DE69720320T2

DE69720320T2 - Interferon-Konjugate

Info

Publication number: DE69720320T2
Application number: DE69720320T
Authority: DE
Inventors: Pascal Sebastian Florham Park Bailon; Alicia Vallejo North Caldwell Palleroni
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1996-05-31
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2017-05-23
Also published as: EP0809996A2; AU2372397A; TJ328B; ATE235920T1; TR199700358A2; GR970300063T1; NL300127I1; JP2980569B2; NO972480L; BR9703421A; US7201897B2; TR199700358A3; SA97180030B1; CZ167997A3; PL320251A1; CA2203480A1; KR100254097B1; AU725195B2; CY2005006I2; HU227992B1

Description

Interferon, insbesondere Interferonα2a, ist ein pharmazeutisch wirksames Protein, das antivirale und antiproliferative Wirkung aufweist. Beispielsweise wird Interferon verwendet, um Haarzellenleukämie und Kaposisarcom zu behandeln, und ist gegen Hepatitis wirksam. Um die Stabilität und Löslichkeit zu verbessern und Immunogenizität zu vermindern, können pharmazeutisch wirksame Proteine, wie Interferon, mit dem Polymer Polyethylenglycol (PEG) konjugiert werden.
Die Bioverfügbarkeit von Proteintherapeutika ist häufig aufgrund ihrer kurzen Plasmahalbwertszeit begrenzt, wodurch somit verhindert wird, dass dieselben ihre maximale klinische Wirksamkeit erlangen. In den letzten Jahren wurde von konjugierten PEG-Biomolekülen gezeigt, dass sie klinisch brauchbare Eigenschaften besitzen (Inada et al., J. Bioact. and Compatible Polymers 5, 343 (1990); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9, 249 (1992); Katre, Advanced Drug Delivery Systems 10, 91 (1993)). Unter diesen sind bessere physikalische und thermische Stabilität, Schutz gegen Anfälligkeit für Enzymabbau, erhöhte Löslichkeit, längere in vivo-Zirkulationshalbwertszeit, verminderte Clearance und erhöhte Wirksamkeit. Es wurde berichtet, dass verzweigte PEG-Konjugate Stabilität gegen erhöhten pH-Wert und thermische Stabilität und größere Stabilität gegen proteolytischen Abbau als lineare PEG-Konjugate zeigen (EP-A-0 400 472 und Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6, 62 (1995)). Andere Eigenschaften von PEG-Proteinen sind verminderte Immunogenizität und Antigenizität sowie verminderte Toxizität. Eine weitere Wirkung von PEGylierung von bestimmten Proteinen kann verminderte in vitro-Wirkung, begleitet von erhöhter in vivo-Wirkung, sein. Dies wurde unter anderem bei G-CSF (Satake-Ishikawa et al., Cell Structure and Function 17, 157–160 (1992)), IL-2 (Katre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1487 (1987)), TNF-α (Tsutsumi et al., Jpn. J. Cancer Res. 85, 9 (1994) ) , IL-6 (Inoue et al ., J. Lab. Clin. Med. 124, 529 (1994)) und CD4-IgG (Chamow et al., Bioconj. Chem. 5, 133 (1994)) beobachtet.
Es wurde nun beobachtet, dass im Fall von Interferon PEGylierung antivirale in vitro-Wirkung vermindert, jedoch antiproliferative Wirkung in Humantumorzellen erhöht. Das neue erfindungsgemäße PEG-Interferonkonjugat hat jedoch überraschende Eigenschaften, indem die antiproliferative Wirkung von dem PEG-Interferon viel höher als jene nicht nur von Interferon, sondern von anderen PEG-Interferonkonjugaten ist. Obwohl die antiproliferative Wirkung des Konjugats gegenüber anderen PEG-Interferon-α-Konjugaten viel höher ist, ist die Verminderung der antiviralen Wirkung dennoch ähnlich. Außerdem ist das PEG-Interferon-α-Konjugat dieser Erfindung nicht immunogen, es ruft eigentlich keine Antikörperbildung hervor. Im Gegensatz dazu rufen andere PEG-Interferon-α-Konjugate eine begrenzte Antikörperbildung hervor.
Folglich ist die Erfindung eine neue Klasse von PEG-Derivaten von Interferonα (IFNα). Das erfindungsgemäße Konjugat hat eine verzweigte PEG-Struktur, wie nachstehend ersichtlich werden kann. Das verzweigte PEG hat den Vorteil, indem es die Bindung von 2 linearen PEG-Molekülen an einer einzelnen Stelle ermöglicht, wodurch die gebundene PEG-Masse ohne eine Vielzahl von PEGylierungsstellen verdoppelt wird.
Verglichen mit unmodifiziertem IFNα (d. h. IFNα ohne eine PEG-Bindung) hat das Konjugat eine höhere Zirkulationshalbwertszeit und Plasmaaufenthaltszeit, verminderte Immunogenizität, verminderte Clearance und erhöhte antiproliferative Wirkung gleichzeitig mit verminderter antiviraler in vitro-Wirkung. Verglichen mit anderen PEG-IFNα-Konjugaten hat das erfindungsgemäße Konjugat eine viel stärkere antiproliferative Wirkung, disproportioniert zu der Erhöhung oder Ver minderung, die in seinen anderen Eigenschaften auftritt, und eigentlich keine Immunogenizität.
Die physiologisch aktive PEG-IFNα-Konjugatspezies dieser Erfindung hat die Formel:
Das erfindungsgemäße Konjugat hat die gleichen Verwendungen, wie IFNα, beispielsweise antiproliferative Verwendungen. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen PEG-Interferon-α-Konjugate verwendbar, um immunomodulatorische Störungen, wie neoplastische Erkrankungen, beispielsweise Haarzellenleukämie, CML und Kaposisarkom, zu behandeln, und infektiöse Erkrankungen werden in der gleichen Weise wie IFNαs (insbesondere IFNα2a) verwendet, um diese Erkrankungen zu behandeln. Jedoch hat das erfindungsgemäße Konjugat verbesserte Eigenschaften, einschließlich überlegene Stabilität, größere Löslichkeit, erhöhte Zirkulationshalbwertszeit und Plasmaaufenthaltszeiten. Zusätzlich haben diese Konjugate antiproliferative Wirkung, die jener von IFNα überlegen ist. Das Konjugat zeigt auch, wie angemerkt, eine überraschende Dissoziation von antiviralen und antiproliferativen Wirkungen. Diese Eigenschaft ist außerdem nützlich, um eine gewünschte Wirkung eines Konjugats unter Vermindern oder Beseitigen einer unerwünschten Wirkung zu erhöhen. Wenn beispielsweise eine unerwünschte Nebenwirkung mit der antiviralen Wirkung verbunden ist, würde das Beseitigen dieser Wirkung die Nebenwirkung unter Beibehalten der antiproliferativen Wirkung beseitigen. Deshalb umfasst die vorliegende Erfindung auch die pharmazeutischen Zusammensetzungen auf der Basis der Verbindungen der Formel I oder deren Salze und Verfahren zur Herstellung derselben.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur Bekämpfung oder Prävention von Krankheiten verwendet werden, umfassen ein Interferonkonjugat der allgemeinen Formel I und ein therapeutisch inertes, nicht-toxisches und therapeutisch verträgliches Trägermaterial. Die zu verwendenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können in üblicher Weise in Übereinstimmung mit guter medizinischer Praxis unter Berücksichtigung der zu behandelnden Störung, des Zustands des jeweiligen Patienten, des Dosierungsorts des Proteinkonjugats, des Verabreichungsverfahrens und anderer den Ärzten bekannten Faktoren formuliert und dosiert werden.
Das beanspruchte Konjugat ist ein physiologisch aktives PEG-IFNα-Konjugat der Formel
worin R und R' unabhängig Niederalkyl darstellen; X NH oder O darstellt (X ist mindestens eine der funktionellen Gruppen in dem IFNα-Molekül, ausgewählt aus NH₂ oder OH); n und n' ganze Zahlen mit einer Summe von 600 bis 1 500 sind und das mittlere Molekulargewicht der Polyethylenglykoleinheiten in dem Konjugat 26 000 Dalton bis 66 000 Dalton ist. Das Konjugat der Formel I hat eine verzweigte Struktur dahingehend, dass zwei PEG-Einheiten an das Protein über eine Einfachbindung gebunden sind.
Die Zahlen n und n' sind derart ausgewählt, dass das erhaltene Konjugat der Formel I eine physiologische Wirkung von IFNα aufweist, wobei die Wirkung die gleiche, mehr als oder ein Bruchteil der entsprechenden Wirkung von unmodifiziertem IFNα wiedergibt. n und n' (n und n' können gleich oder verschieden sein) geben die Zahl von Ethylenglycoleinheiten in dem PEG wieder. Eine einzelne PEG-Einheit von OCH₂CH₂ hat ein Molekulargewicht von 44 Dalton. Das Molekulargewicht des Konjugats (ausschließlich des Molekulargewichts von dem IFNα) hängt von den Zahlen n und n' ab. Die Summe von n und n' für das Konjugat der Formel I ist 600 bis 1500 unter Erzeugen eines Konjugats mit einem mittleren Gesamtmolekulargewicht von PEG-Einheiten von 26000 bis 66000 und vorzugsweise 35000 bis 45000 Dalton und insbesondere 39000 bis 45000 Dalton, wobei 40000 Dalton besonders bevorzugt sind. Eine bevorzugte Summe von n und n' ist 800 bis 1200, wobei die mittlere Summe 850 bis 1000 ist und eine bevorzugte Summe etwa 910 ist. Jeder von n und n' kann einzeln 420 bis 520 sein oder beide können 420 bis 520 sein oder beide können 455 sein. Das bevorzugte Verhältnis von n zu n' ist 0,5 bis 1,5, wobei ein besonders bevorzugtes Verhältnis 0,8 bis 1,2 ist. Ein Molekulargewicht von "etwa" einer bestimmten Zahl bedeutet, dass es innerhalb eines angemessenen Bereichs der Zahl, wie bestimmt durch herkömmliche analytische Techniken, liegt.
Auch bevorzugt ist ein Konjugat der Formel I, worin IFNα IFNα2a ist, ein Konjugat, worin R und R' Methyl darstellen, ein Konjugat, worin X NH darstellt, und ein Konjugat, worin n und n' einzeln oder beide entweder 420 oder 520 sind. Ein solches Konjugat mit all den vorstehenden Eigenschaften ist besonders bevorzugt.
R und R' können beliebiges Niederalkyl sein, womit eine Alkylgruppe mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen, Alkylgruppen sind eingeschlossen. Ein bevorzugtes Alkyl ist Methyl. Bezüglich der zwei PEG-Gruppen der Formel I können R und R' gleich oder verschieden sein.
Mit IFNα (Interferon α) und seinen Arten IFNα2a ist das natürliche oder rekombinante Protein, vorzugsweise human, wie erhalten von beliebiger herkömmlicher Quelle, wie Gewebe, Proteinsynthese, Zellkultur mit natürlichen oder rekombinan ten Zellen, gemeint. Jedes Protein mit der Wirkung von IFNα, wie Muteine oder anderweitig modifizierte Proteine, ist umfasst. Das Gewinnen und Isolieren von IFNα aus natürlichen oder rekombinanten Quellen ist gut bekannt (Pestka, Arch. Biochem. Biophys. 221, 1 (1983)). Ein bevorzugtes IFNα ist IFNα2a, welches, wie vorstehend ausgewiesen, durch bekannte Verfahren erhalten wird (Pestka, Sci. Am. 249, 36 (1583); Europäisches Patent Nr. 43 980).
Das physiologisch wirksame Konjugat der Formel I hat IFNα-Wirksamkeit, womit ein beliebiger Bruchteil oder ein beliebiges Vielfaches von beliebiger bekannter IFNα-Wirksamkeit gemeint ist, wie durch verschiedene auf dem Fachgebiet bekannte Assays bestimmt. Insbesondere haben die erfindungsgemäßen Konjugate IFNα-Wirksamkeit, wie durch antiproliferative Wirksamkeit gegen Tumorzellen und antivirale Wirkung gegen Zellen, die mit einem Virus infiziert sind, gezeigt. Diese sind bekannte Wirksamkeiten von IFNα. Solche Wirksamkeit in einem Konjugat kann durch auf dem Fachgebiet gut bekannte Assays, beispielsweise die nachstehend beschriebenen Assays (siehe auch Rubinstein et al., J. Virol. 37, 755 (1981); Borden et al., Canc. Res. 42, 4948 (1982)) bestimmt werden. Teil dieser Erfindung ist ein Konjugat der Formel I, welches größere antiproliferative Wirksamkeit und weniger antivirale Wirksamkeit als unmodifiziertes IFNα aufweist.
Das Konjugat der Formel I wird durch kovalente Bindung von IFNα an PEG erzeugt, welches durch Austausch von dem PEG-Hydroxyl gegen eine Bindungsgruppe, Bilden eines Reagens, das ein N-Hydroxysuccinimidester-Derivat von PEG (insbesondere Monomethoxy PEG) der Formel II ist, hergestellt wurde. Das Reagens kann durch herkömmliche Verfahren (Monfardini et al., supra) erhalten werden. Die Bindung erfolgt über eine Amid- oder Esterbindung. In einem bevorzugten Konjugat erfolgt die Bindung über eine Amidbindung (X ist NH). Teil dieser Erfindung ist ein Verfahren zum Erhöhen der antiproliferativen Wirkung von IFNα unter Vermindern der antiviralen Wirkung von IFNα durch Binden des wie vorstehend beschriebenen IFNα an ein Reagens der Formel II unter Erzeugung eines PEG-IFN-Konjugats.
X gibt die Bindungsstelle an IFNα wieder, durch das das PEG-Reagens der Formel II kovalent an das IFNα gebunden ist. Die Reagenzien binden an primäre Aminogruppen (XH = NH₂) an beispielsweise Lysin oder an den Endterminus von dem IFNα. Die Reagenzien können auch an ein Hydroxyl (XH = OH), beispielsweise Serin, binden.
Das Reagens der Formel II (PEG2-NHS), in welchem insgesamt 2 Mono-methoxy-PEG (m-PEG)-Ketten an Lysin gebunden sind, wobei jedes an die α- und ε-Aminogruppen über Carbamat (Urethan) bindet und wobei die Lysincarboxylgruppe an einen Succinimidylester aktiviert ist, kann durch herkömmliche Verfahren gemäß bekannten Verfahren (Monfardini et al., supra), anwendbar auf ein Reagens mit R als Niederalkyl und einem gewünschtem n, erhalten werden. Das Reagens kann von Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Alabama) erhalten werden. Das bevorzugte mittlere MW des erhaltenen PEG ist etwa 20000 Dalton unter Bereitstellung einer Gesamt-PEG-Masse von etwa 40000 Dalton in PEG2-NHS (andere MW können durch Variieren von n der PEG-Alkohol-Ausgangsmaterialien für das Reagens der Formel II durch herkömmliche Verfahren erhalten werden).
Das Reagens der Formel II kann an IFNα durch herkömmliche Verfahren konjugiert werden. Insbesondere reagiert das Reagens der Formel II vorwiegend mit einer oder mehreren der primären Aminogruppen (beispielsweise N-Terminus und Lysinseitenketten) von IFNα (beispielsweise IFNα2a) unter Bildung einer Amidbindung zwischen dem IFNα und dem Polymergerüst von PEG. Die PEGylierungsreaktion kann auch zwischen PEG2-NHS und den freien (falls überhaupt) Hydroxylgruppen (beispielsweise Serin) von IFNα stattfinden unter Bildung einer Esterbindung. Der Reaktionsmechanismus wird vorstehend gezeigt. Die Reaktionsbedingungen sind dem Fachmann geläufig und werden nachstehend im Einzelnen bereitgestellt. Das PEG-Reagens wird mit IFNα unter milden basischen Bedingungen bei niederer Temperatur unter Bedingungen, die für eine nukleophile Substitution geeignet sind, kombiniert, welche Konjugat der Formel I erzeugen werden. Dies wird auch in den vorstehenden Reaktionsmechanismen gezeigt.
Das Binden der Reagenzien an IFNα kann durch herkömmliche Verfahren ausgeführt werden. PEG von beliebigem ausgewählten MW dieser Erfindung können angewendet werden. Die Reaktionsbedingungen können ausgewählt werden, um das beanspruchte Konjugat mit einem gebundenen Reagens bereitzustellen. Das Konjugat der Formel I, das ein einzelnes Reagens der Formel II gebunden aufweist, wird von unmodifiziertem IFNα und den Konjugaten, die mehr als ein Reagenzmolekül gebunden aufweisen, durch herkömmliche Verfahren getrennt. Reinigungsverfahren, wie Kationenaustauschchromatographie, können verwendet werden, um Konjugate durch Ladungsunterschied, welcher wirksam Konjugate in ihre verschiedenen Molekulargewichte trennt, zu trennen. Der Gehalt der durch Kationenaustauschchromatographie erhaltenen Fraktionen kann durch das Molekulargewicht unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, beispiels weise Massenspektroskopie, SDS-PAGE oder andere bekannte Verfahren zum Trennen von Moleküleinheiten über das Molekulargewicht identifiziert werden. Eine Fraktion wird dann folglich identifiziert, welche das Konjugat der Formel I frei von unmodifiziertem IFNα gereinigt und von Konjugaten mit mehr als einem gebundenen Reagens enthält. Außerdem setzen die Reagenzien der Formel II ein Lysin pro Reagens bei Säurehydrolyse frei, sodass die Zahl an Lysin in der Hydrolyse die Zahl von an das Protein gebundenen PEGs ausweist. Somit kann die Anzahl von an ein Konjugat gebundenen Reagensmolekülen verifiziert werden.
Die nachstehenden Beispiele werden zur weiteren Erläuterung der Erfindung bereitgestellt. IFNα2a wird in diesen Beispielen verwendet. Andere Arten von IFNα können auch durch die beispielhaft ausgewiesenen Verfahren an PEG konjugiert werden.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Antitumorwirkung von PEG2-IFNalpha2a in Nacktmaus, implantiert subcutan mit humanen renalen A498-Zellen. Alle Tiere empfingen ein subcutanes Implantat von 2 × 10⁶ humanen renalen A498-Zellen der Studie am Tag –33. Am Untersuchungstag 0 wurde die PEG-IFNalpha2a-Behandlung gestartet. Die ausgewiesene Menge (30, 60, 120 oder 300 μg) von PEG2-IFNalpha2a wurde subcutan unter der entgegengesetzten Flanke des Tumors 1-mal pro Woche für einen Zeitraum von vier Wochen verabreicht.
2: Antitumorwirkung von IFNalpha2a bei der Nacktmaus, subcutan implantiert mit humanen renalen A498-Zellen. Alle Tiere empfingen ein subcutanes Implantat von 2 × 10⁶ humanen renalen A498-Zellen der Studie am Tag –33. Am Untersuchungstag 0 wurde die IFNalpha2a-Behandlung gestartet. Die ausgewiesene Menge (10, 20, 40 oder 100 μg) von IFNalpha2a wurde subcutan unter der entgegengesetzten Flanke des Tumors 3-mal pro Woche für einen Zeitraum von vier Wochen verabreicht.
3: Antitumorwirkung von PEG2-IFNalpha2a bei der Nacktmaus, subcutan implantiert mit humanen renalen ACHN-Zellen. Alle Tiere empfingen ein subcutanes Implantat von 2 × 10⁶ humanen renalen ACHN-Zellen der Studie am Tag –25. Am Untersuchungstag 0 wurde die PEG2-IFNalpha2a-Behandlung gestartet. Die ausgewiesene Menge (30, 60, 120 oder 300 μg) von PEG2-IFNalpha2a wurde subcutan unter der entgegengesetzten Flanke des Tumors 1-mal pro Woche für einen Zeitraum von fünf Wochen verabreicht.
4: Antitumorwirkung von IFNalpha2a in Nacktmaus, subcutan implantiert mit humanen renalen ACHN-Zellen. Alle Tiere empfingen ein subcutanes Implantat von 2 × 10⁶ humanen renalen ACHN-Zellen bei der Studie am Tag –25. Am Untersuchungstag 0 wurde die IFNalpha2a-Behandlung gestartet. Die ausgewiesene Menge (10, 20, 40 oder 100 μg) von IF-Nalpha2a subcutan unter der entgegengesetzten Flanke des Tumors 3-mal pro Woche für einen Zeitraum von fünf Wochen verabreicht.
5: Antitumorwirkung von PEG2-IFNalpha2a in Nacktmaus, subcutan implantiert mit humanen renalen. G402-Zellen. Alle Tiere empfingen ein subcutanes Implantat von 2 × 10⁶ humanen renalen G402-Zellen bei der Studie am Tag –45. Am Untersuchungstag 0 wurde die PEG2-IFNalpha2a-Behandlung gestartet. Die ausgewiesene Menge (30, 60, 120 oder 300 μg) von PEG2-IFNalpha2a wurde subcutan unter der entgegengesetzten Flanke des Tumors 1-mal pro Woche für einen Zeitraum von fünf Wochen verabreicht.
6: Antitumorwirkung von IFNalpha2a in Nacktmaus, subcutan implantiert mit humanen renalen G402-Zellen. Alle Tiere empfingen ein subcutanes Implantat von 2 × 10⁶ humanen renalen G402-Zellen bei der Studie am Tag –45. Am Untersuchungstag 0 wurde die IFNalpha2a-Behandlung gestartet. Die ausgewiesene Menge (10, 20, 40 oder 100 μg) von IFNalpha2a wurde subcutan unter der entgegengesetzten Flanke des Tumors 3-mal pro Woche für einen Zeitraum von fünf Wochen verabreicht.
Beispiel 1
Herstellung von Konjugat der Formel I
Materialien
Interferonα2a wurde durch bekannte Verfahren (Pestka, supra) hergestellt. Polyethylenglycol-(PEG)-Reagens der Formel II wurde von Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala) bezogen. Fractogel^® EMD CM 650(S)-Harz mit Teilchengrößen 25-40 μm wurde von EM Separations (Gibbstown, MA) bezogen. Konzentrierte (10X) phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), pH 7,3, wurde von BioWhittaker (Walkersville, MD) bezogen. Natriumdodecyl-(Laurel)-sulfat/Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), vorgegossene Gele und Elektrophoreseanlagen wurde von NOVEX (San Diego, CA) erhalten. Konzentriertes Fast Stain für Proteinanfärben von PEG-Konjugaten auf SDS-PAGE wurde von Zoion Research, Inc. (Newton, MA) bezogen. Der LAL-Endotoxin-Assaykit wurde von Associates von Cape Cod, Inc. (Woods Hole, MA) bezogen. Alle anderen verwendeten Reagenzien waren von der höchsten verfügbaren Qualität. Die jugular kanülierten Ratten und BDF-1-Maus wurden von Charles River Laboratorien (Wilmington, MA) bezogen.
Experimentelle Verfahren
A. Herstellung von Konjugat der Formel I in kleinem Maßstab
Zweihundertacht Milligramm (5,2 μMol) des Reagens der Formel II (mittleres MW von 40000 Dalton) wurden zu 50 mg (2, 6 μMol) IFNα in 10 ml 100 mM Borat, pH 8, 0, gegeben. Das Molverhältnis von Endproteinreagens war 1 : 2. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei 4°C gerührt. Die Reaktion wurde durch Einstellen des pH-Werts auf 4,5 mit Eisessig gestoppt.
Das Reaktionsgemisch wurde 50fach mit Wasser verdünnt, durch ein 0,2 μ filtriert und auf eine Amicon-Säule, gepackt mit 100 ml (3,2 × 13 cm) Fractogel EMD CM 650(S), mit einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/min aufgetragen. Die Säule wurde vorher mit 10 mM Ammoniumacetat, pH 4,5, ins Gleichgewicht gebracht. Der Säulenabstrom wurde durch W-Absorption bei 280 nm verfolgt. Die Säule wurde dann mit ei nem Gleichgewichtspuffer, bis die UV-Absorption zur Grundlinie zurückkehrte, gewaschen. PEG-IFN-Konjugate mit mehr als einem gebundenen Reagens der Formel II (PEG-IFN-Oligomere), wurden mit 40 mM Ammoniumacetat, pH 4,5, eluiert und das Konjugat der Formel I wurde mit 0,12 M NaCl in 40 mM Ammoniumacetatpuffer eluiert. Das unmodifizierte IFN, das in der Säule verblieb, wurde mit 0,5 M NaCl in dem gleichen Puffer eluiert. Die Säule wurde durch 1,0 M NaCl Waschung, gefolgt von Waschung mit dem Gleichgewichtspuffer, regeneriert. Die vereinigten Fraktionen des Konjugats der Formel I wurden in einem gerührten Zellkonzentrator von Amicon, ausgestattet mit einer YM10-Membran, zu einer Konzentration von ungefähr 1 mg/ml auf konzentriert.
Das für die Reinigung verwendete Fractogel CM 650 (S) Kationenaustauschharz adsorbierte das PEG und unmodifizierte IFN wirksam. Die Adsorptionsstärke war abhängig von dem PEGylierungsgrad. Die Konjugate haben weniger fest als das unmodifizierte IFN gebunden. Die PEG-IFN-Oligomere wurden mit 40 mM Ammoniumacetat eluiert, während das Konjugat der Formel I mit 0,12 M NaCl eluierte. Das unmodifizierte IFN eluierte mit 0,5 M NaCl. Alle Zubereitungen enthielten < 5EU/mg Endotoxine. Die erhaltene Zubereitung enthielt > 99% Konjugat der Formel I und war frei von unmodifiziertem IFN.
B. Herstellung von Konjugat der Formel I in großem Maßstab
Sechstausendzweihundertvierzig Milligramm (156 μMol) des Reagens der Formel II (mittleres Molekulargewicht von 40000 Dalton) wurden in 63 ml 1 mM HCl bei 4°C gelöst und schnell zu 125 ml einer Lösung, enthaltend 1000 mg (52 μMol) Interferon in 50 mM Boratpuffer, pH 9,0, gegeben. Das Endprotein/Reagens-Verhältnis war 1 : 3 und die Endreaktionsgemischprotein-Konzentration war 5,3 mg/ml. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei 4°C gerührt. Die Reaktion wurde durch Einstellen des pH-Werts auf 4,5 mit Eisessig gestoppt.
Das Reaktionsgemisch wurde 10fach mit Wasser verdünnt und auf eine mit 600 ml Fractogel EMD CM 650(M) gepackte Säu le, vorher mit 20 mM Natriumacetat, pH 4,5, bei einer linearen Geschwindigkeit von 1,3 cm/min ins Gleichgewicht gebracht, aufgetragen. Die Säule wurde mit dem Gleichgewichtspuffer, gefolgt von 10 mM NaCl gewaschen, um überschüssiges Reagens, Reaktionsnebenprodukte und PEG-IFN-Oligomere zu entfernen. Das Konjugat der Formel I wurde mit dem Gleichgewichtspuffer, enthaltend 200 mM NaCl, eluiert. Das unmodifizierte Interferon, das noch an der Säule adsorbiert war, wurde durch Waschen mit 0,75 M NaCl in dem Gleichgewichtspuffer entfernt. Das Konjugat der Formel I, welches bei 0,3–0,5 mg/ml eluierte, wurde weiter aufkonzentriert und in den Endformulierungspuffer, 20 mM Natriumacetat, pH 5,0, enthaltend 150 mM NaCl, diafiltriert. Die Gesamtausbeute des Konjugats der Formel I war 40–5%.
Das gereinigte PEG-IFN von der Zubereitung im Großmaßstab besteht aus > 99% Konjugat der Formel I. Das mittlere Molekulargewicht des Konjugats der Formel I von diesem Beispiel ist 62000 Dalton, einschließlich des Molekulargewichts von IFNα2a, das 19241 Dalton beträgt, und das mittlere Molekulargewicht des Reagens, das zwischen 40000 und 45000 Dalton liegt, etwa 43000 Dalton.
Beispiel 2
Charakterisierung von Konjugat der Formel I
Proteinbestimmung
Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines A₂₈₀Werts von 1,0 für eine 1 mg/ml Lösung von IFNa α2a bestimmt.
SDS-PAGE-Analyse
Das Konjugat wurde durch Natriumdodecyl(lauryl)sulfat/Polyacrylamid (8–16%)-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen gemäß den Verfahren von Laemmli (Nature 227, 680 (1970)) analysiert. SDS-PAGE enthaltende PEG-Konjugate wurden auf Protein unter Verwendung von Fast Stain (Zoion Research, Inc.) gemäß der Anweisungen der Hersteller angefärbt.
Bestimmung von Endotoxinspiegeln
Endotoxinspiegel wurden unter Verwendung des LAL-Verfahrens gemäß der Anweisungen der Hersteller bestimmt. Alle Zubereitungen enthielten < 5 EU/mg Endotoxine.
Beispiel 3
In vitro-Biowirkungen von Konjugat der Formel I
Antivirale Wirkung auf Rindernierenzellen
Die antivirale in vitro-Wirkung von IFNaα2a und das Konjugat der Formel I, wie in Beispiel 1.A. hergestellt, wurden in einem Zellkultur-Bioassay unter Anwenden von Madin-Darby-Rindernieren (MDBK)-Zellen, gereizt mit vesikulärem Stomatitisvirus (Rubinstein et al., supra), bestimmt. Alle antiviralen Wirkungen werden in Tabelle 1 angeführt zusammen mit ihren entsprechenden Restwirkungen als ein Prozentsatz des Ausgangs-IFN.
Tabelle 1 Antivirale Wirkungen
Antiproliferative in vitro-Wirkung auf Humantumorzellen
Die antiproliferativen in vitro-Wirkungen wurden in Human-Daudi (Burkitt's Lymphoma)-Zellen, wie von Borden et al. beschrieben, bestimmt. Human-Daudi-Zellen wurden als stationäre Suspensionskulturen in RPMI 1540, unterschichtet mit 10% fötalem Rinderserum und 2 mM Glutamin (Grand Island Biologicals, Grand Island, NY), gehalten. Die Zellen wurden ab gesucht und erwiesen sich als frei von Mycoplasma gefunden. Zellen (2 × 10⁴) wurden zu Vertiefungen von Mikrotiterplatten (Costar, MA) in 100 μl Medium gegeben. Verschiedene Konzentrationen von IFN und dem Konjugat der Formel I, wie in Beispiel 1.A. hergestellt, wurden zu den Vertiefungen in einem Volumen von 100 μl gegeben. Die Platten wurden bei 37°C in 5%igem CO₂ für 72 Stunden inkubiert.
Die Zellen wurden mit 0,25 μCi/Vertiefung von ³H-Thymidin (New England Nuclear, Boston, MA) sechzehn Stunden vor dem Zellernten gepulst. Die Zellen wurden auf Glasfiltern geerntet und in einem Flüssigszintillationszähler gezählt. Die Ergebnisse wurden als % Inhibierung, berechnet unter Verwendung der Formel: % Inhibierung = [(A – B)/ A] × 100; worinA = cpm in Kontrollkultur (Zellen inkubiert in Medium allein)
B = cpm in experimenteller Kultur ausgedrückt.
Die Proben wurden vierfach laufen lassen und die Standardabweichung war weniger als 20% im Durchschnitt in allen Fällen. Die Versuche wurden mindestens zweimal mit vergleichbaren Ergebnissen durchgeführt.
Die antiproliferativen Wirkungen (IC₅₀) von IFN und dem Konjugat werden in Tabelle 2 aufgeführt. Die Daten zeigen an, dass es eine 28fache Erhöhung der antiproliferativen Wirkung des Konjugats der Formel I verglichen mit jener von IFN gibt.
Tabelle 2 Antiproliferative in vitro-Wirkungen in Human-Daudi (Burkitt's Lymphoma) Zelllinien.
Beispiel 4
Pharmacokinetik
Weibliche Sprague-Dawley-Ratten, chirurgisch implantiert mit jugularen Kanülen, mit einem mittleren Körpergewicht von 240–260 g wurden einzeln gehalten, freien Zugang zu Futter und Wasser wurde erlaubt und ein 12 Stunden Hell-Dunkel-Zyklus wurde eingehalten. Innerhalb 4–6 Stunden nach Erreichen wurden die jugularen Kanülen mit PBS gespült. Am folgenden Tag nach Spülen mit 0,15–0,2 ml PBS wurden 2 × 10⁶ Einheiten IFNa in 0,2–0,4 ml PBS injiziert, gefolgt von Injektion von 0,15–0,2 ml PBS, um zu sichern, dass das gesamte Arzneimittel in das Tier gewaschen wurde. Somit empfing jedes Tier eine Dosierung von 8 × 10⁶ IFNα-Einheiten/kg Körpergewicht.
Blutproben wurden bei 5, 15 und 30 Minuten sowie 1, 3, 5, 12 und 24 Stunden nach Injektion von IFN und dem Konjugat der Formel I gezogen. Zu allen Zeitpunkten nach Verwerfen der ersten 0,15–0,2 ml des Bluts wurde eine aliquote Menge von 0,5 ml Blut unter Verwendung einer frischen Spritze über die Jugularkanüle abgezogen. Die Proben wurden in Serumtrennrohren bei Raumtemperatur entladen. Waren einmal alle Proben für die Zeitpunkte gesammelt, wurden die Rohre bei 14000 × g in einer Eppendorf-Kühlzentrifuge für 10 Minuten zentrifugiert. Das abgetrennte Serum wurde in 1,5 ml Mikrofugenröhrchen überführt und auf –80°C gefroren, bis sie bereit zum Bioassay sind. Serumproben wurden geeigneterweise verdünnt und die antivirale Wirkung wurde zu jedem Zeitpunkt wie beschrieben bestimmt. Von der Auftragung der Zeit gegen die Wirkung wurde die Endhalbwertszeit des Konjugats der Formel I und IFNα bestimmt und in Tabelle 3 angeführt, was auch Plasmaaufenthaltszeiten einschließt.
Tabelle 3 Endhalbwertszeit (t_1/2) und mittlere Plasmaaufenthaltszeit
Beispiel 5
Immunogenizität
Normale BDF-1-Mäuse (zehn pro Gruppe) wurde intraperitoneal einmal pro Tag fünfmal pro Woche mit verschiedenen Interferonzubereitungen mit 300000 Einheiten antiviraler Wirkung injiziert. Einigen Mäusen wurden auch die aggregierte Form von IFNα2a, die immunogener ist als die monomere Form, injiziert. Blutproben wurden 19 Tage nach der letzten Injektion genommen und das Serum wurde auf neutralisierende Antikörper bewertet. Wie in Tabelle 4 ersichtlich, erzeugte mit IFNα2a injizierte Mäuse neutralisierende Antikörper und diese Reaktion war stark erhöht in den Mäusen, die mit Interferonaggregaten injiziert wurde. Keine Antikörper waren bei der Mehrheit der Tiere, die mit dem erfindungsgemäßen Konjugat injiziert wurden, nachweisbar.
Tabelle 4 Immunogenizität
Beispiel 6
in vivo-Antitumorwirkung
Die in vivo-Antitumorwirkung eines Konjugats der Formel I (PEG2-IFNalpha2a) und unmodifiziertes IFNalpha2a wurden durch Bestimmen ihrer Fähigkeit, die Größe von verschiedenen, subcutan in Mäuse implantierten Humantumorzellen zu vermindern, bewertet. Die Ergebnisse werden in 1–6 gezeigt.
Verfahren: Athymische Nacktmäuse (Harlan) erhielten ein subcutanes Implantat unter der linken Rückflanke von 2 × 10⁶ humanen renalen A498-Zellen (1 und 2), humanen renalen ACHN-Zellen (3 und 4) oder humanen renalen G402-Zellen (5 und 6). Die Tumore ließ man sich wie ausgewiesen 3 bis 6 Wochen festsetzen. Die Größenkriterien für die Akzeptanz in der Studie war 0,05 bis 0,50 Kubikzentimeter. Den Mäusen wurden ganzwöchentlich Dosen von PEG2-IFNalpha2a und unmodifiziertem IFNalpha2a von 30, 60, 120 oder 300 μg gegeben. Im Fall von PEG2-IFNalpha2a wurden die Mäuse einmal pro Woche (Montag) mit 30, 60, 120 oder 300 μg PEG2-IFNalpha2a pro Behandlung behandelt. Im Fall von unmodifiziertem IFNalpha2a wurden die Mäuse dreimal pro Woche (Montag, Mittwoch, Freitag) mit 10, 20, 40 oder 100 μg IFNalpha2a pro Behandlung behandelt. Die Behandlungsdauer war 4 bis 5 Wochen in Abhängigkeit von der Tumoraggressivität. Tumorvolumen wurden jeden Montag vor den Behandlungen gemessen.
Ergebnisse: PEG2-IFNalpha2a zeigte eine deutliche Verminderung in der A498-Tumorgröße für alle wöchentlichen Dosierungsspiegel getestet bei 7 Tagen, 14 Tagen, 21 Tagen und 28 Tagen nach dem Beginn der Behandlung (1 und 2), wenn mit unmodifiziertem IFNalpha2a verglichen. Die Behandlung wurde für vier Wochen fortgesetzt. Sieben Tage später wurde die Behandlung unterbrochen, wobei drei Mäuse jeder Gruppe geopfert wurden. In drei mit PEG2-IFNalpha2a behandelten Mäusen wurde kein Resttumor beobachtet. In mit unmodifiziertem IFNalpha2a behandelter Maus war das A498-Tumorgewicht 1,28 Gramm, 0,62 Gramm bzw. 1,60 Gramm für jede der drei Mäuse. Das A498-Tumorgewicht war 2,32 Gramm, 2,37 Gramm und 1,94 Gramm in jeder der drei Kontrollmäuse. Bei 80 Tagen am Ende des Vier-Wochen-Behandlungszeitraums wurde das Vorliegen von Tumoren durch Befühlen in sieben Mäusen bestimmt. Alle sieben Mäuse waren frei von Tumorgewebe durch Befühlen.
PEG2-IFNalpha2a zeigte eine signifikante Verminderung in ACHN-Tumorgröße für wöchentliche Dosierungsspiegel von 60, 120 und 300 μg bei 14 Tagen, 21 Tagen, 28 Tagen und 35 Tagen (3 und 4), wenn mit unmodifiziertem IFNalpha2a verglichen.
PEG2-IFNalpha2a zeigte eine signifikante Verminderung an der G402-Tumorgröße, wie verglichen mit unmodifiziertem IFNalpha2a für wöchentliche Dosierungsspiegel von 60 und 120 μg bei 14 Tagen, 21 Tagen, 28 Tagen und 35 Tagen (5 und 6).

Claims

Physiologisch wirksames pegyliertes Interferon α-Konjugat mit der Formel
worin R und R' unabhängig C₁-C₆-Alkyl darstellen; X NH oder 0 darstellt; n und n' ganze Zahlen mit einer Summe von 600 bis 1 500 sind und das mittlere Molekulargewicht der Polyethylenglykoleinheiten in dem Konjugat 26 000 Dalton bis 66 000 Dalton ist.
Konjugat nach Anspruch 1, worin das Molekulargewicht der Polyethylenglykoleinheiten 35 000 bis 45 000 Dalton ist.
Konjugat nach Anspruch 2, worin das Molekulargewicht der Polyethylenglykoleinheiten 40 000 Dalton ist.
Konjugat nach Anspruch 1, worin R und R' Methyl darstellen.
Konjugat nach Anspruch 1, worin X NH darstellt.
Konjugat nach Anspruch 1, worin das Interferon α Interferon α2a ist.
Konjugat nach Anspruch 1, worin die mittlere Summe von n und n' 850 bis 1 000 ist.
Konjugat nach Anspruch 1, worin R und R' Methyl darstellen; X NH darstellt; Interferon α Interferon α2a darstellt und einer oder beide von n und n' 420 ist.
Konjugat nach Anspruch 1, worin R und R' Methyl darstellen; X NH darstellt; Interferon α Interferon α2a darstellt und einer oder beide von n und n' 520 ist.
Konjugat nach Anspruch 1, welches eine höhere antiproliferative Wirksamkeit als Interferon α und eine geringere antivirale Wirksamkeit als Interferon α aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines pegylierten Interferon α-Konjugats mit einer erhöhten antiproliferativen Wirksamkeit und verminderten antiviralen Wirksamkeit, verglichen mit Interferon α, wobei das Verfahren im kovalenten Binden eines Reagenz der Formel II
worin R, R', n und n' wie in Anspruch 1 definiert sind, an Interferon α unter Herstellung des pegylierten Interferon α-Konjugats besteht.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend ein pegyliertes Interferon α-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und einen therapeutisch inerten Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung oder Prophylaxe von immunomodulatorischen Störungen, wie neoplastische Erkrankungen oder Infektionserkrankungen, umfassend ein pegyliertes Interferon α-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und einen therapeutisch inerten Träger.
Verwendung eines pegylierten Interferon α-Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten.