TWI232882B - Poly-IFN-beta conjugates - Google Patents

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TWI232882B
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Michael J Roberts
Milton Harris
Wayne Sawlivich
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Description

1232882 五、發明説明（） 本發明係與多元醇干擾素蛋白共輛物有關，更詳而言 之，尤指一種將一多元醇單元共價鍵結到Cys17。 按，人類的纖維細胞干擾素(ΙΡΝ-β)具有抗病毒活性， 而且能刺激自然殺手細胞對抗瘤細胞。該一干擾素係一種 5 由病毒及雙株RNAs所誘發約為20,000 Da的多肽。Derynk 與他人(Nature，285:542_547, 1980)從經由重組DNA科技所 培養的纖維細胞干擾素基因核甘酸順序推論出蛋白質完整 的氨基酸順序。該順序長為166氨基酸。
Shepard 與他人(Nature，294:563-565, 1981)描述一種發 10 生在842基底(位在141位置的Cys-Tyr)的突變，這種突變 廢除其抗毒活性，以及一種將核甘酸1119-1121的刪除變 種菌。
Mark與他人（美國國科會會刊，81(18):5662-5666, 1984) 藉著基底469(T)被(A)取代的方式植入了 一種人工突變，引 15 起位置17的氨基酸Cys - Ser發生轉換。經報導，所得的 IFN-β與“固有”的IFN-β具有同樣的活性，並且在長期存放 期間〇70°C)呈現穩定性。 經 濟 部 智 •慧 財 產 局 員 工 消 費 合 η 社 印 製 親水性聚合物變種系聚乙烯乙二醇，（PEG)，亦稱為聚 乙晞氧化物、（PEO)與分子的共價接合在生物科技與醫藥 20 界都具有重要的用途。PEG在其最常見的形式中是一種在 各個末端具有羥基的線性聚合物：
H0-CH2-CH20(CH2CH20)nCH2CH2-0H 可以用HO-PEG-OH簡單代表此一分子式，其中係指-PEG_代表聚合物沒有終端基的骨幹： -3- 本紙張从適用中國國家榡率（CNS )八4祕（21GX297公釐） 1232882 _____ B7 五、發明説明（） “-PEG-“意指 “-CH2CH20(CH2CH20)nCH2CH2-“ PEG—般是當作甲氧基-PEG-OH，（m-PEG)使用，其中 有一末端是相當惰性的甲氧基，同時另一個末端是一受到 化學改良的羥基
5 CH30-(CH2CH20)n-CH2CH2-0H 分枝的PEGs亦是經常用到的。該等分枝的PEGs可使 用R(-PEG_OH)m代表。其中，R代表一中央核心半體，如 季戊四醇或甘油，m代表分枝的數目。該一分枝的數目（m) 可從三到一百多不等。羥基係受到化學改良物的影響。 10 另一個例如在PCT專利申請案第WO 96/21459號說明 的分枝形式具有受到化學改良物影響的單一末端。這種類 型的PEG可使用（CH30-PEG-)pR_X代表，其中p等於2或 3，R代表如離氨酸或甘油的中央核心，而X代表該等受到 化學活化作用影響羧基的功能基。還有另一種分枝形式， 15 即“懸垂PEG”，則具有反應性基，如羧基，位在沿著PEG 骨幹的地方而非在PEG鏈的端部。 經濟部智慧财產局員工消費合作社印製 除了這些形式的PEG外，該聚合物以可使用骨幹中較 弱的或可裂解的鏈結製備。例如，Harris在第06/026,716 號美國專利申請案中顯示可使用該聚合物骨幹中，受到水 20 解作用影響的醋鏈結製備PEG。這種水解作用根據下列的 反應計畫，會導致聚合物的斷裂進入較低分子量的片段中·· -PEG-C〇2-PEG- + H20 一 -PEG-C02H + HO-PEG-根據本發明，聚乙晞乙二醇或PEG意指包括所有前述 的衍生物。 -4- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1232882 五 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 、發明说明（
乙烯氧化物與丙烯氧化物的共聚物係在其等化學性中 與PEG密切關聯，而且該等共聚物在許多PEG的應用當中 都可取代PEG。該等共聚物具有下列的一般分子式： H0-CH2CHR0(CH2CHR0)nCH2CHR-0H 其中R為Η或CH3。 頁 PEG是一種非常有用的聚合物，具有高水溶解度的屬 性以及在許多有機溶劑中的高溶解度。PEG亦無毒以及非 免疫源的。PEG以化學方式接合一不溶於水的化合物的結 果共軛物一般皆可溶於水，並應可溶於許多有機溶劑。 PEG蛋白共軛物目前正使用於蛋白質取代治療，以及 其它的治療用途。 15 20 譬如，PEG輯化嗓呤核脫氨基酶(ADAGEN®)目前正被 使用於治療嚴重的併發免疫不足症（SCIDS)。PEG .酯化L_ 天冬醯胺酶(ONCAPSPAR®)目前則是正被使用於治療急性 淋巴纖維貧血症(ALL)，而PEG酯化干擾素-oc(INTR〇N(R) A)則進入治療C型肝炎第三階段的試驗。 有關具有臨床功效的PEG蛋白質共輛物一般評論，請 參閱 n.l· Burnham，Am J. Hosp. Pharm.，15: 210-218, 1994 〇 針對PEG酯化蛋白質已經發展出多種方法。將PEG接 合到蛋白質上所發現的反應性基的標準作法是利用親電子 式活化PEG衍生物完成的。將PEG接合到在離氨酸殘基上 與N_末端所發現的α-與ε-氨基獲得一種由產品混合物組 成的共輛物。 一般，該等共軛物係由數種各自依蛋白質分子接合的 -5- 210X297公麓） 国国家榡率（CNS ) Α规4Μ 1232882 A7 _ B7 五、發明説明（） PEG分子(PEG聚合物）所組成，分子數零到蛋白質中氨基 的數目不等。針對一種已經個別改良的蛋白質分子，可將 PEG單元接合到多種不同的氨基酸位址。 這種非特定類型的PEG酯化已經獲得成為幾近非活性 5 的共輛物。活性減量一般是由遮蔽蛋白質的活性键結領域 引起的，一如針對許多胞變動物與抗體一樣。譬如，Katre 與他人在其等第4,766，106號與第4,917,888號美國專利當 中說明了 IFN-β與IL-2與超大量甲氧基-聚乙晞乙二醇N-丁二醛戊二酸以及甲氧基-聚乙烯乙二醇N·丁二醛丁二酸 10 進行PEG酯化。兩種蛋白質是在微生物主細胞當中製造 的，如此可使游離半光胺酸發生指定位址的突變成為絲氨 酸。該一突變為INF-β的MICROBIAL表示當中所必要者以 加速蛋白質摺合作用。尤指，使用於這些實驗中的IFN-β 是商用產品Betaseron⑧，其中，Cys17殘基為一種絲氨酸所 15 取代。此外，由於不存在糖基化作用而降低了其在水性溶 液中的溶解度。非指定PEG酯化導致增加溶解度，但主要 問題是減少了活性與產量的位準。 經濟部智慧财產局員工消費合作社印製 第EP 593 868號歐洲專利申請案，PEG干擾素共輛 物，說明了 PEG-IFN-α共輛物的製備。然而，peg酯化反 20 應並不指定位址，因此獲得PEG-IFN-a定位性的同質異構 物混合物（請亦參閱Monkarsh與他人，ACS Symp. Ser., 680:207-216, 1997)。
Kinstler與他人在第EP 675 201號歐洲專利申請案當 中以mPEG_丙醛展現了巨核細胞生長與發育因素（MGDF) -6- 本紙張尺度適用中國國家榡李（CNS ) A4規格（210X297公釐) '" - A7 B7 1232882 五、發明説明（） 的N-末端殘基。如此可逐批複製PEG酯化及藥物動力學。 Gilbert與他人在第5,711，944號美國專利中則展現了可製 造最適活性位準IFN-α的PEG酯化。在該案當中，需要費 力的淨化步驟才能取得最適共軛物。 5 大多數細胞質變的動物與其它蛋白質並不擁有一指定 PEG接合位址，而且除了前述的範例外，部分的透過PEG 酯化反應產製的同質異體物非常有可能為部分或完全非活 性，因此導致損失了最終混合物的活性。 因此，位址指定的單PEG酯化是製備該等蛋白質共軛 10 物所追求的目標。
Woghiren與他人在生物共輛物化學，4(5):314-318, 1993刊物中發表該一位址指定PEG酯化合成了一種甲氧基 -聚乙烯乙二醇N-丁二醛的硫醇類-選擇性PEG衍生物。顯 示一種以正呲啶二硫化物反應基形式存在，性質穩定，由 15 硫醇類保護的PEG衍生物能夠特定共軛到一種在蛋白質中 游離半光胺酸，木瓜蛋白酶。這種在木瓜蛋白酶與PEG之 間新形成的二硫化物鍵可在溫和的還原條件下經分解以再 生固有蛋白質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 凡在本案中引證的任何問件並非有意當作容許該一文 20 件為相關先有技術，或認屬對本申請案任何請求的可專利 性有實質關係。凡針對任何文件的内肽容或日期的聲明係 根據在提出本案之時為本案申請人等可用資訊，並不從此 構成認定該一聲明的正確性。 本發明之主要目的在於提供一種多元醇干擾素蛋白共 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 1232882 五、發明説明（） 輛物，係將一多元醇單元共價鍵結到Cys17而形成。 本發明之另一目的是供其等位址指定生產的過程以及 其等使用於細菌感染、病毒感染、自動免疫疾病與引起發 炎疾病的治療、預後或診斷。 5 本發明之再一目的係指一種供兩種或兩種以上PEG半 體等逐步附著到多肽（縮多氨酸）的方法。 緣以達成上述目的，本發明係提供一種具有共價鍵結 到人體干擾素-β的Cys 17多元醇半體的多元醇干擾素_6共 輛物。 10 亦，提供一藥物組分以及一供治療感染、腫瘤與免疫 及發炎性疾病的方法。 又，另指一種供階段性將一系列PEG半體接合到一多 肽，尤指接合至IFN-β的方法。 以下，茲舉本發明之數較佳實施例，並配合下列圖示 15 詳細說明於后，其中： 第一圖顯示淨化前PEG_IFN_p共軛物的毛細管電泳 (CE)圖。 經濟部智慈财產局員工消費合作社印製 第二圖A_C顯示由尺寸排阻層析法實施的PEG-IFN-β 共輛物淨化作用（Superose 12):第二圖A-第一道次；第二 20 圖B-第二道次；第二圖C第三道次。 第三圖顯示業經從第三層析法通道淨化的PEG-IFN-β 共軛物SDS_PAGE層析法。第一通道與第四通到係蛋白質 分子量標準，第二通道為“固有’’IFN-β，而第三通道為 PEG-IFN-β 共軛物。 -8， 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X：297公釐） A7 B7 1232882 五、發明説明（） 第四圖提出已淨化PEG_IFN-p共軛物的毛細電泳（CE) 第，其中IFN-β是使用mPEG-OPSS5K予以PEG酯化。 第五圖提出已淨化PEG-IFN-β共軛物的MALDI MS光 譜。 5 第六圖顯示“天然”INF-β與PEG-IFN-β共軛物之間抗 病毒活性的比較。WISH細胞在以囊狀口炎病毒的細胞病 理劑量試驗之前，先在指定的IFN-β樣品濃度下培養二十 四小時。再經過新增的四十八小時MTT轉換後所得出之該 種細胞病理的效應。 10 第七圖顯示IFN-β與PEG-IFN在Daudi細胞中的键結 曲線。 第八圖顯示老鼠中的IFN-β與PEG-IFN在經過靜脈内 投藥後的藥物動力概況。其中虛線指示各標準曲線的化驗 LOQ。 15 第九圖顯示老鼠中的IFN-β與PEG-IFN在經過皮下投 藥後的藥物動力概況。其中虛線指示各標準曲線的化驗 LOQ。 經濟部智慧射產局員工消費合作社印製 本發明係根據多元醇半體，尤指一 PEG半體接合到人 體IFN-β的Cysl7殘基後意外增加（或至少保有=且並未導 20 致減少）來自固有人體干擾素-β生物活性的IFN-β生物活性 的發現。因此，不僅帶有接合到Cysl7殘基的多元醇半體 展示不亞於IFN-β生物活性的IFN-β，而且這種多元醇 IFN-β共軛物也提供了由多元醇半體所賦予的所需屬性，如 增加的溶解度。 -9- 本纸張尺度適用中國國家標李（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 1232882 五、發明説明（） “IFN-β”一如在本案中所使用者係指人體纖維細胞干 擾素，一如藉著體液隔離所取得或藉著DNA重組技術從原 核生物或真核生物宿主細胞以及其鹽類、功能衍生物，先 質與活性分館物所取得者，唯必須包含在自然發生形式當 5 中的位置17含有半胱氨酸殘基。 根據本發明提出的多元醇干擾素_β共輛物當中的多元 醇半體可為任何水溶性，具有線性或分枝鏈的單功能或雙 功能聚合物（環氧燒）。一般，該多元醇是一種如聚合（乙烯 乙二醇)(PEG)的聚合物（環乙二醇烷）。然而，本項技藝中的 10 該等技術可認定該等如聚（丙烯乙二醇）以及聚乙晞乙二醇 與聚丙埽乙二醇的共聚物都適用。 PEG半體一如在本案中所使用者係有意包括但不限於 線性PEG與分枝PEG，甲氧基PEG，可水解或酵素可裂解 的PEG，懸垂PEG，枝晶體PEG，PEG共聚物以及一種或 15 多種的多元醇類，以及PEG與PLGA(聚合酸）的共聚物。
經濟部智慧財產局員工消費合作社印M 至於依本案中所使用的“鹽類”釋義係指羧基的鹽類以 及經由已知方法可取得化合物的氨基作用物的鹽類。羧基 的鹽類包括無機鹽，例如鋼、钟、躬鹽以及有機的鹽類’ 如該等以一種三乙醇胺、精氨酸或離氨酸形成的鹽類。氨 20 基的鹽類包括有，具有如鹽酸等無機酸鹽類以及具有如醋 酸等有機酸的鹽類。 本案中所使用的“功能性衍生物”係指該等可由出現在 氨基酸半體之側鏈上或在末端N_或C-基之功能基根據已 知方法所製備的衍生物。且該等衍生物在藥學上為可接受 -10- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS } A4規格（210X297公釐） ~ _ A7 B7 1232882 五、發明説明（） 者，亦即其等並不會摧毁蛋白質活性或不會將毒性帶到包 含其等之藥學組成物之内者。該等衍生物包括如醋類或複 基脂肪族氨化物以及游離氨基的N-醯衍生物’或游離羥基 的0-酿基衍生物。 5 “先質’’係指該等經轉換可形成人體或動物體内IFN-β的 化合物。 蛋白質一“活性裂解物”在本發明中係指凡為化合物本 身多肽鏈的片段或先質，單獨存在或與相關分子或鍵結到 該化合物殘基的組合’例如當該等片段或先質顯示IFN- β 10 作為藥物一些活性時的糖類或磷酸鹽類的殘基，或多肽分 子的聚集物。 本發明的共輛物可藉著本技藝中已知任何方法製備。根 據本發明一實施例，IFN-β與PEG酯化試劑在一適當的溶 劑中反應，並將所要的共輛物隔離淨化，譬如，藉著一種 15 或多種層析法。 經濟部智慧射產局員工消費合作社印製 “層析法，，意指凡係用來藉著以混合物組分在一支撐上 (靜相）的應用，透過該支撐一溶劑（動相）流動來分離該等混 合物組分之技術。層析法的分離原理係根據不同的靜相與 動相物理性質。 20 某些在文獻中為人所熟如特定類型的層析法包括：液 體、高壓液體、離子交換、吸附、親和、分隔、親水、逆 向、膠濾化、超濾或薄層層析法。 本發明申請案中所使用之”硫醇反應性PEG酯化試劑” 意指凡能夠與半胱氨酸殘基硫醇基起反應的PEG衍生物。 -11- 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） ~ 1232882 A7 ________B7五、發明説明（） 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 it 社 印 譬如該劑能為含有一如功能基的PEG正呲啶二硫化物、乙 烯砜，順丁烯二醯亞胺，碘乙醯胺與其它。根據本發明一實 施例，該硫醇反應性的PEG酸酯劑是PEG的正呲啶二硫化 物（OPSS)衍生物。 5 PEG酯化試劑係依其單-甲氧基酯化的形式使用，按該 處僅有一末端可供共軛使用，或是依一雙功能形式使用， 其中兩個末端可供共軛，例如該等在與雨個INF-β共價鍵 結到一單一 PEG半體的共軛物。該試劑宜具有一位在500 與100,000之間的分子量。 10 製備本發明共軛物的典型反應式如下： ph< 7 蛋白質 _SH +mPEG-S-S- --->mPEG-S-S-蛋白質 β-mercaptoethanol(硫醇二醇） 15
蛋白質-S-H + mPEG-S-H + HOCH2CH2-S-S-CH2CH2〇H 前述反應式的第二行提出一種供切斷PEG蛋白質鏈結 的方法。mPEG -OPSS衍生物對於游離橫酸基是具有高度 20 選擇性的，而且在酸性的酸鹼值條件下，ΙΡΝ-β穩定時可迅 速反應。從共軛物還原到IFN-β與PEG固有形式一事可展 現該種高度選擇性。 在蛋白質與PEG半體之間產生的二硫化物键已顯示在 循環中的穩定性，但是在進入細胞環境時會還原。因此預 本紙張(CNS) A4“x297公釐-)
經濟部智慧3Γ產局員工消費合作社印製 1232882 期這種並不進入細胞的共軛物在循環系統當中會呈穩定直 到被清除為止。 應注意的是由於其它兩個出現在人體IFN^形式中自 然出現位置31與位置141的cys殘基形成一種二硫化物架 5橋而不會與硫醇反應性的PEG酯化試劑起反應，因此上述 反應屬於位址指定的反應。 本發明亦指出一種供階段性接合兩種或兩種以上PEG 半體到一多肽的方法。該一方法係根據認定一低分子量活 化的PEG要比一高分子量活化的PEG更能完全的在一位在 10 一蛋白負受阻的反應位址起反應。昂貴的治療用蛋白質的 PEG改良物必須具有實際功效，才能使得PEG共軛物能實 際生產。此外，為了降低腎小球的過濾作用以及將PEG-蛋白質共軛物的藥學屬性最適化，該共軛物應具有相當於 70kDa分子量蛋白質的有效尺寸。這表示針對一位址指定 15 改良物，其中接合一 PEG者宜接合一分子量大於20kDa的 PEG衍生物。如果改良物的位址太擠，則在大型PEG半體 上的反應基要抵達改良物位址就有困難，因此將導致低產 量。根據本發明將一多肽PEG酯化的宜取方法可藉著接合 少量異質或同質雙功能PEG半體的方式增加位址指定PEG 20 酯化的產量，其中由於該半體的尺寸較小，就可以於位擠 的位址起反應。隨後對於大分子量PEG衍生物經接合到一 小PEG可導致所需PEG酯化蛋白質的高產量。 根據本發明供階段性一系列接合兩種或兩種以上PEG 半體到一多肽包括將一低分子量異質雙功能或同質雙功能 -13- 本紙張尺度適用中國國家榡隼（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐）
A7 B7 1232882 五、發明説明（） 的PEG半體首先接合到該多肽，接著將一單功能或雙功能 PEG半體接合到附著該多肽的低分子量PEG半體的游離末 端。在這種將兩種或兩種以上PEG半體階段性一系列接合 到一多肽之後，其中該多肽宜為IFN-β，而一位擠位址的 5 Cys17係PEG接合宜取位址，則該PEG多肽共軛物可利用 一種或多種技術淨化，如離子交換層析法、位址排阻層析 法、親水性互動層析法、親和力層析法、以及逆相層析法 等。 該低分子量PEG半體分子式如下 10
W-CH2CH20(CH2CH20)nCH2CH2-X 其中W與X為獨立與一胺，硫氫基，羧基或羥基功能 基反應以將低分子量PEG半體接合到多肽。W與X宜獨立 15 選自正呲啶二硫化物、順丁烯二醯亞胺類、乙烯砜類、碘 乙醯胺類、胺類、硫醇類、羧基類、活性酯類、苯駢噻唑 碳酸鹽類、P-硝基酚碳酸鹽類、異氰酸鹽與生物素。低分 子量PEG半體宜具有大約在100與5,000道爾頓之間的分 子量。 20 供接合到附著多肽的該低分子量PEG游離末端的單功 能或雙功能PEG半體宜具有一範圍大約在100道爾頓至 200 kDa之間的分子量，而且最好是為一甲氧基PEG、分 枝PEG、可水解或酵素可裂解的PEG，懸垂PEG，或枝晶 體 PEG。 -14- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0乂297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) tr 線 經濟部智慧财產局員工消費合作社印製 A7 B7 1232882 五、發明説明（） 該單功能或雙功能PEG另具有下列分子式： y-ch2ch2o(ch2ch2o)mch2ch2-z 5 其中Y對附著到多肽低分子量PEG半體游離末端上的 終端基具有反應性，而Z則是-OCH3或供反應的基以形成 一雙功能共輛物。 由前述階段性接合兩種或兩種以上PEG半體的方法所 製造的PEG-多肽共軛物可用來製造供治療疾病或失調的 10 一藥劑或藥物組分，其中該多肽係為一有效活性成分。 本發明另一個目的是要提供經充分淨化形式的共軛 物，該等適合作為細菌與病毒感染、發炎性疾病與腫瘤等 治療、診斷或預後的的製藥組分活性配方使用。 該等藥物組分係本發明另一目的。 15 前述疾病的例子包括而不限於下瀉，愛滋病、風濕性 關節炎，狼瘡性紅斑與多重動脈硬化症。 以下說明將突顯本發明進一步的實施例與優點。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明一實施例係對本發明共軛物一藥學活性量的投 藥給處於發展前述疾病之一危險的對象或是已經顯示等病 20 理的對象。 凡於活性原則相容的投藥路徑都可使用。宜採用胃腸 外的投藥，如皮下、靜脈、注射等都宜取。所要投藥的活 性成分劑量要視根據年齡、體重與患者個別反應的醫生藥 方為準。對一位平均體重75公斤的劑量可為每天l〇pg至 -15- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（2丨OX297公釐） 1232882 A7 B7 五、發明説明（ mg不等，每天劑量宜在20μ§至200盹之間。胃腸外投藥 的載體為本技藝中熟知者，並包括如水、生理食鹽水、林 格氏i液以及/或葡萄糖。該載體可包含小量的賦形劑以維 持蕖物I備的穩定性與等張性。該等溶液的製備可根據一 5 般模態實施。 本發明業經指出係參照特定實施例，但是說明的内容 涵I所有可能由一位熟悉本技藝人士作成未延伸超過本發 明凊求轉利事項意義與目的的改良與取代。 本發明將藉著下列範例說明，該等範例並不構成以任 10 何方式限制本發明。 範例一 ：PEG-IFN-β共軛物的製備 使用mPEG5K-〇PSS的IFN-β改良物 經濟部智惡射產局員工消費合作社印裝 將穩定於一 50 mM醋酸鹽緩衝液，酸鹼值為3.6，濃 15 度為〇.37mg/ml的重組細胞人體IFN-β用來供製備一 PEG-IFN-β共輛物。將大約1.0ml的6M尿素添加到濃度為 0.37mg/ml(0.74 mg，2·7 X Γ8 摩爾）的二毫升 IFN-β。將一克 分子量超過五十摩爾的mPEG5K-OPSS添加到一摩爾的 IFN-β，令兩者在一聚丙婦燒杯内反應，溫度為37°C時反 20 應兩小時，或在50°C時反應一小時。反應混合物接著使用 毛細電泳(CE)圖分析以判定PEG酯化反應在實施任何淨化 作業之前PEG-IFN-β共軛物形成的程度(如第一圖所示）。這 種反應的標準產量為50%的PEG-IFN-β。反應的各種產品 接著使用一 〇.22mm洗淨濾器過滤’過滤後的溶液再裝到 -16- 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 1232882 五、發明説明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 一個尺寸排阻柱中（使用Superose 12或Superose 75)並使用 50mM的磷酸鹽，150mM的氯化納，酸鹼值為7_0的緩衝 液洗提。第二圖A顯示來自PEG-IFN-β共軛物在Superosel2 大小排阻層析柱上的洗提作用概況。將峰值收集利用 5 SDS-PAGE分析(如第三圖所示）。含有PEG-IFN-β共軛物的 裂解物收集在一起並集中後，因為太靠近“固有’’IFN-β峰值 的區域，接著再度裝載到同樣大小的排阻柱以進一步淨化 PEG-IFN-β(如第二圖B所示）。重複這種程序（第三道次）以 確保純度(如第二圖C所示）。第四圖與第五圖分別顯示已 10 淨化PEG-IFN-β共軛物的毛細電泳圖與MALDI MS光譜。 使用mPEG30K-OPSS的IFN-β改良物 將穩定於一 50 mM醋酸鹽緩衝液，酸鹼值為3.6，濃 度為0.36mg/ml的重組細胞人體IFN-β用來供製備一 PEG-IFN-β共輛物。將在3 ml的去離子水中大約36mg的 15 hiPEG3〇k-〇PSS 添加到濃度為 〇.36mg/nil( 1.08 mg，4·9 χ 1〇·8摩爾）的三毫升IFN-β。令兩者在一 50°c的聚丙埽燒杯 内反應二小時。反應混合物接著使用毛細電泳圖分析改良 的程度。這種反應的標準產量為小於30%。接著將溶液裝 到一個尺寸排阻柱中（Superose 12，Pharmacia )並使用 2〇 50mM的磷酸鹽，150mM氣化納，酸鹼值為7·0的緩衝液 洗提。將峰值收集利用SDS-PAGE分析它們的含量。 範例二：PEG-IFN-β共軛物的生物活性 若要評鑑PEG酯化對人體重組細胞IFN-β抗病毒活 -17- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297^^7 1232882 Λ7 ________ __ B7 五、發明説明（） 性，先使用新鮮製備的IFN-β(與使用於peg酯化的同批號） 或是PEG-IFN-β共軛物培養WISH氨基細胞。依WISH-VSV 細胞毒性鑑定測得的IF N · β -媒介的抗病毒活性係依一種根 據 Novick 與他人，J· Immunol·，129: 2244-2247(1982)協定 5 所發展的抗病毒WISH生物鑑定法判定的。於該鑑定法中 所使用的材料如下： WISH 細胞（ATCC CCL 25) 儲存於-70 °C的囊狀口炎病毒母株（ATCC V-520-001-522) 10 IFN-β ’ 人體重組細胞，interPharm Laboratories LTD(32,075-類型，第 205035 批），82 x 106IU/ml，指定活 性：222 X 106 IU/mg 依範例一所製備並維持在酸檢值為7.4PBS中的 PEG-IFN-β共軛物 15 WISH生長基質（MEM高葡萄糖加Earls鹽類 + 10%FBS+1.0% L-穀醯氨+盤尼西靈/鏈霉素（1〇〇 u/ml， lOOpg/ml) 經濟部智慧¾產局員工消費合作社印製 WISH鑑定基質（MEM高葡萄糖加Earls鹽類+5% FBS+1.0% L·穀醯氨 +盤尼西靈/鏈霉素（1〇〇 U/ml, 20 100pg/ml) PBS 中的 5 mg/ml MTT，存放在-70°C。 WISH鑑定協定如下： 將IFN-β樣品稀釋到WISH鑑定基質起始濃度的2X。 在平底的96井培養孤中對WISH鑑定基質中的IFN-β -18- 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格{ 21〇><297公釐} A7 B7 1232882 五、發明説明（） ~~ 樣品作成二倍的稀釋液，使得每一口井含有5〇μ1經稀釋的 IFN-β樣品（部分設控井接受5〇μ1的WISH鑑定基質）。 使用胰蛋白酶/乙二胺四醋酸(EDTA)溶液收取對數成長 階段的WISH細胞，在WISH鑑定基質中清洗，並帶到每 5毫升〇·8 x 1〇6個細胞的最終濃度。 在各口井添加50μ1的wish細胞懸浮液(每口井添加4 X 104個細胞）。暴露到該等細胞的IFN卬最終濃度目前為 IX。 於一 5%二氧化碳加濕細菌培養器中培養二十四小時 ίο後，以vsv母株（一預先決定在四十八小時内WISH細胞 溶解100%劑量）一對十稀釋液(在WISH鑑定基質當中）添加 到所有除了無病毒設控井（這些警僅接受等體積的鑑定基 質）之外的井中。 再等另一個四十八小時後，將25μ1的MTT溶液添加到 15所有的井中，之後將所有的培養皿放在細菌培養器中再培 養兩小時。 將培養皿子倒過來移除所有井中的内含物，並將2〇〇μΐ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 的100%乙醇添加到井中。 經過一小時’使用Soft max Pro套裝軟體與Spectramax 20 光譜儀系統(Molecular Devices)於595nm讀取各培養皿。 _19_ 本紙 CNS ) ( 210X297^^7 I232882
五、 發明説明（ 表一：PEG酯化與模擬_peg酯化IFN-β樣品的抗病毒活性 IFN-β樣品* EC5〇** PEG-IFN-β共轭物 3·9±0·7 pg/ml IFN-β 16·4±1·0 pg/ml * EC5〇(土S.D.)係藉著Microcal Origin 4.1版軟體程式判定的。 一如在第六圖與表一中所展現的，該PEG_IFN^共軛物 維持的抗病毒活性位準優於IFN-β新鮮製成原批。 經觀察到PEG-IFN-β共軛物具有大約高過新製備IF^ 10 15 四倍的生物活性，這也有可能是因為PEG-IFN-β針對“ 有，，IFN-β在新增WISH細胞鑑定基質後增加了穩定性結固 導致的。 ° ^ 範例三：PEG-IFN樣品相對活性試管内鑑定法 PEG[30 kDHFN-β與 PEG[2 X 20 kD]-IFN々的相對 性係藉著利用於範例二說明的標準協定以WISH趣<、、& » 定。由三組不同的人在隔開的時間實施了三項獨立的供& 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 — 本纸張尺度適用中國國家樣隼（CNS ) A4規格（2丨OX297公釐） 1232882 Λ7 ______ B7 五、發明説明（） 表二：PEG-IFN-β相對抗病毒活性 相對干擾i Η舌性*(赛 F自三項研究） 樣品 鑑定一 鑑定二 鑑定三 平均(S.D.) ~ PEG[30kD]-IFN-p 高於3.2 X 高於3.1Χ 高於1.8Χ 高於 3·0Χ(0·78) PEG[2x 20kD]-IFN-p 高於4.2X 高於1.3Χ 高於0.85Χ 高於 2·1Χ(1·8) 各鑑定法中包括了與標準IFN-β比對的EC5〇劑量。 基於 330 pg/ml 的 IFN-β濃度進行比對。PEG[30 kD]-IFN-p(5.41 pg/ml)母株濃度以及 PEG[2 x 20kD]-IFN-p(6.86pg/ml)的濃度係由 5 AAA判定。
PEG-IFN-β對其受體在細胞上的鍵結力經在一固定量 的125I_IFN-a2a之前接受評估。該iFN-oc2a係利用氯胺-T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 方法以1251放射線同位素示蹤的。該1251鍵結的IFNa2a係 10 藉著夠過一 Sephadex G25柱的反應劑以及聚集含有列解物 的蛋白質從游離破上移除的（Pharmacia)。125I-IFN-a2a經藉 著一種IFN-oc2a ELISA鑑定法(Biosource，USA)量化並判定 指定活性。收取在成長指數階段中成長的Daudi細胞並使 用0_5nM 125I-IFN-a2a將2 X 1〇6個細胞在室溫中培養三個 15 小時，培養係在含有2%胎中牛血清以及〇·ι%疊氮鈉的 RPMI 1640鑑定緩衝液稀釋過，不同濃度pEG-IFN-β或 IFN-oc2a中實施的。培養完成時，將細胞透過一層苯二酸 油離心並在伽瑪計數器上計算細胞鍵結的放射性。另，如 第七圖所示，PEG[30 kDHFN-β以及 PEG[2 X 20kD]_IFN-p 20 的鍵結力對受體的键結力非常類似或接近ΙΡΝ-β的鍵結力。 此外，相對活性係在一 Daudi細胞（人體β細胞淋巴瘤） -21· 本紙張尺度適用中國國家榡隼（CNS ) A4規格（2!〇Χ29ΐ^釐) - --—- A7 B7 1232882 五、發明説明（） 抗擴散鑑定法中判定的（表三）。所有的IFNs都係在一 200 ng/ml的2x濃度中作成的。樣品於ΙΟΟμΙ最終體積時，對 整個長度的培養皿經稀釋成三倍。各井中添加1 X 1〇5細胞 /井（100μ1δ)並於37°C在二氧化碳加濕培養器中總計培養七 5 十二小時。四十八小時後，以20μ1中每井1個pCi的量添 加氚標記的（3H)胸（腺嘧啶脫氧核）甘。完成七十二小時的培 養後，使用Tomtek培養皿收成器對培養皿進行收成。顯示 於表三的結果指出並未從PEG酯化觀察到有可偵知的IFN 活性損。事實上，經發現該活性要高於游離IFN-β。這可 10 能是因為無活性聚集物在游離的IFN中形成或是因為所使 用的量化方法不同（PEG-IFN樣品使用氨基酸分析而IFN-β 使用 RP-HPLC)。 表三：Daudi抗擴散鑑定法
IC5〇劑量* 對IFN增加倍數 IFN-β(—號培養皿） 1153.1 - PEG[30 kD]-IFN(71A) 695.6 1.6X IFN-β(二號培養皿） 1005.8 - PEG[40 kD]-IFN(71B) 629.4 1.7X 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 15 *pg/ml 範例四：老鼠體内藥物動力學研究 靜脈投藥 將老鼠注射 l〇〇ng 的 IFN-β，PEG[30 kD]_IFN-P或 20 PEG[2 X 20 kD]-IFN_p，並於注射後的指示時間將血移除。 IFN-β的血清濃度藉著 IFN-β指定 ELIAS(Toray Industries) -22- 本纸張尺度適用中國國家標李（CNS ) A4規格（2丨OX297公釐） ~ 1232882 A7 B7 五、發明説明（ 判定，第八圖顯示判定結果。將二十四隻（六到八個星期大） 雌性B6D2F1種的老鼠分成四組如下：第一組含有九隻經 注射200μ1的500 ng/ml人體lFN-β單劑（最終劑量為每隻老 鼠100 ng);第二組（九隻老鼠)接受2〇〇μΐ當量的pEG30 5 kD-IFN-β ;第三組接受200μ1當量的PEG(2 X 20 kD)-IFN-P ;以及第四組是三隻未經注射的老鼠當作負面控 制。在九個^曰走時間精著使用一支毛細管干擾逆行復軌道 上靜脈叢的方式血液樣本（大約每份樣本2〇〇μ1)收集。將血 液樣本置於室溫中凝結一小時後，加邊並進行微離心。取 10出血清後置於-7〇°C存放直到所有的樣本收集完全為止。利 用Toray鑑定法對血清進行鑑定看是否出現生物活性的人 體IFN-β。結果指出PEG-IFN樣本中在曲線下面積(AUC) 要比游離IFN-β比較之下明顯增強，而PEG[2 X 20 kD]_IFN-P優於 PEG[30 kD]_IFN-p。 15 皮下投藥 將老鼠皮下注射IFN-β與peg -IFN(每隻老氣100ng)。 第九圖展現與游離IFN-β比較下，peG-IFN樣本曲線下總 面積出現戲劇性的增強。此種藥物動力學研究與具有較長 請 先 間 讀 背 5 i 事 項 再 ί 經 濟 部 智 慧η 產 局 員 工 消 費 合η 社 印 製 20 半衰期以及增大AUC的PEG-IFN樣本一致
)八4規格（210><297公釐 1232882 A7 ___B7 五、發明説明（） 範例五：低分子量PEG半體對多肽的附著 使用〇PSS_PEG2k_酿朋1將干擾素β貼上標記。 蛋白質-SH + 〇 C>-S-S-PEG2K- C - νη_νη2
蛋白質-S_S-PEG2K -C-NH-NH 10 在50mM酸鹼值為3.8的醋酸鹽緩衝液中以0.33 mg/ml 的濃度提供重組細胞人體干擾素-β。將二亳升去離子水 中，大約3.6mg (比蛋白質摩爾數多出四十個摩爾 數)OPSS-PEG2K-醯肼的異質雙功能性PEG試劑添加到三毫 升濃度為0.33 mg/ml(0.99mg)的IFN-β，令兩者在一 45°C的 聚丙烯燒杯中反應一個小時，接著使用毛細電泳分析反應 混合物，以判定改良的程度。標準產量視干擾素(3與PEG 試劑的純度而定，從90%至97%不等。接著將溶液倒到一 尺寸排阻柱（Superdex 75, Pharmacia)並使用5mM的磷酸 經 濟 部 智 慧 財 產 jL m 費 合 it 社 印 製 鹽，150mM氯化鈉，酸鹼值為7.0的緩衝液洗提。收集峰 20 值並使用SDS-PAGE分析。單PEG酯化的干擾素裂解物經 聚集在一起，供以高分子量PEG進一步改良步騾之用。
W適用中固國家榡隼（CNS )八4祕（210X297公釐) A7 B7
1232882 五、發明説明（ 使用〇PSS2-PEG34〇0將干擾素β貼上標記。
蛋白質-SH + ^^-S_S-PEG3彻 \7 _ 蛋白質-S-S-PEG34〇〇 -S-S·^) N~~^ 在5〇1111^酸鹼值為3.8的醋酸鹽緩衝液中以0^^_, mg/mi 10的濃度提供重組細胞人體干擾素-β。將二亳升去離予水 中，大約6·1 mg (比蛋白質摩爾數多出四十個摩爾 數XOPSSh-PEGMoo-醯肼的同質雙功能性PEG試劑添力口到 三毫升濃度為〇·33 mg/ml(0.99mg)的IFN-β，令兩者在— 5 〇 C的聚丙稀燒杯中反應兩個小時。反應係使用非還原,丨生白勺 !5 SDS-PAGE監督，接著使用毛細電泳分析最終反應混人 物，以判定改良的程度。標準產量超過95%。接著將溶液 倒到一尺寸排阻柱（Superdex 75，Pharmacia)並使用50 mM 的磷酸鹽，150mM氯化鈉，酸鹼值為7.0的缓衝液洗提 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 η 社 印 製 收集峰值並使用SDS-PAGE分析 2〇 解物經組合在一起。 單PEG酯化的千擾素裂
CNS ) A4規格（210X297公釐） A7 B7 1232882 五、發明説明（） 範例六··第二個PEG半體對低分子量PEG酯化多肽的附著 使用mPEG30K_乙醛(ALD)對IFN-S-S-PEG2K-醯肼的改良
^ \\ II
5 蛋白 i -S-S-PEG2K-C NH-NH2 + hiPEG3〇k- CH2CH2CH
蛋白質，S-S-PEG2K-C - NH-N=CH-mPEG30K 10 將一超過蛋白質二十個摩爾數的mPEG3〇K-ALD添加到 於範例五中的IFN-S-S-PEG2K醯肼的組合裂解物中。反應 係在室溫中進行四小時，並將一樣品添加到一尺寸排阻柱 中（Superose 6, Pharmacia)以判定改良物產量。視PEG試劑 純度與反應條件而定，此種反應的標準改量物產量超過 15 80%。 至此業已完全說明本發明，依暸解，該等熟知本技藝之 人士可在一等值參數、濃度與條件的廣大範圍中，亦沒有 不當實驗的情況下實施皆不超過本發明之精神與範疇。 經濟部智慧¾產局員工消費合作社印製 本發明已經配合其中特定實施例說明，經暸解本發明尚 20 可實施進一步的各種改良。本申請案有意涵蓋凡大體上追 隨本發明於此所揭示原理的變化、用途或改寫，並包括了 該等雖偏離本發明揭示内容但仍在本技藝中有關本發明屬 於已知或慣例等得利用到本說明書中所於下在專利請求事 項中的範疇。 -26- ( CNS ) ( 2I0X297>^ftl 1232882 五、發明説明（） 所有本案所引證的參考資料 要，且不論其在美國或外國專利申=予術期刊專文或摘 或外國專利當中已公開或未公開；者任==國 5提出的資料、圖表及内文此:括參，資料中所 =内容凡落在本案引證的參考資料内者皆亦完4;: 參考而合併到本案。 王』猎奢 經濟部智慈辫產局員工消費合作社印製 、參照已知的方法步驟、傳統的方法步驟、已知方法或 傳統万法並不以任何方式經認屬為允許任何本發明層面、 10說明或實施例可在相關技藝當中揭露、傳授或建議f 、 前述特定實施例的說明完全顯現本發明的一般性質， 致使任何其他人藉著應用本技藝的技術範圍内的知識（包 括本案所引證參考資料的内容在内），隨時為了不同申請案 {多〃了以及或改寫該等特定的實施例，而不必實施不當的實 15驗’亦不會偏離本發明的一般概念。因此，基於本案内容 所提出的教義與指導，該等改寫與修訂係而有意落在該等 所揭露實施力同等範疇與意義之内。另，經瞭解本案之語 法或術語係供說明目的使用，並非為了限制的目的，本說 明書中的語法或術語是鑑於本案提出的各種教授與指道方 20 變凡熟悉本技藝之人士配合本技藝中一般技術之一的知識 詮釋用的。 -27- 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS } A4%格（2丨OX297公釐） 1232882
圖式之簡單說明 第一圖㈣淨化前PEG拙.β共祕的毛細管電泳 (CE)第。 第-圖A-C顯示由尺寸排阻層析法實施的pEG_iFN_p 5共軛物淨化作用（SuPen)se 12):第二圖a—第—道次；第二 圖B-第二遒次；第二圖c第三道次。 第三圖顯示業經從第三層析法通遒淨化的pEG_iFN_p 共輛物SDS-PAGE層析法。帛一通道與第四通到係蛋白質 分子量標準，第二通道為‘‘固有，，IFN_P，而第三通道為 10 PEG-IFN-β 共輛物。 第四圖提出已淨化PEG-IFN· β共軛物的毛細電泳(CE) 第’其中IFN-β是使用mPEG-OPSS5K予以PEG酯化。 第五圖提出已淨化PEG-IFN-β共軛物的MALDI MS光 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 第六圖顯示“天然’’IFN-β與PEG-IFN-β共軛物之間抗 病毒活性的比較。WISH細胞在以囊狀口炎病毒的細胞病 理劑量試驗之前，先在指定的IFN-β樣品濃度下培養二十 四小時。再經過四十八小時MTT轉換後所得出之該種細胞 病理的效應。 第七圖顯示IFN-β與PEG-IFN在Daudi細胞中的鍵結 曲線。 第八圖顯示老鼠中的IFN-β與PEG-IFN在經過靜脈内 投藥後的藥物動力概況。其中虛線指示各標準曲線的化驗 LOQ 〇 -28- 本紙張尺度通用中國國家榡隼（CNS ) A4規格（2丨0犬297公釐） 1232882 A7 B7 五、發明説明（） 第九圖顯示老鼠中的IFN-P與PEG-IFN在經過皮下投 藥後的藥物動力概況。其中虛線指示各標準曲線的化驗 LOQ。 請 先 閲 讀 背 5ί 事 項 再 填 旁
IT 經濟部智慧«產局員工消費合作社印製 -29- 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（2〗0'乂297公釐）

Claims (1)

1232882 § D8 鬌 — ----- — "一^ " " 1 — —»__ 六、申請專利範圍 8. 依據申請專利範圍第3項所述之多元醇干擾素-β共 軛物製程，其中該反應步驟係在一其干擾素為穩定時，於 一酸性酸驗值所實施者。 9. 一種用以治療感染、腫瘤與自體免疫以及發炎性疾病 5 之醫藥組成物，包含有申請專利範圍第1項所述之多元醇 干擾素-β共輛物作為一活性成分，以及一藥學上可接受之 載體、賦形劑或助劑。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3 本紙张尺度適用中國國家標李（CNS ) Α4現格{ 210Χ297公釐）
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