PL196533B1 - Sposób stopniowego przyłączania ugrupowań poli (glikolu etylenowego) (PEG) szeregowo do polipeptydu - Google Patents

Sposób stopniowego przyłączania ugrupowań poli (glikolu etylenowego) (PEG) szeregowo do polipeptydu

Info

Publication number
PL196533B1
PL196533B1 PL378728A PL37872899A PL196533B1 PL 196533 B1 PL196533 B1 PL 196533B1 PL 378728 A PL378728 A PL 378728A PL 37872899 A PL37872899 A PL 37872899A PL 196533 B1 PL196533 B1 PL 196533B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
peg
ifn
polypeptide
molecular weight
group
Prior art date
Application number
PL378728A
Other languages
English (en)
Inventor
Tayar Nabil El
Michael J. Roberts
Milton Harris
Wayne Sawlivich
Original Assignee
Applied Research Systems
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applied Research Systems filed Critical Applied Research Systems
Publication of PL196533B1 publication Critical patent/PL196533B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

1. Sposób stopniowego przy laczania ugrupowa n poli(glikolu etylenowego) (PEG) szeregowo do polipeptydu, znamienny tym, ze a) poddaje si e polipeptyd reakcji z heterodwufunkcyjnym lub homodwufunkcyjnym ugrupowaniem PEG o masie cz asteczkowej w zakresie od oko lo 100 do 5000 daltonów i o nast epuj acym wzorze: W-CH 2 CH 2 O(CH 2 CH 2 O) n CH 2 CH 2 -X, w którym W i X oznaczaj a grupy niezale znie reaguj ace z funkcyjn a grup a aminow a, tiolow a, karboksylow a lub hydroksylow a, z przy laczeniem ugrupowania PEG o ma lej masie cz asteczkowej do polipeptydu, oraz b) poddaje si e przy laczone do polipeptydu ugrupowanie PEG o malej masie cz asteczkowej re- akcji z jednofunkcyjnym lub dwufunkcyjnym ugrupowaniem PEG o masie cz asteczkowej w zakresie od oko lo 100 daltonów do 200 kilodaltonów, z przylaczeniem jednofunkcyjnego lub dwufunkcyjnego ugrupowania PEG do wolnego ko nca ugrupowania PEG o ma lej masie cz asteczkowej i utworzeniem koniugatu PEG-polipeptyd. PL PL PL PL PL PL PL

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 378728 (22) Data zgłoszenia: 28.04.1999 (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie:
344490 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
28.04.1999, PCT/US99/09161 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
04.11.1999, WO99/55377 PCT Gazette nr 44/99 (11) 196533 (13) B1 (51) Int.Cl.
A61K 47/48 (2006.01)
Sposób stopniowego przyłączania ugrupowań poli(glikolu etylenowego) (PEG) szeregowo do polipeptydu
(73) Uprawniony z patentu: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS
(30) Pierwszeństwo: HOLDING N.V.,Curacao,AN
28.04.1998,US,60/083,339 (72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 05.11.2001 BUP 23/01 Nabil El Tayar,Milton,US Michael J. Roberts,Madison,US Milton Harris,Huntsville,US Wayne Sawlivich,Wilmington,US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.01.2008 WUP 01/08 (74) Pełnomocnik:
Zofia Szczepańska, PATPOL Sp. z o.o.
(57) 1. Sposób stopniowego przyłączania ugrupowań poli(glikolu etylenowego) (PEG) szeregowo do polipeptydu, znamienny tym, że
a) poddaje się polipeptyd reakcji z heterodwufunkcyjnym lub homodwufunkcyjnym ugrupowaniem PEG o masie cząsteczkowej w zakresie od około 100 do 5000 daltonów i o następującym wzorze:
W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X, w którym W i X oznaczają grupy niezależnie reagujące z funkcyjną grupą aminową , tiolową, karboksylową lub hydroksylową, z przyłączeniem ugrupowania PEG o małej masie cząsteczkowej do polipeptydu, oraz
b) poddaje się przyłączone do polipeptydu ugrupowanie PEG o małej masie cząsteczkowej reakcji z jednofunkcyjnym lub dwufunkcyjnym ugrupowaniem PEG o masie cząsteczkowej w zakresie od około 100 daltonów do 200 kilodaltonów, z przyłączeniem jednofunkcyjnego lub dwufunkcyjnego ugrupowania PEG do wolnego końca ugrupowania PEG o małej masie cząsteczkowej i utworzeniem koniugatu PEG-polipeptyd.
PL 196 533 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób stopniowego przyłączania ugrupowań poli(glikolu etylenowego) (PEG) szeregowo do polipeptydu, zastosowanie koniugatów PEG-polipeptyd oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca te koniugaty.
Opisano także koniugaty PEG-IFN-β, w których poliol jest kowalencyjnie związany z Cys oraz sposób, specyficznego względem miejsca, wytwarzania tych koniugatów i ich użycie w leczeniu, prognozowaniu lub diagnozowaniu zakażeń bakteryjnych, zakażeń wirusowych, chorób autoimmunizacyjnych i chorób zapalnych.
Ludzki interferon fibroblastowy (IFN-β) wykazuje aktywność przeciwwirusową i może także stymulować aktywność naturalnych komórek-zabójców (komórek K) skierowaną przeciw komórkom nowotworowym. Jest to polipeptyd o około 20000 Da, indukowany przez wirusy i dwuniciowy DNA. Z sekwencji nukleotydów genu dla interferonu fibroblastowego, po sklonowaniu metodą rekombinacji DNA, Derynk i in. [Nature, 285, 542-547 (1980)] wydedukowali pełną sekwencję aminokwasów tego białka. Jej długość wynosi 166 aminokwasów.
Shepard i in. [Nature, 294. 563-565 (1981)] opisali mutację przy zasadzie 842 (Cys > Tyr w pozycji 141) niweczącą aktywność przeciwwirusową oraz klon wariantowy z delecją nukleotydów 1119 - 1121.
Mark i in [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81(18), 5662 -5666 (1984)] dokonali wstawienia sztucznej mutacji za pomocą zastąpienia zasady 469 (T) przez (A), powodując w ten sposób przestawienie aminokwasów z Cys > Ser w pozycji 17. Doniesiono, że otrzymany IFN-β był tak samo aktywny jak IFN-β „natywny”, a także wykazywał stabilność w warunkach długotrwałego przechowywania (w temperaturze -70°C).
Kowalencyjne przyłączenie do cząsteczek polimeru hydrofilowego, a mianowicie poli(glikolu etylenowego) (PEG), znanego także jako poli(tlenek etylenu) (PEO), znajduje ważne zastosowanie w biotechnologii i medycynie. W swej najbardziej typowej postaci PEG jest liniowym polimerem z grupami hydroksylowymi na obu końcach:
HO-CH2-CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-OH
Wzór ten można w skróceniu przedstawić jako HO-PEG-OH, przy czym rozumie się, że -PEGoznacza szkielet polimeru bez grup końcowych:
„-PEG- oznacza ”-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2PEG stosowany jest zwykle jako metoksy-PEG-OH (m-PEG), w którym jeden koniec stanowi względnie obojętna grupa metoksylowa, a drugi grupa hydroksylowa, podlegająca modyfikacji chemicznej:
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
Powszechnie stosowane są także PEG rozgałęzione. PEG rozgałęzione można przedstawić wzorem:
R(-PEG-OH)m w którym R oznacza centralne ugrupowanie rdzeniowe, takie jak pentaerytrytol lub glicerol, a m oznacza liczbę rozgałęzionych ramion. Ilość rozgałęzionych ramion (m) może mieścić się w zakresie od 3 do 100 lub więcej. Grupy hydroksylowe poddaje się modyfikacji chemicznej.
Inna rozgałęziona postać PEG, taka, jaką opisano w zgłoszeniu patentowym PCT WO 96/21469, posiada pojedynczy koniec podlegający modyfikacji chemicznej. PEG tego typu można przedstawić wzorem:
(CH3O-PEG-)pR-X w którym p oznacza 2 lub 3, R oznacza centralny rdzeń, taki jak lizyna lub glicerol, a X oznacza grupę funkcyjną, taką jak grupa karboksylowa, która podlega modyfikacji chemicznej. Jeszcze inna postać rozgałęziona, a mianowicie „PEG z grupami bocznymi” zawiera grupy funkcyjne, takie jak grupa karboksylowa, rozmieszczone raczej wzdłuż szkieletu PEG niż na końcu łańcuchów PEG.
Oprócz tych postaci PEG, polimer ten można wytworzyć także w postaci zawierającej słabe lub ulegające rozkładowi wiązania w szkielecie. I tak, na przykład, Harris (U.S. Patent Application 06/026716)
PL 196 533 B1 wykazał, że można wytworzyć PEG z ulegającymi hydrolizie wiązaniami estrowymi w szkielecie polimeru. Hydroliza taka prowadzi do rozszczepienia polimeru na fragmenty o mniejszej masie cząsteczkowej, zgodnie z poniższym schematem reakcji:
-PEG-CO2-PEG- + H2O 0 PEG-CO2H + HO-PEGRozumie się, że stosowany w niniejszym opisie termin „poli(glikol etylenowy)” lub „PEG” obejmuje swym zakresem wszystkie pochodne wyżej opisane.
Z PEG są ściśle spokrewnione, pod względem chemicznym, kopolimery tlenku etylenu i tlenku propylenu i można ich używać zamiast PEG w wielu zastosowaniach. Mają one wzór następujący:
HO-CH2CHRO (CH2CHRO) nCH2CHR-OH w którym R oznacza H lub CH3.
PEG jest użytecznym polimerem odznaczającym się właściwością dobrej rozpuszczalności w wodzie, jak również dobrą rozpuszczalnością w szeregu rozpuszczalników organicznych. PEG jest także nietoksyczny i nieimmunogenny. W przypadku przyłączania PEG metodą chemiczną (ang. PE-Gylation, w dalszym ciągu niniejszego opisu „PEG-ilowanie” - przyp. tłum.) do związku nierozpuszczalnego w wodzie, powstały tak koniugat jest na ogół rozpuszczalny w wodzie, a także rozpuszczalny w wielu rozpuszczalnikach organicznych.
Obecnie, koniugatu PEG-białko używa się w metodach leczenia obejmujących zastępowanie białka i w innych sposobach leczenia. I tak, na przykład, PEG-ilowana deaminaza adenozynowa (ADAGEN®) stosowana jest do leczenia ostrego złożonego upośledzenia odporności (SCIDS), PEG-ilowanej L-asparaginazy (ONCAPSPAR®) używa się do leczenia ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL), a PEG-ilowany interferon α [INTRON(R) A] znajduje się w III fazie prób leczenia zapalenia wątroby C.
Jeśli chodzi o ogólny przegląd klinicznie skutecznych koniugatów PEG-białko patrz: N.L. Burnham, Am. Chem. Hosp. Pharm., 15, 210 - 218 (1994).
Opracowano szereg różnych metod PEG-ilowania białek. Typowo, przyłączenia PEG do reaktywnych grup znajdujących się na białku dokonuje się z wykorzystaniem elektronofilowo zaktywowanych pochodnych PEG. Przyłączenie PEG do grup aminowych α i ε znajdujących się na resztach lizyny i N-końcu prowadzi do otrzymania koniugatu złożonego z mieszaniny produktów.
Ogólnie, koniugaty tego rodzaju złożone są z populacji szeregu cząsteczek PEG przyłączonych do jednej cząsteczki białka („PEGmery”) w ilości mieszczącej się w zakresie od 0 do liczby grup aminowych w tym białku. W przypadku pojedynczo zmodyfikowanej cząsteczki białka, jednostka PEG może być przyłączona w aktualnej ilości różnych miejsc o charakterze aminowym.
Ten typ niespecyficznego PEG-ilowania prowadzi do powstania szeregu koniugatów, które stają się prawie pozbawione aktywności. Typowo, to zmniejszenie się aktywności spowodowane jest przez ekranowanie aktywnej wiążącej domeny białka, jak to się zdarza w przypadku wielu cytokin i przeciwciał. I tak, na przykład, Katre i in. w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4766106 i w patencie
Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4917888 opisują PEG-ilowanie IFN-β i IL-2 użytym w dużym nadmiarze glutaranem metoksy-polietylenoglikolilo-N-sukcynoimidylu i bursztynianem metoksy-polietylenoglikolilo-N-sukcynoimidylu. Oba te białka wytworzono w drobnoustrojowych komórkach-gospodarzach, co umożliwiło specyficzną względem miejsca mutację wolnej cysteiny do seryny. Mutacja była potrzebna w mikrobiologicznej ekspresji IFN-β dla ułatwienia sfałdowania białka. W szczególności, jako
IFN-β stosowanego w tych eksperymentach użyto produktu handlowego Betaseron®, w którym reszta
Cys17 zastąpiona jest seryną. Oprócz tego, brak glikozylacji doprowadził do zmniejszenia jego rozpuszczalności w roztworze wodnym. Niespecyficzna PEG-ilacja doprowadziła do zwiększenia rozpuszczalności, ale głównym problemem pozostał obniżony poziom aktywności, a także wydajności.
W europejskim zgłoszeniu patentowym EP 593868, zatytułowanym „Koniugaty PEG-interferon”, opisano wytwarzanie koniugatów PEG-IFN-α. Jednakże, reakcja PEG-ilowania nie jest specyficzna względem miejsca, w wyniku czego otrzymuje się mieszaninę pozycyjnych izomerów koniugatów PEG-IFN-α [patrz także: Monkarsh i in., ACS Symp. Ser., 680, 207-216 (1997)].
Kinstler i in. w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 675 201 zademonstrowali selektywną modyfikację N-końcowej reszty megakariocytowego czynnika wzrostu i rozwoju (MGDF) przy użyciu m-PEG-propionoaldehydu. Postępowanie takie umożliwiło dokonywanie w powtarzalny sposób PEG-ilowania i uzyskiwania odtwarzalnej farmakokinetyki z serii (produkcyjnej) na serię.
Gilbert i in. w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5711944 pokazali, że możliwe jest PEG-ilowanie IFN-α z osiągnięciem optymalnego poziomu aktywności. W ich przypadku potrzebne
PL 196 533 B1 okazało się wprowadzenie pracochłonnego etapu oczyszczania w celu uzyskania koniugatu o optymalnych właściwościach.
Większość cytokin, tak jak i innych białek, nie posiada specyficznego miejsca przyłączania PEG i (poza wymienionymi powyżej przykładami) jest wysoce prawdopodobne, że niektóre izomery wytworzone na drodze reakcji PEG-ilowania są częściowo, lub całkowicie, nieaktywne. Prowadzi to do utraty aktywności końcowej mieszaniny.
Tak więc, pożądanym celem wytwarzania koniugatów białkowych tego rodzaju jest mono-PEG-ilowanie specyficzne względem miejsca.
Woghiren i in. [Bioconjugate Chem., 4(5), 314-318 (1993)] zsyntetyzowali specyficzną względem grupy tiolowej pochodną PEG w celu wykorzystania jej w PEG-acylowaniu specyficznym względem miejsca. Wykazali oni, że trwała, z zabezpieczoną grupą tiolową pochodna PEG w postaci reaktywnej grupy disulfidu p-pirydylowego, tworzy w sposób specyficzny koniugat z wolną cysteiną obecną w białku, a mianowicie papainie. Nowo utworzone wiązanie disulfidowe między papainą a PEG można było rozszczepić w łagodnych warunkach redukujących, ze zregenerowaniem białka natywnego.
Publikacja Goodsona i innych [BIOTECHNOLOGY, tom 8, nr 4 (1990), str. 343-346] ujawnia jednoetapowy sposób PEG-ilowania, osiągnięty w reakcji muteiny rlL-2 z nadmiarem molowym reagenta PEG, zawierającego grupy maleimidowe. Ugrupowanie poli(glikolu etylenowego) posiada masę cząsteczkową wynoszącą 6 000 Da. Dokument ten nie dostarcza wiedzy dotyczącej stopniowego przyłączania dwóch różniących się ugrupowań PEG.
Opis patentowy PL 185821 B1 ujawnia PEG-ilowanie rekombinantu czynnika VIII. W szczególności, dokument ten dotyczy sposobu ulepszania funkcji polipeptydu in vivo. Jednak dokument ten nie dostarcza wiedzy dotyczącej stopniowego przyłączania dwóch różniących się jednostek poli(glikolu etylenowego).
Sposób stopniowego przyłączania ugrupowań poli(glikolu etylenowego) (PEG) szeregowo do polipeptydu, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że
a) poddaje się polipeptyd reakcji z heterodwufunkcyjnym lub homodwufunkcyjnym ugrupowaniem PEG o masie cząsteczkowej w zakresie od około 100 do 5000 daltonów i o następującym wzorze:
W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X, w którym W i X oznaczają grupy niezależnie reagujące z funkcyjną grupą aminową, tiolową, karboksylową lub hydroksylową, z przyłączeniem ugrupowania PEG o małej masie cząsteczkowej do polipeptydu, oraz
b) poddaje się przyłączone do polipeptydu ugrupowanie PEG o małej masie cząsteczkowej reakcji z jednofunkcyjnym lub dwufunkcyjnym ugrupowaniem PEG o masie cząsteczkowej w zakresie od około 100 daltonów do 200 kilodaltonów, z przyłączeniem jednofunkcyjnego lub dwufunkcyjnego ugrupowania PEG do wolnego końca ugrupowania PEG o małej masie cząsteczkowej i utworzeniem koniugatu PEG-polipeptyd.
Korzystnie, stosuje się jednofunkcyjne lub dwufunkcyjne ugrupowanie PEG o następującym wzorze:
Y-CH2CH2O(CH2CH2O)mCH2CH2-Z, w którym Y oznacza grupę reaktywną w stosunku do końcowej grupy na wolnym końcu ugrupowania PEG o małej masie cząsteczkowej przyłączonego do polipeptydu, a Z oznacza -OCH3 lub grupę reaktywną w stosunku do grupy o symbolu X, z utworzeniem grupy dwufunkcyjnej.
Bardziej korzystnie, jako jednofunkcyjne lub dwufunkcyjne ugrupowanie PEG stosuje się metoksy-PEG, rozgałęziony PEG, ulegający rozkładowi hydrolitycznemu lub enzymatycznemu PEG, PEG z grupami bocznymi lub dendrymerowy PEG.
Korzystnie, grupy o symbolach W i X są niezależnie wybrane z grupy obejmującej disulfid o-pirydylowy, maleimidy, sulfony winylowe, jodoacetamidy, hydrazydy, aldehydy, estry sukcynoimidowe, epoksydy, aminy, tiole, związki karboksylowe, aktywne estry, pochodne węglanowe benzotriazololu, pochodne węglanowe p-nitrofenolu, izocyjaniany i biotynę.
Korzystnie, stosuje się ugrupowanie PEG o małej masie cząsteczkowej i/lub jednofunkcyjne lub dwufunkcyjne ugrupowanie PEG, stanowiące kopolimer poli(glikolu etylenowego).
Bardziej korzystnie, kopolimer poli(glikolu etylenowego) jest wybrany z grupy obejmującej kopolimery poli(glikol etylenowy)/poli(glikol propylenowy) i kopolimery poli(glikol etylenowy)/poli(kwas mlekowy/glikolowy).
PL 196 533 B1
Korzystnie, sposób obejmuje jeszcze etap oczyszczania koniugatu PEG-polipeptyd następujący po stopniowym przyłączeniu dwóch ugrupowań PEG szeregowo do polipeptydu.
Bardziej korzystnie, w etapie oczyszczania wykorzystuje się jedną, lub więcej niż jedną metodę oczyszczania, wybraną z grupy obejmującej chromatografię jonowymienną, chromatografię ekskluzyjną, chromatografię z interakcją hydrofobową, chromatografię powinowactwa i chromatografię z odwróconymi fazami.
Korzystnie, jako polipeptyd stosuje się interferon β.
Koniugaty PEG-polipeptyd, wytworzone sposobem według wynalazku, stosuje się jako leki.
Koniugaty PEG-polipeptyd, wytworzone sposobem według wynalazku, stosuje się do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia zakażeń bakteryjnych i wirusowych, nowotworów i chorób autoimmunizacyjnych i zapalnych.
Korzystnie, choroba jest wybrana z grupy obejmującej wstrząs septyczny, AIDS, zapalenie stawów reumatoidalne, liszaj rumieniowaty i stwardnienie rozsiane.
Kompozycja farmaceutyczna zawiera koniugaty PEG-polipeptyd, wytworzone sposobem według wynalazku, jako składnik aktywny oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozczynnik lub środek pomocniczy.
Krótki opis rysunków
Figura 1 przedstawia wykres elektroforezy kapilarnej (CE) koniugatu PEG-IFN-β przed oczyszczeniem.
Figury 2A-2C przedstawiają oczyszczanie koniugatu PEG-IFN-β przeprowadzane metodą chromatografii ekskluzyjnej (Superose 12): fig. 2A - pierwsze przejście; fig. 2B - drugie przejście; fig. 2C - trzecie przejście;
Figura 3 przedstawia chromatografię SDS-PAGE oczyszczonego koniugatu PEG-IFN-β z trzeciego przejścia chromatografii. Ścieżki 1 i 4 są to wzorce masy cząsteczkowej białka, ścieżka 2 jest to „natywny” IFN-β, a ścieżka 3 jest to koniugat PEG-IFN-β.
Figura 4 przedstawia wykres elektroforezy kapilarnej (CE) oczyszczonego koniugatu PEG-IFN-β, w którym IFN-β został PEG-ilowany przy użyciu mPEG-OPSS5k.
Figura 5 przedstawia widmo MALDI MS oczyszczonego koniugatu PEG-IFN-β.
Figura 6 przedstawia porównanie przeciwwirusowej aktywności „natywnego” IFN-β i koniugatu PEG-IFN-β. Komórki WISH inkubowano ze wskazanymi stężeniami próbek IFN-β w ciągu 24 godzin, po czym poddano je prowokacji cytopatycznymi dawkami wirusa pryszczycy. Efekt cytopatyczny oznaczano po upływie dalszych 48 godzin na podstawie konwersji MTT.
Figura 7 przedstawia profil wiązania IFN-β i PEG-IFN-β w komórkach Daudi.
Figura 8 przedstawia profil farmakokinetyczny IFN-β i PEG-IFN-β u myszy po podaniu dożylnym. Linie kropkowane pokazują LOQ testu dla każdej krzywej wzorcowej.
Figura 9 przedstawia profil farmakokinetyczny IFN-β i PEG-IFN-β u myszy po podaniu podskórnym. Linie kropkowane pokazują LOQ testu dla każdej krzywej wzorcowej.
Szczegółowy opis wynalazku
Wynalazek niniejszy oparty jest na odkryciu, że przyłączenie ugrupowania poliolu, a bardziej szczegółowo ugrupowania PEG, do reszty Cys17 ludzkiego IFN-β, nieoczekiwanie wzmagało biologiczną aktywność IFN-β wykazywaną przez natywny ludzki interferon-β (a co najmniej utrzymywało ją i nie prowadziło do jej osłabienia). I tak, IFN-β z ugrupowaniem poliolu przyłączonym do reszty Cys17 wykazuje taką samą, lub zwiększoną aktywność biologiczną IFN-β, jednakże tego rodzaju koniugat poliol-IFN-β zapewnia także pożądane właściwości nadawane przez ugrupowanie poliolu, takie jak lepsza rozpuszczalność.
Stosowany w niniejszym opisie termin „IFN-β” oznacza ludzki interferon fibroblastowy, otrzymany przez wyodrębnienie z płynów fizjologicznych, lub metodami rekombinacji DNA z prokariotycznych lub eukariotycznych komórek-gospodarzy, jak równie jego sole, funkcjonalne pochodne, prekursory i frakcje aktywne, z tym, że zawierają one resztę cysteiny obecną w pozycji 17 formy naturalnej.
Ugrupowaniem poliolu w koniugacie poliol-IFN-β według niniejszego wynalazku może być dowolny, rozpuszczalny w wodzie jedno- lub dwufunkcyjny poli(tlenek alkilenu) o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym. Typowo, poliolem jest poli(glikol alkilenowy), taki jak poli(glikol etylenowy) (PEG). Jednakże, specjaliści w tej dziedzinie wiedzy zdadzą sobie sprawę z tego, że można tu stosownie użyć także innych polioli, takich jak, na przykład, poli(glikol propylenowy) oraz kopolimery poli(glikolu etylenowego) i poli(glikolu propylenowego).
PL 196 533 B1
Stosowany w niniejszym opisie termin „ugrupowanie PEG” w zamierzeniu obejmuje swym zakresem PEG o łańcuchu prostym i rozgałęzionym, metoksy-PEG, PEG ulegający rozkładowi hydrolitycznemu lub enzymatycznemu, PEG z grupami bocznymi, dendrymeryczny PEG, kopolimery PEG i jednego, lub więcej niż jednego poliolu, oraz kopolimery PEG i PLGA [poli(kwas mlekowy/kwas glikolowy)].
Stosowany w niniejszym opisie termin „sole” oznacza sole utworzone z udziałem obecnych w związku zarówno grup karboksylowych, jak i funkcyjnych grup aminowych, które to sole można otrzymać znanymi metodami. Do soli grup karboksylowych należą sole nieorganiczne, takie jak, na przykład, sole sodowe, potasowe, wapniowe oraz sole utworzone z zasadami organicznymi, takie jak, na przykład, sole utworzone z aminami i trietanoloaminą, argininą i lizyną. Do soli grup aminowych należą, na przykład, sole utworzone z kwasami nieorganicznymi, takimi jak kwas chlorowodorowy, oraz z kwasami organicznymi, takimi jak kwas octowy.
Stosowany w niniejszym opisie termin „pochodne funkcjonalne” odnosi się do pochodnych, które można wytworzyć z wykorzystaniem grup funkcyjnych obecnych w bocznych łańcuchach ugrupowań aminokwasowych lub w N- lub C-końcowych grupach, zgodnie ze znanymi sposobami postępowania, i które objęte są zakresem niniejszego wynalazku wtedy, gdy są farmaceutycznie dozwolone, to znaczy wtedy, gdy nie niszczą aktywności białka lub gdy nie nadają właściwości toksycznych zawierającym je kompozycjom farmaceutycznym. Do pochodnych takich należą, przykładowo, estry lub alifatyczne amidy grup karboksylowych, a także pochodne N-acylowe wolnych grup aminowych lub pochodne O-acylowe wolnych grup hydroksylowych. Są one utworzone z udziałem grup acylowych, jak, na przykład, w przypadku grup alkanoilowych lub aroilowych.
Stosowany w niniejszym opisie termin „prekursory” oznacza związki, które są przekształcane w IFN-β w organizmie ludzkim lub zwierzęcym.
Stosowany w niniejszym opisie termin „frakcje aktywne” białka odnosi się do jakiegokolwiek fragmentu lub prekursora łańcucha polipeptydowego związku jako takiego, samego lub w kombinacji z pokrewnymi cząsteczkami lub resztami z nim związanymi, na przykład resztami cukrowymi lub fosforanowymi, albo agregatami cząsteczki polipeptydu, jeżeli tylko te fragmenty lub prekursory wykazują, jako lek, taką samą aktywność, jaką przejawia IFN-β.
Koniugaty według niniejszego wynalazku można wytworzyć którąkolwiek spośród stosownych metod znanych w tej dziedzinie techniki. Zgodnie z jednym ze sposobów wykonania niniejszego wynalazku IFN-β poddaje się reakcji ze środkiem PEG-ilującym w środowisku odpowiedniego rozpuszczalnika, po czym pożądany koniugat wyodrębnia się i oczyszcza, na przykład, z zastosowaniem jednej, lub więcej niż jednej metody chromatograficznej.
Stosowany w niniejszym opisie termin „metoda chromatograficzna” oznacza jakąkolwiek technikę stosowaną do wydzielania poszczególnych składników mieszaniny przez naniesienie jej na nośnik (faza stacjonarna), przez który przepływa rozpuszczalnik (faza ruchoma). Zasady rozdziału chromatograficznego oparte są na odmiennym fizycznym charakterze fazy stacjonarnej i fazy ruchomej.
Do niektórych konkretnych typów metod chromatograficznych, dobrze znanych z piśmiennictwa, należą: chromatografia cieczowa, chromatografia cieczowa wysokosprawna, chromatografia jonowymienna, chromatografia absorpcyjna, chromatografia powinowactwa, chromatografia podziałowa, chromatografia hydrofobowa, chromatografia z odwróconymi fazami, chromatografia ekskluzyjna, ultrafiltracja lub chromatografia cienkowarstwowa.
Stosowany w niniejszym opisie termin „środek PEG-ilujący reaktywny w stosunku do grupy tiolowej” oznacza dowolną pochodną PEG zdolną do reagowania z grupą tiolową reszty cysteiny. Może to być, na przykład, PEG zawierający grupę funkcyjną, taką jak ugrupowanie disulfidu o-pirydylowego, sulfonu winylowego, maleimidu, jodoacetimidu i inne. Zgodnie z korzystnym sposobem wykonania niniejszego wynalazku, środkiem PEG-ilującym reaktywnym w stosunku do grupy tiolowej jest pochodna PEG w postaci jego disulfidu o-pirydylowego (OPSS).
Środka PEG-ilującego używa się w formie monometoksylowanej, w przypadku której tylko jeden koniec jest dostępny dla koniugowania, albo w formie dwufunkcyjnej, w przypadku której oba końce są dostępne dla tej reakcji, jak na przykład przy tworzeniu koniugatu z dwoma IFN-β kowalencyjnie przyłączonymi do jednego ugrupowania PEG. Jego masa cząsteczkowa korzystnie mieści się w zakresie od 500 do 100000.
Poniżej pokazany jest typowy schemat reakcji prowadzących do wytworzenia koniugatów według wynalazku:
PL 196 533 B1
N-y PH<7
Białko-SH + mPEG-S-S\_2-
mPEG-S-S- białko β- merkaptoetanoi
Białko-S-H + mPEG-S-H + HOCH2CH2-S-S-CH2CH2OH
Drugi wiersz powyższego schematu przedstawia sposób rozszczepienia wiązania PEG-białko. Pochodna mPEG-OPSS jest wysoce selektywna w stosunku do grup tiolowych i szybko reaguje w warunkach kwasowego zakresu wartości pH, podczas gdy IFN-β zachowuje stabilność. Tę wysoką selektywność można zademonstrować przez sprowadzenie koniugatu do natywnej postaci IFN-β i PEG.
Wykazano, że wiązanie disulfidowe utworzone między ugrupowaniami białka a PEG jest trwałe w krążeniu, ale że może ulec likwidacji po wniknięciu do środowiska komórki. Stąd też, oczekuje się, że koniugat ten, w przypadku nie wniknięcia do komórki, będzie trwały w krążeniu, aż do usunięcia.
Należy zauważyć, że powyższa reakcja jest specyficzna względem miejsca, ponieważ dwie inne reszty Cys obecne w pozycjach 31 i 141 w występującej naturalnie postaci ludzkiego IFN-β nie reagują ze środkiem PEG-ilującym, tworząc mostek disulfidowy.
Wynalazek niniejszy ukierunkowany jest również na sposób stopniowego przyłączania do polipeptydu dwóch, lub więcej niż dwóch ugrupowań PEG. Sposób ten oparty jest na rozpoznaniu, że zaktywowany PEG o małej masie cząsteczkowej reaguje z ograniczanym zawadą przestrzenną miejscem reakcji na białku w sposób bardziej całościowy niż zaktywowany PEG o dużej masie cząsteczkowej. Modyfikacja drogich białek leczniczych przy użyciu PEG musi być kosztowo efektywna, aby wytwarzanie koniugatu PEG było praktycznie możliwe. Oprócz tego, w celu zmniejszenia filtracji kłębuszkowej i dla zoptymalizowania właściwości farmakologicznych koniugatu PEG-białko, koniugat ten powinien wykazywać efektywną wielkość równoważną wielkości białka o masie cząsteczkowej wynoszącej 70 kDa. Oznacza to, że w przypadku dokonywania specyficznej względem miejsca modyfikacji polegającej na przyłączeniu jednego ugrupowania PEG, korzystnie używa się pochodnej PEG o masie cząsteczkowej większej od 20 kDa. Jeżeli miejsce modyfikacji jest przestrzennie ciasne, to grupa reaktywna na dużym ugrupowaniu PEG może mieć trudności z osiągnięciem tego miejsca, co będzie prowadzić do niskiej wydajności. Korzystny sposób PEG-ilowania polipeptydu według niniejszego wynalazku podwyższa wydajność PEG-ilowania specyficznego względem miejsca przez przyłączenie wpierw małego hetero- lub homo-dwufunkcyjnego ugrupowania PEG, dzięki czemu, w wyniku względnie niewielkich rozmiarów tego ugrupowania, może ono reagować z przestrzennie ciasnymi miejscami. Następnie, dokonuje się przyłączenia pochodnej PEG o dużej masie cząsteczkowej do małego ugrupowania PEG, czego wynikiem jest wysoka wydajność pożądanego białka PEGilowanego.
Sposób stopniowego przyłączania dwóch, lub więcej niż dwóch ugrupowań PEG szeregowo do polipeptydu według niniejszego wynalazku polega na tym, że wpierw przyłącza się do polipeptydu heterodwufunkcyjne lub homodwufunkcyjne ugrupowanie PEG o małej masie cząsteczkowej, a następnie do wolnego końca tego ugrupowania PEG o małej masie cząsteczkowej (już przyłączonego do polipeptydu) dołącza się jednofunkcyjne lub dwu-funkcyjne ugrupowanie PEG. Po stopniowym przyłączeniu dwóch, lub więcej niż dwóch ugrupowań PEG szeregowo do polipeptydu (przy czym polipeptydem tym korzystnie jest IFN-β, w którym Cys17, chociaż znajdująca się w miejscu przestrzennie ciasnym, stanowi korzystne miejsce przyłączania PEG), otrzymany koniugat PEG-polipeptyd można poddać oczyszczaniu z zastosowaniem jednej, lub więcej niż jednej metody oczyszczania, takiej jak chromatografia jonowymienna, chromatografia ekskluzyjna, chromatografia z interakcją hydrofobową, chromatografia powinowactwa i chromatografia z odwróconymi fazami.
Ugrupowanie PEG o małej masie cząsteczkowej ma następujący wzór:
W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X, w którym W i X oznaczają grupy niezależnie reagujące z funkcyjną grupą aminową, tiolową, karboksylową lub hydroksylową, z przyłączeniem do polipeptydu ugrupowania PEG o małej masie cząsteczkowej. Korzystnie, grupy o symbolach W i X wybiera się, niezależnie, spośród takich substancji,
PL 196 533 B1 jak: disulfid o-pirydylowy, maleimidy, sulfony winylowe, jodoacetamidy, aminy, tiole, związki karboksylowe, estry aktywne, pochodne węglanowe benzotriazolu, pochodne węglanowe p-nitrofenolu, izocyjaniany i biotyna. Korzystnie, ugrupowanie PEG o małej masie cząsteczkowej ma masę cząsteczkową mieszczącą się w zakresie od około 100 do 5000 daltonów.
Korzystnie, masa cząsteczkowa jednofunkcyjnego lub dwu-funkcyjnego ugrupowania PEG przeznaczonego do przyłączenia do wolnego końca ugrupowania PEG o małej masie cząsteczkowej już przyłączonego do polipeptydu, mieści się w zakresie od około 100 daltonów do 200 kDa i stanowi, korzystnie, metoksy-PEG, rozgałęziony PEG, PEG ulegający rozkładowi hydrolitycznemu lub enzymatycznemu, PEG z grupami bocznymi lub dendrymerowy PEG. Jednofunkcyjny lub dwufunkcyjny PEG ma wzór:
Y-CH2CH2O(CH2CH2O)MCH2CH2-Z, w którym Y oznacza grupę reaktywną w stosunku do końcowej grupy na wolnym końcu ugrupowania PEG o małej masie cząsteczkowej, już przyłączonego do polipeptydu, a Z oznacza -OCH3 lub grupę reaktywną w stosunku do niej, z tworzeniem koniugatu dwufunkcyjnego.
Koniugatu PEG-polipeptyd, wytworzonego powyższym sposobem stopniowego przyłączania dwóch lub większej ilości ugrupowań PEG, można używać do wytworzenia leku lub kompozycji farmaceutycznej przeznaczonej do leczenia chorób lub zaburzeń, w przypadku których polipeptyd okazuje się skuteczny jako składnik aktywny.
Innym celem niniejszego wynalazku są koniugaty otrzymane w zasadniczo czystej postaci, a to dla nadania im przydatności do wykorzystania, jako składnik aktywny, w składzie kompozycji farmaceutycznych, przeznaczonych do leczenia, diagnozowania lub prognozowania zakażeń bakteryjnych i wirusowych, jak również chorób autoimmunizacyjnych, zapalnych i nowotworów. Takie kompozycje farmaceutyczne stanowią dalszy cel niniejszego wynalazku.
Do przykładowych, wyżej wspomnianych chorób należą (bez ograniczania zakresu niniejszego wynalazku): wstrząs septyczny, AIDS, zapalenie stawów reumatoidalne, liszaj rumieniowaty i stwardnienie rozsiane.
Dalsze wykonania i korzyści odnoszone z wynalazku staną się oczywiste na podstawie poniższego opisu.
Jednym z wykonań niniejszego wynalazku jest podawanie, w ilości farmakologicznie skutecznej, koniugatów według wynalazku osobom z ryzykiem rozwoju jednej z przytoczonych powyżej chorób lub chorym już dotkniętym tymi patologiami.
Można tu wykorzystać dowolną drogę podawania, zgodną z charakterem aktywnego czynnika leku. Korzystne jest stosowanie pozajelitowe, takie jak podawanie drogą podskórną, domięśniową lub dożylną. Dawka składnika aktywnego, którą należy podać, zależy od przepisu lekarskiego opartego na takich danych, jak wiek, masa ciała i indywidualna odpowiedź pacjenta na lek.
Dawka może mieścić się w zakresie od 10 μg do 1 mg/dzień/średnia masa ciała 75 kg, korzystnie w zakresie od 20 μg do 200 μg.
Kompozycję farmaceutyczną przeznaczoną do stosowania pozajelitowego można sformułować w postać nadającą się do wstrzykiwań, zawierającą składnik czynny leku i właściwe vehiculum. Vehicula stosowane w postaciach leku przeznaczonych do podawania drogą pozajelitową są dobrze znane w tej dziedzinie techniki i należą do nich, na przykład: woda, fizjologiczny roztwór soli, roztwór Ringera i/lub glukoza. Vehiculum może zawierać niewielką ilość zaróbek w celu utrzymania stabilności i izotoniczności preparatu farmaceutycznego. Sporządzenia roztworów dokonać można zgodnie z typowymi sposobami postępowania.
Wynalazek niniejszy jest opisany z odniesieniem się do konkretnych jego wykonań, ale treść opisu obejmuje swym zakresem wszystkie modyfikacje i zastępcze rozwiązania, które może wnieść specjalista w tej dziedzinie wiedzy bez rozszerzania zakresu wynalazku poza znaczenie i cel zastrzeżeń patentowych.
Poniżej, wynalazek opisany zostanie przez następujące przykłady, których nie należy interpretować jako ograniczających w jakikolwiek sposób zakres wynalazku.
P r z y k ł a d 1
Wytwarzania koniugatu PEG-IFN-β
Modyfikacja IFN-β przy użyciu mPEG5k-OPSS.
Do wytworzenia koniugatu PEG-IFN-β użyto zrekombinowanego ludzkiego IFN-β, stabilnego w stężeniu 0,37 mg/ml w buforze z 50 mM octanu sodu, pH 3,6. Około 1,0 ml 6M mocznika wproPL 196 533 B1 wadzono do 2 ml IFN-β w stężeniu 0,37 mg/ml (0,74 mg, 3,7 x 10-8 mola). Następnie, dodano mPEG3K-OPSS użyty w nadmiarze molowym wynoszącym 50 moli na 1 mol IFN-β i całość poddawano reakcji we fiolce z polipropylenu w ciągu albo 2 godzin w temperaturze 37°C, albo w ciągu 1 godziny w temperaturze 50°C. Następnie, mieszaninę reakcyjną poddano analizie z wykorzystaniem wykresu elektroforezy kapilarnej (CE) w celu oznaczenia, jeszcze przed etapem oczyszczania, rozmiarów tworzenia się koniugatu PEG-IFN-β w reakcji PEG-ilowania (fig. 1). Typową wydajnością w takiej reakcji jest 50% PEG-IFN-β. Produkty reakcji wydzielono z mieszaniny reakcyjnej za pomocą odsączenia na 0,22 mm filtrze strzykawkowym i przesącz wprowadzono do kolumny do chromatografii ekskluzyjnej (albo Superose 12, albo Superdex 75, Pharmacia) i przeprowadzono elucję przy użyciu buforu z 50 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 7,0. Na fig. 2A pokazano profil elucji w etapie oczyszczania koniugatu PRG IFN-β na kolumnie do chromatografii ekskluzyjnej Superose 12. Zebrano frakcje szczytowe i poddano je analizie metodą SDS-PAGE (fig. 3). Frakcje zawierające koniugat PEG-IFN-β połączono ze sobą, po czym otrzymany koncentrat powtórnie wprowadzono na kolumnę do chromatografii ekskluzyjnej jak poprzednio w celu dalszego oczyszczania koniugatu PEG-IFN-β z uwagi na ścisłą bliskość piku „natywnego” IFN-β (fig. 2B). Postępowanie to powtórzono (trzecie przejście) dla zapewnienia czystości produktu (fig. 2C). Na fig. fig. 4 i 5 przedstawiono odpowiednio, wykresy elektroforezy kapilarnej i widma MALDI MS dla oczyszczonego koniugatu PEG-IFN-β.
Modyfikacja IFN-β przy użyciu mPEG30K-OPSS.
Użyto zrekombinowanego ludzkiego IFN-β stabilnego w roztworze o stężeniu 0,36 mg/ml w buforze z 50 mM octanu sodu, pH 3,6. Około 36 mg mPEG30K-OPSS w 3 ml wody dejonizowanej wprowadzono do 3 ml IFN-β w stężeniu 0,36 mg/ml (1,08 mg, 4,9 x 10-8 mola) i całość poddawano reakcji we fiolce z polipropylenu w ciągu 2 godzin w temperaturze 50°C. Następnie, mieszaninę reakcyjną poddano analizie metodą elektroforezy kapilarnej w celu oznaczenia rozmiarów modyfikacji. Typowa wydajność dla takiej reakcji wynosi < 30%. Następnie, roztwór wprowadzono na kolumnę do chromatografii ekskluzyjnej (Superose 12, Pharmacia) i poddano elucji przy użyciu buforu z 50 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 7,0. Frakcje szczytowe zebrano i poddano analizie metodą SDS-PAGE pod względem zawartości.
P r z y k ł a d 2
Aktywność biologiczna koniugatu PEG-IFN-β
W celu oznaczenia skutków wpływu PEG-ilowania na aktywność przeciwwirusową ludzkiego rekombinantowego IFN-β, ludzkie owodniowe komórki WISH wstępnie inkubowano albo ze świeżo otrzymanym IFN-β (ta sama partia, jakiej użyto do PEG-ilowania) albo z koniugatem PEG-IFN-β. Aktywność przeciwwirusową, w której pośredniczy IFN-β, według pomiaru w teście cytopatyczności WISH-VSV, oznaczano zgodnie z przeciwwirusowym testem biologicznym WISH, opracowanym w oparciu o protokół Novicka i in [J. Immunol., 129, 2244-2247 (1982)]. W tym teście WISH użyto następujących materiałów:
komórki WISH (ATCC CCL 25);
szczepy wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (ATCC V-520-001-522), przechowywane w temperaturze -70°C.;
IFN-β, ludzki, zrekombinowany, InterPharm Laboratories LTD (typ 32,075, seria # 205035), 82 x 106 IU/ml, aktywność właściwa: 222 x 106 lU/mg);
koniugat PEG-IFN-β, wytworzony sposobem opisanym w powyższym przykładzie 1 i przetrzymywany w PBS, pH 7,4;
podłoże wzrostowe WISH [„MEM high glucose” z solami Earle'a + 10% FBS + 1,0% L-glutaminy + + penicylina/streptomycyna (100 U/ml, 100 μg/ml)];
podłoże testowe WISH [„MEM high glucose” z solami Earle'a + 5% FBS + 1,0% L-glutaminy + + penicylina/streptomycyna (100 U/ml, 100 μg/ml)];
MTT w stężeniu 5 mg/ml w PBS, przechowywany w temperaturze -70°C.
Protokół dla testu WISH przedstawia się następująco:
- rozcieńczyć próbki IFN-β do 2X stężenia wyjściowego w podłożu testowym WISH;
- sporządzić 3-krotne rozcieńczenia próbek IFN-β w podłożu testowym WISH na płaskodennej płytce o 96 studzienkach tak, że każda studzienka zawiera 50 μl rozcieńczonej próbki IFN-β (pewna ilość studzienek kontrolnych otrzymuje 50 μl samego tylko podłoża wzrostowego WISH);
- zebrać komórki WISH w logarytmicznej fazie wzrostu przy użyciu roztworu trypsyna/EDTA, przemyć w podłożu testowym WISH i doprowadzić do końcowego stężenia 0,8 x 106 komórek/ml;
PL 196 533 B1
- dodać do każdej studzienki po 50 μl zawiesiny komórek WISH (4 x 104 komórek/studzienkę); końcowe stężenie IFN-β eksponowanego na komórki wynosi obecnie 1X;
Po inkubacji w ciągu 24 godzin w nawilżanym inkubatorze (5% CO2), do wszystkich studzienek wprowadza się 1 : 10 rozcieńczenie (w podłożu testowym WISH) szczepu VSV (wstępnie ustalona dawka doprowadzająca do lizy 100% komórek WISH w ciągu 48 godzin), z wyjątkiem studzienek kontrolnych, nie zawierających wirusa (wprowadza się do nich jedynie taką samą objętość samego podłoża testowego).
Po upływie dalszych 48 godzin, do wszystkich studzienek dodaje się 25 μl roztworu MTT i płytki inkubuje jeszcze w ciągu 2 godzin w inkubatorze.
Zawartość studzienek usuwa się przez odwrócenie płytki, po czym do studzienek wprowadza się po 200 pl 100% etanolu.
Po upływie godziny, płytki odczytuje się przy 595 nm przy użyciu pakietu programowego Soft max Pro i układu spektrofotometru Spektramax (Molecular Devices).
T a b e l a 1
Aktywność przeciwwirusowa próbek PEG-ilowanego IFN-β i Mock-PEG-ilowanego IFN-β
Próbka IFN-β* EC50**
Koniugat PEG-IFN-β 3,9 +/- 0,7 pg/ml
IFN-β 16,4 +/- 1,0 pg/ml
* Stężenie wyjściowe IFN-β w próbkach oznaczono metodą analizy aminokwasów (AAA).
** EC50 (+/- S.D.) oznaczono z użyciem oprogramowania Microcal Origin 4.1.
Jak to pokazano na fig. 6 i w powyższej tabeli 1, koniugat PEG-IFN-β utrzymywał poziom aktywności przeciwwirusowej wyższy od poziomu świeżo otrzymanej serii macierzystego IFN-β.
Zaobserwowane zjawisko wykazywania przez koniugat PEG-IFN-β poziomu aktywności biologicznej w przybliżeniu 4 razy wyższego od poziomu aktywności świeżo otrzymanego IFN-β, może także być następstwem zwiększonej trwałości koniugatu PEG-IFN-β w porównaniu z „natywnym” IFN-β po dodaniu podłoża testowego dla komórek WISH.
P r z y k ł a d 3
Względną aktywność biologiczną PEG[30 kD^IFN-β i PEG[2 x 20 kD^IFN-β oznaczono w teście WISH z zastosowaniem standardowego protokołu opisanego w powyższym przykładzie 2 (tabela 2). Trzy różne osoby przeprowadziły trzy niezależne testy w różnym czasie.
T a b e l a 2
Przeciwwirusowa aktywność względna PEG-IFN-β
Próbka Aktywność względna interferonu* (z trzech badań)
Test 1 Test 2 Test 3 Średnia (S. D.)
PEG[30 kDJ-IFN-β 3,2 x większa 3, 1 x większa 1,8 x większa 3,0 x (0,78) większa
PEG[2 x 20 kDJ-IFN-β 4,2 x większa 1,3 x większa 0,85 x większa 2,1 x (1,8) większa
* Dawki EC50 w porównaniu ze wzorcem IFN-β włączonym do każdego badania.
** Porównanie oparto na stężeniu IFN-β wynoszącym 330 pg/ml.
Stężenie wyjściowe PEG[30 kDj-IFN-β (5,41 pg/ml) i PEG[2 x 20 kDj-IFN-β (6,86 pg/ml) oznaczono metodą AAA.
Wiązanie się PEG-IFN-β z jego receptorem na komórkach oceniano w obecności ustalonej ilo125 125 ści J-IFN-a2a. IFN-a2a oznakowano radioaktywnie przy użyciu J metodą opartą na użyciu chlo125 raminy T. Związany z J IFN-a2a oddzielono od wolnego jodu za pomocą przepuszczenia substratów reakcji przez kolumnę Sephadex G25 i połączenia ze sobą frakcji zawierających białko (Pharma125 cia). J-IFN-a2a skwantyfikowano w teście „IFN-a2a ELISA” (Biosource, USA), po czym oznaczono aktywność właściwą. Komórki Daudi znajdujące się w fazie logarytmicznej wzrostu zebrano i 2 x 106
125 komórek inkubowano z 0,5 nM J-IFN-a2a w ciągu 3 godzin, w temperaturze pokojowej, w obecności rozmaitych stężeń PEG-IFN-β lub IFN-a2a rozcieńczonego w buforze testowym, stanowiącym RPMI 1640 z zawartością 2% płodowej surowicy bydlęcej i 0,1% azydku sodu. Po zakończeniu inkubacji, komórki odwirowano przez warstwę oleju ftalanowego i związaną z komórkami radioaktywność zliczono w liczniku gamma. Okazało się, że aktywność wiązania się PEG[30 kD^IFN-β i PEG[2 x 20 kD]PL 196 533 B1
-IFN-β z receptorem była bardzo podobna lub zbliżona do aktywności wiązania IFN-β, jak to przedstawiono na fig. 7.
Oprócz tego, aktywność względną oznaczono w teście antyproliferacyjnym z komórkami Daudi (ludzki chłoniak z grupy limfocytów B) (tabela 3). Wszystkie próbki IFN sporządzono w stężeniu 2x 200 ng/ml. Próbki rozcieńczono 3-krotnie w dół długości płytki przy końcowej objętości 100 μ!. Do każdej studzienki wprowadzono 1 x 105 komórek/studzienkę (100 μθ i inkubowano w ciągu ogółem 72 godzin, w temperaturze 37°C w nawilżanym inkubatorze (5% CO2). Po upływie 48 godzin, dodano trytowaną (3H) tymidynę w ilości 1 μC/studzienkę, w objętości 20 μΚ Po zakończeniu 72-godzinnej inkubacji, zebrano materiał z płytki przy użyciu urządzenia Tomtek Plate Harvester. Wyniki zamieszczone w poniższej tabeli 3 wskazują, że w rezultacie PEG-ilowania nie stwierdzono żadnej wykrywalnej utraty aktywności IFN. W rzeczywistości stwierdzono, że aktywność była nieco wyższa od aktywności wolnego IFN-β. Może to być spowodowane tworzeniem się w wolnym IFN nieaktywnych agregatów, albo różnicami w metodach kwantyfikowania (analiza aminokwasów w przypadku próbek PEG-IFN i metoda RP-HPLC w przypadku IFN-β).
T a b e l a 3
Test antyproliferacyjny z komórkami Daudi
Dawka IC50* Krotność wzrostu w stosunku do IFN
IFN-β (płytka 1) 1153,1 -
PEG[30 kD]-IFN (71 A) 695,6 1,6 x
IFN-β (płytka 2) 1005,8 -
PEG[40 kD]-IFN (71 B) 629,4 1,7 x
* pg/ml
P r z y k ł a d 4
Badania farmakokinetyczne na myszach
Podawanie dożylne
Myszom wstrzyknięto 100 ng IFN-β, PEG[30 kD^IFN-β lub PEG[2 x 20 kD^IFN-β i po upływie wskazanego czasu pobrano z nich krew. Oznaczono stężenie IFN-β w surowicy metodą „IFN-β-specific ELISA” (Toray Industries) i otrzymane wyniki przedstawiono na fig. 8. Myszy (samice ze szczepu B6D2F1, w wieku 6-8 tygodni, po około 20 g każda) w ilości 28 sztuk podzielono na cztery grupy w sposób następujący:
- grupa 1 liczyła 9 myszy, którym wstrzyknięto po 200 μl jako pojedynczy bolus 500 ng/ml ludzkiego IFN-β (dawka końcowa 100 ng/mysz);
- grupa 2 (dziewięć myszy) otrzymała po 200 μl równoważnej masy PEG 30 kD-IFN-β;
- grupa 3 otrzymała po 200 μl równoważnej masy PEG [2 x 20 kD-IFN-β; oraz
- grupa 4, licząca 3 myszy, którym niczego nie wstrzyknięto, służyła jako kontrola negatywna.
Próbki krwi (w przybliżeniu 200 μl/próbkę) pobierano w dziewięciu wskazanych momentach za pomocą rozerwania splotu żylnego pozaoczodołowego przy użyciu kapilary. Próbki krwi pozostawiono do utworzenia skrzepu w ciągu godziny, w temperaturze pokojowej, obwiedzione i wirowano w mikrowirówce. Po wyjęciu, surowice przetrzymywano w temperaturze -70°C, aż do zgromadzenia wszystkich próbek. Surowice badano pod względem obecności aktywnego biologicznie IFN-β w teście Toray. Otrzymane wyniki pokazują, że pole pod krzywą (AUC) jest znacznie powiększone w przypadku próbek PEG-IFN w porównaniu z polem dla wolnego IFN-β i że próbki PEG-IFN przewyższają wolny IFN-β, a próbki PEG[2 x 20 kD-IFN-β przewyższają PEG[30 kD-IFN-β.
Podawanie podskórne
Myszom wstrzyknięto podskórnie IFN-β i PEG-IFN (po 100 ng/mysz). Figura 9 pokazuje, że całkowite pole pod krzywą (AUC) jest w sposób drastyczny powiększone w przypadku próbek PEG-IFN w porównaniu z polem dla wolnego IFN-β. Badania farmakokinetyczne są zgodne z próbkami PEG-IFN o dłuższym okresie półtrwania i zwiększonym AUC.
P r z y k ł a d 5
Przyłączenie ugrupowania PEG o małej masie cząsteczkowej do polipeptydu
Dołączenie OPSS-PEG2k-hydrazydu do interferonu β
PL 196 533 B1
Użyto zrekombinowanego ludzkiego interferonu β w roztworze o stężeniu 0,33 mg/ml w 50 mM buforze z octanem sodu, pH 3,8. Do 3 ml IFN-β w stężeniu 0,33 mg/ml (0,99 mg) dodano w przybliżeniu 3,6 mg (nadmiar molowy wynoszący 40 moli na mol białka) odczynnika w postaci heterodwufunkcyjnego PEG, a mianowicie OPSS-PEG2k-hydrazydu, w 2 ml wody dejonizowanej i całość poddawano reakcji we fiolce z polipropylenu w ciągu godziny, w temperaturze 45°C. Następnie, mieszaninę reakcyjną poddano analizie metodą elektroforezy kapilarnej w celu ustalenia rozmiarów modyfikacji. Typowe wydajności mieściły się w zakresie od 90 do 97%, w zależności od stopnia czystości interferonu β i odczynnika PEG. Następnie, roztwór wprowadzono do kolumny do chromatografii ekskluzyjnej (Superdex 75, Pharmacia) i eluowano buforem z 5 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 7,0. Frakcje szczytowe zebrano i poddano analizie metodą SDS-PAGE. Frakcje zawierające monoPEG-ilowany interferon-β połączono ze sobą i użyto w dalszym etapie modyfikacji z udziałem PEG o dużej masie cząsteczkowej.
Dołączenie (OPSS)2-PEG3400 do interferonu β
Użyto zrekombinowanego ludzkiego interferonu β w roztworze o stężeniu 0,33 mg/ml w buforze z 50 mM octanu sodu, pH 3,8. Do 3 ml interferonu β w stężeniu 0,33 mg/ml (0,99 mg) dodano w przybliżeniu 6,1 mg (nadmiar molowy wynoszący 40 moli na mol białka) odczynnika w postaci homodwufunkcyjnego PEG, a mianowicie (OPSS)2-PEG3400-hydrazydu, w 2 ml wody dejonizowanej i całość poddawano reakcji we fiolce z polipropylenu w ciągu 2 godzin, w temperaturze 50°C. Postęp reakcji monitorowano nie redukującą metodą SDS-PAGE i końcową mieszaninę reakcyjną poddano analizie metodą elektroforezy kapilarnej w celu ustalenia rozmiarów modyfikacji. Typowe wydajności modyfikacji w przypadku tej reakcji z udziałem interferonu β wynosiły > 95%. Następnie, roztwór wprowadzono do kolumny do chromatografii ekskluzyjnej (Superdex 75, Pharmacia) i eluowano buforem z 50 mM fosforanu sodu, 150 mM NaCl, pH 7,0. Frakcje szczytowe zebrano i poddano analizie metodą SDS-PAGE pod względem zawartości. Frakcje zawierające monoPEG-ilowany interferon β połączono ze sobą.
P r z y k ł a d 6
Przyłączenie drugiego ugrupowania PEG do polipeptydu z PEG-ilowania ugrupowaniem o małej masie cząsteczkowej Modyfikacja IFN-S-S-PEG2k-hydrazydu przy użyciu mPEG30k-aldehydu (ALD).
Białk<^S-S-PEG2K“C-NH-NH2
Białko-S-S-PEG2K-C-NH-N=CH-mPEG3oic
Ϊ ' mPEG30K- CHjCHjCH
Do połączonych frakcji IFN-S-S-PEG2k-hydrazydu z przykładu 5 dodano mPEG30k-ALD w 20 molowym nadmiarze w stosunku do białka. Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej (25°C) przez 4 godziny, po czym pobrano próbkę i wprowadzono ją do kolumny do chromatografii ekskluzyjnej (Superose 6, Pharmacia) w celu ustalenia wydajności modyfikacji. Wydajność takiej modyfikacji
PL 196 533 B1 w omawianej reakcji wynosiła typowo > 80% w zależności od czystości odczynnika PEG i warunków prowadzenia reakcji.
Na podstawie tak przedstawionego pełnego opisu niniejszego wynalazku, specjaliści w tej dziedzinie wiedzy zdadzą sobie sprawę z tego, że to samo można wykonać z przyjęciem szerokiego zakresu równoważnych parametrów, stężeń i warunków, bez odchodzenia od istoty i zakresu wynalazku i bez zbytniego eksperymentowania.
Aczkolwiek wynalazek niniejszy został opisany w nawiązaniu do konkretnych jego wykonań, to jednak należy rozumieć, że może on ulegać dalszym modyfikacjom. Zgłoszenie niniejsze w zamiarze obejmuje swym zakresem jakiekolwiek odmiany, sposoby użycia lub adaptacje wynalazku zgodne, ogólnie, z zasadami wynalazku i obejmujące takie odchylenia od niniejszego ujawnienia, jakie wchodzą w zakres znanej i zwyczajowej praktyki w tej dziedzinie wiedzy, której wynalazek dotyczy, i jakie mogą znaleźć zastosowanie w istotnych aspektach przedstawionych w powyższej części niniejszego opisu, zgodnie z zakresem załączonych zastrzeżeń.
Wszystkie przytaczane w niniejszym opisie odnośniki, włączając w to publikacje lub streszczenia w czasopismach, opublikowane lub nie opublikowane zgłoszenia patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki i zagraniczne, lub jakiekolwiek inne odnośniki, są w całości włączone do niniejszego opisu jako odnośniki, włącznie ze wszystkimi danymi, tabelami, figurami i tekstami, zawartymi w przytoczonych odnośnikach. Poza tym, cała zawartość odnośników cytowanych w odnośnikach tu przytoczonych, także jest włączona do niniejszego opisu jako odnośnik.
Odniesienie się do etapów metod znanych, etapów metod typowych, metod znanych lub metod typowych nie stanowi w żadnym przypadku uznania, że jakikolwiek aspekt, opis lub wykonanie niniejszego wynalazku jest ujawnione, podane jako pouczenie lub zasugerowane w odnośnej dziedzinie techniki.

Claims (9)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób stopniowego przyłączania ugrupowań poli(glikolu etylenowego) (PEG) szeregowo do polipeptydu, znamienny tym, że
    a) poddaje się polipeptyd reakcji z heterodwufunkcyjnym lub homodwufunkcyjnym ugrupowaniem PEG o masie cząsteczkowej w zakresie od około 100 do 5000 daltonów i o następującym wzorze:
    W-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-X, w którym W i X oznaczają grupy niezależnie reagujące z funkcyjną grupą aminową, tiolową, karboksylową lub hydroksylową, z przyłączeniem ugrupowania PEG o małej masie cząsteczkowej do polipeptydu, oraz
    b) poddaje się przyłączone do polipeptydu ugrupowanie PEG o małej masie cząsteczkowej reakcji z jednofunkcyjnym lub dwufunkcyjnym ugrupowaniem PEG o masie cząsteczkowej w zakresie od około 100 daltonów do 200 kilodaltonów, z przyłączeniem jednofunkcyjnego lub dwufunkcyjnego ugrupowania PEG do wolnego końca ugrupowania PEG o małej masie cząsteczkowej i utworzeniem koniugatu PEG-polipeptyd.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się jednofunkcyjne lub dwufunkcyjne ugrupowanie PEG o następującym wzorze:
    Y-CH2CH2O(CH2CH2O)mCH2CH2-Z, w którym Y oznacza grupę reaktywną w stosunku do końcowej grupy na wolnym końcu ugrupowania PEG o małej masie cząsteczkowej przyłączonego do polipeptydu, a Z oznacza -OCH3 lub grupę reaktywną w stosunku do grupy o symbolu X, z utworzeniem grupy dwufunkcyjnej.
  3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako jednofunkcyjne lub dwufunkcyjne ugrupowanie PEG stosuje się metoksy-PEG, rozgałęziony PEG, ulegający rozkładowi hydroli-tycznemu lub enzymatycznemu PEG, PEG z grupami bocznymi lub dendrymerowy PEG.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że grupy o symbolach W i X są niezależnie wybrane z grupy obejmującej disulfid o-pirydylowy, maleimidy, sulfony winylowe, jodoacetamidy, hydrazydy, aldehydy, estry sukcynoimidowe, epoksydy, aminy, tiole, związki karboksylowe, aktywne estry, pochodne węglanowe benzotriazololu, pochodne węglanowe p-nitrofenolu, izocyjaniany i biotynę.
    PL 196 533 B1
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się ugrupowanie PEG o małej masie cząsteczkowej i/lub jednofunkcyjne lub dwufunkcyjne ugrupowanie PEG, stanowiące kopolimer poli(glikolu etylenowego).
  6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że kopolimer poli(glikolu etylenowego) jest wybrany z grupy obejmującej kopolimery poli(glikol etylenowy)/poli(glikol propylenowy) i kopolimery poli(glikol etylenowy)/poli(kwas mlekowy/glikolowy).
  7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje jeszcze etap oczyszczania koniugatu PEG-polipeptyd następujący po stopniowym przyłączeniu dwóch ugrupowań PEG szeregowo do polipeptydu.
  8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że we wspomnianym etapie oczyszczania wykorzystuje się jedną, lub więcej niż jedną metodę oczyszczania, wybraną z grupy obejmującej chromatografię jonowymienną, chromatografię ekskluzyjną, chromatografię z interakcją hydrofobową, chromatografię powinowactwa i chromatografię z odwróconymi fazami.
  9. 9. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-8, znamienny tym, że jako polipeptyd stosuje się interferon β.
PL378728A 1998-04-28 1999-04-28 Sposób stopniowego przyłączania ugrupowań poli (glikolu etylenowego) (PEG) szeregowo do polipeptydu PL196533B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8333998P 1998-04-28 1998-04-28
PCT/US1999/009161 WO1999055377A2 (en) 1998-04-28 1999-04-28 Polyol-ifn-beta conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL196533B1 true PL196533B1 (pl) 2008-01-31

Family

ID=22177687

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL378728A PL196533B1 (pl) 1998-04-28 1999-04-28 Sposób stopniowego przyłączania ugrupowań poli (glikolu etylenowego) (PEG) szeregowo do polipeptydu
PL344490A PL193352B1 (pl) 1998-04-28 1999-04-28 Koniugat poliol-interferon ß, sposób jego wytwarzania i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL344490A PL193352B1 (pl) 1998-04-28 1999-04-28 Koniugat poliol-interferon ß, sposób jego wytwarzania i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna

Country Status (30)

Country Link
US (3) US6638500B1 (pl)
EP (2) EP1421956B1 (pl)
JP (2) JP4574007B2 (pl)
KR (1) KR100622796B1 (pl)
CN (2) CN100335503C (pl)
AR (1) AR020070A1 (pl)
AT (2) ATE365563T1 (pl)
AU (1) AU762621B2 (pl)
BG (2) BG64694B1 (pl)
BR (1) BR9910023A (pl)
CA (2) CA2565375A1 (pl)
CY (1) CY1108022T1 (pl)
CZ (2) CZ298597B6 (pl)
DE (2) DE69920002T2 (pl)
DK (2) DK1421956T3 (pl)
EA (2) EA200300382A1 (pl)
EE (1) EE05214B1 (pl)
ES (2) ES2285286T3 (pl)
HU (1) HUP0300548A3 (pl)
IL (1) IL139286A (pl)
NO (2) NO329749B1 (pl)
NZ (1) NZ507456A (pl)
PL (2) PL196533B1 (pl)
PT (2) PT1421956E (pl)
SI (2) SI1075281T1 (pl)
SK (2) SK286654B6 (pl)
TR (2) TR200101751T2 (pl)
TW (2) TWI232882B (pl)
UA (2) UA79430C2 (pl)
WO (1) WO1999055377A2 (pl)

Families Citing this family (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US7704944B2 (en) 1997-08-14 2010-04-27 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use for the treatment of sepsis
IL121860A0 (en) 1997-08-14 1998-02-22 Yeda Res & Dev Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
US7220717B2 (en) 1997-08-14 2007-05-22 Yeda Research And Development Company Ltd. Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use
DK1656952T3 (da) 1998-10-16 2014-01-20 Biogen Idec Inc Polyalkylenglycolkonjugater af interferon beta-1A og anvendelser deraf
CN100480266C (zh) 1998-10-16 2009-04-22 拜奥根Idec马萨诸塞公司 干扰素-β融合蛋白及用途
US7238368B2 (en) * 1999-04-23 2007-07-03 Alza Corporation Releasable linkage and compositions containing same
KR100642955B1 (ko) * 1999-04-23 2006-11-10 알자 코포레이션 방출성 결합 및 그를 함유하는 조성물
US7303760B2 (en) * 1999-04-23 2007-12-04 Alza Corporation Method for treating multi-drug resistant tumors
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
US7431921B2 (en) 1999-08-27 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
TR200101086A3 (pl) * 1999-10-15 2001-08-21
CA2395254C (en) * 1999-12-24 2010-05-11 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Branched polyalkylene glycols
CA2395713C (en) 2000-01-10 2012-04-10 Maxygen, Inc. G-csf conjugates
EP1982732A3 (en) 2000-02-11 2011-06-08 Bayer HealthCare LLC Factor VII or VIIA-like conjugates
ATE471956T1 (de) 2001-01-30 2010-07-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Verzweigte polyalkylenglykole
EP1234583A1 (en) * 2001-02-23 2002-08-28 F. Hoffmann-La Roche Ag PEG-conjugates of HGF-NK4
PL367154A1 (pl) 2001-02-27 2005-02-21 Maxygen Aps Nowe cząsteczki podobne do interferonu beta
ATE468862T1 (de) 2001-07-11 2010-06-15 Maxygen Inc G-csf konjugate
DK3025726T3 (da) 2002-01-18 2019-12-09 Biogen Ma Inc Polyalkylenpolymerforbindelser og anvendelser deraf
TWI334785B (en) 2002-06-03 2010-12-21 Serono Lab Use of recombinant ifn-β1a and pharmaceutical composition comprising recombinant ifn-β1a for the treatment of hcv infection in patients of asian race
AU2003254641A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
AU2003303636B2 (en) * 2002-12-26 2010-08-05 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
CN102319437B (zh) 2002-12-26 2017-10-13 山景医药公司 具有增强的生物学效用的干扰素‑β的聚合物缀合物
DK2085470T3 (da) 2003-03-20 2012-08-06 Bayer Healthcare Llc FVII- eller FVIIa-varianter
TWI272948B (en) 2003-05-01 2007-02-11 Ares Trading Sa HSA-free stabilized interferon liquid formulations
GB0316294D0 (en) * 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
ES2428358T3 (es) 2003-10-17 2013-11-07 Novo Nordisk A/S Terapia de combinación
AU2005319099B2 (en) 2004-02-02 2010-09-16 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone
AU2008201682B2 (en) * 2004-02-02 2011-02-24 Ambrx, Inc. Modified human interferon polypeptides and their uses
CN103755800B (zh) 2004-02-02 2016-02-24 Ambrx公司 经修饰的人类生长激素多肽与其用途
EP1586334A1 (en) * 2004-04-15 2005-10-19 TRASTEC scpa G-CSF conjugates with peg
UA88300C2 (ru) 2004-05-17 2009-10-12 Эйрес Трейдинг С.А. Гидрогелевые композиции, которые содержат интерферон
EA010979B1 (ru) 2004-06-01 2008-12-30 Арес Трейдинг С.А. Стабилизированные жидкие препаративные формы интерферона
MXPA06014079A (es) 2004-06-01 2007-02-15 Ares Trading Sa Metodo para estabilizar proteinas.
TW200633718A (en) * 2004-12-16 2006-10-01 Applied Research Systems Treatment of hepatitis c in the asian population
KR101320936B1 (ko) 2004-12-21 2013-10-23 넥타르 테라퓨틱스 안정화된 중합체성 티올 시약
KR101224781B1 (ko) * 2004-12-22 2013-01-21 암브룩스, 인코포레이티드 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인간 성장호르몬의 조제물
AU2005323106B2 (en) 2004-12-22 2010-07-29 Ambrx, Inc. Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone
WO2006134173A2 (en) 2005-06-17 2006-12-21 Novo Nordisk Health Care Ag Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprising at least one non-native cysteine
MX2008001706A (es) * 2005-08-04 2008-04-07 Nektar Therapeutics Al Corp Conjugados de una porcion g-csf y un polimero.
DK1917276T3 (en) 2005-08-26 2018-05-07 Ares Trading Sa Process for Preparation of Glycosylated Interferon Beta
JP2009507003A (ja) 2005-09-01 2009-02-19 アレス トレーディング ソシエテ アノニム 視神経炎の治療
US20070238656A1 (en) * 2006-04-10 2007-10-11 Eastman Kodak Company Functionalized poly(ethylene glycol)
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
EP2581450B1 (en) * 2006-05-02 2018-08-15 MedImmune Limited Non-natural amino acid substituted polypeptides
US20090252720A1 (en) 2006-05-24 2009-10-08 Novo Nordisk Health Care Ag Prolonged FIX Analogues and Derivatives
CA2649810A1 (en) 2006-05-24 2007-11-29 Laboratoires Serono S.A. Cladribine regimen for treating multiple sclerosis
KR20100019467A (ko) 2007-05-02 2010-02-18 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 인터페론 베타 폴리펩티드 및 그의 용도
CA2707840A1 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
BRPI0821029A2 (pt) * 2007-12-20 2015-06-16 Merck Serono Sa Fomulações de peg-interferon-beta
NZ602170A (en) 2008-02-08 2014-03-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
CN101525381B (zh) * 2008-03-04 2012-04-18 北京百川飞虹生物科技有限公司 一种重组复合干扰素及其表达载体的构建和表达
WO2009155102A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-23 Barofold, Inc. Method for derivatization of proteins using hydrostatic pressure
US20110124614A1 (en) * 2008-10-25 2011-05-26 Halina Offner Methods And Compositions For The Treatment of Autoimmune Disorders
DE102009032179A1 (de) * 2009-07-07 2011-01-13 Biogenerix Ag Verfahren zur Reinigung von Interferon beta
ES2365343B1 (es) 2009-11-19 2012-07-10 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial.
JP5914363B2 (ja) 2010-02-16 2016-05-11 ノヴォ ノルディスク アー／エス 低減されたｖｗｆ結合を有する因子ｖｉｉｉ分子
EP4450523A3 (en) 2010-04-02 2025-03-12 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same
AR080993A1 (es) 2010-04-02 2012-05-30 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de interferon beta donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
US20120135912A1 (en) 2010-05-10 2012-05-31 Perseid Therapeutics Llc Polypeptide inhibitors of vla4
US20130183280A1 (en) 2010-07-15 2013-07-18 Novo Nordisk A/S Stabilized factor viii variants
JP6042335B2 (ja) 2010-09-15 2016-12-14 ノヴォ ノルディスク アー／エス 細胞取込みが低下した第ｖｉｉｉ因子変異体
US9913880B2 (en) * 2011-02-18 2018-03-13 Stemdr Inc. Method of treating sepsis or septic shock
US9382305B2 (en) 2011-07-01 2016-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
BR112014007766B1 (pt) * 2011-10-01 2022-05-10 Glytech, Inc Polipeptídeo glicosilado, método para fabricação do mesmo e composição farmacêutica
CA2865578C (en) 2012-02-27 2023-01-17 Amunix Operating Inc. Xten conjugate compositions and methods of making same
KR20140130705A (ko) 2012-02-29 2014-11-11 도레이 카부시키가이샤 체강액 저류 억제제
MY171183A (en) 2013-03-29 2019-09-30 Glytech Inc Polypeptide glycosylated with sialylated sugar chain
WO2016013697A1 (ko) * 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 인터페론-베타 변이체의 폴리에틸렌글리콜 배합체
US11759500B2 (en) 2014-07-24 2023-09-19 Abion Inc. PEGylated interferon-beta variant
ES2824028T3 (es) 2014-08-19 2021-05-11 Biogen Ma Inc Método de PEGilación
CN107530396B (zh) 2015-05-01 2022-08-26 雅利斯塔制药公司 用于治疗眼科疾病的脂联素拟肽
MX389687B (es) * 2015-06-19 2025-03-20 Eisai R&D Man Co Ltd Inmunoglobulinas conjugadas en cys80.
PL3998067T3 (pl) 2015-11-09 2025-01-07 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Kompozycje do leczenia homocystynurii i sposoby jej leczenia
EP3612214A4 (en) * 2017-04-17 2021-01-20 The Regents of the University of Colorado, A Body Corporate ENZYME REPLACEMENT THERAPY OPTIMIZATION FOR THE TREATMENT OF HOMOCYSTINURIA
CN119097635A (zh) 2017-11-24 2024-12-10 默克专利股份公司 用于治疗进展型形式的多发性硬化症的克拉屈滨疗法
WO2020158690A1 (ja) 2019-01-28 2020-08-06 東レ株式会社 肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体
US20220220176A1 (en) 2019-01-28 2022-07-14 Toray Industries, Inc. Polyethylene glycol-modified form of hepatocyte growth factor or active fragment thereof
US20240226284A1 (en) 2020-09-10 2024-07-11 Merck Patent Gmbh Novel treatment regimen for the treatment of autoimmune disorders

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
DE3676670D1 (de) * 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US5208344A (en) * 1987-07-31 1993-05-04 American Home Products Corporation Naphthalenepropionic acid derivatives as anti-inflammatory/antiallergic agents
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
DE69430251T2 (de) 1993-11-10 2002-11-07 Enzon, Inc. Verbesserte interferon-polymerkonjugate
DE69503849T2 (de) * 1994-03-31 1999-04-01 Amgen Inc., Thousand Oaks, Calif. Zusammensetzungen und Verfahren zur Anregung des Wachstums und der Differenzierung von Megakaryozyten
NZ285664A (en) * 1994-05-18 1998-07-28 Inhale Therapeutic Syst Dry powder interferon composition adapted for pulmonary delivery
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
US5851984A (en) * 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
KR0176625B1 (ko) 1996-11-05 1999-04-01 삼성전자주식회사 적외선 물체검출장치
JP2001508783A (ja) * 1997-01-29 2001-07-03 ポリマスク・ファーマシューティカルズ・パブリック・リミテッド・カンパニー Ｐｅｇ化法
CN1269805A (zh) * 1997-07-14 2000-10-11 博尔德生物技术公司 生长激素和相关蛋白的衍生物
US6307024B1 (en) * 1999-03-09 2001-10-23 Zymogenetics, Inc. Cytokine zalpha11 Ligand
US6531122B1 (en) * 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
DE69936409D1 (de) 2007-08-09
CN1302209A (zh) 2001-07-04
CN1637020A (zh) 2005-07-13
AU762621B2 (en) 2003-07-03
US6638500B1 (en) 2003-10-28
AU3767499A (en) 1999-11-16
TWI232882B (en) 2005-05-21
EP1421956B1 (en) 2007-06-27
US20040043002A1 (en) 2004-03-04
IL139286A (en) 2005-12-18
EE200000614A (et) 2002-04-15
TR200101751T2 (tr) 2002-05-21
CY1108022T1 (el) 2013-09-04
ES2224649T3 (es) 2005-03-01
NO329749B1 (no) 2010-12-13
ES2285286T3 (es) 2007-11-16
CZ20003995A3 (en) 2001-06-13
WO1999055377A3 (en) 1999-12-29
EA200001111A1 (ru) 2001-04-23
DE69936409T2 (de) 2008-04-17
US7700314B2 (en) 2010-04-20
CA2565375A1 (en) 1999-11-04
NO20005337L (no) 2000-12-28
PL344490A1 (en) 2001-11-05
DK1075281T3 (da) 2005-01-03
EP1421956A1 (en) 2004-05-26
CZ298579B6 (cs) 2007-11-14
SK16222000A3 (sk) 2001-04-09
SK286217B6 (sk) 2008-05-06
CN100335503C (zh) 2007-09-05
KR100622796B1 (ko) 2006-09-13
PL193352B1 (pl) 2007-02-28
WO1999055377A2 (en) 1999-11-04
US20070141620A1 (en) 2007-06-21
CN1187094C (zh) 2005-02-02
UA66857C2 (uk) 2004-06-15
NO332224B1 (no) 2012-07-30
HK1038194A1 (zh) 2002-03-08
DK1421956T3 (da) 2007-10-01
AR020070A1 (es) 2002-04-10
BG65046B1 (bg) 2007-01-31
SI1075281T1 (en) 2005-02-28
BR9910023A (pt) 2000-12-26
NO20005337D0 (no) 2000-10-23
UA79430C2 (en) 2007-06-25
ATE365563T1 (de) 2007-07-15
HUP0300548A2 (hu) 2003-06-28
CA2330451A1 (en) 1999-11-04
EP1075281A2 (en) 2001-02-14
PT1421956E (pt) 2007-07-13
EA005495B1 (ru) 2005-02-24
BG64694B1 (bg) 2005-12-30
EA003789B1 (ru) 2003-10-30
JP2002512983A (ja) 2002-05-08
TWI266800B (en) 2006-11-21
EE05214B1 (et) 2009-10-15
EP1075281B1 (en) 2004-09-08
BG109291A (en) 2006-04-28
HK1076115A1 (zh) 2006-01-06
EA200300382A1 (ru) 2005-02-24
ATE275422T1 (de) 2004-09-15
WO1999055377A9 (en) 2000-03-02
SK286654B6 (sk) 2009-03-05
HUP0300548A3 (en) 2005-07-28
KR20010071158A (ko) 2001-07-28
NZ507456A (en) 2003-10-31
JP2010184929A (ja) 2010-08-26
PT1075281E (pt) 2004-11-30
JP4574007B2 (ja) 2010-11-04
DE69920002D1 (de) 2004-10-14
TR200003161T2 (tr) 2001-01-22
US7357925B2 (en) 2008-04-15
CZ298597B6 (cs) 2007-11-21
IL139286A0 (en) 2001-11-25
DE69920002T2 (de) 2005-09-22
BG104871A (bg) 2001-07-31
NO20100324L (no) 2000-12-28
SI1421956T1 (sl) 2007-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7357925B2 (en) Method for treating disorders and diseases treatable with human fibroblast interferon
EA008866B1 (ru) ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
MXPA00010223A (en) Polyol-ifn-beta conjugates
HK1076115B (en) Polyol-ifn-beta conjugates
HK1038194B (en) Polyol-ifn-beta conjugates
KR20030045414A (ko) 인터페론-베타와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체
HK1005225B (en) Interferon conjugates
HK1005225A1 (en) Interferon conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20130428