DE60032255T2

DE60032255T2 - Polymer-stabilisierte neuropeptide

Info

Publication number: DE60032255T2
Application number: DE60032255T
Authority: DE
Inventors: David Michael Huntsville BENTLEY; James Michael Madison ROBERTS
Original assignee: Nektar Therapeutics AL Corp
Current assignee: Nektar Therapeutics
Priority date: 1999-10-04
Filing date: 2000-10-04
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2020-10-05
Also published as: US8008435B2; WO2001024831A3; US20030139346A1; CA2385533C; WO2001024831A9; AU782298B2; AU1631201A; ATE347377T1; KR100619612B1; US20030144207A1; MXPA02003176A; EP1221975B1; CA2385533A1; US20040038899A1; JP2003511357A; EP1221975A2; US8440623B2; US20020013266A1; US20110257106A1; WO2001024831A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Konjugat zwischen einem Peptid und Polyethylenglycol oder einem im Wesentlichen substituierbaren Polymer sowie ein Verfahren zu dessen Verwendung.
Hintergrund der Erfindung
Im letzten Jahrzehnt gab es wesentliche Fortschritte bei der Entdeckung und der Entwicklung von möglichen Neuropharmaka (Kleinmoleküle, Peptide, Proteine und Antisense-Moleküle) zur Behandlung von Schmerzen und von Störungen des Gehirns wie z. B. der Alzheimer- und der Parkinson-Krankheit. Die systemische Lieferung von vielen neu entdeckten Neuropharmaka ist jedoch durch das Fehlen eines wirksamen Systems zu ihrer Lieferung behindert worden. Die intravenöse Injektion ist üblicherweise auf Grund eines unzureichenden Transports durch die Barriere zwischen dem Gehirn und der Blutversorgung (der „Blut-Hirn-Schranke" oder „BHS") unwirksam. Die Blut-Hirn-Schranke ist eine durchgehende physikalische Barriere, die das zentrale Nervensystem, d. h. das Gehirngewebe, von dem allgemeinen Blutkreislauf eines Tiers trennt. Die Barriere ist aus mikrovaskulären Endothelzellen aufgebaut, die durch komplizierte und enge intrazelluläre Verbindungen miteinander verbunden sind. Diese Barriere erlaubt den selektiven Austausch von Molekülen zwischen dem Gehirn und dem Blut, wobei sie das Eintreten von vielen hydrophilen Arzneistoffen und Peptiden in das Gehirn verhindert. Viele der neuen wirkungsstarken neuroaktiven pharmazeutischen Substanzen durchdringen die BHS nicht, da sie ein Molekulargewicht von über 500 Dalton aufweisen und hydrophil sind. Nicht-lipophile Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 500 Dalton durchdringen allgemein die BHS nicht.
Es sind mehrere Strategien zum Liefern von nicht-lipophilen Arzneistoffen mit hohem Molekulargewicht an das Gehirn entwickelt worden, umfassend die intrazerebroventrikuläre Infusion, die Transplantation von genetisch veränderten Zellen, die die neuroaktive Verbindung sekretieren, und die Implantation einer Polymermatrix, die die pharmazeutische Substanz enthält; siehe Pardridge, W. M., J. Controlled Rel. (1996) 39: 281–286. Alle diese Strategien sind jedoch mit invasiven chirurgischen Verfahren verbunden, die zu einer Vielzahl von Komplikationen führen können.
Es sind vier nicht-chirurgische Transportmechanismen zum Durchdringen der BHS bestimmt worden, umfassend: (i) Transmembrandiffusion, (ii) rezeptorvermittelten Transport, (iii) absorptionsvermittelte Endozytose, und (iv) trägervermittelten Transport; siehe Brownless et al., J. Neurochemistry (1993) 60(3): 793–803. Die vaskuläre Durchlässigkeit kann durch Öffnen der engen Verbindungen durch hyperosmotische Saccharidlösungen und Analoga von Bradykinin erhöht werden. Dieses Verfahren trägt jedoch das Problem, dass unerwünschte Verbindungen im allgemeinen Blutkreislauf durch die künstlich vergrößerten Öffnungen der Blut-Hirn-Schranke in das Gehirn eindringen können.
Es ist entdeckt worden, dass Kapillar-Endothelzellen in der Blut-Hirn-Schranke einen hohen Pegel an Rezeptoren für Transferrin, Insulin, die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren I und II, Lipoprotein mit geringer Dichte und den atrialen natriuretischen Faktor aufweisen; siehe Friden, P. M., J. Controlled Rel. (1996) 46: 117–128. Das an Friden erteilte US-Patent Nr. 5,833,988 beschreibt ein Verfahren zum Liefern eines neuropharmazeutischen oder diagnostischen Mittels durch die Blut-Hirn-Schranke unter Verwendung eines Antikörpers gegen den Transferrinrezeptor. Dabei wird ein Nervenwachstums-Faktor oder ein neurotropher Faktor an einen Transferrinrezeptor-spezifischen Antikörper konjugiert. Das so erhaltene Konjugat wird an ein Tier verabreicht und kann die Blut-Hirn-Schranke zu dem Gehirn des Tiers durchdringen.
Das an Pardridge et al. erteilte US-Patent Nr. 4,902,505 beschreibt die Verwendung von chimären Peptiden zum Liefern von Neuropeptiden durch die Blut-Hirn-Schranke. Dabei wird ein rezeptorspezifisches Peptid verwendet, um ein neuroaktives hydrophiles Peptid durch die BHS zu tragen. Die offenbarten Trägerproteine, welche die BHS durch rezeptorvermittelte Transzytose durchdringen können, umfassen Histon, Insulin, Transferrin, den insulinähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF-I), den insulinähnlichen Wachstumsfaktor II (IGF-II), basisches Albumin und Prolactin. Das an Fukuta et al. erteilte US-Patent Nr. 5,442,043 beschreibt die Verwendung eines Insulinfragments als Träger bei einem chimären Peptid zum Transportieren eines Neuropeptids durch die Blut-Hirn-Schranke.
Nicht-invasive Ansätze zum Liefern von neuropharmazeutischen Wirkstoffen durch die BHS sind typischerweise weniger wirkungsvoll als die invasiven Verfahren, um den Wirkstoff tatsächlich in das Gehirn zu bringen. Bei den chimären Peptiden sind hohe Dosen notwendig, um die erwünschte therapeutische Wirkung zu erzielen, da sie einem Abbau unterliegen. Die Konzentration der chimären Peptide im Blutkreislauf kann durch Proteolyse schnell verringert werden. Ein wässriges Liefersystem ist zum Liefern von hydrophoben Arzneistoffen allgemein unwirksam.
Ein weiteres Verfahren zum Liefern von hydrophilen Verbindungen in das Gehirn durch rezeptorvermittelte Transzytose wird von Pardridge et al. in Pharm. Res. (1998) 15(4): 576–582 beschrieben. Dabei wird ein mit Streptavidin modifizierter monoclonaler Antikörper für den Transferrinrezeptor (OX26-MAk) verwendet, um das kationische Protein von Gehirn stammender neurotropher Faktor (BDNF) durch die BHS zu transportieren. Zunächst wird der BDNF mit PEG²⁰⁰⁰-Biotin modifiziert, um BDNF-PEG²⁰⁰⁰-Biotin herzustellen, das anschließend an den Streptavidin-modifizierten Antikörper OX26-MAk gebunden wird. Es ist gezeigt worden, dass das so erhaltene Konjugat durch die BHS in das Gehirn dringen kann.
Das Verlängern der Dauer von antinozizeptiven Wirkungen bei Tieren kann zu einer weniger häufigen Verabreichung von Analgetika führen, wodurch die Patientenzustimmung verbessert werden kann und mögliche Nebenwirkungen verringert werden können. Maeda et al. zeigen in Chem. Pharm. Bull. (1993) 41(11): 2053–2054, Biol. Pharm. Bull. (1994) 17(6): 823–825 und Chem. Pharm. Bull. (1994) 42(9): 1859–1863, dass sie durch Anfügen von Polyethylenglycolamin 4000 an das C-terminale Leucin von Leu-Enkephalin (von dem für die Antinozizeption benötigten Tyrosinrest entfernt gelegen) die Wirkungsstärke und die Wirkungsdauer von Leu-Enkephalin verbessern konnten, wenn es durch intrazerebroventrikuläre Injektion direkt in das Gehirn verabreicht wurde.
Im Fachgebiet besteht Bedarf daran, neuroaktive Wirkstoffe aus dem systemischen Kreislauf durch die Blut-Hirn-Schranke in das Gehirn zu liefern, wobei einige der Nachteile und ungünstigen Umstände, die mit dem Stand der Technik verbunden sind, verringert oder beseitigt werden.
Konjugate von Peptiden mit nicht-antigenen Polymeren an vorbestimmten Stellen sind in WO-A1 9500162 beschrieben worden. Das US-Patent Nr. 5,932,462 beschreibt mehrarmige, monofunktionelle hydrolysestabile Polymere zum Befestigen an biologisch aktive Moleküle wie z. B. Proteine. Weitere Konjugate werden im US-Patent Nr. 5,681,811 beschrieben, wobei sie jedoch eine lipophile Einheit als integralen Bestandteil umfassen.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Liefern eines Peptids in das Gehirn eines Menschen oder eines anderen Tiers durch die Blut-Him-Schranke bereit. Das zu liefernde Peptid wird an ein wasserlösliches nicht-peptidartiges Polymer gebunden, um ein Konjugat zu bilden. Das Konjugat wird dann dem Tier in den Blutkreislauf verabreicht, so dass das Konjugat die Blut-Hirn-Schranke passiert und in das Gehirn gelangt. Das wasserlösliche nicht-peptidartige Polymer kann aus der Gruppe, bestehend aus Polyethylenglycol und Copolymeren von Polyethylenglycol und Polypropylenglycol, die zum Konjugieren durch kovalentes Binden an das Peptid aktiviert wird, ausgewählt werden.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird ein im Wesentlichen hydrophiles Konjugat bereitgestellt, bei dem ein transportierbares analgetisches Peptid, d. h. ein analgetisches Peptid, das die Blut-Hirn-Schranke passieren kann, an ein wasserlösliches nicht-peptidartiges Polymer wie z. B. Polyethylenglycol kovalent gebunden ist. Das Konjugat kann die Blut-Hirn-Schranke eines Tiers passieren.
Geeignete transportierbare Peptide zur Verwendung bei dieser Ausführungsform der Erfindung können Dynorphine, Enkephaline, Endorphine, Endomorphine und Biphalin umfassen. Typischerweise sind diese kleinen Neuropeptide gegen einen Abbau im Körper, der im Blutkreislauf und im Gehirn stattfindet, empfindlich. Im Gegensatz dazu zeigen diese Peptide eine wesentlich erhöhte Stabilität, wenn sie an Polyethylenglycol oder an ein ähnliches nicht-peptidartiges, nicht-immunogenes wasserlösliches Polymer mit ähnlichen Eigenschaften konjugiert sind.
Bei einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die ein wie vorstehend beschriebenes Konjugat gemäß dieser Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Die Zusammensetzung kann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren direkt in den allgemeinen Kreislauf eines Tiers verabreicht werden, wie z. B. durch parenterale Injektion, Injektion in eine intrazerebrale Vene sowie intranasale, pulmonare, okulare und bukkale Verabreichung.
Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Verfahren zum Liefern eines analgetischen Peptids durch die Blut-Hirn-Schranke in das Gehirn eines Tiers bereitgestellt. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen eines wie vorstehend beschriebenen Konjugats gemäß dieser Erfindung und das Verabreichen des Konjugats in den Blutstrom des Wirtstiers.
Früher dachte man, dass große hydrophile Polymere wie z. B. Polyethylenglycol, die an ein Peptid, das die Blut-Hirn-Schranke durchdringen kann, gebunden sind, den Transport des Peptids durch die Blut-Hirn-Schranke beeinträchtigen würden. Insbesondere wurde angenommen, dass ein direktes Konjugieren von großen hydrophilen Polymeren an ein Peptid nicht nur die Hydrophilie erhöhen würde, sondern auch die Wechselwirkung zwischen dem Peptid und seinem Rezeptor oder anderen Strukturen in der BHS durch sterische Störungen durch die großen Polymerketten verschlechtern würde.
Es ist nun entdeckt worden, dass das Konjugat die Blut-Hirn-Schranke eines Tiers trotzdem passieren kann, obwohl das Konjugat im Wesentlichen hydrophil ist und ein wasserlösliches und nicht-peptidartiges Polymer umfasst. Im Vergleich zu ihrem nativen Zustand können Peptide, die an ein wasserlösliches und nicht-peptidartiges Polymer konjugiert sind, eine verringerte Immunogenität, eine verbesserte Wasserlöslichkeit und eine verbesserte Stabilität aufweisen. Insbesondere weisen Peptide, die gemäß dieser Erfindung an Polyethylenglycol konjugiert sind, eine längere Zirkulationszeit und eine verringerte Empfindlichkeit gegen metabolischen Abbau und metabolische Beseitigung auf, wobei sie nach der Lieferung in das Gehirn durch die Blut-Hirn-Schranke eine längere Lebensdauer im Gehirn aufweisen. Somit ermöglicht diese Erfindung das wirkungsvolle Liefern von analgetischen Peptiden in das Gehirn des Menschen und von anderen Tieren, wobei die Wirkungsamkeit der gelieferten Peptide wesentlich verbessert werden kann.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie hier verwendet, bedeutet „Passieren der Blut-Hirn-Schranke" oder „Durchdringen der Blut-Hirn-Schranke", dass nach der Verabreichung in den Blutkreislauf eines Tiers bei einer physiologisch verträglichen, üblichen Dosierung ein Konjugat oder ein Peptid die Blut-Hirn-Schranke des Tiers zu einem solchen Maß passieren kann, dass eine ausreichende Menge des Konjugats oder Peptids in das Gehirn des Tiers geliefert wird, um eine therapeutische, antinozizeptive oder prophylaktische Wirkung auf das Gehirn auszuüben oder um die biologische Funktion des Gehirns zu einem nachweisbaren Grad zu beeinflussen. „Passieren der Blut-Hirn-Schranke" oder „Durchdringen der Blut-Hirn-Schranke" kann hier auch mit der Bedeutung verwendet werden, dass das Konjugat oder Peptid von einem Tiergehirn zu einem Maß aufgenommen werden kann, das durch ein im Fachgebiet bekanntes Verfahren nachweisbar ist, beispielsweise durch die von Williams et al., J. Neurochem., 66(3), Seiten 1289–1299, 1996, beschriebene in situ-Hirnperfusion.
Das Konjugat gemäß dieser Erfindung ist üblicherweise im Wesentlichen hydrophil. Der Begriff „im Wesentlichen hydrophil" soll bedeuten, dass das Konjugat gemäß dieser Erfindung keine wesentlich lipophile Einheit wie Fettsäuren oder Glycolipide enthält. Fettsäuren und Glycolipide werden im Fachgebiet zum Erhöhen der Lipophilie eines Moleküls verwendet, um die Fähigkeit des Moleküls zum Passieren von Zellmembranen zu erhöhen.
Der Begriff „analgetisch", wie er hier verwendet wird, bezeichnet alle chemischen Stoffe, die zum Liefern in das Gehirn von Menschen oder anderen Tieren zum Zweck des Linderns, Abschwächen oder Vorbeugens von Schmerz bei Menschen oder anderen Tieren oder zum anderweitigen Verbessern des körperlichen oder geistigen Wohlbefindens bei Menschen oder Tieren wünschenswert sind. Analgetische Peptide können in das Gehirn von Tieren eingeführt werden, um eine therapeutische, antinozizeptive oder prophylaktische Wirkung auf die biologischen Funktionen des Tiergehirns auszuüben, und können zur Behandlung oder Vorbeugung von Schmerz verwendet werden.
Es können auch Wirkstoffe, die typischerweise nicht als „analgetisch" angesehen werden, an das Peptid-Polymer-Konjugat gemäß der Erfindung gebunden werden. Beispielsweise können diagnostische oder bildgebende Mittel an das Konjugat gebunden werden. Fluoroscein, Proteine oder andere Arten von Wirkstoffen, die spezifisch auf eine bestimmte Art von Zelle oder Protein gerichtet sind, wie z. B. monoclonale Antikörper, können alle bei dem Konjugat gemäß dieser Erfindung für diagnostische oder bildgebende Zwecke verwendet werden.
Wie nachstehend beschrieben wird, wird üblicherweise, wenn ein Wirkstoff die Blut-Hirn-Schranke nicht passieren kann, d. h. wenn er also nicht durch die BHS transportierbar ist, ein Peptid, das die Blut-Hirn-Schranke passieren kann, d. h. das also durch die BHS transportierbar ist, als Träger bei einem Konjugat gemäß dieser Erfindung verwendet.
Bei einer Ausführungsform dieser Erfindung ist das Peptid ein transportierbares analgetisches Peptid. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „transportierbar", dass das Peptid die Blut-Hirn-Schranke eines Tiers, wie vorstehend definiert, durchdringen kann. Somit wird ein Konjugat bereitgestellt, das ein transportierbares Peptid umfasst, welches an ein wasserlösliches, nicht-peptidartiges, nicht-immunogenes Polymer, umfassend Polyethylenglycol, gebunden ist.
Der Begriff „Peptid" bezeichnet jede polymerisierte Sequenz von α-Aminosäuren, die aus 2 bis etwa 40 Aminosäuren mit einer Peptidbindung (-CO-NH-) zwischen jeder Aminosäure besteht und den Zustand und die biologische Funktion des Gehirns eines Tiers beeinflussen kann. Bei einem analgetischen Peptid handelt es sich üblicherweise um ein endogenes Peptid, das in einem Tier natürlich vorkommt, oder um Fragmente oder Analoga davon. Es werden jedoch auch nicht-endogene Peptide, die den Zustand und die biologischen Funktionen eines Tiergehirns beeinflussen können, umfasst.
Von vielen Peptiden im Stand der Technik wird angenommen, dass sie die Blut-Hirn-Schranke passieren können. Beispiele von transportierbaren Peptiden, von denen angenommen wird, dass sie nach einer PEGylierung gemäß der Erfindung die Blut-Hirn-Schranke durchdringen können, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Biphalin- und Opioidpeptide wie z. B. Dynorphine, Enkephaline, Endorphine, Endomorphine und so weiter. Bei der Ausführung der Erfindung können auch viele Derivate und Analoga dieser transportierbaren Peptide verwendet werden.
Es wird angenommen, dass Opioidpeptide bei der Ausführung der Erfindung besonders geeignet sind. Opioidpeptide zeigen eine Vielzahl von pharmakologischen Wirkungen, umfassend Schmerzlinderung und Analgesie.
Enkephalin ist ein Pentapeptid mit der Aminosäuresequenz H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH (Methionin-Enkephalin) oder H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH (Leucin-Enkephalin). Es sind zahlreiche Enkephalin-Analoga identifiziert und synthetisiert worden, die für verschiedene Arten von Opiatrezeptoren spezifisch sind; siehe beispielsweise Hruby und Gehrig (1989) Medicinal Research Reviews, 9(3): 343–401. Beispielsweise beschreibt das US-Patent Nr. 4,518,711 mehrere Enkephalin-Analoga, umfassend DPDPE [D-Pen², D-Pen⁵]-Enkephalin, bei dem es sich um ein cyclisches Enkephalin-Analogon handelt, das durch Substituieren des zweiten und des fünften Aminosäurerests des natürlichen Pentapeptids entweder durch Cystein oder durch D- oder L-Penicillamin (beta,beta-Dimethylcystein) und Verknüpfen der beiden Positionen durch eine Disulfidbindung hergestellt worden ist. Es ist gezeigt worden, dass DPDPE die Blut-Hirn-Schranke in das Gehirn passieren kann; siehe beispielsweise Williams et al. (1996) Journal of Neurochemistry, 66(3): 1289–1299. Das US-Patent Nr. 5,326,751 beschreibt DPADPE, das durch Substituieren des Glycinrests an der dritten Position von DPDPE durch einen Alaninrest hergestellt worden ist.
Andere Enkephalin-Analoga umfassen Biphalin (H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-NH-)₂, das ein synthetisches Analogon von Enkephalin ist und ein dimerisiertes Tetramer darstellt, das durch Koppeln von zwei Einheiten mit der Formel H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-OH am C-Terminus mit Hydrazin hergestellt worden ist. Die Dimerform von Enkephalin verbessert die Affinität und die Spezifität für den delta-Opioidrezeptor. Dimere Enkephalin-Analoga werden von Rodbard et al. im US-Patent Nr. 4,468,383 offenbart.
Die Dynorphine bilden eine weitere Klasse von Opioidpeptiden. Das natürlich isolierte Dynorphin weist 17 Aminosäuren auf. Viele Dynorphinfragmente und Analoga sind im Fachgebiet vorgeschlagen worden, umfassend beispielsweise Dynorphin(1–10), Dynorphin(1–13), Dynorphin(1–13)amid, [D-Pro¹⁰]-Dynorphin(1–11) (DPDYN), Dynorphinamid-Analoga und so weiter; siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 4,684,624, 4,62,941 und 5,017,689. Obwohl solche analgetische Peptide durch die Blut-Hirn-Schranke dringen können, weisen viele von ihnen wegen ihrer Anfälligkeit für einen biologischen Abbau im Körper eine sehr kurze Halbwertszeit auf.
Obwohl Polyethylenglycol üblicherweise ein hohes Molekulargewicht aufweist und hydrophil ist, beeinträchtigt das Konjugieren an die transportierbaren Peptide bei Abwesenheit einer lipophilen Einheit die Transportierbarkeit der Peptide nicht. Die konjugierten Peptide behalten die Fähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu durchdringen. Typischerweise wird das Konjugat gemäß der Erfindung, das ein transportierbares Peptid an Polyethylenglycol oder ein gleichwertiges Polymer gebunden umfasst, nach der Verabreichung in den allgemeinen Kreislauf eines Tiers von dem Gehirn mit einem viel größeren Prozentsatz aufgenommen als eine unkonjugierte Form des Peptids. Die Peptide in den Konjugaten gemäß dieser Erfindung weisen eine erhöhte Stabilität auf und zeigen eine längere Halbwertszeit im Körper.
Bei einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Konjugat bereitgestellt, das ein erstes Peptid, bei dem es sich um ein transportierbares Peptid handelt, und einen zweiten neuroaktiven Wirkstoff umfasst, die durch Polyethylenglycol oder ein gleichwertiges Polymer aneinander gebunden sind. Dieser zweite neuroaktive Wirkstoff kann oder kann nicht fähig sein, für sich allein die Blut-Hirn-Schranke zu durchdringen. Das transportierbare Peptid wird als Träger zum Transportieren eines nicht-transportierbaren neuroaktiven Wirkstoffs durch die Blut-Hirn-Schranke in das Gehirn eines Tiers verwendet. Das verknüpfende Polymer dient nicht nur als eine Verknüpfungseinheit, sondern es erhöht auch die Löslichkeit und die Stabilität des Konjugats und verringert die Immunogenität sowohl des Neuropeptids als auch des anderen zu liefernden neuroaktiven Wirkstoffs.
Gemäß der Erfindung sind das transportierbare Peptid und gegebenenfalls ein weiterer wie vorstehend beschriebener neuroaktiver Wirkstoff kovalent an ein wasserlösliches nicht-peptidartiges Polymer gebunden, um ein Konjugat gemäß dieser Erfindung zu bilden. Die wasserlöslichen nicht-peptidartigen Polymere, die zur Verwendung bei verschiedenen Ausführungsformen dieser Erfindung geeignet sind, umfassen Polyethylenglycol, andere Polyalkylenglycole und Copolymere von Polyethylenglycol und Polypropylenglycol.
Wie hier verwendet, ist der Begriff Polyethylenglycol („PEG") umfassend und bezeichnet jedes aus einer Reihe von Polymeren der allgemeinen Formel: HO-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH wobei n im Bereich von etwa 10 bis 2.000 liegt. PEG bezeichnet auch die Struktureinheit: -CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂- wobei n im Bereich von etwa 10 bis 2.000 liegt. Daher bezeichnet PEG auch modifizierte PEG, umfassend Methoxy-PEG; PEG mit wenigstens einer von einer Hydroxygruppe verschiedenen endständigen Gruppe, die mit einer anderen Einheit reaktiv ist; verzweigte PEG; anhängende PEG; gegabelte PEG; und dergleichen.
Das bei der Ausführung dieser Erfindung verwendbare Polyethylenglycol weist üblicherweise ein mittleres Molekulargewicht von etwa 200 bis 100.000 Dalton auf. Molekulargewichte von etwa 200 bis 10.000 werden jedoch etwas häufiger verwendet. Molekulargewichte von etwa 300 bis 8.000, insbesondere von etwa 500 bis etwa 5.000 Dalton, sind einigermaßen typisch.
PEG ist bei biologischen Anwendungen nützlich, da es sehr erwünschte Eigenschaften aufweist, und es wird für biologische und biotechnologische Anwendungen allgemein anerkannt. PEG ist typischerweise klar, farblos, geruchlos, wasserlöslich, hitzestabil, gegen viele chemische Mittel inert, es hydrolysiert oder verdirbt nicht und es ist allgemein nicht-toxisch. Poly(ethylenglycol) wird als biologisch verträglich angesehen, was bedeutet, dass PEG mit lebenden Geweben oder Organismen coexistieren kann, ohne Schaden zu verursachen. Genauer gesagt wird PEG für sich selbst üblicherweise als nicht-immunogen angesehen, was bedeutet, dass PEG nicht zum Erzeugen einer Immunantwort im Körper neigt. Um immunogene Wirkungen zu vermeiden, sollten wünschenswerte endständige aktivierende Gruppen, durch die PEG an verschiedene Peptide gebunden werden kann, die nicht-immunogene Eigenschaft des PEG nicht nennenswert verändern. Wünschenswerte PEG-Konjugate neigen nicht zum Erzeugen einer wesentlichen Immunantwort oder zum Verursachen von Gerinnung oder anderen unerwünschten Wirkungen.
Bei PEG handelt es sich um ein stark hydratisiertes Polymer mit Zufallsknäuelung, das Proteine oder Peptide von einem enzymatischen Abbau und von Molekülen und Zellen des Immunsystems abschirmen kann und das das hydrodynamische Volumen zum Verlangsamen der Beseitigung durch das retikuloendotheliale System (RES) erhöhen kann. PEG ist ein nützliches Polymer mit den Eigenschaften der Wasserlöslichkeit und der Löslichkeit in vielen organischen Lösungsmitteln. Die einzigartigen Löslichkeitseigenschaften von PEG ermöglichen das Konjugieren (PEGylieren) an bestimmte Verbindungen mit geringer wässriger Löslichkeit, wobei das so erhaltene Konjugat wasserlöslich ist. Die PEGylierung, bei der es sich um das Konjugieren eines PEG-Moleküls an ein anderes Molekül handelt, ist jedoch nicht ohne Schwierigkeiten. Die Wirkungen eines bestimmten PEG-Derivats sind trotzdem nicht immer vorhersehbar. Das Ergebnis hängt von der spezifischen Wechselwirkung zwischen einer bestimmten Verbindung und dem funktionellen nicht-peptidartigen PEG-Polymer ab.
Das bei dieser Erfindung verwendete Polymer kann üblicherweise unverzweigt oder verzweigt sein. Verzweigte Polymergerüste sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Typischerweise weist ein verzweigtes Polymer eine zentrale Kerneinheit und eine Vielzahl von unverzweigten Polymerketten, die an den zentralen Kern gebunden sind, auf. PEG wird gewöhnlich in verzweigten Formen verwendet, die durch Zusetzen von Ethylenoxid zu verschiedenen Polyolen, wie z. B. Glycerin, Pentaerythrit und Sorbit, hergestellt werden können. Als Beispiel ist nachstehend das aus Pentaerythrit hergestellte vierarmig verzweigte PEG gezeigt: C(CH₂-OH)₄ + nC₂H₄O → C[CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH]₄
Die zentrale Einheit kann auch aus verschiedenen Aminosäuren abgeleitet werden. Ein Beispiel dafür ist Lysin.
Die verzweigten Polyethylenglycole können in allgemeiner Form als R(-PEG-OH)_n dargestellt werden, wobei R die Kerneinheit darstellt, wie z. B. Glycerin oder Pentaerythrit, und n die Anzahl der Arme darstellt. Geeignete verzweigte PEG können gemäß dem US-Patent Nr. 5,932,462 hergestellt werden. Diese verzweigten PEG können dann gemäß den hier vorliegenden Lehren verwendet werden.
Gegabelte PEG und verwandte Polymere sollten ebenfalls bei der Ausführung der Erfindung von Nutzen sein. Der Begriff „gegabelt" wird zur Beschreibung von PEG verwendet, die an wenigstens einem ihrer Enden verzweigt sind. Das Polymer weist eine verzweigte Einheit an einem Ende der Polymerkette und zwei freie reaktive Gruppen zum kovalenten Binden an ein anderes Molekül auf, eine an jedem Ende der verzweigten Einheit. Jede reaktive Einheit kann eine verknüpfende Gruppe aufweisen, beispielsweise eine Alkylkette, die eine reaktive Gruppe mit der verzweigten Einheit verknüpft. Somit ermöglicht das verzweigte Ende das Umsetzen des Polymers mit zwei Molekülen, um Konjugate zu bilden. Gegabelte PEG und verwandte gegabelte Polymere werden in der ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung Seriennummer 09/265,989 des gleichen Anmelders, die am 11. März 1999 eingereicht wurde und den Titel „Poly(ethylene glycol) Derivatives with Proximal Reactive Groups" trägt, beschrieben. Die gegabelten PEG können entweder unverzweigt oder an dem Rückgrat, das an das verzweigte Ende gebunden ist, verzweigt sein.
Bei der Ausführung der Erfindung sollten auch wasserlösliche, im Wesentlichen nicht-immunogene, nicht-peptidartige und von PEG verschiedene Polymere geeignet sein, wenn auch nicht notwendigerweise mit gleichwertigen Ergebnissen. Diese anderen Polymere können sowohl in unverzweigter Form als auch in verzweigter Form vorliegen und umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, andere Poly(alkylenoxide), umfassend Copolymere von Ethylenglycol und Propylenglycol, und dergleichen. Beispiele von Polymeren sind im US-Patent Nr. 5,990,237 aufgeführt. Bei den Polymeren kann es sich um geradkettige oder verzweigte Homopolymere oder Zufalls- oder Blockcopolymere und Terpolymere auf der Basis der Monomere der vorstehend genannten Polymere handeln.
Spezielle Beispiele von geeigneten zusätzlichen Polymeren umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Poly(acryloylmorpholin) („PAcM"), Poly(vinylpyrrolidon) („PVP") und Poly(oxazolin). PVP und Poly(oxazolin) sind im Fachgebiet gut bekannte Polymere, und ihre Herstellung sollte dem Fachmann leicht möglich sein. PAcM und seine Synthese und Anwendung sind in den US-Patenten Nr. 5,629,384 und 5,631,322 beschrieben.
Um PEG an ein Peptid zu koppeln, beispielsweise an ein transportierbares Peptid, und so ein Konjugat gemäß dieser Erfindung zu bilden, ist es oft notwendig, das PEG zu „aktivieren", um ein Derivat des PEG mit einer reaktiven Gruppe am Ende zur Umsetzung mit bestimmten Einheiten an dem Peptid herzustellen. Viele aktivierte PEG-Derivate sind im Fachgebiet beschrieben worden und können bei dieser Erfindung verwendet werden, wenn auch nicht notwendigerweise mit gleichwertigen Ergebnissen. Ein Beispiel eines solchen aktivierten Derivats ist der Succinimidylsuccinat-„aktive Ester":
Der aktive Succinimidylester ist eine nützliche Verbindung, da er sich schnell mit Aminogruppen von Proteinen und anderen Molekülen umsetzt, um eine Amidverknüpfung (-CO-NH-) zu bilden. Beispielsweise beschreibt das an Davis et al. erteilte US-Patent Nr. 4,179,337 das Koppeln dieses Derivats an Proteine (dargestellt als PRO-NH₂): mPEG-O₂CCH₂CH₂CO₂NS + PRO-NH₂ → mPEG-O₂C-CH₂CH₂-CONH-PRO.
Andere im Fachgebiet bekannte aktivierte PEG-Moleküle umfassen PEG mit einer reaktiven Cyanursäurechlorid-Einheit, Succinimidylcarbonate von PEG, Phenylcarbonate von PEG, Imidazolylformiat-Derivate von PEG, PEG-Carboxymethylazid, PEG-Imidoester, PEG-Vinylsulfon, aktive Ethylsulfonderivate von PEG, Tresylate von PEG, PEG-Phenylglyoxal, mit einer Aldehydgruppe aktivierte PEG, PEG-Maleimide, PEG mit einer endständigen Aminoeinheit und andere. Diese Polyethylenglycol-Derivate und Verfahren zum Konjugieren solcher Derivate an einen Wirkstoff sind im Fachgebiet allgemein bekannt und werden von Zalipsky et al., Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycol)s for Modification of Polypeptides, in Use of Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Hrsg., Plenum Press, New York (1992), und von Zalipsky, Advanced Drug Reviews (1995) 16: 157–182, beschrieben.
Typischerweise führt das Konjugieren eines wasserlöslichen nicht-immunogenen Polymers an ein Peptid gemäß dieser Erfindung zum Entstehen einer Verknüpfung zwischen dem Polymer und dem Peptid. Der Begriff „Verknüpfung" wird hier verwendet, um Gruppen oder Bindungen zu bezeichnen, die üblicherweise als Ergebnis einer chemischen Umsetzung gebildet werden.
Kovalente Verknüpfungen, die bei der Ausführung dieser Erfindung gebildet werden, können hydrolysestabil sein. Die Verknüpfung kann in Wasser im Wesentlichen stabil sein und sich mit Wasser bei einem zweckmäßigen pH-Wert unter physiologischen Bedingungen über lange Zeiträume, vorzugsweise unbeschränkt, nicht umsetzen. Bei einer anderen Ausführungsform kann die kovalente Verknüpfung unter physiologischen Bedingungen durch Hydrolyse abbaubar sein, so dass der neuroaktive Wirkstoff von dem PEG in dem Körper eines Tiers freigesetzt werden kann, vorzugsweise nachdem es in das Gehirn des Tiers geliefert worden ist.
Der Ansatz, bei dem zu liefernde Arzneistoffe durch den Abbau von komplexen Wirkstoffen unter physiologischen Bedingungen freigesetzt werden, ist eine wirkungsvolle Komponente der Arzneistofflieferung; siehe R. B. Greenwald, Exp. Opin. Ther. Patents, 7(6): 601–609 (1997). Beispielsweise können Konjugate gemäß der Erfindung durch Binden von PEG an transportierbare Peptide und/oder neuroaktive Wirkstoffe unter Verwendung von Verknüpfungen, die bei physiologischen Bedingungen abbaubar sind, hergestellt werden. Die in vivo-Halbwertszeit eines Konjugats PEG-neuroaktiver Wirkstoff hängt von der Art der reaktiven Gruppe des PEG-Moleküls, die das PEG mit dem neuroaktiven Wirkstoff verknüpft, ab. Typischerweise hydrolysieren Esterverknüpfungen, die durch Umsetzen von PEG-Carbonsäuren oder aktivierten PEG-Carbonsäuren mit Alkoholgruppen an neuroaktiven Wirkstoffen hergestellt werden, unter physiologischen Bedingungen und setzen dabei den neuroaktiven Wirkstoff frei; siehe beispielsweise S. Zalipsky, Advanced Drug Delivery Reviews, 16: 157–182 (1995). Beispielsweise wird in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 96/23794 offenbart, dass Paclitaxel unter Verwendung von Esterverknüpfungen an PEG gebunden werden kann und dass das verknüpfte Paclitaxel durch Hydrolyse im Serum freigesetzt werden kann. Ferner wurde die Antimalaria-Wirkung von Dihydroartemisinin, das über eine hydrolysierbare Esterverknüpfung an PEG gebunden ist, gezeigt; siehe Bentley et al., Polymer Preprints, 38(1): 584 (1997). Andere Beispiele von geeigneten hydrolytisch instabilen Verknüpfungen umfassen Carboxylatester, Phosphatester, Disulfide, Acetale, Imine, Orthoester, Peptide und Oligonucleotide.
Typischerweise sollte die Abbaurate des Konjugats so kontrolliert werden, dass kein wesentlicher Abbau stattfindet, bis das Konjugat in das Gehirn eines Tiers eingedrungen ist. Viele Peptide unterliegen in ihrem nativen Zustand einem wesentlichen Abbau im Blutkreislauf und in Organen wie der Leber und den Nieren. Die hydrolytisch abbaubaren Verknüpfungen können so gebildet werden, dass die Halbwertszeit des Konjugats länger ist als die Zeit, die das Konjugat benötigt, um über den Kreislauf im Blutstrom die Blut-Hirn-Schranke zu erreichen. Dabei kann ein geringes Maß an Experimentieren nötig sein, um die geeignete hydrolytisch instabile Verknüpfung zwischen bestimmten neuroaktiven Wirkstoffen und PEG-Derivaten zu ermitteln, wobei dies zu den Fähigkeiten eines Fachmanns gehört, der die vorliegende Beschreibung kennt.
Die kovalente Verknüpfung zwischen einem Peptid und einem Polymer kann durch Umsetzen eines Polymerderivats wie z. B. eines aktivierten PEG mit einer aktiven Einheit an dem Peptid hergestellt werden. Mit einem Peptid können ein oder mehrere PEG-Moleküle verknüpft werden.
Umgekehrt können mehrere Peptide, umfassend transportierbare Peptide und/oder andere Arten von neuroaktiven Wirkstoffen, mit einem PEG-Molekül verknüpft werden. Typischerweise weist ein solches PEG-Molekül mehrere reaktive Einheiten zur Umsetzung mit dem Peptid und den neuroaktiven Wirkstoffen auf. Zu diesem Zweck können bifunktionelle PEG, anhängende PEG und dendritische PEG verwendet werden. Es sind auch reaktive PEG synthetisiert worden, bei denen mehrere aktive funktionelle Gruppen entlang des Rückgrats des Polymers angeordnet sind. Beispielsweise sind im Fachgebiet Lysin-PEG-Konjugate hergestellt worden, bei denen mehrere aktivierte Reste entlang des Polymergerüsts angeordnet sind. Zalipsky et al., Bioconjugate Chemistry (1993) 4: 54–62.
Bei einer Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Konjugat mit einer hantelförmigen Struktur bereitgestellt, wobei ein transportierbares Peptid oder ein anderer transportierbarer neuroaktiver Wirkstoff, der die Blut-Hirn-Schranke eines Tiers passieren kann, an ein Ende eines Polyethylenglycol-Moleküls kovalent gebunden ist und ein weiterer neuroaktiver Wirkstoff, der in das Gehirn eines Tiers geliefert werden soll, an das andere Ende des PEG-Moleküls gebunden ist. Bei diesem anderen neuroaktiven Wirkstoff kann es sich um ein transportierbares Peptid oder um einen beliebigen anderen neuroaktiven Wirkstoff handeln. Typischerweise ist er nicht transportierbar und kann für sich allein die Blut-Hirn-Schranke nicht passieren. Somit wirkt das transportierbare Peptid oder der andere Wirkstoff an einem Ende des PEG-Moleküls als Träger zum Liefern des nicht-transportierbaren neuroaktiven Wirkstoffs in das Gehirn. Zu diesem Zweck können bifunktionelle PEG, und zwar sowohl homobifunktionelle als auch heterobifunktionelle PEG, verwendet werden. Wie hier verwendet, bezeichnet „bifunktionelles PEG" ein PEG-Derivat, das zwei aktive Einheiten aufweist, die sich beide mit einer aktiven Einheit an einem anderen Molekül umsetzen können. Die beiden aktiven Einheiten können an den beiden Enden der PEG-Kette angeordnet sein oder auch einander benachbart an einem gegabelten Ende eines PEG-Kettenmoleküls, das eine sterische Behinderung, falls vorhanden, erlaubt. Geeignete tansportierbare Peptide zur Verwendung bei dieser Erfindung sind vorstehend beschrieben worden und umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Dynorphine, Enkephaline, Biphalin, Endorphine, Endomorphine und Derivative und Analoga davon.
Das Konjugat gemäß dieser Erfindung kann an ein Tier zum Zweck des Behandelns, Linderns oder Abschwächens von Schmerzen verabreicht werden. Beispiele von Tierwirten umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Säuger wie z. B. Menschen und Haustiere, umfassend Katzen, Hunde, Kühe, Pferde, Mäuse und Ratten.
Das Konjugat gemäß dieser Erfindung kann auf jede geeignete Weise an ein Tier verabreicht werden. Beispielsweise kann das Konjugat durch intravenöse Injektion, intramuskuläre Injektion oder subkutane Injektion parenteral verabreicht werden. Bei einer anderen Ausführungsform kann das Konjugat gemäß dieser Erfindung auch durch intranasale oder pulmonale Inhalation oder durch orale oder bukkale Verabreichung in den Körper eingeführt werden. Vorzugsweise wird die intravenöse Injektion verwendet, so dass im Wesentlichen das gesamte Konjugat in einer Injektionsdosis in den Blutstrom des Tiers geliefert wird, in dem das Konjugat zu der Blut-Hirn-Schranke des Tiers zirkuliert.
Das Konjugat kann in einer beliebigen geeigneten Formulierungsform injiziert werden. Beispielsweise kann eine injizierbare Zusammensetzung durch ein beliebiges im Fachgebiet bekanntes Verfahren so formuliert werden, dass sie das Konjugat gemäß dieser Erfindung in einem Lösungsmittel wie z. B. Wasser oder einer Lösung, umfassend Kochsalzlösung und die Ringer-Lösung, umfasst. Der Formulierung können auch ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger, die mit den anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich sind, zugesetzt werden. Ferner können Exzipienten, umfassend Mannit, Natriumalginat und Carboxymethylcellulose, zugesetzt werden. Ferner können der Formulierung auch andere pharmazeutisch verträgliche Komponenten, umfassend antiseptische Mittel wie z. B. Phenylethylalkohol; Stabilisatoren wie z. B. Polyethylenglycol und Albumin; isotonisierende Mittel wie z. B. Glycerin, Sorbit und Glucose; Lösungshilfsmittel; stabilisierende Puffer wie z. B. Natriumcitrat, Natriumacetat und Natriumphosphat; Konservierungsmittel wie z. B. Benzylalkohol; Verdickungsmittel wie z. B. Dextrose; und andere üblicherweise verwendete Zusatzstoffe zugesetzt werden. Die injizierbare Formulierung kann auch in einer festen Form wie z. B. in gefriergetrockneter Form hergestellt werden.
Die PEGylierten transportierbaren Peptide gemäß der Erfindung können in vielfältigen Formulierungen verabreicht werden, umfassend beispielsweise intranasale, bukkale und orale Verabreichung. Die Dosierung des an einen Menschen oder an ein anderes Tier verabreichten Konjugats wird in Abhängigkeit des Tierwirts, der Art der verwendeten transportierbaren Peptide und/oder neuroaktiven Wirkstoffe, des Verfahrens der Verabreichung und der Symptome, an denen das Tier leidet, variieren. Die bei einer speziellen Situation geeigneten Dosierungsbereiche sollten jedoch von einem Fachmann ohne unangemessenen Aufwand leicht bestimmt werden können.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nur zum Zweck der Veranschaulichung gedacht sind und nicht als die Erfindung auf irgendeine Weise beschränkend aufgefasst werden dürfen.
Beispiel 1
Modifizieren und Reinigen von PEG-Dynorphin A
Dynorphin A (1–11) (H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-NH₂) (1,47 mg) wurde in 0,25 ml entionisiertem Wasser und 0,25 ml 25 mM NaP-Puffer mit einem pH-Wert von 5,8 in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen gelöst. Der Peptidlösung wurde das Reagens NHS-PEG_2K-Fluoroscein (1,0 mg) mit einem etwa 2-fach molaren Überschuss zugesetzt. Nach einer Reaktionsdauer von 30 Minuten wurden 0,1 ml 25 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 zugesetzt und die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 3 Stunden weitergeführt.
Das Konjugieren von NHS-PEG_2K-Fluoroscein wurde durch Kapillarelektrophorese (CE) und Massenspektrometrie (MALDI) überwacht. Die Reinigung des PEG-Dynorphin A-Konjugats wurde auf einer HiTrap SP-Kationenaustauschersäule von Amersham/Pharmacia unter Verwendung einer Gradientenelution von 5 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 4,0 zu einem 50 mM Natriumphosphat/1,5 M NaCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 innerhalb von 53 Minuten durchgeführt. Die Fraktionen wurden gesammelt und die Gehalte durch MALDI analysiert. Die Fraktionen wurden vereinigt und vor der in vivo-Untersuchung gefroren gelagert.
Beispiel 2
Modifizieren und Reinigen von PEG-Endomorphin II
Endomorphin II (H-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH₂, 2,3 mg) wurde in 1,15 ml 5 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 gelöst. Das Modifizieren von Endomorphin II wurde innerhalb von 1,5 Stunden bei Raumtemperatur durch Zusetzen von mPEG₂₀₀₀-SPA (38 mg) mit einem 5 molaren Überschuss durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Massenspektrometrie (MALDI) analysiert, um das Ausmaß der Modifizierung zu bestimmen. Dabei wurde MALDI verwendet, um zu bestätigen, dass die Umsetzung zwischen mPEG₂₀₀₀-SPA und Endomorphin II zum Abschluss gekommen war. Die Probe wurde vor der in vivo-Untersuchung unter Verwendung einer 2000 MWCO („Molekulargewichtsausschluss")-Membran gegen Wasser dialysiert und anschließend gefriergetrocknet.
Beispiel 3
In situ-Perfusions-, kapillare Depletions-, Hirnextraktions- und Proteinbindungs-Untersuchungen von PEG-Dynorphin A und PEG-Endomorphin II
Das Protokoll für die Hirnperfusionsexperimente bei Ratten wurde von dem Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Arizona bewilligt. Die in situ-Perfusions-, kapillare Depletions-, Hirnextraktions- und Proteinbindungs-Untersuchungen wurden, wie bereits früher beschrieben, durchgeführt (Williams et al., J. Neurochem., 66(3), Seiten 1289–1299, 1996). PEG-Dynorphin A (PdynA) hatte einen sehr hohen in situ-Aufnahmewert R_Br von 0,343 ± 1,84. Im Gegensatz dazu ergab die in situ-Perfusion mit I¹²⁵-Dynorphin einen sehr hohen R_Br-Wert von etwa 0,96. Die gesamte Radioaktivität wurde in der Lösungsmittelfront der nachfolgenden HPLC gewonnen, wodurch gezeigt wurde, dass sich markiertes Dynorphin A (1–11) schnell abbaut, vermutlich zu I¹²⁵Tyr.
Es wurden kapillare Depletions-Untersuchungen von PdynA durchgeführt, wobei gezeigt wurde, dass sich etwa 88% der Radioaktivität anstatt mit dem Hirnparemchym mit der Kapillarfraktion verbunden hatten.
Die in situ-Aufnahme von PEG-Endomorphin II (Pend) ergab einen R_Br-Wert von 0,057 ± 0,008, ähnlich zu den früher für Peptide berichteten Werten. Eine nachfolgend durchgeführte kapillare Depletions-Untersuchung zeigte, dass 32% der in das Gehirn eingetretenen Radioaktivität mit der Kapillarfraktion und 67% mit dem Hirnparenchym verbunden waren.
Die Proteinbindung von Pend wurde unter Verwendung des Centrifree-Filtersystems untersucht. Dabei wurde gefunden, dass 30% von 25.000 ZpH („Zerfälle pro Minute") Pend an eine 1%-ige BSA-Lösung gebunden waren.
Der Hauptbeitrag liegt darin, dass die PEGylierung die enzymatische Stabilität im Gehirn und im Blut sehr stark verbesserte. Endomorphin und Dynorphin sind entweder im Gehirn oder im Blut mit Halbwertszeiten in der Größenordnung von Minuten sehr instabil. Nach der PEGylierung erhöhten sich die Halbwertszeiten für Endomorphin II auf Werte von Stunden. Bei Endomorphin II betrug die Halbwertszeit in Blutplasma 3,2 Minuten und in Hirngewebe 13 Minuten. Nach der PEGylierung erhöhten sich diese Halbwertszeiten auf über zwei Stunden.
Beispiel 4
Konjugieren von PEG-Doxorubicin an Endomorphin I
Endomorphin I (H-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH₂, 3,0 mg, 4,9 × 10^–6 Mol) wurde in 1 ml 50 mM Natriumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 8,2 mit 150 mM NaCl und 50 mM DTT gelöst. Ein vierfacher molarer Überschuss des Traut-Reagens (2,7 mg) wurde zugesetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Thiol-modifizierte Endomorphin wurde aus DTT und dem Traut-Reagens unter Verwendung einer Superdex 30-Größenausschluss-Säule (Pharmacia) gereinigt. Die modifizierten Endomorphin-Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet.
Doxorubicinhydrochlorid (3,0 mg, 5,2 × 10^–6 Mol) wurde in 1,0 ml 50 mM Natriumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 mit 150 mM NaCl gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 0,1 N Natriumhydroxid auf einen Wert von 8,0 titriert. Zu der Doxorubicinlösung wurde ein zehnfacher molarer Überschuss von heterobifunktionellem PEG (NHS-PEG_2K-OPSS) zugesetzt. Die Umsetzung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur geführt. Das OPSS-PEG_2K- Doxorubicin wurde unter Verwendung einer Superdex 30-Größenausschluss-Säule von nicht umgesetztem PEG und freiem Doxorubicin gereinigt. Die OPSS-PEG_2K-Doxorubicin-Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet.
Die gefriergetrockneten Pulver von modifiziertem Endomorphin I und OPSS-PEG_2K-Doxorubicin wurden in einem 50 mM Natriumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 6,0 rekonstituiert. Äquimolare Mengen jeder Lösung wurden zusammengemischt und 6 Stunden bei Raumtemperatur miteinander umgesetzt. Das Doxorubicin-PEG_2K-Endomorphin-Konjugat wurde auf einer Superdex 30-Größenausschluss-Säule gereinigt.
Beispiel 5
Konjugieren von PEG an DPDPE
3,0 mg DPDPE (Tyr-D-Pen-Gly-Phe-D-Pen) wurden in 5 ml wasserfreiem Acetonitril gelöst. Ein 20%-iger molarer Überschuss eines PEG-Reagens (entweder mPEG-SPA 5K [27,9 mg] oder mPEG-SPA 2K [11,1 mg]) und Triethylamin (0,8 μl) wurden zu dem DPDPE zugesetzt. Die Umsetzung wurde 2 Tage bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre geführt. Die Probe wurde mit entionisiertem Wasser auf 15 ml verdünnt und gefriergetrocknet. Das PEG-DPDPE-Pulver wurde in 5 ml entionisiertem Wasser rekonstituiert und auf einer Superdex 30 Größenausschluss-Säule gereinigt. Die maßgeblichen Fraktionen wurden vereinigt, gegen Wasser dialysiert und bis zu den in situ-Perfusionsexperimenten gefroren aufbewahrt.
Sowohl PEG_2K-DPDPE als auch PEG_5K-DPDPE wurden iodiert und bei in situ-Perfusions-, kapillaren Depletions-, Hirnextraktions- und Proteinbindungs-Untersuchungen wie in Beispiel 3 geprüft. Sowohl bei PEG_2K-DPDPE als auch bei PEG_5K-DPDPE wurde eine wesentliche Zunahme der Aufnahme in das Gehirn beobachtet. Es wurde ermittelt, dass bei beiden Verbindungen die Zunahme daran lag, dass die Peptide in das Gehirn eintraten anstatt in den Kapillaren festgehalten zu werden.
Beispiel 6
Konjugieren von PEG an Biphalin
a. (mPEG_2K)₂-Biphalin
Biphalin (21,1 mg, 0,046 mMol) wurde in 15 ml wasserfreiem Acetonitril gelöst und mit 16 μl Triethylamin (0,115 mMol, 2,5-fach molarer Überschuss) behandelt. Zugleich wurde mPEG_2K-SPA (110 mg, 0,055 mMol, 1,2-fach molarer Überschuss) in 5 ml Acetonitril gelöst. Das gelöste mPEG-SPA wurde der vorstehend beschriebenen Biphalinlösung langsam zugesetzt, anschließend wurde das Reaktionsgemisch 66 Stunden bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt.
Di-PEGyliertes [(mPEG_2K)₂-Biphalin] und mono-PEGyliertes Biphalin [mPEG_2K-Biphalin] wurden auf einer Vydac C18-Umkehrphasensäule bei 1 ml/min und 215 nm UV-Detektion unter Verwendung einer Gradientenelution von 30% bis 60% Lösungsmittel B von nicht umgesetztem PEG und freiem Biphalin getrennt. Das Lösungsmittel A ist 0,1% TFA in Wasser, das Lösungsmittel B ist 0,1% TFA in Acetonitril.
b. (mPEG_5K)₂-Biphalin
Lösen von 118,7 mg Methoxy-PEG_5K-SPA (2,374 × 10^–5 Mol, 1,5-fach molarer Überschuss) in 3,0 ml wasserfreiem Acetonitril. Zusetzen von 10,0 mg Biphalin (1,583 × 10^–5 Mol der -NH₂-Gruppe) unter einem langsamen Argonfluss, gefolgt von Pipettieren von 4,4 μl Triethylamin (3,166 × 10^–5 Mol, 2,0-fach molarer Überschuss) zu der Lösung. Rühren der Lösung bei Raumtemperatur über Nacht.
Abdampfen des Lösungsmittels mittels eines Rotationsverdampfers bei 40°C beinahe bis zur Trockne, anschließend 5 Minuten Weitertrocknen unter Hochvakuum (Verwendung einer Flüssigstickstoff Falle bei der Anwendung des Vakuums). Lösen des Rückstands in 10 ml entionisiertem Wasser. Der pH-Wert der Lösung beträgt 4,5. Beladen einer vorhydratisierten Slide-A-Lyzer-Dialysekassette mit 3500 MWCO (von PIERCE) mit der Lösung durch Injektion, anschließend Dialyse gegen 2 × 900 ml entionisiertes Wasser über einen Zeitraum von drei Tagen.
Laden der Lösung auf eine 2 ml-DEAE-Sepharosesäule. Sammeln des Eluents. Eluieren der Säule mit weiteren 125 ml entionisiertem Wasser, anschließend Sammeln des Eluents (pH-Wert = 7,6). Kombinieren der beiden Fraktionen, Einfrieren der Lösung durch flüssigen Stickstoff und anschließend Gefriertrocknen mittels eines Gefriertrocknungsgeräts.
e. (mPEG_12K)₂-Biphalin
Lösen von 141,4 mg Methoxy-PEG_12K-SPA (1,187 × 10^–5 Mol, 1,5-fach molarer Überschuss) in 2,0 ml wasserfreiem Acetonitril. Zusetzen von 5,0 mg Biphalin·2 TFA (7,915 × 10^–6 Mol der -NH₂-Gruppe) unter einem langsamen Argonfluss, gefolgt von Pipettieren von 2,2 μl Triethylamin (1,583 × 10^–5 Mol, 2,0-fach molarer Überschuss) zu der Lösung. Rühren der Lösung bei Raumtemperatur über Nacht.
Abdampfen des Lösungsmittels bei Raumtemperatur unter Hochvakuum bis zur Trockne (Verwendung einer Flüssigstickstoff-Falle bei der Anwendung des Vakuums). Lösen des Rückstands in 10 ml entionisiertem Wasser. Beladung einer vorhydratisierten Dialysekassette mit 10000 MWCO (von PIERCE) mit der Lösung durch Injektion, anschließend Dialyse gegen 2 × 800 ml entionisiertes Wasser über einen Zeitraum von drei Tagen.
Verdünnen der Lösung mit entionisiertem Wasser auf 18 ml. Laden der Lösung auf eine 10 ml-DEAE-Sepharosesäule. Sammeln des Eluents. Eluieren der Säule mit weiteren 90 ml entionisiertem Wasser. Kombinieren der Fraktionen, Einfrieren durch flüssigen Stickstoff und anschließend Gefriertrocknen mittels eines Gefriertrocknungsgeräts.
d. (mPEG_20K)₂-Biphalin
Lösen von 255,2 mg Methoxy-PEG_20K-SPA (1,187 × 10^–5 Mol, 1,5-fach molarer Überschuss) in 3,0 ml wasserfreiem Acetonitril. Zusetzen von 5,0 mg Biphalin·2 TFA (7,915 × 10^–6 Mol der -NH₂-Gruppe) unter einem langsamen Argonfluss, gefolgt von Pipettieren von 2,2 μl Triethylamin (1,583 × 10^–5 Mol, 2,0-fach molarer Überschuss) zu der Lösung. Rühren der Lösung bei Raumtemperatur über Nacht.
Abdampfen des Lösungsmittels bei Raumtemperatur unter Hochvakuum bis zur Trockne (Verwendung einer Flüssigstickstoff-Falle bei der Anwendung des Vakuums). Lösen des Rückstands in 10 ml entionisiertem Wasser. Zuführen der Lösung an eine vorhydratisierte Dialysekassette mit 10000 MWCO (von PIERCE) durch Injektion, anschließend Dialyse gegen 2 × 800 ml entionisiertes Wasser über einen Zeitraum von drei Tagen.
Verdünnen der Lösung mit entionisiertem Wasser auf 25 ml. Laden der Lösung auf eine 15 ml-DEAE-Sepharosesäule. Sammeln des Eluents. Eluieren der Säule mit weiteren 150 ml entionisiertem Wasser. Kombinieren der Fraktionen, Einfrieren durch flüssigen Stickstoff und anschließend Gefriertrocknen mittels eines Gefriertrocknungsgeräts.
Die Reinheit jeder Probe wurde durch Umkehrphasen-HPLC und durch Massenspektrometrie (MALDI) bestimmt.
Beispiel 7
Prüfung der Analgesie
Tiere
Bei diesen Experimenten wurden männliche ICR-Mäuse (20–25 g) und männliche Sprague-Dawley-Ratten (250–300 g) (Harlan Sprague-Dawley Inc., Indianapolis, IN) verwendet. Die Tiere wurden zu viert pro Käfig in einer Tierpflegeeinrichtung bei 22 ± 0,5°C und einem 12-stündig wechselnden Hell/Dunkel-Zyklus gehalten. Nahrung und Wasser wurden nach Belieben gewährt. Die Tiere wurden nur einmal verwendet.
Protokoll
Alle Arzneistoffe wurden in einer sterilen Kochsalzlösung gelöst und so hergestellt, dass die richtige Dosis in 5 μl (i.c.v.), 100 μl (i.v.), 100 μl (s.c.) bzw. 100 μl (i.m.) des Vehikels geliefert werden würde. Vor der Arzneimittelinjektion wurde für alle Nagetiere die Grundlinien-Latenzzeit aufgezeichnet. Bei den i.c.v.- und i.v.-Injektionsvorgängen wurde eine Morphin-Kontrolle als Vergleich für die analgetischen Wirksamkeiten der Testverbindungen verwendet.
I.C.V.-Injektion
Nagetiere wurden in ein Gefäß gegeben, das mit Ethylether getränkte Gaze enthielt, bis sie in einen leichten Schlaf fielen. Die Nagetiere wurden sofort aus dem Gefäß genommen, anschließend wurde ein Einschnitt von 1/2'' mit einem Skalpell durchgeführt, um die Oberseite des Schädels freizulegen. Der rechte laterale Ventrikel wurde durch Messen von 2 mm lateral und 2 mm kaudal des Bregma lokalisiert. An diesem Punkt wurde eine Hamilton-Spritze (22 G, ½'') 2 mm durch den Schädel geführt und eine Injektion von 5 μl der Verbindung verabreicht. Anschließend wurden die Nagetiere bis zur festgelegten Zeit der Untersuchung in ihre Käfige zurückgebracht. In die Injektionsstelle wurde Methylenblau gegeben, um sich über die korrekte Verabreichung der Verbindung in das laterale Ventrikel zu versichern.
I.Y.-Injektion
Nagetiere wurden in eine Festhaltevorrichtung platziert, anschließend wurden ihre Schwänze in ein Becherglas mit warmem Wasser gegeben und dann mit Ethanol betupft, um die Erweiterung der Schwanzvenen zu maximieren. Eine Vene wurde ausgewählt und die Festhaltevorrichtung wurde angespannt, um starke Bewegungen zu verhindern. Eine 30 G-Nadel wurde als die für die Verabreichung der Verbindungen geeignete Größe ausgewählt. Die Nadel wurde sorgfältig in die Vene jeder Maus eingeführt, anschließend wurde ein Bolus von 100 μl langsam verabreicht. Ein Verblassen der Vene körperaufwärts zeigte eine korrekte Verabreichung an.
S.C.-Injektion
Ratten wurden von Hand festgehalten, um starke Bewegungen zu verhindern. Eine 30 G-Nadel wurde als die für die Verabreichung der Verbindungen geeignete Größe ausgewählt. Die Nadel wurde sorgfältig in das Genick jeder Ratte eingeführt, anschließend wurde ein Bolus von 100 μl langsam verabreicht.
I.M.-Injektion
Ratten wurden von Hand festgehalten, um starke Bewegungen zu verhindern. Eine 30 G-Nadel wurde als die für die Verabreichung der Verbindungen geeignete Größe ausgewählt. Die Nadel wurde sorgfältig in den rechten Hinterbeinmuskel jeder Ratte eingeführt, anschließend wurde ein Bolus von 100 μl langsam verabreicht.
Prüfung der Analgesie
Nagetiere wurden in eine Festhaltevorrichtung platziert, anschließend wurden ihre Schwänze in geeigneter Weise unter dem Strahl eines Wärmestrahlers angeordnet. Der Strahl wurde eingeschaltet, dann wurde die Zeit aufgezeichnet, bis die Tiere ihren Schwanz unter dem Strahl wegschlugen. Wenn die Tiere ihre Schwänze ohne Schlagen bewegten, wurden die Tiere nur dann erneut untersucht, wenn die verstrichene Zeit unter dem Stahl weniger als 5 Sekunden betragen hatte.
Beurteilung der analgetischen Daten
Die Rohdaten (aufgezeichnete Zeiten) wurden zu einem Prozentwert bezogen auf die größte mögliche Wirkung (% M.P.E.) umgewandelt, die zu 15 Sekunden bestimmt wurde. Der Wert von % M.P.E. wurde gemäß folgender Gleichung bestimmt: % M.P.E. = (aufgezeichnete Zeit – Grundlinie)/(15 – Grundlinie) × 100
Mit diesen Prozentwerten kann die Verbindung entsprechend dem Wert von % M.P.E. gegen die Zeit aufgetragen werden. Anschließend kann diese Kurve ausgewertet werden, um die Fläche unter der Kurve (AUC) zu bestimmen.
Die Ergebnisse der i.c.v.-Verabreichung von PEG-DPDPE zeigen eindeutig, dass die PEGylierung die Fähigkeit von DPDPE zum Erzielen einer analgetischen Wirkung nicht beeinträchtigt (1). Außerdem zeigte die Untersuchung eine Tendenz zu einer Verlängerung der analgetischen Wirkung der PEGylierten Verbindung im Vergleich zu der Ursprungsverbindung.
Die intravenöse Injektion von PEG-DPDPE zeigte, dass die PEGylierte Verbindung die Blut-Hirn-Schranke durchdringen kann und zwar in ausreichenden Mengen, um ihre analgetischen Eigenschaften zu behalten (2). Diese Untersuchung bestätigte auch weiter, dass PEGylieren von DPDPE die Dauer der analgetischen Wirkung wesentlich verlängert.
Alle PEGylierten Biphalinproben und Biphalinproben zeigten eine starke analgetische Antwort bei Mäusen mit einer maximalen Antwort von 80–90% zwischen 30 und 45 Minuten. Das (mPEG_2K)₂-Biphalin verlängerte die analgetische Wirkung weiter, wobei ein Wert von 50% M.P.E. bei der 400-Minuten-Marke der Untersuchung im Vergleich zu der 90 Minuten-Marke bei nativem Biphalin beobachtet wurde. Die Daten zeigen auch ein umgekehrtes Verhältnis zwischen dem Molekulargewicht des PEG und dem Wert von % M.P.E. (3).
Beim Vergleich der analgetischen Wirkung von mono-PEGyliertem Biphalin (mPEG_2K-Biphalin) mit der von di-PEGyliertem Biphalin [(mPEG_2K)₂-Biphalin] mit der gleichen Konzentration bei Mäusen beträgt die Dauer der analgetischen Wirkung von mPEG_2K-Biphalin beinahe die Hälfte der von (mPEG_2K)₂-Biphalin bei 50% M.P.E. (4). Tatsächlich besteht eine beinahe gleichwertige analgetische Wirkung von mPEG_2K-Biphalin bei der halben Dosis von (mPEG_2K)₂-Biphalin.
Die intravenöse Verabreichung von (mPEG_2K)₂-Biphalin ergibt bei den verschiedenen untersuchten Dosen eine länger anhaltende analgetische Wirkung bei Ratten als natives Biphalin (5). Ratten, denen (mPEG_2K)₂-Biphalin durch subkutane oder intramuskuläre Verabreichung gegeben worden war, zeigten erhöhte und länger anhaltende Niveaus der analgetischen Wirkung im Vergleich zu nativem Biphalin mit der gleichen Konzentration (6).
Beispiel 8
In situ-Perfusionsuntersuchungen von PEG-DPDPE und PEG-Biphalin
Das Protokoll für die Hirn-Perfusionsexperimente bei Ratten wurde von dem Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Arizona bewilligt. Die in situ-Perfusionsuntersuchungen wurden, wie bereits früher beschrieben, durchgeführt (Williams et al., J. Neurochem., 66(3), Seiten 1289–1299, 1996). PEG_2K-DPDPE wies einen sehr hohen in situ-Aufnahmewert R_Br von 3,41 ± 0,15 auf. Die in situ-Perfusion von I¹²⁵-DPDPE ist mit der von mono-PEGyliertem DPDPE vergleichbar, R_Br = 3,54 ± 0,30. Mit I¹²⁵ markiertes Biphalin weist eine in situ-Perfusionsaufnahme von 7,26 ± 0,11 auf, während die in situ-Aufnahme von (mPEG_2K)₂-Biphalin mit einem R_Br Wert von 2,70 ± 0,27 dramatisch niedriger war.
Viele Modifikationen und andere Ausführungsformen der Erfindung werden einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung, auf den sich diese Erfindung bezieht und der die in der vorstehenden Beschreibung und den begleitenden Abbildungen dargelegten Lehren stützt, nahe liegen. Daher ist es selbstverständlich, dass die Erfindung nicht auf die beschriebenen spezifischen Ausführungsformen beschränkt ist und dass Abänderungen und andere Ausführungsformen vom Umfang der anhängenden Ansprüche umfasst werden sollen. Obwohl hier spezifische Begriffe verwendet werden, werden sie lediglich in einem generischen und beschreibenden Sinn verwendet, und nicht zum Zweck einer Beschränkung.

Claims

Im Wesentlichen hydrophiles Polymer-Peptid-Konjugat, umfassend ein Peptid, welches kovalent gebunden ist an Polyethylenglycol oder ein Copolymer von Polyethylenglycol und Polypropylenglycol mit einem nominalen durchschnittlichen Molekulargewicht von 200 Daltons bis 40000 Daltons, wobei das Peptid ausgewählt ist aus Biphalin und [D-Pen2, D-Pen5]Enkephalin (DPDPE).
Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Polymer weiter gekennzeichnet ist durch Abwesenheit von lipophilen Einheiten.
Konjugat nach Anspruch 1, weiter gekennzeichnet durch die kovalente Bindung von entweder Polyethylenglycol oder einem Copolymer von Polyethylenglycol und Polypropylenglycol mit einem Tyrosinrest des Peptids.
Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Polymer Polyethylenglycol ist.
Konjugat nach Anspruch 4, wobei das Polyethylenglycol ausgewählt ist aus Monomethoxypolyethylenglycol, verzweigtem Polyethylenglycol, Polyethylenglycol mit abbaubaren Verknüpfungen im Gerüst, homobifunktionalem Polyethylenglycol, heterobifunktionalem Polyethylenglycol, vielverzweigtem Polyethylenglycol, anhängendem Polyethylenglycol und gegabeltem Polyethylenglycol.
Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Peptid an mindestens ein Polyethylenglycolmolekül konjugiert ist.
Konjugat nach Anspruch 1, umfassend Biphalin, das kovalent an zwei Polyethylenglycoleinheiten gebunden ist.
Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Polymer ein Polyethylenglycol mit einem nominalen durchschnittlichen Molekulargewicht von 200 bis 10000 Daltons oder 300 bis 8000 Daltons oder 500 bis 5000 Daltons oder 5000 Daltons oder 2000 Daltons ist.
Arzneimittel, umfassend ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Konjugat nach Anspruch 1, weiter umfassend ein neuroaktives Mittel, das zum Peptid gleich oder verschieden sein kann, konjugiert an das Polymer.
Konjugat nach Anspruch 10, weiter gekennzeichnet durch eine hantelförmige Struktur.
Konjugat nach Anspruch 1, weiter umfassend Doxorubicin oder ein bildgebendes oder diagnostisches Mittel, konjugiert an das Polymer.
Verwendung des Konjugats nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz, wobei die Zusammensetzung über den allgemeinen Kreislauf verabreicht wird.
Verwendung des Konjugats nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Lieferung eines Peptids in das Gehirn eines Tiers, wobei das Mittel in den Blutstrom des Tiers verabreicht werden soll.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Polymer ausgewählt ist aus Monomethoxypolyethylenglycol, verzweigtem Polyethylenglycol, Polyethylenglycol mit abbaubaren Verknüpfungen im Gerüst, homobifunktionalem Polyethylenglycol, heterobifunktionalem Polyethylenglycol, vielverzweigtem Polyethylenglycol, anhängendem Polyethylenglycol und gegabeltem Polyethylenglycol.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei der Schritt des Verabreichens des Mittels Inhalation in das Tier über die Lunge oder intranasal umfasst.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei der Schritt des Verabreichens des Mittels oral, Okular, buccal, transdermal oder rektal durchgeführt wird.
Verwendung eines im Wesentlichen hydrophilen Polymer-Peptid-Konjugats zwischen einem Opioidpeptid und Polyethylenglycol oder einem Copolymer von Polyethylenglycol und Polypropylenglycol mit einem nominalen durchschnittlichen Molekulargewicht von 200 Daltons bis 40000 Daltons, wobei das Peptid ausgewählt ist aus Dynorphin, Enkephalin, Endorphin und Endomorphinen, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Lieferung eines Opioidpeptids in das Gehirn eines Tiers zur Behandlung von Schmerz, wobei das Mittel in den Blutstrom eines Tiers verabreicht werden soll.