EA005495B1

EA005495B1 - Способ поэтапного присоединения частей полиэтиленгликоля к полипептиду

Info

Publication number: EA005495B1
Application number: EA200300382A
Authority: EA
Inventors: Набиль Эль Таяр; Майкл Дж. Робертс; Милтон Харрис; Вэйн Соливич
Original assignee: Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В.
Priority date: 1998-04-28
Filing date: 1999-04-28
Publication date: 2005-02-24
Also published as: HUP0300548A2; HK1076115A1; TR200101751T2; ATE365563T1; EA200001111A1; NO329749B1; BG104871A; HUP0300548A3; EE05214B1; EP1075281B1; HK1038194A1; IL139286A0; EP1075281A2; CZ298579B6; EE200000614A; CN1187094C; PL344490A1; CA2565375A1; SI1075281T1; DE69936409T2

Abstract

Изобретение относится к способу поэтапного присоединения ПЭГ-частей последовательно к полипептиду, в частности, к способу получения конъюгатов ПЭГ-β-интерферона.

Description

По настоящей заявке испрошен приоритет в соответствии со ст. 35 И.8.С. § 119(е), по дате подачи первоначальной временной заявки США № 60/083339, полное содержание которой включено сюда в качестве ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способу поэтапного присоединения двух или более частей полиэтиленгликоля (ПЭГ) к полипептиду, в частности к способу получения конъюгатов полиэтиленгликоль-в-интерферон (ПЭГ-β-ИФН), в которых полиольная часть ковалентно связана с Сук¹⁷, а также к использованию продуктов, полученных данным способом в терапии, прогнозе или диагностике бактериальных инфекций, вирусных инфекций, аутоиммунных заболеваний и воспалительных заболеваний.

Предпосылки к созданию изобретения

Интерферон фибробластов человека (β-ИФН) обладает противовирусной активностью и может также стимулировать природные клетки-киллеры против опухолевых клеток. Это полипептид с массой около 20.000 Да, индуцируемый вирусами и двухнитевыми РНК. Из нуклеотидной последовательности гена фибробластного интерферона, клонированного с помощью технологии с использованием рекомбинантной ДНК, Эетуик и др. (ЫаШге, 285:542-547, 1980) установили полную аминокислотную последовательность протеина. Она имеет длину в 166 аминокислот.

8йератб е1 а1. (№1Шге. 294:563-565, 1981) описали мутацию при основании 842 (Сук-Тут в положении 141), которая уничтожала противовирусную активность интерферона, и вариантный клон с делецией нуклеотидов 1119-1121.

Магк и др. (Ргос. ЫаД. Асаб. 8ск И.8.А., 81(18):5662-5666, 1984) осуществили искусственную мутацию путем замены основания 469 (Т) на (А), вызвав замену аминокислоты Сук-8ет в положении 17. Сообщалось, что полученный в результате β-ИФН был так же активен, как нативный β-ИФН, и устойчив при длительном хранении (-70°С).

Ковалентное присоединение к молекулам гидрофильного полимерного полиэтиленгликоля (ПЭГ), также известного как полиэтиленоксид (ПЭО), имеет важное применение в биотехнологии и медицине. В своей наиболее общей форме ПЭГ является линейным полимером с гидроксильными группами на каждом конце

НО-СН₂-СН₂О(СН₂СН₂О)_ПСН₂СН₂-ОН

Эта формула может быть кратко представлена как НО-ПЭГ-ОН, где имеется в виду, что -ПЭГпредставляет основную цепь полимера без концевых групп

-ПЭГ- означает -СН2СН2О (СН2СН2О) ПСН2СН2-.

ПЭГ обычно используется в виде метокси-ПЭГ-ОН (м-ПЭГ), в котором один конец является относительно инертной метоксигруппой, в то время как другой конец представляет гидроксильную группу, которая является объектом химической модификации

СН₃О-(СН₂СН₂О)_П-СН₂СН₂-ОН

Также обычно используются разветвленные ПЭГ. Разветвленные ПЭГ могут быть обозначены как Я(-ПЭГ-ОН)_т, где Я представляет центральное ядро, такое как, например, пентаэритрит или глицерин, и т означает число ответвлений. Число ответвлений (т) может варьироваться от трех до ста или более. Гидроксильные группы являются объектом химических модификаций.

Другая разветвленная форма, такая как описанная в публикации международной патентной заявки АО 96/21469, имеет единственный конец, который является объектом химической модификации. Этот тип ПЭГ может быть представлен как (СН₃О-ПЭГ-)_рЯ-Х, где р равно 2 или 3, Я представляет центральное ядро, такое как например, лизин или глицерин, и X означает функциональную группу, такую как например, карбоксильную, которая является объектом химической активации. Еще одна разветвленная форма, ПЭГ с боковыми цепями, имеет реакционноспособные группы, такие как например, карбоксильная, вдоль основной цепи ПЭГ, а не на конце цепей ПЭГ.

В дополнение к этим формам ПЭГ, полимер может быть также получен со слабыми или способными к расщеплению связями в основной цепи. Например, Натк в заявке на патент США 06/026716 показал, что ПЭГ может быть получен со сложноэфирными связями в полимерной основной цепи, которые являются объектом гидролиза. Этот гидролиз приводит к расщеплению полимера на фрагменты с более низкой молекулярной массой согласно схеме реакции

-ПЭГ-СО₂-ПЭГ-+Н₂О->-ПЭГ-СО₂Н +НО-ПЭГСогласно настоящему изобретению термин полиэтиленгликоль или ПЭГ включает все описанные выше производные.

Сополимеры этиленоксида и пропиленоксида близки ПЭГ по своим химическим свойствам, и они могут быть использованы вместо ПЭГ во многих случаях его применения. Они имеют следующую общую формулу:

НО-СН₂СНЯО(СН₂СНЯО) _ПСН₂СНЯ-ОН, где Я обозначает Н или СН₃.

ПЭГ является полезным полимером, обладающим высокой растворимостью в воде, а также высокой растворимостью во многих органических растворителях. ПЭГ также нетоксичен и не является иммуно

- 1 005495 генным. Когда ПЭГ присоединяют химически (присоединение ПЭГ) к нерастворимым в воде соединениям, полученный в результате конъюгат обычно растворим в воде, а также растворим во многих органических растворителях.

Конъюгаты ПЭГ-белок в настоящее время используются в белок-заместительной терапии и для других терапевтических целей. Например, связанная с ПЭГ аденозиндезаминаза (ΑΌΑΟΕΝ®) используется для лечения серьезных комплексных иммунодефицитных заболеваний, связанная с ПЭГ Ьаспарагиназа (ΘΝΟΑΡδΡΑΚ®) применяется для лечения острого лимфобластного лейкоза и связанной с ПЭГ α-интерферон (ΙΝΤΚΌΝ(Κ) А) находится на III стадии испытаний по лечению гепатита С.

Общий обзор конъюгатов ПЭГ-белок, обладающих клинической эффективностью, дан в Ν.Η ВигпНат, Ат. I. Нокр. РНагт.. 15:210-218, 1994.

Был разработан ряд способов присоединения ПЭГ к белкам.

Обычно проводят присоединение ПЭГ к реакционноспособным группам белка, используя производные ПЭГ с повышенной электрофильностью. Присоединение ПЭГ к α- и ε-аминогруппам, имеющимся в остатках лизина, и к Ν-концу дает конъюгат, состоящий из смеси продуктов.

Обычно такие конъюгаты включают ряд нескольких молекул ПЭГ, присоединенных к молекуле белка (ПЭГ-меры) в количестве в пределах от нуля до числа, соответствующего числу аминогрупп в белке. Для молекулы белка, которая была однократно модифицирована, единица ПЭГ может быть присоединена к ряду различных аминных сайтов.

Такой тип неспецифического присоединения ПЭГ приводил к ряду конъюгатов, которые становились почти неактивными. Понижение активности обычно вызывается экранированием активного связывающего домена белка, как в случае многих цитокинов и антител. Например, Ка1те и др. в патенте США № 4766106 и патенте США № 4917888 описывают присоединение ПЭГ к β-ИФН и интерлейкину 2 (ИЛ2) с использованием большого избытка метоксиполиэтиленгликолилового эфира Ν-сукцинимидилглутаровой кислоты и метоксиполиэтиленгликолилового эфира Ν-сукцинимидилянтарной кислоты. Оба белка продуцировались в микробных клетках-хозяевах, что делало возможной сайт-специфическую мутацию свободного цистеина в серии. Мутация была необходима при микробной экспрессии β-ИФН для облегчения складывания белка. В частности, β-ИФН, используемый в этих экспериментах, является товарным продуктом Ве1акетоп®, в котором остаток Сук¹⁷ заменен серином. Кроме того, отсутствие гликозилирования уменьшало растворимость продукта в водном растворе. Неспецифическое присоединение ПЭГ приводило в результате к повышенной растворимости, но главной проблемой являлся пониженный уровень активности и выход.

Заявка на европейский патент ЕР 593868, названная Конъюгаты ПЭГ-интерферон, описывает получение конъюгатов ПЭГ-а-ИФН. Однако реакция присоединения ПЭГ не является сайт-специфической, и поэтому получается смесь изомеров положения конъюгатов ПЭГ-а-ИФН (см. также МопкагкН и др., АС8 8утр.8ет., 680:207-216, 1997).

КшкДет и др. в заявке на европейский патент ЕР 675201 продемонстрировали селективную модификацию Ν-концевого остатка фактора роста и развития мегакариоцитов м-ПЭГ-пропионовым альдегидом. Это позволило осуществить воспроизводимые присоединения ПЭГ и фармакокинетику от серии к серии. СПЬей и др. в патенте США № 5711944 показали, что присоединение ПЭГ к α-ИФН может быть проведено с оптимальным уровнем активности. В этом случае требовалась трудоемкая стадия очистки для получения оптимального конъюгата.

Большинство цитокинов, как и другие белки, не обладают специфическим сайтом для присоединения ПЭГ и, кроме упомянутых выше примеров, очень возможно, что некоторые из изомеров, получаемые при реакции присоединения ПЭГ, являются частично или полностью неактивными, вызывая таким образом потерю активности конечной смеси.

Сайт-специфическая реакция присоединения одной единицы ПЭГ является, таким образом, желаемой целью при получении таких белковых конъюгатов.

\Уод1нгеп и др., В1осопщда1е СНет., 4(5):314-318, 1993, синтезировали селективное к тиольной группе производное ПЭГ для такого сайт-специфического присоединения ПЭГ. Было показано, что устойчивое производное ПЭГ, защищенное по тиольной группе ортопиридилдисульфидной (о-П-88-) реакционноспособной группой специфически конъюгируется со свободным цистеином в белке, папаине. Вновь образованная дисульфидная связь между папаином и ПЭГ могла быть расщеплена в мягких восстановительных условиях для регенерации нативного белка.

Цитирование здесь любого документа не предполагает признания, что такой документ является ранним прототипом, или может быть рассмотрен как материал в отношении патентоспособности любого пункта настоящей заявки.

Любое заявление, касающееся содержания или даты какого-либо документа, основывается на доступной заявителям информации на момент представления документа и не является признанием правильности такого заявления.

- 2 005495

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение далее относится к способу поэтапного присоединения ПЭГ-частей последовательно к полипептиду, в частности к способу получения конъюгатов полиэтиленгликоль-в-ИФН. Такие конъюгаты, как ожидают, показывают повышенную эффективность ίη νΐνο. Целью изобретения является достижение повышенной растворимости при нейтральных значениях рН, повышенной стабильности (пониженная агрегация), пониженной иммуногенности и отсутствия потери активности по отношению к нативному β-ИФН. Результаты такой конъюгации могут уменьшить число доз, необходимых для ожидаемого действия, упростят и сделают стабильной препаративную форму фармацевтической композиции и увеличат продолжительность действия.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана кривая капиллярного электрофореза (КЭ) конъюгата ПЭГ-β-ИФН до очистки;

фиг. 2А-2С показывают очистку конъюгата ПЭГ-β-ИФН, проведенную с помощью эксклюзионной по размерам хроматографии (супероза 12): фиг. 2А - первое прохождение; фиг. 2В - второе прохождение; фиг. 2С - третье прохождение;

фиг. 3 представляет хроматографию с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (8Ό8-ΡΑΟΕ) конъюгата ПЭГ-|)-ИФН. очищенного после третьего прохождения хроматографии. Полосы 1 и 4 представляют стандарты белков определенной молекулярной массы, полоса 2 означает нативный β-ИФН, и полоса 3 представляет конъюгат ПЭГ-β-ИФН;

фиг. 4 представляет кривую капиллярного электрофореза (КЭ) очищенного конъюгата ПЭГ-β-ИФН, в котором β-ИФН присоединен к ПЭГ использованием м-ПЭГ-о-П-§§_5к;

фиг. 5 представляет масс-спектр лазерной десорбции и ионизации из матрицы (ΜΑΕΟΙ-Μ8) очищенного конъюгата ПЭГ-β-ИФН;

фиг. 6 показывает сравнение антивирусной активности нативного β-ИФН и конъюгата ПЭГ-βИФН. Клетки ^Ι8Η инкубировали с указанными концентрациями образцов β-ИФН в течение 24 ч до контрольного заражения цитопатической дозой вируса везикулярного стоматита. Цитопатический эффект определяли после дополнительных 48 ч при превращении с применением МТТ (3-[4,5диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолийбромид, тиазолиловый синий);

фиг. 7 представляет кривую связывания β-ИФН и ПЭГ -ИФН в клетках ЭаиФ;

фиг. 8 демонстрирует фармокинетическую кривую β-ИФН и ПЭГ -ИФН у мышей после внутривенного введения. Пунктирные линии указывают анализ низшего наблюдаемого количества (1ос.|-анализ) для каждой стандартной кривой;

фиг. 9 демонстрирует фармакокинетическую кривую β-ИФН и ПЭГ -ИФН у мышей после подкожного введения. Пунктирные линии означают БОР-анализ для каждой стандартной кривой.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу поэтапного присоединения двух или более ПЭГ-частей к полипептиду. Этот способ основывается на обнаружении того, что активированный ПЭГ с низкой молекулярной массой реагирует более полно со стерически затрудненным реакционным сайтом на белке, чем активированный ПЭГ с высокой молекулярной массой. ПЭГ-модификация дорогих терапевтических белков должна быть эффективной по стоимости, чтобы приготовление конъюгатов ПЭГ было целесообразным. Кроме того, чтобы уменьшить фильтрацию от конгломератов и оптимизировать фармакологические свойства конъюгатов ПЭГ-белок, конъюгаты должны иметь эффективный размер, эквивалентный таковому для белка с молекулярной массой в 70 кДа. Это означает, что для сайт-специфической модификации, когда присоединяется один остаток ПЭГ, предпочтительно присоединяется производное ПЭГ с молекулярной массой более, чем 20 кДа. Если сайт модификации стерически нагружен, реакционноспособная группа на большой ПЭГ-части может испытывать трудность в достижении сайта модификации, и это приведет к низким выходам. Предпочтительный способ присоединения ПЭГ к полипептиду согласно настоящему изобретению повышает выход сайт-специфического присоединения ПЭГ путем того, что сначала присоединяется небольшая гетеро- или гомобифункциональная ПЭГ-часть, которая, благодаря своему относительно меньшему размеру, может реагировать со стерически нагруженными сайтами. Последующее присоединение производного ПЭГ с большой молекулярной массой к небольшому ПЭГ приводит к высокому выходу желаемого белка с присоединенным ПЭГ.

Способ поэтапного присоединения двух или нескольких ПЭГ-частей последовательно к полипептиду согласно настоящему изобретению включает присоединение гетеробифункциональной или гомобифункциональной ПЭГ-части с низкой молекулярной массой сначала к полипептиду и затем присоединение монофункциональной или бифункциональной ПЭГ-части к свободному концу ПЭГ-части с низкой молекулярной массой, которая присоединена к полипептиду. После поэтапного присоединения двух или более ПЭГ -частей последовательно к полипептиду, который предпочтительно является β-ИФН и в котором Сук¹⁷, расположенный в стерически нагруженном сайте, является предпочтительным сайтом присоединения ПЭГ, конъюгат ПЭГ-полипептид может быть очищен с использованием одной или более хроматографических методов.

- 3 005495

Хроматографический метод подразумевает любую методику, используемую для разделения компонентов смеси при их нанесении на носитель (стационарная фаза), через который пропускают растворитель (подвижная фаза). Принципы разделения при хроматографии основываются на различных физических свойствах стационарной и подвижной фазы.

Некоторые особые виды хроматографических методов, которые хорошо известны в литературе, включают: жидкостную хроматографию, жидкостную хроматографию высокого давления (высокоэффективную), ионообменную хроматографию, абсорбционную хроматографию, аффинную хроматографию, распределительную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, обращенно-фазовую хроматографию, гель-фильтрацию, ультрафильтрацию или тонкослойную хроматографию.

Термин β-ИФН, используемый здесь, означает интерферон фибробластов человека, полученный путем выделения из биологических жидкостей или полученный с помощью методик с рекомбинантной ДНК из прокариотических или эукариотических клеток-хозяев, а также его соли, функциональные производные, предшественники и активные фракции при условии, что они содержат остаток цистеина, находящийся в положении 17 во встречающейся в природе форме.

Понятие соли, используемое здесь, относится как к солям карбоксильных групп, так и к солям аминогрупп, полученным известными способами. Соли карбоксильных групп включают неорганические соли, такие как, например, натриевые, калиевые, кальциевые соли, и соли с органическими основаниями, такие, как образованные с амином, таким как, например, триэтаноламин, аргинин или лизин. Соли аминогрупп включают, например, соли с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, и с органическими кислотами, такими как уксусная кислота.

Понятие функциональные производные, используемое здесь, относится к производным, которые могут быть получены благодаря функциональным группам, присутствующим в боковых цепочках аминокислотных участков или в концевых Ν- или С-группах, в соответствии с известными способами и включаются в настоящее изобретение, когда они являются фармацевтически приемлемыми, т. е. когда они не подавляют активность белка или не придают токсичность содержащим их фармацевтическим композициям. Такие производные включают, например, сложные эфиры или алифатические амиды карбоксильных групп и Ν-ацилпроизводные свободных аминогрупп или О-ацилпроизводные свободных гидроксильных групп, и образуются с ацильными группами, такими как, например, алканоильная или ароильная группы.

Предшественники представляют собой соединения, которые превращаются в β-ИФН в организме человека или животного.

В качестве активных фракций белка настоящее изобретение подразумевает любой фрагмент или предшественник полипептидной цепи самого соединения, одного или в комбинации с родственными молекулами или со связанными с ним остатками, например остатки сахаров или фосфатов или агрегаты полипептидной молекулы, когда такие фрагменты или предшественники проявляют такую же активность, как β-ИФН, в качестве лекарственного средства.

ПЭГ -часть с низкой молекулярной массой имеет формулу \\<С11;С11;(М'Н;С11;О)..С11;С11;-.\.

где \ и X являются группами, которые независимо реагируют с амином, сульфгидрильной, карбоксильной или гидроксильной функциональной группой для присоединения ПЭГ-части с низкой молекулярной массой к полипептиду. \ и X выбираются независимо предпочтительно из ортопиридилдисульфида, имидов малеиновой кислоты, винилсульфонов, иодацетимидов, аминов, тиолов, карбоксилов, активных сложных эфиров, бензотриазолкарбонатов, п-нитрофенолкарбонатов, изоцианатов и биотина. ПЭГ-часть с низкой молекулярной массой предпочтительно имеет молекулярную массу в диапазоне от 100 до 5000 дальтон.

Монофункциональная или бифункциональная ПЭГ-часть для присоединения к свободному концу ПЭГ с низкой молекулярной массой, который связан с полипептидом, имеет предпочтительно молекулярную массу в диапазоне примерно от 100 дальтон до 200 кДа и представляет предпочтительно метокси-ПЭГ, разветвленный ПЭГ, гидролитически или ферментативно разлагаемый ПЭГ, дополненный ПЭГ или дендримерный ПЭГ. Монофункциональный или бифункциональный ПЭГ имеет, кроме того, формулу ¥-СН₂СН₂О(СН₂СН₂О)_мСН₂СН₂-2, где Υ является реакционноспособным остатком по отношению к концевой группе на свободном конце ПЭГ -части с низкой молекулярной массой, которая присоединена к полипептиду, и Ζ является метоксигруппой или реакционноспособной группой для образования бифункционального конъюгата.

Конъюгат ПЭГ-полипептид, полученный вышеупомянутым способом поэтапного присоединения двух или более ПЭГ-частей, может быть применен в качестве активного ингредиента для получения лекарственного средства или фармацевтической композиции для лечения заболеваний или нарушений, по отношению к которым полипептиды эффективны.

Другим объектом настоящего изобретения является получение конъюгатов, по существу, в очищенной форме для того, чтобы они были пригодны для использования в фармацевтических композициях

- 4 005495 в качестве активных ингредиентов для лечения диагностики или прогнозирования бактериальных или вирусных инфекций, а также аутоиммунных, воспалительных заболеваний и опухолей.

Нелимитирующие примеры вышеуказанных заболеваний включают септический шок, СПИД, ревматоидный артрит, красную волчанку и рассеянный склероз.

Дальнейшие варианты осуществления изобретения и преимущества изобретения будут очевидны из следующего описания.

Вариантом осуществления изобретения является введение фармакологически активного количества конъютатов по изобретению субъектам с риском развития одного из вышеупомянутых заболеваний или субъектам, уже имеющим такие патологии.

Может быть использован любой способ введения, совместимый с действующим началом. Парентеральное введение, как, например, подкожное, внутримышечная или внутривенная инъекции предпочтительно. Доза активного ингредиента, которую следует ввести, зависит от медицинского предписания в соответствии с возрастом, весом и индивидуальной реакцией больного.

Доза может быть в интервале от 10 мкг до 1 мг в день для среднего веса тела 75 кг, предпочтительная дневная доза находится в интервале от 20 до 200 мкг.

Фармацевтические композиции для парентерального введения могут быть получены в виде инъецируемой формы, состоящей из активного начала и подходящего носителя. Носители для парентерального введения хорошо известны в этой области и включают, например, воду, физиологический раствор, раствор Рингера и/или декстрозу. Носитель может содержать небольшие количества наполнителей для поддержания стабильности и изотоничности фармацевтического препарата. Получение растворов может быть осуществлено согласно обычным методикам.

Настоящее изобретение описано с ссылкой на конкретные варианты осуществления изобретения, но содержание описания включает все модификации и замены, которые могут быть сделаны специалистом в данной области без расширения объема и цели, определенных формулой изобретения.

Изобретение далее будет описано с помощью следующих примеров, которые не должны быть рассмотрены как каким-либо образом ограничивающие настоящее изобретение.

Пример 1. Получение конъюгата ПЭГ-|1-ИФН.

Модификация β-ИФН с помощью м-ПЭГ_5к-88-П-о.

Рекомбинантный β-ИФН человека, устойчивый при концентрации 0,37 мг/мл в 50 мМ буфере с ацетатом натрия, рН 3,6, использовали для получения конъюгата ПЭГ-|1-ИФН. Примерно 1,0 мл 6М мочевины прибавляли к 2 мл β-ИФН в концентрации 0,37 мг/мл (0,74 мг, 3,7х10^-8 моль). Прибавляли м-ПЭГ_5к88-П-о с молярным избытком 50 моль на один моль β-ИФН и оба компонента реагировали в полипропиленовой пробирке либо в течение 2 ч при 37°С, либо в течение 1 ч при 50°С. Реакционную смесь перед какой-либо очисткой анализировали с использованием кривой капиллярного электрофореза (КЭ) для определения степени образования конъюгата ПЭГ-|1-ИФН при реакции присоединения ПЭГ (фиг. 1). Типичный выход ПЭГ-|1-ИФН для этой реакции составляет 50%. Продукты реакции отфильтровывали от реакционной смеси с применением шприцевого фильтра диаметром 0,22 мм и отфильтрованный раствор затем загружали в колонку для эксклюзионной по размерам хроматографии (либо супероза 12, либо супердекс 75, Рйатшас1а) и элюировали буфером с рН 7,0, содержащим 50 мМ фосфат натрия, 150 мМ №1С1. На фиг. 2А представлена кривая элюирования после очистки конъюгата ПЭГ-β-ИФН на колонке с суперозой 12 для вытеснительной по размерам хроматографии. Пики собирали и анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (фиг. 3). Фракции, содержащие конъюгат ПЭГ-β-ИФН, объединяли и концентрат затем повторно загружали в такую же колонку для вытеснительной по размерам хроматографии с целью дальнейшей очистки конъюгата ПЭГ-βИФН из-за близости пика нативного β-ИФН (фиг. 2В). Эту процедуру повторяли (третье прохождение), чтобы гарантировать чистоту (фиг. 2С). Фиг. 4 и 5 представляют соответственно кривую капиллярного электрофореза и масс-спектр лазерной десорбции и ионизации из матрицы очищенного конъюгата ПЭГβ-ИФН.

Модификация β-ИФН с помощью м-ПЭГ_30к-88-П-о.

Предоставленный рекомбинантный человеческий β-ИФН устойчив в растворе в концентрации 0,36 мг/мл в 50 мМ натрийацетатном буфере, рН 3,6. Приблизительно 36 мг м-ПЭГ_30к-88-П-о в 3 мл деионизованной воды прибавляли к 3 мл β-ИФН в концентрации 0,36 мг/мл (1,08 мг, 4,9х10^-8 моль) и оба продукта реагировали в полипропиленовой пробирке в течение 2 ч при 50°С. Реакционную смесь анализировали для определения степени модификации с помощью капиллярного электрофореза. Обычные выходы для этой реакции составляют <30%. Раствор затем помещают в колонку для вытеснительной по размерам хроматографии (супероза 12, фирма Рйатшааа) и элюируют с помощью буфера с рН 7,0, содержащего 50 мМ фосфата/натрия, 150 мМ ИаС1. Фракции собирают и анализируют на содержание с применением электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

- 5 005495

Пример 2. Биологическая активность конъюгатов ПЭГ-β-ΠΦΗ.

Чтобы оценить влияние присоединения ПЭГ на противовирусную активность рекомбинантного человеческого β-ΠΦΗ, амниотические клетки ΑΙ8Η человека предварительно инкубировали либо со свежеприготовленным β-ΠΦΗ (такая же серия, как использованная для присоединения ПЭГ), либо с конъюгатом ПЭГ-β-ΠΦΗ. Опосредствованную β-ΠΦΗ противовирусную активность, как измеренную с помощью анализа заболеваемости клеток ΑΙ8Η при воздействии вируса везикулярного стоматита (У8У), определяли согласно разработанному биотесту для ΑΙ8Η, основанному на протоколе Хохлск и др., I. 1ттипо1, 129:2244-2247(1982). Материалы, использованные в этом анализе ΑΙ8Η, приведены ниже:

клетки ΑΙ8Η (АТСС/Американская коллекция типовых культур/ССБ 25), штаммы вируса везикулярного стоматита (АТСС ν-520-001-522), хранящиеся при -70°С, β-ΠΦΗ, человеческий рекомбинантный, ШегРЬагт ЬаЬогаФпез Ι/ΓΙ) (тип 32,075, партия № 205035), 82х10^б МЕд./мл, удельная активность: 222х10^б МЕд./мг, конъюгат ПЭГ-β-ΠΦΗ, полученный в примере 1 и сохраняемый в забуференном фосфатом физиологическом растворе (3ΦΡ), рΗ 7,4, среда для роста ΑΙ8Η (минимальная поддерживающая среда/МЕМ/с высоким содержанием глюкозы, с солями Еаг1е+10% фетальной бычьей сыворотки+1,0% I.-глутамина+-пенициллин/стрептомицин (100 Ед./мл, 100 мкг/мл), среда для анализа ΑΙ8Η (МЕМ с высоким содержанием глюкозы, с солями Еаг1е+5% фетальной бычьей сыворотки+1,0% Ь-глутамина+пенициллин/стрептомицин (100 Ед./мл, 100 мкг/мл),

МТТ в концентрации 5 мг/мл в 3ΦΡ, хранящийся при -70°С.

Протокол испытания \\Ί8Η следует далее.

Делают двукратное разведение образцов β-ΠΦΗ относительно начальной концентрации в среде для анализа ΑΙ8Η.

Делают трехкратные разведения образцов β-ΠΦΗ в среде для анализа ΑΙ8Η в 9б-ячеечном плоскодонном планшете так, чтобы в каждой ячейке содержалось 50 мкл разведенного образца β-ΠΦΗ (в некоторые контрольные ячейки помещают только 50 мкл среды для анализа ΑΙ8Η).

Собирают клетки ΑΙ8Η фазы логарифмического роста с помощью раствора трипсин/этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК), промывают средой для анализа ΑΙ8Η и доводят до конечной концентрации 0,8х10^б клеток/ мл.

Прибавляют 50 мкл суспензии клеток ΑΙ8Η (4х10⁴ клеток/в ячейке) в каждую ячейку. Теперь конечная концентрация β-ΠΦΗ, представленного клеткам, составляет 1.

После инкубирования в течение 24 ч в инкубаторе в атмосфере 5% СО2 добавляют 50 мкл, разбавленной 1:10 (в среде для анализа ΑΙ8Η) исходной культуры ν8ν (доза, предварительно определенная для лизирования 100% клеток \\Ί8Η в течение 48 ч) во все ячейки, кроме контрольных ячеек (в такие ячейки помещают только равный объем среды для анализа).

Еще через 48 ч во все ячейки добавляют 25 мкл раствора МТТ, после чего планшеты инкубируют еще в течение 2 ч в инкубаторе.

Содержимое ячеек удаляют путем перевертывания планшета и в ячейки добавляют 200 мкл 100% этилового спирта.

Через 1 ч снимают показания с планшетов при 595 нм с использованием программного обеспечения 8ой тах Рго и спектрофотометрической системы 8рес1гатах (фирмы Мо1еси1аг 1)е'\лсе%.

Таблица 1

Противовирусная активность образцов β-ΠΦΗ с присоединенным ПЭГ и с псевдоприсоединенным ПЭГ

Образец β-ИФН*	ЕС₅₀**
Конъюгат ПЭГ-β-ΠΦΗ	3,9 +/- 0,7пг/мл
β-ИФН	16,4 +/- 1,0пг/мл

* Исходные концентрации β-ΠΦΗ в образцах, определенные с помощью аминокислотного анализа.

** ЕС₅₀ (эффективная концентрация, приводящая к 50%-ному эффекту) (± стандартное отклонение/С.О./) определяли с помощью программного обеспечения М1сгоса1 Опдт 4.1

Как выше показано на фиг. б и в табл. 1, конъюгаты ПЭГ-β-ΠΦΗ поддерживали уровень противовирусной активности выше уровня активности свежеприготовленной партии родительского β-ΠΦΗ. Наблюдение, что конъюгат ПЭГ-β-ΠΦΗ имеет приблизительно в 4 раза более высокую биоактивность, чем активность свежеприготовленного β-ΠΦΗ, может также быть следствием увеличенной стабильности конъюгата ПЭГ-β-ΠΦΗ по отношению к нативному β-ΠΦΗ после прибавления среды для анализа клеток ΑΙ8Η.

Пример 3. Ιη νΐΐΓΟ анализы относительной активности образцов ПЭГ-ИФН.

Определяли относительную биоактивность ПЭГ [30 кДа]- β-ИФН и ПЭГ [2x20 кДа]- β-ИФН путем анализа ΑΙ8Η, используя стандартный протокол, описанный в примере 2 (табл. 2). Было проведено три независимых анализа тремя разными исполнителями в разное время.

Таблица 2

Относительная противовирусная активность ПЭГ-в-ИФН

	Относительная активность интерферона *(из трех исследований
Образец	Анализ 1	Анализ 2	Анализ 3	Среднее значение (С.О.)
ПЭГ[30кДа]- β—ИФН	В 3,2 раза выше	В 3,1 раза выше	В 1,8 раза выше	В 3,0 раза (0,78) выше
ПЭГ [2x20 кДа]-β-ИФН	В 4,2 раза выше	В 1,3 раза выше	В 0,85 раза выше	В 2,1 раза (1,8)выше

* Дозы с ЕС₅₀ в сравнении со стандартом β-ИФН, включенным в каждый анализ.

** Сравнение базируется на концентрации β-ИФН в 330 мкг/мл. Исходные концентрации ПЭГ [30 кДа]- βИФН (5,41 мкг/мл) и ПЭГ [2x20 кДа]- β-ИФН (6,86 мкг/мл) были определены с помощью аминокислотного анализа.

Связывание ПЭГ^-ИФН с его рецептором на клетках оценивалось в присутствии фиксированного количества ¹²⁵1-ИФН-а2а. ИФН-а2а радиоактивно метили с помощью ¹²⁵Ι, используя метод с хлорамином Т. Связанный с ¹²⁵Ι ИФН-а2а отделяли от свободного иода при пропускании реагентов через колонку с Сефадексом Θ25 и объединении содержащих белок фракций (фирма Рйагшас1а). ¹²⁵1-ИФН-а2а количественно оценивали с помощью ферментного иммуносорбентного анализа (ЕБ18А) (фирма Вюзоигсе, США) и определяли удельную активность. Собирали клетки ПаисН, выросшие в экспоненциальной фазе роста, и 2х10⁶ клеток инкубировали с 0,5 нМ ¹²⁵1-ИФН-а2а в течение 3 ч при комнатной температуре в присутствии различных концентраций ПЭГ^-ИФН или ИФН-а2а, разведенных в буфере для анализа, который является средой ΚΡΜΙ 1640, содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки и 0,1% азида натрия. По окончании инкубирования клетки пропускали через слой фталата в виде масла и связанную с клеткой радиоактивность считали с помощью счетчика гамма-квантов. Следует добавить, что связывание ПЭГ [30 кДа]- β-ИФН и ПЭГ [2x20 кДа]- β-ИФН с рецептором было очень похожим или близким связывающей активности β-ИФН, как показано на фиг. 7.

Также относительная активность была определена при анализе антипролиферационного эффекта в отношении клеток ПаисН (В-клетки лимфомы человека) (фиг. 3). Все интерфероны были приготовлены в концентрации 2 х от 200 нг/мл. Образцы разводили три раза вдоль по длине планшета при конечном объеме 100 мкл. Прибавляли в каждую ячейку 1х10⁵ клеток/ячейка (100 мкл) и инкубировали в общей сложности в течение 72 ч при 37°С в увлажненном СО₂ инкубаторе. Через 48 ч прибавляли насыщенный тритием (³Н) тимидин в 20 мкл по 1 мкКю/в ячейке. В конце 72-часового инкубирования все содержимое планшета собирали с помощью устройства для сбора с планшета Тош1ек. Представленные в табл. 3 результаты показывают, что после присоединения ПЭГ не наблюдали какой-либо определяемой потери активности интерферона. На самом деле, активность была несколько выше, чем для свободного β-ИФН. Это может быть объяснено образованием неактивных агрегатов в свободном интерфероне или различиями в способах количественной оценки (аминокислотный анализ для образцов ПЭГ-ИФН и обращеннофазовая ВЭЖХ для β-ИФН).

Таблица 3

Анализ антипролиферационной активности на клетках РаисН

	Доза 1Сбо	Кратность увеличения по отношению к ИФН
β-ИФН(планшет 1)	1153,1	-
ПЭГ[30 кДа]-ИФН(71А)	695,6	В 1,6 раза
β-ИФН(планшет 2)	1005,8
ПЭГ[40кДа]-ИФН (71В)	629,4	В 1,7 раза

* пг/мл

- 7 005495

Пример 4. Фармакокинетические исследования на мышах.

Внутривенное введение.

Мышей инъецировали 100 нг β-ИФН, ПЭГ [30 кДа]- β-ИФН или ПЭГ [2x20 кДа]-в-ИФН и кровь отбирали после этого в указанные моменты времени. Концентрации β-ИФН в сыворотке определяли с помощью специфичного к β-ИФН ЕЫ8Л (Тогау 1п6и51пс5). результаты приведены на фиг. 8. Двадцать восемь самок мышей штамма Β6Ό2Ρ1 (6-8 недель) (каждая весом примерно 20 г) делили на четыре группы следующим образом: группа 1 состояла из девяти мышей, однократно инъецированных 200 мкл болюса человеческого β-ИФН в концентрации 500 нг/мл (конечная доза 100 нг/мышь); группа 2 (девять мышей) получала 200 мкл эквивалентного по массе ПЭГ [30 кДа^-ИФН; группа 3 получала 200 мкл эквивалентного по массе ПЭГ [2x20 кДа^-ИФН; и группа 4 является группой из трех неинъецированных мышей, служивших в качестве отрицательного контроля. Образцы крови (примерно 200 мкл/образец) собирали в девять указанных моментов времени путем введения в ретро-глазничное венозное сплетение капиллярной трубки. Образцам крови давали возможность свернуться в течение 1 ч при комнатной температуре, сгустки, перемешивая круговыми движениями, отводили от стенок и подвергали микроцентрифугированию. Выделенные при этом сыворотки хранили при -70°С до тех пор, пока были собраны все образцы. Сыворотки исследовались на присутствие биоактивного человеческого β-ИФН с использованием Тогау-анализа. Результаты показывают, что площадь под кривой (ППК) заметно возрастает в случае образцов ПЭГ-ИФН по отношению к свободному β-ИФН и что ПЭГ [2x20 кДа^-ИФН превосходит ПЭГ [30 кДа^-ИФН.

Подкожное введение.

Мышам инъецировали подкожно β-ИФН и ПЭГ-ИФН (100 нг/мышь). Фиг. 9 показывает, что общая площадь под кривой (ППК) резко увеличена в случае образцов ПЭГ-ИФН по сравнению со свободным βИФН. Фармакокинетические исследования согласуются с тем, что образцы ПЭГ-ИФН имеют больший период полувыведения и увеличенную ППК.

Пример 5. Присоединение ПЭГ-части с низкой молекулярной массой к полипептиду.

Связывание β-интерферона с о-П-88-ПЭГ_2к-гидразидом.

Рекомбинантный человеческий β-интерферон был использован в растворе в концентрации 0,33 мг/мл в 50 мМ натрийацетатного буфера, рН 3,8. Приблизительно 3,6 мг (40-мольный избыток по отношению к молям белка) гетеробифункционального включающего ПЭГ реагента, о-П-88-ПЭГ_2к-гидразид, в 2 мл деионизованной воды добавляли 3 мл β-ИФН в концентрации 0,33 мг/мл (0,99 мг) и оба компонента реагировали в полипропиленовой пробирке в течение 1 ч при 45°С. Реакционную смесь затем анализировали с использованием капиллярного электрофореза для определения степени модификации. Типичные выходы находились в пределах 90-97%, что зависело от чистоты β-интерферона и ПЭГ реагента. Затем раствор вносили в колонку для вытеснительной по размерам хроматографии (супердекс 75, Рйаттас1а) и элюировали содержащим 5 мМ фосфат натрия и 150 мМ ЫаС1 буфером с рН 7,0. Фракции собирали и анализировали при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Фракции, содержащие β-интерферон с одной присоединенной ПЭГ -частью, объединяли, используя затем для дальнейшего этапа модификации с применением ПЭГ с высокой молекулярной массой.

Связывание β-интерферона с (о-П-88)₂-ПЭГ₃₄₀₀.

Рекомбинантный человеческий β-интерферон использовали в растворе в 50 мМ натрийацетатном буфере, рН 3,8, в концентрации 0,33 мг/мл. Приблизительно 6,1 мг (40-мольный избыток по отношению к молям белка) гомобифункционального ПЭГ реагента, (о-П-88)₂-ПЭГ₃₄₀₀, в 2 мл деионизованной воды прибавляли к 3 мл β-интерферона в концентрации 0,33 мг/мл (0,99 мг) и проводили реакцию в полипропиленовой пробирке 2 ч при 50°С. За ходом реакции следили с помощью невосстановительного электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и конечную реакционную смесь анализировали с помощью капиллярного электрофореза для определения степени модификации.

Типичные модификации для этой реакции с β-интерфероном составляли >95%. Раствор затем вводили в колонку для вытеснительной по размерам хроматографии (супердекс 75, РйаттаОа) и элюировали содержащим 50 мМ фосфат натрия и 150 мМ ЫаС1 буфером с рН 7,0. Фракции собирали и анализировали их содержание с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Фракции, содержащие β-интерферон с одним присоединенным остатком ПЭГ, объединяли.

- 8 005495

Пример 6. Присоединение второй ПЭГ-части к ПЭГ с низкой молекулярной массой, присоединенному к полипептиду.

Модификация ИФН-§-§-ПЭГ_2к-гидразида с помощью м-ПЭГ₃₀к-альдегида.

К объединенным фракциям ИФН-§-§-ПЭГ_2к-гидразида примера 5 прибавляли м-ПЭГ_30к-альдегид в 20-мольном избытке по отношению к белку. Реакцию проводили при комнатной температуре (25°С) в течение 4 ч и образец помещали в колонку для вытеснительной по размерам хроматографии (супероза 6, Рйагтас1а) для определения выхода модификации. Выход модификации обычно составлял >80% в зависимости от чистоты ПЭГ реагента и условий реакции.

После полного описания этого изобретения специалистам в данной области понятно, что то же самое может быть осуществлено в большом диапазоне эквивалентных параметров, концентраций и условий без отступления от объема и сути изобретения и без чрезмерного экспериментирования.

Хотя это изобретение было описано в связи с конкретным вариантом его осуществления, понятно, что оно допускает дальнейшие модификации. Эта заявка предполагает распространение на любые варианты использования или адаптацию изобретений, следующих в большинстве случаев принципам изобре тения и включающих и такие отклонения от настоящего раскрытия, как встречающиеся в рамках известной или привычной практики в области, к которой относится изобретение, и которые могут быть применены к основным существенным признакам, указанным выше в заявленных пунктах формулы изобрете ния.

Все указанные здесь ссылочные материалы, включая статьи в журналах и рефераты, опубликованные или неопубликованные заявки на патенты США или заявки на иностранные патенты, опубликованные патенты США или иностранные патенты или любые другие ссылки, полностью включены сюда в качестве ссылок, включая все данные, таблицы, рисунки и текст цитированных ссылок. Кроме этого, полное содержание ссылочных материалов в приведенных здесь ссылках также полностью включено в качестве ссылок.

Ссылка на известные стадии методов, стадии обычных методов, известные методы или обычные методы ни в какой мере не является допущением того, что любой аспект, описание или осуществление настоящего изобретения раскрывается, изучается или предлагается в уровне техники.

Приведенное выше описание конкретных вариантов осуществления изобретения настолько полно раскрывает общую природу изобретения, что другие могут, используя знания в пределах необходимой в данной области квалификации (включая содержание процитированных ссылок), легко модифицировать и/или адаптировать для различных применений такие специальные варианты осуществления изобретения без чрезмерного экспериментирования, без отклонения от общей концепции настоящего изобретения. Поэтому, основываясь на обучении и следовании представленным здесь указаниям, предполагается, что такие адаптации и модификации находятся в пределах объема и существа эквивалентов раскрываемых вариантов осуществления изобретения. Следует также понять, что приведенная здесь фразеология или терминология используется с целью описания, а не ограничения, так что терминология или фразеология настоящего технического описания должна интерпретироваться квалифицированным специалистом в свете представленного здесь обучения и следования представленным указаниям в комбинации со знаниями квалифицированного специалиста в данной области.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ поэтапного присоединения частей полиэтиленгликоля (ПЭГ) последовательно к полипептиду, включающий стадии взаимодействия полипептида с имеющей низкую молекулярную массу гетеробифункциональной или гомобифункциональной ПЭГ-частью, имеющей следующую формулу:

\\ЛП;С11;О(С11;С11;О)..С11;С11;-.\.

где \ и X являются группами, которые независимо реагируют с аминогруппой, сульфгидрильной, карбоксильной или гидроксильной функциональной группой для присоединения ПЭГ-части с низкой молекулярной массой к полипептиду, и взаимодействия присоединенной к полипептиду ПЭГ-части с низкой молекулярной массой с монофункциональной или бифункциональной ПЭГ-частью для присоединения монофункциональной или бифункциональной ПЭГ-частью к свободному концу ПЭГ-части с низкой молекулярной массой и образованием конъюгата ПЭГ-полипептид.
2. Способ по п.1, где монофункциональная или бифункциональная ПЭГ-часть имеет следующую формулу:

У-СН₂СН₂О(СН₂СН₂О)_тСН₂СН₂-7,

- 9 005495 где Υ является группой, реакционноспособной по отношению к терминальной группе на свободном конце ПЭГ-части с низкой молекулярной массой, присоединенной к полипептиду, и Ζ является метоксигруппой или группой, реагирующей с X с образованием бифункционального конъюгата.
3. Способ по п.2, где монофункциональной или бифункциональной ПЭГ-частью является метоксиПЭГ, разветвленный ПЭГ, гидролитически или ферментативно разлагаемый ПЭГ, дополненный ПЭГ с боковыми цепями или дендримерный ПЭГ.
4. Способ по п.1, где XV и X независимо выбирают из группы, включающей ортопиридилдисульфид, имиды малеиновой кислоты, винилсульфоны, иодацетамиды, гидразиды, альдегиды, сложные сукцинимидильные эфиры, эпоксиды, амины, тиолы, карбоксилы, активированные сложные эфиры, бензотриазолкарбонаты, п-нитрофенолкарбонаты, изоцианаты и биотин.
5. Способ по п.1, где ПЭГ -часть с низкой молекулярной массой имеет молекулярную массу в диапазоне от 100 до 5000 Да.
6. Способ по п.1, где монофункциональная или бифункциональная ПЭГ-часть имеет молекулярную массу в диапазоне от 100 Да до 200 кДа.
7. Способ по п.1, где ПЭГ-частью с низкой молекулярной массой и/или монофункциональной или бифункциональной ПЭГ-частью является сополимер полиэтиленгликоля.
8. Способ по п.7, где сополимер полиэтиленгликоля выбирают из группы, включающей сополимеры полиэтиленгликоль/полипропиленгликоль и сополимеров полиэтиленгликоль/поли(молочная/гликолевая кислота).
9. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию очистки конъюгата ПЭГ-полипептид, следующую за поэтапным присоединением двух ПЭГ -частей последовательно к полипептиду.
10. Способ по п.9, где указанная стадия очистки включает одну или несколько методик очистки, выбранных из группы, включающей ионообменную хроматографию, вытеснительную по размерам хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, аффинную хроматографию и обращенно-фазовую хроматографию.
11. Способ по любому из пп.1-10, где полипептидом является β-интерферон.
12. Применение конъюгатов ПЭГ-полипептид, полученных по способу по любому из пп.1-10, в качестве лекарственного средства.