DE102017204850A1 - HSA-Konjugat - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Wirkstoff-Trägerprotein-Konjugaten.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Wirkstoff-Trägerprotein-Konjugaten. Solche Konjugate sind insbesondere zur Behandlung von Krebserkrankungen, zur Behandlung von Rheumaerkrankungen, zur Behandlung der akuten Graft Versus Host Disease (aGVHD) oder zur Behandlung von Sepsis einsetzbar.
- Wirkstoff-Trägerprotein-Konjugate werden verwendet, um durch Kopplung von körperfremden Wirkstoffen an körpereigene Trägerproteine längere Halbwertszeiten bei der Verabreichung von therapeutischen und/oder diagnostischen Wirkstoffen zu erhalten (siehe zum Beispiel
DE 41 22 210 A1 oderWO 96/32133 - Die Kopplung von Wirkstoff an Trägerprotein erfolgt üblicherweise unter Aktivierung von Carboxylgruppen des Wirkstoffes, beispielsweise mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (siehe z.B.
DE 41 22 210 A1 ) oder mittels 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (HSI). Es wurde nunmehr jedoch festgestellt, dass bei diesen bekannten Kopplungen eines Wirkstoffes an ein Trägerprotein Racemate entstehen. Bei einer Verwendung von Wirkstoff-Trägerprotein-Konjugaten als Arzneimittel ist jedoch die Bildung von Racematen nachteilig und unerwünscht. - Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, Enantiomeren-reine Wirkstoff-Trägerprotein-Konjugate bereitzustellen.
- Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoff-Trägerprotein-Konjugats umfassend die Schritte:
- i) Bereitstellen eines Wirkstoffes, welcher wenigstens eine Carboxylgruppe enthält,
- ii) Umsetzen des Carboxylgruppen-haltigen Wirkstoffes mit einem Kopplungsreagenz ausgewählt aus Phosphoniumsalzen, Aminiumsalzen, Hydroxybenzotriazolen und/oder Uroniumsalzen, wobei ein Wirkstoff-Aktivester gebildet wird und,
- iii) Koppeln des Wirkstoff-Aktivesters an ein Trägerprotein.
- Geeignete Phosphoniumsalze sind insbesondere BOP (Benzotriazolyloxytris [dimethylamino]-phosphoniumhexafluorphosphat), PyBOP (Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium-hexafluorphosphat), PyBroP (Bromtripyrrolidinphosphonium-hexafluorphosphat) sowie BroP (Bromtris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorphosphat).
- Geeignete Uroniumsalze umfassen insbesondere HBTU (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat), HATU (O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorphosphat), TBTU (O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-tetrafluorborat), HCTU (2-(6-Chlor-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium-hexafluorphosphat sowie TATU (O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-tetrafluorborat). Bei Verwendung von Uroniumsalzen kann vorzugsweise HOBt (1-Hydroxybenzotriazol) zusätzlich zugefügt werden. Das Verhältnis an Uroniumsalz zu HOBt beträgt dabei vorzugsweise von 1:10 bis 10:1, am meisten bevorzugt 1:5 bis 5:1. Besonders bevorzugt wird HBTU und HOBt (HBTU/HOBt) oder HATU und HOBt (HATU/HOBt) als Kopplungsreagenz verwendet. Die Uroniumsalze, insbesondere in Kombination mit HOBt, werden besonders bevorzugt als alleiniges Kopplungsreagenz, d.h. in Abwesenheit von anderen Kopplungsreagenzien, insbesondere in Abwesenheit von Carbodiimiden eingesetzt.
- Weitere geeignete Uroniumsalze umfassen insbesondere TNTU (2-(5-Norbornen-2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluorborat), TPTU (2-(2-Oxo-1(2H)-pyridyl-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluorborat), TOTU (O-[(Ethoxycarbony))cyanomethylenamino]-N,N,N',N'-tetramethyluronium-tetrafluorborat), TDBTU (2-(3,4-Dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-tetrafluorborat) oder TSTU (O-(N-Succinimidyl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-tetrafluorborat).
- Weitere bevorzugte Aktivierungsreagenzien sind COMU (1-[(1-(Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidenaminooxy)-dimethylamino-morpholino)]uronium-hexafluorphosphat) oder ((1-Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidenaminooxy) dimethylamino-morpholino-carbenium-hexafluorphosphat), COMBU (4-((1,3-Dimethyl-2,4,6-trioxotetrahydropyrimidin-5(6H)ylidenaminooxy) (dimethylamino)methylen)morpholin-4-iumhexafluorphosphat) oder TOMBU (N-((1,3-Dimethyl-2,4,6-trioxotetrahydropyrimidin-5(6H)-ylidenaminooxy) (dimethylamino)methylen-N-methylmethanaminiumhexafluorphosphat). Besonders bevorzugt ist COMU.
- Geeignete Hydroxybenzotriazole umfassen insbesondere HOBt (1-Hydroxybenzotriazol), welches erfindungsgemäß auch als einziges Kopplungsreagenz, d.h. in Abwesenheit von anderen Kopplungsreagenzien eingesetzt werden kann.
- Bevorzugt ist ein Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoff-Trägerprotein-Konjugats umfassend die Schritte:
- i) Bereitstellen eines Wirkstoffes, welcher wenigstens eine Carboxylgruppe enthält,
- ii) Umsetzen des Carboxylgruppen-haltigen Wirkstoffes mit einem Kopplungsreagenz ausgewählt aus 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HATU), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HBTU), (Benzotriazolyloxytris [dimethylamino]-phosphoniumhexafluorphosphat) (BOP) oder/und ((1-[(1-(Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidenaminooxy)-dimethylamino-morpholino)]uronium-hexafluorphosphat) (COMU), wobei ein Wirkstoff-Aktivester gebildet wird, und
- iii) Koppeln des Wirkstoff-Aktivesters an ein Trägerprotein.
- Besonders bevorzugt wird HOBt alleine als Kopplungsreagenz verwendet. In einer weiteren Ausführungsform werden HOBt und HBTU als alleiniges Kopplungsreagenz verwendet. Am meisten bevorzugt wird als Kopplungsreagenz ausschließlich HOBt/HBTU, HATU, BOP oder COMU eingesetzt, d.h. In Abwesenheit von anderen Kopplungsreagenzien.
- Erfindungsgemäß erfolgt das Umsetzen des Carboxylgruppen-haltigen Wirkstoffs mit dem Kopplungsreagenz vorzugsweise in Abwesenheit von Carbodiimiden, insbesondere in Abwesenheit von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und in Abwesenheit von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC). Bereits die Gegenwart von geringen Mengen an Carbodiimiden, insbesondere an DCC und/oder EDC führt zur Bildung von Racematen.
- Es wurde nunmehr festgestellt, dass Enantiomeren-reine Konjugate aus Carboxylgruppen-haltigen Wirkstoffen und Trägerproteinen durch Verwendung von speziellen Kopplungsreagenzien erhalten werden können. Durch die Verwendung von Phosphoniumsalzen, Aminiumsalzen, Uroniumsalzen und/oder HOBt, insbesondere durch die Verwendung von HOBt, HATU oder HBTU lassen sich Carboxylgruppen von Wirkstoffen in stabile Aktivester überführen. Diese Aktivester sind so stabil, dass sie sogar isoliert und chromatographiert werden können, um sicherstellen zu können, dass Enantiomeren-reine Verbindungen und nicht Racemate vorliegen.
- So kann vor der Kopplung an das Trägerprotein der gebildete Wirkstoff-Aktivester oder zumindest ein Teil davon isoliert werden und anhand von analytischen Methoden (z.B. NMR-Spektroskopie oder HPLC-MS) sichergestellt werden, dass die erhaltene Verbindung ein reines Enantiomer und kein Racemat ist.
- Das erfindungsgemäß hergestellte Wirkstoff-Trägerprotein-Konjugat ist somit vorzugsweise Enantiomeren-rein, d.h. dass das Molverhältnis von erwünschtem zu unerwünschtem Enantiomer insbesondere mindestens 90:10, bevorzugt mindestens 99:1, und noch mehr bevorzugt mindestens 99,9:0,1 beträgt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt der Anteil an unerwünschtem Enantiomer ≤ 1%, insbesondere ≤ 0,1%, bevorzugt ≤ 0,01% und am meisten bevorzugt 0%.
- Die erfindungsgemäß herzustellenden Konjugate enthalten einen Wirkstoff, welcher mindestens eine Carboxylgruppe aufweist. Insbesondere handelt es sich um einen niedermolekularen Wirkstoff mit einem Molekulargewicht ≤ 1000 Da und mehr bevorzugt ≤ 500 Da. Besonders bevorzugt ist der Wirkstoff Methotrexat (MTX), Amethoptherin (AMPT), Metothrexat-Polyglutamat mit 2-4 zusätzlichen Glutamatresten (MTX-PG 2-4) oder Amethoptherin-Polyglutamat mit 2-4 zusätzlichen Glutamatresten (AMPT-PG 2-4). Weiterhin können erfindungsgemäß als Wirkstoffe auch Farbstoffe, insbesondere Fluoreszenzfarbstoff, an ein Trägerprotein gekoppelt werden. Solche Farbstoff-Trägerprotein-Konjugate können z.B. in der photodynamischen Therapie verwendet werden.
- Als Kopplungsreagenz zur Bildung eines Wirkstoff-Aktivesters wird erfindungsgemäß bevorzugt 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HATU), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HBTU), (Benzotriazolyloxytris [dimethylamino]-phosphoniumhexafluorphosphat) (BOP) oder/und ((1-[(1-(Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidenaminooxy)-dimethylamino-morpholino)]uronium-hexafluorphosphat)) (COMU) verwendet. Der aus den eingesetzten Wirkstoffen unter Verwendung dieser speziellen Kopplungsreagenzien gebildete Wirkstoff-Aktivester ist so stabil, dass er gereinigt und als isolierter Feststoff gelagert bzw. transportiert werden kann. Das Wirkstoff-Trägerprotein-Konjugat kann somit sowohl unmittelbar durch Umsetzung des Wirkstoff-Aktivesters mit einem Trägerprotein hergestellt werden als auch nach Lagerung und Transport des Wirkstoff-Aktivesters erst unmittelbar vor Verabreichung an einen Patienten. Der stabile Wirkstoff-Aktivester ermöglicht insbesondere eine Lagerung und einen Transport, so dass dieser beispielsweise an einen Apotheker angeliefert werden kann. Dieser kann dann eine patientengerechte Dosierung und Kopplung an ein Trägerprotein vor Ort vornehmen.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb ein Kit umfassend
- i) einen Wirkstoff-Aktivester gebildet durch Umsetzen eines Carboxylgruppen-haltigen Wirkstoffes mit einem Kopplungsreagenz wie hierin beschrieben,
- ii) ein Trägerprotein, und
- iii) optional weitere Bestandteile, beispielsweise Lösungsmittel.
- Bevorzugt umfasst ein erfindungsgemäßer Kit
- i) einen Wirkstoff-Aktivester gebildet durch Umsetzen von MTX, MTX-PG2-4, AMPT oder AMPT-PG2-4 mit HOBt, HATU, HBTU, BOP oder/und COMU sowie
- ii) humanes Serumalbumin, insbesondere rekombinantes humanes Serumalbumin.
- Bei Umsetzung des Wirkstoff-Aktivesters mit einem Trägerprotein bleibt die Enantiomerenreinheit erhalten. Geeignete Trägerproteine weisen vorzugsweise ein Molekulargewicht von ≥ 18.000 Da, mehr bevorzugt ≥ 50.000 Da auf. Besonders bevorzugt wird als Trägerprotein Serumalbumin eingesetzt, am meisten bevorzugt humanes Serumalbumin (HSA). Ganz besonders bevorzugt wird als Trägerprotein rekombinantes humanes Serumalbumin (rHSA) verwendet. Für veterinärmedizinische Anwendungen können auch entsprechende tierische Albumine eingesetzt werden.
- In dem erfindungsgemäßen Wirkstoff-Trägerprotein-Konjugat ist der Wirkstoff kovalent an das Trägerprotein gebunden. In dem Konjugat beträgt das Molverhältnis von Wirkstoff zu Trägerprotein bevorzugt 10:1 bis 1:10, vorzugsweise 3:1 bis 1:3, insbesondere von 1,5:1 bis 1:1,5.
- Durch die Beladung des Trägerproteins mit einer limitierten Anzahl an Wirkstoffmolekülen bleibt das Trägerprotein in der nativen Form.
- Bei der Umsetzung des Wirkstoff-Aktivesters mit dem Trägerprotein erfolgt eine Kopplung über die Estergruppe des Aktivesters und die ε-Aminogruppen von im Trägerprotein enthaltenen Lysinen.
- Im Gegensatz zu bisher eingesetzten Kopplungstechniken kann erfindungsgemäß ein Enantiomeren-reines Wirkstoff-Trägerprotein-Konjugat erhalten werden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb ein Enantiomeren-reines Wirkstoff-Trägerprotein-Konjugat, insbesondere ein MTX-HSA-Konjugat, ein AMPT-HSA-Konjugat, ein MTX-PG 2-4-HSA-Konjugat sowie ein AMPT-PG 2-4-HSA-Konjugat.
- Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die bei der Umsetzung gebildeten Nebenprodukte wasserlöslich sind und somit problemlos und insbesondere ohne die Notwendigkeit, organische Lösungsmittel einsetzen zu müssen, vom gewünschten Produkt abgetrennt werden können.
- Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
- Esterbildung
-
- KIT - Herstellung von MTX - HSA
- Durch Umsetzen von MTX mit HOBt/HBTU wird der MTX-Aktivester hergestellt. Dieser wird gereinigt (z.B. über HPLC oder Umkristallisation) und kann als isolierter Feststoff z.B. einem Apotheker angeliefert werden. Dieser macht eine, der benötigten Dosis entsprechende, Einwaage. Diese Einwaage des MTX-Aktivesters wird in DMSO gelöst und im Mol.-Verhältnis 1/100 (Ester/Protein) in eine wässrige, z.B. HSA, Lösung eingebracht. Durch Kopplung des MTX-Aktivesters an das HSA wird ein MTX-HSA-Konjugat hergestellt. Danach wird das gebildete MTX-HSA-Konjugat über einen Hepalbin-Adsorber-Filter (Fa. Albutec) oder ein vergleichbares Ultrafiltrationssystem gereinigt und das HOBt / MTX (aus der Hydrolyse des Esters) abgetrennt.
- Die Sterilfiltration des HSA-Konjugates erfolgt über einen 0.2 µm Filter, welcher z.B. im Hepalbin-Adsorber-Filtersystem (Fa. Albutec) enthalten ist.
- Das MTX-HSA-Konjugat kann dann in patientengerechter Dosierung verabreicht werden.
- Die am Beispiel von MTX gezeigte Reaktion verläuft sehr schnell und die Nebenprodukte sind wasserlöslich. Der stabile Ester reagiert mit den ε-Aminogruppen von Lysinen im Protein, z.B. HSA.
- ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
- Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
- Zitierte Patentliteratur
-
- DE 4122210 A1 [0002, 0003]
- WO 9632133 [0002]
Claims (12)
- Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoff-Trägerprotein-Konjugats umfassend die Schritte: i) Bereitstellen eines Wirkstoffes, welcher wenigstens eine Carboxylgruppe enthält, ii) Umsetzen des Carboxylgruppen-haltigen Wirkstoffes mit einem Kopplungsreagenz ausgewählt aus Phosphoniumsalzen, Aminiumsalzen, Hydroxybenzotriazolen und/oder Uroniumsalzen, wobei ein Wirkstoff-Aktivester gebildet wird und, iii) Koppeln des Wirkstoff-Aktivesters an ein Trägerprotein.
- Verfahren nach
Anspruch 1 zur Herstellung eines Wirkstoff-Trägerprotein-Konjugats umfassend die Schritte: i) Bereitstellen eines Wirkstoffes, welcher wenigstens eine Carboxylgruppe enthält, ii) Umsetzen des Carboxylgruppen-haltigen Wirkstoffes mit einem Kopplungsreagenz ausgewählt aus 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HATU), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HBTU), (Benzotriazolyloxytris [dimethylamino]-phosphoniumhexafluor-phosphat) (BOP) oder/und (1-[(1-(Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidenaminooxy)-dimethylamino-morpholino)]uronium-hexafluorphosphat) (COMU), wobei ein Wirkstoff-Aktivester gebildet wird und iii) Koppeln des Wirkstoff-Aktivesters an ein Trägerprotein. - Verfahren nach
Anspruch 1 oder2 , dadurch gekennzeichnet, dass 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) /2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HBTU), O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HATU), (Benzotriazolyloxytris [dimethylamino]-phosphoniumhexafluor-phosphat) (BOP) oder (1-[(1-(Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidenaminooxy)-dimethylamino-morpholino)]uronium-hexafluorphosphat) (COMU) als alleiniges Kopplungsreagenz verwendet wird. - Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in Abwesenheit von Carbodiimiden durchgeführt wird.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Wirkstoff um ein Zytostatikum oder um ein Antirheumatikum handelt.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff ausgewählt wird aus Methotrexat (MTX), Amethoptherin (AMPT), Methotrexat-Polyglutamat (MTX-PG 2-4) und Amethoptherin-Polyglutamat (AMPT-PG 2-4).
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Trägerprotein Serumalbumin, insbesondere humanes Serumalbumin (HSA), und bevorzugt rekombinantes humanes Serumalbumin (rHSA) eingesetzt wird.
- Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Molverhältnis von Wirkstoff zu Trägerprotein 1:10 bis 10:1 beträgt.
- Enantiomeren-reines Wirkstoff-Trägerprotein-Konjugat, erhältlich mit einem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
- Kit, umfassend i) einen Wirkstoff-Aktivester, gebildet durch Umsetzen eines Carboxylgruppen-haltigen Wirkstoffs mit einem Kopplungsreagenz ausgewählt aus Phosphoniumsalzen, Aminiumsalzen, Hydroxybenzotriazolen und/oder Uroniumsalzen und ii) ein Trägerprotein.
- Kit nach
Anspruch 10 , umfassend i) einen Wirkstoff-Aktivester, gebildet durch Umsetzen eines Carboxylgruppen-haltigen Wirkstoffs mit einem Kopplungsreagenz ausgewählt aus 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HATU) und 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HBTU), (Benzotriazolyloxytris [dimethylamino]-phosphoniumhexafluor-phosphat) (BOP) oder/und (1-[(1-(Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidenaminooxy)-dimethylamino-morpholino)]uronium-hexafluorphosphat) (COMU), und ii) ein Trägerprotein. - Kit nach
Anspruch 10 oder11 , umfassend humanes Serumalbumin als Trägerprotein.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN112704741A (zh) * | 2021-01-09 | 2021-04-27 | 重庆医科大学 | 一种血清白蛋白-非甾体抗炎药纳米制剂的制备与应用 |
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| WO1996032133A2 (de) | 1995-04-13 | 1996-10-17 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Konjugat zur behandlung von entzündungs-, infektions- und/oder hauterkrankungen |
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-
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