien und andere Pathogene sowie maligne Zellen. Aufgrund der Polygenie des MHC -Komplexes und des extremen Polymorphismus der MHC-Gene existiert eine sehr große Anzahl unterschiedlicher MHC-Klasse-I-Moleküle, die wiederum eine sehr große Anzahl unterschiedlicher Peptide binden können.
Es ist bekannt, rekombinante MHC-Klasse-I-Moleküle zu verwenden, zum Beispiel, um die Wechselwirkung zwischen T-Zell-Rezeptoren zytotoxischer T-Zellen und MHC- Klasse-I-Molekülen zu untersuchen, T-Zellen zu aktivieren, zu detektieren oder zu isolieren. Die Herstellung solcher rekombinanter MHC-Klasse-I-Moleküle, die zur Ausnutzung des Aviditätseffektes häufig zu Multimeren komplexiert werden, ist allerdings schwierig, wenn die MHC-Klasse-I-Moleküle aus dem ungefalteten (denaturierten) Zustand erzeugt werden, da sie sich nur korrekt falten oder gefaltet bleiben, wenn ein geeignetes Peptid zugegen ist. Das bedeutet für den Fall, dass man einen bestimmten Komplex aus einem MHC-Klasse-I-Molekül und einem bestimmten Peptid einsetzen möchte, dieser Komplex aufwändig aus den einzelnen Komponenten hergestellt werden muss.
Es sind daher Verfahren entwickelt worden, um diesen Prozess zu vereinfachen, indem bei einem bereits gefalteten peptidbeladenen MHC-Klasse-I-Moleküle das gebundene Peptid gegen ein gewünschtes Ziel-Peptid ausgetauscht wird. Ein solches Verfahren ist beispielsweise in der WO 2013/102458 Al beschrieben. Bei dem in der WO 2013/102458 Al beschriebenen Verfahren wird der Austausch eines Platzhalter-Peptids gegen ein Ziel- Peptid mittels einer Aminosäure, einer modifizierten Aminosäure oder eines Peptids, z.B. Di- oder Tripeptids, katalysiert (s. auch Saini SK, Ostermeir K, Ramnarayan VR, Schuster H, Zacharias M, and Springer S, Dipeptides promote folding and peptide binding of MHC class I molecules, Proc Natl Acad Sei USA 110, 15383-15388, doi: 10.1073/pnas.1308672110; Saini SK, Schuster H, Ramnarayan VR, Rammensee HG, Stevanovic S, Springer S. Dipeptides catalyze rapid peptide exchange on MHC class I molecules, Proc Natl Acad Sei USA, 2015, 112(l):202-207, doi: 10.1073/pnas.1418690112). Bei einem solchen Verfahren ist es zur Herstellung eines mit einem gewünschten Ziel-Peptid beladenen MHC-Klasse-I-Moleküls nicht nötig, von einem ungefalteten MHC-Klasse-I-Molekül auszugehen und den oben beschriebenen aufwändigen Faltungsprozess zu durchlaufen. Auch in der WO 2017/197244 ist ein Verfahren zur Durchführung eines Peptidaustausches an einem MHC-Klasse-I oder MHC- Klasse-II-Molekül mit einem daran gebundenen Peptid offenbart. Bei dem Verfahren wird der Austausch in Gegenwart eines Peptidaustauschfaktors vorgenommen, wobei der Peptidaustauschfaktor ein Dipeptid sein kann, beispielsweise Glycyl-Methionin, Glycyl- Cyclohexylalanin, Glycyl-Leucine, Glycyl -Arginin, Glycyl-Lysin, Glycyl -(tert)- Butylalanin oder Glycyl-Homoleucin.
Celie, P. et al., 2009 (“UV-Induced Ligand Exchange in MHC Class I Protein Crystals“, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 12298-12304) offenbart einen UV-induzierten Ligandenaustausch in MHC-Klasse-I-Proteinkristallen. Die Struktur eines MHC- Komplexes mit einem konditionalen MHC-Klasse-I-Liganden und die Struktur des teilweise leeren MHC -Komplexes, der nach UV-induzierter Spaltung des Liganden entsteht, sind in diesem Dokument beschrieben. Für MHC-Klasse-II-Moleküle, die sich in Ihrer Struktur und Funktion wesentlich von MHC-Klasse-I-Molekülen unterscheiden, ist bereits vor längerer Zeit vorgeschlagen worden, Ethanol oder andere kleine H-Bindungsdonoren zum Peptid- Austausch bei MHC- Klasse-II-Molekülen zu verwenden (s. z.B. Falk K, Lau JM, Santambrogio L, Esteban VM, Puentes F, Rötzschke O, Strominger JL, Ligand Exchange of Major Histocompatibility Complex Class II Proteins Is Triggered by H-bond Donor Groups of Small Molecules, J. Biol. Chem. 277, 2709-2715, doi: 10.1074/jbc.M109098200).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Herstellung von definierten Komplexen aus einem MHC-Klasse-I-Molekül und einem Ziel-Peptid zu vereinfachen.
Zur Lösung der Aufgabe stellt die Erfindung ein In- vitro- Verfahr en zum Herstellen eines mit einem Ziel-Peptid beladenen MHC-Klasse-I-Moleküls durch Austauschen eines an eine Peptidbindungsstelle eines MHC-Klasse-I-Molekül gebundenen Platzhalter-Peptids gegen das Ziel-Peptid bereit, wobei das Platzhalter-Peptid und das Ziel-Peptid voneinander verschieden sind, und wobei das MHC-Klasse-I-Molekül mit dem an seine Peptidbindungsstelle gebundenen Platzhalter-Peptid in einer Lösung mit a) dem Ziel-Peptid und b) einem Austauschhelfermolekül zusammengebracht wird, und wobei das Austauschhelfermolekül eine organische Ci-Ce-Verbindung mit einer Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe, ausgenommen eine Aminosäure oder ein Peptid, ist, und wobei die Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe ausgewählt ist aus -OH, -COOH, -CONH2, -SH, =NH, -NH- oder NH2.
Es wurde überraschend gefunden, dass kleine organische Moleküle (Ci-Ce-Verbindungen), bei denen es sich nicht um eine gegebenenfalls modifizierte Aminosäure oder ein Peptid, beispielsweise Di- oder Tripeptid, handelt, und die mindestens eine Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe aufweisen, wie beispielsweise Ethanol, geeignet sind, bei einem MHC-Klasse-I-Molekül einen Austausch eines von dem MHC-Klasse-I- Molekül gebundenen Peptids gegen ein gewünschtes Peptid zu katalysieren. Dies kann beispielsweise vorteilhaft genutzt werden, um rekombinante MHC-Klasse-I-Moleküle herzustellen, die mit einem bestimmten Ziel-Peptid beladen sind. Derartige mit bestimmten Ziel-Peptiden beladene MHC-Klasse-I-Moleküle können zum Beispiel dazu verwendet werden, um gezielt die Wechselwirkung zwischen T-Zell-Rezeptoren und MHC-Klasse-I- Molekülen zu untersuchen oder um T-Zellen zu isolieren oder zu identifizieren.
Unter einem „MHC -Molekül“ oder „MHC -Protein“ wird ein Protein des Haupthistokompatibilitätskomplexes verstanden, d.h. ein Protein, das vom Haupthistokompatibilitätskomplex kodiert wird. MHC -Moleküle werden in verschiedene Klassen, z.B. Klasse I und Klasse II, unterteilt. Unter dem Begriff „MHC -Klasse-I- Protein“ „MHC-Klasse-I-Molekül“, „Klasse-I-Molekül“, „MHC-I-Molekül“, MHC- Klasse-I-Protein“, „Klasse-I-Protein“ oder „MHC-I-Protein“ wird ein Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-I-Protein, unter dem Begriff „MHC -Klasse-II- Protein“ „MHC-Klasse-II-Molekül“, „Klasse-II-Molekül“, „MHC-II-Molekül“, MHC- Klasse-II-Protein“, „Klasse-II-Protein“ oder „MHC-II-Protein“ ein Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-II-Protein verstanden. MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Proteine sind vom Haupthistokompatibilitätskomplex (engl. „Major Histocompatibility Complex“, MHC) kodierte Transmembranproteine und an der zellulären Immunantwort beteiligt. MHC-Klasse-I-Proteine binden Peptide aus dem Zellinneren, wie beispielsweise aus dem Cytosol oder dem Lumen der endocytischen Organellen und präsentieren diese an der Zelloberfläche den zytotoxischen T-Zellen (Antigenpräsentation). Von MHC-Klasse-II-Proteinen präsentierte Antigene veranlassen die Bindung von CD-4-positiven T-Helferzellen. Ein MHC-I-Molekül besteht in der Regel aus einer schweren Alpha-Kette (a-Kette) auch kurz „hc“, Molekulargewicht ca. 44 kDa (etwa 350 Aminosäuren) mit drei extrazellulären Domänen (al, a2 und a3) und einer Transmembrandomäne sowie einer nicht kovalent daran gebundenen leichten Beta-Kette (ß-Kette, auch „ß2-Mikroglobulin“ oder kurz „ß2m“, ca. 12 kDa, 99 Aminosäuren). Menschliche MHC-Klasse-I-Proteine werden auch als HLA-Proteine (HLA = human leukocyte antigen) bezeichnet. Der Begriff umfasst sowohl klassische MHC-Klasse-I- Proteine wie HLA-A, HLA-B und HLA-C als auch nicht-klassische MHC-Klasse-I- Proteine wie HLA-E, HLA-F und HLA-G. MHC-Klasse-II-Proteine bestehen in der Regel aus zwei nahezu gleich großen Ketten, einer Alpha-Kette (a-Kette, ca. 33 kDa) und einer Beta-Kette (ß-Kette, ca. 30 kDa) mit jeweils einer extrazellulären Domäne, einem Transmembransegment und einer relativ kurzen cytosolischen Komponente. Die extrazelluläre Domäne umfasst zwei Domänen (al, a2 bzw. ßl, ß2), wobei die Peptidbindungsstelle (Peptidbindungsdomäne) von Teilen der membranfernen bzw. distalen al - und der ßl -Kette gebildet wird. MHC-Klasse-II-Moleküle werden beim Menschen von drei Isotypen kodiert: HLA-DP, HLA-DQ und HLA-DR (zur Bedeutung von „HLA“ s.o.). Die HLA-DP -Ketten werden von Genen kodiert, die als HLA-DPA (für die Alpha-Kette) oder HLA-DPB (für die Beta-Kette) bezeichnet werden. Die Ketten für HLA-DQ und -DR werden auf die gleiche Weise kodiert. Sowohl MHC-Klasse-I-Gene als auch MHC-Klasse-II-Gene sind stark polymorph. Jeder gegebene Allotyp eines MHC- Klasse-I-Moleküls oder MHC-Klasse-II-Moleküls kann Tausende verschiedener Peptide binden. Der Begriff „MHC -Molekül“ oder „MHC -Protein“ umfasst zudem auch peptidbindende Fragmente aller dieser Proteine, insbesondere die extrazelluläre Domäne oder Abschnitte davon. Unter einem „Abschnitt“ oder „Fragment“ werden hier insbesondere zusammenhängende Teilsequenzen von mindestens 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 80, 90 oder mindestens 100 Aminosäuren verstanden. Der Begriff umfasst auch MHC -Proteine nicht-menschlicher Wirbeltierspezies, beispielsweise von Maus (Mus musculus), Ratte (Rattus norvegicus), Rind (Bos taurus), Pferd (Equus equus) oder Grüner Meerkatze (Macaca mulatta). Die MHC-Klasse-I-Proteine der Maus werden beispielsweise als H-2-Proteine bezeichnet, die von den Genloci H-2D, H-2K und H-2L kodiert werden. Ein bestimmter Allotyp eines Maus-MHC-Klasse-I-Proteins ist beispielsweise H-2Kb oder H-2Ld. Unterklassen von MHC-Klasse-II-Proteinen der Maus sind beispielsweise H-2A, H-2E und H-2P-Proteine. Der Begriff „MHC -Molekül“ oder „MHC -Protein“ umfasst auch synthetische (rekombinante) MHC -Moleküle, d.h. Moleküle, die natürlichen MHC -Molekülen strukturell und funktional entsprechen.
Die Begriffe „Peptidbindungsstelle“ oder „Peptidbindungsdomäne“ bezeichnen den Bereich eines MHC -Proteins, der in der Lage ist, ein Peptid-Antigen nicht-kovalent zu binden. Bei MHC-Klasse-I-Molekülen wird die Peptidbindungsstelle beispielsweise von der Alpha-Kette gebildet, insbesondere einer von der al - und a2 -Domäne durch entsprechende Faltung gebildeten Furche.
Unter einem „peptidfreien MHC -Molekül“ oder „leeren MHC -Molekül“ wird ein unbeladenes MHC -Molekül verstanden, d.h. ein MHC -Molekül, an das kein Peptid (Antigen) gebunden ist. Unter einem „peptidbeladenen MHC -Molekül“ wird hier ein Komplex aus Peptid und MHC -Molekül verstanden. Ein Komplex aus Peptid und MHC -Protein, d.h. ein MHC- Protein, beispielsweise MHC-Klasse-I-Protein, mit daran gebundenem Peptid, wird hier gegebenenfalls synonym auch als „Peptid/MHC -Protein-Komplex“ oder „MHC- Protein/Peptid-Komplex“ bezeichnet. Ein Komplex aus Peptid und MHC-Klasse-I-Protein wird auch als „Klasse-I-Peptid-Komplex“ oder „Peptid/MHC-I“ bezeichnet. Als Abkürzung für einen solchen Komplex wird auch „pMHC-I“ verwendet. Ein Komplex aus Peptid und MHC-Klasse-II-Protein wird auch als „Klasse-II-Peptid-Komplex“ oder „Peptid/MHC -II“ bezeichnet. Als Abkürzung für einen solchen Komplex wird auch „pMHC-II“ verwendet. Die Begriffe „antigenpräsentierendes MHC-Klasse-I-Protein“ oder „antigenpräsentierendes MHC-Klasse-II-Protein“ werden synonym zu dem jeweiligen Komplex verwendet. „Antigenpräsentierend“ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass das MHC-Klasse-I-Protein oder das MHC-Klasse-II-Protein ein Peptid (Antigen) gebunden aufweist.
Unter einem „Platzhalter-Peptid“ wird hier ein Peptid verstanden, das an die Peptidbindungsstelle eines MHC -Moleküls, beispielsweise MHC-Klasse-I-Moleküls nichtkovalent gebunden ist und dazu vorgesehen ist, gegen ein bestimmtes anderes Peptid („Ziel-Peptid“) ausgetauscht zu werden. Es handelt sich vorzugsweise um ein Peptid mit einer Länge von 8 bis 11, vorzugsweise 8-10, Aminosäuren. Es kann sich beispielsweise um ein synthetisches Peptid mit definierten Eigenschaften (z.B. mit einer bestimmten Aminosäuresequenz und/oder Affinität) handeln. Der Begriff umfasst auch synthetische Peptide, die nicht-natürliche oder modifizierte Aminosäuren enthalten.
Unter einem „Ziel-Peptid“ wird ein Peptid, vorzugsweise ein Peptid mit einer Länge von 8 bis 11 Aminosäuren, weiter bevorzugt 8-10 Aminosäuren Länge verstanden, mit dem ein MHC -Molekül unter Verdrängung eines Platzhalter-Peptids beladen wird.
Unter einem „Austauschhelfermolekül“ wird ein Molekül verstanden, welches den Austausch eines Platzhalter-Peptids gegen ein Ziel-Peptid fördert. Fördern bedeutet beispielsweise, dass in Gegenwart des Austauschhelfermoleküls bei einer gegebenen Anzahl von MHC -Molekülen ein größerer Anteil von Platzhalter-Peptiden gegen ein Ziel- Peptid ausgetauscht wird als in Abwesenheit des Austauschhelfermoleküls und/oder in Gegenwart des Austauschhelfermoleküls der Austausch eines Platzhalter-Peptids gegen ein Ziel -Peptid mit größerer Geschwindigkeit abläuft als in Abwesenheit des Austauschhelfermoleküls. Ein Beispiel für ein Austauschhelfermolekül im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Ethanol -Molekül. Gegebenenfalls wird hier auch der Begriff „Austauschkatalysator“ synonym zum Ausdruck „Austauschhelfermolekül“ verwendet.
Unter einer „Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe“, syonym auch als „H-Bindungsdonorgruppe“ oder „Wasserstoffdonorgruppe“ bezeichnet und gegebenenfalls mit „X-H“ oder „XH“ symbolisiert, wird eine funktionelle Gruppe eines Moleküls verstanden, die in der Lage ist, ein Wasser stoffatom für eine Wasserstoffbrückenbindung bereitzustellen. Unter den Begriff fallen beispielsweise die Hydroxylgruppe (-OH, auch „Hydroxygruppe“), Carboxylgruppe (-COOH, auch „Carboxygruppe“), Carbamoylgruppe (-CONH2), Thiolgruppe (-SH), Iminogruppe (=NH oder -NH-) oder Aminogruppe (-NH2). Eine Wasserstoffbrückenbindung ist eine nicht-kovalente und nicht-ionische auf elektrostatischen Kräften beruhende chemische Bindung zwischen einem kovalent an ein Atom eines ersten Moleküls gebundenen Wasserstoffatom mit einer positiven Partialladung und einem Atom eines zweiten Moleküls oder einem anderen Atom des ersten Moleküls mit negativer Partialladung. Anders ausgedrückt, handelt es bei einer Wasserstoffbrückenbindung um eine attraktive Wechselwirkung zwischen einer Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe (X-H) und einem Protonenakzeptor (Y).
Der Begriff „organische Ci-Ce-Verbindung“ bezeichnet eine organische Verbindung aus ein bis sechs C-Atomen. Der Begriff schließt somit organische Verbindungen mit einem, zwei, drei, vier, fünf oder sechs Kohlenstoffatomen ein. Der Begriff schließt auch organische Verbindungen mit Heteroatomen im Kohlenstoffgerüst ein. Der Begriff umfasst aliphatische und aromatische, zyklische und azyklische Verbindungen.
Der Ausdruck „ausgenommen eine Aminosäure oder ein Peptid“ in Bezug auf die organische Ci-Ce-Verbindung bedeutet, dass die organische Ci-Ce-Verbindung weder eine Aminosäure noch ein Peptid, d.h. eine Verbindung aus zwei oder mehr Aminosäuren, beispielsweise ein Di- oder Tripeptid, ist. Unter einer Aminosäure wird eine Verbindung verstanden, die eine mit einem Kohlenstoffatom verbundene Aminogruppe (-NH2) und eine mit demselben oder einem anderen Kohlenstoffatom der Verbindung verbundene Carboxylgruppe (-COOH) enthält. Die organische Ci-Ce-Verbindung gemäß der Erfindung enthält demnach nicht gleichzeitig eine Aminogruppe (-NH2) und eine Carboxylgruppe (-COOH). Der Ausdruck schließt auch ein, dass die Verbindung keine „modifizierte Aminosäure“ ist, oder ein Peptid, das eine „modifizierte Aminosäure“ enthält. Unter einer „modifizierten Aminosäure“ wird eine Aminosäure verstanden, bei der eine andere chemische Verbindung so kovalent an die Aminogruppe, an die Carboxylgruppe, oder an beide Gruppen, gebunden ist, dass mindestens ein H-Atom der Aminogruppe und/oder die OH-Gruppe oder das H der OH-Gruppe der Carboxylgruppe durch eine andere chemische Verbindung substituiert sind. Das gilt auch für Verbindungen, bei denen die Carbonylgruppe C=O der Carboxylgruppe durch eine Thiocarbonylgruppe C=S ersetzt ist, wie beispielsweise bei einer Thioamidbindung. Die organische Ci-Ce-Verbindung enthält demnach nicht gleichzeitig a) eine Carboxylgruppe und b) eine Aminogruppe, bei der mindestens ein H-Atom durch eine andere chemische Gruppierung substituiert ist (z.B. durch eine Acylgruppe), oder a) eine Aminogruppe und b) eine Carboxylgruppe, bei der die OH-Gruppe oder das H der OH-Gruppe substituiert sind, z.B. die OH-Gruppe durch eine Aminogruppe, oder a) eine Aminogruppe, bei der ein H-Atom durch eine andere chemische Gruppierung substituiert ist, und b) eine Carboxylgruppe, bei der die OH-Gruppe oder das H der OH-Gruppe substituiert sind.
Unter einem „Alkohol“ wird eine organische Verbindung verstanden, die eine oder mehrere jeweils an ein Kohlenstoffatom gebundene Hydroxylgruppen (-OH) aufweist, wobei jedes eine OH-Gruppe tragende Kohlenstoffatom sp3-hybridisiert ist und außer an die Hydroxylgruppe nur an Kohlenstoff- oder Wasserstoff atome gebunden ist. Unter einem „mehrwertigen Alkohol“ wird ein Alkohol mit mehr als einer Hydroxylgruppe verstanden, unter einem „einwertigen Alkohol“ ein Alkohol mit nur einer Hydroxylgruppe.
Unter einem „Alkanol“ wird eine organische Verbindung mit der Formel R-OH verstanden, wobei R ein Alkylrest ist, bei dem ein oder mehrere H-Atome gegebenenfalls durch weitere OH-Gruppen substituiert sein können. Ein einwertiges Alkanol ist ein Alkanol der allgemeinen Formel CnEEn+iOH. Beispiele für einwertige Alkanole sind Methanol und Ethanol.
Der Ausdruck, wonach das „MHC-Klasse-I-Molekül mit dem an seine Peptidbindungsstelle gebundenen Platzhalter-Peptid in einer Lösung mit a) dem Ziel- Peptid und b) einem Austauschhelfermolekül zusammengebracht wird“ bedeutet, dass ein mit einem Platzhalter-Peptid beladenes MHC-Klasse-I-Molekül, ein Ziel-Peptid und ein Austauschhelfermolekül in einer für die Austauschreaktion geeigneten Lösung, vorzugsweise einer wässrigen Lösung, und unter für die Austauschreaktion geeigneten Bedingungen, beispielsweise hinsichtlich pH-Wert, Temperatur und Salzgehalt, miteinander in Kontakt gebracht werden. Geeignete Bedingungen sind beispielsweise in Saini et al. 2015 beschrieben (Saini SK, Schuster H, Ramnarayan VR, Rammensee HG, Stevanovic S, Springer S. Dipeptides catalyze rapid peptide exchange on MHC class I molecules, Proc Natl Acad Sei USA, 2015, 112(l):202-207, doi: 10.1073/pnas.1418690112). Geeignete Bedingungen schließen beispielsweise wässrige Lösungen mit 150 mM NaCl und 15 mM anorganischem Phosphat, pH 7, oder 150 mM NaCl, 50 mM Tris Cl, pH 8, ein.
Das Austauschhelfermolekül kann jede organische Ci-Ce-Verbindung mit mindestens einer Wasserstoffbindungsdonorgruppe sein, ausgenommen eine Aminosäure oder ein Peptid. Bevorzugt ist das Austauschhelfermolekül eine aliphatische Ci-Ce-Verbindung. Das Austauschhelfermolekül kann zyklisch oder azyklisch sein, ist aber bevorzugt azyklisch.
Das Austauschhelfermolekül weist mindestens eine Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe auf, kann aber auch mehrere, d.h. zwei oder mehr, der genannten Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppen beinhalten, wobei diese gleich oder verschieden sein können. Es ist jedoch bevorzugt, wenn beim Vorhandensein mehrerer Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppen diese untereinander gleich, beispielsweise alle OH-Gruppen, alle COOH-Gruppen oder alle SH-Gruppen, sind. Wenn das Austauschhelfermolekül mehr als eine der genannten Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppen enthält und mindestens zwei davon voneinander verschieden sind, ist für den Fall, dass die erste Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe -COOH oder CONH2 ist, die zweite, davon verschiedene Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe nicht NH2, =NH oder -NH- Es ist weiter bevorzugt, dass, wenn das Austauschhelfermolekül eine Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe enthält, die ausgewählt ist aus NH2, =NH oder -NH-, das Austauschhelfermolekül keine Carbonylgruppe (C=O) oder Thioncarbonylgruppe (C=S) enthält. Weiter bevorzugt ist, dass, wenn das Austauschhelfermolekül -CONH2 als Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe enthält, das Austauschhelfermolekül keine weitere Carbonylgruppe (C=O) oder eine Thiocarbonyl gruppe (C=S) enthält.
Besonders bevorzugt ist das Austauschhelfermolekül ein Ci-Ce-Alkohol, bevorzugt ein einwertiger oder zweiwertiger Ci-Ce-Alkohol, weiter bevorzugt ein Ci-Ce-Alkanol, vorzugsweise ein einwertiges oder zweiwertiges Ci-Ce-Alkanol, besonders bevorzugt Ethanol.
Beispiele für geeignete Austauschhelfermoleküle sind in Tabelle 1 angegeben:
Tabelle 1 : Beispiele für mögliche Austauschhelfermoleküle und deren CAS-Nummern.
Bezeichnung CAS-Nummer
Methanol 67-56-1 Ethanol 64-17-5
1 -Propanol 71-23-8
2-Propanol 67-63-0 Ethylenglycol 107-21-1
1.2-Propandiol 57-55-6
1.3-Propandiol 504-63-2 n-Butanol 71-36-3
2 -Methyl- 1 -Propanol 78-83-1 2-Butanol 78-92-2
2-Methyl-2-Propanol 75-65-0 Pentan- l-ol 71-41-0 Pentan-2-ol 6032-29-7 Pentan-3-ol 584-02-1 2-Methyl-butan-l-ol 137-32-6
2-Methyl-butan-2-ol 75-85-4
3 -Methyl -butan-l-ol 123-51-3
3 -Methyl -butan-2-ol 598-75-4
2,2-Dimethyl-l -propanol 75-84-3
Formamid 75-12-7
Acetamid 60-35-5
Propanamid 79-05-0
Die Liste von geeigneten Austauschhelfermolekül-Verbindungen in der obigen Tabelle 1 ist nicht abschließend oder in irgendeiner Weise als beschränkend zu verstehen. Von der Erfindung sind auch weitere, in der obigen Tabelle 1 nicht genannte Verbindungen erfasst, beispielsweise die 17 Strukturisomere des Hexanols (CÖHBOH). Bei optische aktiven Verbindungen sind auch deren Stereoisomere erfasst. Darüber hinaus kommen auch Derivate der in der Tabelle 1 aufgeführten oder beispielsweise der genannten Hexanoie, d.h. Verbindungen, die ein oder mehrere weitere funktionelle Gruppen enthalten, als Austauschhelfermolekül in Betracht. Der Fachmann ist leicht in der Lage, anhand der vorliegenden Offenbarung und gegebenenfalls seines allgemeinen Fachwissens ohne erfinderisches Zutun und ohne unzumutbaren Aufwand weitere geeignete Austauschhelfermoleküle aufzufinden.
Es ist besonders bevorzugt, dass die Bindungsaffinität des Ziel-Peptids zur Peptidbindungsstelle des MHC-Klasse-I-Moleküls höher ist als die Bindungsaffinität des Platzhalter-Peptids zur Peptidbindungsstelle des MHC-Klasse-I-Molekül. Das Ziel-Peptid weist daher bevorzugt eine im Vergleich zum Platzhalter-Peptid höhere Assoziationskonstante, weiter bevorzugt eine mindestens um den Faktor 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10, weiter bevorzugt eine mindestens um den Faktor 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder 100 höhere Assoziationskonstante auf. Es ist grundsätzlich aber auch möglich, eine gewünschte Peptidbeladung von MHC-Klasse-I-Molekülen zu bewirken, indem das Ziel-Peptid im Verhältnis zum Platzhalter-Peptid im Überschuss, beispielsweise in einem Verhältnis von mindestens 5: 1, 10: 1, 20: 1, 30: 1, 40: 1, 50: 1, 60: 1, 70: 1, 80: 1, 90: 1 oder mindestens 100: 1 in der Lösung vorhanden ist. Selbstverständlich kann auch ein Ziel- Peptid mit höherer Bindungsaffinität in vorteilhafter Weise im Überschuss, d.h. in höherer Konzentration gegenüber dem Platzhalter-Peptid, in der Lösung vorliegen.
Das mit einem Ziel-Peptid beladene MHC-Klasse-I-Molekül kann auch als Teil eines multimeren Komplexes, beispielweise direkt oder indirekt gebunden an Avidin oder Streptavidin, vorliegen.
Die Erfindung betrifft auch ein Kit zur Durchführung des oben näher beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend a) eine Lösung enthaltend ein mit einem Platzhalter-Peptid beladenes MHC-Klasse-I-Molekül und b) ein Austauschhelfermolekül. Das Austauschhelfermolekül ist vorzugsweise von der das peptidbeladene MHC-Klasse-I- Molekül umfassenden Lösung getrennt in einem gesonderten Behälter in dem Kit enthalten.
Bei dem Platzhalter-Peptid handelt es sich bevorzugt um ein Peptid mit 8-11, weiter bevorzugt 8-10, besonders bevorzugt 8-9 Aminosäuren, z.B. NLVPMVATA oder FAPGNYPAL.
Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Kit ferner ein Ziel-Peptid zum Austausch gegen das Platzhalter-Peptid.
Die Erfindung wird im Folgenden zur Veranschaulichung anhand von Figuren und Ausführungsbeispielen näher beschrieben.
Figur 1. Stark schematisierte Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Figur 2. Peptid-Austausch bei einem MHC -Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, ß2m, und dem Platzhalter-Peptid NLVPMVATA; Ziel-Peptid: NLVPKVATV; Austauschhelfermolekül: Ethanol; „Keines“ bedeutet, dass bei dieser Probe kein Austauschhelfermolekül hinzugefügt wurde. Figur 3. Peptid- Austausch bei einem MHC -Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, ß2m, und dem Platzhalter-Peptid NLVPMVATA; (Ziel-Peptid: NLVPKVATV; Austauschhelfermolekül: Methanol; „Keines“ bedeutet, dass bei dieser Probe kein Austauschhelfermolekül hinzugefügt wurde.
Figur 4. Peptid-Austausch bei einem MHC -Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*24:02, ß2m, und dem Platzhalter-Peptid TYGPVFMCL; Ziel-Peptid: QYTPVSKLF; Austauschhelfermolekül: Ethanol; „Keines“ bedeutet, dass bei dieser Probe kein Austauschhelfermolekül hinzugefügt wurde.
Figur 5. Peptid- Austausch bei einem MHC -Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, ß2m, und dem Platzhalter-Peptid NLVPMVATA; Ziel-Peptid: NLVPKVATV; Austauschhelfermolekül: Methanol; „Keines“ bedeutet, dass bei dieser Probe kein Austauschhelfermolekül hinzugefügt wurde.
Figur 6. Peptid-Austausch bei einem MHC -Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*24:02, ß2m, und dem Platzhalter-Peptid TYGPVFMCL; Ziel-Peptid: QYTPVSKLF; Austauschhelfermoleküle: Ethanol; Dipeptid GF; „Keines“ bedeutet, dass bei dieser Probe kein Austauschhelfermolekül hinzugefügt wurde.
Figur 1 zeigt eine vereinfachte und schematisierte Darstellung des Prinzips des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Figur 1 zeigt im oberen Teil einen ersten MHC-Klasse-I-Peptid- Komplex 1, d.h. ein mit einem Platzhalter-Peptid 6 beladenes MHC-Klasse-I-Molekül 2, bestehend aus einer schweren Kette (a-Kette) 3 und einer leichten Kette (ß2-Mikro- globulin, ß2m) 4. Das Platzhalter-Peptid 6 ist an die Peptidbindungsstelle 5 des MHC- Klasse-I-Moleküls 2 gebunden. Der MHC-Klasse-I-Peptid-Komplex 1 wird mit einem Ziel-Peptid 7, das sich von dem Platzhalter-Peptid 6 unterscheidet, und einem Austauschhelfermolekül 8, zum Beispiel Ethanol, in einer geeigneten Lösung zusammengebracht. Eine H-Bindungsdonorgruppe 9 ist hier durch -XH symbolisiert, wobei X beispielsweise für O, S oder N stehen kann. Das Austauschhelfermolekül 8 katalysiert durch Wechselwirkung mit dem Platzhalter-Peptid 6 und/oder den die Peptidbindungsstelle 5 auskleidenden Aminosäuren die Verdrängung des Platzhalter-Peptids 6 aus der Peptidbindungsstelle 5 und den Austausch gegen das Ziel-Peptid 7. Im unteren Teil der Figur 1 ist der resultierende MHC-Klasse-I-Peptid-Komplex 10 aus dem eingangs eingesetzten MHC-Klasse-I-Molekül 2 und dem daran gebundenen Ziel-Peptid 7 dargestellt.
Beispiele:
Die folgenden Ausführungsbeispiele betreffen einen Peptid-Austausch bei einem MHC- Peptid-Komplex nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Aminosäuresequenzen der Platzhalter- sowie Ziel-Peptide sind im Einbuchstabencode angegeben.
Beispiel 1. Peptid-Austausch bei einem MHC -Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, ß2m, und dem Platzhalter-Peptid NLVPMVATA (Ziel-Peptid: NLVPKVATV; Austauschhelfermolekül: Ethanol).
Schritt 1. Die folgenden Stammlösungen wurden vorbereitet oder bereitgestellt: Assay- Puffer (eine gepufferte 50 mM HEPES (C8H18N2O4S), 150 mM NaCl, 7.5 pH Lösung ist, die bei 2-8°C gelagert wird); MHC -Peptid-Komplex, bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, ß2m, und dem Platzhalter-Peptid NLVPMVATA mit einer Konzentration von 10 pg/mL in 150 mM NaCl und 15 mM Kaliumphosphat, pH 7.0; Ziel- Peptid war NLVPKVATV, wobei die Seitenkette des Lysin (K) an Position 5 des Peptids mit Fluorescein derivatisiert war, so dass das Fluorescein kovalent an die Seitenkette des Peptids gebunden war; das Ziel-Peptid lag mit einer Konzentration 1 mM in 100% DMSO vor; Austauschhelfermolekül: Ethanol.
Schritt 2. Vorbereitung des Peptid-Austauschs: 50 pL einer Lösung des MHC -Peptid- Komplex in Assay-Puffer mit einer Konzentration von 600 nM wurden in die Vertiefungen Al - A9 einer nicht-bindenden, schwarzen, Polystyrol-96-Well-Platte mit flachem Boden pipettiert. In die Vertiefungen Bl - B9 wurden je 50 pL Assay-Puffer pipettiert (für die jeweilige Hintergrundmessung). 25 pL von 80% Austauschhelfermolekül in Assay-Puffer wurden in die Vertiefungen Al - A3 und Bl - B3 pipettiert. 25 pL 40% Austauschhelfermolekül in Assay-Puffer wurden jeweils in Vertiefung A4 - A6 und B4 - B6 pipettiert. In Vertiefung A7-A9 und B7-B9 wurden je 25 pL Assay-Puffer pipettiert. Zu jeder Vertiefung 1-9 der 96-Well-Platte der Reihe A und B wurden 25 pL des Ziel -Peptids mit einer Konzentration von 400 nM (das fluoreszierend markierte Peptid wurde bis zur Nutzung kühl und im Dunkeln gelagert) in Assay-Puffer pipettiert und durch kurzes Auf- und Ab-Pipettieren vermischt. Somit war die End-Konzentration in jeder Vertiefung 100 nM Ziel -Peptid und 300 nM MHC -Peptid-Komplex.
Schritt 3. Messung des Peptid- Austauschs: Die 96-Well-Platte wurde in einen Platten- Leser (z.B. TECAN Infinite Ml 000 PRO) gelegt und für 3 Stunden analysiert. Die Bindung des Ziel-Peptids an das MHC -Molekül wurde verfolgt durch die Messung der Fluoreszenzanisotropie (oder Fluoreszenzpolarisation) des Ziel-Peptids (s. z.B. Saini SK, Schuster H, Ramnarayan VR, Rammensee HG, Stevanovic S, Springer S. Dipeptides catalyze rapid peptide exchange on MHC class I molecules, Proc Natl Acad Sei USA, 2015, 112(l):202-207, doi: 10.1073/pnas.1418690112). Eine ansteigende Fluoreszenzanisotropie zeigt eine zunehmende Bindung des fluoreszenzmarkierten Ziel- Peptids an das MHC-Molkül an. Die Messung wurde bei Raumtemperatur (25°C) mit einer Anregungswellenlänge von 470 nm und Emissionswellenlänge von 517 nm durchgeführt. Alle 30 Sekunden wurde eine Messung aller Vertiefungen vorgenommen.
Schritt 4. Die Daten wurden mit der instrumenteigenen Software oder mit anderen geeigneten Programmen verarbeitet.
Figur 2 zeigt das Ergebnis des in Beispiel 1 beschrieben Peptidaustauschexperimentes. Wie auch bei den Figuren 3 bis 6 bedeutet „Keines“ in der Legende, dass bei dieser Probe kein Austauschhelfermolekül hinzugefügt wurde.
Beispiel 2. Peptid-Austausch bei einem MHC -Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, ß2m, und dem Platzhalter-Peptid NLVPMVATA (Ziel-Peptid: NLVPKVATV; Austauschhelfermolekül: Methanol).
Die experimentelle Ausführung von Beispiel 2 ist identisch mit der von Beispiel 1, mit der Ausnahme, dass das Austauschhelfermolekül hier Methanol war. Figur 3 zeigt das Ergebnis des in Beispiel 2 beschriebenen Peptidaustauschexperimentes.
Beispiel 3. Peptid-Austausch bei einem MHC -Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*24:02, ß2m, und dem Platzhalter-Peptid TYGPVFMCL (Ziel- Peptid: QYTPVSKLF; Austauschhelfermolekül: Ethanol).
Die experimentelle Ausführung von Beispiel 3 ist identisch mit der von Beispiel 1, mit den folgenden Ausnahmen: Der MHC -Peptid-Komplex bestand aus der schweren Kette von HLA-A*24:02, ß2m, und dem Platzhalter-Peptid TYGPVFMCL; das Ziel -Peptid war QYTPVSKLF, welches in der in Beispiel 1 genannten Weise an der Seitenkette des Lysin- Restes mit Fluorescein modifiziert war.
Figur 4 zeigt das Ergebnis des in Beispiel 3 beschrieben Peptidaustauschexperimentes.
Beispiel 4. Peptid-Austausch bei einem MHC -Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, ß2m, und dem Platzhalter-Peptid NLVPMVATA (Ziel-Peptid: NLVPKVATV; Austauschhelfermolekül: Methanol).
Die experimentelle Ausführung von Beispiel 3 ist identisch mit der von Beispiel 1, mit den folgenden Ausnahmen: Der MHC -Peptid-Komplex bestand aus der schweren Kette von HLA-B*27:05, ß2m, und dem Platzhalter-Peptid RRDJRSVAL (hierbei bezeichnet der Buchstabe J die photo-spaltbare Aminosäure 3-amino-3-(2-nitrophenyl)propionsäure); das Ziel-Peptid ist GRVFIIKSY, welches in der in Beispiel 1 genannten Weise an der Seitenkette des Lysin-Restes mit Fluorescein modifiziert war.
Figur 5 zeigt das Ergebnis des in Beispiel 4 beschriebenen Peptidaustauschexperimentes wie.
Beispiel 5. Peptid-Austausch bei einem MHC -Peptid-Komplex bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*24:02, ß2m, und dem Platzhalter-Peptid TYGPVFMCL (Ziel- Peptid: QYTPVSKLF; Austauschhelfermoleküle: Ethanol und das Dipeptid GF). Schritt 1. Die folgenden Stammlösungen wurden vorbereitet oder bereitgestellt: Assay- Puffer (eine gepufferte 50 mM HEPES (C8H18N2O4S), 150 mM NaCl, 7.5 pH Lösung, die bei 2-8°C gelagert wird); MHC -Peptid-Komplex, bestehend aus der schweren Kette von HLA-A*02:01, ß2m, und dem Platzhalter-Peptid TYGPVFMCL mit einer Konzentration von 10 pg/mL in 150 mM NaCl und 15 mM Kaliumphosphat, pH 7.0; Ziel -Peptid war QYTPVSKLF, wobei die Seitenkette des Lysin (K) an Position 7 des Peptids mit Fluorescein derivatisiert war, so dass das Fluorescein kovalent an die Seitenkette des Peptids gebunden war; das Ziel -Peptid lag mit der Konzentration 1 mM in 100% DMSO vor; Austauschhelfermolekül: Ethanol; Austauschhelfermolekül: GF (Dipeptid Glycyl - Phenylalanin), 80 mM in Assay-Puffer.
Schritt 2. Vorbereitung des Peptid-Austauschs: 50 pL einer Lösung des MHC -Peptid- Komplex in Assay-Puffer mit einer Konzentration von 600 nM wurden in die Vertiefungen Al - A12 einer nicht-bindenden, schwarzen, Polystyrol-96-Well-Platte mit flachem Boden pipettiert. 25 pL 40 mM Dipeptid in Assay-Puffer wurden jeweils in Vertiefungen Al - A3 und Bl - B3 pipettiert. In Vertiefungen A4 - A6 und B4 - B6 wurden je 12.5 pL 80 mM Dipeptid pipettiert. Nach 15 Minuten Inkubationszeit wurden in Vertiefung A4 - A6 und B4 - B6, 12.5 pL 80% Austauschhelfermolekül (EtOH) in Assay-Puffer hinzugefügt. 25 pL von 40% Austauschhelfermolekül (EtOH) in Assay-Puffer wurden in die Vertiefungen A7 - A9 und B7 - B9 pipettiert. In Vertiefungen A10 - A12 und B10 - B12 wurden 25 pL Assay-Puffer pipettiert (als Negativ-Kontrolle). Zu jeder Vertiefung der Reihe A und B der 96-Well-Platte wurden 25 pL des mit FITC markierten Ziel-Peptids mit einer Konzentration von 400 nM (das fluoreszierend markierte Peptid wurde bis zur Nutzung kühl und im Dunkeln gelagert) pipettiert und durch kurzes Auf- und Ab-Pipettieren vermischt. Somit war die End-Konzentration in jeder Vertiefung 100 nM fluoreszierend markiertes Ziel -Peptid und 300 nM MHC -Peptid-Komplex.
Schritt 3. Messung des Peptid-Austauschs: Die 96-Well-Platte wurde in einen Platten- Leser (z.B. TECAN Infinite Ml 000 PRO) gelegt und für 3 Stunden analysiert. Die Bindung des Ziel-Peptids an das MHC -Molekül wurde durch die Messung der Fluoreszenzanisotropie (oder Fluoreszenzpolarisation) des Ziel-Peptids verfolgt. Die Messung wurde bei Raumtemperatur (25°C) mit einer Anregungswellenlänge von 470 nm und Emissionswellenlänge von 517 nm durchgeführt. Alle 30 Sekunden wurde eine Messung aller Vertiefungen vorgenommen. Schritt 4. Die Daten werden mit der instrumenteigenen Software oder mit anderen geeigneten Programmen verarbeitet.
Figur 6 zeigt das Ergebnis des in Beispiel 5 beschriebenen Peptidaustauschexperimentes.

Claims

Patentansprüche
1. In -vitro- Verfahren zum Herstellen eines mit einem Ziel-Peptid beladenen MHC- Klasse-I-Moleküls durch Austauschen eines an eine Peptidbindungsstelle eines MHC- Klasse-I-Molekül gebundenen Platzhalter-Peptids gegen das Ziel-Peptid, wobei das Platzhalter-Peptid und das Ziel-Peptid voneinander verschieden sind, und wobei das MHC- Klasse-I-Molekül mit dem an seine Peptidbindungsstelle gebundenen Platzhalter-Peptid in einer Lösung mit a) dem Ziel-Peptid und b) einem Austauschhelfermolekül zusammengebracht wird, und wobei das Austauschhelfermolekül eine organische Ci-Ce- Verbindung mit einer Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe, ausgenommen eine Aminosäure oder ein Peptid, ist, und wobei die Wasserstoffbrückenbindungsdonorgruppe ausgewählt ist aus -OH, -COOH, -CONH2, -SH, =NH, -NH- oder NH2.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Austauschhelfermolekül eine aliphatische Ci- Ce- Verbindung ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Austauschhelfermolekül ein Ci-Ce-Alkohol, bevorzugt ein einwertiger Ci-Ce-Alkohol, weiter bevorzugt ein CI-CÖ- Alkanol, besonders bevorzugt Ethanol ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bindungsaffinität des Ziel-Peptids zur Peptidbindungsstelle des MHC-Klasse-I-Molekül höher ist als die Bindungsaffinität des Platzhalter-Peptids zur Peptidbindungsstelle des MHC-Klasse-I- Molekül.
5. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend a) eine Lösung enthaltend ein mit einem Platzhalter-Peptid beladenes MHC- Klasse-I-Molekül und b) ein Austauschhelfermolekül.
6. Kit nach Anspruch 5, ferner umfassend ein Ziel-Peptid zum Austausch gegen das PI atzhalter-Pepti d .
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