DE3787793T2

DE3787793T2 - Verwendung von einem mullerischem inhibitorstoff als kontraceptivum.

Info

Publication number: DE3787793T2
Application number: DE87904602T
Authority: DE
Inventors: Patricia Donahoe
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1986-06-24
Filing date: 1987-06-24
Publication date: 1994-03-24
Anticipated expiration: 2007-06-25
Also published as: CA1321140C; AU7700887A; DE3787793D1; WO1988000054A1; EP0271570B1; EP0271570A4; AU600013B2; EP0271570A1; US4753794A

Description

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Müller'schen Inhibitorstoff und seine Verwendung als Kontraceptivum.

Wissenschaftlicher Hintergrund

I. Müller'scher Inhibitorstoff

Der Müller'sche Inhibitorstoff (MIS) ist ein 140.000 Dalton Glycoprotein, das für die Regression des Müller-Ganges bei einem männlichen Embryo verantwortlich ist (Jost, A., Comptes Rend. Soc. Biol., 140 : 463-464 (1946); Jost, A., Comptes Rend. Soc. Biol 141:135-136 (1947); Balanchard, M.G., et al., Ped. Res., 8:968-971 (1974); Donahoe, P.K., et al., Biol. Repro., 15 : 329-334 (1976); Donahoe, P.K., et al., J. Ped. Surg., 12:323-330 (1977); Donahoe, P.K., et al., Biol. Repro., 16:238-243 (1977)).
Der Müller'sche Inhibitorstoff hat sich als Glycoproteinhormon herausgestellt.
Der Stoff wird durch fötale und neonatale Sertolizellen der Hoden produziert. MIS wurde teilweise gereinigt und als dimeres Glycoprotein mit 72.000 und 74.000 Dalton bestimmt (Budzik, G.P., et al., in: Lash, J.W., Saxen, L., (Hrsg.), Development Mechanisms: Normal and Abnormal. New York, Alan R., Liss, S. 207-223 (1985)). Die Reinigung von MIS wird in Donahoe, P.K., et al. (U.S. Patent 4.510.131) beschrieben.
Es wurden monoklonale Antikörper zu MIS entwickelt, die sich in der Reinigung und Herstellung von MIS als zweckmäßig erwiesen (Shima, H., et al., Hybridoma, 3:201-214 (1984); Donahoe, P.K., et al., U.S. Patent Nr. 4.487.833) Necklaws, E.C., et al., Endocrinology 118:791-796 (1986). Unter Verwendung dieser monoklonalen Antikörper wurde ein Radioimmuntest für den Nachweis von MIS entwickelt (Hayashi, M., et al., J. Histochem. Cytochem., 32:649-654 (1984)).
Dieser Radioimmuntest weist MIS in der Follikelflüssigkeit von reifen Rinderovarien nach (Vigier, B., et al., Endocrinol., 114:1315-1320 (1984) sowie in der Flüssigkeit von großen und kleinen Follikeln neugeborener Ovarien (Necklaws, E., et al., Endocrinol., 2:791-796 (1986) und in Inkubationsmedien von Rindergranulosazellen (Vigier, B., et al., supra (1984)).
MIS hat sich in vitro als cytotoxisch zu menschlichen Ovarialkrebszellen erwiesen (Donahoe, P.K., et al., Science, 205:913-915 (1979)). Er hat sich auch in vivo als wirksam gegen diesen Krebs erwiesen (Donahoe, P.K., et al., U.S. Patent Nr. 4.510.131).
Das Gen für MIS wurde kloniert und in Gewebskulturzellen exprimiert; sowohl die DNA- als auch die Aminosäuresequenzen sind bekannt (Cate, R.L. et al., Cell 45:685-698 (1986)).

II. Embryologie von Säugetieren

Die Oocyte von Säugetieren tritt während des Fetallebens in die erste meiotische Teilung ein, wird aber in der späten Prophase (in der dictyaten oder diffusen Diplotän-Phase der Meiose) vor oder unmittelbar nach der Geburt gehemmt (Beaumont, H.M., et al., Proc. R. Soc. London (Series Biological Sciences) 155: 557-579 (1962). Die Wiederaufnahme der Meiose tritt normalerweise erst kurz vor der Ovulation ein, wenn ein Anstieg von Gonadotropinen die Wiederaufnahme der meiotischen Reifung veranlaßt (Dekel, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:4369-4373 (1978). Die präovulatorische Wiederaufnahme der Meiose ist gekennzeichnet durch: (1) den Abbau der Strukturen, die als Keimbläschen (GV) bekannt sind, (2) die Ausstoßung des ersten Polkörperchens und (3) das Fortschreiten zur Metaphase der zweiten meiotischen Teilung (Tsafriri, A., et al., J. Repro. Fertil., 64:541-551(1982). Bei der Ratte fällt die Periode der MIS-Produktion durch die Eierstöcke mit der Periode der meiotischen Oocytenhemmung zusammen. Die physiologischen Mechanismen, die dafür verantwortlich sind, die Oocyte in dem Zustand der meiotischen Hemmung zu halten, sind unbekannt, aber für das Verständnis der vorliegenden Erfindung unbedeutend. Es wird angenommen, daß solche Mechanismen durch den MIS der vorliegenden Erfindung reguliert werden. Es ist jedoch allgemein bekannt, daß wenn Oocyten vom Nagetier, Rind oder Schwein in vitro kultiviert und anschließend von Follikeln isoliert werden, sie die Meiose sofort wieder aufnehmen (Edwards, R.G., Nature, 196:446-450 (1962); Foote, W.D., et al Anal. Biol. Animale Bioch. Biophys. (Paris), 9:329-349 (1969)).

III. Meioseinhibitoren

Von drei verschiedenen Molekülarten wird berichtet, daß sie bei der Hemmung der Meiose von Säugetieroocyten beteiligt sind: (1) eine Proteinfraktion mit geringem Molekulargewicht von Follikelflüssigkeit oder Granulosazellen ("Oocytenmeioseinhibitor" genannt), (2) Steroide und (3) cAMP und andere Nucleotide (Downs, S.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82 : 454-458 (1985); McGaughey, R.W., Endocrinol., 100 : 39-45 (1977); Dekel, N., et al., Biol. Repro., 20 : 191-197 (1979), und Hubbard, C.J., et al., Biol. Repro., 26 : 628-632 (1982)).
Der Oocytenmeioseinhibitor wird durch Granulosazellen produziert und ist in der Müller'schen Follikelflüssigkeit enthalten. Eine teilweise Reinigung dieser Flüssigkeit hat gezeigt, daß der Oocytenmeioseinhibitor ein kleines Polypeptid mit einem Molekulargewicht von weniger als 6.000 ist. Sato, E., et al., Differentiation, 26 : 59-62 (1984). Dieses Protein verhindert die spontane Wiederaufnahme der Meiose in kultivierten, in Cumuluszellen eingeschlossenen Oocyten, aber nicht in bloßgelegten Oocyten. Hillensjo, T., et al., Adv. Exper. Med. Biol., 147 : 175-188 (1982). Die hemmende Wirkung des Proteins kann durch das luteinisierende Hormon (LH) überwunden werden. Die hemmenden Wirkungen können auch durch Entfernung des Faktors aus dem Kulturmedium umgekehrt werden (Sato, E., et al., supra).
Zusammenfassend offenbart somit der wissenschaftliche Hintergrund, daß MIS, ein Glycoprotein mit hohem Molekulargewicht, durch die Hoden von Säugetieren erzeugt wird. MIS ist imstande, die Regression des Müller-Ganges bei einem in Entwicklung befindlichen, männlichen Embryo zu lenken. Bei Fehlen dieses Stoffes, würde der Müller-Gang seine Entwicklung zu dem weiblichen Fortpflanzungssystem fortsetzen.
Sobald die Oocyten von Säugetieren gebildet sind, wird ihre Weiterentwicklung bei dem in Entwicklung befindlichen Embryo im späten Prophase-Stadium der Meiose gehemmt. Diese Entwicklungshemmung wird als das Ergebnis von Wechselwirkungen zwischen dem weiblichen Fortpflanzungssystem und entweder einem Oocytenmeioseinhibitor mit geringem Molekulargewicht, Steroiden oder Nucleotiden wie cAMP angesehen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß der Müller'sche Inhibitorstoff die Oocytenmeiose hemmt. Diese Hemmung verhindert die Bildung reifer Oocyten und führt daher zu einem Zustand der Unfruchtbarkeit. Es ist von Bedeutung, daß diese Hemmung durch die Verabreichung von Verbindungen wie dem epidermalen Wachstumsfaktor reversibel ist. Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von MIS als Kontraceptivum. Der Anmelder nimmt an, will aber durch diese Annahme nicht eingeschränkt werden, daß sich die kontraceptive Fähigkeit von MIS aus dem Vermögen von MIS ergibt, die Oocytenreifung zu beeinflussen.
Genauer schafft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Müller'schen Inhibitorstoff gemeinsam mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Die Zusammensetzung der Erfindung ist zur Verwendung als kontraceptive Zusammensetzung geeignet. Es wird natürlich bevorzugt, daß der Müller'sche Inhibitorstoff im wesentlichen frei von natürlichen Kontaminanten ist, und geeignetes Material zur Verwendung in der Zusammensetzung kann durch Expression eines rekombinanten Müller'schen Inhibitorstoffgens in einem Wirt erzeugt werden.
Die Zusammensetzung der Erfindung kann zur Verabreichung über den oralen, lokalen, intravenösen, intramuskulären oder parenteralen Weg bereitet werden.
Ein zweites Merkmal der Erfindung betrifft die Verwendung des Müller'schen Inhibitorstoffes in der Zubereitung eines Kontraceptivums.
Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Antikörper aufweist, der imstande ist, an den Müller'schen Inhibitorstoff zu binden, gemeinsam mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Eine solche Zusammensetzung ist zur Herbeiführung der Fruchtbarkeit zweckmäßig, und daher betrifft ein weiteres Merkmal der Erfindung die Verwendung eines Antikörpers gegen den Müller'schen Inhibitorstoff bei der Herstellung eines Mittels zur Herbeiführung der Fruchtbarkeit bei einer Frau, die an Unfruchtbarkeit leidet, die durch anomal hohe Werte des Müller'schen Inhibitorstoffes bedingt ist, oder zur Umkehrung der kontraceptiven Aktivität des Müller'schen Inhibitorstoffes. Die für diese Verwendung am besten geeigneten Antikörper sind monoklonale Antikörper.
Ein zusätzliches Merkmal der Erfindung betrifft die Verwendung des epidermalen Wachstumsfaktors bei der Herstellung eines Mittels zur Umkehrung der kontraceptiven Aktivität des Müller'schen Inhibitorstoffes.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 ist eine Zeichnung eines reifen Graaf-Follikels, in der die relativen Positionen der unreifen Oocyte, Cumuluszellen und der Keimbläschenstruktur dargestellt sind.
Fig. 2 zeigt den zeitlichen Ablauf der Oocytenreifung, gemessen durch den Keimbläschenabbau von bloßgelegten Ratten-Oocyten mit oder ohne MIS.
Fig. 3 zeigt den durchschnittlichen Prozentsatz des Keimbläschenabbaus, dessen Auftreten mit oder ohne MIS nach einer Inkubationsperiode von 4-5 Stunden festgestellt wurde. Sternchen geben an, daß die Signifikanz der Daten einen p-Wert von weniger als 0,01 aufweist.
Fig. 4 zeigt, wie sich die Dauer der Gegenwart von MIS auf den Prozentsatz von Oocyten auswirkt, bei welchen ein Keimbläschenabbau eintritt. Die Reversibilität der MIS-Aktivität ist dargestellt.
Fig. 5A bzw. 5B zeigen die Wirkung von Dibutyryl-cyclo-AMP und MIS auf den Prozentsatz von bloßgelegten Oocyten oder in Cumuluszellen eingeschlossenen Oocyten, bei welchen ein Keimbläschenabbau eintritt.
Fig. 6 zeigt die Wirkung von Fortpflanzungshormonen auf die durch MIS herbeigeführte Hemmung des Keimbläschenabbaus bei bloßgelegten und in Cumuluszellen eingeschlossenen Oocyten.
Fig. 7 zeigt die Wirkung von MIS auf den Keimbläschenabbau bei bloßgelegten und in Cumuluszellen eingeschlossenen Maus-Oocyten.
Fig. 8 zeigt die Fähigkeit von rekombinanten, menschlichen MIS-Zubereitungen, den Abbau von Keimbläschen zu hemmen.
Fig. 9 zeigt die Fähigkeit des epidermalen Wachstumsfaktors zur Umkehrung der Fähigkeit von MIS, die Oocytenreifung zu hemmen.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Der Müller'sche Inhibitorstoff kann durch eine Reihe verschiedener Verfahren gewonnen werden. Der Stoff kann aus dem Hodengewebe nach dem Verfahren von Donahoe, P.K., et al., (U.S. Patente 4.510.131 und 4.404.188) gereinigt werden.
MIS kann aber auch durch die Verwendung von Immunaffinitätschromatographie aus Hodengewebe gereinigt werden, wie von Donahoe, P.K., et al., (U.S. Patent Nr. 4.487.833) geoffenbart. Das Material kann auch durch rekombinante DNA-Techniken erhalten werden (Cate, R.L. et al., Cell 45:685-698 (1986)).
Der Begriff "Müller'scher Inhibitorstoff" (auch "MIS" genannt) soll Verbindungen und Materialien umfassen, die MIS strukturell ähnlich sind. Beispiele für solche enthaltenen Substanzen und Materialien sind Salze, Derivate und Aglyconformen von MIS. Zusätzlich soll die vorliegende Erfindung mutante Formen von MIS umfassen, die im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie MIS besitzen. Beispiele für solche mutanten Formen sind MIS-Moleküle mit einer Deletion, Insertion oder Veränderung in der Aminosäuresequenz. MIS kann von jedem Säugetierausgangsstoff oder, wie oben erwähnt, von Nicht-Säugetierausgangsstoffen durch Verwendung rekombinanter DNA-Technik oder durch chemische Synthese des MIS-Proteins erhalten werden.
Der Begriff "Peptidfragment" soll sowohl synthetische als auch natürlich vorkommende Aminosäuresequenzen umfassen, die von der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz von MIS ableitbar sind.
Ein Peptid wird als "von der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz von MIS ableitbar" bezeichnet, wenn es durch Fragmentierung der gewählten, natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz erhalten werden kann oder wenn es aufgrund der Kenntnis der Sequenz der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz oder des genetischen Materials (DNA oder RNA), das diese Sequenz kodiert, synthetisiert werden kann.
Ein Material wird als "im wesentlichen frei von natürlichen Kontaminanten" bezeichnet, wenn es im wesentlichen von Materialien gereinigt wurde, mit welchen es normalerweise und von Natur aus vor der Reinigung gefunden wird. Beispiele für natürliche Kontaminanten, die mit MIS verbunden sein können, sind: andere Peptide, Kohlenstoffhydrate, glycosylierte Peptide, Lipide, Membran usw . . Ein Material wird auch als im wesentlichen frei von natürlichen Kontaminanten bezeichnet, wenn diese Kontaminanten im wesentlichen in einer Probe des Materials fehlen.
Ein Gen wird als "rekombinantes" Gen bezeichnet, wenn es durch Anwendung rekombinanter DNA-Techniken erhalten wurde. Beispiele rekombinanter DNA-Techniken umfassen das Klonieren, die Mutagenese, Transformation usw. Rekombinante DNA-Techniken sind bei Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982) beschrieben.
Die Erfindung betrifft ferner Polypeptide, die zusätzlich zu der gewählten Sequenz eine oder mehr Aminosäuren mehr oder weniger enthalten können, die in der natürlich vorkommenden Sequenz nicht vorhanden sein können, wobei solche Polypeptide dem gewählten Polypeptid funktionell gleich sind. Solche Polypeptide für die vorliegende Erfindung werden als "funktionelle Derivate" bezeichnet, vorausgesetzt, sie weisen die Aktivität auf, die im wesentlichen jener von MIS gleich ist.
Im Bereich der vorliegenden Erfindung liegen jene Peptidfragmente in MIS, die imstande sind, als Inhibitoren der Oocytenreifung zu dienen. Ebenso eingeschlossen ist die Verwendung von zusätzlichen Aminosäureresten, die zur Verstärkung der Kopplung an das Trägerprotein beigefügt sind, oder Aminosäurereste, die zur Verstärkung der Hemmwirkung beigefügt sind. Wie in der Wissenschaft bekannt, können die Aminosäurereste von MIS in ihrer geschützten oder ungeschützten Form vorliegen, wobei geeignete Amino- oder Carboxylschutzgruppen verwendet werden.
Der MIS kann auch in Gegenwart von kationischen Salzgruppen vorliegen. Zweckmäßige Kationen sind Erdalkalimetallkationen oder alkalische Erdmetallkationen (d. h., Na, K, Li, 1/2Ca, 1/2Ba usw.) oder Aminkationen (d. h., Tetraalkylammonium, Trialkylammonium, wobei Alkyl C&sub1;-C&sub1;&sub2; sein kann).
Die MIS-Zusammensetzung kann in der Form der freien Amine (am N-Terminus) oder der Säure-Additionssalze vorliegen. Herkömmliche Säure-Additionssalze sind Halogenwasserstoffsäuresalze, d. h., Hbr, Hi oder bevorzugter, HCl.
Die MIS Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können nach bekannten Verfahren zur Bereitung pharmazeutisch zweckmäßiger Zusammensetzungen zubereitet werden, wobei MIS oder seine funktionellen Derivate in Vermischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger kombiniert werden. Geeignete Träger und ihre Zubereitung, einschließlich anderer menschlicher Proteine, z. B. Humanserumalbumin, werden zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences (16. Ausgabe A. Oslo Ed. Mack, Easton PA (1980)) beschrieben. Zur Bildung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung, die zur wirksamen Verabreichung geeignet ist, enthalten solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge des MIS oder seiner funktionellen Derivate, gemeinsam mit einer geeigneten Menge des Trägers.
Eine "wirksame Menge", von MIS ist jene, die zur Erzielung einer Kontraception bei einem ovulierenden Menschen oder Tier ausreicht. Erfindungsgemäß kann die Kontraception durch Beeinflussung der natürlichen Entwicklung der gehemmten Oocyten zu reifen Oocyten erzielt werden. Die wirksame Menge kann abhängig von Kriterien wie Alter, Gewicht, physischem Zustand, vergangene Krankengeschichte und Empfindlichkeit des Empfängers schwanken, liegt aber vorzugsweise zwischen 10&supmin;&sup7; M bis 10&supmin;² M.
Da die kontraceptive Aktivität von MIS reversibel ist, wird bevorzugt, eine wirksame Menge von MIS kontinuierlich an einen Empfänger zu verabreichen, so daß ein anhaltender Zustand der herbeigeführten Unfruchtbarkeit aufrechterhalten wird. Zum Beispiel kann eine monatliche oder zweimonatige Verabreichung erfolgen.
Es können aber auch Zusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung verwendet werden. Faktoren, die die Häufigkeit der Verabreichung von MIS betreffen, umfassen die Pharmakokinetik des Verbleibens in den Ovarien und die Potenz der Zubereitung.
Zusammensetzungen, die MIS oder seine funktionellen Derivate enthalten, können oral, intravenös, intramuskulär, subkutan oder lokal verabreicht werden.
Zur parenteralen Verabreichung werden MIS-haltige Zusammensetzungen in destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert wird auf 6 bis 8 eingestellt. Zur Erleichterung des Lyophilisierungsverfahrens, das zu einem geeigneten Produkt führt, kann der Lösung Lactose beigegeben werden. Die Lösung wird dann filtersterilisiert, in Ampullen gefüllt und lyophilisiert. In diesen Zusammensetzungen kann die Konzentration von MIS zwischen 10&supmin;&sup7; M und 10&supmin;² M betragen.
Zur Kontrolle der Wirkungsdauer können zusätzliche pharmazeutische Verfahren angewendet werden. Zubereitungen mit kontrollierter Freisetzung können durch Verwendung von Polymeren erreicht werden, um MIS oder seine funktionellen Derivate in einen Komplex überzuführen oder zu adsorbieren. Die kontrollierte Abgabe kann durch Auswahl geeigneter Makromoleküle (zum Beispiel Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose und Protaminsulfat) und Konzentration der Makromoleküle wie auch Einschlußverfahren durchgeführt werden, um die Freisetzung zu kontrollieren. Ein weiteres mögliches Verfahren zur Kontrolle der Wirkungsdauer durch Zubereitungen mit kontrollierter Freisetzung ist der Einschluß von MIS in Partikel eines polymeren Materials, wie Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogelen, Poly(Milchsäure) oder Ethylenvinylacetatkopolymeren. Anstatt MIS in diese polymeren Partikel einzuschließen, ist es aber auch möglich, MIS in Mikrokapseln einzuschließen, die zum Beispiel durch Koazervierungsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisierung hergestellt wurden, wie zum Beispiel Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Kapseln bzw. Poly(Methylmethacrylat)-Mikrokapseln, oder in kolloidalen Arzneimittelabgabesystemen, wie zum Beispiel Liposomen, Albuminmikrokugeln, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln oder in Makroemulsionen. Solche Angaben sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, supra (1980) beschrieben.
Der MIS der vorliegenden Erfindung kann entweder durch einen "Bolus" oder in einer "Medikamentzusammensetzung mit verzögerter Freisetzung" verabreicht werden. Der Begriff "Bolus" soll jede Verabreichungsform bezeichnen, bei der MIS in einzelnen und trennbaren Dosierungen gegeben wird. Pillen, Tabletten, Kapseln und Injektionen sind alle Beispiele für Bolus-Verabreichungen. Der Begriff "Medikament mit verzögerter Freisetzung" soll jede Verabreichungsform bezeichnen, bei der MIS kontinuierlich und anhaltend gegeben wird. Zu Beispielen für Medikamente mit verzögerter Freisetzung zählen Implantate, Infusionen oder Vorrichtungen für verzögerte Freisetzung.
Der MIS der vorliegenden Erfindung und seine funktionellen Derivate, entweder einzeln oder in pharmakologisch annehmbaren Zusammensetzungen, sind als Kontraceptivum bei ovulierenden Menschen oder Tieren geeignet. Es wird angenommen, ohne dadurch die Erfindung einzuschränken, daß die Fähigkeit von MIS, die normale Oocytenreifung zu beeinflussen, den Grund für die kontraceptive Wirksamkeit von MIS darstellt.
Ein Merkmal der Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß die kontraceptive Wirkung von MIS (d. h. die Fähigkeit von MIS, die Oocytenreifung zu hemmen) durch Verbindungen wie den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) umgekehrt werden kann. Sowohl die Wirksamkeit der kontraceptiven Aktivität von MIS wie auch die Umkehrbarkeit durch Verbindungen wie EGF nehmen mit steigender MIS-Konzentration zu. Der epidermale Wachstumsfaktor ist ein Peptidhormon, welches das Wachstum und die Differenzierung von epidermalem Gewebe während der Embryogenese stimuliert (Carpenter, G., et al., Exper. Cell. Res. 164 : 1-10 (1986); Kris, R.M., et al., Bio.Technol. 3 : 135-140 (1985)). EGF kann von natürlichen Ausgangsstoffen gereinigt oder durch Anwendung rekombinanter DNA-Technik erhalten werden. Die zur Umkehrung der kontraceptiven Wirkungen von MIS erforderliche Menge von EGF wird im allgemeinen durch Berücksichtigung derselben Faktoren wie jenen bestimmt, die zur Bestimmung der Dosierung und Verabreichungsform von MIS herangezogen werden. Die zur Umkehrung der kontraceptiven Wirkung von MIS erforderliche Menge von EGF schwankt im allgemeinen zwischen 10&supmin;&sup7; M bis 10&supmin;² M. EGF kann von Collaborative Research, Lexington, MA, erhalten werden.
Wie für den Fachmann offensichtlich ist, trifft die vorangehende Besprechung der pharmazeutischen Zusammensetzungen gleichfalls auf die Herstellung von pharmazeutisch geeigneten Zubereitungsformen des epidermalen Wachstumsfaktors oder der Anti-MIS-Antiseren zu.
Die Anti-MIS-Antiseren oder der monoklonale Antikörper können zur Förderung der Fruchtbarkeit bei weiblichen Patienten verwendet werden, wenn die Unfruchtbarkeit durch anomal hohe Erzeugung von MIS bedingt ist. Der Antikörper kann lokal oder durch jedes andere geeignete Verfahren verabreicht werden. Die Dosierungen liegen im Bereich von 10&supmin;&sup7; M bis 10&supmin;² M.
Nachdem diese Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, folgt nun zur Veranschaulichung eine nähere Erklärung mit Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele.

BEISPIEL 1

Reinigung des Müller'schen Inhibitorstoffes

Der Müller'sche Inhibitorstoff wurde nach dem Verfahren von Budzik, G.P., et al., Cell 21 : 909-915 (1980) und Budzik, G.P., et al., Cell 34 : 307-314 (1983) gereinigt. Kurz gesagt, es wurden die Hoden von Kälbern, die weniger als zwei Wochen alt waren, in 1 mm Fragmente in eisgekühlten, serumfreien Ham's F10 Medien zerkleinert (Budzik, G.P., et al. (1980) supra) und dann bei 37ºC 45 Minuten bei leichtem Rühren inkubiert. Das Medium wurde durch Ammoniumsulfatfällung, reäquilibriertes 250 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, 0,03% Natriumazid, 1 mM EDTA, pH 8, konzentriert und dann auf eine Diethylaminoethyl Bio-Gel A Säule aufgebracht. In der ungebundenen Fraktion wurde eine hohe biologische Aktivität festgestellt. Diese Fraktion wurde dann mit verdünnter HCl auf pH 5 eingestellt, bei 40.000·g 10 Minuten zur Entfernung des Niederschlages zentrifugiert, und der Überstand wurde dann durch eine Carboxymethyl Bio-Gel A Säule geleitet, die mit 50 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, 0,03% Natriumazid, 1 mM EDTA, pH 6, voräquilibriert war. Die ungebundene Fraktion, die wieder eine hohe biologische Aktivität aufwies, wurde dreifach auf einem Amicon PM-30 Ultrafilter konzentriert und direkt in eine Weizenkeimlektin (WKL)-Sepharose-6MB Säule geladen (Budzik, G.P., et al. (1980) supra), die mit 10 mM HEPES (ph 7), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,01% Nonidet P-40 (NP-40) äquilibriert war. Nach einer Pufferwaschung wurde die biologisch aktive Fraktion mit 100 mg/ml N-Acetylglucosamin eluiert und ohne weitere Äquilibration auf eine Affinitätssäule geladen, die Matrex Gel Green A® (AMICON) enthielt (Budzik, G.P., et al. (1983) supra) und zuvor in 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,01% NP-40, pH 8,0, voräquilibriert wurde. Nach der Elution mit nur diesem Puffer und mit 10 mM ATP wurde die gebundene Fraktion, die MIS biologische Aktivität aufwies, mit dem Beladungspuffer eluiert, der 500 mM NaCl enthielt. Diese Endfraktion wurde 80-fach durch Vakuumdialyse gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung, die 0,01% NP-40 enthielt, konzentriert und in 1 ml Teilmengen bei 80ºC zur folgenden Verwendung gelagert. Jede Ampulle enthielt 0, 15 mg Protein pro ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, (pH 7) und 0,01% NP-40. Die Verdünnungen dieses Materials wurden unter Verwendung von Krebs-Ringer Bicarbonat- (KRB) (Donahoe, R.P., J. Exper. Zool. 169 : 237-250, (1968)) Lösung durchgeführt, um MIS-Konzentrationen von 1,5·10² bis 1,5·10&sup9; mg/ml herzustellen.

BEISPIEL 2

Test auf Oocytenreifung-Hemmaktivität

Ovarien von präpubertären, 25-57 Tage alten Sprague-Dawley Ratten (etwa 50 bis 60 g Körpergewicht) oder Schweizer Mäusen mit etwa 15 bis 20 g Körpergewicht wurden unmittelbar nach der Tötung seziert und in die KRB-Lösung, die in Beispiel 1 beschrieben ist, eingebracht. Das sezierte Gewebe wurde auf einer Wärmeplatte bei 35ºC gehalten. Die Oocyten wurden unter einem Mikroskop sichtbar gemacht, und die im Cumulus eingeschlossene Oocyte wurde von den Follikeln durch Zupfen mit einer sterilen Nadel befreit. In einigen Fällen wurden die anhaftenden Eihügelzellen von den Oocyten abgestreift, indem die aggregierten Zellen rasch in eine Pipette hinein- und hinausgezogen wurden, so daß eine bloßgelegte Oocyte erhalten wurde. Vollständig gewachsene Oocyten, die ein intaktes Keimbläschen mit und ohne Cumuluszellen enthielten, wurden innerhalb von 3 Minuten nach ihrer Isolierung verwendet. Frühreife und kleine Oocyten wurden verworfen. 10-20 Oocyten wurden in 0,2 ml Medium unter Leichtparaffinöl pipettiert und in einem Inkubator 1 bis 24 Stunden unmittelbar nach der Gewinnung bei 37ºC kultiviert. Die Oocyten wurden kontinuierlich mit 95% Luft und 5% CO&sub2;, mit Wasser gesättigt, gespült. Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung einer in Entwicklung befindlichen Oocyte.
Zu jedem gewählten Zeitpunkt wurden die Oocyten als unreif (intaktes 20 Keimbläschen mit Nucleolus) oder reif (wenn kein Keimbläschen nachgewiesen werden konnte) bewertet.
Für jede experimentelle Behandlung wurde der Prozentsatz von Oocyten in den beiden Kategorien berechnet. Zur Prüfung der Unterschiede zwischen den Gruppen oder der statistischen Signifikanz wurde der Chi-Square-Test verwendet. Als signifikant wurde ein p-Wert von weniger als 0,01 erachtet.

BEISPIEL 3

Bestimmung des zeitlichen Ablaufs der Oocytenreifung

MIS wurde nach der Beschreibung in Beispiel 1 hergestellt. Die Wirkung von MIS auf den zeitlichen Ablauf der Oocytenreifung wurde durch die Verwendung des Tests auf Oocytenreifung-Hemmaktivität, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt. Somit wurden bloßgelegte Ratten-Oocyten nur mit KRB-Medium oder mit beigefügtem MIS inkubiert und der zeitlichen Ablauf und das Ausmaß des Keimbläschenabbaus bestimmt. Der Prozentsatz des spontanen Keimbläschenabbaus der Oocyten wurde bei inkrementellen Inkubationszeiten berechnet. Nach fünfstündiger Inkubation und mit Kontrollmedium trat ein spontaner Keimbläschenabbau bei mehr als 80% der bloßgelegten Oocyten ein, was darauf hinwies, daß eine wesentliche Anzahl von Oocyten eine Reifung erfuhr. Eine signifikante und dosisabhängige Hemmung des spontanen Keimbläschenabbaus wurde bei Oocytenzubereitungen beobachtet, die in Gegenwart der MIS-haltigen Fraktionen bei Konzentrationen von 1,5·10&supmin; bis 10&supmin;² mg Protein/ml inkubiert wurden. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 2 dargestellt. Dieses Experiment zeigt, daß MIS ein wirksamer Inhibitor der Oocytenreifung ist. Wie in Fig. 3 dargestellt, bewirkte die Zugabe der MIS-haltigen Fraktion in diesen Konzentrationen, aber nicht mit 10&supmin;&sup9; oder 10&supmin;&sup8; mg Protein/ml, eine signifikante und zunehmende Hemmung des Keimbläschenabbaus sowohl bei bloßgelegten als auch bei in Cumuluszellen eingeschlossenen Ratten-Oocyten. Bei äquimolaren Konzentrationen gab es zwischen bloßgelegten oder in Cumuluszellen eingeschlossenen Oocyten keinen signifikanten Unterschied in der durch MIS herbeigeführten Hemmung des Keimbläschenabbaus. Die Hemmwirkung von MIS auf die Oocytenreifung wurde daher als dosisabhängig und Cumuluszellen-unabhängig bestimmt.

BEISPIEL 4

Reversibilität der MIS-Hemmung

Zur Bestimmung, ob die MIS-Hemmung der Oocytenreifung reversibel ist, wurde ein zeitlicher Ablauf der Oocytenreifung bestimmt. So wurden in stündlichen Intervallen bloßgelegte Ratten-Oocyten, die wie in Beispiel 2 bereitet worden waren, auf die Reifung sowohl mit als auch ohne MIS getestet. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 4 dargestellt. Bei einer Stunde zeigten 10% der bloßgelegten Ratten-Oocyten einen spontanen Keimbläschenabbau in den kontrollierten Medien. Dieser Abbau stieg nachweislich in progressiven Inkrementen an, bis bei 5 Stunden 81% der Oocyten, die ursprünglich vorhanden waren, einen Keimbläschenabbau aufwiesen. Die Gegenwart von 1,5·10&supmin;³ mg Protein/ml MIS verhinderte das Eintreten eines Keimbläschenabbaus bei 1 Stunde vollständig und verringerte den Keimbläschenabbau bei etwa 50% (d. h., bei 43% der Oocyten hatte ein Keimbläschenabbau nach 5 Stunden stattgefunden).
Nach 2 Stunden MIS-Inkubation wurde ein Teil der Oocytenprobe dreimal in KRB-Lösung gewaschen und in eine frische KRB-Lösung eingebracht. 74% der so behandelten Oocyten zeigten einen Keimbläschenabbau nach 5 Stunden, was darauf hinweist, daß die MIS-Wirkung bei bloßgelegten Oocyten reversibel ist.
Dieses Experiment zeigt ferner, daß die kontraceptive Wirksamkeit von MIS von der kontinuierlichen Gegenwart einer wirksamen Menge von MIS abhängt.

BEISPIEL 5

Wirkung des Dibutyryl-cyclo-AMP auf die MIS-Hemmung

Ratten-Oocyten wurden 5 Stunden nur in kontrollierten Medien oder mit 1,5· 10&supmin;³ mg Protein/ml MIS kultiviert. Dibutyryl-cyclo-AMP (dbcAMP) bei Konzentrationen von 50, 100 oder 150 x 10.6 mM wurde entweder alleine oder mit 1,5·10&supmin;³ mg Protein/ml MIS inkubiert. Die Zugabe von 50·10&supmin;&sup6; M dbcAMP in KRB-Lösung veränderte den Prozentsatz der Oocyten, die einen Keimbläschenabbau aufwiesen, nicht signifikant und beeinflußte auch nicht die Hemmwirkung von MIS (bei der Konzentration von 1,5·10&supmin;³ mg Protein/ml). Die Zugabe von 100·10&supmin;&sup6; M und 150·10&supmin;&sup6; M dbcAMP in KRB-Lösung hemmte den spontanen Keimbläschenabbau signifikant, verstärkte aber nicht die Hemmwirkung von 1,5· 10&supmin;³ mg Protein/ml MIS. Diese Experimente wurden sowohl an bloßgelegten als auch an in Cumuluszellen eingeschlossenen Oocyten durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 5A (bloßgelegte Oocyten) und 5B (in Cumuluszellen eingeschlossene Oocyten) dargestellt.
Dieses Experiment zeigt, daß MIS nicht synergistisch oder antagonistisch mit dbcAMP zur Hemmung der Oocytenreifung wirkt. Das Experiment zeigt ferner, daß die MIS-Hemmwirkung Cumuluszellen-unabhängig und cAMP-unabhängig ist.

BEISPIEL 6

Wirkung anderer Fortpflanzungshormone auf die durch MIS herbeigeführte Hemmung der Oocytenreifung

Die Wirkung der Fortpflanzungshormone wie des follikelstimulierenden Hormons (FSH), luteinisierenden Hormons (LH), Progesteron, 17 Beta-Estradiol und Testosteron auf die durch MIS herbeigeführte Hemmung wurde unter Verwendung von bloßgelegten oder in Cumuluszellen eingeschlossenen Ratten-Oocyten bestimmt. Zur Durchführung dieser Bestimmung wurde der Test auf Oocytenreifung-Hemmaktivität, wie in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung von bloßgelegten oder in Cumuluszellen eingeschlossenen Ratten-Oocyten durchgeführt.
Die MIS-Konzentration betrug 1,5·10³ mg Protein/ml. Die durch MIS herbeigeführte Hemmung wurde bei verschiedenen Hormonkonzentrationen geprüft (0,1, 1,0 und 10 ug/ml FSH; 0,4, 4,0 und 40 ug/ml LH; 0,1, 1,0 und 10 ug/ml Progesteron; 0,1, 1,0 und 10 ug/ml 17 Beta-Estradiol; und 0,1, 1,0 und 10 ug/ml Testosteron). Wie in Fig. 6 dargestellt, hatten diese Hormone keinen Einfluß auf die durch MIS herbeigeführte Hemmung, weder bei bloßgelegten noch bei in Cumuluszellen eingeschlossenen Oocyten. Diese Ergebnisse zeigen, daß die durch MIS herbeigeführte Hemmung der Oocytenreifung unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit anderer Fortpflanzungshormone ist.

BEISPIEL 7

Wirkung von Isobutylmethylxanthin auf die durch MIS herbeigeführte Hemmung der Oocytenreifung

Bloßgelegte und in Cumuluszellen eingeschlossene Maus-Oocyten wurden 3 Stunden nur in Kontrollmedien oder mit 1,5·10&supmin;², 10&supmin;&sup4;, 10&supmin;&sup6; oder 10&supmin;&sup8; mg Protein/ml MIS oder 10&supmin;&sup4; M Isobutylmethylxanthin (IBMX) kultiviert. Wie in Fig. 7 dargestellt, bewirkte die Zugabe von IBMX eine signifikante Hemmung des spontanen Keimbläschenabbaus sowohl bei den bloßgelegten als auch bei den in Cumuluszellen eingeschlossenen Oocyten. Es zeigte sich, daß MIS den spontanen Keimbläschenabbau nicht hemmen konnte, was darauf hinweist, daß bovines MIS nicht die Hemmwirkung auf die Meiose von Maus-Oocyten besitzt, die zuvor bei Ratten-Oocyten beobachtet worden war.

BEISPIEL 8

Wirkung von Anti-MIS-Antiseren auf die MIS-Hemmung

Monoklonale Antikörper, die imstande sind, an gereinigten MIS zu binden, wurden nach dem Verfahren von Shima, H., et al. (Hybridoma, 3 : 201-214 (1984)) zubereitet. Nach anfänglicher Durchmusterung der Hybridomzellen auf ihre Fähigkeit, MIS-spezifische Antikörper herzustellen, wurden positive Hybridome weiter auf ihre Fähigkeit, die biologische Aktivität von MIS zu hemmen, selektiert.
Da MIS ein Inhibitor der Oocytenreifung ist, kann durch Verabreichung von Anti-MIS-Antiseren (die imstande sind, die biologische Aktivität von MIS zu hemmen) die MIS-Hemmung blockiert und somit umgekehrt werden. Wenn die weibliche Unfruchtbarkeit durch eine anomale Erzeugung von MIS verursacht wird, dann kann durch Verabreichung eines Anti-MIS-Antikörpers, wie den zuvor beschriebenen, die Fruchtbarkeit wiederhergestellt werden.

BEISPIEL 9

Fähigkeit von rekombinanten menschlichen MIS-Zubereitungen, den Keimbläschenabbau zu hemmen

Es wurde der Test auf Oocyten-Keimbläschenabbau von Beispiel 2 zur Testung der Fähigkeit von rekombinanten menschlichen MIS-Zubereitungen, den Keimbläschenabbau zu hemmen, verwendet. Rekombinanter menschlicher MIS wurde durch Transfektion des MIS-Gens (Cate, R.L., et al., Cell 45 : 685-698 (1986)) in chinesischen Hamsterovarzellen und Vermehrung der Zellen in einem serumfreien Medium (nach dem Medium von Cate, R.L., et al., (1986) zubereitet) eingesetzt.
Der MIS wurde dann durch Ionenaustausch und Lectin-Affinitätschromatographie (Budzik, G.P., et al., Cell 21 : 909-921(1980)) gereinigt, um eine MIS-Zubereitung zu erhalten, die möglicherweise zwischen 1-10% MIS und wahrscheinlicher etwa 1% MIS enthielt. Die Ergebnisse dieses Oocytentests sind in Fig. 8 dargestellt. Wie aus dieser Figur ersichtlich ist, wurde weder bei dem nichtionischen Detergens NP-40 (10&supmin;&sup7;-fach verdünnt) noch bei dem Krebs-Ringer-Puffer (KRB) eine Hemmung des Keimbläschenabbaus festgestellt. Es zeigte sich, daß serumfreier, rekombinanter menschlicher MIS den Keimbläschenabbau bei einer 10&supmin;²- bis 10&supmin;¹-fachen Verdünnung signifikant hemmte.
Es wurde festgestellt, daß die Fähigkeit von menschlichem rekombinanten MIS, den Keimbläschenabbau zu hemmen, die Gegenwart eines nichtionischen Detergens (vorzugsweise NP-40) bei einer 10&supmin;&sup6;- bis 10&supmin;&sup8;-fachen Verdünnung (besonders bevorzugt bei einer 10&supmin;&sup7;-fachen Verdünnung) erfordert.

BEISPIEL 10

Fähigkeit von EGF zur Umkehrung der Fähigkeit von MIS, die Oocytenreifung zu hemmen

Es wurde der Test auf Oocyten-Keimbläschenabbau von Beispiel 2 zur Testung der Fähigkeit von EGF, die kontraceptive Aktivität von MIS umzukehren, verwendet. Rekombinanter menschlicher MIS, der nach dem Verfahren von Beispiel 9 zubereitet worden war, wurde unter Verwendung der Farbstoffaffinitätschromatographie (Budzik, G.P., et al., Cell 34:307-314 (1983)) gereinigt. EGF wurde von Collaborative Research, Lexington, MA, erhalten.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 9 dargestellt. Diese Figur zeigt, daß die Zugabe von KRB oder EGF zu den Keimbläschen den Abbau der Keimbläschen nicht hemmen konnte (Balken 1 und 2). Die Zugabe von MIS, das entweder durch DEAE/Green 3- oder Fast Q Ionenaustausch/Green 3-Chromatographie (Balken 3 bzw. 5) gereinigt wurde, hemmte nachweislich den Keimbläschenabbau. Die Zugabe von EGF zu einer MIS-haltigen Probe führte zu einer Umkehrung der Hemmung und einem Abbau der Keimbläschen (Balken 4 bzw. 6). Somit zeigt dieses Beispiel, daß die kontraceptive Wirkung von MIS durch EGF umgekehrt werden kann.

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Müller'schen Inhibitorstoff gemeinsam mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Müller'sche Inhibitorstoff im wesentlichen frei von natürlichen Kontaminanten ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Müller'sche Inhibitorstoff durch Expression eines rekombinanten Müller'schen Inhibitorstoffgens in einem Wirt erzeugt wird.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in einer Form, die zur Verabreichung über den oralen, lokalen, intravenösen, intramuskulären oder parenteralen Weg geeignet ist.

5. Verwendung des Müller'schen Inhibitorstoffes in der Zubereitung eines Kontraceptivums.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper, der imstande ist, an den Müller'schen Inhibitorstoff zu binden, gemeinsam mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

7. Verwendung eines Antikörpers gegen den Müller'schen Inhibitorstoff in der Zubereitung eines Mittels zur Herbeiführung der Fruchtbarkeit bei einer Frau, die an Unfruchtbarkeit leidet, die durch anomal hohe Werte des Müller'schen Inhibitorstoffes bedingt ist.

8. Verwendung eines Antikörpers gegen den Müller'schen Inhibitorstoff in der Zubereitung eines Mittels zur Umkehrung der kontraceptiven Aktivität des Müller'schen Inhibitorstoffes.

9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Antikörper monoklonal ist.

10. Verwendung des epidermalen Wachstumsfaktors in der Zubereitung eines Mittels zur Umkehrung der kontraceptiven Aktivität des Müller'schen Inhibitorstoffes.